KR20230047014A - 신규한 재조합 Fc 수용체 및 이를 포함하는 세포 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재조합 Fc 수용체 및 이를 포함하는 세포에 관한 것으로, CD16 폴리펩타이드의 ADAM17절단 부위의 아미노산 변형으로 ADAM17에 대한 절단저항성을 가지고, CD64의 세포외 결합영역의 전부 또는 일부로 대체됨으로써 항체 Fc 영역과의 결합 친화도가 향상될 수 있다.

Description

신규한 재조합 Fc 수용체 및 이를 포함하는 세포 {NOVEL RECOMBINANT FC RECEPTORS AND CELLS COMPRISING THE SAME}

본 발명은 신규한 재조합 Fc 수용체 및 이를 포함하는 세포에 관한 것이다.

면역계를 활성화 또는 억제하여 질병을 치료하는 면역치료(immunotherapy)는 빠르게 성장 중인 분야로 그 임상적인 중요성이 더욱 커지고 있다. 특히 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor, 이하 CAR) T세포의 개발은 입양면역치료(adoptive cell transfer, 이하 ACT)의 획기적인 발전을 가져온 바 있다.

CAR는 면역 세포 활성화를 위한 하나 이상의 세포 내 신호전달 도메인 및 항원 결합 도메인이 포함되도록 재조합된 수용체이다. CAR를 표면에 발현하도록 조작된 세포독성 T세포(cytotoxic T cell), 자연 살해 세포(natural killer cell, 이하 NK 세포) 등의 면역세포(CAR-X)는 상기 항원 결합 도메인이 결합하는 항원으로 표적화되며 해당 항원과의 결합에 의해 활성화되어 상기 항원을 발현하는 세포에 대한 면역반응을 일으키게 된다.

지난 10년간 다양한 세포 표면 항원을 표적으로 하는 다수의 CAR가 보고되어 왔다. 표적 항원 외에도, 항원 결합 도메인 및 세포 내 신호전달 도메인과 이들을 연결하는 막통과 도메인으로 구성된 제1세대 CAR에 비해 면역 공자극 분자 유래의 신호전달 도메인의 추가 및 전체 도메인 구성의 조합 등, 세포 증식, 세포독성, 사이토카인 분비, in vivo 생존, 면역적합성 및 안전성 등의 측면을 고려한 다양한 변형이 시도되었으며, 특히 일부 혈액암에서 탁월한 효과를 보이기도 하였다.

그러나, 기존 CAR는 특정 항원에 대해서만 특이성을 가지게 되며, 이에 따라 여러 가지 한계를 가지게 된다. 개별 CAR를 포함하는 세포치료제는 개별 표적 질병세포(diseased cell)에 특이적인 표적 항원의 발굴, 해당 항원에 특이적인 결합부위 설계/도출, 이를 포함하는 CAR의 설계 및 세포 내 도입이라는 여러 과정을 포함하며, 여기에 전임상 및 임상시험 등 긴 검증 및 적절한 투여방법과 조성을 도출하는 절차가 필요하다. 이에 더해, 현재 대부분을 차지하는 자가유래 CAR-X의 경우, 제조 과정에도 개별 환자마다 추가적으로 비용과 시간이 들게 된다. 또한 특히 암은 지속적인 변이와 서로 다른 환자 간 뿐만 아니라 같은 환자 유래의 세포 간에도 이질성(heterogeneity)을 나타내는 경우가 많아 고정된 표적 항원을 가지는 CAR-X의 이러한 암에 대한 치료효과가 떨어질 수 있다. 또한, 기존의 CAR-X 세포의 경우, 상기 세포의 지나친 활성화에 따른 사이토카인 폭풍(cytokine release syndrome), 신경독성을 포함한 표적 항원을 가지는 정상조직에 대한 독성(on-target, off-tumor effect) 등의 위험이 보고된 바 있다. 또한, 특히 고형암의 경우 면역세포의 접근성이 떨어지며, 내부로 면역세포가 침투하는데 성공하더라도 면역 억제적인 미세환경(tumor microenvironment)을 조성하여 해당 면역세포가 제대로 활성을 나타내지 못하는 경우가 많다.

본 발명은 위와 같이 표적이 고정되어 있는 기존의 CAR가 가지는 한계를 벗어나 범용성을 가지면서도 면역세포의 활성을 높일 수 있는 신규한 키메라 수용체인 재조합 Fc 수용체를 제공하고자 한다. 본 발명에 따른 재조합 Fc 수용체 및 이를 포함하는 형질전환된 포유동물 세포는 면역치료에 있어 효과가 향상되고, 고정된 표적분자를 갖지 않으므로 다양한 질병의 치료를 위해 적용될 수 있으며, 상기 재조합 Fc 수용체는 기존 CD16의 활성화 후 일어나는 ADAM17에 의한 절단에 저항성을 가지므로 절단에 따른 수용체의 면역활성화 효과 감소를 방지할 수 있다.

한국공개특허 제2021-0110827호.

