JP2023521407A - 分析的および治療的使用のための抗原特異的抗体の富化 - Google Patents

Abstract

本発明は、本明細書に記載の捕捉部分を含む表面を含む粒子（例えば、微粒子、ナノ粒子；磁性、非磁性）を使用して、本明細書に記載の干渉を除去するか、または診断試験の前にバイオマーカー、特に抗体を富化するか、または単離して予防もしくは治療目的に使用する方法に関する。モノクローナルマウス抗体で処置された患者または診断目的でそれらを受けた患者における異好性抗体などの、誤った試験結果および患者の安全性に対するリスクの増加をもたらし得る多数の既知の試料特異的干渉を管理および緩和するための生物学的試料の単純で効率的かつ費用効果的なコンディショニングのための方法が、本明細書に記載される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年４月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／００８，４７２号の優先権の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本開示は、その後の分析的、予防的または治療的使用のために抗原特異的抗体を単離するために、本明細書に記載の捕捉部分を含む表面を含む粒子（例えば、微粒子、ナノ粒子；磁性、非磁性）を使用するための方法に関する。

背景
検査室試験は、健康評価、健康管理、および最終的には公衆の健康において重要な役割を果たし、あらゆる生活段階の人に影響を及ぼす。ほぼすべての人が、生涯にわたって１またはそれを超える検査室試験を受けることになる。米国だけで毎年推定７０～１００億回の検査室試験が行われ、検査室試験は医学的決定の約７０％に影響を及ぼす。

さらに、メディケア・メディケイド・サービスセンター（ＣＭＳ）は２０１８年１月１日に、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ａｃｃｅｓｓ ｔｏ Ｍｅｄｉｃａｒｅ Ａｃｔ（ＰＡＭＡ）によって要求される新しいＣｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｆｅｅ Ｓｃｈｅｄｕｌｅ（ＣＬＦＳ）を施行したため、ＰＡＭＡは検査室試験の払い戻しを削減している。なおもさらに重要なのは、検査室の結果が最初から正確であり、トラブルシューティングの労力が軽減されるか、または時間がかからず、検査室のワークフローに影響を与えないことである。

干渉は、例えば抗体結合に干渉することによって診断試験の結果の正確な値を変化させることができるか、または架橋、立体障害、もしくは自己抗体機構によってアッセイシグナルを増加または減少させることができる、患者検体中に存在する物質である。イムノアッセイは干渉を受けやすいことが知られているが、臨床検査室は、そのような結果が機器（分析計）または検査室によって認識されず、かつフラグが付けられない場合、または医師が患者の結果が臨床像に適合しないことを検査室に通知しない場合、誤った結果を依然として報告する可能性がある。問題を引き起こす可能性があるような検体を前もって特定する実用的な手段がない任意の検体では、誤った結果が予期せず生じ得る。そのような干渉の結果として、誤った結果が偽陰性および偽陽性の試験結果をもたらし得、それが患者ケアに影響を及ぼす可能性があり、不必要な侵襲的、診断的もしくは治療的手順、または患者の処置の失敗をもたらし得る。

臨床検査室には、試料の種類（すなわち、血漿）、キャリーオーバー、凍結／解凍、安定性、溶血、黄疸、脂血症、抗凝固剤の効果、試料保存、結合タンパク質、薬物および薬物代謝産物、ならびに交差反応性などの試料特異的干渉の多くの供給源がある。しかしながら、ヒト抗動物抗体（ＨＡＡＡ）およびヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）の干渉などの異好性抗体干渉は、検出が困難であり、患者の管理に影響を及ぼし得るため、面倒で問題がある。

干渉に起因する複雑さにもかかわらず、バイオマーカースクリーニングおよび診断試験は、例えば生物学的試料中のそれらの存在または存在量が低いために、困難であり得る。

したがって、体内に見出されるバイオマーカーは、疾患を検出、予測、または管理するために使用することができるが、多くは現在市販されている試験を使用して検出するには存在量が少なすぎる。試験精度を改善し、バイオマーカーを見出すのが困難な測定を行い、コストを削減し、最終的には生命を守るために臨床試料を調製する新しい診断技術に対する満たされていない臨床的必要性が存在する。

ビオチンは、ビタミンＢ７としても知られており、多くの場合、マルチビタミンにおいて、また、処方箋不要の健康および美容の補助食品において見出される水溶性Ｂビタミンである。ストレプトアビジン－ビオチン結合機構を使用するインビトロ検査室診断試験は、高い循環ビオチン濃度による影響を受ける潜在性がある。ビオチンは、アビジン、ストレプトアビジン、またはニュートラアビジンタンパク質との特異的な非共有結合に対する影響を最小限に抑えながら、大きな抗体からステロイドホルモンまでの様々な標的に共有結合によって結合することができる。したがって、ビオチンは、様々な形態のイムノアッセイの検出系において頻繁に使用されている。

イムノアッセイは、一般に、サンドイッチイムノアッセイ（非競合的）または競合的阻害イムノアッセイのいずれかに分類される。一般に、ストレプトアビジン－ビオチン結合は、アッセイインキュベーション中に、サンドイッチイムノアッセイにおけるビオチン化抗体または競合イムノアッセイにおけるビオチン化抗原をストレプトアビジンコーティング表面に結合させるために使用される。生物学的検体が過剰なビオチンを含有する場合、ビオチンは、ストレプトアビジンコーティング表面への結合についてビオチン化抗体または抗原と競合し、ビオチン化抗体または抗原の捕捉が減少する。過剰なビオチンは、アッセイシグナルが分析物濃度に正比例するので、サンドイッチイムノアッセイにおいて誤って低い結果をもたらす。競合イムノアッセイにおける過剰なビオチンは、アッセイシグナルが分析物濃度に反比例するので、誤って上昇した結果をひきおこす。

食事由来のビオチンの正常な循環濃度および正常な代謝は、ビオチン化イムノアッセイに干渉するには低すぎる（１．２ｎｇ／ｍＬ未満）。しかしながら、高用量ビオチンサプリメント（例えば、５ｍｇまたはそれより高い）の摂取は、一般的に使用されるビオチン化イムノアッセイに干渉し得る有意に高い血中濃度をもたらし得る。いくつかの研究は、ビオチンの血清濃度が、１日当たり２０ｍｇのビオチンのサプリメントを摂取している対象についてはビオチン摂取後１時間以内に最大３５５ｎｇ／ｍＬに達し、３００ｍｇのビオチンの単回投与後の対象については最大１１６０ｎｇ／ｍＬに達し得ることを示している。ＦＤＡによれば、高レベルのビオチンを摂取している患者から採取された血液または他の試料中のビオチンは、アッセイデザインに応じて、ビオチンベースのイムノアッセイにおいて誤って高いまたは誤って低い結果を引き起こし得る。

高レベルのビオチンを摂取している患者から採取された血液または他の試料中のビオチンは、アッセイデザインに応じて、ビオチンベースのイムノアッセイにおいて誤って高いまたは誤って低い結果を引き起こし得る。誤った試験結果は、不適切な患者管理ならびに誤診をもたらす場合がある。

ビオチン干渉閾値は、単一のプラットフォームであっても、アッセイ間で大きく異なる。５１ｎｇ／ｍＬ未満のビオチン干渉閾値を有する試験は、高リスク試験、または脆弱な免疫測定法および競合法と考えられる。

ビオチンに基づく試験はまた、抗体、タンパク質もしくは抗原にコンジュゲートされたビオチンを捕捉するための試験デザインにおけるストレプトアビジンの使用に関連する干渉機構、または抗ストレプトアビジン干渉を受けやすい。抗ストレプトアビジン抗体およびタンパク質は、特定の検査室試験に有意に干渉し、誤った試験結果を引き起こし得る。アッセイデザインおよびフォーマットに応じて試験シグナルの減少および偽低または偽高の患者結果を引き起こすビオチン干渉と同様に、抗ストレプトアビジン干渉も試験シグナルの減少をもたらすが、異なる機構を介しており、したがってビオチン干渉と間違えられ得る。抗ストレプトアビジン抗体の原因は完全には知られておらず、議論されているが、１つの可能な原因は細菌Ｓ．ａｖｉｄｉｎｉｉに由来する可能性がある。多くの人が日常生活においてこれらの細菌に曝露されており、それへの免疫学的反応を生じさせる可能性があると考えられる。

したがって、検査室のワークフローおよびターンアラウンドタイムに影響を与えることなく、診断試験前に試料干渉を排除または最小化し、バイオマーカー濃度を富化するための単純で安価で自動化可能で効果的な解決策が臨床的に必要とされている。

発明の概要
モノクローナルマウス抗体で処置された患者または診断目的でそれらを受けた患者における異好性抗体などの、誤った試験結果および患者の安全性に対するリスクの増加をもたらし得る多数の既知の試料特異的干渉を管理および緩和するための生物学的試料の単純で効率的かつ費用効果的なコンディショニングのための方法が、本明細書に記載される。本明細書に記載の方法はまた、健康および美容および体重減少のために、または例えば多発性硬化症の処置のために消費者によって摂取される処方箋不要の（ＯＴＣ）サプリメント、マルチビタミンおよび薬草剤から生じ得るビオチンから生じる試料特異的干渉を管理および緩和することができる。

生物学的試料中のバイオマーカーの濃度を富化または増加させる方法も本明細書に記載される。特に、バイオマーカーは、抗原特異的抗体、例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイクタンパク質などのウイルス構造タンパク質であり得る。様々な実施形態において、スパイクタンパク質は、完全タンパク質、Ｓ１サブユニット、Ｓ２サブユニット、またはその抗原断片、例えば受容体結合ドメイン（アミノ酸３３１～５２４など）および／またはＳ１サブユニットのＮ末端ドメイン（例えば、アミノ酸残基１～２６０）である。スパイクタンパク質またはその抗原断片をビオチン化し、ストレプトアビジン化ビーズに結合させることができ、次いでストレプトアビジン化ビーズをＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の捕捉試薬として機能させることができる。典型的には、Ｎ末端ドメインおよび受容体結合ドメインの両方が使用される場合、それらの断片は別々のビーズに結合し、次いでそれらは混合されて捕捉試薬として機能する。

一態様において、生物学的試料から抗原特異的抗体を単離する方法であって、ａ）試料を、捕捉部分を含む粒子と組み合わせて、混合物を提供することと、ｂ）混合物を混合して、抗体に粒子複合体を提供することと、それによって、生物学的試料から抗体を単離することと、を含む、方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質のＳ１サブユニット、またはその受容体結合ドメインおよび／またはＮ末端ドメインである。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質の構造は、当技術分野で公知である（Ｗａｌｌｓら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓｐｉｋｅ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、Ｃｅｌｌ １８０：１－１２、２０２０、それは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。様々な実施形態において、生物学的試料は、血液、血漿、血清、または他の抗体含有生物学的流体であり得る。

いくつかの実施形態において、単離された抗体は、血清学的アッセイにおいて検出され、定量され、または特徴付けられる。

いくつかの実施形態において、捕捉部分－抗体複合体は、粒子から切断される。他の実施形態において、特に捕捉部分が依然として粒子に結合している間に、抗体が捕捉部分から溶出される。次いで、富化または単離された抗体を、質量分析およびエドマン分解を含むタンパク質化学分析的方法に供することができる。富化または単離された抗体は、予防または治療目的のための受動免疫に使用することができる。例えば、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質を認識する抗体を単離する場合、それらを治療薬としてＣＯＶＩＤ－１９患者に投与することができ、あるいは、それらを医療従事者またはＣＯＶＩＤ－１９患者への曝露によるＳＡＲ－ＣｏＶ－２による感染のリスクがある他の人に予防的に投与することができる。

一態様において、生物学的試料から干渉を除去する方法であって、ａ）試料を捕捉部分を含む粒子と組み合わせて混合物を提供することと、ｂ）混合物を混合して干渉に対する粒子複合体を提供することと、ｃ）粒子複合体を除去または排除して枯渇溶液を提供することと、それによって干渉の量（例えば、質量、容量モル濃度（molarity）、濃度）を減少させるまたは低減することができること、を含む方法が本明細書で提供される。

図１は、本明細書に記載の粒子による生物学的試料からの干渉の除去（または枯渇）に基づく確認および不合格（disqualification）アッセイのスキームを示す。

図２は、本明細書に記載の凍結乾燥粒子による生物学的試料からの干渉の除去（または枯渇）に基づく枯渇アッセイのスキームを示す。

図３は、本明細書中に記載される磁化されたピペットチップによる生物学的試料からの干渉の除去（または枯渇）に基づく枯渇アッセイのためのスキームを示す。

図４は、ビオチン摂取後の経時的なビオチン濃度を示すグラフである。

図５は、ビオチン枯渇を示すグラフである。

図６は、ビオチン枯渇を示すグラフである。

図７は、ビオチン摂取後の経時的なビオチン濃度を示すグラフである。

図８は、異なるビオチン用量の摂取後のビオチン濃度を示すグラフである。

図９は、ビオチン枯渇を示すグラフである。

図１０は、ＰＴＨ濃度を示すグラフである。

図１１は、３重キャリブレータービーズを用いて生成されたＩｇＡ、ＩｇＧおよびＩｇＭの検量線を示す。

図１２は、連続試料が入手可能であり、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体アッセイで最初に陰性と試験された５名のＰＣＲ陽性患者における総ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体レベルを示す。

図１３は、連続試料が入手可能である３７名のＰＣＲ陽性患者における総ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体レベルを示す。

発明の詳細な説明
本明細書に記載の粒子を本明細書に記載の生物学的試料と組み合わせることを含む、生物学的試料を枯渇または富化する方法が、本明細書に記載される。

一態様において、生物学的試料からバイオマーカーを単離する方法であって、ａ）試料を、捕捉部分を含む粒子と組み合わせて、混合物を提供することと、ｂ）混合物を混合して、バイオマーカーに粒子複合体を提供することと、それによって、生物学的試料からバイオマーカーを単離することと、を含む、方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは抗原特異的抗体である。いくつかの実施形態において、抗原特異的抗体は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質のスパイクタンパク質、例えばＳ１サブユニット、またはその受容体結合ドメインおよび／またはＮ末端ドメインを認識する。

いくつかの実施形態において、方法は、粒子複合体を診断試験に供することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、粒子複合体から切断または溶出されたバイオマーカーを診断試験に供することをさらに含む。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは病原体特異的抗体である。いくつかの実施形態において、病原体特異的抗体は抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２抗体である。いくつかの実施形態において、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体は、受容体結合ドメイン、Ｎ末端ドメイン、またはその両方を認識する抗体を含む。

受容体結合ドメインおよびＮ末端ドメインの両方に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体が存在する。これらのドメインのいずれかに結合する抗体は、Ｓ１スパイクとウイルス受容体（アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２））との相互作用を立体的に遮断する。したがって、これらのドメインに結合する抗体は、中和抗体と考えられる。これらのドメインのいずれかを認識するＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡアイソタイプ抗体はすべて中和していると考えられる。したがって、生物学的試料中の中和抗体の程度を正確に評価するために、両方の種類の抗体を捕捉および定量することが有利であり得る。同様に、捕捉した抗体を予防的または治療的に使用する場合には、両方の種類を捕捉して使用することにより、より強固な受動免疫を確立することができる。例えば、受容体結合ドメインとＮ末端ドメインの両方を認識する抗体が使用される場合、これらのドメインのうちの１つを認識する抗体が使用される場合よりも、ドメインのうちの１つに変異を有するバリアントウイルスが中和から逃れる可能性は低い。

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を捕捉するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１－ＲＢＤ抗原およびＳ１－ＮＴＤ抗原を捕捉試薬に使用する。いくつかの実施形態において、これらの抗原をビオチン化し、ストレプトアビジン化磁気ビーズ上にコーティングする。

一態様において、生物学的試料から干渉を除去する方法であって、ａ）試料を捕捉部分を含む粒子と組み合わせて混合物を提供することと、ｂ）混合物を混合して干渉に対する粒子複合体を提供することと、ｃ）粒子複合体を除去または排除して枯渇溶液を提供することと、それによって干渉の量（例えば、質量、容量モル濃度、濃度）を減少させるまたは低減することができること、を含む方法が本明細書で提供される。

いくつかの実施形態において、この方法は、枯渇溶液を特性評価（例えば、診断試験）に供することをさらに含む。

いくつかの実施形態において、粒子は、凍結乾燥生成物（例えば、ＬｙｏＳｐｈｅｒｅ（商標）（ＢＩＯＬＹＰＨ ＬＬＣ））として提供される。

一態様において、診断試験の精度を高める方法であって、ａ）生物学的試料を捕捉部分を含む粒子と組み合わせて混合物を提供することと、ｂ）混合物を混合して干渉に対する粒子複合体を提供することと、ｃ）粒子複合体を除去または排除して枯渇溶液を提供することと、ｄ）枯渇溶液を診断試験に供することと、それによって診断試験の精度を高めることができることと、を含む、方法が本明細書で提供される。

いくつかの実施形態において、この方法に供されない生物学的試料と比較して、干渉の少なくとも１％、３％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９９％が除去される。いくつかの実施形態において、生物学的試料中に１００ｐｐｍ未満の干渉を提供するのに十分な量の干渉が除去される。いくつかの実施形態において、診断試験において検出可能な量未満の干渉を提供するのに十分な量の干渉が除去される。

いくつかの実施形態において、捕捉部分はヒト抗動物抗体（例えば、マウスＩｇＧ、ヒツジＩｇＧ、ヤギＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、ウシＩｇＧ、ブタＩｇＧ、ウマＩｇＧ）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、異好性抗体（例えば、ＦＲ（Ｆｃ特異的）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、重合ＩｇＧ（１、２ａ、２ｂ型ＩｇＧおよびＩｇＧ断片、血清成分）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、アッセイ特異的結合剤（例えば、ビオチン、フルオレセイン、抗フルオレセインポリ／Ｍａｂ、抗ビオチンポリ／Ｍａｂ、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、アッセイ特異的シグナル分子（例えば、ＨＲＰ、ＡＬＰ、アクリジニウムエステル、イソルミノール／ルミノール、ルテニウム、Ｎ－（４－アミノブチル）－Ｎ－エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）／環状ＡＢＥＩ）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分はアッセイ特異的ブロッカー（例えば、ＢＳＡ、魚皮ゼラチン、カゼイン、オボアルブミン、ＰＶＰ、ＰＶＡ）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、アッセイ特異的コンジュゲートリンカー（例えば、ＬＣ、ＬＣ－ＬＣ、ＰＥＯ４、ＰＥＯ１６）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は抗原自己抗体（例えば、遊離Ｔ３、遊離Ｔ４）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分はタンパク質自己抗体（例えば、ＭＴＳＨ、ＴｎＩ、ＴｎＴ、非心臓ＴｎＴ（骨格筋疾患））である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、化学発光基質（例えば、ルミノール、イソルミノール、イソルミノール誘導体、ＡＢＥＩ、ＡＢＥＩ誘導体、ルテニウム、アクリジニウムエステル）または蛍光標識（例えば、フルオレセインまたは他のフルオロフォアおよび色素）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジン、ポリＡ、ポリＤＴ、アプタマー、抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、抗体断片、組換えタンパク質、酵素、タンパク質、生体分子、またはポリマーである。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、ビオチン、フルオレセイン、Ｐｏ１ｙＤＴ、ＰｏｌｙＡ、抗原などである。

いくつかの実施形態において、除去することまたは排除することは、分離である。いくつかの実施形態において、分離は物理的分離を含む。いくつかの実施形態において、分離は磁気分離を含む。いくつかの実施形態において、磁気分離のための磁石は、大型ピペッティングマシンに１～１２個の試料調製管を保持するように設計されたラック内に２～１２個の磁石を含む多重磁石デバイスである。そのようなピペッティングマシンの例としては、ＨａｍｉｌｔｏｎまたはＴｅｃａｎによって構築されたものが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、磁気分離のための磁石は、９６ウェルまたは３８４ウェルマイクロタイタープレートに磁化を提供するように設計された９６個または３８４個の磁石を含む多重磁石デバイスである。いくつかの実施形態において、分離は化学的分離を含む。いくつかの実施形態において、除去または排除することは、ペレットおよび上清を提供するために、１０００×ｇまたはそれを超えて少なくとも１分間、２分間、３分間、４分間または５分間の遠心分離、および上清を除去することを含む。いくつかの実施形態において、除去することまたは排除することは、（例えば、フィルタによる）濾過を含む。いくつかの実施形態において、フィルタは、粒子の直径（例えば、ナノ粒子、微粒子）よりも十分に小さい多孔度または分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する。いくつかの実施形態において、濾過は、重力、真空、または遠心分離機によるものである。いくつかの実施形態において、除去することまたは排除することは、磁化を含む。いくつかの実施形態において、磁化は、強い磁石（例えば、ネオジム磁石）を使用して生じ、ペレットおよび上清を提供する。いくつかの実施形態において、磁石は遠心分離機ロータ内にある。いくつかの実施形態において、磁石は、使い捨てピペットチップ、カバーまたはシース内の磁石である。

