KR20230035665A - Pva 막 고정화 효소 및 이의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 PVA 막 고정화 효소 및 이의 제조 방법을 제공한다. 상기 PVA 막 고정화 효소는 PVA 다공성 막 및 PVA 다공성 막에 포매된 효소를 포함하고, PVA 다공성 막은 3차원 구조화 PVA 다공성 막이며, 효소는 트랜스아미나제, D-락테이트 탈수소효소, 시클로헥사논 모노옥시게나제, 케토리덕타제, 엔-리덕타제, 니트릴라제, 암모니아 분해효소, 아미노산 탈수소효소, 이민 리덕타제, 알코올 탈수소효소, 포름산암모늄 탈수소효소, 포도당 1-탈수소효소, 및 이들의 돌연변이체 중 어느 하나로부터 선택된다. 3차원 구조화 PVA 다공성 막을 담체로 사용하여 효소를 포매 방식으로 고정화함으로써, 포매 및 고정화 프로세스가 간단하고, 조건이 온화하며, 비표면적이 크고, 효소는 PVA 다공성 막에 포매 및 고정화된 후 비교적 안정하여 사용 과정에서 쉽게 침출되지 않는다. 사용된 PVA 다공성 막의 다공성 구조는 반응물 및 생성물을 더 잘 전달할 수 있으므로, 연속 흐름 생화학 촉매 작용에 사용하기에 적합하고, 효소에 대한 광범위한 적용성을 갖는다.

Description

PVA 막 고정화 효소 및 이의 제조 방법
본 발명은 효소 고정화 기술분야에 관한 것으로, 구체적으로, PVA 막 고정화 효소 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
생체 촉매 작용은 화학 물질, 중간체, 정밀 화학 물질, 및 최종 약물 분자 제조 계획의 구성 요소로 되고 있다. 그러나, 공정 요구 사항이 계속 확장됨에 따라 효소 적용의 효율성과 경제성이 불가피해졌다. 따라서, 효소의 활성, 특이성, 및 생산성을 강화시켜야 할 뿐만 아니라 특히 상업적 규모의 적용을 위한 경제적 실행 가능성을 촉진하기 위해 저장 수명 및 재활용성도 향상시켜야 한다.
효소 고정화 플랫폼은 생산 과정에서 효소를 적절하게 통합하기 위한 우수한 도구를 제공한다. 수년에 걸쳐 여러 천연 및 합성 담체 쌍의 효소 고정화 효율이 평가되었는데, 예를 들어, 각 플랫폼은 적용성, 경제성, 및 이점에 따라 구체적으로 평가되었다. 고정화된 생체 촉매는 유기 합성, 오염 제어, 및 진단 목적 등의 분야에 광범위하게 적용된다(Enzyme Microb Technol, 31,171-8; J Pharm Sci, 89,979-90).
효소를 고체 담체 상에 또는 고체 담체 내에 고정시켜 고정화를 구현함으로써, 이질적인 고정화 효소 시스템을 얻는다. 효소는 물리적 방식(담체와 효소 간의 약한 상호작용) 및 화학적 방식(담체와 효소 간의 공유 결합 형성)(Analyst, 133,697-701; Chem Soc Rev, 40,2567-92; Berlin Heidelberg: Springer, 95-126.) 또는 이 둘의 조합을 포함한 다양한 방법으로 고정화될 수 있으며, 다양한 기능적 활성의 담체를 포함한다.
효소의 물리적 고정화 방법에는 막 또는 막 반응기 내에서 수불용성 기질에 대한 흡착(물리적, 이온), 예를 들어 메조다공성 재료에 대한 흡착, 포함(또는 겔 포매), 고체 막에 의한 미세 캡슐화, 액체 막에 의한 미세 캡슐화, 효소 Langmuir-Blodgett 막의 형성(Anal Chem, 1994; 66,1120A-7A) 등이 포함된다. 막 포매 또는 캡슐화의 경우, 얻은 효소 촉매는 친수성, 소수성, 반응성 작용기 밀도, 공극률, 기공 크기 분포, 막 두께, 반응기 구성 등과 같은 막 지지체의 성질에 따라 다르다. 고정화의 고정화 방법은 막 내 효소의 위치 결정을 기반으로 하며, 그 목적은 조작 조건에서 매우 안정적일 뿐만 아니라 효소의 더 높은 발현을 구현하는 것이다.
현재, 다공성 막을 이용한 효소의 고정화에 대한 연구가 많이 이루어지고 있으나, 효소의 구조와 활성 부위가 다르기 때문에 고정화 방법도 다른데, 예를 들어 PVA 막(폴리비닐알코올 막)을 사용하여 리파아제를 고정화하는 경우, 고정화에 의한 리파아제의 안정성과 활성을 개선시키는 목적을 달성하기 위해서는 가교에 글루타르알데히드를 사용해야 한다. 또한, 다공성 막을 이용하여 자일라나아제, 카탈라아제, 셀룰라아제, β-갈락토시다아제, 및 아스코르브산 산화효소 등의 효소계를 고정화할 경우, 일반적으로 아미노기, 카르복실기, 설프히드릴기, 히드록실기, 이미다졸기, 또는 페놀기 등과 같은 그룹을 이용하여 공유 결합을 통해 다공성 막과 효소를 결합시킨다. 이로부터 종래 기술에서는 가교제를 사용하여 효소를 고정화할 때 고순도 효소를 사용해야 하므로 고정화 방법이 복잡하고 효소의 로딩량이 제한됨을 알 수 있다.
본 발명의 주요 목적은 다공성 막을 사용하여 효소를 고정화하는 공정이 복잡한 종래 기술의 문제를 해결하기 위해 PVA 막 고정화 효소 및 이의 제조 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 구현하기 위해, 본 발명의 일 측면에 따르면, PVA 막 고정화 효소를 제공하며, 상기 PVA 막 고정화 효소는 PVA 다공성 막 및 PVA 다공성 막에 포매된 효소를 포함하고, PVA 다공성 막은 3차원 구조화 PVA 다공성 막이며, 효소는 트랜스아미나제, D-락테이트 탈수소효소, 시클로헥사논 모노옥시게나제, 케토리덕타제, 엔-리덕타제, 니트릴라제, 암모니아 분해효소, 아미노산 탈수소효소, 이민 리덕타제, 알코올 탈수소효소, 포름산암모늄 탈수소효소, 포도당 1-탈수소효소, 및 이들의 돌연변이체 중 어느 하나로부터 선택된다.
또한, 상기 효소는 유리 효소 또는 가교 효소 응집체이다.
또한, 상기 트랜스아미나제는 Chromobacterium violaceum DSM30191 유래 트랜스아미나제 또는 Arthrobacter citreus 유래 트랜스아미나제, 또는 B.thuringiensis 유래 트랜스아미나제이고; 케토리덕타제는 Acetobacter sp.CCTCC M209061 유래 케토리덕타제, 또는 Candida macedoniensis AKU4588 유래 케토리덕타제이며; 시클로헥사논 모노옥시게나제는 Rhodococcus sp.Phi1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제, 또는 Brachymonas petroleovorans 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제, 또는 Rhodococcus ruber-SD1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제이고; 암모니아 분해효소는 Aspergillus niger CBS 513.88 유래 암모니아 분해효소 및 Solenostemon scutellarioides 유래 암모니아 분해효소이며; 엔-리덕타제는 Saccharomyces cerevisiae 유래 엔-리덕타제 및 Chryseobacterium sp.CA49 유래 엔-리덕타제이고; 이민 리덕타제는 Streptomyces sp 유래 이민 리덕타제 및 Bacillus cereus 유래 이민 리덕타제이며; 아미노산 탈수소효소는 Bacillus cereus 유래 류신 탈수소효소 및 Bacillus sphaericus 유래 페닐알라닌 탈수소효소이고; 니트릴라제는 Aspergillus niger CBS 513.88 유래 니트릴라제 및 Neurospora crassa OR74A 유래 니트릴라제이다.
또한, 상기 Chromobacterium violaceum DSM30191 유래 트랜스아미나제는 SEQ ID NO.1로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 트랜스아미나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.1로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열이며, 여기서 돌연변이는 7번째, 47번째, 90번째, 95번째, 297번째, 304번째, 380번째, 405번째, 및 416번째 돌연변이 부위 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 7번째 트레오닌은 시스테인으로 돌연변이되며, 47번째 세린은 시스테인으로 돌연변이되고, 90번째 리신은 글리신으로 돌연변이되며, 95번째 알라닌은 프롤린으로 돌연변이되고, 297번째 이소류신은 류신으로 돌연변이되며, 304번째 리신은 아스파르트산으로 돌연변이되고, 380번째 글루타민은 류신으로 돌연변이되며, 405번째 아르기닌은 글루타민산으로 돌연변이되고, 416번째 아르기닌은 트레오닌으로 돌연변이되거나, 또는 트랜스아미나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열 중의 돌연변이 부위를 갖고, 또한 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이다.
또한, 상기 Arthrobacter citreus 유래 트랜스아미나제는 SEQ ID NO.2로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 트랜스아미나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.2로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열이며, 여기서 돌연변이는 3번째, 5번째, 60번째, 164번째, 171번째, 178번째, 180번째, 186번째, 187번째, 252번째, 370번째, 384번째, 389번째, 404번째, 411번째, 423번째, 및 424번째 돌연변이 부위 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 3번째 류신은 세린으로 돌연변이되며, 5번째 발린은 세린으로 돌연변이되고, 60번째 시스테인은 티로신으로 돌연변이되며, 164번째 페닐알라닌은 류신으로 돌연변이되고, 171번째 글루타민산은 아스파르트산으로 돌연변이되며, 178번째 알라닌은 류신으로 돌연변이되고, 180번째 이소류신은 발린으로 돌연변이되며, 186번째 세린은 글리신으로 돌연변이되고, 187번째 세린은 알라닌으로 돌연변이되며, 252번째 발린은 이소류신으로 돌연변이되고, 370번째 류신은 알라닌으로 돌연변이되며, 384번째 티로신은 페닐알라닌으로 돌연변이되고, 389번째 이소류신은 페닐알라닌으로 돌연변이되며, 404번째 류신은 글루타민으로 돌연변이되고, 411번째 글리신은 아스파르트산으로 돌연변이되며, 423번째 메티오닌은 리신으로 돌연변이되고, 424번째 글루타민산은 글루타민으로 돌연변이되거나, 또는 트랜스아미나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열 중의 돌연변이 부위를 갖고, 또한 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이다.
또한, 상기 Acetobacter sp.CCTCC M209061 유래 케토리덕타제는 SEQ ID NO.3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 케토리덕타제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.3으로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열이며, 여기서 돌연변이는 94번째, 144번째, 및 156번째 돌연변이 부위 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 94번째 알라닌은 아스파라긴으로 돌연변이되며, 144번째 글루타민산은 세린으로 돌연변이되고, 156번째 아스파라긴은 트레오닌 또는 발린으로 돌연변이되거나, 또는 케토리덕타제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열 중의 돌연변이 부위를 갖고, 또한 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이다.
또한, 상기 Rhodococcus sp.Phi1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제는 SEQ ID NO.4로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 시클로헥사논 모노옥시게나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.4로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열이며, 여기서 돌연변이는 280번째, 435번째, 436번째, 438번째, 441번째, 508번째, 및 510번째 돌연변이 부위 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 280번째 페닐알라닌은 티로신으로 돌연변이되며, 435번째 페닐알라닌은 아스파라긴으로 돌연변이되고, 436번째 페닐알라닌은 세린으로 돌연변이되며, 438번째 류신은 알라닌으로 돌연변이되고, 441번째 세린은 발린으로 돌연변이되며, 510번째 류신은 발린으로 돌연변이되거나, 또는 시클로헥사논 모노옥시게나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열 중의 돌연변이 부위를 갖고, 또한 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이다.
또한, 상기 Rhodococcus ruber-SD1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제는 SEQ ID NO.5로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 시클로헥사논 모노옥시게나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.5로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열이며, 여기서 돌연변이는 45번째, 190번째, 249번째, 257번째, 393번째, 504번째, 및 559번째 돌연변이 부위 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 45번째 메티오닌은 트레오닌으로 돌연변이되며, 190번째 프롤린은 류신으로 돌연변이되고, 249번째 시스테인은 발린으로 돌연변이되며, 257번째 시스테인은 알라닌으로 돌연변이되고, 393번째 시스테인은 발린으로 돌연변이되며, 504번째 프롤린은 발린으로 돌연변이되고, 559번째 티로신은 메티오닌으로 돌연변이되거나, 또는 시클로헥사논 모노옥시게나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열 중의 돌연변이 부위를 갖고, 또한 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이다.
또한, 상기 PVA 막 고정화 효소는 각 효소의 보조효소 및 보조인자를 더 포함하고, 보조효소 및 보조인자는 PVA 다공성 막에 포매된다.
또한, 상기 PVA 다공성 막은 또한 폴리에틸렌글리콜 및/또는 폴리에틸렌이민을 갖고, 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 PEG400 ~ PEG6000이며, 폴리에틸렌이민의 분자량은 3KDa ~ 70KDa이다.
또한, 상기 폴리에틸렌글리콜과 PVA 다공성 막의 질량비는 5:4 ~ 75:4이며, 폴리에틸렌이민과 PVA 다공성 막의 질량비는 1:12 ~ 1:240이다.
또한, 상기 효소는 조효소이다.
또한, 상기 효소의 로딩량은 0.05 ~ 0.4g 유리 효소/cm2 막 또는 0.03 ~ 0.06g 건조 가교 효소 응집체/cm2 막이다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 어느 하나에 따른 PVA 막 고정화 효소의 제조 방법을 제공하며, 제조 방법은, 효소와 PVA 용액을 포함하는 원료를 소정 시간 동안 혼합하여 혼합계를 얻는 단계 S1; 혼합계를 몰드에 첨가하고 혼합계를 건조 처리하여 막에 포매된 효소를 얻되, 몰드는 3차원 구조화 PVA 다공성 막을 형성하기 위한 3차원 구조화 몰드인 단계 S2; 및 인산 완충액을 이용하여 막에 포매된 효소를 침지 처리 및 세척한 후, PVA 막 고정화 효소를 얻는 단계 S3을 포함한다.
또한, 상기 혼합계의 pH값은 6.0 ~ 6.5이다.
또한, 상기 단계 S1은, 효소의 현탁액 또는 효소 용액을 조제하되, 현탁액 중의 효소는 가교 효소 응집체이고, 효소 용액 중의 효소는 세포가 제거된 유리 효소인 단계; 및 현탁액 또는 효소 용액을 PVA 용액과 소정 시간 동안 혼합하여 혼합계를 얻는 단계를 포함한다.
또한, 상기 소정 시간은 10 ~ 60분이며; PVA 용액의 PVA 분자량은 20KDa ~ 200KDa이다.
또한, 상기 PVA 용액 중 PVA의 함량은 10 ~ 50g/100mL이다.
또한, 상기 PVA 용액에는 아세트산, 메탄올, 및 황산이 분산되어 있다.
또한, 상기 PVA 용액의 pH값은 5.5 ~ 6.5이다.
또한, 상기 효소와 PVA 용액의 비율은 1 ~ 50g/100mL이다.
또한, 상기 현탁액 또는 효소 용액은 인산 완충액, 선택적인 보조인자, 및 선택적인 보조효소를 더 포함한다.
또한, 상기 보조효소와 효소의 중량비는 10:1 ~ 1:10이다.
또한, 상기 단계 S1은, PVA 수용액과 가교 효소 입자를 혼합하여 혼합계를 형성하는 단계를 포함한다.
또한, 상기 가교 효소 입자와 PVA 수용액의 비율은 1 ~ 50g/100mL이다.
또한, 상기 소정 시간은 10 ~ 60분이다.
또한, 상기 가교 효소 입자는 효소, 선택적인 보조인자, 및 선택적인 보조효소를 포함한다.
또한, 상기 단계 S1은, PVA 수용액과 변형제 용액을 제1 소정 시간 동안 혼합하여 제2 혼합계를 형성하는 단계; 및 제2 혼합계와 효소계를 제2 소정 시간 동안 혼합하여 혼합계를 형성하는 단계를 포함한다.
또한, 상기 PVA 수용액의 농도는 5 ~ 30g/100mL이며, 바람직하게는 변형제 용액은 보조인자가 분산되어 있는 폴리에틸렌글리콜 수용액 및/또는 보조인자가 분산되어 있는 폴리에틸렌이민 수용액을 포함한다.
또한, 상기 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 PEG400 ~ PEG6000이며, 혼합계 중 폴리에틸렌글리콜의 농도는 3 ~ 10g/100mL이다.
또한, 상기 폴리에틸렌이민의 분자량은 3KDa ~ 70KDa이고, 보다 바람직하게는 3KDa ~ 50KDa.
또한, 상기 혼합계 중 폴리에틸렌이민의 농도는 0.1 ~ 1g/100mL이며, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 0.3g/100mL이다.
또한, 상기 효소계는 효소, 선택적인 보조인자, 선택적인 보조효소, 및 인산 완충액을 포함한다.
