KR20230047936A - 유도만능줄기세포 배양 배지 유래 성분을 포함하는 조성물 내지 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 배양 배지의 상층액 유래 성분을 포함하는 신경세포 손상 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.
본 발명의 엑소좀은 유도만능줄기세포로의 배양 배지에서 분리되어 신경세포 손상을 개선 내지 피부를 재생시킬 수 있으므로 신경세포 손상 관련 질환, 특히 코로나 바이러스 감염으로 인한 미각 내지 후각이상이나 알츠하이머 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 내지 피부 재생용 조성물로서 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 엑소좀은 유도만능줄기세포로의 배양 배지에서 분리되어 신경세포 손상을 개선 내지 피부를 재생시킬 수 있으므로 신경세포 손상 관련 질환, 특히 코로나 바이러스 감염으로 인한 미각 내지 후각이상이나 알츠하이머 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 내지 피부 재생용 조성물로서 효과적으로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 배양 배지의 상층액 유래 성분을 포함하는 신경세포 손상 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대한 것이다.
세포외소포체(Extracellular vesicle; EV)는 원핵생물, 고등 진핵생물 또는 식물 등 다양한 세포에서 분비되는 나노사이즈의 지질 이중층(lipid-bilayer)으로 둘러싸인 소포체이다. 세포외소포체는 세포 내 DNA, RNA, 단백질 또는 지방 등의 운반을 통한 세포 사이의 상호작용을 담당한다.
최근 약물 개발을 위해 세포외소포체를 임상적으로 응용하고자 하는 연구가 진행되고 있다. 특히, 인간 세포 배양과정에서 수득한 세포외소포체가 질병 치료를 위해 광범위하게 사용되고 있다. 그러나 세포외소포체가 in vivo에서 치료 활성을 나타내기 위해서는 많은 양이 요구된다. 따라서 새로운 세포외소포체 출처 내지 분리방법이 필요한 실정이다.
엑소좀은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭이다. 엑소좀의 직경은 대략 30-100 nm 인 것으로 보고되어 있다. 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies)라고 불리는 세포 내 특정 구획에서 기원하며 세포 밖으로 방출, 분비되는 것이 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 부른다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포, 줄기세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려졌다. 특히, 줄기세포에서 유래된 엑소좀은 수용체 및 단백질뿐 아니라 핵 성분을 함유하고 있어 세포 간 커뮤니케이션 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 줄기세포에서 유래된 엑소좀은 줄기세포에 비해 동물 혈청을 상대적으로 적게 함유하고 있어 동물 혈청 감염에 의한 증상(zoonosis)의 위험성 역시 배재할 수 있다.
이에 본 발명자는 새로운 출처에서 분리한 엑소좀 내지 이의 치료 효과를 제공하기위하여 예의 노력한 결과, 유도만능줄기세포(iPSC) 배양 배지의 상층액에서 분리한 엑소좀의 경우 신경세포 손상을 개선 또는 피부 재생 효과가 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 배양 배지의 상층액 유래 성분을 포함하는 신경세포 손상 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 배양 배지의 상층액 유래 성분을 포함하는 피부 재생용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 배양 배지의 상층액 유래 성분을 포함하는 신경세포 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유도만능줄기세포는 이형접합 또는 동형접합인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유도만능줄기세포는 분화 전 유도만능줄기세포 또는 유도만능줄기세포에서 분화된 세포인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유도만능줄기세포에서 분화된 세포는 피질 신경 줄기세포(cortical neural stem cell)인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 상층액 유래 성분은 유도만능줄기세포에서 분비된 분비단백체(secretome) 인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 분비단백체는 엑소좀(exosome)인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 신경세포 손상 질환은 미각이상, 후각이상, 파킨슨씨병, 알츠하이머, 피크병(Pick's disease), 헌팅턴병 (Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(amyotriophic lateral sclerosis), 허혈성 뇌질환(stroke), 탈 수초질환(demyelinating disease), 다발성 경화증, 간질, 퇴행성 신경질환 및 척추 손상(spinal cord injury) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 미각이상 또는 후각이상은 코로나 바이러스 감염에 의한 미각이상 또는 후각이상인 것이다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 스프레이, 가글 또는 주사제 제형인 것이다.