본 발명은 상술한 바와 같은 문제점을 해결하고자 안출된 것으로서, 발명의 목적은 암 또는 감염성 질병에 대한 치료제에 이용될 수 있는 재조합 Fc 수용체를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 Fc 수용체를 인코딩하는 핵산분자를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 핵산분자를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 숙주세포를 포함하는 암 치료용 약학 조성물 또는 바이러스 감염병 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 기술적 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명의 일실시예는 서열번호 1의 196번째 내지 198번째에 대응되는 ADAM17 절단 부위 서열을 포함하는 CD16 폴리펩타이드의 적어도 일부를 포함하는 재조합 Fc 수용체에 있어서, i) 상기 197번째 위치의 세린(Serine)이 프롤린(Proline)으로 치환, 및 상기 198번째 위치의 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 치환 중 적어도 하나의 아미노산 변형, 및 ii) 상기CD16 폴리펩타이드의 세포외 결합영역(ectodomain)의 전체 또는 일부의 CD64의 세포외 결합영역으로의 교체 중 적어도 하나를 포함하는, 재조합 Fc 수용체를 제공한다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 CD16 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 197번째 아미노산 위치의 세린(Serine)이 프롤린(Proline)으로 치환, 및 상기 198번째 아미노산 위치의 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 치환 중 적어도 하나의 아미노산 변형, 및 상기 서열번호 1의 176번째 아미노산이 발린(Valine)으로 치환된 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 197번째 아미노산 위치의 세린(Serine)이 프롤린(Proline)으로 치환되고, 상기CD16 폴리펩타이드의 세포외 결합영역(ectodomain)의 전체 또는 일부의 CD64의 세포외 결합영역으로 교체된 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 197번째 아미노산 위치의 세린(Serine)이 프롤린(Proline)으로 치환되고 상기 198번째 아미노산 위치의 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 치환된 것이며, 상기CD16 폴리펩타이드의 세포외 결합영역(ectodomain)의 전체 또는 일부의 CD64의 세포외 결합영역으로 교체된 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기CD16 폴리펩타이드의 세포외 결합영역(ectodomain)의 전체 또는 일부의 CD64의 세포외 결합영역으로 교체된 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 CD64의 세포외 결합영역(ectodomain)은 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 재조합 Fc 수용체는 서열번호 4 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에는 상기 Fc 수용체를 인코딩하는 핵산 분자 제공한다.

본 발명의 다른 실시예에는 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명의 다른 실시예에는 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 실시예에 있어서, 상기 숙주세포는 포유동물의 면역세포, 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화된 세포일 수 있다.

본 발명의 다른 실시예에는 상기 숙주세포를 포함하는 암 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 실시예에는 상기 숙주세포를 포함하는 바이러스 감염병 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상술한 과제 해결 수단은 단지 예시적인 것으로서, 본 발명을 제한하려는 의도로 해석되지 않아야 한다. 상술한 예시적인 실시예 외에도, 도면 및 발명의 상세한 설명에 추가적인 실시예가 존재할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따른 재조합 Fc 수용체는 항체와의 결합을 통해 상기 재조합 Fc 수용체를 발현하는 세포에 원하는 항원에 대한 특이성을 부여할 수 있다. 이와 같은 특성에 따라, 본 발명의 실시예에 따른 재조합 Fc 수용체를 발현하는 세포는 조합되는 항체의 종류에 따라 다양한 질병의 치료에 이용될 수 있을 뿐 아니라, 지속적으로 변이가 이루어지며 세포 간 이질성(heterogeneity)을 나타내는 암과 같은 질환에도 조합되는 항체의 종류를 변경하여 효과적으로 대응할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 Fc 수용체는, 항체의 결합 후 일어나는 ADAM17에 의한 절단에 저항성을 가지고, 항체의 Fc 도메인에 대해 CD16에 비해 높은 친화도를 가질 수 있으며, 이에 따라 상기 재조합 Fc 수용체를 발현하는 세포에 더 효과적인 이펙터 반응(예컨대, 항체 의존성 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC), 항체 의존성 세포 식균활동(antibody-dependent cellular phagocytosis, ADCP), 탈과립(degranulation), 사이토카인 분비 등)을 유도할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 재조합 Fc 수용체는, 원래 항체에 의존적으로 작용하지 않던 세포 독성 이펙터 세포(예컨대, 세포 독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL))에 도입시 항체에 의해 이펙터 기능을 활성화시킬 수 있도록 한다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 세포는, 이에 포함된 Fc 수용체가 내재적인(endogenous) CD16의 조절서열에 의해 발현 조절되도록 설계되어 있다. 이는 특히 CD16을 발현하는 세포, 예컨대 NK세포에서의 발현 패턴을 재현할 수 있도록 하며, 줄기세포로부터 이러한 세포를 유도하여 얻고자 하는 경우, 분화 전 소모적인 단백질 발현을 방지할 수 있도록 할 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 NK92MI 세포에 Engineered Receptor를 포함한 벡터를 electroporation으로 transfection한 다음 sorting 및 antibiotics selection 이후 표면에서 CD16 혹은 CD64 receptor의 발현을 유세포 분석으로 측정한 것이다.
도 2는 각각 Engineered receptor를 발현한 NK92MI 세포의 Intracellular domain의 CD16 receptor의 발현을 Western blot을 통해 측정한 것이다. CD16 full form, CD64/16 chimeric form의 receptor 모두 안쪽으로 CD16 receptor를 발현하고 있어 band를 통해 이를 확인할 수 있었다. 반면 receptor를 발현하지 않는 NK92MI 실험군에서는 band 가 나타나지 않았다.
도 3은 각각 Engineered receptor를 발현한 NK92MI 세포에 PMA/Ionomycin으로 강한 자극을 주었을 때, ADAM17에 의한 shedding 영향을 유세포 분석으로 측정한 것이다. 3a는 Unstimulated를 100으로 두었을 때 receptor의 발현을 상대적인 MFI 값을 나타낸 것으로 대조군(hCD16)은 3가지 자극 농도에서 모두 절단되어 발현이 감소한 반면 Candidate, D2, D5, F4 세포주에서는 절단되지 않고 오히려 발현이 증가하거나 유지되었다. 3b의 그래프는 PMA/Ionomycin 5가지 농도 구간에서 receptor의 발현을 유세포분석으로 측정하였다. 대조군은 활성화 시, 자극을 주지 않은 실험군과 비교하여 발현이 하향 조절되었고, D5와 F4는 활성화 시에도 발현이 상향조절되거나 유지되는 것을 보이며 3a의 결과를 보충하고 있다. 3c는 3a의 결과를 히스토그램으로 나타낸 결과이다.
도 4는 다양한 암세포주에서 각각 Engineered receptor를 발현한 NK92MI 세포의 ADCC 활성을 target cell에서 방출하는 LDH release로 측정한 것이다. LDH는 세포 사멸 시 세포막이 손상될 때 배양 상등액으로 방출되는 세포질 효소로 세포독성을 나타내는 지표로 흔히 사용된다. 4a와 4b는 MDA-MB-231과 MDA-MB-453 세포주에서 control IgG 실험군에 비해 항원을 타겟하는 항체를 사용했을 때 NK92MI나 대조군과 비교하여 Candidate, D2, D5의 높은 세포독성을 보여준다. 4c는 다른 세포주들과 비교하여 CD16을 발현하는 NK92 세포에 의한 lysis에 저항을 보이는 AsPC-1 세포주에서의 ADCC 결과이다.
도 5는 다양한 암세포주에서 각각 Engineered receptor를 발현한 NK92MI 세포의 장기간 ADCC 활성을 Incucyte 실시간 이미징 장비와 Caspase-3/7 red dye를 통해 측정한 것이다. GFP를 포함하는 vector 가 들어있는 D2, D5, F4 NK92MI 세포주에서는 녹색 형광을 확인할 수 있고, 죽은 target cell 은 Red 형광으로 확인할 수 있다. 5a와 5b는 MDA-MB-231과 MDA-MB-453 세포주의 ADCC 상황에서 시간에 따른 Apoptosis count를 나타낸 것이다. 5c는 최대 apoptosis를 보이는 1.5시간 이후 실험군별 이미지를 나타낸 것이다. 5d는 시간별 각 실험군에서의 이미지가 변화하는 모습을 보여준다.
도 6은 본 발명의 재조합 Fc 수용체를 발현하기 위해 제조된 universal receptor vector로서, 도 6a는 Candidate(CD16 full form) 발현에 사용된 vector이고, 도 6b는 D2, D5, F4 (CD64/16 chimera) 발현에 사용된 vector이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서 상에서 “도메인(domain)”은 기능적 또는 구조적인 특성을 가지는 단위를 가리키는 용어로 사용된다. 본 발명에 따른 도메인은 바람직하게는 폴리펩타이드이다. 이러한 폴리펩타이드는 단일 폴리펩타이드 사슬일 수 있고, 하나 이상의 폴리펩타이드 사슬의 일부가 모여 형성된 모듈일 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 단백질 부분(proteinaceous parts) 및 비-단백질 부분(non-proteinaceous parts)을 포함할 수 있는데, 이때 상기 비-단백질 부분은 예컨대 글루타르알데히드(glutaraldehyde)와 같은 화학적 가교제 또는 화학적 링커일 수 있다.

