KR20230042649A - 항암제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물 - Google Patents

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KR20230042649A
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Abstract

본 발명은 현재 사용되고 있는 표적항암제 및 화학항암제의 항암 효과 증진을 위한 화합물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 부작용이 없으면서도 우수한 항암 효과를 나타내는 올리고펩티드 AQTGTGKT 또는 이의 아날로그를 포함하는 조성물 등에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그를 항암제와 혼합하여 병용 처리할 때, 대조군과 각각의 단독 처리군에 비해 암 증식 억제 효과에 있어서 유의한 시너지 효과를 제공할 수 있다. 더욱이, 낮은 농도의 항암제로 우수한 병용 항암 효과를 나타내기 때문에 정상 조직에 나타나는 기능 및 활성 손상, 골수 기능 저하, 위장장애, 탈모증, 항암제 내성 등의 부작용을 최소화할 수 있다. 또한, 상기 올리고펩티드 및 이의 아날로그는 항체에 비해 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고, 조직 내에 침투가 용이하다는 장점이 있어 다양한 암종에 대한 항암제와 병용하여 사용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

항암제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물 {Pharmaceutical Composition for enhancing anticancer effects of anticancer drugs}
본 발명은 암 치료에 있어서 표적항암제 및 화학항암제와 같은 항암제와 병용투여를 통해 시너지 효과를 나타낼 수 있는 화합물, 및 상기 화합물과 항암제의 조합을 포함하는 약학적 조성물 등에 관한 것이다.
현재 암의 조기 진단법의 개발 및 새로운 항암 요법의 지속적인 개발로 인하여 암의 치료 효과가 향상되고 있음에도 불구하고, 암은 아직도 우리나라 사망 원인 중 제1, 2위를 다투는 심각한 질환이다. 현재 사용되고 있는 항암제의 대부분은 화학요법에 의한 것으로 암의 종류에 따라 약리작용이 다양하고, 독성에 의한 부작용이 다양하게 나타나기 때문에 암 치료의 문제점으로 지적되고 있다. 따라서 이러한 화학요법계의 한계를 극복하기 위해서는 항암기전이 명확한 표적 치료제 개발이 지속적으로 필요하다.
기존의 항암제는 암 세포뿐만 아니라, 정상 세포에도 침투하여 정상 세포의 기능 및 활성에 손상을 입히기 때문에, 골수 기능 저하, 위장장애, 탈모증 등의 부작용을 유발하기도 하고, 장기간 화학 요법에 따른 항암제에 대한 다약제 저항성을 보이는 등 암 치료의 커다란 문제점을 보인다. 따라서, 기존 항암제의 이러한 심각한 문제점을 해결하기 위한 방편으로서, 항암제와 병용투여함으로써 항암제의 효율은 극대화하면서도 부작용은 최소화할 수 있는 병용투여용 약제의 개발이 활발하게 이루어지고 있다.
특히, 암 치료용 병용투여 요법은 다중 수단을 통해 암세포를 공격한다는 이점이 있으므로, 암치료에 많이 이용되고 있는데, 대한민국 공개특허 제10-2014-0097607호에서는 암 치료를 위한 병용투여용 약학적 조성물을 개시한 바 있다. 병용투여 요법은, 항암제의 효능을 증진시키면서도, 투여하는 항암제의 양을 감소시켜 항암제의 독성 및 부작용을 최소화할 수 있고, 항암제에 대하여 저항성이 나타난 경우에도 유용하다. 비록 다수의 효과적인 병용투여 치료법이 지난 수십 년간에 걸쳐 확인되기는 하였지만, 매년 암으로 사망하는 사람들의 수가 계속해서 높아지는 것에 비추어 볼 때, 효과적인 병용투여 치료법을 개발하는 것은 중요하다.
대한민국 특허공개공보 제10-2014-0097607호
본 발명은 상술한 바와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 항암 활성 펩티드 AQTGTGKT(alanine-glutamine-threonine-glycine-threonine-glycine-lysine-threonine) 또는 이의 아미드화된 아날로그 화합물을 기존의 항암제와 병용투여하는 경우, 항암 활성에서 현저한 상승 효과가 나타나는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 화합물 및 항암제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 화합물 및 항암제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항암제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 (ii) 항암제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
본 발명의 일 구현예에서, 상기 아날로그는 일반식 X-AQTGTGKT로 표시되는 화합물이고, 상기 X는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
[화학식 1]
Figure pat00001
상기 화학식 1에서,
R1은 수소, 치환 또는 비치환된 페닐기, 치환 또는 비치환된 나프틸기, 또는 치환 또는 비치환된 C1 내지 C5의 알킬기임.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 R1은 하기 화학식 2 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
[화학식 2]
Figure pat00002
[화학식 3]
Figure pat00003
(상기 화학식 3에서,
R2 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1 내지 C5의 알킬기, 또는 페닐기이고;
R3은 수소, C1 내지 C5의 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 C3의 알콕시기임.)
[화학식 4]
Figure pat00004
(상기 화학식 4에 있어서,
R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 또는 C1 내지 C3의 알킬기임.)
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 항암제는 표적항암제, 및 화학항암제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 표적항암제는 티로신 키나아제 억제제, PARP 억제제, 혈관신생억제제, CDK4/6 억제제 (cyclin-dependent kinases 4/6 inhibitor), 호르몬 치료제 (hormonal therapy drugs), 및 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugates)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 티로신 키나아제 억제제는 EGFR(epidermal growth factor receptor), ALK(anaplastic lymphoma kinase), ROS1(ROS Proto-Oncogene 1), BRAF(B-Raf Proto-Oncogene), HER2(human epidermal growth factor receptor 2), RET(Ret Proto-Oncogene), NTRK1(Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinase 1), MET(Mesenchymal-Epithelial Transition factor), 및 NRG1(Neuregulin 1)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 대한 표적 약물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 티로신 키나아제 억제제는 오시머티닙(Osimertinib), 아파티닙(Afatinib), 브리가티닙(Brigatinib), 다사티닙(Dasatinib), 다코미티닙(Dacomitinib), 엘로티닙(Erlotinib), 제피티닙(Gefitinib), 라파티닙(Lapatinib), 네라티닙(Neratinib), 반데타닙(Vandetanib), 아이코티닙(Icotinib), 바리티닙(Varitinib), 테세바티닙(Tesevatinib), 카네르티닙(Canertinib), 나쿠오티닙(Naquotinib), 펠리티닙(Pelitinib), 포지오티닙(Poziotinib), 로실레티닙(Rociletinib), 나자르티닙(Nazartinib), 알리티닙(Allitinib; ALS-1306), 피로티닙(Pyrotinib), 티르포스틴(Tyrphostin), 크리조티닙(Crizotinib), 세리티닙(Ceritinib), 엔트렉티닙(Entrectinib), 다브라페닙(Dabrafenib), 트라메티닙(Trametinib), 알렉티닙(Alectinib), 로라티닙(lorlatinib) 라로텍티닙(Larotectinib), 레이저티닙(Lazertinib), 올무티닙(Olmutinib), AG 1478, CUDC-101, MTKi-327(JNJ-26483327), CL-387785(EKI-785), CNX-2006, PD168393, TAK285, WZ4002, 및 AV-412(MP-412)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 PARP 억제제는 올라파립(Olaparib), 루카파립(Rucaparib), 탈라조파립(Talazoparib), 벨리파립(Veliparib), 및 니라파립(Niraparib)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 CDK4/6 억제제는 트릴라시클립(Trilaciclib), 팔보시클립(Palbociclib), 리보시클립(Ribociclib), 및 아베마시클립(Abemaciclib)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 호르몬 치료제는 타목시펜(Tamoxifen), 토레미펜(Toremifene), 풀베스트란(Fulvestrant), 고세렐린(Goserelin), 류프롤리드(Leuprolide), 아나스트로졸(Anastrozole), 레트로졸(Letrozole), 및 엑세메스탄(Exemestane)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 항체-약물 접합체는 사시투주맙 고비테칸(Sacituzumab govitecan), 및 라디라투주맙(Ladiratuzumab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 표적항암제는 다라투무맙(Daratumumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 및 리툭시맙(Rituximab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 화학항암제는 알림타(Alimta), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 페메트렉시드(Pemetrexed), 시스플라틴(Cisplatin), 젬시타빈(Gemcitabine), 카보플라틴(Carboplatin), 플루오로우라실(5-FU), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 파클리탁셀(Paclitaxel), 빈크리스틴(Vincristine), 에토포사이드(Etoposide), 및 독소루비신(Doxorubicin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 상기 항암제의 항암 효과를 증진시키고 부작용은 감소시킬 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 상기 항암제가 혼합된 혼합제 형태일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 상기 항암제가 각각 제제화되어 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여되는 형태일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 항암제는 전체 조성물 대비 0.01 내지 10 μM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 전체 조성물 대비 1 내지 50 μM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 항암제 : 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 1 : 1 내지 500의 몰농도(molarity)비로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 약학적 조성물은 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 표적항암제; 및 화학항암제를 모두 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 암은 편평상피세포암, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다:
또한, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 (ii) 항암제를 유효성분으로 포함하는, 항암제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 아날로그는 일반식 X-AQTGTGKT로 표시되는 화합물이고, 상기 X는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
[화학식 1]
Figure pat00005
상기 화학식 1에서,
R1은 수소, 치환 또는 비치환된 페닐기, 치환 또는 비치환된 나프틸기, 또는 치환 또는 비치환된 C1 내지 C5의 알킬기임.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 R1은 하기 화학식 2 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 화합물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다:
[화학식 2]
Figure pat00006
[화학식 3]
Figure pat00007
(상기 화학식 3에서,
R2 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1 내지 C5의 알킬기, 또는 페닐기이고;
R3은 수소, C1 내지 C5의 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 C3의 알콕시기임.)
[화학식 4]
Figure pat00008
(상기 화학식 4에 있어서,
R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 또는 C1 내지 C3의 알킬기임.)
본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 항암제와 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 조성물은 편평상피세포암, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 암에 대한 상기 항암제의 항암 효과를 증진시키기 위한 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 (ii) 항암제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 항암제는 각각 유효량으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그를 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 항암제의 항암 효과 증진 방법을 제공한다. 상기 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 유효량으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 항암제의 항암 효과 증진제의 제조를 위한, 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그의 항암제의 항암 효과 증진 용도를 제공한다. 상기 항암제의 항암 효과 증진 용도는 항암제의 부작용 억제 용도를 포함한다.
또한, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 (ii) 항암제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 암 치료용 약제의 제조를 위한 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 (ii) 항암제를 유효성분으로 포함하는 조성물의 암의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
본 발명은 암 예방/치료용 약학적 조성물 및 항암제의 항암 효과 증진용 조성물 등에 관한 것으로서, 상기 조성물은 종양촉진인자로서 기존 항암제의 내성에 관여하는 오토파지 기전에 바탕을 둔 올리고펩티드 AQTGTGKT 및 이의 아날로그 화합물을 유효성분으로 한다. 본 발명에 따른 올리고펩티드 및 이의 아날로그는 암이 진행된 상태에서만 오토파지의 상단단계에 관여하는 단백질 타깃과 선택적으로 결합하여 오토파지를 과활성화시켜 정상세포에는 영향을 미치지 않으면서 특이적으로 암 세포만을 표적 할 수 있으므로, 항암제 내성 환자들에게 기존 항암제 단독 처리 효과의 부작용을 최소화하면서 암세포 증식 억제 효과를 극대화할 수 있다.
보다 구체적으로 올리고펩티드 AQTGTGKT 및 이의 아날로그 화합물을 기존의 항암제와 병용투여하는 경우 상승된 항암 효과를 나타내고, 낮은 농도의 약물만으로도 유의적으로 우수한 암 세포 증식을 억제하는 항암 효과를 나타내기 때문에 정상 조직에 나타나는 기능 및 활성 손상, 골수 기능 저하, 위장장애, 탈모증, 항암제 내성 등의 부작용을 최소화할 수 있다. 또한, 올리고펩티드는 항체에 비해 분자량이 작아 면역반응의 우려가 적고, 조직 내에 침투가 용이하다는 장점이 있어 다양한 암종에 대한 항암제와 병용하여 사용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a는 폐암 세포주 H1975에서 본 발명에 따른 화합물 3-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙(Osimertinib)의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다(* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001; 이하 동일).
도 1b는 폐암 세포주 H1975에서 본 발명에 따른 화합물 4-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 1c는 폐암 세포주 H1975에서 본 발명에 따른 화합물 Ac-AQTGTGKT와 오시머티닙의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 1d는 폐암 세포주 H1975에서 본 발명에 따른 화합물 4-MeOPh-AQTGTGKT와 오시머티닙의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 1e는 폐암 세포주 H1975에서 본 발명에 따른 화합물 2-PhPh-AQTGTGKT 와 오시머티닙의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 1f는 폐암 세포주 H1975에서 본 발명에 따른 화합물 Ph-AQTGTGKT와 오시머티닙의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 1g는 폐암 세포주 H1975에서 본 발명에 따른 화합물 Naphtyl-AQTGTGKT 와 오시머티닙의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 1h는 폐암 세포주 H1975/OR에서 본 발명에 따른 화합물 3-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 2a는 폐암 세포주 H1975에서 본 발명에 따른 화합물 4-PhPh-AQTGTGKT와 알림타(Alimta)의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 2b는 폐암 세포주 H1975/OR에서 본 발명에 따른 화합물 3-PhPh-AQTGTGKT와 알림타의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 2c는 폐암 세포주 H1975에서 본 발명에 따른 화합물 2-PhPh-AQTGTGKT와 알림타의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 2d는 폐암 세포주 H1975에서 본 발명에 따른 화합물 Ph-AQTGTGKT와 알림타의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 2e는 폐암 세포주 H1975에서 본 발명에 따른 화합물 Naphtyl-AQTGTGKT와 알림타의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 폐암 세포주 H1975에서 본 발명에 따른 화합물 3-PhPh-AQTGTGKT, 오시머티닙, 및 알림타의 삼중 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 4a는 폐암 세포주 H820에서 본 발명에 따른 화합물 AQTGTGKT와 오시머티닙의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 4b는 폐암 세포주 H820에서 본 발명에 따른 화합물 3-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 5는 폐암 세포주 PC9/OR에서 본 발명에 따른 화합물 3-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 6a는 유방암 세포주 HCC1937에서 본 발명에 따른 화합물 AQTGTGKT와 올라파립(Olaparib)의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 6b는 유방암 세포주 HCC1937에서 본 발명에 따른 화합물 3-PhPh-AQTGTGKT와 올라파립의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 6c는 유방암 세포주 HCC1937에서 본 발명에 따른 화합물 4-PhPh-AQTGTGKT와 올라파립의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 6d는 유방암 세포주 HCC1937에서 본 발명에 따른 화합물 Acyl-PhPh-AQTGTGKT와 올라파립의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 6e는 유방암 세포주 HCC1937에서 본 발명에 따른 화합물 2-PhPh-AQTGTGKT와 올라파립의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 6f는 유방암 세포주 HCC1937에서 본 발명에 따른 화합물 Ph-AQTGTGKT와 올라파립의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 6g는 유방암 세포주 HCC1937에서 본 발명에 따른 화합물 Naphtyl-AQTGTGKT와 올라파립의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 7a는 유방암 세포주 HCC1937에서 본 발명에 따른 화합물 4-MeOph-AQTGTGKT와 시스플라틴의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 7b는 유방암 세포주 HCC1937에서 본 발명에 따른 화합물 3-PhPh-AQTGTGKT와 시스플라틴의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 7c는 유방암 세포주 HCC1937에서 본 발명에 따른 화합물 4-PhPh-AQTGTGKT와 시스플라틴의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 7d는 유방암 세포주 HCC1937에서 본 발명에 따른 화합물 Acyl-PhPh-AQTGTGKT와 시스플라틴의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 7e는 유방암 세포주 HCC1937에서 본 발명에 따른 화합물 2-PhPh-AQTGTGKT와 시스플라틴의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 7f는 유방암 세포주 HCC1937에서 본 발명에 따른 화합물 Ph-AQTGTGKT와 시스플라틴의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 7g는 유방암 세포주 HCC1937에서 본 발명에 따른 화합물 Naphtyl-PhPh-AQTGTGKT와 시스플라틴의 병용 처리에 따른 세포 활성 억제 효과를 MTT assay로 분석한 결과를 나타낸다.
