KR20230041651A - 분석 및 치료 용도를 위한 항원 특이적 항체의 풍부화 - Google Patents

분석 및 치료 용도를 위한 항원 특이적 항체의 풍부화 Download PDF

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조슈아 케인 솔도
스콧 더글라스 버그만
카르멘 엘 윌리
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베라바스, 인크.
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Abstract

본 발명은, 진단 테스트 전에 또는 분리되고 예방 또는 치료 목적에 사용될, 바이오마커, 특히 항체를 풍부화하기 위해, 또는 본원에 기술된 간섭을 제거하기 위해 본원에 기술된 포획 모이어티를 포함하는 표면을 포함하는 입자(예컨대, 미세입자, 나노입자; 자성, 비자성)를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

분석 및 치료 용도를 위한 항원 특이적 항체의 풍부화
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 4월 10일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/008,472에 대한 우선권의 이익을 주장하며, 이 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시는 항원 특이적 항체를 후속되는 분석, 예방, 또는 치료 용도를 위해 단리하기 위하여 본원에 기재된 바와 같이 포획 모이어티(capture moiety)를 포함하는 표면을 포함하는 입자(예컨대, 마이크로미립자, 나노미립자; 자성, 비자성)를 사용하는 방법에 관한 것이다.
실험실 테스트는 건강 평가, 건강 관리, 및 궁극적으로 대중 건강에 중요한 역할을 하며, 모든 삶의 단계에서 사람에게 영향을 미친다. 거의 모든 사람은 그들의 생애 중에 수행된 하나 이상의 실험실 테스트를 경험할 것이다. 미국에서만 매년 70억 내지 100억 건으로 추정되는 실험실 테스트가 수행되며, 실험실 테스트는 대략 70%의 의학적 결정에 영향을 미친다.
더불어, 2018년 1월 1일에 메디케어 앤드 메디케이드 서비스 센터(Centers for Medicare and Medicaid Services, CMS)가 메디케어 접근 보호법(Protecting Access to Medicare Act, PAMA)에서 요구하는 대로 새로운 임상 검사실 요금표(CLFS)를 실행한 이후로 PAMA는 실험실 검사 변제를 줄이고 있다. 보다 더 중요한 것은 실험실 결과가 처음에는 정확하고 문제해결 노력이 감소되거나 시간이 덜 걸리며 실험실 작업 흐름을 방해하지 않는다는 것이다.
간섭은 진단 테스트의 정확한 결과의 값을, 예컨대 항체 결합을 간섭함으로써 변경시킬 수 있거나, 또는 가교, 입체 장애, 또는 자가항체 메커니즘에 의해 검정 신호를 증가 또는 감소시킬 수 있는, 환자 표본에 존재하는 물질이다. 면역검정은 간섭에 취약한 것으로 알려져 있지만, 그러한 결과가 기기(분석기) 또는 실험실에 의해 인식 및 표시되지 않거나, 또는 의사가 실험실에 환자 결과가 임상 사진과 맞지 않는다는 것을 알리지 않은 경우 임상 실험실은 여전히 잘못된 결과를 보고할 수 있다. 잘못된 결과는 임의의 표본으로, 그러한 표본이 문제를 유발할 가능성이 있는지 미리 확인하는 실제 수단 없이 예상치 못하게 발생할 수 있다. 그러한 간섭의 결과는 잘못된 결과가 위음성 및 위양성 테스트 결과를 초래할 수 있고, 환자 치료에 영향을 줄 수 있으며, 불필요한 침습, 진단 또는 치료 과정, 또는 환자 치료 실패로 이어질 수 있다는 것이다.
임상 실험실에서는 샘플 유형(즉, 혈장), 캐리 오버(carry-over), 동결/해동, 안정성, 용혈, 황달(icterus), 지방혈증(lipemia), 항응고제 효과, 샘플 보관, 결합 단백질, 약물 및 약물 대사산물, 및 교차 반응성과 같은 샘플 특이적 간섭의 많은 공급원이 있다. 그러나, 인간 항-동물 항체(HAAA) 및 인간 항-마우스 항체(HAMA) 간섭과 같은 이종성(heterophilic ) 항체 간섭은 그것들이 검출하기 어렵고 환자 관리에 영향을 줄 수 있기 때문에 번거롭거나 문제가 될 수 있다.
간섭으로부터 발생하는 합병증에도 불구하고, 바이오마커 스크리닝 및 진단 테스트는, 예를 들어 생물학적 샘플 중의 그것의 낮은 존재 또는 풍부함으로 인해 어려울 수 있다.
그러므로, 신체에서 발견된 바이오마커가 질환을 검출, 예측, 또는 관리하기 위해 사용될 수 있는 한편, 많은 것들이 오늘날 상업적으로 이용 가능한 테스트를 사용하여 검출되기에는 너무 낮은 풍부성으로 발견된다. 테스트 정확도를 개선하고, 발견하기 어려운 바이오마커를 측정하고, 비용을 감소시키며, 궁극적으로 생명을 구하는 임상 샘플을 제조하는 새로운 진단 기술에 대한 충족되지 않은 임상적 요구가 있다.
비타민 B7로도 알려져 있는 비오틴은 종종 종합 비타민 및 처방전 없이 구할 수 있는 건강 및 미용 보조제에서 발견되는 수용성 B 비타민이다. 스트렙트아비딘-비오틴 결합 메커니즘을 사용하는 시험관내 실험실 진단 테스트는 높은 순환 비오틴 농도에 의해 영향을 받을 잠재력을 가진다. 비오틴은 공유 결합을 통해 다양한 표적 - 큰 항체로부터 스테로이드 호르몬에 이르기까지-에 그것의 아비딘, 스트렙트아비딘, 또는 뉴트라비딘 단백질과의 특정 비공유 결합에 최소한의 영향을 미치면서 부착될 수 있다. 그러므로, 비오틴은 상이한 형태의 면역검정의 검출 시스템에서 자주 사용될 수 있다.
면역검정은 일반적으로 샌드위치 면역검정(비경합성) 또는 경합 억제 면역검정으로서 분류된다. 일반적으로, 스트렙트아비딘-비오틴 결합은 샌드위치 면역검정에서 비오티닐화된 항체를, 또는 경합 면역검정에서 비오티닐화된 항원을 스트렙트아비딘 코팅 표면에 커플링시키기 위해 검정 인큐베이션 동안 사용된다. 생물학적 표본이 과잉 비오틴을 함유하는 경우, 비오틴은 비오티닐화된 항체 또는 항원과 스트렙트아비딘 코팅 표면에의 결합에 대해 경합하여, 비오티닐화된 항체 또는 항원의 감소된 포획을 초래한다. 과잉의 비오틴은 샌드위치 면역검정에서 검정 신호가 분석물 농도와 정비례하기 때문에 잘못된 낮은 결과를 생성한다. 경합 면역검정에서 과잉 비오틴은 검정 신호가 분석물 농도와 역비례하기 때문에 잘못된 상승된 결과를 유발한다.
식이 및 정상적인 대사로부터 유래된 비오틴의 정상적인 순환 농도는 비오티닐화된 면역검정을 간섭하기에는 너무 낮다(< 1.2 ng/mL). 그러나, 고용량의 비오틴 보충제(예컨대, 5 mg 이상)의 섭취는 일반적으로 사용된 비오티닐화된 면역검정을 간섭할 수 있는 상당히 상승된 혈중 농도를 초래할 수 있다. 일부 연구는 비오틴의 혈청 농도가 1일에 20 mg의 비오틴 보충제를 소비하는 대상체의 경우 비오틴 섭취 후 처음 1시간 내에 최대 355 ng/mL에 도달할 수 있고, 300 mg의 비오틴의 단일 용량 후에 최대 1160 ng/mL까지 도달한다. FDA에 따르면, 고수준의 비오틴을 섭취하는 환자로부터 취한 혈액 또는 다른 샘플 중의 비오틴은 검정의 성질에 따라 비오틴 기반 면역검정에서 잘못되게 높거나 잘못되게 낮은 결과를 유발할 수 있다.
고수준의 비오틴을 섭취하는 환자로부터 취한 혈액 또는 다른 샘플 중의 비오틴은 검정의 설계에 따라 비오틴 기반 면역검정에서 잘못되게 높거나 잘못되게 낮은 결과를 유발할 수 있다. 부정확한 테스트 결과는 잘못된 진단뿐만 아니라 부적절한 환자 관리로 이어질 수 있다.
비오틴 간섭 한계값은 단일 플랫폼에서도, 검정 간에 광범위하게 상이하다. < 51 ng/mL의 비오틴 간섭 한계값을 사용하는 테스트는 고위험 테스트, 또는 취약한 면역측정 및 경합 방법이다.
비오틴 기반 테스트는 또한 항체, 단백질 또는 항원에 콘쥬게이션된 비오틴을 포획하기 위한 테스트 설계에서 스트렙트아비딘의 사용과 관련된 간섭 메커니즘, 또는 항-스트렙트아비딘 간섭에 민감하다. 항-스트렙트아비딘 항체 및 단백질은 특정 실험실 테스트를 상당히 간섭할 수 있고 부정확한 테스트 결과를 유발할 수 있다. 검정 설계 및 포맷에 따라 감소된 테스트 신호 및 잘못되게 낮거나 잘못되게 높은 환자 결과를 유발하는 비오틴 간섭과 유사하게, 항-스트렙트아비딘 간섭 또한 감소된 테스트 신호를 초래하지만, 상이한 메커니즘을 통해 발생되므로, 그것은 비오틴 간섭으로 오인받을 수 있다. 비록 항-스트렙트아비딘 항체의 원인이 완전하게 알려지지 않고 논의 중에 있지만, 한 가지 가능한 원인은 박테리아 스트렙토미세스 아비디니(S. avidinii)로부터 유래될 수 있다. 많은 사람이 일상적인 삶에서 이 박테리아에 노출되고 그것에 대한 면역학적 반응을 전개시킬 수 있었던 것으로 여겨진다.
그러므로 실험식 작업 흐름 및 처리 시간에 영향을 미치지 않으면서 진단 테스트 전에 샘플 간섭을 제거하거나 최소화하며 바이오마커 농도를 풍부하게 하기 위한 간단하고, 저렴하며, 자동화 가능하고 효과적인 해결책에 대한 임상적인 필요성이 있다.
본원에는 잘못된 테스트 결과 및 환자 안전성에 대한 증가된 위험으로 이어질 수 있는 많은 수의 알려진 샘플 특이적 간섭을 관리 및 완화하기 위한 간단하고, 효율적이며 비용 효율적인 생물학적 샘플, 예컨대 단클론성 마우스 항체로 치료되었거나 진단 목적으로 단클론성 마우스 항체를 받은 환자의 이종성 항체의 조건화 방법이 기술된다. 본원에 기술된 방법은 또한 건강 및 미용 및 체중 감소를 위해 또는 치료적으로, 예컨대 다발성 경색의 치료를 위해 소비자가 복용한 일반의약품(OTC) 보충제, 종합비타민 및 허브 요법으로부터 유래될 수 있는 비오틴으로부터 발생하는 샘플 특이적 간섭을 또한 관리 및 완화시킬 수 있다.
또한 본원에는 생물학적 샘플 중의 바이오마커의 농도를 풍부화하거나 증가시키는 방법이 기술된다. 특히, 바이오마커는 항원 특이적 항체, 예를 들어 바이러스 구조 단백질, 예컨대 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질일 수 있다. 다양한 구현예에서 스파이크 단백질은 완전 단백질, S1 하위유닛, S2 하위유닛, 또는 그것의 항원성 단편, 예를 들어, 수용체 결합 도메인(예컨대 아미노산 331-524) 및/또는 S1 하위유닛(예컨대, 아미노산 잔기 1-260)의 N 말단 도메인이다. 스파이크 단백질 또는 그것의 항원성 단편은 비오티닐화되고 스트렙트아비딘 처리된 비드에 부착될 수 있고 그런 후 SARS-CoV-2 중화 항체에 대한 포획 시약으로서 작용할 수 있다. 전형적으로, 만약 N 말단 도메인 및 수용체 결합 도메인이 모두 사용된다면, 별도의 비드에 부착된 단편이 있고, 그런 후 혼합되어 포획 시약으로서 작용한다.
한 측면으로, 본원에는 생물학적 샘플로부터 항원 특이적 항체를 단리하는 방법이 제공되며, 방법은: a) 샘플을 포획 모이어티를 포함하는 입자와 조합하여 혼합물을 제공하는 단계; 및 b) 혼합물을 혼합하여 항체에 입자 복합체를 제공하는 단계; 그로써 항체를 생물학적 샘플로부터 단리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서 포획 모이어티는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질의 S1 하위유닛, 또는 그것의 수용체 결합 도메인 및/또는 N 말단 도메인이다. SARS-CoV-2 스파이크 단백질의 구조는 기술분야에 알려져 있다(Walls et al, Structure, Function, and Antigenicity of the SARS-CoV-2 Spike Glycoprotein, Cell 180:1-12, 2020, 전문이 본원에 참조로 포함됨). 다양한 구현예에서 생물학적 샘플은 혈액, 혈장, 혈청, 또는 다른 항체 함유 생물학적 유체일 수 있다.
일부 구현예에서, 단리된 항체는 검출되거나, 정량화되거나, 또는 그렇지 않으면 혈청학 검정으로 특징규명된다.
일부 구현예에서 포획 모이어티-항체 복합체는 입자로부터 절단된다. 다른 구현예에서 항체는 포획 모이어티로부터 용출되지만, 특히 포획 모이어티는 여전히 입자에 부착된다. 풍부화된 또는 단리된 항체는 그런 후 질량 분석 및 에드만(Edman) 분해를 포함한 단백질 화학 분석 방법이 적용될 수 있다. 풍부화된 또는 단리된 항체는 수동 면역화에, 예방 또는 치료 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들어, SARS-CoV-2의 스파이크 단백질을 인식하는 항체가 단리되면, 그것은 COVID-19 환자에게 치료제로서 투여될 수 있거나, 또는 대안으로, 건강관리 종사자 또는 COVID-19 환자에 대한 노출로 인해 SAR-CoV-2에 의한 감염의 위험이 있는 다른 사람에게 예방적으로 투여될 수 있다.
한 측면으로, 본원에는 생물학적 샘플로부터 간섭을 제거하는 방법이 제공되며, 방법은: a) 샘플을 포획 모이어티를 포함하는 입자와 조합하여 혼합물을 제공하는 단계; b) 혼합물을 혼합하여 입자 복합체를 간섭에 제공하는 단계; 및 c) 입자 복합체를 제거하거나 배출(eliminating)시켜서 고갈된 용액을 제공하는 단계; 그로써 간섭의 양(예컨대, 질량, 몰농도, 농도)을 감소 또는 축소시키는 단계를 포함한다.
도 1은 본원에 기술된 입자에 의한 생물학적 샘플로부터의 간섭의 제거(또는 고갈)를 토대로 한 확인 및 실격 검정을 위한 계획을 도시한다.
도 2는 본원에 기술된 동결건조 입자에 의한 생물학적 샘플로부터의 간섭의 제거(또는 고갈)를 토대로 한 고갈 검정을 위한 계획을 도시한다.
도 3은 본원에 기술된 자성화된 피펫 팁에 의한 생물학적 샘플로부터의 간섭의 제거(또는 고갈)를 토대로 한 고갈 검정을 위한 계획을 도시한다.
도4는 비오틴 섭취 후 시간 경과에 따른 비오틴 농도를 보여주는 그래프이다.
도 5는 비오틴 고갈을 보여주는 그래프이다.
도 6은 비오틴 고갈을 보여주는 그래프이다.
도 7은 비오틴 섭취 후 시간 경과에 따른 비오틴 농도를 보여주는 그래프이다.
도 8은 상이한 비오 용량의 섭취 후 비오틴 농도를 보여주는 그래프이다.
도 9는 비오틴 고갈을 보여주는 그래프이다.
도 10은 PTH 농도를 보여주는 그래프이다.
도 11은 삼중 교정기 비드로 생성된 IgA, IgG, 및 IgM에 대한 교정 곡선을 도시한다.
도 12는 초기에 SARS-CoV-2 중화 항체 검정에서 음성으로 테스트되었던, 연속 샘플을 입수할 수 있는 5명의 PCR 양성 환자에서의 총 SARS-CoV-2 중화 항체 수준을 도시한다.
도 13은 연속 샘플을 입수할 수 있는 37명의 PCR 양성 환자에서의 총 SARS-CoV-2 중화 항체 수준을 도시한다.
본원에는 생물학적 샘플을 고갈 또는 풍부화하는 방법이 기술되며, 방법은 본원에 기술된 입자를 본원에 기술된 생물학적 샘플과 조합하는 단계를 포함한다.
한 측면으로, 본원에는 생물학적 샘플로부터 바이오마커를 분리하는 방법이 제공되며, 방법은: a) 샘플을 포획 모이어티를 포함하는 입자와 조합하여 혼합물을 제공하는 단계; 및 b) 혼합물을 혼합하여 바이오마커에 입자 복합체를 제공하는 단계; 그로써 바이오마커를 생물학적 샘플로부터 분리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 항원 특이적 항체이다. 일부 구현예에서 항원 특이적 항체는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 스파이크 단백질, 예를 들어 S1 하위유닛, 또는 그것의 수용체 결합 도메인 및/또는 N 말단 도메인을 인식한다.
일부 구현예에서, 방법은 입자 복합체에 진단 테스트를 수행하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 입자 복합체로부터 절단된 또는 용출된 바이오마커에 진단 테스트를 실시하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 병원체 특이적 항체이다. 일부 구현예에서, 병원체 특이적 항체는 항-SARS-CoV2 항체이다. 일부 구현예에서, 항-SARS-CoV-2 항체는 수용체 결합 도메인, N 말단 도메인, 또는 둘 다를 인식하는 항체를 포함한다.
수용체 결합 도메인 및 N 말단 도메인 둘 다에 대해 지시된 SARS-CoV-2 중화 항체가 있다. 이들 도메인 중 어느 하나에 대한 항체 결합은 S1 스파이크와 바이러스 수용체(안지오텐신 전환 효소 2(ACE2))의 상호작용을 입체적으로 차단한다. 따라서, 이들 도메인에 결합하는 항체는 중화 항체로 여겨진다. 이들 도메인 중 어느 하나를 인식하는 IgM, IgG, 및 IgA 아이소타입 항체는 모두 중화하는 것으로 여겨진다. 그러므로, 생물학적 샘플 중의 중화 항체의 정도를 정확하게 평가하기 위하여, 두 종류의 항체를 모두 포획하고 정량화하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, 만약 포획된 항체가 예방 또는 치료 용도로 사용되는 경우, 더 강력한 수동 면역이 이들 두 종류를 포획하고 사용함으로써 확립될 수 있다. 예를 들어, 만약 수용체 결합 도메인 및 N 말단 도메인을 모두 인식하는 항체가 사용되면 도메인 중 하나에서 돌연변이가 있는 변이 바이러스가, 이들 도메인 중 하나를 인식하는 항체가 사용된 경우보다 중화를 피할 가능성은 더 적을 것이다.
SARS-CoV-2 중화 항체를 포획하기 위하여, SARS-CoV-2 S1-RBD 및 S1-NTD 항원이 포획 시약에 사용된다. 일부 구현예에서, 이들 항원은 비오티닐화되고, 스트렙트아비딘 처리된 자성 비드 상에 코팅된다.
한 측면으로, 본원에는 생물학적 샘플로부터 간섭을 제거하는 방법이 제공되며, 방법은: a) 샘플을 포획 모이어티를 포함하는 입자와 조합하여 혼합물을 제공하는 단계; b) 혼합물을 혼합하여 입자 복합체를 간섭에 제공하는 단계; 및 c) 입자 복합체를 제거하거나 배출시켜서 고갈된 용액을 제공하는 단계; 그로써 간섭의 양(예컨대, 질량, 몰농도, 농도)을 감소 또는 축소시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 고갈된 용액에 특징규명(예컨대, 진단 테스트)을 실행하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 입자는 동결건조 제품(예컨대, LyoSphereTM(BIOLYPH LLC))으로서 제공된다.
한 측면으로, 본원에는 진단 테스트의 정확도를 증가시키는 방법이 제공되며, 방법은: a) 생물학적 샘플을 포획 모이어티를 포함하는 입자와 조합하여 혼합물을 제공하는 단계; b) 혼합물을 혼합하여 입자 복합체를 간섭에 제공하는 단계; c) 입자 복합체를 제거하거나 배출시켜서 고갈된 용액을 제공하는 단계; 및 d) 고갈된 용액에 진단 테스트를 수행하는 단계; 그로써 진단 테스트의 정확도를 증가시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법이 실행되지 않은 생물학적 샘플에 비교하여 적어도 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99%의 간섭이 제거된다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플에서 100 ppm 미만의 간섭을 제공하기 위하여 간섭의 충분한 양이 제거된다. 일부 구현예에서, 진단 테스트에서 검출 가능한 간섭의 양보다 적은 간섭을 제공하기 위하여 충분한 양의 간섭이 제거된다.
일부 구현예에서, 포획 모이어티는 인간 항-동물 항체(예컨대, 마우스 IgG, 양 IgG, 염소 IgG, 토끼 IgG, 소 IgG, 돼지 IgG, 말 IgG)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 이종성 항체(예컨대, FR(Fc 특이적), Fab, F(ab)'2, 중합된 IgG(유형 1, 2a, 2b IgG 및 IgG 단편, 혈청 구성요소)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 검정 특이적 결합자(예컨대, 비오틴, 플루오레세인, 항-플루오레세인 폴리/Mab, 항-비오틴 폴리/Mab, 스트렙트아비딘, 뉴트라비딘)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 검정 특이적 신호 분자(예컨대, HRP, ALP, 아크리디늄 에스테르, 아이소루미놀/루미놀, 루테늄, N-(4-아미노부틸)-N-에틸아이소루미놀(ABEI)/고리형 ABEI)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 검정 특이적 차단제(예컨대, BSA, 생선 껍질 젤라틴, 카세인, 오브알부민, PVP, PVA)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 검정 특이적 콘쥬게이트 링커(예컨대, LC, LC-LC, PEO4, PEO16)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 항원 자가항체(예컨대, 유리 T3, 유리 T4)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 단백질 자가항체(예컨대, MTSH, TnI, TnT, 비-심장 TnT(골격근 질환))이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 화학발광 기질(예컨대, 루미놀, 아이소루미놀, 아이소루미놀 유도체, ABEI, ABEI 유도체, 루테늄, 아크리디늄 에스테르) 또는 형광 표지(예컨대, 플루오레세인 또는 다른 형광단 및 염료)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 스트렙트아비딘, 뉴트라비딘, 아비딘, 폴리A, 폴리DT, 압타머, 항체, Fab, F(ab')2, 항체 단편, 재조합 단백질, 효소, 단백질, 생체분자, 또는 중합체이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 비오틴, 플루오레세인, 폴리DT, 폴리A, 항원, 등이다.