또한, 본 발명은 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 배양 배지의 상층액 유래 성분을 포함하는 신경세포 손상 개선용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 스프레이, 가글 또는 주사제 제형인 것이다.
또한, 본 발명은 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 배양 배지의 상층액 유래 성분을 포함하는 피부 재생용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 스프레이 제형인 것이다.
또한, 본 발명은 i) 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)를 계대배양 하는 단계;
ii) 상기 계대배양한 iPSC 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
iii) 상기 수득한 상등액을 시린지 필터(syringe filter)로 필터링 하는 단계;
iv) 상기 필터링된 상등액을 동결건조 또는 한외여과(ultrafiltration)하여 농축하는 단계; 및
v) 크기배제크로마토그래피(size exclusion chromatography) 또는 초원심분리(ultracentrifugation)를 이용하여 상기 농축된 시료에서 분비단백체를 분리하는 단계;
를 포함하는 유도만능줄기세포 유래 분비단백체의 분리방법을 제공한다.
본 발명의 유도만능줄기세포의 배양 배지에서 분리된 성분들은 신경세포 손상을 개선 내지 피부를 재생시킬 수 있으므로 신경세포 손상 관련 질환, 특히 코로나 바이러스 감염으로 인한 미각 내지 후각이상이나 알츠하이머 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 내지 피부 재생용 조성물로서 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 유도만능줄기세포(iPSC) 또는 iPSC 유래 신경 줄기세포(iPSC-derived neural stem cell)의 배양 배지에서 분리된 엑소좀의 치료적 효과를 나타낸다.
도 2는 유도만능줄기세포(iPSC)를 2일 또는 4일동안 계대배양한 결과를 나타낸다.
도 3은 유도만능줄기세포(iPSC)를 확대배양하여 엑소좀을 분리하는 과정을 나타낸다.
도 4는 유도만능줄기세포(iPSC)에서 엑소좀을 분리하는 과정을 나타낸다. 엑소좀은 iPSC 배양 배지 유래 성분을 동결건조(lyophilization) 하거나 한외여과(ultrafiltration)하여 분리될 수 있다.
도 5는 유도만능줄기세포(iPSC) 배양 배지의 상층액을 원심분리한 결과를 나타낸다. 원심분리된 유도만능줄기세포(iPSC) 배양 배지의 상층액을 컬럼을 통하여 총 33개의 fraction 으로 용출되었다.
도 6은 세포외소포체(EV)가 포함된 fraction들을 모아 엑소좀 입자를 NTA(Nanoparticle tracking analysis) 로 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 분리된 엑소좀이 9.4 X 107 particles/ml 농도로 분리된 것을 나타낸다.
도 8은 유도만능줄기세포(iPSC)가 신경세포로 분화하는 과정을 나타낸다. iPSC는 분화 24일 후 Tbr2+마커를 가지고 있는 피질 신경 줄기세포로 분화할 수 있고, 피질 신경 줄기세포는 이후 성숙한 피질 신경세포로 분화할 수 있다.
도 9는 유도만능줄기세포(iPSC)를 이용한 피질 신경 줄기세포의 분화 및 엑소좀 분리 과정을 나타낸다. 배양액을 동결건조함으로써 분비단백체를 수득할 수 있다.
도 10은 본 발명의 분비단백체를 이용한 알츠하이머 치료제의 개념을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 유도만능 줄기세포 유래 시크리톰(iPSC-Sec) 및 세포외 소포체(EVs)의 in vivo 유효성을 평가하고자 제조한 마우스 모델 제조단계 및 인지능력 평가 단계를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 유도만능 줄기세포 유래 시크리톰(iPSC-Sec) 및 세포외 소포체(EVs)를 투여한 마우스 모델들의 반즈 미로(Barnes Mazes) 실험 결과를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 유도만능 줄기세포 유래 시크리톰(iPSC-Sec) 및 세포외 소포체(EVs)를 투여한 마우스 모델들의 몸무게 변화를 나타낸다.