도 8a는 암세포에서 본 발명에 따른 화합물 3-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙의 최적 병용 요법(regimen)을 탐색하기 위해 병용 처리 시점에 따른 세포 성장 저해 효과를 비교 분석한 결과를 나타낸다.
도 8b는 폐암 세포주 PC9/OR에서 본 발명에 따른 화합물 3-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙의 최적 병용 요법(regimen)의 구체적 탐색을 위한 병용 처리 기간에 따른 세포 성장 저해 효과를 비교 분석한 결과를 나타낸다.
도 9a는 폐암 세포주 H820을 누드마우스에 접종하여 종양을 형성시킨 후 본 발명에 따른 화합물 3-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙의 병용 처리에 따른 종양 성장 억제 효과를 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 9b는 폐암 세포주 H1975를 누드마우스에 접종하여 종양을 형성시킨 후 본 발명에 따른 화합물 3-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙의 병용 처리에 따른 종양 성장 억제 효과를 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 폐암 환자의 종양 조직을 이식한 PDX 모델에서 레이저티닙 및 본 발명에 따른 화합물(3-PhPh-AQTGTGKT)의 단독 또는 병용투여에 따른 종양 성장 정도를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 11은 폐암 환자의 종양 조직을 이식한 PDX 모델에서 오시머티닙 및 본 발명에 따른 화합물(3-PhPh-AQTGTGKT)의 단독 또는 병용투여에 따른 종양 성장 정도를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 H1975 세포주를 이용하여 제작한 폐암 동물모델에서 오시머티닙에 대한 내성 발현 후 본 발명에 따른 화합물(3-PhPh-AQTGTGKT)의 병용투여에 따른 종양 성장 결과이다.
도 13은 H1975 세포주를 이용하여 제작한 폐암 동물모델에서 오시머티닙에 대한 내성이 발현되기 전 본 발명에 따른 화합물(3-PhPh-AQTGTGKT)의 병용투여에 따른 종양 성장 결과이다.
도 14a 내지 14c는 HCC1806 세포주를 이용하여 제작한 유방암 동물모델에서 본 발명에 따른 화합물인 AQTGTGKT(도 14a), 3-PhPh-AQTGTGKT(도 14b), 및 Ph-AQTGTGKT(도 14c)의 단독투여 또는 시스플라틴과의 병용투여에 따른 종양 성장을 분석한 결과이다.
도 15는 폐암 세포주 H820을 누드마우스에 접종하여 종양을 형성시킨 후 본 벌명에 따른 화합물 3-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙의 병용 처리한 후, 종양 조직을 적출하여 종양 내의 p-Beclin1의 억제 효과를 비교 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 16 내지 도 22는 본 발명에 따른 화합물을 동정하고, 화합물의 구조 확인을 위한 UPLC-MS(상단) 및 1H NMR(하단) 결과를 나타낸 도로서, 도 16은 4-PhPh-AQTGTGKT, 도 17은 Ac-AQTGTGKT, 도 18은 3-PhPh-AQTGTGKT, 도 19는 4-MeOPh-AQTGTGKT, 도 20은 2-PhPh-AQTGTGKT, 도 21은 Ph-AQTGTGKT, 도 22는 Naphthyl-AQTGTGKT의 측정 결과를 나타낸 것이다.
본 발명자들은 다양한 암 세포주에서 올리고펩티드 AQTGTGKT 또는 이의 아미드화 아날로그(amidation analog)를 기존의 항암제와 병용 사용하는 경우 더 향상된 항암 효과를 나타낸다는 사실을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, 다양한 폐암 세포주에서 표적항암제 및/또는 화학항암제를 본 발명에 따른 화합물과 병용 처리하는 경우 각각 단독으로 처리한 경우와 비교하여 항암 효과가 유의하게 상승하는 것을 확인하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 유방암 세포주에서 표적항암제 또는 화학항암제를 본 발명에 따른 화합물과 병용 처리하는 경우 각각 단독으로 처리한 경우와 비교하여 항암 효과가 유의하게 상승하는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 오시머티닙과 3-PhPh-AQTGTGKT의 병용 요법에 따른 종양 성장 억제 효과를 분석한 결과, 오시머티닙을 단독으로 처리한 후 3-PhPh-AQTGTGKT를 추가하여 병용 처리하는 것 보다 오시머티닙과 3-PhPh-AQTGTGKT를 병용으로 처리한 후 오시머티닙을 단독으로 처리하는 경우, 더욱 더 향상된 항암 효과를 나타내는 것을 발견하였다(실시예 3.1 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 오시머티닙과 3-PhPh-AQTGTGKT의 병용 요법에 따른 종양 성장 억제 효과를 분석한 결과, 오시머티닙과 3-PhPh-AQTGTGKT를 병용으로 처리한 후 오시머티닙을 단독으로 처리하는 경우보다 오시머티닙과 3-PhPh-AQTGTGKT를 병용 처리를 계속적으로 하는 경우가, 더욱 더 향상된 항암 효과를 나타내는 것을 발견하였다(실시예 3.2 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, H820 폐암 세포주로 제작한 이종이식 폐암 동물모델을 이용하여 오시머티닙 및 3-PhPh-AQTGTGKT의 병용투여에 의한 효과를 확인한 결과, 상기 화합물 및 항암제를 각각 단독투여한 경우보다 이들을 병용투여하였을 때 더욱 상승된 종양 성장 억제 효과가 있음을 확인하였다(실시예 4 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 폐암 환자의 종양조직을 이식한 PDX 폐암 동물모델을 이용하여 레이저티닙 또은 오시머티닙; 및 3-PhPh-AQTGTGKT의 병용투여에 의한 효과를 확인한 결과, 상기 화합물 및 항암제를 각각 단독투여한 경우보다 이들을 병용투여하였을 때 더욱 상승된 종양 성장 억제 효과가 있음을 확인하였다(실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, H1975 폐암 세포주로 제작한 이종이식 폐암 동물모델을 이용하여 항암제에 대한 내성이 발현되기 전후에 오시머티닙 및 3-PhPh-AQTGTGKT의 병용투여에 의한 효과를 확인한 결과, 내성이 발현되기 전과 후 모두 상기 화합물 및 항암제를 각각 단독투여한 경우보다 이들을 병용투여하였을 때 더욱 상승된 종양 성장 억제 효과가 있음을 확인하였다(실시예 6 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, HCC1806 유방암 세포주로 제작한 이종이식 유방암 동물모델을 이용하여 오시머티닙; 및 AQTGTGKT, 3-PhPh-AQTGTGKT, 또는 Ph-AQTGTGKT의 병용투여에 의한 효과를 확인한 결과, 상기 화합물 및 항암제를 각각 단독투여한 경우보다 이들을 병용투여하였을 때 더욱 상승된 종양 성장 억제 효과가 있음을 확인하였다(실시예 7 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 오시머티닙과 3-PhPh-AQTGTGKT의 병용투여에 따른 자가포식작용을 분석한 결과, 단독투여한 경우와 비교하여 병용투여한 군에서 p-Beclin1의 발현이 현저하게 감소하는 것을 확인하였다(실시예 8 참조).
이에 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 (ii) 항암제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 (ii) 항암제를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 (ii) 항암제를 유효성분으로 포함하는, 항암제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 일반식으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암제의 부작용 억제용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 항암제의 부작용 억제는 항암제의 내성 억제를 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 일반식으로 표시되는 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암제의 병용투여용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 아날로그는 일반식 X-AQTGTGKT으로 표시되는 화합물이고, 상기 X는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다:
[화학식 1]
Figure pat00009
상기 화학식 1에서,
R1은 수소, 치환 또는 비치환된 페닐기, 치환 또는 비치환된 나프틸기, 또는 치환 또는 비치환된 C1 내지 C5의 알킬기임.
바람직하게는, 상기 R1은 하기 화학식 2 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 화합물일 수 있다:
[화학식 2]
Figure pat00010
[화학식 3]
Figure pat00011
(상기 화학식 3에서,
R2 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1 내지 C5의 알킬기, 또는 페닐기이고;
R3은 수소, C1 내지 C5의 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 C3의 알콕시기임.)
[화학식 4]
Figure pat00012
(상기 화학식 4에 있어서,
R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 또는 C1 내지 C3의 알킬기임.)
바람직하게는, 본 발명에 따른 화합물은 하기 일반식으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다:
[일반식]
X-AQTGTGKT
(상기 일반식에서, A는 알라닌(alanine)이고, Q는 글루타민(glutamine)이고, T는 트레오닌(threonine)이고, G는 글라이신(glycine)이고, K는 라이신(lysine)이고,
X는 존재하지 않거나; 또는
Figure pat00013
로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상임.)
상기 일반식에서 X가 존재하지 않는다는 것은 상기 일반식으로 표시되는 화합물이 AQTGTGKT임을 의미한다.
상기 X가
Figure pat00014
인 화합물은 본 명세서에서 “3-PhPh-AQTGTGKT”로 표기될 수 있다. 이외에 본 발명에 따른 화합물의 명칭들은 표 1에 기재되어 있다. 또한, 본 명세서 전반에서, 본 발명에 따른 올리고펩티드 및 이의 아날로그는 간단히 “화합물”로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “올리고펩티드”는 펩티드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형(linear)의 분자를 의미한다. 본 발명의 아미드화 올리고펩티드는 분자·생물학적인 방법과 함께 당업계에 공지된 화학적 합성 방법(예를 들어, 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques))에 따라 제조될 수 있다(Merrifield, J. Amer. Chem. Soc. 85: 2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)).
본 발명에 따른 화합물의 범위에는 이의 약학적으로 허용 가능한 염도 포함될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어, “약학적으로 허용 가능한”이라는 용어는 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 또는 기타 문제점이나 합병증 없이 이득/위험 비가 합리적이어서 대상체(예: 인간)의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하며, 건전한 의학적 판단의 범주 이내인 화합물을 의미한다. 상기 약학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염 및 약학적으로 허용 가능한 금속염을 포함한다.
구체적으로, 적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염 (예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
본 발명의 화합물의 범위에는 약학적으로 허용 가능한 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 이성질체, 수화물 및 용매화물이 모두 포함될 수 있다.
상기 화합물은 비방향족 이중 결합 및 하나 이상의 비대칭 중심을 가질 수 있다. 따라서, 이들은 라세미체 및 라세미체 혼합물, 단일 거울상이성질체, 개별적인 부분입체이성질체, 부분입체이성질체 혼합물 및 시스- 또는 트랜스-이성질체로서 발생할 수 있다. 모든 이러한 이성질체 형태가 고려된다.
또한, 본 발명에 따른 화합물의 범위에는 본 발명의 화합물과 균등한 생물학적 활성을 발휘하는 아미노산 서열의 변이를 갖는 생물학적 기능 균등물이 포함될 수 있다. 이러한 아미노산 서열의 변이는 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하 및 크기 등에 기초하여 이루어질 수 있다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 알라닌과 글라이신은 유사한 크기를 가지고; 라이신은 양전하를 띤 잔기이며; 글루타민과 트레오닌은 전하를 띠지 않는다는 것을 알 수 있다. 따라서, 이러한 고려 사항에 기초하여, 알라닌과 글라이신; 그리고 글루타민과 트레오닌은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다. 달리 언급되지 않은 한, 본 명세서에 개시된 아미노산 서열은 N말단으로부터 C말단으로의 순서로 기재된 것을 원칙으로 한다.
변이를 도입하는 데 있어서, 아미노산의 소수성 인덱스(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 각각의 아미노산은 소수성과 전하에 따라 다음과 같이 소수성 인덱스가 부여되어 있다: 아이소류신(+4.5); 발린(+4.2); 류신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인(+2.5); 메싸이오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글라이신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 타이로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루탐산(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파트산(-3.5); 아스파라진(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
단백질의 상호적인 생물학적 기능(interactive biological function)을 부여하는 데 있어서 소수성 아미노산 인덱스는 매우 중요하다. 유사한 소수성 인덱스를 가지는 아미노산으로 치환하여야 유사한 생물학적 활성을 보유할 수 있다는 것은 공지된 사실이다. 소수성 인덱스를 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 소수성 인덱스 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
한편, 유사한 친수성 값(hydrophilicity value)을 가지는 아미노산 사이의 치환이 균등한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 초래한다는 것도 잘 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호에 개시된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 각각의 아미노산 잔기에 부여되어 있다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파트산(+3.0±1); 글루탐산(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라진(+0.2); 글루타민(+0.2); 글라이신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메싸이오닌(-1.3); 발린(-1.5); 류신(-1.8); 아이소류신(-1.8); 타이로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4).
친수성 값을 참조하여 변이를 도입시키는 경우, 바람직하게는 ±2 이내, 보다 바람직하게는 ±1 이내, 보다 더 바람직하게는 ±0.5 이내의 친수성 값 차이를 나타내는 아미노산 사이에 치환을 한다.
분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에 따른 올리고펩타이드는 이의 아미노산 서열(AQTGTGKT)로 제한되는 것이 아니라, 이와 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 62.5%의 상동성, 보다 바람직하게는 75% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 87.5% 이상의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “병용투여”는, 치료 요법의 개별 성분들을 동시, 순차적으로, 또는 개별적으로 투여하는 방식으로 이룰 수 있다. 2 이상의 약물을 동시에 또는 순차적으로 투여하거나, 또는 일정한 또는 정해지지 않은 간격으로 교대로 투여하는 등의 방법으로 병용 치료 효과를 얻는 것으로, 병용 치료법은 이에 한정되지 아니하지만, 예를 들어 반응 정도, 반응 속도, 질병 진행까지의 기간 또는 생존 기간을 통해 측정된 효능이 병용 치료법의 성분 중 하나 또는 나머지를 통상적인 용량으로 투약하여 얻을 수 있는 효능보다 치료학적으로 우수하면서 상승효과를 제공할 수 있는 것으로 정의될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “항암제”란, 악성종양의 치료를 위하여 사용되는 물질을 총칭하는 의미로 사용되었다. 대부분의 항암제는 암세포의 각종 대사경로에 개입하여 주로 핵산의 합성을 억제하거나 항암활성(抗癌活性)을 나타내는 약제이다. 현재 암 치료에 사용되고 있는 항암제는 생화학적인 작용 기전에 따라 알킬화제(alkylating agents), 대사길항제(代謝拮抗劑: antimetabolites), 항생물질(抗生物質: antibiotics), 유사분열억제제(有絲分裂抑制劑: vinca alkaloid), 호르몬제 및 기타의 6개 범주로 분류하고 있으나, 본 발명에 따른 항암제는 상기 범주에 포함되지 않을 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 표적항암제, 및 화학항암제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 표적항암제와 함께 투여될 수 있다. 본 발명에서 “표적항암제”는 암 세포나 암 조직에서 특이적으로 변화되는 단백질이나 유전자를 표적으로 하여, 암의 성장 및 발생에 관여하는 분자 활동을 방해함으로써 항암 효과를 나타내는 제제를 의미한다. 상기 표적항암제는 티로신 키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor, TKI), PARP 억제제(poly-ADP ribose polymerase inhibitors), 혈관신생억제제(angiogenesis inhibitor), CDK4/6 억제제 (cyclin-dependent kinases 4/6 inhibitor), 호르몬 치료제 (hormonal therapy drugs), 및 항체-약물 접합체 (antibody-drug conjugates)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 표적항암제는 단클론 항체 항암제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
특히, 상기 티로신 키나아제 억제제는 EGFR(epidermal growth factor receptor), ALK(anaplastic lymphoma kinase), ROS1(ROS Proto-Oncogene 1), BRAF(B-Raf Proto-Oncogene), HER2(human epidermal growth factor receptor 2), RET(Ret Proto-Oncogene), NTRK1(Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinase 1), MET(Mesenchymal-Epithelial Transition factor), 및 NRG1(Neuregulin 1)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 대한 표적 약물일 수 있으며, 이의 비제한적인 예로는 오시머티닙(Osimertinib), 아파티닙(Afatinib), 브리가티닙(Brigatinib), 다사티닙(Dasatinib), 다코미티닙(Dacomitinib), 엘로티닙(Erlotinib), 제피티닙(Gefitinib), 라파티닙(Lapatinib), 네라티닙(Neratinib), 반데타닙(Vandetanib), 아이코티닙(Icotinib), 바리티닙(Varitinib), 테세바티닙(Tesevatinib), 카네르티닙(Canertinib), 나쿠오티닙(Naquotinib), 펠리티닙(Pelitinib), 포지오티닙(Poziotinib), 로실레티닙(Rociletinib), 나자르티닙(Nazartinib), 알리티닙(Allitinib; ALS-1306), 피로티닙(Pyrotinib), 티르포스틴(Tyrphostin), 크리조티닙(Crizotinib), 세리티닙(Ceritinib), 엔트렉티닙(Entrectinib), 다브라페닙(Dabrafenib), 트라메티닙(Trametinib), 알렉티닙(Alectinib), 로라티닙(lorlatinib) 라로텍티닙(Larotectinib), 레이저티닙(Lazertinib), 올무티닙(Olmutinib), AG 1478, CUDC-101, MTKi-327(JNJ-26483327), CL-387785(EKI-785), CNX-2006, PD168393, TAK285, WZ4002, 및 AV-412(MP-412) 등을 들 수 있다.
