JP2023533280A - Ｐｖａ膜固定化酵素及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
ＰＶＡ膜固定化酵素及びその製造方法を提供する。当該ＰＶＡ膜固定化酵素は、ＰＶＡ多孔質膜及びＰＶＡ多孔質膜に包埋されている酵素を含み、ＰＶＡ多孔質膜は、三次元的に構造されたＰＶＡ多孔質膜であり、酵素は、アミノ基転移酵素、Ｄ－乳酸脱水素酵素、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、ケト還元酵素、アルケン還元酵素、ニトリル加水分解酵素、アンモニア分解酵素、アミノ酸脱水素酵素、イミン還元酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸アンモニウム脱水素酵素、グルコース１－脱水素酵素及びそれらの変異体からいずれか選ばれる。三次元的に構造されたＰＶＡ多孔質膜を採用してそれを担体として酵素を包埋の方式で固定化し、包埋固定化のフローはシンプルであり、条件が穏やかで、比表面積が大きく、酵素がＰＶＡ多孔質膜に包埋固定化されると比較的安定しており、使用中に浸出しにくく、採用するＰＶＡ多孔質膜の多孔質構造は反応物と生成物をよりよく送達できるため、連続フロー生体触媒への使用に適し、酵素に対する幅広い適合性を有する。【選択図】図１
Description
本発明は、酵素固定化の技術分野に関し、具体的に言えば、ＰＶＡ膜固定化酵素及びその製造方法に関する。
生体触媒は、化学物質、中間体、ファインケミカル及び最終薬物分子製造プログラムの不可欠な部分になりつつある。しかし、プロセス上の需要が拡大し続けるにつれて、酵素の使用上の効率及び経済性が避けられなくなる。そのために、酵素活性、特異性及び生産性を向上させるだけでなく、貯蔵寿命及びリサイクル性を向上させる必要があり、特に商業的な規模のある使用の経済的実行可能性を促進するためには必要である。
酵素固定化プラットフォームは生産の過程で酵素を適切に統合するために優れたツールを提供している。数年来、いくつかの天然および合成担体ペアの酵素固定化効率が評価されてきており、例えば、各プラットフォームについてはその使用、経済性及び利点に基づいて専門的な評価が行われている。固定化生体触媒は、有機合成、汚染防止及び診断を目的とする分野などで幅広く使用されている（Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｃｒｏｂ Ｔｅｃｈｎｏｌ，３１，１７１－８；Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ，８９，９７９－９０）。
酵素を固体担体上又は固体担体内に固定することによって固定化を実現し、このようにして不均一な固定化酵素系を得る。物理的方式（担体と酵素の間に弱い相互作用が存在する）及び化学的方式（担体と酵素が共有結合を形成させる）（Ａｎａｌｙｓｔ，１３３，６９７－７０１；Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｒｅｖ，４０，２５６７－９２；Ｂｅｒｌｉｎ Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，９５－１２６）又は両者の組み合わせなどの様々な方法で酵素を固定できるため、様々な機能的に活性な担体を含む。
酵素の物理的固定方法は、膜又は膜リアクタ内、水不溶性マトリックスへの吸着（イオンによる物理的方式、例えば、メソポーラス材料への吸着）、封入（又はゲル包埋）、固体膜を用いたマイクロカプセル化、液体膜を用いたマイクロカプセル化、酵素触媒ラングミュア・ブロジェット（Ｌａｎｇｍｕｉｒ－Ｂｌｏｄｇｅｔｔ）膜の形成（Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ，１９９４；６６，１１２０Ａ－７Ａ）などを含む。膜包埋又はカプセル化の場合に、得られた酵素触媒は、膜支持体の特性、例えば、親水性、疎水性、反応性官能基の密度、孔隙率、孔径分布、膜の厚さ、リアクタの構成などによって決められる。固定化という固定方法は酵素の膜内の局在化に基づくもので、その目的は、操作条件下で高度な安定性を有するだけでなく酵素のより高い発現を実現させることである。
現在、多孔質膜を採用して酵素を固定化する研究が多くあるが、酵素によってその構造と活性部位が異なるため、その固定化方法にも違いがあり、例えば、ＰＶＡ膜（ポリビニルアルコール膜）を採用してリパーゼを固定する場合、固定化を利用してリパーゼの安定性及び活性を改善するという目的を達成するために、グルタルアルデヒドを採用して架橋させる必要がある。また、多孔質膜を利用してキシラナーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、β－ガラクトシダーゼ、アスコルビン酸オキシダーゼなどの酵素を固定化する場合、アミノ基、カルボキシ基、チオール基、ヒドロキシ基、イミダゾール又はフェノール基などの基を利用して多孔質膜と酵素とを共有結合によって結合させるのが一般的である。以上から分かるように、従来の技術では架橋剤を採用して酵素を固定化する場合に高純度の酵素を使用する必要があるため、固定化方法が複雑になり、酵素の担載容量が限られている。
本発明の主な目的は、ＰＶＡ膜固定化酵素及びその製造方法を提供して、多孔質膜を採用して酵素を固定化するプロセスが複雑であるという従来の技術の課題を解決することである。
上記の目的を達成するための本発明の一態様において、ＰＶＡ膜固定化酵素を提供し、当該ＰＶＡ膜固定化酵素は、ＰＶＡ多孔質膜及びＰＶＡ多孔質膜に包埋されている酵素を含み、ＰＶＡ多孔質膜は、三次元的に構造されたＰＶＡ多孔質膜であり、酵素は、アミノ基転移酵素、Ｄ－乳酸脱水素酵素、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、ケト還元酵素、アルケン還元酵素、ニトリル加水分解酵素（ニトリラーゼ）、アンモニア分解酵素（アンモニアリアーゼ）、アミノ酸脱水素酵素、イミン還元酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸アンモニウム脱水素酵素、グルコース１－脱水素酵素及びそれらの変異体からいずれかが選ばれる。