본 명세서 상에 포함된 아미노산 서열은 본 발명에 따른 각 도메인의 특성을 유지하면서 서열 차이가 나타나도록 하는 변화가 이루어지는 경우, 해당 서열과 80% 이상, 바람직하게 90% 이상, 더욱 바람직하게 95% 이상, 가장 바람직하게 99% 이상의 상동성을 가지는 서열을 포괄할 수 있다. 상기 변화는 일부 아미노산 잔기의 부가, 치환 또는 결실 중에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.

본 발명에서 사용되는 “아미노산 치환” 또는 “치환”은 모체 폴리펩타이드 서열의 특정 위치에 있는 아미노산이 상이한 아미노산으로 대체되는 것을 의미한다.

본 발명은 재조합 Fc 수용체에 관한 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 196번째 내지 198번째에 대응되는 ADAM17 절단 부위 서열을 포함하는 CD16 폴리펩타이드의 적어도 일부를 포함하는 재조합 Fc 수용체에 있어서, i) 상기 197번째 위치의 세린(Serine)이 프롤린(Proline)으로 치환, 및 상기 198번째 위치의 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 치환 중 적어도 하나의 아미노산 변형, 및 ii) 상기CD16 폴리펩타이드의 세포외 결합영역(ectodomain)의 전체 또는 일부의 CD64의 세포외 결합영역으로의 교체 중 적어도 하나를 포함한다.

CD16은 2종의 상이한 형태로서, 즉, 2종의 상이한, 그러나 상동성이 매우 큰 유전자의 생성물인 CD16a 및 CD16b 로서 발현된다. CD16a는 폴리펩타이드가 앵커링된 단백질이고, CD16b는 글리코실포스파티딜이노시톨이 앵커링된 단백질이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, CD16은, 부적절하지 않다면, 당업자에게 명백한 이 단백질의 두 가지 형태를 가르킨다.

CD16 폴리펩타이드는 ADAM17 절단 부위 서열을 포함하는 것이라면 NCBI 등에 공지된 임의의 CD16 폴리펩타이드 서열일 수 있다.

본 발명의 재조합 Fc 수용체는 예를 들어, 서열번호 1의 아미노산 서열의 CD16 폴리펩타이드의 적어도 일부를 포함할 수 있다.

ADAM 17은 CD16을 통한 신호전달이 활성화되면 CD16의 세포외 결합영역(ectodomain)을 절단하여 ADCC 활성화 신호전달을 저해하는 프로테아제로서, 상기 ADAM17 절단 부위 서열은 예를 들어, 서열번호 1의 196번째 내지 198번째에 대응되는 서열을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 재조합 Fc 수용체는 i) 상기 197번째 위치의 세린(Serine)이 프롤린(Proline)으로 치환, 및 상기 198번째 위치의 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 치환 중 적어도 하나의 아미노산 변형, 및 ii) 상기CD16 폴리펩타이드의 세포외 결합영역(ectodomain)의 전체 또는 일부의 CD64의 세포외 결합영역으로의 교체 중 적어도 하나를 포함한다.

