KR20230042372A - 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드의 스크리닝 방법 - Google Patents

표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, (1) 그람 음성 세균으로 발현 가능한 복수의 발현 벡터로 구성되는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 제공하는 공정이고, 상기 복수의 발현 벡터는 각각, 서로 다른 폴리펩티드를 코드하는 제1 폴리뉴클레오티드, 제1 폴리뉴클레오티드의 상류에 배치된 분비 시그널 서열 및 표적 단백질을 코드하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 공정; (2) 상기 발현 벡터로 그람 음성 세균을 형질 전환하고, 상기 폴리펩티드를 페리플라즘 간극 내에, 상기 표적 단백질을 내막 표면에, 각각 발현시키는 공정; (3) 페리플라즘 간극 내에 있어서, 상기 폴리펩티드를 상기 표적 단백질과 접촉시키는 공정; (4) 그람 음성 세균에 스페로플라스트를 형성시켜서, 전기 생리학적 방법에 의해 표적 단백질에 대한 상기 폴리펩티드의 활성을 측정하는 공정; (5) 측정된 활성에 기초하여, 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드를 동정하는 공정을 포함하는, 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

Description

표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드의 스크리닝 방법
관련출원
본 출원은 일본특허출원 2020-132823호(2020년 8월 5일 출원)에 기초하는 우선권을 주장하고 있고, 이 내용은 본 명세서에 참조로서 도입된다.
기술분야
본 발명은 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드를 스크리닝하는 방법, 상기 방법을 위한 라이브러리, 상기 라이브러리의 신규의 제작 방법에 관한 것이다.
독 거미 등의 독액에 포함되는 ICK 펩티드는 3개의 디술피드 결합을 갖는 폴리펩티드이다. ICK 펩티드는 소화 효소로 분해되지 않고, 래트에의 정맥 내 투여에 의해 수 시간에 걸쳐 혈중에 검출할 수 있다(비특허문헌 1).
ICK 펩티드는 이온 채널에 작용하고 그 독성을 발휘하는 것이 알려져 있다. 발명자는 이온 채널에 작용하는 ICK 펩티드를 클로닝하고, 그 특성을 해석하고 있다(비특허문헌 2 및 3). ICK 펩티드를 라이브러리화하면, 이온 채널에 초점을 맞춘 펩티드 라이브러리를 구축할 수 있으며, 다양한 이온 채널에 작용하는 펩티드의 창제가 가능해진다.
이온 채널은 다양한 질환에 관련되어 있는 것이 알려져 있지만(비특허문헌 2), 이온 채널이 개폐하는 자극은 주로 막 전위의 변화나 온도 변화, 기계적 자극 등이기 때문에, 화합물 라이브러리에 있어서의 히트 화합물을 합성 전개하는 방법은 취하지 않고, 이온 채널 창약을 추진하는 것은 일반적으로 곤란을 수반한다.
발명자는 대장균의 내막과 페리플라즘 공간을 이용하고, 이온 채널이나 수용체에 작용하는 펩티드를 탐색하는 기술로서, PERISS(intra Periplasm Secretion and Selection; 내부 페리플라즘 분비 및 선별)법을 고안하고, 연구 개발을 진행시키고 있다(특허문헌 1). 이 방법에서는, 대장균의 페리플라즘 공간에 이온 채널 초점화 펩티드 라이브러리를 발현시키고, 내막에 발현시킨 표적 분자와 페리플라즘 공간에서 상호 작용시킴으로써, 후보 펩티드를 탐색한다.
PERISS법을 사용해서 이온 채널 창약을 추진하기 위해서는, 대장균 내막에 이온 채널이 활성이 있는 상태에서 발현되고 있는 것의 확인이 필요하다. 웨스턴 블롯 등의 종래 기술에서는, 이온 채널의 발현은 확인할 수 있지만, 올바른 입체 구조로 활성이 있는 상태에서 발현하고 있는지의 여부는 평가할 수 없다. 그래서, 발명자들은 대장균 내막에 강제 발현시킨 이온 채널의 활성을 패치 클램프법으로 전기 생리학적으로 측정하는 기술 개발에 성공하고 있다(비특허문헌 4).
대장균 페리플라즘에 분자를 제시하는 방법으로서 고정 페리플라즘 발현(Anchored periplasmic expression)법이 알려져 있다(특허문헌 2, 비특허문헌 5). 이 기술에서는 (1) 대장균 페리플라즘에 표적 분자를 발현시킨다, (2) 대장균 외막에 미소한 구멍을 뚫는다, (3) 배양액 중에 형광 라벨한 리간드 라이브러리를 첨가한다, (4) 표적 분자와 결합한 리간드를 그 형광을 지표로 셀 소터로 회수한다,라고 하는 공정을 거쳐서 표적 분자와 결합하는 리간드를 동정한다. 대장균 페리플라즘을 반응장으로 하여 이용하는 점은 PERISS법과 공통되지만, 기타의 점에서는 다른 기술이다.
일본특허공개 제2014-207905 WO2005/019409(일본특허공표 제2006-515514호)
Kikuchi et al., "High Proteolytic Resistance of Spider-Derived Inhibitor Cystine Knots" International Journal of Peptides(2015) Vol.2015, Article ID 537508 Kimura et al., "Molecular Cloning and Sequence Analysis of the cDNAs Encoding Toxin-Like Peptides from the Venom Glands of Tarantula Grammostola rosea" International Journal of Peptides (2012) Vol.2012, Article ID 731293 Ono et al., "Characterization of voltage-dependent calcium channel blocking peptides from the venom of the tarantula Grammostola rosea" (2011) Toxicon 58265-276. Kikuchi et al., "The application of the Escherichia coli giant spheroplast for drug screening with automated planar patch clamp system" (2015) Biotechnology Reports 7, p17-23 Harvey et al., "Anchored periplasmic expression, a versatile technology for the isolation of high-affinity antibodies from Escherichia coli- expressed libraries" (2004) Proc Natl Acad Sci Vol.101, No.25, p9193-9198.
종래의 PERISS법에서는 자기 비즈로 표적 분자에 결합하는 펩티드를 선택하고, 라이브러리 부분을 차세대 시퀀서 등으로 해석한다. 얻어진 펩티드가 어떤 활성을 가질지는, DNA 서열 결정 후, 코드되고 있는 펩티드를 생산하고, 그 활성을 평가해야 한다. 그러나, ICK 펩티드와 같이 분자 내에 복수의 디술피드 결합을 갖는 펩티드의 경우, 그 화학적 합성은 시간과 비용을 요하고, 또한 대장균에 의한 재조합 생산도 곤란을 수반한다.
본 발명의 과제는, PERISS법에서 얻어진 후보 펩티드의 활성을 간편하게 평가하고, 보다 효율적으로 목적 펩티드를 탐색하는 방법 및 그를 위한 툴을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해서, 발명자들은 예의 검토하고, PERISS법에 있어서, 대장균 내막에 발현시킨 표적 단백질과, 페리플라즘 간극 내에 발현시킨 펩티드와의 상호 작용을, 패치 클램프법에 의해 전기 생리학적으로 측정함으로써, 당해 펩티드의 표적 단백질에 대한 작용을 결정할 수 있는 것을 발견했다.
또한, 기지의 막 단백질의 리간드의 입체 구조에, ODA법을 적용함으로써, 다른 단백질과 상호 작용할 가능성이 높은 부위를 예측하고, 당해 부위의 서열을 랜덤화함으로써, 다양한 표적 단백질에 작용(혹은 상호 작용)하는 폴리펩티드를 탐색하기 위한 라이브러리를 제작할 수 있는 것을 발견했다.
본 발명은 상기의 지견에 기초하는 것으로, 이하의 [1] 내지 [15]를 제공한다.
[1] 표적 단백질에 대해 작용하는 폴리펩티드를 스크리닝하는 방법으로서,
(1) 그람 음성 세균으로 발현 가능한 복수의 발현 벡터로 구성되는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 제공하는 공정이고,
상기 복수의 발현 벡터는, 각각 서로 다른 폴리펩티드를 코드하는 제1 폴리뉴클레오티드, 제1 폴리뉴클레오티드의 상류에 배치된 분비 시그널 서열 및 표적 단백질을 코드하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 공정;
(2) 상기 발현 벡터로 그람 음성 세균을 형질 전환하고, 상기 폴리펩티드를 페리플라즘 간극 내에, 상기 표적 단백질을 내막 표면에, 각각 발현시키는 공정;
(3) 페리플라즘 간극 내에 있어서, 상기 폴리펩티드를 상기 표적 단백질과 접촉시키는 공정;
(4) 그람 음성 세균에 스페로플라스트를 형성시켜서, 전기 생리학적 방법에 의해 표적 단백질에 대한 상기 폴리펩티드의 활성을 측정하는 공정;
(5) 측정된 활성에 기초하여, 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드를 동정하는 공정;
을 포함하는, 방법.
[2] 그람 음성 세균이 대장균인, [1]에 기재된 방법.
[3] 표적 단백질이 막 단백질인, [1] 또는 [2]에 기재된 방법.
[4] 막 단백질이 막 수용체, 이온 채널, 또는 트랜스포터인, [3]에 기재된 방법.
[5] 전기 생리학적 방법이 패치 클램프법인, [1] 내지 [4]의 어느 것에 기재된 방법.
[6] 폴리뉴클레오티드 라이브러리가, 미리 표적 단백질에 결합하는 폴리펩티드를 코드하는 제1 폴리뉴클레오티드에 대해서 농축하는 공정, 바람직하게는 5라운드 이상의 농축 공정을 포함하는, [1] 내지 [5]의 어느 것에 기재된 방법.