さらに、前記酵素は、遊離酵素又は架橋酵素凝集体である。
さらに、前記アミノ基転移酵素は、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ） ＤＳＭ３０１９１に由来するアミノ基転移酵素又はアルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）に由来するアミノ基転移酵素、又はバチルス・チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）に由来するアミノ基転移酵素であり、ケト還元酵素は、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１に由来するケト還元酵素、又はカンジダ・マケドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ） ＡＫＵ４５８８に由来するケト還元酵素であり、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼは、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）Ｐｈｉ１に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、又はブラキモナス・ペトロレオボランス（Ｂｒａｃｈｙｍｏｎａｓ ｐｅｔｒｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、又はロドコッカス・ルバー－ＳＤ１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ－ＳＤ１）に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、アンモニア分解酵素は、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ） ＣＢＳ ５１３．８８に由来するアンモニア分解酵素及びソレノステモン・スクテラリオイデス（Ｓｏｌｅｎｏｓｔｅｍｏｎ ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｏｉｄｅｓ）に由来するアンモニア分解酵素であり、アルケン還元酵素は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するアルケン還元酵素及びクリセオバクテリウム属（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＣＡ４９に由来するアルケン還元酵素であり、イミン還元酵素は、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ）に由来するイミン還元酵素及びバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）に由来するイミン還元酵素であり、アミノ酸脱水素酵素は、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）に由来するロイシン脱水素酵素及びバチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）に由来するフェニルアラニン脱水素酵素であり、ニトリル加水分解酵素は、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ） ＣＢＳ ５１３．８８に由来するニトリル加水分解酵素及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ） ＯＲ７４Ａに由来するニトリル加水分解酵素である。
さらに、前記クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ） ＤＳＭ３０１９１に由来するアミノ基転移酵素は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、アミノ基転移酵素の変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列に変異が起きて得られるアミノ酸配列であり、変異は、少なくとも、７位、４７位、９０位、９５位、２９７位、３０４位、３８０位、４０５位及び４１６位の１つの変異部位を含み、且つ７位のトレオニンはシステインに変異し、４７位のセリンはシステインに変異し、９０位のリシンはグリシンに変異し、９５位のアラニンはプロリンに変異し、２９７位のイソロイシンはロイシンに変異し、３０４位のリシンはアスパラギン酸に変異し、３８０位のグルタミンはロイシンに変異し、４０５位のアルギニンはグルタミン酸に変異し、４１６位のアルギニンはトレオニンに変異し、又はアミノ基転移酵素の変異体のアミノ酸配列は、変異が起きて得られるアミノ酸配列の変異部位を有し、且つ変異が起きて得られるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