一態様において、生物学的試料からバイオマーカーを単離する方法であって、ａ）試料を、捕捉部分を含む粒子と組み合わせて、混合物を提供することと、ｂ）混合物を混合して、バイオマーカーを含む粒子複合体を提供することと、ｃ）混合物から粒子複合体を除去することと、ｄ）混合物に切断試薬または放出（溶出）剤を添加して、バイオマーカーを含む単離物を得ることと、それによって、生物学的試料からバイオマーカーを単離することと、を含む、方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、バイオマーカーを単離する前に、本明細書に開示される方法に従って前処理または洗浄される。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは抗原特異的抗体である。いくつかの実施形態において、抗原特異的抗体は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質のスパイクタンパク質、例えばＳ１サブユニット、またはその受容体結合ドメインおよび／またはＮ末端ドメインを認識する。いくつかの実施形態において、生物学的試料からバイオマーカーを単離するための方法は、生物学的試料に対して診断試験を行う前に行われる。

いくつかの実施形態において、洗浄試薬は、捕捉部分としてヒト免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、および／またはＩｇＭを含む。いくつかの実施形態において、洗浄試薬は、捕捉部分として動物免疫グロブリン、例えばウサギ、ヤギ、またはマウスＩｇＧを含む。いくつかの実施形態において、洗浄試薬はＢＳＡを含む。洗浄試薬（複数可）には、バイオマーカー捕捉試薬と同じ微粒子を用いることが望ましい。このようにして、分析物抗体およびアッセイ試薬（例えば、ストレプトアビジンおよびビーズ自体）に特異的な１または複数の異好性干渉（複数可）を除去することができる。

一態様において、生物学的試料中にバイオマーカーが存在するかどうかを決定する方法であって、ａ）試料を捕捉部分と組み合わせて混合物を提供することと、ｂ）混合物を、捕捉部分を含む粒子と組み合わせて、三次複合体を提供することと、ｃ）三次複合体を混合物から除去して単離物を提供することと、ｄ）三次複合体の指標が単離物中に存在するかどうかを決定することと、それによって、バイオマーカーが生物学的試料中に存在するかどうかを決定することと、を含む、方法が本明細書で提供される。

一態様において、生物学的試料中にバイオマーカーが存在するかどうかを決定する方法であって、ａ）試料を捕捉部分を含む粒子と組み合わせて混合物を提供することと、ｂ）混合物を混合して、干渉に対する粒子複合体を提供することと、ｃ）粒子複合体を除去または排除して枯渇溶液を提供することと、ｄ）枯渇溶液を、第２の捕捉部分を含む第２の粒子と組み合わせて、第２の混合物を提供することと、ｅ）第２の混合物を混合して、バイオマーカーを含む第２の粒子複合体を提供することと、ｆ）第２の混合物から第２の粒子複合体を除去することと、ｇ）第２の混合物に切断試薬または放出剤を添加して、バイオマーカーを含む単離物を提供することと、それによって生物学的試料からバイオマーカーを単離することと、を含む、方法が本明細書で提供される。

いくつかの実施形態において、方法は、粒子複合体を希釈剤で洗浄することをさらに含む。

いくつかの実施形態において、切断試薬は、ジスルフィド結合還元試薬である。

いくつかの実施形態において、方法は、バイオマーカーに対して診断試験を行うことをさらに含む。

一態様において、試料中のバイオマーカーの量を富化する方法であって、ａ）捕捉部分を含む粒子を試料に添加して混合物を提供することと、ｂ）混合物を混合して粒子複合体を得ることと、ｃ）粒子複合体を分離してペレットおよび上清を得ることと、ｅ）ペレットから上清を除去することと、ｆ）希釈剤でペレットを洗浄することと、ｇ）バイオマーカーをペレットから溶出して、富化された試料を提供することと、試料中のバイオマーカーの量を富化することと、を含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、生物学的試料からバイオマーカーを富化するための方法は、生物学的試料に対して診断試験を行う前に行われる。

いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、腫瘍マーカー、例えばｐ５３などの腫瘍抗原に対する自己抗体である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原はネオ抗原である。いくつかの腫瘍抗原は、発達上不適切な様式で発現され、例えば、それが通常は全く発現されないであろう組織または成熟段階で、またはそれが発現されているのと同程度の高レベルで発現される。これは、腫瘍抗原を認識する抗体の産生をもたらし得る。発癌プロセスに関与する他の腫瘍抗原は変異していてもよく、変異は腫瘍抗原を免疫原性にする（ネオ抗原）。再び、変化した腫瘍抗原を認識する抗体を産生することができる。そのような自己抗体の検出は、早期の検出または悪性状態の変化を含むがんの検出および診断に有用である場合があり、適切な処置を選択するのに有用である。このような腫瘍抗原は、抗腫瘍抗原自己抗体の捕捉試薬に使用することができる。

がんの早期検出に有用であり得る腫瘍マーカーに対するさらなる自己抗体としては、がん抗原１５－３（ＣＡ１５－３）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、がん抗原１９－９（ＣＡ１９－９）、ｃ－Ｍｙｃ、ｐ５３、熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）２７およびＨｓｐ７０、真核生物翻訳開始因子３サブユニットＡ（ＥＩＦ３Ａ）、ならびに肺がん（ＬＣ）を認識するものが挙げられる。これらの腫瘍抗原特異的自己抗体は、長い半減期を有し、低循環または低存在量のがんタンパク質に応答して大量に産生されるので、がんの早期検出のための有望なバイオマーカーである。

いくつかの実施形態において、バイオマーカーは外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の指標である。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、ｓ－１００β、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）、切断型タウタンパク質（Ｃ－タウ）およびユビキチンＣ末端ヒドロラーゼ－Ｌ１（ＵＣＨ－Ｌ１）である。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、アルツハイマー病（ＡＤ）の指標である。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、アミロイドベータ、ＢＡＣＥ１、可溶性Ａβ前駆体タンパク質（ｓＡＰＰ）である。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、性感染症（ＳＴＤ）の指標である。いくつかの実施形態において、ＳＴＤは、クラミジア、淋病、梅毒、トリコモナス、ＨＰＶ、ヘルペス、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶである。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、細菌感染の指標である。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、細菌に対する捕捉部分である。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、切断試薬によって複合体から切断される。いくつかの実施形態において、バイオマーカーの存在がＭＡＬＤＩ－ＭＳによって決定される。いくつかの実施形態において、バイオマーカーの存在は分子診断法によって決定される。いくつかの実施形態において、バイオマーカーの存在はイムノアッセイによって決定される。

いくつかの実施形態において、干渉はフィブリノーゲンであり、除去または排除は分離、例えば遠心分離による物理的分離であり、粒子複合体はクロットに閉じ込められる。

図１を参照すると、本明細書に記載の粒子による生物学的試料からの干渉の除去（または枯渇）に基づく確認および不合格アッセイのスキームが示されている。生物学的試料は、一次採血管（ＰＢＣＴ）から吸引され、二次移送管（ＳＴＴ）に分注される。本明細書に記載される粒子、例えば、遊離ビオチンおよび／または異好性抗体の捕捉部分を含む表面を含む粒子は、ＳＴＴに添加されて、試料干渉に結合し、それを枯渇させる。

図２では、本明細書に記載の凍結乾燥粒子による生物学的試料からの干渉の除去（または枯渇）に基づく枯渇アッセイのスキームが示されている。凍結乾燥粒子（例えば、本明細書に記載の粒子）を含むＰＢＣＴは、生物学的試料を受け取り、生物学的試料による粒子の再懸濁および分散をもたらす。

図３では、本明細書中に記載される磁化されたピペットチップによる生物学的試料からの干渉の除去（または枯渇）に基づく枯渇アッセイのためのスキームが示されている。本明細書に記載の干渉または本明細書に記載のバイオマーカーを生物学的試料から除去するために、磁石を含むピペットチップが生物学的試料に加えられる。

分離方法
本明細書に記載の粒子は、生物学的試料の添加前に、一次採血管、２４時間蓄尿デバイス、採尿デバイス、唾液採取管、便採取デバイス、精液採取デバイス、採血バッグ、または任意の試料採取管もしくはデバイスなどの採取デバイスに添加することができる。

本明細書に記載の粒子はまた、試料を採取デバイスに採取した後、または一次採取デバイスからの試料を貯蔵または移送デバイス、例えばプラスチックまたはガラスチューブ、バイアル、ボトル、ビーカー、フラスコ、バッグ、缶、マイクロタイタープレート、ＥＬＩＳＡプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート１５３６ウェルプレート、キュベット、反応モジュール、リザーバ、または液体試料を保持、貯蔵または処理するのに適した任意の容器に移した後に、試料に添加することができる。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の粒子は、生物学的試料を含む採取デバイスに添加される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の粒子は、生物学的試料の添加前に採取デバイスに添加される。

いくつかの実施形態において、特に分析的適用ではなく分取的適用を含む実施形態において、複数のドナーからの生物学的試料は、粒子を添加する前にプールされる。少なくとも１０リットルを一度に処理することができる。

一態様において、尿採取デバイス上など、生物学的試料（すなわち、放出機構を駆動するスクリューキャップを含む本明細書に記載の採取デバイスを含む粒子を放出するためのデバイスが本明細書に記載される。例えば、デバイスは、スクリューキャップの閉鎖の際に本明細書に記載の粒子を放出するスクリューキャップを備えた管である。

一態様において、生物学的試料（すなわち、封入された組成物または規定の速度または時点で溶液に溶解する組成物）を含む容器への粒子の化学的放出を含むデバイスが本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のデバイスは、本明細書に記載の粒子の添加を遅延させるように、例えば、バイオマーカーの富化または単離の前に試料の前処理を提供するように、または診断試験を行うように構成される。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の試料は、本明細書に記載の粒子を添加する前に化学物質、タンパク質、ブロッカー、界面活性剤またはそれらの組み合わせで前処理して、例えば、ｐＨを調整し、試料特異的干渉を枯渇または競合し、および／またはマトリックス固有の課題を管理してから、ナノ粒子を試料に添加、導入、分散または混合して、ナノ粒子の標的バイオマーカー（複数可）に対する特異性および結合動態を改善することができる。試料前処理後の試料へのナノ粒子の遅延添加は、試料前処理後の試料にナノ粒子を添加することによって物理的に制御することができる。ナノ粒子はまた、ナノ粒子が試料中に放出、添加、分散または混合され得る前に化学物質、ポリマーまたは糖が溶解する必要があるように、ナノ粒子が化学物質、ポリマーまたは糖シェル、コーティングまたは重合によって封入、遮蔽または保護される場合、試料前処理中に試料中に存在し得る。ナノ粒子の遅延放出は、遅延薬物放出技術において今日使用されているような当業者に公知の化学を使用することができる。

分取親和性分離は、一般的に使用されるカラムクロマトグラフィである。磁性粒子分離技術は、いくつかの試料が引き起こす可能性があるカラムの詰まりの問題を回避することができる。一例では、磁性粒子技術は、全血または細胞含有血液画分の処理を可能にする。磁性粒子分離技術はまた、典型的なカラムベースの親和性分離よりも短い時間で達成することができる。粒子分離技術のさらに別の利点は、捕捉されたリガンド（バイオマーカー）の溶出をより小さい体積で達成することができ、さらなる処理なしでより濃縮された分子をもたらすことである。

粒子の磁気分離方法

一態様において、生物学的試料から干渉を除去する方法（例えば、診断試験の前、またはバイオマーカーの富化もしくは単離の前に）、または磁性粒子を単離もしくは分離する方法（例えば、一次採血管内、カスタム試料採取デバイス内、二次移送管もしくはカスタム試料デバイス内、またはプールされた試料）が本明細書で提供される。例えば、磁石ベースのデバイスは、磁性ナノ粒子を側部（複数可）および／または底部に迅速に（２分未満；好ましくは３０秒未満）単離して、本質的に粒子を含まない上清を形成する。粒子を含まない上清は、その後、粒子を含むペレットを破壊することなく吸引、排水、または他の方法で除去され、診断試験のために別個の移送管に分注することができる。いくつかの実施形態において、ペレットを単離するか、または診断試験に供する。

粒子の磁気分離のためのデバイス

本明細書で提供されるのは、本明細書に記載の方法で使用して、例えば診断試験のためにバイオマーカーを除去または枯渇させることができる、本明細書に記載の粒子を含むデバイスである。いくつかの実施形態において、デバイスは、本明細書に記載の粒子と本明細書に記載の試料との組み合わせを遅延させる物理的機構を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のデバイスは、本明細書に記載の粒子と本明細書に記載の試料との組み合わせを遅延させるための時限放出機構を含む。

磁気チューブホルダー。カスタム磁気チューブホルダー、またはそのスタンドから除去され、粒子を含まない上清のその後の診断試験のために試料ラックの内部に挿入することができるカスタム磁気チューブホルダー。カスタム磁気チューブホルダーは、その設計において物理的開口部または透き通った／透明なプラスチック（磁石または磁石アレイが存在しない場合）を有するように設計することができ、試料管バーコードを依然として検出して分析計によって読み取ることができ、または脂血症、溶血、細胞残屑／クロット検出、レベル検知などの指数試験（indices test）は、依然として分析計によって実行することができる。試料管は、磁気チューブホルダーの開口部（空間）または透き通った／透明なプラスチックによって分析計がバーコードを見て読み取ること、および／または脂血症、溶血、細胞残屑／クロット検出、レベル検知などの指数試験を実行することを可能にすることを確実にするために、特定の位置付けでカスタム磁気チューブホルダーにのみ適合するようにノッチまたは舌状のもの（tongue）および溝の設計を有するように設計されたカスタム試料管であり得る。

いくつかの実施形態において、接着剤、Ｖｅｌｃｒｏ（登録商標）、または他の方法を介して試料ラックに取り付けることができる磁石（複数可）の使用。磁性ナノ粒子を含有する試料管が磁石（複数可）を用いて試料ラック位置（複数可）に挿入されると、磁性ナノ粒子は試料管の側面（複数可）および／または底部に迅速に分離して、試料ラック特異的試験プラットフォームまたは分析計によって、診断試験のための本質的に粒子を含まない試料上清を形成する。

試料ラック自体は、所与の分析計（例えば、Ａｂｂｏｔｔ ＡＲＣＨＩＴＥＣＴ、Ｓｉｅｍｅｎｓ ＡＤＶＩＡ Ｃｅｎｔａｕｒ ＸＰ、Ｒｏｃｈｅ ｃｏｂａｓ ｅ４１１／ｅ６０１／６０２／ｅ８０１、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｃｃｅｓｓ ２／ＤｘＩ ４００／ＤｘＩ ８００、ＤｉａＳｏｒｉｎ ＬＩＡＩＳＯＮ／ＬＩＡＩＳＯＮ ＸＬなどに特異的である）に適合するカスタム磁気試料ラックとして機能する。例えば、ラック内のすべての管位置は、磁性ナノ粒子を試料管の側面（複数可）および／または底部に迅速に分離して、診断試験のための本質的に粒子を含まない試料上清を形成するように設計された多くの磁石を有する。

一態様において、試験管のラック用のホルダ（例えば、試験管ホルダ）を含むデバイス（例えば、分離デバイス）であり、ホルダは磁石を含む、デバイスが本明細書で提供される。

使い捨てピペットチップ。一態様において、デバイスは、使い捨てピペットチップの内部に挿入されたカスタム磁石を含む使い捨てピペットチップであって、上記ピペットチップの表面に磁性ナノ粒子を迅速に単離して本質的に粒子を含まない試料上清を形成する、使い捨てピペットチップである。カスタム磁石を有する使い捨てピペットチップは、その後、粒子を含むペレットを破壊することなく試料から除去することができる。粒子を含む使い捨てチップは、粒子が捕捉したものを測定または特徴付ける必要がない場合（すなわち、干渉枯渇）は廃棄することができるか、または後続の診断試験（すなわち、富化）で粒子の単離および特性評価のために新しい管に挿入することができる。例えば、粒子を有する使い捨てチップを、緩衝液を含む二次移送管に挿入することができる。磁石がチップから除去された場合、または磁石がオフにされた場合（例えば、電磁石）、粒子は緩衝液中に自由に分散する。

一態様において、本明細書に提供されるのは、使い捨てピペットチップを含むデバイスであり、チップは磁石を含む。

粒子の物理的分離の方法

一態様において、物理的な力（例えば、重力）によって本明細書に記載の粒子を除去する方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の粒子は、物理的な力によって（例えば、遠心分離によって）生物学的試料から分離、単離、または除去される。いくつかの実施形態において、本方法は、例えば、一次採血管、カスタム試料採取デバイス、二次移送管またはカスタム試料デバイス内で、本明細書に記載の診断試験方法の適用前に使用される。いくつかの実施形態において、粒子を除去する方法は濾過である。

例えば、フィブロネクチンおよび／または他の凝固因子に特異的な磁性ナノ粒子、またはその後の「クロット」（血清中）の捕捉もしくは結合のためのクロット成分／構成成分、細胞残屑（すなわち、赤血球膜特異的）、および／または細胞残屑（血清または血漿中）の捕捉もしくは結合は、遠心分離機ロータおよび／またはチューブホルダーにおける強力な磁石または磁気技術の統合によって遠心分離速度および効率を高める（検査室の効率、ワークフロー、およびスループットを改善するために、回転時間を短くする）。遠心分離からのＲＣＦまたはＧｓと磁性ナノ粒子複合体（すなわち、クロット＋磁気ビーズ、細胞残屑＋磁気ビーズ）の磁気分離とのこの組み合わせは、その後の分析のために試料を明確にするために、試料管の側面または底部でのはるかに迅速かつより効率的な分離および上清形成を可能にする。例えば、ほとんどの検査室におけるこの遠心分離工程は４分またはそれを超え、遠心分離と磁性ナノ粒子のクロット／細胞残屑の複合体の磁気分離／単離とを組み合わせることによって２分またはそれ未満（好ましくは１分またはそれ未満）に短縮することができる。

さらに、ナノ粒子または複数の磁性ナノ粒子が、１、５、１０、２０、３０、またはそれを超える異なる干渉機構などの１またはそれを超える異なる試料干渉機構にも特異的である場合、これらの干渉は、存在する場合、ナノ粒子によって捕捉され、遠心分離からの物理的分離後、試料から除去されるか、または上記の遠心分離および磁気分離の組み合わせによって試料から除去される。

これらの磁性ナノ粒子は、遠心分離による、または遠心分離および遠心分離機での磁気分離との組み合わせによって単離されるクロットまたは細胞残屑に対する特異性も有する必要はないが、それらの表面は、１またはそれを超える抗体がクロットおよび／または細胞残屑に特異的であろう、一方、他の抗体（複数可）および／または抗原が試料干渉に特異的であろう２つ以上の抗体および／または抗原で、共コーティングまたは固定化することができる。これに関して、ナノ粒子は、遠心分離による、または遠心分離および磁気分離の組み合わせによるその後の物理的分離または単離のために、試料の干渉ならびにクロットおよび／または細胞残屑の両方に特異的に結合するであろう。

クロットおよび／または細胞残屑に特異的なナノ粒子の使用は、磁性ナノ粒子による特異的結合によって凝固速度（clotting rate of speed）を増加させ、磁気分離および単離のためにすべてを磁気に引っ張る。磁場および強度によって形成されたこのビーズベースのペレットはまた、クロットの強制近接またはナノ粒子およびその後の磁石によって特異的に捕捉された凝固因子に基づいてクロット形成を加速する。

粒子の化学的分離方法

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の粒子は、化学的分離法によって生物学的試料から分離、単離、または除去される。いくつかの実施形態において、化学的分離方法は、例えば、一次採血管、カスタム試料採取デバイス、二次移送管またはカスタム試料デバイス内で、診断試験方法の適用前に使用される。

一態様において、粒子の化学的分離のための方法であって、塩、溶媒、ポリマー、または洗剤のうちの１またはそれを超えるものを提供することを含む方法が提供される。

いくつかの実施形態において、化学的分離方法、例えば液液相分離は、粒子を相Ａに分配し、かつナノ粒子を含まない試料は相Ｂへと分配され、そこで相Ｂが試験される。液液相分離（化学相分離）のための作用物質（agent）は、塩、可溶性ポリマーおよび洗剤によるものであり得る。

例えば、液液相分離は、ヘキサンなどの非極性溶媒を極性水性試料に添加することによって行うことができ、粒子は非極性相に分配され、本明細書に記載の診断試験による試験のためにナノ粒子を含まない水相を残す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の分離方法は、有機相中にナノ粒子を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の分離方法は、水相中にナノ粒子を提供する。

生物学的試料中の粒子を単離するための方法であって、粒子および生物学的試料に非極性溶媒および水性極性溶媒を提供して非極性溶媒層および極性溶媒層を提供することと、非極性溶媒を含む非極性溶媒層を除去することと、粒子を含む水性極性溶媒を単離することとを含み、それにより粒子を単離する方法。

試料回収は、非極性相を吸引および廃棄する前に、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ用の重水素化内部標準などの内部標準の添加および使用によって調整または補正することができる。

いくつかの実施形態において、分離は、磁気分離と組み合わせて使用される物理的分離である。例えば、一態様において、デバイス（例えば、重力および磁石の磁力の両方による分離を助ける磁石を備えた磁化遠心分離機または遠心分離機）が提供される。一態様において、本明細書に記載の粒子を分離するためのデバイスであって、磁石および遠心分離機を含むデバイスが本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、デバイスは遠心分離の時間を有意に短縮する。

