KR20230043113A - 의약용 사포닌 유도체 - Google Patents

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KR20230043113A
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saponin
xyl
rha
fuc
glc
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KR1020237002633A
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English (en)
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루벤 포스텔
가이 허먼스
헨드릭 푸치스
Original Assignee
사프렘 테크놀로지스 비.브이.
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Publication date
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Abstract

본 발명은 트리테르펜 아글리콘 및 제1 당류 사슬 및/또는 제2 당류 사슬을 포함하는 사포닌 기반 키라야 사포나리아(Quillaja saponaria) 사포닌 유도체에 관한 것으로, 다음을 포함한다: 유도체화된 알데히드 기를 포함하는 아글리콘 코어 구조; 및/또는 제1 당류 사슬로서 제1 당류 사슬은 유도체화된 카르복실 기를 포함하는 것; 및/또는 제2 당류 사슬로서 제2 당류 사슬은 유도체화된 적어도 하나의 아세톡시 기를 포함하는 것. 본 발명은 또한 본 발명의 사포닌 유도체를 포함하는 제1 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 제1 약학적 조성물 및 항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 임의의 하나 이상을 포함하는 제2 약학적 조성물을 포함하는 약학적 복합제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암, 감염성 질환, 바이러스 감염, 고콜레스테롤혈증, 원발성 고옥살산뇨증, A 형 혈우병, B 형 혈우병, 알파-1 항트립신 관련 간 질환, 급성 간 포르피린증, 트랜스티레틴-매개 아밀로이드증, 또는 자가-면역 질환의 치료 또는 예방에서의 사용, 또는 의약으로서의 사용을 위한, 본 발명의 제1 약학적 조성물 또는 약학적 복합제에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 세포를 분자 및 본 발명의 사포닌 유도체와 접촉시키는 것을 포함하는, 상기 세포 외부로부터 상기 세포 내부로 분자를 전달하는 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다.