본 발명의 재조합 Fc 수용체가 상기 197번째 위치의 세린(Serine)이 프롤린(Proline)으로 치환, 및 상기 198번째 위치의 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 치환 중 적어도 하나의 아미노산 변형을 포함하는 경우, 구체적으로, CD16 폴리펩타이드의 서열번호 1의 196번째 내지 198번째에 대응되는 ADAM17 절단 부위 서열은 196번째 위치는 발린(Valine), 197번째 위치는 프롤린(Proline), 198번째 위치는 트레오닌(Threonine)이거나, 196번째 위치는 발린(Valine), 197번째 위치는 프롤린(Proline), 198번째 위치는 세린(Serine)이거나, 196번째 위치는 발린(Valine), 197번째 및 198번째 위치는 세린(Serine)인 것일 수 있다.

본 발명의 재조합 Fc 수용체는 상기와 같은 아미노산 변형을 포함함으로써, ADAM17에 대한 절단저항성을 가질 수 있다.

본 발명의 재조합 Fc 수용체는 상기CD16 폴리펩타이드의 세포외 결합영역(ectodomain)의 전체 또는 일부의 CD64의 세포외 결합영역으로의 교체를 포함할 수 있다.

Fc 수용체는 세포외 결합영역(ectodomain), 막통과 도메인(transmembrane) 및 세포내 결합영역(Intracellular domain)을 포함하는데, 본 발명은 CD64의 세포외 결합영역의 일부 또는 전부를 포함할 수 있다. CD64와 CD16 둘 다 항체의 Fc 영역에 결합하지만, CD64가 약 100배∼1,000배 높은 친화력을 갖는다. CD64는 세포외 결합영역이 항체 결합을 담당하는 3개의 면역글로불린 도메인으로 이루어지는 당단백질 α 사슬을 포함하며, 상기 3개 모두의 면역글로불린 도메인의 존재는 항체와의 고친화력 상호작용에 중요한 것으로 확인되었다. 이와는 달리, CD16의 세포외 결합영역은 단지 2개의 면역글로불린 유사 도메인을 갖는다. CD64 내의 가외의 면역글로불린 유사 접힘구조의 존재는 높은 Fc 친화력의 강력한 결정인자일 수 있다. 본 발명의 재조합 Fc 수용체는 또한 단지 CD64 내의 이러한 가외 면역글로불린 유사 접힘구조 또는 그것의 돌연변이 버전을 CD16의 세포외 결합영역으로 삽입하여, 항체에 대한 고친화력을 가질 수 있다.

본 발명은 CD64의 세포외 결합영역을 CD16의 임의의 적절한 막통과 도메인 및 세포내 결합영역에 융합시킨 것일 수 있다. 또한, CD64의 3개의 면역글로불린 도메인(EC1, EC2, EC3) 및 hinge의 일부와 CD16의 hinge 일부, 막통과 도메인 및 세포내 결합 영역을 융합시킨 것일 수 있으나, 이제 제한되지 않고, CD16 폴리펩타이드의 항체 Fc 영역에의 친화도를 향상시키기 위해 CD64의 세포외 결합영은 CD16 폴리펩타이드의 세포외 결합영역(ectodomain)의 전체 또는 일부에 해당하는 적절한 위치에서 교체될 수 있다.

상기 CD64의 세포외 결합영역은 예를 들어, 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 예를 들면, 상기 CD16 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 197번째 아미노산 위치의 세린(Serine)이 프롤린(Proline)으로 치환, 및 상기 198번째 아미노산 위치의 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 치환 중 적어도 하나의 아미노산 변형, 및 상기 서열번호 1의 176번째 아미노산이 발린(Valine)으로 치환된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 재조합 Fc 수용체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 예를 들면, 상기 197번째 아미노산 위치의 세린(Serine)이 프롤린(Proline)으로 치환되고, 상기CD16 폴리펩타이드의 세포외 결합영역(ectodomain)의 전체 또는 일부의 CD64의 세포외 결합영역으로의 교체된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 재조합 Fc 수용체는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 예를 들면, 상기 197번째 아미노산 위치의 세린(Serine)이 프롤린(Proline)으로 치환되고 상기 198번째 아미노산 위치의 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 치환된 것이며, 상기CD16 폴리펩타이드의 세포외 결합영역(ectodomain)의 전체 또는 일부의 CD64의 세포외 결합영역으로 교체된 것일 수 있다. 보다 구체적으로 본 발명의 재조합 Fc 수용체는 서열번호 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 예를 들면, 상기CD16 폴리펩타이드의 세포외 결합영역(ectodomain)의 전체 또는 일부의 CD64의 세포외 결합영역으로 교체된 것일 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 재조합 Fc 수용체는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명은 상기 Fc 수용체를 인코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

상기 핵산 분자는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 가지며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체(analogue)도 포함할 수 있다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)). 본 발명의 재조합 Fc 수용체를 인코딩하는 핵산 분자 서열은 변형될 수 있다. 상기 변형은 뉴클레오타이드의 추가, 결실 또는 비보존적 치환 또는 보존적 치환을 포함할 수 있다. 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이, 본 발명의 핵산 분자는 본 발명의 재조합 Fc 수용체를 생산하는 데 사용되는 숙주 세포에 따라 발현 벡터에 혼입될 수 있다.

본 발명은 상기 핵산 분자를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.