또한, 상기 효소는 세포가 제거된 유리 효소 또는 가교 효소 응집체이다.
또한, 상기 효소계 중 보조인자의 농도는 1 ~ 20mg/mL이다.
또한, 상기 효소계 중 보조효소와 효소의 중량비는 10:1 ~ 1:10이다.
또한, 상기 효소와 PVA 용액의 비율은 1 ~ 50g/100mL이다.
또한, 상기 단계 S2는, 혼합계를 몰드에 넣고 제3 소정 시간 동안 정치한 후 몰드에 탈수 촉진제를 첨가하여 건조 처리하되, 탈수 촉진제는 아세토니트릴, 에탄올, 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 다수인 단계를 포함한다.
또한, 상기 탈수 촉진제와 혼합계의 부피비는 1:10 ~ 5:1이다.
또한, 상기 제3 소정 시간은 2 ~ 4시간이다.
또한, 상기 몰드는 3차원 구조화 몰드이며, 3차원 구조화 몰드는 돌기 또는 요홈을 갖는다.
또한, 상기 단계 S3은, 막에 포매된 효소를 인산 완충액에 2 ~ 16시간 동안 침지한 후 새로운 인산 완충액을 이용하여 막에 포매된 효소를 세척하여 PVA 막 고정화 효소를 얻는 단계를 포함한다.
본 발명의 기술적 해결수단을 적용하여, PVA 다공성 막을 담체로 사용하여 효소를 포매 방식으로 고정화함으로써, 포매 및 고정화 프로세스가 간단하고, 조건이 온화하며, 정제된 효소 또는 조효소에 대해 모두 우수한 고정화 효과가 있고, 효소는 PVA 다공성 막에 포매 및 고정화된 후 비교적 안정하여 사용 과정에서 쉽게 침출되지 않는다. 사용된 PVA 다공성 막의 다공성 구조는 반응물 및 생성물을 더 잘 전달할 수 있으므로, 연속 흐름 생화학 촉매 작용에 사용하기에 적합하다. 상기 포매 및 고정화는 기계적 고정화이기 때문에 효소에 대한 광범위한 적용성을 갖는다. PVA 다공성 막을 3차원 구조화하여 입체적 구조를 갖도록 함으로써, 표면적이 더 넓어지고 보다 많은 포매 부위를 제공하여, 효소의 높은 활성 및 안정성을 보장함과 동시에 효소의 로딩량을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 일부를 구성하는 명세서의 도면은 본 발명에 대한 추가적인 이해를 제공하기 위해 사용되며, 본 발명의 예시적인 실시형태 및 그 설명은 본 발명을 해석하기 위한 것으로 본 발명에 대한 부적절한 한정을 구성하지 않는다.
도 1은 PLP를 첨가한 경우와 PLP를 첨가하지 않은 경우의 본 발명의 실시예 2에 따른 PVA 막 고정화 효소의 안정성 그래프를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 실시예 3에 따른 두 가지 PVA 막 고정화 효소의 안정성 그래프를 나타낸다.
도 3은 PLP를 첨가한 경우와 PLP를 첨가하지 않은 경우의 본 발명의 실시예 5에 따른 PVA 막 고정화 효소의 안정성 그래프를 나타낸다.
도 4는 PLP를 첨가한 경우와 PLP를 첨가하지 않은 경우의 본 발명의 실시예 6에 따른 PVA 막 고정화 효소의 안정성 그래프를 나타낸다.
도 5는 PLP를 첨가한 경우와 NAD+를 첨가한 경우의 본 발명의 실시예 8에 따른 PVA 막 고정화 효소의 안정성 그래프를 나타낸다.
도 6은 PLP를 첨가한 경우와 NAD+를 첨가한 경우의 본 발명의 실시예 8에 따른 PVA 막 고정화 효소의 안정성 그래프를 나타낸다.
도 7은 PLP를 첨가한 경우와 PLP를 첨가하지 않은 경우의 본 발명의 실시예 9에 따른 PVA 막 고정화 효소의 안정성 그래프를 나타낸다.
설명해야 할 것은, 모순되지 않은 경우, 본 발명의 실시형태 및 실시형태의 특징은 서로 조합될 수 있다. 아래 도면을 참조하고 실시형태를 기반으로 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 배경기술에서 분석한 바와 같이, 종래 기술에서는 다공성 막을 사용하여 효소를 고정화하는 공정이 복잡하므로, 본 발명은 상기 문제를 해결하기 위해 PVA 막 고정화 효소 및 이의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 전형적인 일 실시형태에서, PVA 막 고정화 효소를 제공하며, 상기 PVA 막 고정화 효소는 PVA 다공성 막 및 PVA 다공성 막에 포매된 효소를 포함하고, PVA 다공성 막은 3차원 구조화 PVA 다공성 막이며, 효소는 트랜스아미나제(예를 들어 ω-트랜스아미나제), D-락테이트 탈수소효소, 포르메이트 탈수소효소, 카르보닐 리덕타제, 시클로헥사논 모노옥시게나제, 엔-리덕타제, 니트릴라제, 암모니아 분해효소, 아미노산 탈수소효소, 이민 리덕타제, 및 이들의 돌연변이체 중 어느 하나로부터 선택된다.
본 발명은 PVA 다공성 막을 담체로 사용하여 효소를 포매 방식으로 고정화함으로써, 포매 및 고정화 프로세스가 간단하고, 조건이 온화하며, 정제된 효소 또는 조효소에 대해 모두 우수한 고정화 효과가 있고, 효소는 PVA 다공성 막에 포매 및 고정화된 후 편평한 PVA 막에 고정화되는 것보다 더 안정하여 사용 과정에서 쉽게 침출되지 않는다. 사용된 PVA 다공성 막의 다공성 구조는 반응물 및 생성물을 더 잘 전달할 수 있으므로, 연속 흐름 생화학 촉매 작용에 사용하기에 적합하다. 상기 포매 및 고정화는 기계적 고정화이기 때문에 효소에 대한 광범위한 적용성을 갖는다. PVA 다공성 막을 3차원 구조화하여 입체적 구조를 갖도록 함으로써, 표면적이 더 넓어지고 보다 많은 포매 부위를 제공하여, 효소의 높은 활성 및 안정성을 보장함과 동시에 효소의 로딩량을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 PVA 막 고정화 효소에 포매된 효소는 유리 효소 또는 가교 효소 응집체일 수 있고, 유리 효소든 가교 효소 응집체든 포매된 후 모두 촉매 작용 효과를 효과적으로 발휘할 수 있다.
소위 가교 효소 응집체는 종래 기술에서 말하는 것과 유사하고, 모두 유리 효소를 황산암모늄 또는 에탄올, 아세토니트릴, 아세톤, 프로판올, PEG 등의 침전제로 침전시킨 후, 글루타르알데히드, 글리옥살 또는 알데히드화 덱스트란 등의 이기능성 시약을 첨가하여 공유 가교 결합을 수행함으로써 얻은 불용성 효소 응집체이다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 PVA 막 고정화 효소는 효소에 대한 광범위한 적용성을 갖고, 다음과 같은 효소에 더 적합하다. 트랜스아미나제는 Chromobacterium violaceum DSM30191 유래 트랜스아미나제 또는 Arthrobacter citreus 유래 트랜스아미나제, 또는 B.thuringiensis 유래 트랜스아미나제이고; 케토리덕타제는 Acetobacter sp.CCTCC M209061 유래 케토리덕타제, 또는 Candida macedoniensis AKU4588 유래 케토리덕타제이며; 시클로헥사논 모노옥시게나제는 Rhodococcus sp.Phi1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제, 또는 Brachymonas petroleovorans 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제, 또는 Rhodococcus ruber-SD1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제이고; 암모니아 분해효소는 Aspergillus niger CBS 513.88 유래 암모니아 분해효소 및 Solenostemon scutellarioides 유래 암모니아 분해효소이며; 엔-리덕타제는 Saccharomyces cerevisiae 유래 엔-리덕타제 및 Chryseobacterium sp.CA49 유래 엔-리덕타제이고; 이민 리덕타제는 Streptomyces sp 유래 이민 리덕타제 및 Bacillus cereus 유래 이민 리덕타제이며; 아미노산 탈수소효소는 Bacillus cereus 유래 류신 탈수소효소 및 Bacillus sphaericus 유래 페닐알라닌 탈수소효소이고; 니트릴라제는 Aspergillus niger CBS 513.88 유래 니트릴라제 및 Neurospora crassa OR74A 유래 니트릴라제이며, 바람직하게는, Chromobacterium violaceum DSM30191 유래 트랜스아미나제는 SEQ ID NO.1로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 트랜스아미나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.1로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열이며, 여기서 돌연변이는 7번째, 47번째, 90번째, 95번째, 297번째, 304번째, 380번째, 405번째, 및 416번째 돌연변이 부위 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 7번째 트레오닌은 시스테인으로 돌연변이되며, 47번째 세린은 시스테인으로 돌연변이되고, 90번째 리신은 글리신으로 돌연변이되며, 95번째 알라닌은 프롤린으로 돌연변이되고, 297번째 이소류신은 류신으로 돌연변이되며, 304번째 리신은 아스파르트산으로 돌연변이되고, 380번째 글루타민은 류신으로 돌연변이되며, 405번째 아르기닌은 글루타민산으로 돌연변이되고, 416번째 아르기닌은 트레오닌으로 돌연변이되거나, 또는 트랜스아미나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열 중의 돌연변이 부위를 갖고, 또한 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이며; 바람직하게는, Arthrobacter citreus 유래 트랜스아미나제는 SEQ ID NO.2로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 트랜스아미나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.2로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열이며, 여기서 돌연변이는 3번째, 5번째, 60번째, 164번째, 171번째, 178번째, 180번째, 186번째, 187번째, 252번째, 370번째, 384번째, 389번째, 404번째, 411번째, 423번째, 및 424번째 돌연변이 부위 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 3번째 류신은 세린으로 돌연변이되며, 5번째 발린은 세린으로 돌연변이되고, 60번째 시스테인은 티로신으로 돌연변이되며, 164번째 페닐알라닌은 류신으로 돌연변이되고, 171번째 글루타민산은 아스파르트산으로 돌연변이되며, 178번째 알라닌은 류신으로 돌연변이되고, 180번째 이소류신은 발린으로 돌연변이되며, 186번째 세린은 글리신으로 돌연변이되고, 187번째 세린은 알라닌으로 돌연변이되며, 252번째 발린은 이소류신으로 돌연변이되고, 370번째 류신은 알라닌으로 돌연변이되며, 384번째 티로신은 페닐알라닌으로 돌연변이되고, 389번째 이소류신은 페닐알라닌으로 돌연변이되며, 404번째 류신은 글루타민으로 돌연변이되고, 411번째 글리신은 아스파르트산으로 돌연변이되며, 423번째 메티오닌은 리신으로 돌연변이되고, 424번째 글루타민산은 글루타민으로 돌연변이되거나, 또는 트랜스아미나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열 중의 돌연변이 부위를 갖고, 또한 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이며; 바람직하게는, Acetobacter sp.CCTCC M209061 유래 케토리덕타제는 SEQ ID NO.3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 케토리덕타제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.3으로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열이며, 여기서 돌연변이는 94번째, 144번째, 및 156번째 돌연변이 부위 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 94번째 알라닌은 아스파라긴으로 돌연변이되며, 144번째 글루타민산은 세린으로 돌연변이되고, 156번째 아스파라긴은 트레오닌 또는 발린으로 돌연변이되거나, 또는 케토리덕타제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열 중의 돌연변이 부위를 갖고, 또한 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이며; 바람직하게는, Rhodococcus sp.Phi1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제는 SEQ ID NO.4로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 시클로헥사논 모노옥시게나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.4로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열이며, 여기서 돌연변이는 280번째, 435번째, 436번째, 438번째, 441번째, 508번째, 및 510번째 돌연변이 부위 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 280번째 페닐알라닌은 티로신으로 돌연변이되며, 435번째 페닐알라닌은 아스파라긴으로 돌연변이되고, 436번째 페닐알라닌은 세린으로 돌연변이되며, 438번째 류신은 알라닌으로 돌연변이되고, 441번째 세린은 발린으로 돌연변이되며, 510번째 류신은 발린으로 돌연변이되거나, 또는 시클로헥사논 모노옥시게나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열 중의 돌연변이 부위를 갖고, 또한 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이며; 바람직하게는, Rhodococcus ruber-SD1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제는 SEQ ID NO.5로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 시클로헥사논 모노옥시게나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.5로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열이며, 여기서 돌연변이는 45번째, 190번째, 249번째, 257번째, 393번째, 504번째, 및 559번째 돌연변이 부위 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 45번째 메티오닌은 트레오닌으로 돌연변이되며, 190번째 프롤린은 류신으로 돌연변이되고, 249번째 시스테인은 발린으로 돌연변이되며, 257번째 시스테인은 알라닌으로 돌연변이되고, 393번째 시스테인은 발린으로 돌연변이되며, 504번째 프롤린은 발린으로 돌연변이되고, 559번째 티로신은 메티오닌으로 돌연변이되거나, 또는 시클로헥사논 모노옥시게나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열 중의 돌연변이 부위를 갖고, 또한 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이다.
PVA 막 고정화 효소의 촉매 작용 효율을 향상시키기 위해, 바람직하게는 상기 PVA 막 고정화 효소는 각 효소의 보조효소 및 보조인자를 더 포함한다. 상기 각 효소의 보조효소 및 보조인자는 상기 효소에 상응한 보조효소 및 보조인자가 있으면 PVA 막 고정화 효소에 상기 효소의 보조효소 및 보조인자도 포매되어 있고, 상기 효소에 보조효소 또는 보조인자가 없으면 PVA 막 고정화 효소에 필요없는 보조효소 또는 보조인자를 설정하지 않음을 의미한다.
본 발명의 PVA 막 고정화 효소는 정제된 효소에 적용될 뿐만 아니라 조효소에도 적용될 수 있으며, 절차를 절약하기 위해, 바람직하게는 상기 효소는 조효소이다. 동시에, 본 발명의 고정화 방식은 포매 방식이므로, 로딩될 수 있는 효소의 양이 상대적으로 많고, 바람직하게는 효소의 로딩량은 0.05 ~ 0.4g 유리 효소/cm2 막 또는 0.03 ~ 0.06g 건조 가교 효소 응집체/cm2 막이다.
다른 실시형태에서, 상기 PVA 다공성 막은 또한 폴리에틸렌글리콜 및/또는 폴리에틸렌이민을 갖고, 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 PEG400 ~ PEG6000이며, 폴리에틸렌이민의 분자량은 3KDa ~ 70KDa이고, 바람직하게는 3KDa ~ 50KDa이다. 또한, 바람직하게는 상기 폴리에틸렌글리콜과 PVA 다공성 막의 질량비는 5:4 ~ 75:4이고, 폴리에틸렌이민과 PVA 다공성 막의 질량비는 1:12 ~ 1:240이다. 상기 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌이민은 PVA 다공성 막의 기공 구조를 더 풍부하게 한다.
본 발명의 다른 전형적인 실시형태에서, 상기 어느 하나에 따른 PVA 막 고정화 효소의 제조 방법을 제공하며, 상기 제조 방법은, 효소와 PVA 용액을 포함하는 원료를 소정 시간 동안 혼합하여 혼합계를 얻는 단계 S1; 혼합계를 몰드에 첨가하고 혼합계를 건조 처리하여 막에 포매된 효소를 얻되, 몰드는 3차원 구조화 PVA 다공성 막을 형성하기 위한 3차원 구조화 몰드인 단계 S2; 및 인산 완충액을 이용하여 막에 포매된 효소를 침지 처리 및 세척한 후, PVA 막 고정화 효소를 얻는 단계 S3을 포함하고, 바람직하게는 혼합계의 pH값은 6.0 ~ 6.5이다.
본 발명의 제조 방법은 혼합, 건조, 및 후처리 공정을 이용하여 PVA 막 고정화 효소를 형성할 수 있으므로, 과정이 간단하고, 조작이 용이하며, 글루타르알데히드, 아미노기, 카르복실기 등을 사용하여 가교 또는 공유 고정화를 수행할 필요가 없으며, 형성된 PVA 막 고정화 효소 중의 PVA 다공성 막을 담체로 사용하여 효소를 포매 방식으로 고정화함으로써, 정제된 효소 또는 조효소에 대해 모두 우수한 고정화 효과가 있고; 효소는 PVA 다공성 막에 포매 및 고정화된 후 비교적 안정하여 사용 과정에서 쉽게 침출되지 않는다. 사용된 PVA 다공성 막의 다공성 구조는 반응물 및 생성물을 더 잘 전달할 수 있으므로, 연속 흐름 생화학 촉매 작용에 사용하기에 적합하다. 상기 포매 및 고정화는 기계적 고정화이기 때문에 효소에 대한 광범위한 적용성을 갖는다. 3차원 구조화 몰드를 사용하여 PVA 다공성 막을 3차원 구조화하여 입체적 구조를 갖도록 함으로써, 표면적이 더 넓어지고 보다 많은 포매 부위를 제공하여, 효소의 높은 활성 및 안정성을 보장함과 동시에 효소의 로딩량을 향상시킬 수 있다.