일부 구현예에서, 제거 또는 배출은 분리이다. 일부 구현예에서, 분리는 물리적 분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 분리는 자성 분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 자성 분리를 위한 자석은 대형 피펫팅 기계 상에 1 내지 12개의 샘플 제조 튜브를 보유하도록 설계된 랙에 2 내지 12개의 자석을 포함한 다중 자석 장치이다. 그러한 피펫팅 기계의 예로, 한정하는 것은 아니지만, Hamilton 또는 Tecan에 의해 구성된 것을 들 수 있다. 일부 구현예에서, 자성 분리를 위한 자석은 96 웰 또는 384 웰 미세역가 플레이트에 자화(magnetization)를 제공하도록 설계된 96 또는 384개의 자석을 포함한 다중 자석 장치이다. 일부 구현예에서, 분리는 화학적 분리를 포함한다. 일부 구현예에서, 제거 또는 배출 단계는 1000 x g 이상에서 적어도 1분, 2분, 3분, 4분, 또는 5분 동안 원심분리하여 펠릿 및 상층액을 제공하는 단계; 및 상층액을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제거 또는 배출 단계는 여과(예컨대, 필터를 통함)를 포함한다. 일부 구현예에서, 필터는 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)의 직경보다 충분히 작은 다공성 또는 분자량 컷오프(MWCO)를 가진다. 일부 구현예에서, 여과는 중력, 진공, 또는 원심분리에 의한 것이다. 일부 구현예에서, 제거 또는 배출 단계는 자화를 포함한다. 일부 구현예에서, 자화는 펠릿 및 상층액을 제공하기 위하여 강력한 자석(예컨대, 네오디늄 자석)을 사용하여 발생한다. 일부 구현예에서, 자석은 원심분리기 로터에 있다. 일부 구현예에서, 자석은 일회용 피펫 팁, 커버 또는 덮개 내에 있는 자석이다.
한 측면으로, 본원에는 생물학적 샘플로부터 바이오마커를 분리하는 방법이 제공되며, 방법은: a) 샘플을 포획 모이어티를 포함하는 입자와 조합하여 혼합물을 제공하는 단계; b) 혼합물을 혼합하여 바이오마커를 포함하는 입자 복합체를 제공하는 단계; c) 혼합물로부터 입자 복합체를 제거하는 단계; 및 d) 혼합물에 절단 시약 또는 방출(용출)제를 첨가하여 바이오마커를 포함하는 분리물을 제공하는 단계; 그로써 바이오마커를 생물학적 샘플로부터 분리하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 본원에 개시된 방법에 따라 전처리되거나 세정된 후, 바이오마커가 분리된다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 항원 특이적 항체이다. 일부 구현예에서 항원 특이적 항체는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 스파이크 단백질, 예를 들어 S1 하위유닛, 또는 그것의 수용체 결합 도메인 및/또는 N 말단 도메인을 인식한다. 일부 구현예에서, 바이오마커를 생물학적 샘플로부터 분리하는 방법은 생물학적 샘플에 대해 진단 테스트를 수행하기 전에 수행된다.
일부 구현예에서, 세정 시약은 인간 면역글로불린, 예를 들어, IgG, IgA, 및/또는 IgM을 포획 모이어티로서 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 시약은 동물 면역글로불린, 예를 들어, 토끼, 염소, 또는 마우스 IgG를, 포획 모이어티로서 포함한다. 일부 구현예에서, 세정 시약은 BSA를 포함한다. 세정 시약(들)에는 바이오마커 포획 시약에 사용된 것과 동일한 미세입자를 사용하는 것이 바람직하다. 이런 방식으로, 분석물 항체 및 검정 시약(예를 들어, 스트렙트아비딘 및 비드 자체)에 특이적인 이종성 간섭(들)이 제거될 수 있다.
한 측면으로, 본원에는 바이오마커가 생물학적 샘플에 존재하는지를 측정하는 방법이 제공되며, 방법은: a) 샘플을 포획 모이어티와 조합하여 혼합물을 제공하는 단계; b) 혼합물을 포획 모이어티를 포함하는 입자와 조합하여 3차 복합체를 제공하는 단계; c) 혼합물로부터 3차 복합체를 제거하여 분리물을 제공하는 단계; 및 d) 3차 복합체에 대한 지표가 분리물에 존재하는지를 측정하는 단계; 그로써 바이오마커가 생물학적 샘플에 존재하는지를 측정하는 단계를 포함한다.
한 측면으로, 본원에는 바이오마커가 생물학적 샘플에 존재하는지를 측정하는 방법이 제공되며, 방법은: 샘플을 포획 모이어티를 포함하는 입자와 조합하여 혼합물을 제공하는 단계; b) 혼합물을 혼합하여 입자 복합체를 간섭에 제공하는 단계; c) 입자 복합체를 제거 또는 배출하여 고갈된 용액을 제공하는 단계; d) 고갈된 용액을 제2 포획 모이어티를 포함하는 제2 입자와 조합하여 제2 혼합물을 제공하는 단계; e) 제2 혼합물을 혼합하여 바이오마커를 포함하는 제2 입자 복합체를 제공하는 단계; f) 제2 입자 복합체를 제2 혼합물로부터 제거하는 단계; 및 g) 제2 혼합물에 절단 시약 또는 방출제를 첨가하여 바이오마커를 포함하는 분리물을 제공하는 단계; 그로써 바이오마커를 생물학적 샘플로부터 분리하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법은 입자 복합체를 희석제로 세척하는 단계를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, 절단 시약은 이황화 결합 환원제이다.
일부 구현예에서, 방법은 바이오마커에 대해 진단 테스트를 수행하는 단계를 추가로 포함한다.
한 측면으로, 본원에는 샘플 중의 바이오마커의 양을 풍부하게 하는 방법이 제공되며, 방법은: a) 샘플에 포획 모이어티를 포함하는 입자를 첨가하여 혼합물을 제공하는 단계; b) 혼합물을 혼합하여 입자 복합체를 제공하는 단계; c) 입자 복합체를 분리하여 펠릿과 상층액을 제공하는 단계; e) 펠릿으로부터 상층액을 제거하는 단계; f) 펠릿을 희석제로 세척하는 단계; 및 g) 바이오마커를 펠릿으로부터 용출하여 풍부화된 샘플을 제공하는 단계; 그로써 샘플 중의 바이오마커의 양을 풍부화하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플로부터 바이오마커를 풍부하게 하는 방법은 생물학적 샘플에 대해 진단 테스트를 수행하기 전에 수행된다.
일부 구현예에서, 바이오마커는 종양 마커, 예를 들어, 종양 항원, 예컨대 p53에 대한 자가항체이다. 일부 구현예에서, 종양 항원은 네오항원이다. 일부 종양 항원은 발달상 부적절한 방식으로 발현되는데, 예를 들어, 정상적으로는 전혀 발현되지 않을 조직 또는 성숙 단계에서 발현되거나, 또는 그것이 발현되는 것과 같이 높은 수준으로 발현된다. 이것은 종양 항원을 인식하는 항체의 생성으로 이어질 수 있다. 종양 형성 과정에 관여하는 다른 종양 항원이 돌연변이될 수 있고 돌연변이는 종양 항원을 면역원성으로 만든다(네오항원). 다시, 변경된 종양 항원을 인식하는 항체가 생성될 수 있다. 그러한 자가항체의 검출은 악성 상태의 조기 검출 또는 변화를 포함한, 암의 검출 및 진단에 유용할 수 있고, 적절한 치료를 선택하는데 유용하다. 그러한 종양 항원은 항-종양 항원 자가항체를 위한 포획 시약에 사용될 수 있다.
추가로 암의 조기 검출에 유용할 수 있는 종양 마커에 대한 자가항체로는 암 항원 15-3(CA15-3), 암배아 항원(CEA), 암 항원 19-9(CA19-9), c-Myc, p53, 열 충격 단백질(Hsp)27 및 Hsp70, 진핵 번역 개시 인자 3 하위유닛 A(EIF3A), 및 폐암(LC)을 인식하는 것들을 들 수 있다. 이들 종양 항원 특이적 자가항체는 그것들이 긴 반감기를 가지며 저순환 또는 저풍부성 암 단백질에 대한 반응으로 대량으로 생성되기 때문에 암의 초기 검출을 위한 유망한 바이오마커이다.
일부 구현예에서, 바이오마커는 외상성 뇌 장애(TBI)의 지표이다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 s-100β, 신경교 섬유성 산성 단백질(GFAP), 뉴런 특이적 에놀라제(NSE), 신경섬유 경쇄(NFL), 절단된 타우(tau) 단백질(C-타우), 및 유비퀴틴 C-말단 가수분해효소-L1(UCH-L1)이다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 알츠하이머병(AD)의 지표이다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 아밀로이드 베타, BACE1, 가용성 Aβ 전구체 단백질(sAPP)이다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 성 매개 질환(STD)의 지표이다. 일부 구현예에서, STD는 클라미디아(Chlamydia), 임질(Gonorrhea), 매독(Syphilis), 트리코모나스(Trichomonas), HPV, 헤르페스, B형 간염, C형 간염, HIV이다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 박테리아 감염의 지표이다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 박테리아에 대한 포획 모이어티이다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 복합체로부터 절단 시약에 의해 절단된다. 일부 구현예에서, 바이오마커의 존재는 MALDI-MS에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 바이오마커의 존재는 분자 진단 방법에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 바이오마커의 존재는 면역검정에 의해 측정된다.
일부 구현예에서, 간섭은 피브리노겐이고 제거 또는 배출 단계는 분리, 예컨대 원심분리에 의한 물리적 분리이며, 이때 입자 복합체는 응고물에 포획된다.
도 1을 보면, 본원에 기술된 입자에 의한 생물학적 샘플로부터의 간섭의 제거(또는 고갈)를 토대로 한 확인 및 실격 검정에 대한 계획이 도시된다. 생물학적 샘플은 일차 혈액 수집 튜브(PBCT)로부터 흡인되고 이차 전달 튜브(STT)로 분배된다. 본원에 기술된 입자, 예컨대, 유리 비오틴 및/또는 이종성 항체에 대한 포획 모이어티를 포함하는 표면을 포함하는 입자가 STT에 첨가되어 샘플 간섭에 결합되고 고갈시킨다.
도 2에서, 본원에 기술된 동결건조 입자에 의한 생물학적 샘플로부터의 간섭의 제거(또는 고갈)를 토대로 한 고갈 검정에 대한 계획이 도시된다. 동결건조 입자(예컨대, 본원에 기술된 입자)를 포함하는 PBCT는 생물학적 샘플을 받아서, 입자와 생물학적 샘플의 재현탁 및 분산을 초래한다.
도 3에서, 본원에 기술된 자성 피펫 팁에 의한 생물학적 샘플로부터의 간섭의 제거(또는 고갈)를 토대로 한 고갈 검정에 대한 계획이 도시된다. 자석을 포함하는 피펫 팁이 생물학적 샘플에 첨가되어 생물학적 샘플로부터 본원에 기술된 간섭 또는 본원에 기술된 바이오마커가 제거된다.
분리 방법
본원에 기술된 입자는 생물학적 샘플의 첨가 전에 일차 혈액 수집 튜브, 24시간 소변 수집 장치, 소변 수집 장치, 타액 수집 튜브, 대변 수집 장치, 정액 수집 장치, 혈액 수집 주머니, 또는 임의의 샘플 수집 튜브 또는 장치와 같은 수집 장치에 첨가될 수 있다.
본원에 기술된 입자는 또한 수집 장치에의 샘플의 수집 후에, 또는 일차 수집 장치로부터 플라스틱 또는 유리 튜브, 바이알, 병, 비이커, 플라스크, 주머니, 캔, 미세역가 플레이트, ELISA 플레이트, 96-웰 플레이트, 384-웰 플레이트 1536 웰 플레이트, 큐벳, 반응 모듈, 저장고, 또는 액체 샘플을 보유, 보관 또는 처리하기에 적합한 임의의 용기와 같은 보관 또는 전달 장치에 전달된 후 샘플에 첨가될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 입자는 생물학적 샘플을 포함하는 수집 장치에 첨가된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 입자는 생물학적 샘플의 첨가 전에 수집 장치에 첨가된다.
일부 구현예, 특히 분석 적용보다는 제조 적용을 포함하는 구현예에서, 다수의 기증자로부터의 생물학적 샘플은 입자를 첨가하기 전에 모아진다. 적어도 10 리터가 한번에 처리될 수 있다.
한 측면으로, 본원에는 소변 수집 장치상에서와 같이 생물학적 샘플을 포함하는 본원에 기술된 수집 장치를 포함하는, 입자를 방출하기 위한 장치(즉, 방출 메커니즘을 촉발시키는 나사 캡)가 기술된다. 예를 들어, 장치는 나사 캡이 닫힐 때 본원에 기술된 입자를 방출하는 나사 캡이 장착된 튜브이다.
한 측면으로, 본원에는 생물학적 샘플(즉, 캡슐화된 조성물 또는 규정된 속도 또는 시점에 용액에 용해되는 조성물)을 포함하는 용기로의 입자의 화학적 방출을 포함하는 장치가 기술된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 장치는, 예를 들어 바이오마커 풍부화 또는 분리, 또는 진단 테스트 전에 샘플의 전처리를 제공하기 위하여 본원에 기술된 입자의 첨가를 지연시키도록 구성된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 샘플은, 예를 들어 pH를 조정하고, 샘플 특이적 간섭을 고갈시키거나 경합시키기 위해 본원에 기술된 입자의 첨가 전에 화학물질, 단백질, 차단제, 계면활성제 또는 그것들의 조합으로 전처리될 수 있고/거나, 나노입자의 표적 바이오마커(들)에 대한 특이성 및 결합 동역학을 개선하기 위하여 나노입자가 샘플에 첨가되거나, 도입되거나, 분산되거나 또는 혼합되기 전에 매트릭스 특이적 도전을 관리할 수 있다. 샘플 전처리 후 나노입자의 샘플에의 지연된 첨가는 샘플 전처리 후 나노입자를 샘플에 첨가함으로써 물리적으로 제어될 수 있다. 나노입자는 또한 샘플 전처리 중에 샘플에 존재할 수 있다. 만약 나노입자가 샘플에서 방출되거나, 첨가되거나, 분산되거나 또는 혼합될 수 있기 전에 화학물질, 중합체 또는 당이 용해될 필요가 있도록 나노입자가 화학물질, 중합체 또는 당 껍질, 코팅, 또는 중합화에 의해 캡슐화되거나, 차폐되거나 또는 보호된다면, 나노입자는 또한 샘플 전처리 중에 샘플에 존재할 수 있다. 나노입자의 지연된 방출은 현재 지연된 약물 방출 기술에서 사용되는 것과 같이 기술분야에 숙련된 사람들에게 알려져 있는 화학을 사용할 수 있다.
제조용 친화성 분리는 일반적으로 칼럼 크로마토그래피를 사용하였다. 자성 입자 분리 기술은 일부 샘플이 유발할 수 있는 칼럼의 응고 문제를 피할 수 있다. 한 예에서, 자성 입자 기술은 전혈 또는 세포 함유 혈액 분획의 처리를 허용한다. 자성 입자 분리 기술은 또한 전형적인 칼럼 기반 친화성 분리보다 적은 시간 내에 달성될 수 있다. 자성 분리 기술의 또 다른 장점은 포획된 리간드(바이오마커)의 용출이 더 작은 부피로 달성될 수 있고, 추가 처리 없이 더 농축된 분자를 초래할 수 있다는 것이다.
입자의 자성 분리 방법
한 측면으로, 본원에는 생물학적 샘플로부터 간섭을 제거하는(예컨대, 진단 테스트 전에, 또는 바이오마커의 풍부화 또는 분리 전에), 또는 자성 입자를 단리 또는 분리하는(예컨대, 일차 혈액 수집 튜브, 맞춤형 샘플 수집 장치, 이차 전달 튜브 또는 맞춤형 샘플 장치, 또는 모아진 샘플 내에서)) 방법이 제공된다. 예를 들어, 자석 기반 장치는 빠르게(2분 미만; 바람직하게 30초 미만) 자성 나노입자를 측면(들) 및/또는 바닥으로 분리시켜서 본질적으로 입자 없는 상층액을 형성한다. 입자 없는 상층액은 후속해서 입자를 포함하는 펠릿을 파괴하지 않으면서 흡인, 배수, 또는 다르게는 제거될 수 있고 진단 테스트를 위해 별도의 전달 튜브에 분배될 수 있다. 일부 구현예에서, 펠릿은 분리되거나 진단 테스트를 받는다.
입자의 자성 분리를 위한 장지
본원에는 바이오마커를 개선시키거나 고갈시키기 위하여, 예를 들어 진단 테스트를 위하여 본원에 기술된 방법으로 사용될 수 있는 본원에 기술된 입자를 포함하는 장치가 제공된다. 일부 구현예에서, 장치는 본원에 기술된 입자와 본원에 기술된 샘플과의 조합을 지연시키는 물리적 메커니즘을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 장치는 본원에 기술된 입자와 본원에 기술된 샘플과의 조합을 지연시키기 위하여 시간 제한 방출 메커니즘을 포함한다.
자성 튜브 홀더. 맞춤형 자성 튜브 홀더, 또는 스탠드로부터 제거될 수 있는 맞춤형 자성 튜브 홀더로, 입자 없는 상층액의 후속 진단 테스트를 위해 샘플 랙 내부에 삽입될 수 있다. 맞춤형 자성 튜브 홀더는 샘플 튜브 바코드가 분석자에 의해 여전히 감지되고 판독될 수 있거나, 또는 지방혈증, 용혈, 세포 파편/응고 검출, 수준 감지, 등과 같은 색인 테스트가 여전히 분석자에 의해 수행될 수 있는 디자인에서 물리적 개구부 또는 깨끗한/투명한 플라스틱(자석 또는 자석 배열이 존재하지 않는 경우)을 갖도록 설계될 수 있다. 샘플 튜브는 자성 튜브 홀더 개구부(공간) 또는 깨끗한/투명한 플라스틱이 분석자가 바코드를 보고 판독하고/거나 지방혈증, 용혈, 세포 파편/응고 검출, 수준 감지, 등과 같은 색인 테스트를 수행하는 것을 허용하는 것을 보장하기 위하여 특정 방향으로만 맞춤형 자성 튜브 홀더를 맞추기 위하여, 노치, 또는 텅(tongue) 및 그루브 디자인을 갖도록 설계된 맞춤형 샘플 튜브일 수 있다.
일부 구현예에서, 샘플 랙에 부착될 수 있는 자석(들)의 사용은 접착제, 벨크로, 또는 다른 방법을 통한 것이다. 자성 나노입자를 함유하는 샘플 튜브가 자석(들)이 있는 샘플 랙 위치(들)로 삽입된 후에, 자성 나노입자는 샘플 튜브의 측면(들) 및/또는 바닥으로 빠르게 분리되어 샘플 랙 특이적 테스트 플랫폼 또는 분석자에 의한 진단 테스트를 위한 본질적으로 입자 없는 샘플 상층액이 형성될 것이다.
주어진 분석기(예컨대, Abbott ARCHITECT, Siemens ADVIA Centaur XP, Roche cobas e411/e601/602/e801, Beckman Coulter Access 2/DxI 400/DxI 800, DiaSorin LIAISON/LIAISON XL, 등에 특이적임)와 부합하는 맞춤형 자성 샘플 랙으로서 샘플 랙 자체. 예를 들어, 랙에서 모든 튜브 위치는 자성 나노입자를 샘플 튜브의 측면(들) 및/또는 바닥으로 빠르게 분리하여 진단 테스트 전에 본질적으로 입자 없는 샘플 상층액을 형성하도록 설계된 자석의 배열을 가질 것이다.
한 측면으로, 본원에는 시험관의 랙을 위해 홀더(예컨대, 시험관 홀더)를 포함하는 장치(예컨대, 분리 장치)가 제공되며, 홀더는 자석을 포함한다.
일회용 피펫 팁. 한 측면으로, 장치는 자성 나노입자를 피펫 팁의 표면으로 빠르게 분리하여 본질적으로 입자 없는 샘플 상층액을 형성하기 위해 일회용 팁 내부에 삽입된 맞춤형 자석을 포함하는 일회용 피펫 팁이다. 맞춤형 자석이 있는 일회용 피펫 팁은 후속해서 입자를 포함하는 펠릿을 파괴하지 않으면서 샘플로부터 제거될 수 있다. 입자를 포함하는 일회용 팁은 만약 입자가 포획한 것을 측정하거나 특징규명할 필요가 없다면(즉, 간섭 고갈) 폐기되거나, 또는 후속되는 진단 테스트에서 입자의 분리 및 특징규명(즉, 풍부화)을 위해 새로운 튜브에 삽입될 수 있다. 예를 들어, 입자가 있는 일회용 팁은 완충제를 함유한 이차 전달 튜브에 삽입될 수 있다. 만약 자석이 팁으로부터 제거되거나, 또는 자석이 꺼져 있다면(예컨대, 전자석) 입자는 완충액으로 자유롭게 분산된다.
한 측면으로, 본원에는 일회용 피펫 팁을 포함하는 장치가 제공되며, 팁은 자석을 포함한다.
입자의 물리적 분리 방법
한 측면으로, 본원에는 물리력(예컨대, 중력)에 의해 본원에 기술된 입자를 제거하는 방법이 기술된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 입자는 생물학적 샘플로부터 물리력에 의해 분리되거나, 단리되거나, 또는 제거된다(예컨대, 원심분리에 의해). 일부 구현예에서, 방법은 본원에 기술된 진단 테스트 방법의 적용 전에, 예를 들어, 일차 혈액 수집 튜브, 맞춤형 샘플 수집 장치, 이차 전달 튜브 또는 맞춤형 샘플 장치 내에서 사용된다. 일부 구현예에서, 입자를 제거하기 위한 방법은 여과이다.
예를 들어, "응고물"(혈청에서)의 후속 포획 또는 결합 및/또는 세포 파편(혈청 또는 혈장에서)의 포획 또는 결합을 위한 피브로넥틴 및/또는 다른 응고 인자 또는 응고 구성요소/구성성분에 특이적인 자성 나노입자는 강력한 자석 또는 자석 기술을 원심분리기 로터 및/또는 튜브 홀더에 포함시킴으로써 원심분리 속도 및 효율을 향상시킨다(실험실 효율, 작업 흐름 및 산출량을 개선하기 위한 더 짧은 회전 시간). 원심분리로부터의 RCF 또는 G와 자성 나노입자 복합체(즉, 응고물 + 자성 비드, 세포 파편 + 자성 비드)의 자성 분리와의 이런 조합은 샘플 튜브의 측면 또는 바닥에서의 훨씬 더 빠르고 보다 효율적인 분리 및 상층액 형성을 가능하게 하여 후속 분석을 위해 샘플을 정화시킨다. 예를 들어, 대부분의 실험실에서 이 원심분리 단계는 4분 이상이며, 자성 나노입자 응고물/세포 파편 복합체의 자성 분리/단리와 원심분리를 조합함으로써 2분 이하로 감소될 수 있다.
더욱이, 만약 나노입자 또는 복수의 자성 나노입자가 또한 하나 이상의 상이한 샘플 간섭 메커니즘, 예컨대 1, 5, 10, 20, 30개, 또는 그 이상의 상이한 간섭 메커니즘에 대해 특이적이라면, 이들 간섭은, 존재하는 경우, 나노입자에 의해 포획될 것이고 원심분리로부터의 물리적 분리 후에, 또는 위에서 기술된 원심분리와 자성 분리의 조합에 의해 샘플로부터 고갈될 수 있다.
