KR102260026B1 - 귀뚜라미 가압증숙 및 효소처리물을 함유하는 면역조절용 조성물 - Google Patents

귀뚜라미 가압증숙 및 효소처리물을 함유하는 면역조절용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 귀뚜라미의 가압증숙 및 효소처리물, 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소처리물, 상황버섯 추출물, 오가피 추출물, 도라지 추출물 및 울금 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 염증반응인자로서의 종양괴사인자(TNF-α), 산화질소(nitric oxide, NO) 생성을 억제하고, 면역조절에 관여하는 대식세포(macrophage)의 기능을 조절하는 효과를 가지고 있어, 면역염증반응 질환의 예방 및 치료용 의약품 또는 이들 질환을 개선시키는데 유용한 건강기능식품으로 이용할 수 있다.

Description

귀뚜라미 가압증숙 및 효소처리물을 함유하는 면역조절용 조성물 {Composition for immunomodulatory effects containing cricket treated with high-pressure by steaming process and enzyme-decomposed}
본 발명은 귀뚜라미 효소분해물, 갈색거저리 유충 효소분해물, 상황버섯, 오가피, 도라지 및 울금 추출물을 함유하는 면역조절용 조성물에 관한 것으로, 상기 면역조절용 조성물은 염증반응인자로서의 종양괴사인자(TNF-α), 산화질소 (nitric oxide, NO) 생성을 억제하여 면역조절에 관여하는 대식세포(macrophage)의 기능을 조절하는 효과를 가지고 있어 면역염증반응 질환 예방 및 치료 의약품 또는 이를 개선시키는데 유용한 건강기능성식품으로 제공될 수 있다.
세계적으로 퍼지고 있는 코로나 바이러스 감염증으로 건강에 대한 관심이 높아진 가운데 면역조절 효능을 갖는 식품에 관심이 집중되고 있다. 면역력은 세균이나 바이러스 등 해로운 물질로부터 인체를 보호하는 일종의 방어 체계이다. 이러한 방어체계는 선천성 면역과 적응성 면역(adaptive immunity)으로 대비된다. 초기면역반응에서는 대식세포와 자연살해세포(natural killer cell, NK 세포)의 활성에 의해 병원체를 억제하여 숙주를 보호하는데, 이때 대식세포는 병원체를 탐식하면서 활성세포인 TNF-α(tumor necrosis factor-α)를 많이 생산해 분비하고 NK 세포는 활성지표인 퍼포린(perforin)을 많이 생산하고 분비함으로써 병원체 감염세포를 살해한다. 이어서 후천성 면역에 관여하는 독성세포(cytotoxic) T 림프구, 헬퍼(helper) T 림프구 그리고 B 림프구가 활성화 해 감염세포를 살해하거나 항체를 만들어 숙주를 보호한다. 세포독성 T 림프구 NK 세포처럼 피포린을 많이 생산 분배해 병원체 감원세포를 죽이고 B 림프구는 헬퍼 T 림프구의 의존 또는 비의존적으로 항체를 만들어 숙주를 보호한다. COX-2(cyclooxygenase-2), IL-6(Interlucinase-6) 및 TNF-α(tumor necrosis factor-α)로 대표하는 염증성 사이토카인은 면역반응을 매개하는 물질로 특히 초기면역반응에 깊이 관여하고 있는 것으로 알려있다. 또한, NO(nitric oxide)는 라디칼로서 NOS(nitric oxide syntheses) 효소군에 의하여 L-아르기닌으로부터 생성되며, 세포의 주요한 2차 전달체로 작용한다. 유도성(inducible NOS; iNOS)은 염증이 있을 때 다량의 NO를 생성하여 과산화질산염(peroxynitrite) 등의 반응성 라디칼을 생성하여 항암, 항균 및 항 기생충 효과를 나타낸다. 활성화 된 대식세포에 의해 생성된 NO는 종양세포의 파괴에 관여하고 있는 중요한 유효분자로 확인되고 있으며 더욱이, 비특이적으로 숙주를 방어하거나, 대식세포-매개성 사멸, 생체외 및 생체내에서 미생물 및 조양세포의 증식억제에 NO가 관여하고 있음이 보고 된 바 있다. 하지만 과다하게 생성된 NO와 TNF-α는 전신적 염증을 유발하여 생체에 여러 가지 부정적 영향을 미치기도 한다. 따라서 대식세포에 의한 TNF-α와 NO 등의 적절한 생성은 면역체계를 조절하는데 중요한 역할을 한다.
면역체계의 상호간 균형이 깨졌을 때 발생할 수 있는 질병을 예방하기 위해 면역 조절제 개발이 추진되고 있으나 부작용 및 문제점이 제기되어져 왔다. 이러한 문제점을 해결하고자 최근에는 안전성이 보고된 천연물의 면역조절 효능 연구가 다양하게 이루어지고 있다. 지금까지 많은 연구에서 플라보노이드(flavonoid) 다당류(polysaccharides) 및 단백질을 포함하는 천연 화합물 또는 추출물의 면역활성이 보고되어 있고, 최근에는 천연소재를 효소처리 등 생물학적 방법에 면역 조절 효과 검증을 위한 연구가 많이 이루어지고 있는 추세이다. 예로 황칠나무 추출물 또는 이로부터 분리된 활성성분을 포함하는 면역조절 또는 면역증강용 조성물(대한민국 등록특허 제10-2154147호), 알로에 꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 면역조절 활성을 갖는 조성물(대한민국 등록특허 제 10-1758338호), 코엔자임 큐텐과 오메가 ３의 복합제를 이용한 면역 조절용 조성물(대한민국 등록특허 제10-0905387호), 항염증 및 면역조절 활성을 가지는 매자나무유래 용매 추출물의 조성물(대한민국 등록특허 제10-0905387호), 고온스트레스에 의해 저하된 면역조절능력을 개선시키는 홍삼추출물 및 이의 제조방법(대한민국 등록특허 제10-2129005호) 등이 개시되었다.