상기 발현벡터는 상기 핵산 분자에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 "벡터"는 그것이 결합되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것이다. 예를 들면, 상기 벡터로서는 플라스미드 즉, 부가 DNA 분절이 결찰될 수 있는 DNA의 환형 이중 사슬 조각이 있다. 또한, 상기 벡터로서는 바이러스 벡터 즉, 부가의 DNA 분절이 바이러스 게놈 내에 결찰될 수 있는 벡터가 있다. 상기 벡터는 이 벡터가 도입된 숙주 세포 내에서 자율적으로 복제될 수 있다. 예를 들어, 박테리아 복제 기원을 가지는 박테리아 벡터 및 에피좀 포유동물벡터일 수 있다. 또한, 상기 벡터(예를 들어, 비-에피좀 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입됨에 따라서 이 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있으며, 이로써, 숙주 게놈과 함께 복제된다. 뿐만 아니라, 임의의 벡터는 이 벡터에 작동 가능하도록 연결된 유전자를 발현시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 "발현 조절 서열"은 암호화 서열이 결찰되어 이 암호화 서열을 발현 및 가공시키는데 필요한 폴리뉴클레오티드 서열을 의미하는 것이다. 발현 조절 서열은 적당한 전사 개시, 종결, 프로모터, 인핸서 서열, 효율적인 RNA 가공 신호 예를 들어, 스플라이싱 및 폴리아데닐화 신호, 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열, 번역 효율을 증가시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 공통 서열) 및 단백질의 안정성을 증강시키는 서열을 포함하며 원하는 경우에는, 단백질 분비를 촉진하는 서열도 포함한다. 이와 같은 발현 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라서 상이한데 원핵 생물의 경우, 이러한 발현 조절 서열로서는 일반적으로 프로모터, 리보좀 결합 위치, 그리고 전사 종결 서열을 포함하고 진핵 생물의 경우, 이러한 발현 조절 서열로서는 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함한다. 본 발명에 있어서 발현 조절 서열은 최소한 그 존재가 발현 및 가공 과정에 필수적인 모든 성분들을 포함하는 것이며, 그 존재가 유리한 부가 성분 예를 들어, 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 포함할 수 있다.

본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어 "숙주 세포"는 핵산, 예를 들어, 본 발명의 핵산을 발현시키는데 사용될 수 있는 세포이다. 전형적으로, 숙주 세포는 폴리펩타이드-코딩 핵산으로 형질전환 또는 형질감염될 수 있는 배양 세포이고, 그 후 상기 핵산이 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다.

본 발명의 숙주세포는 예를 들면, 포유동물의 면역세포, 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화된 세포일 수 있다.

상기 면역세포는 예를 들면, NK세포, T세포, B세포, NKT세포, 호중구, 호산구, 호염구, 비만세포, 단핵구, 수지상세포 또는 대식세포일 수 있다. 또한, 상기 면역세포는 세포독성 이펙터 세포일 수 있다. 여기서 상기 세포독성 이펙터 세포는 NK 세포, 세포 독성 T 세포, 대식세포, 단핵구, 호중구 및 호산구 등일 수 있다. 상기 세포는 바람직하게는 NK세포 또는 세포 독성 T 세포일 수 있다. 이 중에서 T세포의 경우, T세포 수용체(T cell receptor, 이하 TCR)를 통해 주조직 적합 복합체(Major histocompatibility complex, 이하 MHC) 및 MHC에 로딩된 펩타이드와 상호작용하는 특성을 가지는데, 이때, 해당 TCR이 외래의 것으로 인식한 MHC를 발현하는 세포를 공격하게 된다. 반면 NK세포는 TCR을 포함하지 않으므로, 치료 목적으로 대상에게 투여시 대상의 세포를 이식된 세포가 공격하는 이식편대숙주 질환(graft-versus-host disease, 이하 GVHD)을 유발하지 않는다는 장점이 있어 바람직할 수 있다.

상기 줄기세포는 예를 들면, 배아줄기세포, 성체줄기세포 또는 유도줄기세포일 수 있다. 면역세포는 증폭이 용이하지 않은 경우가 많으므로 증식능이 높은 줄기세포를 형질전환하는 경우 단일 클론의 증폭 측면에서 유리할 수 있다.

상기 숙주세포는 자가유래(autologous), 동종유래(allogeneic) 또는 이종유래(xenogeneic)인 것 중 어느 하나일 수 있고, 이종유래인 것인 경우 바람직하게 포유류로부터 얻어진 것일 수 있다. 바람직하게 상기 숙주세포는 면역거부반응에 대한 가능성을 줄이기 위해, 1) 자가유래의 것, 또는 2) 동종유래의 것으로서 면역 반응 조절과 관련된 유전자가 조작된 세포 중에서 선택할 수 있다. 상기 면역 반응 조절과 관련된 유전자는 이식된 세포에 의한 숙주 세포의 공격 및/또는 숙주 세포에 의한 이식 세포의 공격과 관련된 유전자를 포함할 수 있다. 상기 이식된 세포에 의한 숙주 세포의 공격과 관련된 유전자로는 예컨대 MHC를 인식하는 TCR이 있으며, 이의 발현을 감소 또는 제거할 수 있도록 조작된 것일 수 있다. 또한, HLA-G나 HLA-E와 같은 비고전적 MHC가 발현되도록 하는 경우, 이식 세포를 숙주세포로부터 보호하는 효과가 있을 수 있다.

상기 숙주 세포는 MHC의 발현과 관련된 TAP1, TAP2, TAPBP, NLRC5, CIITA, RFXANK, RFX5, RFXAP 등의 발현이 감소 또는 제거된 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 숙주세포는 세포의 MHC-1의 항원 제시에 필요한 상기 유전자를 녹아웃시키며 동시에 안전하게 형질전환할 수 있도록 세포의 상기 유전자 영역에 재조합효소 인식 서열을 삽입하여 랜딩패드화한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 유전자 영역은 엑손 영역뿐만 아니라, 해당 유전자의 발현 조절과 관련이 있는 인핸서, 프로모터 및 인트론 등이 포함된 모든 영역을 포함할 수 있다.

상기 유전자의 발현을 감소 또는 제거하여 숙주 TCR에 의해 비자기(non-self) 분자로 인식될 수 있는 MHC의 발현을 감소 또는 제거할 수 있다.

상기와 같은 면역 반응 조절과 관련된 유전자가 조작된 세포는, 매번 새로운 환자를 위해 형질도입, 증폭, 스크리닝 및 활성 테스트 등을 진행해야 하는 자가유래 세포에 비해 기성품(off-the-shelf) 형태로 미리 제조할 수 있어 시간 및 비용 측면에서 장점을 가질 수 있다.