상기 혼합계 형성 방식은 효소를 제공하는 형태가 상이함에 따라 달라질 수 있으며, 아래에서 몇 가지 바람직한 혼합계 형성 방식을 제공하되, 아래의 단계 S1에 대한 설명은 단계 S1의 범위에 대한 제한으로 작용되지 않는다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 단계 S1은, 효소의 현탁액 또는 효소 용액을 조제하되, 현탁액 중의 효소는 가교 효소 응집체이고, 효소 용액 중의 효소는 세포가 제거된 유리 효소인 단계; 및 현탁액 또는 효소 용액을 PVA 용액과 소정 시간 동안 혼합하여 혼합계를 얻는 단계를 포함한다. 효소 용액이든 효소의 현탁액이든 모두 PVA 용액과 혼합할 수 있으며, 혼합 과정에서 기계적 교반 또는 자기 교반을 수행할 수 있다.
상기 PVA 용액은 PVA, 물, 아세트산, 메탄올, 및 황산을 포함하는 혼합 용액이고, 바람직하게는 혼합 용액의 pH값은 5.5 ~ 6.5이며, 아세트산, 메탄올, 및 황산의 조합은 제조된 막이 더 많은 미세 기공을 갖도록 한다.
효소의 PVA 용액 내 분산 균일성을 향상시키기 위해, 바람직하게는 상기 소정 시간은 2 ~ 4시간이다.
보다 신뢰할 수 있는 기계적 강도를 갖는 겔 필름을 형성하기 위해, PVA 용액의 PVA 분자량은 20KDa ~ 200KDa이고, 또한 보다 풍부한 공극률의 PVA 다공성 막을 형성하고 효소의 분산에 유리하도록, 바람직하게는 PVA 용액 중 PVA의 함량은 5 ~ 30g/100mL이며, 바람직하게는 10 ~ 50g/100mL이다.
PVA 막에 효소를 포매하는 이러한 기계적 고정화 방식에 기반하면, 효소의 로딩량이 많을 수 있고, 바람직하게는 상기 현탁액 또는 효소 용액 중 효소의 농도는 0.1 ~ 0.5g/mL이며, 바람직하게는 효소와 PVA 용액의 비율은 1 ~ 50g/100mL이고, 보다 바람직하게는 5 ~ 40g/100mL이다.
혼합 과정에서, 효소의 높은 활성을 유지하기 위해, 바람직하게는 현탁액 또는 효소 용액은 인산 완충액, 선택적인 보조인자, 및 선택적인 보조효소를 더 포함하고, 바람직하게는 보조인자의 농도는 1 ~ 20mg/mL이며, 바람직하게는 보조효소와 효소의 중량비는 10:1 ~ 1:10이다.
본 발명의 다른 실시형태에서, 상기 단계 S1은, PVA 수용액과 가교 효소 입자를 혼합하여 혼합계를 형성하는 단계를 포함한다. 상기 실시형태에서, 가교 효소는 건조 입자의 형태로 PVA 수용액과 혼합하여 가교 효소 입자의 분산을 용이하게 한다. 효소의 로딩량을 보장하기 위해, 바람직하게는 가교 효소 입자와 PVA 수용액의 비율은 1 ~ 50g/100mL이다. 마찬가지로, 가교 효소 입자의 PVA 수용액 내 분산 균일성을 향상시키기 위해, 바람직하게는 소정 시간은 10 ~ 60분이다. 또한, 필요한 경우, 바람직하게는 가교 효소 입자는 효소, 선택적인 보조인자, 및 선택적인 보조효소를 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시형태에서, 상기 단계 S1은, PVA 수용액과 변형제 용액을 제1 소정 시간 동안 혼합하여 제2 혼합계를 형성하는 단계; 및 제2 혼합계와 효소계를 제2 소정 시간 동안 혼합하여 혼합계를 형성하는 단계를 포함한다. 변형제를 사용하여 PVA 막 형성을 촉진하고 기공 구조를 풍부하게 한다.
보다 풍부한 공극률의 PVA 다공성 막을 형성하고 효소의 분산에 유리하도록, 바람직하게는 PVA 수용액의 농도는 5 ~ 30g/100mL이다. 본 발명에 사용되는 변형제는 PVA 막 형성시 일반적으로 사용되는 변형제로부터 선택될 수 있고, 효소에 대한 변형제의 영향을 방지하기 위해, 바람직하게는 변형제 용액은 아세트산, 메탄올, 및 황산이 분산되어 있는 혼합액 및/또는 보조인자가 분산되어 있는 폴리에틸렌글리콜 수용액 및/또는 보조인자가 분산되어 있는 폴리에틸렌이민 수용액을 포함하고, 여기서, 바람직하게는 혼합액 중 아세트산의 함량은 2 ~ 4g/100mL이며, 메탄올의 함량은 5 ~ 9g/100mL이고, 황산의 함량은 0.5 ~ 1g/100mL이며; 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 PEG400 ~ PEG6000이고, 바람직하게는 혼합계 중 폴리에틸렌글리콜의 농도는 3 ~ 10g/100mL이며; 바람직하게는 폴리에틸렌이민의 분자량은 3KDa ~ 70KDa이고, 보다 바람직하게는 3KDa ~ 50KDa이며, 바람직하게는 혼합계 중 폴리에틸렌이민의 농도는 0.1 ~ 1g/100mL이고, 보다 바람직하게는 0.1 ~ 0.3g/100mL이다.
상기 변형제 용액을 첨가하는 경우, 효소계와 제2 혼합계의 혼합에 큰 영향을 미치지 않으므로, 상기 효소계는 현재 효소를 공급하기 위해 일반적으로 사용되는 시스템 형태일 수 있고, 바람직하게는 효소계는 효소, 선택적인 보조인자, 선택적인 보조효소, 및 인산 완충액을 포함하며, 바람직하게는 효소는 세포가 제거된 유리 효소 또는 가교 효소 응집체이다. 효소의 로딩량을 향상시키기 위해, 보조인자 및 보조효소의 사용이 필요한 경우, 보조인자의 농도는 1 ~ 20mg/mL이고, 바람직하게는 효소계 중 보조효소와 효소의 중량비는 10:1 ~ 1:10이며, 효소와 PVA 용액의 비율은 1 ~ 50g/100mL이다.
혼합계를 형성한 후, 혼합계를 정치하여 건조시킬 수 있고, 막 형성 공정의 속도를 높이기 위해, 바람직하게는 상기 단계 S2는, 혼합계를 몰드에 넣고 제3 소정 시간 동안 정치한 후 몰드에 탈수 촉진제를 첨가하여 건조 처리하되, 탈수 촉진제는 아세토니트릴, 에탄올, 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 다수인 단계를 포함하고, 바람직하게는 탈수 촉진제와 혼합계의 부피비는 1:10 ~ 5:1이다. 막 형성 과정에서, 효소는 형성된 PVA 다공성 막에 포매되어 안정적인 고정화 효소 구조를 형성한다. 막 형성이 너무 빨라 효소가 완전히 코팅될 수 없는 것을 방지하기 위해, 바람직하게는 제3 소정 시간은 2 ~ 4시간이다. 또한, 3차원 구조화 몰드의 구조를 간소화하기 위해, 바람직하게는 3차원 구조화 몰드는 돌기 또는 요홈을 갖는다.
막이 형성된 후, 효소의 고정화를 보다 견고하게 하기 위해, 바람직하게는 상기 단계 S3은, 막에 포매된 효소를 인산 완충액에 2 ~ 16시간 동안 침지한 후 새로운 인산 완충액을 이용하여 막에 포매된 효소를 세척하여 PVA 막 고정화 효소를 얻는 단계를 포함한다.
본 발명의 상기 제조 방법에서, 사용되는 효소는 정제된 효소 또는 조효소일 수 있고, 비용을 절감하기 위해, 바람직하게는 상기 효소는 조효소이다.
본 발명에서 얻은 PVA 막 고정화 효소는 완충액에 의해 추가로 재현탁될 수 있고, 글루타르알데히드를 첨가하여 변형시켜 효소 분자 사이가 아미노기와 글루타르알데히드의 알데히드기 간의 공유 결합을 통해 가교 결합되어 더 큰 응집체를 형성하도록 함으로써, PVA 막으로부터 누출되지 않음과 동시에 PVA 막 표층에 부착된 효소도 글루타르알데히드의 암(arm) 작용을 통해 PVA와 공유 결합으로 연결되어 보다 견고하게 고정화될 수 있고, 사용 횟수를 늘릴 수 있다. 바람직하게는, 글루타르알데히드의 사용량은 1 ~ 2g/100mL 현탁액이다.
아래, 실시예 및 비교예를 기반으로 본 발명의 유익한 효과를 더 설명한다.
이하 실시예에서 사용되는 효소 및 이의 유래는 표 1에 나타낸 바와 같다.
효소 약칭 종의 유래
트랜스아미나제 TA-Cv Chromobacterium violaceum DSM30191
TA-Ac Arthrobacter citreus
TA-Bt B.thuringiensis
케토리덕타제 KRED-Ac Acetobacter sp.CCTCC M209061
KRED-Cm Candida macedoniensis AKU4588
알코올 탈수소효소 ADH-Tb Thermoanaerobium brockii
D-락테이트 탈수소효소 D-LDH Lactobacillus helveticus
포름산암모늄 탈수소효소 FDH Candida boidinii
포도당 1-탈수소효소 GDH Lysinibacillus sphaericus G10
시클로헥사논 모노옥시게나제 CHMO-Rs Rhodococcus sp.Phi1
CHMO-Bp Brachymonas petroleovorans
CHMO-Rr Rhodococcus ruber-SD1
엔-리덕타제 ERED-Sc Saccharomyces cerevisiae
ERED-Chr Chryseobacterium sp.CA49
이민 리덕타제 IRED-Str Streptomyces sp.
IRED-Bc Bacillus cereus
아미노산 탈수소효소 AADH-Bc Bacillus cereus
AADH-Bs Bacillus sphaericus
암모니아 분해효소 PAL-An Aspergillus niger CBS 513.88
PAL-Ss Solenostemon scutellarioides
니트릴라제 NIT-An Aspergillus niger CBS 513.88
NIT-Nc Neurospora crassa OR74A
여기서, TA-Cv 트랜스아미나제의 아미노산 서열은 다음과 같이 SEQ ID NO.1로 표시된다.
Figure pct00001
이의 돌연변이체 1(TA-Cv-V1)의 돌연변이 부위 및 아미노산 돌연변이 상황은 R416T+T7C+S47C+Q380L이고; 돌연변이체 2(TA-Cv-V2)의 돌연변이 부위 및 아미노산 돌연변이 상황은 R416T+T7C+S47C+R405E+K90G+A95P+K304D+Q380L+I297L이다.
여기서, TA-Ac 트랜스아미나제의 아미노산 서열은 다음과 같이 SEQ ID NO.2로 표시된다.
Figure pct00002
이의 돌연변이체 1(TA-Ac-V1)의 돌연변이 부위 및 아미노산 돌연변이 상황은 L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I+L404Q+E171D이고; 돌연변이체 2(TA-Ac-V2)의 돌연변이 부위 및 아미노산 돌연변이 상황은 L3S+V5S+C60Y+F164L+A178L+S187A+I180V+L370A+G411D+S186G+Y384F+I389F+V252I+E424Q+M423K이다.
여기서, KRED-Ac 케토리덕타제의 아미노산 서열은 다음과 같이 SEQ ID NO.3으로 표시된다.
Figure pct00003
이의 돌연변이체 1(KRED-Ac-V1)의 돌연변이 부위 및 아미노산 돌연변이 상황은 E144S+A94N+N156V이고; 돌연변이체 2(KRED-Ac-V2)의 돌연변이 부위 및 아미노산 돌연변이 상황은 E144S+A94T+N156T이다.
여기서, CHMO-Rs 시클로헥사논 모노옥시게나제의 아미노산 서열은 다음과 같이 SEQ ID NO.4로 표시된다.
Figure pct00004
이의 돌연변이체 1(CHMO-Rs-Cv-V1)의 돌연변이 부위 및 아미노산 돌연변이 상황은 F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V이고; 돌연변이체 2(CHMO-Rs-Cv-V2)의 돌연변이 부위 및 아미노산 돌연변이 상황은 F508Y+F435N+L438A+T436S+F280V+S441V+L510V이다.
여기서, CHMO-Rr 시클로헥사논 모노옥시게나제의 아미노산 서열은 다음과 같이 SEQ ID NO.5로 표시된다.
Figure pct00005
이의 돌연변이체 1(CHMO-Rr-V1)의 돌연변이 부위 및 아미노산 돌연변이 상황은 P190L+Y559M+C249V+C393V+C257A+M45T이고; 돌연변이체 2(CHMO-Rr-V2)의 돌연변이 부위 및 아미노산 돌연변이 상황은 Y559M+P190L+P504V이다.
아래 실시예에서 사용된 인산 완충액(PB)은 인산수소이나트륨-인산이수소나트륨 완충액이다.
실시예 1
PVA 막 포매에 의한 트랜스아미나제 TA-CV CLEA(가교 효소)의 고정화:
PVA I 용액의 제조: 50mL의 10%(w/v) PVA(200KDa)를 30mL의 10%(w/v) 아세트산, 50%(v/v) 메탄올, 10%(w/v) 황산과 혼합하였다.
PVA 막 캡슐화: PVA I 용액의 pH를 6.0으로 조절하고, 20mL의 용액을 취하여 TA-CV 가교 효소 응집체(CLEA)의 현탁액과 혼합(TA-CV 가교 효소 응집체 CLEA의 현탁액의 조성은 2ml의 0.1M 인산 완충액(PB) pH 7.0 중 0.5g의 TA-CV의 가교 효소이고, ml당 2mg의 PLP(피리독살인산)가 함유됨)한 후 20분 동안 교반하여 혼합계를 형성하였다. 이를 3D 다공성 실리카겔 템플릿에 붓고 37℃에서 건조시켜 막에 포매된 효소를 얻되, 각 템플릿의 탄성 구멍은 정사각형이며, 용적은 약 0.1 ~ 0.2cm3이고, 탄성 구멍의 표면적은 약 2 ~ 5cm2이다. 막에 포매된 효소를 0.1M PB(pH 7.0) + 0.5M NaCl의 완충액에 3시간 동안 침지하고, 막에 포매된 효소를 완충액에서 꺼낸 다음 0.1M PB(pH 7.0)로 상기 막에 포매된 효소를 3회 세척하여 실시예 1의 PVA 막 고정화 효소를 얻었다.
비교예 1
상기 실시예 1의 3D 다공성 실리카겔 템플릿을 고온 내성 실리카겔 원판으로 교체하여 편평한 PVA 막에 포매된 효소를 형성하되, 실리카겔 원판의 바닥 면적은 80cm2이다.
동시에, 상이한 분자량의 PVA, PVA 농도, 및 효소와 PVA의 비율 등의 매개변수가 PVA 막 고정화 효소의 활성 및 안정성에 미치는 영향을 조사하였다.
전환 및 안정성 테스트:
전환 연구에서 사용된 반응 모델:
Figure pct00006
상기 반응식에서 R1 및 R2은 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 아랄킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬로부터 선택될 수 있고, R1과 R2는 연결되어 고리를 형성할 수 있다.
Figure pct00007
0.1g의 케톤 기질 1을 취하여 0.35mL의 메탄올에 용해시키고, 아미노기 공여체로서 3.0몰 당량의 이소프로필아민 염산염을 첨가하고, 반응 시스템에 5mg의 PLP를 첨가한 다음, 0.3mL의 0.1M PB 7.0으로 희석하여 반응할 시스템을 형성하였다. 3mg의 TA-CV CLEA, 또는 3mg의 TA-CV CLEA를 포함하는 실시예 1의 3차원 구조화 PVA 막 고정화 효소 또는 3mg의 TA-CV CLEA를 포함하는 비교예 1의 편평한 PVA 막 고정화 효소를 촉매로 사용하였다. 30℃에서 20시간 동안 반응시킨 후, HPLC 방법을 통해 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였고, 11주기의 전환율을 테스트하여 표 2에 기록하였다.
　 반복 사용에서 각 횟수의 전환율(%)
1회 2회 3회 4회 5회 6회 7회 8회 9회 10회 11회
TA-CV-CLEA 98 95 90.7 98.1 95.3 93.6 91.9 90.8 86.6 80.1 72.4
3차원 구조화
PVA 막
고정화 효소		 96.2 93.1 99.3 96.8 97.9 97.2 97.3 96.1 96.3 95.7 96.1
편평한 PVA 막
고정화 효소		 84.3 83.1 83.4 81.9 81.0 80.8 80.6 76.9 76.1 76.0 75.4
또한, PVA 분자량, PVA 농도, 및 효소와 PVA 용액의 비율이 PVA 막 고정화 효소의 활성 및 안정성에 미치는 영향 결과는 표 3에 나타낸 바와 같다.