본 발명에서 '귀뚜라미'라 함은 그 대표적인 쌍별귀뚜라미 성충을 포함하며, 귀뚜라미과(科)에 속하며 불완전 변태하는 곤충이다. 귀뚜라미는 세계적으로 약 800종이 알려져 있고, 한국에는 40종 정도가 알려져 있으며 쌍별귀뚜라미는 식품원료로 식품의약품안전처에서 인정하고 있다. 한의학에서는 귀뚜라미가 해열제, 이뇨제, 신경마비, 소변불통, 부인난산치료에 특효하다고 알려져 왔다.
갈색거저리는 딱정벌레목(目) 거저리과(科) 곤충의 일종이다. 갈색거저리는 한국을 비롯한 전 세계에 분포되어 있다. 갈색거저리 유충의 영양성분으로는 건조중량 대비 단백질 45~57%, 지방 25~34%, 탄수화물 8~11 % 정도로 높아 전 세계적으로 미래식량자원으로 주목 받고 있다. 최근 갈색거저리의 약리 효능 평가연구에서 항산화 활성, 다식세포의 항염증 효과, 암세포에 대한 독성 및 항암활성 증대 효과 등이 보고되어져 있다.
상황버섯(Phellinus linteus)에 함유된 활성성분은 폴리페놀, 베타글루칸 등이다. 항산화, 혈전용해활성, 면역증강, 항염증 효능이 있다. 오가피(Acanthopanax)은 리그난 화합물, 쿠마린 화합물, 페놀배당체, 플라보노이드 성분, 사포닌 성분 등이 함유하고 있다. 기력, 기억력, 노화억제, 면역력 등에 효능이 있다. 도라지(Platycodon grandiflorum)에는 사포닌, 칼슘, 섬유질, 철분, 무기질, 단백질, 비타민 등이 함유되어 있다. 항염증, 항알러지, 면역 반응, 당뇨, 고지혈증 및 항암 효과가 있다. 울금(Curcumd longa)에는 Curcumin, Turmerone, zingiberene, PTMC 등의 성분이 들어 있다. 항암, 항산화, 간염, 특히 만성 C형, 고혈압, 동맥경화, 항산화에 주목되는 약초이다.
이에 본 발명자들은 쌍별귀뚜라미, 상황버섯, 오가피, 도라지 및 울금이 갖는 다양한 생리활성을 연구하던 중, 쌍별귀뚜라미 효소 처리물, 갈색거저리 유충 효소 처리물 및 상기 이들 생약재 추출물의 혼합물이 면역조절하는 능력이 증가됨을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
대한민국 등록특허 제10-2154147호 (발명의 명칭 : 황칠나무 추출물 또는 이로부터 분리된 활성성분을 포함하는 면역조절 또는 면역증강용 조성물. 출원인 : 전남대학교산학협력단, 등록일 : 2020년09월03일) 대한민국 등록특허 제10-1758338호 (발명의 명칭 : 알로에 꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항염증 또는 면역조절 활성을 갖는 조성물. 출원인 : 건국대학교 글로컬산학협력단 주식회사 네이처텍, 등록일 : 2017년07월10일) 대한민국 등록특허 제10-2114519호 (발명의 명칭 : 코엔자임 큐텐과 오메가３의 복합제를 이용한 면역조절용 조성물. 출원인 : 우리들제약(주), 등록일 : 2020년05년18일) 대한민국 등록특허 제10-0905387호 (발명의 명칭 : 항염증 및 면역조절 활성을 가지는 매자나무유래 용매 추출물의 조성물. 출원인 : 강원대학교산학협력단, 등록일 : 2009년06월23일) 대한민국 등록특허 제10-2129005호 (발명의 명칭 : 고온스트레스에 의해 저하된 면역조절능력을 개선시키는 홍삼추출물 및 이의 제조방법. 출원인 : 고려인삼연구 주식회사, 등록일 : 2020년06년25일)
김성필 등. 면역 결핍 동물모델에서 잣피 추출물의 면역조절 효과, J Kor. Soc Food Sci Nutr. 46(9): 1027-1034, 2017. 이가원. 버섯 추출물의 체액성 및 세포매개 면역기능 조절, 전남대학교대학원석사학위논문, 2017. 윤지아 등. 솔잎 메탄올추출물의 마우스 경구투여에 의한 장관면역 활성 Kor. Soc Food Sci Nutr. 39(3); 356 - 362, 2010.
본 발명의 목적은 귀뚜라미의 가압증숙 및 효소처리물, 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소처리물, 상황버섯 추출물, 오가피 추출물, 도라지 추출물 및 울금 추출물의 최적 혼합 비율을 결정하여, 면역조절용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명은 귀뚜라미의 가압증숙 및 효소처리물, 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소처리물, 상황버섯 추출물, 오가피 추출물, 도라지 추출물 및 울금 추출물을 함유하는 면역조절용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 면역조절이란 면역증강 또는 항염증 기능을 뜻한다.