干渉の除去のための方法
干渉を除去または最小化するための方法が本明細書に記載され、この方法は、溶血、脂血症、黄疸、ビリルビン、ミクロフィブリンクロット、細胞残屑、血球、フィブリノーゲン、薬物、代謝産物、サプリメント、薬草剤、およびマルチビタミンなどの他の干渉物質に起因する試験誤差（例えば、干渉）の既知の分析前および分析ソースを枯渇させる（例えば、緩和する、低減する、または管理する）ことを含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、マトリックス効果または試料タイプの違い（例えば、動物種、ヒト種）による干渉を除去するための方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、診断試験（例えば、例えば臨床試験における診断またはバイオマーカー試験）の前に干渉を除去する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバイオマーカーを除去する方法は、本明細書に記載のバイオマーカーの診断試験の精度および信頼性を改善するために臨床試験で使用される。例えば、本明細書に記載の方法は、例えば、選択基準または除外基準のために、患者の選択またはスクリーニングに使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法または除去もしくは枯渇を使用して、臨床データまたは臨床試験結果における外れ値を同定することができる。例えば、臨床データまたは臨床試験結果における外れ値は、本明細書に記載のバイオマーカーの偽陽性または偽陰性の同定を含む。

枯渇は、その後の干渉のないまたは減少した定量的、半定量的もしくは定性的分析のために十分な量の干渉が捕捉および／または除去される場合、完全として定義される。枯渇は、十分な量の干渉（複数可）または干渉機構（複数可）がその後の半定量的または定性的分析のために捕捉および／または除去される場合、部分的として定義され、または十分な量の干渉（複数可）または干渉機構（複数可）および内部標準（複数可）が、ＬＣＭＳおよびＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（すなわち、重水素化内部標準）およびＨＰＬＣ（Ｃ１４またはトリチウム化内部放射性同位体内部標準）などの標的分析物（複数可）またはバイオマーカーの回収について調整するために内部標準を使用することができる測定方法による定量的、半定量的または定性的分析のために捕捉される場合も、部分的として定義される。

枯渇は、試料からの干渉の１００％の除去を意味するのではなく、残留干渉がもはや誤った結果をもたらさないことを意味する。しかしながら、試料の処置前枯渇は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるその後の溶出および分析などの特定のアッセイまたは目的のために、または試料の分析前処理、分子診断のための核酸精製および濃縮のために、または尿、唾液および便などの困難な試料タイプからのバイオマーカーの富化のために必要とされる場合、干渉の１００％の除去をもたらし得る。

いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法は、１週間、６日間、５日間、４日間、３日間、２日間、１日間、２４時間、２０時間、１６時間、１２時間、８時間、４時間、２時間、１時間、３０分、１５分、１０分、５分またはそれ未満で行われる。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載される方法は、１日未満で行われる。

干渉
本明細書で提供される方法は、生物学的試料における干渉を低減、最小化、または排除する。干渉は、例えば抗体結合に干渉することによって診断試験の結果の正確な値を変化させることができるか、または架橋、立体障害、もしくは自己抗体機構によってアッセイシグナルを増加または減少させることができる、患者検体中に存在する物質である。本明細書で使用される「干渉」とは、血液、血漿、血清、ＣＦＳ、尿、便、唾液、精液、羊水、または免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ）、タンパク質、抗原、脂質、トリグリセリド、細胞構成成分、異物（foreign substance）、化学物質、薬物、薬物代謝産物、サプリメント、ビタミン、薬草剤、異物（foreign body）（ウイルス、細菌（グラム陽性、グラム陰性）、真菌、酵母）、および試験に干渉し、試験原料、製剤、生物学的および合成的な成分、試験デザイン、および／または試験フォーマットとの特異的または非特異的相互作用によって試験に干渉し誤った試験結果をもたらす可能性がある任意の異物、食品または食物物質によって生成される廃棄物などの他の体液または試料マトリックス中の任意の内因性もしくは外因性物質または内因性および／もしくは外因性物質の組み合わせを指す。干渉は、それらに限定されないが、自己抗体、リウマチ因子（ＲＦ）、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）、ヒト抗動物抗体（ＨＡＡＡ）、例えばヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、マウス、ウマ、ブタおよびロバのポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体などの異好性または異好性様干渉であってよく、試験デザインまたはアッセイ処方に使用されるアッセイ特異的干渉、例えば化学発光基質（ルミノール、イソルミノール、イソルミノール誘導体、ＡＢＥＩ、ＡＢＥＩ誘導体、ルテニウム、アクリジニウムエステル）、蛍光標識、例えばフルオレセインまたは他のフルオロフォアおよび色素、捕捉部分（ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジン、ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ、ポリＡ、ポリＤＴ、アプタマー、抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、抗体断片、組換えタンパク質、酵素、タンパク質、生体分子、ポリマー）およびそれらの結合パートナー（すなわち、ビオチン、フルオレセイン、Ｐｏ１ｙＤＴ、ＰｏｌｙＡ、抗原など）、コンジュゲーションリンカー（ＬＣ、ＬＣ－ＬＣ、ＰＥＯ、ＰＥＯｎ）、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、オボアルブミン、ゼラチン、精製ポリおよびモノクローナルＩｇＧ、例えばマウス、ヤギ、ヒツジおよびウサギ、ポリビニルアルコール（ＰＡＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）およびＴｅｔｒｏｎｉｃなどのトリブロックコポリマー、ならびにＳｕｒｍｏｄｉｃｓおよびＳｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓからのものなどの市販のブロッカー、ブロッキングタンパク質およびポリマーベースのブロッキング試薬）は、抗体ベースの診断試験、非抗体ベースの診断試験、または質量分析（すなわち、ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＬＣＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、分子診断法、ラテラルフロー、ポイントオブケア（ＰｏＣ）、ＣＬＩＡおよびＣＬＩＡ除外試験およびデバイスによるその後の分析のための試料前処理方法およびデバイスの設計に典型的に使用される。

一態様において、生物学的試料から干渉（例えば、ビオチン）を除去する方法であって、捕捉部分で誘導体化された粒子（推論（inference）に結合する）を提供することを含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、干渉はビオチンである。

別の態様において、試料を粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）で前処理して、血清または血漿から性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）または性ステロイド結合グロブリン（ＳＳＢＧ）を枯渇させ、ＳＨＢＧ枯渇試料をその後試験して、遊離または生物学的に利用可能なホルモンまたはステロイド（すなわち、遊離テストステロン）を測定することができる。いくつかの実施形態において、干渉は、性ホルモン結合グロブリン（ＳＨＢＧ）または性ステロイド結合グロブリン（ＳＳＢＧ）である。

いくつかの実施形態において、干渉は、ビオチン、ＨＡＭＡ、ＲＦ、異好性または抗ＳＡｖである。

バイオマーカーの除去または富化のための方法
生物学的試料中のバイオマーカーの濃度を富化または増加させる方法が本明細書に記載される。「富化」は、完全または部分的な粒子捕捉および、生物学的試料（例えば、ヒトもしくは動物の血清、血漿、血液、全血、処理血液、尿、唾液、便（液体および固体）、精液（semen）もしくは精液（seminal fluid）、細胞、組織、生検材料、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または任意の液体もしくは固体）由来の標的分析物（複数可）またはバイオマーカーの粒子への結合として定義される。いくつかの実施形態において、富化は、例えばバイオマーカー特異的ナノ粒子を洗浄し、次いで単離してバイオマーカーの特性評価および測定工程の前に干渉を除去または最小化することを可能にすることによる、生物学的試料の洗浄および濃縮を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法を使用して、その後の溶出および試験または他の使用のために生物学的試料中の特異的標的（例えば、バイオマーカー）を単離および精製する、または診断試験、さらなる精製、製剤化または他の使用の前にバイオマーカーの濃度を富化または増加させる。

バイオマーカー特異的粒子を洗浄または単離した後、特性評価または測定工程の前に、リン酸緩衝食塩水（すなわち、ＰＢＳ ｐＨ７．２）またはＬＣ－ＭＳ／ＭＳ適合性緩衝液などの緩衝液中で粒子を分散、再構成または再懸濁することができる。これは、粒子による捕捉され富化されたバイオマーカーの重要な特性評価または測定工程が、同じ特性評価、測定または試験方法またはシステムを使用して血液、血漿、血清または尿で測定された同じバイオマーカーと比較して、動物の血液、血漿、血清または尿で測定されたバイオマーカー間のマトリックス効果またはバイアスを導入または引き起こすものである、動物またはヒトのマトリックスにおいてではなく、緩衝液系で行われることを意味する。洗浄は、試料マトリックス、成分、タンパク質および細胞構成成分ならびに関連する干渉またはマトリックス効果を洗浄することを可能にする。同様に、単離されたバイオマーカーは、動物またはヒトマトリックスから除去され、治療的または予防的使用のための製剤緩衝液に放出され得る。

富化は、十分な量の分析物（複数可）がその後の診断試験、例えば、定量的、半定量的、または定性的分析のために捕捉される場合、完全として定義され、十分な量の分析物（複数可）またはバイオマーカーがその後の半定量的または定性的分析のために捕捉される場合、部分的として定義され、または十分な量の標的分析物（複数可）またはバイオマーカーおよび内部標準（複数可）が、ＬＣＭＳおよびＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（すなわち、重水素化内部標準）およびＨＰＬＣ（Ｃ１４またはトリチウム化内部放射性同位体内部標準）などの標的分析物（複数可）またはバイオマーカーの回収のために調整するために内部標準を使用することができる測定方法による定量的、半定量的または定性的分析のために捕捉される場合も、部分的として定義される。十分な量の捕捉種がその後の予防的または治療的製品における使用のために得られる場合、富化は分取と定義される。

診断試験の前に試料中のバイオマーカーを富化するための方法であって、ａ）粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）を試料に添加することと、ｂ）試料を粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）と混合することと、ｃ）粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）を試料と共にインキュベートして、バイオマーカーを粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）に結合させ、捕捉することと、ｄ）試料から粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）を分離または除去することと、ｅ）粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）を保存することと、ｆ）適切な洗浄希釈剤を使用して粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）を洗浄して、非特異的物質を除去することと、ｇ）バイオマーカーに特異的な定性的、半定量的または定量的診断試験を用いて、粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）によって捕捉されたバイオマーカーの量、質量、容量モル濃度、濃度または収率を測定することと、を含む方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、希釈剤は水（例えば、脱イオン水、注射用水、食塩水、緩衝水溶液）を含む。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の富化方法は洗浄工程を含む。洗浄工程は、本明細書に記載の干渉を除去し、および／または目的の洗浄、精製または単離されたバイオマーカー（例えば、本明細書に記載のバイオマーカー）を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の富化方法は、マトリックス効果または種効果を低減する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の富化方法は、異なる起源の２つの生物学的試料を比較する診断試験の前に使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の富化方法は、動物試料とヒト試料とを比較する診断試験の前に使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の富化方法は、血清試料と血漿試料とを比較する診断試験の前に使用される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の富化方法は、高粘度の試料に対して使用される。

いくつかの実施形態において、富化方法は、バイオマーカーが富化された第１の生物学的試料を、バイオマーカーが富化された第２の生物学的試料と組み合わせることを含む。

本明細書で提供されるのは、粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）によって捕捉され富化された標的バイオマーカーの量、質量、容量モル濃度、濃度または収率を測定する方法であり、それによって、バイオマーカーは、本明細書に記載の切断試薬によって、例えば、ｐＨ（例えば、重炭酸ナトリウムなどの塩基でｐＨを上昇させ、酢酸、トリクロロ酢酸、スルホサリチル酸、ＨＣｌ、ギ酸などの酸でｐＨを低下させ、一般的なｐＨ溶出緩衝液、例えば１００ｍＭグリシン・ＨＣｌ、ｐＨ２．５～３．０、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０、５０～１００ｍＭトリエチルアミンまたはトリエタノールアミン、ｐＨ１１．５、１５０ｍＭ水酸化アンモニウム、ｐＨ１０．５）、ディスプレーサまたは置換剤（displacing agent）、競合的溶出（例えば０．１Ｍ超のカウンターリガンドまたは類似体）、イオン強度および／またはカオトロピック効果（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ中３．５～４．０Ｍ塩化マグネシウム ｐＨ７．０、１０ｍＭリン酸緩衝液中５Ｍ塩化リチウム ｐＨ７．２、２．５Ｍヨウ化ナトリウム ｐＨ７．５、０．２～３．０Ｍチオシアン酸ナトリウム）、界面活性剤、洗剤、濃縮無機塩、変性（例えば、２～６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、２～８Ｍ尿素、１％デオキシコール酸、１％ＳＤＳ）、有機溶媒（例えば、アルコール、クロロホルム、エタノール、メタノール、アセトニトリル、ヘキサン、ＤＭＳＯ、１０％ジオキサン、５０％エチレングリコール ｐＨ８～１１．５（カオトロピックでもある））、放射線または熱（温度上昇）、コンフォメーション変化、ジスルフィド結合還元剤（２－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）、酵素不活性化、カオトロピック剤（尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム）、機械的撹拌、超音波処理、およびタンパク質消化酵素（ペプシン、トリプシン）、ならびにそれらの組み合わせなどの溶出戦略を使用して結合相互作用を破壊することによって、粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）から溶出、解離または遊離される。

いくつかの実施形態において、１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．５を溶出緩衝液として使用して、複合体化抗ＩｇＡ、ＩｇＧ、および／もしくはＩｇＭ検出抗体（例えば、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８抗ヒトＩｇＧ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５５５抗ヒトＩｇＭ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７抗ヒトＩｇＡ）または標識検出抗体と複合体化した捕捉ＩｇＡ、ＩｇＧ、および／もしくはＩｇＭ抗体を捕捉ビーズから放出する。続いて、磁気ビーズを強磁性で単離し、次いで溶出物を中和緩衝液、例えば３００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ１０．０で新しいウェルに移してｐＨを中和し、蛍光光度計または蛍光リーダーによるその後の検出のためにフルオロフォアの安定性を改善する。酸性溶出ｐＨのこの中和は、アッセイの正確さおよび再現性を改善するために重要であり得る。

特に明記しない限り、または本開示から暗示されない限り、本明細書に記載される任意の特定の方法または組成物に関連して記載される任意の実施形態は、本明細書に記載される他の実施形態のいずれかと組み合わせて使用することができる。

様々な実施形態の方法および組成物は、当技術分野で公知の任意の適切なアッセイ、例えば、タンパク質－タンパク質親和性アッセイ、タンパク質－リガンド親和性アッセイ、核酸親和性アッセイ、間接蛍光抗体アッセイ（ＩＦＡＳ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、直接または間接アッセイ、競合アッセイ、サンドイッチアッセイ、ＣＬＩＡまたはＣＬＩＡ免除試験（CLIA waved test）、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、分析的アッセイなどを含むが、これらに限定されない当技術分野で公知の任意の適切な親和性アッセイまたは免疫アッセイと組み合わせて使用することができる。

診断試験の前に同じ試料から試料干渉を枯渇させることおよびバイオマーカーを富化することの両方の方法であって、ａ）バイオマーカー特異的粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）を試料に添加する前に、試料特異的干渉を遮断または枯渇させるために、化学的および／または生物学的試薬、添加剤または組成物を試料に添加する、ｂ）試料を化学的および／または生物学的試薬、添加剤または組成物で前処理またはインキュベートした後に、バイオマーカー特異的粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）を試料に添加する、ｃ）バイオマーカー特異的粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）を試料とインキュベートして、標的バイオマーカー（複数可）を粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）に結合させ、捕捉する、ｄ）粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）を洗浄するか、または粒子を試料および化学的および／または生物学的試薬、添加剤または組成物から単離する、ｅ）診断試験を使用して、粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）によって捕捉および富化されたバイオマーカー（複数可）を特徴付ける、からなる方法。

例えば、一実施形態では、ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎに結合した粒子は、中性ｐＨで試料中のビオチンに結合するであろう。ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ粒子に結合したビオチンは、ｐＨが１０に上昇するとビオチンを放出するであろう。

バイオマーカー
生物学的試料中に存在するバイオマーカーを単離する、または単離もしくは富化する方法が本明細書に記載される。本明細書で言及される「バイオマーカー」は、老化または疾患などのプロセス、事象、または状態の特徴的な生物学的または生物学的に由来する指標（例えば、代謝産物）として定義される。バイオマーカーは、内因性および／または外因性分析物、抗原、小分子、大分子、薬物、治療薬、代謝産物、生体異物、化学物質、ペプチド、タンパク質、タンパク質消化物、ウイルス抗原、細菌、細胞、細胞溶解物、細胞表面マーカー、エピトープ、抗体、抗体の断片、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ受容体、受容体のリガンド、ホルモン、ホルモンの受容体、酵素、酵素の基質、一本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖ポリヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖ポリヌクレオチド、ポリマーおよびアプタマーであり得る。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、本明細書に記載の干渉（例えば抗体結合に干渉することによって診断試験の結果の正確な値を変化させることができるか、または架橋、立体障害、もしくは自己抗体機構によってアッセイシグナルを増加または減少させることができる、患者検体中に存在する物質）である。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、感染症抗原、例えばウイルス抗原に対する抗体である。感染症抗原に対する抗体は、感染症病原体による感染への曝露および該感染からの回復を示すことができる。そのような場合、抗体は、治療目的または予防目的のための受動免疫に使用することができる。いくつかの実施形態において、感染症疾患抗原に対する抗体は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質のスパイクタンパク質、例えばＳ１サブユニット、またはその受容体結合ドメインおよび／またはＮ末端ドメインを認識する。本明細書で使用される「干渉」は、それらに限定されないが、自己抗体、リウマチ因子（ＲＦ）、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）、ヒト抗動物抗体（ＨＡＡＡ）、例えばヤギ、ウサギ、ヒツジ、ウシ、マウス、ウマ、ブタおよびロバのポリクローナル抗体および／またはモノクローナル抗体などの異好性または異好性様干渉であってよく、試験デザインまたはアッセイ処方に使用されるアッセイ特異的干渉、例えば化学発光基質（ルミノール、イソルミノール、イソルミノール誘導体、ＡＢＥＩ、ＡＢＥＩ誘導体、ルテニウム、アクリジニウムエステル）、蛍光標識、例えばフルオレセインまたは他のフルオロフォアおよび色素、捕捉部分（ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジン、ポリＡ、ポリＤＴ、アプタマー、抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、抗体断片、組換えタンパク質、酵素、タンパク質、生体分子、ポリマー）およびそれらの結合パートナー（すなわち、ビオチン、フルオレセイン、Ｐｏ１ｙＤＴ、ＰｏｌｙＡ、抗原など）、コンジュゲーションリンカー（ＬＣ、ＬＣ－ＬＣ、ＰＥＯ、ＰＥＯｎ）、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、オボアルブミン、ゼラチン、精製ポリおよびモノクローナルＩｇＧ、例えばマウス、ヤギ、ヒツジおよびウサギ、ポリビニルアルコール（ＰＡＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－８０、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）およびＴｅｔｒｏｎｉｃなどのトリブロックコポリマー、ならびにＳｕｒｍｏｄｉｃｓおよびＳｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓからのものなどの市販のブロッカー、ブロッキングタンパク質およびポリマーベースのブロッキング試薬）は、抗体ベースの診断試験、非抗体ベースの診断試験、または質量分析（すなわち、ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＬＣＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、分子診断法、ラテラルフロー、ポイントオブケア（ＰｏＣ）、ＣＬＩＡおよびＣＬＩＡ除外試験およびデバイスによるその後の分析のための試料前処理方法およびデバイスの設計に典型的に使用される。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、本明細書に記載の生物学的試料中に見出される。

フィブリノーゲン。フィブリノーゲンは、組織および血管の損傷中にトロンビンによってフィブリンに変換され、その後フィブリンに基づくクロットの形成をもたらす。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法で使用される本明細書に記載の粒子（例えば、粒子誘導性抗フィブリノーゲン（例えば、マウス抗フィブリノーゲン））は、全血中のフィブリノーゲンに結合し、フィブリノーゲンの分離（例えば、化学的分離）を可能にする。フィブリンを介してクロットに結合する粒子を単離し、粒子を含まない血清試験のための遠心分離後の血清から除去することができる。いくつかの実施形態において、バイオマーカーはフィブリノーゲンである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、粒子由来抗フィブリノーゲンを使用して、試料（例えば、血液試料）の遠心分離の必要性を除去する。