또한, 상기 PARP 억제제는 올라파립(Olaparib), 루카파립(Rucaparib), 탈라조파립(Talazoparib), 벨리파립(Veliparib), 및 니라파립(Niraparib)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 CDK4/6 억제제는 트릴라시클립(Trilaciclib), 팔보시클립(Palbociclib), 리보시클립(Ribociclib), 및 아베마시클립(Abemaciclib)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 호르몬 치료제는 타목시펜(Tamoxifen), 토레미펜(Toremifene), 풀베스트란(Fulvestrant), 고세렐린(Goserelin), 류프롤리드(Leuprolide), 아나스트로졸(Anastrozole), 레트로졸(Letrozole), 및 엑세메스탄(Exemestane)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 본 발명에 따른 표적항암제는 항체-약물 접합체(Antibody-drug conjugates; ADCs)일 수 있다. 상기 ADC는 암세포 표면의 특정 표적 항원에 결합하는 항체(Antibody)와 강력한 세포사멸 기능을 갖는 약물(Drug)을 공유 결합(conjugation)시켜 만든 것으로, 항체의 표적에 대한 선택성과 약물의 강력한 사멸 활성을 이용하여 약물이 암세포에만 선택적으로 작용하게 하여, 치료효과는 높이고 부작용은 낮춘 항암 약물이다.
바람직하게는, 상기 ADC는 사시투주맙 고비테칸(Sacituzumab govitecan), 및 라디라투주맙(Ladiratuzumab) 등으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이외에도, 본 발명에 따른 표적항암제는 다라투무맙(Daratumumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 및 리툭시맙(Rituximab) 등으로부터 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명의 조성물은 화학항암제와 함께 투여될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 “화학항암제”는 “세포독성항암제” 또는 “화학약물항암제” 등의 용어로도 불리우는 1세대 항암제를 의미한다. 상기 화학항암제의 비제한적인 예로 알림타(Alimta), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 페메트렉시드(Pemetrexed), 시스플라틴(Cisplatin), 젬시타빈(Gemcitabine), 카보플라틴(Carboplatin), 플루오로우라실(5-FU), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 파클리탁셀(Paclitaxel), 빈크리스틴(Vincristine), 에토포사이드(Etoposide), 독소루비신(Doxorubicin) 등을 들 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 조성물 (또는 이의 유효성분들)은 항암제의 항암 효과를 증진시키고 부작용은 감소시킬 수 있다. 적절한 병용요법에 의해 부작용이 있는 항암제의 투여량을 최소화할 수 있기 때문이다. 여기서, “항암 효과를 증진”시킨다는 것은, 결과적으로 항암제의 기능을 강화할 수 있는 모든 효과를 이르는 것으로서, 종양의 성장 억제, 종양의 전이 억제, 종양의 재발 억제 등과 같은 항암제의 항암 효과를 증진시키는 것은 물론, 항암제에 대한 암세포의 저항 내지 내성 형성을 억제함으로써 결과적으로 항암 효과를 증진시키는 것까지 모두 포함하는 개념이다. 즉, 본 발명에 따른 올리고펩타이드 및 이의 아날로그는 항암 효과를 증진시키기 위한 목적으로, 공지된 항암제의 병용투여용 화합물로서 사용될 수 있다. 즉, 본 발명에 올리고펩타이드 및 이의 아날로그는 항암제와의 병용투여 용도로 사용되어, 상기 항암제의 항암 효과를 증진시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 항암제와 동시에(simultaneously), 별도로(separately), 또는 순차적(sequentiallly)으로 투여될 수 있으며, 항암제와 순차적으로 투여되는 경우에도 투여 순서에 제한되는 것은 아니나, 암의 종류 및 항암제의 종류, 환자의 상태 등에 따라 투여 요법은 적절하게 조절될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서는, 치료 초기에 본 발명에 따른 화합물과 오시머티닙을 암세포에 동시 처리하는 경우 암세포의 성장 저해 효과가 가장 높았다. 따라서 상기 화합물은 항암제 투여 전 또는 항암제와 동시에 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 항암제와 함께 계속 병용하는 경우, 병용 후 항암제를 단독으로 처리하는 경우와 비교하였을 때, 더욱 더 항암 효과가 좋았다. 따라서 항암 효과의 극대화를 목적으로 할 경우에는 본 발명의 화합물을 항암제와 계속적으로 병용해 주는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에 따른 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 개체에서 항암제에 대한 내성이 발현되기 전 또는 후에 상기 항암제 혹은 다른 항암제와 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물 내의 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그, 또는 항암제의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.
본 발명에 있어서, 상기 항암제는 전체 조성물 대비 0.1 내지 10 μM, 0.1 내지 9 μM, 0.1 내지 8 μM, 0.1 내지 7 μM, 0.1 내지 6 μM, 0.1 내지 5 μM, 0.1 내지 4 μM, 0.1 내지 3 μM, 0.1 내지 2 μM, 또는 0.1 내지 1 μM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 달리 말하면, 상기 조성물은 개체에 투여시 상기 항암제가 0.1 내지 10 μM의 농도로 투여되는 용량으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 전체 조성물 대비 1 내지 50 μM, 1 내지 40 μM, 1 내지 30 μM, 1 내지 20 μM, 1 내지 15 μM, 1 내지 12 μM, 1 내지 10 μM, 1 내지 9 μM, 1 내지 8 μM, 1 내지 7 μM, 1 내지 6 μM, 1 내지 5 μM, 1 내지 4 μM, 1 내지 3 μM, 1 내지 2 μM, 2 내지 12 μM, 또는 2 내지 11 μM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 달리 말하면, 상기 조성물은 개체에 투여시 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그가 0.1 내지 10 μM의 농도로 투여되는 용량으로 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 상기 항암제가 혼합된 혼합제 형태로서, 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 상기 항암제의 동시(simultaneous) 투여를 위한 형태일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 상기 항암제가 각각 제제화되어 동시에 (simultaneously), 별도로 (separately), 또는 순차적으로 (sequentially) 투여되는 형태일 수 있다. 이 경우, 상기 조성물은 유효성분으로 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그의 약학적 유효량을 포함하는 제1 약학적 조성물; 및 유효성분으로 상기 항암제의 약학적 유효량을 포함하는 제2 약학적 조성물을 포함하는, 동시 또는 순차적 투여를 위한 병용투여용 약학적 조성물일 수 있다. 이 때, 순차적 투여의 경우 투여 순서에 제한되는 것은 아니며, 환자의 상태 등에 따라 투여 요법은 적절하게 조절될 수 있다.
즉, 상기 약학적 조성물이 순차적 투여를 위한 병용투여용 약학적 조성물인 경우, 상기 조성물은 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그 (“제1 성분”)가 먼저 투여된 후 상기 항암제 (“제2 성분”)이 투여되는 것일 수 있으며, 그 반대 순서도 가능하다.
바람직하게는, 상기 항암제는 티로신 키나아제 억제제, 더욱 바람직하게는, 오시머티닙(Osimertinib)이고, 본 발명에 따른 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 일반식 X-AQTGTGKT로 표시되는 화합물이되, 상기 X는 존재하지 않거나; 또는
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,
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,
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,
Figure pat00019
,
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및
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로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 화합물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 상기 항암제는 PARP 억제제, 더욱 바람직하게는 올라파립(Olaparib)이고, 본 발명에 따른 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 일반식 X-AQTGTGKT로 표시되는 화합물이되, 상기 X는 존재하지 않거나; 또는
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,
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,
Figure pat00024
,
Figure pat00025
,
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,
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, 및
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로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 화합물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 상기 항암제는 시스플라틴(Cisplatin)이고, 본 발명에 따른 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 일반식 X-AQTGTGKT로 표시되는 화합물이되, 상기 X는 존재하지 않거나; 또는
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,
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,
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,
Figure pat00032
,
Figure pat00033
,
Figure pat00034
, 및
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로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 화합물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 상기 항암제는 알림타(Alimta)이고, 본 발명에 따른 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 일반식 X-AQTGTGKT로 표시되는 화합물이되, 상기 X는
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,
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,
Figure pat00038
,
Figure pat00039
, 및
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로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 화합물일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
바람직하게는, 상기 항암제는 레이저티닙(Lazertinib)이고, 본 발명에 따른 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 일반식 X-AQTGTGKT로 표시되는 화합물이되, 상기 X는
Figure pat00041
일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이때 상기 항암제와 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 1 : 1 내지 500, 1 : 1 내지 400, 1 : 1 내지 300, 1 : 1 내지 200, 1 : 1 내지 180, 1 : 1 내지 150, 1 : 1 내지 130, 1 : 1 내지 120, 1 : 1 내지 110, 1 : 1 내지 100, 1 : 1 내지 90, 1 : 1 내지 80, 1 : 1 내지 70, 1 : 1 내지 60, 1 : 1 내지 50, 1 : 1 내지 40, 1 : 1 내지 30, 1 : 1 내지 20, 1 : 1 내지 10, 1 : 1 내지 9, 1 : 1 내지 8, 1 : 1 내지 7, 1 : 1 내지 6, 1 : 1 내지 5, 1 : 1 내지 4, 1 : 1 내지 3, 또는 1 : 1 내지 2의 몰농도(molarity)비로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 표적항암제; 및 화학항암제를 모두 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 올리고펩티드 또는 이의 아날로그를 표적항암제 및 화학항암제와 함께 3중 병용사용하였을 때, 본 발명에 따른 화합물의 단독 사용에 비해 항암 효과가 더욱 좋은 것은 물론, 상기 표적항암제 및 상기 화학항암제의 병용에 비해서도 항암 효과가 현저히 상승되는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 올리고펩티드 또는 이의 아날로그를 표적항암제 및 화학항암제와 3중으로 사용하는 경우 더욱 우수한 암 예방 및 치료 효과를 달성할 수 있다.
본 발명에 따른 올리고펩티드 또는 이의 아날로그를 화학항암제 및 표적항암제와 함께 3중으로 사용하는 경우, 화학항암제 : 표적항암제: 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그의 몰농도비는 1 : 5 내지 50 : 5 내지 200 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 즉, 본 발명에 따른 약학적 조성물에서 화학항암제 : 표적항암제: 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 1 : 5 내지 50 : 5 내지 200의 몰농도비로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 더욱 구체적으로, 상기 약학적 조성물에서 화학항암제 : 표적항암제: 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 1 : 5 내지 50 : 5 내지 150, 1 : 5 내지 50 : 5 내지 100, 1 : 5 내지 40 : 5 내지 200, 1 : 5 내지 40 : 5 내지 150, 1 : 5 내지 30 : 5 내지 150, 1 : 5 내지 30 : 5 내지 100, 1 : 5 내지 30 : 5 내지 80, 1 : 5 내지 30 : 5 내지 60, 1 : 10 내지 30 : 20 내지 150, 1 : 10 내지 30 : 30 내지 100, 1 : 10 내지 30 : 30 내지 80, 1 : 10 내지 30 : 30 내지 70, 1 : 15 내지 30 : 40 내지 100, 1 : 15 내지 25 : 30 내지 80, 1 : 15 내지 25 : 30 내지 60, 또는 1 : 15 내지 25 : 40 내지 60의 몰농도비로 포함될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 따른 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 암의 예방 및/또는 치료에 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 용어 “암”이란, 제어되지 않은 세포성장으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 하는 것을 말한다. 학문적으로는 신생물이라고 명명되기도 한다. 암은 수술, 방사선 및 화학요법으로 치료를 하더라도 많은 경우에 근본적인 치유가 되지 못하고 환자에게 고통을 주며 궁극적으로는 죽음에 이르게 하는 난치성 만성질환으로, 암의 발생요인으로는 여러 가지가 있으나, 내적 요인과 외적 요인으로 구분한다. 정상세포가 어떠한 기전을 거처 암세포로 형질전환이 되는지에 대해서는 정확하게 규명되지 않았으나, 상당수의 암이 환경요인 등 외적인자에 의해 영향을 받아 발생하는 것으로 알려져 있다. 내적 요인으로는 유전 인자, 면역학적 요인 등이 있으며, 외적 요인으로는 화학물질, 방사선, 바이러스 등이 있다. 암의 발생에 관련되는 유전자에는 종양형성유전자(oncogenes)와 종양억제유전자(tumor suppressor genes)가 있는데, 이들 사이의 균형이 위에서 설명한 내적 혹은 외적 요인들에 의해 무너질 때 암이 발생하게 된다.
상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 이의 비제한적인 예로서, 편평상피세포암, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 보다 구체적으로는 폐암, 유방암, 혈액암, 대장암, 췌장암, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 암일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 폐암은 비소세포성 폐암(non-small cell lung carcinoma) 또는 폐유두선암(lung papillary adenocarcinoma)일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 본 발명에 따른 화합물은 T790M 돌연변이 양성 환자, EGFR m- 환자, 및/또는 오시머티닙에 대한 내성이 발생한 환자의 폐암 치료를 위한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 있어서, 상기 폐암은 EGFR 돌연변이 (예컨대, L858R 돌연변이, 및/또는 T790M 돌연변이) 및/또는 MET amplification 돌연변이 등을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 화합물을 항암제와 병용하였을 때 상기 돌연변이를 포함하는 암세포 혹은 동물모델에 대해 우수한 항암 효과가 발휘되는 것을 확인하였다.
또한, 상기 유방암은 Hormone receptor(HR) 양성 유방암일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 유방암은 삼중음성유방암 (Triple negative breast cancer)일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 유방암은 BRCA1 돌연변이 (예컨대, 5382C 돌연변이)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 화합물을 항암제와 병용하였을 때 상기 돌연변이를 포함하는 암세포 혹은 동물모델에 대해 우수한 항암 효과가 발휘되는 것을 확인하였다.
또한, 상기 혈액암은 백혈병, 림프종, 다발성 골수종 등일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 일반식으로 표시되는 화합물을 포함하는, 항암제의 항암 효과 증진용 키트를 제공할 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 양태로서 본 발명은 (i) 상기 일반식으로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염; 및 (ii) 항암제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 키트를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 상기 화합물 또는 항암제 외에도 암의 예방 또는 치료에 통상적으로 필요한 다른 구성성분, 조성물, 용액, 장치 등을 제한 없이 포함할 수 있으며, 특히 본 발명에 따른 화합물의 적합한 사용 및 보관 등을 지시하는 설명서 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
상기 암의 예방 및/또는 치료 효과는 암세포의 성장을 억제하는 효과뿐 아니라, 이동(migration), 침습(invasion), 전이(metastasis) 등으로 인한 암의 악화를 억제하는 효과를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어, “개체”란 질병의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상을 의미한다. 예를 들어, 상기 개체는 인간, 또는 비-인간인 영장류, 생쥐, 개, 고양이, 말, 양 및 소를 포함하는 포유류일 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적 조성물로 제조하기 위하여 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및/또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있다.
본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여된다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시에 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 선택될 수 있다. 구체적인 예로, 상기 약학적 조성물은 0.001 내지 1000 mg/kg, 0.01 내지 100 mg/kg, 0.01 내지 10 mg/kg, 0.1 내지 10 mg/kg 또는 0.1 내지 1 mg/kg의 양을 1일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 따른 약학적 조성물의 유효량은 환자의 연령, 성별, 상태, 체중, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 질병종류, 병용되는 약물에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다. 일일 투여량은 하루 1회 내지 수회 나누어 투여할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실험 재료 및 방법
1. AQTGTGKT 아날로그 화합물의 합성
본 발명에 따른 13종의 AQTGTGKT 아날로그 화합물은 세원생명공학에 의뢰하여 합성하였으며, 1H NMR 및 UPLC-MS(ultraperformance liquid chromatography-mass spectrometry) 기법으로 분석하여 화학 구조를 확인하였다.
1.1. 반응 일반
모든 반응은 달리 언급되지 않는 한 추가 반응 없이 상업적으로 판매되는 물질 및 시약을 사용하여 수행하였다. 반응들은 실리카겔 플레이트(Keiselgel 60 F254, Merck) 및/또는 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 상의 박막 크로마토그래피(TLC)에 의해 모니터링 하였다. TLC 플레이트 상의 반점의 가시화는 UV 광에 의해 그리고 과망간산 칼륨 및/또는 닌하이드린에서 TLC 플레이트를 염색하고 히트건(heat gun)으로 탄화시킴으로써 달성되었다. 모든 생성물은 1H NMR 및/또는 UPLC-MS를 사용하여 특정하였다.
1.2. Boc/OBn-TG의 합성