Description

의약용 사포닌 유도체
본 발명은 트리테르펜 아글리콘 및 제1 당류 사슬 및/또는 제2 당류 사슬을 포함하는 사포닌 기반 키라야 사포나리아(Quillaja saponaria) 사포닌 유도체에 관한 것으로, 다음을 포함한다: 유도체화된 알데히드 기를 포함하는 아글리콘 코어 구조; 및/또는 제1 당류 사슬로서 제1 당류 사슬은 유도체화된 카르복실 기를 포함하는 것; 및/또는 제2 당류 사슬로서 제2 당류 사슬은 유도체화된 적어도 하나의 아세톡시 기를 포함하는 것. 본 발명은 또한 본 발명의 사포닌 유도체를 포함하는 제1 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 제1 약학적 조성물 및 항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 임의의 하나 이상을 포함하는 제2 약학적 조성물을 포함하는 약학적 복합제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 암, 감염성 질환, 바이러스 감염, 고콜레스테롤혈증, 원발성 고옥살산뇨증, A 형 혈우병, B 형 혈우병, 알파-1 항트립신 관련 간 질환, 급성 간 포르피린증, 트랜스티레틴-매개 아밀로이드증, 또는 자가-면역 질환의 치료 또는 예방에서의 사용, 또는 의약으로서의 사용을 위한, 본 발명의 제1 약학적 조성물 또는 약학적 복합제에 관한 것이다. 추가로, 본 발명은 세포를 분자 및 본 발명의 사포닌 유도체와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포 외부로부터 세포 내부로 분자를 전달하는 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다.
표적 종양 요법은 암 세포의 성장 및 생존에 관여되는 특정 유전자 및 단백질을 표적화하는 약물을 사용하는 암 치료이다. 표적화 모이어티로서 항체를 함유하는 표적화된 독소인, 면역독소는 종양-특이적 항원에 대한 항체의 특이성을 결합하여, 그것들로 하여금 목표로 하는 작용 지점으로 독소를 보낼 수 있도록 하고, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 및 보체-의존성 세포독성과 같은 세포 살해 메커니즘을 추가적으로 도입할 수 있기 때문에 매우 유망하다. 그 효과를 보이기 위해서, 독소는 내재화 후 시토졸 내로 방출되어야 한다. 주요한 문제점은 페이로드(payload)를 지니는 표적화 모이어티가 종종 완전히 내재화되지 않는 것, 내재화 후 곧장 표면으로 재활용되는 것, 또는 리소좀에서 분해되어, 세포 시토졸 내로의 페이로드의 충분한 전달을 방해한다는 것이다. 종양 세포에 대한 독성 페이로드 농도를 보장하고 불충분한 시토졸 진입을 극복하기 위해, 표적화된 독소의 높은 혈청 수준이 요구되며 종종, 구체적으로 면역원성 및 혈관 누출 증후군을 포함한, 심각한 부작용을 초래한다. 따라서, 항체-약물 접합체(ADC)를 이용하여 암 환자를 치료할 때 충분히 넓은 치료 범위(therapeutic window)가 여전히 관심사이다.
불충분한 시토졸 진입 문제점에 대처하기 위해, 예를 들어 생합성 경로의 내생적 세포막 수송 복합체로의 독소의 재전송, 엔도솜 파괴, 엔도솜 막의 막 온전성 약화, 또는 세포 침투 펩티드의 사용과 관련된 몇몇 전략이 개발되었다.
예를 들어, 사포닌과 같은 글리코실화된 트리테르펜은 종양 요법에서, 리보솜-비활성화 단백질(RIP)과 같은, 표적화된 독소에 대한 엔도솜 탈출 증진제로서 작용하는 것으로 밝혀졌다. 사포닌의 구조-활성 관계 분석으로 다음의 코어 구조 요소의 존재가 RIP의 세포 독성을 증진시키는 사포닌의 능력에 유익한 것으로 보인다는 것이 드러났다 (X1 = H 또는 OH이고 X2 = 다당류 모이어티인 화학식 (I) 참고):
- C-3에 있고 글루쿠론산을 함유하는 분지형 삼-당류
- C-4에 있는 알데히드
- C-28에 있는 카르복시 기
- C-28 위치에 연결되고 아세틸 기를 함유하는 적어도 4 개의 당 모이어티의 다당류 모이어티(R2)
[화학식 (I)]
Figure pct00001
특히, 트리테르페노이드 사포닌인 SO1861(화학식 II, 때로는 SPT001로도 언급됨)은 종양-세포 표적화된 독소의 엔도솜 탈출을 증진시키기 위한 강력한 분자로 확인되었다. 증진제 메커니즘에 대한 이중 효과가 상정된다: 첫째, 엔도솜 탈출의 직접적인 증가로 카스파제-의존성 아폽토시스를 초래, 이는 둘째, 리소좀 막 파괴 후 카텝신 및 기타 가수분해 효소의 방출 후 야기되는, 리소좀-매개 세포 사멸 경로와 결합된다.
[화학식 (II)]
Figure pct00002
엔도솜 탈출 증진제로서의 사포닌의 적용은 이들 사포닌이 적혈구 막을 파열시키는 능력을 갖는다는 인식에 기반한다. 그러나, 동시에, 사포닌의 세포 파열 활성은 대상체가 이러한 사포닌을 이용하여 치료될 때 부작용(위험)에 기여하여, 치료 지수를 제한하는 것 때문에 최적의 치료 범위에 영향을 미친다. 실제로, 항-종양 요법이 필요한 환자에게 투여될 때, 이러한 사포닌의, 세포외로의 및/또는 세포내로의, 독성은 예를 들어 최적의 투약 요법 및 투여 경로 및 빈도가 고려될 때 중요하다.
트리테르펜 백본, 펜타사이클릭 C30 테르펜 골격(사포게닌 또는 아글리콘으로도 알려짐)의 구조, 당류 측쇄의 수 및 길이뿐만 아니라 백본에 연결된 당 잔기의 유형 및 연결 변이체를 포함한, 사포닌 자체의 화학적 조성의 모든 특성이 이러한 사포닌의 용혈 잠재력 및/또는 세포독성에 기여한다.
세포의 엔도솜 및 시토졸이 고려될 때 사포닌은 그 자체로는 표적-특이적이지 않으며, 사포닌은, 동일한 투여 경로가 고려될 때에도, 예상대로 그리고 매우 자주 표적화된 독소와는 다른 동역학으로 (인간) 대상체 내에서 분포한다. 따라서, 이를 필요로 하는 환자에게 예를 들어 ADC 및 사포닌을 포함하는 치료적 복합제 적용 후, 사포닌 분자는 임의의 기관에서 발견될 수 있어 특이성이 표적화된 독소에 의해서만 매개된다는 것을 암시한다. 전신에의 사포닌 분포는 표적 세포에의 특이적 축적과 비교할 때 성공적인 치료를 위해 더 높은 농도를 필요로 한다. 따라서, 적합한 치료 범위를 달성하기 위해, 체내 사포닌의 전신적 적용을 고려하여 성공적인 적용을 위해 변형된 사포닌의 독성이 충분히 낮을 필요가 있다.
키라야 사포나리아 사포닌이 WO2004/092329 및 WO93/05789로부터 추가로 알려져 있다. 사포닌의 합성 유사체는 그 중에서도 WO2015/184451로부터 알려져 있다.
따라서, 예를 들어 ADC와 함께 사포닌의 병용투여가 고려될 때 치료 지수를 향상시킬 필요가: ADC의 세포독성 효과 증강이 고려될 때 충분한 효능을 유지하는 동시에 사포닌의 세포독성을 더 잘 제어(또는 더 잘: 더 낮게)할 필요가 여전히 존재한다.
개요
놀랍게도, 본 발명자들은
- 사포닌의 아글리콘의 C-3에 결합되고 변형된 글루쿠론산을 함유하는 분지형 삼-당류 모이어티; 및/또는
- 사포닌의 아글리콘의 C-4에 있는 변형된 알데히드; 및/또는
- 사포닌의 아글리콘의 C-28 위치에 결합된 다당류 모이어티;
를 갖는, 변형된 사포닌, 즉 사포닌 유도체가 사포닌 유도체와 접촉된 세포의 세포 생존력이 고려될 때 감소된 독성을 갖는다는 것, 예를 들어 독소 세포독성 또는 BNA 매개 유전자 침묵의 증강이 고려될 때 활성을 갖는다는 것(임의의 이론에 얽매이기 원하지 않지만: 변형된 사포닌의 유사하거나 향상된 엔도솜 탈출 증진 활성과 관련됨) 및/또는 비변형된 사포닌의 독성, 활성 및 용혈 활성과 비교할 때, 감소된 용혈 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 이를 이용하여, 세포 독성에 대한 IC50 값 대 예를 들어 독소 증강 또는 유전자 침묵의 비율이 증가되고/증가되거나, 사포닌 용혈 활성에 대한 IC50 값 대 예를 들어 독소 증강 또는 유전자 침묵의 비율이 증가되기 때문에, 본 발명자들은 향상된 치료 범위를 갖는 사포닌 유도체를 제공한다.
본 발명의 제1 양태는 트리테르펜 아글리콘 코어 구조 및 아글리콘 코어 구조에 연결된 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬 중 적어도 하나를 포함하는 키라야 사포나리아(QS) 사포닌 기반 사포닌 유도체에 관한 것이며, 여기서:
i. 사포닌 유도체는 유도체화된 알데히드 기를 포함하는 아글리콘 코어 구조를 포함하거나;
ii. 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하며 여기서 제1 당류 사슬은, 유도체화된, 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하거나;
iii. 사포닌 유도체는 유도체화 i. 및 ii.의 조합, 바람직하게는 유도체화 i. 및 ii. 중 하나를 포함하며;
여기서 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬은 독립적으로 단당류, 선형 올리고당류 및 분지형 올리고당류로부터 선택된다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체가 기반으로 하는 상기 QS 사포닌은:
- C-4에 알데히드 기를 포함하는 상기 아글리콘 코어 구조; 및
- 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하는 제1 당류 사슬 중 적어도 하나를 추가로 포함한다.
구체적인 구현예에서, 사포닌 유도체가 기반으로 하는 사포닌은 키라야 사포나리아 (QS) 사포닌이다.
본 발명의 양태는 트리테르펜 아글리콘 코어 구조 및 아글리콘 코어 구조에 연결된 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬 중 적어도 하나를 포함하는 QS 사포닌 기반 사포닌 유도체에 관한 것이며; 상기 사포닌은:
C-4에 알데히드 기를 포함하는 상기 아글리콘 코어 구조; 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하는 제1 당류 사슬 중 적어도 하나를 추가로 포함하며;
여기서:
i. 사포닌 유도체는 유도체화된 알데히드 기를 포함하는 아글리콘 코어 구조를 포함하거나;
ii. 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하며 여기서 제1 당류 사슬은, 유도체화된, 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하거나
iii.사포닌 유도체는 유도체화 i. 및 ii.의 조합, 바람직하게는 1 개 유도체화 i. 또는 ii.를 포함하며;
여기서 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬은 독립적으로 단당류, 선형 올리고당류 및 분지형 올리고당류로부터 선택된다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌은 자연 발생 사포닌이다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 모노데스모시드 트리테르펜 글리코시드 또는 바이데스모시드 트리테르펜 글리코시드, 보다 바람직하게는 바이데스모시드 트리테르펜 글리코시드이다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 단, 사포닌 유도체는 화학식 (VI) 내지 (XXXIV)를 갖는 다음의 사포닌 유도체 중 임의의 하나가 아니다:
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 단, 사포닌 유도체는 화학식 (XL) 내지 (XLV)를 갖는 다음의 사포닌 유도체 중 임의의 하나가 아니다:
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
본 발명의 제2 양태는 본 발명에 따른 사포닌 유도체 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 제1 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제3 양태는 다음을 포함하는 약학적 복합제에 관한 것이다.
·본 발명의 제1 약학적 조성물, 및
·항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 임의의 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 제2 약학적 조성물.
본 발명의 제4 양태는 본 발명의 사포닌 유도체를 포함하고 항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-핵산 접합체 또는 수용체-리간드 - 핵산 접합체 중 임의의 하나 이상을 추가로 포함하고, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 제3 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제5 양태는, 의약으로서의 사용을 위한, 본 발명의 제1 약학적 조성물, 본 발명의 약학적 복합제 또는 본 발명의 제3 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제6 양태는, 암, 감염성 질환, 바이러스 감염, 고콜레스테롤혈증, 원발성 고옥살산뇨증, A 형 혈우병, B 형 혈우병, 알파-1 항트립신 관련 간 질환, 급성 간 포르피린증, 트랜스티레틴-매개 아밀로이드증, 또는 자가-면역 질환의 치료 또는 예방에서의 사용을 위한, 본 발명의 제1 약학적 조성물, 본 발명의 약학적 복합제 또는 본 발명의 제3 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제7 양태는 다음의 단계를 포함하는, 세포 외부로부터 상기 세포 내부로, 바람직하게는 상기 세포의 시토졸 내로 분자를 전달하는 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다:
a) 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)에서 제공된 세포 외부로부터 세포 내로 전달하기 위한 분자를 제공하는 단계;
c) 본 발명에 따른 사포닌 유도체를 제공하는 단계;
d) 단계 a)의 세포를 단계 b)의 분자 및 단계 c)의 사포닌 유도체와 시험관내 또는 생체외 접촉시켜, 세포 외부로부터 상기 세포 내로의 분자의 전달을 확립하는 단계.
정의
용어 "사포닌"은 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는 사포게닌인 친유성 아글리콘 코어와 결합된 하나 이상의 친수성 글리콘 모이어티를 포함하는 양친매성 글리코시드 그룹을 지칭한다. 사포닌은 자연 발생 또는 합성(즉, 비-자연 발생)일 수 있다. 용어 "사포닌"은 자연-발생 사포닌, 자연-발생 사포닌의 유도체 뿐만 아니라 화학적 및/또는 생명공학적 합성 경로를 통해 처음부터 합성되는 사포닌을 포함한다.
용어 "변형된 사포닌"은 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는 사포닌, 즉 사포닌 유도체를 지칭하며, 이는 변형된 사포닌을 제공하도록 화학적 변형이 되기 전 비-유도체화된 사포닌에서 알데히드 기, 카르복실 기, 아세테이트 기 및/또는 아세틸 기 중 임의의 것이 이전에 존재하였던 위치에 하나 이상의 화학적 변형을 갖는다. 예를 들어, 변형된 사포닌은 변형된 사포닌이 기반으로 하는 사포닌에서 알데히드 기, 카르복실 기, 아세테이트 기 및/또는 아세틸 기 중 임의의 하나 이상의 화학적 변형에 의해 제공된다. 즉, 사포닌이 제공되고 알데히드 기, 카르복실 기, 아세테이트 기 및/또는 아세틸 기 중 임의의 것이 화학적으로 변형되어 변형된 사포닌을 제공한다. 예를 들어, 변형된 사포닌을 제공하도록 변형된 사포닌은 자연 발생 사포닌이다. 전형적으로, 변형된 사포닌은 합성 사포닌이며, 전형적으로 변형된 사포닌은 천연 사포닌의 변형이고, 따라서 천연 사포닌으로부터 유도되지만, 변형된 사포닌은 천연 대응물을 가질 수 있거나 가지지 않을 수 있는 합성 사포닌으로부터도 유도될 수 있다. 전형적으로, 변형된 사포닌은 천연 대응물을 가지지 않고, 즉, 변형된 사포닌은 예를 들어 식물 또는 나무에 의해 자연적으로 생산되지 않는다.
용어 "반-합성 사포닌 유도체"는 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는 사포닌이 자연에서 발견될 것인 사포닌의 합성적 변형을 지칭한다. 따라서, 키라야 사포나리아 몰리나(Quillaja saponaria Molina) 나무의 수피로부터 단리되는, QS-7, QS-17, QS-18, 및 QS-21과 같은, 자연 발생 사포닌 자체 또는 Quil-A 성분은 용어 "반-합성 사포닌 유도체"에 포함되지 않는다. 반-합성 사포닌 유도체는, 단리되어 화학적 변환을 거친, 단리된 자연 발생 사포닌으로 해석되어야 한다. 결과적으로, 실험실 규모 또는 산업 규모에서 수행되는 생물적-변환 또는 효소적 변환을 거치는, 자연 발생 사포닌 또한 용어 "합성 사포닌 유도체"에 포함된다. 이러한 사포닌의 예시로는 비아실화된 사포닌(데아실 사포닌 또는 탈아실화된 사포닌 또는 데스아실 사포닌으로도 알려짐)이 있으며, 이는 알칼리성 가수분해를 통하여 그 자체가 트리테르펜의 28-위치에 부착된, 올리고당류 잔기로부터 아실 또는 아실오일 기를 제거하도록 변형된다.
용어 "합성 사포닌 유도체"는 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는 화학적 및/또는 생명공학적 합성 경로를 통해, 예를 들어 합성 아글리콘 코어 구조 중간체를, 탄수화물 치환기 또는 당류 모이어티 또는 당류 사슬과 같은, 치환기에 커플링함으로써, 사포닌을 처음부터 합성하는 것을 지칭한다.
용어 "아글리콘 코어 구조"는 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는 1 개 또는 2 개의 탄수화물 안테나 또는 당류 사슬(글리칸)이 결합되지 않은 사포닌의 아글리콘 코어를 지칭한다. 예를 들어, 키라산(키라산)은 SO1861, QS-7 및 QS21에 대한 아글리콘 코어 구조이다. 전형적으로, 사포닌의 글리칸은, 선형 또는 분지형 글리칸과 같은, 단-당류 또는 올리고-당류이다.
용어 "QS21" 또는 "QS-21"은, 추가로 명시되지 않는 한, 도 41에 나타난 구조식을 갖는, QS21의 이성질체 중 임의의 하나 뿐만 아니라, 도 41에 나타난 이성질체 중 둘 이상, 예컨대 모두의 혼합물을 지칭한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 전형적인 QS21 포함 천연 추출물은 QS21의 상이한 이성질체들의 혼합물을 포함할 것이다.
용어 "당류 사슬"은 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는 글리칸, 탄수화물 안테나, 단일 당류 모이어티(단-당류) 또는 다중 당류 모이어티(올리고당류, 다당류)를 포함하는 사슬 중 임의의 것을 지칭한다. 당류 사슬은 오직 당류 모이어티로만 구성될 수 있거나 또는, 예를 들어 QS-21에 존재하는 것과 같은, 4E-메톡시신남산, 4Z-메톡시신남산, 및 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산) 중 임의의 하나와 같은 모이어티를 추가로 포함할 수 있다.
용어 "화학적으로 변형된"은 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는 제2 화학 기 또는 제2 화학 모이어티가 제공되도록 하는 제1 화학 기 또는 제1 화학 모이어티의 화학적 변형을 지칭한다. 예시로는 카르보닐 기의 -(H)C-OH 기로의 화학적 변형, 아세테이트 기의 하이드록실 기로의 화학적 변형, 그의 알데히드 기에서 화학 반응 등을 통해 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH) 모이어티와 접합된 사포닌 제공 등이 있다.
용어 "화학적으로 변형된 알데히드 기"는 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는 사포닌의 알데히드 기를 수반하여 처음의 알데히드 기의 새로운 화학 기로의 대체를 초래하는 화학 반응에 의해 수득되는 화학 반응 생성물을 지칭한다. 예를 들어, 사포닌의 처음 알데히드 기로부터 -(H)C-OH 기의 형성.
용어 "화학적으로 변형된 카르복실 기"는 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는, 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기와 같은, 사포닌의 카르복실 기, 및 추가 분자를 수반하여 처음의 카르복실 기의 새로운 화학 기로의 대체를 초래하는 화학 반응에 의해 수득되는 화학 반응 생성물을 지칭한다. 예를 들어, 사포닌의 글루쿠론산의 카르복실 기를 수반하는, 사포닌과 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(AMPD), N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM) 또는 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HATU) 중 임의의 하나 간의 접합체 형성.
당류 사슬 명칭의 맥락에서 용어 "Api/Xyl-" 또는 "Api- 또는 Xyl-"은 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는 아피오스(Api) 모이어티를 포함하거나, 자일로스(Xyl) 모이어티를 포함하는 당류 사슬을 지칭한다.
용어 "변형된 사포닌이 기반으로 하는 사포닌"은 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는 변형된 사포닌을 제공하기 위해 변형된 사포닌을 지칭한다. 전형적으로, 변형된 사포닌이 기반으로 하는 사포닌은 자연 발생 사포닌이며, 이는 변형된 사포닌을 제공하도록 화학적 변형을 거친다.
용어 "사포닌 기반 변형된 사포닌"은 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는 변형된 사포닌이 제공되도록 화학적 변형 단계를 거친 사포닌을 지칭하며, 여기서 변형된 사포닌이 만들어진 사포닌은 전형적으로 자연 발생 사포닌이다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는 특히 DNA, 변형된 DNA, RNA, mRNA, 변형된 RNA, BNA와 같은, 단일-가닥 분자 또는 이중-가닥 분자로 제시되는, 합성 핵산, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO, AON), 짧은 또는 작은 간섭 RNA(siRNA; 침묵 RNA), 안티-센스 DNA, 안티-센스 RNA 등을 포함하는 임의의 천연 또는 합성 핵산 열을 지칭한다.
용어 "항체-약물 접합체" 또는 "ADC"는 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는 IgG, Fab, scFv, 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 하나 또는 다수의 VH 도메인, 단일- 도메인 항체, VHH, 낙타과 VH 등과 같은 항체와, 활성 약학적 성분, 독소, 올리고뉴클레오티드, 효소, 소분자 약물 화합물 등과 같이, 인간 환자와 같은 대상체의 세포와 접촉될 때 치료적 효과를 미칠 수 있는 임의의 분자의 임의의 접합체를 지칭한다.
용어 "항체-올리고뉴클레오티드 접합체" 또는 "AOC"는 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는 IgG, Fab, scFv, 면역글로불린, 면역글로불린 단편, 하나 또는 다수의 VH 도메인, 단일- 도메인 항체, VHH, 낙타과 VH 등과 같은 항체와, DNA, 변형된 DNA, RNA, mRNA, 변형된 RNA, BNA와 같은, 단일-가닥 분자 또는 이중-가닥 분자로 제시되는, 합성 핵산, 안티센스 올리고뉴클레오티드(ASO), 짧은 또는 작은 간섭 RNA(siRNA; 침묵 RNA), 안티-센스 DNA, 안티-센스 RNA 등을 포함하는 천연 또는 합성 핵산 열로부터 선택되는 올리고뉴클레오티드와 같이, 인간 환자와 같은 대상체의 세포와 접촉될 때 치료적 효과를 미칠 수 있는 임의의 올리고뉴클레오티드 분자의 임의의 접합체를 지칭한다.
예를 들어 공유결합 접합체의 부분으로서 이펙터 분자를 지칭할 때 용어 "이펙터 분자", 또는 "이펙터 모이어티"는 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는 예를 들어 표적 분자: 단백질, 펩티드, 탄수화물, 글리칸과 같은 당류, (인)지질, DNA, RNA와 같은 핵산, 효소 중 임의의 하나 이상에 선택적으로 결합할 수 있고, 이러한 하나 이상의 표적 분자(들)의 생물학적 활성을 조절하는 분자를 지칭한다. 이펙터 분자는 예를 들어 약물 분자와 같은 소분자, 단백질 독소와 같은 독소, BNA와 같은 올리고뉴클레오티드, 제노 핵산 또는 siRNA, 효소, 펩티드, 단백질, 또는 이들의 조합 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 분자이다. 따라서, 예를 들어, 이펙터 분자 또는 이펙터 모이어티는, 표적 분자: 단백질, 펩티드, 탄수화물, 글리칸과 같은 당류, (인)지질, DNA, RNA와 같은 핵산, 효소 중 임의의 하나 이상에 선택적으로 결합할 수 있고, 표적 분자에 결합한 결과 이러한 하나 이상의 표적 분자(들)의 생물학적 활성을 조절하는, 약물 분자와 같은 소분자, 단백질 독소와 같은 독소, BNA와 같은 올리고뉴클레오티드, 제노 핵산 또는 siRNA, 효소, 펩티드, 단백질, 또는 이들의 임의의 조합 중 임의의 하나 이상으로부터 선택되는 분자 또는 모이어티이다. 전형적으로, 이펙터 분자는 인간 세포와 같은 포유류 세포와 같은 세포 내부, 예컨대 상기 세포의 시토졸에서 생물학적 효과를 미칠 수 있다. 따라서 전형적인 이펙터 분자는 약물 분자, 플라스미드 DNA, 항체-약물 접합체(ADC)에 포함된 독소와 같은 독소, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체(AOC)에 포함된 siRNA, BNA, 핵산과 같은 올리고뉴클레오티드이다. 예를 들어, 이펙터 분자는 (세포내) 효소 활성, 유전자 발현, 또는 세포 신호 전달을 증가 또는 감소시킬 수 있는 리간드로 작용할 수 있는 분자이다.
용어 "HSP27"은 세포에서 HSP27의 발현을 침묵시키는 BNA 분자에 관한 것이다.
"잠금 핵산" 또는 줄여서 "LNA", 또는 2'-O,4'-C-아미노에틸렌 또는 2'-O,4'-C-아미노메틸렌 가교된 핵산(BNANC)을 지칭하는, 용어 "가교된 핵산", 또는 줄여서 "BNA"는 그의 일반의 과학적 의미를 가지며 여기서는 변형된 RNA 뉴클레오티드를 지칭한다. BNA는 또한 '구속 RNA 분자' 또는 '접근할 수 없는 RNA 분자'로 지칭된다. BNA 모노머는 "고정된" C3'-엔도 당 주름잡힘을 갖는 5-원, 6-원 또는 심지어 7-원 가교된 구조를 함유할 수 있다. 가교는 리보스의 2',4'-위치에 합성적으로 포함되어 2',4'-BNA 모노머를 제공한다. BNA 모노머는 당업계에 공지된 표준 포스포라미다이트 화학을 사용하여 올리고뉴클레오티드 폴리머 구조 내로 포함될 수 있다. BNA는 결합 친화성 및 안정성이 증가된 구조적으로 단단한 올리고뉴클레오티드이다.
용어 "C-4에 있는 알데히드" 또는 "사포닌의 아글리콘의 C-4에 있는 변형된 알데히드"는 사포닌의 아글리콘에 대해 알데히드 기 또는 알데히드 기로부터 유도된 변형된 기의 위치를 찾기 위하여 사용되며 분자 1에서 볼 수 있다. 전형적으로, 키라산 아글리콘 코어 및 깁소게닌 아글리콘 코어는 C-4에 연결된 알데히드 기를 갖는다. 동시에, 상기 알데히드 기의 동일한 위치는 또한 분자 1에서 볼 수 있는 바와 같이 키라산 또는 깁소게닌의 위치 C23에 있는 것으로도 정의될 수 있다. 따라서, 알데히드 기 위치의 두 가지 정의는 둘 모두 사용될 수 있다.
상세한 설명 및 청구범위에서 용어 제1, 제2, 제3 등은 예를 들어 유사한 요소, 조성물, 조성물의 구성 성분, 또는 개별적인 방법 단계 간의 구별을 위해 사용되며, 반드시 순차적 또는 발생 순서를 기술하기 위함은 아니다. 용어는 적절한 상황 하에서 상호 교환 가능하며 본 발명의 구현예는, 달리 명시되지 않는 한, 본원에 기술되거나 설명된 것과 다른 순서로 작동할 수 있다.
본원에 기술된 본 발명의 구현예는, 달리 명시되지 않는 한, 조합 및 협동하여 작동할 수 있다.
추가로, 다양한 구현예는, "바람직한" 또는 "예컨대" 또는 "예를 들어" 또는 "구체적으로" 등으로 지칭되지만, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 보다는 본 발명이 실행될 수 있는 예시적인 방식으로서 해석되어야 한다.
청구범위에 사용된, 용어 "포함하는"은 이후에 나열되는 예를 들어 요소 또는 방법 단계 또는 조성물의 구성 성분으로 제한되는 것으로 해석되지 않아야 하고; 다른 요소 또는 방법 단계 또는 일정 조성물의 구성 성분을 배제하지 않는다. 언급된 특징, 정수, (방법) 단계 또는 구성 성분의 존재를 언급된 대로 명시하는 것으로 해석되어야 하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계 또는 구성 성분, 또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 따라서, 표현 "단계 A 및 B를 포함하는 방법"의 범위는 오직 단계 A 및 B로 구성된 방법으로 제한되지 않아야 하며, 오히려 본 발명과 관련하여, 방법의 유일한 열거된 단계가 A 및 B이고, 추가로 청구범위는 그들 방법 단계의 등가물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 표현 "성분 A 및 B를 포함하는 조성물"의 범위는 오직 성분 A 및 B로 구성된 조성물로 제한되지 않아야 하며, 오히려 본 발명과 관련하여, 조성물의 유일한 열거된 성분이 A 및 B이고, 추가로 청구범위는 그들 성분의 등가물을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
또한, 부정관사 "a" 또는 "an"에 의한 요소 또는 성분의 언급은, 하나 및 오직 하나의 요소 또는 성분이 존재하는 것으로 문맥이 명확하게 요구하지 않는 한, 하나 초과의 요소 또는 성분이 존재할 가능성을 배제하지 않는다. 따라서 부정관사 "a" 또는 "an"은 일반적으로 "적어도 하나"를 의미한다.
도 1: 분자 3A의 합성
도 2: 분자 6의 합성
도 3: 분자 8의 합성
도 4: 분자 9의 합성
도 5: 분자 10의 합성
도 6: 분자 11의 합성
도 7: 분자 12의 합성
도 8: 분자 14의 합성
도 9: 분자 15의 합성
도 10: 분자 16의 합성
도 11: 분자 18의 합성
도 12: 분자 19의 합성
도 13: 분자 20의 합성
도 14: 분자 21의 합성
도 15: 분자 6의 질량-크로마토그램
도 16: SO1861로부터 시작하는 분자 6 합성의 질량-크로마토그램 세부 사항
도 17: 분자 6으로부터 시작하는 분자 9의 질량-크로마토그램 세부 사항
도 18a: EGFR 발현 세포(HeLa) 상에서 비-효과적 고정 농도 5 pM EGF-디안틴 존재 하에서의 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 18b: EGFR 발현 세포(A431) 상에서 비-효과적 고정 농도 5 pM EGF-디안틴의 존재 하에서의 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선. 도 18b에서의 y-축은 도 18a에서와 동일한 y-축이다.
도 19a: EGFR 발현 세포(HeLa) 상에서 비-효과적 고정 농도 5 pM EGF-디안틴의 존재 하에서의 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 19b: EGFR 발현 세포(A431) 상에서 비-효과적 고정 농도 5 pM EGF-디안틴의 존재 하에서의 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선. 도 19b에서의 y-축은 도 19a에서와 동일한 y-축이다.
도 20a: EGFR 발현 세포(HeLa) 상에서 비-효과적 고정 농도 5 pM EGF-디안틴의 존재 하에서의 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 20b: EGFR 발현 세포(A431) 상에서 비-효과적 고정 농도 5 pM EGF-디안틴의 존재 하에서의 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선. 도 20b에서의 y-축은 도 20a에서와 동일한 y-축이다.
도 21a: EGFR 발현 세포(HeLa) 상에서 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 21b: EGFR 발현 세포(A431) 상에서 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선. 도 21b에서의 y-축은 도 21a에서와 동일한 y-축이다.
도 22: 인간 적혈구 용혈 분석에 의해 결정된 사포닌 유도체의 용혈 활성
도 23a: EGFR 발현 세포(HeLa) 상에서 비-효과적 고정 농도 5 pM EGF-디안틴의 존재 하에서의 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 23b: EGFR 발현 세포(A431) 상에서 비-효과적 고정 농도 5 pM EGF-디안틴의 존재 하에서의 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 24a: EGFR 발현 세포(HeLa) 상에서 비-효과적 고정 농도 5 pM EGF-디안틴의 존재 하에서의 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 24b: EGFR 발현 세포(A431) 상에서 비-효과적 고정 농도 5 pM EGF-디안틴의 존재 하에서의 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 25a: EGFR 발현 세포(HeLa) 상에서 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 25b: EGFR 발현 세포(A431) 상에서 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 26a: EGFR 발현 세포(HeLa) 상에서 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 26b: EGFR 발현 세포(A431) 상에서 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 27: 인간 적혈구 용혈 분석에 의해 결정된 사포닌 유도체의 용혈 활성.
도 28: 인간 적혈구 용혈 분석에 의해 결정된 사포닌 유도체의 용혈 활성
도 29: 인간 적혈구 용혈 분석에 의해 결정된 사포닌 유도체의 용혈 활성
도 30a: EGFR 발현 세포(HeLa) 상에서 비-효과적 고정 농도 5 pM EGF-디안틴의 존재 하에서의 사포닌 유도체의 활성에 대한 IC50-곡선
도 30b: EGFR 발현 세포(A431) 상에서 비-효과적 고정 농도 5 pM EGF-디안틴의 존재 하에서의 사포닌 유도체의 활성에 대한 IC50-곡선
도 31a: EGFR 발현 세포(HeLa) 상에서 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 31b: EGFR 발현 세포(A431) 상에서 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-곡선
도 32: 인간 적혈구 용혈 분석에 의해 결정된 사포닌 유도체의 용혈 활성
도 33a: EGFR 발현 세포(HeLa) 상에서 농도 5 pM 세툭시맙-사포린의 존재 하에서의 다양한 QS 사포닌 분획물의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 33b: EGFR 발현 세포(A431) 상에서 농도 5 pM 세툭시맙-사포린의 존재 하에서의 다양한 QS 사포닌 분획물의 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50-곡선
도 34a: EGFR 발현 세포(HeLa) 상에서 QS 사포닌 분획물의 독성에 대한 IC50-곡선
도 34b: EGFR 발현 세포(A431) 상에서 QS 사포닌 분획물의 독성에 대한 IC50-곡선
도 35: 인간 적혈구 용혈 분석에 의해 결정된 QS 사포닌 분획물의 용혈 활성
도 36: 분자 23의 합성
도 37: 분자 25의 합성
도 38: 분자 27의 합성
도 39: 분자 28의 합성
도 40a: 분자 29의 합성
도 40b: QS21-Ald-EMCH (분자 30)
도 40c : QS21-Glu-AMPD (분자 31)
도 40d: QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD) (분자 32)
도 40e: QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD) (분자 33)
도 41: 네 가지 QS-21 이성질체의 구조
도 42: 임계 마이셀 농도 결정: 단일-변형된 SO1861에 대한 ANS 형광 수율.
도 43: 임계 마이셀 농도 결정: 이-변형된 SO1861에 대한 ANS 형광 수율.
도 44: 임계 마이셀 농도 결정: 삼-변형된 SO1861에 대한 ANS 형광 수율.
도 45: 임계 마이셀 농도 결정: QS 사포닌에 대한 ANS 형광 수율.
도 46: 임계 마이셀 농도 결정: QS21에 대한 ANS 형광 수율.
도 47a: 임계 마이셀 농도 결정: 변형된 QS21에 대한 ANS 형광 수율.
도 47 b: 임계 마이셀 농도 결정: 단일-변형된 QS21에 대한 ANS 형광 수율.
도 47c: 임계 마이셀 농도 결정: 이-변형된 QS21에 대한 ANS 형광 수율.
도 48: A431 세포 상에서 SO1861 또는 SO1861-EMCH + 10 pM 세툭시맙-사포린의 세포 생존력 분석(MTS).
도 49: A431 세포 상에서 세툭시맙-디안틴 + 300 nM 및 4000 nM SO1861-EMCH의 세포 생존력 분석(MTS).
도 50: A431 세포 상에서 세툭시맙-사포린 + 300 nM 및 1500 nM SO1861 또는 4000 nM SO1861-EMCH의 세포 생존력 분석(MTS).
도 51: A431 세포 상에서 SO1861 또는 SO1861-EMCH + 10 pM EGF디안틴의 세포 생존력 분석(MTS).
도 52a, 도 52b: A431 세포 상에서 EGF디안틴 + 10 nM, 300 nM 및 1500 nM SO1861 또는 4829 nM SO1861-EMCH의 세포 생존력 분석(MTS).
도 53a, 도 53b: A431 세포 상에서 트라스투주맙-디안틴 또는 트라스투주맙-사포린 + 1500 nM SO1861 또는 4000 nM SO1861-EMCH의 세포 생존력 분석(MTS).
도 54: A431 세포 상에서 SO1861-EMCH + 100 nM HSP27BNA, 100 nM 세툭시맙-HSP27BNA의 HSP27 mRNA 유전자 침묵 분석.
도 55: A431 세포 상에서 세툭시맙-HSP27BNA 접합체(DAR1.5 또는 DAR4) + 100 nM SO1861-EMCH 또는 4000 nM SO1861-EMCH의 HSP27 mRNA 유전자 침묵 분석.
도 56: SK-BR-3 세포 상에서 트라스투주맙-HSP27BNA 접합체(DAR4.4) + 100 nM SO1861-EMCH 또는 4000 nM SO1861-EMCH의 HSP27 mRNA 유전자 침묵 분석.
도 57a, 도 57b: A431 세포 및 A2058 세포 상에서 HSP27BNA + 4000 nM SO1861-EMCH의 HSP27 mRNA 유전자 침묵 분석.
도 58: SK-BR-3 세포 상에서 HSP27BNA 또는 HSP27LNA + 4829 nM SO1861-EMCH의 HSP27 mRNA 유전자 침묵 분석.
도 59: 분자 26의 합성.
도 60: 티올과 EMCH 말레이미드 기의 마이클 첨가 반응(Michael addition reaction)에 대한 일반 반응식(R = CH2-CH2-OH인 경우 도 60은 SO1861-Ald-EMCH-차단(SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올)의 합성을 기술한다).
도 61: (A) SO1861-Ald-EMCH 및 (B) SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼. (A) RP 모드: m/z 2124 Da([M+K]+, 사포닌-Ald-EMCH), m/z 2109 Da([M+K]+, SO1861-Ald-EMCH), m/z 2094 Da([M+Na]+, SO1861-EMCH). (B) RP 모드: m/z 2193 Da([M+K]+, 사포닌-Ald-EMCH-메르캅토에탄올), m/z 2185 Da([M+K]+, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올), m/z 2170 Da([M+Na]+, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올).
도 62: pH 3의 HCl 용액에서의 가수분해 (도 62a) 전 및 (도 62b) 후의 SO1861-EMCH의 MALDI-TOF-MS 스펙트럼.
도 63. 비접합 사포닌-매개 엔도솜 탈출 및 표적 세포 살해 증진. A) 1.5 pM EGF디안틴의 존재 또는 부재 하에서 SO1861, SO1832, SO1862(SO1861의 이성질체) 또는 SO1904로 처리된 HeLa 세포(EGFR+)의 세포 생존력 분석 B) EGF디안틴 및 고정 농도의 SO1861, SO1832, SO1862(SO1861의 이성질체) 또는 SO1904로 처리된 HeLa 세포(EGFR+)의 세포 생존력 분석. C) 1.5 pM EGF디안틴의 존재 또는 부재 하에서 SO1861 또는 GE1741로 처리된 HeLa 세포(EGFR+)의 세포 생존력 분석. D) 1.5 pM EGF디안틴의 존재 또는 부재 하에서 다양한 QS혼합물(키라야 사포나리아 유래 사포닌 혼합물)로 처리된 HeLa 세포(EGFR+)의 세포 생존력 분석. 도 63b 및 도 63d의 y축은 도 63a의 y축과 동일하다.
도 64. 비접합 SO1861 대 SO1861-Ald-EMCH 활성. 본 발명에 따른, 암 세포에서의 EGFR 표적화된 안티센스 BNA 올리고 전달 및 유전자 침묵. A, B, C) 1.5 pM EGF디안틴의 존재 또는 부재 하에서 SO1861 또는 SO1861-Ald-EMCH로 처리된 A431(EGFR++), HeLa(EGFR+) 또는 A2058(EGFR-) 세포의 세포 생존력 분석. D, E) 1.5 pM EGF디안틴의 존재 또는 부재 하에서 SO1861 또는 SO1861-L-N3(SO1861-N3 또는 SO1861-N3/아지드로도 지칭됨)로 처리된 A431(EGFR++) 또는 HeLa(EGFR+) 세포의 세포 생존력 분석. 도 64b, 도 64c 및 도 64e의 y축은 도 64a의 y축과 동일하다.
도 65. 비접합 SO1861 대 SO1861-Ald-EMCH(불안정한 히드라존 결합) 대 SO1861-HATU(SO1861-(S)(안정) 및 SO1861-Glu-HATU로도 지칭됨). EGF디안틴의 존재 또는 부재 하에서, SO1861, SO1861-Glu-HATU(SO1861-(S) (S=HATU)로도 지칭됨) 및 SO1861-Ald-EMCH(SO1861 아글리콘 코어와 EMCH 링커 사이의 히드라존 결합은 '불안정한 링커'로도 지칭된다)로 처리된 HeLa 세포(EGFR+)의 세포 생존력 분석.
도 66: A) EGFR 발현 세포(HeLa) 및 B) EGFR 발현 세포(A431) 상에서 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-그래프. 도 66b의 y축은 도 66a의 y축과 동일하다.
도 67: 인간 적혈구 용혈 분석에 의해 결정된 사포닌 유도체의 용혈 활성.
도 68: A) EGFR 발현 세포(HeLa) 및 B) EGFR 발현 세포(A431) 상에서 사포닌 유도체의 독성에 대한 IC50-그래프. 도 68b의 y축은 도 68a의 y축과 동일하다.
도 69: A) EGFR 발현 세포(HeLa) 및 B) EGFR 발현 세포(A431) 상에서 사포닌의 독성에 대한 IC50-그래프. 도 69b의 y축은 도 69a의 y축과 동일하다.
도 70: 인간 적혈구 용혈 분석에 의해 결정된 사포닌 및 사포닌 유도체의 용혈 활성.
도 71: SO1861 및 SO1861-EMCH의 영향 하에서의 적혈구 용해.
도 72: SO1831-Ald-EMCH의 분자 구조.
도 73: 도 73의 A) 에스신; 및 도 73의 B) SO1831, SO1831-Ald-EMCH('SO1831-EMCH')의 마이셀 형성.
본 발명은 구체적인 구현예에 대하여 기술될 것이지만 본 발명은 그에 제한되지 않고 오직 청구범위에 의해서만 제한된다.
놀랍게도, 본 발명자들은 다음의 그룹:
- 사포닌의 아글리콘의 C-3에 결합되고 변형된 글루쿠론산을 함유하는 분지형 삼-당류 모이어티; 및/또는
- 사포닌의 아글리콘의 C-4에 있는 변형된 알데히드; 및/또는
- 사포닌의 아글리콘의 C-28 위치에 결합된 다당류 모이어티;
를 갖는, 변형된 사포닌, 즉 사포닌 유도체가 사포닌 유도체와 접촉된 세포의 세포 생존력이 고려될 때 감소된 독성을 갖는다는 것; 변형된 사포닌에서 상기 언급된 그룹 중 하나 또는 둘이 유도체화되는 경우(즉, 다음 중 하나 또는 둘: 아글리콘의 알데히드 기, 아글리콘의 C-3에 결합된 다당류 사슬에서의 글루쿠론산의 카르복실 기), 예를 들어 독소 세포독성 또는 BNA 매개 유전자 침묵의 증강이 고려될 때 활성을 갖는다는 것(임의의 이론에 얽매이기 원하지 않지만: 변형된 사포닌의 유사하거나 향상된 엔도솜 탈출 증진 활성과 관련됨); 및/또는, 비변형된 사포닌의 독성, 활성 및 용혈 활성과 비교할 때, 감소된 용혈 활성을 갖는다는 것을 발견하였다. 사포닌 유도체의 경우, 세포독성이 이들의 자연 발생 대응물에 대해 결정된 세포독성보다 더 낮고, 용혈 활성이 사포닌 유도체의 자연 발생 대응물에 대해 결정된 용혈 활성보다 더 낮기 때문에, 그리고 단일 유도체화된 사포닌 및 이중-유도체화된 사포닌의 경우, 세포 독성에 대한 IC50 값 대 예를 들어 독소 증강 또는 유전자 침묵의 비율이 유사하거나 증가되고/증가되거나, 사포닌 용혈 활성에 대한 IC50 값 대 예를 들어 독소 증강 또는 유전자 침묵의 비율이 유사하거나 증가되기 때문에, 본 발명자들은 향상된 치료 범위를 갖는 사포닌 유도체를 제공한다. 예시된 사포닌 유도체의 개관에 대해서는 표 A2를, 도 1 내지 도 14 및 도 36 내지 도 40 및 도 66 내지 도 70과 결합하여 참조하고, 세포독성, 용혈 활성 및 엔도솜 탈출 증진 활성('활성')의 개관 뿐만 아니라, 다양한 세포 상에서 결정된, 세포독성에 대한 IC50 대 활성에 대한 IC50의 비율, 및 용혈 활성에 대한 IC50 대 활성에 대한 IC50의 비율의 개관에 대해서는 표 A5 및 표 A6 및 표 A12를 참조한다.
본 발명의 제1 양태는 트리테르펜 아글리콘 코어 구조('아글리콘'으로도 지칭됨) 및 아글리콘 코어 구조에 연결된 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬 중 적어도 하나를 포함하는 사포닌 기반 사포닌 유도체에 관한 것이며, 여기서:
i. 사포닌 유도체는 유도체화된 알데히드 기를 포함하는 아글리콘 코어 구조를 포함하거나;
ii. 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하며 여기서 제1 당류 사슬은, 유도체화된, 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하거나;
iii. 사포닌 유도체는 유도체화 i., ii. 중 임의의 조합, 바람직하게는 i. 및 ii. 중 1 개 유도체화를 포함하며;
여기서 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬은 독립적으로 단당류, 선형 올리고당류 및 분지형 올리고당류로부터 선택된다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체가 기반으로 하는 상기 사포닌은:
- C-4에 알데히드 기를 포함하는 상기 아글리콘 코어 구조; 및
- 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하는 제1 당류 사슬 중 적어도 하나를 추가로 포함한다.
구체적인 구현예에서, 사포닌 유도체가 기반으로 하는 사포닌은 키라야 사포나리아 (QS) 사포닌이다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌은 자연 발생 사포닌이다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 유도체화된 알데히드 기를 포함하는 아글리콘 코어 구조를 포함한다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 반-합성 사포닌 유도체이다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 5000 g/mol 미만, 바람직하게는 4000 g/mol 미만, 보다 바람직하게는 3000 g/mol 미만, 가장 바람직하게는 2500 g/mol 미만의 분자량, 및/또는 1000 g/mol 초과, 바람직하게는 1500 g/mol 초과, 보다 바람직하게는 1800 g/mol 초과의 분자량을 갖는다.
본 발명의 양태는 트리테르펜 아글리콘 코어 구조 및 아글리콘 코어 구조에 연결된 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬 중 적어도 하나를 포함하는 키라야 사포나리아(QS) 사포닌 기반 사포닌 유도체이며; 상기 사포닌은:
C-4에 알데히드 기를 포함하는 상기 아글리콘 코어 구조; 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하는 제1 당류 사슬 중 적어도 하나를 추가로 포함하며; 여기서:
i. 사포닌 유도체는 유도체화된 알데히드 기를 포함하는 아글리콘 코어 구조를 포함하거나;
ii. 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하며 여기서 제1 당류 사슬은, 유도체화된, 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하거나
iii. 사포닌 유도체는 유도체화 i. 및 ii.의 조합, 바람직하게는 유도체화 i. 및 ii. 중 하나를 포함하며;
여기서 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬은 독립적으로 단당류, 선형 올리고당류 및 분지형 올리고당류로부터 선택된다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며 단, 사포닌 유도체는 화학식 (VI) 내지 (XII)를 갖는 다음의 사포닌 유도체 중 임의의 하나가 아니다:
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며 단, 사포닌 유도체는 키라야 사포나리아 사포닌으로부터 유도되고 화학식 (XIII) 내지 (XXI)을 갖는 다음의 사포닌 유도체 중 임의의 하나가 아니다:
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며 단, 사포닌 유도체는 화학식 (XXII) 내지 (XXXIV)를 갖는 다음의 사포닌 유도체 중 임의의 하나가 아니다:
Figure pct00029
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며 단, 사포닌 유도체는 화학식 (XXXV) 내지 (XXXIX)를 갖는 다음의 합성 사포닌 중 임의의 하나가 아니다:
Figure pct00035
Figure pct00036
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며 단, 사포닌 유도체는 화학식 (XL) 내지 (XLV)를 갖는 다음의 합성 사포닌 중 임의의 하나가 아니다:
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
Figure pct00042
바람직한 구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며 단, 사포닌 유도체는 키라야 사포나리아 사포닌의 유도체이다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 모노데스모시드 트리테르펜 글리코시드 또는 바이데스모시드 트리테르펜 글리코시드, 보다 바람직하게는 바이데스모시드 트리테르펜 글리코시드이다.
바람직한 구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 위치 C-23에 알데히드 작용을 갖는 12,13-데하이드로올레아난 유형에 속하고 선택적으로 사포닌의 C-3베타-OH 기에서의 탄수화물 치환기에 글루쿠론산 작용을 포함하는 트리테르페노이드 사포닌 및/또는 비스데스모시드 트리테르펜 사포닌의 유도체, 및/또는 키라야 사포나리아 종으로부터 단리된 사포닌의 유도체이다.
바람직한 구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌은 12,13-데하이드로올레안 유형에 속한다.
놀랍게도, 사포닌의 아글리콘의 C-23에 있는 알데히드 기, 및 아글리콘의 C-3에 있는 당류 모이어티, 즉 글루쿠론산 모이어티에서의 카르복실 기 중 임의의 1, 또는 2개의 변형(유도체화)은, 이러한 사포닌 유도체가 세포, 즉 다양한 유형의 세포와 접촉될 때 세포독성의 감소를 초래한다. 세포독성의 감소는 표 A2, 표 A3, 표 A12 및 도 1 내지 도 14 및 도 36 내지 도 40 및 도 66 내지 도 70에 나열된 일련의 여러 가지 사포닌 유도체에 대해 본 발명자들에 의해 확립되었다. 따라서 세포독성이 감소된 이들 일련의 사포닌 유도체가 제공되는 것이 본 발명의 일부이며, 여기서 세포독성의 감소는 비변형된 자연 발생 사포닌 대응물에 대해 결정된 세포독성에 상대적이다. 사포닌 유도체는 이러한 자연 발생 사포닌으로부터 형성될 수 있다. 전형적으로, 본 발명의 사포닌 유도체는, QS-21(이소형)과 같이, 자연에 존재하는, 자연 발생 대응물과 비교할 때 1개, 또는 2개를 포함한다. 세포독성의 감소가 고려될 때, 세포독성이 감소된 사포닌이 제공되어야 하는 경우, 본원 상기에서 약술된 사포닌 분자의 위치에서 1개, 2개 또는 3개의 변형(유도체화)을 포함하는 사포닌 유도체가, 동등하게 적합하다. 추가로, 본 발명자들은 놀랍게도 매우 다양한 상이한 변형이 세포독성을 낮추고, 용혈 활성을 낮추고, 엔도솜 탈출 증진 활성 정도를 충분하게 보존 및 잔존시키는 데 적합하다는 것을 확립하였다. 용혈 활성이 고려될 때, 세포독성 감소와 유사하게, 사포닌에서 지시된 화학 그룹 중 1개, 2개 또는 3개가 유도체화되는 경우 용혈 활성이 감소된다. 이들 유도체화는, 표 A2, 표 A3, 표 A12 및 도 1 내지 도 14 및 도 36 내지 도 40 및 도 66 내지 도 70에 약술된 유도체화와 같이, 다양한 특성의 것일 수 있다. 환원에 의한 알데히드 기의 하이드록실 기로의 유도체화만큼 작은 유도체화, 및 AEM을 이용한 글루쿠론산의 카르복실 기의 유도체화와 결합된, EMCH를 이용한 알데히드 기의 유도체화만큼 큰 유도체화 둘 모두 세포독성 및 용혈 활성을 감소시킨다. 둘 모두 자연 발생 사포닌 대응물과 비교할 때, 감소된 세포독성의 측면에서 향상된 세포독성, 및 감소된 용혈 활성의 측면에서 향상된 용혈 활성을 갖는 사포닌 유도체를 제공하기 위해, 사포닌의 2개 화학 그룹 중 임의의 하나 이상, 예컨대 1개, 또는 2개가 다양한 크기 및/또는 다양한 화학적 특성을 갖는 다수의 상이한 화학 그룹에 의해 유도체화될 수 있다.
임의의 이론에 얽매이기 원하지 않지만, 사포닌의 아글리콘의 C-233 원자에 있는 알데히드 기는 바이데스모시드 트리테르펜 글리코시드 유형의 사포닌의 엔도솜 탈출 증진 활성과 관계가 있고/있거나 이에 기여하는 것으로 추정되고, 즉 예를 들어, 시험관내 및 생체내 둘 모두에서, 동일한 용량이 이러한 사포닌의 부재 하에 동일한 세포에 접촉될 때 이러한 독소의 독성과 비교하여, 이러한 사포닌의 존재 하에 세포와 접촉될 때 (단백질) 독소의 독성이 증가. 실제로, 본 발명자들은 글루쿠론산 유닛의 유도체화된 카르복실 기를 갖고, 아글리콘에 유리 알데히드 기를 포함하는 사포닌 유도체가 엔도솜 탈출 증진 활성을 갖는다는 것을 확립하였다. 이들 유도체는 감소된 용혈 활성 및 감소된 세포 독성을 갖는다. 예를 들어, 분자 3A, 분자 8, 분자 11, 분자 18, 분자 19 및 분자 28 및 분자 31로서의 사포닌 유도체(표 A2, 표 A3, 표 A5, 표 A6, 표 A12, 도 1, 도 3, 도 6, 도 11, 도 12, 도 39, 도 40c)는 아글리콘 구조에 비변형된 유리 알데히드를 갖고, 항체가 결합하는 수용체를 발현하는 다양한 (종양) 세포와 접촉되는 항체-약물 접합체의 세포독성 증진이 고려될 때, 실제로 활성을 나타낸다. 따라서 이들 사포닌 유도체는 명시적으로 구상되는 본 발명의 구현예이다.
놀랍게도, 사포닌 유도체가 유리 알데히드 기를 포함하지 않도록, 아글리콘에 유도체화된 알데히드 기를 갖는 사포닌 유도체도 또한 이펙터 분자의 세포독성이 리간드-독소 접합체, 예를 들어 ADC의 형태로 (종양) 세포에 제공될 때, 그리고 아무 것도 유도체화되지 않거나 C-23에 있는 다당류 사슬의 카르복실 기가 유도체화된다는 전제 조건에서, 여전히 특징적인 엔도솜 탈출 증진 활성을 나타낸다. 예를 들어, 표 A2, 표 A3, 표 A12 및 도 2, 도 4, 도 5, 도 8, 도 9, 도 13, 도 38 및 도 40에서 분자 6, 분자 9, 분자 10, 분자 14, 분자 15, 분자 20, 분자 27 및 분자 29로 지시된, 변형된 알데히드 기를 갖고 추가 유도체화가 없거나 하나의 추가 유도체화를 갖는 사포닌 유도체는 아글리콘에 유도체화된 알데히드 기를 갖는 이러한 사포닌 유도체의 존재 하에 종양 세포와 접촉되는 이펙터 분자의 세포독성 효과를 증진시키는 능력을 갖는다. 이들 사포닌 유도체 모두는 감소된 세포독성을 나타내고 감소된 용혈 활성을 나타내므로 명시적으로 구상되는 본 발명의 구현예이다.
본 발명자들은 또한 일정 변형이 상응하는 비변형된 사포닌과 비교할 때 임계 마이셀 농도(CMC) 증가로 이어진다는 것을 발견했다. 예를 들어, 분자 2, 분자 6, 분자 8, 분자 10, 분자 15, 분자 27 및 분자 28로 지시되는 사포닌 유도체, 바람직하게는 분자 2, 분자 6, 분자 8, 분자 10, 및 분자 15로 지시되는 사포닌 유도체는 그의 상응하는 비유도체화된 사포닌과 비교할 때 증가된 CMC를 갖고 따라서 명시적으로 구상되는 본 발명의 구현예이다. 임의의 이론에 얽매이기 원하지 않지만, 증가된 CMC는 몇 가지 이유로 유리하다고 여겨진다. 예를 들어, 유리 분자는 일반적으로 마이셀 구조 내 정렬된 분자보다 접합 반응에 더 영향받기 쉽기 때문에, 증가된 CMC는 뒤따르는 접합 반응에서 변형된 사포닌의 사용을 용이하게 할 수 있다. 추가로, 사포닌 유도체가 생물학적 기능(예를 들어, 생체내 치료 또는 생체외 방법 또는 시험관내 방법에서)을 발휘할 필요가 있는 경우, 예를 들어 사포닌 유도체가 통상대로 사용되는 경우 또는 심지어 담체 또는 또다른 실체로부터 갈라진 후 제자리에 방출되는 경우, 유리 사포닌 분자가 이들 사포닌 유도체가 마이셀 구조 내 정렬된 경우보다 그의 생물학적 표적과 보다 용이하게 상호작용할 수 있을 것이기 때문에 비변형된 사포닌과 비교할 때 증가된 CMC는 유리하다. 임계 마이셀 농도를 초과하는 (넘는) 농도에서, 사포닌은 (예를 들어 분취용 HPLC를 사용하는) 단리를 저해하는 마이셀을 형성하기 때문에 증가된 CMC는 또한 사포닌 유도체의 대규모 생산 및 농축을 용이하게 하는 데 유용할 수 있다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 사포닌 유도체에 대해 관찰된 CMC 증가는 세포독성 또는 용혈 활성 증가와 관련되지 않았다. 예를 들어, α-헤데린을 기준점으로 고려하면, CMC 증가는 일반적인 세포독성의 증가와 관련될 수 있지만(디기토닌의 경우와 같이) 또한 세포독성의 감소와 관련될 수도 있음(글리시리진 및 헤데라코시드 C의 경우와 같이)을 나타내는, 문헌[de Groot et al. ("Saponin interaction with model membrane systems-Langmuir monolayer studies, hemolysis and formation of ISCOMs", Planta medica 82.18 (2016): 1496-1512.)]의 표 2 데이터로부터 볼 수 있는 바와 같이, CMC와 세포독성 간의 관계는 예측가능하지 않고 복합적이다. 추가로, 분자 2, 분자 6, 분자 10, 및 분자 15로 지시되는 사포닌 유도체의 경우 CMC 증가는 또한, 상응하는 유리 사포닌과 비교하여, 증가된 비율: IC50 용혈/IC50 활성과 관련되므로, 이들 사포닌 유도체는 구체적으로 본 발명의 바람직한 구현예이다.
따라서 본 발명자들은 세포독성이 고려되고/고려되거나 용혈 활성이 고려될 때 향상된 치료 범위를 갖는, 그리고 예를 들어 독소의 증강이 고려될 때 및/또는 상응하는 비유도체화된 사포닌과 비교하여 증가된 CMC를 갖는 사포닌 유도체를 제공한다. 본 발명의 이러한 사포닌 유도체는 구체적으로 예를 들어, 암의 예방 또는 치료를 위한 예를 들어 ADC 또는 AOC를 수반하는 치료 요법에 적용하기에 적합하다. 세포독성 및/또는 용혈 활성이 고려될 때, 특히 이러한 사포닌 유도체가 예를 들어, ADC 또는 AOC를 이용한 치료를 필요로 하는 환자에게 투여될 때 이러한 사포닌 유도체의 안전성이 향상된다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 여기서 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하며 여기서 제1 당류 사슬은, 유도체화된, 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하며 보다 바람직하게는, 사포닌 유도체는 유도체화된 상기 제1 당류 사슬을 포함하고 사포닌 유도체는 알데히드 기 또는 유도체화된 알데히드 기를 포함하는 아글리콘 코어 구조를 포함하며, 가장 바람직하게는, 사포닌 유도체는 유도체화된 상기 제1 당류 사슬을 포함하고 사포닌 유도체는 알데히드 기를 포함하는 아글리콘 코어 구조를 포함한다. 이러한 유도체화 중 2개의 모든 다른 가능한 조합이 동등하게 바람직하다. 추가로, 사포닌에서 화학 그룹 중 1개, 또는 2개가 표 A2 및 표 A3에 나열된 유도체화 중 임의의 하나 이상에 따라 유도체화된다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 아글리콘 코어 구조를 포함하며:
2알파-하이드록시 올레아놀산;
16알파-하이드록시 올레아놀산;
헤데라게닌(23-하이드록시 올레아놀산);
16알파,23-디하이드록시 올레아놀산;
깁소게닌;
키라산;
프로토에스시게닌-21(2-메틸부트-2-에노에이트)-22-아세테이트;
23-옥소-바링토게놀 C-21,22-비스(2-메틸부트-2-에노에이트);
23-옥소-바링토게놀 C-21(2-메틸부트-2-에노에이트)-16,22-디아세테이트;
디기토게닌;
3,16,28-트리하이드록시 올레아난-12-엔;
깁소겐산,
및
이의 유도체,
바람직하게는 사포닌 유도체는 키라산 및 깁소게닌 또는 이의 유도체로부터 선택되는 아글리콘 코어 구조를 포함하고, 보다 바람직하게는 사포닌 유도체 아글리콘 코어 구조는 키라산 또는 이의 유도체이다. 구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 아글리콘 코어 구조를 포함하며:
2알파-하이드록시 올레아놀산;
16알파-하이드록시 올레아놀산;
헤데라게닌 (23-하이드록시 올레아놀산);
16알파,23-디하이드록시 올레아놀산;
깁소게닌;
키라산;
프로토에스시게닌-21(2-메틸부트-2-에노에이트)-22-아세테이트;
23-옥소-바링토게놀 C-21,22-비스(2-메틸부트-2-에노에이트);
23-옥소-바링토게놀 C-21(2-메틸부트-2-에노에이트)-16,22-디아세테이트;
디기토게닌;
3,16,28-트리하이드록시 올레아난-12-엔;
깁소겐산,
바람직하게는 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조 키라산을 포함한다.
본 발명자들은 이제, 트리테르펜 글리코시드 유형의 사포닌을 기반으로, 이러한 유도체와 접촉되는 세포의 감소된 세포독성 및 더 낮은 용혈과 관련하여 향상된 사포닌 유도체가 제공될 수 있음을 발견하였기 때문에, 기본적으로 본 발명자들에 의해 테스트된 이러한 엔도솜 탈출 증진 활성을 갖는 임의의 사포닌, 예컨대, 상기 구현예의 아글리콘을 갖고 표 A1에 나열된 사포닌은 이에 따라 향상될 수 있다. 독소 및 예를 들어 BNA의 증강이 고려될 때 충분히 높은 정도로 활성을 보존하면서도 독성을 낮추고 용혈 활성을 낮추는 것은, 사포닌 유도체 단독 또는 예를 들어 ADC 또는 AOC와 조합한 사포닌 유도체의 치료 범위를 넓히는 것이 고려될 때, 본 발명자들에 의한 중요한 성취이다. 천연 사포닌 대응물의 적용과 비교할 때 사포닌 유도체에 의해 발휘되거나 유도되는 세포독성 부작용 (위험) 및 원하지 않는 용혈 활성 (위험)이 감소되면서, 유도체화된 사포닌의 충분히 높은 용량이 예를 들어 이를 필요로 하는 암 환자를 위한 종양 요법에 적용될 수 있다. 본 발명의 사포닌 유도체의 치료 범위 향상은 예를 들어 표 A5 및 표 A6에 예시된 사포닌 유도체에 대해 명백하다: 세포독성, 또는 용혈 활성에 대한 IC50 대 엔도솜 탈출 증진 활성에 대한 IC50의 비율 뿐만 아니라 용혈 활성, 세포독성 및 활성이 나열되어 있다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 사포닌 유도체는 키라산, 깁소게닌, 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 아글리콘 코어 구조를 포함하고, 바람직하게는 사포닌 유도체는 키라산 및 이의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 아글리콘 코어 구조를 포함하며, 여기서 제1 당류 사슬은, 존재하는 경우, 아글리콘 코어 구조의 C3 원자('C-3' 원자로도 표시됨) 또는 C28 원자('C-28' 원자로도 표시됨)에, 바람직하게는 C3 원자에 연결되고/연결되거나, 여기서 제2 당류 사슬은, 존재하는 경우, 아글리콘 코어 구조의 C28 원자에 연결된다. 아글리콘에 결합된 당류 사슬 둘 모두를 갖는 사포닌을 기반으로 하는 사포닌 유도체가 바람직하지만, 일반적으로 엔도솜 탈출 증진 활성을 나타내는 임의의 사포닌은, 더 낮은 세포독성, 더 낮은 용혈 활성 및 충분히 높은 엔도솜 탈출 증진 활성을 갖는 단일, 이중 또는 삼중, 바람직하게는 단일 또는 이중 유도체화된 사포닌을 제공하기 위한, 본 발명에 따른 유도체화에 적합하다. 사포닌 유도체가 키라산 및 깁소게닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아글리콘 코어 구조를 포함하는, 사포닌 유도체가 바람직하고, 바람직하게는 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조 키라산을 포함하며, 여기서 제1 당류 사슬은, 존재하는 경우, 아글리콘 코어 구조의 C3 원자 또는 C28 원자에, 바람직하게는 C3 원자에 연결되고/연결되거나, 여기서 제2 당류 사슬은, 존재하는 경우, 아글리콘 코어 구조의 C28 원자에 연결된다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 여기서 제1 당류 사슬은, 존재하는 경우, 다음(목록 S1)으로부터 선택된다:
GlcA-,
Glc-,
Gal-,
Rha-(1→2)-Ara-,
Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-,
Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-,
Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-,
Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-, 및
이의 유도체,
그리고/또는 여기서 제2 당류 사슬은, 존재하는 경우, 다음(목록 S2)으로부터 선택된다:
Glc-,
Gal-,
Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-,
Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-,
Ara-,
Xyl-,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc- 여기서 R1은 4E-메톡시신남산,
Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc- 여기서 R2는 4Z-메톡시신남산,
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-디-OAc-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc- 여기서 R3은 4E-메톡시신남산,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
(Ara- 또는 Xyl-)(1→3)-(Ara- 또는 Xyl-)(1→4)-(Rha- 또는 Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha- 또는 Fuc-)(1→4)]-(Rha- 또는 Fuc-),
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc- 여기서 R4는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc- 여기서 R5는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-,
6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-디-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc- 여기서 R6은 5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc- 여기서 R7은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc- 여기서 R8은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc- 여기서 R9는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc- 여기서 R10은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc- 여기서 R11은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc- 여기서 R12는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산)
Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-, 및
이의 유도체.
바람직하게는, 제1 당류 사슬은 Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA- 이고 제2 당류 사슬은 다음(목록 S3) 중 임의의 하나이다:
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc- 여기서 R6은 5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc- 여기서 R7은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc- 여기서 R8은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc- 여기서 R9는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc- 여기서 R10은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc- 여기서 R11은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc- 여기서 R12는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산). 이러한 당류 사슬은 QS 사포닌 QS-7, QS-17, QS-18 및 QS-21의 전형적인 일부이다.
전형적으로, 세포가 사포닌 및 독소와 접촉될 때, 독소의 세포독성을 증진시키는 사포닌은 아글리콘에 결합된 이러한 단당류 또는 다당류 사슬 중 1개 또는 2개를 갖는다. 2개의 당류 사슬을 포함하는 유도체화를 위해 선택된 사포닌이 바람직하다. 엔도솜 탈출 증진 활성이 충분히 높은 정도로 보존되어야 하는 경우 이러한 사포닌으로 하여금 단일, 이중 또는 삼중 유도체화, 바람직하게는 단일 또는 이중 유도체화를 거치도록 하기 위한 특히 바람직한 사포닌의 개관이 표 A1에 제공되어 있다. 물론, 이러한 사포닌이 예를 들어 독소, BNA 등에 대한 엔도솜 탈출 증진 활성을 나타낸다면, 이러한 사포닌의 구조적 변이체는 본 발명에 따른 유도체화에 동등하게 적합하다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서, 여기서 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하고 제2 당류 사슬을 포함하며, 여기서 제1 당류 사슬은 하나 초과의 당류 모이어티를 포함하고 제2 당류 사슬은 하나 초과의 당류 모이어티를 포함하며, 여기서 아글리콘 코어 구조는 키라산 또는 깁소게닌이고, 여기서 다음 중 1개, 또는 2개, 바람직하게는 하나이다:
i. 아글리콘 코어 구조의 알데히드 기가 유도체화되었다, 및
ii. 제1 당류 사슬이, 유도체화된 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함한다.
구현예에서 본 발명에 따른 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하고 제2 당류 사슬을 포함하며, 여기서 제1 당류 사슬은 하나 초과의 당류 모이어티를 포함하고 제2 당류 사슬은 하나 초과의 당류 모이어티를 포함하며, 여기서 아글리콘 코어 구조는 키라산이고, 여기서 다음 중 하나이다:
i. 아글리콘 코어 구조의 알데히드 기가 유도체화되었다, 및
ii. 제1 당류 사슬이, 유도체화된 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하고 제2 당류 사슬을 포함하며, 여기서 제1 당류 사슬은 하나 초과의 당류 모이어티를 포함하고 제2 당류 사슬은 하나 초과의 당류 모이어티를 포함하며, 여기서 아글리콘 코어 구조는 키라산이고, 여기서:
i. 아글리콘 코어 구조의 알데히드 기가 유도체화되었다, 및
ii. 제1 당류 사슬이, 유도체화되지 않은 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함한다.
구체적인 구현예에서, 본 발명에 따른 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하고 제2 당류 사슬을 포함하며, 여기서 제1 당류 사슬은 하나 초과의 당류 모이어티를 포함하고 제2 당류 사슬은 하나 초과의 당류 모이어티를 포함하며, 여기서 아글리콘 코어 구조는 키라산 또는 깁소게닌이고, 여기서:
i. 아글리콘 코어 구조의 알데히드 기가 유도체화되지 않았다, 및
ii. 제1 당류 사슬이, 유도체화된 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함한다.
다음의 개요는 적합한 유도체화를 보여준다:
Figure pct00043
본 발명에 따르면, 사포닌은 3개의 유도체화를 포함할 수 있고 여전히 충분히 높은 엔도솜 탈출 증진 활성을 나타낼 수 있다. 구체적으로 이펙터 분자 및 유도체화된 사포닌과 접촉된 종양 세포 내에서의 독소 또는 BNA와 같은, 세포 내부에서의 이펙터 분자의 효과 및 활성을 증강시키는 능력의 (잠재적인 또는 명백한) 감소보다 세포독성 및/또는 용혈 활성의 감소가 더 큰 경우. 따라서, 본 발명은, 아글리콘의 알데히드 기가 고려될 때, 존재하는 경우, C-3에 있는 다당류에서의 글루쿠론산 유닛의 카르복실 기가 고려될 때, 단일, 또는 2개의 유도체화를 포함하는 유도체화된 사포닌을 제공한다. 1개 또는 2개의 변형을 갖는 사포닌 유도체가 바람직하다. 예를 들어 유리 알데히드 기를 갖고 당류 사슬에 1 또는 2개의 유도체화를 갖는 사포닌 유도체는 독소 또는 BNA와 같은 이펙터 분자의 엔도솜 탈출을 향상시키는 데 적합하다. 전술된 바와 같이, 유도체화된 알데히드 기를 갖는 사포닌 유도체 또한 동등하게 적합하다. 유도체화 결과 아글리콘에 유리 알데히드 기를 갖지 않는 사포닌 유도체는, 여전히 충분하고 효율적인 엔도솜 탈출 증진 활성을 나타낸다. 임의의 이론에 얽매이기 원하지 않지만, 인간 세포와 같은 (포유류) 세포의 엔도솜 및 리소좀 내의 산성 조건의 결과로서, 위치 C-23에서 유도체화된 아글리콘을 갖는 사포닌 유도체를 제공하기 위해 처음에 사포닌의 알데히드 기에 결합된 모이어티의 pH 유도된 분할 결과 세포 내부에서 알데히드 기가 다시 형성될 수 있다. 엔도솜 또는 리소좀에서 다시 형성될 수 있는 변형된 알데히드 기를 갖는 사포닌 유도체의 예는, 알데히드의 카르보닐 기와 예를 들어 아글리콘에 결합된 화학 그룹의 히드라지드 모이어티, 예컨대 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH), 또는, 티오-에테르 결합을 형성하며, 말레이미드 기에 결합된 메르캅토에탄올을 갖는 EMCH, 사이에 형성된 히드라존 결합을 포함하는 사포닌 유도체이다. 이러한 사포닌 유도체의 예는 도 40b 및 도 40d에 제공되며, 본원 하기에서는 분자 30 및 분자 32로 나타난다:
[분자 30]
Figure pct00044
[분자 32]
Figure pct00045
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 다음으로 구성된 사포닌 군으로부터 선택되는 사포닌의 유도체이고: 키라야 수피 사포닌, QS-7, QS1861, QS-7 api, QS1862, QS-17, QS-18, QS-21, QS-21 A-apio, QS-21 A-xylo, QS-21 B-apio, QS-21 B-xylo, 바람직하게는 사포닌 유도체는 QS-21 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다. 이들 사포닌은 본질적으로 본 발명자에 의해 확립된 엔도솜 탈출 증진 활성을 나타내는 사포닌이거나, 엔도솜 탈출 증진 활성이 확립된 사포닌과 구조적으로 매우 유사한 것이다. 이들 사포닌의 구조적 개요는 표 A1에 요약되어 있다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 분자 1로 표시되는 키라산 사포닌 또는 깁소게닌 사포닌의 유도체이다:
[분자 1]
Figure pct00046
여기서
제1 당류 사슬 A1은 수소, 단당류 또는 선형 또는 분지형 올리고당류를 나타내고, 바람직하게는 A1은 본 발명의 일정 구현예에 대해 본원의 상기에서 정의된 당류 사슬을 나타내고(목록 S1), 보다 바람직하게는 A1은 본 발명의 일정 구현예에 대해 본원의 상기에서 정의된 당류 사슬을 나타내며(목록 S1) A1은 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성되고;
제2 당류 사슬 A2는 수소, 단당류 또는 선형 또는 분지형 올리고당류를 나타내고, 바람직하게는 A2는 본 발명의 일정 구현예에 대해 본원의 상기에서 정의된 당류 사슬을 나타내며(목록 S2), 여기서 A1 및 A2 중 적어도 하나는 수소가 아니며, 바람직하게는 A1 및 A2 둘 모두 올리고당류 사슬이고;
R은 깁소게닌에서 수소이거나 키라산에서 하이드록실이고;
여기서 사포닌 유도체는 분자 1로 표시되는 사포닌에 해당되며 여기서 다음의 유도체화 중 적어도 하나가 존재한다:
i. 키라산 또는 깁소게닌의 위치 C23에 있는 알데히드 기가 유도체화되었다; 및
ii. A1이 본 발명의 일정 구현예에 대해 본원의 상기에서 정의된 당류 사슬을 나타내고(목록 S1) A1이 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성된 경우, A1의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기가 유도체화되었다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이고, 여기서 A1은 본 발명의 일정 구현예에 대해 본원의 상기에서 정의된 당류 사슬을 나타내며(목록 S1) 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성되며 여기서 A1의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기는 유도체화되었고/유도체화되었거나 여기서 A2는 본 발명의 일정 구현예에 대해 본원의 상기에서 정의된 당류 사슬을 나타낸다(목록 S2).
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 A1은 당류 사슬 Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-를 나타내며 글루코론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성되며 여기서 A1의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기는 유도체화되었고/유도체화되었거나 여기서 A2는 본 발명의 일정 구현예에 대해 본원의 상기에서 정의된 당류 사슬을 나타낸다(목록 S3). 구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이고, 여기서 분자 1로 표시되는 사포닌은 바이데스모시드 트리테르펜 사포닌이다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 분자 1로 표시되는 사포닌에 해당되며 여기서 다음의 유도체화 중 적어도 하나가 존재하며, 바람직하게는 다음의 유도체화 중 1개 또는 2개가 존재하며, 보다 바람직하게는 하나가 존재한다:
i. 키라산 또는 깁소게닌의 위치 C23에 있는 알데히드 기가 다음에 의해 유도체화되었다;
- 알코올로 환원; 또는
- 바람직하게는 히드라지드와의 반응을 통해, 히드라존 결합으로 변환; 및
ii. A1이 본 발명의 일정 구현예에 대해 본원의 상기에서 정의된 당류 사슬을 나타내고(목록 S1, 바람직하게는 Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-) A1이 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성된 경우, A1의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기가, 바람직하게는 아민과의 반응을 통해, 아미드 결합으로 변환됨으로써 유도체화되었다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 분자 1로 표시되는 사포닌에 해당되며 여기서 다음의 유도체화 중 적어도 하나가 존재하며, 바람직하게는 다음의 유도체화 중 1개 또는 2개가 존재하며, 보다 바람직하게는 하나가 존재한다:
i. 키라산 또는 깁소게닌의 위치 C23에 있는 알데히드 기가 다음에 의해 유도체화되었다;
- 알코올로 환원; 또는
- N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환되어, QS21-Ald-EMC와 같은 사포닌-Ald-EMCH를 제공하며, 여기서 EMCH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것; 또는
- N-[β-말레이미도프로피온산]히드라지드(BMPH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환되며, 여기서 BMPH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것; 또는
- N-[κ-말레이미도운데칸산]히드라지드(KMUH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환되며, 여기서 KMUH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것; 및
ii. A1이 본 발명의 일정 구현예에 대해 본원의 상기에서 정의된 당류 사슬을 나타내고(목록 S1) A1이 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성된 경우, A1의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기가, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(AMPD) 또는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통해 아미드 결합으로 변환됨으로써 유도체화되어, QS-21-Glu-AMPD와 같은 사포닌-Glu-AMPD 또는 QS-21-Glu-AEM과 같은 사포닌-Glu-AEM을 제공하였다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA이고/이거나 A2는 Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc이며, 보다 바람직하게는 분자 1로 표시되는 사포닌은 QS-21 유도체이며, 여기서 A1은 Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA이고/이거나 A2는 Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc이다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 다음의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되며: QS-21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, 키라야사포닌, QS-18, Quil-A, 이의 입체이성질체 및 이들의 조합, 바람직하게는 사포닌 유도체는 QS-21 유도체로 구성된 군으로부터 선택된다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 단일 유도체화를 포함하는 QS-21 유도체이며, 여기서 단일 유도체화는, 예컨대 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HATU)를 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기에 결합하는 것에 의한 또는 (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP)를 QS-21의 글루쿠론 모이어티의 카르복실 기에 결합하는 것에 의한, QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기의 변환이거나, 여기서 사포닌 유도체는 분자 30으로 표시되는 QS-21 유도체이며, 이는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 유도체화된 키라산 아글리콘 코어 구조의 지시된 위치 C23에 있는 알데히드 기를 포함하는 QS-21 유도체를 나타내거나:
[분자 30]
Figure pct00047
또는 여기서 사포닌 유도체는 QS-21 유도체이며, 상기 QS-21 유도체는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 유도체화된 키라산 아글리콘 코어 구조의 지시된 위치 C23에 있는 알데히드 기를 포함하며 여기서 EMCH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올을 이용하여 유도체화되어 티오-에테르 결합을 형성하거나,
또는, 여기서 사포닌 유도체는 QS-21 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 다음 중 하나에 따른 화학식을 가지며:
[분자 27]
Figure pct00048
,
[분자 28]
Figure pct00049
,
[분자 29]
Figure pct00050
,
여기서 R은, 다음 화학식에 따른, Q api, A xyl, B api 및 B xyl 중 임의의 하나로 정의되거나:
Figure pct00051
사포닌 유도체는 다음 중 하나에 따른 화학식을 갖는다:
[분자 31]
Figure pct00052
,
[분자 32]
Figure pct00053
,
[분자 33]
Figure pct00054
.
분자 30으로 표시되는 사포닌은 유리 설프히드릴 기를 포함하는 추가 분자와의 접합 반응을 위한 전구체로서의 적용에 적합하다. 분자 30으로 표시된 사포닌 유도체의 말레이미드 기는 이러한 유리 설프히드릴 기와 티오-에테르 결합을 형성할 수 있다. 예를 들어, 분자 30의 사포닌 유도체는 유리 설프히드릴 기를 갖는 시스테인과 같은 유리 설프히드릴 기를 포함하는 펩티드 또는 단백질에 공유결합으로 커플링될 수 있다. 이러한 단백질은 예를 들어 항체 또는, Fab, scFv와 같은, 이의 결합 단편 또는 결합 도메인, VHH, 예를 들어 낙타류 VH와 같은, 단일 도메인 항체이다. 항체(또는 이의 결합 도메인 또는 단편)가, 예를 들어 종양 세포 상에 존재하는, 수용체와 같은 표적 세포 표면 분자로의 특이적 결합을 위한 항체일 때, 예를 들어 유리 설프히드릴 기를 포함하는 항체와의 커플링 반응에서의 분자 2 사포닌 유도체의 적용은, 세포로의 및 세포 내부에서의 사포닌의 표적화된 전달을 위한 접합체를 제공한다. 바람직하게는, 사포닌 유도체는, 수용체, 예를 들어HER2, EGFR, CD71과 같은 종양-세포 특이적 표면 분자에 결합할 수 있는 항체 또는 VHH에 커플링된다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서:
i. 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조를 포함하며 여기서 아글리콘 코어 구조는 다음에 의해 유도체화된 알데히드 기를 포함한다;
- 알코올로 환원; 또는
- N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환되며 여기서 EMCH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것; 또는
- N-[β-말레이미도프로피온산]히드라지드(BMPH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환되며 여기서 BMPH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것; 또는
- N-[κ-말레이미도운데칸산]히드라지드(KMUH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환되며 여기서 KMUH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것; 또는
ii. 제1 당류 사슬은 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하며, 이는 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(AMPD) 또는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통해 아미드 결합으로 변환됨으로써 유도체화되었다; 또는
iii. 사포닌 유도체는 임의의 조합의 2개의 유도체화 i. 및 ii.를 포함한다;
바람직하게는, 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조를 포함하고 여기서 아글리콘 코어 구조는 EMCH와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 유도체화된 알데히드 기를 포함하고 여기서 EMCH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화된다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조를 포함하며 여기서 아글리콘 코어 구조는 알데히드 기를 포함하고 여기서 제1 당류 사슬은 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하며, 이는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통해 아미드 결합으로 변환됨으로써 유도체화되었다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 단, N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 아글리콘 코어 구조의 알데히드 기가 유도체화되고 사포닌이 QS-21인 경우, 글루쿠론산 또한 유도체화되며, 단 사포닌이 QS-21이고 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기가 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HATU)와 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기의 반응에 의해 유도체화되는 경우, 알데히드 기 및 아세톡시 기(Me(CO)O-) 또한 변형된다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 단, 사포닌 유도체의 아글리콘 코어 구조의 알데히드 기가 EMCH와의 반응을 통해 유도체화되고 사포닌이 QS-21인 경우, 글루쿠론산 또한 유도체화되며, 단, 사포닌이 QS-21이고 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기가 결합된 HATU에 의해 유도체화되는 경우, 알데히드 기 또한 유도체화된다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 화학식 (a)에 따른다:
[화학식 (a)]
Figure pct00055
여기서 R1 및 R2는 독립적으로 수소, 단당류, 선형 올리고당류 및 분지형 올리고당류로부터 선택되고, 바람직하게는 R1은 본 발명에서 정의된 제1 당류 사슬이고 R2는 본 발명에서 정의된 제2 당류 사슬이며,
여기서 X = O, P 또는 S, 바람직하게는 O이고;
여기서 Y =는 H, 비치환된 C1-C10 직쇄, 분지형 또는 환형 알킬, 비치환된 C2-C10 직쇄, 분지형 또는 환형 알케닐 또는 비치환된 C2-C10 직쇄 또는 분지형 알키닐 또는 화학식 (b) 또는 화학식 (c)에 따른 말레이미드 모이어티, 바람직하게는 화학식 (b) 또는 화학식 (c)에 따른 말레이미드 모이어티를 나타내고,
[화학식 (b)] [화학식 (c)]
Figure pct00056
여기서 o는 0 내지 10, 바람직하게는 2 내지 7, 보다 바람직하게는 4 내지 6으로부터 선택되는 정수이고
W는 화학식 (d)에 따른 티올 작용기이며
[화학식 (d)]
Figure pct00057
여기서 U = SH, NH2 또는 OH, 바람직하게는 OH이고,
p는 0 내지 4, 바람직하게는 1 내지 3, 보다 바람직하게는 1 또는 2로부터 선택되는 정수이다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 화학식 (e)에 따른다:
[화학식 (e)]
Figure pct00058
여기서 R1 및 R2는 독립적으로 수소, 단당류, 선형 올리고당류 및 분지형 올리고당류로부터 선택되고, 바람직하게는 R1은 본 발명에서 정의된 제1 당류 사슬이고 R2는 본 발명에서 정의된 제2 당류 사슬이며, 여기서 R1은 화학식 (f)에 따른 기능화된 글루코른산 모이어티를 포함하며:
[화학식 (f)]
Figure pct00059
여기서 T = NR3R4이며, 여기서 R3 및 R4는 독립적으로 H, 비치환된 C1-C10 직쇄, 분지형 또는 환형 알킬, 비치환된 C2-C10 직쇄, 분지형 또는 환형 알케닐 또는 비치환된 C2-C10 직쇄 또는 분지형 알키닐, 또는 화학식 (b) 또는 화학식 (c)에 따른 말레이미드 모이어티를 나타내며,
[화학식 (b)] [화학식 (c)]
Figure pct00060
여기서 o는 0 내지 10, 바람직하게는 2 내지 7, 보다 바람직하게는 4 내지 6으로부터 선택되는 정수이며
W는 화학식 (d)에 따른 티올 작용기이며
[화학식 (d)]
Figure pct00061
여기서 U = SH, NH2 또는 OH, 바람직하게는 OH이고,
p는 0 내지 4, 바람직하게는 1 내지 3, 보다 바람직하게는 1 또는 2로부터 선택되는 정수이거나;
여기서 T = OR5이며, 여기서 R5는 독립적으로 H, 비치환된 C1-C10 직쇄, 분지형 또는 환형 알킬, 비치환된 C2-C10 직쇄, 분지형 또는 환형 알케닐 또는 비치환된 C2-C10 직쇄 또는 분지형 알키닐, 또는 화학식 (b) 또는 화학식 (c)에 따른 말레이미드 모이어티를 나타내며,
[화학식 (b)] [화학식 (c)]
Figure pct00062
여기서 o는 0 내지 10, 바람직하게는 2 내지 7, 보다 바람직하게는 4 내지 6으로부터 선택되는 정수이며
W는 화학식 (d)에 따른 티올 작용기이며
[화학식 (d)]
Figure pct00063
여기서 U = SH, NH2 또는 OH, 바람직하게는 OH이고,
p는 0 내지 4, 바람직하게는 1 내지 3, 보다 바람직하게는 1 또는 2로부터 선택되는 정수이다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 화학식 (g)에 따른다:
[화학식 (g)]
Figure pct00064
여기서 R2는 독립적으로 수소, 단당류, 선형 올리고당류 및 분지형 올리고당류로부터 선택되고, 바람직하게는 R2는 본 발명에서 정의된 제2 당류 사슬이고,
여기서 T = NR3R4이며, 여기서 R3 및 R4는 독립적으로 H, 비치환된 C1-C10 직쇄, 분지형 또는 환형 알킬, 비치환된 C2-C10 직쇄, 분지형 또는 환형 알케닐 또는 비치환된 C2-C10 직쇄 또는 분지형 알키닐, 또는 화학식 (b) 또는 화학식 (c)에 따른 말레이미드 모이어티를 나타내며,
[화학식 (b)] [화학식 (c)]
Figure pct00065
여기서 o는 0 내지 10, 바람직하게는 2 내지 7, 보다 바람직하게는 4 내지 6으로부터 선택되는 정수이며
W는 화학식 (d)에 따른 티올 작용기이며
[화학식 (d)]
Figure pct00066
여기서 U = SH, NH2 또는 OH, 바람직하게는 OH이고,
p는 0 내지 4, 바람직하게는 1 내지 3, 보다 바람직하게는 1 또는 2로부터 선택되는 정수이거나;
여기서 T = OR5이며, 여기서 R5는 독립적으로 H, 비치환된 C1-C10 직쇄, 분지형 또는 환형 알킬, 비치환된 C2-C10 직쇄, 분지형 또는 환형 알케닐 또는 비치환된 C2-C10 직쇄 또는 분지형 알키닐, 또는 화학식 (b) 또는 화학식 (c)에 따른 말레이미드 모이어티를 나타내며,
[화학식 (b)] [화학식 (c)]
Figure pct00067
여기서 o는 0 내지 10, 바람직하게는 2 내지 7, 보다 바람직하게는 4 내지 6으로부터 선택되는 정수이며
W는 화학식 (d)에 따른 티올 작용기이며
[화학식 (d)]
Figure pct00068
여기서 U = SH, NH2 또는 OH, 바람직하게는 OH이고,
p는 0 내지 4, 바람직하게는 1 내지 3, 보다 바람직하게는 1 또는 2로부터 선택되는 정수이다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 화학식 (g)에 따른다:
[화학식 (g)]
Figure pct00069
여기서 R2는 독립적으로 수소, 단당류, 선형 올리고당류 및 분지형 올리고당류로부터 선택되고, 바람직하게는 R2는 본 발명에서 정의된 제2 당류 사슬이고,
여기서 T = NR3R4이며, 여기서 R3 및 R4는 독립적으로 H, 비치환된 C1-C10 직쇄, 분지형 또는 환형 알킬, 비치환된 C2-C10 직쇄, 분지형 또는 환형 알케닐 또는 비치환된 C2-C10 직쇄 또는 분지형 알키닐, 또는 화학식 (b) 또는 화학식 (c)에 따른 말레이미드 모이어티를 나타내며,
[화학식 (b)] [화학식 (c)]
Figure pct00070
여기서 o는 0 내지 10, 바람직하게는 2 내지 7, 보다 바람직하게는 4 내지 6으로부터 선택되는 정수이며
W는 화학식 (d)에 따른 티올 작용기이며
[화학식 (d)]
Figure pct00071
여기서 U = SH, NH2 또는 OH, 바람직하게는 OH이고,
p는 0 내지 4, 바람직하게는 1 내지 3, 보다 바람직하게는 1 또는 2로부터 선택되는 정수이거나;
여기서 T = OR5이며, 여기서 R5는 독립적으로 H, 비치환된 C1-C10 직쇄, 분지형 또는 환형 알킬, 비치환된 C2-C10 직쇄, 분지형 또는 환형 알케닐 또는 비치환된 C2-C10 직쇄 또는 분지형 알키닐, 또는 화학식 (b) 또는 화학식 (c)에 따른 말레이미드 모이어티를 나타내며,
[화학식 (b)] [화학식 (c)]
Figure pct00072
여기서 o는 0 내지 10, 바람직하게는 2 내지 7, 보다 바람직하게는 4 내지 6으로부터 선택되는 정수이며
W는 화학식 (d)에 따른 티올 작용기이며
[화학식 (d)]
Figure pct00073
여기서 U = SH, NH2 또는 OH, 바람직하게는 OH이고,
p는 0 내지 4, 바람직하게는 1 내지 3, 보다 바람직하게는 1 또는 2로부터 선택되는 정수이며,
여기서 X = O, P 또는 S, 바람직하게는 O이고;
여기서 Y =는 H, 비치환된 C1-C10 직쇄, 분지형 또는 환형 알킬, 비치환된 C2-C10 직쇄, 분지형 또는 환형 알케닐 또는 비치환된 C2-C10 직쇄 또는 분지형 알키닐 또는 화학식 (b) 또는 화학식 (c)에 따른 말레이미드 모이어티, 바람직하게는 H 또는 분지형 알키닐 또는 화학식 (b) 또는 화학식 (c)에 따른 말레이미드 모이어티를 나타내고,
[화학식 (b)] [화학식 (c)]
Figure pct00074
여기서 o는 0 내지 10, 바람직하게는 2 내지 7, 보다 바람직하게는 4 내지 6으로부터 선택되는 정수이고
W는 화학식 (d)에 따른 티올 작용기이며
[화학식 (d)]
Figure pct00075
여기서 U = SH, NH2 또는 OH, 바람직하게는 OH이고,
p는 0 내지 4, 바람직하게는 1 내지 3, 보다 바람직하게는 1 또는 2로부터 선택되는 정수이다.
본원에서 구현예 D2로 지칭되는, 구현예는, 사포닌 유도체가 사포닌, 구체적으로 SO1861, 여기서 아글리콘 코어 구조는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 유도체화된 알데히드 기를 포함하고 여기서 EMCH의 말레이미드 기는 티올과의 티오-에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화된 것, 그리고 여기서 사포닌 상에 다른 유도체화는 존재하지 않는 것이 아닌 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 사포닌 유도체가 사포닌, 구체적으로 SO1861, 여기서 아글리콘 코어 구조는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 유도체화된 알데히드 기를 포함하고 여기서 EMCH의 말레이미드 기는 티올과의 티오-에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것이 아닌 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