外傷性脳損傷。一実施形態では、バイオマーカーは外傷性脳損傷に関するものである。急性脳損傷の重症度および大きさならびに血液脳関門（ＢＢＢ）の完全性に関連するバイオマーカーは９つあるが、それらは血液中の非常に低い循環濃度で存在し、既存のイムノアッセイ技術および試験プラットフォームを使用して検出および定量することは非常に困難である。Ｂａｎｙａｎ ＢＴＩ試験（ＦＤＡは２０１８年２月１４日に認可した）は、これらのバイオマーカーのうちの２つのみを測定するが、本明細書中に記載の方法およびデバイス（例えば、富化方法；富化デバイス）は、患者の９つすべてのバイオマーカーの同時測定を可能にして、ほとんどの患者の診断および予後診断を助ける。９つのバイオマーカーのそれぞれについての捕捉部分で誘導体化された粒子は、ＴＢＩを有すると疑われる患者からの生物学的試料に添加され得る。いくつかの実施形態において、外傷性脳損傷バイオマーカーは、Ｓ１００Ｂ、ＧＦＡＰ、ＮＬＦ、ＮＦＨ、γ－エノラーゼ（ＮＳＥ）、α－ＩＩスペクトリン、ＵＣＨ－Ｌ１、総タウ、およびリン酸化タウからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、外傷性脳損傷バイオマーカーは、ＧＦＡＰおよびＵＣＨ－Ｌ１から選択される。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法（例えば、富化方法）を使用して、Ｓ１００Ｂ、ＧＦＡＰ、ＮＬＦ、ＮＦＨ、γ－エノラーゼ（ＮＳＥ）、α－ＩＩスペクトリン、ＵＣＨ－Ｌ１、総タウ、およびリン酸化タウからなる群から選択される外傷性脳損傷バイオマーカーの１、２、３、４、５、６、７、８、または９つの存在を単離または富化する。

アルツハイマー病。一実施形態では、バイオマーカーはアルツハイマー病に関するものである。アルツハイマー病の重症度および規模に関連するバイオマーカーは、２つある。いくつかの実施形態において、アルツハイマー病バイオマーカーは、アミロイドベータ、ＢＡＣＥ１、および可溶性Ａβ前駆体タンパク質（ｓＡＰＰ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、アルツハイマー病バイオマーカーは、β－アミロイド（１－４２）、ホスホ－タウ（１８１ｐ）、および総タウからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される方法（例えば、富化方法）を使用して、アミロイドベータ、ＢＡＣＥ１および可溶性Ａβ前駆体タンパク質（ｓＡＰＰ）からなる群から選択される１、２または３つのアルツハイマー病バイオマーカーの存在を単離または富化する。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、アミロイドベータ、ＢＡＣＥ１、または可溶性Ａβ前駆体タンパク質（ｓＡＰＰ）である。いくつかの実施形態において、アルツハイマー病のバイオマーカーは、生物学的試料（例えば、ＣＳＦ）中に見出される。

性感染症。一実施形態では、バイオマーカーは性感染症（ＳＴＤ）に関するものである。ＳＴＤの伝播に特徴的なバイオマーカーは少なくとも１０個存在する。いくつかの実施形態において、ＳＴＤバイオマーカーは、クラミジア、淋病、梅毒、トリコモナス、ＨＰＶ、ヘルペス１および２、ＨＳＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ１および２のバイオマーカーである。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法（例えば、富化方法）を使用して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２または１３個のＳＴＤバイオマーカー：クラミジア、淋病、梅毒、トリコモナス、ＨＰＶ、ヘルペス１および２、ＨＳＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ１および２、ならびにＨＩＶ抗体の存在を単離または富化する。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは尿中にある（例えば、クラミジア、淋病、トリコモナス）。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、血液、血清、または血漿（例えば、梅毒、ＨＰＶ、ヘルペス１および２、ＨＳＶ、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ１および２、ＨＩＶ抗体）中にある。

細菌感染。一実施形態では、バイオマーカーは細菌感染、例えば敗血症に関するものである。細菌感染についての現在のゴールドスタンダード試験は、陽性結果が分子診断などの確認試験に反映され得る前に２４～４８時間かかり得る血液培養である。敗血症を予防または管理するために患者を首尾よく処置するために時間が重要である場合、わずか３０分またはそれ未満で、例えば６０分またはそれ未満（例えば、５０分、４０分、３０分、２０分またはそれ未満）で、細菌感染を除外する（rule-in）／除外する（rule-out）方法が本明細書に記載される。細菌感染に特徴的なバイオマーカーは少なくとも３０個存在する。いくつかの実施形態において、細菌バイオマーカーは、敗血症を引き起こす細菌種のバイオマーカー（例えば、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａおよびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃｉｕｍ、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓのバイオマーカーである。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、グラム陽性またはグラム陰性細菌のバイオマーカーである。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、酵母病原体（例えば、血流病原体に関連する酵母病原体）のバイオマーカーである。

いくつかの実施形態において、グラム陽性菌は、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、またはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）である。

いくつかの実施形態において、グラム陰性菌は、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｂａｕｍａｎｎｉｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ複合体、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｒｏｔｅｕｓ、またはＳｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓである。

いくつかの実施形態において、酵母病原体は、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｇｌａｂｒａｔａ、Ｃａｎｄｉｄａ ｋｒｕｓｅｉ、Ｃａｎｄｉｄａ ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓである。

いくつかの実施形態において、質量分析法がそれに続く。切断剤（例えば、還元剤（例えば、ＤＴＴまたはＴＣＥＰ））を細菌－粒子結合複合体に添加してリンカー（すなわち、粒子を表面捕捉部分にコンジュゲートするリンカー）を切断する方法が想定される。得られた細菌を培養で成長させるか、またはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって分析する。

切断剤（例えば、還元剤（例えば、ＤＴＴまたはＴＣＥＰ））を細菌－粒子結合複合体に添加してリンカー（すなわち、粒子を表面捕捉部分にコンジュゲートするリンカー）を切断する方法が想定される。得られた細菌を培養で成長させるか、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析によって分析するか、またはＢｉｏＦｉｒｅ ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓによるＦｉｌｍＡｒｒａｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＢＣＩＤ）パネルなどの分子診断によって分析する。

病原体特異的抗体。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、病原体、特に病原体の構造的または表面露出抗原を認識する抗体である。磁性粒子上の捕捉部分としては、病原体特異的抗原が用いられる。抗原特異的抗体が捕捉部分（病原体特異的抗原）に結合できるように、全血、血液画分、血漿または血清を磁性粒子と混合する。粒子は、生体液から磁気的に分離される。次いで、磁性粒子を放出緩衝液中で応答させて、捕捉部分から抗体を溶出させる。これは分析的規模で行うことができ、抗体を質量分析（例えば、存在し得る抗体の複数の種を分離するためのＬＣ－ＭＳを含む）、エドマン分解、および他のタンパク質化学分析的方法に供して、抗体のタンパク質配列を決定することができる。配列情報を使用して、同じ特異性（単数または複数）を有するモノクローナル抗体（パラトープ（複数可））を構築することができる。これはまた、分取規模で行うことができ、富化または単離された抗原特異的抗体は、治療または予防のために診療所で使用される。いくつかの実施形態において、病原体特異的抗原を認識する抗体は、ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２スパイクタンパク質のスパイクタンパク質、例えばＳ１サブユニット、またはその受容体結合ドメインおよび／またはＮ末端ドメインおよび／または受容体結合ドメインを認識する。

甲状腺機能。ＴＳＨ濃度は、甲状腺ホルモンの過剰（甲状腺機能亢進症）または欠乏（甲状腺機能低下症）が疑われる患者の甲状腺機能試験の一部として測定される。いくつかの実施形態において本明細書中に記載される方法は、甲状腺機能を評価するために使用される。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは抗原（例えば、ＴＳＨ）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、抗原（例えば、ＴＳＨ）に対する特異性を有する自己抗体（例えば、遊離自己抗体、複合体化自己抗体）である。

いくつかの実施形態において、干渉（甲状腺刺激ホルモン、遊離チロキシン、および遊離トリヨードチロニンの測定に影響を及ぼす）は、マクロＴＳＨ、ビオチン、抗ストレプトアビジン抗体、抗ルテニウム抗体、甲状腺ホルモン自己抗体、または異好性抗体である。

心機能。いくつかの実施形態において本明細書に記載される方法は、心機能を評価するために使用される。血中を循環するトロポニンのレベルの上昇は、心臓障害、例えば心筋梗塞のバイオマーカーである。心臓ＩおよびＴは、心筋損傷の特異的指標である。トロポニンのサブユニットも心臓の健康のマーカーである。具体的には、ｃＴｎＩおよびｃＴｎＴは、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、例えば１型および２型心筋梗塞、不安定狭心症、術後心筋外傷ならびに関連疾患のバイオマーカーである。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは遊離ｃＴｎＩ、遊離ｃＴｎＴ、二元ｃＴｎＩ－ＴｎＣまたは三元ｃＴｎＩ－ＴｎＣ－ＴｎＴである。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは心不全の指標である。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、脳卒中の指標である（例えば、その全体が参照により組み込まれるｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｈａｊｏｕｒｎａｌｓ．ｏｒｇ／ｄｏｉ／１０．１１６１／ＳＴＲＯＫＥＡＨＡ．１１７．０１７０７６およびｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．３６０ｄｘ．ｃｏｍ／ｂｕｓｉｎｅｓｓ－ｎｅｗｓ／ｒｏｃｈｅ－ｔｅｓｔ－ｈｅｌｐｓ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ－ｂｌｅｅｄｉｎｇ－ｒｉｓｋ－ｓｔｒｏｋｅ－ｒｉｓｋ－ｐａｔｉｅｎｔｓ－ｃｏｎｓｉｄｅｒｉｎｇ＃．Ｗ１ｊｚ０ｔｈＫｈｃＡに記載されているように）。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは線維症の指標である（例えば、その全体が参照により組み込まれるｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｎｌｉｎｅｊａｃｃ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／６５／２２／２４４９に記載されているように）。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）の診断のためのものである。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、心臓トロポニン（Ｉ、Ｉ－Ｃ、Ｉ－Ｃ－Ｔ、Ｔ）および他の心臓トロポニン断片、ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ、ＡＮＰ、ＣＮＰ）、Ｎ末端断片（すなわち、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ、ＮＴ－ｐｒｏＣＮＰ）、グリコシル化、非グリコシル化、ＣＲＰ、ミオグロビン、クレアチニンキナーゼ（ＣＫ）、ＣＫ－ＭＢ、ｓＳＴ２、ＧＤＦ－１５、ガレクチン－３に関するものである。

いくつかの実施形態において、典型的には、今日、試験不可能であるか、試験前に試料の希釈が必要である（これは試験の感度、精度および正確さを損なう）、非常に希薄または低濃度のバイオマーカー（複数可）ならびに、非常に小さな試料体積（すなわち、新生児、小児、高齢者）の検出の確度を改善するために、大きな試料体積（すなわち、１ｍＬ、１０ｍＬ、１００ｍＬ、１０００ｍＬなど）を試験することができることによる精度および正確さは、。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、１ｍＬ、１０ｍＬ、１００ｍＬ、１０００ｍＬまたはそれを超える体積である。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、０．５ｍＬ、０．２５ｍＬ、０．１ｍＬ、０．０５ｍＬまたはそれ未満の体積である。

また、本明細書では、洗浄工程または粒子単離とそれに続く捕捉されたバイオマーカー（複数可）の選択的放出もしくは溶出、またはバイオマーカー特性評価工程の前に粒子からの捕捉部分－バイオマーカー複合体の選択的放出もしくは溶出を可能にすることによって、診断試験の前にバイオマーカーの富化を支援するための粒子試料前処理を使用する方法または試験方法も提供される。

粒子表面上の捕捉部分とバイオマーカー、例えば酸性または塩基性ｐＨ、高い容量モル濃度塩、糖、化学的ディスプレーサ、洗剤、界面活性剤、および／もしくはキレート剤、またはそれらの組み合わせとの間の結合を、捕捉部分を置き換えるまたは溶出することなく、バイオマーカーのみを除いて破壊する「切断試薬または「放出剤」の使用。磁石（複数可）を用いて試料マトリックスから粒子を洗浄または単離した後、続いて、粒子を放出剤（複数可）を含有する溶出溶液で処理して、バイオマーカーおよび／または標識検出試薬を溶液中に選択的に放出することができる。粒子は、本質的に粒子を含まない試料上清を形成するために、試料デバイス（バイアル、試験管、その他）の側面（複数可）および／または底部に迅速に（２分未満；理想的には３０秒未満で）単離することができる。粒子を含むペレットを破壊することなく、粒子を含まない上清をその後吸引し、別個の移送管に分注するか、またはバイオマーカーを試験するために分析システム（すなわち、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳまたはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）に直接注入することができる。いくつかの実施形態において、溶出した成分を含有する上清を中和緩衝液に移して、それほど過酷でない条件（ｐＨなど）を再確立し、溶出溶液による分解または変性からバイオマーカーおよび／または標識を保存する。
例えば、本明細書に記載の切断試薬または放出剤は、例えば、ｐＨ（例えば、重炭酸ナトリウムなどの塩基でｐＨを上昇させ、酢酸、トリクロロ酢酸、スルホサリチル酸、ＨＣｌ、ギ酸などの酸でｐＨを低下させ、一般的なｐＨ溶出緩衝液、例えば１００ｍＭグリシン・ＨＣｌ、ｐＨ２．５～３．０、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．０、５０～１００ｍＭトリエチルアミンまたはトリエタノールアミン、ｐＨ１１．５、１５０ｍＭ水酸化アンモニウム、ｐＨ１０．５）、ディスプレーサまたは置換剤、競合的溶出（例えば０．１Ｍ超のカウンターリガンドまたは類似体）、イオン強度および／またはカオトロピック効果（例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ中３．５～４．０Ｍ塩化マグネシウム ｐＨ７．０、１０ｍＭリン酸緩衝液中５Ｍ塩化リチウム ｐＨ７．２、２．５Ｍヨウ化ナトリウム ｐＨ７．５、０．２～３．０Ｍチオシアン酸ナトリウム）、界面活性剤、洗剤、濃縮無機塩、変性（例えば、２－６Ｍグアニジン・ＨＣｌ、２－８Ｍ尿素、１％デオキシコール酸、１％ＳＤＳ）、有機溶媒（例えば、アルコール、クロロホルム、エタノール、メタノール、アセトニトリル、ヘキサン、ＤＭＳＯ、１０％ジオキサン、５０％エチレングリコール ｐＨ８～１１．５（カオトロピックでもある））、放射線または熱（温度上昇）、コンフォメーション変化、ジスルフィド結合還元剤（２－メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン）、酵素不活性化、カオトロピック剤（尿素、塩化グアニジニウム、過塩素酸リチウム）、機械的撹拌、超音波処理、およびタンパク質消化酵素（ペプシン、トリプシン）、ならびにそれらの組み合わせなどの溶出戦略を使用して、本明細書に記載の粒子と本明細書に記載の捕捉部分との間の本明細書に記載の結合相互作用または切断可能な結合を破壊する。いくつかの実施形態において、溶出した成分を含有する上清を中和緩衝液に移して、それほど過酷でない条件（ｐＨなど）を再確立し、溶出溶液による分解または変性からバイオマーカーおよび／または標識を保存する。

特性評価方法
その後の特性評価または診断試験のためにバイオマーカーを枯渇および／または富化する方法が本明細書に記載される。本明細書に記載のバイオマーカー（例えば、干渉）の特性評価は、本明細書に記載のバイオマーカー（例えば、本明細書に記載の干渉）の同定および／または定量を含む。

特性評価は、バイオマーカー、例えば抗原特異的抗体の検出および／または定量を含み得る。抗原特異的抗体を粒子に結合させることにより、それを他の特異性から単離し、元の試料よりも小さい体積に放出し、必要に応じて濃縮することができる。特異的抗体の典型的な診断アッセイは、例えば全血清に関連して、最初に抗体を単離することなくそれらを検出する。これは絶対定量を困難にする。抗体活性は、血清がどれだけ希釈され得るかに基づいて力価として特徴付けられることが多いが、依然として活性を保持する。目的の種を捕捉し、それを血清中の免疫グロブリンの残りの部分から分離することによって、単純なタンパク質アッセイを使用して、どの程度の特異的抗体が存在するかを定量することができる。さらに、アイソタイプ特異的試薬を使用して、既知量のビーズ結合免疫グロブリンを用いて生成された標準曲線と比較することによって、関心対象の各アイソタイプを、並行アリコートで、または別個の標識にコンジュゲートされている場合、単一アリコートで多重化して別々に定量することができる。標準曲線は、一般に免疫グロブリンに対するものまたは特異的アイソタイプに対するものであってよく、後者は、別々にまたは多重様式で生成され得る。ＩｇＭは初期応答に典型的であり、ＩｇＧおよびＩｇＡはより成熟したより効果的な免疫応答に典型的である。この容易な絶対定量により、血清中の抗原特異的抗体の量を１つの血清試料から次の試料まで直接比較することが可能になる。いくつかの実施形態において、抗原特異的抗体はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１サブユニット、またはその受容体結合ドメインおよび／またはＮ末端ドメインおよび／または受容体結合ドメインを認識する。

本発明の粒子
生物学的試料の単離、枯渇および／または富化のための粒子が本明細書に記載される。いくつかの実施形態において、粒子は、切断可能な結合および捕捉部分（例えば、１つの捕捉部分を提示するように官能化された粒子表面）を含む。いくつかの実施形態において、粒子は、切断不可能な結合および捕捉部分（例えば、１つの捕捉部分を提示するように官能化された粒子表面）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の粒子は、捕捉部分（例えば、本明細書中に記載のバイオマーカーに対する高い特異性を有する捕捉部分）を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の粒子（例えば、本明細書に記載の粒子の表面、粒子表面は本明細書に記載の捕捉部分に結合していない）は、不活性である（例えば、本明細書中に記載されるバイオマーカーに対する有意な結合を示さない）。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の粒子は、粒子または診断試験をさらに改変することなく、本明細書に記載の診断試験に使用することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の粒子は、試料を変更することなく（例えば、追加のバイオマーカー（例えば、干渉）を添加または除去することなく、試料に添加および試料から除去することができる。

本明細書に記載の粒子は十分に小さく、平均直径は０．０５０マイクロメートル～最大３．００マイクロメートル、または好ましくは直径０．１００マイクロメートル～１．１マイクロメートル、またはさらにより好ましくは直径０．２００マイクロメートル～０．６００マイクロメートル、またはさらにより好ましくは直径０．１００マイクロメートル～０．５００マイクロメートルである。

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の粒子（例えば、微粒子、ナノ粒子）は、コアまたは支持体を含み、コアまたは支持体は、酸化鉄、強磁性酸化鉄、Ｆｅ_２Ｏ_３およびＦｅ_３Ｏ_４、マグヘマイト、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される常磁性または超常磁性材料である。

いくつかの実施形態において、粒子表面は、有機ポリマーまたは有機コポリマーを含み、有機ポリマーまたは有機コポリマーは疎水性である。いくつかの実施形態において、粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）表面は、これらに限定されないが、セラミック、ガラス、ポリマー、コポリマー、金属、ラテックス、シリカ、金、銀、または合金などのコロイド金属、ポリスチレン、誘導体化ポリスチレン、ポリ（ジビニルベンゼン）、スチレン－アシレートコポリマー、スチレン－ブタジエンコポリマー、スチレン－ジビニルベンゼンコポリマー、ポリ（スチレン－オキシエチレン）、ポリメチルメタクリレート、ポリメタクリレート、ポリウレタン、ポリグルタルアルデヒド、ポリエチレンイミン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸、Ｎ，Ｎ’－メチレンビスアクリルアミド、ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ポリアクリロニトリル、ポリスルホン、ポリ（エーテルスルホン）、熱分解材料、ブロックコポリマー、およびこれらのコポリマーからなる群から選択される材料などの有機ポリマーまたはコポリマー、シリコーンもしくはシリカ、メチロールメラミン、デキストランもしくはポリ（エチレングリコール）－デキストラン（ＰＥＧ－ＤＥＸ）などの生分解性ポリマー、またはそれらの組み合わせを含む。

本明細書で使用される場合、「ブロッカー」は、タンパク質、ポリマー、界面活性剤、洗剤、またはそれらの組み合わせを指す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の粒子（例えば、ナノ粒子、微粒子）上の捕捉部分の結合は、タンパク質、ポリマー、界面活性剤、洗剤、またはそれらの組み合わせなどのブロッカーでブロックされる。ブロッカーは、アルブミン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、オボアルブミン、ゼラチン、カゼイン、酸加水分解カゼイン、ガンマグロブリン、精製ＩｇＧ、動物血清、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体等のタンパク質、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）等のポリマー、タンパク質とポリマーの組み合わせ、ペプチド、（ＰＥＯ）ｎ－ＮＨＳ、（ＰＥＯ）ｎ－マレイミド等のＰＥＧ化試薬、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標） Ｆ１０８、Ｆ１２７、Ｆ６８等のトリブロックコポリマー、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標） Ｘ－１００、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）－２０）、Ｔｗｅｅｎ（登録商標） ８０（非イオン性）等の非イオン性洗剤、ＣＨＡＰＳ等の両性イオン性洗剤、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、デオキシコール酸塩、コール酸塩、サルコシル界面活性剤等のイオン性洗剤、スクロース等の糖、異好性ブロッキング試薬（Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）、ＭＡＫ３３（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、免疫グロブリン阻害試薬（ＩＩＲ）（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ）、Ｈｅｔｅｒｏｂｌｏｃｋ（Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ（ＪＳＲ）、ＴＲＵ Ｂｌｏｃｋ（Ｍｅｒｉｄｉａｎ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＳｔａｂｉｌＣｏａｔ（登録商標）＆ＳｔａｂｉｌＧｕａｒｄ（登録商標）（Ｓｕｒｍｏｄｉｃｓ）などの市販のブロッカーからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、ブロッカーは、本明細書に記載の粒子に結合（例えば、共有結合、非共有結合）している。いくつかの実施形態において、ブロッカーは、本明細書に記載の粒子に結合（例えば、共有結合、非共有結合）していない。