먼저 작용기가 벤질로 보호된 TG를 하기의 반응식 1에 따라 합성하였다. 이하 각 반응식에서 화합물 하기에 병기한 아라비아 숫자(n)에 따라 화합물 n으로 지칭하기로 한다.
[반응식 1]
Figure pat00042
구체적으로, BocThr(OBn)OH (화합물 1; 25.0 g, 80.8 mmol, 1.0 당량) 및 NOSu (9.77 g, 84.8 mmol, 1.05 당량)를 다이클로로메탄 (150 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고 불활성 대기하에 두었다. 그 후, 상기 혼합물에 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸카보다이이미드 하이드로클로라이드 (16.3 g, 84.8 mmol, 1.05 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 20시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 NH4Cl(포화 수성)로 세척하고 상을 분리하였다. 유기층을 MgSO4상에서 건조시키고 감압하에 농축하여 생성물로서 담황색 오일 (35.7 g, >100% 수율, 정량 수율을 가정)의 화합물 2를 수득하였다.
상기 화합물 2 BocThr(OBn)OSu (32.8 g, 80.8 mmol, 1.0 당량)를 1,4-다이옥세인 (200 mL)에 용해시키고, 증류수 (100 mL) 중의 글라이신 나트륨 염 수화물 용액을 한번에 첨가하였다. 실온에서 6시간 동안 교반한 후, 혼합물을 에틸 아세테이트 및 시트르산(포화 수성)으로 분획하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과한 후 감압하에서 농축하였다. 조 물질을 물 (0.1% 포름산) 용리액 중 30-70% 아세토 나이트릴 (0.1% 포름산)으로 C18 (400 g) 컬럼에서 정제하였다. 원하는 분획을 합하고, 에틸 아세테이트 및 NaHCO3(포화 수성)으로 분획하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과한 후 감압하에 생성물로서 담황색 검 (21.9 g, 74% 수율)의 화합물 3을 수득하였다.
1.3. CBz/OBn/CO 2 Bn-KT의 합성
OH 작용기가 벤질로 보호된 KT를 하기의 반응식 2에 따라 합성하였다.
[반응식 2]
Figure pat00043
구체적으로, BocLys(CBz)OH (화합물 4; 27.0 g, 70.9 mmol, 1.0 당량) 및 NOSu (9.80 g, 85.1 mmol, 1.2 당량)를 다이클로로메탄 (128 mL)에 용해시켰다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고 불활성 대기하에 두었다. 그 후, 상기 혼합물에 1-(3-다이메틸아미노프로필)-3-에틸 카보다이이미드 하이드로 클로라이드 (16.3 g, 85.1 mmol, 1.05 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고 20시간 동안 교반하였다. 이이서 혼합물을 NH4Cl (포화 수성)로 세척하고 상을 분리하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고 감압하에 농축하여 생성물로서 옅은 황색 오일 (36.7 g, >100% 수율, 정량 수율로 가정)의 화합물 5를 수득하였다.
이어서, 상기 화합물 5 (BocLys(Cbz)OSu; 36.7 g, 70.9 mmol, 1.0 당량) 및 Thr(OBn)OBn.HCl (25.0 g, 74.4 mmol, 1.05 당량)을 실온에서 1,4-다이옥세인 (477 mL)에 용해시켰다. 상기 용액에 증류수 (326 mL) 중 NaHCO3 (6.85 g, 81.5 mmol, 1.15 당량)의 용액을 첨가하였다. 이 후 생성된 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고 10% 시트르산 (수성) 및 염수로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과한 후 감압하에서 농축하여 생성물로서 황색의 유성 고체 55.9 g (>100% 수율, 정량적 수율로 가정)의 화합물 6을 수득하였다.
마지막으로, 상기 화합물 6 (BocLys(Cbz)Thr(OBn)OBn; 55.9 g, 70.9 mmol, 1.00 당량)을 1,4-다이옥세인 (360 mL)에 용해시키고 1,4-다이옥세인 (177 mL) 중 4N HCl을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 그 후 NaHCO3의 포화 수용액을 pH 값이 8이 될 때까지 첨가하였다. 상기 용액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 생성된 유기 용액을 Na2SO4 상에서 건조시킨 후 여과한 다음 감압하에서 농축하여 생성물로서 황색 유성 고체(38.7 g, 97% 수율)의 화합물 7을 수득하였다.
1.4. CBz/OBn/OBn/CO 2 Bn-TGKT의 합성
상기 1.2. 및 1.3.에서 합성한 TG와 KT를 하기의 반응식 3에 따라 결합하여 TGKT를 합성하였다.
[반응식 3]
Figure pat00044
보다 구체적으로, 다이클로로메탄 (50 mL) 중 BocThr(OBn)GlyOH(화합물 3; 5.61 g, 15.3 mmol, 1.00 당량) 및 화합물 8(Lys(Cbz)Thr(OBn)OBn; 10.0 g, 15.3 mmol, 1.0 당량) 용액에, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (5.90 mL, 33.7 mmol, 2.2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 불활성 대기하에 교반하고 HATU (7.00 g, 18.4 mmol, 1.20 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 2시간 동안 교반한 다음, NH4Cl (포화 수성)으로 세척하고, 이어서 NaHCO3 (포화 수성)로 세척하였다. 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과한 후 감압하에 농축하여 생성물로서 옅은 주황색 오일성 고체 (25.0 g, >100% 수율, 정량 수율로 가정)의 화합물 9를 수득하였다.
상기 수득한 BocThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 9; 이전 단계로부터 취한 13.9 g, 15.3 mmol, 1.0 당량)를 질소하에 실온에서 1,4-다이옥세인 (150 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 1,4-다이옥세인 (20 mL) 중의 4N HCl을 첨가하였다. 상기 혼합물은 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압하에서 농축하고 물 (0.1% 포름산) 용리액 중 20% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산)을 사용하여 C18 (400 g) 컬럼에서 정제하였다. 원하는 분획을 합하고 동결 건조시켰다. 생성된 분말은 NaHCO3 (포화 수성) 및 다이클로로메탄에 용해시키고 15분 동안 교반하였다. 층을 분리시키고 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시킨 후 여과한 다음 감압하에 농축시켜 생성물로서 무색 검 (10.9 g, 88% 수율)의 화합물 10을 수득하였다.
1.5. CBz/OBn/OBn/OBn/CO 2 Bn-TGTGKT의 합성
상기 1.2. 및 1.4.에서 합성한 TG(화합물 3)와 TGKT(화합물 10)를 하기의 반응식 4에 따라 결합하여 벤질로 보호된 TGTGKT를 합성하였다.
[반응식 4]
Figure pat00045
보다 구체적으로, 다이클로로메탄 (100mL) 중의 BocThr(OBn)GlyOH (화합물 3; 5.10 g, 14.0 mmol, 1.05 당량) 및 BocThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn) OBn(화합물 10; 10.8 g, 13.3 mmol, 1.0 당량) 용액에 N,N-다이아이소프로필에틸 아민 (5.10 mL, 29.3 mmol, 2.2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 불활성 대기하에 교반하고 HATU (5.60 g, 14.7 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 2시간 동안 교반하고, NH4Cl(포화 수성) 및 NaHCO3(포화 수성)로 세척하였다. 유기층을 감압하에서 농축하여 생성물로서 담황색 검 (21.4 g, >100% 수율, 정량 수율을 가정)의 화합물 11을 수득하였다.
이어서, 상기 수득한 화합물 11 (BocThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr (OBn)OBn; 이전 단계에서 취한 15.4g, 13.3mmol, 1.00 당량)을 질소하의 실온에서 1,4-다이옥세인 (150 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 1,4-다이옥세인 (50 mL) 중 4N HCl을 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압하에서 농축하고 물 (0.1% 포름산) 용리액 중 20% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산)을 사용하여 C18 (120 g) 컬럼에서 정제하였다. 원하는 분획을 합하고, 절반의 부피로 농축한 후 NaHCO3 (포화 수성) 및 에틸 아세테이트로 분획하였다. 층을 분리하고 유기층을 Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 여과하고 감압하에 농축하여 생성물로서 회백색 고체 (14.6 g, >100% 수율, 정량 수율을 가정)의 화합물 12를 수득하였다.
1.6. CBz/OBn/OBn/OBn/CO 2 Bn-QTGTGKT의 합성
상기 1.5.에서 합성한 화합물 12(TGTGKT)에 하기 반응식 5에 따라 Q를 추가로 결합하여 화합물 14(QTGTGKT)를 합성하였다.
[반응식 5]
Figure pat00046
보다 구체적으로, 에틸 아세테이트 (150 mL) 및 N,N-다이메틸포름아마이드 (25 mL) 중 Thr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 12; 12.7 g, 12.0 mmol, 1.0 당량) 및 BocGlnOH (3.25 g, 13.2 mmol, 1.1 당량)의 용액에 N,N-다이아이소 프로필에틸아민 (4.60 mL, 26.4 mmol, 2.2 당량)을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 불활성 대기하에 교반하고 HATU (5.47 g, 14.4 mmol, 1.20 당량)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반한 다음, NH4Cl (포화 수성)로 세척하였다. 유기층을 다이클로로메탄으로 추가 추출하였다. 이어서 유기층을 합하고 감압하에 농축시켰다. 조 물질을 물 (0.1% 포름산) 중의 20-100% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배를 사용하여 400 g C18 컬럼으로 정제하였다. 원하는 분획을 합한 후, 에틸 아세테이트 및 NaHCO3 (포화 수성) 용액으로 분획하였다. 유기층을 농축시키고, 동결 건조 공정에 의해 잔류수를 제거하였다. 합한 분획으로 총 12.9 g (89% 총 수율)의 화합물 13을 수득하였다.
상기 수득한 화합물 13 (BocGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn) OBn; 7.00 g, 5.40 mmol, 1.00 당량)을 질소하에 실온에서 1,4-다이옥세인 (150 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 1,4-다이옥세인 (43.5 mL) 중 4N HCl을 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 20시간 동안 교반하였다. 혼합물을 감압하에서 농축하고 물/ 아세토나이트릴 (2/1) 용액을 사용하여 동결 건조시켰다. 최종적으로 담황색 분말 (6.36 g, 96% 수율)의 화합물 14를 분리하였다.
1.7. AQTGTGKT 아날로그의 합성
4-PhPh-AQTGTGKT를 제외한 나머지 6 종의 아날로그는 상기 반응식 5의 최종 생성물인 화합물 14 및 하기 반응식 6의 생성물인 화합물 17n을 하기 반응식 7에 따라 결합시켜 합성하였다.
[반응식 6]
Figure pat00047
[반응식 7]
Figure pat00048
상기 반응식 7에 따라 순도 90% 이상의 3-PhPh-AQTGTGKT 2.9 mg, 순도 89%의 4-MeOPh-AQTGTGKT 7.0 mg, 순도 95% 이상의 2-PhPh-AQTGTGKT 22.7 mg, 순도 90% 이상의 Ph-AQTGTGKT 23.2 mg, 및 순도 85%의 Naphthyl-AQTGTGKT 23.2 mg을 최종적으로 수득하였다.
이하, 각각의 아날로그 합성 과정에 대하여 구체적으로 설명한다.
1.7.1. 3-PhPh-AQTGTGKT의 합성
3-PhPh-AQTGTGKT(화합물 19-1)는 하기 반응식 8에 따라 수득한 화합물 17-1을 상기 화합물 14와 반응식 9에 따라 반응시켜 최종 목적 화합물인 3-PhPh-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 8]
Figure pat00049
보다 구체적으로, H-Ala-OBzl.HCl (388 mg, 1.80 mmol, 1.2 당량)을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 현탁시키고 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (653 μL, 3.75 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, HATU (855 mg, 2.25 mmol, 1.5 당량) 및 [1,1'-바이페닐]-3-카복실산 (297 mg, 1.50 mmol, 1 당량)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 염수로 세척하였다. 수득한 유기물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과한 후 감압하에 농축시켰다. 잔류물은 25 g 컬럼에서 헵테인 중의 2-40% 에틸 아세테이트 구배로 정제하여 무색 고체 (493 mg, 91% 수율)의 화합물 16-1 수득하였다.
이어서, 최소량의 물로 적신 10% Pd/C (49 mg)를 메탄올 (30 mL) 중의 화합물 16-1(3-PhPh-AlaOBn; 493 mg, 1.37 mmol) 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 수소 대기(벌룬)하에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물은 셀라이트 패드를 통해 여과시키고, 메탄올 및 에틸 아세테이트로 세척하였다. 수득한 여과액은 감압하에 농축시켜 무색 거품 (337 mg, 91% 수율)의 화합물 17-1을 수득하고, 이를 하기 반응식 9에 따라 화합물 14와 반응시켰다.
[반응식 9]
Figure pat00050
보다 구체적으로, N, N-다이아이소프로필에틸아민 (97.0 μL, 0.556 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메테인 (20 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz) Thr(OBn)OBn (화합물 14; 300 mg, 0.253 mmol, 1 당량) 및 3-PhPh-AlaOH (화합물 17-1; 68.0 mg, 0.253 mmol, 1 당량) 현탁액에 HATU (106 mg, 0.278 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 반응 혼합물을 NaHCO3 (포화 수성)로 세척하였다. 유기물을 감압하에서 농축하고 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 40-100% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 60g C18 컬럼으로 정제하여 동결 건조를 거친 후 무색 고체 (140 mg, 38% 수율)의 화합물 18-1을 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (85.0 mg)를 2M 염산(수성, 0.5 mL) 및 2-프로판올 (10 mL) 중의 3-PhPh-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-1; 85.0 mg, 59.1 μmol) 용액에 첨가하였다. 상기 혼합물을 수소 대기(벌룬)하에서 4.5시간 동안 교반한 후, 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축하고, 잔류물을 동결 건조하였다. 그 후 물 (0.1% 포름산) 중의 5-50% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산)을 사용하여 60 g C18 컬럼에서 물질을 정제하고, 동결 건조하여 무색 고체 (2.9 mg, 5% 수율)의 목적 화합물 19-1을 수득하였다.
화합물 19-1(3-PhPh-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ=8.01-7.99 (m, 1H), 7.86-7.82 (m, 1H), 7.75-7.66 (m, 3H), 7.55 (t, J 7.7 Hz, 1H), 7.49 (t, J 7.5 Hz, 2H), 7.43-7.38 (m, 1H), 4.48-4.24 (m, 5H), 4.23-4.12 (m, 3H), 4.09 (d, J 3.8 Hz, 1H), 4.00- 3.96 (m, 2H), 3.88 (s, 2H), 2.90 (t, J 7.4Hz, 2H), 2.35 (t, J 7.5Hz, 2H), 2.15-2.06 (m, 1H), 2.03-1.91 (m , 1H), 1.84-1.72 (m, 1H), 1.70-1.52 (m, 3H), 1.45 (d, J 7.2Hz, 3H), 1.40-1.24 (m, 2H), 1.15-1.05 (m, 9H) , 16 exchangeable protons not visible.
1.7.2. 4-MeOPh-AQTGTGKT의 합성
4-MeOPh-AQTGTGKT(화합물 19-2)는 하기 반응식 10에 따라 수득한 화합물 17-2를 상기 화합물 14와 반응식 11에 따라 반응시켜 최종 목적 화합물인 4-MeOPh-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 10]
Figure pat00051
보다 구체적으로, H-Ala-OBzl.HCl (425 mg, 1.97 mmol, 1.2 당량)을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 현탁시키고 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (715 μL, 4.11 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, HATU (937mg, 2.46mmol, 1.5 당량) 및 4-메톡시벤조산 (250mg, 1.64mmol, 1 당량)을 첨가하고 상기 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 염수로 세척하였다. 유기물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과한 후 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 헵테인 중의 15-50% 에틸 아세테이트 구배로 25 g 컬럼 상에서 정제하여 무색 고체 (360 mg, 70% 수율)의 화합물 16-2를 수득하였다.
이어서, 최소량의 물로 적신 10% Pd/C (18 mg)를 메탄올 (15 mL) 중의 4-OMePh-AlaOBn (화합물 16-2; 180 mg, 0.574 mmol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬)하에서 110시간 동안 교반하였다. 그 후 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 메탄올로 세척하였다. 수득한 여과액은 감압하에 농축시켜 무색 오일 (128 mg, 100% 수율)의 화합물 17-2를 수득하고, 이를 하기 반응식 11에 따라 화합물 14와 반응시켰다.
[반응식 11]
Figure pat00052
보다 구체적으로, N, N-다이아이소프로필에틸아민 (63.0 μL, 0.360 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메테인 (20 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys (Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 14; 200 mg, 0.164 mmol, 1 당량) 및 4-OMePh-AlaOH (화합물 17-2; 36.6 mg, 0.164 mmol, 1 당량)의 현탁액에 HATU (74.5 mg, 0.196 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 64시간 동안 교반하고, 상기 반응 혼합물을 메탄올로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 물로 세척하였다. 유기물을 감압하에서 농축하고 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 50-95% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 60g C18 컬럼에서 정제하여 동결 건조를 거친 후 무색 고체 (113 mg, 50% 수율)의 화합물 18-2를 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (100 mg)를 2M 염산(수성, 1.0 mL) 및 2-프로판올 (20 mL) 중의 4-OMePh-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-2; 108 mg, 77.6 μmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축시키고, 잔류물을 물에 용해시킨 다음 동결 건조시켰다. 상기 건조된 물질을 물 (0.1% 포름산) 중의 5-30% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배를 사용하여 30g C18 컬럼에서 정제하고, 동결 건조하여 무색 고체 (7.0 mg, 10% 수율)의 화합물 19-2를 수득하였다.
화합물 19-2(4-MeOPh-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ=7.76-7.71 (m, 2H), 7.02-6.98 (m, 2H), 4.42-4.28 (m, 5H), 4.24-4.13 (m, 3H), 4.09 (d, J 3.9 Hz, 1H), 4.01-3.96 (m, 2H), 3.89 (s, 2H), 3.81 (s, 3H), 2.91 (t, J 7.4 Hz, 2H), 2.34 (t, J 7.6 Hz, 2H), 2.14-2.06 (m, 1H), 2.00-1.91 (m, 1H), 1.85-1.75 (m, 1H), 1.71-1.54 (m, 3H), 1.42 (d, J 7.2 Hz, 3H), 1.40-1.25 (m, 3H), 1.16-1.07 (m, 8H), 16 exchangeable protons not visible.
1.7.3. 2-PhPh-AQTGTGKT의 합성
2-PhPh-AQTGTGKT(화합물 19-3)는 하기 반응식 12에 따라 수득한 화합물 17-3을 상기 화합물 14와 반응식 13에 따라 반응시켜 최종 목적 화합물인 2-PhPh-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 12]
Figure pat00053