さらに、前記アルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）に由来するアミノ基転移酵素は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、アミノ基転移酵素の変異体のアミノ酸配列は、配列番号２に示されるアミノ酸配列に変異が起きて得られるアミノ酸配列であり、変異は、少なくとも、３位、５位、６０位、１６４位、１７１位、１７８位、１８０位、１８６位、１８７位、２５２位、３７０位、３８４位、３８９位、４０４位、４１１位、４２３位及び４２４位の１つの変異部位を含み、且つ３位のロイシンはセリンに変異し、５位のバリンはセリンに変異し、６０位のシステインはチロシンに変異し、１６４位のフェニルアラニンはロイシンに変異し、１７１位のグルタミン酸はアスパラギン酸に変異し、１７８位のアラニンはロイシンに変異し、１８０位のイソロイシンはバリンに変異し、１８６位のセリンはグリシンに変異し、１８７位のセリンはアラニンに変異し、２５２位のバリンはイソロイシンに変異し、３７０位のロイシンはアラニンに変異し、３８４位のチロシンはフェニルアラニンに変異し、３８９位のイソロイシンはフェニルアラニンに変異し、４０４位のロイシンはグルタミンに変異し、４１１位のグリシンはアスパラギン酸に変異し、４２３位のメチオニンはリシンに変異し、４２４位のグルタミン酸はグルタミンに変異し、又はアミノ基転移酵素の変異体のアミノ酸配列は、変異が起きて得られるアミノ酸配列の変異部位を有し、且つ変異が起きて得られるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
さらに、前記アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１に由来するケト還元酵素は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有し、ケト還元酵素の変異体のアミノ酸配列は、配列番号３に示されるアミノ酸配列に変異が起きて得られるアミノ酸配列であり、変異は、少なくとも、９４位、１４４位及び１５６位の１つの変異部位を含み、且つ９４位のアラニンはアスパラギンに変異し、１４４位のグルタミン酸はセリンに変異し、１５６位のアスパラギンはトレオニン若しくはバリンに変異し、又はケト還元酵素の変異体のアミノ酸配列は、変異が起きて得られるアミノ酸配列の変異部位を有し、且つ変異が起きて得られるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
さらに、前記ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）Ｐｈｉ１に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼの変異体のアミノ酸配列は、配列番号４に示されるアミノ酸配列に変異が起きて得られるアミノ酸配列であり、変異は、少なくとも、２８０位、４３５位、４３６位、４３８位、４４１位、５０８位及び５１０位の１つの変異部位を含み、且つ２８０位のフェニルアラニンはチロシンに変異し、４３５位のフェニルアラニンはアスパラギンに変異し、４３６位のフェニルアラニンはセリンに変異し、４３８位のロイシンはアラニンに変異し、４４１位のセリンはバリンに変異し、５１０位のロイシンはバリンに変異し、又はシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼの変異体のアミノ酸配列は、変異が起きて得られるアミノ酸配列の変異部位を有し、且つ変異が起きて得られるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
さらに、前記ロドコッカス・ルバー－ＳＤ１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ－ＳＤ１）に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼは、配列番号５に示されるアミノ酸配列を有し、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼの変異体のアミノ酸配列は、配列番号５に示されるアミノ酸配列に変異が起きて得られるアミノ酸配列であり、変異は、少なくとも、４５位、１９０位、２４９位、２５７位、３９３位、５０４位及び５５９位の１つの変異部位を含み、且つ４５位のメチオニンはトレオニンに変異し、１９０位のプロリンはロイシンに変異し、２４９位のシステインはバリンに変異し、２５７位のシステインはアラニンに変異し、３９３位のシステインはバリンに変異し、５０４位のプロリンはバリンに変異し、５５９位のチロシンはメチオニンに変異し、又はシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼの変異体のアミノ酸配列は、変異が起きて得られるアミノ酸配列の変異部位を有し、且つ変異が起きて得られるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
さらに、前記ＰＶＡ膜固定化酵素は、各酵素の補酵素及び補因子をさらに含み、補酵素及び補因子はＰＶＡ多孔質膜に包埋される。
さらに、前記ＰＶＡ多孔質膜はポリエチレングリコール及び／又はポリエチレンイミンをさらに有し、ポリエチレングリコールの分子量は、ＰＥＧ４００～ＰＥＧ６０００であり、ポリエチレンイミンの分子量は、３ＫＤａ～７０ＫＤａである。
さらに、前記ポリエチレングリコールとＰＶＡ多孔質膜との質量比は、５：４～７５：４であり、ポリエチレンイミンとＰＶＡ多孔質膜との質量比は、１：１２～１：２４０である。
さらに、前記酵素は、粗酵素である。
さらに、前記酵素の担載容量は、０．０５～０．４ｇの遊離酵素／ｃｍ２膜又は０．０３～０．０６ｇの乾燥した架橋酵素凝集体／ｃｍ２膜である。
本発明の別の態様において、前記いずれかのＰＶＡ膜固定化酵素の製造方法を提供し、製造方法は、酵素及びＰＶＡ溶液を含む原料を所定の時間混合して、混合系を得るステップＳ１と、混合系を金型に加えて混合系に乾燥処理を行って、膜包埋酵素を得ることであって、金型は、三次元的に構造されたＰＶＡ多孔質膜を形成させるために三次元的に構造された金型であるステップＳ２と、リン酸緩衝液で膜包埋酵素に浸漬処理を行って洗浄した後、ＰＶＡ膜固定化酵素を得るステップＳ３とを含む。