切断可能な結合。一態様において、捕捉部分は、本明細書に記載の切断可能な結合によってバイオマーカーに結合する。切断可能な結合は、共有結合または非共有結合によるものであり得る。非共有結合の例には、親和性、イオン性、ファンデルワールス（例えば、双極子／双極子またはロンドン力）、水素結合（例えば、ポリヌクレオチド二重鎖間）、および疎水性相互作用が含まれる。会合が非共有結合性である場合、実体間の会合は、好ましくは特異的である。特異的な非共有結合性会合の非限定的な例としては、ビオチンとビオチン結合タンパク質、例えばアビジン、カプトアビジン（captavidin）、ＳＡ、ニュートラアビジン、ＳＡの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの混合物との間の結合相互作用；ビオチン化Ｆａｂ、ビオチン化免疫グロブリンもしくはその断片、ビオチン化小分子（例えば、ホルモンまたは受容体のリガンドなど）、ビオチン化ポリヌクレオチド、ビオチン化巨大分子（例えば、タンパク質または天然もしくは合成ポリマー）の、アビジン、ＳＡ、ニュートラアビジン、ＳＡの断片、アビジンの断片、ニュートラアビジンの断片、またはそれらの混合物などのビオチン結合タンパク質への結合；基質のその酵素への結合；糖タンパク質と糖タンパク質に特異的なレクチンとの結合；リガンドとリガンドに特異的な受容体との結合；抗体が産生される抗原への抗体の結合；およびポリヌクレオチドと相補的または実質的に相補的なポリヌクレオチドとの間の二重鎖形成；等が挙げられる。

ジスルフィド結合（Ｒ－Ｓ－Ｓ－Ｒ）などの切断可能な結合を使用して、捕捉部分（すなわち、抗体または抗体断片、例えば、ＳＨ－Ｆａｂ）を粒子に固定または結合する。試料マトリックスから粒子を洗浄または単離した後、続いて、ＴＣＥＰまたはＤＴＴなどの還元剤を含有する溶液で粒子を処理してジスルフィド結合を切断し、捕捉部分バイオマーカー複合体を溶液中に放出することができる。粒子は、本質的に粒子を含まない試料上清を形成するために、試料デバイス（バイアル、試験管、その他）の側面（複数可）および／または底部に迅速に（２分未満；理想的には３０秒未満で）単離することができる。その後、粒子を含むペレットを破壊することなく粒子を含まない上清を吸引し、別個の移送管に分注するか、または捕捉部分－バイオマーカー複合体を試験するために分析システム（すなわち、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳもしくはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ、またはＦｉｌｍＡｒｒａｙ血液培養同定パネルなどの分子診断）に直接注入することができる。

いくつかの実施形態において、切断可能な結合は、ジスルフィド結合（Ｒ－Ｓ－Ｓ－Ｒ）である。

いくつかの実施形態において、切断可能な結合は、ストレプトアビジンまたはカプトアビジン、アビジン、およびビオチンの間の非共有結合である。

捕捉部分。本明細書に記載の干渉に結合する１つの捕捉部分、または本明細書に記載のバイオマーカーを含む粒子が本明細書で提供される。本明細書で言及される場合、「捕捉部分」は、抗体、抗体の結合断片、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ受容体、受容体のリガンド、ホルモン、ホルモンの受容体、酵素、酵素の基質、一本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖ポリヌクレオチド、二本鎖オリゴヌクレオチド、二本鎖ポリヌクレオチド、抗原、ペプチド、ポリマー、アプタマー、およびタンパク質からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、捕捉部分はタンパク質である。タンパク質は、例えば、単量体、二量体、多量体、または融合タンパク質であり得る。特定の実施形態において、タンパク質は、アルブミン、例えば、抗体、抗体の断片、ＢＳＡ、オボアルブミン、ＢＳＡの断片、オボアルブミンの断片、マウスＩｇＧ、重合マウスＩｇＧ、ＨＡＭＡおよびＲＦ干渉機構を標的とするマウスＩｇＧの抗体断片（Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２）および異なるサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＥ、ＩｇＤ）、ＨＡＡＡ干渉を標的とする精製動物ポリクローナル抗体（すなわち、ウシ、ヤギ、マウス、ウサギ、ヒツジ）、ＭＡＳＩ干渉を標的とするストレプトアビジン、ＡＬＰ、ＨＲＰ、ＢＳＡ（イソルミノール、ルテニウム、アクリジニウムにコンジュゲートした）、またはそれらの混合物のうちの少なくとも１つのものを含む。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、病原体、例えば細菌またはウイルスの構造的または表面露出抗原である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、ウイルス構造タンパク質、例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）のスパイクタンパク質である。いくつかの実施形態において、スパイクタンパク質は、Ｓ１サブユニット、またはその受容体結合ドメインおよび／またはＮ末端ドメインである。

いくつかの実施形態において、捕捉部分はヒト抗動物抗体（例えば、マウスＩｇＧ、ヒツジＩｇＧ、ヤギＩｇＧ、ウサギＩｇＧ、ウシＩｇＧ、ブタＩｇＧ、ウマＩｇＧ）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、異好性抗体（例えば、ＦＲ（Ｆｃ特異的）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、重合ＩｇＧ（１、２ａ、２ｂ型ＩｇＧおよびＩｇＧ断片、血清成分）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、アッセイ特異的結合剤（例えば、ビオチン、フルオレセイン、抗フルオレセインポリ／Ｍａｂ、抗ビオチンポリ／Ｍａｂ、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、アッセイ特異的シグナル分子（例えば、ＨＲＰ、ＡＬＰ、アクリジニウムエステル、イソルミノール／ルミノール、ルテニウム、ＡＢＥＩ／環状ＡＢＥＩ）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分はアッセイ特異的ブロッカー（例えば、ＢＳＡ、魚皮ゼラチン、カゼイン、オボアルブミン、ＰＶＰ、ＰＶＡ）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、アッセイ特異的コンジュゲートリンカー（例えば、ＬＣ、ＬＣ－ＬＣ、ＰＥＯ４、ＰＥＯ１６）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は抗原自己抗体（例えば、遊離Ｔ３、遊離Ｔ４）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分はタンパク質自己抗体（例えば、ＭＴＳＨ、ＴｎＩ、ＴｎＴ、非心臓ＴｎＴ（骨格筋疾患））である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、化学発光基質（例えば、ルミノール、イソルミノール、イソルミノール誘導体、ＡＢＥＩ、ＡＢＥＩ誘導体、ルテニウム、アクリジニウムエステル）または蛍光標識（例えば、フルオレセインまたは他のフルオロフォアおよび色素）である。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、アビジン、ポリＡ、ポリＤＴ、アプタマー、抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、抗体断片、組換えタンパク質、酵素、タンパク質、生体分子、ポリマー、または分子インプリントポリマーである。いくつかの実施形態において、捕捉部分は、ビオチン、フルオレセイン、Ｐｏ１ｙＤＴ、ＰｏｌｙＡ、抗原などである。

いくつかの実施形態において、捕捉部分はビオチンに結合する（例えば、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ＣａｐｔＡｖｉｄｉｎ、抗ビオチン抗体、抗体断片、アプマー、分子インプリントポリマーなど）。

いくつかの実施形態は、２またはそれを超える異なる捕捉部分を有する結合表面を提供する。

捕捉部分の生成。一態様において、捕捉部分を作製する方法であって、遊離自己抗体または自己抗体複合体に対する複合体特異的またはコンフォメーション特異的抗体の産生または生成を含む方法が提供される。遊離自己抗体は、それらの抗原標的にまだ複合体化されていない自己抗体である。複合体化自己抗体は、それらの抗原標的と複合体を形成した自己抗体である。

一態様において、捕捉部分を作製する方法であって、ＭＴＳＨのような自己抗体複合体に対する複合体特異的またはコンフォメーション特異的抗体の産生または生成を含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、自己抗体は、トリヨードチロニン（Ｔ３）またはチロキシン（Ｔ４）である。いくつかの実施形態において、自己抗体複合体はＭＴＳＨである。例えば、複合体特異的抗体またはコンフォメーション特異的抗体をＭＴＳＨのような自己抗体複合体にすることができ、これをヒト血清から精製し、捕捉部分として使用することができる。このようにして、生成された抗体は、ＴＳＨとのｈＩｇＧまたはｈＩｇＭ複合体に対する特異性のみを有するであろう。ＭＴＳＨは、技術および公開された方法に基づいて、またはタンパク質生化学および精製の当業者によって精製され得る。いくつかの実施形態において、自己抗体アッセイ干渉の確度が最も高い自己免疫疾患を有する患者は、自己抗体を産生または生成するために使用される。例えば、その参考文献の全体が引用されている、ＢＮＰ、国際公開第２０１４１１４７８０号、国際公開第２０１６１１３７１９号および国際公開第２０１６１１３７２０号についてのＨｙＴｅｓｔ ＳＥＳアッセイを参照されたい。

甲状腺特異的自己抗体。例えば、一実施形態では、自己抗体は抗甲状腺自己抗体（例えば、抗甲状腺ペルオキシダーゼ抗体、チロトロピン受容体抗体、サイログロブリン抗体）である。抗甲状腺自己抗体は、甲状腺上の１またはそれを超える成分に対して標的化される自己抗体である。

いくつかの実施形態において、自己抗体は、遊離自己抗体（例えば、チロトロピン（ＴＳＨ））である。

いくつかの実施形態において、自己抗体は、複合体化自己抗体（例えば、ＭＴＳＨ）である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の捕捉部分は、複合体化した自己抗体に対する特異性を有するか、ＭＴＳＨなどのその抗原標的に既に結合したｈＩｇＧおよび／またはｈＩｇＭに対する確認特異性を有するように生成された抗体である。

以下の項目は、親和性アッセイが設計される用途に応じて、分析物結合剤（捕捉部分）および分析物からなる結合対の一方のメンバーとして、またはあるいは他方のメンバーとして機能し得る物質の非限定的なリストである。そのような物質は、例えば、捕捉部分（分析物結合剤）として使用することができ、または様々な実施形態で使用することができる捕捉部分を（例えば、それらをハプテン／抗原として使用して特異的抗体を生成することによって）生成するために使用することができる。イムノアッセイを含む親和性アッセイは、試料中の分析物であるそのような物質の存在および／またはレベルを検出するために、様々な実施形態に従って設計することができる。特定の実施形態において、分析物結合捕捉部分を使用して、試料中の分析物としてこれらの物質を検出することができる。あるいは、本明細書に開示される物質は、様々な実施形態に従って固相支持体表面と会合し、それらと相互作用する分子（例えば、列挙された物質、結合タンパク質、または酵素に特異的な抗体またはその断片など）を捕捉するために使用することができる。

分析物結合剤（捕捉部分）および分析物からなる結合対の一方のメンバーとして、またはあるいは他方のメンバーとして機能し得る物質の非限定的なリストには、誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）、ＣＡ１９－９、ＩＬ－ｌα、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－ｔ、ＩＬ－５、ＩＬ－７、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２、ＩＬ－１３、ｓＩＬ－２Ｒ、ｓＩＬ－４Ｒ、ｓＩＬ－６Ｒ、ＳＩＶコア抗原、ＩＬ－１ＲＡ、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ；ＰＳＡ、ｐＰＳＡ、ＢＰＳＡなどのＰＳＡ（前立腺特異的抗原）のアイソフォーム、ＰＳＡ中、非α_１－抗キモトリプシン複合体化ＰＳＡ、α_１－抗キモトリプシン複合体化ＰＳＡ、ｈＫ２、ｈＫ４、およびｈＫ１５などの前立腺カリクレイン、ｅｋ－ｒｈＫ２、Ａｌａ－ｒｈＫ２、ＴＷＴ－ｒｈＫ２、Ｘａ－ｒｈＫ２、ＨＷＴ－ｒｈＫ２、および他のカリクレイン；ＨＩＶ－１ ｐ２４；フェリチン、Ｌフェリチン、トロポニンＩ、ＢＮＰ、レプチン、ジゴキシン、ミオグロビン、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチドまたは脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、ＮＴ－ｐｒｏＢＮＰ、ＣＮＰ、ＮＴ－ｐｒｏＣＮＰ（１－５０）、ＮＴ－ＣＮＰ－５３（５１－８１）、ＣＮＰ－２２（８２－１０３）、ＣＮＰ－５３（５１－１０３）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）；ヒト成長ホルモン、骨アルカリホスファターゼ、ヒト卵胞刺激ホルモン、ヒト黄体形成ホルモン、プロラクチン；ヒト絨毛性ゴナドトロピン（例えば、ＣＧα、ＣＧβ）；可溶性ＳＴ２、サイログロブリン；抗サイログロブリン；ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、B.anthracis保護抗原、B.anthracis致死因子、B.anthracis胞子抗原、F.tularensis ＬＰＳ、S.aureasエンテロトキシンＢ、Y.pestis莢膜Ｆ１抗原、インスリン、αフェトプロテイン（例えば、ＡＦＰ ３００）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ１５．３抗原、ＣＡ１９．９抗原、ＣＡ１２５抗原、ＨＡＶ Ａｂ、ＨＡＶ Ｉｇｍ、ＨＢｃ Ａｂ、ＨＢｃ Ｉｇｍ、ＨＩＶ１／２、ＨＢｓＡｇ、ＨＢｓＡｂ、ＨＣＶ Ａｂ、抗ｐ５３、ヒスタミン；ネオプテリン；ｓ－ＶＣＡＭ－１、セロトニン、ｓＦａｓ、ｓＦａｓリガンド、ｓＧＭ－ＣＳＦＲ、ｓ１ＣＡＭ－１、チミジンキナーゼ、ＩｇＥ、ＥＰＯ、内因性因子Ａｂ、ハプトグロブリン、抗カルジオリピン、抗ｄｓＤＮＡ、抗Ｒｏ、Ｒｏ、抗Ｌａ、抗ＳＭ、ＳＭ、抗ｎＲＮＰ、抗ヒストン、抗Ｓｃｌ－７０、Ｓｃｌ－７０、抗核抗体、抗セントロメア抗体、ＳＳ－Ａ、ＳＳ－Ｂ、Ｓｍ、Ｕ１－ＲＮＰ、Ｊｏ－１、ＣＫ、ＣＫ－ＭＢ、ＣＲＰ、虚血修飾アルブミン、ＨＤＬ、ＬＤＬ、ｏｘＬＤＬ、ＶＬＤＬ、トロポニンＴ、トロポニンＩ、トロポニンＣ、ミクロアルブミン、アミラーゼ、ＡＬＰ、ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＧＴ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、プレアルブミン、抗ストレプトリシン、クラミジア、ＣＭＶ ＩｇＧ、トキソＩｇＧ、トキソＩｇＭ、アポリポタンパク質Ａ、アポリポタンパク質Ｂ、Ｃ３、Ｃ４、プロパージン因子Ｂ、アルブミン、α_１－酸性糖タンパク質、α_１－抗トリプシン、α_１－ミクログロブリン、α_２－マクログロブリン、抗ストレプトリシンＯ、抗トロンビン－ＩＩＩ、アポリポタンパク質Ａｌ、アポリポタンパク質Ｂ、β_２－ミクログロブリン、セルロプラスミン、補体Ｃ３、補体Ｃ４、Ｃ反応性タンパク質、ＤＮａｓｅ Ｂ、フェリチン、遊離カッパ軽鎖、遊離ラムダ軽鎖、ハプトグロビン、免疫グロブリンＡ、免疫グロブリンＡ（ＣＳＦ）、免疫グロブリンＥ、免疫グロブリンＧ、免疫グロブリンＧ（ＣＳＦ）、免疫グロブリンＧ（尿）、免疫グロブリンＧサブクラス、免疫グロブリンＭ、免疫グロブリンＭ（ＣＳＦ）、カッパ軽鎖、ラムダ軽鎖、リポタンパク質（ａ）、ミクロアルブミン、プレアルブミン、プロパージン因子Ｂ、リウマチ因子、フェリチン、トランスフェリン、トランスフェリン（尿）、風疹ＩｇＧ、チログロブリン抗体、トキソプラズマＩｇＭ、トキソプラズマＩｇＧ、ＩＧＦ－Ｉ、ＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ）－３、ヘプシン、ｐｉｍ－１キナーゼ、Ｅ－カドヘリン（E-cadherein）、ＥＺＨ２、およびα－メチルアシル－ＣｏＡラセマーゼ、ＴＧＦ－ベータ、ＩＬ６ＳＲ、ＧＡＤ、ＩＡ－２、ＣＤ－６４、好中球ＣＤ－６４、ＣＤ－２０、ＣＤ－３３、ＣＤ－５２、シトクロムＰ４５０のアイソフォーム、ｓ－ＶＣＡＭ－１、ｓＦａｓ、ｓＩＣＡＭ、Ｂ型肝炎表面抗原、トロンボプラスチン、ＨＩＶ ｐ２４、ＨＩＶ ｇｐ４１／１２０、ＨＣＶ Ｃ２２、ＨＣＶ Ｃ３３、ヘモグロビンＡ１ｃ、およびＧＡＤ６５、ＩＡ２、ビタミンＤ、２５－ＯＨ ビタミンＤ、１，２５（ＯＨ）２ ビタミンＤ、２４，２５（ＯＨ）２ ビタミンＤ、２５，２６（ＯＨ）２ ビタミンＤ、ビタミンＤの３－エピマー、ＦＧＦ－２３、スクレロスチン、プロカルシトニン、カルシトニン、c. dificille毒素Ａ＆Ｂ、h. pylori、ＨＳＶ－１、ＨＳＶ２を含む。

親和性アッセイが設計される用途に応じて、分析物結合剤（捕捉部分）および分析物からなる結合対の一方のメンバーとして、またはあるいは他方のメンバーとして機能してよく、現在開示されている実施形態で使用できる適切な物質には、例えば、ＷＨＯ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（２００５年６月３０日付けで更新されたｈｔｔｐ：／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｂｌｏｏｄｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｒｅ＿ｍａｔｅｒｉａｌｓで入手可能であり、当技術分野で周知の物質が列挙されており、このリストは参照により本明細書に組み込まれる）によって保持され、特徴付けられ、および／または配布されるＷＨＯ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓのいずれかに特異的な部分、例えば抗体またはその断片も含む。