이들 자성 나노입자는 원심분리 또는 원심분리기에서 원심분리와 자성 분리의 조합을 통해 분리되기 위하여 응고물 또는 세포 파편에 대해 특이성을 가질 필요가 없지만, 그것의 표면은 하나 이상의 항체 및/또는 항원으로 동시 코팅되거나 고정될 수 있고 여기서 하나 이상의 항체는 응고물 및/또는 세포 파편에 특이적이겠지만, 다른 항체(들) 및/또는 항원은 샘플 간섭에 특이적일 것이다. 이와 관련하여, 나노입자는 후속 물리적 분리 또는 원심분리 또는 원심분리 및 자성 분리의 조합을 통한 분리를 위해 응고물 및/또는 세포 파편뿐만 아니라 샘플 간섭에 모두 특이적으로 결합할 것이다.
응고물 및/또는 세포 파편에 특이적인 나노입자의 사용은 자성 나노입자에 의한 특이적 결합 및 자성 분리 및 분리를 위해 모든 것을 자석으로 끌어당김으로써 응고 속도를 증가시킨다. 자기장 및 강도에 의해 형성된 이런 비드 기반 펠릿은 또한 응고물의 강제된 근접성 또는 나노입자와 후속적으로 자석에 의한 구체적으로 포획된 응고 인자를 토대로 응고물 형성을 가속화한다.
입자의 화학적 분리 방법
일부 구현예에서, 본원에 기술된 입자는 생물학적 샘플로부터 화학적 분리 방법에 의해 분리되거나, 단리되거나, 또는 제거된다. 일부 구현예에서, 화학적 분리 방법은 진단 테스트 방법의 적용 전에, 예를 들어, 일차 혈액 수집 튜브, 맞춤형 샘플 수집 장치, 이차 전달 튜브 또는 맞춤형 샘플 장치 내에서 사용된다.
한 측면으로, 입자의 화학적 분리 방법이 제공되며, 방법은 염, 용매, 중합체, 또는 계면활성제 중 하나 이상을 제공하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 화학적 분리 방법, 예컨대, 액체-액체 상 분리는 입자를 상 A에 분배하고, 나노입자 유리 샘플은 상 B로 나누어질 것이고 상 B가 테스트된다. 액체-액체 상 분리(화학적 상 분리)를 위한 작용제는 염, 가용성 중합체 및 계면활성제에 의한 것일 수 있다.
예를 들어, 액체-액체 상 분리는 헥산과 같은 비극성 용매를 극성 수성 샘플에 첨가함으로써 발생할 수 있고 여기서 비극성 상으로의 입자 분할로 본원에 기술된 진단 테스트에 의해 테스트하기 위한 나노입자 유리 수성 상이 남겨진다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 분리 방법은 유기상에 나노입자를 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 분리 방법은 수성 상에 나노입자를 제공한다.
생물학적 샘플 중의 입자를 분리하는 방법으로, 방법은 입자 및 생물학적 샘플에 비극성 용매 및 수성 극성 용매를 제공하여 비극성 용매층과 극성 용매층을 제공하는 단계, 비극성 용매를 포함하는 비극성 용매층을 제거하는 단계, 및 입자를 포함하는 수성 극성 용매를 분리함으로써, 입자를 분리하는 단계를 포함한다.
샘플 회수는 내부 표준, 예컨대 LC-MS/MS에 대한 변성된 내부 표준을 비극성 상의 흡인 및 폐기 전에 첨가 및 사용함으로써 조정 또는 보정될 수 있다.
일부 구현예에서, 분리는 자성 분리와 함께 사용된 물리적 분리이다. 예를 들어, 한 측면으로, 장치(예컨대, 자화된 원심분리기 또는 중력 및 자석의 자기력 둘 다에 의해 분리를 보조하는 자석이 장착된 원심분리기)가 제공된다. 한 측면으로, 본원에는 본원에 기술된 입자의 분리를 위한 장치가 제공되며, 장치는 자석과 원심분리기를 포함한다. 일부 구현예에서, 장치는 원심분리 시간을 상당히 감소시킨다.
간섭의 제거 방법
본원에는 간섭을 제거 또는 최소화하는 방법이 기술되며, 방법은 용혈, 지방혈증, 황달, 빌리루빈, 마이크로피브린 응고물, 세포 파편, 혈액 세포, 피브리노겐, 약물, 대사산물, 보충제, 허브 요법, 및 종합비타민과 같은 다른 간섭 물질로 인한 테스트 오류(예컨대, 간섭)의 알려진 분석 전 및 분석 공급원을 고갈(예컨대, 완화, 감소 또는 관리)시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 매트릭스 효과 또는 샘플 유형 차이(예컨대, 동물 종, 인간 종)로 인한 간섭을 제거하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 진단 테스트(예컨대, 예를 들어 임상 실험에서 진단 또는 바이오마커 테스트) 전에 간섭을 제거하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 바이오마커 제거 방법은 임상 실험에서 본원에 기술된 바이오마커의 진단 테스트의 정확도 및 의존성을 개선하기 위한 임상 실험에 사용된다. 예를 들어, 본원에 기술된 방법은 환자 선택 또는 선별에, 예컨대, 포함 또는 배제 기준에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법 또는 제거 또는 고갈은 임상 데이터 또는 임상 실험 결과에서 국외자를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 임상 데이터 또는 임상 실험에서 국외자는 본원에 기술된 바이오마커에 대한 위양성 또는 위음성 확인을 포함한다.
고갈은 후속되는 간섭 유리 또는 감소된 정량적, 반정량적, 또는 정량적 분석을 위해 충분한 양의 간섭이 포획되고/거나 제거된다면 완전한 것으로 정의된다. 고갈은 후속되는 반정량적 또는 정량적 분석을 위해 충분한 양의 간섭(들) 또는 간섭 메커니즘(들)이 포획되고/거나 제거된다면 부분적인 것으로 정의되며, 또는 LCMS 및 LC- MS/MS(즉, 변성된 내부 표준) 및 HPLC(C14 또는 적정된 내부 방사성 동위원소 내부 표준)와 같은 표적 분석물(들) 또는 바이오마커의 회수를 위해 조정하기 위해 내부 표준을 사용할 수 있는 측정 방법에 의한 정량적, 반정량적 또는 정성적 분석을 위해 충분한 양의 간섭(들) 또는 간섭 메커니즘(들) 및 내부 표준(들)이 포획된다면 또한 부분적이다.
고갈은 샘플로부터 간섭의 100% 제거를 함축하지 않지만 잔류 간섭이 더 이상 잘못된 결과를 초래하지 않는 것을 의미한다. 그런, 샘플 전처리 고갈은 필요하다면 LC-MS/MS에 의한 후속되는 용출 및 분석과 같은 특정 검정 또는 목적을 위해, 또는 분자 진단을 위한 샘플 분석 전 처리, 핵산 정제 및 농축을 위해, 또는 소변, 타액 및 대변과 같은 까다로운 샘플 유형으로부터 바이오마커의 풍부화를 위해 간섭의 100% 제거를 초래할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 1주, 6일, 5일, 4일, 3일, 2일, 1일, 24시간, 20시간, 16시간, 12시간, 8시간, 4시간, 2시간, 1시간, 30분, 15분, 10분, 5분 또는 그 미만보다 적은 시간에 수행된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 1일 이내에 수행된다.
간섭
본원에 제공된 방법은 생물학적 샘플에서 간섭을 감소, 최소화, 또는 제거한다. 간섭은 진단 테스트의 결과의 정확한 값을, 예컨대, 항체 결합을 간섭함으로써 변경시킬 수 있거나, 또는 가교, 입체 장애, 또는 자가항체 메커니즘에 의해 검정 신호를 증가 또는 감소시킬 수 있는, 환자 표본에 존재하는 물질이다. 본원에서 사용되는 바 "간섭"은 혈액, 혈장, 혈청, CFS, 소변, 대변, 타액, 정액, 양수, 또는 다른 체액 또는 샘플 매트릭스, 예컨대 면역글로불린(IgG, IgM, IgA, IgE, IgD), 단백질, 항원, 지질, 트라이글리세라이드, 세포 구성성분, 외래 물질, 화학물질, 약물, 약물 대사산물, 보충제, 비타민, 허브 요법, 이물질(바이러스, 박테리아(그람 양성, 그람 음성), 진균, 효모) 및 테스트를 간섭할 수 있고 테스트 원료 물질, 제형, 생물학적 및 합성 구성요소, 테스트 설계, 및/또는 테스트 포맷과의 특이적 또는 비특이적 상호작용에 의해 잘못된 테스트 결과를 초래할 수 있는 임의의 이물질, 식품 또는 식이 물질에 의해 생성된 폐기물 중의 임의의 내인성 또는 외인성 물질 또는 내인성 및/또는 외인성 물질의 조합을 나타낸다. 간섭은, 한정하는 것은 아니지만, 이종체(heterophile) 또는 이종체 유사 간섭, 예컨대 자가항체, 류머티스 인자(RF), 인간 항-마우스 항체(HAMA), 인간 항-동물 항체(HAAA), 예컨대 염소, 토끼, 양, 소, 마우스, 말, 돼지, 및 당나귀 다클론성 및/또는 단클론성 항체, 및 테스트 설계 또는 검정 제형에 사용된 제조 검정 특이적 간섭, 예컨대 화학발광 기질(루미놀, 아이소루미놀, 아이소루미놀 유도체, ABEI, ABEI 유도체, 루테늄, 아크리디늄 에스테르), 형광 표지, 예컨대 플루오레세인 또는 다른 형광단 및 염료, 포획 모이어티(스트렙트아비딘, 뉴트라비딘, 아비딘, 캡트아비딘, 폴리A, 폴리DT, 압타머, 항체, Fab, F(ab')2, 항체 단편, 재조합 단백질, 효소, 단백질, 생체분자, 중합체) 및 그것의 결합 파트너(즉, 비오틴, 플루오레세인, 폴리DT, 폴리A, 항원, 등), 콘쥬게이션 링커(LC, LC-LC, PEO, PEOn), 소 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민, 오브알부민, 젤라틴, 정제된 다클론성 및 단클론성 IgG, 예컨대 마우스, 염소, 양 및 토끼, 폴리비닐 알코올(PAA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), Tween-20, Tween-80, Triton X-100, 플루로닉 및 테트로닉과 같은 삼블록 공중합체, 및 상업적으로 이용 가능한 차단제, 차단 단백질 및 중합체 기반 차단 시약일 수 있고 이것들은 항체 기반 진단 테스트, 비-항체 기반 진단 테스트, 또는 샘플 전처리 방법 및 질량 분석(즉, HPLC, MS, LCMS, LC-MS/MS), 방사성 면역검정(RIA), 효소 결합 면역검정(ELISA), 화학발광 면역검정(CLIA), 분자 진단, 측면 흐름, 현장 진료(PoC), CLIA 및 CLIA 면제 테스트 및 장치에 의한 후속 분석을 위한 장치의 설계에 전형적으로 사용된다(예컨대 Surmodics 및 Scantibodies로부터 유래).
한 측면으로, 본원에는 생물학적 샘플로부터 간섭(예컨대, 비오틴)을 제거하는 방법이 제공되며, 방법은 포획 모이어티(간섭에 결합할 것임)로 유도체화된 입자를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 간섭은 비오틴이다.
또 다른 측면으로, 샘플은 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)로 전처리되어 성 호르몬 결합 글로불린(SHBG) 또는 성 스테로이드 결합 글로불린(SSBG)을 혈청 또는 혈장으로부터 고갈시킬 수 있어서 SHBG 고갈 샘플이 후속해서 유리 또는 생체 이용 가능한 호르몬 또는 스테로이드(즉, 유리 테스토스테론)를 측정하기 위해 테스트될 수 있다. 일부 구현예에서, 간섭은 성 호르몬 결합 글로불린(SHBG) 또는 성 스테로이드 결합 글로불린(SSBG)이다.
일부 구현예에서, 간섭은 비오틴, HAMA, RF, 이종성, 또는 항-SAv이다.
바이오마커의 제거 또는 풍부화 방법
본원에는 생물학적 샘플에서 바이오마커의 농도를 향상 또는 증가시키는 방법이 기술된다. "풍부화"는 완전한 또는 부분적인 입자 포획 및 표적 분석물(들) 또는 바이오마커의 생물학적 샘플(예컨대, 인간 또는 동물 혈청, 혈장, 혈액, 전혈, 가공된 혈액, 소변, 타액, 대변(액체 및 고체), 정액 또는 정액, 세포, 조직, 생검 물질, DNA, RNA, 또는 임의의 유체 또는 고체)로부터의 입자에 대한 결합으로서 정의된다. 일부 구현예에서, 풍부화는, 예를 들어 바이오마커 특이적 나노입자가 세척되도록 한 후, 분리하여 바이오마커 특징규명 및 측정 단계 전에 간섭을 제거 또는 최소화함으로써, 생물학적 샘플의 세척 및 농축물을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 후속 용출 및 테스트 또는 다른 용도를 위해, 또는 진단 테스트, 추가의 정제, 제형화, 또는 다른 용도 전에 바이오마커의 농도를 풍부화 또는 증가시키기 위해 생물학적 샘플에서 특정 표적(예컨대, 바이오마커)을 분리 및 정제하기 위해 사용된다.
바이오마커 특이적 입자의 세척 또는 분리 후에, 입자는 특징규명 또는 측정 단계 전에 인산염 완충 식염수(즉, PBS, pH 7.2), 또는 LC-MS/MS 양립성 완충액과 같은 완충액에 분산, 재구성 또는 재현탁될 수 있다. 이것은 입자에 의한 포획되고 풍부화된 바이오마커의 핵심 특징규명 또는 측정 단계가 완충액 시스템에서 발생하며 동일한 특징규명, 측정 또는 테스트 방법 또는 시스템을 사용하여 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 측정된 동일한 바이오마커와 비교하여 동물 혈액, 혈장, 혈청 또는 소변에서 측정된 바이오마커 간에 매트릭스 효과 또는 편향을 도입하거나 유발하는 동물 또는 인간 매트릭스에서는 발생하지 않는 것을 의미한다. 세척은 샘플 매트릭스, 구성요소, 단백질 및 세포 구성요소 및 관련된 간섭 또는 매트릭스 효과가 세척되는 것을 허용한다. 유사하게, 분리된 바이오마커는 동물 또는 인간 매트릭스로부터 제거될 수 있고 치료 또는 예방 용도로 제형 완충액으로 방출될 수 있다.
풍부화는 충분한 양의 분석물(들)이 후속 진단 테스트, 예컨대, 정량적, 반정량적, 또는 정성적 분석을 위해 포획되는 경우 완전한 것으로 정의되며, 충분한 양의 분석물(들) 또는 바이오마커가 후속 반정량적 또는 정성적 분석을 위해 포획되는 경우 부분적인 것으로 정의되거나, 또는 충분한 양의 분석물(들) 또는 바이오마커 및 내부 표준(들)이 표적 분석물(들) 또는 바이오마커의 회수를 위해 조정하기 위해 내부 표준을 사용할 수 있는 측정 방법, 예컨대 LCMS 및 LC-MS/MS(즉, 변성된 내부 표준) 및 HPLC(C14 또는 적정된 내부 방사성 동위원소 내부 표준)에 의한 정량적, 반정량적, 또는 정성적 분석을 위해 포획되는 경우 부분적인 것으로 정의된다. 풍부화는 충분한 양의 포획된 종이 예방 또는 치료 제품에서의 후속 사용을 위해 얻어지는 경우 예비용으로 정의된다.
본원에는 a) 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)를 샘플에 첨가하는 단계; b) 샘플을 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)와 혼합하는 단계; c) 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)를 샘플과 인큐베이션하여 바이오마커를 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)에 결합시켜 포획하는 단계; d) 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)를 샘플로부터 분리 또는 제거하는 단계; e) 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)를 저장하는 단계; f) 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)를 적절한 세척 희석제를 사용하여 세척함으로써 비특이적 물질을 제거하는 단계; g) 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)에 의해 포획된 바이오마커의 양, 질량, 몰농도, 농도, 또는 수율을 바이오마커에 특이적인 정성적, 반정량적 또는 정량적 진단 테스트를 사용하여 측정하는 단계로 이루어지는, 진단 테스트 전에 샘플에서 바이오마커를 풍부하게 하는 방법이 제공된다. 일부 구현예에서, 희석제는 물(예컨대, 탈이온수, 주사용 물, 식염수, 완충된 수성 용액)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 풍부화 방법은 세척 단계를 포함한다. 세척 단계는 본원에 기술된 것과 같이 간섭을 제거하고/하거나 또는 세척되거나, 정제되거나, 또는 분리된 관심 있는 바이오마커(예컨대, 본원에 기술된 바이오마커)를 제공한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 풍부화 방법은 매트릭스 효과 또는 종 효과를 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 풍부화 방법은 상이한 기원의 두 생물학적 샘플을 비교하는 진단 테스트 전에 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 풍부화 방법은 동물 샘플과 인간 샘플을 비교하는 진단 테스트 전에 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 풍부화 방법은 혈청 샘플과 혈장 샘플을 비교하는 진단 테스트 전에 사용된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 풍부화 방법은 고점도의 샘플에 대해 사용된다.
일부 구현예에서, 풍부화 방법은 바이오마커로 풍부해진 제1 생물학적 샘플을 바이오마커로 풍부해진 제2 생물학적 샘플과 조합하는 단계를 포함한다.
본원에는 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)에 의해 포획 및 풍부화된 표적화된 바이오마커의 양, 질량, 몰농도, 농도, 또는 수율을 측정하는 방법이 제공되며 그로써 바이오마커는 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)로부터 본원에 기술된 절단 시약에 의해, 예컨대, pH(예컨대 중탄산 나트륨과 같은 염기로 증가된 pH, 아세트산, 트라이클로로아세트산, 설포살리실산, HCl, 포름산과 같은 산으로 감소된 pH, 및 100 mM 글리신·HCl, pH 2.5-3.0, 100 mM 시트르산, pH 3.0, 50-100 mM 트라이에틸아민 또는 트라이에탄올아민, pH 11.5, 150 mM 수산화 암모늄, pH 10.5와 같은 공통 pH 용출 완충액), 대체제(displacer) 또는 대체 작용제, 경합 용출(예컨대 >0.1 M 카운터 리간드 또는 유사체), 이온 강도 및/또는 혼돈 효과(예컨대 NaCl, KCl, 10 mM Tris pH 7.0 중의 3.5-4.0 M 염화 마그네슘, 10 mM 인산염 완충액 pH 7.2 중의 5 M 염화 리튬, 2.5 M 요오드화 나트륨 pH 7.5, 0.2-3.0 M 티오시안산 나트륨), 계면활성제, 세제(detergent), 농축 무기 염, 변성(예컨대 2-6 M 구아니딘·HCl, 2-8 M 우레아, 1% 데옥시콜레이트, 1% SDS), 유기 용매(예컨대 알코올, 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 아세토니트릴, 헥산, DMSO, 10% 다이옥산, 50% 에틸렌 글리콜 pH 8-11.5(또한 카오트로픽(chaotropic))), 방사선 또는 열(증가된 온도), 입체형태 변화, 이황화 결합 감소제(2-머캡토에탄올, 다이티오트레이톨, 트리스(2-카르복실에틸)포스핀), 효소 비활성화, 카오트로픽제(우레아, 염화 구아니디늄, 과염소산 리튬), 기계적 교반, 초음파처리, 및 단백질 소화 효소(펩신, 트립신), 및 그것들의 조합과 같은 용출 전략을 사용하여 결합 상호작용을 파괴함으로써 용출되거나, 분리되거나 또는 자유로워진다.
일부 구현예에서, 100 mM 글리신, pH 2.5가 복합체를 형성한 항-IgA, IgG, 및/또는 IgM 검출 항체(예컨대, AlexaFluor488-항-인간 IgG, AlexaFluor555-항-인간 IgM, AlexaFluor647-항-인간 IgA) 또는 표지된 검출 항체와 복합체를 형성한 포획된 IgA, IgG, 및/또는 IgM 항체를 포획 비드로부터 방출시키기 위한 용출 완충액으로서 사용된다. 자성 비드는 후속적으로 강력한 자석으로 분리된 후 용출물은 중화 완충액, 예를 들어, 300 mM Tris pH 10.0이 있는 새로운 웰로 전달되어 pH를 중화하고 형광 측정기 또는 형광 판독기에 의한 후속 검출을 위해 형광단의 안정성을 개선시킨다. 산성 용출 pH의 이런 중화는 검정 정확도 및 재생성을 개선하기 위해 중요할 수 있다.
다르게 명시되지 않거나, 또는 개시에서 암시되지 않는 한, 본원에 기술된 임의의 특정 방법 또는 조성물과 함께 기술된 임의의 구현예는 본원에 기술된 임의의 다른 구현예와 함께 사용될 수 있다.
다양한 구현예의 방법 및 조성물은 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 검정, 예를 들어 한정하는 것은 아니지만, 단백질-단백질 친화성 검정, 단백질-리간드 친화성 검정, 핵산 친화성 검정, 간접 형광 항체 검정(IFAS), 효소 결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사성 면역검정(RIA), 및 효소 면역검정(EIA), 직접 또는 간접 검정, 경합 검정, 샌드위치 검정, CLIA 또는 CLIA 웨이브 테스트, LC-MS/MS, 분석 검정, 등을 포함한 기술분야에 알려져 있는 임의의 적합한 친화성 검정 또는 면역검정과 함께 사용될 수 있다.
진단 테스트 전에 동일한 샘플로부터 샘플 간섭을 고갈시키고 바이오마커를 풍부하게 하는 방법은: a) 화학적 및/또는 생물학적 시약, 첨가제 또는 조성물을 샘플에 첨가하여 바이오마커 특이적 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)의 샘플에의 첨가 전에 샘플 특이적 간섭을 차단 또는 고갈시키는 단계; b) 샘플을 화학적 및/또는 생물학적 시약, 첨가제 또는 조성물로 사전 처리 또는 함께 인큐베이션한 후에 샘플에 바이오마커 특이적 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)를 첨가하는 단계; c) 바이오마커 특이적 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)를 샘플과 함께 인큐베이션하여 표적화된 바이오마커(들)를 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)에 결합시키고 포획하는 단계; d) 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)를 세척하거나 샘플 및 화학적 및/또는 생물학적 시약, 첨가제 또는 조성물로부터 분리하는 단계; e) 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자)에 의해 포획되고 풍부화된 바이오마커(들)를 진단 테스트를 사용하여 특징규명하는 단계를 포함한다.
예를 들어, 구현예에서, 캡트아비딘에 결합된 입자는 중성 pH에서 샘플 중의 비오틴과 결합할 것이다. 캡트아비딘 입자에 결합된 비오틴은 pH가 10으로 상승할 때 비오틴을 방출할 것이다.