さらに、前記混合系のｐＨは、６．０～６．５である。
さらに、前記ステップＳ１は、酵素懸濁液又は酵素溶液を調製することであって、懸濁液中の酵素は架橋酵素凝集体であり、酵素溶液中の酵素は細胞を除去した遊離酵素であることと、懸濁液又は酵素溶液とＰＶＡ溶液を所定の時間混合して、混合系を得ることとを含む。
さらに、前記所定の時間は、１０～６０分であり、ＰＶＡ溶液のＰＶＡの分子量は、２０ＫＤａ～２００ＫＤａである。
さらに、前記ＰＶＡ溶液中のＰＶＡの含有量は、１０～５０ｇ／１００ｍＬである。
さらに、前記ＰＶＡ溶液には酢酸、メタノール及び硫酸が分散されている。
さらに、前記ＰＶＡ溶液のｐＨは、５．５～６．５である。
さらに、前記酵素とＰＶＡ溶液との比率は、１～５０ｇ／１００ｍＬである。
さらに、前記懸濁液又は酵素溶液は、リン酸緩衝液、任意選択の補因子及び任意選択の補酵素をさらに含む。
さらに、前記補酵素と酵素との重量比率は、１０：１～１：１０である。
さらに、前記ステップＳ１は、ＰＶＡ水溶液、架橋酵素粒子を混合して、混合系を形成させることを含む。
さらに、前記架橋酵素粒子とＰＶＡ水溶液との比率は、１～５０ｇ／１００ｍＬである。
さらに、前記所定の時間は、１０～６０分である。
さらに、前記架橋酵素粒子は、酵素、任意選択の補因子及び任意選択の補酵素を含む。
さらに、前記ステップＳ１は、ＰＶＡ水溶液、改質剤溶液を第１の所定時間混合して、第２混合系を形成させることと、第２混合系と酵素系とを第２の所定時間混合して、混合系を形成させることとを含む。
さらに、前記ＰＶＡ水溶液の濃度は、５～３０ｇ／１００ｍＬであり、好ましくは、改質剤溶液が、補因子が分散されているポリエチレングリコール水溶液及び／又は補因子が分散されているポリエチレンイミン水溶液を含む。
さらに、前記ポリエチレングリコールの分子量は、ＰＥＧ４００～ＰＥＧ６０００であり、混合系中のポリエチレングリコールの濃度は、３～１０ｇ／１００ｍＬである。
さらに、前記ポリエチレンイミンの分子量は、３ＫＤａ～７０ＫＤａであり、好ましくは、３ＫＤａ～５０ＫＤａである。
さらに、前記混合系中のポリエチレンイミンの濃度は、０．１～１ｇ／１００ｍＬであり、好ましくは、０．１～０．３ｇ／１００ｍＬである。
さらに、前記酵素系は、酵素、任意選択の補因子、任意選択の補酵素及びリン酸緩衝液を含む。
さらに、前記酵素は、細胞を除去した遊離酵素又は架橋酵素凝集体である。
さらに、前記酵素系中の補因子の濃度は、１～２０ｍｇ／ｍＬである。
さらに、前記酵素系中の補酵素と酵素との重量比率は、１０：１～１：１０である。
さらに、前記酵素とＰＶＡ溶液の比率は、１～５０ｇ／１００ｍＬである。
さらに、前記ステップＳ２は、混合系を金型に置いて第３の所定時間静置した後に金型に脱水促進剤を加えて乾燥処理を行うことであって、脱水促進剤は、アセトニトリル、エタノール及びアセトンからなる群からいずれか又は複数選ばれることを含む。
さらに、前記脱水促進剤と混合系との体積比率は、１：１０～５：１である。
さらに、前記第３の所定時間は、２～４時間である。
さらに、前記金型は、三次元的に構造された金型であり、三次元的に構造された金型は、突起又は凹溝を有する。
さらに、前記ステップＳ３は、膜包埋酵素をリン酸緩衝液に２～１６時間浸漬した後に新しいリン酸緩衝液で膜包埋酵素を洗浄して、ＰＶＡ膜固定化酵素を得ることを含む。
本発明の技術的解決手段を用いると、ＰＶＡ多孔質膜を採用してそれを担体として酵素を包埋の方式で固定化し、包埋固定化のフローはシンプルであり、条件が穏やかで、精製酵素又は粗酵素にいずれも良好な固定化効果を有し、且つ酵素はＰＶＡ多孔質膜に包埋固定化されると比較的安定しており、使用中に浸出しにくく、採用するＰＶＡ多孔質膜の多孔質構造は反応物と生成物をよりよく送達できるため、連続フロー生体触媒への使用に適する。前記包埋固定は機械的な固定であるため、酵素に対して幅広い適合性を有する。ＰＶＡ多孔質膜を三次元的に構造させることによって、立体的構造を持たせ、さらに、より大きい表面積を有するため、より多くの包埋部位を提供し、さらに、酵素の高い活性及び安定性を保証した上で、酵素の担載容量を高めている。
図面が本願の構成部分として本発明への更なる理解のために提供され、本発明の例示的な実施例及びその説明は、本発明に対する限定を構成せず、本発明を解釈するために用いられる。図面では、
なお、矛盾が生じない限り、本願の実施例及び実施例の特徴を互いに組み合わせることができる。次に、図面を参照し実施例と結び付けて本発明を詳しく説明する。
本願の背景技術で述べられているように、多孔質膜を採用して酵素を固定化する従来の技術はプロセスが複雑であり、本願は、当該課題を解決するために、ＰＶＡ膜固定化酵素及びその製造方法を提供する。
本願の典型的な実施形態において、ＰＶＡ膜固定化酵素を提供し、当該ＰＶＡ膜固定化酵素は、ＰＶＡ多孔質膜及びＰＶＡ多孔質膜に包埋されている酵素を含み、ＰＶＡ多孔質膜は、三次元的に構造されたＰＶＡ多孔質膜であり、酵素は、アミノ基転移酵素（例えば、ω－アミノ基転移酵素）、Ｄ－乳酸脱水素酵素、ギ酸脱水素酵素、カルボニル還元酵素、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、ケテン還元酵素、ニトリル加水分解酵素、アンモニア分解酵素、アミノ酸脱水素酵素、イミン還元酵素及びそれらの変異体からいずれかが選ばれる。
本願は、ＰＶＡ多孔質膜を採用してそれを担体として酵素を包埋の方式で固定化し、包埋固定化のフローはシンプルであり、条件が穏やかで、精製酵素又は粗酵素にいずれも良好な固定化効果を有し、且つ酵素がＰＶＡ多孔質膜内に包埋固定化されると、平面のＰＶＡ膜内での固定と比べると、より安定しており、使用中に浸出しにくく、採用するＰＶＡ多孔質膜の多孔質構造は反応物と生成物をよりよく送達できるため、連続フロー生体触媒への使用に適する。前記包埋固定は機械的な固定であるため、酵素に対して幅広い適合性を有する。ＰＶＡ多孔質膜を三次元的に構造させることによって、立体的構造を持たせ、さらに、より大きい表面積を有するため、より多くの包埋部位を提供し、さらに、酵素の高い活性及び安定性を保証した上で、酵素の担載容量を高めている。