본원에서 구현예 D3으로 지칭되는, 구현예는, 사포닌 유도체가 사포닌, 구체적으로 SO1861, 여기서 아글리콘 코어 구조는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 유도체화된 알데히드 기를 포함하고 여기서 EMCH의 말레이미드 기는 다음 중 하나, 바람직하게는 모두로부터 선택되는 티올과의 티오-에테르 결합 형성에 의해 유도체화된 것:
·메르캅토에탄올,
·적어도 2-이미노티올란을 이용해 유도체화된 에틸렌디아민 코어를 갖는 폴리(아미도아민) 덴드리머,
·적어도 2-이미노티올란을 이용해 추가로 유도체화된 에틸렌디아민 코어를 갖는 폴리(아미도아민) 덴드리머와 시아닌-3의 접합체,
·적어도 2-이미노티올란을 이용해 유도체화된 G4 덴드론,
·적어도 2-이미노티올란을 이용해 추가로 유도체화된 G4 덴드론과 시아닌-5의 접합체,
·소 혈청 알부민(BSA), 및
·서열 SESDDAMFCDAMDESDSK [SEQ ID NO: 1]을 갖는 펩티드
그리고 여기서 사포닌 상에 다른 유도체화는 존재하지 않는 것이 아닌 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 표현 "G4 덴드론"은 화학식 (A2) 화합물을 의미하는 것으로 해석되어야 한다:
[화학식 (A2)]
Figure pct00076
.
본원에서 구현예 D4로 지칭되는, 구현예는, 사포닌 유도체가 사포닌, 구체적으로 SO1861, 여기서 카르복실 기는 선택적으로 추가로 유도체화된 에틸렌디아민 코어를 갖는 폴리(아미도아민) 덴드리머와 시아닌-3의 접합체와의 반응에 의해 아미드로 변환됨으로써 유도체화된 것, 그리고 여기서 사포닌 상에 다른 유도체화는 존재하지 않는 것이 아닌 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 사포닌 유도체가 사포닌, 구체적으로 SO1861, 여기서 카르복실 기는 선택적으로 추가로 유도체화된 에틸렌디아민 코어를 갖는 폴리(아미도아민) 덴드리머와 시아닌-3의 접합체와의 반응에 의해 아미드로 변환됨으로써 유도체화된 것이 아닌 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
본원에서 구현예 D5로 지칭되는, 구현예는, 사포닌 유도체가 사포닌, 구체적으로 SO1861, 여기서 아글리콘 코어 구조는 에틸렌디아민 코어를 갖는 폴리(아미도아민) 덴드리머와 시아닌-3의 접합체와의 반응에 의해, 예컨대 환원적 아미노화를 통해, 아민으로 변환됨으로써 유도체화된 알데히드 기를 포함하는 것, 그리고 여기서 사포닌 상에 다른 유도체화는 존재하지 않는 것이 아닌 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 사포닌 유도체가 사포닌, 구체적으로 SO1861, 여기서 아글리콘 코어 구조는 에틸렌디아민 코어를 갖는 폴리(아미도아민) 덴드리머와 시아닌-3의 접합체와의 반응에 의해, 예컨대 환원적 아미노화를 통해, 아민으로 변환됨으로써 유도체화된 알데히드 기를 포함하는 것이 아닌 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
본원에서 구현예 D6으로 지칭되는, 구현예는, 사포닌 유도체가 독소, 마이크로 RNA, 또는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하지 않는 것, 바람직하게는 사포닌 유도체가, 독소, 약물, 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드와 같은, 약학적 활성 물질을 포함하지 않는 것을 특징으로 하고, 보다 바람직하게는 사포닌 유도체가 이펙터 분자를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
본원에서 구현예 D7로 지칭되는, 구현예는, 사포닌 유도체가 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는, 폴리머 또는 올리고머 구조를 포함하지 않는 것을 특징으로 하고:
·폴리에틸렌이민 및 폴리(아미도아민)과 같은, 폴리- 또는 올리고(아민),
·폴리에틸렌 글리콜,
·폴리(락티드)와 같은, 폴리- 또는 올리고(에스테르),
·폴리(락탐),
·폴리락티드-코-글리콜리드 공중합체,
·시클로덱스트린 및 폴리덱스트로스와 같은, 다- 또는 올리고당류,
·단백질 및 펩티드와 같은, 폴리- 또는 올리고(아미노산), 및
·DNA, RNA, LNA(잠금 핵산) 및 PNA(펩티드 핵산)와 같은, 핵산 및 이의 유사체;
바람직하게는 사포닌 유도체가 폴리머, 올리고머, 덴드리머, 덴드론화된 폴리머, 또는 덴드론화된 올리고머와 같은 구조적으로 정렬된 형성물인 폴리머 또는 올리고머 구조를 포함하지 않거나 하이드로겔, 마이크로겔, 나노겔, 안정화된 폴리머 마이셀 또는 리포솜과 같은 집합된 폴리머 구조인 것을 특징으로 하고, 보다 바람직하게는 사포닌 유도체가 폴리머 또는 올리고머 구조를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
본원에서 구현예 D8로 지칭되는, 구현예는, 사포닌 유도체가 주로 또는 전적으로 함께 결합된 적어도 2개의 동일하거나 유사한 유닛으로부터 확립되는 분자 구조를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
본원에서 구현예 D9로 지칭되는, 구현예는, 사포닌 유도체가, SO1861과 N-[(디메틸아미노)-1H-1,2,3-트리아졸로-[4,5-b]피리딘-1-일메틸렌]-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥시드(HATU)의 반응 생성물인, 화학식 (A3) 화합물이 아닌 것을 특징으로 하고:
[화학식 (A3)]
Figure pct00077
,
바람직하게는 사포닌 유도체가 활성화된 에스테르가 아닌 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다. 도 59 참고.
본원에서 구현예 D10으로 지칭되는, 구현예는, 사포닌 유도체가 사포닌, 구체적으로 SO1861 여기서 카르복실 기는 아미드 결합 또는 에스테르 결합으로 변환됨으로써 유도체화된 것, 그리고 여기서 사포닌 상에 다른 유도체화는 존재하지 않는 것이 아닌 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
본원에서 구현예 D11로 지칭되는, 구현예는, 사포닌 유도체가 디안틴 모이어티를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
본원에서 구현예 D12로 지칭되는, 바람직한 구현예는, 사포닌 유도체가 단일 사포닌 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
본원에서 구현예 D13으로 지칭되는, 바람직한 구현예는, 사포닌 유도체가 2500 g/mol 미만, 바람직하게는 2300 g/mol 미만, 보다 바람직하게는 2150 g/mol 미만의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다.
본원에서 구현예 D14로 지칭되는, 바람직한 구현예는, 사포닌 유도체화가 400 g/mol 미만, 바람직하게는 300 g/mol 미만, 보다 바람직하게는 270 g/mold 미만의 분자량을 갖는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 사포닌 유도체이다. 사포닌 유도체화의 분자량은 아글리콘 코어 및 1개(모노데스모시드 사포닌의 경우) 또는 2개의(바이데스모시드 사포닌의 경우) 글리콘(당) 사슬을 제외한 사포닌 유도체의 분자량에 해당한다. 당업자는 사포닌 유도체가 그의 대응하는 비유도체화된 사포닌보다 더 낮은 분자량을 갖는 경우, 사포닌 유도체화가 어떠한 분자량 증가도 가져오지 않고 따라서 사포닌 유도체화가 400 g/mol 미만, 바람직하게는 300 g/mol 미만, 보다 바람직하게는 270 g/mol 미만의 분자량을 갖는다는 구현예 D14의 요건을 따른다는 것을 이해할 것이다.
당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 구현예 D2 내지 D14는 서로 중에서 뿐만 아니라 본 출원에 기술된 다른 구현예와 조합될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 구현예에서 구현예 D2 내지 D14의 다음 조합이 제공된다:
·D2 내지 D11, D13 중 하나 이상 및 D12 ;
·D2 내지 D12 중 하나 이상 및 D13;
·D2 내지 D11 중 하나 이상 및 D12, D13;
·D2, D10 및 D12;
·D3, D7, D9 및 바람직하게는 D13; 또는
·D3, D9, D12 및 D13.
구현예 D2 내지 D14의 이들 조합이 본 발명에 따른 다른 구현예, 바람직하게는, 구현예 D14와 다시 조합될 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다.
구체적으로 바람직한 구현예는 구현예 D3, D9, D12 및 D13과 D14 중 하나 또는 둘 모두의 조합에 해당한다. 다시 말해, 구체적으로 바람직한 구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체로서 여기서 사포닌 유도체는 단일 사포닌 모이어티를 포함하고, 여기서 사포닌 유도체는 2500 g/mol 미만, 바람직하게는 2300 g/mol 미만, 보다 바람직하게는 2150 g/mol 미만의 분자량을 가지며, 여기서 사포닌 유도체는
·사포닌, 구체적으로 SO1861, 여기서 아글리콘 코어 구조는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 유도체화된 알데히드 기를 포함하며 여기서 EMCH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화된 것, 그리고 여기서 바람직하게는 사포닌 상에 다른 유도체화가 존재하지 않는 것이 아니다; 및
·SO1861과 N-[(디메틸아미노)-1H-1,2,3-트리아졸로-[4,5-b]피리딘-1-일메틸렌]-N-메틸메탄아미늄 헥사플루오로포스페이트 N-옥시드(HATU)의 반응 생성물인 활성화된 에스테르가 아니다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조를 포함하며 여기서 아글리콘 코어 구조는 알데히드 기를 포함하고 여기서 제1 당류 사슬은 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하며, 이는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통해 아미드 결합으로 변환됨으로써 유도체화되었다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 단, N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 아글리콘 코어 구조의 알데히드 기가 유도체화되고 사포닌이 QS-21인 경우, 글루쿠론산 또한 유도체화되며, 단 사포닌이 QS-21이고 SO1861의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기가 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HATU)와 QS-21 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기의 반응에 의해 유도체화되는 경우, 알데히드 기 또한 변형된다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체이며, 단, 사포닌 유도체의 아글리콘 코어 구조의 알데히드 기가 EMCH와의 반응을 통해 유도체화되고 사포닌이 QS-21인 경우, 글루쿠론산 또한 유도체화되며, 단, 사포닌이 QS-21이고 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기가 결합된 HATU에 의해 유도체화되는 경우, 알데히드 기 또한 유도체화된다.
본 발명의 제2 양태는 본 발명에 따른 사포닌 유도체 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 제1 약학적 조성물에 관한 것이다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 희석제를 포함하고, 추가로 다음을 포함하는 본 발명에 따른 제1 약학적 조성물이다:
·약학적으로 허용가능한 염, 바람직하게는, 암모늄, 칼슘, 구리, 철, 마그네슘, 망간, 포타슘, 소듐, 스트론튬 또는 아연 염, 바람직하게는 NaCl과 같은, 약학적으로 허용가능한 무기 염; 및/또는
·포스페이트, 보레이트, 시트레이트, 카르보네이트, 히스티딘, 락테이트, 트로메타민, 글루코네이트, 아스파르테이트, 글루타메이트, 타르타레이트, 숙시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 아세테이트 및/또는 케토글루타레이트 함유 완충제 시스템과 같은, 약학적으로 허용가능한 완충제 시스템.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 바람직하게는 물을 포함하는 본 발명에 따른 제1 약학적 조성물이며, 여기서 조성물은 25℃의 온도에서 액체이고 2 내지 11의 범위 내, 바람직하게는 4 내지 9의 범위 내, 보다 바람직하게는 6 내지 8의 범위 내 pH를 갖는다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 바람직하게는 물을 포함하는 본 발명에 따른 제1 약학적 조성물이며, 여기서 조성물은 25℃의 온도에서 액체이고 여기서 사포닌 유도체의 농도는 10-12 내지 1 mol/l의 범위 내, 바람직하게는 10-9 내지 0.1 mol/l의 범위 내, 보다 바람직하게는 10-6 내지 0.1 mol/l의 범위 내에 있다.
전형적으로, 이러한 제1 약학적 조성물은 예를 들어 ADC 또는 AOC와 조합하여 사용하기에 적합하다. 예를 들어, 제1 약학적 조성물은, 이러한 ADC 또는 AOC 요법을 필요로 하는 환자에게 ADC 또는 AOC가 투여되기 전에, ADC 또는 AOC와 함께, 또는 ADC 또는 AOC의 투여 (직)후, ADC 또는 AOC의 투여를 필요로 하는 환자에게 투여된다. 예를 들어, 제1 약학적 조성물은 ADC 또는 AOC를 포함하는 약학적 조성물과 혼합되고, 수득된 혼합물의 적합한 용량이 ADC 또는 AOC 요법을 필요로 하는 환자에게 투여된다. 본 발명에 따르면, 사포닌 유도체 및 ADC 또는 AOC가 종양 세포와 같은 표적 세포 내부에 공동-위치할 때, 제1 약학적 조성물에 포함된 사포닌 유도체는 이러한 ADC 또는 AOC에 포함된 이펙터 분자의 효능 및 효과를 증진시킨다. 사포닌 유도체의 영향 하에서, 사포닌 유도체의 부재 하에 동일한 용량의 ADC 또는 AOC와 동일한 세포를 접촉시키는 것과 비교하여, 이펙터 분자는 더 높은 정도로 표적 세포의 시토졸 내로 방출된다. 따라서, 이펙터 분자가 제1 약학적 조성물의 사포닌 유도체와 함께 표적 세포 내부에 공동-위치할 때, 이펙터 분자 포함 ADC 또는 AOC가 전달되는 세포 내부에 사포닌 유도체가 부재할 때 동일한 효능을 달성하기 위해 요구되는 용량과 비교하여, 더 낮은 ADC 또는 AOC 용량에서 유사한 효능이 얻어질 수 있다.
구현예는 본 발명의 제1 약학적 조성물이며, 여기서 사포닌 유도체는 분자 30으로 표시되는 사포닌 유도체:
[분자 30]
Figure pct00078
,
또는 단일 유도체화를 포함하는 QS-21 유도체이며, 여기서 단일 유도체화는 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HATU)와 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기의 반응에 의한 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기의 변환이다.
본 발명의 제3 양태는 다음을 포함하는 약학적 복합제에 관한 것이다:
o 본 발명의 제1 약학적 조성물; 및
o 항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 임의의 하나 이상을 포함하고, 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 선택적으로 포함하는 제2 약학적 조성물.
본 발명의 제4 양태는 본 발명의 사포닌 유도체를 포함하고 다음 중 임의의 하나 이상을 추가로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 선택적으로 포함하는 제3 약학적 조성물에 관한 것이다: 항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-핵산 접합체 또는 수용체-리간드 - 핵산 접합체.
구현예는 본 발명의 약학적 복합제 또는 본 발명의 제3 약학적 조성물이며, 여기서 제2 약학적 조성물 또는 제3 약학적 조성물은 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 임의의 하나 이상을 포함하고, 여기서 약물은 예를 들어 사포린 및 디안틴과 같은 독소이고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 예컨대 아포리포단백질 B 또는 HSP27의 유전자 침묵을 위한, siRNA 또는 BNA이다.
구현예는 본 발명의 약학적 복합제 또는 본 발명의 제3 약학적 조성물이며, 여기서 사포닌 유도체는 다음의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 사포닌 유도체이고: QS-21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, 키라야사포닌, QS-18, Quil-A, 이의 입체이성질체 및 이들의 조합, 바람직하게는 사포닌 유도체는 QS-21 유도체로 구성된 군으로부터 선택되고, 보다 바람직하게는 사포닌 유도체는 QS21 유도체이다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체, 바람직하게는 약학적으로 허용가능한 희석제를 포함하고, 추가로 다음을 포함하는 본 발명에 따른 제3 약학적 조성물이다:
·약학적으로 허용가능한 염, 바람직하게는, 암모늄, 칼슘, 구리, 철, 마그네슘, 망간, 포타슘, 소듐, 스트론튬 또는 아연 염, 바람직하게는 NaCl과 같은, 약학적으로 허용가능한 무기 염; 및/또는
·포스페이트, 보레이트, 시트레이트, 카르보네이트, 히스티딘, 락테이트, 트로메타민, 글루코네이트, 아스파르테이트, 글루타메이트, 타르타레이트, 숙시네이트, 말레이트, 푸마레이트, 아세테이트 및/또는 케토글루타레이트 함유 완충제 시스템과 같은, 약학적으로 허용가능한 완충제 시스템.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 바람직하게는 물을 포함하는 본 발명에 따른 제3 약학적 조성물이며, 여기서 조성물은 25℃의 온도에서 액체이고 2 내지 11의 범위 내, 바람직하게는 4 내지 9의 범위 내, 보다 바람직하게는 6 내지 8의 범위 내 pH를 갖는다.
구현예는 본 발명에 따른 사포닌 유도체 및 약학적으로 허용가능한 희석제, 바람직하게는 물을 포함하는 본 발명에 따른 제3 약학적 조성물이며, 여기서 조성물은 25℃의 온도에서 액체이고 여기서 사포닌 유도체의 농도는 10-12 내지 1 mol/l의 범위 내, 바람직하게는 10-9 내지 0.1 mol/l의 범위 내, 보다 바람직하게는 10-6 내지 0.1 mol/l의 범위 내에 있다.
본 발명의 제5 양태는 의약으로서 사용하기 위한, 본 발명의 제1 약학적 조성물, 본 발명의 약학적 복합제, 또는 본 발명의 제3 약학적 조성물에 관한 것이다. 바람직한 구현예에서 본 발명의 제1 약학적 조성물로서 여기서 사포닌 유도체는 QS-21-Ald-EMCH, QS-21-Ald-EMCH-메르캅토에탄올, QS21-Glu-AEM, QS21-Glu-AMPD, QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM), QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD), QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD), QS-21-L-N3 또는 QS-21-Glu-HATU를 포함하는, 바람직하게는 이로 구성되는 것, 본 발명의 약학적 복합제로서 여기서 사포닌 유도체는 QS-21-Ald-EMCH, QS-21-Ald-EMCH-메르캅토에탄올, QS21-Glu-AEM, QS21-Glu-AMPD, QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM), QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD), QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD), QS-21-L-N3 또는 QS-21-Glu-HATU를 포함하는, 바람직하게는 이로 구성되는 것, 또는 본 발명의 제3 약학적 조성물로서 여기서 사포닌 유도체는 QS-21-Ald-EMCH, QS-21-Ald-EMCH-메르캅토에탄올, QS21-Glu-AEM, QS21-Glu-AMPD, QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM), QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD), QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD), QS-21-L-N3 또는 QS-21-Glu-HATU를 포함하는, 바람직하게는 이로 구성되는 것이 의약으로서의 사용을 위해 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서 본원에 기술된 사포닌 유도체, 바람직하게는 QS-21-Ald-EMCH, QS-21-Ald-EMCH-메르캅토에탄올, QS21-Glu-AEM, QS21-Glu-AMPD, QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM), QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD), QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD), QS-21-L-N3 또는 QS-21-Glu-HATU가 의약으로서의 사용을 위해 제공된다.
본 발명의 제6 양태는 암, 감염성 질환, 바이러스 감염, 고콜레스테롤혈증, 원발성 고옥살산뇨증, A 형 혈우병, B 형 혈우병, 알파-1 항트립신 관련 간 질환, 급성 간 포르피린증, 트랜스티레틴-매개 아밀로이드증, 또는 자가-면역 질환의 치료 또는 예방에서의 사용을 위한, 본 발명의 제1 약학적 조성물, 본 발명의 약학적 복합제, 또는 본 발명의 제3 약학적 조성물에 관한 것이다.
바람직한 구현예에서 본 발명의 제1 약학적 조성물로서 여기서 사포닌 유도체는 QS-21-Ald-EMCH, QS-21-Ald-EMCH-메르캅토에탄올, QS21-Glu-AEM, QS21-Glu-AMPD, QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM), QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD), QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD), QS-21-L-N3 또는 QS-21-Glu-HATU를 포함하는, 바람직하게는 이로 구성되는 것, 본 발명의 약학적 복합제로서 여기서 사포닌 유도체는 QS-21-Ald-EMCH, QS-21-Ald-EMCH-메르캅토에탄올, QS21-Glu-AEM, QS21-Glu-AMPD, QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM), QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD), QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD), QS-21-L-N3 또는 QS-21-Glu-HATU를 포함하는, 바람직하게는 이로 구성되는 것, 또는 본 발명의 제3 약학적 조성물로서 여기서 사포닌 유도체는 QS-21-Ald-EMCH, QS-21-Ald-EMCH-메르캅토에탄올, QS21-Glu-AEM, QS21-Glu-AMPD, QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM), QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD), QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD), QS-21-L-N3 또는 QS-21-Glu-HATU를 포함하는, 바람직하게는 이로 구성되는 것이, 암, 감염성 질환, 바이러스 감염, 고콜레스테롤혈증, 원발성 고옥살산뇨증, A 형 혈우병, B 형 혈우병, 알파-1 항트립신 관련 간 질환, 급성 간 포르피린증, 트랜스티레틴-매개 아밀로이드증, 또는 자가-면역 질환의 치료 또는 예방에서의 사용을 위해, 제공된다.
바람직한 구현예에서 제4 약학적 조성물은, 암, 감염성 질환, 바이러스 감염, 고콜레스테롤혈증, 원발성 고옥살산뇨증, A 형 혈우병, B 형 혈우병, 알파-1 항트립신 관련 간 질환, 급성 간 포르피린증, 트랜스티레틴-매개 아밀로이드증, 또는 자가-면역 질환, 바람직하게는 암의 치료 또는 예방에서의 사용을 위해, 트리테르펜 아글리콘 코어 구조 및 아글리콘 코어 구조에 연결된 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬 중 적어도 하나를 포함하는 사포닌에 기반한 사포닌 유도체, 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함하며, 여기서:
i. 사포닌 유도체는 유도체화된 알데히드 기를 포함하는 아글리콘 코어 구조를 포함하거나;
ii. 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하며 여기서 제1 당류 사슬은 유도체화된 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하거나;
iii. 사포닌 유도체는 임의의 조합의 유도체화 i., ii. 를 포함하며;
여기서 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬은 독립적으로 단당류, 선형 올리고당류 및 분지형 올리고당류로부터 선택되고,
여기서 사포닌 유도체는 2500 g/mol 미만의 분자량을 갖는다.
바람직한 구현예에서 암, 감염성 질환, 바이러스 감염, 고콜레스테롤혈증, 원발성 고옥살산뇨증, A 형 혈우병, B 형 혈우병, 알파-1 항트립신 관련 간 질환, 급성 간 포르피린증, 트랜스티레틴-매개 아밀로이드증, 또는 자가-면역 질환, 바람직하게는 암의 치료 또는 예방에서의 사용을 위한 제2 약학적 복합제는 다음을 포함한다:
·트리테르펜 아글리콘 코어 구조 및 아글리콘 코어 구조에 연결된 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬 중 적어도 하나를 포함하는 사포닌에 기반한 사포닌 유도체로서, 여기서:
i. 사포닌 유도체는 유도체화된 알데히드 기를 포함하는 아글리콘 코어 구조를 포함하거나;
ii. 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하며 여기서 제1 당류 사슬은 유도체화된 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하거나;
iii. 사포닌 유도체는 임의의 조합의 유도체화 i., ii.를 포함하며;
여기서 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬은 독립적으로 단당류, 선형 올리고당류 및 분지형 올리고당류로부터 선택되는 것,
및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제
·항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 임의의 하나 이상을 포함하고, 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 제5 약학적 조성물.
바람직한 구현예에서 제6 약학적 조성물은 트리테르펜 아글리콘 코어 구조 및 아글리콘 코어 구조에 연결된 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬 중 적어도 하나를 포함하는 사포닌에 기반한 사포닌 유도체로서, 여기서:
i. 사포닌 유도체는 유도체화된 알데히드 기를 포함하는 아글리콘 코어 구조를 포함하거나;
ii. 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하며 여기서 제1 당류 사슬은 유도체화된 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하거나;
iii. 사포닌 유도체는 임의의 조합의 유도체화 i., ii.를 포함하며;
여기서 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬은 독립적으로 단당류, 선형 올리고당류 및 분지형 올리고당류로부터 선택되는 것,
및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함하고
다음 중 임의의 하나 이상을 추가로 포함한다: 암, 감염성 질환, 바이러스 감염, 고콜레스테롤혈증, 원발성 고옥살산뇨증, A 형 혈우병, B 형 혈우병, 알파-1 항트립신 관련 간 질환, 급성 간 포르피린증, 트랜스티레틴-매개 아밀로이드증, 또는 자가-면역 질환의 치료 또는 예방에서의 사용을 위한, 항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-핵산 접합체 또는 수용체-리간드 - 핵산 접합체, 그리고 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 것.
바람직한 구현예에서 본 발명에 따른 사용을 위한 제2 약학적 복합제 또는 본 발명에 따른 사용을 위한 제3 약학적 조성물은 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 임의의 하나 이상을 포함하며, 여기서 약물은 예를 들어 사포린 및 디안틴과 같은 독소이고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 예컨대 아포리포단백질 B 또는 HSP27의 유전자 침묵을 위한, siRNA 또는 BNA이다.
본 발명의 제7 양태는 다음의 단계를 포함하는, 세포 외부로부터 상기 세포 내부로, 바람직하게는 상기 세포의 시토졸 내로 분자를 전달하는 시험관내 또는 생체외 방법에 관한 것이다:
a) 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)에서 제공된 세포 외부로부터 세포 내로 전달하기 위한 분자를 제공하는 단계;
c) 본 발명에 따른 사포닌 유도체를 제공하는 단계;
d) 단계 a)의 세포를 단계 b)의 분자 및 단계 c)의 사포닌 유도체와 시험관내 또는 생체외 접촉시켜, 세포 외부로부터 상기 세포 내로의 분자의 전달을 확립하는 단계.
바람직한 구현예는 다음의 단계를 포함하는 본 발명의 방법이다:
a) 세포를 제공하는 단계;
b) 단계 a)에서 제공된 세포 외부로부터 세포 내로 전달하기 위한 분자를 제공하는 단계;
c) 트리테르펜 아글리콘 코어 구조 및 아글리콘 코어 구조에 연결된 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬 중 적어도 하나를 포함하는, 바람직하게는 자연 발생, 사포닌에 기반한 사포닌 유도체로서, 여기서:
i. 사포닌 유도체는 유도체화된 알데히드 기를 포함하는 아글리콘 코어 구조를 포함하거나;
ii. 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하며 여기서 제1 당류 사슬은 유도체화된 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하거나;
iii. 사포닌 유도체는 임의의 조합의 유도체화 i., ii.를 포함하며;
여기서 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬은 독립적으로 단당류, 선형 올리고당류 및 분지형 올리고당류로부터 선택되는 것을 제공하는 단계,
d) 단계 a)의 세포를 단계 b)의 분자 및 단계 c)의 사포닌 유도체와 시험관내 또는 생체외 접촉시켜, 세포 외부로부터 상기 세포 내로의 분자의 전달을 확립하는 단계.
구현예는 본 발명의 방법이며, 여기서 세포는 T-세포, NK-세포, 종양 세포와 같은 인간 세포이고/이거나, 여기서 단계 b)의 분자는 다음 중 임의의 하나이며: 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 약물은 예를 들어 독소이며 여기서 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 siRNA 또는 BNA인 것이고/이거나, 여기서 사포닌 유도체는 다음의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되며: QS-21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, 키라야사포닌, QS-18, Quil-A, 이의 입체이성질체 및 이들의 조합, 바람직하게는 사포닌 유도체는 QS-21 유도체로 구성된 군으로부터 선택되며, 보다 바람직하게는 사포닌 유도체는 QS-21 유도체인 것; 또는 여기서 사포닌 유도체는 분자 30으로 표시되는 QS-21 유도체이며, 이는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 유도체화된 키라산 아글리콘 코어 구조의 지시된 위치 C4에 있는 알데히드 기를 포함하는 QS-21 유도체를 나타내는 것:
[분자 30]
Figure pct00079
,
또는 여기서 사포닌 유도체는 QS-21 유도체이며, QS-21 유도체는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 유도체화된 키라산 아글리콘 코어 구조의 지시된 위치 C23에 있는 알데히드 기를 포함하며 여기서 EMCH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올을 이용하여 유도체화되어 티오-에테르 결합을 형성하는 것,
또는 여기서 사포닌 유도체는 다음인 유도체이며
i. 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조를 포함하며 여기서 아글리콘 코어 구조는 다음에 의해 유도체화된 알데히드 기를 포함한다:
- 알코올로 환원; 또는
- N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환되며 여기서 EMCH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것; 또는
- N-[β-말레이미도프로피온산]히드라지드(BMPH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환되며 여기서 BMPH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것; 또는
- N-[κ-말레이미도운데칸산]히드라지드(KMUH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환되며 여기서 KMUH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것; 또는
ii. 제1 당류 사슬은 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하며, 이는 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(AMPD) 또는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통해 아미드 결합으로 변환됨으로써 유도체화되었다; 또는
iii. 사포닌 유도체는 임의의 조합의 2개의 유도체화 i., ii.를 포함한다;
바람직하게는, 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조를 포함하며 여기서 아글리콘 코어 구조는 EMCH와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 유도체화된 알데히드 기를 포함하고 여기서 EMCH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오-에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되거나; 여기서 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조를 포함하며 여기서 아글리콘 코어 구조는 알데히드 기를 포함하고 여기서 제1 당류 사슬은 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하며, 이는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통해 아미드 결합으로 변환됨으로써 유도체화되었거나; 여기서 사포닌 유도체는 유도체이며 단, N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 아글리콘 코어 구조의 알데히드 기가 유도체화되고 사포닌이 QS-21인 경우, 글루쿠론산 또한 유도체화되며, 단 사포닌이 QS-21이고 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기가 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HATU)와 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기의 반응에 의해 유도체화되는 경우, 알데히드 기 또한 변형되거나; 여기서 사포닌은 유도체이며 단, 사포닌 유도체의 아글리콘 코어 구조의 알데히드 기가 EMCH와의 반응을 통해 유도체화되고 사포닌이 QS-21인 경우, 글루쿠론산 또한 유도체화되며, 단, 사포닌이 QS-21이고 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기가 결합된 HATU에 의해 유도체화되는 경우, 알데히드 기 또한 유도체화된다.
구체적인 구현예에서 본원에 기술된 세포 외부로부터 상기 세포 내부로, 바람직하게는 상기 세포의 시토졸 내로 분자를 전달하는 시험관내 또는 생체외 방법이 제공되며 여기서 사포닌 유도체는 QS-21-Ald-EMCH, QS-21-Ald-EMCH-메르캅토에탄올, QS-21-L-N3 또는 QS-21-Glu-HATU를 포함하고, 바람직하게는 이로 구성된다.
본 발명이 여러 구현예의 측면에서 기술되었지만, 본 명세서를 읽고 도면을 연구하면 이의 대안, 수정, 치환 및 균등물이 당업자에게 명백해질 것으로 고려된다. 본 발명은 설명된 구현예에 어떠한 방식으로도 제한되지 않는다. 첨부된 청구범위에 의해 정의된 범위를 벗어나지 않고 변경이 이루어질 수 있다.
본 발명은 다수의 예시적인 구현예를 참고로 하여 상기에서 기술되었다. 수정이 가능하며, 첨부된 청구범위에 정의된 보호 범위에 포함된다. 본 발명은 다음의 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다.
[표 A1]
Figure pct00080
Figure pct00081
Figure pct00082
Figure pct00083
실시예 및 예시적 구현예
재료:
SO1861, SO1832, SO1862(이성질체) 및 SO1904는 업체[Analyticon Discovery GmbH]에 의해 사포나리아 오피시날리스 L로부터 수득한 원 식물 추출물로부터 단리 및 정제되었다. QS21(순수한), QS18(분획물), QS17(분획물), QS7(분획물) QS21(분획물)은 업체[Desert King International, San Diego]로부터 구입하였다. 트라스투주맙(Tras, Herceptin®, Roche), 세툭시맙(Cet, Erbitux®, Merck KGaA)은 약국에서 구입하였다. EGF디안틴은 표준 절차에 따라 이.콜라이(E.coli)에서 생산하였다. 세툭시맙-사포린 접합체는 업체[Advanced Targeting Systems(San Diego, CA)]에서 생산 및 구입하였다. 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드(TCEP, 98%, Sigma-Aldrich), 5,5-디티오비스(2-니트로벤조산)(DTNB, Ellman's 시약, 99%, Sigma-Aldrich), 제바(Zeba)TM 스핀 탈염 컬럼(2 mL, Thermo-Fisher), 누페이지(NuPAGE)TM 4-12% 비스-트리스 단백질 겔(Thermo-Fisher), 누페이지(NuPAGE)TM MES SDS 러닝 완충제(Thermo-Fisher), 노벡스(Novex)TM 샤프(Sharp) 사전-염색 단백질 표준(Thermo-Fisher), 페이지블루(PageBlue)TM 단백질 염색 용액(Thermo-Fischer), 피어스(Pierce)TM BCA 단백질 분석 키트(Thermo-Fisher), N-에틸말레이미드(NEM, 98%, Sigma-Aldrich), 1,4-디티오트레이톨(DTT, 98%, Sigma -Aldrich), 세파덱스(Sephadex) G25(GE Healthcare), 세파덱스 G50 M(GE Healthcare), 수퍼덱스(Superdex) 200P(GE Healthcare), 이소프로필 알코올(IPA, 99.6%, VWR), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(Tris, 99%, Sigma- Aldrich), 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 하이드로클로라이드(Tris.HCL, Sigma-Aldrich), L-히스티딘(99%, Sigma-Aldrich), D-(+)-트레할로스 탈수화물(99%, Sigma-Aldrich), 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트(TWEEN 20, Sigma-Aldrich), 둘베코(Dulbecco's) 포스페이트-완충 염수(DPBS, Thermo-Fisher), 구아니딘 하이드로클로라이드(99%, Sigma-Aldrich), 에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐 염 이수화물(EDTA-Na2, 99%, Sigma-Aldrich), 멸균 필터 0.2 μm 및 0.45 μm(Sartorius), 숙시니미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC, Thermo-Fisher), 비바스핀(Vivaspin) T4 및 T15 농축기(Sartorius), 수퍼덱스 200PG(GE Healthcare), 테트라(에틸렌 글리콜) 숙시니미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(PEG4-SPDP, Thermo-Fisher), [O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-N,N,N,N-테트라메틸우로늄-헥사플루오르포스페이트](HATU, 97%, Sigma-Aldrich), 디메틸 설폭시드(DMSO, 99%, Sigma-Aldrich), N-(2-아미노에틸)말레이미드 트리플루오로아세테이트 염(AEM, 98%, Sigma-Aldrich), L-시스테인(98.5%, Sigma-Aldrich), 탈이온수(DI)는 초순수 실험수 시스템(MilliQ, Merck)으로부터 새로 받았다, 니켈-니트릴로트리아세트산 아가로스(Ni-NTA 아가로스, Protino), 글리신(99.5%, VWR), 5,5-디티오비스(2-니트로벤조산(Ellman's 시약, DTNB, 98%, Sigma-Aldrich), S-아세틸메르캅토숙신산 무수물 플루오레세인(SAMSA 시약, Invitrogen) 소듐 바이카르보네이트(99.7%, Sigma-Aldrich), 소듐 카르보네이트(99.9%, Sigma-Aldrich), 세파덱스 G-25 수지 포함 PD 미니트랩(MiniTrap) 탈염 컬럼(GE Healthcare), PD10 G25 탈염 컬럼(GE Healthcare), 0.5, 2, 5, 및 10 mL의 제바 스핀 탈염 컬럼(Thermo-Fisher), 비바스핀 원심 필터 T4 10 kDa MWCO, T4 100 kDa MWCO, 및 T15(Sartorius), 바이오셉(Biosep) s3000 aSEC 컬럼(Phenomenex), 비바셀(Vivacell) 한외여과 유닛 10 및 30 kDa MWCO(Sartorius), 날진(Nalgene) 래피드-플로우(Rapid-Flow) 필터(Thermo-Fisher).
약어
AEM: N-(2-아미노에틸)말레이미드 트리플루오로아세테이트 염
AMPD: 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올
BOP: (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트
DIPEA: N,N-디이소프로필에틸아민
DMF: N,N-디메틸포름아미드
EMCH.TFA: N-(ε-말레이미도카프로산) 히드라지드, 트리플루오로아세트산 염
HATU: 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트
Min: 분
NMM: 4-메틸모르폴린
r.t.: 머무름 시간
TCEP: 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 하이드로클로라이드
Temp: 온도
TFA: 트리플루오로아세트산
분석 방법
LC-MS 방법 1
장치: 워터스(Waters) I클래스; 이원 펌프: UPIBSM, SM: SO를 갖는 UPISMFTN; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320 nM, SQD: ACQ-SQD2 ESI, 생성물의 분자량에 따른 질량 범위 1500 내지 2400 또는 2000 내지 3000 범위 내의 neg 또는 neg/pos; ELSD: 기체 압력 40 psi, 드리프트 튜브 온도: 50℃; 컬럼: 액퀴티(Acquity) C18, 50Х2.1 mm, 1.7 μm 온도: 60℃, 유량: 0.6 mL/분,
생성물의 극성에 따른 구배:
At0 = 2% A, t5.0 분 = 50% A, t6.0 분 = 98% A
Bt0 = 2% A, t5.0 분 = 98% A, t6.0 분 = 98% A
후 시간: 1.0 분, 용리액 A: 아세토니트릴, 용리액 B: 물 중 10 mM 암모늄 바이카르보네이트(pH=9.5).
LC-MS 방법 2, 2
장치: 워터스 I클래스; 이원 펌프: UPIBSM, SM: SO를 갖는 UPISMFTN; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320 nm, SQD: ACQ-SQD2 ESI, 생성물의 분자량에 따른 질량 범위: pos/neg 100 내지 800 또는 neg 2000 내지 3000; ELSD: 기체 압력 40 psi, 드리프트 튜브 온도: 50℃; 컬럼: 워터스 엑스셀렉트(XSelect)TM CSH C18, 50Х2.1 mm, 2.5 μm, 온도: 25℃, 유량: 0.5 mL/분, 구배: t0 분 = 5% A, t2.0 분 = 98% A, t2.7 분 = 98% A, 후 시간: 0.3 분, 용리액 A: 아세토니트릴, 용리액 B: 물 중 10 mM 암모늄 바이카르보네이트(pH = 9.5).
LC-MS 방법 3
장치: 워터스 I클래스; 이원 펌프: UPIBSM, SM: SO를 갖는 UPISMFTN; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320 nm, SQD: ACQ-SQD2 ESI, 생성물의 분자량에 따른 질량 범위 pos/neg 105 내지 800, 500 내지 1200 또는 1500 내지 2500; ELSD: 기체 압력 40 psi, 드리프트 튜브 온도: 50℃; 컬럼: 워터스 엑스셀렉트TM CSH C18, 50Х2.1 mm, 2.5 μm, 온도: 40℃, 유량: 0.5 mL/분, 구배: t0 분 = 5% A, t2.0 분 = 98% A, t2.7 분 = 98% A, 후 시간: 0.3 분, 용리액 A: 아세토니트릴 중 0.1% 포름산, 용리액 B: 물 중 0.1% 포름산.
LC-MS 방법 4
장치: 워터스 I클래스; 이원 펌프: UPIBSM, SM: SO를 갖는 UPISMFTN; UPCMA, PDA: UPPDATC, 210-320 nm, SQD: ACQ-SQD2 ESI, 생성물의 분자량에 따른 질량 범위: pos/neg 100 내지 800 또는 neg 2000 내지 3000; ELSD: 기체 압력 40 psi, 드리프트 튜브 온도: 50℃ 컬럼: 워터스 액퀴티 쉴드(Acquity Shield) RP18, 50 x 2.1 mm, 1.7 μm, 온도: 25℃, 유량: 0.5 mL/분, 구배: t0 분 = 5% A, t2.0 분 = 98% A, t2.7 분 = 98% A, 후 시간: 0.3 분, 용리액 A: 아세토니트릴, 용리액 B: 물 중 10 mM 암모늄 바이카르보네이트(pH = 9.5).
분취용 방법
분취용 MP-LC 방법 1,
기기 유형: 레벨레리스(Reveleris)TM 프렙 MPLC; 컬럼: 워터스 엑스셀렉트TM CSH C18(145 x 25 mm, 10 μm); 유량: 40 mL/분; 컬럼 온도: 실온; 용리액 A: 물 중 10 mM 암모늄바이카르보네이트 pH = 9.0); 용리액 B: 물 중 99% 아세토니트릴 + 1% 10 mM 암모늄바이카르보네이트; 구배:
At0 분 = 5% B, t1 분 = 5% B, t2 분 = 10% B, t17 분 = 50% B, t18 분 = 100% B, t23 분 = 100% B
Bt0 분 = 5% B, t1 분 = 5% B, t2 분 = 20% B, t17 분 = 60% B, t18 분 = 100% B, t23 분 = 100% B
; 검출 UV: 210, 235, 254 nm 및 ELSD.
분취용 MP-LC 방법 2
기기 유형: 레벨레리스TM 프렙 MPLC; 컬럼: 페노메넥스(Phenomenex) LUNA C18(3)(150Х25 mm, 10μm); 유량: 40m L/분; 컬럼 온도: 실온; 용리액 A: 물 중 0.1%(v/v) 포름산, 용리액 B: 아세토니트릴 중 0.1%(v/v) 포름산; 구배:
At0 분 = 5% B, t1 분 = 5% B, t2 분 = 20% B, t17 분 = 60% B, t18 분 = 100% B, t23 분 = 100% B
Bt0 분 = 2% B, t1 분 = 2% B, t2 분 = 2% B, t17 분 = 30% B, t18 분 = 100% B, t23 분 = 100% B
Ct0 분 = 5% B, t1 분 = 5% B, t2 분 = 10% B, t17 분 = 50% B, t18 분 = 100% B, t23 분 = 100% B
Dt0 분 = 5% B, t1 분 = 5% B, t2 분 = 5% B, t17 분 = 40% B, t18 분 = 100% B, t23 분 = 100% B
; 검출 UV : 210, 235, 254 nm 및 ELSD.
분취용 LC-MS 방법 3
MS 기기 유형: 애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies) G6130B 사중극자; HPLC 기기 유형: 애질런트 테크놀로지스 1290 분취용 LC; 컬럼: 워터스 엑스셀렉트TM CSH(C18, 150Х19 mm, 10 μm); 유량: 25 ml/분; 컬럼 온도: 실온; 용리액 A: 100% 아세토니트릴; 용리액 B: 물 중 10 mM 암모늄 바이카르보네이트 pH=9.0; 구배:
At0 = 20% A, t2.5 분 = 20% A, t11 분 = 60% A, t13 분 = 100% A, t17 분 = 100% A
Bt0 = 5% A, t2.5 분 = 5% A, t11 분 = 40% A, t13 분 = 100% A, t17 분 = 100% A
; 검출: DAD (210 nm); 검출: MSD (ESI pos/neg) 질량 범위: 100 내지 800; DAD 기반 분획물 수집.
분취용 LC-MS 방법 4
MS 기기 유형: 애질런트 테크놀로지스 G6130B 사중극자; HPLC 기기 유형: 애질런트 테크놀로지스 1290 분취용 LC; 컬럼: 워터스 엑스브릿지(XBridge) 단백질(C4, 150 x 19 mm, 10 μm); 유량: 25 ml/분; 컬럼 온도: 실온; 용리액 A: 100% 아세토니트릴; 용리액 B: 물 중 10 mM 암모늄 바이카르보네이트 pH=9.0; 구배:
At0 = 2% A, t2.5 분 = 2% A, t11 분 = 30% A, t13 분 = 100% A, t17 분 = 100% A
Bt0 = 10% A, t2.5 분 = 10% A, t11 분 = 50% A, t13 분 = 100% A, t17 분 = 100% A
Ct0 = 5% A, t2.5 분 = 5% A, t11 분 = 40% A, t13 분 = 100% A, t17 분 = 100% A
; 검출: DAD (210 nm); 검출: MSD (ESI pos/neg) 질량 범위: 100 내지 800; DAD 기반 분획물 수집
플래시 크로마토그래피
그레이스(Grace) 레벨레리스 X2® C-815 플래시; 용매 전달 시스템: 자동-프라이밍을 갖는 3-피스톤 펌프, 단일 실행에서 4개까지의 용매를 갖는 4개의 독립된 채널, 용매을 다 쓰면 자동-전환 라인; 최대 펌프 유속 250 mL/분; 최대 압력 50 bar(725 psi); 검출: UV 200-400 nm, 4개까지의 UV 신호 조합 및 전체 UV 범위 스캔, ELSD; 컬럼 크기: 기기 상 4 내지 330 g, 루어(luer) 유형, 선택적 홀더가 있는 경우 750 g에서 3000 g까지.
실시예 1: 사포닌 유도체의 합성
다음의 변형된 SO1861 사포닌, 즉 사포닌 유도체를, 표 A2에 요약된 바와 같이, 자연 발생 SO1861에 기반하여 합성하였다:
[표 A2]
합성된 변형 SO1861 (SO1861 유도체)의 개관:
Figure pct00084
Figure pct00085
Figure pct00086
Figure pct00087
SO1861 유도체의 합성에 대한 다음의 기술을 참조하며, 표 A2 및 도면을 참조한다.
SO1861-Ald-EMCH(분자 2 ) 합성; 도 60, 도 61a 참고
사포나리아 오피시날리스 L 유래 SO1861(59 mg, 31.7 μmol) 및 EMCH(301 mg, 888 μmol)를 교반기가 있는 둥근 플라스크에 넣고 13 mL 메탄올에 용해했다. TFA(400 μL, cat.)를 용액에 첨가하고 반응 혼합물을 RCT B 자기 교반기(IKA Labortechnik) 상에서 800 rpm으로 및 실온에서 3 시간 동안 교반하였다. 3 시간 동안 교반한 후, 혼합물을 밀리큐(MilliQ) 물 또는 PBS로 희석하고 MWCO가 1 kDa인 재생된 셀룰로스 막 튜브(Spectra/Por 7)를 사용하여 밀리큐 물 또는 PBS에 대해 24 시간 동안 광범위하게 투석했다. 투석 후, 용액을 동결건조하여 흰색 분말을 수득하였다. 수율 62.4 mg(95%). 건조된 분취량은 1H NMR 및 MALDI-TOF-MS를 통한 특성 확인을 위해 추가로 사용하였다.
1H NMR (400 MHz, 메탄올-D 4) (SO1861): δ = 0.50-5.50 (m, 사포닌 트리테르페노이드 및 당 백본 양성자), 9.43 (1H, s, 사포닌의 알데히드 양성자, Ha).
1H NMR (400 MHz, 메탄올-D 4) (SO1861-Ald-EMCH, PBS 워크업): δ = 0.50-5.50 (m, 사포닌 트리테르페노이드 및 당 백본 양성자), 6.79 (2 H, s, 말레이미드 양성자, Hc), 7.62-7.68 (1 H, m, 히드라존 양성자, Hb).
MALDI-TOF-MS (RP 모드): m/z 2124 Da ([M+K]+, 사포닌-EMCH), m/z 2109 Da ([M+K]+, SO1861-ALD-EMCH), m/z 2094 Da ([M+Na]+, SO1861-ALD-EMCH). 도 61a 참고.
MALDI-TOF-MS (RN 모드): m/z 2275 Da ([M-H]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2244 Da ([M-H]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2222 Da ([M-H]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2178 Da ([M-H]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2144 Da ([M-H]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2122 Da ([M-H]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2092 Da ([M-H]-, 사포닌-EMCH 접합체), 2070 Da ([M-H]-, SO1861-ALD-EMCH), 2038 Da ([M-H]-, SO1832-EMCH), 1936 Da ([M-H]-, SO1730-EMCH), 1861 Da ([M-H]-, SO1861). SO1861-ALD-EMCH는 분자 2로 표시된다(화학식: C93H143N3O48, 정확한 질량: 2069.88):
[분자 2]
Figure pct00088
히드라존 결합의 pH 의존적 가수분해를 테스트하기 위해, SO1861-Ald-EMCH를 pH 3에서 HCl 용액에 용해시켰고 MALDI-TOF-MS 스펙트럼을 2개의 상이한 시점에서 기록하였다(도 62). 도 62a 및 도 62b에 나타난 바와 같이, SO1861-Ald-EMCH에 해당하는 m/z 2070 Da에서의 피크의 명확한 감소 경향이 도 61b에서 보인다. SO1861은 가수분해 동안 생성되기 때문에, m/z 2070 Da에서의 감소 경향을 동반한 m/z 1861 Da에서의 피크의 증가가 기록되었다. 이들 결과는 히드라존 결합이 가수분해에 대해 반응성이 있고 SO1861 상에 부착되어 있더라도 절단된다는 것을 보여준다.
SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올(분자 3 ; SO1861-Ald-EMCH-차단) 합성; 도 60 및 도 61b 참고
SO1861-Ald-EMCH의 말레이미드 기는 6.5 내지 7.5의 pH 범위에서 수행될 때 티올과 빠르고 특이적인 마이클 첨가 반응을 수행한다.
SO1861-Ald-EMCH(0.1 mg, 48 nmol)에 200 μL 메르캅토에탄올(18 mg, 230 μmol)을 첨가하고 용액을 써모믹서(ThermoMixer) C(Eppendorf) 상에서 800 rpm 및 실온에서 1 시간 동안 진탕하였다. 1 시간 동안 진탕한 후, 용액을 메탄올로 희석하고 MWCO가 1 kDa인 재생된 셀룰로스 막 튜브(Spectra/Por 7)를 사용하여 메탄올에 대해 광범위하게 4시간 동안 투석하였다. 투석 후 SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올을 제공하고(분자 3), 분취량을 취해 MALDI-TOF-MS를 통해 분석했다.
MALDI-TOF-MS(RP 모드): m/z 2193 Da([M+K]+, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올), m/z 2185 Da([M+K]+, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올), m/z 2170 Da ([M+Na]+, SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올). 도 61b 참고. SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올은 분자 3으로 표시된다(화학식: C95H149N3O49S, 정확한 질량: 2147.90):
[분자 3]
Figure pct00089
SO1861-Glu-AMPD(분자 3A ) 합성; 도 1 참고
SO1861(28.8 mg, 0.015 mmol), AMPD(8.11 mg, 0.077 mmol) 및 HATU(17.6 mg, 0.046 mmol)를 DMF(1.00 mL) 및 NMM(8.48 μL, 0.077 mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 1 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC2에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조시켰다. 다음으로, 분취용 LC-MS3를 이용하여 생성물을 재정제하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(20.2 mg, 67%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 = 93% (화학식: C87H139NO47, 정확한 질량: 1949,85.
LRMS (m/z): 1949 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 2.451B
SO1861-Ald-OH(분자 6 ) 합성; 도 2 참고
SO1861(20.0 mg, 10.7 μmol)을 메탄올(1.00 mL)에 용해시켰다. 다음으로, 소듐 보로하이드리드(4.06 mg, 0.107 mmol; NaBH4)를 첨가했다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 30 분 후 반응 혼합물을 물(0.50 mL)로 희석하고 분취용 MP-LC2에 넣었다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(15.9 mg, 79%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 97% (화학식: C83H132O46, 정확한 질량: 1864,80).
LRMS (m/z): 1865 [M-1]1- (도 15 및 도 16 참고)
LC-MS r.t. (분): 1.951B
SO1861-Ac-OH(분자 8) 합성; 도 3 참고
SO1861(9.30 mg, 4.99 μmol)에 물(0.25 mL) 및 메탄올(0.25 mL) 중 소듐 하이드록시드(2.00 mg, 0.050 mmol) 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 2 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC2에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(8.86 mg, 97%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 = 97% (화학식: C81H128O45, 정확한 질량: 1820,77).
LRMS (m/z): 1820 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 1.831B
SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(분자 9 ) 합성; 도 4 참고
SO1861-Ald-OH(9.37 mg, 5.02 μmol), AMPD(2.64 mg, 0.025 mmol) 및 BOP(6.66 mg, 0.015 mmol)를 DMF(0.50 mL) 및 NMM(5.52 μL, 0.050 mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 1 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC2에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(6.32 mg, 64%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 = 95% (화학식: C87H141NO47, 정확한 질량: 1951,87.
LRMS (m/z): 1952 [M-1]1- (도 17 참고)
LC-MS r.t. (분): 2.451B
SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(분자 10 ) 합성; 도 5 참고
SO1861-Ald-OH(26.8 mg, 0.014 mmol)에 물(0.50 mL) 및 메탄올(0.50 mL) 중 소듐 하이드록시드(5.74 mg, 0.144 mmol) 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 2 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC2에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(24.2 mg, 92%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 = 98%. (화학식: C81H130O45, 정확한 질량: 1822,79)
LRMS (m/z): 1822 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 1.811B
SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(분자 11 ) 합성; 도 6 참고
SO1861-Ac-OH(14.3 mg, 7.84 μmol), AMPD(4.12 mg, 0.039 mmol) 및 BOP(10.4 mg, 0.024 mmol)를 DMF(0.50 mL) 및 NMM(8.62 μL, 0.078 mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 1 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC2에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조시켰다. 다음으로, 생성물을 제1 분취용 MP-LC2를 사용하여, 이어서 분취용 LC-MS3으로 재정제하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(9.47 mg, 63%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 = 98% (화학식: C85H137NO46, 정확한 질량: 1907,84).
LRMS (m/z): 1908 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 2.311B
SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(분자 12 ) 합성; 도 7 참고
SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(8.57 mg, 4.70 μmol), AMPD(42.58 mg, 0.025 mmol) 및 BOP(6.57 mg, 0.015 mmol)를 DMF(0.50 mL) 및 NMM(5.17 μL, 0.047 mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 1 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC2에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조시켰다. 다음으로, 분취용 MP-LC2를 다시 사용하여 생성물을 재정제하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(7.21 mg, 80%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 = 97.8% 화학식: C85H139NO46, 정확한 질량: 1909,86)
LRMS (m/z): 1910 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 2.211B
SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)(분자 14 ) 합성; 도 8 참고
SO1861-Glu-AMPD(10.6 mg, 5.43 μmol) 및 EMCH.TFA(9.22 mg, 0.027 mmol)를 메탄올(엑스트라 드라이, 0.50 mL)에 용해시켰다. 다음으로 TFA(1.66 μL, 0.022 mmol)를 첨가했다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 2 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC1에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조시켰다. 다음으로, 분취용 LC-MS3을 사용함으로써 생성물을 재정제하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 함께 풀링했다. 생성된 용액을 포름산을 사용하여 중화하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(2.61 mg, 22%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 = 95% (화학식: C97H152N4O49, 정확한 질량: 2156,95).
LRMS (m/z): 2156 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 2.641B
SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)(분자 15 ) 합성; 도 9 참고
SO1861-Ac-OH(9.05 mg, 4.97 μmol) 및 EMCH.TFA(8.43 mg, 0.025 mmol)를 메탄올(엑스트라 드라이, 0.50 mL)에 용해시켰다. 다음으로, TFA(1.52 μL, 0.022 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 2 시간 후, 반응 혼합물을 분취용 MP-LC1에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(6.58 mg, 65%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다.LC-MS에 기반한 순도 = 97% (화학식: C91H141N3O47, 정확한 질량: 2027,87).
LRMS (m/z): 2028 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 1.961B
SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(분자 16 ) 합성; 도 10 참고
SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(6.00 mg, 3.14 μmol) 및 EMCH.TFA(5.33 mg, 0.016 mmol)를 메탄올(엑스트라 드라이, 0.50 mL)에 용해시켰다. 다음으로, TFA(0.96 μL, 0.013 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 2 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC1에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조시켰다. 다음으로, 분취용 LC-MS3을 사용함으로써 생성물을 재정제하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 함께 풀링했다. 생성된 용액을 포름산을 사용하여 중화하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(1.04 mg, 16%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 = 94% (화학식: C95H150N4O48, 정확한 질량: 2114,94).
LRMS (m/z): 2115 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 2.551B
SO1861-Glu-AEM(분자 18 ) 합성; 도 11 참고
SO1861(10.4 mg, 5.58 μmol), AEM(7.10 mg, 0.028 mmol) 및 HATU(6.36 mg, 0.017 mmol)를 DMF(1.00 mL) 및 NMM(6.13 μL, 0.056 mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 1 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC2에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(7.82 mg, 71%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 = 95% (화학식: C89H136N2O47, 정확한 질량: 1984,83).
LRMS (m/z): 1985 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 2.621B
SO1861-(Glu-AEM)-(Ac-OH)(분자 19 ) 합성; 도 12 참고
SO1861-Ac-OH(9.02 mg, 4.95 μmol), AEM(7.10 mg, 0.028 mmol) 및 HATU(5.65 mg, 0.015 mmol)를 DMF(0.50 mL) 및 NMM(5.44 μL, 0.050 mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 1 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC2에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(7.16 mg, 74%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 = 96% (화학식: C87H134N2O46, 정확한 질량: 1942,82).
LRMS (m/z): 1944 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 2.471B
SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)(분자 20 ) 합성; 도 13 참고
SO1861-Ald-OH(9.38 mg, 5.03 μmol), AEM(6.39 mg, 0.025 mmol) 및 HATU(5.73 mg, 0.015 mmol)를 DMF(0.50 mL) 및 NMM(5.53 μL, 0.050 mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 1 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC2에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(8.63 mg, 86%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 = 95% (화학식: C89H138N2O47, 정확한 질량: 1986,85).
LRMS (m/z): 1987 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 2.621B
SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)-(Ac-OH)(분자 21 ) 합성; 도 14 참고
SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(8.92 mg, 4.89 μmol), AEM(6.54 mg, 0.026 mmol) 및 HATU(5.65 mg, 0.015 mmol)를 DMF(0.50 mL) 및 NMM(5.38 μL, 0.049 mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 1 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC2에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(8.92 mg, 94%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 = 97% (화학식: C87H136N2O46, 정확한 질량: 1944,84).
LRMS (m/z): 1944 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 2.461B
SO1861-L-N 3 (분자 23 ) 합성 ; 도 36 참고
화학식: C94H151N5O50, 정확한 질량: 2149,94
SO1861-L-NHS(분자 25 ) 합성; 도 37 참고
SO1861-L-N3(7.71 mg, 3.58 μmol) 및 DBCO-NHS(2.88 mg, 7.17 μmol)를 건조 DMF(0.50 mL)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 30 분 후 반응 혼합물을 디에틸 에테르(40 mL)에 적가하였다. 원심분리(7800 RPM, 5 분) 후 상층액을 붓고 펠렛을 디에틸 에테르(20 mL) 중에 재현탁하고 다시 원심분리했다. 상층액을 부은 후 잔류물을 물/아세토니트릴(3:1, v/v, 3 mL)에 용해시키고 생성된 용액을 곧장 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(8.81 mg, 96%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 84%. 가수분해된 NHS 에스테르의 14%를 함유한다. (화학식: C117H169N7O55, 정확한 질량: 2552,06).
LRMS (m/z): 2551 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 2.76/2.782 (이성질체로 인해 이중 피크)
SO1861-Glu-HATU(분자 26 ) 합성; 도 59 참고
SO1861-Glu-HATU를 생산하기 위해 활성 에스테르, 즉 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HATU)를 생성하는 펩티드 커플링 화학에 사용되는 시약을 통해 SO1861의 카르복실 기를 활성화한다. 생성된 SO1861의 활성 에스테르는 도 59에 나타난다.
다음의 변형된 QS-21 사포닌, 즉 사포닌 유도체는 자연 발생 QS-21을 기반으로 합성하였다:
[표 A3]
합성된 변형 QS-21의 개관:
Figure pct00090
Figure pct00091
QS21-Ald-OH(분자 27 ) 합성; 도 38 참고
QS21(9.41 mg, 4.73 μmol)을 메탄올(0.50 mL)에 용해시켰다. 다음으로, 소듐 보로하이드리드(1.79 mg, 0.047 mmol)를 첨가했다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 30 분 후 반응 혼합물을 물(0.50 mL)로 희석하고 분취용 MP-LC2A에 넣었다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(4.68 mg, 50%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 99% (정확한 질량: 1990, 4 이성질체: Api/Xyl (2:1)).
LRMS (m/z): 1990 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 1.25/2.311B (이중 피크, 17/83 UV-면적 %, QS21이 혼합물인 것에 기인함)
QS21-Glu-AEM(분자 28 ) 합성; 도 39 참고
QS-21(2.42 mg, 1.22 μmol; 도 41), AEM(1.68 mg, 6.61 μmol) 및 HATU(1.48 mg, 3.89 μmol)를 DMF(0.50 mL) 및 NMM(1.34 μL, 0.012 mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 1 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC2A에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(1.80 mg, 70%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 92% (정확한 질량: 2110, 4 이성질체: Api/Xyl (2:1)).
LRMS (m/z): 2110 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 2.84/2.931B (이중 피크, 10/90 UV-면적 %, QS21이 혼합물인 것에 기인함)
QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)(분자 29 ) 합성; 도 40a 참고
QS-21-Ald-OH(1.92 mg, 0.964 μmol), AEM(1.29 mg, 5.08 μmol) 및 HATU(1.10 mg, 2.89 μmol)를 DMF(0.50 mL) 및 NMM(1.06 μL, 9.64 μmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 1 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC2A에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(1.46 mg, 72%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 92% (정확한 질량: 2112, 4 이성질체: Api/Xyl (2:1)).
LRMS (m/z): 2112 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 2.83/2.921B (이중 피크, 7/93 UV-면적 %, QS21이 혼합물인 것에 기인함)
QS21-Ald-EMCH(도 40b; 분자 30 ) 합성
QS21(4.82 mg, 2.42 μmol) 및 EMCH.TFA(4.11 mg, 0.012 mmol)를 메탄올(엑스트라 드라이, 0.25 mL)에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 2 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC2A에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조시켰다. 다음으로, 분취용 MP-LC2A를 사용함으로써 생성물을 재정제하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(2.78 mg, 52%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 96%.
LRMS (m/z): 2196 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 2.441B (QS21이 혼합물인 것으로 인해 다중 피크)
QS21-Glu-AMPD(도 40c; 분자 31 ) 합성
QS21(4.89 mg, 2.46 μmol), AMPD(1.29 mg, 0.012 mmol) 및 BOP(3.26 mg, 7.37 μmol)를 DMF(0.50 mL) 및 NMM(2.70 μL, 0.025 mmol)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 1 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC2A에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(3.76 mg, 74%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 94%.
LRMS (m/z): 2076 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 2.781B (QS21이 혼합물인 것으로 인해 다중 피크)
QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)(도 40d; 분자 32 ) 합성
QS21-Glu(2.47 mg, 1.19 μmol) 및 EMCH.TFA(2.02 mg, 5.95 μmol)를 메탄올(엑스트라 드라이, 100 μL)에 용해시켰다. 다음으로 TFA(0.36 μL, 4.76 μmol)를 첨가했다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 2 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC2A에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(2.25 mg, 83%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 95%.
LRMS (m/z): 2283 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 2.881B (QS21이 혼합물인 것으로 인해 다중 피크)
QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(도 40e; 분자 33 ) 합성
QS21-(Ald-OH)(4.90 mg, 2.46 μmol), AMPD(1.29 mg, 0.012 mmol) 및 BOP(3.26 mg, 7.37 μmol)를 DMF(0.50 mL) 및 NMM(2.70 μL, 0.025 μL)의 혼합물에 용해시켰다. 반응 혼합물을 1 분 동안 진탕하고 실온에 움직이지 않게 놓아두었다. 1 시간 후 반응 혼합물을 분취용 MP-LC2A에 적용하였다. 생성물에 해당하는 분획물을 즉시 함께 풀링하고, 냉동하고 하룻밤동안 동결건조하여 표제 화합물(2.16 mg, 42%)을 흰색 솜털같은 고체로 수득하였다. LC-MS에 기반한 순도 96%.
LRMS (m/z): 2077 [M-1]1-
LC-MS r.t. (분): 2.771B (QS21이 혼합물인 것으로 인해 다중 피크)
실시예 2: 사포닌 유도체의 활성 - 파일럿 연구
본원에 기술된 사포닌 변형은 엔도솜 탈출을 증진시키는 사포닌의 능력을 실질적으로 방해하지 않는 것으로 밝혀졌다(엔도솜 내부에서 변형된 사포닌 또는 사포닌이 접합체로부터 유리된다). 실험 결과는, 본원 하기에 있는, 표 Ex2에 요약되어 있다.
화학적으로 변형된 사포닌 SO1861은 세포-기반 생물분석에서, 판독 정보로서 상대 세포 생존력으로, 반응성을 보였다. HeLa 세포를 다음의 구성물과 함께 72시간 동안 인큐베이션하고 72시간-인큐베이션 전후의 세포 생존력을 평가하였다. 실험에서, 세포는 1,5 pM 디안틴-EGF 접합체에 노출시켰다. 음성 대조군은, 디안틴-EGF 없이, 완충제 비히클 및 10 마이크로그램/ml 사포닌과 함께 인큐베이션된 세포였다. 세포 생존력은 사포닌 및 EGF-디아틴 둘 모두를 제외시킨 대조군에 대해 100%로 설정하였다. 양성 대조군은 비-변형된 사포닌 SO1861 + 디안틴-EGF 10 마이크로그램/ml이었다. 72시간 후 세포 생존력은 본질적으로 0%였다. 화학적으로 변형된 사포닌 변이체의 경우, 10 마이크로그램/ml 사포닌을 1,5 pM 디안틴-EGF와 조합하여 테스트했다. SO1861-Ald-EMCH는 10 마이크로그램/ml에서 세포 생존력을 감소시켰다.
이들 데이터는 사포닌이 엔도솜 탈출 증진 활성을 잃지 않고서 유리 알데히드 기 또는 유리 카르보닐 기에서 변형될 수 있음을 입증한다.
[표 Ex2]
표적화된 독소(EGF디안틴)와의 병용투여 시 SO1861 및 SO1861 유도체의 세포 살해 활성(+ 또는 -). EGFR 발현 세포(예를 들어 A431, HeLa)의 비처리 대조군과 비교하여 병용투여는 증진된 세포 살해를 초래했다
Figure pct00092
실시예 3: 사포닌 유도체의 활성 - 상세 연구
다양한 사포닌(예를 들어 SO1861, QS-21)을 '유리' 비접합 분자로서 세포에 리간드 독소 융합체(예를 들어 EGF-디아틴) 또는 항체-단백질 독소 접합체와 함께 병용-투여하여, 표적-발현 세포의 세포 살해 활성 증진을 초래했다.
본 발명자들은 분자 내의 다양한 위치에서 SO1861(사포나리아 오피시날리스의 뿌리 추출물로부터 단리 및 정제) 및 QS21(키라야 사포나리아로부터 단리 및 정제; 데저트 킹(Desert King))을 화학적으로 변형(단일, 이중 또는 삼중 변형)하여, 표 A2 및 표 A3에 약술된 일련의 사포닌 유도체를 제공하였다. 1) EGFR 발현 세포(HeLa 및 A431)에 대한 리간드 독소의 엔도솜 탈출 증진 활성(변형된 SO1861/QS21 적정 + 5 pM EGF디아틴)에 대해; 2) HeLa 및 A431에 대한 내재적 세포 독성(변형된 SO1861/QS21 적정)에 대해; 및 3) 인간 적혈구 용혈 활성(인간 적혈구에 대해 변형된 SO1861/QS21 적정)에 대해 사포닌 유도체를 테스트하였다.
엔도솜 탈출 증진 활성을 결정하기 위해, 변형된 SO1861을 EGFR 발현 세포(HeLa 및 A431) 상에서 비-효과적 고정 농도 5 pM EGF-디안틴의 존재 하에 적정하였다(도 18a 내지 도 18b 및 도 19a 내지 도 19b 참고). 추가로, 비-효과적 고정 농도 5 pm EGF-디안틴의 존재 하에 적정된 사포닌 유도체에 대해 엔도솜 탈출 증진 활성 또한 결정하였다(SO1861과 SO1861-Ald-EMCH 및 SO1861-Ald-EMCH-차단- 의 비교에 대해서는 도 23a 내지 도 23b 참고 그리고 SO1861과 SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH), SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD) 및 SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)에 대해서는 도 24a 내지 도 24b 참고). 이는 SO1861과 비교하여 단일 변형된 변형을 갖는 변형된 사포닌은 다음 농도에서 활성을 보임을 밝혔다: SO1861-Ald-OH HeLa 상에서: IC50 = 600 nM 및 A431 상에서: IC50 = 600 nM, SO1861-Glu-AMPD HeLa 상에서: IC50 = 600 nM 및 A431 상에서: IC50 = 600 nM, SO1861-Ac-OH HeLa 상에서: IC50 = 1000 nM 및 A431 상에서: IC50 = 800 nM, SO1861-Glu-AEM HeLa 상에서: IC50 = 1500 nM 및 A431 상에서: IC50 = 2000 nM 및 SO1861-Ald-EMCH HeLa 상에서: IC50 = 2000 nM 및 A431 상에서: IC50 = 2000 nM 그리고 이중 변형은 다음의 IC50 값으로 활성을 보였다: SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD) HeLa 상에서: IC50 = 3000 nM 및 A431 상에서: IC50 = 3000 nM SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD) HeLa 상에서: IC50 = 4000 nM 및 A431 상에서: IC50 = 4000 nM, SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH) HeLa 상에서: IC50 = 4000 nM 및 A431 상에서: IC50 = 5000 nM, SO1861-(Glu-AEM)-(Ac-OH) HeLa 상에서: IC50 = 8000 nM 및 A431 상에서: IC50 = 4000 nM, SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH) HeLa 상에서: IC50 = 8000 nM 및 A431 상에서: IC50 = 10.000 nM, SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH) HeLa 상에서: IC50 = 40.000 nM 및 A431 상에서: IC50 = 20.000 nM. 테스트된 삼중 변형은 현재 농도에서 활성을 보이지 않았다. 비변형된 SO1861 대조군을 사용하여 다음 IC50 값을 수득하였다. HeLa에서: IC50 = 100 nM, 및 A431에서: IC50 = 200 nM. 변형된 QS21의 엔도솜 탈출 증진은 EGFR 발현 세포 상에서 비-효과적 고정 농도5 pM EGF-디아틴의 존재 하에 사포닌 유도체를 적정함으로써 결정하였다(도 30a 및 도 30b 참고). 이는 비변형된 QS21과 비교하여 다음의 변형된 QS21은 다음 농도에서 활성을 보임을 밝혔다: QS21 HeLa 상에서: IC50 = 200 nM 및 A431 상에서: IC50 = 200 nM, QS21-Ald-OH HeLa 상에서: IC50 = 600 nM 및 A431 상에서: IC50 = 600 nM, QS21-Glu-AEM HeLa 상에서: IC50 = 600 nM 및 A431 상에서: IC50 = 700 nM, QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM) HeLa 상에서: IC50 = 1500 nM 및 A431 상에서: IC50 = 3000 nM. 결론적으로, 비변형된 SO1861 및 QS21은 둘 모두 HeLa 및 A431 세포에서 IC50 = 200 nM로 효과적이었다. 단일 SO1861/QS21 변형(SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ald-EMCH-차단, SO1861-Glu-AMPD, SO1861-Ald-OH, SO1861-Ac-OH, SO1861-Glu-AEM, QS21-Ald-OH, QS21-Glu-AEM)은 HeLa 또는 A431에서 IC50 = 600 nM - 2000 nM로 활성을 보인 반면(표 A5 및 표 A6) 이중 SO1861/QS21 변형은 Hela 또는 A431 세포에서 IC50 = 1500 - 40.000 nM로 활성을 보였다(표 A5 및 표 A6). SO1861의 삼중 변형의 경우 20.000 nM까지 활성을 관찰할 수 없었다.
전술된 바와 같이, 엔도솜 탈출 증진 활성을 결정하기 위해, SO1861 유도체, QS21 유도체 및 이들의 비-유도체화된 대응물을 EGFR 발현 세포(HeLa 및 A431) 상에서 비-효과적 고정 농도 5 pM EGF디아틴의 존재 하에 적정하였다. 이는 비-유도체화된 SO1861 및 비-유도체화된 QS21 및 QS21 유도체 QS21-Glu-AMPD가 HeLa 및 A431 세포에서 IC50 = 200 nM로 효과적임을 밝혔다. 단일 SO1861/QS21 변형(SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ald-EMCH(차단) (SO1861-Ald-EMCH(메르캅토에탄올), SO1861-Glu-AMPD, SO1861-(Ald-OH), SO1861-Ac-OH, SO1861-Glu-AEM, QS21-Ald-EMCH, QS21-(Ald-OH), QS21-Glu-AEM)은 HeLa 또는 A431에서 IC50 = 600 nM - 2000 nM로 활성을 보인 반면(표 A5 및 표 A6) 이중 SO1861 변형 및 이중 QS21 변형은 Hela 또는 A431 세포에서 IC50 = 1500 - 40.000 nM로 활성을 보였다(표 A5 및 표 A6). SO1861의 삼중 변형의 경우 20.000 nM까지 활성을 관찰할 수 없었다.
독성 결정을 위해 변형된 SO1861을 HeLa 세포(도 20a 및 도 21a 참고) 및 A431 세포(도 20b 및 도 21b 참고) 상에서 적정했다. 도 25a 및 도 25b는 SO1861, SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ald-EMCH-차단에 대한 독성 테스트의 세부 사항을 도시하고, 도 26a 및 도 26b는 SO1861, SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH), SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD) 및 SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)에 대한 세부 사항을 나타낸다. 이는 HeLa 세포 상에서 비변형된 SO1861이 가장 강한 내재적 독성: IC50 = 2000 nM을 보인 반면 HeLa 세포 상에서 단일 변형 SO1861-Ac가 IC50 = 10.000 nM로 독성을 보임을 밝혔다. 모든 다른 SO1861-유도체의 경우 HeLa 세포에 대한 내재적 독성(IC50)은 20.000 nM보다 높았다. A431 세포에서 비변형된 SO1861의 독성은 IC50: 1000 nM로 관찰되는 반면 단일 변형 SO1861-Ac-OH, SO1861-Ald-OH, SO1861-Glu-AMPD, SO1861-Ald-EMCH는 잘 받아들여 IC50 = 2000 nM, IC50 = 7000 nM, IC50 = 20.000 nM 및 IC50 = 30.000 nM로 독성을 보인다. 변형된 QS21의 독성 결정을 위해, HeLa 세포(도 31a 참고) 및 A431 세포(도 31b) 상에서 사포닌 유도체를 적정하였다. 이는 QS21이 HeLa 세포 상에서: IC50 = 6000 nM 및 A431 세포 상에서: IC50 = 3000 nM로, QS21-Ald-OH HeLa 세포 상에서: IC50 = 20.000 nM 및 A431 세포 상에서: IC50 = 20.000 nM, QS21-Glu-AEM HeLa 세포 상에서: IC50 = > 100.000 nM 및 A431 세포 상에서: IC50 = > 100.000 nM, QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM) HeLa 세포 상에서: IC50 = > 100.000 nM 및 A431 세포 상에서: IC50 = > 100.000 nM로 독성을 보임을 밝혔다, SO1861 또는 QS21 이중 변형 및 SO1861 삼중 변형의 경우 100.000 nM까지 독성을 관찰할 수 없었다. 전술된 바와 같이, 비변형되거나 변형된 SO1861 또는 QS21을 HeLa 및 A431 세포 상에서 적정하였다. 이는 비변형된 SO1861이 IC50 = 1000 nM(HeLa) 및 IC50 = 2000 nM(A431)로 독성을 보인 반면, QS21은 IC50 = 6000 nM(HeLa) (IC50 = 3000 nM(A431)로 독성을 보이고 QS21-Glu-AMPD는 IC50 = 9000 nM(HeLa) 및 IC50 = 5000 nM(A431)로 독성을 보임을 밝혔다(표 A5 및 표 A6). HeLa 세포 상에서 단일 SO1861 변형의 경우 및 단일 QS21 변형의 경우, SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ald-EMCH(차단), SO1861-(Ald-OH), SO1861-Glu-AEM, QS21-Ald-EMCH, QS21-Glu-AEM은 100.000 nM까지 독성을 보이지 않은 반면, SO1861-Glu-AMPD, SO1861-Ac-OH , QS21-(Ald-OH)는 각각 IC50 = 20.000 nM, IC50 = 10.000 nM, IC50= 20.000 nM 로 독성을 보였다(표 A5 및 표 A6). A431 세포에서, SO1861-Glu-AEM 및 QS21-Glu-AEM은 100.000 nM까지 독성을 보이지 않은 반면 SO1861-Ald-EMCH(IC50 = 30.000 nM), SO1861-Ald-EMCH(차단)(IC50 = 30.000 nM), SO1861-(Ald-OH)(IC50 = 7000 nM), SO1861-Ac-OH(IC50 = 2000 nM), SO1861-Glu-AMPD(IC50 = 20.000 nM), QS21-Ald-EMCH(IC50 = 30.000 nM), QS21-(Ald-OH)(IC50 = 20.000 nM)에 대해서는 독성을 관찰할 수 있었다(표 A5 및 표 A6). SO1861 이중 변형 또는 QS21 이중 변형 및 SO1861 삼중 변형의 경우 100.000 nM까지 독성을 관찰할 수 없었다(표 A5 및 표 A6).
또한, 비변형된 및 변형된 SO1861의 용혈 활성을 인간 적혈구 용혈 분석으로 결정하였다(도 22, 도 27, 도 28 및 도 32 참고). 이는 비변형된 SO1861이 IC50 = 8000 nM로 비변형된 QS21은 IC50 = 3000 nM로 활성을 보임을 밝혔다. 단일 변형 SO1861-Ald-EMCH는 1.000.000 nM까지 용혈 활성을 보이지 않은 반면, SO1861-Ald-EMCH-차단(IC50 = 300.000 nM), SO1861-Ald-OH(IC50 = 30.000 nM), SO1861-Ac-OH(IC50 = 20.000 nM), SO1861-Glu-AMPD(IC50 = 20.000 nM), SO1861-Glu-AEM(IC50 = 30.000 nM) QS21-Ald-OH(IC50 = 20.000 nM), 및 QS21-Glu-AEM(IC50 = 10.000 nM)의 경우 인간 적혈구의 용혈 활성을 관찰할 수 있었다(표 A5 및 표 A6). SO1861 또는 QS21 이중 변형의 경우 SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD), SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH), SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH) 및 QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)에 대해서는 용혈 활성이 (1.000.000 nM까지) 관찰되지 않은 반면, SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(IC50 = 100.000), SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(IC50 = 200.000), SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(IC50 = 140.000), SO1861-(Glu-AEM)-(Ac-OH)(IC50 = 100.000)에 대해서는 용혈 활성을 관찰하였다. SO1861 삼중 변형 중 어느 것에 대해서도 100.000 nM까지 용혈을 관찰할 수 없었다. 용혈 분석은 비변형된 SO1861의 경우 IC50 = 8000 nM로 및 비변형된 QS21의 경우 IC50 = 3000 nM로 그리고 변형된 QS21-Glu-AMPD의 경우 IC50 = 3000 nM로 용혈 활성을 나타내 보였다. 단일 변형 SO1861-Ald-EMCH는 1.000.000 nM까지 용혈 활성을 보이지 않은 반면, SO1861-Ald-EMCH(차단)(IC50 = 300.000 nM), SO1861-(Ald-OH)(IC50 = 30.000 nM), SO1861-Ac-OH(IC50 = 20.000 nM), SO1861-Glu-AMPD(IC50 = 20.000 nM), SO1861-Glu-AEM(IC50 = 30.000 nM) QS21-Ald-EMCH(IC50 = 30.000 nM), QS21-(Ald-OH)(IC50 = 20.000 nM), 및 QS21-Glu-AEM(IC50 = 10.000 nM)의 경우 인간 적혈구의 용혈 활성을 관찰할 수 있었다(표 A5 및 표 A6). SO1861 이중 변형 또는 QS21 이중 변형의 경우 SO1861-Ald-EMCH-(Glu-AMPD), SO1861-(Ac-OH)-EMCH, SO1861-(Ald- OH)-(Glu-AEM), QS21-Ald-EMCH-(Glu-AMPD) 및 QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM)에 대해서는 용혈 활성이 (1.000.000 nM까지) 관찰되지 않은 반면, SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(IC50 = 100.000 nM), SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)(IC50 = 200.000 nM), SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)(IC50 = 140.000 nM), SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AEM)(IC50 = 100.000 nM) 및 QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)(IC50 = 40.000 nM)에 대해서는 용혈 활성을 관찰하였다(표 A5 및 표 A6). SO1861 삼중 변형 중 어느 것에 대해서도 100.000 nM까지 용혈을 관찰할 수 없었다(표 A5 및 표 A6).