보다 구체적으로, H-Ala-OBzl.HCl (388 mg, 1.80 mmol, 1.2 당량)을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 현탁시키고 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (653 μL, 3.75 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, HATU (855 mg, 2.25 mmol, 1.5 당량) 및 [1,1'-바이페닐]-2-카복실산 (297 mg, 1.50 mmol, 1 당량)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 염수로 세척 하였다. 수득한 유기물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과한 후 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 헵테인 중의 2-40% 에틸 아세테이트 구배로 25 g 컬럼에서 정제하여 무색 오일 (416 mg, 77% 수율)의 화합물 16-3을 수득하였다.
이어서, 최소량의 물로 적신 10% Pd/C (42 mg)를 메탄올 (20 mL) 중 2-PhPh-AlaOBn (화합물 16-3; 416 mg, 1.16 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬)하에서 18시간 동안 교반하였다. 그 후 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 메탄올로 세척하였다. 수득한 여과액은 감압하에 농축시켜 무색 오일 (308 mg, 99% 수율)의 화합물 17-3을 수득하고, 이를 하기 반응식 13에 따라 화합물 14와 반응시켰다.
[반응식 13]
Figure pat00054
보다 구체적으로, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (63.0 μL, 0.360 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메테인 (20 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz) Thr(OBn)OBn (화합물 14; 200 mg, 0.164 mmol, 1 당량) 및 2-PhPh-AlaOH (화합물 17-3; 44.2 mg, 0.164 mmol, 1 당량)의 현탁액에 HATU (74.5 mg, 0.196 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 64시간 동안 교반하고, 상기 반응 혼합물을 메탄올로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 물로 세척하였다. 유기층을 감압하에 농축하고 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 50-95% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 60 g C18 컬럼에서 정제하여 동결 건조를 거친 후 무색 고체 (115 mg, 49% 수율)의 화합물 18-3을 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (100 mg)를 2M 염산(수성, 1.0 mL) 및 2-프로판올 (20 mL) 중의 2-PhPh-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-3; 110 mg, 76.5 μmol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축시키고, 잔류물을 물에 용해시킨 다음 동결 건조하였다. 상기 건조된 물질을 물 (0.1% 포름산) 중의 5-50% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 30 g C18 컬럼에서 정제하고, 동결 건조하여 무색 고체 (22.7 mg, 31% 수율)의 화합물 19-3을 수득하였다.
화합물 19-3(2-PhPh-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ=7.56-7.48 (m, 2H), 7.44-7.33 (m, 7H), 4.38-4.26 (m, 4H), 4.25-4.13 (m, 4H), 4.08 (d, J 3.9 Hz, 1H), 4.00-3.96 (m, 2H), 3.89 (s, 2H), 2.91 (t, J 7.5 Hz, 2H), 2.25 (t, J 7.5 Hz, 2H), 2.09-2.01 (m, 1H), 1.93-1.77 (m, 2H), 1.72-1.56 (m, 3H), 1.41-1.29 (m, 2H), 1.18 (d, J 7.2 Hz, 3H), 1.12 (d, J 5.6 Hz, 6H), 1.08 (d, J 6.4 Hz, 3H), 16 exchangeable protons not visible.
1.7.4. Ph-AQTGTGKT의 합성
Ph-AQTGTGKT(화합물 19-4)는 하기 반응식 14에 따라 수득한 화합물 17-4을 상기 화합물 14와 반응식 15에 따라 반응시켜 최종 목적 화합물인 Ph-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 14]
Figure pat00055
보다 구체적으로, H-Ala-OBzl.HCl (388 mg, 1.80 mmol, 1.2 당량)을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 현탁시키고 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (653 μL, 3.75 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 실온에서 5 분 동안 교반한 후, HATU (855 mg, 2.25 mmol, 1.5 당량) 및 벤조산 (183 mg, 1.50 mmol, 1 당량)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 염수로 세척하였다. 수득한 유기물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과한 후 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 헵테인 중의 2-50% 에틸 아세테이트 구배로 25 g 컬럼에서 정제하여 무색 오일 (375 mg, 88% 수율)의 화합물 16-4를 수득하였다.
이어서, 최소량의 물로 적신 10% Pd/C (38 mg)를 메탄올 (30 mL) 중 Ph-Ala-OBn (화합물 16-4; 375 mg, 1.32 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬)하에서 4시간 동안 교반하였다. 그 후 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 메탄올로 세척하였다. 수득한 여과액은 감압하에 농축시켜 무색 유리 (glass; 254 mg, 99% 수율)의 화합물 17-4를 수득하고, 이를 하기 반응식 15에 따라 화합물 14와 반응시켰다.
[반응식 15]
Figure pat00056
보다 구체적으로, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (97.0 μL, 0.556 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메탄 (20 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr (OBn)OBn (화합물 14; 300 mg, 0.253 mmol, 1 당량) 및 Ph-Ala-OH (화합물 17-4; 49.0 mg, 0.253 mmol, 1)의 현탁액에 HATU (106 mg, 0.278 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 상기 반응 혼합물을 NaHCO3 (포화 수성)로 세척하였다. 유기물을 감압하에 농축하고 수득한 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 40-100% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 60 g C18 컬럼에서 정제하여 동결 건조를 거친 후 무색 고체 (200 mg, 58%)의 화합물 18-4를 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (110 mg)를 2M 염산(수성, 1.0 mL) 및 2-프로판올 (20 mL) 중의 Ph-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-4; 110 mg, 80.8 μmol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 18시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축시키고, 잔류물을 물에 용해시킨 다음 동결 건조시켰다. 상기 건조된 물질을 물 (0.1% 포름산) 중의 5-50% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배를 사용하여 60 g C18 컬럼에서 정제하고, 동결 건조하여 무색 고체 (23.2 mg, 33% 수율)의 화합물 19-4를 수득하였다.
화합물 19-4(Ph-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ=7.74-7.70 (m, 2H), 7.58-7.53 (m, 1H), 7.48-7.43 (m, 2H), 4.45-4.34 (m, 3H), 4.32-4.27 (m, 2H), 4.25-4.14 (m, 3H), 4.11 (d, J 3.8 Hz, 1H), 4.00-3.96 (m, 2H), 3.89 (s, 2H), 2.91 (t, J 7.4 Hz, 2H), 2.34 (t, J 7.6 Hz, 2H), 2.14-2.06 (m, 1H), 2.01-1.91 (m, 1H), 1.85-1.76 (m, 1H), 1.71-1.56 (m, 3H), 1.43 (d, J 7.3 Hz, 3H), 1.40-1.30 (m, 2H), 1.16-1.07 (m, 9H), 16 exchangeable protons not visible.
1.7.5. Naphthyl-AQTGTGKT의 합성
Naphthyl-AQTGTGKT(화합물 19-5)는 하기 반응식 16에 따라 수득한 화합물 17-5를 상기 화합물 14와 반응식 17에 따라 반응시켜 최종 목적 화합물인 Naphthyl-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 16]
Figure pat00057
보다 구체적으로, H-Ala-OBzl.HCl (388 mg, 1.80 mmol, 1.2 당량)을 에틸 아세테이트 (10 mL)에 현탁시키고 N,N-다이아이소프로필에틸아민 (653 μL, 3.75 mmol, 2.5 당량)을 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 교반한 후, HATU (855 mg, 2.25 mmol, 1.5 당량) 및 2-나프토산 (258 mg, 1.50 mmol, 1 당량)을 첨가하고 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 상기 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석한 다음 NH4Cl (포화 수성), NaHCO3 (포화 수성) 및 염수로 세척하였다. 수득한 유기물을 건조시키고 (Na2SO4), 여과한 후 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 헵테인 중의 2-40% 에틸 아세테이트 구배로 25 g 컬럼에서 정제하여 무색 고체 (385 mg, 77% 수율)의 화합물 16-5를 수득하였다.
이어서, 최소량의 물로 적신 10% Pd/C (39 mg)를 메탄올 (20 mL) 중 2-Naphthyl-AlaOBn (화합물 16-5; 385 mg, 1.15 mmol)의 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 4시간 동안 교반하였다. 그 후 상기 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 메탄올로 세척하였다. 수득한 여과액은 감압하에 농축시켜 무색 고체 (266 mg, 95% 수율)의 화합물 17-5를 수득하고, 이를 하기 반응식 17에 따라 화합물 14와 반응시켰다.
[반응식 17]
Figure pat00058
보다 구체적으로, N,N-다이아이소프로필에틸아민 (97.0 μL, 0.556 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메테인 (20 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz) Thr(OBn)OBn (화합물 14; 300 mg, 0.253 mmol, 1 당량) 및 2-Naphthyl-Ala-OH (화합물 17-5; 61.0 mg, 0.253 mmol, 1 당량) 현탁액에 HATU (106 mg, 0.278 mmol, 1.1 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 이어서 (포화 수성) NaHCO3로 세척하였다. 수득한 유기층을 감압하에 농축하고 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 40-100% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 60 g C18 컬럼에서 정제하여 동결 건조를 거친 후 무색 고체 (230 mg, 64% 수율)의 화합물 18-5를 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (101 mg)를 2M 염산(수성, 1.0 mL) 및 2-프로판올 (20 mL) 중의 2-Naphthyl-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-5; 101 mg, 71.5 μmol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 3시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축시키고, 잔류물을 물에 용해시킨 다음 동결 건조시켰다. 상기 건조된 물질을 물 (0.1% 포름산) 중의 5-40% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배로 30 g C18 컬럼상에서 정제하고, 동결 건조하여 무색 고체 (23.2 mg, 33% 수율)의 화합물 19-5를 수득하였다.
화합물 19-5(Naphthyl-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ=8.32 (s, 1H), 8.01-7.90 (m, 3H), 7.79-7.73 (m, 1H), 7.64-7.55 (m, 2H), 4.51-3.70 (m, 13H), 2.96-2.81 (m, 2H), 2.39-2.30 (m, 2H), 2.18-2.04 (m, 1H), 2.03-1.93 (m, 1H), 1.85-1.72 (m, 1H), 1.71-1.53 (m, 3H), 1.50-1.43 (m, 3H), 1.39-1.24 (m, 2H), 1.19-1.04 (m, 9H), 16 exchangeable protons not visible.
1.8. Ac-AQTGTGKT의 합성
Ac-AQTGTGKT(화합물 19-6)는 하기 반응식 18에 따라 수행되어 최종 목적 화합물인 Ac-AQTGTGKT를 합성하였다.
[반응식 18]
Figure pat00059
보다 구체적으로, N, N-다이아이소프로필에틸아민 (94.0 μL, 0.540 mmol, 2.2 당량) 및 다이클로로메테인 (30 mL) 중의 GlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz) Thr(OBn)OBn (화합물 14; 300 mg, 0.245 mmol, 1 당량) 및 Ac-Ala-OH (32.1 mg, 0.245 mmol, 1 당량)의 현탁액에 HATU (112 mg, 0.294 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 14시간 동안 교반하고, 상기 반응 혼합물을 (포화 수성) NH4Cl, NaHCO3 및 물로 세척하였다. 유기층을 감압하에 농축하고, 잔류물을 물 (0.1% 포름산) 중의 50-95% 아세토나이트릴 (0.1% 포름산) 구배에서 60 g C18 컬럼으로 정제하였다. 원하는 분획을 합하고 동결 건조하여 무색 고체 (104 mg, 33% 수율)의 화합물 18-6을 수득하였다.
이어서, 10% Pd/C (10 mg)를 2M 염산(수성, 0.19 mL) 및 2-프로판올 (5 mL) 중의 Ac-AlaGlnThr(OBn)GlyThr(OBn)GlyLys(Cbz)Thr(OBn)OBn (화합물 18-6; 33 mg, 25 μmol) 용액에 첨가하였다. 혼합물을 수소 대기(벌룬) 하에서 14시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 0.45 ㎛ 시린지 필터를 통해 여과하였다. 수득한 여과액을 감압하에 농축시키고, 물에 용해시킨 다음 동결 건조하였다. 상기 건조된 물질을 메탄올 중 0.5M 암모니아로 용리시키면서 500 mg SCX-2 카트리지에서 정제하였다. 원하는 분획을 합하고 감압하에 농축한 다음 동결 건조하여 무색 고체 (7.6 mg, 37% 수율)의 화합물 19-6을 수득하였다.
화합물 19-6(Ac-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ=4.40-4.33 (m, 2H), 4.32-4.27 (m, 2H), 4.24-4.12 (m, 4H), 4.08 (d, J 4.0 Hz, 1H), 4.03-3.88 (m, 4H), 2.92 (t, J 7.2 Hz, 2H), 2.32 (t, J 7.8 Hz, 2H), 2.15-2.02 (m, 1H), 1.99-1.88 (m, 4H), 1.86-1.76 (m, 1H), 1.74-1.55 (m, 3H), 1.45-1.31 (m, 2H), 1.29 (t, J 7.4 Hz, 2H), 1.20-1.06 (m, 10H), 16 exchangeable protons not visible.
1.9. 4-PhPh-AQTGTGKT의 합성
1.9.1. QTGTGKT 중간체의 합성
4-PhPh-AQTGTGKT 합성을 위한 중간체 QTGTGKT는 하기 반응식 19 내지 반응식 23에 따라 합성하였다:
[반응식 19]
Figure pat00060
[반응식 20]
Figure pat00061
[반응식 21]
Figure pat00062
[반응식 22]
Figure pat00063
[반응식 23]
Figure pat00064
상기 반응식 19 내지 반응식 23은 상기 반응식 1 내지 반응식 5와 벤질 보호기 유무 여부를 제외하고는 거의 유사한 과정으로서, 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
1.9.2. 4-PhPh-AQTGTGKT의 합성
상기 반응식 23에서 수득한 화합물 31은 하기 반응식 24에서 합성된 알라닌 유도체와 반응식 25에 따라 결합되어 최종 생성물 4-PhPh-AQTGTGKT를 수득하였다.
[반응식 24]
Figure pat00065
[반응식 25]
Figure pat00066
상기 반응식 24 및 반응식 25 또한 전술한 반응식과 거의 유사한 과정에 의해 진행되었는바 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 최종적으로 무색 고체 (583 mg, 68% 수율)의 화합물 36을 수득하였다.
화합물 36(4-PhPh-AQTGTGKT)의 1H NMR 데이터는 다음과 같이 측정되었다:
1H NMR (400 MHz; D2O): δ=7.85 (d, J 8.8 Hz, 2H), 7.77 (d, J 8.8 Hz, 2H), 7.70 (d, J 7.2 Hz, 2H), 7.49 (t, J 7.2 Hz, 2H), 7.42 (t, J 7.1 Hz, 1H), 4.34-4.04 (m, 6H), 4.07 (d, J 3.6 Hz, 1H), 3.93 (d, J 2.0 Hz, 2H), 2.82 (t, J 7.0 Hz, 2H), 1.82-1.67 (m, 1H), 1.66-1.55 (m, 1H), 1.54-1.44 (m, 2H), 1.37-1.22 (m, 2H), 1.18 (d, J 6.4 Hz, 3H), 1.06 (t, J 6.5 Hz, 3H), 10 exchangeable protons not visible.
1.10. 화합물 확인
상기 제법에 의해 수득한 AQTGTGKT 아날로그 13종은 1H NMR 및 UPLC-MS(ultraperformance liquid chromatography-mass spectrometry) 기법으로 분석하여 화학 구조를 확인하였다 (도 16 내지 22).
상기 13종의 AQTGTGKT 아날로그 화합물에 대한 구조식은 하기 표 1에 나타내었다.
이름 구조식
4-PhPh-AQTGTGKT
Figure pat00067
Ac(Acyl)-AQTGTGKT
Figure pat00068
3-PhPh-AQTGTGKT
Figure pat00069
4-MeOPh-AQTGTGKT
Figure pat00070
2-PhPh-AQTGTGKT
Figure pat00071
Ph-AQTGTGKT
Figure pat00072
Naphthyl-AQTGTGKT
Figure pat00073
2,4,6-MePh-AQTGTGKT
Figure pat00074
1-MeOCF3Ph-AQTGTGKT
Figure pat00075
4-MorPh-AQTGTGKT
Figure pat00076
PhMeMeC-AQTGTGKT
Figure pat00077
4-CF3Ph-AQTGTGKT
Figure pat00078
Ph3C-AQTGTGKT
Figure pat00079
2. MTT (tetrazolium) assay
본 발명에 따른 화합물을 암 세포주에 처리하고, 동시 또는 4시간 후 표적항암제 (오시머티닙 또는 올라파립) 또는 화학항암제 (알림타 또는 시스플라틴)을 첨가하여 MTT assay를 통해 세포의 증식 정도로 병용효과를 측정하였다. 구체적으로, 96-well 플레이트에 각 well 당 2 × 103/100 μl 세포를 분주하고, 24시간 동안 배양한 후 본 발명에 따른 화합물을 도입하였으며, 4시간 경과 후 각각의 암 세포에 항암제를 처리하였다. 화합물 및 항암제의 처리 농도 및 처리 시간은 실시예에 구체적으로 기재하였다. 화합물 및 항암제의 처리를 마친 후, CellTiter-96®(Promega Co., 미국) 시약을 각 well 당 10 μl씩 첨가하고 5% CO2, 37℃ 환경에서 반응시켰다. 3시간 경과 후 분광광도계(spectrophotometer; SPECTROstarNano, BMG)를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
3. CDX(Cell line-derived xenograft) 모델 제작
(1) H820 세포주를 이용한 폐암 동물모델 제작
H820 세포를 5 × 106 cells/mouse의 농도로 마트리겔(matrigel)과 1:1 비율로 혼합하여 각각 200 μl씩 마우스의 옆구리에 피하주사로 1회 접종하였다. 접종 완료 후, 형성된 종양의 부피가 70 내지 130 mm3에 도달한 것을 확인한 다음 무작위 군 분리를 실시하였다. 시험물질은 2일 간격으로 7회 미정맥투여 및 경구투여 하였다.
(2) H1975 세포주를 이용한 폐암 동물모델 제작
H1975 세포를 5 × 106 cells/mouse의 농도로 마트리겔(matrigel)과 1:1 비율로 혼합하여 각각 200μl씩 마우스의 옆구리에 피하주사로 1회 접종하였다. 접종 후 형성된 종양의 부피가 70 내지 130 mm3 에 도달한 것을 확인한 다음 무작위 군 분리를 실시하였다. 군 분리 후 오시머티닙(Osimertinib)을 매일 경구투여 하였고, 종양의 성장이 억제된 후 다시 재성장하는 시점을 확인하고 시험물질과 병용투여를 시작하였다. 시험물질은 2일 간격으로 7회 미정맥투여 하였다.
(3) CDX 동물모델을 이용한 항암제에 대한 내성 발현 전후의 효능 평가
항암제에 대한 내성이 발현되기 전 또는 후의 본 발명의 화합물 및 항암제의 병용 효과를 확인하기 위하여, H1975 세포주를 이용한 CDX 폐암 동물모델을 별도로 제작했다.