本願のＰＶＡ膜固定化酵素は、包埋される酵素が遊離酵素であってもよいし架橋酵素凝集体であってもよく、遊離酵素であれ架橋酵素凝集体であれ、包埋後にいずれも触媒効果を効果的に発揮できる。
架橋酵素凝集体とは、従来の技術と同様に、硫酸アンモニウム又はエタノール、アセトニトリル、アセトン、プロパノール、ＰＥＧなどの沈殿剤で遊離酵素を沈殿させた後、グルタルアルデヒド、グリオキサール又はアルデヒド化デキストランなどの二官能性試薬を加えて共有架橋させることによって得た不溶性酵素凝集体である。
上述したように、本願のＰＶＡ膜固定化酵素は、酵素に対する幅広い適合性を有し、特に次の酵素に適する。アミノ基転移酵素であって、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ） ＤＳＭ３０１９１に由来するアミノ基転移酵素又はアルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）に由来するアミノ基転移酵素、又はバチルス・チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）に由来するアミノ基転移酵素であり、ケト還元酵素であって、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１に由来するケト還元酵素、又はカンジダ・マケドニエンシス（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ） ＡＫＵ４５８８に由来するケト還元酵素であり、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであって、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）Ｐｈｉ１に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、又はブラキモナス・ペトロレオボランス（Ｂｒａｃｈｙｍｏｎａｓ ｐｅｔｒｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、又はロドコッカス・ルバー－ＳＤ１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ－ＳＤ１）に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、アンモニア分解酵素であって、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ） ＣＢＳ ５１３．８８に由来するアンモニア分解酵素及びソレノステモン・スクテラリオイデス（Ｓｏｌｅｎｏｓｔｅｍｏｎ ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｏｉｄｅｓ）に由来するアンモニア分解酵素であり、アルケン還元酵素であって、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するアルケン還元酵素及びクリセオバクテリウム属（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．）ＣＡ４９に由来するアルケン還元酵素であり、イミン還元酵素であって、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ）に由来するイミン還元酵素及びバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）に由来するイミン還元酵素であり、アミノ酸脱水素酵素であって、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）に由来するロイシン脱水素酵素及びバチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）に由来するフェニルアラニン脱水素酵素であり、ニトリル加水分解酵素であって、アスペルギルス・ニゲル（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ） ＣＢＳ ５１３．８８に由来するニトリル加水分解酵素及びニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ） ＯＲ７４Ａに由来するニトリル加水分解酵素であり、好ましくは、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ） ＤＳＭ３０１９１に由来するアミノ基転移酵素が配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、アミノ基転移酵素の変異体のアミノ酸配列が配列番号１に示されるアミノ酸配列に変異が起きて得られるアミノ酸配列であり、変異が、少なくとも、７位、４７位、９０位、９５位、２９７位、３０４位、３８０位、４０５位及び４１６位の１つの変異部位を含み、且つ７位のトレオニンがシステインに変異し、４７位のセリンがシステインに変異し、９０位のリシンがグリシンに変異し、９５位のアラニンがプロリンに変異し、２９７位のイソロイシンがロイシンに変異し、３０４位のリシンがアスパラギン酸に変異し、３８０位のグルタミンがロイシンに変異し、４０５位のアルギニンがグルタミン酸に変異し、４１６位のアルギニンがトレオニンに変異し、又はアミノ基転移酵素の変異体のアミノ酸配列が、変異が起きて得られるアミノ酸配列