ＷＨＯコードによって物質の後の括弧内に特定されるそのような適切な国際参照標準の部分リストには、ヒト組換えトロンボプラスチン（ｒＴＦ／９５）、ウサギトロンボプラスチン（ＲＢＴ／９０）、甲状腺刺激抗体（９０／６７２）、組換えヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（９８／７１４）、高分子量ウロキナーゼ（８７／５９４）、前立腺特異的抗原（９６／６６８）、前立腺特異的抗原９０：１０（９６／７００）；ヒト血漿プロテインＣ（８６／６２２）、ヒト血漿プロテインＳ（９３／５９０）、関節リウマチ血清（Ｗ１０６６）、血清アミロイドＡタンパク質（９２／６８０）、ストレプトキナーゼ（００／４６４）、ヒトトロンビン（０１／５８０）、ウシ複合トロンボプラスチン（ＯＢＴ／７９）、抗Ｄ陽性対照静脈内免疫グロブリン（０２／２２８）、膵島細胞抗体（９７／５５０）、リポタンパク質ａ（ＩＦＣＣ ＳＲＭ ２Ｂ）、ヒトパルボウイルスＢ１９ ＤＮＡ（９９／８００）、ヒトプラスミン（９７／５３６）、ヒトプラスミノゲン活性化因子インヒビター１（９２／６５４）、血小板因子４（８３／５０５）、プレカリクレイン活性化因子（８２／５３０）、ヒト脳ＣＪＤ対照およびヒト脳孤発性ＣＪＤ調製物１ならびにヒト脳孤発性ＣＪＤ調製物２およびヒト脳バリアントＣＪＤ（なし；それぞれＷＨＯ ＴＲＳ ＥＣＢＳ Ｒｅｐｏｒｔ Ｎｏ．９２６，５３．ｓｕｐ．ｒｄ Ｒｅｐｏｒｔに引用されている、脳ホモジネート）、ヒト血清補体成分Ｃ１ｑ、Ｃ４、Ｃ５、因子Ｂ、および全機能補体ＣＨ５０（Ｗ１０３２）、ヒト血清免疫グロブリンＥ（７５／５０２）、ヒト血清免疫グロブリンＧ、Ａ、およびＭ（６７／８６）、ヒト血清タンパク質アルブミン、α－１－アンチトリプシン、α－２－マクログロブリン、セルロプラスミン、補体Ｃ３、トランスフェリン（Ｗ１０３１）、抗Ｄネガティブコントロール静脈内免疫グロブリン（０２／２２６）、Ａ型肝炎ＲＮＡ（００／５６０）、Ｂ型肝炎表面抗原サブタイプａｄｗ２遺伝子型Ａ（０３／２６２および００／５８８）、Ｂ型肝炎ウイルスＤＮＡ（９７／７４６）、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ（９６／７９８）、ＨＩＶ－１ ｐ２４抗原（９０／６３６）、ＨＩＶ－１ ＲＮＡ（９７／６５６）、ＨＩＶ－１ ＲＮＡ遺伝子型（１０ Ｉ０１／４６６のセット）、ヒトフィブリノゲン濃縮物（９８／６１４）、ヒト血漿フィブリノーゲン（９８／６１２）、上昇したＡ２ヘモグロビン（８９／６６６）、上げられたＦヘモグロビン（８５／６１６）、ヘモグロビンシアニド（９８／７０８）、低分子量ヘパリン（８５／６００ および ９０／６８６）、未分画ヘパリン（９７／５７８）、血液凝固第ＶＩＩＩ因子およびフォン・ヴィレブランド因子（０２／１５０）、ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子濃縮物（９９／６７８）、ヒト血液凝固因子ＸＩＩＩ血漿（０２／２０６）、ヒト血液凝固因子ＩＩ、ＶＩＩ、ＩＸ、Ｘ（９９／８２６）、ヒト血液凝固因子ＩＩおよびＸ濃縮物（９８／５９０）、ヒト癌胎児性抗原（７３／６０１）、ヒトＣ反応性タンパク質（８５／５０６）、組換えヒトフェリチン（９４／５７２）、アポリポタンパク質 Ｂ（ＳＰ３－０７）、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）、ヒトベータトロンボグロブリン（８３／５０１）、ヒト血液凝固第ＩＸ因子濃縮物（９６／８５４）、ヒト血液凝固第ＩＸａ因子濃縮物（９７／５６２）、ヒト血液凝固因子Ｖライデン、ヒト ｇＤＮＡ 試料 ＦＶ 野生型、ＦＶＬホモ接合体、ＦＶＬ ヘテロ接合体（０３／２５４、０３／２６０、０３／２４８）、ヒト血液凝固第ＶＩＩ因子濃縮物（９７／５９２）、ヒト血液凝固第ＶＩＩａ因子濃縮物（８９／６８８）、ヒト抗梅毒血清（ＨＳ）、ヒト抗破傷風免疫グロブリン（ＴＥ－３）、ヒトアンチトロンビン濃縮物（９６／５２０）、ヒト血漿アンチトロンビン（９３／７６８）、ヒト抗サイログロブリン血清（６５／９３）、抗トキソプラズマ血清（ＴＯＸＭ）、ヒト抗トキソプラズマ血清（ＩｇＧ）（０１／６００）、ヒト抗水痘帯状疱疹免疫グロブリン（Ｗ１０４４）、アポリポプロテインＡ－１（ＳＰ１－０１）、ヒト抗インターフェロンベータ血清（Ｇ０３８－５０１－５７２）、ヒト抗麻疹血清（６６／２０２）、抗核リボ核タンパク質血清（Ｗ１０６３）、抗核因子（均一）血清（６６／２３３）、抗パルボウイルスＢ１９（ＩｇＧ）血清（９１／６０２）、抗ポリオウイルス血清タイプ１、２、３（６６／２０２）、ヒト抗狂犬病免疫グロブリン（ＲＡＩ）、ヒト抗風疹免疫グロブリン（ＲＵＢＩ－１－９４）、抗平滑筋血清（Ｗ１０６２）、ヒト抗二本鎖 ＤＮＡ 血清（Ｗｏ／８０）、ヒト抗Ｅ完全血液型判定血清（Ｗ１００５）、ヒト抗エキノコックス血清（ＥＣＨＳ）、ヒト抗Ａ型肝炎免疫グロブリン（９７／６４６）、ヒト抗Ｂ型肝炎免疫グロブリン（Ｗ１０４２）、ヒト抗Ｅ型肝炎血清（９５／５８４）、抗ヒト血小板抗原－１ａ（９３／７１０）、抗ヒト血小板抗原－５ｂ（９９／６６６）、ヒト抗インターフェロンα血清（Ｂ０３７－５０１－５７２）、ヒトアルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、アンクロド（ancrod）（７４／５８１）、ヒト抗Ａ血液型判定血清（Ｗ１００１）、ヒト抗Ｂ血液型判定血清（Ｗ１００２）、ヒト抗Ｃ型完全血液型判定血清（Ｗ１００４）、抗Ｄ（抗Ｒｈ０）完全血液型判定試薬（９９／８３６）、ヒト抗Ｄ（抗Ｒｈ０）不完全血液型判定血清（Ｗ１００６）、およびヒト抗Ｄ免疫グロブリン（０１／５７２）が含まれる。

親和性アッセイが設計される用途に応じて、分析物結合剤（捕捉部分）および分析物からなる結合対の一方のメンバーとして、またはあるいは他方のメンバーとして機能し得る適切な物質の他の例には、化合物を認識することができる抗体を生成するためのハプテンとして使用することができる化合物が含まれ、プロゲステロン、エストロゲンおよびテストステロン、プロゲスチン、コルチコステロイドおよびデヒドロエピステロンを含むがこれらに限定されないホルモン、ならびにＷＨＯによって国際参照標準として列挙されている任意の非タンパク質／非ポリペプチド抗原の任意の塩、エステルまたはエーテルが含まれるが、これらに限定されない。物質の後の括弧内のＷＨＯコードによって特定されるそのような適切な国際参照標準の部分リストには、ビタミンＢ１２（ＷＨＯ ８１．５６３）、葉酸塩（ＷＨＯ ９５／５２８）、ホモシステイン、トランスコバラミン、Ｔ４／Ｔ３、および参照により本明細書に組み込まれるＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ（ＷＨＯのウェブサイト、例えば、２００５年６月３０日に更新されたページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｂｌｏｏｄｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｒｅｆ＿ｍａｔｅｒｉａｌｓ／で入手可能）のＷＨＯカタログに開示されている他の物質が含まれる。本明細書に記載の方法および組成物は、上述のＷＨＯ参照標準または参照標準を含有する混合物を含むことができる。

親和性アッセイが設計される用途に応じて、分析物結合剤（捕捉部分）および分析物からなる結合対の一方のメンバーとして、またはあるいは他方のメンバーとして機能し得る物質の他の例としては、乱用薬物が挙げられる。乱用薬物には、例えば、以下の薬物およびその代謝産物（例えば、血中、尿中、および他の生体物質中に存在する代謝産物）のリスト、ならびにその任意の塩、エステル、またはエーテル：ヘロイン、モルヒネ、ヒドロモルホン、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、フェンタニル、デメロール、メタドン、ダーボン、スタドル、タルウィン（talwin）、パレゴリック、ブプレネックス；例えば、アンフェタミン、メタンフェタミンなどの興奮剤；メチルアンフェタミン、エチルアンフェタミン、メチルフェニデート、エフェドリン、プソイドエフェドリン、エフェドラ、マハング（ma huang）、メチレンジオキシアンフェタミン（ＭＤＳ）、フェンテルミン、フェニルプロパノールアミン；アミフェナゾール、ベミグライド（bemigride）、ベンズフェタミン、ブロマタン、クロルフェンテルミン、クロプロパミド、クロテタミド、ジエチルプロピオン、ジメチルアンフェタミン、ドキサプラム、エタミバン、フェンカムファミン、メクロフェノキサート、メチルフェニデート、ニケタミド、ペモリン、ペンテトラゾール、フェンジメトラジン、フェンメトラジン、フェンテルミン、フェニルプロパノールアミン、ピクロトキシン、ピプラドール、プロリンタン、ストリキニーネ、シネフリン、フェンシクリジンおよびエンジェルダストＰＣＰ、ケタミンなどの類似体；例えば、バルビツレート、グルテチミド、メタカロン、およびメプロバメート、メトヘキシタール、チアミル、チオペンタール、アモバルビタール、ペントバルビタール、セコバルビタール、ブタルビタール、ブタバルビタール、タルブタール（talbutal）、そしてアプロバルビタール、フェノバルビタール、メフォバルビタールなどの抑制剤；例えば、エスタゾラム、フルラゼパム、テマゼパム、トリアゾラム、ミダゾラム、アルプラゾラム、クロルジアゼポキシド、クロラゼペート、ジアゼパム、ハラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、プラゼパム、クアゼパム、クロナゼパム、フルニトラゼパムなどのベンゾジアザペン類（benzodiazapenes）；ガンマヒドロキシル酪酸やガンマブチロラクトンなどのＧＢＨ薬；グルテチミド、メタカロン、メプロバメート、カリソプロドール、ゾルピデム、ザレプロン；テトラヒドラカンナビノール（tetrahydracannabinol）および類似体などのカンナビノイド薬；コカイン、３－４メチレンジオキシメタンフェタミン（ＭＤＭＡ）；例えば、メスカリンとＬＳＤなどの幻覚剤が含まれる。

実施例１：高用量ビオチン摂取後のビオチン干渉枯渇
内因性（非スパイク）ビオチン試料を連続的に収集した。ベースライン血清試料を、５名の見かけ上健康な成人ボランティア（４男性、１女性）から、ＢＤブランドＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）１０ｍＬ赤トップチューブ内の肘前静脈採血によって得た。その後、各ボランティアは、２０ｍｇ用量のビオチン（４×５ｍｇ、Ｆｉｎｅｓｔ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｂｉｏｔｉｎ ５０００ ｍｃｇ Ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｑｕｉｃｋ Ｄｉｓｓｏｌｖｅ、商品番号９３８５０８、Ｗａｌｇｒｅｅｎｓによって販売されている）を摂取した。ビオチン摂取の１、３、６、８、および２４時間後に血清試料を得た。血液を室温で１時間凝固させ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ卓上遠心分離機で２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。各時点について、各ボランティアからの血清試料をプールし、室温で１５分間混合し、２ｍＬクライオバイアル中の１．２ｍＬのアリコートにアリコートし、－８０℃で凍結した。

ビオチン代謝は、遊離ビオチンＥＬＩＳＡを使用して、連続的に収集した試料中のビオチンレベルを測定することによって決定した。ビオチン血清試料を、Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ＩＤＫ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ ＥＬＩＳＡキット（部品番号Ｋ８１４１、ロット番号１８０９０６、測定範囲４８．１～１１００ｐｇ／ｍＬ）によって試験した。キットの測定範囲を上回る試料をキットの試料希釈緩衝液で希釈した。ビオチン摂取の１、３、６、および８時間後に収集した試料は、５０，０００～５００，０００ｐｇ／ｍＬの範囲にあると仮定し、１：１０００に希釈した。ビオチン摂取の２４時間後に収集した試料は、２０，０００ｐｇ／ｍＬ付近またはそれ未満であると仮定し、１：２０に希釈した。試料をＥＬＩＳＡキットプロトコルに従って試験したところ、ビオチン濃度は、２０ｍｇのビオチン摂取の８時間後（６０～１０７ｎｇ／ｍＬ；ｎ＝５）および２４時間後（２４～３２ｎｇ／ｍＬ；ｎ＝４）に依然として有意に上昇していた（図４および表１）。

ストレプトアビジン（ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｂｉｏｔｉｎ試薬）でコーティングした超常磁性ナノ粒子を用いて連続的に収集した血清試料から高レベルの内因性ビオチン（３７０または５５０ｎｇ／ｍＬ）は、２００μＬの血清を１．５ｍＬマイクロ遠心管に添加し、２０μＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｂｉｏｔｉｎ試薬を添加し、試料を１０分間穏やかに混合／揺動させ、Ｄｅｘｔｅｒ ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）１．５Ｓを用いてＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｂｉｏｔｉｎ試薬を１０分間磁気的に分離し、磁性粒子の破壊を回避するために血清を慎重に吸引し、遊離ビオチンＥＬＩＳＡを用いて血清試料を試験することによって、枯渇させた。

第１の研究では、同じ高ビオチン（３７０ｎｇ／ｍＬ）内因性血清試料の異なるアリコートに漸増量（ｍｇ）のＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｂｉｏｔｉｎ試薬を添加して、試料中の遊離ビオチンの１００％を枯渇させるのに必要な試薬の量を決定した。２０μＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｂｉｏｔｉｎ試薬（直径２３０ｎｍ、ビーズ１ｍｇあたり３２μｇのストレプトアビジン）を、２０ｍｇのビオチン摂取の１時間後に収集した血清試料の各２００μＬアリコートに添加し、室温で１０分間穏やかに反転させることによって混合し、Ｄｅｘｔｅｒ ＬｉｆｅＳｅｐ １．５Ｓ磁石を使用して１０分間磁気的に分離した。１７５μＬの血清上清を慎重に吸引し、Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ＩＤＫ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ ＥＬＩＳＡキット（部品番号Ｋ８１４１、ロット番号１８０９０６）によって測定し、キットの測定範囲を超える試料をキットの試料希釈緩衝液で希釈した。２３０ｎｍのＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｂｉｏｔｉｎ試薬は、単純な２０分間のプロセス、２００μＬの試料、およびわずか０．３９ｍｇの試薬を使用して、１００％の遊離ビオチンを首尾よく枯渇させた（図５）。

第２の研究では、同じ高ビオチン（５５０ｎｇ／ｍＬ）血清試料の異なるアリコートに漸増量（ｍｇ）の２つの異なるＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｂｉｏｔｉｎ試薬を、添加して、試料中の遊離ビオチンの１００％を枯渇させるのに必要な各試薬の量を決定した。２０μＬの２３０ｎｍ ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｂｉｏｔｉｎ試薬（ビーズ１ｍｇ当たり３２μｇのストレプトアビジン）または２０μＬの５５０ｎｍ ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｂｉｏｔｉｎ試薬（ビーズ１ｍｇ当たり４μｇのストレプトアビジン）を、５０ｍｇのビオチン摂取の１時間後に収集した血清の各２００μＬアリコートに添加し、室温で１０分間穏やかに反転させることによって混合し、Ｄｅｘｔｅｒ ＬｉｆｅＳｅｐ １．５Ｓ磁石を使用して１０分間磁気的に分離した。１７５μＬの血清上清を慎重に吸引し、Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ＩＤＫ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ ＥＬＩＳＡキット（部品番号Ｋ８１４１、ロット番号１８０９０６）によって測定し、キットの測定範囲を超える試料をキットの試料希釈緩衝液で希釈した。２３０ｎｍ ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｂｉｏｔｉｎ試薬は、単純な２０分間のプロセス、２００μＬの試料、および０．７５ｍｇの試薬のみを使用して、１００％の遊離ビオチンを首尾よく枯渇させたが、５５０ｎｍ ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｂｉｏｔｉｎ試薬は、１．８６ｍｇの試薬を使用して、８９％の遊離ビオチンのみを枯渇させた。これらの結果は、ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｂｉｏｔｉｎ試薬の結合容量および結合効率が、ストレプトアビジンの量およびビーズ１ｍｇ当たりのビオチン結合容量を増加させることにより、および／またはＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｂｉｏｔｉｎ試薬の濃度または量（ｍｇ）を増加させて添加することにより、ビーズ直径をより小さくし単位質量当たりの表面積を増やすことで改善されることを実証している（図６）。

実施例２．血清試料中の高濃度の遊離ビオチンを結合および枯渇させるための最適化された試料前処理試薬を使用したビオチン干渉枯渇
６人のボランティア（２５歳～４６歳までの５人の明らかに健康な成人、１人の糖尿病２型 ６５歳）は、ＢＤブランドＶａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）１０ｍＬ赤トップチューブに、肘前静脈採血によってベースライン時に採取した空腹時血清試料を有していた。その後、各ボランティアは、２０ｍｇ、１００ｍｇまたは２００ｍｇの用量の処方箋不要の（ＯＴＣ）ビオチンを摂取した。２０ｍｇ用量については、ビオチン摂取の１、３、６、８、および２４時間後に血清試料を得た。１００および２００ｍｇ用量については、ビオチン摂取の１、６および２４時間後に血清試料を収集した。血液を室温で１時間凝固させ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ卓上遠心分離機で２，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。各時点およびビオチン用量について、各ボランティアからの血清試料をプールし、室温で１５分間混合し、２ｍＬクライオバイアル中の１．２ｍＬのアリコートにアリコートし、－８０℃で凍結した。すべての試料は、ワシントン大学、検査医学部門、１９５９ ＮＥ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｓｔｒｅｅｔ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ ９８１９５で、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳビオチン測定のために送られた。２０ｍｇの用量では、ビオチンレベルは１時間で最も高く［９６～１７９ｎｇ／ｍＬ］、６時間では５名すべてのボランティアが依然として１５ｎｇ／ｍＬ超［１７～３５］の血清ビオチンレベルを有し、８時間では５名のボランティアのうち４名が１５ｎｇ／ｍＬ超［１６～２８］の血清ビオチンレベルを有し、２４時間では、既知の糖尿病２型であるボランティア１が１５ｎｇ／ｍＬ超［１８］のビオチンレベルを有した（図７）。

１００および２００ｍｇ用量について、ビオチンレベルは、１００ｍｇ用量については２９４～４５９ｎｇ／ｍＬ、２００ｍｇ用量については６１０～８６１ｎｇ／ｍＬで１時間で最も高かった。６時間で、２０ｍｇまたは１００ｍｇのビオチンを摂取したボランティアは、２０ｍｇ用量では１７～３５ｎｇ／ｍＬ、２００ｍｇ用量では９５～３４７ｎｇ／ｍＬの１５ｎｇ／ｍＬ超の血清ビオチンレベルを有していた。２４時間で、１００ｍｇのビオチンを摂取した２名のボランティアは、１５ｎｇ／ｍＬを超えるビオチンレベルを有し、糖尿病であることが知られているボランティア１は８４ｎｇ／ｍＬ、ボランティア６は５４ｎｇ／ｍＬであった（図８）。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（図９）によって測定して高い内因性ビオチンレベル［２９４～８６１ｎｇ／ｍＬ］を有する４つの試料を選択した。ベースライン血清試料を、ＰＴＨ Ｉｎｔａｃｔ ＥＬＩＳＡ（ＤＲＧ ＰＴＨインタクトＥＬＩＳＡ、パート番号ＥＩＡ－３６４５）によって試験し、ＰＴＨ値は２８．１から５０．３ｐｇ／ｍＬの範囲であった。ビオチン摂取後１時間の試料はすべて、ＰＴＨ結果が１．５７ｐｇ／ｍＬ未満、または検出下限未満（ＬＬＤ）であった（図１０）。

４つすべての試料を、ストレプトアビジン（ＶｅｒａＰｒｅｐ Ｂｉｏｔｉｎ）でコーティングされた最適化された５５０ｎｍの超常磁性ナノ粒子で前処理し、試料１および４は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって５００ｎｇ／ｍＬ未満のビオチンレベルを有し、０．５ｍｇの試薬で前処理し、かつ試料２および３は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって５００ｎｇ／ｍＬ超のビオチンレベルを有し、以下のプロトコルを使用して１．５ｍｇの試薬で前処理した。
１．ＶｅｒａＰｒｅｐ Ｂｉｏｔｉｎ試薬バイアルを貯蔵庫から取り出し、中速で最低１０秒間ボルテックスしてよく混合し、試薬を再懸濁する。
２．試薬バイアルをフォームバイアルホルダーに挿入する。
３．管のカラー（collar）が磁石フレームに接触するまで、空のマイクロ管２ｍｌ（ＳＡＲＳＥＤＴ Ｏｒｄｅｒ Ｎｕｍｂｅｒ ７２．６９４）をＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）１．５Ｓ磁石に挿入する。
４．２００μＬ（０．５ｍｇ）または６００μＬ（１．５ｍｇ）のよく混合した試薬を空の管に分注して、磁石上の試薬を３０秒超の間分離して試薬ペレットを形成する。
５．試薬ペレットを乱すことなく、すべての保存緩衝液上清（約２００μＬまたは約６００μＬ）を慎重に吸引し、廃棄する。
６．４００μＬのよく混合された血清または血漿試料を、試薬ペレットを含む管に分注する。
７．管のキャップのねじを締め、管を磁石から取り外し、中速で最低１０秒間ボルテックスしてよく混合し、試料中に試薬を再懸濁する。
８．管を検査室用ミキサー上に中速で置き、室温で１０分間インキュベートする。
９．ねじキャップを緩め、管のカラーが磁石フレームに接触するまで管を磁石に挿入する。
１０．試薬を４分超の間磁気的に分離して試薬ペレットを形成する。
１１．試薬ペレットを乱すことなく試料上清を慎重に吸引し、試験のために試料を移送管に分注する。注意：この工程を慎重に行う場合、すべての試料上清（約４００μＬ）を吸引することができる。試薬のいずれかが誤って吸引された場合、試料／試薬混合物を管に戻し、工程１０に戻るだけである。
１２．試料は、試験の準備ができている。

ビオチン干渉除去を検証するために、Ｉｍｍｕｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ ＩＤＫ（登録商標）Ｂｉｏｔｉｎ ＥＬＩＳＡキット（部品番号Ｋ８１４１、測定範囲４８．１～１，１００ｎｇ／Ｌ）を使用して、ＶｅｒａＰｒｅｐ Ｂｉｏｔｉｎ前処理試料を試験した。ビオチン濃度は、０．２～１．０ｎｇ／ｍＬの範囲、または正常な血漿レベル内（２００～１，２００ｎｇ／Ｌ）であった（図９）。試料１～４のＶｅｒａＰｒｅｐ Ｂｉｏｔｉｎ前処理の直後に、ＰＴＨ Ｉｎｔａｃｔ ＥＬＩＳＡを用いてＰＴＨ値を測定し、ＰＴＨ値は２６．７～５２．０ｐｇ／ｍＬの範囲であった（図１０）。