다양한 QS 사포닌 분획물의 엔도솜 탈출 증진 활성(HeLa 및 A431 세포 상에서 사포닌 적정 + 5 pM 세툭시맙-사포린, 도 33a 내지 도 33b 참고), 독성(HeLa 및 A431 세포 상에서 사포닌 적정, 도 34a 내지 도 34b 참고) 및 용혈 활성(인간 적혈구 상에서 사포닌 적정, 도 32 및 도 35 참고)을 테스트하였다. 이는 QS21(분획물), QS17(분획물), QS18(분획물)이 HeLa 세포 및 A431 세포에서 200 nM에서 활성을 보이는 반면, QS7(분획물)은 IC50 = 6000 nM(HeLa) 및 10.000 nM(A431)로 활성을 보임을 밝혔다. 독성 결정하는 동안 HeLa 세포 및 A431 세포에서 QS21(분획물), QS17(분획물), QS18(분획물)은 IC50 = 10.000 nM로 독성을 보임을 관찰했을 때, 반면 QS7(분획물)은 IC50 = 20.000 nM로 독성을 보였다(도 34). 다음으로, 용혈 분석을 수행하였고 이는 IC50 = 3000 nM에서의 QS21(분획물) IC50 = 5000 nM에서의 QS17(분획물), QS18(분획물)의 용혈 활성을 밝힌 반면, QS7(분획물)에 대해서는 20.000 nM까지 용혈 활성을 검출할 수 없었다(도 35).
다양한 SO 사포닌(SO1862(이성질체), SO1832, SO1904)뿐만 아니라 항체-SO1861 접합체(세툭시맙-SO1861(DAR4), 트라스투주즈맙-SO1861(DAR4))의 용혈 활성을 테스트하였다. 이는 SO1862(이성질체, SO1832, SO1904의 용혈 활성이 SO1861(IC50 = 10.000 nM)과 비슷하다는 것을 밝혔다(도 29). 세툭시맙-SO1861(DAR4) 접합체는 60.000 nM까지 용혈 활성을 보이지 않은 반면 트라스투주즈맙-SO1861(DAR4)은 60.000 nM부터 줄곧 초기 용혈 활성을 보였다(IC50 = 200.000 nM)(도 29).
SO1861, SO1861-Ald-EMCH 및 SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올(SO1861-Ald-EMCH-차단)의 세포독성, 용혈 활성 및 엔도솜 탈출 증진 활성을 비교할 때, 후자의 2개는 유사하거나 본질적으로 동등하게 세포독성이 있고, 용혈활성이 있고 엔도솜 탈출 증진 활성 생물-분석에서 활성이 있었고, 후자의 2개는 SO1861보다 세포독성이 적고 용혈 활성이 적었다. 또한 표 A5 및 표 A6참고.
세포-생존력 분석
세포 생존력은 제조사의 지시(CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)에 따라 수행한, MTS-분석으로 결정하였다. MTS 용액은 10% FBS(PAN-Biotech GmbH)가 보충된 페놀 레드 없는 DMEM(PAN-Biotech GmbH)에서 20x 희석하였다. 세포를 웰당 200 μL PBS로 1 회 세척한 후, 웰당 100 μL 희석된 MTS 용액을 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 약 20 내지 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 써모 사이언티픽 멀티스칸(Thermo Scientific Multiskan) FC 플레이트 판독기(Thermo Scientific) 상에서 492 nm에서의 광학 밀도를 측정했다. 정량화를 위해 '매질만 있는' 웰의 배경 신호를 모든 다른 웰로부터 뺀 후, 비처리된 웰의 배경 보정 신호를 처리된 웰의 배경 보정 신호에 대해 나눔으로써, 비처리된/처리된 세포의 비율을 계산하였다.
FACS 분석
세포를 10 cm 디쉬에 500,000c/플레이트로, 10% 송아지 태아 혈청(PAN-Biotech GmbH) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(PAN-Biotech GmbH) 보충된 DMEM(PAN-Biotech GmbH) 중에 시딩하고, 90% 컨플루언시에 도달할 때까지, 48시간 동안 인큐베이션했다(5% CO2, 37℃). 다음으로, 세포를 단일 세포로 트립신화(TryplE Express, Gibco Thermo Scientific)하였다. 0.75 x 106 세포를 15 mL 팔콘(falcon) 튜브로 옮기고 원심분리(1,400 rpm, 3분)했다. 세포 펠렛을 가라앉은 채로 두면서 상층액을 버렸다. 볼텍스 진탕기 상에서 팔콘 튜브를 가볍게 두드려 펠렛을 분리하고 세포를 4 mL 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS)로 세척했다. 세척 후, 세포를 3 mL 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS) 중에 재현탁하고 3개의 둥근 바닥 FACS 튜브에 대해 동등하게 나누었다(1 mL/튜브). 세포를 다시 원심분리하고 200 μL 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS) 또는 200 μL 항체 용액; 195 μL의 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS) 중에 5 μL 항체 함유 중에 재현탁했다. APC 마우스 IgG1, κ 이소타입 대조군 FC(#400122, Biolegend)를 이소타입 대조군으로 사용하였고, APC 항-인간 EGFR(#352906, Biolegend)을 사용하였다. 샘플을 튜브 롤러 혼합기 상에서 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션했다. 그 후, 세포를 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS)로 3x 세척하고 PBS 중 2% PFA 용액을 사용하여 실온에서 20 분 동안 정착시켰다. 세포를 차가운 PBS로 2x 세척하고, FACS 분석을 위해 250 내지 350 μL 차가운 PBS 중에 재현탁했다. 샘플을 비디 팩스칸토(BD FACSCanto) II 유세포 분석 시스템(BD Biosciences) 및 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 분석했다. FACS 분석 결과는 표 A4에 요약되어 있다.
[표 A4]
세포 표면 발현 수준(다양한 세포주에서 EGFR 및 HER2의 평균 형광 강도(MFI).
Figure pct00093
용혈 분석
피콜(Ficoll) 구배를 사용하여 완충층으로부터 적혈구(RBC)를 단리했다. 수득된 RBC 펠렛(~4 내지 5 ml)을 50 ml DPBS(Ca2+/Mg2+ 없음, PAN-Biotech GmbH)로 2x 세척했다. RT에서 800xg 10 분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. RBC를 계수하고, 총 세포 수에 기반하여, DPBS(Ca2+/Mg2+ 없음) 중에 500.000.000 c/ml로 재현탁했다.
사포닌 희석액은 DPBS(Ca2+/Mg2+ 포함, PAN-Biotech GmbH)에서, 1.11x 최종 세기로 준비하였다. 양성 용해 대조군으로 0.02% 트리톤-X100 용액을 DPBS+/+ 중에 제조하였다. 96 웰 V-바닥 플레이트에 모든 화합물 용액 중 135 μl를 웰당 분배했다. 여기에 15 μl RBC 현탁액을 첨가하고 짧게 혼합했다(10 초 - 600 rpm). 플레이트를, 가볍게 교반하면서, RT에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 그 후 플레이트를 800xg에서 10 분 동안 회전시켜 RBC를 펠렛화하고 100 내지 120 μl 상층액을 표준 96 wp(96 웰-플레이트)로 옮겼다. 이어서, 써모 사이언티픽 멀티스칸 FC 플레이트 판독기(Thermo Scientific) 상에서 405 nm에서의 OD를 측정했다. 정량화를 위해 'DPBS+/+만 있는' 웰의 배경 신호를 모든 다른 웰로부터 뺀 후 처리된 웰의 배경 보정 신호를 0.02% 트리톤-X100 웰(x100)의 배경 보정 신호에 대해 나눔으로써, 0.02% 트리톤-X100에 비교한 용혈 백분율을 계산하였다.
[표 A5]
SO1861, SO1861 유도체, QS-21 유도체 및 QS-21을 이용한 적혈구 및 HeLa 세포의 처리.
Figure pct00094
Figure pct00095
Figure pct00096
SO1861-Ald-EMCH-메르캅토에탄올 또는 SO1861-Ald-EMCH(메르캅토에탄올)로도 지칭되는 분자 3 참고
[표 A6]
SO1861, SO1861 유도체, QS-21 유도체 및 QS-21을 이용한 적혈구 및 A431 세포의 처리.
Figure pct00097
Figure pct00098
실시예 4: 사포닌 유도체의 임계 마이셀 농도(CMC)
재료 및 방법
사포나리아 오피시날리스(SO)로부터 유래된(표 A7) 및 키라야 사포나리아(QS)로부터 유래된(표 A8, 및 표 A9) 사포닌의 임계 마이셀 농도(CMC)는 다음과 같이 문헌[DeVendittis et al. (A fluorimetric method for the estimation of the critical micelle concentration of surfactants, Analytical Biochemistry, Volume 115, Issue 2, August 1981, Pages 278-286)]의 방법에 의해 결정하였다:
정제수(MQ) 또는 PBS(Dulbecco's PBS+/+) 중의 8-아닐리노나프탈렌-1-설폰산(ANS)의 방출 스펙트럼을 CMC 미만 및 초과 범위를 포함시키는 1 내지 1400 μM 범위의 사포닌 건조 중량 농도에서 결정하였다. CMC 초과에서는, 형광 염료가 마이셀 내로 분배되기 때문에 ANS의 형광 수율이 증가하고 최대 방출 파장이 감소한다. 형광 수율은 여기 파장 355 nm, 및 방출 파장 460 nm에서 플루오로스칸 어센트(Fluoroskan Ascent) FL(Thermo Scientific) 상에서 기록하였다. 75.86 μM 농도로 6 μg ANS를 샘플 및 측정 당 사용했다.
결과
SO1861 사포닌
작용기 알데히드(Ald), 글루쿠론산(Glu)에서의 화학적 변형, 및 아세틸 기(Ac)의 제거는 각각의 사포닌의 마이셀 특성에 영향을 나타냈다. 도 42에 나타난 바와 같이, SO1861 사포닌 상 각각의 작용기의 단일-변형은 얻어진 ANS의 상대 형광값의 기울기로 나타나는 마이셀 형성능에 유의미하게 영향을 미쳤다. 글루쿠론산에 대한 변형(SO1861-Glu-AMPD, SO1861-Glu-AEM)은 명확히 더 가파른 기울기를 초래하여(도 42) 185 μM의 천연 SO1861에 대해 얻어진 바와 같은 더 낮은 CMC 값을 초래했다. SO1861-Ald-EMCH 차단 샘플에 대해서도 유사한 관찰 결과를 얻었다. 그러나, 알데히드 및 아세틸 기에 대한 변형(SO1861-Ald-OH, SO1861-Ald-EMCH, SO1861-Ac-OH)은 유의미하게 더 편평한 기울기를 초래하여(도 42), 천연 SO1861에 대하여 더 높은 CMC 값으로 이어졌다. SO1861-Ald-EMCH 샘플은 얻어진 기울기가 거의 평평하고 800 μM까지의 농도에 대해서도 CMC를 결정할 수 없었기 때문에 특히 흥미로웠다.
SO1861 사포닌의 이-변형(도 43) 및 삼-변형(도 44)에 대해 변형 위치 관련한 유사한 관찰 결과를 얻었다. 글루쿠론산에 대한 변형(SO1861-(Ald-OH)-(Glu-AMPD), SO1861-(Ac-OH)-(Glu-AMPD), SO1861-(Glu-AEM)-(Ac-OH), SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH), SO1861-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD))은 더 가파른 ANS 형광 수율 기울기 따라서 더 낮은 CMC 값을 초래하는 반면, 알데히드 및 아세틸 위치에 대한 변형(SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH), SO1861-(Ald-EMCH)-(Ac-OH))은 편평한 ANS 형광 수율 기울기 따라서 천연 SO1861에 대하여 증가된 CMC 값으로 이어진다(표 A7).
삼-변형된 사포닌 SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)-(Ac-OH) 및 SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)를 비교할 때, SO1861-(Glu-AEM)-(Ald-OH)-(Ac-OH)에서의 글루쿠론산에 대한 변형은 각각의 ANS 형광 수율의 더 편평한 기울기를 초래한 반면 SO1861-(Ald-OH)-(Ac-OH)-(Glu-AMPD)에서의 글루쿠론산에 대한 변형은 천연 SO1861에 대해 각각의 ANS 형광 수율의 더 가파른 기울기를 초래했다(도 44). (유리 사포닌보다 더 낮은 CMC를 갖는) Glu-변형된 유도체에서도, 상기 알데히드 및/또는 아세톡시 변형이, CMC를 고려할 때, Glu-변형의 부정적인 영향을 적어도 부분적으로 완화시키면서, CMC를 증가시킬 수 있기 때문에, 이들 결과는 CMC가 고려되는 경우 알데히드 및/또는 아세톡시 위치에서의 변형의 중요성을 시사한다.
[표 A7]
PBS에서 결정된 SO 사포닌의 CMC 값
Figure pct00099
QS 사포닌
키라야 사포나리아(QS)로부터 유래된 사포닌에 대해, QS7, QS17, QS18, QS21 Frac, 및 QS21 SP CMC 값을 결정하였고 이는 표 A8에 나타나 있다. 도 45에 나타난 바와 같이, 높이 평가된 QS 사포닌의 ANS 형광 수율의 기울기는 유도된 CMC 값에 대응한다. 얻어진 CMC 값은, 모두 70 μM 부근에서 유사한 CMC를 나타내는, QS-17, QS-18, 및 QS-21 Frac에 비해, 49 μM의 가장 높은 CMC 값에 있는 QS21 SP에서 시작하여 감소하는 경향을 보인다. 마지막으로, QS-7의 경우 230 μM의 CMC 값을 얻었다.
정제수(MQ) 및 PBS에서 측정된 QS21 SP의 ANS 형광 수율을 비교할 때, 정제수(MQ)에서의 기울기가 약간 더 가파르며 정제수에서의 약간 더 높은 CMC 값 예상으로 이어진다(도 46, 표 A9).
단일-변형된 QS21 사포닌 QS21-Ald-EMCH(분자 30; 도 40b), QS21-Glu-AEM, QS21-(Ald-OH), 및 QS21-Glu-AMPD(도 47a, 도 47b)의 경우 글루쿠론산에 대한 AMPD 변형(QS21-Glu-AMPD, 도 47b)만이 천연 QS21에 대해 더 가파른 ANS 형광 수율의 기울기로 이어져 40 μM의 더 낮은 CMC 값을 초래했다(표 A9). 모든 다른 글루쿠론산(QS21-Glu-AEM) 및 알데히드 위치(QS21-(Ald-OH), QS21-Ald-EMCH) 둘 모두에서의 QS21 단일-변형은 천연 QS21보다 더 편평한 ANS 형광 수율 기울기를 초래했다(도 47b).
사포나리아 오피시날리스 사포닌 SO1861에 대한 이-변형에 대한 발견과 유사하게, QS21 사포닌의 AldGlu 변형(QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD), 도 40e, 분자 33, 도 47c) 또한 천연 QS21에 대해 더 가파른 ANS 형광 수율의 기울기를 초래하여 39 μM의 더 낮은 CMC 값으로 이어졌다(표 A9). 모든 다른 글루쿠론산 및 알데히드 위치 둘 모두에서의 QS21 이-변형(QS21-(Ald-OH)-(Glu-AEM), QS21-Ald-EMCH-(Glu-AEM), 도 47c)은 천연 QS21보다 더 편평한 ANS 형광 수율 기울기를 초래했다.
[표 A8]
정제수(MQ)에서 결정된 QS 사포닌의 CMC 값
Figure pct00100
[표 A9]
PBS에서 결정된 변형된 QS21 사포닌의 CMC 값
Figure pct00101
실시예 5: SO1861 및 SO1861-Ald-EMCH의 엔도솜 탈출 증진 활성
SO1861 및 SO1861-Ald-EMCH(예를 들어 도 48 내지 58에서, SO1861-EMCH로도 지칭됨)는 표적화된 단백질 독소의 엔도솜 탈출을 증진시키는 능력에 대해 테스트하였다. 이를 위해 EGFR 발현 세포(A431) 상에서 고정 농도 10 pM 세툭시맙-사포린(DAR4를 갖는, 단백질 독소, 사포린에 접합된 세툭시맙)에 대해 SO1861 또는 SO1861-Ald-EMCH를 적정하였다. 이는 SO1861(IC50 = 800 nM) 및 SO1861-Ald-EMCH(IC50 = 2000 nM)가 10 pM 세툭시맙-사포린과 조합하여 A431 세포의 효율적인 세포 살해를 유도하는 반면, SO1861 또는 SO1861-Ald-EMCH 단독으로는 세포 살해 활성을 보이지 않았음을 밝혔다(도 48).
다음으로, 다양한 고정 농도의 SO1861 또는 SO1861-Ald-EMCH에 대해 세툭시맙-디안틴 또는 세툭시맙-사포린을 적정하였다. 이는 4000 nM SO1861-Ald-EMCH, 4829 nM SO1861-Ald-EMCH 또는 1500 nM SO1861의 존재 하에 낮은 pM 농도의 세툭시맙-디안틴(IC50 = 1 pM, 도 49) 또는 세툭시맙-사포린(IC50 = 0,5 pM, 도 50)을 이용한 효율적인 세포 살해를 밝혔다. 이 세포 살해 효과는 300 nM SO1861 또는 300 nM SO1861-Ald-EMCH에서는 관찰되지 않았다(도 49 및 도 50).
다음으로, EGFR 발현 세포(A431) 상에서 고정 농도 10 pM EGF디안틴(EGFR 표적화 융합 단백질 독소)에 대해 SO1861 또는 SO1861-Ald-EMCH를 적정했다. 이는 SO1861(IC50 = 800 nM) 및 SO1861-Ald-EMCH(IC50 = 2000 nM)가 10 pM EGF디안틴과 조합하여 A431 세포의 효율적인 세포 살해를 유도하는 반면, SO1861 또는 SO1861-Ald-EMCH 단독으로는 세포 살해 활성을 보이지 않음을 밝혔다. (도 51).
다음으로, 다양한 고정 농도의 SO1861 또는 SO1861-Ald-EMCH에 대해 EGF디안틴을 적정하였다. 이는 4829 nM SO1861-Ald-EMCH 또는 1500 nM SO1861의 존재 하에 낮은 pM 농도의 EGF 디안틴(IC50 = 0,1 pM, 도 52)을 이용한 효율적인 세포 살해를 밝혔다. 이 세포 살해 효과는 10 nM SO1861 또는 300 nM SO1861에서는 관찰되지 않았다(도 52).
다음으로, HER2 발현 세포(SK-BR-3) 상에서 고정 농도 1500 nM SO1861 또는 4000 nM SO1861-Ald-EMCH에 대해 트라스투주맙-디안틴 또는 트라스투주맙-사포린(DAR4를 갖는, 단백질 독소, 사포린에 접합된 트라스투주맙)을 적정하였다. 이는 1500 nM SO1861 또는 4000 nM SO1861-Ald-EMCH의 존재 하에 낮은 pM 농도의 트라스투주맙-디안틴(IC50 = 0,1 pM) 또는 트라스투주맙-사포린(IC50 = 0,1 pM)을 이용한 효율적인 세포 살해를 밝혔다(도 53).
도 48 내지 도 53에 약술된 이들 결과 모두는 SO1861-Ald-EMCH가 표적화된 단백질 독소의 엔도솜 탈출 및 세포질 전달을 효율적으로 증진시킴으로써, 표적화된 단백질 독소의 유효 농도를 nM 범위로부터 낮은 pM 범위로 유의미하게 감소시킴을 보여준다.
HSP27 mRNA에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드(BNA, 가교된 핵산)의 엔도솜 탈출을 증진시키는 능력에 대해 SO1861-Ald-EMCH를 테스트하였다. 이를 위해, EGFR/HER2 발현 세포(A431) 상에서 고정 농도 100 nM HSP27BNA, 100 nM 세툭시맙-HSP27BNA(DAR4를 갖는, HSP27BNA에 접합된 세툭시맙) 또는 100 nM 트라스투주맙-HSP27BNA(DAR4를 갖는, HSP27BNA에 접합된 트라스투주맙)에 대해 SO1861-Ald-EMCH를 적정하였다. 이는 SO1861-Ald-EMCH(IC50 = 700 nM)가 A431 세포에서 100 nM HSP27BNA, 100 nM 세툭시맙-HSP27BNA(도 54) 또는 100 nM 트라스투주맙-HSP27BNA와 조합하여 효율적인 HSP27 유전자 침묵 세포를 유도함을 밝혔다(나타나지 않음). SO1861-Ald-EMCH 단독으로는 HSP27 유전자 침묵 활성을 나타내지 않았다(도 54).
다음으로, EGFR(A431) 또는 HER2(SK-BR-3) 발현 세포에서 다양한 고정 농도의 SO1861-Ald-EMCH에 대해 세툭시맙-HSP27BNA(DAR1.5 또는 DAR4), 트라스투주맙-HSP27BNA(DAR4.4)를 적정했다. 이는 4000 nM SO1861-Ald-EMCH의 존재 하에 낮은 nM 농도의 세툭시맙-HSP27BNA(IC50 = 0,5 nM, 도 55)를 이용한 A431 세포에서의 효율적인 HSP27 유전자 침묵을 밝힌 반면, 세툭시맙-HSP27BNA 단독 또는 세툭시맙-HSP27BNA + 100 nM SO1861-Ald-EMCH는 유전자 침묵 활성을 나타내지 않거나 매우 높은 농도에서 약간의 활성만을 나타냈다(IC50 > 100 nM; 도 550). SKBR-3 세포에서, 4000 nM SO1861-Ald-EMCH의 존재 하에 트라스투주맙-HSP27BNA(IC50 = 0,5 nM, 도 56)는 효율적인 HSP27 유전자 침묵 활성을 나타낸 반면, 트라스투주맙-HSP27BNA 단독 또는 트라스투주맙-HSP27BNA + 100 nM SO1861-Ald-EMCH는 약간의 유전자 침묵 활성만을 나타내었다(IC50 > 100 nM; 도 56).
다음으로, 다양한 세포주에서 고정 농도의 SO1861-Ald-EMCH에 대해 표적화되지 않은 HSP27BNA를 적정하였다. 이는 4000 nM 또는 4829 nM SO1861-Ald-EMCH의 존재 하에서 낮은 nM 농도의 HSP27BNA(IC50(SK-BR3) = 2 nM; IC50(A431) = 10 nM; IC50(A2058) = 10 nM)를 이용한 A431, A2058 및 SK-BR-3 세포에서의 효율적인 HSP27 유전자 침묵을 밝힌(도 57 및 도 58) 반면, HSP27BNA 단독으로는 훨씬 더 높은 농도(IC50(SK-BR3) = 300 nM; IC50(A431) = 1000 nM; IC50(A2058) > 1000 nM)에서 유전자 침묵을 유도하였다(도 57 및 도 58). HSP27BNA의 그 활성(SO1861-Ald-EMCH와 함께 및 없이)을 HSP27LNA(LNA, 잠금 핵산) 활성과 비교할 때, 발명자들은 엔도솜 탈출/유전자 침묵 증진 인자가 비슷하지만, HSP27BNA와 비교하여 더 높은 HSP27LNA 농도에서임을 관찰하였다(도 58).
이 모든 것은 SO1861-Ald-EMCH가 표적화된 안티센스 BNA 올리고뿐만 아니라 비표적화된 BNA/LNA 올리고의 엔도솜 탈출 및 세포질 전달을 효율적으로 증진시킴으로써, 표적화된 및 비표적화된 안티센스 올리고의 유효 농도를 μM 범위로부터 낮은 nM 범위로 유의미하게 감소시킴을 보여준다.
재료
트라스투주맙(Tras, Herceptin®, Roche), 세툭시맙(Cet, Erbitux®, Merck KGaA). 디안틴-cys는 업체[Proteogenix, France]로부터 생산 및 구입하였고, EGF디안틴은 표준 절차에 따라 이.콜라이에서 생산하였다. 세툭시맙-사포린 및 트라스투주맙-사포린 접합체는 업체[Advanced Targeting Systems(San Diego, CA)]로부터 생산 및 구입했다.
방법
플래시 크로마토그래피
그레이스 레벨레리스 X2® C-815 플래시; 용매 전달 시스템: 자동-프라이밍을 갖는 3-피스톤 펌프, 단일 실행에서 4개까지의 용매를 갖는 4개의 독립된 채널, 용매을 다 쓰면 자동-전환 라인; 최대 펌프 유속 250 mL/분; 최대 압력 50 bar(725 psi); 검출: UV 200-400 nm, 4개까지의 UV 신호 조합 및 전체 UV 범위 스캔, ELSD; 컬럼 크기: 기기 상 4 내지 330 g, 루어 유형, 선택적 홀더가 있는 경우 750 g에서 3000 g까지.
HSP27BNA 올리고 서열
문헌[Zhang et al. (2011) [Y Zhang, Z Qu, S Kim, V Shi, B Liao1, P Kraft, R Bandaru, Y Wu, LM Greenberger and ID Horak, Down-modulation of cancer targets using locked nucleic acid (LNA)-based antisense oligonucleotides without transfection, Gene Therapy (2011) 18, 326-333]]에 따른 HSP27 BNA 올리고(5'-GGCacagccagtgGCG-3')([SEQ-ID NO: 2])를 업체[Bio-Synthesis Inc.(Lewisville, Texas)]에서 5'-티올 C6 링커 포함 또는 불포함하여 주문하였다. HSP27 LNA 올리고(5'-ggcacagccagtggcg-3')([SEQ-ID NO: 3])를 업체[Bio-Synthesis Inc. (Lewisville, Texas)]에서 주문하였다.
RNA 단리 및 유전자 발현 분석
세포로부터의 RNA를 단리하고 표준 프로토콜(Biorad)에 따라 분석하였다. 사용한 qPCR 프라이머는 표 A10에 표시되어 있다.
[표 A10]
qPCR에서 사용한 프라이머가 아래 나타나 있다:
Figure pct00102
트라스투주맙-사포린 및 세툭시맙-사포린 합성
주문 제작 mAb-사포린 접합체를 업체[Advanced Targeting Systems(San Diego, CA)]로부터 생산 및 구입했다.
트라스투주맙-디안틴 및 세툭시맙-디안틴 합성
디안틴-Cys(17.0 ml, ~9.6 mg)를 비바스핀 T15 필터 튜브(3,000 g, 20℃, 10 분)를 사용하여 한외여과로 농축했다. 생성된 3.25 ml 분취량을 TBS pH 7.5로 용리하는 제바 10 ml 스핀 컬럼을 사용하여 겔 여과하였다.
트라스투주맙(mAb) 또는 세툭시맙(mAb)(0.30 ml, ~10 mg)을 DPBS pH 7.5를 사용하여 10 mg/ml로 희석하고, DPBS pH 7.5로 용리하는 제바 5 ml 스핀 컬럼을 통해 탈염하고 2.50 mg/ml로 표준화했다. 새로 제조된 DMSO 중 SMCC 용액(1.00 mg/ml, 4.20 몰 당량, 13.9 x 10-5 mmol)의 분취량을 mAb의 분취량에 첨가하고, 혼합물을 잠시 볼텍싱한 다음 롤러-혼합을 사용하여 20℃에서 60 분 동안 인큐베이션했다. 그 후, 새로 제조된 DPBS pH 7.5 중 글리신 용액(2.0 mg/ml, 5.0 몰 당량, 69.5 Х 10-5 mmol)의 분취량을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. TBS pH 7.5로 용리하는 제바 10 ml 스핀 컬럼을 사용하여 겔 여과한 후 mAb-SMCC(4.27 mg, 2.80 Х 10-5 mmol, 1.514 mg/ml)를 수득하였다.
새로 제조된 TBS pH 7.5 중 TCEP 용액(1.00 mg/ml, 0.5 몰 당량, 12.6 x 10-5 mmol)의 분취량을 디안틴-Cys(7.54 mg, 25.3 x 10-5 mmol, 2.258 mg/ml)에 첨가하고, 혼합물을 잠시 볼텍싱한 다음 롤러-혼합을 사용하여 20℃에서 60 분 동안 인큐베이션했다. 그 후, TBS pH 7.5로 용리하는 제바 10 ml 스핀 컬럼을 사용하여 겔 여과하여 디안틴-SH(6.0 mg, 20.2 Х 10-5 mmol, 1.722 mg/ml, 디안틴:SH = 1.1)를 수득하였다.
대량의 mAb-SMCC에 디안틴-SH의 분취량(7.20 몰 당량)을 첨가하고, 혼합물을 잠시 볼텍싱한 다음 20℃에서 하룻밤동안 인큐베이션했다. 약 16 시간 후, 새로 제조된 TBS pH 7.5 중 NEM 용액(2.50 mg/ml, 5.0 몰 당량, 101 x 10-5 mmol)의 분취량을 첨가하여 반응을 켄칭하였다. 반응 혼합물을 0.45 μm로 여과한 다음 비바스핀 T15 필터 튜브(3,000 g, 20℃, 15 분)를 사용하여 한외여과를 통해 2 ml 미만으로 농축했다. DPBS pH 7.5로 용리하는 1.6 x 35 cm 수퍼덱스 200PG 컬럼을 사용하는 겔 여과로 접합체를 정제하였다.
항체-(L-HSP27 BNA) n [HSP27 BNA 디설피드를 통해]
DAR4를 갖는 PEG 4 -SPDP를 통한 트라스투주맙-(L-HSP27) 4 , 세툭시맙-(L-HSP27) 4 , 합성 및 DAR2를 갖는 PEG 4 -SPDP를 통한 세툭시맙-(L-HSP27) 2 합성
트라스투주맙, 세툭시맙,은 이하 "Ab"로 지칭된다. Ab와 HSP27 BNA 사이에 불안정한(L) 디설피드 결합을 형성하는 테트라(에틸렌 글리콜) 숙신이미딜 3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트(PEG4-SPDP) 링커를 통해 Ab를 HSP27 BNA 디설피드에 접합시켰다. 절차는 트라스투주맙-(L-HSP27 BNA)4에 대해 예시적으로 기술된다.
HSP27 BNA 디설피드 올리고(2.7 mg, 470 nmol, 6.10 mg/ml)를 롤러 혼합을 사용하여 20℃에서 30 분 동안 TCEP(10 몰 당량, 4.7 μmol, 1.34 mg, 50 mg/ml)와 반응시켰다. 그 후, TBS pH 7.5로 용리하는 PD10 G25 탈염 컬럼으로 올리고-SH를 정제하고 즉시 사용하였다. 올리고-SH를 수득하였다(2.48 mg, 90%, 1.24 mg/ml, SH 대 올리고 비율 = 0.8)
새로 제조한 DMSO(1 mg/ml) 중 PEG4-SPDP 용액(6.81 몰 당량, 70.1 nmol, 39 μg)의 분취량과 트라스투주맙(1.5 mg, 10.3 nmol, 2.50 mg/ml)을 롤러 혼합을 사용하여 20℃에서 60 분 동안 반응시켰다. 그 후, 글리신(2 mg/ml의 새로 제조된 TBS pH 7.5 중 용액 15.1 μl)으로 반응을 켄칭한 다음 TBS pH 7.5로 용리하는 제바 탈염 컬럼을 통해 탈염시켰다. 생성된 Tras-S-PEG4-SPDP의 분취량을 취하여 UV-Vis 분석으로 테스트하였다. 피리디일-2-티온(PDT)을 유리시키기 위해 TCEP를 사용하고 343 nm에서의 UV-vis 분석을 통해 SPDP 혼입을 결정하였다(SPDP 대 Ab 비율: 4). 나머지 Tras-(S-PEG4-SPDP)4를 새로 제조한 HSP27 올리고뉴클레오티드(올리고-SH)(8 몰 당량, 82.4 nmol, 1.24 mg/ml)의 분취량과 반응시키고 롤러 혼합을 사용하여 20℃에서 하룻밤동안 인큐베이션했다. 17 시간 후, 접합체를 UV-vis 분석으로 분석하여 343 nm에서 피리디일-2-티온(PDT) 치환에 의한 HSP27의 혼입을 확인하였다. DPBS pH 7.5로 용리하는 1.6 x 33 cm 세파덱스 G50 컬럼을 사용하여 미정제 접합체를 정제했다. 생성된 트라스투주맙-(L-HSP27)4를 단일 분획물로 수득하였다. 수율: n.d.. 순도: 96%, HSP27 BNA 대 Ab 비율 = 4.4
실시예 6 - 사포닌의 엔도솜 탈출 증진 활성
이전에는, 다양한 사포닌(SO1861, SA1642)의 효능을 리간드 독소 융합체(예를 들어 EGF디안틴) 또는 항체-단백질 독소 접합체와 함께 '유리' 비접합된 분자로서 세포에 병용 투여하여, 표적 발현 세포의 세포 살해 활성 증진을 초래했다. 여기서는, 사포나리아 오피시날리스의 뿌리 추출물로부터 단리된 세 가지 상이한 사포닌 분자(SO1861, SO1862(SO1861의 이성질체), SO1832 및 SO1904)를 HeLa(EGFR+) 세포 상에서 비-효과적 고정 농도 1.5 pM EGF디안틴의 존재 및 부재 하에 적정하였다. 이는 EGF 디안틴이 없는 처리와 비교하여 모든 테스트된 사포닌 변이체의 세포 살해 활성의 강력한 증진을 밝혔다(IC50 = 300 nM; 도 63a). 다음으로, 고정 농도의 사포닌(~1000 nM)을 이용하여 EGF디안틴을 적정하였고 이는 낮은 pM 농도의 EGF디안틴에서의 강력한 표적화된 세포 살해 증진(IC50 = 0.4 pM; 도 63b)을 밝혔으며, 이는 모든 사용된 사포닌 SO1861, SO1862(SO1861의 이성질체), SO1832 및 SO1904에 대해 관찰되었다. EGF-디아틴 단독으로는 매우 높은 농도에서만 세포 살해를 유도할 수 있었다(IC50 = 10.000 pM). 이것은 이들 특정 유형의 사포닌은, 모두 이용가능한 매우 적은 양의 표적화된 독소만을 가지고 효율적으로 엔도솜 탈출을 유도하는 내재적 능력을 갖고 있음을 보여준다.
이 테스트를 확장하기 위해, 다른 공급원 유래의 사포닌을 분석했다. 깁소필라 엘레간스(Gypsophila elegans) M.Bieb의 뿌리 추출물로부터 정제된 사포닌(GE1741)을 1.5 pM EGF디안틴의 존재 및 부재 하에 HeLa 세포 상에서 적정하고 정제된 SO1861과 비교했다. GE1741도 또한 EGF디안틴 유도된 HeLa 세포 살해를 증진하지만, SO1861과 비교해 약간 더 낮은 효능을 보이고.(GE1741 IC50 = 800 nM; 도 63c) 또한 더 높은 일반 독성을 나타낸다(EGF디안틴 부재 하에 IC50 = 5.000 nM; 도 63c). 키라야 사포나리아 사포닌의 상이한 부분 정제된 혼합물(QS혼합물 1 내지 3)을 HeLa 세포 상에 1.5 pM EGF디안틴과 함께 병용투여한 유사한 테스트는, 3개 중 2개(QS혼합물 1 및 QS혼합물 3)에 대해 SO1861과 유사한 활성을 나타내었다(IC50 QS혼합물/QS혼합물3 = 300 nM; 도 63d). QS혼합물(2)는 1.5 pM EGF 디안틴 유도된 세포 살해를 증진시키는 데 덜 효율적(IC50 = 2000 nM; 도 63d)이지만, 일반 독성은 관찰되지 않는다. 이것은 QS 추출물에서도, 표적화 리간드 독소 EGF디안틴의 엔도솜 탈출을 효율적으로 유도하는 특정 유형의 사포닌이 이용 가능함을 보여준다. 따라서, 키라야 사포나리아 사포닌, GE1741, SO1861, SO1862, SO1832 및 SO1904와 같은, 본 실시예에 기술된 사포닌은 구체적으로 본 발명에 따라 유도체화하기에 매력적인 사포닌이다.
실시예 7 -사포닌 및 사포닌 유도체의 엔도솜 탈출 증진 활성
불안정한/산 민감성 유도체화(Ald-EMCH 또는 SO1861-L-N3(SO1861-N3 및 SO1861-아지드 또는 SO1861-N3/아지드로도 지칭됨)를 알데히드 기를 통해 SO1861에 적용하여, SO1861-Ald-EMCH 또는 SO1861-L-N3를 생성했다. SO1861-Ald-EMCH의 활성을 확인하기 위해 EGFR 발현(A431, HeLa) 및 비-발현 세포(A2058) 상에서 고정된 비-효과적(1.5 pM) EGF디아틴 농도의 존재 및 부재 하에 분자를 적정했다. 3개 세포주 모두에서 SO1861 단독으로는 강한 세포 생존력 감소를 보인 반면, 단일 화합물로서의 SO1861-Ald-EMCH는 25.000 nM까지 독성을 보이지 않았다(도 64a 내지 도 64c). SO1861-Ald-EMCH를 1.5 pM EGF디안틴과 조합하였을 때 EGFR+ A431 및 HeLa 세포에서 강력한 표적 특이적 세포 생존력 감소가 관찰되는(IC50 = 3.000 nM; 도 64a, 도 64b) 반면, EGFR- A2058 세포는 전혀 영향을 받지 않는다(도 64c). SO1861-L-N3에 대해서도 유사한 결과를 수득하였다. 1.5 pM EGF디안틴과 병용 투여된 SO1861-L-N3 또한 A431 및 HeLa 세포 상에서 효율적인 세포 살해를 나타냈으나(IC50 = 3.000 nM), EGF디안틴 없는 경우 10.000 nM 초과에서 일반 독성이 관찰된다(도 64d, 도 64e).
HATU는 SO1861의 카르복실산 기를 통해 SO1861에 접합시켜 SO1861-(S), SO1861-HATU 및 SO1861-Glu-HATU로도 지칭됨,을 생성하였다. 활성을 결정하기 위해, 상이한 농도의 SO1861-(S)를 1.5 pM EGF디안틴과 병용 투여하고 EGFR 발현 HeLa 세포에서 세포 살해 활성을 테스트했다. SO1861-(S)는 SO1861과 유사한 활성을 보였고, 이는, SO1861-Ald-EMCH에서 관찰되는 것과 유사하게, 카르복실산 기로의 접합이 분자의 엔도솜 탈출 증진 효능에 영향을 미치지 않음을 시사한다(도 65).
실시예 8
QS21(키라야 사포나리아로부터 단리 및 정제)은 분자 내 알데히드 기, 및 글루쿠론산 기에서 화학적으로 변형시켰다(단일 또는 이중 변형; 도 40). 변형된 QS21은 1) EGFR 발현 세포 상에서 리간드 독소(변형된 QS21 + 5 pM EGF디아틴)의 엔도솜 탈출 증진 활성(표 A4) 2) HeLa 및 A431 상에서의 내재적 세포 독성(QS21 적정) 3) 인간 적혈구 용혈 활성(인간 적혈구 상에서의 변형된 QS21 적정)에 대해 테스트하였다. 엔도솜 탈출 증진 활성을 결정하기 위해, EGFR 발현 세포(HeLa 및 A431) 상에서 비-효과적 고정 농도 5 pM EGF디아틴의 존재 하에 변형된 QS21을 적정하였다. 이는 QS21-Glu-AMPD + 5 pM EGF디안틴이 HeLa 세포에서 QS21 + 5 pM EGF디안틴(IC50 = 200 nM)만큼 효과적인 반면, A431에서는 QS21-Glu-AMPD + 5 pM EGF디안틴(IC50 = 150 nM)이 QS21 + 5 pM EGF 디안틴(IC50 = 90 nM)과 비교하여 활성이 약간 더 적음을 밝혔다(도 66a 및 도 66b). QS21-Ald-EMCH + 5 pM EGF디안틴은 HeLa 및 A431 세포에서 IC50 = 900 nM로 효과가 있는 반면, QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD) + 5 pM EGF디안틴은 HeLa에서 IC50 = 2000 nM 그리고 A431 세포에서 IC50 = 1500 nM로 효과가 있고 QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD) + 5p M EGF디안틴은 HeLa에서 IC50 = 4000 nM A431 세포에서 IC50 = 2000 nM로 효과가 있었다.(도 66a 및 도 66b). 다음으로 독성을 결정하였고, 이를 위해 변형된 사포닌을 HeLa 및 A431 세포 상에서 적정하였다. 이는 QS21-Ald-EMCH가 HeLa 세포에서는 QS21과 동일한 독성(IC50 = 10.000 nM)을 보인 반면, A431 상에서는, QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)가 QS21(IC50 = 2000 nM)과 비교하여 더 적은 독성이 있음(IC50 = 5000 nM)을 밝혔다(도 66a 및 도 66b). QS21-Ald-EMCH는 HeLa에서 IC50 > 30.000 nM 및 A431 세포에서 IC50 = 30.000 nM로 독성을 보인 반면, QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD) 및 QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD) 둘 모두의 경우 HeLa 및 A431 세포에서 30.000 nM까지 독성을 관찰할 수 없었다(도 66a 및 도 66b).
다음으로 적혈구 용혈 분석을 수행하였고 이는 QS21-Glu-AMPD가 비변형된 QS21(IC50 = 3000 nM)과 유사한 용혈 활성을 보인 반면, QS21-Ald-EMCH는 IC50 = 40.000 nM로, QS21-(Ald-OH)-(Glu-AMPD)는 IC50 = 50.000 nM로 용혈 활성을 보였고 QS21-(Ald-EMCH)-(Glu-AMPD)는 이들 농도에서 최소 용혈 활성을 보였음(IC50 > 300.000 nM)을 밝혔다(도 67).
다음으로, SO1831(사포나리아 오피시날리스로부터 단리 및 정제됨)을 알데히드 기에서 화학적으로 변형시켰다, SO1831-Ald-EMCH(도 72). 변형된 및 비변형된 SO1831뿐만 아니라 1개의 다른 사포닌: 에스신(95% 및 98%)을 1) EGFR 발현 세포 상에서의 리간드 독소(5 pM EGF디안틴)의 엔도솜 탈출 증진 활성, 2) HeLa 및 A431 상에서의 내재적 세포 독성 3) 인간 적혈구 용혈 활성 및 4) 임계 마이셀 농도(CMC)에 대해 테스트하였다, 표 A12 참고. 엔도솜 탈출 증진 활성을 결정하기 위해, 변형된 SO1831, 비변형된 SO1831 및 에스신(95% 및 98%)을 EGFR 발현 세포(HeLa 및 A431) 상에서 비-효과적 고정 농도 5 pM EGF디아틴의 존재 하에 적정하였다. 이는 SO1831 + 5 pM EGF디안틴이 HeLa 세포 및 A431 세포에서 IC50 = 300 nM로 효과가 있는 반면, SO1831-Ald-EMCH + 5p M EGF디안틴은 HeLa 세포 및 A431 세포에서 IC50 = 5000 nM로 활성을 보임을 밝혔다(도 68a 및 도 68b). 에스신(95% 또는 98%) + 5 pM EGF디안틴은 HeLa 세포 및 A431 세포에서 4000 nM에서 활성을 나타냈다(도 68a 및 도 68b). 다음으로 독성을 결정하였고, 이를 위해 변형된 사포닌을 HeLa 및 A431 세포 상에서 적정하였다. 이는 SO1831이 HeLa 세포에서 IC50 = 4000 nM, 및 A431 세포에서 IC50 = 2000 nM로 독성을 보이는 반면, SO1831-Ald-EMCH는 HeLa 세포에서 30.000 nM까지 독성을 보이지 않고 A431 세포에서 IC50 = 30.000 nM로 독성을 보임을 밝혔다(도 68a 및 도 68b). 에스신(95% 또는 98%)은 HeLa 세포 또는 A431 세포에서 30.000 nM까지 독성을 보이지 않았다(도 69a 및 도 69b).
다음으로, 적혈구 용혈 분석을 수행하였고 이는 에스신(95% 또는 98%)이 IC50 = 10.000 nM로 용혈을 보임을 밝혔다(도 70). SO1831은 15.000 nM에서 용혈 활성을 보이는 반면, SO1831-Ald-EMCH는 IC50 = 100.000 nM로 더 적은 용혈성이 있다(도 71).
작용기 알데히드(Ald)에서의 SO1831의 화학적 변형은, 각각의 사포닌의 마이셀 특성에 대한 영향을 보였다(표 A11 참고). 도 73의 B에 나타난 바와 같이, SO1831 사포닌 상의 각각의 작용기의 단일-변형은 얻어진 ANS의 상대 형광 값의 기울기로 나타나는 마이셀 형성 능력에 유의미하게 영향을 미쳤다. 에스신에 대한 CMC 또한 결정하였고 도 73의 A 및 표 A11에 나타나 있다.
[표 A11]
PBS에서 결정된 SO 사포닌의 CMC 값
Figure pct00103
재료 및 방법
세포-생존력 분석
세포 생존력은 제조사의 지시(CellTiter 96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)에 따라 수행한, MTS-분석으로 결정하였다. MTS 용액은 10% FBS(PAN-Biotech GmbH)가 보충된 페놀 레드 없는 DMEM(PAN-Biotech GmbH)에서 20x 희석하였다. 세포를 웰당 200 μL PBS로 1 회 세척한 후, 웰당 100 μL 희석된 MTS 용액을 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 약 20 내지 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 써모 사이언티픽 멀티스칸 FC 플레이트 판독기(Thermo Scientific) 상에서 492 nm에서의 광학 밀도를 측정했다. 정량화를 위해 '매질만 있는' 웰의 배경 신호를 모든 다른 웰로부터 뺀 후, 비처리된 웰의 배경 보정 신호를 처리된 웰의 배경 보정 신호에 대해 나눔으로써, 비처리된/처리된 세포의 비율을 계산하였다.
용혈 분석
피콜 구배를 사용하여 완충층으로부터 적혈구(RBC)를 단리했다. 수득된 RBC 펠렛(~4 내지 5 ml)을 50 ml DPBS(Ca2+/Mg2+ 없음, PAN-Biotech GmbH)로 2x 세척했다. RT에서 800xg 10 분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. RBC를 계수하고, 총 세포 수에 기반하여, DPBS(Ca2+/Mg2+ 없음) 중에 500.000.000 c/ml로 재현탁했다.
사포닌 희석액은 DPBS(Ca2+/Mg2+ 포함, PAN-Biotech GmbH)에서, 1.11x 최종 세기로 준비하였다. 양성 용해 대조군으로 0.02% 트리톤-X100 용액을 DPBS+/+ 중에 제조하였다. 96 웰 V-바닥 플레이트에 모든 화합물 용액 중 135 μl를 웰당 분배했다. 여기에 15 μl RBC 현탁액을 첨가하고 짧게 혼합했다(10 초 - 600 rpm). 플레이트를, 가볍게 교반하면서, RT에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 그 후 플레이트를 800xg에서 10 분 동안 회전시켜 RBC를 펠렛화하고 100 내지 120 μl 상층액을 표준 96 wp(96 웰-플레이트)로 옮겼다. 이어서, 써모 사이언티픽 멀티스칸 FC 플레이트 판독기(Thermo Scientific) 상에서 405 nm에서의 OD를 측정했다. 정량화를 위해 'DPBS+/+만 있는' 웰의 배경 신호를 모든 다른 웰로부터 뺀 후 처리된 웰의 배경 보정 신호를 0.02% 트리톤-X100 웰(x100)의 배경 보정 신호에 대해 나눔으로써, 0.02% 트리톤-X100에 비교한 용혈 백분율을 계산하였다.
CMC 결정
사포닌의 임계 마이셀 농도(CMC)는 다음과 같이 문헌[DeVendittis et al. (A fluorimetric method for the estimation of the critical micelle concentration of surfactants, Analytical Biochemistry, Volume 115, Issue 2, August 1981, Pages 278-286)]의 방법에 의해 결정하였다:
정제수(MQ) 또는 PBS(Dulbecco's PBS+/+) 중의 8-아닐리노나프탈렌-1-설폰산(ANS)의 방출 스펙트럼을 CMC 미만 및 초과 범위를 포함시키는 1 내지 1400 μM 범위의 사포닌 건조 중량 농도에서 결정하였다. CMC 초과에서는, 형광 염료가 마이셀 내로 분배되기 때문에 ANS의 형광 수율이 증가하고 최대 방출 파장이 감소한다. 형광 수율은 여기 파장 355 nm, 및 방출 파장 460 nm에서 플루오로스칸 어센트 FL(Thermo Scientific) 상에서 기록하였다. 75.86 μM 농도로 6 μg ANS를 샘플 및 측정 당 사용했다.
FACS 분석
세포를 10 cm 디쉬에 500,000c/플레이트로, 10% 송아지 태아 혈청(PAN-Biotech GmbH) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(PAN-Biotech GmbH) 보충된 DMEM(PAN-Biotech GmbH) 중에 시딩하고, 90% 컨플루언시에 도달할 때까지, 48 시간 동안 인큐베이션했다(5% CO2, 37℃). 다음으로, 세포를 단일 세포로 트립신화(TryplE Express, Gibco Thermo Scientific)하였다. 0.75 x 106 세포를 15 mL 팔콘 튜브로 옮기고 원심분리(1,400 rpm, 3 분)했다. 세포 펠렛을 가라앉은 채로 두면서 상층액을 버렸다. 볼텍스 진탕기 상에서 팔콘 튜브를 가볍게 두드려 펠렛을 분리하고 세포를 4 mL 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS)로 세척했다. 세척 후, 세포를 3 mL 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS) 중에 재현탁하고 3개의 둥근 바닥 FACS 튜브에 대해 동등하게 나누었다(1 mL/튜브). 세포를 다시 원심분리하고 200 μL 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS) 또는 200 μL 항체 용액; 195 μL의 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS) 중에 5 μL 항체 함유 중에 재현탁했다. APC 마우스 IgG1, κ 이소타입 대조군 FC(#400122, Biolegend)를 이소타입 대조군으로 사용하였고, APC 항-인간 EGFR(#352906, Biolegend)을 사용하였다. 샘플을 튜브 롤러 혼합기 상에서 4℃에서 30 분 동안 인큐베이션했다. 그 후, 세포를 차가운 PBS(Mg2+ 및 Ca2+ 없음, 2% FBS)로 3x 세척하고 PBS 중 2% PFA 용액을 사용하여 실온에서 20 분 동안 정착시켰다. 세포를 차가운 PBS로 2x 세척하고, FACS 분석을 위해 250 내지 350 μL 차가운 PBS 중에 재현탁했다. 샘플을 비디 팩스칸토 II 유세포 분석 시스템(BD Biosciences) 및 플로우조 소프트웨어를 사용하여 분석했다. FACS 분석 결과는 표 A4에 요약되어 있다.
[표 A12]
SO1831, SO1831 유도체, QS-21 유도체 및 에스신을 사용한 적혈구 및 HeLa 세포의 처리.
Figure pct00104
SEQUENCE LISTING <110> Sapreme technologies B.V. Charit?- Universit?smedizin Berlin <120> SAPONIN DERIVATIVES WITH IMPROVED THERAPEUTIC WINDOW <130> P6092645PCT2 <150> NL 2025904 <151> 2020-06-24 <150> PCT/EP2020/071045 <151> 2020-07-24 <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Customized peptide <400> 1 Ser Glu Ser Asp Asp Ala Met Phe Cys Asp Ala Met Asp Glu Ser Asp 1 5 10 15 Ser Lys <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP27 BNA oligo <400> 2 ggcacagcca gtggcg 16 <210> 3 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP27 LNA oligo <400> 3 ggcacagcca gtggcg 16 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP27 Primer Forward <400> 4 gcagtccaac gagatcacca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSP27 Primer Reverse <400> 5 taaggcttta cttggcggca 20