の変異部位を有し、且つ変異が起きて得られるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、好ましくは、アルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）に由来するアミノ基転移酵素が配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、アミノ基転移酵素の変異体のアミノ酸配列が配列番号２に示されるアミノ酸配列に変異が起きて得られるアミノ酸配列であり、変異が、少なくとも、３位、５位、６０位、１６４位、１７１位、１７８位、１８０位、１８６位、１８７位、２５２位、３７０位、３８４位、３８９位、４０４位、４１１位、４２３位及び４２４位の１つの変異部位を含み、且つ３位のロイシンがセリンに変異し、５位のバリンがセリンに変異し、６０位のシステインがチロシンに変異し、１６４位のフェニルアラニンがロイシンに変異し、１７１位のグルタミン酸がアスパラギン酸に変異し、１７８位のアラニンがロイシンに変異し、１８０位のイソロイシンがバリンに変異し、１８６位のセリンがグリシンに変異し、１８７位のセリンがアラニンに変異し、２５２位のバリンがイソロイシンに変異し、３７０位のロイシンがアラニンに変異し、３８４位のチロシンがフェニルアラニンに変異し、３８９位のイソロイシンがフェニルアラニンに変異し、４０４位のロイシンがグルタミンに変異し、４１１位のグリシンがアスパラギン酸に変異し、４２３位のメチオニンがリシンに変異し、４２４位のグルタミン酸がグルタミンに変異し、又はアミノ基転移酵素の変異体のアミノ酸配列が、変異が起きて得られるアミノ酸配列の変異部位を有し、且つ変異が起きて得られるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、好ましくは、アセトバクター属（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．）ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１に由来するケト還元酵素が配列番号３に示されるアミノ酸配列を有し、ケト還元酵素の変異体のアミノ酸配列が配列番号３に示されるアミノ酸配列に変異が起きて得られるアミノ酸配列であり、変異が、少なくとも、９４位、１４４位及び１５６位の１つの変異部位を含み、且つ９４位のアラニンがアスパラギンに変異し、１４４位のグルタミン酸がセリンに変異し、１５６位のアスパラギンがトレオニン若しくはバリンに変異し、又はケト還元酵素の変異体のアミノ酸配列が、変異が起きて得られるアミノ酸配列の変異部位を有し、且つ変異が起きて得られるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、好ましくは、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）Ｐｈｉ１に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼが配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼの変異体のアミノ酸配列が配列番号４に示されるアミノ酸配列に変異が起きて得られるアミノ酸配列であり、変異が、少なくとも、２８０位、４３５位、４３６位、４３８位、４４１位、５０８位及び５１０位の１つの変異部位を含み、且つ２８０位のフェニルアラニンがチロシンに変異し、４３５位のフェニルアラニンがアスパラギンに変異し、４３６位のフェニルアラニンがセリンに変異し、４３８位のロイシンがアラニンに変異し、４４１位のセリンがバリンに変異し、５１０位のロイシンがバリンに変異し、又はシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼの変異体のアミノ酸配列が、変異が起きて得られるアミノ酸配列の変異部位を有し、且つ変異が起きて得られるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、好ましくは、ロドコッカス・ルバー－ＳＤ１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ－ＳＤ１）に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼが配列番号５に示されるアミノ酸配列を有し、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼの変異体のアミノ酸配列が配列番号５に示されるアミノ酸配列に変異が起きて得られるアミノ酸配列であり、変異が、少なくとも、４５位、１９０位、２４９位、２５７位、３９３位、５０４位及び５５９位の１つの変異部位を含み、且つ４５位のメチオニンがトレオニンに変異し、１９０位のプロリンがロイシンに変異し、２４９位のシステインがバリンに変異し、２５７位のシステインがアラニンに変異し、３９３位のシステインがバリンに変異し、５０４位のプロリンがバリンに変異し、５５９位のチロシンがメチオニンに変異し、又はシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼの変異体のアミノ酸配列が、変異が起きて得られるアミノ酸配列の変異部位を有し、且つ変異が起きて得られるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列である。
ＰＶＡ膜固定化酵素の触媒効率を高めるために、好ましくは、前記ＰＶＡ膜固定化酵素が各酵素の補酵素及び補因子をさらに含む。前記各酵素の補酵素及び補因子としては、もし当該酵素が対応する補酵素及び補因子を有すれば、ＰＶＡ膜固定化酵素には当該酵素の補酵素及び補因子がさらに包埋されており、もし当該酵素が補酵素又は補因子を有さなければ、ＰＶＡ膜固定化酵素には他の補酵素又は補因子を設けない。