[7] 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드의 제조 방법으로서,
[1] 내지 [6]의 어느 것에 기재된 방법에 의해, 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드를 동정하고, 동정한 폴리펩티드를, 유전자 재조합, 또는 화학 합성에 의해 제조하는 공정을 포함하는, 제조 방법.
[8] 라이브러리의 제작 방법으로서,
(1) 기지의 막 단백질의 리간드에 대해서, 상기 리간드의 입체 구조에 ODA법을 적용해서 다른 단백질과 상호 작용할 가능성이 높은 부위를 예측하는 공정;
(2) 상기 리간드의 아미노산 서열에 있어서, 예측된 부위를 랜덤화한 복수의 폴리펩티드를 제작하거나, 또는 상기 폴리펩티드를 각각 코드하는 복수의 폴리뉴클레오티드를 제작하는 공정;
(3) 상기 복수의 폴리펩티드, 또는 상기 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 라이브러리를 제작하는 공정;
을 포함하는, 라이브러리의 제작 방법.
[9] 리간드가 ICK 폴리펩티드, 예를 들어 GTx1-15인, [8]에 기재된 제작 방법.
[10] 막 단백질이 막 수용체, 이온 채널, 또는 트랜스포터인, [8] 또는 [9]에 기재된 제작 방법.
[11] 폴리뉴클레오티드 라이브러리가, [8] 내지 [10]의 어느 것에 기재된 방법으로 제작되는, [1] 내지 [7]의 어느 것에 기재된 방법.
[12] 하기의 아미노산 서열을 갖는 서로 다른 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 코드하는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 라이브러리.
DCLGXXRKCIPDNDKCCRPXLVCSRTHKXCXXXX(서열번호 1)
[13] 상기 복수의 폴리뉴클레오티드가, 각각 그람 음성균으로 발현 가능한 발현 벡터에 삽입되어 있는, [12]에 기재된 라이브러리.
[14] 상기 발현 벡터가, 상기 폴리뉴클레오티드, 그 상류에 배치된 분비 시그널 서열 및 표적 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, [13]에 기재된 라이브러리.
[15] 서열번호 4 내지 9의 어느 것으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드.
본 발명의 방법에 의하면, 표적 단백질에 대한 폴리펩티드의 결합과, 저해 활성 등의 상호 작용의 유무 판정을 일련의 공정에서 행할 수 있다. 선택된 폴리펩티드의 아미노산 서열은, 당해 폴리펩티드를 발현하는 세포로부터, 플라스미드(발현 벡터)를 회수하고, DNA 서열을 해석함으로써 결정할 수 있다. 즉, 간편하고 또한 신속하게 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드와 그 활성 및 서열 정보를 얻을 수 있다.
ICK 펩티드와 같이, 분자 내에 복수의 매듭상의 디술피드 결합을 갖는 펩티드는, 기본적으로 무세포계에서 합성하는 것은 곤란하다. 분자 샤프롱 등을 공발현시킴으로써, 무세포계에 있어서 디술피드 결합을 형성시키는 기술도 알려져 있지만, 어느 시스테인 잔기를 결합시키는지 등 디술피드 결합의 제어는 할 수 없다. 또한, 무세포계를 이용한 스크리닝 방법에서는, 펩티드 라이브러리와 표적 분자는 별도의 계에서 발현되며, 이온 채널을 표적 분자로 하는 경우에는, 정확한 평가를 실시하기 위해서는 숙련된 고도의 기술이 필요해진다.
이에 반해, 본 발명의 방법에서는, 그람 음성균(대장균 등)의 페리플라즘 공간을 발현의 장소로 함으로써, 복잡한 구조를 갖는 펩티드를 올바른 입체 구조로 발현시키는 것이 가능하다. 본 발명의 방법은, 다양한 표적 분자에 대하여, 펩티드 라이브러리와 표적 분자를 동일한 계에서 발현시키고, 동시에 활성에 기초하는 스크리닝을 할 수 있다. 본 발명의 방법은, 창약 타깃으로서 중요한, 막 수용체나 이온 채널 등의 막 단백질을 표적으로 하는 분자의 스크리닝에 유용하다.
도 1은 PERISS법의 개념도를 나타낸다.
도 2는 ODA법에 의해 단백질간 상호 작용에 관여하는 영역을 예측한 입체 구조의 모식도를 나타낸다.
도 3은 인간 Kv2.1을 코드하는 DNA 및 ODA 라이브러리를 포함하는 플라스미드의 구성을 나타낸다.
도 4a은 클론 4의 Kv2.1(control)에 대한 저해 활성을 패치 클램프법에 의해 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4b는 클론 9의 Kv2.1(control)에 대한 저해 활성을 패치 클램프법에 의해 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4c는 클론 16의 Kv2.1(control)에 대한 저해 활성을 패치 클램프법에 의해 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4d는 클론 30의 Kv2.1(control)에 대한 저해 활성을 패치 클램프법에 의해 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4e는 클론 32의 Kv2.1(control)에 대한 저해 활성을 패치 클램프법에 의해 측정한 결과를 나타내는 그래프이다. 도 4f는 클론 46의 Kv2.1(control)에 대한 저해 활성을 패치 클램프법에 의해 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 종래의 PERISS법에 따라 5회 농축을 행한 플라스미드 DNA 서열을 차세대 시퀀서로 해석한 결과를 나타낸다.
도 6은 인간 단구 세포주(THP-1)에 대한 GTx1-15의 세포 장애 활성을 나타내는 그래프이다.
도 7은 인간 단구 세포주(THP-1)에 대한 GTx1-15의 면역원성을 나타내는 그래프이다.
도 8은 GTx1-15의 온도 안정성을 나타내는 그래프이다.
1. 표적 단백질에 작용하는 펩티드의 스크리닝 방법
1.1 표적 단백질
본 발명은 표적 단백질에 작용하는 펩티드의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 있어서, 「표적 단백질」은 막 단백질인 것이 바람직하고, 막 단백질로서는, 막 수용체, 이온 채널, 트랜스포터(막 수송체) 등을 들 수 있다. 특히 리간드가 불분명한 이온 채널이나 트랜스포터에 작용하는 펩티드의 스크리닝에, 본 발명의 방법은 적합하게 이용할 수 있다.
「막 수용체」로서는, 예를 들어 이하의 것을 들 수 있다.
(1) G 단백질 결합형 수용체
7회 막 관통형 구조를 갖고, 리간드가 결합하면 G 단백질이 활성화되고, 특정한 세컨드 메신저를 합성하는 효소가 활성화 혹은 불활성화됨으로써, 세포 응답을 발생시킨다. 무스카린성 아세틸콜린 수용체, 아드레날린 수용체, 아데노신 수용체, GABA 수용체(B형), 안기오텐신 수용체, 칸나비노이드 수용체, 코레시스트키닌 수용체, 도파민 수용체, 글루카곤 수용체, 히스타민 수용체, 후각 수용체, 오피오이드 수용체, 로돕신 수용체, 세크레틴 수용체, 세라토닌 수용체, 소마트스타틴 수용체, 가스트린 수용체, P2Y 수용체 등을 들 수 있다.
(2) 이온 채널형 수용체
리간드의 결합에 의해 수용체의 구조가 변화하고, 특정한 이온의 투과가 가능해지고, 막 전위가 변화한다. 니코틴성 아세틸콜린 수용체, 글리신 수용체, GABA 수용체(A형, C형), 글루타민산 수용체, 세라토닌 수용체 3형, P2X 수용체, 기타 세포의 막 전위에 반응해서 작동하는 전위 의존성 이온 채널을 들 수 있다.
(3) 사이토카인 수용체 슈퍼패밀리
리간드가 결합하면 수용체는 이량체가 되고, 티로신키나아제와 상호 작용함으로써 활성화한다. 각종 사이토카인 수용체, 프롤락틴 수용체 등을 들 수 있다.
(4) 효소 활성을 갖는 수용체
리간드의 결합에 의해, 세포질측의 티로신키나아제 활성이나 그아닐산시크라제 활성이 높아진다. 티로신키나아제 수용체, 그아닐산시크라제 수용체, 인슐린 수용체 등, 많은 성장 인자의 수용체가 포함된다.
「이온 채널」이란, 세포의 생체막에 존재하는 막 관통 단백질이며, 수동적으로 이온을 투과시키는 단백질이다. 이온 채널은 신경 회로의 활동, 근수축, 간격 등, 이온이 관여하는 다양한 생리 기능에 관여하고 있다. 이온 채널은 이온 선택성(칼륨 채널, 나트륨 채널, 칼슘 채널, 양이온 채널 등)이나, 게이트의 개폐 제어(전위 의존성, 리간드 의존성, 기계 자극 의존성, 온도 의존성, 인산화 의존성)에 의해 분류된다.
이온 채널로서는, 예를 들어 이하의 것을 들 수 있다.
(1) 전위 의존성 채널
전위 의존성 채널로서는, 전위 의존성 칼륨 채널, 전위 의존성 나트륨 채널, 전위 의존성 칼슘 채널, 칼슘 활성형 칼륨 채널, HCN 채널, CNG 채널, TRP 채널, 전위 의존성 프로톤 채널 등을 들 수 있다.
(2) 내측 방향 정류성 칼륨 채널
고전적 채널인 Kir1, 2, 4, 5, 7, GTP 결합 단백질로 활성화되는 Kir3, ATP 감수성 칼륨 채널을 구성하는 Kir6으로 크게 구별된다. 신경 세포나 심근에 있어서의 정지 막 전위의 유지 등에 중요한 역할을 하고 있다.