바람직하게는, 귀뚜라미의 가압증숙 및 효소처리물 10~30 중량%, 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소처리물 10~30 중량%, 상황버섯 추출물 5~20 중량%, 오가피 추출물 5~20 중량%, 도라지 추출물 2~20 중량% 및 울금 추출물 2~20 중량%를 포함할 수 있다.
상기 귀뚜라미의 가압증숙 및 효소처리물, 또는, 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소처리물은, 각각 귀뚜라미 또는 갈색거저리 유충을 마이크로파로 처리 후 수분함량이 5중량% 이하가 되도록 건조하는 단계; 500~700 kgf/cm2의 압력으로 착유하여 탈지된 귀뚜라미 또는 갈색거저리 유충을 얻고 이를 분쇄하여 분쇄물을 얻는 단계; 상기 분쇄물에 물을 첨가하고 가압증숙한 후 효소처리 하는 단계;를 통해 얻을 수 있다. 상기 마이크로파 처리 후 건조는 열풍건조를 수행하는 것이 좋다.
보다 바람직하게는, 상기 귀뚜라미의 가압증숙 및 효소처리물, 또는, 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소처리물은, 각각 귀뚜라미 또는 갈색거저리 유충을 105~120℃의 온도에서 50~60HZ 마이크로파로 5~10분간 처리 후 수분함량이 5중량%(바람직하게는 2~5중량%) 이하가 되도록 건조하는 단계; 500~700 kgf/cm2의 압력으로 10~30분간 착유하여 탈지된 귀뚜라미 또는 갈색거저리 유충을 얻는 단계; 50~60 mesh로 분쇄하여 분쇄물을 얻는 단계; 상기 분쇄물 100 중량부 기준으로 200~500 중량부의 물을 첨가하고 가압증숙한 후 효소처리 하는 단계;를 통해 얻을 수 있다.
이 때, 상기 귀뚜라미 또는 갈색거저리 유충 각각의 가압증숙시, 110~200℃의 온도로 0.5~8시간 처리하는 것이 바람직하다, 압력은 1.1~5.0 kgf/cm2의 압력으로 가압하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 1.2~2.0 kgf/cm2의 압력으로 가압하는 것이 더 바람직하다.
상기 귀뚜라미 또는 갈색거저리 유충 각각을 가압증숙 후에 효소처리시, 플락토맥스, 플라보자임, 알칼라아제, 프로테아제 및 알파아밀라제로 이루어진 군 중에서 선택되는 효소를 처리한 것일 수 있다. 각 효소처리 조건은 40~70℃에서 2~6시간인 것이 바람직하다.
상기 조성물에서, 상황버섯 추출물, 오가피 추출물, 도라지 추출물 및 울금 추출물은 각각의 원료인 상황버섯, 오가피, 도라지 및 울금을 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출한 후 얻은 액상을 분말화한 것일 수 있다.
또한 본 발명은 귀뚜라미의 가압증숙 및 효소처리물, 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소처리물, 상황버섯 추출물, 오가피 추출물, 도라지 추출물 및 울금 추출물을 함유하는 면역조절용 건강기능식품 조성물을 제공할 수 있다.
이에, 본 발명은 귀뚜라미의 가압증숙 및 효소처리물, 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소처리물, 상황버섯 추출물, 오가피 추출물, 도라지 추출물 및 울금 추출물을 함유하는 면역조절용 약학조성물을 제공할 수 있다.
상기 오가피는 가시오갈피나무, 왕가시오갈피나무, 오갈피나무, 지리산오갈피나무, 섬오갈피나무, 털오갈피나무, 서울오갈피나무 및 오가나무로부터 이루어진 군 중에서 1종 이상 선택될 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에서 원료가 되는 귀뚜라미는 7 내지 9령의 성충, 갈색거저리 유충은 5 내지 10령의 유충을 사용할 수 있다.
귀뚜라미 및 갈색거저리 유충은 105~120℃의 온도에서 50~60HZ 마이크로파로 5~10분간 처리 후 수분함량이 5중량%(바람직하게는 2~5중량%) 이하가 되도록 건조한다. 건조 이후 탈지과정은 착유기를 이용하며, 압력 500~700kgf/cm2 하에서 20 내지 40분간 착유하여 탈지된 귀뚜라미와 갈색거저리 유충을 입자의 크기가 50~70 mesh가 되도록 분쇄한 후 각 곤충 100 중량부 기준 200~400 중량부의 정제수를 첨가한 후 압력 1.1~1.5kgf/cm2 및 110~150℃에서 0.5~8시간 동안 가열하여 연화시킨다. 정제수 첨가시, 각 곤충 100 중량부 기준으로 정제수가 200 중량부 미만이면 이후의 효소처리 과정에서 효소가 과활성화 되어 단백분해 된 조성물의 품질이 저하될 수 있으며, 정제수가 400 중량부를 초과하게 되면 역시 이후의 효소처리 시 효소활성이 약해 단백분해가 잘되지 않을 수 있다.