도 14는 본 발명의 유도만능 줄기세포 유래 시크리톰(iPSC-Sec) 및 세포외 소포체(EVs)를 투여한 마우스 모델들의 아밀로이드 베타 42(Amyloid beta 42)의 농도 변화를 나타낸다.
도 15는 본 발명의 유도만능 줄기세포 유래 시크리톰(iPSC-Sec) 및 세포외 소포체(EVs)를 투여한 마우스 모델들의 NF-L 농도를 나타낸다.
도 16은 본 발명의 유도만능 줄기세포 유래 시크리톰(iPSC-Sec) 및 세포외 소포체(EVs)를 투여한 마우스 모델들의 뇌조직을 티오플라빈 S(Thioflavin S)으로 염색한 결과를 나타낸다(그룹 1: G1, 그룹 2: G2, 그룹 3: G3, 그룹 4: G4, 그룹 5: G5, 그룹 6: G6, 그룹 7: G7, 그룹 8: G8, 그룹 9: G9, 그룹 10: G10).
도 2는 유도만능줄기세포(iPSC)를 2일 또는 4일동안 계대배양한 결과를 나타낸다.
도 3은 유도만능줄기세포(iPSC)를 확대배양하여 엑소좀을 분리하는 과정을 나타낸다.
도 4는 유도만능줄기세포(iPSC)에서 엑소좀을 분리하는 과정을 나타낸다. 엑소좀은 iPSC 배양 배지 유래 성분을 동결건조(lyophilization) 하거나 한외여과(ultrafiltration)하여 분리될 수 있다.
도 5는 유도만능줄기세포(iPSC) 배양 배지의 상층액을 원심분리한 결과를 나타낸다. 원심분리된 유도만능줄기세포(iPSC) 배양 배지의 상층액을 컬럼을 통하여 총 33개의 fraction 으로 용출되었다.
도 6은 세포외소포체(EV)가 포함된 fraction들을 모아 엑소좀 입자를 NTA(Nanoparticle tracking analysis) 로 측정한 결과를 나타낸다.
도 7은 분리된 엑소좀이 9.4 X 107 particles/ml 농도로 분리된 것을 나타낸다.
도 8은 유도만능줄기세포(iPSC)가 신경세포로 분화하는 과정을 나타낸다. iPSC는 분화 24일 후 Tbr2+마커를 가지고 있는 피질 신경 줄기세포로 분화할 수 있고, 피질 신경 줄기세포는 이후 성숙한 피질 신경세포로 분화할 수 있다.
도 9는 유도만능줄기세포(iPSC)를 이용한 피질 신경 줄기세포의 분화 및 엑소좀 분리 과정을 나타낸다. 배양액을 동결건조함으로써 분비단백체를 수득할 수 있다.
도 10은 본 발명의 분비단백체를 이용한 알츠하이머 치료제의 개념을 나타낸다.
도 11은 본 발명의 유도만능 줄기세포 유래 시크리톰(iPSC-Sec) 및 세포외 소포체(EVs)의 in vivo 유효성을 평가하고자 제조한 마우스 모델 제조단계 및 인지능력 평가 단계를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 유도만능 줄기세포 유래 시크리톰(iPSC-Sec) 및 세포외 소포체(EVs)를 투여한 마우스 모델들의 반즈 미로(Barnes Mazes) 실험 결과를 나타낸다.
도 13은 본 발명의 유도만능 줄기세포 유래 시크리톰(iPSC-Sec) 및 세포외 소포체(EVs)를 투여한 마우스 모델들의 몸무게 변화를 나타낸다.
도 14는 본 발명의 유도만능 줄기세포 유래 시크리톰(iPSC-Sec) 및 세포외 소포체(EVs)를 투여한 마우스 모델들의 아밀로이드 베타 42(Amyloid beta 42)의 농도 변화를 나타낸다.