구체적으로, 항암제에 대한 내성 발현 전의 본 발명의 화합물 및 항암제의 병용 효과를 확인하기 위한 폐암 동물모델은 다음과 같은 방법으로 제작했다. H1975 세포를 4 주령 female BALB/c nude mouse에 5×106 cells/mouse의 농도로 마트리겔과 1:1 비율로 혼합하여 200 ㎕씩 마우스의 옆구리에 피하주사로 1회 접종하였다. 접종 후 형성된 종양의 부피가 70 내지 300㎣의 크기가 되었을 때 오시머티닙을 5mpk로 매일 경구투여 했다. 오시머티닙의 투여 시작일을 1일로 설정하고 주 2회 종양의 부피를 측정하였다. 오시머티닙 투여 50일 째부터 개체들을 Vehicle; 및 3-PhPh-AQTGTGKT 10mg/kg 2개의 그룹으로 군 분리하여 오시머티닙 내성 발현 전에 3-PhPh-AQTGTGKT의 효능평가를 실시했다. Vehicle 그룹은 오시머티닙의 매일 경구투여와 2일 간격의 vehicle 미정맥 투여를 진행하였으며, 오시머티닙 및 3-PhPh-AQTGTGKT 병용투여 그룹은 10mg/kg 농도로 2일 간격 7회 미정맥 투여하면서 종양의 크기를 주 2회 측정했다.
다음으로, 항암제에 대한 내성 발현 후의 본 발명의 화합물 및 항암제의 병용 효과를 확인하기 위한 폐암 동물모델은 다음과 같은 방법으로 제작했다. H1975 세포를 5×106 cells/mouse의 농도로 matrigel과 1:1 비율로 혼합하여 200 ㎕씩 4 주령 female BALB/c nude mouse의 옆구리에 피하주사로 1회 접종하였다. 접종 완료 후, 형성된 종양의 부피가 70 내지 300㎣의 크기가 되었을 때 오시머티닙을 5mpk로 매일 경구투여 하였다. 오시머티닙 투여 시작일을 1일로 설정하고 주 2회 종양의 부피를 측정하며 오시머티닙 투여 54일 째부터 종양이 다시 커지는 경향이 관찰되어 오시머티닙에 의해 줄어들었던 종양이 이전 측정일 대비 50% 이상의 성장율을 나타내어 약물 내성을 획득하였다고 판단하였다. 54일간 오시머티닙을 매일 경구투여 하였던 개체들을 Vehicle; 3-PhPh-AQTGTGKT 5mg/kg 투여군; 및 10mg/kg 투여군의 3개의 그룹으로 군 분리하여 오시머티닙에 대한 내성 발현 후 3-PhPh-AQTGTGKT의 효능평가를 실시하였다. Vehicle 그룹은 오시머티닙의 매일 경구투여 및 vehicle의 2일 간격 미정맥 투여를 진행하고, 오시머티닙 및 3-PhPh-AQTGTGKT 병용투여 그룹은 5mg/kg 또는 10mg/kg 농도로 2일 간격으로 7회 미정맥 투여하면서 종양의 크기를 주 2회 측정하였다.
(4) HCC1806 세포주를 이용한 유방암 동물모델 제작
HCC1806 세포를 4 주령 female BALB/c nude mouse에 5×106 cells/mouse의 농도로 matrigel과 1:1의 비율로 혼합하여 200 ㎕씩 마우스의 옆구리에 피하주사로 1회 접종하였다. 접종 완료 후 형성된 종양의 부피가 150 내지 250 ㎣의 크기가 되었을 때 무작위 군 분리를 실시하였다. 무작위 군 분리 후 AQTGTGKT, 3-PhPh-AQTGTGKT, 또는 Ph-AQTGTGKT를 2일 간격으로 9회 미정맥 투여하고, 시스플라틴은 7일간격 3회 복강내 투여하면서 종양의 단축과 장축을 측정하여 부피를 산출하여 종양의 성장곡선을 나타냈다.
5. EGFR L858R 돌연변이를 포함하는 PDX(Patient-derived xenograft) 모델 제작
폐암 환자의 수술 조직 30례에 대하여 병리과 전문의의 육안 검사 및 종양 부위 확인 과정이 완료된 후, 50 ml 튜브에 HBSS media에 종양 조직이 담긴 상태로 제공받아 24시간 이내에 NOD/SCID 마우스에 이식하였다. Zoletil (Virbac S.A.) : Rompun (Bayer) : 멸균 증류수의 비율을 1:1:8로 해서 마취를 시킨 후, 3 mm3의 크기 종양 조직을 마우스의 피하(subcutaneous, S.C)에 이식하였다 (Passage 0, P0). 이식 후 조직 volume이 500 mm3 크기로 자라면 성공 예로 간주하고 조직을 적출하였다 (Passage 1, P1). 적출된 조직은 BALB/c nude 마우스에 같은 방법으로 이식하였으며, 종양이 자라면 순차적으로 이식하였다 (P2 내지 P5). 계대 이식 후 남은 조직은 3 mm3의 크기로 4 조각씩 절단하여 cryo-tube에 동결보존 배지 (FBS:DMSO 비율= 9:1)와 함께 넣어 LN2 tank에 보관하였으며, 실험할 때 37℃에서 해동하여 사용했다. 치료 반응성 실험에 사용되는 마우스의 경우, 먼저 동결조직을 37℃에서 해동하여 준비한 다음, 마우스 2마리 옆구리에 이식하고, 이식 편 종양이 300 내지 500 mm3의 크기로 성장하면 실험에 사용할 수 있도록 마리 수를 맞추어서 피하에 이식하였다. 종양 조직 이식 후 tumor volume이 300~350 mm3에 도달한 것을 확하고, 무작위 군 분리하였다. 레이저티닙(Lazertinib) 및 본 발명의 화합물의 병용 효과를 확인하는 실험에서, 레이저티닙은 10mpk의 농도로 매일 경구투여하고 3-PhPh-AQTGTGKT은 10mpk의 농도로 미 정맥 투여하여 종양의 성장 곡선을 분석하였다. 또한, 오시머티닙(Osimertinib) 및 본 발명의 화합물의 병용 효과를 확인하는 실험에서는 오시머티닙을 5mpk의 농도로 매일 경구투여하고 3-PhPh-AQTGTGKT은 10mpk의 농도로 미 정맥 투여하여 종양의 성장 곡선을 분석하였다.
5. 면역화학염색(IHC)
파라핀에 포매된 조직을 슬라이드에 4 μm 두께로 잘라 붙인 다음, 잘 건조한 후 IHC 실험 방법을 수행하였다. 각 슬라이드를 탈파라핀화한 후, 시트르산염 버퍼(citrate buffer; pH 6.0)를 사용하여 내재성 효소를 제거하였다. 이어서, P-Beclin1 항체를 1:100으로 희석하여 4℃에서 15시간 동안 처리하였다. TBST 세척 완충용액으로 4번 반복하여 씻어 준 다음 2차 항체 반응을 위하여 rabbit HRP를 처리하고 실온에서 30분 동안 반응시켰다. 항체 반응을 위한 기질을 넣어주어 발색이 나타나면 슬라이드를 씻어 준 후 봉입하였고, 슬라이드 스캔 후 결과를 판독하였다.
실시예 1: 폐암 세포에서 AQTGTGKT 또는 이의 아날로그의 표적/화학항암제 병용에 따른 항암 효과
1.1. 폐암 세포주 H1975에서의 병용 효과
(1) H1975에서의 본 발명의 화합물 및 표적항암제의 병용효과 확인
상기 “실험 재료 및 방법”에서 기술한 MTT assay 방법에 따라 폐암 세포주 H1975에서 AQTGTGKT 또는 이의 아날로그들의 항암제 병용에 따른 항암 효과를 확인하였다.
먼저, 표적항암제인 오시머티닙 (Osimertinib)과의 병용효과를 확인하였다. H1975에 3-PhPh-AQTGTGKT를 25 μM 농도로 처리하고, 4시간 후 오시머티닙을 1.25 μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 68시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다. 그 결과 도 1a에 나타난 바와 같이, 3-PhPh-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control; 미처리 대조군, 이하 동일)과 비교하여 세포의 증식이 약 10% 감소하였으며, 오시머티닙을 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 19% 감소하였다. 반면, 3-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙을 병용 처리한 경우에는 약 30%의 세포 증식 억제 효과를 보였다.
다음으로, H1975에 4-PhPh-AQTGTGKT를 2 μM 농도로 처리하고, 동시에 오시머티닙을 1 μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 48시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다. 그 결과, 4-PhPh-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 12% 감소하였으며, 오시머티닙을 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 5% 감소하였다. 반면, 4-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙을 병용 처리한 경우에는 약 24%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 1b).
다음으로, H1975에 Ac-AQTGTGKT를 10 μM 농도로 처리하고, 동시에 오시머티닙을 0.5 μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 48시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다. 그 결과, Ac-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 14% 감소하였으며, 오시머티닙을 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 12% 감소하였다. 반면, Ac-AQTGTGKT와 오시머티닙을 병용 처리한 경우에는 약 26%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 1c).
또한, H1975에 4-MeOPh-AQTGTGKT를 10 μM 농도로 처리하고, 동시에 표적항암제인 오시머티닙을 0.5 μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 48시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다. 그 결과, 4-MeOPh-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 6% 감소하였으며, 오시머티닙을 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 21% 감소하였다. 반면, 4-MeOPh-AQTGTGKT와 오시머티닙을 병용 처리한 경우에는 약 27%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 1d).
추가로, H1975에 2-PhPh-AQTGTGKT, Ph-AQTGTGKT, 또는 Naphtyl-AQTGTGKT를 10 μM 농도로 처리하고, 동시에 표적 항암제인 오시머티닙을 0.5 μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 24시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
그 결과, 2-PhPh-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 17% 감소하였으며, 오시머티닙을 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 약 18% 감소하였다. 반면, 2-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙을 병용 처리한 경우에는 28%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 1e).
아울러, Ph-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 17% 감소하였으며, 오시머티닙을 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 약 19% 감소하였다. 반면, ph-AQTGTGKT와 오시머티닙을 병용 처리한 경우에는 31%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 1f).
나아가, Naphtyl-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 19% 감소하였으며, 오시머티닙을 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 약 19% 감소하였다. 반면, Naphtyl-AQTGTGKT와 오시머티닙을 병용 처리한 경우에는 27%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 1g).
추가로, H1975/OR에 3-PhPh-AQTGTGKT를 5 μM 농도로 처리하고, 4시간 후에 표적항암제인 오시머티닙을 2.5 μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 68시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다. 그 결과 도 1h에 나타난 바와 같이, 3-PhPh-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 17% 감소하였으며, 오시머티닙을 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 7% 감소하였다. 반면, 3-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙을 병용 처리한 경우에는 약 30%의 세포 증식 억제 효과를 보였다.
(2) H1975에서의 본 발명의 화합물 및 화학항암제의 병용효과 확인
다음으로, 화학항암제인 알림타 (Alimta; Pemetrexed)와의 병용효과를 확인하였다. 마찬가지로 상기 “실험 재료 및 방법”에서 기술한 MTT assay 방법에 따라 폐암 세포주 H1975에 4-PhPh-AQTGTGKT를 2 μM 농도로 처리하고, 동시에 화학항암제인 알림타를 0.2 μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 48시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다. 그 결과 도 2a에 나타난 바와 같이, 4-PhPh-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 9% 감소하였으며, 알림타를 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 6% 감소하였다. 반면, 4-PhPh-AQTGTGKT와 알림타를 병용 처리한 경우에는 약 22%의 세포 증식 억제 효과를 보였다.
또한, H1975/OR에 3-PhPh-AQTGTGKT를 5 μM 농도로 처리하고, 4시간 후에 화학항암제인 알림타를 0.1 μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 72시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다. 그 결과 도 2b에 나타난 바와 같이, 3-PhPh-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 6.5% 감소하였으며, 알림타를 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 8.3% 감소하였다. 반면, 3-PhPh-AQTGTGKT와 알림타를 병용 처리한 경우에는 약 20%의 세포 증식 억제 효과를 보였다.
다음으로, H1975에 2-PhPh-AQTGTGKT, Ph-AQTGTGKT, 또는 Naphtyl-AQTGTGKT를 10 μM 농도로 처리하고, 동시에 알림타를 0.1 μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 72시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
그 결과, 2-PhPh-AQTGTGKT 를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 각각 9% 감소하였으며, 알림타를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 약 16% 감소하였다. 반면, 2-PhPh-AQTGTGKT를 알림타와 병용 처리한 경우에는 각각 24%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 2c).
또한, Ph-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 각각 10% 감소하였으며, 알림타를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 약 16% 감소하였다. 반면, Ph-AQTGTGKT를 알림타와 병용 처리한 경우에는 각각 22%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 2d).
나아가, Naphtyl-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 각각 8% 감소하였으며, 알림타를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 약 16% 감소하였다. 반면 Naphtyl-AQTGTGKT를 알림타와 병용 처리한 경우에는 각각 24%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 2e).
(3) H1975에서의 본 발명의 화합물, 표적항암제, 및 화학항암제의 병용효과 확인
추가로, 본 발명의 화합물, 표적항암제, 및 화학항암제의 삼중 요법에 의한 항암 효과를 확인하였다. 구체적으로, 3-PhPh-AQTGTGKT, 오시머티닙, 및 알림타의 삼중 병용에 의한 폐암 세포 사멸 효과를 확인하였으며, 이 때 3-PhPh-AQTGTGKT는 5 μM의 농도로, 오시버티닙 및 알림타는 각각 2.5 μM 및 100 nM의 농도로 H1975 세포에 72시간 동안 처리하였다 (각각, 3-PhPh-AQTGTGKT와의 병용 항암 효과 확인 실험에서 처리된 농도임). 삼중 병용에 의한 항암 효과를 3-PhPh-AQTGTGKT 단독 처리군, 그리고 오시머티닙 및 알림타의 병용 처리군과 비교하였다.
그 결과, 3-PhPh-AQTGTGKT, 오시머티닙, 및 알림타의 삼중 병용 처리군은 대조군과 비교하여 세포 성장을 약 35% 억제한 바, 3-PhPh-AQTGTGKT 단독 처리군이나 오시머티닙 및 알림타의 병용 처리군과 비교하여 훨씬 우수한 세포 증식 억제 효능을 갖는 것으로 나타났다 (도 3). 상기 결과는, 본 발명에 따른 화합물을 표적항암제 또는 화학항암제와 병용하면 단독요법에 비해 항암 효과가 더욱 우수할 뿐만 아니라, 표적항암제 및 화학항암제와 3중 병용시 항암 효과가 현저하게 증진될 수 있다는 것을 보여준다.
1.2. 폐암 세포주 H820에서의 병용 효과
상기 “실험 재료 및 방법”에서 기술한 MTT assay 방법에 따라 폐암 세포주 H820에서 AQTGTGKT 또는 이의 아날로그들의 항암제 병용에 따른 항암 효과를 확인하였다.
먼저, H820에 AQTGTGKT를 10 μM 농도로 처리하고, 동시에 표적항암제인 오시머티닙을 5 μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 48시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다. 그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 15% 감소하였으며, 오시머티닙을 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 28% 감소하였다. 반면, AQTGTGKT와 오시머티닙을 병용 처리한 경우에는 약 40%의 세포 증식 억제 효과를 보였다.
다음으로, H820에 3-PhPh-AQTGTGKT를 40 μM 농도로 처리하고, 4시간 후 표적항암제인 오시머티닙을 6 μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 72시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다. 그 결과 도 4b에 나타난 바와 같이, 3-PhPh-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 8% 감소하였으며, 오시머티닙을 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 15% 감소하였다. 반면, 3-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙을 병용 처리한 경우에는 약 22%의 세포 증식 억제 효과를 보였다.
1.3. 폐암 세포주 PC9/OR에서의 병용 효과
상기 “실험 재료 및 방법”에서 기술한 MTT assay 방법에 따라 비소세포성 폐암 세포주 PC9/OR에 3-PhPh-AQTGTGKT를 25 μM 농도로 처리하고, 4시간 후 표적항암제인 오시머티닙을 4 μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 68시간 뒤에 세포 독성을 비교하였다.
그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 3-PhPh-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 0.2% 감소하였으며, 오시머티닙을 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 10% 감소하였다. 반면, 3-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙을 병용 처리한 경우에는 약 40%의 세포 증식 억제 효과를 보였다.
상기 실시예 1.1 내지 1.3의 결과는 폐암 세포에서 본 발명에 따른 AQTGTGKT 또는 이의 아날로그; 및 표적항암제의 병용요법이 단독요법에 비해 훨씬 더 효과적임을 보여주는 것이다.
실시예 2: 유방암 세포에서 AQTGTGKT 또는 이의 아날로그의 표적/화학항암제 병용에 따른 항암 효과
2.1. 유방암 세포주에서의 본 발명의 화합물 및 표적항암제의 병용효과 확인
상기 “실험 재료 및 방법”에서 기술한 MTT assay 방법에 따라 유방암 세포주 HCC1937에서 AQTGTGKT 또는 이의 아날로그들의 표적항암제 병용에 따른 항암 효과를 확인하였다.
먼저, 유방암 세포주 HCC1937 세포에 AQTGTGKT를 5 μM 농도로 처리하고, 동시에 표적항암제인 올라파립 (Olaparib)을 2.5 μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 24시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다. 그 결과 도 6a에 나타난 바와 같이, AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 감소되지 않았으며, 올라파립을 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 1.2% 감소하였다. 반면, AQTGTGKT와 올라파립을 병용 처리한 경우에는 약 13%의 세포 증식 억제 효과를 보였다.
이어서, HCC1937에 3-PhPh-AQTGTGKT를 10 μM 농도로 처리하고, 동시에 표적항암제인 올라파립을 2.5 μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 24시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다. 그 결과 도 6b에 나타난 바와 같이, 3-PhPh-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 감소되지 않았으며, 올라파립을 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 감소되지 않았다. 반면, 3-PhPh-AQTGTGKT와 올라파립을 병용 처리한 경우에는 약 8.2%의 세포 증식 억제 효과를 보였다.
추가로, HCC1937에 4-phph-AQTGTGKT, Ac-AQTGTGKT, 2-phph-AQTGTGKT, ph-AQTGTGKT, 또는 Naphtyl-AQTGTGKT를 10 μM 농도로 처리하고, 동시에 올라파립을 2.5μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 48 또는 72시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
그 결과, 4-phph-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 각각 4% 감소하였으며, 올라파립을 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 5% 감소했다. 반면, 4-phph-AQTGTGKT와 올라파립을 병용 처리한 경우에는 각각 약 15%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 6c).