(3) 리간드 의존성 채널
리간드 의존성 채널로서는, Cys-루프 수용체(글리신 수용체, GABA 수용체(A형, C형)), 글루타민산 수용체, P2X 수용체를 들 수 있다. 이들은 막 수용체이기도 하다.
(4) 세포 내막계 이온 채널
세포 내막에 존재하는 수용체형 이온 채널이며, 리아노진 수용체, IP3 수용체, TRIC 채널을 들 수 있다.
(5) 기타
투 포어 채널, 산 감수성 이온 채널, 상피형 나트륨 채널, 염소 채널, 코넥신.
「트랜스포터(막 수송체)」는 생체막을 관통하고, 막을 통해서 물질의 수송을 하는 단백질이다. 인간의 트랜스포터에는, SLC(Solute carrier) 트랜스포터, ABC(ATP-binding cassette) 트랜스포터의 2개의 슈퍼패밀리와, 몇 가지의 패밀리가 존재한다.
막 수용체, 이온 채널, 트랜스포터는, 서로 중복할 수 있다. 이들의 막 단백질은, 그 활성화가 세포(세포막)의 전기 생리학적 방법에 의해 검출 가능한 한, 그 통칭에 관계없이, 본 발명의 「표적 단백질」에 포함된다.
1.2 스크리닝의 각 공정
본 발명의 스크리닝 방법은, 이하의 공정을 포함한다:
공정 1: 그람 음성 세균으로 발현 가능한 복수의 발현 벡터로 구성되는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 제공하는 공정이고,
상기 복수의 발현 벡터는, 각각 서로 다른 폴리펩티드를 코드하는 제1 폴리뉴클레오티드, 제1 폴리뉴클레오티드의 상류에 배치된 분비 시그널 서열 및 표적 단백질을 코드하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 공정;
공정 2: 상기 발현 벡터로 그람 음성 세균을 형질 전환하고, 상기 폴리펩티드를 페리플라즘 간극 내에, 상기 표적 단백질을 내막 표면에, 각각 발현시키는 공정;
공정 3: 페리플라즘 간극 내에 있어서, 상기 폴리펩티드를 상기 표적 단백질과 접촉시키는 공정;
공정 4: 그람 음성 세균에 스페로플라스트를 형성시켜서, 전기 생리학적 방법에 의해 표적 단백질에 대한 상기 폴리펩티드의 활성을 측정하는 공정;
공정 5: 측정된 활성에 기초하여, 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드를 동정하는 공정.
이하, 본 발명의 각 공정에 대해서 상세하게 설명한다. 이들 공정 중, 공정 1 내지 공정 3은 PERISS법을 이용한 것이며, 그 개요를 도 1에 나타낸다.
(공정 1) 폴리뉴클레오티드 라이브러리의 제공
먼저, 그람 음성 세균으로 발현 가능한 복수의 발현 벡터로 구성되는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 제공한다.
본 발명에 있어서, 「발현 벡터」는 그람 음성균으로 발현 가능한 것이면, 특별히 한정되지 않고, 기타 미생물이나 무세포계에 있어서 발현 가능한 벡터여도 된다. 각 발현 벡터는 서로 다른 폴리펩티드를 코드하는 제1 폴리뉴클레오티드와, 분비 시그널 서열 및 표적 단백질을 코드하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 발현 벡터는 적합하게는, 제1 폴리뉴클레오티드의 발현 카세트와 제2 폴리뉴클레오티드의 발현 카세트를 포함하는 플라스미드이다.
「제1 폴리뉴클레오티드」는 라이브러리를 구성하는 랜덤화된 서열 부분을 포함하고, 발현 벡터마다 다른 폴리펩티드를 코드한다.
「분비 시그널 서열」은 제1 폴리뉴클레오티드의 상류에 작동 가능하게 연결되며, 균체 내에서 발현한 제1 폴리뉴클레오티드가 코드하는 폴리펩티드가 내막 외(페리플라즘 간극 내)에 분비되는 것을 가능하게 한다. 페리플라즘이란, 그람 음성균에 있어서, 내막과 외막의 2개의 생체막에 둘러싸인 공간이다. 분비 시그널 서열은 모든 발현 벡터에 있어서 공통이다.
「제2 폴리뉴클레오티드」는 표적 단백질을 코드하고, 모든 발현 벡터에 있어서 공통이다. 제2 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질이 그람 음성균의 내막 상에 발현되도록, 발현 벡터에 내장된다. 표적 단백질이, 막 단백질 이외의 가용성 단백질(효소 등)인 경우에는, 1회 막 관통형 단백질의 페리플라즘측으로 연결해서 발현시킨다.
발현 벡터는 상기 제1 폴리뉴클레오티드가 페리플라즘 간극 내에, 제2 폴리뉴클레오티드가 내막 상에 발현되도록 설계된다. 그러한 발현 벡터의 설계는 당해 분야에서 주지이며, 예를 들어 제1 폴리뉴클레오티드의 상류(5'측)에는 상기 분비 시그널에 더해서, 후속 공정에 있어서의 폴리뉴클레오티드의 회수, 정제를 용이하게 하기 위한 태그 서열, SD 서열 및 프로모터 서열이 부가되고, 하류(3'측)에는 정지 코돈이 부가된다. 또한, 제2 폴리뉴클레오티드의 상류(5'측)에는 SD 서열 및 프로모터 서열이 부가되고, 하류(3'측)에는 정지 코돈이 부가된다.
본 발명에 있어서, 「그람 음성균」은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 대장균, 프로테오박테리아 문의 살모넬라, 슈도모나스 및 아세트산균; 시아노박테리아, 녹색 황세균 등을 사용할 수 있지만, 전형적으로는 대장균을 사용한다. 각 폴리뉴클레오티드의 코돈은 숙주인 그람 음성균에 있어서, 당해 폴리펩티드가 코드하는 폴리펩티드가 효율적으로 발현되도록 최적화될 수 있다.
일례로서, 전형적인 대장균용의 발현 벡터(플라스미드)의 조제법에 대해서 설명한다. 제1 폴리뉴클레오티드의 5'측에, 대장균의 페리플라즘 간극으로 수송하기 위한 시그널 서열(OmpA 등)에 이어서 정제용 태그 서열(Strept-tag(등록상표) 등)을 배치하고, 또한 대장균의 페리플라즘 간극내 효소(DsbC 등)와의 융합 단백질로서 발현하도록, 프로모터 서열을 포함하는 제어 서열을 부가하고, 3'측에는 정지 코돈을 부가한다. 페리플라즘 간극내 효소와의 융합은, 폴리펩티드의 가용성을 높이고, 페리플라즘 간극 내에서의 안정된 발현을 가능하게 한다.
(공정 2) 그람 음성균의 형질 전환과 폴리펩티드의 발현
상기 발현 벡터를 사용해서 그람 음성 세균을 형질 전환하고, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드에 코드되는 폴리펩티드를 발현시킨다. 그람 음성균의 형질 전환은, 일렉트로포레이션, 염화칼슘법 등, 당해 분야에서 공지된 방법을 사용해서 실시할 수 있다.
제1 폴리뉴클레오티드에 코드되는 폴리펩티드는, 전사·번역 후, 분비 시그널에 의해, 페리플라즘 간극 내에 분비된다. 1개의 세포에는 1개의 발현 벡터에 포함되는 1종류의 제1 폴리뉴클레오티드가 도입되고, 그 때문에, 1종류의 폴리펩티드가 페리플라즘 간극 내에 분비된다. 한편, 제2 폴리뉴클레오티드에 코드되는 표적 단백질은 모든 세포에서 공통이며, 내막 상에 발현된다.
(공정 3) 폴리펩티드와 표적 단백질의 접촉
페리플라즘 간극 내에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드에 코드되는 폴리펩티드는, 내막 상에 발현하고 있는 표적 단백질과 접촉 가능한 상태가 된다(도 1). PERISS법과 마찬가지 원리로, 표적 단백질에 대하여 친화성을 갖는 폴리펩티드는, 내막상의 표적 단백질에 결합하고, 복합체를 형성한다.
(공정 4) 표적 단백질에 대한 폴리펩티드의 활성 측정
그람 음성균을 스페로플라스트화하고, 전기 생리학적 방법에 의해, 표적 단백질에 대한 폴리펩티드의 활성을 측정한다.
「스페로플라스트」란, 그람 음성균의 세포벽이 부분적으로 상실되고, 구상이 된 세포이다. 스페로플라스트화는, 리소자임이나 페니실린 등으로 그람 음성균을 처리함으로써 실시할 수 있다. 스페로플라스트화한 그람 음성균은 부분적으로 세포막이 상실되고 있기 때문에, 전기 생리학적 방법에 의해 표적 단백질과 폴리펩티드의 상호 작용에 관한 정보(전기 생리학적 변화)를 해석할 수 있다. 또한, 1개의 세포의 스페로플라스트내에는 동일한 폴리펩티드가 고농도로 존재하고, 당해 폴리펩티드의 표적 단백질에 대한 활성을 측정하는 데 좋은 조건으로 되어 있다.
「전기 생리학적 방법」으로서는, 패치 클램프법(Patch clamp technique)을 이용할 수 있다. 패치 클램프법은 이온 채널이나 트럼프 포터를 개재한 이온의 거동을 기록함으로써, 세포막 상의 이온 채널이나 트랜스포터의 활동을 직접적으로 측정하는 방법이다. 패치 클램프법으로는, 유리 전극과 세포막 사이에 저항이 높은 시일을 형성시킴으로써, 전극 선단과 동일 정도의 크기인 작은 세포로부터의 전위 측정이 가능하고, 세포막 상의 이온 채널 등의 미소 전류를 측정하는 것이 가능하다. 패치 클램프법에는, 셀 어태치법, 전세포법 등, 다양한 방법이 알려져 있고, 당업자는, 목적에 따라 이들 방법을 적절히 선택하여, 사용할 수 있다.