ビオチン摂取後１時間の試料は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳあたり高レベルのビオチン干渉（２９４～８６１ｎｇ／ｍＬ）およびＰＴＨ Ｉｎｔａｃｔ ＥＬＩＳＡによる検出不能なＰＴＨ値（１．５７ｐｇ／ｍＬ未満）を有していたが、ＶｅｒａＰｒｅｐ Ｂｉｏｔｉｎで前処理したビオチン摂取後１時間の試料は、Ｂｉｏｔｉｎ ＥＬＩＳＡキットあたりの生理学的に正常なビオチン値（１．１ｎｇ／ｍＬ未満）およびＰＴＨ Ｉｎｔａｃｔ ＥＬＩＳＡによる正常なＰＴＨ値（２６．７～５２．０ｐｇ／ｍＬ）を有していた（図９および１０）。ＶｅｒａＰｒｅｐビオチン試料処置前のＰＴＨ値をベースラインＰＴＨ値と比較すると、結果は９５～１１３％に回復した（１０５％の平均回復率）（図１０）。ＶｅｒａＰｒｅｐビオチン試料前処理後の試験結果の有意差、またはこのＰＴＨ Ｉｎｔａｃｔ ＥＬＩＳＡサンドイッチイムノアッセイにおけるＰＴＨ値の有意な増加は、ビオチン干渉が試験した４つすべての試料で臨床的に有意であったことを裏付けている。

実施例３：低存在量バイオマーカー富化
ストレプトアビジンでコーティングし、続いてビオチン化抗ＴＳＨ抗体（ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＴＳＨ試薬）またはビオチン化抗ＰＴＨモノクローナル抗体（ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＰＴＨ試薬）でコーティングした５５０ｎｍの超常磁性ナノ粒子を使用して、０．０１９５μＩＵのＴＳＨ／ｍＬまたは０．４９７ｐｇのＰＴＨ／ｍＬ）のいずれかの４０ｍＬのＰＢＳ中の非常に低レベルのバイオマーカーを富化した。

第１の研究では、５５０ｎｍのＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｂｉｏｔｉｎをビオチン化抗ＴＳＨ捕捉抗体でコーティングすることによって、ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＴＳＨ試薬を調製した。０．０８ｍＬのＴＳＨ抗原（１０μＩＵ／ｍＬ ＥＬＩＳＡキャリブレーター）を、ＤＲＧ ＴＳＨ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡ（部品番号ＥＩＡ－１７９０、ロット番号ＲＮ ５８８４９）の機能的感度（０．０５４μＩＵ／ｍＬ未満）より低い４１ｍＬのＰＢＳ緩衝液で０．０１９５μＩＵ／ｍＬに希釈し、１ｍＬをベースライン試料として保存した（富化前）。４０ｍＬの試料を、ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＴＳＨプロトコルを用いて処理して、その後のＴＳＨ ＥＬＩＳＡ試験のための１．０ｍＬの富化試料を作製した。

１０μＩＵ／ｍＬのＴＳＨ標準液８０μＬを４１．０ｍＬのＰＢＳ中で０．０１９５μＩＵ／ｍＬに希釈し、１．０ｍＬをベースライン試料として保存する（富化前）。
１．８０μＬの１０μＩＵ／ｍＬのＴＳＨ標準液を対照としての１．０ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｌｅａｖｅ中０．８０μＩＵ／ｍＬに希釈する
２．ＰＢＳ中４０ｍＬの０．０１９５μＩＵ／ｍＬのＴＳＨを５０ｍＬファルコン管に添加する
３．ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＴＳＨを添加し、混合する
４．混合しながら室温で６０分間インキュベートする
５．Ｄｅｘｔｅｒ ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）５０ＳＸを使用してＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＴＳＨを６０分間磁気的に分離する
６．４０ｍＬのＰＢＳをデカントし廃棄物へと廃棄する
７．４．０ｍＬのＰＢＳ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、混合する
８．Ｄｅｘｔｅｒ ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）５０ＳＸを使用して４ｍＬのＰＢＳ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ中のＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＴＳＨを３０分間磁気的に分離する
９．４ｍＬのＰＢＳをデカントして廃棄物へと廃棄する
１０．１ｍＬのＰＢＳ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、混合する
１１．１ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＴＳＨを１．７５ｍＬ円錐底スナップキャップバイアルに移す。
１２．Ｄｅｘｔｅｒ ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）１．５Ｓを使用して、１ｍＬのＰＢＳ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ中のＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＴＳＨを１０分間磁気的に分離する。
１３．１ｍＬのＰＢＳを吸引して廃棄物へと破棄する
１４．１ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｌｅａｖｅを添加し、混合する
１５．Ｄｅｘｔｅｒ ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）１．５Ｓを用いて１ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｌｅａｖｅ中のＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＴＳＨを、１０分間磁気的に分離する。
１６．１ｍＬの上清（富化試料）を吸引して保存し、対照、ベースライン試料および富化試料を試験する。

０．０８ｍＬのＴＳＨ抗原（１０μＩＵ／ｍＬ ＥＬＩＳＡキャリブレーター）も、対照としてＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｌｅａｖｅ緩衝液で１ｍＬにして０．８００μＩＵ／ｍＬに希釈した。ベースライン試料、富化試料、および対照をＤＲＧ ＴＳＨ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡによって試験し、富化試料のＴＳＨ％回収率を［富化試料の結果］／［対照の結果］×１００％として計算した。予想通り、希釈されたＴＳＨベースライン試料は、Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ＥＬＩＳＡによって検出不能であり、０．００μＩＵ／ｍＬを読み取った。０．８０ｍｇの試薬のみを使用して、ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＴＳＨは、検出不能から０．７３μＩＵ／ｍＬまで希釈されたＴＳＨを首尾よく富化した（表２）。対照と比較して、これは９８．６％の回収率であったが、アッセイシグナルを抑制したＴＳＨ ＥＬＩＳＡにおけるＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｌｅａｖｅ緩衝液のマトリックス効果があった可能性がある（表３）。

第二の研究では、ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＰＴＨ試薬を、ビオチン化抗ＰＴＨ捕捉抗体で５５０ｎｍのＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｂｉｏｔｉｎをコーティングすることによって調製した。０．０２１ｍＬのＰＴＨ抗原（９７１ｐｇ／ｍＬ ＥＬＩＳＡキャリブレーター）を、ＤＲＧ ＰＴＨ（副甲状腺）Ｉｎｔａｃｔ ＥＬＩＳＡ（部品番号ＥＩＡ－３６４５、ロット番号２８９６）の機能的感度（１．５６ｐｇ／ｍＬ未満）未満で４１ｍＬのＰＢＳ緩衝液中で０．４９７ｐｇ／ｍＬに希釈し、１ｍＬをベースライン試料として保存した（富化前）。４０ｍＬの試料を、ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＰＴＨプロトコルを用いて処理して、その後のＰＴＨ ＥＬＩＳＡ試験のための１．０ｍＬの富化試料を作製した。
１．９７１ｐｇ／ｍＬのＰＴＨ標準液２１μＬをＰＢＳで４１．０ｍＬにして０．４９７ｐｇ／ｍＬに希釈し、１．０ｍＬをベースライン試料として保存する（富化前）。
２．９７１ｐｇ／ｍＬのＰＴＨ標準液２１μＬを対照としてＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｌｅａｖｅで１．０ｍＬにして２０．４ｐｇ／ｍＬに希釈する。
３．ＰＢＳ中の４０ｍＬの０．４９７ｐｇ／ｍＬ ＰＴＨを５０ｍＬファルコン管に添加する
４．ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＰＴＨを添加し、混合する
５．混合しながら室温で３０分間インキュベートする
６．Ｄｅｘｔｅｒ ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）５０ＳＸを使用してＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＰＴＨを１５分間磁気的に分離する。
７．４０ｍＬのＰＢＳをデカントして廃棄物へと廃棄する
８．４．０ｍＬのＰＢＳ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、混合する
９．Ｄｅｘｔｅｒ ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）５０ＳＸを使用して４ｍＬのＰＢＳ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ中のＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＰＴＨを１０分間磁気的に分離する。
１０．４ｍＬのＰＢＳをデカントして廃棄物へと廃棄する
１１．１ｍＬのＰＢＳ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、混合する
１２．１ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＰＴＨを１．７５ｍＬ円錐底スナップキャップバイアルに移す
１３．Ｄｅｘｔｅｒ ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）１．５Ｓを使用して、１ｍＬのＰＢＳ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ中のＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＰＴＨを１０分間を磁気的に分離する。
１４．１ｍＬのＰＢＳを吸引して廃棄物へと破棄する
１５．１ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｌｅａｖｅを添加し、混合する
１６．Ｄｅｘｔｅｒ ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）１．５Ｓを使用して、１ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｌｅａｖｅ中のＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＰＴＨを１０分間磁気的に分離する。
１７．１ｍＬの上清（富化試料）を吸引して保存し、対照、ベースライン試料および富化試料を試験する。

０．０２１ｍＬのＰＴＨ抗原（９７１ｐｇ／ｍＬ ＥＬＩＳＡキャリブレーター）も、対照としてＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｌｅａｖｅ緩衝液で１ｍＬにして２０．４ｐｇ／ｍＬに希釈した。ベースライン試料、富化試料および対照をＤＲＧ ＰＴＨ（副甲状腺）Ｉｎｔａｃｔ ＥＬＩＳＡによって試験し、富化試料のＰＴＨ％回収率を［富化試料の結果］／［対照の結果］×１００％として計算した。希釈ＰＴＨベースライン試料は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｌｅａｖｅ緩衝液のマトリックス効果のために１３．５ｐｇ／ｍＬを読み取った。このマトリックス効果は、アッセイシグナルの増強をもたらした。０．８０ｍｇの試薬のみを使用して、ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ ＰＴＨは、希釈したＰＴＨを４２．３ｐｇ／ｍＬまで首尾よく富化した（表４）。対照と比較して、これは１０９％の回収率であった（表５）。

実施例４：後続の質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳまたはＭＡＬＤＩ－ＭＳ）による分析のための尿からの低存在量バイオマーカー富化
以下に、バイオマーカーに特異的な捕捉部分でコーティングされた超常磁性ナノ粒子を使用して、大量の尿試料から低存在量バイオマーカーおよびスパイクした内部標準（ＩＳＴＤ）を富化するための質量分析試料前処理プロトコルを記載する。全く同じプロトコルはまた、同じ試料からの１を超えるバイオマーカーおよび対応するスパイクされたＩＳＴＤを多重化および富化するために、各集団が異なる捕捉部分でコーティングされている、一緒に混合またはプールされた複数の異なる超常磁性ナノ粒子集団を使用することもできる。２またはそれを超えるバイオマーカーの富化および特性評価は、単一のバイオマーカーの特性評価では不可能な疾患の臨床診断および／または予後のためのアルゴリズムの使用を容易にする。例えば、尿からの閉塞性睡眠時無呼吸（ＯＳＡ）の診断のために、ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ試薬は、カリクレイン－１、ウロモジュリン、ウロコルチン－３およびオロソムコイド－１を捕捉して富化するための４つの異なる抗体、またはカリクレイン－１、ウロモジュリン、ウロコルチン－３およびオロソムコイド－１、ＩＬ－６、ＩＬ－１０および高感度Ｃ反応性タンパク質を捕捉して富化するための７つの異なる抗体を含み得る。
１．患者の尿を収集する（尿収集カップなどの標準的な尿収集プロトコルを使用する）
２．尿収集試料を混合する
３．４０ｍＬの尿を５０ｍＬのファルコン管に添加する
４．富化するバイオマーカーのための重水素化内部標準を添加し、混合する
５．ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎを添加し、混合する
６．ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを添加し、混合する
７．インキュベート：バイオマーカー＋ＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅによる重水素化内部標準捕捉
８．Ｄｅｘｔｅｒ ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）５０ＳＸを使用した４０ｍＬ尿中のＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを磁気的に分離する。
９．尿を吸引して廃棄物へと破棄する
１０．４ｍＬのＰＢＳ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを添加し、混合する
１１．Ｄｅｘｔｅｒ ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）５０ＳＸを使用して、４ｍＬのＰＢＳ Ｗａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒ中のＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを磁気的に分離する。
１２．尿を吸引して廃棄物へと破棄する
１３．工程１２をさらに２回繰り返す（２Ｘ）
１４．１ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｌｅａｖｅを添加し、混合する（質量分析適合緩衝液）。
１５．Ｄｅｘｔｅｒ ＬｉｆｅＳｅｐ（登録商標）１．５Ｓを使用して、１ｍＬのＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｌｅａｖｅ中のＶＥＲＡＰＲＥＰ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅを磁気的に分離する。
１６．ＬＣ－ＭＳによって１ｍＬの上清試料を吸引し、試験する
１７．１）４０ｍＬの尿試料サイズ、２）バイオマーカーのＬＣ－ＭＳ定量、および３）重水素化内部標準回収率に基づいて報告されたバイオマーカー値を調整することに基づいて決定された最終バイオマーカー濃度

捕捉され富化された１つまたは複数のバイオマーカーの選択的放出または切断は、ｐＨの変化（酸性ｐＨ、例えばグリシンｐＨ２．５の溶出とそれに続く中和、またはアルカリ性ｐＨ１０．０またはそれを超える）によって、ＴＣＥＰまたはＤＴＴなどの還元剤で切断されたジスルフィド結合などの切断可能なリンカーを使用して、またはモル過剰のＤ－ビオチンと単量体アビジン、またはコンカナバリンＡ上の結合部位について競合するモル過剰の糖とコンカナバリンＡなどの競合的溶出を使用することにより、達成することができる。

実施例５．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体アッセイ
このアッセイは、受容体結合ドメインとＮ末端ドメインの両方を認識するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を単離し、定量する。それは、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭを別々に定量する。以下で行うように、血清抗体をアッセイしたが、この手順は、唾液抗体をアッセイするために経口食塩水リンスで行うこともできる。アッセイでは、試料を最初に洗浄して潜在的な異好性干渉を除去し、抗体をビーズ（微粒子）上に捕捉し、検出試薬と反応させ、捕捉された抗体（依然として検出試薬によって結合されている）をビーズから溶出させ、上清を定量のために移す。アッセイは、手動または自動で行うことができる。アッセイのための一般化された手順には、以下が含まれる。

１．プレートウォッシャを洗浄／ブロッキング緩衝液でプライミングする
ａ．最初に水で３０分間音波処理する。

２．すべての試薬を調製する
ａ．すべてのビーズは、使用のために均質になるように混合され、ロッカー上にあるべきである。

３．プレートコンディショニング－ウェル表面への例えば免疫グロブリンの非特異的結合を阻止するために、ＴＴＡ（トリス緩衝食塩水、０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０（ポリソルベート２０）、０．０５％アジド、ｐＨ７．４）中０．０２３％（ｗ／ｖ）Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ１０８（ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロック－ポリ（エチレングリコール）、トリブロックコポリマー）の洗浄緩衝液で、一対の透明な丸底９６ウェルマイクロタイタープレートを洗浄する。一方の丸底プレートは「洗浄」プレートとして機能し、他方は「捕捉」プレートとして機能する。

４．異好性干渉を除去するための分析前試料清浄。
ａ．遠心分離の混合なしで、冷蔵貯蔵庫からの試料を直接使用する。いかなる脂質も直接ピペッティングすることを避ける。
ｂ．ブロックされた丸底プレートに、「清浄」プレートレイアウト中の６０μＬの各試料を添加する。
ｃ．すべての試料を添加したら、マルチチャンネルピペットを使用して、試料を含むすべてのウェルに１４０μＬの清浄なビーズ（ウサギＩｇＧ、ヒトＩｇＧ、ストレプトアビジン、および／またはビーズ自体に特異的な異好性干渉を捕捉および除去するための、３６μｇのウサギＩｇＧ－ビオチン－ストレプトアビジンビーズと４μｇのヒトＩｇＧ－ビオチン－ストレプトアビジンビーズとの混合物）を添加する。
ｉ．注意：ベースの、清浄なビーズで使用される１．６ミクロン超常磁性磁気ストレプトアビジンビーズは、捕捉ビーズで使用される、全く同じベースの１．６ミクロン超常磁性ストレプトアビジンビーズである。このようにして、捕捉ビーズを用いて清浄な試料を試験する前に、ベースのストレプトアビジンビーズに特異的な任意の異好性干渉が試料から除去される。
ｄ．プレートウォッシャ中で振盪しながら３７℃で１５分間インキュベートする。
ｉ．速い設定での軌道振盪、４２５ｃｐｍ
ｅ．磁石上に４分間置く。
ｉ．例えば、Ａｌｐａｑｕａ Ｃａｔａｌｙｓｔ ９６、部品番号Ａ０００５５０。

５．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１－ＲＢＤまたはＳ１－ＮＴＤに特異的なＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡの検出および多重定量のための中和抗体の捕捉。
ａ．マルチチャンネルピペットを使用して、５０μＬの洗浄した試料をブロッキングした捕捉プレート（透明な平底）に移す。
ｂ．マルチチャンネルピペットを用いて１５０μＬの捕捉ビーズ（ＲＢＤまたはＮＴＤに特異的なヒト免疫グロブリンＩｇＡ、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭを捕捉するために使用される３０μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１－ＲＢＤ－ビオチン－ストレプトアビジンビーズと１０μｇのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓ１－ＮＴＤ－ビオチン－ストレプトアビジンビーズとの混合物）を各ウェルに添加する。
ｉ．同じ体積の捕捉ビーズを空のウェルに添加して、捕捉ビーズブランクとして機能させる。
ｉｉ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイク糖タンパク質（Ｓ１）ＲＢＤ（Ｈｉｓタグあり、ＨＥＫ２９３で作製；Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐａｒｔ．Ｎｏ．ＲＥＣ３１８８２）。
ｉｉｉ．ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＮＴＤ（Ｈｉｓタグあり、ＨＥＫ２９３で作製；Ｔｈｅ Ｎａｔｉｖｅ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｐａｒｔ．Ｎｏ．ＲＥＣ３１９０５）。
ｃ．それぞれ異なるキャリブレーターレベルを含むプレートの６つのウェルに、６０μＬの３重キャリブレータービーズを添加する（下記参照）。
ｉ．３重キャリブレータービーズを加えながらプレートを磁石上にセットし、各キャリブレーターを分注するときにチップを「リンス」する。
ｄ．プレートリーダーで振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
ｉ．速い設定での軌道振盪、４２５ｃｐｍ。
ｅ．プレートウォッシャで３回洗浄する。
ｉ．２分間の初期／振盪工程。

６．捕捉された抗体の多重標識。
ａ．ウェルあたり２００μＬの３重コンジュゲートを添加する。
ｉ．マルチチャンネルピペット上の同じ８チップのセットを使用して、プレート全体のすべてのウェルにコンジュゲートを添加することができる。
ｉｉ．すべてのウェルにコンジュゲートを入れたら、戻して５回上下にピペッティングしてウェルを完全に混合する（マルチチャンネルピペットを使用するが、各列には新しいチップを用意する）。
ｉｉｉ．３重コンジュゲートは、コンジュゲート緩衝液（ＴＴＡ中０．１％ＢＳＡ）中の、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－４８８とコンジュゲートした０．００２ｍｇ／ｍｌのポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＭ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－５５５とコンジュゲートした０．００２ｍｇ／ｍｌのポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＧ、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－６４７とコンジュゲートした０．００２ｍｇ／ｍｌのポリクローナルウサギ抗ヒトＩｇＡである。
ｂ．プレートリーダーで振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートする。
ｉ．速い設定での軌道振盪、４２５ｃｐｍ。
ｃ．プレートウォッシャで３回洗浄する。
ｉ．２分間の初期／振盪工程。

７．ビーズからの抗体－コンジュゲート複合体の溶出
ａ．３５．５Ｍｌの中和緩衝液（３００ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ１０．０）で透明底の黒色プレート（ブロックされていない）上のウェルを予め充填する。
ｂ．捕捉プレートをプレートウォッシャから取り外す。
ｃ．２２０μＬの溶出緩衝液（１００ｍＭグリシン、ｐＨ２．５）を添加する。
ｉ．マルチチャンネルピペット上の同じ８チップのセットを使用して、プレート全体のすべてのウェルにコンジュゲートを添加することができる。
ｉｉ．すべてのウェルに溶出緩衝液を入れたら、戻して５回上下にピペッティングしてウェルを完全に混合する（マルチチャンネルピペットを使用するが、各列には新しいチップを用意する）。
ｄ．磁石上に２分間置く。
ｅ．マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルの２００ｕＬを（工程７ａの）黒色の透明な平底読み取りプレートに移す。