바이오마커
본원에는 생물학적 샘플에 존재하는 바이오마커를 분리하는 방법 또는 분리하거나 풍부하게 하는 방법이 기술된다. 본원에서 언급되는 "바이오마커"는 노화 또는 질환과 같은 과정, 사건, 또는 상태의 독특한 생물학적 또는 생물학적으로 유래된 지표(예컨대, 대사산물)로서 정의된다. 바이오마커는 내인성 및/또는 외인성 분석물, 항원, 소분자, 큰 분자, 약물, 치료제, 대사산물, 생체이물, 화학물질, 펩타이드, 단백질, 단백질 소화물, 바이러스 항원, 박테리아, 세포, 세포 용해물, 세포 표면 마커, 에피토프, 항체, 항체의 단편, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 수용체, 수용체 리간드, 호르몬, 호르몬 수용체, 효소, 효소 기질, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드, 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드, 중합체 및 압타머일 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 본원에 기술된 간섭(예컨대, 진단 테스트의 정확한 결과의 값을, 예컨대 항체 결합을 간섭함으로써 변경시킬 수 있거나, 또는 가교, 입체 장애, 또는 자가항체 메커니즘에 의해 검정 신호를 증가 또는 감소시킬 수 있는, 환자 표본에 존재하는 물질)이다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 감염성 질환 항원, 예를 들어 바이러스 항원에 대한 항체이다. 감염성 질환 항원에 대한 항체는 감염성 질환 병원체로의 감염에 대한 노출, 및 그것으로부터의 회복을 나타낼 수 있다. 그러한 경우에 항체는 치료 또는 예방 목적의 수동 면역화에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서 감염성 질환 항원에 대한 항체는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 스파이크 단백질, 예를 들어 S1 하위유닛, 또는 그것의 수용체 결합 도메인 및/또는 N 말단 도메인을 인식한다. 본원에서 사용되는 바 "간섭"은, 한정하는 것은 아니지만, 이종체 또는 이종체 유사 간섭, 예컨대 자가항체, 류머티스 인자(RF), 인간 항-마우스 항체(HAMA), 인간 항-동물 항체(HAAA), 예컨대 염소, 토끼, 양, 소, 마우스, 말, 돼지, 및 당나귀 다클론성 및/또는 단클론성 항체, 및 테스트 설계 또는 검정 제형에 사용된 제조 검정 특이적 간섭, 예컨대 화학발광 기질(루미놀, 아이소루미놀, 아이소루미놀 유도체, ABEI, ABEI 유도체, 루테늄, 아크리디늄 에스테르), 형광 표지, 예컨대 플루오레세인 또는 다른 형광단 및 염료, 포획 모이어티(스트렙트아비딘, 뉴트라비딘, 아비딘, 폴리A, 폴리DT, 압타머, 항체, Fab, F(ab')2, 항체 단편, 재조합 단백질, 효소, 단백질, 생체분자, 중합체) 및 그것의 결합 파트너(즉, 비오틴, 플루오레세인, 폴리DT, 폴리A, 항원, 등), 콘쥬게이션 링커(LC, LC-LC, PEO, PEOn), 소 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민, 오브알부민, 젤라틴, 정제된 다클론성 및 단클론성 IgG, 예컨대 마우스, 염소, 양 및 토끼, 폴리비닐 알코올(PAA), 폴리비닐피롤리돈(PVP), Tween-20, Tween-80, Triton X-100, 플루로닉 및 테트로닉과 같은 삼블록 공중합체, 및 상업적으로 이용 가능한 차단제, 차단 단백질 및 중합체 기반 차단 시약일 수 있고 이것들은 항체 기반 진단 테스트, 비-항체 기반 진단 테스트, 또는 샘플 전처리 방법 및 질량 분석(즉, HPLC, MS, LCMS, LC-MS/MS), 방사성 면역검정(RIA), 효소 결합 면역검정(ELISA), 화학발광 면역검정(CLIA), 분자 진단, 측면 흐름, 현장 진료(PoC), CLIA 및 CLIA 면제 테스트 및 장치에 의한 후속 분석을 위한 장치의 설계에 전형적으로 사용된다(예컨대 Surmodics 및 Scantibodies로부터 유래). 일부 구현예에서, 바이오마커는 본원에 기술된 생물학적 샘플에서 발견된다.
피브리노겐. 피브리노겐은 조직 및 혈관 손상 중에 트롬빈에 의해 피브린으로 전환되며, 그것은 후속적으로 피브린 기반 혈액 응고물의 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법에서 사용된 본원에 기술된 입자(예컨대, 입자 유래 항-피브리노겐(예컨대, 마우스 항-피브리노겐))는 전혈에서 피브리노겐에 결합하여 분리(예컨대, 화학적 분리)를 허용한다. 피브린을 통해 응고물에 결합하는 입자는 입자가 없는 혈청 테스트를 위해 원심분리 후 혈청으로부터 분리 및 제거될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 피브리노겐이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법은 샘플(예컨대, 혈액 샘플)의 원심분리에 대한 필요성을 제거하기 위해 입자 유래 항-피브리노겐을 사용한다.
외상성 뇌 손상. 한 구현예에서, 바이오마커는 외상성 뇌 손상에 대한 것이다. 급성 뇌 손상의 중증도 및 크기 및 혈액 뇌 장벽(BBB)의 무결성과 관련된 9개의 바이오마커가 있지만, 그것들은 혈액에서 매우 낮은 순환 농도로 존재하고 기존의 면역검정 기술 및 테스트 플랫폼을 사용하여 검출 및 정량화가 매우 어렵다. 반얀(Banyan) BTI 테스트(FDA 승인 2018년 2월 14일)는 이들 바이오마커 중 2개만을 측정하지만, 본원에 기술된 방법 및 장치(예컨대, 풍부화 방법; 풍부화 장치)는 환자에서 9개 전부의 동시 측정을 가능하게 하여 가까운 환자의 진단 및 예후를 도울 수 있다. 9개의 바이오마커의 각각에 대한 포획 모이어티로 유도체화된 입자는 TBI를 가진 것으로 의심되는 환자로부터의 생물학적 샘플에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, 외상성 뇌 손상 바이오마커는 S100B, GFAP, NLF, NFH, γ-에놀라제(NSE), α-II 스펙트린, UCH-L1, 총 타우, 및 인산화된 타우로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 외상성 뇌 손상 바이오마커는 GFAP 및 UCH-L1로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법(예컨대, 풍부화 방법)은 S100B, GFAP, NLF, NFH, γ-에놀라제(NSE), α-II 스펙트린, UCH-L1, 총 타우, 및 인산화된 타우로 이루어지는 군으로부터 선택된 외상성 뇌 손상 바이오마커의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개의 존재를 분리 또는 풍부화하기 위해 사용된다.
알츠하이머병. 한 구현예에서, 바이오마커는 알츠하이머병에 대한 것이다. 알츠하이머병의 중증도 및 크기와 관련된 2개의 바이오마커가 있다. 일부 구현예에서, 알츠하이머병 바이오마커는 아밀로이드 베타, BACE1, 및 가용성 Aβ 전구체 단백질(sAPP)로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 알츠하이머병 바이오마커는 β-아밀로이드(1-42), 인-타우(181p), 및 총 타우로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법(예컨대, 풍부화 방법)은 아밀로이드 베타, BACE1, 및 가용성 Aβ 전구체 단백질(sAPP)로 이루어지는 군으로부터 선택된 알츠하이머병 바이오마커의 1, 2 또는 3개의 존재를 분리 또는 풍부화하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 아밀로이드 베타, BACE1, 또는 가용성 Aβ 전구체 단백질(sAPP)이다. 일부 구현예에서, 알츠하이머병에 대한 바이오마커는 생물학적 샘플(예컨대, CSF)에서 발견된다.
성 매개 질환. 한 구현예에서, 바이오마커는 성 매개 질환(STD)에 대한 것이다. STD의 전염에 특징적인 바이오마커가 적어도 10개 있다. 일부 구현예에서, STD 바이오마커는 클라미디아, 임질, 매독, 트리코모나스, HPV, 헤르페스 1 및 2, HSV, A형 간염, B형 간염, C형 간염, HIV 1 및 2에 대한 바이오마커이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 방법(예컨대, 풍부화 방법)은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개의 STD 바이오마커: 클라미디아, 임질, 매독, 트리코모나스, HPV, 헤르페스 1 및 2, HSV, A형 간염, B형 간염, C형 간염, HIV 1 및 2, 및 HIV 항체의 존재를 분리 또는 풍부화하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 소변에 있다(예컨대, 클라미디아, 임질, 트리코모나스). 일부 구현예에서, 바이오마커는 혈액, 혈청, 또는 혈장에 있다(예컨대, 매독, HPV, 헤르페스 1 및 2, HSV, A형 간염, B형 간염, C형 간염, HIV 1 및 2, HIV 항체).
박테리아 감염. 한 구현예에서, 바이오마커는 박테리아 감염, 예컨대, 패혈증에 대한 것이다. 박테리아 감염에 대한 현재 황금 표준 테스트는 혈액 배양으로 양성 결과가 분자 진단과 같은 확인 테스트에 반영될 수 있기까지 24-48시간이 걸린다. 본원에는 패혈증을 예방 또는 관리하기 위해 환자를 성공적으로 치료하는데 시간이 중요한 경우 30분 이내의 짧은 시간, 예를 들어 60분 이내(예컨대, 50분, 40분, 30분, 20분 또는 그 이하)에 박테리아 감염을 용인/배제(rule-in/rule-out)하는 방법이 기술된다. 박테리아 감염의 특징적인 바이오마커가 적어도 30개 있다. 일부 구현예에서, 박테리아 바이오마커는 패혈증 유발 박테리아 종(예컨대, 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 대장균(Escherichia coli), 폐렴 간균(Klebsiella pneumoniae), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 및 황색 포도상구균(Staphylococcus aureus))에 대한 바이오마커로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 엔테로코커스 패시움, 대장균, 폐렴 간균, 녹농균, 및 황색 포도상구균에 대한 바이오마커이다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 그람 양성 박테리아 또는 그람 음성 박테리아에 대한 바이오마커이다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 효모 병원체(예컨대, 혈류 병원체와 관련된 효모 병원체)에 대한 바이오마커이다.
일부 구현예에서, 그람 양성 박테리아는: 엔테로코커스(Enterococcus), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 스타필로코커스(Staphylococcus), 황색 포도상구균, 스트렙토코커스(Streptococcus), B군 연쇄상구균(Streptococcus agalactiae), 폐렴 구균(Streptococcus pneumoniae), 또는 화농성 연쇄상구균(Streptococcus pyogenes)이다.
일부 구현예에서, 그람 음성 박테리아는: 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 뇌수막염균(Neisseria meningitides), 녹농균, 장내세균과(Enterobacteriaceae), 엔테로박터 클로아카에 복합체(Enterobacter cloacae complex), 대장균, 클레브시엘라 옥시토카(Klebsiella oxytoca), 폐렴 간균, 프로테우스(Proteus), 또는 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)이다.
일부 구현예에서, 효모 병원체는: 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 글라브라타(Candida glabrata), 칸디다 크루세이(Candida krusei), 칸디다 파라프실로시스(Candida parapsilosis), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis)이다.
일부 구현예에서, 질량 분석 방법이 이어진다. 절단제(예컨대, 환원제(예컨대, DTT 또는 TCEP))가 박테리아-입자 결합 복합체에 첨가되어 링커(즉, 입자를 표면 포획 모이어티에 콘쥬게이션시키는 링커)를 절단하는 방법이 구상된다. 결과적으로 생성된 박테리아는 배양에서 성장되거나 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 분석된다.
절단제(예컨대, 환원제(예컨대, DTT 또는 TCEP))가 박테리아-입자 결합 복합체에 첨가되어 링커(즉, 입자를 표면 포획 모이어티에 콘쥬게이션시키는 링커)를 절단하는 방법이 구상된다. 결과적으로 생성된 박테리아는 배양에서 성장되거나 MALDI-TOF 질량 분석에 의해 분석되거나 또는 BioFire 진단에 의한 FilmArray® 혈액 배양 확인(BCID) 패널과 같은 분자 진단에 의해 분석된다.
병원체 특이적 항체. 일부 구현예에서 바이오마커는 병원체, 특히 병원체의 구조적 또는 표면 노출된 항원을 인식하는 항체이다. 병원체 특이적 항원은 자성 입자 상의 포획 모이어티로서 사용된다. 전혈, 혈액 분획, 혈장 또는 혈청이 항원 특이적 항체가 포획 모이어티(병원체 특이적 항원)에 결합할 수 있도록 자성 입자와 혼합된다. 입자는 생물학적 유체로부터 자기적으로 분리된다. 그런 후 자성 입자가 방출 완충액에서 반응하여 항체가 포획 모이어티로부터 용출된다. 이것은 분석 규모로 실행될 수 있고 항체는 질량 분석(예를 들어, 존재할 수 있는 항체의 다중 종을 분리하기 위한 LC-MS), 에드만 분해, 및 항체의 단백질 서열을 측정하기 위한 다른 단백질 화학 분석 방법이 수행될 수 있다. 서열 정보는 동일한 특이성 또는 특이성들(파라토프(들))을 가지는 단클론성 항체를 구성하기 위해 사용될 수 있다. 이것은 또한 제조 규모로 실행될 수 있고 풍부화된 또는 분리된 항원 특이적 항체는 치료 또는 예방을 위해 임상에서 사용된다. 일부 구현예에서 병원체 특이적 항원을 인식하는 항체는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질 스파이크 단백질, 예를 들어 S1 하위유닛, 또는 그것의 수용체 결합 도메인 및/또는 N 말단 도메인 및/또는 수용체 결합 도메인을 인식한다.
갑상선 기능. TSH 농도는 갑상선 호르몬의 과다(갑상선 기능 항진증) 또는 결핍(갑상선 기능 저하증)을 가지는 것으로 의심되는 환자에서 갑상선 기능의 일부로서 측정된다. 본원에 기술된 방법은 일부 구현예에서 갑상선 기능을 평가하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 항원(예컨대, TSH)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 항원(예컨대, TSH)에 특이성을 가진 자가항체(예컨대, 유리 자가항체, 복합 자가항체)이다.
일부 구현예에서, 간섭(갑상선 자극 호르몬, 유리 티록신, 및 유리 트라이요오도티로닌의 측정에 영향을 미침)은 매크로TSH, 비오틴, 항-스트렙트아비딘 항체, 항-루테늄 항체, 갑상선 호르몬 자가항체, 또는 이종성 항체이다.
심장 기능. 본원에 기술된 방법은 일부 구현예에서 심장 기능을 평가하기 위해 사용된다. 혈액에서 증가된 수준의 트로포닌 순환은 심장 장애, 예컨대, 심근 경색(myocardial infarction)의 바이오마커이다. 심장 I 및 T는 심근 손상의 특이적 지표이다. 트로포닌의 하위유닛은 또한 심장 건강에 대한 마커이다. 구체적으로 cTnI 및 cTnT는 급성 심근 경색(AMI), 예를 들어 1형 및 2형 심근 경색, 불안정 협심증, 수술 후 심근 외상 및 관련 질환에 대한 바이오마커이다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 유리 cTnI, 유리 cTnT, 2변수(binary) cTnI-TnC, 또는 3변수(ternary) cTnI-TnC-TnT이다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 심부전(heart failure)에 대한 지표이다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 뇌졸중(stroke)에 대한 지표이다(예컨대, https://www.ahajournals.org/doi/10.1161/STROKEAHA.117.017076 및 https://www.360dx.com/business-news/roche-test-helps-differentiate-bleeding-risk-stroke-risk-patients-considering#.W1jz0thKhcA에서 기술되며, 이는 전체 내용이 참조로 포함됨). 일부 구현예에서, 바이오마커는 섬유증(fibrosis)에 대한 지표이다(예컨대, http://www.onlinejacc.org/content/65/22/2449에서 기술되며, 이는 전체 내용이 참조로 포함됨). 일부 구현예에서, 바이오마커는 급성 관상동맥 증후군(acute coronary syndrome, ACS)의 진단을 위한 것이다. 일부 구현예에서, 바이오마커는 심장 트로포닌(I, I-C, I-C-T, T) 및 다른 심장 트로포닌 단편, 나트륨 이뇨 펩타이드(BNP, ANP, CNP), N 말단 단편(즉, NT-proBNP, NT-proCNP), 글리코실화된, 비글리코실화된, CRP, 미오글로빈, 크레아티닌 키나제(CK), CK-MB, sST2, GDF-15, 갈렉틴-3에 대한 것이다.
일부 구현예에서, 매우 희석되거나 저농도의 바이오마커(들), 뿐만 아니라 전형적으로 오늘날 테스트할 수 없거나 테스트 감도, 정확도 및 정밀도를 손상시키는 테스트 전에 샘플 희석이 필요한 매우 적은 샘플(즉, 신생아, 소아과, 노인)의 검출 가능성을 개선하기 위해 큰 샘플 부피(즉, 1 mL, 10 mL, 100 mL, 1000 mL, 등)를 테스트할 수 있는 정확성 및 정밀도. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 1 mL, 10 mL, 100 mL, 1000 mL 또는 그 이상의 부피이다. 일부 구현예에서, 생물학적 샘플은 0.5 mL, 0.25 mL, 0.1 mL, 0.05 mL 또는 더 적은 부피이다.
또한 본원에는 세척 단계 또는 입자 분리 후 바이오마커 특징규명 단계 또는 테스트 방법 전에 입자로부터 포획된 바이오마커(들)의 선택적 방출 또는 용출, 또는 포획 모이어티-바이오마커 복합체의 선택적 방출 또는 용출을 허용함으로써 진단 테스트 전에 바이오마커의 풍부화를 돕기 위해 입자 샘플 전처리를 사용하는 방법이 제공된다.
입자 표면 상의 포획 모이어티와 바이오마커, 예컨대, 산성 또는 염기성 pH, 높은 몰농도 염, 당, 화학적 대체제, 세제, 계면활성제, 및/또는 킬레이트화제, 또는 그것들의 조합 사이의 결합을, 포획 모이어티뿐만 아니라 바이오마커의 대체 또는 용출 없이 파괴할 "절단 시약 또는 "방출제"의 사용. 자석(들)이 포함된 샘플 매트릭스로부터 입자의 세척 또는 분리 후, 입자는 후속해서 방출제(들)를 함유한 용출 용액으로 처리되어 바이오마커 및/또는 표지된 검출 시약이 용액으로 선택적으로 방출될 수 있다. 입자는 빠르게(2분 미만; 이상적으로 30초 미만) 샘플 장치(바이알, 시험관, 기타)의 측면(들) 및/또는 바닥으로 분리되어 본질적으로 입자 없는 샘플 상층액이 형성될 수 있다. 입자 없는 상층액은 후속해서 입자를 포함하는 펠릿을 파괴하지 않으면서 흡인되고 별도의 전달 튜브로 분배되거나 바이오마커의 테스트를 위해 분석 시스템(즉, LC-MS/MS 또는 MALDI-TOF) 위로 직접 주입될 수 있다. 일부 구현예에서, 용출된 구성요소를 함유한 상층액은 중화 완충액으로 전달되어 덜 엄격한 조건(예컨대 pH)이 재확립되고 바이오마커 및/또는 표지가 용출 용액에 의한 분해 또는 변성으로부터 보존된다. 예를 들어, 본원에 기술된 절단 시약 또는 방출제는 본원에 기술된 입자와 본원에 기술된 포획 모이어티 사이의 본원에 기술된 결합 상호작용 또는 절단 가능한 결합을, 예컨대, pH(예컨대 중탄산 나트륨과 같은 염기로 증가된 pH, 아세트산, 트라이클로로아세트산, 설포살리실산, HCl, 포름산과 같은 산으로 감소된 pH, 및 100 mM 글리신·HCl, pH 2.5-3.0, 100 mM 시트르산, pH 3.0, 50-100 mM 트라이에틸아민 또는 트라이에탄올아민, pH 11.5, 150 mM 수산화 암모늄, pH 10.5와 같은 공통 pH 용출 완충액), 대체제 또는 대체 작용제, 경합 용출(예컨대 >0.1 M 카운터 리간드 또는 유사체), 이온 강도 및/또는 혼돈 효과(예컨대 NaCl, KCl, 10 mM Tris pH 7.0 중의 3.5-4.0 M 염화 마그네슘, 10 mM 인산염 완충액 pH 7.2 중의 5 M 염화 리튬, 2.5 M 요오드화 나트륨 pH 7.5, 0.2-3.0 M 티오시안산 나트륨), 계면활성제, 세제, 농축 무기 염, 변성(예컨대 2-6 M 구아니딘·HCl, 2-8 M 우레아, 1% 데옥시콜레이트, 1% SDS), 유기 용매(예컨대 알코올, 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 아세토니트릴, 헥산, DMSO, 10% 다이옥산, 50% 에틸렌 글리콜 pH 8-11.5(또한 카오트로픽)), 방사선 또는 열(증가된 온도), 입체형태 변화, 이황화 결합 감소제(2-머캡토에탄올, 다이티오트레이톨, 트리스(2-카르복실에틸)포스핀), 효소 비활성화, 카오트로픽제(우레아, 염화 구아니디늄, 과염소산 리튬), 기계적 교반, 초음파처리, 및 단백질 소화 효소(펩신, 트립신), 및 그것들의 조합과 같은 용출 전략을 사용하여 파괴한다. 일부 구현예에서, 용출된 구성요소를 함유한 상층액은 중화 완충액으로 전달되어 덜 엄격한 조건(예컨대 pH)이 재확립되고 바이오마커 및/또는 표지가 용출 용액에 의한 분해 또는 변성으로부터 보존된다.
특징규명 방법
본원에는 후속 특징규명 또는 진단 테스트를 위해 바이오마커를 고갈 및/또는 풍부화하는 방법이 기술된다. 본원에 기술된 바이오마커(예컨대, 간섭)의 특징규명은 본원에 기술된 바이오마커(예컨대, 본원에 기술된 간섭)의 확인 및/또는 정량화를 포함한다.
특징규명은 바이오마커, 예를 들어, 항원 특이적 항체의 검출 및/또는 정량화를 포함할 수 있다. 항원 특이적 항체를 입자에 결합시킴으로써 다른 특이성과 분리될 수 있고, 원래의 샘플보다 더 작은 부피로 방출되어 필요하다면 농축시킬 수 있다. 특이적 항체에 대한 전형적인 진단 검정은, 예를 들어, 전체 혈청의 맥락에서 첫 번째로 항체를 단리하지 않고 항체를 검출한다. 이것은 절대 정량화를 어렵게 한다; 항체 활성은 종종 어느 정도의 혈청이 희석될 수 있지만 여전히 활성을 보유하는지를 토대로 한 역가로서 특징규명된다. 관심 있는 종을 포획하고 그것을 혈청의 면역글로불린의 나머지로부터 분리함으로써, 단순한 단백질 검정이 어느 정도의 특이적 항체가 존재하는지를 정량화하는데 사용될 수 있다. 추가로, 아이소타입 특이적 시약을 사용하여 당업자는 관심 있는 각각의 아이소타입을 분취액과 나란히 또는, 단일 분취액으로 다중화된 구별되는 표지에 콘쥬게이션되어 있다면, 공지된 양의 비드 결합 면역글로불린으로 생성된 표준 곡선과 비교함으로써 별도로 정량화할 수 있다. 표준 곡선은 일반적으로 면역글로불린 또는 특정 아이소타입에 대한 것일 수 있고, 후자는 별도로 또는 다중 방식으로 생성될 수 있다. IgM은 초기 반응에 전형적인 반면, IgG 및 IgA는 더 성숙하고 더 효과적인 면역 반응에 전형적이다. 이런 쉬운 절대 정량화는 하나의 혈청 샘플로부터 다음 샘플까지 가능한 혈청에서 항원 특이적 항체의 양을 직접적으로 비교하게 한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 항체는 SARS-CoV-2 S1 하위유닛, 또는 그것의 수용체 결합 도메인 및/또는 N 말단 도메인 및/또는 수용체 결합 도메인을 인식한다.