본 발명은 상기 숙주세포 및 항체를 동시에 또는 순차적으로 대상체에 투여하여 암 또는 바이러스 감염병을 효과적으로 치료할 수 있다.

상기 항체는 하나 이상의 항원에 특이성을 가지는 것, 한 가지 이상의 단클론 항체를 조합한 것, 또는 그 조합 중에서 선택된 것일 수 있다. 상기 항체는 예컨대 i) IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 중에서 선택된 면역글로불린; ii) Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2, VHH, VNAR 등과 같은 천연(native) 항체 단편; iii) scFv, dsFv, ds-scFv, (scFv)2, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), 펜타바디(pentabody) 등과 같은 엔지니어링된 항체; 중에서 선택된 것일 수 있는데, 이때, 상기 항체는 바람직하게 CD16 및 CD64의 Fc 결합 도메인과 IgG의 결합에 관여하는 IgG 유래의 단백질 단편, 예컨대 Fc 도메인 또는 그 일부와 선택적으로 힌지 도메인 또는 그 일부 등을 포함하는 단백질 단편을 포함할 수 있다. 상기 IgG 유래의 단백질 단편은 IgG 중에서 바람직하게 IgG1, IgG3, 또는 IgG4로부터 유래한 것, 더욱 바람직하게는 IgG1 또는 IgG3로부터 유래한 것일 수 있다. Fcγ 수용체의 Fc에 대한 결합력(affinity)은 IgG3>IgG1>IgG4 순으로 알려져 있으며, 특히 IgG1 및 IgG3가 항체 의존적인 이펙터 기능에 대한 강력한 활성제로 작용하는 것으로 알려져 있다. IgG3는 이러한 이펙터 기능을 가장 강하게 활성화시킬 수 있으나, 체내 반감기가 짧아 치료적인 세포독성 유도 목적으로는 IgG1이 선호되는 것으로 알려져 있다. 상기 항체는 하나의 항원 결합 도메인을 포함(monovalent)하는 것일 수 있고, 하나 이상의 항원 결합 도메인을 포함(multivalent)하는 것일 수 있다. 상기 항체는 단일클론성(monoclonal) 또는 다중클론성(polyclonal)인 것일 수 있다. 상기 항체는 마우스, 토끼, 염소, 말, 닭, 햄스터, 인간 등 동물로부터 단리되거나 정제된 천연유래 항체이거나, 천연유래 항체의 서열특성을 참고하여 설계 및 유전자 합성된 합성 항체일 수 있다. 상기 항체는 인간화된(humanized) 항체 또는 키메라성(chimeric) 항체 등 조작된 항체일 수 있다. 상기 항체는 단량체 형태 또는 중합체 형태일 수 있다. 상기 항체는 화학적 변형, 예컨대 이황화결합 추가, 글리코실화(glycosylation), 측쇄(side chain)가 변형된 아미노산, 메티오닌(methionine)의 산화, 아스파라긴 또는 글루타민의 탈아미드화, 감마-카복실화(γ-Carboxylation), 베타-하이드록실화 (β-Hydroxylation), 황산화(sulfation) 등을 하나 이상 포함할 수 있다. 상기 항체는 표적 항원에 대해 임의 수준의 친화도(affinity) 또는 결합력(avidity)을 가질 수 있다. 상기 항체는 마우스, 토끼, 인간, 인간화 또는 키메라 단백질 중에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

상기 대상체는 동물, 바람직하게는 포유동물, 특히 인간을 포함하는 동물일 수 있으며, 동물에서 유래한 세포, 조직, 기관 등일 수도 있다. 또한, 상기 대상체는 상기 치료가 필요한 환자(patient) 일 수 있다.

본 발명은 상기 숙주세포를 포함하는 암 또는 바이러스 감염병 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 암은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, 샘암종(adenocarcinoma), 유방암, 췌장암, 혈액암, 난소암, 결장암, 방광암, 폐암, 간암, 위암, 식도암, 전립선암, 자궁암, 자궁경부암, 흑색종, 대장암, 신장암 또는 전이성 흉막 종양 등일 수 있다.

상기 바이러스는 특정 형태의 바이러스에 국한되는 것은 아니며, dsDNA계통 바이러스, ssDNA계통 바이러스 또는 RNA계통 바이러스일 수 있다. 구체적으로 아데노바이러스, 헤르페스바이러스, 마마바이러스, 파르보바이러스, 레오바이러스, 로타바이러스 또는 레트로바이러스 등에 적용될 수 있고, 본 발명의 조성물이 항 바이러스 활성을 나타내는 한 특별히 제한되지 않는다.

본 발명에서 사용되는 “치료”는 암 또는 바이러스 감염에 의한 증상을 개선시키거나 호의적으로 변화시키는 활성을 의미한다.

상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 생리적으로 혼화 가능한 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅물, 항 박테리아 제제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등을 의미하는 것이다. 약학적으로 허용 가능한 담체의 예는 물, 염수, 인산염 완충 염수, 덱스트로즈, 글리세롤 및 에탄올 등과 이들의 혼합물이 있다. 다수의 경우, 등장제 예를 들어, 당, 다가 알콜 예를 들어, 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 것이다.

본 발명의 조성물은 다양한 형태 예를 들어, 액체, 반고체 및 고체 투여형 예를 들어, 액체 용액(예를 들어, 주사 가능하고, 주입 가능한 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환약, 분말, 리포좀 및 좌제의 형태를 가질 수 있다. 바람직한 형태는 의도로 하는 투여 방식과 치료 방법에 따라서 달라진다. 본 발명의 조성물은 현탁액, 용액 또는 유질 또는 수성 비이클 중 유액의 형태를 취할 수 있으며, 제형화 제제 예를 들어, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전, 적당한 비히클 예를 들어, 멸균 무 발열원물과 함께 사용될 분말형으로 존재할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 제조될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함할 수 있다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

상기 조성물은 항체를 더 포함할 수 있고, 항체에 관하여는 전술한 바와 같다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.