Claims (32)

  1. 트리테르펜 아글리콘 코어 구조 및 아글리콘 코어 구조에 연결된 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬 중 적어도 하나를 포함하는 키라야 사포나리아(Quillaja saponaria)(QS) 사포닌 기반 사포닌 유도체로서; 상기 사포닌은
    C-4에 알데히드 기를 포함하는 상기 아글리콘 코어 구조; 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하는 제1 당류 사슬 중 적어도 하나를 추가로 포함하며; 여기서:
    i. 사포닌 유도체는 유도체화된 알데히드 기를 포함하는 아글리콘 코어 구조를 포함하거나;
    ii. 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하며 여기서 제1 당류 사슬은, 유도체화된, 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하거나;
    iii. 사포닌 유도체는 유도체화 i. 및 ii.의 조합, 바람직하게는 유도체화 i. 및 ii 중 하나를 포함하며;
    여기서 제1 당류 사슬 및 제2 당류 사슬은 독립적으로 단당류, 선형 올리고당류 및 분지형 올리고당류로부터 선택되는, 사포닌 유도체.
  2. 제1항에 있어서, 사포닌은 자연 발생 사포닌인, 사포닌 유도체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 사포닌 유도체는 화학식 (VI) 내지 (XXXIV) 및 (XL) 내지 (XLV)를 갖는 다음의 사포닌 유도체 중 임의의 하나가 아니라는 전제를 갖는, 사포닌 유도체:
    Figure pct00105