도 15는 본 발명의 유도만능 줄기세포 유래 시크리톰(iPSC-Sec) 및 세포외 소포체(EVs)를 투여한 마우스 모델들의 NF-L 농도를 나타낸다.
도 16은 본 발명의 유도만능 줄기세포 유래 시크리톰(iPSC-Sec) 및 세포외 소포체(EVs)를 투여한 마우스 모델들의 뇌조직을 티오플라빈 S(Thioflavin S)으로 염색한 결과를 나타낸다(그룹 1: G1, 그룹 2: G2, 그룹 3: G3, 그룹 4: G4, 그룹 5: G5, 그룹 6: G6, 그룹 7: G7, 그룹 8: G8, 그룹 9: G9, 그룹 10: G10).
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 '예방'이란, 본 발명의 iPSC 배양 배지의 상층액 유래 성분으로 인해 신경세포 손상 관련 질환이 억제되거나 그 발병이 지연되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 '개선' 또는 '치료'란, 본 발명의 iPSC 배양 배지의 상층액 유래 성분으로 인해 신경세포 손상 관련 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도가 호전되거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 엑소좀(exosome)은 세포 증식, 상처 치료, 항세포사멸 또는 항염증 효과를 제공할 수 있으며, 약물전달 수단 또는 새로운 iPSC 유도 수단으로서 활용될 수 있다.
본 발명의 엑소좀 분리시, 동결건조(lyophilization) 하거나 한외여과(ultrafiltration) 하는 경우의 장단점은 하기 [표 1] 과 같다.
| 동결건조(lyophilization) | 한외여과(ultrafiltration) | |
| 장점 | 대량 가능 비용 저렴 장기 보관 가능(파우더) |
빠름 사용하기 쉬움 즉시 처리 가능 |
| 단점 | 동결건조하는 동안 엑소좀 손상 가능 전처리 과정이 오래걸림 | 대량 처리를 위해서는 비용이 비쌈 필터막의 손실 농축하는 동안 엑소좀 손상 가능 |
상기 엑소좀을 포함하는 스프레이 제제는 코로 분사하여 후각상피(olfactory epithelium)를 통하여 약물이 뇌쪽으로 통과하게 한다.
후각상피는 후각신경세포(olfactory nerve cell)를 포함하고 있어 혈액뇌관문(blood brain barrier; BBB)을 통과할 수 있으며 뇌나 뇌척수액(cerebrospinal fluid; CSF)에 직접적으로 약물을 전달할 수 있는 통로가 된다.
피질 신경 줄기세포(Cortical neural stem cell)의 분비단백체(secretome)나 엑소좀은 신경세포 관련 단백질이나 miRNA를 다량 포함할 것으로 예측이 되며 이를 코에서 뇌 쪽으로 직접 전달함으로써 약물이 BBB를 통과하지 못하는 기존 약물 전달방식의 단점을 보완할 수 있다.
따라서, 본 발명은 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 배양 배지의 상층액 유래 성분을 포함하는 신경세포 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유도만능줄기세포는 이형접합 또는 동형접합인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유도만능줄기세포는 분화 전 유도만능줄기세포 또는 유도만능줄기세포에서 분화된 세포인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 유도만능줄기세포에서 분화된 세포는 피질 신경 줄기세포(cortical neural stem cell)인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 상층액 유래 성분은 유도만능줄기세포에서 분비된 분비단백체(secretome)를 포함하여 유도만능줄기세포를 배양한 배지의 상층액에 포함되어 있는 성분이라면 모두 포함하는 개념일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 분비단백체는 엑소좀(exosome)인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 신경세포 손상 질환은 미각이상, 후각이상, 파킨슨씨병, 알츠하이머, 피크병(Pick's disease), 헌팅턴병 (Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(amyotriophic lateral sclerosis), 허혈성 뇌질환(stroke), 탈 수초질환(demyelinating disease), 다발성 경화증, 간질, 퇴행성 신경질환 및 척추 손상(spinal cord injury) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 미각이상 또는 후각이상은 코로나 바이러스 감염에 의한 미각이상 또는 후각이상인 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 스프레이, 가글 또는 주사제 제형인 것일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제형화할 경우에는 하나 이상의 완충제(예를 들어, 식염수 또는 PBS), 항산화제, 정균제, 킬레이트화제(예를 들어, EDTA 또는 글루타치온), 충진제, 증량제, 결합제, 아쥬반트(예를 들어, 알루미늄 하이드록사이드), 현탁제, 농후제 습윤제, 붕해제 또는 계면활성제, 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부외용; 복강내, 직장, 정맥, 근육, 피하 또는 뇌혈관내 주사하는 주사제; 경피 투여제; 또는 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법에 따라 제형화할 수 있다.