효소 PVA 분자량
(KDa)		 PVA 농도
(g/100mL)		 효소와 PVA
용액의 비율
(g/100mL)		 전환율
(%)		 순환
횟수
TA-CV-V1-CLEA 6 15 5 ＞90% 7
TA-CV-V1-CLEA 20 15 5 ＞90% 9
TA-CV-V1-CLEA 100 15 5 ＞95% 15
TA-CV-V1-CLEA 200 15 5 ＞95% 15
TA-CV-V1-CLEA 250 15 5 ＞80% 5
TA-CV-V1-CLEA 100 1 5 ＞90% 8
TA-CV-V1-CLEA 100 10 5 ＞90% 13
TA-CV-V1-CLEA 100 20 5 ＞90% 17
TA-CV-V1-CLEA 20 50 5 ＞90% 11
TA-CV-V1-CLEA 20 60 5 ＞90% 8
TA-CV-V1-CLEA 200 12 0.5 ＞90% 7
TA-CV-V1-CLEA 200 12 1 ＞90% 13
TA-CV-V1-CLEA 200 12 10 ＞90% 17
TA-CV-V1-CLEA 200 12 20 ＞90% 16
TA-CV-V1-CLEA 200 12 40 ＞90% 12
TA-CV-V1-CLEA 200 12 50 ＞90% 9
혼합계의 pH값이 효소의 활성 및 안정성에 미치는 영향은 표 4에 나타낸 바와 같다.
효소 PVA 분자량
(KDa)		 PVA 농도
(g/100mL)		 효소와 PVA
용액의 비율
(g/100mL)		 pH 전환율
(%)		 순환 횟수
TA-CV-CLEA 200 15 5 4 50% 2
TA-CV-CLEA 200 15 5 5 80% 4
TA-CV-CLEA 200 15 5 6 ＞95% 8
TA-CV-CLEA 200 15 5 6.5 ＞95% 8
TA-CV-V1-CLEA 200 15 5 4 65% 6
TA-CV-V1-CLEA 200 15 5 5 75% 9
TA-CV-V1-CLEA 200 15 5 6 ＞95% 17
TA-CV-V1-CLEA 200 15 5 6.5 ＞95% 17
TA-CV-V2-CLEA 200 15 5 4 75% 8
TA-CV-V2-CLEA 200 15 5 5 90% 9
TA-CV-V2-CLEA 200 15 5 6 ＞95% 18
TA-CV-V2-CLEA 200 15 5 6.5 ＞95% 18
실시예 2
PVA 막 포매에 의한 트랜스아미나제 TA-CV CLEA의 고정화
PVA II 용액의 제조: 12% ~ 15%(w/v) PVA 수용액.
PVA 막 포매: 30mL의 PVA 용액을 취하여 3g의 CLEA 습식 입자 및 50mg의 PLP를 첨가하고, 균일하게 교반하여 혼합계를 형성한 후, 3D 다공성 실리카겔 템플릿에 붓고 37℃에서 건조시켜 막에 포매된 효소를 얻되, 각 템플릿의 탄성 구멍은 원형이며, 용적은 약 0.15 ~ 0.2cm3이고, 탄성 구멍의 표면적은 약 3 ~ 5cm2이다. 막에 포매된 효소를 0.1M PB 7.0 완충액에 밤새 침지하고, 막에 포매된 효소를 완충액에서 꺼낸 다음 0.1M PB 7.0 완충액으로 상기 막에 포매된 효소를 2회 세척하여 실시예 2의 PVA 막 고정화 효소를 얻었다.
CLEA를 첨가하기 전에, 일정량의 PEG400 ~ PEG6000을 각각 PVA II 용액에 용해시켜 병렬 실험(parallel experiment)을 수행하였다.
실시예 1의 기질 유형에 따른 전환 및 안정성 테스트:
0.1g의 케톤 기질 1을 취하여 0.35mL의 메탄올에 용해시키고, 아미노기 공여체로서 3.0몰 당량의 이소프로필아민 염산염을 첨가하고, 반응 시스템에 5mg의 PLP를 첨가한 다음, 0.3mL의 0.1M PB 7.0으로 희석하여 반응할 시스템을 형성하였다. 6mg의 TA-Cv CLEA가 포매된 비표면적이 약 6cm2인 실시예 2의 각 PVA 막 고정화 효소를 절단하여 촉매로 사용하고, PLP를 첨가하지 않고 병렬 반응(parallel reaction)을 수행하였다. 30℃에서 4시간 동안 반응시킨 후, HPLC 방법을 통해 전환율을 측정하였고, 매회 반응은 20시간 동안 수행하였으며, 1회의 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였고, 반복 사용 횟수를 조사하였으며, 테스트 결과는 도 1에 도시된 바와 같다.
도 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 2의 PVA 막 고정화 효소의 활성 및 안정성이 매우 우수하고, 14주기 사용 후에도 활성이 감소되지 않았다. PLP를 첨가하지 않은 경우 활성은 약간 낮았으나 안정성은 PLP를 첨가한 경우와 마찬가지로 양호하였으며, 도 1로부터 PEG400 또는 PEG6000을 첨가하면 반응 속도를 증가시킬 수 있음을 알 수 있다.
또한, PEG 분자량 및 혼합계 중의 PEG 농도가 효소의 활성 및 안정성에 미치는 영향을 조사하였으며, 그 결과는 표 5에 나타낸 바와 같다.
효소 PEG 분자량
(Da)		 첨가된
PEG의 농도		 3h
전환율(%)		 순환
횟수
TA-Cv-V1 가교 효소 응집체 무 무 ＞25% 14
TA-Cv-V1 가교 효소 응집체 400 1 ＞35% 14
TA-Cv-V1 가교 효소 응집체 400 3 ＞35% 15
TA-Cv-V1 가교 효소 응집체 400 5 ＞35% 15
TA-Cv-V1 가교 효소 응집체 400 10 ＞35% 14
TA-Cv-V1 가교 효소 응집체 2000 3 ＞35% 15
TA-Cv-V1 가교 효소 응집체 2000 5 ＞40% 15
TA-Cv-V1 가교 효소 응집체 2000 10 ＞40% 15
TA-Cv-V1 가교 효소 응집체 2000 12 ＞40% 13
TA-Cv-V1 가교 효소 응집체 2000 15 ＞40% 10
TA-Cv-V1 가교 효소 응집체 6000 1 ＞35% 14
TA-Cv-V1 가교 효소 응집체 6000 3 ＞35% 14
TA-Cv-V1 가교 효소 응집체 6000 5 ＞35% 14
TA-Cv-V1 가교 효소 응집체 6000 10 ＞35% 14
실시예 3
PVA-유기 용매 막 포매에 의한 TA-CV 습식 세포 유리 효소 또는 TA-CV CLEA의 고정화:
7.0mL의 10%(w/v) PVA 용액을 취하여 5mL의 TA-CV 유리 효소 용액(여기에 5mg/mL의 PLP가 함유됨) 또는 1g의 TA-CV CLEA와 혼합한 후 30분 동안 교반하여 혼합계를 형성하였고, 혼합계를 유리 또는 고온 내성 원판에 붓고 실온에서 3시간 동안 정치한 다음, 15mL의 유기 용매인 아세토니트릴을 3D 다공성 실리카겔 템플릿에 천천히 붓고 37℃에서 건조시켜 막에 포매된 효소를 형성하되, 각 템플릿의 탄성 구멍은 원형이며, 용적은 약 0.15 ~ 0.2cm3이고, 탄성 구멍의 표면적은 약 3 ~ 5cm2이다. 막에 포매된 효소를 0.1M PB 7.0 + 0.5M NaCl의 완충액에 2 ~ 3시간 동안 침지하고, 막에 포매된 효소를 완충액에서 꺼낸 다음 0.1M PB(pH 7.0)로 상기 막에 포매된 효소를 3회 세척하여 실시예 3의 두 가지 PVA 막 고정화 효소를 얻었다.
실시예 1의 기질 유형에 따른 전환 및 안정성 테스트:
0.1g의 케톤 기질 1을 취하여 0.35mL의 메탄올에 용해시키고, 아미노기 공여체로서 3.0몰 당량의 이소프로필아민을 첨가하고, 반응 시스템에 5mg의 PLP를 첨가한 다음, 0.3mL의 0.1M PB 7.0으로 희석하여 반응할 시스템을 형성하였다. TA-CV 습식 세포 또는 CLEA가 포매되어 제조된 비표면적이 약 6cm2인 PVA 막 고정화 효소를 절단하여 촉매로 사용하였다. 30℃에서 20시간 동안 반응시킨 후, HPLC 방법을 통해 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였고, 테스트 결과는 표 6 및 도 2에 도시된 바와 같다.
　 전환율
순환 횟수 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
PVA 막 고정화
TA-CV 유리 효소		 98.5 97.6 98.6 96.3 98.7 98.5 95.4 98.7 98.7 97.7
CLEA-PVA 막 고정화
가교 효소 응집체
(TA-CV CLEA)		 98.2 97.9 98 98.2 96 99 97.1 98.7 98.7 98.7
20시간 동안 반응시킨 후에도 전환율은 여전히 98%에 도달할 수 있으며, 10주기 사용 후에도 활성을 잃지 않고 안정적이다.
실시예 4
PVA-유기 용매 TA-CV 포매에 의한 고비표면적 고정화 TA-CV의 제조:
5.0mL의 10%(w/v) PVA 용액을 취하여 5mL의 TA-CV 유리 효소 용액(효소의 농도는 0.1g/mL이고, 5mg/mL의 PLP가 함유됨)과 혼합한 후 20분 동안 교반하여 혼합계를 형성하였으며, 기포를 제거하고, 0.1mL의 혼합계를 3D 다공성 실리카겔 템플릿에 적가하되, 각 템플릿의 단일 구멍은 원형 또는 사각형이며, 용적은 약 0.15 ~ 0.2cm3이고, 단일 구멍의 표면적은 약 3 ~ 5cm2이다. 실온에서 3시간 동안 정치한 다음, 0.06mL의 유기 용매인 아세톤 또는 아세토니트릴을 구멍에 천천히 적가하고, 37℃에서 건조시켜 각 구멍에서 중공 블록형 막에 포매된 효소를 형성하였다. 이러한 중공 블록형 막에 포매된 효소를 0.1M PB 7.0 + 0.5M NaCl 완충액에 2 ~ 3시간 동안 침지하였다. 다음으로, 완충액을 제거하고, 0.1M PB 7.0으로 중공 블록형 막에 포매된 효소를 3회 세척하여 실시예 4의 각 PVA 막 고정화 효소를 얻었다.
글루타르알데히드에 의한 일부 막에 포매된 효소에 대한 추가 변형: 0.1M PB 7.0으로 막에 포매된 효소를 재현탁하고 글루타르알데히드를 적가하되, 100mL당 현탁액에 1 ~ 2g의 글루타르알데히드를 적가하고, 실온에서 2시간 동안 부드럽게 교반하고, 완충액을 제거하고, 글루타르알데히드에 의해 변형된 중공 블록형 막에 포매된 효소를 0.1M PB 7.0으로 3회 세척하여 글루타르알데히드에 의해 변형된 PVA 막 고정화 효소를 얻었다.
실시예 1의 기질 유형에 따른 반응 활성 및 안정성 테스트:
0.1g의 케톤 기질을 취하여 0.35mL의 메탄올에 용해시키고, 아미노기 공여체로서 3.0몰 당량의 이소프로필아민 염산염을 첨가하고, 반응 시스템에 5mg의 보조인자 PLP를 첨가한 다음, 0.3mL의 0.1M PB 7.0으로 희석하여 반응할 시스템을 형성하였다. TA-CV 유리 효소(아세톤에 의해 건조됨)가 포매된 비표면적이 약 6cm2인 PVA 막 고정화 효소, TA-CV 유리 효소(아세톤에 의해 건조되고 글루타르알데히드에 의해 변형됨)가 포매된 비표면적이 약 6cm2인 PVA 막 고정화 효소, TA-CV 유리 효소(아세토니트릴에 의해 건조됨)가 포매된 비표면적이 약 6cm2인 PVA 막 고정화 효소, TA-CV 유리 효소(아세토니트릴에 의해 건조되고 글루타르알데히드에 의해 변형됨)가 포매된 비표면적이 약 6cm2인 PVA 막 고정화 효소를 절단하여 촉매로 사용하였다. 30℃에서 20시간 동안 반응시킨 후 10주기를 반복하고, HPLC 방법을 통해 20시간 반응의 전환율을 측정하였으며, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였고, 반복 사용 횟수를 조사하였으며, 테스트 결과는 표 7에 나타낸 바와 같다.
촉매 건조 및 변형 방식 전환율(%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
TA-CV 아세토니트릴에
의해 건조됨		 95.1 95.9 90.5 82.1 81.6 86.5 86.5 92.5 90.6 91.3
TA-CV 아세토니트릴에
의해 건조되고
1% 글루타르
알데히드에
의해 변형됨		 78.6 89.7 86.2 70.7 89.9 79.8 82.3 88 87.7 85.4
TA-CV 아세토니트릴에
의해 건조되고
2% 글루타르
알데히드에
의해 변형됨		 79.7 88.9 87.3 80.1 89.5 83.2 85.6 88.5 88.1 87.2
TA-CV 아세토니트릴에
의해 건조되고
2.5% 글루타르
알데히드에
의해 변형됨		 74.1 66.5 60.4 43.2 -/- -/- -/- -/- -/- -/-
TA-CV 아세톤에
의해 건조됨		 95.8 91.7 88.8 87.2 92.4 84.2 83.4 90.8 82.9 88.6
TA-CV 아세톤에
의해 건조되고
2% 글루타르
알데히드에
의해 변형됨		 85.3 78.9 77.9 72.7 77 74.2 78.5 81.2 81.7 79.3
또한, 탈수제와 PVA-효소 혼합계의 비율이 효소의 활성 및 안정성에 미치는 영향을 조사하였으며, 그 결과는 표 8에 나타낸 바와 같다.
촉매 탈수제 탈수제와
PVA-효소
혼합계의
부피비		 전환율(%) 반복 사용
횟수/회
TA-CV 아세토니트릴 1:20 ＞85% 16
1:10 ＞85% 18
1:5 ＞85% 19
1:1 ＞85% 19
3:1 ＞85% 19
5:1 ＞85% 18
7:1 ＞85% 16
아세톤 1:20 ＞85% 15
1:10 ＞85% 17
1:5 ＞85% 19
1:1 ＞85% 19
에탄올 1:10 ＞85% 18
1:5 ＞85% 19
1:1 ＞85% 19
표 7의 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 4의 PVA 막 고정화 효소를 촉매로 사용한 경우, 10주기 후에도 활성이 감소되지 않았다. GA에 의해 변형되는 경우, 효소의 활성은 약간 낮았으나 안정성은 GA에 의해 변형되지 않은 경우와 마찬가지로 양호하였다.
실시예 5
PVA-CFP 막 포매에 의한 TA-CV 유리 효소의 고정화
PVA 용액: 물에서 12%(w/v) 용액을 제조하였다.
보조인자-폴리머 용액(CFP 용액): 2%w/v PEI(폴리에틸렌이민)(3KDa ~ 70KDa)를 용해시키고, 5mg/mL의 보조인자(PLP)를 첨가하여 실온에서 0.5 ~ 3시간 동안 혼합하였다.
35mL의 PVA 용액 및 5mL의 CFP 용액을 취하여 30분 동안 충분히 혼합한 다음, 5mL의 효소 용액(효소의 농도는 0.1g/mL임) 및 3 ~ 5mg의 보조인자 PLP를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 혼합하여 혼합계를 형성하였다. 다음으로, 혼합계를 3D 구조화된 다공성 실리카겔 템플릿에 붓고 37℃에서 건조시켜 막에 포매된 효소를 얻되, 각 템플릿의 단일 구멍은 원형 또는 사각형이며, 용적은 약 0.15 ~ 0.2cm3이고, 단일 구멍의 표면적은 약 3 ~ 5cm2이다. 막에 포매된 효소를 0.1M PB 7.0 완충액에 밤새 침지하였다. 완충액을 제거한 후, 0.1M PB 7.0으로 막에 포매된 효소를 2회 세척하여 실시예 5의 PVA 막 고정화 효소를 얻었다.
실시예 1의 기질 유형에 따른 활성 및 안정성 테스트:
0.1g의 케톤 기질 1을 취하여 0.35mL의 메탄올에 용해시키고, 아미노기 공여체로서 3.0몰 당량의 이소프로필아민을 첨가하고, 반응 시스템에 5mg의 PLP를 첨가한 다음, 0.3mL의 0.1M PB 7.0으로 희석하여 반응할 시스템을 형성하였다. 3mg의 TA-CV 유리 효소가 포매된 비표면적이 약 3 ~ 4cm2인 실시예 4의 PVA 막 고정화 효소를 절단하여 촉매로 사용하고, PLP를 첨가하지 않고 병렬 반응을 수행하였다. 30℃에서 20시간 동안 반응시킨 후 14주기를 반복하고, HPLC 방법을 통해 4시간 반응의 전환율을 테스트하였으며, 테스트 결과는 도 3에 도시된 바와 같다.