상기 귀뚜라미와 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소 처리과정 중 가압증숙시, 110~200℃의 온도로 처리하는 것이 바람직하고, 110~150℃가 더 바람직하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 시간은 0.5~8시간, 1.5~8시간으로 하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 3~6시간이 좋지만 이에 한정되는 것은 아니다. 압력은 1.1~5.0kgf/cm2의 압력으로 가압하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 1.2~2.0kgf/cm2의 압력으로 가압하는 것이며, 더 바람직하게는 1.2~1.5kgf/cm2의 압력으로 가압하는 것이 바림직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 가열 조건은 연화과정에서 가열 온도가 110℃ 미만이면 연화 작용이 잘 일어나지 않을 수 있고, 가열 온도가 150℃를 초과하게 되면 단백질의 성상에 변화가 나타나 단백분해된 조성물의 품질이 저하될 수 있다. 마찬가지로 가열 시간이 0.5시간 미만이면 연화가 잘 안 될 수 있으며, 가열 시간이 8시간을 초과하게 되면 단백질의 성상에 변화가 일어날 수 있다.
상기의 귀뚜라미 또는 갈색거저리 유충 각각을 가압증숙 후에 효소처리시, 플라토멕스(protamax), 플라보자임(Flavozyme), 알칼라아제(Alcalase), 프로테아제(Protease), BAN(Bacterial Amylase Novo) 또는 알파-아밀라제(α-Amylase) 에서 선택되는 효소를 처리할 수 있으며, 이들 효소를 1차 처리는 또는 1차 처리 후 2차 처리할 수 있다. 이에, 상기 효소처리로서 플로타멕스를 1차 처리 후 알파-아밀라아제를 2차 처리하는 것이 바람직하다.
상기 효소는, 가압증숙 처리된 귀뚜라미 또는 갈색거저리 유충 분쇄물 각각 100 중량부 기준으로, 효소를 0.1~10 중량부 첨가하여 60~80℃, pH 7~8 조건에서 2~8시간 동안 처리한다. 이 후 95~100℃에서 20~40분간 효소활성을 실활시킨 다음 40~60℃가 되도록 온도를 내려면 1차 효소처리가 완료한다. 그 다음에 필요할 경우, 60~70℃, pH 7~8조건에서 가압증숙 처리된 귀뚜라미 또는 갈색거저리 유충 분쇄물 100 중량부 기준으로 효소를 0.1~10 중량부 첨가하여 5~12시간 동안 2차 효소처리 한 다음 95~100℃에서 20~40분간 효소활성을 실활시켜 2차 효소처리를 완료한다. 1차 또는 2차 효소처리가 완료된 것을 여과 또는 천으로 잔사를 걸러낸 다음 건조시킨다. 건조방법으로는 열풍건조, 스프레이 건조, 동결건조, 실온(20~30℃) 건조방법으로 수행할 수 있다.
효소 처리온도는 각 효소마다 차이가 있지만 40~80℃인 것이 좋다. 대부분의 효소는 80℃를 초과하면 실활된다.
귀뚜라미 또는 갈색거저리 유충 분말 100 중량부 기준으로 효소를 0.1 중량부 미만으로 첨가하게 되면 효소활성이 거의 나타나지 않을 수 있고, 10 중량부를 초과하여 첨가하게 되는 것은 효소 사용에 대한 비용 면에서 바람직하지 않고 효소의 작용이 과하게 되어 최종 단백분해된 산물의 물성이 더 나빠질 수 있다.
이 때 원료시료인 귀뚜라미 또는 갈색거저리 유충은 금식하여 배설물을 완전하게 배출시킨 것을 사용하며, 건조 후 탈지 및 분말화 공정을 거친 분말 상태로 정제수를 첨가한 후 가열하는 것이 바람직하다.
만약 건조되지 않은 생물 상태의 귀뚜라미 성충 및 갈색거저리 유충을 세척 후 정제수를 첨가한 뒤 가열하고, 가열 과정이 충분히 수행된 후에는 이를 식힌 후 귀뚜라미 성충 및 갈색거저리 유충을 분말화하고 효소 처리하여 가수분해과정을 수행할 수도 있다.
추출물의 원료인 상황버섯, 오갈피, 도라지 및 울금은 생것 상태로 건조하거나 또는 일정 시간 증자 또는 가열, 끓는 물에 데친 후 건조하여 분말 상태로 제조할 수 있다. 이 때 분말화 한 후 가열 또는 건조 가능한 온도는 70~100℃, 바람직한 가열 시간은 5~20분, 건조시간은 8~24시간인 것이 좋다. 건조는 열풍건조, 동결건조 등의 통상적인 건조방법을 통해 수행할 수 있다. 또한 제조된 상황버섯 분말, 오가피 분말, 도라지 분말 또는 울금 분말 100 중량부 기준으로 용매 500~2000 중량부를 첨가하고 20~100℃에서 1~24시간 동안 추출하고, 액상만을 취한 후 이를 농축 및 건조하여 각각의 추출물로 제조할 수 있다.
각 추출과정은 1~4번까지 반복할 수 있다.
상기 추출물 제조용 용매로서, 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있다. 상기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 추출물의 제조시 사용되는 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액은 원료 사용 중량 기준 1~40배 부피(1kg 기준 1~40ℓ) 또는 1~40배 중량을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~40배 부피 또는 중량을 사용할 수 있다. 추출용매로서 가장 바람직하게는 물을 사용하는 것이 좋다.