상기 주사제의 경우에는 반드시 멸균되어야 하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염으로부터 보호되어야 한다. 주사제의 경우 적합한 담체의 예로는 이에 한정되지는 않으나, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 혼합물 및/또는 식물유를 포함하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 보다 바람직하게는, 적합한 담체로는 행크스 용액, 링거 용액, 트리에탄올 아민이 함유된 PBS (phosphate buffered saline) 또는 주사용 멸균수, 10% 에탄올, 40% 프로필렌 글리콜 및 5% 덱스트로즈와 같은 등장 용액 등을 사용할 수 있다. 상기 주사제를 미생물 오염으로부터 보호하기 위해서는 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르빈산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 주사제는 대부분의 경우 당 또는 나트륨 클로라이드와 같은 등장화제를 추가로 포함할 수 있다.
경피 투여제의 경우 연고제, 크림제, 로션제, 겔제, 외용액제, 파스타제, 리니멘트제, 에어롤제 등의 형태가 포함된다. 상기에서 경피 투여는 약학적 조성물을 국소적으로 피부에 투여하여 약학적 조성물에 함유된 유효한 양의 활성성분이 피부 내로 전달되는 것을 의미한다.
흡입 투여제의 경우, 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
또한, 본 발명은 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 배양 배지의 상층액 유래 성분을 포함하는 신경세포 손상 개선용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 스프레이, 가글 또는 주사제 제형인 것일 수 있다.
상기 스프레이 제형은 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
상기 가글 제형은 치약, 구강 스프레이, 구강 연고, 구강 세정제 또는 구강 청정제 등 가글링할 수 있는 제품으로서 해당 기술분야에 통상적으로 사용되는 가글 제형을 모두 포함할 수 있다.
상기 주사제 제형은 상기 약학적 조성물의 제형에서 사용되는 개념과 동일하므로 설명은 그 기재로 대신한다.
또한, 본 발명은 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 배양 배지의 상층액 유래 성분을 포함하는 피부 재생용 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 조성물은 스프레이 제형인 것일 수 있다.
상기 스프레이 제형은 본 발명에 따라 사용되는 화합물은 적합한 추진제, 예를 들면, 디클로로플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 다른 적합한 기체를 사용하여, 가압 팩 또는 연무기로부터 에어로졸 스프레이 형태로 편리하게 전달 할 수 있다. 가압 에어로졸의 경우, 투약 단위는 계량된 양을 전달하는 밸브를 제공하여 결정할 수 있다. 예를 들면, 흡입기 또는 취입기에 사용되는 젤라틴 캡슐 및 카트리지는 화합물, 및 락토즈 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화할 수 있다.
또한, 본 발명은 i) 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)를 계대배양 하는 단계;
ii) 상기 계대배양한 iPSC 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
iii) 상기 수득한 상등액을 시린지 필터(syringe filter)로 필터링 하는 단계;
iv) 상기 필터링된 상등액을 동결건조 또는 한외여과(ultrafiltration)하여 농축하는 단계; 및
v) 크기배제크로마토그래피(size exclusion chromatography) 또는 초원심분리(ultracentrifugation)를 이용하여 상기 농축된 시료에서 분비단백체를 분리하는 단계;
를 포함하는 유도만능줄기세포 유래 분비단백체의 분리방법을 제공할 수 있다.