도 3으로부터 알 수 있는 바와 같이, 형성된 PVA 막 고정화 효소의 활성 및 안정성이 매우 우수하고, 14주기 사용 후에도 활성이 감소되지 않았다. PLP를 첨가하지 않은 경우 활성은 약간 낮았으나 안정성은 PLP를 첨가한 경우와 마찬가지로 양호하였다.
또한, PEI 분자량 및 혼합계 중의 PEI의 농도가 효소의 활성 및 안정성에 미치는 영향을 조사하였으며, 그 결과는 표 9에 나타낸 바와 같다.
효소 PEI
분자량(KDa)		 첨가된
PEI의 농도		 4h 전환율(%) 순환 횟수
TA-Cv-V2 무 무 ＞25% 14
TA-Cv-V2 0.6 0.3 ＞25% 14
TA-Cv-V2 3 0.3 ＞35% 16
TA-Cv-V2 10 0.3 ＞35% 18
TA-Cv-V2 25 0.3 ＞35% 16
TA-Cv-V2 50 0.3 ＞35% 75
TA-Cv-V2 60 0.3 ＞35% 18
TA-Cv-V2 70 0.3 ＞35% 15
TA-Cv-V2 100 0.3 ＞35% 11
TA-Cv-V2 3 0.05 ＞35% 15
TA-Cv-V2 3 0.1 ＞35% 17
TA-Cv-V2 3 0.5 ＞35% 16
TA-Cv-V2 3 0.8 ＞35% 16
TA-Cv-V2 3 1 ＞35% 15
TA-Cv-V2 60 0.05 ＞35% 15
TA-Cv-V2 60 0.3 ＞35% 18
TA-Cv-V2 60 0.5 ＞35% 18
TA-Cv-V2 60 1 ＞35% 14
TA-Cv-V2 60 2 ＞35% 10
실시예 6
PVA-CFP 막 포매에 의한 TA-CV CLEA의 고정화
PVA 용액: 물에서 12%w/v의 용액을 제조하였다.
CFP 용액: 물에서 2%w/v PEI(3KDa ~ 70KDa) 용액을 제조하고, 5mg/mL의 보조인자(PLP)를 첨가하여 실온에서 0.5 ~ 3시간 동안 혼합하였다.
3g의 TA-CV CLEA를 10mL의 CFP 용액에 현탁하고 30mL의 PVA 용액과 충분히 혼합하여 혼합계를 형성하였다. 다음으로, 혼합계를 다공성 실리카겔 템플릿에 붓고 37℃에서 건조시켜 막에 포매된 효소를 형성하되, 각 템플릿의 단일 구멍은 원형 또는 사각형이며, 용적은 약 0.15 ~ 0.2cm3이고, 단일 구멍의 표면적은 약 3 ~ 5cm2이다. 막에 포매된 효소를 0.1M PB 7.0 완충액에 밤새 침지하였다. 막에 포매된 효소를 완충액에서 꺼낸 다음 0.1M PB 7.0으로 2회 세척하여 실시예 6의 PVA 막에 포매된 고정화 효소를 얻었다.
실시예 1의 기질 유형에 따른 활성 및 안정성 테스트:
0.1g의 케톤 기질 1을 취하여 0.35mL의 메탄올에 용해시키고, 아미노기 공여체로서 3.0몰 당량의 이소프로필아민을 첨가하고, 반응 시스템에 5mg의 PLP를 첨가한 다음, 0.3mL의 0.1M PB 7.0으로 희석하여 반응할 시스템을 형성하였다. 6mg의 TA-CV CLEA가 포매된 비표면적이 약 5cm2인 실시예 6의 PVA 막에 포매된 고정화 효소를 촉매로 사용하고, PLP를 첨가하지 않고 병렬 반응을 수행하였다. 30℃에서 20시간 동안 반응시킨 후 14주기를 반복하고, HPLC 방법을 통해 전환율을 측정하였으며, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였고, 반복 사용 횟수를 조사하였으며, 테스트 결과는 도 4에 도시된 바와 같다.
도 4로부터 알 수 있는 바와 같이, PVA 막에 포매된 고정화 효소의 활성 및 안정성이 매우 우수하고, 14주기 사용 후에도 활성이 감소되지 않았다. PLP를 첨가하지 않은 경우 활성은 약간 낮았으나 안정성은 PLP를 첨가한 경우와 마찬가지로 양호하였다.
실시예 7
PVA-CFP 막 포매에 의한 TA-Ac 유리 효소의 고정화
PVA 용액: 물에서 12%w/v의 용액을 제조하였다.
CFP 용액: 물에서 2%w/v PEI(3KDa ~ 70KDa) 용액을 제조하고, 5mg/mL의 보조인자(PLP)를 첨가하여 실온에서 0.5 ~ 3시간 동안 혼합하였다.
35mL의 PVA 용액 및 5mL의 CFP 용액을 취하여 30분 동안 충분히 혼합한 다음, 5mL의 TA-Ac효소 용액(효소의 농도는 0.1g/mL임) 및 3 ~ 5mg의 보조인자 PLP를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 혼합하여 혼합계를 얻었다. 다음으로, 혼합계를 3D 다공성 실리카겔 템플릿에 붓고 37℃에서 건조시켜 막에 포매된 효소를 얻되, 각 템플릿의 단일 구멍은 원형 또는 사각형이며, 용적은 약 0.15 ~ 0.2cm3이고, 단일 구멍의 표면적은 약 3 ~ 5cm2이다. 막에 포매된 효소를 0.1M PB 7.0에 밤새 침지하였다. 막에 포매된 효소를 완충액에서 꺼낸 다음 0.1M PB 7.0으로 2회 세척하여 실시예 7의 PVA 막에 포매된 고정화 효소를 얻었다.
실시예 1의 기질 유형에 따른 활성 및 안정성 테스트:
구체적으로, 케톤 기질 2
Figure pct00008
로 실시예 1에서 사용된 케톤 기질 1을 대체하였다.
수성 완충 시스템에서의 테스트: 0.1g의 케톤 기질 2를 취하여 1mL의 0.1M PB 7.0 완충액에 현탁하고, 아미노기 공여체로서 3.0몰 당량의 이소프로필아민 염산염을 첨가하고, 반응 시스템에 5mg의 PLP를 첨가하고, 10mg의 TA-Ac 유리 효소를 포함하는 실시예 7의 PVA 막에 포매된 고정화 효소를 촉매로 사용하였다. 30℃에서 20시간 동안 반응시킨 후 5주기를 반복하고, HPLC 방법을 통해 전환율을 측정하였으며, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였고, 반복 사용 횟수를 조사하였으며, 테스트 결과는 표 10에 나타낸 바와 같다.
2상 시스템에서의 테스트: 0.1g의 케톤 기질 2를 취하여 비수상의 1mL의 MTBE에 용해시키고, 수상으로서 1mL의 0.1M PB 7.0을 첨가하고, 아미노기 공여체로서 3.0몰 당량의 이소프로필아민을 첨가하고, 반응 시스템에 5mg의 PLP를 첨가하여 반응할 시스템을 형성하였으며, 10mg의 TA-Ac 유리 효소를 포함하는 실시예 7의 PVA 막 고정화 효소를 촉매로 사용하였다. 30℃에서 20시간 동안 반응시킨 후 5주기를 반복하고, HPLC 방법을 통해 전환율을 측정하였으며, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였고, 반복 사용 횟수를 조사하였으며, 테스트 결과는 표 10에 나타낸 바와 같다.
　 용매계 전환율(%)
1 2 3 4 5
실시예 7의
PVA 막 고정화 효소 TA-Ac		 수성 63.7 67.4 59.5 64.1 62.9
2상 39.6 42.2 46.4 49.2 44.1
표 10의 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 7의 PVA 막 고정화 효소의 활성 및 안정성이 매우 우수하고, 5주기 사용 후에도 활성이 감소되지 않았다.
PVA 분자량, PVA 농도, 및 효소와 PVA 용액의 비율이 효소의 활성 및 안정성에 미치는 영향을 조사하였으며, 그 결과는 표 11에 나타낸 바와 같다.
효소 PVA 분자량
(KDa)		 PVA 농도
(g/100mL)		 효소와
PVA 용액의 비율
(g/100mL)		 전환율
(%)		 순환
횟수
TA-Ac-V1 20 15 5 ＞60% 8
TA-Ac-V1 100 15 5 ＞60% 13
TA-Ac-V1 200 15 5 ＞60% 14
TA-Ac-V1 250 15 5 ＞60% 7
TA-Ac-V1 100 1 5 ＞60% 8
TA-Ac-V1 100 10 5 ＞60% 10
TA-Ac-V1 100 20 5 ＞60% 11
TA-Ac-V1 20 50 5 ＞60% 13
TA-Ac-V1 20 60 5 ＞60% 8
TA-Ac-V1 200 12 0.5 ＞60% 7
TA-Ac-V1 200 12 1 ＞60% 9
TA-Ac-V1 200 12 10 ＞60% 12
TA-Ac-V1 200 12 20 ＞60% 13
TA-Ac-V1 200 12 40 ＞60% 11
TA-Ac-V1 200 12 50 ＞60% 7
TA-Ac 200 12 10 ＞60% 5
TA-Ac 200 12 20 ＞60% 6
TA-Ac 200 12 40 ＞60% 6
실시예 8
PVA-CFP 막 포매에 의한 케토리덕타제의 고정화
PVA 용액:물에서 12%(w/v) 용액을 제조하였다.
CFP 용액: 물에 용해된 2%(w/v) PEI(3KDa ~ 70KDa)를 제조하고, 경우에 따라 5mg/mL의 보조인자(NAD+ 또는 PLP)를 첨가하여 실온에서 0.5 ~ 3시간 동안 혼합하였다.
35mL의 PVA 용액 및 5mL의 CFP 용액을 취하여 30분 동안 충분히 혼합한 다음, 5mL의 KRED-Ac 또는 KRED-Cm의 효소 용액(효소의 농도는 0.1g/mL임) 및 4mg의 보조인자 NAD+를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 혼합하여 혼합계를 형성하였다. 다음으로, 혼합계를 3D 실록산 템플릿에 붓되, 각 템플릿의 단일 구멍은 원형 또는 사각형이며, 용적은 약 0.15 ~ 0.2cm3이고, 단일 구멍의 표면적은 약 3 ~ 5cm2이다. 37℃에서 건조시켜 막에 포매된 효소를 형성하였다. 막에 포매된 효소를 0.1M PB 7.0에 밤새 침지하였다. 막에 포매된 효소를 완충액에서 꺼낸 다음 0.1M PB 7.0으로 2회 세척하여 실시예 8의 NAD+ 함유 PVA 막 고정화 효소를 얻었다.
PLP로 보조인자 NAD+를 대체하여 상기 과정을 반복하여 실시예 8의 PLP 함유 PVA 막 고정화 효소를 얻었다.
활성 및 안정성 테스트:
전환 연구에서 사용된 반응 모델:
Figure pct00009
상기 반응식에서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 아랄킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬로부터 선택될 수 있거나, 또는 R1과 R2는 연결되어 고리를 형성할 수 있다.
케톤 기질:
Figure pct00010
,
Figure pct00011
0.1g의 케톤 기질 3 또는 4를 취하여 0.5mL의 이소프로판올에 용해시키고, 반응 시스템에 5mg의 보조인자 NAD+를 함유한 0.5mL의 0.1M PB 7.0을 첨가하여 반응할 시스템을 형성하였으며, 반응할 시스템에 촉매로서 30mg의 케토리덕타제 KRED-Ac(케톤 기질 3을 사용하여 활성을 테스트함) 또는 케토리덕타제 KRED-Cm(케톤 기질 4를 사용하여 활성을 테스트함)이 포매된 실시예 8의 PVA 막에 포매된 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 20시간 동안 반응시킨 후 11주기를 반복하고, GC 방법으로 전환율을 측정하였으며, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였고, 반복 사용 횟수를 조사하였으며, 그 결과는 도 5, 도 6에 도시된 바와 같고, 여기서 도 5에 대응되는 기질은 케톤 기질 3이고, 도 6에 대응되는 기질은 케톤 기질 4이다.
도 5로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 8의 PVA 막 고정화 효소 KRED-Ac는 케톤 기질 3에 대한 활성 및 안정성이 매우 우수하고, 전환율이 99%에 이르며, 11주기 반복 사용 후에도 활성이 손실되지 않았다. PLP로 CFP 용액을 제조할 경우, 활성은 NAD+보다 훨씬 좋았다.
도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, 실시예 8에서 얻은 PVA 막에 포매된 고정화 효소 KRED-Cm의 활성 및 안정성이 매우 우수하고, 전환율이 99%에 이르며, 10주기 반복 사용 후에도 활성이 손실되지 않았다. PLP로 CFP 용액을 제조할 경우, 활성은 NAD+보다 훨씬 좋았다.
효소계에서 보조인자의 농도를 조사하였으며, 그 결과는 표 12에 나타낸 바와 같다.
효소 보조인자 보조인자의 농도
(mg/mL)		 전환율(%) 순환 횟수
KRED-Ac PLP 0.5 ＞99% 12
KRED-Ac PLP 1 ＞99% 14
KRED-Ac PLP 5 ＞99% 14
KRED-Ac PLP 10 ＞99% 14
KRED-Ac PLP 20 ＞99% 14
KRED-Ac PLP 30 ＞99% 14
KRED-Ac NAD 0.5 ＞99% 8
KRED-Ac NAD 1 ＞99% 10
KRED-Ac NAD 5 ＞99% 14
KRED-Ac NAD 10 ＞99% 15
KRED-Ac NAD 20 ＞99% 15
KRED-Ac NAD 30 ＞99% 15
KRED-Ac-V1 PLP 5 ＞99% 18
KRED-Ac-V1 PLP 10 ＞99% 18
KRED-Ac-V1 NAD 5 ＞99% 15
KRED-Ac-V1 NAD 10 ＞99% 17
실시예 9
PVA 막에 포매된 고정화 트랜스아미나제 TA-Bt 및 이의 보조효소 LDH, FDH의 공-가교 효소, 트랜스아미나제 TA-Bt 및 이의 보조효소 LDH, FDH의 공-가교 효소는 이하에서 공-가교 효소로 약칭된다.
PVA I 용액의 제조: 50mL의 10%(w/v) PVA(200KDa)를 30mL의 10%(w/v) 아세트산, 50%(v/v) 메탄올, 10%(w/v) 황산과 혼합하였다.
PVA 막 캡슐화: PVA I 용액의 pH를 4 ~ 6.5로 조절하고, 20mL의 용액을 취하여 공-가교 효소의 현탁액과 혼합(공-가교 효소의 현탁액의 조성은 2ml의 0.1M 인산 완충액(PB) pH 7.0 중 0.5g의 TA-Bt와 LDH 및 FDH의 공-가교 효소이고, ml당 2mg의 PLP(피리독살인산)가 함유됨)한 후 20분 동안 교반하여 혼합계를 형성하였다. 이를 3D 다공성 실리카겔 템플릿에 붓고 37℃에서 건조시켜 막에 포매된 효소를 얻되, 각 템플릿의 탄성 구멍은 정사각형이며, 용적은 약 0.1 ~ 0.2cm3이고, 탄성 구멍의 표면적은 약 2 ~ 5cm2이다. 막에 포매된 효소를 0.1M PB(pH 7.0) + 0.5M NaCl의 완충액에 3시간 동안 침지하고, 막에 포매된 효소를 완충액에서 꺼낸 다음, 0.1M PB(pH 7.0)로 상기 막에 포매된 효소를 3회 세척하여 실시예 9의 PVA 막 고정화 효소를 얻었다.
활성 및 안정성 테스트.
전환 연구에서 사용된 반응 모델:
Figure pct00012
상기 반응식에서 R은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 아랄킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬, 할로겐으로부터 선택될 수 있다.
Figure pct00013
5mL의 0.1M PB(pH 8.0)를 10ml의 반응 플라스크에 넣은 후, 100mg의 상기 기질 5, 80mg의 포름산암모늄, 및 5mg의 PLP를 첨가하고, pH를 7.5 ~ 8.0으로 조절한 다음 5mg의 NAD+ 및 10mg의 막 고정화 효소(습식, 50 ~ 80% 물 함유)를 첨가하였다. 30℃에서 20시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였다. 구체적으로, TA-Bt와 보조효소의 공동 고정화 효소에서 주효소와 보조효소의 비율이 효소의 활성 및 안정성에 미치는 영향을 조사하였으며, 그 결과는 표 13에 나타낸 바와 같다.
효소 TA:LDH:FDH 질량비 전환율(%) 순환 횟수
TA-Bt+LDH+FDH 15:1:1 80% 10
TA-Bt+LDH+FDH 10:1:1 ＞99% 10
TA-Bt+LDH+FDH 10:1:2 ＞99% 11
TA-Bt+LDH+FDH 5:1:1 ＞99% 16
TA-Bt+LDH+FDH 7:1:1 ＞99% 12
TA-Bt+LDH+FDH 7:1:2 ＞99% 15
TA-Bt+LDH+FDH 5:1:1 ＞99% 12
TA-Bt+LDH+FDH 6:1:2 ＞99% 15
TA-Bt+LDH+FDH 5:1:3 ＞99% 16
실시예 10
PVA-CFP 막 표매에 의한 TA-Bt와 보조효소 D-LDH, FDH의 공동 고정화
PVA(200KDa) 용액: 물에서 12%(w/v) 용액을 제조하였다.