발명의 입자
본원에는 생물학적 샘플의 분리, 고갈 및/또는 풍부화를 위한 입자가 기술된다. 일부 구현예에서, 입자는 절단 가능한 결합 및 포획 모이어티를 포함한다(예컨대, 하나의 포획 모이어티 상에 존재하도록 기능화된 입자 표면). 일부 구현예에서, 입자는 비-절단 가능한 결합 및 포획 모이어티를 포함한다(예컨대, 하나의 포획 모이어티 상에 존재하도록 기능화된 입자 표면). 일부 구현예에서, 본원에 기술된 입자는 포획 모이어티(예컨대, 본원에 기술된 바이오마커에 대한 높은 특이성을 가진 포획 모이어티)를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 입자(예컨대, 본원에 기술된 입자의 표면, 본원에 기술된 포획 모이어티에 결합되지 않은 입자 표면)는 비활성이다(예컨대 본원에 기술된 바이오마커에 대한 충분한 결합을 나타내지 않는다). 일부 구현예에서, 본원에 기술된 입자는 본원에 기술된 진단 테스트에서 입자 또는 진단 테스트에 대한 추가의 변형 없이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 입자는 샘플을 변경시키지 않으면서(예컨대, 추가의 바이오마커(예컨대, 간섭)를 첨가하거나 제거하지 않으면서) 샘플에 첨가되고 샘플로부터 제거될 수 있다.
본원에 기술된 입자는 평균 직경이 0.050 마이크로미터 내지 3.00 마이크로미터, 또는 바람직하게는 0.100 마이크로미터 내지 1.1 마이크로미터의 직경, 또는 더욱 바람직하게는 0.200 마이크로미터 내지 0.600 마이크로미터, 또는 훨씬 더 바람직하게는 0.100 마이크로미터 내지 0.500 마이크로미터의 직경으로 충분히 작다.
일부 구현예에서, 본원에 기술된 입자(예컨대, 미세입자, 나노입자)는 코어 또는 지지체를 포함하며, 코어 또는 지지체는 산화 철, 강자성 산화 철, Fe2O3, 및 Fe3O4, 마그헤마이트, 또는 그것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 상자성 또는 초상자성 물질이다.
일부 구현예에서, 입자 표면은 유기 중합체 또는 공중합체를 포함하며, 유기 중합체 또는 공중합체는 소수성이다. 일부 구현예에서, 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자) 표면은, 한정하는 것은 아니지만, 세라믹, 유리, 중합체, 공중합체, 금속, 라텍스, 실리카, 금, 은, 또는 합금과 같은 콜로이드 금속, 폴리스티렌, 유도체화된 폴리스티렌, 폴리(다이비닐벤젠), 스티렌-아실레이트 공중합체, 스티렌-부타디엔 공중합체, 스티렌-다이비닐벤젠 공중합체, 폴리(스티렌-옥시에틸렌), 폴리메틸 메타크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리우레탄, 폴리글루타르알데하이드, 폴리에틸렌 이민, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐 알코올, 폴리아크릴산, N,N'-메틸렌 비스-아크릴아미드, 폴리올레핀, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리비닐클로라이드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리설폰, 폴리(에테르 설폰), 열분해 물질, 블록 공중합체, 및 전술한 공중합체, 실리콘, 또는 실리카, 메틸롤 멜라민, 덱스트란 또는 폴리(에틸렌 글리콜)-덱스트란(PEG-DEX)과 같은 생분해성 중합체, 또는 그것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 물질과 같은 유기 중합체 또는 공중합체를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, "차단제"는 단백질, 중합체, 계면활성제 또는 세제, 또는 그것들의 조합을 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 입자(예컨대, 나노입자, 미세입자) 상에서 포획 모이어티의 결합은 단백질, 중합체, 계면활성제 또는 세제, 또는 그것들의 조합과 같은 차단제로 차단된다. 차단제는 알부민, 소 혈청 알부민, 인간 혈청 알부민, 오브알부민, 젤라틴, 카세인, 산 가수분해된 카세인, 감마 글로불린, 정제된 IgG, 동물 혈청, 다클론성 항체, 및 단클론성 항체와 같은 단백질, 폴리비닐 알코올(PVA) 및 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 중합체, 단백질과 중합체의 조합, 펩타이드, (PEO)n-NHS 또는 (PEO)n-말레이미드와 같은 페길화 시약, 플루로닉 F108, F127, 및 F68과 같은 삼블록 공중합체, Triton X-100, 폴리소르베이트 20(Tween-20), 및 Tween 80(비이온성)과 같은 비이온성 세제, CHAPS와 같은 쯔비터이온성 세제, 도데실 황산 나트륨(SDS), 데옥시콜레이트, 콜레이트, 및 사르코실과 같은 이온성 세제, 계면활성제, 수크로스와 같은 당, 및 이종성 차단 시약(Scantibodies), MAK33(Roche Diagnostics), 면역글로불린 억제 시약(IIR)(Bioreclamation), 헤테로블록(Omega Biologicals), 클록마스터(JSR), TRU 블록(Meridian Life Sciences), 및 StabilCoat® & StabilGuard®(Surmodics)와 같은 상업적 차단체로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 차단제는 본원에 기술된 입자에 결합된다(예컨대, 공유 결합, 비공유 결합). 일부 구현예에서, 차단제는 본원에 기술된 입자에 결합되지 않는다(예컨대, 공유 결합, 비공유 결합).
절단 가능한 결합. 한 측면으로, 포획 모이어티는 본원에 기술된 절단 가능한 결합에 의해 바이오마커에 결합한다. 절단 가능한 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합을 통해서이다. 비공유 결합의 예로는, 친화성, 이온성, 반데르발스(예컨대, 쌍극자/쌍극자 또는 런던 분산력), 수소 결합(예컨대, 폴리뉴클레오타이드 듀플렉스 사이의), 및 소수성 상호작용을 들 수 있다. 결합이 비공유성인 경우, 실체 사이의 결합은 바람직하게 특이적이다. 특이적 비공유 결합의 비제한적인 예로는 비오틴과 아비딘, 캡트아비딘, SA, 뉴트라비딘, SA의 단편, 아비딘의 단편, 뉴트라비딘의 단편, 또는 그것들의 혼합물과 같은 비오틴 결합 단백질 사이의 결합 상호작용; 비오티닐화된 Fab, 비오티닐화된 면역글로불린 또는 그것의 단편, 비오티닐화된 소분자(예컨대, 예를 들어, 호르몬 또는 수용체 리간드), 비오티닐화된 폴리뉴클레오타이드, 비오티닐화된 거대분자(예컨대, 단백질 또는 천연 또는 합성 중합체)의 아비딘, SA, 뉴트라비딘, SA의 단편, 아비딘의 단편, 뉴트라비딘의 단편, 또는 그것들의 혼합물과 같은 비오틴 결합 단백질에 대한 결합; 표면의 그것의 효소에 대한 결합; 당단백질에 특이적인 렉틴에 대한 당단백질의 결합; 리간드에 특이적인 수용체에 대한 리간드의 결합; 항체가 발생되게 하는 항원에 대한 항체의 결합; 및 폴리뉴클레오타이드와 상보하는 또는 실질저긍로 상보하는 폴리뉴클레오타이드 사이의 듀플렉스 형성; 등을 들 수 있다.
절단 가능한 결합, 예컨대 이황화 결합(R-S-S-R)이 포획 모이어티(즉, 항체 또는 SH-Fab와 같은 항체 단편)를 입자에 고정시키거나 결합시키기 위해 사용된다. 입자를 샘플 매트릭스로부터 세척 또는 분리한 후에, 입자는 후속적으로 TCEP 또는 DTT와 같은 환원제를 함유한 용액으로 처리되어 이황화 결합이 절단되고 포획 모이어티-바이오마커 복합체가 용액으로 방출될 수 있다. 입자는 빠르게(2분 미만; 이상적으로 30초 미만) 샘플 장치(바이알, 시험관, 기타)의 측면(들) 및/또는 바닥으로 분리되어 본질적으로 입자 없는 샘플 상층액이 형성될 수 있다. 입자 없는 상층액은 후속적으로 입자를 포함한 펠릿을 파괴하지 않고 흡인되고 별도의 전달 튜브로 전달되거나 포획 모이어티-바이오마커 복합체의 테스트를 위해 분석 시스템(즉, LC-MS/MS 또는 MALDI-TOF 또는 FilmArray 혈액 배양 확인 패널)에 직접 주입될 수 있다.
일부 구현예에서, 절단 가능한 결합은 이황화 결합(R-S-S-R)이다.
일부 구현예에서, 절단 가능한 결합은 스트렙트아비딘 또는 캡트아비딘, 아비딘과 비오틴 사이의 비공유 결합이다.
포획 모이어티. 본원에는 본원에 기술된 간섭, 또는 여기서 기술된 바이오마커에 결합하는 하나의 포획 모이어티를 포함하는 입자가 제공된다. 본원에서 나타내는 바, "포획 모이어티"는 항체, 항체의 결합 단편, IgG, IgM, IgA, IgE, IgD, 수용체, 수용체 리간드, 호르몬, 호르몬 수용체, 효소, 효소 기질, 단일 가닥 올리고뉴클레오타이드, 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드, 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드, 이중 가닥 폴리뉴클레오타이드, 항원, 펩타이드, 중합체, 압타머, 및 단백질로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 포획 모이어티는 단백질이다. 단백질은, 예를 들어, 모노머, 다이머, 멀티머, 또는 융합 단백질일 수 있다. 특정 구현예에서, 단백질은 알부민, 예컨대, 예를 들어, 항체, 항체의 단편, BSA, 오브알부민, BSA의 단편, 오브알부민의 단편, 마우스 IgG, 중합화된 마우스 IgG, 항체 단편(Fc, Fab, F(ab')2) 및 HAMA 및 RF 간섭 메커니즘을 표적화하기 위한 마우스 IgG의 상이한 하위부류(IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgE, IgD), HAAA 간섭을 표적화하기 위한 정제된 동물 다클론성 항체(즉, 소, 염소, 마우스, 토끼, 양), MASI 간섭을 표적화하기 위한 스트렙트아비딘, ALP, HRP, BSA(아이소루미놀, 루테늄, 아크리디늄에 콘쥬게이션됨) 또는 그것들의 혼합물 중 적어도 하나를 포함한다. 일부 구현예에서 포획 모이어티는 병원체, 예를 들어 박테리아 또는 바이러스의 구조적 또는 표면 노출된 항원이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 바이러스 구조 단백질, 예컨대 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)의 스파이크 단백질이다. 일부 구현예에서, 스파이크 단백질은 S1 하위유닛, 또는 그것의 수용체 결합 도메인 및/또는 N 말단 도메인이다.
일부 구현예에서, 포획 모이어티는 인간 항-동물 항체(예컨대, 마우스 IgG, 양 IgG, 염소 IgG, 토끼 IgG, 소 IgG, 돼지 IgG, 말 IgG)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 이종성 항체(예컨대, FR(Fc 특이적), Fab, F(ab)'2, 중합화된 IgG(유형 1, 2a, 2b IgG 및 IgG 단편, 혈청 구성요소)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 검정 특이적 결합제(예컨대, 비오틴, 플루오레세인, 항-플루오레세인 폴리/Mab, 항-비오틴 폴리/Mab, 스트렙트아비딘, 뉴트라비딘)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 검정 특이적 신호 분자(예컨대, HRP, ALP, 아크리디늄 에스테르, 아이소루미놀/루미놀, 루테늄, ABEI/고리형 ABEI)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 검정 특이적 차단제(예컨대, BSA, 생선 껍질 젤라틴, 카세인, 오브알부민, PVP, PVA)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 검정 특이적 콘쥬게이트 링커(예컨대, LC, LC-LC, PEO4, PEO16)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 항원 자가항체(예컨대, 유리 T3, 유리 T4)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 단백질 자가항체(예컨대, MTSH, TnI, TnT, 비-심장 TnT(골격근 질환))이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 화학발광 기질(예컨대, 루미놀, 아이소루미놀, 아이소루미놀 유도체, ABEI, ABEI 유도체, 루테늄, 아크리디늄 에스테르) 또는 형광 표지(예컨대, 플루오레세인 또는 다른 형광단 및 염료)이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 스트렙트아비딘, 뉴트라비딘, 아비딘, 폴리A, 폴리DT, 압타머, 항체, Fab, F(ab')2, 항체 단편, 재조합 단백질, 효소, 단백질, 생체분자, 중합체, 또는 분자 각인 중합체이다. 일부 구현예에서, 포획 모이어티는 비오틴, 플루오레세인, 폴리DT, 폴리A, 항원, 등이다.
일부 구현예에서, 포획 모이어티는 비오틴(예컨대, 아비딘, 스트렙트아비딘, 뉴트라비딘, 캡트아비딘, 항-비오틴 항체, 항체 단편, 압티머, 분자 각인 중합체, 등)에 결합한다.
일부 구현예는 둘 이상의 상이한 포획 모이어티를 가진 결합 표면을 제공한다.
포획 모이어티의 생성. 한 측면으로, 포획 모이어티를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은 유리 자가항체 또는 자가항체 복합체에 대한 복합체 특이적 또는 입체형태 특이적 항체의 제조 또는 생성 단계를 포함한다. 유리 자가항체는 그것의 항원 표적에 이미 복합체를 형성하지 않은 자가항체이다. 복합체를 형성한 자가항체는 그것의 항원 표적과 복합체를 형성한 자가항체이다.
한 측면으로, 포획 모이어티를 제조하는 방법이 제공되며, 방법은 MTSH와 같은 자가항체 복합체에 대한 복합체 특이적 또는 입체형태 특이적 항체의 제조 또는 생성 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 자가항체는 트라이요오도티로닌(T3) 또는 티록신(T4)이다. 일부 구현예에서, 자가항체 복합체는 MTSH이다. 예를 들어, 복합체 특이적 또는 입체형태 특이적 항체는 인간 혈청으로부터 정제되고 포획 모이어티로서 사용될 수 있는 MTSH와 같은 자가항체 복합체에 대해 발생할 수 있다. 이런 방식으로 생성된 항체는 TSH를 가진 hIgG 또는 hIgM 복합체에 대해서만 특이성을 가질 수 있을 것이다. MTSH는 기법 및 공개된 방법을 토대로 또는 단백질 생화학 및 정제의 기술분야에 숙련된 누군가에 의해 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, 가장 큰 자가항체 검정 간섭 가능성을 가진 자가면역 질환을 가진 환자가 자가항체를 제조 또는 생성하기 위해 사용된다. 예를 들어, BNP에 대해 HyTest SES 검정, WO2014114780, WO2016113719 및 WO2016113720을 참고하며, 이들은 참고문헌 전체가 인용된다.
갑상선 특이적 자가항체. 예를 들어, 구현예에서, 자가항체는 항-갑상선 자가항체(예컨대, 항-갑상선 과산화효소 항체, 갑상선 자극 호르몬 수용체 항체, 티로글로불린 항체)이다. 항-갑상선 자가항체는 갑상선 상의 하나 이상의 구성요소에 대해 표적화된 자가항체이다.
일부 구현예에서, 자가항체는 유리 자가항체(예컨대, 갑상선 자극 호르몬(TSH))이다.
일부 구현예에서, 자가항체는 복합체를 형성한 자가항체(예컨대, MTSH)이다. 일부 구현예에서, 본원에 기술된 포획 모이어티는 복합체를 형성한 자가항체에 대해 특이성 또는 MTSH와 같은 그것의 항원 표적이 이미 결합된 hIgG 및/또는 hIgM에 대한 확인 특이성으로 생성된 항체이다.
아래의 항목은 친화성 검정을 설계할 적용에 따라 분석물 결합제(포획 모이어티)와 분석물로 이루어지는 결합 쌍의 하나, 또는 대안으로 다른 구성원으로서 기능할 수 있는 물질의 비제한적인 목록이다. 그러한 물질은, 예를 들어, 포획 모이어티(분석물 결합제)로서 사용되거나 다양한 구현예로 사용될 수 있는 포획 모이어티를 생성하기 위해(예컨대, 그것을 특정 항체를 생성하기 위한 합텐/항원으로서 사용함) 사용될 수 있다. 면역검정을 포함하는 친화성 검정이 샘플 중의 분석물인 그러한 물질의 존재 및/또는 수준을 검출하기 위해 다양한 구현예에 따라 설계될 수 있다. 특정 구현예에서, 분석물 결합 포획 모이어티는 이들 물질을 샘플 중의 분석물로서 검출하기 위해 사용될 수 있다. 대안으로, 본원에 개시된 물질은 다양한 구현예에 따라 고상 지지체 표면과 결합될 수 있고, 그것과 상호작용하는 분자(예컨대, 예를 들어, 열거된 물질에 특이적인 항체 또는 그것의 단편, 결합 단백질, 또는 효소)를 포획하기 위해 사용될 수 있다.
분석물 결합제(포획 모이어티)와 분석물로 이루어지는 결합 쌍의 하나, 또는 대안으로 다른 구성원으로서 기능할 수 있는 물질의 비제한적인 목록으로 다음을 들 수 있다: 유도성 산화질소 생성효소(iNOS), CA19-9, IL-lα, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-t, IL-5, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, sIL-2R, sIL-4R, sIL-6R, SIV 코어 항원, IL-1RA, TNF-α, IFN-감마, GM-CSF; PSA(전립선 특이적 항원)의 동형(isoform), 예컨대 PSA의 PSA, pPSA, BPSA, 비 α1-항키모트립신-복합체를 형성한 PSA, α1-항키모트립신-복합체를 형성한 PSA, hK2, hK4, 및 hK15와 같은 전립선 칼리크레인, ek-rhK2, Ala-rhK2, TWT-rhK2, Xa-rhK2, HWT-rhK2, 및 다른 칼리크레인; HIV-1 p24; 페리틴, L 페리틴, 트로포닌 I, BNP, 렙틴, 디곡신, 미오글로빈, B형 나트륨 이뇨 펩타이드 또는 뇌 나트륨 이뇨 펩타이드(BNP), NT-proBNP, CNP, NT- proCNP(1-50), NT-CNP-53(51-81), CNP-22(82-103), CNP-53(51-103), 심방 나트륨 이뇨 펩타이드(ANP); 인간 성장 호르몬, 뼈 알칼리 포스파타제, 인간 여포 자극 호르몬, 인간 황체화 호르몬, 프로락틴; 인간 융모막 성선 자극 호르몬(예컨대, CGα, CGβ); 가용성 ST2, 티로글로불린; 항-티로글로불린; IgE, IgG, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, 탄저균(B. anthracis) 보호 항원, 탄저균 치사 인자, 탄저균 포자 항원, 아토병균(F. tularensis) LPS, 황색 포도상구균 내독소 B, 페스트균(Y. pestis) 캡슐 F1 항원, 인슐린, 알파 태아단백질(예컨대, AFP 300), 암배아 항원(CEA), CA 15.3 항원, CA 19.9 항원, CA 125 항원, HAV Ab, HAV Igm, HBc Ab, HBc Igm, HIV1/2, HBsAg, HBsAb, HCV Ab, 항-p53, 히스타민; 네오프테린; s-VCAM-1, 세로토닌, sFas, sFas 리간드, sGM-CSFR, s1CAM-1, 티미딘 키나제, IgE, EPO, 내인자 Ab, 합토글로불린, 항-카디올리핀, 항-dsDNA, 항-Ro, Ro, 항-La, 항-SM, SM, 항-nRNP, 항히스톤, 항-Scl-70, Scl-70, 항-핵 항체, 항-중심체 항체, SS-A, SS-B, Sm, U1-RNP, Jo-1, CK, CK-MB, CRP, 허혈 변형 알부민, HDL, LDL, oxLDL, VLDL, 트로포닌 T, 트로포닌 I, 트로포닌 C, 마이크로알부민, 아밀라제, ALP, ALT, AST, GGT, IgA, IgG, 프리알부민, 항-스트렙토리신, 클라미디아, CMV IgG, 톡소 IgG, 톡소 IgM, 아포리포단백질 A, 아포리포단백질 B, C3, C4, 프로퍼딘 인자 B, 알부민, α1-산 당단백질, α1-항트립신, α1-마이크로글로불린, α2-마크로글로불린, 항-스트렙토리신 O, 항트롬빈-III, 아포리포단백질 Al, 아포리포단백질 B, β2-마이크로글로불린, 세룰로플라스민, 보체 C3, 보체 C4, C-반응성 단백질, DNase B, 페리틴, 유리 카파 경쇄, 유리 람다 경쇄, 합토글로빈, 면역글로불린 A, 면역글로불린 A(CSF), 면역글로불린 E, 면역글로불린 G, 면역글로불린 G(CSF), 면역글로불린 G(소변), 면역글로불린 G 하위부류, 면역글로불린 M, 면역글로불린 M(CSF), 카파 경쇄, 람다 경쇄, 지방단백질(a), 마이크로알부민, 프리알부민, 프로퍼딘 인자 B, 류머티스 인자, 페리틴, 트랜스페린, 트렌스페린(소변), 루벨라 IgG, 티로글로불린 항체, 톡소혈장 IgM, 톡소혈장 IgG, IGF-I, IGF 결합 단백질(IGFBP)-3, 헵신, pim-1 키나제, E-카드헤레인, EZH2, 및 a-메틸아실-CoA 라세마제, TGF-베타, IL6SR, GAD, IA-2, CD-64, 호중구 CD-64, CD- 20, CD-33, CD-52, 시토크롬 P450의 동형, s-VCAM-1, sFa, sICAM, B형 간염 표면 항원, 트롬보플라스틴, HIV p24, HIV gp41/120, HCV C22, HCV C33, 헤모글로빈 A1c, 및 GAD65, IA2, 비타민 D, 25-OH 비타민 D, 1,25(OH)2 비타민 D, 24,25(OH)2 비타민 D, 25,26(OH)2 비타민 D, 비타민 D의 3-에피머, FGF-23, 스클레로스틴, 프로칼시토닌, 칼시토닌, 클로스트리디움 디피실(c. dificille) 독소 A&B, 헬리코박터 파일로리(h. pylori), HSV-1, HSV2.
친화성 검정이 설계될 적용에 따라, 분석물 결합제(포획 모이어티)와 분석물로 이루어지는 결합 쌍의 하나, 또는 대안으로 다른 구성원으로서 기능할 수 있고 현재 개시된 구현예로 사용될 수 있는 적합한 물질로는 또한 모이어티, 예컨대 예를 들어 WHO 국제 생물학적 표준 연구소(WHO International Laboratories for Biological Standards)가 보유하고, 특징규명하고/거나 배포하는 임의의 WHO 국제 생물학적 참조 제제(기술분야에 잘 알려져 있는 물질을 열거하는 http:/www.who.int/bloodproducts/re_materials, 2005년 6월 30일 업데이트로부터 이용 가능하며; 목록은 본원에 참조로 포함됨)에 대해 특이적인 항체 또는 그것의 단편을 들 수 있다.