상기 단계 v)의 분리는 해당 기술분야의 통상의 기술자가 농축된 시료에서 분비단백체를 분리하는데 사용하는 방법을 사용하는 분리를 모두 포함할 수 있으나, 바람직하게는 크기배제크로마토그래피(size exclusion chromatography) 또는 초원심분리(ultracentrifugation)를 이용하는 분리를 의미하는 것일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석하지 않는 것은 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명한 것이다.
유도만능줄기세포 계대배양 및 엑소좀 분리
유도만능줄기세포(iPSC)를 비트로넥틴(vitronectin)으로 코팅된 디쉬에 배양하고 10% CO2 상태의 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션 하였다. 매일 Fresh Essential 8 (E8) medium 6ml으로 갈아주고 iPSCs가 70% 차게 되면 계대배양 하였다. 계대배양시 trypsin-EDTA (TE)를 사용하고 10μM rho-associated kinase (ROCK) inhibitor를 medium에 넣어서 사용하였다. 시딩 후 4일 째 배양액을 모두 수집하고, Cell debris 를 제거하기 위해 3,000 x g, 15 분, 4℃에서 원심분리 하였다. 원심분리 후 상등액을 새로운 conical tube에 옮겨 0.2 mm syringe filter를 이용하여 배양액을 filter 해주었다. 배양액을 동결건조 하거나 한외여과(Ultrafiltration; 4,500 x g, 30 min, 4 ℃)하여 농축한 뒤 컬럼을 이용하여 엑소좀을 분리하였다.
엑소좀 분리는, 크기배제크로마토그래피(size exclusion chromatography; SEC)를 상온에서 두고 10 mL의 DPBS를 이용하여 평형화(equilibration)한 후 농축된 시료 (0.5-1 mL)를 크기배제크로마토그래피에 넣었다. 농축된 시료가 컬럼 내로 모두 들어가면 DPBS를 넣어 용출하였다. 용출된 시료는 1 fraction 당 0.5 mL으로 총 33개의 fraction을 얻었다. 모든 fraction을 얻어내면 2mL 0.5 M NaOH를 이용하여 CIP(Cleaning in place)를 진행한 후, 컬럼을 다시 DPBS를 이용하여 남아있던 NaOH 를 제거하였다. 분리 정제된 엑소좀의 입자수는 NTA 기기를 이용하여 입자 수를 측정하였고, ELISA를 통하여 농도를 측정하였다.
유도만능줄기세포에서 피질 신경세포로 분화
동결된 iPSC를 해동 후 확대배양(expansion) 하였다. iPSC가 70% 차게 되면 gentle cell dissociation을 이용하여 세포를 해리하였다. 라미닌(Laminin)이 코팅되어 있는 디쉬에 시딩한 후 Compound C와 SB431542가 포함된 배양액으로 10일동안 매일 갈아주었다. 배양액은 N2 배양액과 B27 배양액을 1:1 로 섞어 만들었다. 그 결과 Neuron progenitor cell(NPC)로 분화할 수 있었다. 라미닌이 코팅되어있는 디쉬에 NPC를 스플릿하여 시딩한 후 이틀에 한번 배양액을 8일 동안 갈아주었다. 분화 16일 및 17일에 FGF2를 넣어주었다. 그 결과 Neural stem cell(NSC)로 분화할 수 있었다. 라미닌이 코팅되어 있는 디쉬에 NSC를 스플릿하여 시딩한 후 이틀에 한번 배양액을 6일 동안 갈아준다. 결과 Cortical neural stem cell로 분화할 수 있었다. 분화 후 배양액을 수집하여 동결건조하여 분비단백체(secretome)를 얻거나 엑소좀을 분리할 수 있다.
In vivo 유효성 평가
상기 <실시예 1> 에서 분리한 유도만능 줄기세포 유래 시크리톰(Secretome, iPSC-Sec) 및 세포외 소포체(EV, EVs)의 in vivo 유효성을 평가하고자 하였다.