또한, Acyl-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 각각 5% 감소하였으며, 올라파립을 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 5% 감소했다. 반면, Acyl-AQTGTGKT와 올라파립을 병용 처리한 경우에는 각각 약 15%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 6d).
또한, 2-phph-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 각각 12% 감소 하였으며, 올라파립을 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 유의미한 세포의 증식 감소가 나타나지 않았다. 반면, 2-phph-AQTGTGKT와 올라파립을 병용 처리한 경우에는 각각 약 23% 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 6e).
다음으로, ph-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 10% 감소하였으며, 올라파립을 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 유의미한 세포의 증식 감소가 나타나지 않았다. 반면 ph-AQTGTGKT와 올라파립을 병용 처리한 경우에는 각각 약 25%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 6f).
또한, Naphtyl-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 10% 감소하였으며, 올라파립을 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 유의미한 세포의 증식 감소가 나타나지 않았다. 반면 Naphtyl-AQTGTGKT와 올라파립을 병용 처리한 경우에는 각각 약 25%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 6g).
2.2. 유방암 세포주에서의 본 발명의 화합물 및 화학항암제의 병용효과 확인
상기 “실험 재료 및 방법”에서 기술한 MTT assay 방법에 따라 유방암 세포주 HCC1937에서 AQTGTGKT 또는 이의 아날로그들의 화학항암제 병용에 따른 항암 효과를 확인하였다.
먼저, HCC1937 세포에 4-MeOph-AQTGTGKT를 5 μM 농도로 처리하고, 동시에 화학항암제인 시스플라틴(Cisplatin)을 4 μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 48시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다. 그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, 4-MeOph-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 4.6% 감소하였으며, 시스플라틴을 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 7.9% 감소하였다. 반면, 4-MeOph-AQTGTGKT와 시스플라틴을 병용 처리한 경우에는 약 15%의 세포 증식 억제 효과를 보였다.
다음으로, HCC1937에 3-PhPh-AQTGTGKT를 10 μM 농도로 처리하고, 동시에 시스플라틴을 2 μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 72시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다. 그 결과, 도 7b에 나타난 바와 같이, 3-PhPh-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 3% 감소하였으며, 시스플라틴을 단독으로 처리한 경우에는 대조군과 비교하여 세포의 증식이 약 10% 감소하였다. 반면, 3-PhPh-AQTGTGKT와 시스플라틴을 병용 처리한 경우에는 약 20%의 세포 증식 억제 효과를 보였다.
추가로, HCC1937에 4-phph-AQTGTGKT, Ac-AQTGTGKT, 2-phph-AQTGTGKT, ph-AQTGTGKT, 또는 Naphtyl-AQTGTGKT를 10 μM 농도로 처리하고, 동시에 시스플라틴을 2 또는 4μM의 농도로 단독 또는 병용 처리한 후 72시간 뒤에 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
그 결과, 도 7c에 나타난 바와 같이, 4-phph-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포 증식이 4% 감소하였으며, 시스플라틴을 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 약 11% 감소하였다. 반면, 4-phph-AQTGTGKT와 시스플라틴을 병용 처리한 경우에는 약 18%의 세포 증식 억제 효과를 보였다.
또한, Acyl-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포 증식이 5% 감소하였으며, 시스플라틴을 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 약 11% 감소하였다. 반면, Acyl-AQTGTGKT와 시스플라틴을 병용 처리한 경우에는 약 19%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 7d).
아울러, 2-phph-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포 증식이 3% 감소하였으며, 시스플라틴을 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 약 29% 감소하였다. 반면, 2-phph-AQTGTGKT와 시스플라틴을 병용 처리한 경우에는 약 32%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 7e).
또한, ph-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 유의미한 세포 증식의 감소가 없었으며, 시스플라틴을 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포 증식이 약 25% 감소하였다. 반면, ph-AQTGTGKT와 시스플라틴을 병용 처리한 경우에는 약 33%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 7f).
다음으로, Naphtyl-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 유의미한 세포 증식의 감소가 없었으며, 시스플라틴을 단독으로 처리한 경우에는 대조군(control)과 비교하여 세포의 증식이 약 25% 감소하였다. 반면, Naphtyl-AQTGTGKT와 시스플라틴을 병용 처리한 경우에는 각각 33%의 세포 증식 억제 효과를 보였다 (도 7g).
실시예 3: 3-PhPh-AQTGTGKT 및 오시머티닙의 병용 요법에 따른 항암 효과 평가
3.1. 3-PhPh-AQTGTGKT의 병용 시점에 따른 항암 효과 비교
오시머티닙과 3-PhPh-AQTGTGKT의 병용 처리를 위한 최적 요법(regimen) 탐색을 위해, PC9/OR 폐암 세포주에서 오시머티닙과 3-PhPh-AQTGTGKT를 병용 처리 후 오시머티닙을 단독으로 처리한 군, 먼저 오시머티닙 단독 처리한 후 오시머티닙과 3-PhPh-AQTGTGKT를 병용 처리한 군으로 나누어 실험을 진행하였다. 보다 구체적으로, 조합 1(Combo 1)은 오시머티닙 4 μM과 3-PhPh-AQTGTGKT 25 μM를 3일 동안 처리하고 배지를 교체한 후 오시머티닙을 단독으로 3일 동안 처리하였고, 조합 2(Combo 2)는 오시머티닙 4 μM을 단독으로 3일 동안 처리하고 배지를 교체한 후 오시머티닙 4 μM과 3-PhPh-AQTGTGKT 25 μM를 3일 동안 처리하였다. 이후 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 흡광기로 570 nm에서 세포의 성장을 측정하였다.
그 결과 도 8a에 나타난 바와 같이, 오시머티닙을 단독으로 처리한 이후 오시머티닙과 3-PhPh-AQTGTGKT를 병용 처리한 경우(Combo 2)보다, 오시머티닙과 3-PhPh-AQTGTGKT를 먼저 병용 처리한 후 오시머티닙을 단독으로 처리한 경우(Combo 1)에서 더 현저한 세포 성장 저해 효과를 보였다.
3.2. 3-PhPh-AQTGTGKT의 병용 기간에 따른 항암 효과 비교
상기 실시예 3.1에서 나타난 병용 최적 요법을 좀 더 구체적으로 탐색하기 위해, PC9/OR 폐암 세포주에서 오시머티닙과 3-PhPh-AQTGTGKT를 병용 처리 후 오시머티닙을 단독으로 처리한 군, 오시머티닙과 3-PhPh-AQTGTGKT를 병용 처리를 계속한 군으로 나누어 실험을 진행하였다. 보다 구체적으로, 조합 1(Combo 1)은 오시머티닙 1 μM과 3-PhPh-AQTGTGKT 25 μM를 3일 동안 처리하고 배지를 교체한 후 오시머티닙을 단독으로 3일 동안 처리하였고 조합 2(Combo 2)는 오시머티닙 1 μM과 3-PhPh-AQTGTGKT 25 μM 3일 동안 처리하고 배지를 교체한 후 오시머티닙 1 μM과 3-PhPh-AQTGTGKT 25 μM를 3일 동안 처리를 반복하였다. 이후 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 흡광기로 570 nm에서 세포의 성장을 측정하였다.
그 결과 도 8b에 나타난 바와 같이, 오시머티닙과 3-PhPh-AQTGTGKT를 먼저 병용 처리한 후 오시머티닙을 단독으로 처리한 경우(Combo 1)보다 오시머티닙 1 μM과 3-PhPh-AQTGTGKT 25 μM를 3일 동안 처리를 반복한 경우(Combo 2) 더 현저한 세포 성장 저해 효과를 보였다.
실시예 4: 폐암 세포주를 이용하여 제작한 폐암 동물모델에서 AQTGTGKT 아날로그 및 오시머티닙 병용에 따른 항암 효과
상기 “실험 재료 및 방법”에서 기술한 폐암 동물 모델인 H820 폐암 세포주 이식 누드마우스에 3-PhPh-AQTGTGKT를 10 mpk 용량으로 14일 동안 2일 간격으로 7회 처리하였고, 오시머티닙은 2.5 mpk로 매일 경구 투여해 준 후, 종양의 성장을 비교하였다.
그 결과 도 9a에 나타난 바와 같이, 3-PhPh-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 경우에는 대조군(PBS 투여군)과 비교하여 종양의 성장이 약 38% 감소하였으며, 오시머티닙의 단독투여는 46%, 3-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙을 병용하여 처리한 군은 51%의 종양성장의 억제 효과를 보였다.
또한, H1975 세포주를 이용한 폐암 동물 모델에서 오시머티닙 내성 발현 후 본 발명의 화합물 및 오시머티닙의 병용 효능을 평가하였다. H1975 세포주를 4주령 암컷 Balb/C 누드 마우스에 접종 (inoculation) 후 종양의 형성 여부 및 성장을 관찰하고 종양의 단축과 장축을 측정하여 부피를 산출하였다. 종양의 부피가 70-120 mm3 크기가 되었을 때 무작위 군 분리하고 음성대조군인 PBS와 오시머티닙 5 mpk를 매일 경구 투여하였다.
투여 시작일을 day 1으로 설정하고 주 2회 종양의 부피를 측정한 결과, PBS 그룹의 경우 투여 20일째 1,000 mm3에 도달하였으며, 오시머티닙 5 mpk 투여그룹의 경우 투여 시작일로부터 투여 횟수에 따라 줄어들기 시작하여 PBS 그룹과 통계적으로 유의하게 종양의 성장이 억제된 것을 확인하였다 (P<0.001).
그러나 오시머티닙 투여 24일 째부터 종양이 다시 커지는 경향을 발견하였으며, 투여 28일째 오시머티닙 투여군의 종양 크기와 가장 마지막으로 측정된 종양 크기를 비교하였을 때 종양 성장률이 50% 이상으로 나타난 바, 오시머티닙에 대한 내성을 획득하였다고 판단하였다. 이에 따라, 28일 동안 오시머티닙 5 mpk를 매일 경구 투여한 개체들을 다시 2개의 그룹으로 분리하고 투여 32일까지 관찰하였으며, 종양이 점차 더 증가함에 따라 매일 오시머티닙 5 mpk를 경구투여하고 PBS를 2일 간격으로 미 정맥 투여한 그룹 (오시머티닙+PBS 그룹); 및 매일 오시머티닙 5 mpk를 경구투여하고 3-PhPh-AQTGTGKT 10 mpk (오시머티닙+3-PhPh-AQTGTGKT 그룹)를 2일 간격으로 미 정맥 투여한 그룹으로 나누어 효능평가를 실시하였다.
결과는 도 9b에 나타냈다. 오시머티닙 내성 발현 후 초기 투여 2회차부터 오시머티닙+PBS 그룹 대비 오시머티닙+3-PhPh-AQTGTGKT 그룹의 종양의 성장이 지연되었으며, 투여 7회 후 (투여 14일 후) 오시머티닙+3-PhPh-AQTGTGKT 그룹과 오시머티닙+PBS 그룹의 종양의 성장 곡선간에 통계적으로 유의한 차이가 나타나기 시작하였다 (P<0.01). 투여 종료일에 종양의 크기를 측정한 결과, 오시머티닙+PBS 그룹은 평균 692.6 mm3으로 측정되었고 오시머티닙+3-PhPh-AQTGTGKT 그룹의 종양 크기는 364.7mm 3으로 측정된 바, 오시머티닙+PBS 그룹 대비 오시머티닙+3-PhPh-AQTGTGKT 투여그룹에서 종양의 크기가 약 52% 억제된 것이 확인되었다. 실험을 진행하는 동안 모든 개체에서 체중의 감소 및 사망한 동물은 관찰되지 않았다.
상기와 같은 결과는 폐암 동물 모델에서 3-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙의 병용요법이 단독요법에 비해 훨씬 더 효과적임을 보여주는 것이다.
실시예 5. 폐암 PDX 동물모델에서 AQTGTGKT 아날로그 및 항암제의 병용 효과 확인
5.1. AQTGTGKT 아날로그 및 레이저티닙의 병용 효과 확인
본 실시예에서는 본 발명에 따른 화합물과 표적항암제인 레이저티닙 (Lazertinib)의 병용 효과를 in vivo에서 확인하였다. 상기 “실험 재료 및 방법”에서 기술한 바와 같이, 폐암 PDX 모델은 EGFR L858R 돌연변이를 포함하는 PDX 조직을 이식하여 제작하였으며, 종양조직의 이식 완료 후 형성된 종양의 부피가 300 내지 350 mm3 크기가 되었을 때 다음과 같이 무작위로 그룹을 분리하였다: 레이저티닙 10mpk 단독투여군; 3-PhPh-AQTGTGKT 10mg/kg 단독투여군; 및 레이저티닙 및 3-PhPh-AQTGTGKT 병용투여군. 레이저티닙은 10mpk의 농도로 매일 경구투여하고 3-PhPh-AQTGTGKT은 10mpk의 농도로 미 정맥 투여하였으며, 시간에 따른 종양의 성장 곡선을 관찰하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 레이저티닙 단독투여군 및 3-PhPh-AQTGTGKT 단독투여군은 10일 후부터 대조군 대비 종양 성장이 억제된 결과를 보였으며, 레이저티닙 및 3-PhPh-AQTGTGKT 병용투여군의 경우 7일 이후부터 대조군 대비하여 억제하는 효능을 나타냈다. 13일 이후, 레이저티닙 또는 3-PhPh-AQTGTGKT 단독투여 대비하여 레이저티닙 및 3-PhPh-AQTGTGKT 병용투여군에서 종양의 억제 효능이 우세하게 나타나기 시작하였다. 21일차에 3-PhPh-AQTGTGKT의 투여가 10회 이루어진 후 종양의 성장곡선을 분석한 결과, 레이저티닙 또는 3-PhPh-AQTGTGKT 단독투여군은 대조군 대비하여 통계적으로 유의하게 종양 성장이 억제되었는데 (P<0.001), 레이저티닙 및 3-PhPh-AQTGTGKT 병용투여군은 대조군 대비하여 더욱 현저하게 종양의 성장이 억제된 것이 확인되었다 (P<0.001). 특히, 3-PhPh-AQTGTGKT 단독투여 (P<0.001) 혹은 레이저티닙 (P<0.05) 단독투여군 대비하여 병용투여군에서 통계적으로 유의하게 종양의 성장이 억제된 것으로 나타났다.
5.2. AQTGTGKT 아날로그 및 오시머티닙의 병용 효과 확인
본 실시예에서는 본 발명에 따른 화합물과 표적항암제인 오시머티닙의 병용 효과를 in vivo에서 확인하였다. 상기 “실험 재료 및 방법”에서 기술한 바와 같이, 폐암 PDX 모델은 EGFR L858R 돌연변이를 포함하는 PDX 조직을 이식하여 제작하였으며, 종양조직의 이식 완료 후 형성된 종양의 부피가 300 내지 350 mm3 내지 크기가 되었을 때 무작위 군 분리하여 오시머티닙 5mpk 단독투여군; 3-PhPh-AQTGTGKT 10mg/kg 단독투여군; 오시머티닙 및 3-PhPh-AQTGTGKT 병용투여군으로 분리하여 종양의 성장 곡선을 관찰하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 오시머티닙 단독투여군 및 3-PhPh-AQTGTGKT 단독투여군은 10일 후부터 대조군 대비하여 종양 성장이 억제되었는데, 오시머티닙 및 3-PhPh-AQTGTGKT 병용투여군의 경우 7일 이후부터 대조군 대비하여 종양 성장이 억제되는 것을 확인할 수 있었다. 특히, 13일 이후 오시머티닙 또는 3-PhPh-AQTGTGKT 단독투여군 대비하여 오시머티닙 및 3-PhPh-AQTGTGKT 병용투여군에서 종양의 억제 효능이 우세하게 나타나기 시작했다. 21일차에 3-PhPh-AQTGTGKT 투여 10회 후 종양의 성장곡선을 분석한 결과, 오시머티닙 또는 3-PhPh-AQTGTGKT 단독투여군은 대조군 대비하여 통계적으로 유의하게 종양의 성장을 억제하였는데 (P<0.001), 오시머티닙과 3-PhPh-AQTGTGKT 병용투여군은 대조군 대비하여 더욱 현저하게 종양의 성장이 억제된 것이 확인되었다 (P<0.001). 특히, 오시머티닙 또는 3-PhPh-AQTGTGKT 단독투여군 대비하여 병용투여군에서 통계적으로 유의하게 종양의 성장이 억제된 것으로 나타났다 (P<0.001).
실시예 6. H1975 세포주를 이용하여 제작한 폐암 동물모델에서 AQTGTGKT 아날로그 및 항암제의 병용 효과 확인
6.1. 항암제에 대한 내성이 발현된 후의 폐암 모델에서의 병용효과 확인
본 실시예에서는 폐암 세포주를 이식한 후 항암제 (오시머티닙)을 장기 투여하여 해당 항암제에 대한 내성이 발현된 폐암 동물모델을 제작하고, 항암제에 대한 내성이 발현된 후의 본 발명의 화합물 및 항암제의 병용 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 “실험 재료 및 방법”에서 서술한 바와 같이, H1975 세포주를 주입하여 제작한 폐암 동물모델에 오시머티닙을 54일간 매일 경구투여하였으며, 초반에 오시머티닙에 의해 종양 성장이 감소하다가 이후 종양이 다시 성장세를 보이는 동물모델을 약물 내성을 획득한 개체로 판단하였다. 54일간 오시머티닙을 경구투여 받은 모델들을 Vehicle; 3-PhPh-AQTGTGKT 5mg/kg 투여군; 및 10mg/kg 투여군의 3개의 그룹으로 군 분리하고, 3-PhPh-AQTGTGKT의 효능평가를 실시하였다. Vehicle 그룹은 오시머티닙의 매일 경구투여 및 vehicle의 2일 간격 미정맥 투여를 진행하고, 오시머티닙 및 3-PhPh-AQTGTGKT 병용투여 그룹은 5mg/kg 또는 10mg/kg 농도로 2일 간격으로 7회 미정맥 투여하면서 종양의 크기를 주 2회 측정하였다.
그 결과, 오시머티닙 투여 횟수에 따라 종양의 부피가 줄어들기 시작하여 종양의 성장이 억제되었고, 오시머티닙 내성 발현 후 초기 투여 2회부터 3-PhPh-AQTGTGKT 10mpk 투여군은 종양 크기가 유지되어 PBS 그룹 대비하여 종양 성장이 억제된 것을 확인할 수 있었다. 투여 7회 후 (투여 14일 후) 종양의 성장 곡선이 PBS 그룹 대비하여 병용투여군에서 통계적으로 유의하게 차이가 나타나기 시작했다 (P<0.01). 3-PhPh-AQTGTGKT 5mpk투여군의 경우 투여 3회 후 종양의 성장이 PBS 그룹 대비하여 낮은 성장율을 보였으며 투여 7회까지 억제하여 PBS 그룹 대비하여 통계적으로 유의한 차이를 보이는 것으로 나타났다 (P<0.01). 결과는 도 12에 나타냈다. 실험을 진행하는 동안 개체 무게의 감소나 사망한 개체는 관찰되지 않았다.
6.2. 항암제에 대한 내성이 발현되기 전의 폐암 모델에서의 병용효과 확인
본 실시예에서는 항암제에 대한 내성이 발현되기 전의 본 발명의 화합물 및 항암제의 병용 효과를 확인하였다.
상기 “실험 재료 및 방법”에서 서술한 바와 같이, H1975 세포 접종 완료 후 형성된 종양의 부피가 70 내지 300㎣의 크기가 되었을 때 오시머티닙의 투여 횟수에 따라 종양의 부피가 줄어들기 시작한 바, 종양의 성장이 억제된 것을 볼 수 있었고, 오시머티닙에 대한 내성 발현 전인 투여 50일 후에 오시머티닙 단독투여군과 3-PhPh-AQTGTGKT 10mg/kg 병용투여군으로 분리하여 3-PhPh-AQTGTGKT 투여에 따른 항암 효과를 관찰하였다.
그 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 오시머티닙 단독투여군의 경우 투여 54일 차부터 종양이 다시 성장하는 경향성을 보였으며, 투여 58일 이후 내성이 발현되어 종양의 성장이 촉진되는 결과를 보였다. 반면, 오시머티닙 및 3-PhPh-AQTGTGKT 10mg/kg 병용투여군은 64일이 경과할 때까지 종양이 재성장하지 않고 낮은 크기의 종양을 유지하는 결과를 나타냈다. 64일 이후 종양의 재성장이 나타나긴 하였으나, 단독투여군 대비하여 종양의 크기는 매우 작았다. 또한, 투여 82일까지 3-PhPh-AQTGTGKT 10mpk투여군의 종양은 PBS 그룹 대비하여 낮은 성장율을 보였다. 실험을 진행하는 동안 개체 무게의 감소나 사망한 개체는 관찰되지 않았다.
실시예 7: HCC1806 세포주를 이용하여 제작한 유방암 동물모델에서 AQTGTGKT 아날로그 및 오시머티닙 병용에 따른 항암 효과
본 실시예에서는 유방암 세포주를 마우스에 이식하여 유방암 동물모델을 제작한 후, 이에 대한 본 발명의 화합물 및 항암제의 병용효과를 확인하였다. 구체적으로, 유방암 동물 모델인 HCC1806 세포주 이식 누드마우스에 AQTGTGKT, 3-PhPh-AQTGTGKT, 또는 Ph-AQTGTGKT를 10mg/kg 용량으로 18일 동안 2일 간격으로 9회 미정맥 투여하였고, 시스플라틴은 5mg/kg 용량으로 7일 간격 3회 복강내 투여한 후 종양의 성장을 비교하였다.
먼저, AQTGTGKT 단독투여군, 시스플라틴 단독투여군, 및 병용투여군 모두 12일차부터 대조군 대비 종양의 성장이 억제되는 양상이 나타났고, 특히 시스플라틴 및 AQTGTGKT 병용 그룹은 투여 마지막 날인 18일에 종양의 크기가 대조군 대비 통계적으로 유의하게 감소한 것을 확인할 수 있었다 (p<0.001). 또한, 단독투여군과 비교하였을 때에도, 병용투여 그룹의 종양 크기 및 성장 곡선이 감소한 것을 확인할 수 있었다 (도 14a).
다음으로, 3-PhPh-AQTGTGKT 단독투여군, 시스플라틴 단독투여군, 시스플라틴 및 3-PhPh-AQTGTGKT 병용투여군 모두 9일차부터 대조군 대비 종양의 성장이 억제되는 경향을 볼 수 있었고, 투여 18일 후에는 종양 성장이 대조군 대비 통계적으로 유의하게 감소한 것이 확인됐다 (p<0.001). 또한, 단독투여군 대비 병용투여군에서 종양의 크기 및 성장 곡선이 감소한 것을 볼 수 있었다 (도 14b).
Ph-AQTGTGKT 단독투여군, 시스플라틴 단독투여군, 시스플라틴 및 Ph-AQTGTGKT병용투여 그룹에서는 대조군 대비 9일 후 종양의 성장이 억제되는 경향을 볼 수 있었고, 투여 18일 후에는 종양 성장이 대조군 대비 통계적으로 감소했다 (p<0.001). 또한, 병용투여군의 종양 크기 및 성장 곡선은 단독투여군 대비 감소한 것으로 나타났다 (도 14c).
실시예 8: 병용투여에 따른 자가포식작용(autophagy) 효과 평가
상기 “실험 재료 및 방법”에서 기술한 폐암 동물 모델인 H820 폐암 세포주 이식 누드마우스에 3-PhPh-AQTGTGKT를 10 mpk 용량으로 14일 동안 2일 간격으로 7회 처리하였고, 오시머티닙은 2.5 mpk로 매일 경구 투여해 준 후, 종양을 채취하여 p-Beclin1 면역염색을 하였다.
그 결과 도 15에 나타난 바와 같이, 이종이식 폐암 동물 모델에서 오시머티닙의 단독투여그룹과 비교하였을 때 3-PhPh-AQTGTGKT를 단독으로 처리한 그룹에서 p-Beclin1의 발현이 감소하였고, 3-PhPh-AQTGTGKT와 오시머티닙의 병용 그룹에서는 훨씬 더 감소하는 것을 보여주었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (27)