물질 다음의 괄호로 WHO 코드에 의해 확인되는 그러한 적합한 국제 참조 표준의 부분 목록으로는 다음을 들 수 있다: 인간 재조합 트롬보플라스틴(rTF/95), 토끼 트롬보플라스틴(RBT/90), 갑상선 자극 항체(90/672), 재조합 인간 조직 플라스미노겐 활성자(98/714), 고분자량 유로키나제(87/594), 전립선 특이적 항원(96/668), 전립선 특이적 항원 90:10(96/700); 인간 혈장 단백질 C(86/622), 인간 혈장 단백질 S(93/590), 류머티스 관절염 혈청(W1066), 혈청 아밀로이드 A 단백질(92/680), 스트렙토키나제(00/464), 인간 트롬빈(01/580), 소 조합 트롬보플라스틴(OBT/79), 항-D 양성 대조군 정맥내 면역글로불린(02/228), 샘세포 항체(97/550), 지방단백질 a(IFCC SRM 2B), 인간 파보바이러스 B19 DNA(99/800), 인간 플라스민(97/536), 인간 플라스미노겐 활성자 억제제 1(92/654), 혈소판 인자 4(83/505), 프레칼리크레인 활성자(82/530), 인간 뇌 CJD 대조군 및 인간 뇌 산발성 CJD 제제 1 및 인간 뇌 산발성 CJD 제제 2 및 인간 뇌 변이체 CJD(없음; 각각 WHO TRS ECBS Report No. 926, 53.sup.rd Report에서 인용됨, 뇌 균등물), 인간 혈청 보체 구성요소 C1q, C4, C5, 인자 B, 및 전체 기능성 보체 CH50(W1032), 인간 혈청 면역글로불린 E(75/502), 인간 혈청 면역글로불린 G, A, 및 M(67/86), 인간 혈청 단백질 알부민, 알파-1-항트립신, 알파-2-마크로글로불린, 세룰로플라스민, 보체 C3, 트랜스페린(W1031), 항-D 음성 대조군 정맥내 면역글로불린(02/226), A형 간염 RNA(00/560), B형 간염 표면 항원 하위유형 adw2 유전자형 A(03/262 및 00/588), B형 간염 바이러스 DNA(97/746), C형 간염 바이러스 RNA(96/798), HIV-1 p24 항원(90/636), HIV-1 RNA(97/656), HIV-1 RNA 유전자형(10 I01/466 세트), 인간 피브리노겐 농축물(98/614), 인간 혈장 피브리노겐(98/612), 상승된 A2 헤모글로빈(89/666), 상승된 F 헤모글로빈(85/616), 헤모글로빈시안화물(98/708), 저분자량 헤파린(85/600 및 90/686), 미분획화 헤파린(97/578), 혈액 응고 인자 VIII 및 폰 빌레브란트 인자(02/150), 인간 혈액 응고 인자 VIII 농축물(99/678), 인간 혈액 응고 인자 XIII 혈장(02/206), 인간 혈액 응고 인자 II, VII, IX, X(99/826), 인간 혈액 응고 인자 II 및 X 농축물(98/590), 인간 암배아 항원(73/601), 인간 C 반응성 단백질(85/506), 재조합 인간 페리틴(94/572), 아포리포단백질 B(SP3-07), 베타-2-마이크로글로불린(B2M), 인간 베타-트롬보글로불린(83/501), 인간 혈액 응고 인자 IX 농축물(96/854), 인간 혈액 응고 인자 IXa 농축물(97/562), 인간 혈액 응고 인자 V 라이덴, 인간 gDNA 샘플 FV 야생형, FVL 동형접합체, FVL 이형접합체(03/254, 03/260, 03/248), 인간 혈액 응고 인자 VII 농축물(97/592), 인간 혈액 응고 인자 VIIa 농축물(89/688), 인간 항-매독 혈청(HS), 인간 항-파상풍 면역글로불린(TE-3), 인간 항트롬빈 농축물(96/520), 인간 혈장 항트롬빈(93/768), 인간 항-티로글로불린 혈청(65/93), 항-톡소혈장 혈청(TOXM), 인간 항-톡소혈장 혈청(IgG)(01/600), 인간 항-수두 대상포진 면역글로불린(W1044), 아포리포단백질 A-1(SP1-01), 인간 항-인터페론 베타 혈청(G038-501-572), 인간 항-홍역 혈청(66/202), 항-핵 리보핵단백질 혈청(W1063), 항-핵 인자(상동성) 혈청(66/233), 항-파보바이러스 B19(IgG) 혈청(91/602), 항-폴리오바이러스 혈청 유형 1, 2, 3(66/202), 인간 항-광견병 면역글로불린(RAI), 인간 항-풍진 면역글로불린(RUBI-1-94), 항-평활근 혈청(W1062), 인간 항-이중 가닥 DNA 혈청(Wo/80), 인간 항-E 완전 혈액 유형 혈청(W1005), 인간 항-에키노코커스 혈청(ECHS), 인간 항-A형 간염 면역글로불린(97/646), 인간 항-B형 간염 면역글로불린(W1042), 인간 항-E형 간염 혈청(95/584), 항-인간 혈소판 항원-1a(93/710), 항-인간 혈소판 항원-5b(99/666), 인간 항-인터페론 알파 혈청(B037-501-572), 인간 알파태아단백질(AFP), 안크로드(ancrod)(74/581), 인간 항-A 혈액 유형 혈청(W1001), 인간 항-B 혈액 유형 혈청(W1002), 인간 항-C 완전 혈액 유형 혈청(W1004), 항-D(항-Rh0) 완전 혈액 유형 시약(99/836), 인간 항-D(항-Rh0) 불완전 혈액 유형 혈청(W1006), 및 인간 항-D 면역글로불린(01/572).
친화성 검정이 설계될 적용에 따라, 분석물 결합제(포획 모이어티)와 분석물로 이루어지는 결합 쌍의 하나, 또는 대안으로 다른 구성원으로서 기능할 수 있는 적합한 물질의 다른 예는 화합물을 인식할 수 있는 항체를 생성하기 위한 합텐으로서 사용될 수 있는 화합물을 포함하며, 한정하는 것은 아니지만, 다음의 것의 임의의 염, 에스테르, 또는 에테르를 포함한다: 한정하는 것은 아니지만, 프로게스테론, 에스트로겐, 및 테스토스테론을 포함할 호르몬, 프로게스틴, 코르티코스테로이드, 및 데하이드로에피안드로스테론, 및 WHO에 의해 내부 참조 표준으로서 열거된 임의의 비-단백질/비-폴리펩타이드 항원. 물질 다음의 괄호로 WHO 코드에 의해 확인되는 그러한 적합한 국제 참조 표준의 부분 목록으로는 비타민 B12(WHO 81.563), 엽산(WHO 95/528), 호모시스테인, 트랜스코발라민, T4/T3, 및 국제 생물학적 참조 제제의 WHO 카탈로그에 개시된 다른 물질(WHO 웹사이트, 예를 들어 http:/www.who.int/bloodproducts/re_materials, 2005년 6월 30일 업데이트로부터 이용 가능함)을 들 수 있고, 내용은 참조로 본원에 포함된다. 본원에 기술된 방법 및 조성물은 상기 언급된 WHO 참조 표준 또는 참조 표준을 함유하는 혼합물을 포함할 수 있다.
친화성 검정이 설계될 적용에 따라, 분석물 결합제(포획 모이어티)와 분석물로 이루어지는 결합 쌍의 하나, 또는 대안으로 다른 구성원으로서 기능할 수 있는 적합한 물질의 다른 예는 남용 약물을 들 수 있다. 남용 약물로는, 예를 들어, 다음의 약물 및 그것의 대사산물(예컨대, 혈액, 소변, 및 다른 생물학적 물질에 존재하는 대사산물), 뿐만 아니라 그것의 임의의 염, 에스테르, 또는 에테르의 목록을 들 수 있다: 헤로인, 모르핀, 하이드로모르폰, 코데인, 옥시코돈, 하이드로코돈, 펜타닐, 데메롤, 메타돈, 다본, 스타돌, 탈윈, 파레고리, 부프레넥스; 예를 들어, 암페타민, 메타암페타민과 같은 각성제; 메틸암페타민, 에틸암페타민, 메틸페니데이트, 에페드린, 슈도에페드린, 마황속, 마황, 메틸렌다이옥시암페타민(MDS), 펜터민, 페닐프로판올아민; 아미페나졸, 베메그리드, 벤즈페타민, 브로마탄, 클로르펜터민, 프로프로파미드, 크로테타미드, 다이에틸프로피온, 다이메틸암페타민, 독사프람, 에타미반, 펜캄파민, 메클로페녹세이트, 메틸페니데이트, 니케타미드, 페몰린, 펜테트라졸, 펜다이메트라진, 펜메트라진, 펜터민, 페닐프로판올아민, 피크로톡신, 피프라돌, 프롤린탄, 스트리키닌, 시네프린, 펜시클리딘 및 엔젤 더스트와 같은 유사체, PCP, 케타민; 예를 들어, 바르비투레이트, 글루테티미드, 메타쿠알론, 및 메프로바메이트, 메토헥시탈, 티아밀, 티오펜탈, 아모바르비탈, 펜토바르비탈, 세코바르비탈, 부탈비탈, 부타바르비탈, 탈부탈, 및 아프로바르비탈, 페노바르비탈, 메포바르비탈과 같은 진정제; 예를 들어, 에스타졸람, 플루라제팜, 테마제팜, 트라이아졸람, 미다졸람, 알프라졸람, 플로르다이아제폭사이드, 클로르아제페이트, 다이아제팜, 할라제팜, 로르아제팜, 옥사제팜, 프라제팜, 쿠아제팜, 클로나제팜, 플루니트라제팜과 같은 벤조다이아자펜; 감마 하이드록실 부티르산 및 감마 부티로락톤과 같은 GBH 약물; 글루테티미드, 메타쿠알론, 메프로바메이트, 카리소프로돌, 졸피뎀, 잘레플론; 테트라하이드라칸나비놀 및 유사체와 같은 칸나비노이드 약물, 코케인, 3-4 메틸렌다이옥시메탐페타민(MDMA); 예를 들어, 메스칼린 및 LSD와 같은 환각제.
실시예
실시예 1: 고용량 비오틴 섭취 후 비오틴 간섭 고갈.
내인성(비-스파이크) 비오틴 샘플을 연속적으로 수집하였다. 기준선 혈청 샘플을 5명의 외관상 건강한 성인 지원자(4명의 남성, 1명의 여성)로부터 BD 브랜드 Vacutainer™ 10 mL 레드 탑 튜브에서 전주 정맥(antecubital venous) 혈액 채취에 의해 얻었다. 각각의 지원자는 후속해서 20 mg 용량의 비오틴(4 x 5 mg, Finest Nutrition 비오틴 5000 mcg 딸기 맛, 빠른 용해, 품목 # 938508, Walgreens사 유통)을 섭취하였다. 혈청 샘플을 비오틴 섭취 후 1, 3, 6, 8, 및 24시간 후에 얻었다. 혈액을 1시간 동안 실온에서 응고하도록 놓아둔 후 2,000 rpm에서 15분 동안 Beckman Allegra 6R 탁상 원심분리기에서 원심분리하였다. 각 시점에 대해, 각각의 지원자로부터 혈청 샘플을 모으고, 15분 동안 실온에서 혼합하고, 2 mL 냉동 바이알에 1.2 mL 분취액으로 분취한 후 -80℃에서 냉동시켰다.
연속적으로 수집한 샘플 중의 비오틴 수준을 유리 비오틴 ELISA를 사용하여 측정함으로써 비오틴 대사를 측정하였다. 비오틴 혈청 샘플을 Immundiagnostik IDK® 비오틴 ELISA 키트(부품 번호 K8141, 로트 번호 180906, 측정 범위 48.1 - 1100 pg/mL)에 의해 테스트하였다. 키트의 측정 범위를 초과하는 샘플을 키트의 샘플 희석 완충액으로 희석하였다. 비오틴 섭취 후 1, 3, 6, 및 8시간 후에 수집한 샘플을 50,000 내지 500,000 pg/mL 범위에 있는 것으로 상정하고 1:1000으로 희석하였다. 비오틴 섭취 후 24시간 후에 수집한 샘플을 20,000 pg/mL에 근접하거나 미만인 것으로 상정하고 1:20으로 희석하였다. 샘플을 ELISA 키트 프로토콜에 따라 테스트하였고 비오틴 수준은 20 mg 비오틴 섭취 후 8시간(60-107 ng/mL; n=5명)과 24시간(24-32 ng/mL; n=4명)에 여전히 상당히 상승하였다(도 4 및 표 1).
Figure pct00001
고수준의 내인성 비오틴(370 또는 550 ng/mL)을, 200 μL 혈청을 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 첨가하고, 20 μL VERAPREP 비오틴 시약을 첨가하고, 샘플을 10분 동안 부드럽게 혼합/흔들어주고, VERAPREP 비오틴 시약을 Dexter LifeSep ® 1.5S를 사용하여 10분 동안 자성적으로 분리하고, 혈청을 조심스럽게 흡인하여 자성 입자의 파괴를 피함으로써 스트렙트아비딘(VERAPREP 비오틴 시약)으로 코팅된 초상자성 나노입자를 사용하고, 유리 비오틴 ELISA를 사용하여 혈청 샘플을 테스트함으로써 연속적으로 수집된 혈청 샘플로부터 고갈시켰다.
첫 번째 연구로, 증가하는 양(mg)의 VERAPREP 비오틴 시약을 동일한 고용량 비오틴(370 ng/mL) 내인성 혈청 샘플의 상이한 분취액에 첨가하여 어느 정도의 시약이 샘플 중의 유리 비오틴을 100% 고갈시키는데 필요한지를 측정하였다. 20 μL VERAPREP 비오틴 시약(230 nm 직경, mg 비드당 32 μg 스트렙트아비딘)을 20 mg 비오틴 섭취 후 1시간 후에 수집한 혈청 샘플의 각각 200 μL 분취액에 첨가하고, 10분 동안 실온에서 부드럽게 위아래를 반전시킴으로써 혼합하고, 10분 동안 Dexter LifeSep 1.5S 자석을 사용하여 자성 분리하였다. 175 μL 혈청 상층액을 조심스럽게 흡인하고 Immundiagnostik IDK® 비오틴 ELISA 키트(부품 번호 K8141, 로트 번호 180906)에 의해 측정하고 키트의 측정 범위를 초과하는 샘플을 키트의 샘플 희석 완충액으로 희석하였다. 230 nm VERAPREP 비오틴 시약은 간단한 20분 과정, 200 μL 샘플, 및 단지 0.39 mg 시약을 사용하여 100% 유리 비오틴을 성공적으로 고갈시켰다(도 5).
두 번째 연구로, 증가하는 양(mg)의 2가지 상이한 VERAPREP 비오틴 시약을 동일한 고용량 비오틴(550 ng/mL) 혈청 샘플의 상이한 분취액에 첨가하여 어느 정도의 각각의 시약이 샘플 중의 유리 비오틴을 100% 고갈시키는데 필요한지를 측정하였다. 20 μL의 230 nm VERAPREP 비오틴 시약(mg 비드당 32 μg 스트렙트아비딘), 또는 20 μL의 550 nm VERAPREP 비오틴 시약(mg 비드당 4 μg 스트렙트아비딘)을 50 mg 비오틴 섭취 후 1시간 후에 수집한 혈청 샘플의 각각 200 μL 분취액에 첨가하고, 10분 동안 실온에서 부드럽게 위아래를 반전시킴으로써 혼합하고, 10분 동안 Dexter LifeSep 1.5S 자석을 사용하여 자성 분리하였다. 175 μL 혈청 상층액을 조심스럽게 흡인하고 Immundiagnostik IDK® 비오틴 ELISA 키트(부품 번호 K8141, 로트 번호 180906)에 의해 측정하고 키트의 측정 범위를 초과하는 샘플을 키트의 샘플 희석 완충액으로 희석하였다. 230 nm VERAPREP 비오틴 시약은 간단한 20분 과정, 200 μL 샘플, 및 단지 0.75 mg 시약을 사용하여 100% 유리 비오틴을 성공적으로 고갈시킨 한편, 550 nm VERAPREP 비오틴 시약은 1.86 mg 시약으로 단지 89%의 유리 비오틴을 고갈시켰다. 이들 결과는 VERAPREP 비오틴 시약의 결합 용량 및 결합 효율이 더 작은 비드 직경 및 단위 질량당 증가된 표면적으로, mg 비드당 스트렙트아비딘의 양 및 비오틴 결합 용량을 증가시킴으로써, 및/또는 증가된 농도 또는 양(mg)의 VERAPREP 비오틴 시약을 첨가함으로써 개선되는 것을 입증한다(도 6).
실시예 2. 혈청 샘플 중의 고농도의 유리 비오틴에 결합하고 고갈시키기 위하여 최적화된 샘플 전처리 시약을 사용하는 비오틴 간섭 고갈.
6명의 지원자(25세 내지 46세의 5명의 외관상 건강한 성인, 65세의 1명의 2형 당뇨병)에서 BD 브랜드 Vacutainer™ 10 mL 레드 탑 튜브에서 전주 정맥 혈액 채취에 의해 공복 혈청 샘플을 기준선으로 수집하였다. 각각의 지원자는 후속해서 20 mg, 100 mg 또는 200 mg 용량의 일반 의약품(OTC) 비오틴을 섭취하였다. 20 mg 용량의 경우, 혈청 샘플을 비오틴 섭취 후 1, 3, 6, 8, 및 24시간 후에 얻었다. 100 및 200 mg 용량의 경우, 혈청 샘플을 비오틴 섭취 후 1, 6, 및 24시간 후에 수집하였다. 혈액을 1시간 동안 실온에서 응고하도록 놓아둔 후 2,000 rpm에서 15분 동안 Beckman Allegra 6R 탁상 원심분리기에서 원심분리하였다. 각 시점 및 비오틴 용량에 대해, 각각의 지원자로부터 혈청 샘플을 모으고, 15분 동안 실온에서 혼합하고, 2 mL 냉동 바이알에 1.2 mL 분취액으로 분취한 후 -80℃에서 냉동시켰다. 모든 샘플을 미국 워싱턴 98195 시애틀 엔이 퍼시픽 스트리트 1959 소재의 워싱턴 대학교 검사의학과에 LC-MS/MS 비오틴 측정을 위해 보냈다. 20 mg 용량의 경우, 비오틴 수준은 1시간 째에 가장 높았고, 6시간 째에 전부 5명의 지원자가 여전히 > 15 ng/mL [17 - 35]의 혈청 비오틴 수준을 가졌으며, 8시간 째에 5명의 지원자 중 4명이 > 15 ng/mL [16 - 28]의 혈청 비오틴 수준을 가졌고, 24시간 째에는 2형 당뇨병으로 알려진 지원자 1이 > 15 ng/mL [18]의 비오틴 수준을 가졌다(도 7).
100 및 200 mg 용량의 경우 비오틴 수준은 1시간 째에 100 mg 용량의 경우 294 - 459 ng/mL, 및 200 mg 용량의 경우 610 - 861 ng/mL으로 가장 높았다. 6시간 째에, 20 mg 또는 100 mg 비오틴을 섭취한 지원자는 > 15 ng/mL의 혈청 비오틴 수준을 가졌는데, 20 mg 용량의 경우 17 - 35 ng/mL, 및 200 mg 용량의 경우 95 - 347 ng/mL이었다. 24시간 째에, 100 mg 비오틴을 섭취한 2명의 지원자는 > 15 ng/mL의 비오틴 수준을 가졌는데, 당뇨병으로 알려진 지원자 1은 84 ng/mL이었고, 지원자 6은 54 ng/mL이었다(도 8).
LC-MS/MS에 의해 측정된 높은 내인성 비오틴 수준 [294 - 861 ng/mL]을 가진 4개의 샘플을 선택하였다(도 9). 기준선 혈청 샘플을 PTH 온전한 ELISA(DRG PTH 온전한 ELISA, 부품 번호 EIA-3645)에 의해 테스트하였고 PTH 값은 28.1 내지 50.3 pg/mL의 범위였다. 비오틴 섭취 후 1시간 후 샘플은 모두 < 1.57 pg/mL이거나, 또는 검출 하한(LLD) 아래의 PTH 값을 가졌다(도 10).
전부 4개 샘플을 스트렙트아비딘으로 코팅된 최적화된 550 nm 초상자성 나노입자(VeraPrep 비오틴)로 전처리하였는데, 여기서 샘플 1 및 4는 LC-MS/MS에 의해 < 500 ng/mL의 비오틴 수준을 가졌으며 0.5 mg 시약으로 전처리하였고, 샘플 2 및 3은 LC-MS/MS에 의해 > 500 ng/mL의 비오틴 수준을 가졌으며 1.5 mg 시약으로 전처리하였고, 전처리는 다음의 프로토콜을 사용하였다:
1. VeraPrep 비오틴 시약 바이알을 보관소에서 꺼내어 최소 10초 동안 중간 속도로 와동시켜 시약을 잘 혼합하고 재현탁시킨다.
2. 시약 바이알을 폼(foam) 바이알 홀더에 삽입한다.
3. 빈 마이크로 튜브 2 ml(SARSEDT 주문 번호 72.694)을 튜브의 고리가 자석 프레임에 닿을 때까지 LifeSep® 1.5S 자석에 삽입한다.
4. 200 μL(0.5 mg) 또는 600 μL(1.5 mg)의 잘 혼합된 시약을 빈 튜브에 분배하여 시약을 자석에서 > 30초 동안 분리시켜 시약 펠릿을 형성한다.
5. 조심스럽게 흡인하고 모든 보관 완충액 상층액(약 200 μL 또는 약 600 μL)을 시약 펠릿을 파괴하지 않으면서 버린다.
6. 400 μL의 잘 혼합된 혈청 또는 혈장 샘플을 시약 펠릿을 함유한 튜브에 분배한다.
7. 튜브의 캡 나사를 조이고, 튜브를 자석으로부터 제거하고, 최소 10초 동안 중간 속도로 와동시켜서 샘플의 시약을 잘 혼합하고 재현탁시킨다.
8. 튜브를 실험실 혼합기 상에 중간 속도로 배치하고 실온에서 10분 동안 인큐베이션한다.
9. 캡 나사를 풀고 튜브의 고리가 자석 프레임에 닿을 때까지 튜브를 자석에 삽입한다.
10. 시약을 > 4분 동안 자성 분리하여 시약 펠릿을 형성한다.
11. 시약 펠릿을 교란하지 않으면서 샘플 상층액을 조심스럽게 흡인하고 샘플을 테스트를 위해 전달 튜브에 분배한다. 주의: 모든 샘플 상층액(약 400 μL)은 이 단계가 조심스럽게 수행되면 흡인될 수 있다. 만약 임의의 시약이 실수로 흡인된다면 간단하게 샘플/시약 혼합물을 튜브에 넣고 단계 10으로 되돌아간다.
12. 샘플은 이제 테스트 준비가 되었다.
비오틴 간섭 제거를 검증하기 위하여, VeraPrep 비오틴 전처리 샘플을 Immundiagnostik IDK® 비오틴 ELISA 키트(부품 번호 K8141, 측정 범위 48.1 - 1,100 ng/L)를 사용하여 테스트하였다. 비오틴 농도는 0.2 내지 1.0 ng/mL 범위이거나, 정상 혈장 수준(200 - 1,200 ng/L) 내에 있다(도 9). 샘플 1-4의 VeraPrep 비오틴 전처리 직후, PTH 값을 PTH 온전한 ELISA를 사용하여 측정하였고 PTH 값은 26.7 내지 52.0 pg/mL의 범위였다(도 10).