「전기 생리학적 방법」으로서는, 아프리카발톱개구리 등의 난모 세포나 CHO 등의 배양 세포를 사용한 2개 전극 전위 고정법을 이용할 수도 있다. 예를 들어, 1회 막 관통형 단백질의 페리플라즘측에 펩티드를 결합해서 발현시키는 것으로, 세포막에 앵커링한 상태에서 당해 펩티드를 발현시킬 수 있다. 이 방법에서, 아프리카발톱개구리 난모 세포에 이온 채널을 발현시키고, 동시에 난모 세포의 세포막에 앵커링한 형태로 펩티드를 발현시키고, 2개 전극 전위 고정법에 의해 활성을 측정 할 수 있다. 이 방법에 의하면, 프리의 펩티드로 측정하는 것보다 측정 효과가 좋아질 것으로 생각된다. 이 방법은 일반적으로는 멤브레인-테더드 톡신법이라 불린다(Ibanez-Tallon et al. Neuron, 43, 305-311, 2004).
활성 측정은 표적 단백질 등의 특성에 의하지만, 예를 들어 정지 막 전위 변화 -80㎷ → +20㎷에서 얻어지는 측정 전류값 변화나 -80㎷부터 +10㎷ 스텝으로 +60㎷까지 막 전위를 변화시켰을 때의 측정 전류값 변화를, 폴리펩티드를 발현하지 않고 있는 네거티브 컨트롤과 비교함으로써 측정할 수 있다.
종래의 PERISS법에서는, 페리플라즘 간극 내에서의 표적 단백질과 폴리펩티드의 결합은 평가할 수 있었지만, 표적 단백질에 대한 폴리펩티드의 활성(아고니스트 활성 또는 안타고니스트 활성)을 평가할 수는 없었다. 본 발명의 방법에서는, 폴리펩티드가 표적 단백질에 상호 작용함으로써 발생하는 세포의 전기 생리학적 변화를, 그람 음성균을 스페로플라스트화해서 측정함으로써, 표적 단백질에 대한 폴리펩티드의 활성을 직접 평가하는 것이 가능해진다.
(공정 5) 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드의 동정
마지막으로, 전기 생리학적 방법에 의해 측정된 활성에 기초하여, 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드를 동정한다.
예를 들어, 표적 단백질이 이온 채널의 경우, 폴리펩티드의 결합에 의해 이온 채널을 개재한 전류가 유의미하게 저해된 경우, 당해 폴리펩티드는 표적 단백질에 대한 안타고니스트 활성을 가지면 폴리펩티드와 동정할 수 있다. 한편, 폴리펩티드의 결합에 의해 이온 채널을 개재한 전류가 유의미하게 촉진된 경우, 당해 폴리펩티드는 표적 단백질에 대한 아고니스트 활성을 가지면 폴리펩티드와 동정할 수 있다. 측정한 활성은, 상기한 바와 같이, 폴리펩티드 및 이것을 코드하는 폴리뉴클레오티드 서열과 일대일로 대응하고 있다. 따라서, 원하는 활성을 갖는 세포로부터 발현 벡터(플라스미드) 정제하고, 그 서열을 생어법 등으로 결정함으로써, 목적으로 하는 폴리펩티드의 아미노산 서열을 동정할 수 있다. 트랜스포터도 미소 전류를 흘리는 것이 알려져 있고, 그 전류의 저해를 개재하여, 활성을 측정할 수 있다. GPCR 등의 막 수용체에 대해서는, Kir 등의 이온 채널을 C 말단측으로 연결함으로써 수용체의 구조 변화를 이온 채널의 활성으로서 측정할 수 있다.
1.3 라이브러리의 농축
본 발명에서 사용하는 라이브러리는, 표적 단백질에의 결합에 대해서, 미리 농축되어 있는 것이 바람직하다. 라이브러리의 농축은 기존 공보(WO2010/104114, 일본특허공개 제2014-207905)에 따라, 공정 1 내지 공정 3을 실시하고, 표적 단백질에 결합한 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 선택·증폭하는 것을 반복함으로써 실시할 수 있다.
구체적으로는, 표적 단백질에 결합한 폴리펩티드를 포함하는 세포를 선택한 후, 세포 내에 포함되는 당해 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 미니프렙법 등을 이용해서 회수하고, 증폭하고, 제2 라이브러리를 제작한다.
표적 단백질에 결합한 폴리펩티드의 회수는 그람 음성균을 스페로플라스트화한 후, 폴리펩티드에 미리 도입한 태그(예를 들어, Strept-tag(등록상표))를 이용하고, 이 태그에 결합하는 비즈(Strep-Tactin(등록상표)비즈 등)에 의해 선택하는 방법이 전형적이다. 태그로서는 스트렙트아비딘이나 그 개량 단백(Strept-tag(등록상표)) 외, T7, 히스티딘, FLAG 태그 등을 이용할 수 있고, 자기 비즈, 세파로스 비즈, 아가로오스 비즈, 다공성 등의 비즈, 플레이트 또는 멤브레인을 사용해서 선택할 수 있다.
선택된, 비즈에 고정된 상태의 「폴리펩티드-막 단백질-스페로플라스트 복합체」의 스페로플라스트 세포 내부로부터, 플라스미드 DNA를 단리하고, 당해 플라스미드 DNA 중에서 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 구성하는 폴리뉴클레오티드 서열을 PCR에서 증폭하고, 제2 라이브러리를 제작한다. 제2 라이브러리는 원래의 라이브러리와 동일한 랜덤화 영역 및 프레임워크 영역을 갖지만, 라이브러리 전체로서 표적 단백질과의 친화성이 증가하고 있고, 랜덤화 영역의 서열 다양성이 감소하고 있는(「농축되어 있는」) 것이다. 이 공정을 반복하여, 다수 라운드의 선택 및 라이브러리의 생성을 행함으로써, 표적과의 친화성이 보다 높은 폴리펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드의 집합(농축된 라이브러리)을 얻을 수 있다(도 1 참조).
제2 라운드 이후의 선택 라운드에 있어서는, 폴리펩티드-막 단백질-스페로플라스트 복합체의 인큐베이션 시간을 감소시키거나, 세정의 횟수를 증가시키거나, 온도를 높이는 것에 의해, 선택압을 순차 높게 하여, 보다 결합 친화성이 높은 폴리펩티드를 농축할 수 있다.
농축 공정의 횟수는 사용하는 라이브러리의 구조나 사이즈에 따라 다르지만, 통상 2 내지 10라운드, 바람직하게는 3라운드 이상(예를 들어, 3 내지 8라운드), 보다 바람직하게는 5라운드 이상(예를 들어 5 내지 7라운드) 행하는 것이 바람직하다.
2. 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드의 제조 방법
상기와 같이 해서 동정된 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드는, 그 구조에 따라, 유전자 재조합, 또는 화학 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드의 제조 방법도, 본 발명의 범위 내이다.
3. ODA법을 이용한 라이브러리의 제작 방법
본 발명은 ODA(Optimal Docking Area)법을 이용한 라이브러리의 제작 방법도 제공한다.
「ODA법」란, 특정한 단백질에 있어서, 탈용매화 에너지에 기초하여, 단백질 상호 작용 영역을 예측하는 방법이다(Juan Fernandes-Recio et al. "Optimal Docking Area: A New Method for Predicting Protein- Protein Interaction Sites" POTEINS: Structure, Function, and Bioinformatics 58:134-143(2005)). 본 발명에 있어서는, ODA법에 의해 특정한 단백질 표면에 있어서의 탈용매화 에너지값이 작은 영역을, 단백질 상호 작용이 예측되는 부위(다른 단백질과 상호 작용할 가능성이 높은 부위)로서, 당해 부위를 랜덤화한 복수의 폴리펩티드로 구성되는 폴리펩티드 라이브러리를 제작한다. 또한, 상기 폴리펩티드를 코드하는 복수의 폴리뉴클레오티드로부터 이루어지는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 제작한다.
구체적으로 말하면, 본 발명의 폴리펩티드 라이브러리의 제작 방법은, 이하의 공정을 포함한다:
(1) 기지의 막 단백질의 리간드에 대해서, 상기 리간드의 입체 구조에 ODA법을 적용하여, 다른 단백질과 상호 작용할 가능성이 높은 부위를 예측하는 공정;
(2) 상기 리간드의 아미노산 서열에 있어서, 예측된 부위를 랜덤화한 복수의 폴리펩티드를 제작하는 공정;
(3) 상기 복수의 폴리펩티드를 포함하는 폴리펩티드 라이브러리를 제작하는 공정.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 라이브러리의 제작 방법은 이하의 공정을 포함한다:
(1) 기지의 막 단백질의 리간드에 대해서, 상기 리간드의 입체 구조에 ODA법을 적용하여, 다른 단백질과 상호 작용할 가능성이 높은 부위를 예측하는 공정;
(2) 상기 리간드의 아미노산 서열에 있어서, 예측된 부위를 랜덤화한 복수의 폴리펩티드를 설계하고, 상기 폴리펩티드를 각각 코드하는 복수의 폴리뉴클레오티드를 제작하는 공정;
(3) 상기 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 제작하는 공정.