제조예: 항체의 Fc 부분에 결합하는 Universal Fc receptor NK 세포의 제작

1. 발현 벡터의 제작

puC vector에 Universal Fc receptor의 construct를 바이오닉스에 합성 주문하였고, 서열부분을cloning 하여 Candidate(서열번호 4)는 pcDNA3.1(+) vector(도 6a)에, D2(서열번호 6), D5(서열번호 5), F4(서열번호 8)는 pcDNA3.1(+) IRES GFP vector(도 6b)에 발현시켰다. Candidate의 vector는 human CD16a의 서열에서 F176V, S197P, T198S 에서의 서열의 변경을 포함한다. D2, D5, F4는 S1, S2, EC1, EC2, EC3, Hinge 일부까지는 CD64 receptor서열이고, 나머지 Hinge, TM, IC는 hCD16a의 서열을 포함한다. D2, D5, F4 서열에는 발현을 확인할 수 있도록 EGFP를 포함하였다.

대조군은 human CD16a에서 F176V에서의 서열의 변경을 포함하는 hCD16을 사용하였다(서열번호 9).

2. 벡터의 transfection 및 세포주 구축

제작된 벡터는 발현 확인을 위해 NK cell non-Hodgkin's lymphoma 유래 세포주인 NK92MI 세포에 형질전환을 하였다. 형질전환은 electroporation을 통해 이루어졌고 kit는 Thermo Fisher 사의 Neon transfection system kit를 사용하였다. Thermo 사에서 제공하는 NK92MI 세포주 형질전환 조건을 최적화한 후 사용하여 (1200 V, 20ms/3 pulses) 실험 후 37 ℃, 5% CO₂ 조건에서 배지를 추가하여 2-3주간 안정화 기간을 거친 후 BD, FACS AriaⅢ을 통해 Candidate 은 FITC anti-human CD16 antibody(Biolegend)를 사용해 CD16을 발현하는 세포들을, D2, D5, F4는 GFP를 발현하는 세포들을 1차적으로 Sorting 하였다. 이후 2-3주간 안정화 기간을 거친 후 같은 방식으로 2차 Sorting 혹은 G418 Sulfate(Enzo)을 2주간 처리하여 Universal-NK 세포주를 구축하였다.

실험예1. 벡터의 발현 확인(유세포분석)

제조예의 세포들을 이용하여 EC domain의 receptor 발현을 유세포 분석으로 확인하였다. 각 세포에 mouse IgG1 kappa Isotype Control, APC(Invitrogen), anti-CD16-APC, anti-CD64-APC 항체를 처리하여 염색한 후 45분 후 FACS buffer 로 세척한 뒤 BD FACS lyric으로 분석하였다. 해당 실험을 통해 대조군(hCD16), Candidate 에서는 EC domain의 CD16 receptor의 발현을, D2, D5, F4 에서는 CD64 receptor의 발현을 확인할 수 있었다(도 1).

실험예 2. 벡터의 발현 확인(Western blot)

제조예의 세포들을 이용하여 IC domain의 CD16 receptor 발현을 Western blot으로 확인하였다. 세포를 RIPA 버퍼에 1시간 lysis 후 14000rpm에 spin down하여 단백질만 회수한 다음 BCA assay (Pierce, Themo Fisher)를 통해 농도를 확인하였다. 농도 확인 후 단백질 10 ㎍ 정도를 SDS-PAGE 후 PVDF membrane에 transfer하여 5% skim milk 로 RT에서 1시간 blocking 하였다. CD16 C-terminus에 binding 하는 anti-CD16-antibody(abcam)와 1:1000 비율로 4 ℃에서 overnight으로 반응시켰다. 반응 후 Image Quant 800으로 밴드를 확인하였다. 확인 결과 CD16 full form NK 세포(hCD16, Candidate), CD64/16 chimeric form NK 세포(D2, D5, F4) 모두 안쪽으로 CD16 receptor를 발현하고 있어 band를 통해 이를 확인할 수 있었다. 반면 receptor를 발현하지 않는 NK92MI 실험군에서는 band 가 나타나지 않았다(도 2).

실험예 3: 유세포 분석을 통한 ADAM17에 의한 수용체 절단 확인

제조예의 세포들을 이용하여 ADAM17에 의한 수용체 절단을 실험하였다. 우선 유세포 분석을 통해 Universal-NK 세포에 PMA/Ionomycin으로 강한 자극을 주었을 때, ADAM17에 의해 shedding, 절단되어 수용체의 발현이 감소하는지 확인하기 위해 CD16 혹은 CD64의 발현수준을 보았다. 각 세포에 PMA/Ionomycin cocktail(Biolegend)을 3가지 다른 농도로 처리하고 4시간 후 harvest 하여 각각 CD16과 CD64를 인지하는 항체(Biolegend)를 염색한 후 BD FACS lyric으로 분석하였다. 대조군은 3가지 자극 농도에서 모두 절단되어 발현이 감소한 반면 Candidate, D2, D5, F4 세포주에서는 절단되지 않고 오히려 발현이 증가하거나 유지되었다(도3a 및 3c). 추가로 PMA/Ionomycin 5가지 농도 구간에서 receptor의 발현을 유세포분석으로 측정하였다. 대조군은 활성화 시, 자극을 주지 않은 실험군과 비교하여 발현이 하향 조절되었고, D5와 F4는 활성화 시에도 발현이 상향조절되거나 유지되는 것을 보였다(도 3b).

실험예 4: Universal Fc receptor의 효능 확인

벡터의 발현을 확인한 뒤 Universal-NK 세포의 효능을 확인하기 위해 MDA-MB-231, MDA-MB-453, AsPC-1 세포주로 ADCC(Antibody Dependent Cell Cytotoxicity) 실험을 진행하였다.