本願のＰＶＡ膜固定化酵素は、精製酵素に適するだけでなく、粗酵素にも適し、プロセスの簡素化のために、好ましくは、当該酵素が粗酵素である。また、本願の固定化の方式は包埋であるため、担載可能な酵素量は比較的多く、好ましくは、酵素の担載容量が０．０５～０．４ｇの遊離酵素／ｃｍ２膜又は０．０３～０．０６ｇの乾燥した架橋酵素凝集体／ｃｍ２膜である。
別の実施例において、前記ＰＶＡ多孔質膜はポリエチレングリコール及び／又はポリエチレンイミンをさらに有し、ポリエチレングリコールの分子量は、ＰＥＧ４００～ＰＥＧ６０００であり、ポリエチレンイミンの分子量は、３ＫＤａ～７０ＫＤａであり、好ましくは、３ＫＤａ～５０ＫＤａである。さらに、好ましくは、前記ポリエチレングリコールとＰＶＡ多孔質膜との質量比が５：４～７５：４であり、ポリエチレンイミンとＰＶＡ多孔質膜との質量比が１：１２～１：２４０である。前記ポリエチレングリコール、ポリエチレンイミンは、ＰＶＡ多孔質膜中の細孔構造を増やす。
本願の別の典型的な実施形態において、前記いずれかのＰＶＡ膜固定化酵素の製造方法を提供し、当該製造方法は、酵素及びＰＶＡ溶液を含む原料を所定の時間混合して、混合系を得るステップＳ１と、混合系を金型に加えて混合系に乾燥処理を行って、膜包埋酵素を得ることであって、金型は、三次元的に構造されたＰＶＡ多孔質膜を形成させるために三次元的に構造された金型であるステップＳ２と、リン酸緩衝液で膜包埋酵素に浸漬処理を行って洗浄した後、ＰＶＡ膜固定化酵素を得るステップＳ３とを含み、好ましくは、混合系のｐＨが６．０～６．５である。
本願の製造方法は、混合、乾燥及び後処理のプロセスを用いるだけでＰＶＡ膜固定化酵素を形成させることができ、工程がシンプルであり、操作しやすく、グルタルアルデヒド、アミノ基、カルボキシ基などを用いて架橋又は共有結合による固定を必要とせず、形成させたＰＶＡ膜固定化酵素中のＰＶＡ多孔質膜は担体として酵素を包埋の方式で固定化し、精製酵素又は粗酵素にいずれも良好な固定化効果を有し、且つ酵素はＰＶＡ多孔質膜内に包埋固定化されると比較的安定しており、使用中に浸出しにくく、採用するＰＶＡ多孔質膜の多孔質構造は反応物と生成物をよりよく送達できるため、連続フロー生体触媒への使用に適する。前記包埋固定は機械的な固定であるため、酵素に対して幅広い適合性を有する。三次元的に構造された金型を採用してＰＶＡ多孔質膜を三次元的に構造させることによって、立体的構造を持たせ、さらに、より大きい表面積を有するため、より多くの包埋部位を提供し、さらに、酵素の高い活性及び安定性を保証した上で、酵素の担載容量を高めている。
前記混合系の形成方式は、酵素の提供形態によって変更してもよいが、以下、混合系のいくつかの好ましい形成方式を提供し、ステップＳ１に対する下記の説明はステップＳ１の範囲への限定にならない。
本願の一実施例において、前記ステップＳ１は、酵素懸濁液又は酵素溶液を調製することであって、懸濁液中の酵素は架橋酵素凝集体であり、酵素溶液中の酵素は細胞を除去した遊離酵素であることと、懸濁液又は酵素溶液とＰＶＡ溶液を所定の時間混合して、混合系を得ることとを含む。酵素溶液であれ酵素懸濁液であれ、いずれもＰＶＡ溶液と混合することができ、混合工程では機械的撹拌又は磁気撹拌を行うことができる。
前記ＰＶＡ溶液は、ＰＶＡ、水、酢酸、メタノール及び硫酸を含む混合溶液であり、好ましくは、混合溶液のｐＨが５．５～６．５であり、酢酸、メタノール及び硫酸を組み合わせると得られた膜はより多くの微細孔を有する。
ＰＶＡ溶液における酵素の分散の均一性を向上させるために、好ましくは、前記所定の時間が２～４時間である。
機械的強度により信頼性のあるゲル薄膜を形成させるためには、ＰＶＡ溶液のＰＶＡの分子量が２０ＫＤａ～２００ＫＤａであり、また、さらに、孔隙率の高いＰＶＡ多孔質膜を形成させ且つ酵素がその中に分散しやすいように、好ましくは、ＰＶＡ溶液中のＰＶＡの含有量が５～３０ｇ／１００ｍＬであり、好ましくは、１０～５０ｇ／１００ｍＬである。
ＰＶＡ膜包埋酵素という機械的な固定化方式は、酵素の担載容量を大きくすることができ、好ましくは、前記懸濁液又は酵素溶液中の酵素の濃度が０．１～０．５ｇ／ｍＬであり、好ましくは、酵素とＰＶＡ溶液との比率が１～５０ｇ／１００ｍＬであり、より好ましくは、５～４０ｇ／１００ｍＬである。
混合工程で、酵素の高い活性を保持させるために、好ましくは、懸濁液又は酵素溶液が、リン酸緩衝液、任意選択の補因子及び任意選択の補酵素をさらに含み、好ましくは、補因子の濃度が１～２０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、補酵素と酵素との重量比率が１０：１～１：１０である。
本願の別の実施例において、前記ステップＳ１は、ＰＶＡ水溶液、架橋酵素粒子を混合して、混合系を形成させることを含む。当該実施例において、架橋酵素が乾燥粒子の形態でＰＶＡ水溶液と混合するため、架橋酵素粒子は分散しやすい。酵素の担載容量を保証するために、好ましくは、架橋酵素粒子とＰＶＡ水溶液との比率が１～５０ｇ／１００ｍＬである。同様に、ＰＶＡ水溶液における架橋酵素粒子の分散の均一性を向上させるために、好ましくは、所定の時間が１０～６０分である。さらに、必要ならば、好ましくは、架橋酵素粒子が酵素、任意選択の補因子及び任意選択の補酵素を含む。
本願のまた別の実施例において、前記ステップＳ１は、ＰＶＡ水溶液、改質剤溶液を第１の所定時間混合して、第２混合系を形成させることと、第２混合系と酵素系を第２の所定時間混合して、混合系を形成させることとを含む。改質剤を使用してＰＶＡの成膜を促進し、その中の細孔構造を増やす。