막 단백질로서는 1.1에 기재한 막 수용체, 이온 채널, 트랜스포터를 이용할 수 있다. 바람직하게는, 막 단백질은 막 수용체 또는 이온 채널이다.
기지의 막 단백질의 리간드로서는 상기 막 단백질의 리간드로서, 그 구조가 공지된 폴리펩티드이면, 특별히 한정되지 않는다. 그러한 리간드가 적합한 일례로서, ICK 폴리펩티드를 들 수 있다.
ICK 폴리펩티드는 거미 독액 성분에 포함되는, Inhibitor Cystine Knots(ICK)라 불리는, 특유의 구조 모티프를 갖는 일련의 폴리펩티드이다. 이 구조 모티프는 6개의 시스테인 잔기(Cys-1-Cys-6)를 포함하고, Cys-1과 Cys-4, Cys-2와 Cys-5 및 Cys-3과 Cys-6이 S-S 결합함으로써 형성되는 매듭상의 시스테인 결합을 포함한다. ICK 폴리펩티드에서는, 이 구조 모티프는 엄밀하게 보존되어 있지만, 그 이외의 서열은 다양하다. 전술한 바와 같이, ICK 폴리펩티드와 같이 복잡한 구조를 갖는 펩티드는, 무세포계에서 발현시키는 것은 곤란하기 때문에, 본 발명의 스크리닝계에 적합하다. 공지된 ICK 펩티드의 예는, 예를 들어 하기 표에 나타내는 것을 들 수 있지만 이들에 한정되지 않는다.
Figure pct00001
GTx 시리즈도 적합하게 이용할 수 있다(전술 Kimura, et al, 2012). GTx 시리즈 중, GTx1과 GTx2는 ICK 펩티드이다. GTx3은 MIT1이나 프로키네티신 등이 대표예이며, GTx4, GTx5 및 GTx6은 분자 내에 복수의 SS 결합을 갖는 디술피드·리치·펩티드이고, GTx7은 환상 펩티드이다. 기타, 청자고둥의 코노톡신류도 사용할 수 있다.
리간드의 입체 구조는, 공지된 정보를 이용해도 되고, NMR을 사용해서 결정 해도 되고, 호몰로지 모델링을 사용해서 예측해도 된다. 어느 방법에 의해 입체 구조에 관한 정보를 얻을지는, 리간드의 사이즈나 구조에 따라 적절히 선택한다.
본 발명의 방법에서는, ODA법에 의해, 리간드의 입체 구조로부터 다른 단백질과 상호 작용할 가능성이 높은 부위를 예측하고, 그 부위를 랜덤화한 라이브러리를 제작함으로써, 본래의 표적 분자(기지의 막 단백질)뿐만 아니라, 그 이외의 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드의 효율적인 스크리닝도 가능해진다. 따라서, 오펀 수용체의 리간드 탐색에도 이용할 수 있다.
본 발명의 방법으로 제작되는 라이브러리는, 본 발명의 스크리닝 방법에 적합하게 이용할 수 있지만, 무세포계를 이용한 계 등, 그 이외의 스크리닝 방법에도 이용할 수 있다.
제작한 라이브러리는, 목적에 따라, 당해 분야에서 공지된 방법에 의해, 라이브러리의 농축을 행해도 된다. 농축 공정은, 예를 들어 PERISS법을 적용하는 경우에는, 통상 2 내지 10라운드, 바람직하게는 3라운드 이상(예를 들어, 3 내지 8라운드), 보다 바람직하게는 5회 이상(예를 들어, 5 내지 7라운드) 행한다. 또한, 시험관 내 분자 진화를 적용하여, 스크리닝에서 선택된 폴리펩티드의 서열에 대해서, 그 서열의 일부를 더욱 랜덤화한 자손 라이브러리를 제작해도 된다.
4. 본 발명의 폴리펩티드 라이브러리 및 폴리뉴클레오티드 라이브러리
발명자들은 본 발명의 방법에 의해, ICK 펩티드의 1종인 GTx1-15의 구조에 기초하는, 폴리펩티드 라이브러리와 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 제작했다. 본 발명은 이들 라이브러리도 제공한다.
GTx1-15의 구조에 기초하는 폴리펩티드 라이브러리는, 하기의 아미노산 서열을 갖는 서로 다른 복수의 폴리펩티드를 포함한다.
DCLGXXRKCIPDNDKCCRPXLVCSRTHKXCXXXX(서열번호 1)
GTx1-15의 구조에 기초하는 폴리뉴클레오티드 라이브러리는, 상기 아미노산 서열(서열번호 1)을 갖는 서로 다른 폴리펩티드를 코드하는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 라이브러리는, 적당한 발현 벡터에 도입하고, 숙주 세포를 형질 전환함으로써, 폴리펩티드로서 발현시킬 수 있다. 상기한 바와 마찬가지로, 본 발명의 라이브러리는, 무세포계를 이용한 계 등, 그 이외의 스크리닝 방법에도 이용할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드 라이브러리를, PERISS법이나 본 발명의 스크리닝 방법에 있어서 사용하는 경우에는, 라이브러리의 멤버인 복수의 폴리뉴클레오티드는, 각각 그람 음성균으로 발현 가능한 발현 벡터에 삽입된다. 이 경우, 발현 벡터에는, 상기 폴리뉴클레오티드 외, 분비 시그널 서열 및 표적 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 발현 벡터는, 당해 분야의 기술 상식 및 상기 1.2의 기재에 기초하여 설계할 수 있다.
5. 본 발명의 스크리닝에서 얻어진 표적 단백질과 작용하는 폴리펩티드의 용도
본 발명의 스크리닝 방법에서 얻어진 폴리펩티드는, 표적 단백질을 타깃으로 하는 창약 외, 시료 중의 표적 단백질을 검출하기 위한 검출 시약, 표적 단백질 정제용의 어피니티 담체 등으로서 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서의 바람직한 표적 단백질은, 생체막 표면에서 각종 정보 전달에 관련되어 있는 막 단백질이다. 따라서, 표적 단백질인, 각종 막 수용체, 약물 트랜스포터, 이온 채널 등의 아고니스트, 안타고니스트의 탐색 이외, 오펀 수용체의 리간드 물질의 탐색에도 유용하다. 본 발명의 스크리닝에서 얻어진 폴리펩티드는, 그 자체에 치료제나 진단약 등의 약리 작용을 기대할 수 있는 것 외에, 장래의 창약 개발의 리드 화합물을 제공할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법에서 얻어진 폴리펩티드의 일례로서, 서열번호 4 내지 9에 나타나는 폴리펩티드를 들 수 있다. 이들의 폴리펩티드 중, 서열번호 4 내지 7 및 9는, GTx1-15의 골격에 기초하여 설계된 라이브러리로부터, 칼륨 채널인 인간 Kv2.1에 대한 아고니스트 또는 안타고니스트 활성을 갖는 것으로서 선택, 동정된 것이다. 또한 서열번호 8에 나타나는 폴리펩티드는, 어느 활성도 나타내지 않는 것으로서 선택, 동정된 것이다. 췌장의 β 세포에 있는 칼륨 채널인 Kv2.1은 세포막의 흥분 상태를 원래의 정지 막 전위로 되돌리는 지연 정류성 채널이며, 이것을 저해하면 세포의 흥분 상태가 연장되어 β 세포로부터의 인슐린 방출을 증대할 수 있는 것이 알려져 있다. 따라서, 안타고니스트 활성이 있는 펩티드는, 당뇨병 치료약으로서 기대할 수 있다. 또한, 위암이나 자궁암에서 Kv2.1의 발현이 증대하고 있는 것이 알려져 있기 때문에, 안타고니스트 활성이 있는 펩티드는 위암이나 자궁암의 치료약으로서도 기대할 수 있다. 한편, 수아종 메둘로블라스토마의 Kv2.1을 활성화함으로써 아포토시스를 유도하는 등, 아고니스트 활성이 있는 펩티드는, 암의 증식을 억제하는 치료약으로서 기대할 수 있다. 어느 활성도 나타내지 않는 펩티드도 결합제로서 이용 가능하다.
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명에 대해서 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 펩티드 라이브러리의 제작
표적 막 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 탐색하기 위한 펩티드 라이브러리를, ICK 펩티드인 GTx1-15(서열번호 2)에 ODA법을 이용해서 제작했다. ODA법은 펩티드 또는 단백질 분자의 탈용매화에 기초해서 그 분자가 다른 분자와 상호 작용하는 부위를 예측하는 방법이다(Proteins. 2005 Jan 1;58(1):134-43). 본 방법에서 얻어지는 화상에 있어서, 「구체」의 크기는 그 에너지값에 따른다. 큰 사이즈의 「구체」는 작은 에너지값을 나타내고, 고도로 단백질-단백질 상호 작용에 관계하고 있는 부위라 생각된다.
발명자는 호몰로지 모델링에 의해 예측한 GTx1-15의 입체 구조에 ODA법을 적용하고, GTx1-15에 있어서, 고도로 단백질-단백질 상호 작용에 관계하고 있는 부위를 특정하고 있다(도 2, 전술 Ono et al. 2011). 이 부위는, 표적 분자 이외의 단백질과도 상호 작용할 가능성이 예상되며, 따라서 이 부위를 라이브러리화하면, 펩티드 본래의 표적 분자와는 달랐던 표적 분자에 대한 펩티드를 스크리닝하는 것이 가능해진다고 생각된다.
그래서, 특정된 부위를 랜덤화하여, 폴리펩티드를 탐색하기 위한 펩티드 라이브러리를 제작했다.
얻어진 펩티드 라이브러리의 아미노산 서열은, 하기와 같다.