CFP 용액: 2%(w/v) PEI(3KDa ~ 70KDa) 수용액을 제조하고, 5mg/mL의 보조인자(PLP)를 첨가하여 실온에서 0.5 ~ 3시간 동안 혼합하였다.
35mL의 PVA 용액 및 5mL의 CFP 용액을 취하여 30분 동안 충분히 혼합한 다음, 5mL의 TA-Bt 효소 용액(효소의 농도는 0.08g/mL임), 0.08g의 보조효소 D-LDH, 0.1g의 보조효소 FDH, 및 4mg의 보조인자 NAD+를 첨가하고, 실온에서 30분 동안 혼합하여 혼합계를 형성하였다. 다음으로, 혼합계를 3D 실록산 템플릿에 붓되, 각 템플릿의 단일 구멍은 원형 또는 사각형이며, 용적은 약 0.15 ~ 0.2cm3이고, 단일 구멍의 표면적은 약 3 ~ 5cm2이다. 37℃에서 건조시켜 막에 포매된 효소를 형성하였다. 막에 포매된 효소를 0.1M PB 7.0에 밤새 침지하였다. 막에 포매된 효소를 완충액에서 꺼낸 다음 0.1M PB 7.0으로 2회 세척하여 실시예 10의 PLP 및 NAD+ 함유 PVA-CFP 막 고정화 효소를 얻었다.
실시예 9의 모델을 사용한 활성 및 안정성 테스트:
5mL의 0.1M PB(pH 8.0)를 10ml의 반응 플라스크에 넣은 후, 100mg의 상기 기질 5, 80mg의 포름산암모늄, 및 5mg의 PLP를 첨가하고, pH를 7.5 ~ 8.0으로 조절한 다음 5mg의 NAD+, 10mg의 PLP 및 NAD+ 함유 PVA-CFP 막 고정화 효소(습식, 50 ~ 80% 물 함유)를 첨가하였다. 30℃에서 20시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였고, PLP를 첨가하지 않고 병렬 반응을 수행하였다.
30℃에서 4시간 동안 반응시킨 후 9주기를 반복하고, HPLC 방법을 통해 전환율을 측정하였으며, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였고, 반복 사용 횟수를 조사하였으며, 테스트 결과는 도 7에 도시된 바와 같다.
도 7로부터 알 수 있는 바와 같이, 얻은 PVA 막 고정화 효소의 활성 및 안정성이 매우 우수하고, 9주기 사용 후에도 활성의 현저한 손실은 없었고, PLP가 첨가되지 않은 반응 시스템의 활성 및 안정성은 PLP를 첨가한 경우와 마찬가지로 양호하였다.
실시예 11
PVA-CFP 막 고정화 시클로헥사논 모노옥시게나제:
고정화 방법은 PVA에 캡슐화된 효소를 시클로헥사논 모노옥시게나제 CHMO-Rs 또는 CHMO-Bp, 또는 시클로헥사논 모노옥시게나제 CHMO와 이의 보조효소인 알코올 탈수소효소 ADH-Tb 또는 포도당 탈수소효소 GDH 혼합 효소로 변경한 것을 제외하고는 실시예 10과 동일하며, 구체적인 효소 조성은 표 14에 나타낸 바와 같다.
활성 및 안정성 테스트:
전환 연구에서 사용된 반응 모델:
Figure pct00014
상기 반응식에서 R은 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아랄킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬로부터 선택될 수 있거나, 또는 R은 이에 연결된 헤테로고리와 함께 축합 고리 시스템을 형성할 수 있다.
CHMO의 PVA-CFP 막 고정화 효소의 활성은 하기 기질 6을 이용하여 반응시켜 검출하였다.
Figure pct00015
3mL의 0.1M PB(pH 8.0)를 10ml의 반응 플라스크에 넣은 후, 50mg의 기질 6, 100mg의 포도당, 및 5mg의 NADP+, 50mg의 알코올 탈수소효소 ADH-Tb, 5mg의 포도당 탈수소효소 GDH를 첨가한 다음, 20mg의 시클로헥사논 모노옥시게나제를 포함하는 PVA-CFP 막 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 20시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였다.
CHMO와 보조효소 GDH의 PVA-CFP 막 고정화 효소의 활성은 다음과 같은 반응 조건으로 검출하였다.
3mL의 0.1M PB(pH 8.0)를 10ml의 반응 플라스크에 넣은 후, 50mg의 기질 6, 100mg의 포도당, 및 5mg의 NADP+를 첨가한 다음, 30mg의 CHMO와 GDH 혼합 효소의 공동 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 20시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였다.
CHMO와 보조효소 ADH-Tb의 PVA-CFP 막 고정화 효소의 활성은 다음과 같은 반응 조건으로 검출하였다.
3mL의 0.1M PB(pH 8.0)를 10ml의 반응 플라스크에 넣은 후, 50mg의 기질 6, 200μl의 이소프로판올, 및 5mg의 NADP+를 첨가한 다음, 30mg의 CHMO와 ADH 혼합 효소의 공동 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 20시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였다.
테스트 결과는 표 14에 나타낸 바와 같다.
CFP-PVA에
캡슐화된 효소		 주효소:보조효소(중량비) 전환율(%) 순환 횟수
CHMO-Rs -/- ＞90% 8
CHMO-Bp -/- ＞90% 7
CHMO-Rs+ADH 12:1 ＞90% 6
10:1 ＞90% 7
5:1 ＞90% 8
5:2 ＞90% 8
1:1 ＞90% 5
1:2 80% 3
CHMO-Rs+GDH 5:1 ＞90% 6
5:2 ＞90% 7
1:1 ＞90% 3
CHMO-Rs-V1+ADH 5:2 ＞90% 16
CHMO-Rs-V2+ADH 5:2 ＞90% 18
CHMO-Bp+ADH 10:1 ＞90% 8
5:1 ＞90% 10
5:2 ＞90% 10
1:1 ＞90% 5
CHMO-Bp+GDH 5:1 ＞90% 8
5:2 ＞90% 7
1:1 ＞90% 5
CHMO-Rr -/- ＞90% 11
CHMO-Rr-V1 -/- ＞90% 16
CHMO-Rr-V2 -/- ＞90% 19
CHMO-Rr-V1+ADH 10:1 ＞90% 13
CHMO-Rr-V1+ADH 5:1 ＞90% 16
CHMO-Rr-V1+ADH 3:1 ＞90% 15
CHMO-Rr-V2+ADH 5:1 ＞90% 20
실시예 12
PVA-CFP 막 고정화 엔-리덕타제:
고정화 방법은 PVA에 캡슐화된 효소를 엔-리덕타제 ERED-Sc 또는 ERED-Chr, 또는 엔-리덕타제와 이의 보조효소인 포도당 탈수소효소 GDH 또는 포름산암모늄 탈수소효소 FDH의 혼합 효소로 변경한 것을 제외하고는 실시예 10과 동일하며, 두 가지 효소의 중량비는 ERED:GDH(또는 FDH)=5:1이다.
활성 및 안정성 테스트.
전환 연구에서 사용된 반응 모델:
Figure pct00016
상기 반응식에서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 아랄킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬로부터 선택될 수 있거나, 또는 R1과 R2는 고리를 형성할 수 있다.
ERED의 PVA-CFP 막 고정화 효소의 활성은 하기 기질 7의 반응을 통해 검출하였다.
Figure pct00017
3mL의 0.1M PB(pH 7.0 ~ 8.0)를 10ml의 반응 플라스크에 넣은 후, 100mg의 기질 7을 첨가하고, 이어서 20mg의 NAD(P)+, 80mg의 포름산암모늄, 5mg의 FDH, 및 30mg의 엔-리덕타제를 포함하는 PVA-CFP 막 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였다.
ERED와 FDH의 PVA-CFP 막 고정화 효소의 활성은 하기 기질 7의 반응을 통해 검출하였다.
3mL의 0.1M PB(pH 7.0 ~ 8.0)를 10ml의 반응 플라스크에 넣은 후, 100mg의 기질 7을 첨가하고, 이어서 20mg의 NAD(P)+, 80mg의 포름산암모늄, 및 40mg의 엔-리덕타제와 FDH 혼합 효소를 포함하는 PVA-CFP 막 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였다.
ERED와 GDH의 PVA-CFP 막 고정화 효소의 활성은 다음과 같은 반응을 통해 검출하였다.
3mL의 0.1M PB(pH 7.0 ~ 8.0)를 10ml의 반응 플라스크에 넣은 후, 100mg의 기질 7을 첨가하고, 이어서 20mg의 NAD(P)+, 120mg의 포도당, 및 40mg의 엔-리덕타제와 GDH 혼합 효소를 포함하는 PVA-CFP 막 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였다. 테스트 결과는 표 15에 나타낸 바와 같다.
CFP-PVA에 캡슐화된 효소 주효소:보조효소(중량비) 전환율(%) 순환 횟수
ERED-Sc -/- ＞94% 10
ERED-Chr -/- ＞90% 11
ERED-Sc+FDH 5:1 ＞90% 11
2:1 ＞90% 12
1:1 ＞90% 10
1:2 ＞90% 10
1:5 ＞90% 10
1:10 ＞90% 10
1:12 ＞90% 8
ERED-Sc+GDH 5:1 ＞90% 13
2:1 90% 13
1:1 90% 11
1:2 90% 10
ERED-Chr+GDH 5:1 ＞90% 11
2:1 ＞90% 11
1:1 ＞90% 10
1:2 ＞90% 10
1:5 ＞90% 9
1:10 ＞90% 7
실시예 13
PVA-CFP 막 고정화 이민 리덕타제
고정화 방법은 PVA에 캡슐화된 효소를 이민 리덕타제 IRED-Str 또는 IRED-Bc, 또는 엔-리덕타제와 이의 보조효소인 포도당 탈수소효소 GDH 또는 포름산암모늄 탈수소효소 FDH의 혼합 효소로 변경한 것을 제외하고는 실시예 10과 동일하며, 두 가지 효소의 비율은 ERED:GDH(또는 FDH)=4:1이다.
활성 및 안정성 테스트.
전환 연구에서 사용된 반응 모델:
Figure pct00018
상기 반응식에서 R1 및 R2는 각각 독립적으로 H, 치환 또는 비치환된 알킬, 치환 또는 비치환된 시클로알킬, 치환 또는 비치환된 아릴, 치환 또는 비치환된 아랄킬, 치환 또는 비치환된 헤테로고리, 치환 또는 비치환된 헤테로시클로알킬로부터 선택될 수 있거나, 또는 R1 및 R2는 이들에 연결된 헤테로고리 또는 방향족 고리와 함께 축합 고리 시스템을 형성할 수 있다.
IRED의 PVA-CFP 막 고정화 효소의 활성은 하기 기질 8을 사용하여 다음과 같은 방법에 따라 테스트하였다.
Figure pct00019
2mL의 0.1M PB 완충액(pH 7.0 ~ 8.0)을 10mL의 반응 플라스크에 넣은 다음, 100mg의 상기 기질 8, 10mg의 NAD(P)+, 60mg의 포름산암모늄, 10mg의 FDH, 및 40mg의 IRED를 포함하는 PVA-CFP 막 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였다.
IRED 및 FDH의 PVA-CFP 막 고정화 효소의 활성은 기질 8을 사용하여 다음과 같은 방법에 따라 테스트하였다.
2mL의 0.1M PB 완충액(pH 7.0 ~ 8.0)을 10mL의 반응 플라스크에 넣고, 100mg의 상기 기질 8을 첨가한 다음, 10mg의 NAD(P)+, 60mg의 포름산암모늄을 첨가하고, 그 다음 50mg의 IRED 및 FDH 혼합 효소를 포함하는 PVA-CFP 막 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였다.
IRED 및 GDH의 PVA-CFP 막 고정화 효소의 활성은 다음과 같은 방법에 따라 테스트하였다.
3mL의 0.1M PB 완충액(pH 7.0 ~ 8.0)을 10mL의 반응 플라스크에 넣은 후, 100mg의 기질 8을 첨가한 다음, 10mg의 NAD(P)+, 100mg의 포도당, 및 50mg의 IRED 및 GDH 혼합 효소를 포함하는 PVA-CFP 막 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 테스트하였다. 테스트 결과는 표 16에 나타낸 바와 같다.
CFP-PVA에 캡슐화된 효소 전환율(%) 순환 횟수
IRED-Str ＞90% 6
IRED-Bc ＞90% 7
IRED-Str+FDH ＞90% 5
IRED-Str+GDH ＞90% 6
IRED-Bc+FDH ＞90% 4
IRED-Bc+GDH ＞90% 6
실시예 14
PVA-CFP 막 고정화 니트릴라제
고정화 방법은 PVA에 캡슐화된 효소를 니트릴라제 NIT-An 또는 NIT-Nc의 효소 용액(효소의 농도는 0.1g/mL임) 또는 NIT-An 또는 NIT-Nc의 가교 효소 응집체 현탁액(0.5g/mL)으로 변경한 것을 제외하고는 실시예 10과 동일하다.
활성 및 안정성 테스트.
전환 연구에서 사용된 반응 모델:
Figure pct00020
니트릴라제의 PVA-CFP 막 고정화 효소의 활성은 하기 기질 9를 사용하여 다음과 같은 방법에 따라 테스트하였다.
Figure pct00021
2mL의 0.1M PB 완충액(pH 7.0 ~ 8.0)을 10mL의 반응 플라스크에 넣고, 100mg의 상기 기질 9를 첨가한 다음, 20mg의 NIT를 포함하는 PVA-CFP 막 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였다.
테스트 결과는 표 17에 나타낸 바와 같다.
CFP-PVA에 캡슐화된 효소 전환율(%) 순환 횟수
NIT-An ＞98% 5
NIT-Nc ＞98% 4
NIT-An 가교 효소 응집체 ＞98% 8
NIT-Nc 가교 효소 응집체 ＞98% 8
실시예 15
PVA-CFP 막 고정화 암모니아 분해효소
고정화 방법은 PVA에 캡슐화된 효소를 암모니아 분해효소 PAL-An 또는 PAL-Ss로 변경한 것을 제외하고는 실시예 10과 동일하다.
활성 및 안정성 테스트.
전환 연구에서 사용된 반응 모델:
Figure pct00022
암모니아 분해효소 PAL의 PVA-CFP 막 고정화 효소의 활성은 하기 기질 10을 사용하여 다음과 같은 방법에 따라 테스트하였다.
Figure pct00023
8mL의 4M 카밤산암모늄 수용액(pH 9.0 ~ 9.5)을 10mL의 반응 플라스크에 넣고, 100mg의 상기 기질 10을 첨가한 다음, 40mg의 NIT를 포함하는 PVA-CFP 막 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였다.
테스트 결과는 표 18에 나타낸 바와 같다.
CFP-PVA에 캡슐화된 효소 전환율(%) 순환 횟수
PAL-An ＞98% 18
PAL-Ss ＞98% 17
실시예 16
PVA-CFP 막 고정화 아미노산 탈수소효소
고정화 방법은 PVA에 캡슐화된 효소를 아미노산 탈수소효소 AADH-Bc 또는 AADH-Bs, 또는 아미노산 탈수소효소와 이의 보조효소인 포도당 탈수소효소 GDH 또는 포름산암모늄 탈수소효소 FDH의 혼합 효소로 변경한 것을 제외하고는 실시예 10과 동일하며, 두 가지 효소의 비율은 AADH:GDH(또는 FDH)=4:1이다.
활성 및 안정성 테스트.
전환 연구에서 사용된 반응 모델:
Figure pct00024
R은 치환 또는 비치환된 아릴이다.
AADH의 PVA-CFP 막 고정화 효소의 활성은 하기 기질 11 또는 12를 사용하여 다음과 같은 방법에 따라 테스트하였다.
Figure pct00025
,
Figure pct00026
5mL의 0.1M Tris-Cl 완충액(pH 8.0 ~ 9.0)을 10mL의 반응 플라스크에 넣은 다음, 100mg의 기질 11 또는 12, 108mg의 염화암모늄을 첨가하고, pH를 7.5 ~ 8.0으로 조절한 다음, 10mg의 NAD+, 150mg의 포도당, 및 10mg GDH를 첨가하고, 마지막으로 20mg의 AADH가 포매된 PVA-CFP 막 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였다.
AADH 및 FDH 공동 고정화 효소의 활성 검출 방법은 다음과 같다.
5mL의 0.1M Tris-Cl 완충액(pH 8.0 ~ 9.0)을 10mL의 반응 플라스크에 넣은 다음, 100mg의 기질 11 또는 12, 108mg의 염화암모늄을 첨가하고, pH 7.5 ~ 8.0으로 조절한 다음, 10mg의 NAD+, 80mg의 포름산암모늄, 및 50mg의 AADH와 FDH 혼합 효소가 포매된 PVA-CFP 막 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였다.