８．プレートリーダーで蛍光を読み取る。

トリプレックスキャリブレータービーズは、以下の４つの構成要素から組み立てられる。
・ストレプトアビジンで共有結合的に修飾され、ビオチン化ヒトＩｇＡと反応する１．６μｍ磁気ビーズ（親和性精製）、
・ストレプトアビジンで共有結合的に修飾され、ビオチン化ヒトＩｇＧと反応する１．６μｍ磁気ビーズ（親和性精製）、
・ストレプトアビジンで共有結合的に修飾され、ビオチン化ヒトＩｇＭと反応する１．６μｍ磁気ビーズ（親和性精製）、
・Ｔｒｉｓでクエンチする１．６μｍ磁気ビーズ（カルボキシル）（ＴＲｉｓビーズ）、
それぞれ１０ｍｇ／ｍｌで保存したのは、ＴＴＡ中０．１％ＢＳＡのキャリブレータービーズ保存溶液である。

ビーズをキャリブレータービーズ保存溶液で１．００ｍｇ／ｍｌに希釈し、ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭビーズをＴｒｉｓビーズと以下の比：１００：０、７５：２５、５０：５０、２５：７５、１０：９０、および０：１００でそれぞれ別々にプールする。次いで、各非ゼロＩｇ較正レベルについて、ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭ混合物を１：１：１でプールして、３重キャリブレータービーズのセットを作製する。３重キャリブレータービーズをキャリブレータービーズ保存溶液中０．３ｍｇ／ｍｌの最終濃度で使用する。検量線を図１１に示す。

本質的に上記のようなプロトコルに従って、２０１８年１２月以前に収集した１４６個の血清試料を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体の存在について試験した。これは、ウイルスがヒト集団に出現するかなり前のものであったので、試料は陰性であると予想され、実際にこれが見出されたものである（表６参照）。

「診断ルーチン」は、定期的な診断試験後に残っている血清試料を指し、そこでは、ドナーの健康状態は知られていない。「供血者」は、健常ドナーからの供血から保存された試料を指す。これらの結果は、このアッセイが９５％というＦＤＡの緊急使用許可の特異性（FDA emergency use authorization Specificity）要件を満たすことを示している。

このアッセイを、ＰＣＲで確認されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を有する６３人の症候性患者について１２２個の試料を試験するためにも使用した。これらの試料は、症状発現日から採取した１またはそれを超える連続検体を含んでいた。結果を表７に示す。

これらの結果は、このアッセイが９０％というＦＤＡの緊急使用許可の感度要件を満たすことを示している。最初のアッセイで偽陰性結果を示したいくつかの試料は、後に収集された試料について陽性結果を示した（図１２）。２つまたは３つの連続試料があった多くの患者は経時的に同様のレベルの抗体を示したが、一部の患者は急速に増加または減少する抗体レベルを示した（図１３）。

実施例６．食塩水による口腔すすぎ液からのバイオマーカーの清浄および捕捉
１ｍＬ（１０００μＬ）の食塩水による口腔すすぎ液試料（５ｍＬの０．９％ＮａＣｌを２５秒間ゆすぎ、５秒間うがいをして、収集管に吐き出した＝５ｍＬ食塩水＋唾液試料、または食塩水中の唾液ベースの試料）を清浄にするために、以下の組成を有する２×または４×の清浄ビーズのいずれかを添加する。

１試験当たり２×清浄ビーズの場合：
２５ｕｇのウサギＩｇＧビーズ
２５ｕｇのＢＳＡビーズ
１０ｕｇの精製ヒトＩｇＡビーズ
１０ｕｇの精製ヒトＩｇＧビーズ
１０ｕｇの精製ヒトＩｇＭビーズ

１試験当たり４×清浄ビーズの場合：
５０ｕｇウサギＩｇＧビーズ
５０ｕｇのＢＳＡビーズ
２０ｕｇの精製ヒトＩｇＡビーズ
２０ｕｇの精製ヒトＩｇＧビーズ
２０ｕｇの精製ヒトＩｇＭビーズ

清浄化した１ｍＬの食塩水による口腔すすぎ液試料からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体を捕捉するために、５×または１０×捕捉ビーズを添加して、この量のＲＢＤおよびＮＴＤ捕捉ビーズを用いて、清浄な食塩水による口腔すすぎ液試料からの総中和免疫グロブリンを富化および捕捉する。

１試験当たり５×捕捉ビーズの場合：
１５０ｕｇのＲＢＤビーズ
５０ｕｇのＮＴＤビーズ

試験あたり１０×捕捉ビーズの場合：
３００ｕｇのＲＢＤビーズ
１００ｕｇのＮＴＤビーズ

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ ｍＲＮＡワクチンの（通常の２回のうちの）１回の投与を受けた３人の患者およびワクチン接種されていない３人の対象に対する１０×清浄ビーズおよび１０×捕捉ビーズを使用したアッセイの結果を表８に示す。これらのデータは、投与後わずか８日で収集され、この初期の時点でさえ、アッセイがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２中和抗体応答を検出（および定量）することができることを示している。（人は、一般に、ワクチンの２回目の投与の２週間後まで「完全にワクチン接種された」と見なされない。）

図から分かるように、患者２は３つすべてのアイソタイプのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的抗体のバックグラウンドレベルを超えており、ワクチン接種した３人すべての患者はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２特異的ＩｇＧのバックグラウンドレベルを超えている。

略語
ＡＢＥＩ Ｎ－（４－アミノブチル）－Ｎ－エチルイソルミノール
ＡＬＰ アルカリホスファターゼ
ＢＳＡ ウシ血清アルブミン
Ｆａｂ 断片抗体結合
Ｆｃ 断片、結晶化可能
ＨＡＡＡ ヒト抗動物抗体
ＨＡＭＡ ヒト抗マウス抗体
ＨＡＳＡ ヒト抗ヒツジ抗体
ＩＦＵ 使用説明書
ＩｇＧ 抗体または免疫グロブリン
ＩｇＭ 免疫グロブリンＭ
ＨＲＰ 西洋ワサビペルオキシダーゼ
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ 液体クロマトグラフィタンデム質量分析
ＬＤＴ 検査室開発試験
Ｍａｂ モノクローナル抗体
ＭＡＳＩ 製造アッセイ特異的干渉
ＭＦＧ ＩＶＤ製造業者
ＰＭＰ 超常磁性微粒子
ＰＢＣＴ 一次採血管
ＲＦ リウマチ因子
ＲＬＵ 相対光単位またはアッセイ応答シグナル
ＲＵＯ 研究使用のみ
ＳＡｖ ストレプトアビジン
ＳＴＴ 二次移送管
ＴＡＴ ターンアラウンドタイム
ＷＦ ワークフロー

定義
本明細書で使用される場合、「試料」または「生物学的試料」は、診断、予後、スクリーニング、リスク評価、リスク層別化、および治療薬モニタリングなどのモニタリングのために試験される任意のヒトまたは動物の血清、血漿（すなわち、ＥＤＴＡ、ヘパリンリチウム、クエン酸ナトリウム）、血液、全血、処理血液、尿、唾液、便（液体および固体）、精液もしくは精液、羊水、脳脊髄液、細胞、組織、生検材料、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または任意の流体、溶解した固体、または処理した固体材料を指す。いくつかの実施形態において、試料は大容量試料である。いくつかの実施形態において、試料は、複数の試料（例えば、同じまたは異なる対象からの２つ以上の試料）を含む。いくつかの実施形態において、試料は、試料中に低存在量で存在するバイオマーカーを含む。

いくつかの実施形態において、試料は、一次採血管（ＰＢＣＴ）、二次移送管（ＳＳＴ）、採血バッグ、２４時間（２４時間）尿採取デバイス、ベリコア管、ナノテイナー（nanotainer）、唾液採取管、血液スポット濾紙、または便および精液などの任意の採取管もしくはデバイス、ヘパリンナトリウム、ヘパリンリチウム、またはヘパリンアンモニウムを含有する薄緑トップまたは緑トップ血漿セパレータチューブ（ＰＳＴ）と、クエン酸ナトリウム（すなわち３．２％または３．８％）またはクエン酸塩、テオフィリン、アデノシン、ジピリダモール（ＣＴＡＤ）を含有する薄青トップチューブ、ガラス（添加剤なし）またはプラスチックチューブ（凝固活性剤を含む）中の血清を収集するための血清学または免疫血液学のための赤トップチューブ、ガラス（添加剤なし）またはプラスチックチューブ（凝固活性剤を含む）中の血清の収集のための化学用の赤トップチューブ、分子診断およびウイルス量検出において血漿を試験するためのＥＤＴＡ Ｋ２、ＥＤＴＡ Ｋ３、液体ＥＤＴＡ溶液（すなわち８％）、またはＥＤＴＡ Ｋ２／ゲルチューブを含有する紫ラベンダートップチューブ、血液バンクＥＤＴＡ用のピンクトップチューブ、シュウ酸カリウムおよびフッ化ナトリウム、フッ化ナトリウム／ＥＤＴＡ、またはフッ化ナトリウム（抗凝固剤がない場合、血清試料が得られる）を含有する灰トップチューブ、ＡＣＤ溶液ＡまたはＡＣＤ溶液Ｂを含有する黄トップチューブ、藤紫トップ（血清、添加剤なしまたはヘパリンナトリウム）、血液を採取するための添加剤または任意の添加剤もしくはそれらの組み合わせを含まない、任意の用途または診断試験タイプのための白トップチューブ、または任意の色もしくはチューブタイプに採取される。

いくつかの実施形態において、試料は、尿、２４時間尿、唾液および便などの困難な試料タイプであるか、または関心のあるバイオマーカーが希釈されているかもしくは測定が困難であり得る。例えば、生物学的試料は、患者集団（例えば、新生児の、小児の、老人の、妊婦の、腫瘍、自己免疫疾患）について困難であり得る。例えば、いくつかのバイオマーカーは、既存のＰＯＣＴ分析計および中央検査室分析計によって確実に検出され、正確かつ正確に測定されるには、例えば循環中、または尿中で、薄すぎるまたは低すぎる濃度ある。いくつかの実施形態において、困難な試料は脳脊髄液（ＣＳＦ）である。

本明細書で使用される場合、「採取デバイス」は、試料の添加前に、一次採血管（ＰＢＣＴ）、２４時間尿採取デバイス、尿採取デバイス、唾液収集管、便採取デバイス、精液採取デバイス、採血バッグ、または任意の試料収集管もしくはデバイスであり得る。

ＰＢＣＴおよび二次移送管（ＳＳＴ）は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（ＢＤ）、Ｇｒｅｉｎｅｒ、ＶＷＲおよびＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈのような会社からの任意の市販の標準またはカスタム収集管（ゲル分離器ありまたはなし）、ガラスチューブ、プラスチックチューブ、ヘパリンナトリウム、ヘパリンリチウム、またはヘパリンアンモニウムを含有する薄緑トップまたは緑トップ血漿セパレータチューブ（ＰＳＴ）と、クエン酸ナトリウム（すなわち３．２％または３．８％）またはクエン酸塩、テオフィリン、アデノシン、ジピリダモール（ＣＴＡＤ）を含有する薄青トップチューブ、ガラス（添加剤なし）またはプラスチックチューブ（凝固活性剤を含む）中の血清を収集するための血清学または免疫血液学のための赤トップチューブ、ガラス（添加剤なし）またはプラスチックチューブ（凝固活性剤を含む）中の血清の収集のための化学用の赤トップチューブ、分子診断およびウイルス量検出において血漿を試験するためのＥＤＴＡ Ｋ２、ＥＤＴＡ Ｋ３、液体ＥＤＴＡ溶液（すなわち８％）、またはＥＤＴＡ Ｋ２／ゲルチューブを含有する紫ラベンダートップチューブ、血液バンクＥＤＴＡ用のピンクトップチューブ、シュウ酸カリウムおよびフッ化ナトリウム、フッ化ナトリウム／ＥＤＴＡ、またはフッ化ナトリウム（抗凝固剤がない場合、血清試料が得られる）を含有する灰トップチューブ、ＡＣＤ溶液ＡまたはＡＣＤ溶液Ｂを含有する黄トップチューブ、藤紫トップ（血清、添加剤なしまたはヘパリンナトリウム）、血液を採取するための添加剤または任意の添加剤もしくはそれらの組み合わせを含まない、任意の用途または診断試験タイプのための白トップチューブ、または任意の色もしくは管タイプであり得る。

本明細書で使用される場合、「記憶デバイス」または「転送デバイス」は、採取デバイスに受け入れられた試料および／または他の構成要素を受け取るデバイスを指す。貯蔵または移送デバイスは、プラスチックまたはガラスチューブ、バイアル、ボトル、ビーカー、フラスコ、バッグ（例えば、採血バッグ、缶、マイクロタイタープレート、ＥＬＩＳＡプレート、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート １５３６ウェルプレート、キュベット、反応モジュール、リザーバ、または液体試料を保持、貯蔵または処理するのに適した任意の容器であり得る。
本明細書で言及される場合、「診断試験」には、それだけに限らないが、任意の抗体ベースの診断試験、非抗体ベースの診断試験、免疫抽出（ＩＥ）および固相抽出（ＳＰＥ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、分子診断、ラテラルフロー（ＬＦ）、ポイントオブケア（ＰｏＣ）、消費者直接取引（ＤＴＣ）、ＣＬＩＡおよびＣＬＩＡ除外試験およびデバイス、研究用途のみ（ＲＵＯ）試験、インビトロ診断（ＩＶＤ）試験、検査室開発試験（ＬＤＴ）、コンパニオン診断、ならびに診断、予後、スクリーニング、リスク評価、リスク層別化、および治療薬モニタリングなどの質量分析法（すなわち、ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＬＣＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によるその後の分析のための試料前処理方法またはデバイスが含まれる。いくつかの実施形態において、診断試験は、短いターンアラウンドタイム（ＳＴＡＴ）診断試験、外来検査、ラテラルフロー試験、ポイントオブケア（ＰｏＣ）試験、分子診断試験、ＨＰＬＣ、ＭＳ、ＬＣＭＳ、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、化学発光イムノアッセイ（ＣＬＩＡ）、ＣＬＩＡおよびＣＬＩＡ除外試験、ならびに診断、予後、スクリーニング、リスク評価、リスク層別化、処置モニタリングおよび治療薬モニタリングに使用される任意の診断試験を含む。

本明細書で使用される場合、病原体は、細菌、ウイルス、または疾患を引き起こし得る他の微生物である。

血清学は、血清および他の体液の科学的研究である。実際には、この用語は通常、血清中の抗体の診断的同定を指す。そのような抗体は、典型的には、感染（所与の微生物に対する）、他の外来タンパク質（例えば、不一致輸血に応答して、）、または自身のタンパク質（自己免疫疾患の場合）に応答して形成される。

最後に、本明細書の態様は特定の実施形態を参照することによって強調されているが、当業者は、これらの開示された実施形態が本明細書に開示された主題の原理の例示にすぎないことを容易に認識することを理解されたい。したがって、開示される主題は、本明細書に記載される特定の方法、プロトコル、および／または試薬などに決して限定されないことを理解されたい。したがって、本明細書の趣旨から逸脱することなく、本明細書の教示に従って、開示された主題の様々な修正もしくは変更または代替構成を行うことができる。最後に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではない。したがって、本発明は、正確に図示および説明されたものに限定されない。

本発明を実施するための本発明者らに知られている最良の形態を含む、本発明の特定の実施形態を本明細書に記載する。当然ながら、前記の説明を読めば、これらの記載された実施形態の変形形態が当業者には明らかになる。本発明者は、当業者がそのような変形形態を適切に使用することを期待しており、本発明者らは、本明細書に具体的に記載されている以外の方法で本発明が実施されることを意図している。したがって、本発明は、適用法によって許容されるように、添付の特許請求の範囲に列挙された主題のすべての修正および均等物を含む。さらに、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、上記の実施形態のすべての可能な変形形態の任意の組み合わせが本発明に包含される。

本発明の代替の実施形態、要素、または工程のグループ分けは、限定として解釈されるべきではない。各群メンバーは、個別に、または本明細書に開示される他の群メンバーと任意に組み合わせて参照および特許請求することができる。群の１またはそれを超えるメンバーは、利便性および／または特許性の理由から、群に含まれ得るか、または群から削除され得ることが予想される。そのような包含または削除が生じる場合、本明細書は、修正された群を含み、したがって添付の特許請求の範囲で使用されるすべてのマーカッシュ群の記載を満たすと見なされる。

特に明記しない限り、本明細書および特許請求の範囲で使用される特性、項目、量、パラメータ、特質、用語などを表すすべての数字は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、そのように限定された特性、項目、量、パラメータ、特質、または用語が、記載された特性、項目、量、パラメータ、特質、または用語の値の上下１０％の範囲を包含することを意味する。したがって、反対のことが示されない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、変化し得る近似値である。少なくとも、特許請求の範囲に対する均等論の適用を制限する試みとしてではなく、各数値表示は、報告された有効数字の数に照らして、通常の丸め技術を適用することによって少なくとも解釈されるべきである。本発明の広い範囲を示す数値範囲および値は近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示される数値範囲および値は可能な限り正確に報告される。しかしながら、任意の数値範囲または値は、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を本質的に含む。本明細書における値の数値範囲の列挙は、単に、その範囲内に入るそれぞれの別個の数値を個別に参照する簡略化した方法として役立つことを意図している。本明細書に別段の指示がない限り、数値範囲の個々の値は、あたかもそれが本明細書に個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。

本発明を説明する文脈（特に以下の特許請求の範囲の文脈）で使用される「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語および同様の指示対象は、本明細書で特に示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく明らかにすることを意図しており、特許請求される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいかなる言語も、本発明の実施に不可欠な特許請求されていない要素を示すと解釈されるべきではない。

本明細書に開示される特定の実施形態は、言語からなる、または本質的に言語からなることを使用して、特許請求の範囲においてさらに限定され得る。特許請求の範囲で使用される場合、出願時または補正によって追加されたかどうかにかかわらず、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という移行用語は、特許請求の範囲で指定されていない要素、工程、または成分を除外する。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という移行用語は、請求項の範囲を特定の材料または工程、ならびに基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。そのように特許請求される本発明の実施形態は、本明細書に本質的にまたは明示的に記載され、可能にされる。

本明細書において参照および特定されるすべての特許、特許刊行物、および他の刊行物は、例えば、本発明に関連して使用され得るそのような刊行物に記載されている組成物および方法論を説明および開示する目的で、その全体が参照により個別に明示的に本明細書に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示についてのみ提供される。この点に関するいかなるものも、本発明者らが先行発明によって、または他の理由でそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。これらの文書の日付に関するすべての記述または内容に関する表現は、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成しない。

Claims (23)

1. 生物学的試料から抗原特異的抗体を単離する方法であって、
   ａ）前記試料を、前記抗原特異的抗体のための捕捉部分を含む第１の粒子と組み合わせて、混合物を提供することと、
   ｂ）前記混合物を混合して、粒子複合体を前記バイオマーカーに提供することと、
   ｃ）前記生物学的試料から前記粒子を分離すること
   それによって、前記生物学的試料から前記抗体を単離することと、を含む、方法。
2. 前記粒子から前記抗原特異的抗体を解離させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 解離させることが、前記第１の粒子からの前記抗体の切断または溶出を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記放出された抗体を特性評価に供することをさらに含む、請求項３に記載の方法。
5. 特性評価が、検出可能な標識にコンジュゲートされた抗免疫グロブリン抗体と複合体を形成することを含む、請求項４に記載の方法。
6. 前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項５に記載の方法。
7. 前記抗原特異的抗体に関連するシグナルを免疫グロブリンの標準曲線と比較することをさらに含む、請求項４～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記抗免疫グロブリン抗体がアイソタイプ特異的ではない、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記抗免疫グロブリン抗体がアイソタイプ特異的である、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記アイソタイプ特異的抗免疫グロブリン抗体が、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＧ、および抗ＩｇＭのうちの少なくとも２つを含み、それぞれが異なる標識にコンジュゲートされた、請求項９に記載の方法。
11. 前処理をさらに含み、前記前処理は、
    ａ）生物学的試料を干渉のための捕捉部分を含む第２の粒子と組み合わせて混合物を提供することと、
    ｂ）前記混合物を混合して第２の粒子複合体を前記干渉に提供することと、
    ｃ）前記第２の粒子複合体を除去または排除して、枯渇溶液を提供することと、を含む、請求項１に記載の方法。
12. 前記捕捉部分がヒトおよび／または非ヒト動物免疫グロブリンを含む、請求項１１に記載の方法。
13. 前記捕捉部分がストレプトアビジンを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 前記第１および／または第２の粒子が凍結乾燥生成物として提供される、請求項１または１１に記載の方法。
15. 請求項１～３または１１～１４のいずれか一項に記載の方法によって作製された富化抗体。
16. 前記抗原特異的抗体が病原体特異的抗体である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 病原体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記捕捉部分がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質である、請求項１７に記載の方法。
19. 前記スパイクタンパク質が、Ｓ１サブユニット、またはその受容体結合ドメインおよび／またはＮ末端ドメインである、請求項１８に記載の方法。
20. 前記抗原特異的抗体が自己抗体である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記抗原特異的抗体が腫瘍抗原特異的自己抗体である、請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記抗原特異的抗体が外来タンパク質に対するものである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記抗原特異的抗体がヒト抗体である、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

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