    Figure pct00106

    Figure pct00107

    Figure pct00108

    Figure pct00109

    Figure pct00110

    Figure pct00111

    Figure pct00112

    Figure pct00113

    Figure pct00114

    Figure pct00115

    Figure pct00116

    Figure pct00117

    또는
    Figure pct00118

    Figure pct00119

    Figure pct00120

    Figure pct00121

    Figure pct00122

    .
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 사포닌 유도체는 모노데스모시드 트리테르펜 글리코시드 또는 바이데스모시드 트리테르펜 글리코시드, 보다 바람직하게는 바이데스모시드 트리테르펜 글리코시드인, 사포닌 유도체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하며 여기서 제1 당류 사슬은, 유도체화된, 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하고,
    보다 바람직하게는, 사포닌 유도체는 유도체화된 상기 제1 당류 사슬을 포함하고 사포닌 유도체는 알데히드 기 또는 유도체화된 알데히드 기를 포함하는 아글리콘 코어 구조를 포함하며,
    가장 바람직하게는, 사포닌 유도체는 유도체화된 상기 제1 당류 사슬을 포함하고 사포닌 유도체는 알데히드 기를 포함하는 아글리콘 코어 구조를 포함하는, 사포닌 유도체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 사포닌 유도체는 다음으로 구성된 군으로부터 선택되는 아글리콘 코어 구조를 포함하며:
    2알파-하이드록시 올레아놀산;
    16알파-하이드록시 올레아놀산;
    헤데라게닌(23-하이드록시 올레아놀산);
    16알파,23-디하이드록시 올레아놀산;
    깁소게닌;
    키라산;
    프로토에스시게닌-21(2-메틸부트-2-에노에이트)-22-아세테이트;
    23-옥소-바링토게놀 C-21,22-비스(2-메틸부트-2-에노에이트);
    23-옥소-바링토게놀 C-21(2-메틸부트-2-에노에이트)-16,22-디아세테이트;
    디기토게닌;
    3,16,28-트리하이드록시 올레아난-12-엔;
    깁소겐산,
    바람직하게는 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조 키라산을 포함하는, 사포닌 유도체.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 사포닌 유도체는 키라산 및 깁소게닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 아글리콘 코어 구조를 포함하고, 바람직하게는 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조 키라산을 포함하며, 여기서 제1 당류 사슬은, 존재하는 경우, 아글리콘 코어 구조의 C3 원자 또는 C28 원자에, 바람직하게는 C3 원자에 연결되고/연결되거나, 제2 당류 사슬은, 존재하는 경우, 아글리콘 코어 구조의 C28 원자에 연결되는, 사포닌 유도체.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 당류 사슬은, 존재하는 경우, 다음으로부터 선택되고/선택되거나:
    GlcA-,
    Glc-,
    Gal-,
    Rha-(1→2)-Ara-,
    Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA-,
    Glc-(1→2)-[Glc-(1→4)]-GlcA-,
    Glc-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
    Xyl-(1→2)-Ara-(1→3)-[Gal-(1→2)]-GlcA-,
    Glc-(1→3)-Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-Glc-(1→4)-Gal-,
    Rha-(1→2)-Gal-(1→3)-[Glc-(1→2)]-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Ara-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Rha-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Glc-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-,
    Xyl-(1→4)-Fuc-(1→2)-Gal-(1→2)-Fuc-(1→2)-GlcA-, 및
    이의 유도체,
    제2 당류 사슬은, 존재하는 경우, 다음으로부터 선택되고:
    Glc-,
    Gal-,
    Rha-(1→2)-[Xyl-(1→4)]-Rha-,
    Rha-(1→2)-[Ara-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-,
    Ara-,
    Xyl-,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R1-(→4)]-Fuc- 여기서 R1은 4E-메톡시신남산,
    Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R2-(→4)]-Fuc- 여기서 R2는 4Z-메톡시신남산,
    Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
    Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-3,4-디-OAc-Fuc-,
    Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R3-(→4)]-3-OAc-Fuc- 여기서 R3은 4E-메톡시신남산,
    Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
    Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-4-OAc-Fuc-,
    (Ara- 또는 Xyl-)(1→3)-(Ara- 또는 Xyl-)(1→4)-(Rha- 또는 Fuc-)(1→2)-[4-OAc-(Rha- 또는 Fuc-)(1→4)]-(Rha- 또는 Fuc-),
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    Xyl-(1→4)-[Gal-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    Ara/Xyl-(1→4)-Rha/Fuc-(1→4)-[Glc/Gal-(1→2)]-Fuc-,
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R4-(→4)]-Fuc- 여기서 R4는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R5-(→4)]-Fuc- 여기서 R5는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-,
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4-OAc-Fuc-,
    6-OAc-Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc-Rha-(1→3)]-Fuc-,
    Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3-OAc--Rha-(1→3)]-Fuc-,
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-[Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[3,4-디-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    6-OAc-Glc-(1→3)-[Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    Glc-(1→3)-[Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)]-Rha-(1→2)-Fuc-,
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc-,
    Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
    Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc- 여기서 R6은 5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
    Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc- 여기서 R7은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
    Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc- 여기서 R8은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc- 여기서 R9는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc- 여기서 R10은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc- 여기서 R11은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc- 여기서 R12는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산)
    Glc-(1→3)-[Glc-(1→6)]-Gal-, 및
    이의 유도체,
    바람직하게는, 제1 당류 사슬은 Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA- 이고 제2 당류 사슬은 다음 중 임의의 하나인, 사포닌 유도체:
    Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[Rha-(1→3)]-4OAc-Fuc-,
    Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R6-(→4)]-Fuc- 여기서 R6은 5-O-[5-O-Rha-(1→2)-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
    Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R7-(→4)]-Fuc- 여기서 R7은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
    Api/Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-[Glc-(1→3)]-Rha-(1→2)-[R8-(→4)]-Fuc- 여기서 R8은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R9-(→4)]-Fuc- 여기서 R9는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R10-(→4)]-Fuc- 여기서 R10은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
    Api-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R11-(→3)]-Fuc- 여기서 R11은 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산),
    Xyl-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[R12-(→3)]-Fuc- 여기서 R12는 5-O-[5-O-Ara/Api-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥타노일]-3,5-디하이드록시-6-메틸-옥탄산).
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 사포닌 유도체는 제1 당류 사슬을 포함하고 제2 당류 사슬을 포함하며, 여기서 제1 당류 사슬은 하나 초과의 당류 모이어티를 포함하고 제2 당류 사슬은 하나 초과의 당류 모이어티를 포함하며, 여기서 아글리콘 코어 구조는 키라산 또는 깁소게닌이고, 여기서 다음 중 1개, 또는 2개, 바람직하게는 하나인, 사포닌 유도체:
    i. 아글리콘 코어 구조의 알데히드 기가 유도체화됨, 및
    ii. 제1 당류 사슬이, 유도체화된 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함함.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 사포닌 유도체는 다음으로 구성된 사포닌 군으로부터 선택되는 사포닌의 유도체이며: 키라야 수피 사포닌, QS-7, QS1861, QS-7 api, QS1862, QS-17, QS-18, QS-21, QS-21 A-apio, QS-21 A-xylo, QS-21 B-apio, QS-21 B-xylo, 이의 입체이성질체 및 이들의 조합, 바람직하게는 사포닌 유도체는 QS-21 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는, 사포닌 유도체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 사포닌 유도체는 분자 1로 표시되는 제7항의 키라산 사포닌 또는 깁소게닌 사포닌의 사포닌 유도체이며:
    [분자 1]
    Figure pct00123

    여기서
    제1 당류 사슬 A1은 수소, 단당류 또는 선형 또는 분지형 올리고당류를 나타내고, 바람직하게는 A1은 제8항에 정의된 당류 사슬을 나타내고, 보다 바람직하게는 A1은 제8항에 정의된 당류 사슬을 나타내며 A1은 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성되고;
    제2 당류 사슬 A2는 수소, 단당류 또는 선형 또는 분지형 올리고당류를 나타내고, 바람직하게는 A2는 제8항에 정의된 당류 사슬을 나타내며,
    여기서 A1 및 A2 중 적어도 하나는 수소가 아니고, 바람직하게는 A1 및 A2 둘 모두 올리고당류 사슬이고;
    R은 깁소게닌에서 수소이거나 키라산에서 하이드록실이며;
    여기서 사포닌 유도체는 분자 1로 표시되는 사포닌에 대응되며 여기서 다음의 유도체화 중 적어도 하나가 존재하는, 사포닌 유도체:
    i. 키라산 또는 깁소게닌의 위치 C23에 있는 알데히드 기가 유도체화됨; 및
    ii. A1이 제8항에 정의된 당류 사슬을 나타내고 A1이 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성된 경우, A1의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기가 유도체화됨.
  12. 제11항에 있어서, A1은 제8항에 정의된 당류 사슬을 나타내며 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성되며 여기서 A1의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기는 유도체화된, 사포닌 유도체.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 분자 1로 표시되는 사포닌은 바이데스모시드 트리테르펜 사포닌인, 사포닌 유도체.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 사포닌 유도체는 분자 1로 표시되는 사포닌에 대응되며 여기서 다음의 유도체화 중 적어도 하나가 존재하고, 바람직하게는 다음의 유도체화 중 1개 또는 2개가 존재하는, 사포닌 유도체:
    i. 키라산 또는 깁소게닌의 위치 C23에 있는 알데히드 기는 다음에 의해 유도체화됨;
    - 알코올로 환원; 또는
    - N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환되어, SO1861-Ald-EMCH 또는 QS-21-Ald-EMCH와 같은 사포닌-Ald-EMCH를 제공하며, 여기서 EMCH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것; 또는
    - N-[β-말레이미도프로피온산]히드라지드(BMPH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환되며 여기서 BMPH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것; 또는
    - N-[κ-말레이미도운데칸산]히드라지드(KMUH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환되며 여기서 KMUH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것; 및
    ii. A1이 제8항에 정의된 당류 사슬을 나타내고 A1이 글루쿠론산 모이어티를 포함하거나 이로 구성된 경우, A1의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기가, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(AMPD) 또는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통해 아미드 결합으로 변환됨으로써 유도체화되어, QS-21-Glu-AMPD와 같은 사포닌-Glu-AMPD 또는 QS-21-Glu-AEM과 같은 사포닌-Glu-AEM을 제공함.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, A1 은 Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA이고/이거나 A2는 Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc이며, 보다 바람직하게는 QS-21 유도체이며, 여기서 A1은 Gal-(1→2)-[Xyl-(1→3)]-GlcA이고/이거나 A2는 Glc-(1→3)-Xyl-(1→4)-Rha-(1→2)-[Xyl-(1→3)-4-OAc-Qui-(1→4)]-Fuc인, 사포닌 유도체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 사포닌 유도체는 다음의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되며: QS-21, QS-21A, QS-21 A-api, QS-21 A-xyl, QS-21B, QS-21 B-api, QS-21 B-xyl, QS-7-xyl, QS-7-api, QS-17-api, QS-17-xyl, QS1861, QS1862, 키라야사포닌, QS-18, Quil-A, 이의 입체이성질체 및 이들의 조합, 바람직하게는 사포닌 유도체는 QS-21 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는, 사포닌 유도체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 사포닌 유도체는 단일 유도체화를 포함하는 QS-21 유도체이며, 여기서 단일 유도체화는 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HATU)를 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기에 결합시키는 것에 의한 또는 (벤조트리아졸-1-일옥시)트리스(디메틸아미노)포스포늄 헥사플루오로포스페이트(BOP)를 QS-21의 글루쿠론 모이어티의 카르복실 기에 결합시키는 것에 의한 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기의 변환이거나, 사포닌 유도체는 분자 30으로 표시되는 QS-21 유도체이며, 이는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 유도체화된 키라산 아글리콘 코어 구조의 지시된 위치 C23에 있는 알데히드 기를 포함하는 QS-21 유도체를 나타내는 것이거나:
    [분자 30]
    Figure pct00124

    사포닌 유도체는 QS-21 유도체이며, 상기 QS-21 유도체는 N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 유도체화된 키라산 아글리콘 코어 구조의 지시된 위치 C23에 있는 알데히드 기를 포함하고 여기서 EMCH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올을 이용하여 유도체화되어 티오에테르 결합을 형성하는 것이거나,
    사포닌 유도체는 QS-21 유도체이며, 여기서 사포닌 유도체는 다음 중 하나에 따른 화학식을 가지며:
    [분자 27]
    Figure pct00125

    ,
    [분자 28]
    Figure pct00126

    ,
    [분자 29]
    Figure pct00127

    ,
    여기서 R은, 다음 화학식에 따른, Q api, A xyl, B api 및 B xyl 중 임의의 하나로 정의되거나:
    Figure pct00128

    사포닌 유도체는 다음 중 하나에 따른 화학식을 갖는, 사포닌 유도체:
    [분자 31]
    Figure pct00129

    ,
    [분자 32]
    Figure pct00130

    ,
    [분자 33]
    Figure pct00131

    .
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    i. 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조를 포함하며 여기서 아글리콘 코어 구조는 다음에 의해 유도체화된 알데히드 기를 포함하거나:
    - 알코올로 환원; 또는
    - N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환되며 여기서 EMCH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것; 또는
    - N-[β-말레이미도프로피온산]히드라지드(BMPH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환되며 여기서 BMPH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것; 또는
    - N-[κ-말레이미도운데칸산]히드라지드(KMUH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환되며 여기서 KMUH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것;
    ii. 제1 당류 사슬은 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하며, 이는 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(AMPD) 또는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통해 아미드 결합으로 변환됨으로써 유도체화되거나;
    iii. 사포닌 유도체는 임의의 조합의 2개의 유도체화 i., ii.를 포함하고;
    바람직하게는, 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조를 포함하며 여기서 아글리콘 코어 구조는 EMCH와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 유도체화된 알데히드 기를 포함하고, 여기서 EMCH의 말레이미드 기는 메르캅토에탄올과의 티오에테르 결합 형성에 의해 선택적으로 유도체화되는 것인, 사포닌 유도체.
  19. 제18항에 있어서, 사포닌 유도체는 아글리콘 코어 구조를 포함하며 여기서 아글리콘 코어 구조는 알데히드 기를 포함하고 제1 당류 사슬은 카르복실 기, 바람직하게는 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기를 포함하며, 이는 N-(2-아미노에틸)말레이미드(AEM)와의 반응을 통해 아미드 결합으로 변환됨으로써 유도체화된, 사포닌 유도체.
  20. 제18항에 있어서, N-ε-말레이미도카프로산 히드라지드(EMCH)와의 반응을 통해 히드라존 결합으로 변환됨으로써 아글리콘 코어 구조의 알데히드 기가 유도체화되고 사포닌이 QS-21인 경우의 전제 하에, 글루쿠론산 또한 유도체화되고, 사포닌이 QS-21이고 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기가 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HATU)와 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기의 반응에 의해 유도체화되는 경우의 전제 하에, 알데히드 기 또한 변형되는, 사포닌 유도체.
  21. 제18항에 있어서, 사포닌 유도체의 아글리콘 코어 구조의 알데히드 기가 EMCH와의 반응을 통해 유도체화되고 사포닌이 QS-21인 경우의 전제 하에, 글루쿠론산 또한 유도체화되고, 사포닌이 QS-21이고 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기가 결합된 HATU에 의해 유도체화되는 경우의 전제 하에, 알데히드 기 또한 유도체화되는, 사포닌 유도체.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 사포닌 유도체 및 선택적으로 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 포함하는 제1 약학적 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 사포닌 유도체는 분자 30으로 표시되는 사포닌 유도체이거나:
    [분자 30]
    Figure pct00132

    단일 유도체화를 포함하는 QS-21 유도체로서, 여기서 단일 유도체화는 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로[4,5-b]피리디늄 3-옥시드 헥사플루오로포스페이트(HATU)와 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기의 반응에 의한 QS-21의 글루쿠론산 모이어티의 카르복실 기의 변환인, 제1 약학적 조성물.
  24. 다음을 포함하는 약학적 복합제:
    ·제22항 또는 제23항의 제1 약학적 조성물; 및
    ·항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 임의의 하나 이상을 포함하고, 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 선택적으로 포함하는 제2 약학적 조성물.
  25. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항의 사포닌 유도체를 포함하고 다음 중 임의의 하나 이상을 추가로 포함하고, 약학적으로 허용가능한 부형제 및/또는 희석제를 선택적으로 포함하는 제3 약학적 조성물: 항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-핵산 접합체 또는 수용체-리간드 - 핵산 접합체.
  26. 제24항의 약학적 복합제 또는 제25항의 제3 약학적 조성물로서, 제2 약학적 조성물 또는 제3 약학적 조성물은 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체 중 임의의 하나 이상을 포함하고, 여기서 약물은 예를 들어 사포린 및 디안틴과 같은 독소이고, 여기서 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, 예컨대 아포리포단백질 B 또는 HSP27의 유전자 침묵을 위한, siRNA 또는 BNA인, 약학적 복합제 또는 제3 약학적 조성물.
  27. 제24항 또는 제26항의 약학적 복합제 또는 제25항 또는 제26항의 제3 약학적 조성물로서, 사포닌 유도체는 제17항에 따른 사포닌 유도체인, 약학적 복합제 또는 제3 약학적 조성물.
  28. 항체-독소 접합체, 수용체-리간드 - 독소 접합체, 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체에 대해 및 이와 조합하여 엔도솜 탈출 증진제로서 사용하기 위한, 제22항 또는 제23항의 제1 약학적 조성물, 제24항, 제26항 또는 제27항 중 어느 한 항의 약학적 복합제 또는 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항의 제3 약학적 조성물.
  29. 의약으로서 사용하기 위한, 제22항 또는 제23항의 제1 약학적 조성물, 제24항, 제26항 또는 제27항 중 어느 한 항의 약학적 복합제 또는 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항의 제3 약학적 조성물.
  30. 암, 감염성 질환, 바이러스 감염, 고콜레스테롤혈증, 원발성 고옥살산뇨증, A 형 혈우병, B 형 혈우병, 알파-1 항트립신 관련 간 질환, 급성 간 포르피린증, 트랜스티레틴-매개 아밀로이드증, 또는 자가-면역 질환의 치료 또는 예방에서의 사용을 위한, 제22항 또는 제23항의 제1 약학적 조성물, 제24항, 제26항 또는 제27항 중 어느 한 항의 약학적 복합제 또는 제25항 내지 제27항 중 어느 한 항의 제3 약학적 조성물.
  31. 다음의 단계를 포함하는, 세포 외부로부터 상기 세포 내부로, 바람직하게는 상기 세포의 시토졸 내로 분자를 전달하는 시험관내 또는 생체외 방법:
    a) 세포를 제공하는 단계;
    b) 단계 a)에서 제공된 세포 외부로부터 세포 내로 전달하기 위한 분자를 제공하는 단계;
    c) 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 따른 사포닌 유도체를 제공하는 단계;
    d) 단계 a)의 세포를 단계 b)의 분자 및 단계 c)의 사포닌 유도체와 시험관내 또는 생체외 접촉시켜, 세포 외부로부터 상기 세포 내로의 분자의 전달을 확립하는 단계.
  32. 제31항에 있어서, 세포는 T-세포, NK-세포, 종양 세포와 같은 인간 세포이고/이거나, 사포닌 유도체는 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항의 사포닌 유도체이고/이거나, 단계 b)의 분자는 다음 중 임의의 하나이며: 항체-약물 접합체, 수용체-리간드 - 약물 접합체, 항체-올리고뉴클레오티드 접합체 또는 수용체-리간드 - 올리고뉴클레오티드 접합체, 여기서 약물은 예를 들어 독소이며 여기서 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 siRNA 또는 BNA인, 방법.
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