  1. (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 (ii) 항암제를 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아날로그는 일반식 X-AQTGTGKT로 표시되는 화합물이고, 상기 X는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00080

    상기 화학식 1에서,
    R1은 수소, 치환 또는 비치환된 페닐기, 치환 또는 비치환된 나프틸기, 또는 치환 또는 비치환된 C1 내지 C5의 알킬기임.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 R1은 하기 화학식 2 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:
    [화학식 2]
    Figure pat00081


    [화학식 3]
    Figure pat00082

    (상기 화학식 3에서,
    R2 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1 내지 C5의 알킬기, 또는 페닐기이고;
    R3은 수소, C1 내지 C5의 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 C3의 알콕시기임.)

    [화학식 4]
    Figure pat00083

    (상기 화학식 4에 있어서,
    R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 또는 C1 내지 C3의 알킬기임.)
  4. 제1항에 있어서,
    상기 항암제는 표적항암제, 및 화학항암제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 표적항암제는 티로신 키나아제 억제제, PARP 억제제, 혈관신생억제제, CDK4/6 억제제, 호르몬 치료제, 및 항체-약물 접합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 티로신 키나아제 억제제는 EGFR(epidermal growth factor receptor), ALK(anaplastic lymphoma kinase), ROS1(ROS Proto-Oncogene 1), BRAF(B-Raf Proto-Oncogene), HER2(human epidermal growth factor receptor 2), RET(Ret Proto-Oncogene), NTRK1(Neurotrophic Receptor Tyrosine Kinase 1), MET(Mesenchymal-Epithelial Transition factor), 및 NRG1(Neuregulin 1)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상에 대한 표적 약물인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 티로신 키나아제 억제제는 오시머티닙(Osimertinib), 아파티닙(Afatinib), 브리가티닙(Brigatinib), 다사티닙(Dasatinib), 다코미티닙(Dacomitinib), 엘로티닙(Erlotinib), 제피티닙(Gefitinib), 라파티닙(Lapatinib), 네라티닙(Neratinib), 반데타닙(Vandetanib), 아이코티닙(Icotinib), 바리티닙(Varitinib), 테세바티닙(Tesevatinib), 카네르티닙(Canertinib), 나쿠오티닙(Naquotinib), 펠리티닙(Pelitinib), 포지오티닙(Poziotinib), 로실레티닙(Rociletinib), 나자르티닙(Nazartinib), 알리티닙(Allitinib; ALS-1306), 피로티닙(Pyrotinib), 티르포스틴(Tyrphostin), 크리조티닙(Crizotinib), 세리티닙(Ceritinib), 엔트렉티닙(Entrectinib), 다브라페닙(Dabrafenib), 트라메티닙(Trametinib), 알렉티닙(Alectinib), 로라티닙(lorlatinib) 라로텍티닙(Larotectinib), 레이저티닙(Lazertinib), 올무티닙(Olmutinib), AG 1478, CUDC-101, MTKi-327(JNJ-26483327), CL-387785(EKI-785), CNX-2006, PD168393, TAK285, WZ4002, 및 AV-412(MP-412)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 PARP 억제제는 올라파립(Olaparib), 루카파립(Rucaparib), 탈라조파립(Talazoparib), 벨리파립(Veliparib), 및 니라파립(Niraparib)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제5항에 있어서,
    상기 CDK4/6 억제제는 트릴라시클립(Trilaciclib), 팔보시클립(Palbociclib), 리보시클립(Ribociclib), 및 아베마시클립(Abemaciclib)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제5항에 있어서,
    상기 호르몬 치료제는 타목시펜(Tamoxifen), 토레미펜(Toremifene), 풀베스트란(Fulvestrant), 고세렐린(Goserelin), 류프롤리드(Leuprolide), 아나스트로졸(Anastrozole), 레트로졸(Letrozole), 및 엑세메스탄(Exemestane)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제5항에 있어서,
    상기 항체-약물 접합체는 사시투주맙 고비테칸(Sacituzumab govitecan), 및 라디라투주맙(Ladiratuzumab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 제4항에 있어서,
    상기 표적항암제는 다라투무맙(Daratumumab), 트라스투주맙(Trastuzumab), 및 리툭시맙(Rituximab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제4항에 있어서,
    상기 화학항암제는 알림타(Alimta), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 페메트렉시드(Pemetrexed), 시스플라틴(Cisplatin), 젬시타빈(Gemcitabine), 카보플라틴(Carboplatin), 플루오로우라실(5-FU), 사이클로포스파미드(Cyclophosphamide), 파클리탁셀(Paclitaxel), 빈크리스틴(Vincristine), 에토포사이드(Etoposide), 및 독소루비신(Doxorubicin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 상기 항암제의 항암 효과를 증진시키고 부작용은 감소시키는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 상기 항암제가 혼합된 혼합제 형태인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 상기 항암제가 각각 제제화되어 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여되는 형태인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 항암제는 전체 조성물 대비 0.01 내지 10 μM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 전체 조성물 대비 1 내지 50 μM의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  19. 제1항에 있어서,
    상기 항암제 : 상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그는 1 : 1 내지 500의 몰농도(molarity)비로 포함되는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  20. 제1항에 있어서,
    상기 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 표적항암제; 및 화학항암제를 모두 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  21. 제1항에 있어서,
    상기 암은 편평상피세포암, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  22. 제1항의 약학적 조성물을 유효성분으로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 키트.
  23. (i) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 올리고펩티드 또는 이의 아날로그; 및 (ii) 항암제를 유효성분으로 포함하는, 항암제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 아날로그는 일반식 X-AQTGTGKT로 표시되는 화합물이고, 상기 X는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염인 것을 특징으로 하는, 항암제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물:
    [화학식 1]
    Figure pat00084

    상기 화학식 1에서,
    R1은 수소, 치환 또는 비치환된 페닐기, 치환 또는 비치환된 나프틸기, 또는 치환 또는 비치환된 C1 내지 C5의 알킬기임.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 R1은 하기 화학식 2 내지 4 중 어느 하나로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는, 항암제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물:
    [화학식 2]
    Figure pat00085


    [화학식 3]
    Figure pat00086

    (상기 화학식 3에서,
    R2 및 R4는 각각 독립적으로 수소, C1 내지 C5의 알킬기, 또는 페닐기이고;
    R3은 수소, C1 내지 C5의 알킬기, 페닐기, 또는 C1 내지 C3의 알콕시기임.)

    [화학식 4]
    Figure pat00087

    (상기 화학식 4에 있어서,
    R6 및 R7은 각각 독립적으로 수소, 또는 C1 내지 C3의 알킬기임.)

  26. 제23항에 있어서,
    상기 조성물은 항암제와 동시에, 별도로, 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 항암제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물.
  27. 제23항에 있어서,
    상기 조성물은 편평상피세포암, 폐암, 폐의 선암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 혈액암, 간암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암, 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 및 뇌암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 암에 대한 상기 항암제의 항암 효과를 증진시키기 위한 것인, 항암제의 항암 효과 증진용 약학적 조성물.
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