알츠하이머 동물모델로서 human APP 및 PSEN1 transgene 을 발현하는 13주령 5xFAD mice에 유도만능 줄기세포 유래 시크리톰 또는 EV 를 4주 동안 비강 내 투여(intra nasal)하였다(도 11). 구체적인 조건은 하기 [표 2]와 같다.
| 실험군 | 설명 | 방법 |
| 그룹 1 | 알츠하이머(AD) | D.W 25㎕ |
| 그룹 2 | iPSC-Sec 5㎍/g | 25 ㎕ 내에 동결건조된 iPSC-Sec 를 농도에 맞추어 D.W에 녹여 사용, 1주에 1번, 4주간 투여 |
| 그룹 3 | iPSC-Sec 10㎍/g | 25 ㎕ 내에 동결건조된 iPSC-Sec 를 농도에 맞추어 D.W에 녹여 사용, 1주에 1번, 4주간 투여 |
| 그룹 4 | iPSC-Sec 50㎍/g | 25 ㎕ 내에 동결건조된 iPSC-Sec 를 농도에 맞추어 D.W에 녹여 사용, 1주에 1번, 4주간 투여 |
| 그룹 5 | EVs 5.00E+05 | EV 를 5x105 particles/마리 in 25 ㎕, 1주에 1번, 4주간 투여 |
| 그룹 6 | EVs 5.00E+07 | EV 를 5x107 particles/마리 in 25 ㎕, 1주에 1번, 4주간 투여 |
| 그룹 7 | Media Only 50㎍/g | iPSC-Sec 의 최고 농도인 50㎍/g 에 해당하는 미디어만 동결시킨 파우더를 D.W에 녹여 사용 |
| 그룹 8 | F. PBS | EV 처리의 control 군이 되는 Filter PBS 25㎕ |
| 그룹 9 | 도네페질(Donepezil) | 알츠하이머 약물의 positive 약물인 Donepezil을 1주에 3번 복강투여(i.p.)함. |
| 그룹 10 | Wilde type | 질환 모델에 대한 healthy control |
<3-1> 인지능력 평가
마우스가 17주령이 되었을때 인지 개선 능력을 측정할 수 있는 Barnes Maze를 실시하였다. Barnes Mazes는 하루에 한번 pre-maze를 이틀 동안 실시하였고, 3일 째 본 maze를 실시하여 마우스의 동선 및 시간을 측정하였다. 먹이가 있는 Target으로 처음으로 찾아들어가는데까지 걸리는 시간을 latency로 보고 측정하였다(도 11).
AD 군에 비해 media only 군(그룹 7)이 증가되는 양상이나 시크리톰이 함유된 iPSC-Sec 군이 latency 가 다소 감소됨을 확인하였다. EV 처리 군의 질환 모델인 F. PBS 군(그룹 8)에 비해 EV 처리 군이 latency 가 다소 감소됨을 확인하였다. 먹이가 있는 target distance 의 경우도 같은 양상을 보였다. 타겟 존 내의 speed를 보았을때 알츠하이머 모델에 F.PBS(그룹 8)를 처리한 군에 비해 EV를 처리한 군이 speed가 다소 올라감을 확인하였다(도 12).
<3-2> 마우스 몸무게 측정
마우스 군의 몸무게를 주마다 측정하였을때 16주까지 약물에 의한 차이는 유의성 있게 차이나는 것은 확인 되지 않았다(도 13).
<3-3> 아밀로이드 베타 및 NFL 농도 측정
각 그룹에서 3마리씩 뇌를 homogenation 시켜서 amyloid beta 42 및 NF-L(neurofilament light chain) 에 대한 ELISA를 진행하였다. Amyloid beta 42의 경우 알츠하이머 질환에 뇌 부분에 많이 축적이 된다고 알려져 있다. NF-L은 알츠하이머 환자의 CSF에서 증가한다고 알려져 있다.