AADH 및 GDH의 PVA-CFP 막 고정화 효소의 활성 검출 방법은 다음과 같다.
5mL의 0.1M Tris-Cl 완충액(pH 8.0 ~ 9.0)을 10mL의 반응 플라스크에 넣은 다음, 100mg의 기질 11 또는 12, 108mg의 염화암모늄을 첨가하고, pH 7.5 ~ 8.0으로 조절한 다음, 10mg의 NAD+, 150mg의 포도당, 및 50mg의 AADH와 GDH 혼합 효소가 포매된 PVA-CFP 막 고정화 효소를 첨가하였다. 30℃에서 16시간 동안 반응시킨 후, 전환율을 측정하였고, 매회 반응이 종료된 후 고정화 효소를 분리하여 다음 회의 반응에서 반복 사용하였으며, 반복 사용 횟수를 조사하였다. 테스트 결과는 표 19에 나타낸 바와 같다.
CFP-PVA에 캡슐화된 효소 전환율(%) 순환 횟수
AADH-Bc ＞95% 7
AADH-Bs ＞95% 9
AADH-Bc+FDH ＞95% 6
AADH-Bc+GDH ＞95% 8
AADH-Bs+FDH ＞95% 8
AADH-Bs+GDH ＞95% 7
이상의 설명으로부터 본 발명에 따른 실시예가 다음과 같은 기술적 효과를 구현함을 알 수 있다.
본 발명은 PVA 다공성 막을 담체로 사용하여 효소를 포매 방식으로 고정화함으로써, 포매 및 고정화 프로세스가 간단하고, 조건이 온화하며, 정제된 효소 또는 조효소에 대해 모두 우수한 고정화 효과가 있고, 효소는 PVA 다공성 막에 포매 및 고정화된 후 비교적 안정하여 사용 과정에서 쉽게 침출되지 않는다. 사용된 PVA 다공성 막의 다공성 구조는 반응물 및 생성물을 더 잘 전달할 수 있으므로, 연속 흐름 생화학 촉매 작용에 사용하기에 적합하다. 상기 포매 및 고정화는 기계적 고정화이기 때문에 효소에 대한 광범위한 적용성을 갖는다. PVA 다공성 막을 3차원 구조화하여 입체적 구조를 갖도록 함으로써, 표면적이 더 넓어지고 보다 많은 포매 부위를 제공하여, 효소의 높은 활성 및 안정성을 보장함과 동시에 효소의 로딩량을 향상시킬 수 있다.
상술한 내용은 본 발명의 바람직한 실시예일 뿐 본 발명을 제한하지 않으며, 당업자에게 있어서 본 발명이 다양한 수정 및 변경이 이루어질 수 있음은 자명한 것이다. 본 발명의 사상 및 원칙 내에서 진행된 임의의 수정, 등가적 대체, 개선 등은 모두 본 발명의 보호범위 내에 속해야 한다.
<110> ASYMCHEM LIFE SCIENCE (TIANJIN) CO., LTD. <120> PVA Membrane Immobilized Enzyme and Preparation Method therefor <130> PN192225KLY <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 459 <212> PRT <213> Chromobacterium violaceum DSM30191 <400> 1 Met Gln Lys Gln Arg Thr Thr Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala 1 5 10 15 His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly 20 25 30 Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser Glu 35 40 45 Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val 50 55 60 Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu 65 70 75 80 Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr Thr His Pro Ala Val 85 90 95 Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp 100 105 110 Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile 115 120 125 Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys 130 135 140 Thr Leu Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly 145 150 155 160 Ala Ser Leu Gly Gly Met Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro 165 170 175 Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly 180 185 190 Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu 195 200 205 Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val 210 215 220 Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr 225 230 235 240 Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu 245 250 255 Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe 260 265 270 Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys 275 280 285 Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys 290 295 300 Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe 305 310 315 320 Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val 325 330 335 Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile 340 345 350 Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu 355 360 365 His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Val Gln Ala Phe Thr Leu 370 375 380 Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile 385 390 395 400 Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Arg 405 410 415 Ala Cys Gly Asp His Ile Val Ser Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg 420 425 430 Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu 435 440 445 Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala 450 455 <210> 2 <211> 476 <212> PRT <213> Arthrobacter citreus <400> 2 Met Gly Leu Thr Val Gln Lys Ile Asn Trp Glu Gln Val Lys Glu Trp 1 5 10 15 Asp Arg Lys Tyr Leu Met Arg Thr Phe Ser Thr Gln Asn Glu Tyr Gln 20 25 30 Pro Val Pro Ile Glu Ser Thr Glu Gly Asp Tyr Leu Ile Thr Pro Gly 35 40 45 Gly Thr Arg Leu Leu Asp Phe Phe Asn Gln Leu Cys Cys Val Asn Leu 50 55 60 Gly Gln Lys Asn Gln Lys Val Asn Ala Ala Ile Lys Glu Ala Leu Asp 65 70 75 80 Arg Tyr Gly Phe Val Trp Asp Thr Tyr Ala Thr Asp Tyr Lys Ala Lys 85 90 95 Ala Ala Lys Ile Ile Ile Glu Asp Ile Leu Gly Asp Glu Asp Trp Pro 100 105 110 Gly Lys Val Arg Phe Val Ser Thr Gly Ser Glu Ala Val Glu Thr Ala 115 120 125 Leu Asn Ile Ala Arg Leu Tyr Thr Asn Arg Pro Leu Val Val Thr Arg 130 135 140 Glu His Asp Tyr His Gly Trp Thr Gly Gly Ala Ala Thr Val Thr Arg 145 150 155 160 Leu Arg Ser Phe Arg Ser Gly Leu Val Gly Glu Asn Ser Glu Ser Phe 165 170 175 Ser Ala Gln Ile Pro Gly Ser Ser Cys Ser Ser Ala Val Leu Met Ala 180 185 190 Pro Ser Ser Asn Thr Phe Gln Asp Ser Asn Gly Asn Tyr Leu Lys Asp 195 200 205 Glu Asn Gly Glu Leu Leu Ser Val Lys Tyr Thr Arg Arg Met Ile Glu 210 215 220 Asn Tyr Gly Pro Glu Gln Val Ala Ala Val Ile Thr Glu Val Ser Gln 225 230 235 240 Gly Val Gly Ser Thr Met Pro Pro Tyr Glu Tyr Val Pro Gln Ile Arg 245 250 255 Lys Met Thr Lys Glu Leu Gly Val Leu Trp Ile Ser Asp Glu Val Leu 260 265 270 Thr Gly Phe Gly Arg Thr Gly Lys Trp Phe Gly Tyr Gln His Tyr Gly 275 280 285 Val Gln Pro Asp Ile Ile Thr Met Gly Lys Gly Leu Ser Ser Ser Ser 290 295 300 Leu Pro Ala Gly Ala Val Val Val Ser Lys Glu Ile Ala Ala Phe Met 305 310 315 320 Asp Lys His Arg Trp Glu Ser Val Ser Thr Tyr Ala Gly His Pro Val 325 330 335 Ala Met Ala Ala Val Cys Ala Asn Leu Glu Val Met Met Glu Glu Asn 340 345 350 Leu Val Glu Gln Ala Lys Asn Ser Gly Glu Tyr Ile Arg Ser Lys Leu 355 360 365 Glu Leu Leu Gln Glu Lys His Lys Ser Ile Gly Asn Phe Asp Gly Tyr 370 375 380 Gly Leu Leu Trp Ile Val Asp Ile Val Asn Ala Lys Thr Lys Thr Pro 385 390 395 400 Tyr Val Lys Leu Asp Arg Asn Phe Arg His Gly Met Asn Pro Asn Gln 405 410 415 Ile Pro Thr Gln Ile Ile Met Glu Lys Ala Leu Glu Lys Gly Val Leu 420 425 430 Ile Gly Gly Ala Met Pro Asn Thr Met Arg Ile Gly Ala Ser Leu Asn 435 440 445 Val Ser Arg Gly Asp Ile Asp Lys Ala Met Asp Ala Leu Asp Tyr Ala 450 455 460 Leu Asp Tyr Leu Glu Ser Gly Glu Trp Gln Gln Ser 465 470 475 <210> 3 <211> 253 <212> PRT <213> Acetobacter sp. CCTCC M209061 <400> 3 Met Ala Arg Val Ala Gly Lys Val Ala Ile Val Ser Gly Ala Ala Asn 1 5 10 15 Gly Ile Gly Lys Ala Thr Ala Gln Leu Leu Ala Lys Glu Gly Ala Lys 20 25 30 Val Val Ile Gly Asp Leu Lys Glu Glu Asp Gly Gln Lys Ala Val Ala 35 40 45 Glu Ile Lys Ala Ala Gly Gly Glu Ala Ala Phe Val Lys Leu Asn Val 50 55 60 Thr Asp Glu Ala Ala Trp Lys Ala Ala Ile Gly Gln Thr Leu Lys Leu 65 70 75 80 Tyr Gly Arg Leu Asp Ile Ala Val Asn Asn Ala Gly Ile Asn Tyr Ser 85 90 95 Gly Ser Val Glu Ser Thr Ser Leu Glu Asp Trp Arg Arg Val Gln Ser 100 105 110 Ile Asn Leu Asp Gly Val Phe Leu Gly Thr Gln Val Ala Ile Glu Ala 115 120 125 Met Lys Lys Ser Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Leu Ser Ser Ile Ser 130 135 140 Gly Leu Ile Gly Asp Pro Met Leu Ala Ala Tyr Val Ala Ser Lys Gly 145 150 155 160 Gly Val Arg Leu Phe Thr Lys Ser Ala Ala Leu His Cys Ala Lys Ser 165 170 175 Gly Tyr Lys Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Tyr Ile Trp Thr 180 185 190 Pro Met Val Ala Gly Leu Thr Lys Glu Asp Ala Ala Ala Arg Gln Lys 195 200 205 Leu Val Asp Leu His Pro Ile Gly His Leu Gly Glu Pro Asn Asp Ile 210 215 220 Ala Tyr Gly Ile Leu Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Val Thr 225 230 235 240 Gly Ser Glu Leu Val Ile Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln 245 250 <210> 4 <211> 541 <212> PRT <213> Rhodococcus sp. Phi1 <400> 4 Met Thr Ala Gln Ile Ser Pro Thr Val Val Asp Ala Val Val Ile Gly 1 5 10 15 Ala Gly Phe Gly Gly Ile Tyr Ala Val His Lys Leu His Asn Glu Gln 20 25 30 Gly Leu Thr Val Val Gly Phe Asp Lys Ala Asp Gly Pro Gly Gly Thr 35 40 45 Trp Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Leu Ser Asp Thr Glu Ser His 50 55 60 Leu Tyr Arg Phe Ser Phe Asp Arg Asp Leu Leu Gln Asp Gly Thr Trp 65 70 75 80 Lys Thr Thr Tyr Ile Thr Gln Pro Glu Ile Leu Glu Tyr Leu Glu Ser 85 90 95 Val Val Asp Arg Phe Asp Leu Arg Arg His Phe Arg Phe Gly Thr Glu 100 105 110 Val Thr Ser Ala Ile Tyr Leu Glu Asp Glu Asn Leu Trp Glu Val Ser 115 120 125 Thr Asp Lys Gly Glu Val Tyr Arg Ala Lys Tyr Val Val Asn Ala Val 130 135 140 Gly Leu Leu Ser Ala Ile Asn Phe Pro Asp Leu Pro Gly Leu Asp Thr 145 150 155 160 Phe Glu Gly Glu Thr Ile His Thr Ala Ala Trp Pro Glu Gly Lys Asn 165 170 175 Leu Ala Gly Lys Arg Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Ser Thr Gly Gln 180 185 190 Gln Val Ile Thr Ala Leu Ala Pro Glu Val Glu His Leu Thr Val Phe 195 200 205 Val Arg Thr Pro Gln Tyr Ser Val Pro Val Gly Asn Arg Pro Val Thr 210 215 220 Lys Glu Gln Ile Asp Ala Ile Lys Ala Asp Tyr Asp Gly Ile Trp Asp 225 230 235 240 Ser Val Lys Lys Ser Ala Val Ala Phe Gly Phe Glu Glu Ser Thr Leu 245 250 255 Pro Ala Met Ser Val Ser Glu Glu Glu Arg Asn Arg Ile Phe Gln Glu 260 265 270 Ala Trp Asp His Gly Gly Gly Phe Arg Phe Met Phe Gly Thr Phe Gly 275 280 285 Asp Ile Ala Thr Asp Glu Ala Ala Asn Glu Ala Ala Ala Ser Phe Ile 290 295 300 Arg Ser Lys Ile Ala Glu Ile Ile Glu Asp Pro Glu Thr Ala Arg Lys 305 310 315 320 Leu Met Pro Thr Gly Leu Tyr Ala Lys Arg Pro Leu Cys Asp Asn Gly 325 330 335 Tyr Tyr Glu Val Tyr Asn Arg Pro Asn Val Glu Ala Val Ala Ile Lys 340 345 350 Glu Asn Pro Ile Arg Glu Val Thr Ala Lys Gly Val Val Thr Glu Asp 355 360 365 Gly Val Leu His Glu Leu Asp Val Leu Val Phe Ala Thr Gly Phe Asp 370 375 380 Ala Val Asp Gly Asn Tyr Arg Arg Ile Glu Ile Arg Gly Arg Asn Gly 385 390 395 400 Leu His Ile Asn Asp His Trp Asp Gly Gln Pro Thr Ser Tyr Leu Gly 405 410 415 Val Thr Thr Ala Asn Phe Pro Asn Trp Phe Met Val Leu Gly Pro Asn 420 425 430 Gly Pro Phe Thr Asn Leu Pro Pro Ser Ile Glu Thr Gln Val Glu Trp 435 440 445 Ile Ser Asp Thr Val Ala Tyr Ala Glu Arg Asn Glu Ile Arg Ala Ile 450 455 460 Glu Pro Thr Pro Glu Ala Glu Glu Glu Trp Thr Gln Thr Cys Thr Asp 465 470 475 480 Ile Ala Asn Ala Thr Leu Phe Thr Arg Gly Asp Ser Trp Ile Phe Gly 485 490 495 Ala Asn Val Pro Gly Lys Lys Pro Ser Val Leu Phe Tyr Leu Gly Gly 500 505 510 Leu Gly Asn Tyr Arg Asn Val Leu Ala Gly Val Val Ala Asp Ser Tyr 515 520 525 Arg Gly Phe Glu Leu Lys Ser Ala Val Pro Val Thr Ala 530 535 540 <210> 5 <211> 603 <212> PRT <213> Rhodococcus ruber-SD1 <400> 5 Met Thr Thr Ser Ile Asp Arg Glu Ala Leu Arg Arg Lys Tyr Ala Glu 1 5 10 15 Glu Arg Asp Lys Arg Ile Arg Pro Asp Gly Asn Asp Gln Tyr Ile Arg 20 25 30 Leu Asp His Val Asp Gly Trp Ser His Asp Pro Tyr Met Pro Ile Thr 35 40 45 Pro Arg Glu Pro Lys Leu Asp His Val Thr Phe Ala Phe Ile Gly Gly 50 55 60 Gly Phe Ser Gly Leu Val Thr Ala Ala Arg Leu Arg Glu Ser Gly Val 65 70 75 80 Glu Ser Val Arg Ile Ile Asp Lys Ala Gly Asp Phe Gly Gly Val Trp 85 90 95 Tyr Trp Asn Arg Tyr Pro Gly Ala Met Cys Asp Thr Ala Ala Met Val 100 105 110 Tyr Met Pro Leu Leu Glu Glu Thr Gly Tyr Met Pro Thr Glu Lys Tyr 115 120 125 Ala His Gly Pro Glu Ile Leu Glu His Cys Gln Arg Ile Gly Lys His 130 135 140 Tyr Asp Leu Tyr Asp Asp Ala Leu Phe His Thr Glu Val Thr Asp Leu 145 150 155 160 Val Trp Gln Glu His Asp Gln Arg Trp Arg Ile Ser Thr Asn Arg Gly 165 170 175 Asp His Phe Thr Ala Gln Phe Val Gly Met Gly Thr Gly Pro Leu His 180 185 190 Val Ala Gln Leu Pro Gly Ile Pro Gly Ile Glu Ser Phe Arg Gly Lys 195 200 205 