DCLGXXRKCIPDNDKCCRPXLVCSRTHKXCXXXX(서열번호 1)
실시예 2: PERISS법을 사용한 표적 단백질에 결합하는 펩티드의 스크리닝
표적 단백질인 인간 Kv2.1을 코드하는 DNA(서열번호 3)를 플라스미드에 내장했다. 이 플라스미드를 대장균 C43(DE3)주에 트랜스폼하고, LB 한천 배지에 전개해서 콜로니를 얻었다. 단일 콜로니를 사용해서 거대 스페로플라스트를 제작하고, 기보에 따라, 패치 클램프법으로 발현 전류를 측정하고, Kv2.1의 전류를 측정할 수 있는 것을 확인했다(전술 Kikuchi et al. Biotechnology Reports, 2015).
상기 플라스미드에, 실시예 1에서 제작한 펩티드 라이브러리를 탠덤에 내장하고, 단일의 플라스미드로부터 표적막 단백질과 펩티드 라이브러리가 동시에 발현하는 컨스트럭트(펩티드 라이브러리 플라스미드 DNA)를 제작했다(도 3). 도 3에 도시한 바와 같이, ODA 펩티드 라이브러리를 코드하는 DNA 서열의 5'측에는, 시그널 서열인 OmpA에 이어 정제용 Strept-tag(등록상표)를 배치하고, 대장균의 페리플라즘 간극 내 효소인 DsbC를 코드하는 서열을 링커를 개재해서 부가했다.
이하와 같이, 제작한 펩티드 라이브러리 플라스미드 DNA에 PERRIS법을 적용하고, 표적 단백질(인간 Kv2.1)에 결합하는 펩티드를 탐색했다.
E. coli C43(DE3)주의 적격 세포 100μL에 펩티드 라이브러리 플라스미드 DNA를 더하고, 빙상에서 3분 방치했다. 이어서, 그 세포 현탁액을 일렉트로포레이션용 큐벳트로 옮기고, 일렉트로포레이션을 행하여, 세포주에 플라스미드 DNA를 도입했다. 일렉트로포레이션 처리한 세포를 포함하는 세포 현탁액을 100μL당 1mL의 SOC 배지에 현탁하고, 15mL 튜브로 옮기고 37℃, 200rpm, 1시간 회복 배양을 행하였다. 회복 배양액 전량을 LB 플레이트(50μg/ml 암피실린 함유)에 도말했다. 그 후, 37℃에서 약 16시간 배양을 행하였다. 배양 후, LB 플레이트 배지 표면에 1매당 3mL의 LB 배지(50μg/ml 암피실린 함유)를 적하하여, 균체와 잘 현탁했다. 균체 현탁액을 100ml LB 배지(50μg/ml 암피실린 함유)를 넣은 500ml 삼각 플라스크에 접종, 37℃, 200rpm으로 배양했다. 배양 개시로부터 1시간 후, 100μl의 IPTG를 첨가(최종 농도 1mM)하고, 배양 온도를 25℃로 변경하고, 200rpm으로 배양을 계속했다. 배양 개시로부터 약 3.5 시간 후에 배양물을 원심용 튜브로 옮기고, 실온, 2000g의 조건에서 5분간 원심 분리 처리를 행하였다. 원심 처리 후, 통상의 방법에 의해 스페로플라스트화했다. 1mL의 0.6M 자당 완충액(750μL 0.8M Sucrose, 20μL 1M Tris-HCl, 230μL H2O, 5㎎ BSA)으로 스페로플라스트를 현탁했다. 스페로플라스트 현탁액에 스트렙트아비딘 자기 비즈를 첨가했다. 비즈 현탁 스페로플라스트 용액을 실온에서 20분간 완만하게 진탕했다. 자기 스탠드를 사용하여, 1mL의 0.6M 자당 완충 세정액(15mL 0.8M Sucrose, 0.6mL 5M NaCl, 0.4mL 1M Tris-HCl, 2mL H2O)으로 2회 자기 비즈를 세정했다. 세정 후, 회수한 스페로플라스트 균체로 플라스미드를 정제했다.
표적 단백질에 결합하는 펩티드를 농축하기 위해서, 정제한 플라스미드를 E. coli C43(DE3)주의 적격 세포 100μL 중에 더하여, 상기의 방법과 마찬가지로 PERISS법(즉, 표적 단백질에 결합하는 펩티드를 발현하는 플라스미드의 농축 공정)을 4회 반복하고, 합계 5회 PERISS법을 적용했다.
실시예 3: 농축된 라이브러리에 포함되는 펩티드의 활성 결정
PERISS법을 5회 실시하고, 표적 단백질에 결합하는 펩티드가 농축된 라이브러리에 포함되는 펩티드의 활성을, 패치 클램프법을 사용해서 결정했다.
농축 후의 플라스미드를 사용하여, C43(DE3) 대장균주를 형질 전환했다. E. coli C43(DE3) 라이브러리 플라스미드 도입주를 50μg/ml 암피실린 함유 LB 배지의 2% 한천 플레이트에 획선 도말하고, 37℃, 24시간 정치 배양했다. 정치 배양 후, 배양 플레이트의 1콜로니를 10ml LB 배지(50μg/ml 암피실린 함유)를 넣은 100ml 삼각 플라스크에 접종하고, 37℃, 200rpm으로 18시간 진탕 전 배양했다. 전 배양 후, 100μl의 50μg/ml 암피실린과 600μl의 10㎎/ml 세팔렉신을 첨가한 100ml LB 배지를 분주한 500ml 삼각 플라스크에, 1ml의 전 배양액을 식균하고, 37℃, 200rpm으로 진탕 본 배양했다. 본 배양 개시로부터 1시간 후, 100μl의 1M IPTG를 첨가(최종 농도 1mM)하고, 배양 온도를 30℃로 변경해서 200rpm으로 배양을 계속했다. O.D.600이 0.2 내지 0.4에 달한 시점에서 배양물을 원심용 튜브로 옮기고, 스페로플라스트 조제용 샘플에 제공했다. 원심용 튜브로의 이동은 50ml tube에 배양액 45ml를 옮기는 것으로 행하였다. 신장한 대장균을 집균, 상청을 제거했다. 통상의 방법에 의해 대장균을 스페로플라스트화하고, 거대 스페로플라스트를 얻었다. 제작한 거대 스페로플라스트를 사용해서 전기 생리학적 측정을 나니온(Nanion)사 포트-어-패치(Port-a-patch) 장치에 의해 행하였다. 정지 막 전위를 -80㎷로 고정하고 +20㎷로의 전위 변화 자극을 부여하고, 내막에 발현하고 있는 인간 Kv2.1 전류를 측정했다. 21개의 클론의 전류를 측정하고, 펩티드를 발현하지 않고 인간 Kv2.1만을 발현하고 있는 클론의 전류를 대조로서 해석했다.
그 결과, 클론 4, 9, 16 및 46이 안타고니스트 활성을 나타내고, 클론 30이 아고니스트 활성을 나타냈다(도 4). 32는 양쪽 활성을 나타내지 않고 결합제 활성을 나타내고 있다고 생각된다.
클론 4, 9, 16, 30, 32 및 46의 DNA 서열을 결정하고, 펩티드의 아미노산 서열을 명백히 하였다.
클론 4: DCLGRRRKCIPDNDKCCRPLLVCSRTHKGCWVMG(서열번호 4)
클론 9: DCLGSSRKCIPDNDKCCRPPLVCSRTHKSCTLFL(서열번호 5)
클론 16: DCLGRWRKCIPDNDKCCRPILVLCTPSG(서열번호 6)
클론 30: DCLGPLRKCIPDTTNAVVQILYAVERTKKCWSAK(서열번호 7)
클론 32: DCLGSVRKCIPDNDKCCRPVLVCSRTHKFCFLVM(서열번호 8)
클론 46: DCLGYWRKCIPTTTNAVVQVLYAVERHKECIMAK(서열번호 9)
클론 16과 30, 46은 원래의 라이브러리의 서열과 다르지만, 이러한 신규 서열이 얻어진 경우, 이들 서열을 기초로 해서 새로운 연구로 진행하는 것이 가능한 것도 본법의 유리한 점이다.
PERISS법을 5회 실시한 플라스미드 DNA 서열을 차세대 시퀀서로 해석한바, 상기 클론 4, 9, 30, 32 및 46이 포함되어 있는 것을 알 수 있다(도 5).
종래법으로는, 차세대 시퀀서의 결과가 나오고 나서 활성 측정에 제공하는 후보 펩티드를 결정한다. 그 후, NEB사의 pMal 시스템(고가용성 MBP(말토오스 결합성 단백질) 태그에 의한 고수량 단백질 발현 시스템) 등을 사용해서 당해 펩티드를 페리플라즘 간극 내에 발현시키고, MBP 태그를 사용해서 정제하지만, 그 공정에는 펩티드의 올리고 DNA의 합성, 재조합, 서열 확인, 발현, 정제 등이 포함되며, 최저로도 1개월은 걸린다. 그 때문에, 차세대 시퀀서를 위한 샘플 조제도 포함하면 전기 생리학적 측정 결과가 나올 때까지 2개월 가까이 걸리게 된다.
본 실시예에서는, 5회째의 PERISS법이 끝나고 나서 전기 생리학적 측정 결과가 나올 때까지 2일밖에 걸리지 않고, 그 후의 생어법에 의한 DNA는 서열의 결정도 포함하여 일주일이면 되므로, 종래의 PERISS법과 비교해서 압도적인 속도로 후보 펩티드의 활성을 결정할 수 있다.