상기 추출물의 추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 이렇게 제조된 추출물은 열풍건조, 감압건조 또는 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다. 또한, 상기 추출물은 컬럼크로마토그래피를 이용하여 정제하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 귀뚜라미의 가압증숙 및 효소처리물, 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소처리물, 상황버섯 추출물, 오가피 추출물, 도라지 추출물 및 울금 추출물을 함유하는 면역조절용 약학 조성물을 제공한다. 상기 약학 조성물은, 각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현택액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로즈, 수쿠로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀루로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마스네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 칼트 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 매용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면, 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 들이 포함 될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에텔렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경도 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01mg/kg/일 내지 대략 2,000mg/kg/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1mg/kg/ 일 내지 500mg/kg/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수 있고, 수회 나누어 투여 할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 간 보호 및 숙취해소용 조성물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용 할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명은 귀뚜라미의 가압증숙 및 효소처리물, 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소처리물, 상황버섯 추출물, 오가피 추출물, 도라지 추출물 및 울금 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 면역조절용건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액체 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민복합제 등이 있다.
본 발명은 귀뚜라미의 가압증숙 및 효소처리물, 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소처리물, 상황버섯 추출물, 오가피 추출물, 도라지 추출물 및 울금 추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 상기 조성물은 염증반응인자로서의 종양괴사인자(TNF-α), 산화질소(nitric oxide, NO) 생성을 억제하고, 면역조절에 관여하는 대식세포(macrophage)의 기능을 조절하는 효과를 가지고 있어, 면역염증반응 질환의 예방 및 치료용 의약품 또는 이들 질환을 개선시키는데 유용한 건강기능식품으로 이용할 수 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명을 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화 될 수 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당 업계자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
제조예 1 및 2. 귀뚜라미 및 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소처리물의 제조
○ 귀뚜라미와 갈색거저리 유충의 탈지단계
전문 사육농가에서 크기 8령의 쌍별귀뚜라미 성충 및 9령의 갈색거저리 유충을 각각 구입하여 쌍별귀뚜라미는 1일간 및 갈색거저리 유충은 3일간 각각 금식시켜 배설물을 완전히 배출시킨 것을 생것 상태에서 흐르는 물로 3회 수세하였다. 이후 건조단계, 탈지단계, 분쇄단계, 고온/가압 단계, 효소가수분해단계 및 건조단계를 걸쳐 고온/가압, 효소처리물 제조를 완성한다. 이 중에서 건조단계, 탈지단계, 분쇄단계는 다음의 과정을 거쳐 수행하였다.
① 건조단계 : 50/60HZ의 주파수인 유전가열로 건조하는 산업용 마이크로파 건조기(KMD, Dalimeng. Korea)를 이용하여 105℃ 온도 상태로 5분 동안 처리한 다음 갈색거저리 유충의 수분 함량이 5% 이하가 되도록 건조온도 60℃ 온도에서 12시간 열풍건조기를 이용하여 건조하였다.
② 탈지단계 : 산업용 착유기(명진종합기계)를 이용하여 600 kgf/cm2의 압력을 가하면서 20분간 착유하여 탈지 상태의 곤충을 얻었다. 피착유물(시료량)은 2 kg, 피착유물(착유기내) 온도는 60℃이었다.
③ 분쇄단계 : 산업용 핀크래샤밀(거려산업)로 갈색거저리 유충 분말 입도가 50~60 mesh 가 되도록 분쇄하여 효소처리용 원료로 사용하였다.
○ 귀뚜라미 및 갈색거저리 유충의 가압증숙 처리
이 후, 상기의 쌍별귀뚜라미 탈지분말과 갈색거저리 유충 탈지분말을 증숙기에 넣은 다음 각 분말물 대비 3배 중량의 정제수를 첨가하여 온도 121℃ 및 압력 1.3kgf/cm2의 조건에서 3시간 동안 가압증숙 처리하였다.
○ 귀뚜라미 및 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소 처리물 제조
가압증숙 처리된 귀뚜라미와 갈색거저리 유충 분쇄물 각각 100g당 Protamax(Subtilisin Carlsberg, Novozymes) 1.0g을 첨가하여 pH 7.0 및 50℃ 조건에서 6시간 동안 단백질이 가수분해되는 1차 가수분해과정을 수행하였다. 이렇게 가수분해된 1차가수분해물에 α-Amylase(Subtilisin Carlsberg, Novozymes) 0.5g을 첨가하여 pH 7.0 및 70℃ 조건에서 6시간 동안 2차 가수분해과정을 수행하였다. 각각의 분해물을 전량을 여과한 후 건조시켜 다음과 같이 제조예 1 및 제조예 2의 효소처리물을 얻었다.
제조예 1 : 귀뚜라미의 가압증숙 및 효소처리물
제조예 2 : 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소 처리물
제조예 3 내지 6. 상황버섯 추출물, 오가피 추출물, 도라지 추출물 및 울금 추출물의 제조
상황버섯, 오가피, 도라지, 울금(경동시장, 서울, 제기동)을 구입하여 추출원료로 사용하였다. 각각의 추출원료에 10배 중량의 정제수를 넣고 90℃에서 12시간 추출 후 여과하여 얻은 액상을 30~35 brix로 농축하여 다음과 같이 제조예 3 내지 6의 추출물을 얻었다.
제조예 3 : 상황버섯 추출물
제조예 4 : 오가피 추출물
제조예 5 : 도라지 추출물
제조예 6 : 울금 추출물
실시예 1 내지 4. 혼합물 제조
제조예 1 내지 6에서 준비된 각 시료를 하기와 표 1과 같이 혼합하여 혼합물을 제조하였다.