비오틴 섭취 후 1시간 후 샘플은 LC-MS/MS에 따라 높은 수준(294 내지 861 ng/mL)의 비오틴 간섭 및 PTH 온전한 ELISA에 의해 검출할 수 없는 PTH 값(< 1.57 pg/mL)을 가진 한편, VeraPrep 비오틴으로 전처리된 비오틴 섭취 후 1시간 후 샘플은 비오틴 ELISA 키트에 따라 생리적으로 정상적인 비오틴 값(< 1.1 ng/mL) 및 PTH 온전한 ELISA에 의해 정상적인 PTH 값(26.7 내지 52.0 pg/mL)을 가졌다(도 9 및 10). VeraPrep 비오틴 샘플 전처리 PTH 값을 기준선 PTH 값에 비교했을 때 결과는 95에서 113%로 회복되었다(105%의 평균 회복률)(도 10). VeraPrep 비오틴 샘플 전처리 후 테스트 결과의 상당한 차이, 또는 이 PTH 온전한 ELISA 샌드위치 면역검정에서 PTH 값의 상당한 증가는 비오틴 간섭이 테스트된 4개의 샘플 전부에서 임상적으로 유의미한 것을 확증시켜준다.
실시예 3: 저풍부성 바이오마커 풍부화
40 mL PBS 중의 0.0195 μIU TSH/mL 또는 0.497 pg PTH/mL의 매우 낮은 수준의 바이오마커를 스트렙트아비딘으로 코팅된 550 nm 초상자성 나노입자를 사용하여 풍부화하고 후속해서 비오티닐화된 항-TSH 항체(VERAPREP 농축물 TSH 시약) 또는 비오티닐화된 항-PTH 단클론성 항체(VERAPREP 농축물 PTH 시약)로 코팅하였다.
첫 번째 연구로, VERAPREP 농축물 TSH 시약을 550 nm VERAPREP 비오틴을 비오티닐화된 항-TSH 포획 항체로 코팅함으로써 제조하였다. 0.08 mL TSH 항원(10 μIU/mL ELISA 교정기)을 DRG TSH 초민감성 ELISA(부품 번호 EIA-1790, 로트 번호 RN58849)의 기능성 민감도 아래로(<0.054 μIU/mL) 41 mL PBS 완충액으로 0.0195 μIU/mL로 희석하고, 1 mL을 기준선 샘플(풍부화 전)로서 보관하였다. 40 mL 샘플을 VERAPREP 농축물 TSH 프로토콜을 사용하여 후속 TSH ELISA 테스트를 위한 1.0 mL의 풍부화된 샘플을 제조하였다:
80 μL의 10 μIU/mL TSH 표준을 41.0 mL PBS로 0.0195 μIU/mL로 희석하고, 1.0 mL을 기준선 샘플(풍부화 전)로서 보관한다.
1. 대조군으로서 80 μL의 10 μIU/mL TSH 표준을 1.0 mL VERAPREP 절단으로 0.80 μIU/mL로 희석한다.
2. PBS 중의 40 mL의 0.0195 μIU/mL TSH를 50 mL 팔콘 튜브에 첨가한다.
3. VERAPREP 농축물 TSH를 첨가하고, 혼합한다.
4. 혼합하면서 60분 동안 실온에서 인큐베이션한다.
5. VERAPREP 농축물 TSH를 60분 동안 Dexter LifeSep® 50SX를 사용하여 자성 분리한다.
6. 40 mL PBS를 가만히 따르고 폐기물로 버린다.
7. 4.0 mL PBS 세척 완충액을 첨가하고, 혼합한다.
8. 4 mL PBS 세척 완충액 중의 VERAPREP 농축물 TSH를 30분 동안 Dexter LifeSep® 50SX를 사용하여 자성 분리한다.
9. 4 mL PBS를 가만히 따르고 폐기물로 버린다.
10. 1 mL PBS 세척 완충액을 첨가하고, 혼합한다.
11. 1 mL VERAPREP 농축물 TSH를 1.75 mL 원뿔형 바닥 스냅 캡 바이알에 옮긴다.
12. 1 mL PBS 세척 완충액 중의 VERAPREP 농축물 TSH를 10분 동안 Dexter LifeSep® 1.5S를 사용하여 자성 분리한다.
13. 1 mL PBS를 흡인하고 폐기물로 버린다.
14. 1 mL VERAPREP 절단을 첨가하고, 혼합한다.
15. 1 mL VERAPREP 절단 중의 VERAPREP 농축물 TSH를 10분 동안 Dexter LifeSep® 1.5S를 사용하여 자성 분리한다.
16. 1 mL 상층액(풍부화된 샘플)을 흡인하여 보관하고, 대조군, 기준선 샘플 및 풍부화된 샘플을 테스트한다.
0.08 mL TSH 항원(10 μIU/mL ELISA 교정기)을 또한 대조군으로서 VERAPREP 절단 완충액으로 1 mL 중의 0.800 μIU/mL로서 희석하였다. 기준선 샘플, 풍부화된 샘플, 및 대조군을 DRG TSH 초민감성 ELISA에 의해 테스트하였고, 풍부화된 샘플의 TSH % 회수율을 [풍부화된 샘플 결과]/[대조군 결과] x 100%로서 계산하였다. 예상했던 것과 같이, 희석된 TSH 기준선 샘플은 초민감성 ELISA에 의해 검출할 수 없었고 0.00 μIU/mL로 판독되었다. 0.80 mg 시약만을 사용하여, VERAPREP 농축물 TSH는 희석된 TSH를 검출할 수 없는 수준에서 0.73 μIU/mL로 성공적으로 풍부화하였다(표 2). 대조군과 비교하여 이것은 98.6% 회수율이었지만, TSH ELISA에서 검정 신호를 억제한 VERAPREP 절단 완충액의 매트릭스 효과가 있을 수 있었다(표 3).
Figure pct00002
Figure pct00003
두 번째 연구로, VERAPREP 농축물 PTH 시약을 550 nm VERAPREP 비오틴을 비오티닐화된 항-PTH 포획 항체로 코팅함으로써 제조하였다. 0.021 mL PTH 항원(971 pg/mL ELISA 교정기)을 DRG PTH(부갑상선) 온전한 ELISA(부품 번호 EIA-3645, 로트 번호 2896)의 기능성 민감도 아래로(<1.56 pg/mL) 41 mL PBS 완충액으로 0.497 pg/mL로 희석하고, 1 mL을 기준선 샘플(풍부화 전)로서 보관하였다. 40 mL 샘플을 VERAPREP 농축물 PTH 프로토콜을 사용하여 처리하여 후속 PTH ELISA 테스트를 위한 1.0 mL의 풍부화된 샘플을 제조하였다:
1. 21 μL의 971 pg/mL PTH 표준을 41.0 mL PBS로 0.497 pg/mL로 희석하고, 1.0 mL을 기준선 샘플(풍부화 전)로서 보관한다.
2. 대조군으로서 21 μL의 971 pg/mL PTH 표준을 1.0 mL VERAPREP 절단으로 20.4 pg/mL로 희석한다.
3. PBS 중의 40 mL의 0.497 pg/mL PTH를 50 mL 팔콘 튜브에 첨가한다.
4. VERAPREP 농축물 PTH를 첨가하고, 혼합한다.
5. 혼합하면서 30분 동안 실온에서 인큐베이션한다.
6. VERAPREP 농축물 PTH를 15분 동안 Dexter LifeSep® 50SX를 사용하여 자성 분리하다.
7. 40 mL PBS를 가만히 따르고 폐기물로 버린다.
8. 4.0 mL PBS 세척 완충액을 첨가하고, 혼합한다.
9. 4 mL PBS 세척 완충액 중의 VERAPREP 농축물 PTH를 10분 동안 Dexter LifeSep® 50SX를 사용하여 자성 분리한다.
10. 4 mL PBS를 가만히 따르고 폐기물로 버린다.
11. 1 mL PBS 세척 완충액을 첨가하고, 혼합한다.
12. 1 mL VERAPREP 농축물 PTH를 1.75 mL 원뿔형 바닥 스냅 캡 바이알에 옮긴다.
13. 1 mL PBS 세척 완충액 중의 VERAPREP 농축물 PTH를 10분 동안 Dexter LifeSep® 1.5S를 사용하여 자성 분리한다.
14. 1 mL PBS를 흡인하고 폐기물로 버린다.
15. 1 mL VERAPREP 절단을 첨가하고, 혼합한다.
16. 1 mL VERAPREP 절단 중의 VERAPREP 농축물 PTH를 10분 동안 Dexter LifeSep® 1.5S를 사용하여 자성 분리한다.
17. 1 mL 상층액(풍부화된 샘플)을 흡인하여 보관하고, 대조군, 기준선 샘플 및 풍부화된 샘플을 테스트한다.
0.021 mL PTH 항원(971 pg/mL ELISA 교정기)을 또한 대조군으로서 VERAPREP 절단 완충액으로 1 mL 중의 20.4 pg/mL로서 희석하였다. 기준선 샘플, 풍부화된 샘플, 및 대조군을 DRG DRG PTH(부갑상선) 온전한 ELISA에 의해 테스트하였고, 풍부화된 샘플의 PTH % 회수율을 [풍부화된 샘플 결과]/[대조군 결과] x 100%로서 계산하였다. 희석된 PTH 기준선 샘플은 ELISA 검정에서 VERAPREP 절단 완충액의 매트릭스 효과로 인해 13.5 pg/mL로 판독되었다. 이 매트릭스 효과는 향상된 검정 신호를 초래하였다. 0.80 mg 시약만을 사용하여, VERAPREP 농축물 PTH는 희석된 PTH를 42.3 pg/mL로 성공적으로 풍부화하였다(표 4). 대조군과 비교하여 이것은 109% 회수율이었다(표 5).
Figure pct00004
Figure pct00005
실시예 4: 후속 질량 분석(LC-MS/MS 또는 MALDI-MS) 분석을 위한 소변으로부터의 저풍부성 바이오마커 풍부화
다음은 바이오마커에 특이적인 포획 모이어티로 코팅된 초상자성 나노입자를 사용하여 대량 부피의 소변 샘플로부터 저풍부성 바이오마커 및 스파이크된 내부 표준(ISTD)을 풍부화하기 위한 질량 분석 샘플 전처리 프로토콜을 기술한다. 정확한 동일 프로토콜은 또한 함께 혼합되거나 함께 모아진 복수의 상이한 초상자성 나노입자 집단을 사용할 수 있었고, 동일한 샘플로부터 하나 이상의 바이오마커 및 상응하는 스파이크된 ISTD를 복합체화하고 풍부화하기 위하여, 각 집단은 상이한 포획 모이어티로 코팅된다. 2개 이상의 바이오마커의 풍부화 및 특징규명은 단일 바이오마커의 특징규명으로는 가능하지 않은 임상 진단 및/또는 질환의 예후에 대한 알고리즘의 사용을 용이하게 한다. 예를 들어, 소변으로부터 폐쇄성 수면 무호흡증(OSA)의 진단을 위해, VERAPREP 농축물 시약은 칼리크레인-1, 유로모둘린, 유로코르틴-3 및 오로소뮤코이드-1을 포획 및 풍부화하기 위해 4개의 상이한 항체, 또는 칼리크레인-1, 유로모둘린, 유로코르틴-3 및 오로소뮤코이드-1, IL-6, IL-10 및 고민감성 C 반응성 단백질을 포획 및 풍부화하기 위해 7개의 상이한 항체를 포함할 수 있었다:
1. 환자 소변을 수집한다(소변 수집 컵과 같은 표준 소변 수집 프로토콜을 사용함).
2. 소변 수집을 혼합한다.
3. 40 mL 소변을 50 mL 팔콘 튜브에 첨가한다.
4. 풍부화된 바이오마커에 대한 중수소화된 내부 표준을 첨가하고, 혼합한다.
5. VERAPREP 조건을 첨가하고, 혼합한다.
6. VERAPREP 농축물을 첨가하고, 혼합한다.
7. 바이오마커 + VERAPREP 농축물에 의한 중수소화된 내부 표준 포획을 인큐베이션한다.
8. 40 mL 소변 중의 VERAPREP 농축물을 Dexter LifeSep® 50SX를 사용하여 자성 분리한다.
9. 소변을 흡인하고 폐기물로 버린다.
10. 4 mL PBS 세척 완충액을 첨가하고, 혼합한다.
11. 4 mL PBS 세척 완충액 중의 VERAPREP 농축물을 Dexter LifeSep® 50SX를 사용하여 자성 분리한다.
12. 소변을 흡인하고 폐기물로 버린다.
13. 단계 12를 2회 더(2X) 반복한다.
14. 1 mL VERAPREP 절단을 첨가하고, 혼합한다(질량 분석 부합 가능한 완충액).
15. 1 mL VERAPREP 절단 중의 VERAPREP 농축물을 Dexter LifeSep® 1.5S를 사용하여 자성 분리한다.
16. 1 mL 상층액 샘플을 흡인하고 LC-MS에 의해 테스트한다.
17. 최종 바이오마커 농도를: 1) 40 mL 소변 샘플 크기, 2) 바이오마커의 LC-MS 정량화, 및 3) 중수소화된 내부 표준 회수율을 토대로 한 조정 보고된 바이오마커 값을 토대로 측정하였다.
포획된 또는 풍부화된 바이오마커 또는 바이오마커들의 선택적 방출 또는 절단을 TCEP 또는 DTT와 같은 환원제로 절단된 이황화 결합과 같은 절단 가능한 링커를 사용하여, 또는 단량체 아비딘을 가진 몰 과잉량의 D-비오틴 또는 콘카나발린 A 상의 결합 부위에 대해 경합하는 콘카나발린 A를 가진 당의 몰 과잉량과 같은 경합 용출을 사용함으로써 pH 변화(글리신 pH 2.5 용출과 이어서 중화와 같은 산성 pH, 또는 알칼리성 pH 10.0 이상)로 달성할 수 있다.
실시예 5. SARS-CoV-2 중화 항체 검정
이 검정은 수용체 결합 도메인 및 N 말단 도메인을 모두 인식하는 SARS-CoV-2 중화 항체를 단리하고 정량화한다. 그것은 IgG, IgA, 및 IgM을 별도로 정량화한다. 아래에서 수행되는 것과 같이, 혈청 항체를 검정하였지만, 과정은 또한 타액 항체를 검정하기 위해 경구용 식염수 세정에 대해 수행될 수 있다. 검정에서, 샘플을 먼저 세척하여 잠재적인 이종성 간섭을 제거하고, 항체를 비드(미세입자) 상에 포획하고 검출 시약과 반응시키며, 포획된 항체(여전히 검출 시약에 결합됨)를 비드로부터 용출시키고, 상층액을 정량화를 위해 전달한다. 검정을 수동으로 또는 자동으로 수행할 수 있다. 일반화된 검정 과정은 다음을 포함한다:
1. 세척/차단 완충액으로 플레이트 세척기 프라이밍.
a. 먼저 물로 30분 동안 초음파처리한다.
2. 모든 시약 준비.
a. 모든 비드는 사용에 균일하도록 혼합되고 락커 상에 있어야 한다.
3. 플레이트 조건화 - 한 쌍의 깨끗한, 둥근 바닥 96 웰 미세역가 플레이트를 TTA(Tris 완충 식염수, 0.05% Tween®20(폴리소르베이트 20), 0.05% 아지드, pH 7.4) 중의 0.023%(중량/부피) 플루로닉® F108(폴리(에틸렌 글리콜)-블록-폴리(프로필렌 글리콜)-블록-폴리(에틸렌 글리콜), 삼블록 공중합체)의 세척 완충액으로 세척하여 예를 들어, 면역글로불린의 웰 표면에의 비특이적 결합을 차단한다. 하나의 둥근 바닥 플레이트는 "세척" 플레이트로서 작용할 것이고 다른 하나는 "포획" 플레이트로서 작용할 것이다.
4. 분석 전 샘플 세척으로 이종성 간섭 제거.
a. 냉장 보관으로부터 직접 샘플을, 원심분리의 혼합 없이 사용한다. 어떠한 액체든 직접 피펫팅을 피한다.
b. "세척" 플레이트 레이아웃의 60 μL의 각 샘플을 차단된 둥근 바닥 플레이트에 첨가한다.
c. 모든 샘플을 첨가한 후, 다중채널 피펫을 사용하여 140 μL의 세척된 비드(토끼 IgG, 인간 IgG, 스트렙트아비딘에 특이적인 이종성 간섭, 및/또는 비드 자체를 포획 및 제거하기 위한 36 μg 토끼 IgG-비오틴-스트렙트아비딘 비드와 4 μg 인간 IgG-비오틴-스트렙트아비딘 비드의 혼합물)를 샘플이 있는 모든 웰에 첨가한다.
i. 주의: 세척된 비드에 사용된 기본 1.6 마이크론 초상자성 자성 스트렙트아비딘 비드는 포획 비드에 사용된 정확히 동일한 기본 1.6 마이크론 초상자성 스트렙트아비딘 비드이다. 이 방법으로 포획 비드로 깨끗한 샘플을 테스트하기 전에 기본 스트렙트아비딘 비드에 특이적인 임의의 이종성 간섭이 샘플로부터 제거된다.
d. 37℃에서 15분 동안 플레이트 세척기에서 흔들어주면서 인큐베이션한다.
i. 빠른 설정, 425 cpm에서 궤도 진동.
e. 자석에 4분 동안 배치한다.
i. 예를 들어, Alpaqua 촉매 96, 부품 번호 A000550.
5. SARS-CoV-2 S1-RBD 또는 S1-NTD에 특이적인 IgM, IgG, 및 IgA의 검출 및 다중 정량화를 위한 포획 중화 항체.
a. 50 μL의 세척된 샘플을 차단된 포획 플레이트(깨끗한 평평 바닥)에 다중채널 피펫을 사용하여 전달한다.
b. 150 μL의 포획 비드(RBD 또는 NTD에 특이적인 인간 면역글로불린 IgA, IgG 및/또는 IgM을 포획하기 위해 사용된 30 μg SARS-CoV-2 S1-RBD-비오틴-스트렙트아비딘 비드와 10 μg SARS-CoV-2 S1-NTD-비오틴-스트렙트아비딘 비드의 혼합물)를 각 웰에 다중채널 피펫을 사용하여 첨가한다.
i. 동일한 부피의 포획 비드를 빈 웰에 첨가하여 포획 비드 블랭크로서 작용하게 한다.
ii. SARS-CoV-2 스파이크 당단백질(S1) RBD(His 태그를 가지며 HEK293에서 생성됨; The Native Antigen Company 부품 번호 REC31882).
iii. SARS-CoV-2 스파이크 NTD(His 태그를 가지며 HEK293에서 생성됨; The Native Antigen Company, 부품 번호 REC31905).
c. Add 60 μL의 삼중 교정기 비드를, 각각이 상이한 교정기 수준을 함유하고 있는 플레이트의 6개 웰에 첨가한다(아래 참조).
i. 삼중 교정기 비드를 첨가하는 동안 플레이트를 자석에 설정하고 각 교정기를 분배함에 따라 팁을 "세정"한다.
d. 플레이트 판독기에서 30분 동안 37℃에서 흔들어주면서 인큐베이션한다.
i. 빠른 설정, 425 cpm에서 궤도 진동.
e. 플레이트 세척기 상에서 3회 세척한다.
i. 2분 초기/진동 단계.
6. 포획된 항체의 다중 표지화.
a. 웰당 200 μL의 삼중 콘쥬게이트를 첨가한다.
i. 다중 채널 피펫 상에 8개 팁의 동일 세트를 사용하여 콘쥬게이트를 플레이트 전체의 모든 웰에 첨가한다.
ii. 모든 웰이 콘쥬게이트를 가지면, 뒤로 돌아가서 위아래로 5회 피펫팅하여 웰을 철저하게 잘 혼합한다(다중 채널 파이펫을 사용하지만 각 열에 대한 새로운 팁을 사용함).
iii. 삼중 콘쥬게이트는 콘쥬게이트 완충액(TTA 중의 0.1% BSA) 중의 AlexaFluor-488과 콘쥬게이션된 0.002 mg/ml 다클론성 토끼 항-인간 IgM, AlexaFluor-555와 콘쥬게이션된 0.002 mg/ml 다클론성 토끼 항-인간 IgG, 및 AlexaFluor-647과 콘쥬게이션된 0.002 mg/ml 다클론성 토끼 항-인간 IgA이다.
b. 플레이트 판독기에서 30분 동안 37℃에서 흔들어주면서 인큐베이션한다.
i. 빠른 설정, 425 cpm에서 궤도 진동.
c. 플레이트 세척기 상에서 3회 세척한다.
i. 2분 초기/진동 단계.
7. 비드로부터 항체-콘쥬게이트 복합체의 용출.
a. 35.5 MI의 중화 항체(300 mM Tris pH 10.0)로 깨끗한 바닥, 검은색 플레이트(차단되지 않음) 상의 웰을 사전 충전한다.
b. 플레이트 세척기에서 포획 플레이트를 꺼낸다.
c. 220 μL 용출 완충액(100 mM 글리신, pH 2.5)을 첨가한다.
i. 다중 채널 피펫 상에 8개 팁의 동일 세트를 사용하여 콘쥬게이트를 플레이트 전체의 모든 웰에 첨가한다.
ii. 모든 웰이 용출 완충액을 가지면, 뒤로 돌아가서 위아래로 5회 피펫팅하여 웰을 철저하게 잘 혼합한다(다중 채널 파이펫을 사용하지만 각 열에 대한 새로운 팁을 사용함).
d. 자석에 2분 동안 놓아둔다.
e. 200 uL의 각 웰을 다중 채널 피펫을 사용하여 검은색, 깨끗한 바닥 판독 플레이트(단계 7a)에 전달한다.
8. 플레이트 판독기 상에서 형광을 판독한다.
삼중 교정기 비드는 4가지 구성요소:
· 스트렙트아비딘으로 공유 변형되고 비오티닐화된 인간 IgA(친화성 정제됨)와 반응하는 1.6 μm 자성 비드,
· 스트렙트아비딘으로 공유 변형되고 비오티닐화된 인간 IgG(친화성 정제됨)와 반응하는 1.6 μm 자성 비드,
· 스트렙트아비딘으로 공유 변형되고 비오티닐화된 인간 IgM(친화성 정제됨)과 반응하는 1.6 μm 자성 비드,
· Tris(TRis 비드)로 퀀칭된 1.6 μm 자성 비드(카르복실)
로부터 조립되며, 각각 10 mg/ml로 보관된 것은 TTA 중의 0.1% BSA의 교정기 비드 보관 용액이다.
비드를 교정기 비드 보관 용액으로 1.00 mg/ml로 희석하고 IgA, IgG, 및 IgM 비드를 각각 별도로 다음의 비율로 Tris 비드로 모은다: 100:0, 75:25, 50:50, 25:75, 10:90, 및 0:100. 각각의 비-제로(0) Ig 교정 수준에 대해, 다음으로 IgA, IgG, 및 IgM 혼합물을 1:1:1로 모아서 세트 삼중 교정기 비드를 생성한다. 삼중 교정기 비드를 교정기 비드 보관 용액 중의 0.3 mg/ml의 최종 농도로 사용한다. 보정 곡선을 도 11에 도시한다.
본질적으로 위에서 기술된 프로토콜을 따라, 본 발명자들은 2018년 12월 전에 수집한 146개 혈청 샘플을 SARS-CoV-2 중화 항체의 존재에 대해 테스트하였다. 이것은 바이러스가 인간 집단에 출현하기 훨씬 이전의 일이므로 샘플은 음성일 것으로 예상되었고, 실제로 이것이 발견된 것이다(표 6 참고).