참고예 1: GTx1-15의 THP-1 세포에 대한 영향
THP-1 세포를, L-글루타민 및 페니실린, 스트렙토마이신을 보충한 10% 소 태아 혈청을 함유하는 RPMI-1640 중에서 배양했다. 세포 독성 어세이를 위해서, 3×104 THP-1 세포를, 80μl의 RPMI-1640 배지를 포함하는 96웰 플레이트의 단일 웰에 접종했다. 접종 직후에, 20μl의 GTx1-15 용액을 웰에 첨가했다. GTx1-15의 최종 농도는 1, 3, 10 및 30μg/mL였다. 대조로서, GTx1-15 용액 대신에 RPMI1640 배지를 웰에 첨가했다. 24시간의 인큐베이션 후, 세포 독성을 시험했다. 10μl의 WST-1 용액을 각 웰에 간단하게 첨가하고, 37℃에서 2시간 인큐베이트했다. 인큐베이션 후, 450㎚/620㎚으로 마이크로플레이트 리더를 사용해서 흡수를 측정했다.
면역원성 어세이를 위해서, 2.4×106의 THP-1 세포를, 1.2ml의 RPMI-1640 배지를 포함하는 12웰 플레이트의 단일 웰에 접종했다. 접종 직후에, GTx1-15 용액 또는 DNCB 용액을 각 웰에 첨가했다. GTx1-15의 최종 농도는 1, 3 및 10μg/mL이며, 양성 대조로서의 DNCB 농도는 4μg/mL였다. 24시간의 인큐베이션의 후, THP1 세포를 1000g으로 5분간 원심 분리에 의해 수집하고, 이어서, 전체 RNA를, RNeasy Mini Kit(QIAGEN)를 사용해서 세포로부터 추출했다. 전체 RNA를 주형에 cDNA를 합성했다. 인간 CD80, CD86, CD54 및 GAPDH의 발현량을 각각에 특이적 프라이머를 사용한 정량 PCR로 정량했다.
GTx1-15는 THP-1 세포에 대하여, 1-30μg/ml의 농도에 있어서, 세포 상해성을 나타내지 않았다(도 6). 또한, CD86, CD80, CD54의 유의미한 발현은 인지되지 않고, 면역원성도 없는 것이 확인되었다(도 7).
참고예 2: GTx1-15의 온도 안정성
GTx1-15(24.7μM, 10μg/100μl)를 다양한 온도(20, 37, 50, 75 및 95℃)에서 24시간 인큐베이트함으로써, 열 안정성을 검토했다. 24시간 후, 100μl의 시료를 400μl의 0.05% TFA 용액으로 희석하고, 그 후, Superiorex ODS 칼럼(4.6×250㎜, Shiseido)을 사용해서 분리, 1ml/분의 유속으로 0.05% TFA를 포함하는 0% 내지 30% 아세토니트릴의 직선 구배로 용출시켰다. GTx1-15양을 나타내는 피크 면적을 Unicorn 소프트웨어 버전 7.1의 평가 함수를 사용해서 계산했다.
GTx1-15는 20℃ 내지 75℃에서 거의 분해되지 않고 유지되고, 95℃에 있어서도 70%가 분해되지 않고 유지되고 있었다(도 8).
발명자들은, GTx1-15 등의 ICK 펩티드가 소화 효소로 분해되지 않고, 래트 혈장 중에서 37℃, 24시간 인큐베이트해도 분해는 인지되지 않고, 정맥 내 투여에 의해 수 시간에 걸쳐 혈중에 검출할 수 있는 것을 확인하였다(전술 Kikuchi et al. International Journal of Peptides, 2015). 또한, GTx1-15는 세포 상해성이나 면역원성을 나타내지 않고, 고온 안정성을 갖고, 의약품으로서의 기본적인 특성을 구비한 펩티드라고 할 수 있다. 이것은, GTx1-15를 주형으로서 구축한 펩티드 라이브러리에서 얻어지는 펩티드도 마찬가지 특성을 갖는 것을 시사한다. 이 특성은 GTx1-15뿐만 아니라, 다른 ICK 펩티드에도 공통인 것인 것이 기대된다.
본 발명은 막 수용체, 약물 트랜스포터, 이온 채널 등의 아고니스트, 안타고니스트의 탐색, 오펀 수용체의 리간드 물질의 탐색 및 창약 개발에 있어서 유용하다.
본 명세서 중에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허 출원을 그대로 참고로 해서 본 명세서 중에 있어서 도입하는 것으로 한다.
서열표 프리 텍스트
서열번호 1: 합성 펩티드(GTx1-15에 기초하는 라이브러리)
서열번호 4: 합성 펩티드(클론 4)
서열번호 5: 합성 펩티드(클론 9)
서열번호 6: 합성 펩티드(클론 16)
서열번호 7: 합성 펩티드(클론 30)
서열번호 8: 합성 펩티드(클론 32)
서열번호 9: 합성 펩티드(클론 46)
서열번호 10 내지 27: 합성 펩티드(농축 후(5 rounds) 플라스미드 DNA 서열)
SEQUENCE LISTING <110> The National Institute of Advanced Industrial Science and Technology <120> Method for screening polypeptides acting on a target protein <130> PSK-9038WO <150> JP2020-132823 <151> 2020-08-05 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (library based on GTx1-15) <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (20)..(20) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <220> <221> misc_feature <222> (31)..(34) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 1 Asp Cys Leu Gly Xaa Xaa Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Xaa Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Xaa Cys Xaa Xaa 20 25 30 Xaa Xaa <210> 2 <211> 34 <212> PRT <213> Grammostola rosea <400> 2 Asp Cys Leu Gly Phe Met Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Asn Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Trp Cys Lys Tyr 20 25 30 Val Phe <210> 3 <211> 2562 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 atgacgaaac acggtagccg ctcgactagc tcgctgccgc cggaaccgat ggaaatcgtc 60 cgctctaaag cctgctcacg tcgtgttcgt ctgaatgtgg gcggacttgc ccatgaagtc 120 ctgtggcgga ccttagaccg cctgcctcgt acccgtttgg gcaaattacg cgattgcaat 180 acccacgatt ccctcttgga agtttgtgat gactactcat tggatgataa tgaatatttc 240 tttgatcggc atccgggtgc cttcacatcg attctgaact tttaccgtac ggggcgcctg 300 cacatgatgg aggaaatgtg cgctctgagc tttagtcagg aactcgacta ttggggcatt 360 gacgaaatct accttgaatc ttgctgtcaa gcgcgctatc accagaaaaa agagcagatg 420 aacgaagaac ttaaacgcga agcggaaacg ctgcgcgaac gcgaaggtga agaatttgac 480 aacacctgtt gcgcggaaaa gcgcaagaaa ttgtgggatt tgctggaaaa gccgaactct 540 agtgtcgcgg cgaaaattct ggccattatc agcattatgt ttatcgtgtt atcgactatt 600 gcactgtccc tcaatacgtt accagaactg caatcactcg atgagtttgg gcaaagtacc 660 gataatccgc agttggccca cgtggaagcc gtatgcattg cgtggtttac catggaatac 720 ttgttgcgct ttctgagcag tcccaaaaaa tggaaattct tcaaaggtcc acttaacgcg 780 attgatctgc ttgccattct gccgtattac gttaccatct tcctgaccga gtcaaacaaa 840 tcggtgttgc agtttcaaaa cgttcggcgc gtcgtccaga ttttccggat tatgcgtatt 900 ctgcgcattc tgaaactggc ccgtcattcc accgggcttc aaagcctggg ctttacgctg 960 cgtcgcagct ataatgaact gggactcctg attctgtttc tggcgatggg catcatgatc 1020 ttcagctcac tcgtgttctt tgcggagaag gatgaggatg atacgaaatt caaatccatc 1080 ccggcaagct tttggtgggc tacgattacc atgacgaccg tgggttacgg tgacatttat 1140 ccgaaaacct tgctgggcaa aatcgtcggt ggcctttgct gtattgctgg cgtgctggtc 1200 atcgcgctgc cgattcccat tattgtgaat aacttctcag aattttacaa agaacagaag 1260 cgccaggaga aggccatcaa acgccgtgaa gcgctggagc gcgctaaacg caatggtagt 1320 attgtaagca tgaacatgaa agacgcattt gcgcgcagca tcgaaatgat ggacatcgta 1380 gttgaaaaga atggggagaa catgggcaag aaagataagg tgcaggataa ccatctgagc 1440 ccaaacaaat ggaagtggac gaaacgcact ttatccgaaa cctctagtag caaatctttc 1500 gagactaagg aacagggatc accggagaaa gcccgctcta gttcctcccc acagcatctg 1560 aatgtgcaac agttagaaga tatgtataac aaaatggcca aaactcaaag tcaacccatt 1620 ctgaatacca aagagagtgc agcacagtcg aaaccgaaag aagaactgga gatggagtcc 1680 atcccgtcgc ctgtagcacc actgccgact cgtacggagg gtgtgattga catgcgttcc 1740 atgagctcta ttgactcctt tatcagctgt gcaaccgatt ttccggaagc aacgcgcttc 1800 tctcactccc ctctcacgtc gttaccgagt aaaacaggcg gttcgaccgc tccagaggtt 1860 ggctggcgtg gtgccctggg tgccagcgga ggacgtttcg tagaagcaaa cccgagcccg 1920 gacgcgagcc agcatagctc cttcttcatc gaatcaccga aatcttcaat gaaaaccaac 1980 aatcccctca aacttcgcgc tctgaaagtg aacttcatgg aaggggaccc ttctccactg 2040 ttgccggttc tggggatgta tcatgaccct ttacgtaacc gtggctcggc agccgcggcg 2100 gtagccggtc ttgaatgtgc cacactgtta gataaagcgg tcttatcccc ggaaagttcg 2160 atctatacaa ccgctagcgc gaaaaccccg cctcggagcc cagagaaaca tactgctatc 2220 gcatttaact ttgaagcagg cgttcatcag tacatcgatg cggataccga tgatgaaggc 2280 caactgctgt atagcgtgga ttcgagtcca ccgaaaagtt tacccggttc aacctcgccg 2340 aaattttcca caggcacccg tagcgaaaag aatcactttg agagcagtcc tctcccgaca 2400 tcgcctaaat ttctgcgcca gaattgcatt tatagcacgg aagcgctgac tggcaagggt 2460 ccgtctggcc aggagaagtg taaactggag aatcacattt ctccggacgt tcgtgtgctg 2520 cccggcggcg gtgcgcatgg ctctacacgc gatcagtcaa tt 2562 <210> 4 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (Clone 4) <400> 4 Asp Cys Leu Gly Arg Arg Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Leu Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Gly Cys Trp Val 20 25 30 Met Gly <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (Clone 9) <400> 5 Asp Cys Leu Gly Ser Ser Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Pro Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Ser Cys Thr Leu 20 25 30 Phe Leu <210> 6 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (Clone 16) <400> 6 Asp Cys Leu Gly Arg Trp Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Ile Leu Val Leu Cys Thr Pro Ser Gly 20 25 <210> 7 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (Clone 30) <400> 7 Asp Cys Leu Gly Pro Leu Arg Lys Cys Ile Pro Asp Thr Thr Asn Ala 1 5 10 15 Val Val Gln Ile Leu Tyr Ala