조건 제조예 1
(g)		 제조예 2
(g)		 제조예 3
(g) 		제조예 4
(g) 		제조예 5
(g) 		제조예 6
(g)
실시예 1 20 30 20 10 10 10
실시예 2 20 20 15 20 15 10
실시예 3 30 10 15 15 20 10
실시예 4 10 30 15 10 15 20
실시예 5 25 25 5 20 5 20
실시예 6 25 25 20 5 20 5
비교제조예 1 및 2. 귀뚜라미 및 갈색거저리 유충의 상압 열탕 처리물 제조
제조예 1 및 2의 과정 중, 탈지 단계까지는 동일하게 수행한 후, 탈지된 쌍별귀뚜라미 분말과 갈색거저리 유충 분말 각각을 증숙기에 넣은 다음 3배 중량의 정제수를 첨가하여 상압(1기압)/온도 100℃(열탕) 조건에서 6시간 동안 가열처리하였고, 이 후 효소처리는 수행하지 않고, 건조하였으며, 이를 이후의 비교예용 원료 시료로 사용하였다.
비교제조예 1 : 귀뚜라미의 상압 열탕 처리물
비교제조예 2 : 갈색거저리 유충의 상압 열탕 처리물
비교제조예 3 및 4. 귀뚜라미 및 갈색거저리 유충의 가압 처리물 제조
제조예 1 및 2의 과정 중, 가압증숙단계까지만 수행한 후에 바로 건조를 하고, 이후의 효소처리단계를 수행하지 않았다.
비교제조예 3 : 귀뚜라미의 가압 숙성물
비교제조예 4 : 갈색거저리 유충의 가압 숙성물
비교제조예 5 및 6. 귀뚜라미 및 갈색거저리 유충의 상압 열탕처리 및 효소 처리물 제조
비교제조예 1 및 2의 귀뚜라미 및 갈색거저리 유충의 상압 열탕 처리물 각각에 제조예 1 및 2에서와 같은 방법으로 Protamax(Subtilisin Carlsberg, Novozymes)를 처리 후 이에 α-Amylase(Subtilisin Carlsberg, Novozymes) 처리 하였다.
비교제조예 5 : 귀뚜라미의 상압 열탕처리 및 효소처리물
비교제조예 6 : 갈색거저리 유충의 상압 열탕처리 및 효소처리물
비교예 1 내지 4. 비교대상 혼합물 제조
각 원료를 표 2 및 표 3과 같이 혼합하여 비교대상 혼합물을 제조하였다.
조건 제조예 1 (g) 제조예 2 (g) 비교
제조예 1 (g)		 비교
제조예 2 (g)		 비교
제조예 3 (g) 		비교
제조예 4 (g) 		비교
제조예 5 (g) 		비교
제조예 6 (g)
비교예 1 0 0 50 50 0 0 0 0
비교예 2 0 0 0 0 50 50 0 0
비교예 3 0 0 0 0 0 0 50 50
비교예 4 50 50 0 0 0 0 0 0
조건 제조예 1 (g) 제조예 2 (g) 제조예 3 (g) 제조예 4 (g) 제조예 5 (g) 제조예 6 (g)
비교예 5 0 30 30 0 40 0
비교예 6 5 5 25 30 5 30
비교예 7 0 0 25 25 25 25
비교예 8 40 0 15 15 15 15
실험예 1. 세포배양 조건
실험에 사용한 RAW 264.7(murine macrophage cell line) 세포, SC-1 세포 및 YAC-1 세포는 한국세포주은행(한국)에서 분양받아 사용하였다. RAW 264.7 세포와 SC-1세포는 10% Fetal bovine serum(FBS), 100U/㎖의 페니실린 및 100㎍/㎖의 penicillin-streptomycin 함유된 DMEM 배지를 사용하였고, YAC-1 세포는 10% fedal bovine serum 2 mmol/L glutamine, 100 mg/L, penicillin-streptomycin을 함유된 RPMI 1640을 이용하여 37℃, 5% CO2 배양기(비전과학, 한국)에서 2~3일 간격으로 계대 배양하였다. IL-2 의존성 NK 세포주인 NK92(humn NK lymphoma)는 ATCC(American Type Culture Collection) 로부터 구입하였다. NK92 세포는 20% FCS(HyClone, Logan, UF), 2mM L-글루타메이트, 100㎍/mL penicillin, 100㎍/mL streptomycin(Life Technologies)을 포함하고 100U/mL의 IL-2(Chiron, Emeryville, CA)가 첨가된 α-MEM(Life Technologies, Karlsruhe, Germany) 배지에서 유지하였다.
실험예 2. 세포에서의 탐식작용 활성 효과
RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1 x 106 cells/well씩 분주한 후 24시간 동안 배양시켜 Cytoselect 96 well phagocytosis assay kit(cell biolabs Inc., San Die해, CA, USA)를 이용하여 대식세포의 탐식능을 측정하였다. 본 발명에서는 대식세포를 활성화시켜 탐식능을 증가시키기 위해 kit에 포함된 zymosan 입자를 사용하였다. Zymosan을 첨가하고 시료를 200 ㎍/mL로 처리하여 15분간 배양하였다. 그 후 serum free DMEM으로 세척 후 fixation solution을 첨가하고 5분 동안 상온에 방치하였다. 모든 well을 Dulbecco's phosphate buffered saline(DPBS: Welgene, Daegu, Korea)으로 세척 후 1X blocking regent를 첨가하고 orbital shaker(Daihan Scintific Co., Ltd., Wonju, Korea)를 이용하여 60분 동안 방치하였다. 모든 well을 DPBS로 세척 후 1X permeabilization solution을 첨가하고 5분 동안 상온에 방치하였다. 모든 well을 SPBS로 세척 후 1X detection reagent를 첨가한 후 orbital shaker를 이용하여 60분 동안 방치하였다. 모든 well을 SPBS로 세척 후 detection buffer를 첨가하고 orbital shaker를 이용하여 10분 동안 방치 후 substrate를 첨가하고 10분 동안 배양하였다. ELISA reader(VERSAMAXSL-20, Molecular Devices)를 이용하여 흡광도 450 nm에서 측정하여 그 결과를 표 4에 나타내었다.