Figure pct00006
*신뢰 구간
"진단 일상"은 일상적인 진단 테스트 후에 남아 있는 혈청 샘플을 나타내며, 이때 기증자의 건강 상태는 알려져 있지 않다. "혈액 기증자"는 건강한 기증자로부터의 혈액 기증으로부터 보관된 샘플을 나타낸다. 이들 결과는 검정이 95%의 FDA 응급 사용 승인 특이성 요구 사항을 충족하는 것을 보여준다.
검정을 또한 PCR 확증 SARS-CoV-2 감염에 걸린 63명의 유증상 환자에 대한 122개 샘플을 테스트하는데 사용하였다. 이들 샘플은 증상 발현일로부터 수집된 하나 이상의 연속 표본을 포함하였다. 결과를 표 7에 제공한다.
Figure pct00007
이들 결과는 검정이 90%의 FDA 응급 사용 승인 민감성 요구 사항을 충족하는 것을 보여준다. 초기 검정에서 위음성 결과를 제공하는 여러 샘플은 나중에 수집된 샘플에 대해 양성 결과를 제공하였다(도 12). 2 또는 3개의 연속 샘플이 있었던 많은 환자가 시간 경과에 따라 유사한 수준의 항체를 보였지만, 일부 환자는 신속하게 증가하거나 감소하는 항체 수준을 보였다(도 13).
실시예 6. 식염수 구강 세정으로부터 바이오마커의 세척 및 포획
깨끗한 1 mL(1000 μL)의 식염수 구강 세정 샘플(25초 동안 흔들어주고, 5초 동안 양치질하고, 수집 튜브에 뱉어낸 5 mL 0.9% NaCl = 5 mL 식염수　+ 타액 샘플, 또는 식염수 중의 타액 기반 샘플)에, 다음 조성을 가진 2회 또는 4회 세척 비드를 첨가한다:
테스트당 2회 세척 비드의 경우:
25 ug 토끼 IgG 비드
25 ug　BSA 비드
10 ug 정제된 인간 IgA 비드
10 ug 정제된 인간 IgG 비드
10 ug 정제된 인간 IgM 비드
테스트당 4회 세척 비드의 경우:
50 ug 토끼 IgG 비드
50 ug　BSA 비드
20 ug 정제된 인간 IgA 비드
20 ug 정제된 인간 IgG 비드
20 ug 정제된 인간 IgM 비드
깨끗해진 1 mL 식염수 구강 세정 샘플로부터 SARS-CoV-2 중화 항체를 포획하기 위하여, 본 발명자들은 5회 또는 10회 포획 비드를 첨가하여 이 양의 RBD 및 NTD 포획 비드로 총 중화 면역글로불린을 깨끗한 식염수 구강 세정 샘플로부터 풍부화하고 포획하였다:
테스트당 5회 포획 비드의 경우:
150 ug RBD 비드
50 ug NTD 비드
테스트당 10회 포획 비드의 경우:
300 ug RBD 비드
100 ug NTD 비드
SARS-CoV-2 mRNA 백신을 1회 투여받은(보통 2회 중) 3명의 환자 및 3명의 백신접종되지 않은 대상체에 대해 10회 세척 비드 및 10회 포획 비드를 사용한 검정의 결과를 표 8에 제시한다. 이들 데이터는 투여 후 8일에만 수집하였고 이 초기 시점에서조차 검정이 SARS-CoV-2 중화 항체 반응을 검출(및 정량화)할 수 있음을 보여준다(사람은 일반적으로 백신의 2회 투여 후 2주까지 "완전히 백신접종"된 것으로 간주되지 않는다).
Figure pct00008
알 수 있는 것과 같이, 환자 2는 전부 3개의 아이소타입의 SARS-CoV-2 특이적 항체의 배경 수준을 초과하는 수준을 가지며 3명의 백신 접종된 환자는 모두 SARS-CoV-2 특이적 IgG의 배경 수준을 초과하는 수준을 가진다.
약어
ABEI N-(4-아미노부틸)-N-에틸아이소루미놀
ALP 알칼리 포스파타제
BSA 소 혈청 알부민
Fab 단편 항체 결합
Fc 단편, 결정화 가능
HAAA 인간 항-동물 항체
HAMA 인간 항-마우스 항체
HASA 인간 항-양 항체
IFU 사용 지침
IgG 항체 또는 면역글로불린
IgM 면역글로불린 M
HRP 양고추냉이 과산화효소
LC-MS/MS 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분석
LDT 실험실 발달 테스트
Mab 단클론성 항체
MASI 제조 검정 특이적 간섭
MFG IVD 제조사
PMP 초상자성 미세입자
PBCT 일차 혈액 수집 튜브
RF 류머티스 인자
RLU 상대적 광 단위 또는 검정 반응 신호
RUO 연구용 단독
SAv 스트렙트아비딘
STT 이차 전달 튜브
TAT 처리 시간
WF 작업 흐름
정의
본원에서 사용되는 바, "샘플" 또는 "생물학적 샘플"은 임의의 인간 또는 동물 혈청, 혈장(즉, EDTA, 리튬 헤파린, 시트르산 나트륨), 혈액, 전혈, 가공된 혈액, 소변, 타액, 대변(액체 및 고체), 정액 또는 정액, 양수, 뇌척수액, 세포, 조직, 생검 물질, DNA, RNA, 또는 임의의 유체, 용해된 고체, 또는 진단, 예후, 스크리닝, 위험 평가, 위험 계층화, 및 치료 약물 모니터링과 같은 모니터링을 위해 테스트될 처리된 고체 물질을 나타낸다. 일부 구현예에서, 샘플은 대용량 샘플이다. 일부 구현예에서, 샘플은 동일한 또는 상이한 대상체로부터의 복수의 샘플(예컨대, 하나 이상의 샘플)을 포함한다. 일부 구현예에서, 샘플은 샘플에 낮은 풍부성으로 존재하는 바이오마커를 포함한다.
일부 구현예에서, 샘플은 일차 혈액 수집 튜브(PBCT), 이차 전달 튜브(SST), 혈액 수집 주머니, 24시간(24-hr) 소변 수집 장치, 베리코어 튜브(vericore tube), 나노테이너(nanotainer), 타액 수집 튜브, 혈액 반점 필터지, 또는 대변 및 정액을 위한 것과 같은 임의의 수집 튜브 또는 장치, 나트륨 헤파린, 리튬 헤파린 또는 암모늄 헤파린을 함유하는 연한 녹색 상단 또는 녹색 상단 혈장 분리기 튜브(PST), 시트르산 나트륨(즉, 3.2% 또는 3.8%) 또는 시트레이트, 테오필린, 아데노신, 다이피리다몰(CTAD)을 함유하는 연한 청색 상단 튜브, 유리(첨가제 없음) 또는 플라스틱 튜브(응고 활성자 함유)에 혈청의 수집을 위한 혈청학 또는 면역혈액학을 위한 적색 상단 튜브, 유리(첨가제 없음) 또는 플라스틱 튜브(응고 활성자 함유)에 혈청의 수집을 위한 화학을 위한 적색 상단 튜브, EDTA K2, EDTA K3, 액체 EDTA 용액(즉, 8%)을 함유한 자주색 라벤더 상단 튜브, 또는 분자 진단 및 바이러스 부하 검출에서 혈장을 테스트하기 위한 EDTA K2/겔 튜브, 혈액 은행 EDTA를 위한 분홍색 상단 튜브, 옥살산 칼륨 및 플루오르화 나트륨, 플루오르화 나트륨/EDTA, 또는 플루오르와 나트륨(항응고제 없음, 혈청 샘플을 초래할 것임)을 함유하는 회색 상단 튜브, ACD 용액 A 또는 ACD 용액 B를 함유하는 황색 상단 튜브, 로열 블루 상단 튜브(혈청, 첨가제 또는 나트륨 헤파린 없음), 백색 상단 튜브, 또는 혈액 수집을 위한, 첨가제 또는 임의의 첨가제 또는 그것들의 조합을 함유하지 않는, 임의의 적용 또는 진단 테스트 유형을 위한 임의의 색상 또는 튜브 유형에 수집된다.
일부 구현예에서, 샘플은 소변, 24시간 소변, 타액 및 대변과 같은 까다로운 샘플 유형이거나, 또는 관심 있는 바이오마커가 희석되거나 측정되기 어려울 수 있는 것이다. 예를 들어, 생물학적 샘플은 환자 집단(예컨대, 신생아, 소아과, 노인, 임신, 종양, 자가면역 질환)으로 인해 까다로울 수 있다. 예를 들어, 일부 바이오마커는 기존의 POCT 및 중앙 실험실 분석가에 의해 신뢰할 수 있을 정도로 검출되고 정확하고 정밀하게 측정되기에는, 예컨대, 순환, 또는 소변에서 너무 희석되었거나 너무 낮은 농도이다. 일부 구현예에서, 까다로운 샘플은 뇌척수액(CSF)이다.
본원에서 사용되는 바, "수집 장치"는 일차 혈액 수집 튜브(PBCT), 24시간 소변 수집 장치, 소변 수집 장치, 타액 수집 튜브, 대변 수집 장치, 정액 수집 장치, 혈액 수집 주머니, 또는 샘플의 첨가 전 임의의 샘플 수집 튜브 또는 장치일 수 있다.
PBCT 및 이차 전달 튜브(SST)는 Becton Dickinson(BD), Greiner, VWR, 및 Sigma Aldrich와 같은 회사로부터의 임의의 상업적으로 이용 가능한 표준 또는 맞춤형 수집 튜브(겔 분리기가 있거나 없음), 유리 튜브, 플라스틱 튜브, 나트륨 헤파린, 리튬 헤파린 또는 암모늄 헤파린을 함유하는 연한 녹색 상단 또는 녹색 상단 혈장 분리기 튜브(PST), 시트르산 나트륨(즉, 3.2% 또는 3.8%) 또는 시트레이트, 테오필린, 아데노신, 다이피리다몰(CTAD)을 함유하는 연한 청색 상단 튜브, 유리(첨가제 없음) 또는 플라스틱 튜브(응고 활성자 함유)에 혈청의 수집을 위한 혈청학 또는 면역혈액학을 위한 적색 상단 튜브, 유리(첨가제 없음) 또는 플라스틱 튜브(응고 활성자 함유)에 혈청의 수집을 위한 화학을 위한 적색 상단 튜브, 유리(첨가제 없음) 또는 플라스틱 튜브(응고 활성자 함유)에 혈청의 수집을 위한 화학을 위한 적색 상단 튜브, EDTA K2, EDTA K3, 액체 EDTA 용액(즉, 8%)을 함유한 자주색 라벤더 상단 튜브, 또는 분자 진단 및 바이러스 부하 검출에서 혈장을 테스트하기 위한 EDTA K2/겔 튜브, 혈액 은행 EDTA를 위한 분홍색 상단 튜브, 옥살산 칼륨 및 플루오르화 나트륨, 플루오르화 나트륨/EDTA, 또는 플루오르와 나트륨(항응고제 없음, 혈청 샘플을 초래할 것임)을 함유하는 회색 상단 튜브, ACD 용액 A 또는 ACD 용액 B를 함유하는 황색 상단 튜브, 로열 블루 상단 튜브(혈청, 첨가제 또는 나트륨 헤파린 없음), 백색 상단 튜브, 또는 혈액 수집을 위한, 첨가제 또는 임의의 첨가제 또는 그것들의 조합을 함유하지 않는, 임의의 적용 또는 진단 테스트 유형을 위한 임의의 색상 또는 튜브 유형일 수 있다.
본원에서 사용되는 바, "보관 장치" 또는 "전달 장치"는 수집 장치에 수용된 샘플 및/또는 다른 구성요소를 수용하는 장치를 나타낸다. 보관 또는 전달 장치는 플라스틱 또는 유리 튜브, 바이알, 병, 비이커, 플라스크, 주머니(예컨대, 혈액 수집 주머니), 캔, 미세역가 플레이트, ELISA 플레이트, 96-웰 플레이트, 384-웰 플레이트 1536 웰 플레이트, 큐벳, 반응 모듈, 저장고, 또는 액체 샘플을 보유, 보관 또는 처리하기에 적합한 임의의 용기일 수 있다.
본원에서 언급되는 바, "진단 테스트"로는, 한정하는 것은 아니지만 임의의 항체 기반 진단 테스트, 비-항체 기반 진단 테스트, 크로마토그래피, 분광광도법, 및 질량분석법(즉, HPLC, MS, LCMS, LC-MS/MS)에 의한 후속 분석을 위한 샘플 전처리 방법 또는 장치, 예컨대 면역추출(IE) 및 고상 추출(SPE), 방사성 면역검정(RIA), 효소 결합 면역검정(ELISA), 화학발광 면역검정(CLIA), 분자 진단, 측면 흐름(LF), 현장 진료(PoC), 소비자에게 직접(DTC), CLIA 및 CLIA 면제 테스트 및 장치, 연구용(RUO) 테스트, 시험관내 진단(IVD) 테스트, 실험실 개발 테스트(LDT), 동반자 진단, 및 진단, 예후, 스크리닝, 위험 평가, 위험 계층화, 및 치료 약물 모니터링과 같은 모니터링을 들 수 있다. 일부 구현예에서, 진단 테스트는 짧은 처리 시간(STAT) 진단 테스트, 보행 테스트, 측면 흐름 테스트, 현장 치료(PoC) 테스트, 분자 진단 테스트, HPLC, MS, LCMS, LC-MS/MS, 방사성 면역검정(RIA), 효소 결합 면역검정(ELISA), 화학발광 면역검정(CLIA), 분자 진단, 측면 흐름(LF), 현장 진료(PoC), 소비자에게 직접(DTC), CLIA 및 CLIA 면제 테스트, 및 진단, 예후, 스크리닝, 위험 평가, 위험 계층화, 치료 모니터링, 및 치료 약물 모니터링을 위해 사용된 임의의 진단 테스트를 포함한다.
본원에서 사용되는 바, 병원체는 박테리아, 바이러스, 또는 질환을 유발할 수 있는 다른 미생물이다.
혈청학은 혈청 및 다른 체액의 과학적 연구이다. 실제로, 용어는 일반적으로 혈청 중의 항체의 진단적 확인을 나타낸다. 그러한 항체는 전형적으로 감염에 대한 반응으로(주어진 미생물에 대해), 다른 외래 단백질에 대해(예를 들어, 일치하지 않는 혈액 수혈에 대한 반응으로), 또는 자신의 단백질에 대해(자가면역 질환의 경우에) 형성된다.
마지막으로, 비록 본 명세서의 측면들이 특정 구현예를 참조함으로써 강조되지만, 기술분야에 숙련된 사람은 이들 개시된 구현예가 단지 본원에 개시된 주제의 원리를 예시하는 것임을 쉽게 인정할 것이라는 것이 이해되어야 한다. 그러므로, 개시된 주제는 본원에 기술된 특정 방법, 프로토콜, 및/또는 시약, 등에 어떠한 방식으로든 제한되지 않는 것이 이해되어야 한다. 그로써, 개시된 주제에 대한 다양한 형 또는 변경 또는 대체 구성이 본 명세서의 사상으로부터 벗어나지 않으면서 본원의 교시에 따라 만들어질 수 있다. 마지막으로, 본원에서 사용된 용어는 특정 구현예를 기술할 목적만을 위한 것이며, 청구범위에 의해서만 정의되는 본 발명의 범주를 제한하려고 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 정확하게 제시되고 기술된 것에 한정되지 않는다.
본 발명의 특정 구현예는 발명을 수행하기 위한 것으로 발명자들에게 알려져 있는 최상의 방식을 포함하여, 본원에 기술된다. 물론, 이들 기술된 구현예의 변동이 전술한 설명을 읽을 때에 기술분야에 통상적인 지식을 가진 사람들에게 분명해질 것이다. 발명자들은 숙련된 전문가가 그러한 변동을 적절하게 사용할 것을 예상하며, 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기술된 것과 다르게 실시될 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 적용될 수 있는 법률이 허용하는 바 발명에 첨부된 청구범위에서 인용된 주제의 모든 변형 및 동등물을 포함한다. 더욱이, 모든 가능한 변동의 위에서 기술된 구현예의 임의의 조합이 본원에서 다르게 나타내지 않거나 다르게는 문맥상 분명하게 모순되지 않는 한 발명에 포함된다.
본 발명의 대안적인 구체예, 요소, 또는 단계의 그룹화는 제한으로 해석되지 않아야 한다. 각각의 그룹 구성원은 개별적으로 또는 본원에 개시된 다른 그룹 구성원과의 임의의 조합으로 언급되거나 청구될 수 있다. 그룹의 하나 이상의 구성원은 편리함 및/또는 특허성의 이유로 그룹에 포함되거나, 또는 그룹으로부터 삭제될 수 있다. 임의의 그러한 포함 또는 삭제가 발생하는 경우에, 명세서는 변형된 그룹을 포함하는 것으로 간주됨으로써 첨부된 청구범위에 사용된 모든 Markush 그룹의 서면 설명을 충족한다.
다르게 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위에서 사용된 특징, 항목, 양, 매개변수, 특성, 용어, 등을 표시하는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 수정되는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서 사용되는 바, 용어 "약"은 그렇게 한정된 특징, 항목, 양, 매개변수, 특성, 또는 용어가 명시된 특징, 항목, 양, 매개변수, 특성, 또는 용어의 값의 위아래로 플러스 또는 마이너스 10%의 범위를 포함하는 것을 의미한다. 따라서, 반대로 표시되지 않는 한, 명세서 및 첨부된 청구범위에서 제시된 숫자 매개변수는 달라질 수 있는 근사값이다. 최소한, 그리고 청구 범위의 범주에 대한 등가 원칙의 적용을 제한하려는 시도는 아니지만, 각각의 숫자 표시는 적어도 보고된 유효 자릿수에 비추어 그리고 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다. 발명의 넓은 범주를 설명하는 수치 범위 및 값이 근사치임에도 불구하고, 구체적인 예에서 제시된 수치 범위 및 값은 가능한 정확하게 보고된다. 그러나, 임의의 수치 범위 또는 값은 본질적으로 각각의 테스트 측정에서 발견된 표준 편차에서 필연적으로 발생하는 특정 오류를 포함한다. 여기서 값의 수치적 범위를 언급하는 것은 단지 그 범위 내에 속하는 각각의 별도의 수치 값을 개별적으로 언급하는 축약형 방법으로서 작용하려는 의도이다. 본원에서 다르게 표시되지 않는 한, 수치 범위의 각각의 개별 값은 그것이 개별적으로 본원에서 인용되는 것처럼 본 명세서에 포함된다.
지칭하는 대상을 나타내는 용어("a," "an," "the") 및 본 발명을 설명하는 맥락에서 사용된 유사한 대상물은 본원에서 다르게 표시되거나 맥락에 의해 분명하게 모순되지 않는 한, 단수 및 복수 둘 다를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 기술된 모든 방법은 본원에서 다르게 표시되거나 맥락에 의해 분명하게 모순되지 않는 한 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에서 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시의 언어(예컨대, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 더 낫게 조명하려는 의도이며 다르게 청구된 발명의 범주를 제한하지 않는다. 본 명세서의 어떤 언어도 발명의 실행에 필수적인 어떠한 청구되지 않은 요소를 나타내는 것으로 해석되지 않아야 한다.
본원에 개시된 특정 구현예는 언어로 이루어지거나 본질적으로 이루어지는을 사용하는 청구범위에서 추가로 제한될 수 있다. 청구범위에서 사용될 때, 출원된 대로 또는 보정에 따라 추가되었는지 여부에 관계없이, 전환 용어 "이루어지는"은 청구 범위에 명시되지 않은 요소, 단계, 또는 성분을 배제한다. 전환 용어 "본질적으로 이루어지는"은 청구범위의 범주를 명시된 물질 또는 단계 및 기본적이고 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것으로 제한한다. 그렇게 청구된 본 발명의 구현예는 본원에서 본질적으로 또는 명시적으로 기술되고 가능하다.
본 명세서에서 참조되고 확인된 모든 특허, 특허 공보, 및 다른 출판물은, 예를 들어 본 발명과 관련하여 사용될 그러한 출판물에 기술된 조성물 및 방법을 기술하고 개시할 목적으로 그 전문이 참조로 개별적으로 및 분명하게 본원에 포함된다. 이들 출판물은 본 발명의 출원일 전의 개시를 위해서만 제공된다. 이런 관점에서 어떠한 것도 발명자가 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 그러한 개시보다 선행할 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 이들 문서의 내용에 대한 날짜 또는 표현에 대한 모든 진술은 출원인이 활용할 수 있는 정보를 기반으로 하며 이들 문서의 날짜 또는 내용의 정확성에 대해 어떠한 승인도 구성하지 않는다.

Claims (23)

  1. 생물학적 샘플로부터 항원 특이적 항체를 단리하는 방법으로서,
    a) 샘플을 항원 특이적 항체에 대한 포획 모이어티를 포함하는 제1 입자와 조합하여 혼합물을 제공하는 단계;
    b) 혼합물을 혼합하여 바이오마커에 입자 복합체를 제공하는 단계; 및
    c) 입자를 생물학적 샘플로부터 분리하고 이로써 항체를 생물학적 샘플로부터 단리하는 단계
    를 포함하는, 생물학적 샘플로부터 항원 특이적 항체를 단리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항원 특이적 항체를 입자로부터 분리하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 분리 단계는 제1 입자로부터 항체의 절단 또는 용출을 포함하는 것인 방법.
  4. 제3항에 있어서, 방법은 방출된 항체에 대해 특징규명하는 단계를 추가로 포함하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 특징규명 단계는 검출 가능한 표지에 콘쥬게이션된 항-면역글로불린 항체와 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 검출 가능한 표지는 형광 표지인 방법.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 특이적 항체와 결합된 신호를 면역글로불린에 대한 표준 곡선과 비교하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항-면역글로불린 항체는 아이소타입 특이적인 것이 아닌 방법.
  9. 제5항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항-면역글로불린 항체는 아이소타입 특이적인 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 아이소타입 특이적 항-면역글로불린 항체는, 각각 구별되는 표지에 콘쥬게이션된 항-IgA, 항-IgG, 및 항-IgM 중 적어도 2개를 포함하는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 전처리 단계를 추가로 포함하며, 전처리는
    a) 생물학적 샘플을 간섭에 대한 포획 모이어티를 포함하는 제2 입자와 조합하여 혼합물을 제공하는 단계;
    b) 혼합물을 혼합하여 간섭에 제2 입자 복합체를 제공하는 단계;
    c) 제2 입자 복합체를 제거 또는 배출(eliminating)시켜서 고갈된 용액을 제공하는 단계
    를 포함하는 것인 방법.
  12. 제11항에 있어서, 포획 모이어티는 인간 및/또는 비인간 동물 면역글로불린을 포함하는 것인 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 포획 모이어티는 스트렙트아비딘을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항 또는 제11항에 있어서, 제1 및/또는 제2 입자는 동결건조 제품으로서 제공되는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제3항, 또는 제11항 내지 제14항 중 어느 하나의 방법에 의해 만들어진 풍부화된 항체.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 특이적 항체는 병원체 특이적 항체인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 병원체는 SARS-CoV-2인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 포획 모이어티는 SARS-CoV-2의 스파이크 단백질인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 스파이크 단백질은 S1 하위유닛, 또는 그것의 수용체 결합 도메인 및/또는 N 말단 도메인인 방법.
  20. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 특이적 항체는 자가항체인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 항원 특이적 항체는 종양 항원 특이적 자가항체인 방법.
  22. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 특이적 항체는 외래 단백질에 대항하는 것인 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 항원 특이적 항체는 인간 항체인 방법.
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