Val Glu Arg Thr Lys Lys Cys Trp Ser 20 25 30 Ala Lys <210> 8 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (Clone 32) <400> 8 Asp Cys Leu Gly Ser Val Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Val Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Phe Cys Phe Leu 20 25 30 Val Met <210> 9 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (Clone 46) <400> 9 Asp Cys Leu Gly Tyr Trp Arg Lys Cys Ile Pro Thr Thr Thr Asn Ala 1 5 10 15 Val Val Gln Val Leu Tyr Ala Val Glu Arg His Lys Glu Cys Ile Met 20 25 30 Ala Lys <210> 10 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 10 Asp Cys Leu Gly Arg Trp Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Ile Leu Val Leu Cys Thr Pro Ser Gly Leu Val Pro Arg 20 25 30 Gly Ser <210> 11 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 11 Asp Cys Leu Gly Pro Pro Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Val Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Arg Cys Pro Thr 20 25 30 Leu Val <210> 12 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 12 Asp Cys Leu Gly Arg Arg Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Leu Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Gly Cys Trp Val 20 25 30 Met Gly <210> 13 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 13 Asp Cys Leu Gly Ser Ser Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Pro Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Ser Cys Thr Leu 20 25 30 Phe Leu <210> 14 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 14 Asp Cys Leu Gly Gly Glu Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Pro Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Tyr Cys Val Val 20 25 30 Met Ile <210> 15 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 15 Asp Cys Leu Gly Ala Leu Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Val Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Ser Cys Leu Leu 20 25 30 Ala Lys <210> 16 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 16 Asp Cys Leu Gly Glu Pro Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Tyr Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Met Cys Met Gly 20 25 30 Ile Ile <210> 17 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 17 Asp Cys Leu Gly Pro Leu Arg Lys Cys Ile Pro Asp Thr Thr Asn Ala 1 5 10 15 Val Val Gln Ile Leu Tyr Ala Val Glu Arg Thr Lys Lys Cys Trp Ser 20 25 30 Ala Lys <210> 18 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 18 Asp Cys Leu Gly Ala Phe Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Ile Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Thr Cys Ile Phe 20 25 30 Tyr Phe <210> 19 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 19 Asp Cys Leu Gly Tyr Trp Arg Lys Cys Ile Pro Thr Thr Thr Asn Ala 1 5 10 15 Val Val Gln Val Leu Tyr Ala Val Glu Arg His Lys Glu Cys Ile Met 20 25 30 Ala Lys <210> 20 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 20 Asp Cys Leu Gly Met Phe Arg Lys Cys Ile Pro Asp Lys Tyr Cys Ala 1 5 10 15 Tyr Val Ile Leu Val Pro Arg Gly Ser Ser Leu Ser Leu Ser Leu Ala 20 25 30 Ala Ala <210> 21 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 21 Asp Cys Leu Gly Met Ser Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Val Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Met Cys Ile Leu 20 25 30 Val Lys <210> 22 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 22 Asp Cys Leu Gly His Gln Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Ala Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Ala Cys Thr Phe 20 25 30 Val Ile <210> 23 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 23 Asp Cys Leu Gly Pro Ala Arg Lys Cys Ile Pro Thr Thr Thr Asn Ala 1 5 10 15 Val Val Gln Cys Leu Tyr Ala Val Glu Arg Thr Lys Thr Val Gln Val 20 25 30 Ser Asp <210> 24 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 24 Asp Cys Leu Gly Thr Asp Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Val Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Met Cys Ile Ile 20 25 30 Ala Lys <210> 25 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 25 Asp Cys Leu Gly Pro Leu Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Ile Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Phe Cys Ile Met 20 25 30 Ala Lys <210> 26 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 26 Asp Cys Leu Gly Pro Pro Arg Lys Cys Ile Pro Thr Thr Thr Asn Ala 1 5 10 15 Val Val His Thr Leu Tyr Ala Val Glu Arg Thr Lys Asn Val Leu Gly 20 25 30 Phe Val <210> 27 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic peptide (enriched (5 rounds) plasmid DNA sequence) <400> 27 Asp Cys Leu Gly Ser Val Arg Lys Cys Ile Pro Asp Asn Asp Lys Cys 1 5 10 15 Cys Arg Pro Val Leu Val Cys Ser Arg Thr His Lys Phe Cys Phe Leu 20 25 30 Val Met

Claims (15)

  1. 표적 단백질에 대한 작용하는 폴리펩티드를 스크리닝하는 방법으로서,
    (1) 그람 음성 세균으로 발현 가능한 복수의 발현 벡터로 구성되는 폴리뉴클레오티드 라이브러리를 제공하는 공정이고,
    상기 복수의 발현 벡터는, 각각 서로 다른 폴리펩티드를 코드하는 제1 폴리뉴클레오티드, 제1 폴리뉴클레오티드의 상류에 배치된 분비 시그널 서열 및 표적 단백질을 코드하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 공정;
    (2) 상기 발현 벡터로 그람 음성 세균을 형질 전환하고, 상기 폴리펩티드를 페리플라즘 간극 내에, 상기 표적 단백질을 내막 표면에, 각각 발현시키는 공정;
    (3) 페리플라즘 간극 내에 있어서, 상기 폴리펩티드를 상기 표적 단백질과 접촉시키는 공정;
    (4) 그람 음성 세균에 스페로플라스트를 형성시켜서, 전기 생리학적 방법에 의해 표적 단백질에 대한 상기 폴리펩티드의 활성을 측정하는 공정;
    (5) 측정된 활성에 기초하여, 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드를 동정하는 공정;
    을 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 그람 음성 세균이 대장균인, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표적 단백질이 막 단백질인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 막 단백질이 막 수용체, 이온 채널, 또는 트랜스포터인, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 전기 생리학적 방법이 패치 클램프법인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 라이브러리가, 미리 표적 단백질에 결합하는 폴리펩티드를 코드하는 제1 폴리뉴클레오티드에 대해서 농축하는 공정을 포함하는, 방법.
  7. 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드의 제조 방법으로서,
    제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해, 표적 단백질에 작용하는 폴리펩티드를 동정하고, 동정한 폴리펩티드를, 유전자 재조합, 또는 화학 합성에 의해 제조하는 공정을 포함하는, 제조 방법.
  8. 라이브러리의 제작 방법으로서,
    (1) 기지의 막 단백질의 리간드에 대해서, 상기 리간드의 입체 구조에 ODA법을 적용해서 다른 단백질과 상호 작용할 가능성이 높은 부위를 예측하는 공정;
    (2) 상기 리간드의 아미노산 서열에 있어서, 예측된 부위를 랜덤화한 복수의 폴리펩티드를 제작하거나, 또는 상기 폴리펩티드를 각각 코드하는 복수의 폴리뉴클레오티드를 제작하는 공정;
    (3) 상기 복수의 폴리펩티드, 또는 상기 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 라이브러리를 제작하는 공정;
    을 포함하는, 라이브러리의 제작 방법.
  9. 제8항에 있어서, 리간드가 ICK 폴리펩티드인, 제작 방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 막 단백질이 막 수용체, 이온 채널, 또는 트랜스포터인, 제작 방법.
  11. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드 라이브러리가, 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제작되는, 방법.
  12. 하기의 아미노산 서열을 갖는 서로 다른 폴리펩티드, 또는 상기 폴리펩티드를 코드하는 복수의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 라이브러리.
    DCLGXXRKCIPDNDKCCRPXLVCSRTHKXCXXXX(서열번호 1)
  13. 제12항에 있어서, 상기 복수의 폴리뉴클레오티드가, 각각 그람 음성균으로 발현 가능한 발현 벡터에 삽입되어 있는, 라이브러리.
  14. 제13항에 있어서, 상기 발현 벡터가, 상기 폴리뉴클레오티드, 그 상류에 배치된 분비 시그널 서열 및 표적 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 라이브러리.
  15. 서열번호 4 내지 9의 어느 것으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는, 폴리펩티드.
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