Ser Phe His Thr Ser Arg Trp Asp Tyr Asp Tyr Thr Gly Gly Asp Ala 210 215 220 Leu Gly Ala Pro Met Asp Lys Leu Ala Asp Lys Arg Val Ala Val Ile 225 230 235 240 Gly Thr Gly Ala Thr Ala Val Gln Cys Val Pro Glu Leu Ala Lys Tyr 245 250 255 Cys Arg Glu Leu Tyr Val Val Gln Arg Thr Pro Ser Ala Val Asp Glu 260 265 270 Arg Gly Asn His Pro Ile Asp Glu Lys Trp Phe Ala Gln Ile Ala Thr 275 280 285 Pro Gly Trp Gln Lys Arg Trp Leu Asp Ser Phe Thr Ala Ile Trp Asp 290 295 300 Gly Val Leu Thr Asp Pro Ser Glu Leu Ala Ile Glu His Glu Asp Leu 305 310 315 320 Val Gln Asp Gly Trp Thr Ala Leu Gly Gln Arg Met Arg Ala Ala Val 325 330 335 Gly Ser Val Pro Ile Glu Gln Tyr Ser Pro Glu Asn Val Gln Arg Ala 340 345 350 Leu Glu Glu Ala Asp Asp Glu Gln Met Glu Arg Ile Arg Ala Arg Val 355 360 365 Asp Glu Ile Val Thr Asp Pro Ala Thr Ala Ala Gln Leu Lys Ala Trp 370 375 380 Phe Arg Gln Met Cys Lys Arg Pro Cys Phe His Asp Asp Tyr Leu Pro 385 390 395 400 Ala Phe Asn Arg Pro Asn Thr His Leu Val Asp Thr Gly Gly Lys Gly 405 410 415 Val Glu Arg Ile Thr Glu Asn Gly Val Val Val Ala Gly Val Glu Tyr 420 425 430 Glu Val Asp Cys Ile Val Tyr Ala Ser Gly Phe Glu Phe Leu Gly Thr 435 440 445 Gly Tyr Thr Asp Arg Ala Gly Phe Asp Pro Thr Gly Arg Asp Gly Val 450 455 460 Lys Leu Ser Glu His Trp Ala Gln Gly Thr Arg Thr Leu His Gly Met 465 470 475 480 His Thr Tyr Gly Phe Pro Asn Leu Phe Val Leu Gln Leu Met Gln Gly 485 490 495 Ala Ala Leu Gly Ser Asn Ile Pro His Asn Phe Val Glu Ala Ala Arg 500 505 510 Val Val Ala Ala Ile Val Asp His Val Leu Ser Thr Gly Thr Ser Ser 515 520 525 Val Glu Thr Thr Lys Glu Ala Glu Gln Ala Trp Val Gln Leu Leu Leu 530 535 540 Asp His Gly Arg Pro Leu Gly Asn Pro Glu Cys Thr Pro Gly Tyr Tyr 545 550 555 560 Asn Asn Glu Gly Lys Pro Ala Glu Leu Lys Asp Arg Leu Asn Val Gly 565 570 575 Tyr Pro Ala Gly Ser Ala Ala Phe Phe Arg Met Met Asp His Trp Leu 580 585 590 Ala Ala Gly Ser Phe Asp Gly Leu Thr Phe Arg 595 600

Claims (13)

  1. PVA 막 고정화 효소로서,
    상기 PVA 막 고정화 효소는 PVA 다공성 막 및 상기 PVA 다공성 막에 포매된 효소를 포함하고, 상기 PVA 다공성 막은 3차원 구조화 PVA 다공성 막이며, 상기 효소는 트랜스아미나제, D-락테이트 탈수소효소, 시클로헥사논 모노옥시게나제, 케토리덕타제, 엔-리덕타제, 니트릴라제, 암모니아 분해효소, 아미노산 탈수소효소, 이민 리덕타제, 알코올 탈수소효소, 포름산암모늄 탈수소효소, 포도당 1-탈수소효소, 및 이들의 돌연변이체 중 어느 하나로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 PVA 막 고정화 효소.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 3차원 구조화 PVA 다공성 막은 돌기 또는 요홈에 의해 형성된 3차원 구조를 갖고, 바람직하게는 상기 효소는 유리 효소 또는 가교 효소 응집체인 것을 특징으로 하는 PVA 막 고정화 효소.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 트랜스아미나제는 Chromobacterium violaceum DSM30191 유래 트랜스아미나제 또는 Arthrobacter citreus 유래 트랜스아미나제, 또는 B.thuringiensis 유래 트랜스아미나제이고; 상기 케토리덕타제는 Acetobacter sp.CCTCC M209061 유래 케토리덕타제, 또는 Candida macedoniensis AKU4588 유래 케토리덕타제이며; 상기 시클로헥사논 모노옥시게나제는 Rhodococcus sp.Phi1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제, 또는 Brachymonas petroleovorans 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제, 또는 Rhodococcus ruber-SD1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제이고; 상기 암모니아 분해효소는 Aspergillus niger CBS 513.88 유래 암모니아 분해효소 및 Solenostemon scutellarioides 유래 암모니아 분해효소이며; 상기 엔-리덕타제는 Saccharomyces cerevisiae 유래 엔-리덕타제 및 Chryseobacterium sp.CA49 유래 엔-리덕타제이고; 상기 이민 리덕타제는 Streptomyces sp 유래 이민 리덕타제 및 Bacillus cereus 유래 이민 리덕타제이며; 상기 아미노산 탈수소효소는 Bacillus cereus 유래 류신 탈수소효소 및 Bacillus sphaericus 유래 페닐알라닌 탈수소효소이고; 상기 니트릴라제는 Aspergillus niger CBS 513.88 유래 니트릴라제 및 Neurospora crassa OR74A 유래 니트릴라제이며;
    바람직하게는, 상기 Chromobacterium violaceum DSM30191 유래 트랜스아미나제는 SEQ ID NO.1로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 트랜스아미나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.1로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열이며, 상기 돌연변이는 7번째, 47번째, 90번째, 95번째, 297번째, 304번째, 380번째, 405번째, 및 416번째 돌연변이 부위 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 7번째 트레오닌은 시스테인으로 돌연변이되며, 47번째 세린은 시스테인으로 돌연변이되고, 90번째 리신은 글리신으로 돌연변이되며, 95번째 알라닌은 프롤린으로 돌연변이되고, 297번째 이소류신은 류신으로 돌연변이되며, 304번째 리신은 아스파르트산으로 돌연변이되고, 380번째 글루타민은 류신으로 돌연변이되며, 405번째 아르기닌은 글루타민산으로 돌연변이되고, 416번째 아르기닌은 트레오닌으로 돌연변이되거나, 또는 상기 트랜스아미나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 상기 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열 중의 상기 돌연변이 부위를 갖고, 또한 상기 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이며;
    바람직하게는, 상기 Arthrobacter citreus 유래 트랜스아미나제는 SEQ ID NO.2로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 트랜스아미나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.2로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열이며, 상기 돌연변이는 3번째, 5번째, 60번째, 164번째, 171번째, 178번째, 180번째, 186번째, 187번째, 252번째, 370번째, 384번째, 389번째, 404번째, 411번째, 423번째, 및 424번째 돌연변이 부위 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 3번째 류신은 세린으로 돌연변이되며, 5번째 발린은 세린으로 돌연변이되고, 60번째 시스테인은 티로신으로 돌연변이되며, 164번째 페닐알라닌은 류신으로 돌연변이되고, 171번째 글루타민산은 아스파르트산으로 돌연변이되며, 178번째 알라닌은 류신으로 돌연변이되고, 180번째 이소류신은 발린으로 돌연변이되며, 186번째 세린은 글리신으로 돌연변이되고, 187번째 세린은 알라닌으로 돌연변이되며, 252번째 발린은 이소류신으로 돌연변이되고, 370번째 류신은 알라닌으로 돌연변이되며, 384번째 티로신은 페닐알라닌으로 돌연변이되고, 389번째 이소류신은 페닐알라닌으로 돌연변이되며, 404번째 류신은 글루타민으로 돌연변이되고, 411번째 글리신은 아스파르트산으로 돌연변이되며, 423번째 메티오닌은 리신으로 돌연변이되고, 424번째 글루타민산은 글루타민으로 돌연변이되거나, 또는 상기 트랜스아미나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 상기 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열 중의 상기 돌연변이 부위를 갖고, 또한 상기 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이며;
    바람직하게는, 상기 Acetobacter sp.CCTCC M209061 유래 케토리덕타제는 SEQ ID NO.3으로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 케토리덕타제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.3으로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열이며, 상기 돌연변이는 94번째, 144번째, 및 156번째 돌연변이 부위 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 94번째 알라닌은 아스파라긴으로 돌연변이되며, 144번째 글루타민산은 세린으로 돌연변이되고, 156번째 아스파라긴은 트레오닌 또는 발린으로 돌연변이되거나, 또는 상기 케토리덕타제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 상기 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열 중의 상기 돌연변이 부위를 갖고, 또한 상기 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이며;
    바람직하게는, 상기 Rhodococcus sp.Phi1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제는 SEQ ID NO.4로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 시클로헥사논 모노옥시게나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.4로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열이며, 상기 돌연변이는 280번째, 435번째, 436번째, 438번째, 441번째, 508번째, 및 510번째 돌연변이 부위 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 280번째 페닐알라닌은 티로신으로 돌연변이되며, 435번째 페닐알라닌은 아스파라긴으로 돌연변이되고, 436번째 페닐알라닌은 세린으로 돌연변이되며, 438번째 류신은 알라닌으로 돌연변이되고, 441번째 세린은 발린으로 돌연변이되며, 510번째 류신은 발린으로 돌연변이되거나, 또는 상기 시클로헥사논 모노옥시게나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 상기 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열 중의 상기 돌연변이 부위를 갖고, 또한 상기 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이며;
    바람직하게는, 상기 Rhodococcus ruber-SD1 유래 시클로헥사논 모노옥시게나제는 SEQ ID NO.5로 표시되는 아미노산 서열을 갖고, 상기 시클로헥사논 모노옥시게나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO.5로 표시되는 아미노산 서열이 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열이며, 상기 돌연변이는 45번째, 190번째, 249번째, 257번째, 393번째, 504번째, 및 559번째 돌연변이 부위 중 적어도 하나를 포함하고, 또한 45번째 메티오닌은 트레오닌으로 돌연변이되며, 190번째 프롤린은 류신으로 돌연변이되고, 249번째 시스테인은 발린으로 돌연변이되며, 257번째 시스테인은 알라닌으로 돌연변이되고, 393번째 시스테인은 발린으로 돌연변이되며, 504번째 프롤린은 발린으로 돌연변이되고, 559번째 티로신은 메티오닌으로 돌연변이되거나, 또는 상기 시클로헥사논 모노옥시게나제의 돌연변이체의 아미노산 서열은 상기 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열 중의 상기 돌연변이 부위를 갖고, 또한 상기 돌연변이되어 얻어진 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 PVA 막 고정화 효소.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 PVA 막 고정화 효소는 각 효소의 보조효소 및 보조인자를 더 포함하고, 상기 보조효소 및 상기 보조인자는 상기 PVA 다공성 막에 포매되는 것을 특징으로 하는 PVA 막 고정화 효소.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 PVA 다공성 막은 또한 폴리에틸렌글리콜 및/또는 폴리에틸렌이민을 갖고, 바람직하게는 상기 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 PEG400 ~ PEG6000이며, 바람직하게는 상기 폴리에틸렌이민의 분자량은 3KDa ~ 70KDa이고; 바람직하게는, 상기 폴리에틸렌글리콜과 상기 PVA 다공성 막의 질량비는 5:4 ~ 75:4이며, 상기 폴리에틸렌이민과 상기 PVA 다공성 막의 질량비는 1:12 ~ 1:240인 것을 특징으로 하는 PVA 막 고정화 효소.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 효소는 조효소인 것을 특징으로 하는 PVA 막 고정화 효소.
  7. 청구항 1 또는 청구항 6에 있어서,
    상기 효소의 로딩량은 0.05 ~ 0.4g 유리 효소/cm2 막 또는 0.03 ~ 0.06g 건조 가교 효소 응집체/cm2 막인 것을 특징으로 하는 PVA 막 고정화 효소.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 따른 PVA 막 고정화 효소의 제조 방법으로서,
    상기 제조 방법은,
    효소와 PVA 용액을 포함하는 원료를 소정 시간 동안 혼합하여 혼합계를 얻는 단계 S1;
    상기 혼합계를 몰드에 첨가하고 상기 혼합계를 건조 처리하여 막에 포매된 효소를 얻되, 상기 몰드는 3차원 구조화 PVA 다공성 막을 형성하기 위한 3차원 구조화 몰드인 단계 S2; 및
    인산 완충액을 이용하여 상기 막에 포매된 효소를 침지 처리 및 세척한 후, 상기 PVA 막 고정화 효소를 얻는 단계 S3을 포함하고,
    바람직하게는 상기 혼합계의 pH값은 6.0 ~ 6.5인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  9. 청구항 8에 있어서,
    상기 단계 S1은,
    효소의 현탁액 또는 효소 용액을 조제하되, 상기 현탁액 중의 효소는 가교 효소 응집체이고, 상기 효소 용액 중의 효소는 세포가 제거된 유리 효소인 단계; 및
    상기 현탁액 또는 상기 효소 용액을 상기 PVA 용액과 소정 시간 동안 혼합하여 상기 혼합계를 얻는 단계를 포함하고,
    바람직하게는 상기 소정 시간은 10 ~ 60분이며; 상기 PVA 용액의 PVA 분자량은 20KDa ~ 200KDa이고; 바람직하게는 상기 PVA 용액 중 PVA의 함량은 10 ~ 50g/100mL이며; 바람직하게는 상기 PVA 용액에는 아세트산, 메탄올, 및 황산이 분산되어 있고; 바람직하게는 상기 PVA 용액의 pH값은 5.5 ~ 6.5이며; 바람직하게는 상기 효소와 상기 PVA 용액의 비율은 1 ~ 50g/100mL이고; 바람직하게는 상기 현탁액 또는 상기 효소 용액은 인산 완충액, 선택적인 보조인자, 및 선택적인 보조효소를 더 포함하며; 바람직하게는 상기 보조효소와 상기 효소의 중량비는 10:1 ~ 1:10인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  10. 청구항 8에 있어서,
    상기 단계 S1은,
    PVA 수용액과 가교 효소 입자를 혼합하여 상기 혼합계를 형성하는 단계를 포함하고,
    바람직하게는 상기 가교 효소 입자와 상기 PVA 수용액의 비율은 1 ~ 50g/100mL이며; 바람직하게는 상기 소정 시간은 10 ~ 60분이고; 바람직하게는 상기 가교 효소 입자는 효소, 선택적인 보조인자, 및 선택적인 보조효소를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  11. 청구항 8에 있어서,
    상기 단계 S1은,
    PVA 수용액과 변형제 용액을 제1 소정 시간 동안 혼합하여 제2 혼합계를 형성하는 단계; 및
    상기 제2 혼합계와 효소계를 제2 소정 시간 동안 혼합하여 상기 혼합계를 형성하는 단계를 포함하고,
    바람직하게는 상기 PVA 수용액의 농도는 5 ~ 30g/100mL이며; 바람직하게는 상기 변형제 용액은 보조인자가 분산되어 있는 폴리에틸렌글리콜 수용액 및/또는 보조인자가 분산되어 있는 폴리에틸렌이민 수용액을 포함하고; 바람직하게는 상기 폴리에틸렌글리콜의 분자량은 PEG400 ~ PEG6000이며, 바람직하게는 상기 혼합계 중 상기 폴리에틸렌글리콜의 농도는 3 ~ 10g/100mL이고; 바람직하게는 상기 폴리에틸렌이민의 분자량은 3KDa ~ 70KDa이며, 보다 바람직하게는 상기 폴리에틸렌이민의 분자량은 3KDa ~ 50KDa이고; 바람직하게는 상기 혼합계 중 상기 폴리에틸렌이민의 농도는 0.1 ~ 1g/100mL이며, 보다 바람직하게는 상기 혼합계 중 상기 폴리에틸렌이민의 농도는 0.1 ~ 0.3g/100mL이고; 바람직하게는 상기 효소계는 효소, 선택적인 보조인자, 선택적인 보조효소, 및 인산 완충액을 포함하며; 바람직하게는 상기 효소는 효소에서 세포가 제거된 유리 효소 또는 가교 효소 응집체이고; 바람직하게는 상기 효소계 중 상기 보조인자의 농도는 1 ~ 20mg/mL이며; 바람직하게는 상기 효소계 중 상기 보조효소와 상기 효소의 중량비는 10:1 ~ 1:10이고; 바람직하게는 상기 효소와 상기 PVA 용액의 비율은 1 ~ 50g/100mL인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  12. 청구항 8 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 S2는,
    상기 혼합계를 몰드에 넣고 제3 소정 시간 동안 정치한 후 상기 몰드에 탈수 촉진제를 첨가하여 건조 처리하되, 상기 탈수 촉진제는 아세토니트릴, 에탄올, 및 아세톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 다수인 단계를 포함하고,
    바람직하게는 상기 탈수 촉진제와 상기 혼합계의 부피비는 1:10 ~ 5:1이며; 바람직하게는 상기 제3 소정 시간은 2 ~ 4시간이고; 바람직하게는 상기 몰드는 3차원 구조화 몰드이며, 상기 3차원 구조화 몰드는 돌기 또는 요홈을 갖는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  13. 청구항 8 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 S3은,
    상기 막에 포매된 효소를 상기 인산 완충액에 2 ~ 16시간 동안 침지한 후 새로운 상기 인산 완충액을 이용하여 상기 막에 포매된 효소를 세척하여 상기 PVA 막 고정화 효소를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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