조건 Phagocytic activity (%)
zymosan 100.00±0.1
zymosan + 실시예 1 179.7±4.9
zymosan + 실시예 2 159.8±4.2
zymosan + 실시예 3 152.1±5.0
zymosan + 실시예 4 167.8±4.8
zymosan + 실시예 5 153.5±2.4
zymosan + 실시예 6 155.2±5.2
zymosan + 비교예 1 70.2±3.2
zymosan + 비교예 2 79.4±4.2
zymosan + 비교예 3 92.3±5.2
zymosan + 비교예 4 103.9±4.9
zymosan + 비교예 5 113.4±4.3
zymosan + 비교예 6 109.2±3.6
zymosan + 비교예 7 123.5±5.2
zymosan + 비교예 8 118.2±2.3
병원균이 인체에 침입하여 조직 내에서 복제를 시작하면 대식세포의 활성이 일어나 박테리아나 바이러스, 암세포 등을 인지하고 이에 탐식작용을 일으킨다.
표 4를 확인한 바, 탐식작용을 자극시키는 zymosan과 시료를 200 ㎍/mL로 각각 처리한 결과 실시예 1 내지 6에서 현저하게 증가되었다.
실험예 3. 산화질소(nitric oxide, NO)의 생성 정도
RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1 x 106 cells/well씩 분주한 후 24시간 동안 배양한 후에 시료 200 ㎍/mL을 30분간 전처리한 후, 0.1 ㎍/mL의 LPS(Sigma-Aldrich Co.)를 처리하고 24시간 배양한 후 상층액 50 μL와 동량의 Griess reagent((Sigma-Aldrich Co.)를 혼합하여 15분 후 ELISA reagent를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
조건 Nitric oxide (μM)
LPS 2.25±0.13
실시예 1 + LPS 0.48±0.15
실시예 2 + LPS 0.57±0.12
실시예 3 + LPS 0.67±0.23
실시예 4 + LPS 0.72±0.13
실시예 5 + LPS 0.62±0.22
실시예 6 + LPS 0.69±0.12
비교예 1 + LPS 2.02±0.21
비교예 2 + LPS 1.79±0.29
비교예 3 + LPS 1.52±0.20
비교예 4 + LPS 1.37±0.15
비교예 5 + LPS 1.35±0.22
비교예 6 + LPS 1.32±0.15
비교예 7 + LPS 1.42±0.05
비교예 8 + LPS 1.45±0.22
그 결과는 표 5와 같은데, LPS 처리는 염증반응을 일으켜 NO의 생성을 촉진하며, 과다하게 생성된 NO는 전신적 염증을 유발하여 생체에 여러 가지 부정적 영향을 미치기도 한다. 하지만 적정량의 NO의 생성은 오히려 선천성 면역의 중요한 인자로 여겨지고 있다. LPS와 시료를 200 ㎍/mL로 각각 처리한 결과 NO의 생성량은 실시예 1 내지 6에서 적절한 낮은 수치로 조절된 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물이 면역력 증가로 인한 항염 기능이 월등히 좋음을 알 수 있다.
실험예 4. TNF-α 생성 정도
RAW 264.7 세포를 96 well plate에 1 x 106 cells/well씩 분주한 후 24시간 동안 배양한 후에 시료 200 ㎍/mL로 전처리한 후 1 ㎍/mL의 LPS를 6시간 처리하고 얻어낸 상층액으로부터 RAW264.7 세포에서 생성되는 TNF-α의 량을 ELISA 방법( Endogen, Cambridge, MA)으로 측정하였다. 그 결과는 표 6에 나타내었다.
조건 TNF-α (pg/mL)
LPS 1675±23.4
실시예 1 + LPS 470.6±23.1
실시예 2 + LPS 578.2±55.4
실시예 3 + LPS 625.2±54.6
실시예 4 + LPS 580.2±45.4
실시예 5 + LPS 452.2±14.2
실시예 6 + LPS 534.4±24.1
비교예 1 + LPS 1489.2±42.2
비교예 2 + LPS 1484.8±42.3
비교예 3 + LPS 1478.0±45.9
비교예 4 + LPS 1390.3±45.2
비교예 5 + LPS 1042.4±14.5
비교예 6 + LPS 1131.2±22.2
비교예 7 + LPS 1021.3±13.3
비교예 8 + LPS 1023.5±14.4
표 6의 결과를 참고할 때, LPS 처리는 염증반응을 일으켜 TNF-α의 생성을 촉진하며, 과다하게 생성된 TNF-α는 전신적 염증을 유발하여 생체에 여러 가지 부정적 영향을 미치기도 한다. 하지만 적정량의 TNF-α의 생성은 오히려 선천성 면역의 중요한 인자로 여겨지고 있다. LPS와 시료를 200 ㎍/mL로 각각 처리한 결과 TNF-α의 생성량은 실시예 1 내지 6에서 적절한 낮은 수치로 조절된 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물이 면역력 증가로 인한 항염 기능이 월등히 좋음을 알 수 있다.