4-1. LDH release를 통한 ADCC 활성 확인

Target Cell과 Antibody 그리고 Universal-NK 세포가 결합하여 ADCC 기전으로 인한 target cell 의LDH 방출을 알아보기 위해 CytoTox 96®Non-Radioactive Cytotoxicity Assay kit(Promega)를 사용하였다. 사용된 타겟 세포는 MDA-MB-231, MDA-MB-453, AsPC-1 세포주였다. 96 well plate에 target 세포를 seeding 하고 하루 안정화 후 antibody는 1 ㎍/㎖로 Universal-NK 세포를 E:T=2:1, 1:1, 0.5:1 세가지 비율로 추가하였다. 4시간 후 96 well plate를 spin down 한 뒤 세포 상층액만 회수하여 새로운 96 well plate에 실험군 별로 넣어주었다. Assay kit의 프로토콜대로 실험을 진행한 후 multireader기를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. %Cytotoxicity 계산법은 아래와 같다.

실험 결과 모든 세포주에서 control IgG 실험군에 비해 항원을 타겟하는 항체를 사용했을 때 NK92MI나 대조군과 비교하여 Candidate, D2, D5의 높은 세포독성을 보여주었다(도 4a 내지 4c).

4-2. Caspase-3/7 staining을 통한 장기간 ADCC 활성 확인

Target Cell과 Antibody 그리고 Universal-NK 세포가 결합하여 ADCC 기전으로 인한 target cell의 apoptosis를 알아보기 위해 Incucyte real time imaging 장비와 Caspase-3/7 apoptosis Red dye(Satorius)를 사용하였다. Red dye는 target cell의 casepase 3/7이 인식하는 DEVD peptide의 motif에 결합한다. 사용된 타겟 세포는 MDA-MB-231, MDA-MB-453 세포주였다. 건강한 세포에서는 변화가 없지만, Apoptotic cell에서는 활성화된 Caspase가 DEVD recognition motif를 절단하고 핵 안으로 들어가 DNA 가 red 형광을 띄도록 만들어서 Dead cell을 실시간으로 정량화 할 수 있다. 96 well plate에 target 세포를 seeding 하고 하루 안정화 후 antibody와 Red dye를 처리하고 Universal-NK 세포를 E:T=2:1 비율로 추가하였다. GFP를 포함하는 vector 가 들어있는 D2, D5, F4 NK92MI 세포주에서는 녹색 형광을 확인할 수 있고, 죽은 target cell 은 Red 형광으로 확인할 수 있었다. 실험 결과 두 세포주에서 Candidate와 비교하여 D2, D5의 높은 세포독성을 보여주었다(5a 내지 5d).

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (13)

1. 서열번호 1의 196번째 내지 198번째에 대응되는 ADAM17 절단 부위 서열을 포함하는 CD16 폴리펩타이드의 적어도 일부를 포함하는 재조합 Fc 수용체에 있어서,
   i) 상기 197번째 위치의 세린(Serine)이 프롤린(Proline)으로 치환, 및 상기 198번째 위치의 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 치환 중 적어도 하나의 아미노산 변형, 및
   ii) 상기CD16 폴리펩타이드의 세포외 결합영역(ectodomain)의 전체 또는 일부의 CD64의 세포외 결합영역으로의 교체 중 적어도 하나를 포함하는, 재조합 Fc 수용체.
   
2. 청구항 1에 있어서, 상기 CD16 폴리펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하고,
   상기 197번째 아미노산 위치의 세린(Serine)이 프롤린(Proline)으로 치환, 및 상기 198번째 아미노산 위치의 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 치환 중 적어도 하나의 아미노산 변형, 및
   상기 서열번호 1의 176번째 아미노산이 발린(Valine)으로 치환된, 재조합 Fc 수용체.
   
3. 청구항 1에 있어서, 상기 197번째 아미노산 위치의 세린(Serine)이 프롤린(Proline)으로 치환되고,
   상기CD16 폴리펩타이드의 세포외 결합영역(ectodomain)의 전체 또는 일부의 CD64의 세포외 결합영역으로 교체된, 재조합 Fc 수용체.
   
4. 청구항 1에 있어서, 상기 197번째 아미노산 위치의 세린(Serine)이 프롤린(Proline)으로 치환되고 상기 198번째 아미노산 위치의 트레오닌(Threonine)이 세린(Serine)으로 치환된 것이며,
   상기CD16 폴리펩타이드의 세포외 결합영역(ectodomain)의 전체 또는 일부의 CD64의 세포외 결합영역으로 교체된, 재조합 Fc 수용체.
   
5. 청구항 1에 있어서, 상기CD16 폴리펩타이드의 세포외 결합영역(ectodomain)의 전체 또는 일부의 CD64의 세포외 결합영역으로 교체된, 재조합 Fc 수용체.
   
6. 청구항 1에 있어서, 상기 CD64의 세포외 결합영역(ectodomain)은 서열번호 2 또는 3의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 Fc 수용체.
   
7. 청구항 1에 있어서, 상기 재조합 Fc 수용체는 서열번호 4 내지 8 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 재조합 Fc 수용체.
   
8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 따른 상기 Fc 수용체를 인코딩하는 핵산 분자.
   
9. 청구항 8에 따른 상기 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
   
10. 청구항 9에 따른 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
    
11. 청구항 10에 있어서, 상기 숙주세포는 포유동물의 면역세포, 줄기세포 또는 줄기세포로부터 분화된 세포인, 숙주세포.
    
12. 청구항 10에 따른 상기 숙주세포를 포함하는 암 치료용 약학 조성물.
    
13. 청구항 10에 따른 상기 숙주세포를 포함하는 바이러스 감염병 치료용 약학 조성물.

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