Amyloid beta 42 Mouse ELISA Kit(invitrogen, # KMB3441)을 사용하였으며 제조사의 프로토콜대로 시행하였다. 단백질 총량을 측정할 수 있는 BCA assay를 통하여 측정된 amyloid beta 42의 양을 normalization 하였다. 알츠하이머 초기 모델로서 5xFAD 마우스 13주령에서부터 주입하여 17주령 시 희생하여 마우스 뇌를 적출하여 얻은 데이터이다.
Wild type(그룹 10)에 비해 알츠하이머 군인 AD 군, F. PBS 군(그룹 8)에서 amyloid beta 42가 증가 하였고 시크리톰 처리 군인 iPSC-Sec 10 ㎍/g에서 다소 감소하였음을 확인하였다(도 14).
마우스의 뇌 내에 NF-L(neurofilament light chain)을 측정해 보았을때 wild type에 비해 AD 군과 EV군의 AD 대조군인 F. PBS에서는 수치가 증가하였고, iPSC-Sec 50 ㎍/g에서 감소하는 경향을 나타내었다(도 15).
<3-4> 티오플라빈 염색
각 실험군의 5xFAD 마우스 brain을 적출하여 frozen section 을 진행하였다.
뇌 조직을 30 ㎛으로 절편하여 amyloid beta plaque를 염색할 수 있는 티오플라빈 S(Thioflavin S) 염색을 시행하였다. 티오플라빈 S 용액에 8분동안 incubation 하여 염색을 시행하였으며, 에탄올로 세척한 후 mount 하여 형광현미경으로 plaque를 확인하였다.
알츠하이머 군인 G1(그룹 1), G8(그룹 8) 군에서 amyloid beta plaque가 발현하였으나 인지기능 부분과 연관된 해마(hipocampus) 부분에서는 많이 발현하지 않았다. 대뇌 피질 부분에서 plaque가 발현되었는데, 시크리톰 처리군인 G2, G3, G4의 경우와 EV 처리 군인 G5, G6의 경우 amyloid beta plaque의 큰차이를 염색 상에서는 차이를 보지 못했다(도 16).
Claims (14)
- 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 배양 배지의 상층액 유래 성분을 포함하는 신경세포 손상 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포는 이형접합 또는 동형접합인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포는 분화 전 유도만능줄기세포 또는 유도만능줄기세포에서 분화된 세포인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 유도만능줄기세포에서 분화된 세포는 피질 신경 줄기세포(cortical neural stem cell)인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 상층액 유래 성분은 유도만능줄기세포에서 분비된 분비단백체(secretome) 인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 분비단백체는 엑소좀(exosome)인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 신경세포 손상 질환은 미각이상, 후각이상, 파킨슨씨병, 알츠하이머, 피크병(Pick's disease), 헌팅턴병 (Huntington's disease), 근위축성 측면 경화증(amyotriophic lateral sclerosis), 허혈성 뇌질환(stroke), 탈 수초질환(demyelinating disease), 다발성 경화증, 간질, 퇴행성 신경질환 및 척추 손상(spinal cord injury) 으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 미각이상 또는 후각이상은 코로나 바이러스 감염에 의한 미각이상 또는 후각이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 조성물은 스프레이, 가글 또는 주사제 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 배양 배지의 상층액 유래 성분을 포함하는 신경세포 손상 개선용 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 조성물은 스프레이, 가글 또는 주사제 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC) 배양 배지의 상층액 유래 성분을 포함하는 피부 재생용 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 조성물은 스프레이 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
- i) 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC)를 계대배양 하는 단계;
ii) 상기 계대배양한 iPSC 배양액을 원심분리하여 상등액을 수득하는 단계;
iii) 상기 수득한 상등액을 시린지 필터(syringe filter)로 필터링 하는 단계;
iv) 상기 필터링된 상등액을 동결건조 또는 한외여과(ultrafiltration)하여 농축하는 단계; 및
v) 크기배제크로마토그래피(size exclusion chromatography) 또는 초원심분리(ultracentrifugation)를 이용하여 상기 농축된 시료에서 분비단백체를 분리하는 단계;
를 포함하는 유도만능줄기세포 유래 분비단백체의 분리방법.
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