실험예 5. Natural killer(NK) 세포 활성 측정
BALB/c 마우스로부터 비장을 적출하여 마쇄한 후 10% fetal bovine serum, 2 mmol/L glutamine, 200 mg/L penicillin-streptomycin을 첨가한 RPMI 1640으로 세척한 후 red blood cell lysing buffer(Sigma-Aldrich Co.)로 적혈구를 용혈시켜 비장세포 부유액을 만들어 96 well plate에 각 well 당 1X103 cells/well씩 분주한 후 effector 세포로 이용하였다. Target 세포는 Yac-1 세포를 이용하였으며 effector 세포와 target 세포의 혼합비를 5:1로 조정하고 시료 100 ㎍/mL로 처리하였다. 37℃, 5% CO2 배양기(비전과학, 한국)에서 4시간 동안 배양한 후 유리된 lactate dehydrogenase(LDH)를 cytotox 96 non radioactive cytotoxicity assay kit(Promega Corporation, Madison, WI, USA)를 사용하였다. ELISA reader를 이용하여 흡광도 490 nm에서 측정하고 YAC-1 세포의 사멸정도를 NK cell activity (%)로 나타내었으며, 이에 대한 결과를 표 7에 나타내었다.
조건 NK cells activity (%)
실시예 1 58.3±1.2
실시예 2 32.7±1.8
실시예 3 38.6±1.8
실시예 4 42.5±2.0
실시예 5 43.2±1.3
실시예 6 45.3±0.8
비교예 1 19.8±1.4
비교예 2 20.1±1.5
비교예 3 23.8±2.4
비교예 4 25.0±1.9
비교예 5 15.2±1.2
비교예 6 21.2±0.8
비교예 7 22.3±0.7
비교예 8 20.1±1.2
정상적인 면역계의 상태에서는 병원균이 세포에 들어가기 전에 대식세포의 탐식작용에 의하여 제거되거나 NK 세포의 감염된 세포를 인지하여 사멸시키는 반응이 일어난다.
표 7의 결과를 확인한 바, 본 발명에서 YAC-1 세포의 사멸 정도를 측정함으로써 NK 세포의 활성을 평가할 때, 실시예 1 내지 6에서 월등히 증가됨을 알 수 있다.

Claims (5)

  1. 귀뚜라미의 가압증숙 및 효소처리물 10~30 중량%, 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소처리물 10~30 중량%, 상황버섯 추출물 5~20 중량%, 오가피 추출물 5~20 중량%, 도라지 추출물 2~20 중량% 및 울금 추출물 2~20 중량%를 함유하는 조성물로서,
    상기 귀뚜라미 가압증숙 및 효소처리물, 또는 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소처리물은, 각각 귀뚜라미 또는 갈색거저리 유충을 105~120℃의 온도에서 50~60HZ 마이크로파로 5~10분간 처리후 수분함량이 5중량% 이하가 되도록 건조하는 단계; 500~700 kgf/cm2의 압력으로 착유하여 탈지된 귀뚜라미 또는 갈색거저리 유충을 얻고 이를 분쇄하여 분쇄물을 제조하는 단계; 상기 분쇄물 100 중량부 기준으로 물을 200~500 중량부 첨가하고, 110~200℃의 온도로 0.5~8시간 동안 1.2~2.0 kgf/cm2의 압력 조건으로 가압증숙한 후 플로타멕스를 이용하여 40~70℃에서 2~6시간 동안 1차 가수분해과정을 수행하고 이후 알파-아밀라아제를 이용하여 40~70℃에서 2~6시간 동안 2차 가수분해과정을 수행하여 효소처리 하는 단계;를 통해 얻는 것이고,
    상기 조성물이 NK(Natural killer) 세포의 활성 및 대식세포의 탐식작용을 증강시키는 기능이 있는 것을 특징으로 하는 면역조절 및 면역증강용 조성물.
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  5. 귀뚜라미의 가압증숙 및 효소처리물 10~30 중량%, 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소처리물 10~30 중량%, 상황버섯 추출물 5~20 중량%, 오가피 추출물 5~20 중량%, 도라지 추출물 2~20 중량% 및 울금 추출물 2~20 중량%를 함유하는 조성물로서,
    상기 귀뚜라미 가압증숙 및 효소처리물, 또는 갈색거저리 유충의 가압증숙 및 효소처리물은, 각각 귀뚜라미 또는 갈색거저리 유충을 105~120℃의 온도에서 50~60HZ 마이크로파로 5~10분간 처리후 수분함량이 5중량% 이하가 되도록 건조하는 단계; 500~700 kgf/cm2의 압력으로 착유하여 탈지된 귀뚜라미 또는 갈색거저리 유충을 얻고 이를 분쇄하여 분쇄물을 제조하는 단계; 상기 분쇄물 100 중량부 기준으로 물을 200~500 중량부 첨가하고, 110~200℃의 온도로 0.5~8시간 동안 1.2~2.0 kgf/cm2의 압력 조건으로 가압증숙한 후 플로타멕스를 이용하여 40~70℃에서 2~6시간 동안 1차 가수분해과정을 수행하고 이후 알파-아밀라아제를 이용하여 40~70℃에서 2~6시간 동안 2차 가수분해과정을 수행하여 효소처리 하는 단계;를 통해 얻는 것이고,
    상기 조성물이 NK(Natural killer) 세포의 활성 및 대식세포의 탐식작용을 증강시키는 기능이 있는 것을 특징으로 하는 면역조절 및 면역증강용 건강기능식품.
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