さらに孔隙率の高いＰＶＡ多孔質膜を形成させ、且つ酵素がその中に分散しやすいように、好ましくは、ＰＶＡ水溶液の濃度が５～３０ｇ／１００ｍＬである。本願で用いる改質剤は、ＰＶＡの成膜でよく使用する改質剤の中から選択することができ、改質剤の酵素に対する影響を避けるために、好ましくは、改質剤溶液が、酢酸、メタノール、硫酸が分散されている混合液及び／又は補因子が分散されているポリエチレングリコール水溶液及び／又は補因子が分散されているポリエチレンイミン水溶液を含み、好ましくは、混合液中の酢酸の含有量が２～４ｇ／１００ｍＬであり、メタノールの含有量が５～９ｇ／１００ｍＬであり、硫酸の含有量が０．５～１ｇ／１００ｍＬであり、好ましくは、ポリエチレングリコールの分子量がＰＥＧ４００～ＰＥＧ６０００であり、好ましくは、混合系中のポリエチレングリコールの濃度が３～１０ｇ／１００ｍＬであり、好ましくは、ポリエチレンイミンの分子量が３ＫＤａ～７０ＫＤａであり、より好ましくは、３ＫＤａ～５０ＫＤａであり、好ましくは、混合系中のポリエチレンイミンの濃度が０．１～１ｇ／１００ｍＬであり、より好ましくは、０．１～０．３ｇ／１００ｍＬである。
上述したように改質剤溶液を添加した時には、酵素系と第２混合系の混合に明らかな影響が生じないため、前記酵素系は、従来の酵素の提供の一般的な形態であってもよく、好ましくは、酵素系が、酵素、任意選択の補因子、任意選択の補酵素及びリン酸緩衝液を含み、好ましくは、酵素が、細胞を除去した遊離酵素又は架橋酵素凝集体である。酵素の担載容量を高めるために、補因子及び補酵素を使用する必要がある時に、補因子の濃度は、１～２０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、酵素系中の補酵素と酵素との重量比率が１０：１～１：１０であり、酵素とＰＶＡ溶液との比率が１～５０ｇ／１００ｍＬである。
混合系を形成させた後に、混合系を静置して乾燥させてもよく、成膜の過程を加速させるために、好ましくは、前記ステップＳ２が、混合系を金型に置いて第３の所定時間静置した後に金型に脱水促進剤を加えて乾燥処理を行うことであって、脱水促進剤が、アセトニトリル、エタノール及びアセトンからなる群からいずれか又は複数選ばれることを含み、好ましくは、脱水促進剤と混合系との体積比率が１：１０～５：１である。成膜工程では、形成されたＰＶＡ多孔質膜によって酵素が包埋されて、安定した固定化酵素構造が形成される。成膜が早すぎて、酵素が完全には被覆されないことを避けるために、好ましくは、第３の所定時間が２～４時間である。また、三次元的に構造された金型構造の簡素化のために、好ましくは、三次元的に構造された金型が突起又は凹溝を有する。
成膜後に、酵素の固定化を一層確実にするために、好ましくは、前記ステップＳ３が、膜包埋酵素をリン酸緩衝液に２～１６時間浸漬した後に新しいリン酸緩衝液で膜包埋酵素を洗浄して、ＰＶＡ膜固定化酵素を得ることを含む。
本願に記載の製造方法で、使用する酵素は精製酵素であってもよいし、粗酵素であってもよく、コストを節約するために、好ましくは、前記酵素が粗酵素である。
本願で得たＰＶＡ膜固定化酵素をさらに緩衝液で再懸濁し、グルタルアルデヒドを加えて改質してもよく、酵素分子同士はアミノ基とグルタルアルデヒドのアルデヒド基の共有結合によって互いに架橋してより大きな凝集体を形成させ、ＰＶＡ膜から漏れることはなく、また、ＰＶＡ膜の表面に付着している酵素はグルタルアルデヒドのアーム作用によってＰＶＡと共有接続することによって、一層強固に固定化され、使用回数が増加する。好ましくは、グルタルアルデヒドの量が１～２ｇ／１００ｍＬ懸濁液である。
以下、実施例及び比較例で本願の有益な効果を一層説明する。
下記の実施例で使用する酵素及びその由来は、表１を参照する。
ＴＡ－Ｃｖアミノ基転移酵素のアミノ酸配列は、配列番号１：
ＭＱＫＱＲＴＴＳＱＷＲＥＬＤＡＡＨＨＬＨＰＦＴＤＴＡＳＬＮＱＡＧＡＲＶＭＴＲＧＥＧＶＹＬＷＤＳＥＧＮＫＩＩＤＧＭＡＧＬＷＣＶＮＶＧＹＧＲＫＤＦＡＥＡＡＲＲＱＭＥＥＬＰＦＹＮＴＦＦＫＴＴＨＰＡＶＶＥＬＳＳＬＬＡＥＶＴＰＡＧＦＤＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＳＶＤＴＭＩＲＭＶＲＲＹＷＤＶＱＧＫＰＥＫＫＴＬＩＧＲＷＮＧＹＨＧＳＴＩＧＧＡＳＬＧＧＭＫＹＭＨＥＱＧＤＬＰＩＰＧＭＡＨＩＥＱＰＷＷＹＫＨＧＫＤＭＴＰＤＥＦＧＶＶＡＡＲＷＬＥＥＫＩＬＥＩＧＡＤＫＶＡＡＦＶＧＥＰＩＱＧＡＧＧＶＩＶＰＰＡＴＹＷＰＥＩＥＲＩＣＲＫＹＤＶＬＬＶＡＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＥＷＦＧＨＱＨＦＧＦＱＰＤＬＦＴＡＡＫＧＬＳＳＧＹＬＰＩＧＡＶＦＶＧＫＲＶＡＥＧＬＩＡＧＧＤＦＮＨＧＦＴＹＳＧＨＰＶＣＡＡＶＡＨＡＮＶＡＡＬＲＤＥＧＩＶＱＲＶＫＤＤＩＧＰＹＭＱＫＲＷＲＥＴＦＳＲＦＥＨＶＤＤＶＲＧＶＧＭＶＱＡＦＴＬＶＫＮＫＡＫＲＥＬＦＰＤＦＧＥＩＧＴＬＣＲＤＩＦＦＲＮＮＬＩＭＲＡＣＧＤＨＩＶＳＡＰＰＬＶＭＴＲＡＥＶＤＥＭＬＡＶＡＥＲＣＬＥＥＦＥＱＴＬＫＡＲＧＬＡである。
ＭＱＫＱＲＴＴＳＱＷＲＥＬＤＡＡＨＨＬＨＰＦＴＤＴＡＳＬＮＱＡＧＡＲＶＭＴＲＧＥＧＶＹＬＷＤＳＥＧＮＫＩＩＤＧＭＡＧＬＷＣＶＮＶＧＹＧＲＫＤＦＡＥＡＡＲＲＱＭＥＥＬＰＦＹＮＴＦＦＫＴＴＨＰＡＶＶＥＬＳＳＬＬＡＥＶＴＰＡＧＦＤＲＶＦＹＴＮＳＧＳＥＳＶＤＴＭＩＲＭＶＲＲＹＷＤＶＱＧＫＰＥＫＫＴＬＩＧＲＷＮＧＹＨＧＳＴＩＧＧＡＳＬＧＧＭＫＹＭＨＥＱＧＤＬＰＩＰＧＭＡＨＩＥＱＰＷＷＹＫＨＧＫＤＭＴＰＤＥＦＧＶＶＡＡＲＷＬＥＥＫＩＬＥＩＧＡＤＫＶＡＡＦＶＧＥＰＩＱＧＡＧＧＶＩＶＰＰＡＴＹＷＰＥＩＥＲＩＣＲＫＹＤＶＬＬＶＡＤＥＶＩＣＧＦＧＲＴＧＥＷＦＧＨＱＨＦＧＦＱＰＤＬＦＴＡＡＫＧＬＳＳＧＹＬＰＩＧＡＶＦＶＧＫＲＶＡＥＧＬＩＡＧＧＤＦＮＨＧＦＴＹＳＧＨＰＶＣＡＡＶＡＨＡＮＶＡＡＬＲＤＥＧＩＶＱＲＶＫＤＤＩＧＰＹＭＱＫＲＷＲＥＴＦＳＲＦＥＨＶＤＤＶＲＧＶＧＭＶＱＡＦＴＬＶＫＮＫＡＫＲＥＬＦＰＤＦＧＥＩＧＴＬＣＲＤＩＦＦＲＮＮＬＩＭＲＡＣＧＤＨＩＶＳＡＰＰＬＶＭＴＲＡＥＶＤＥＭＬＡＶＡＥＲＣＬＥＥＦＥＱＴＬＫＡＲＧＬＡである。
その変異体１（ＴＡ－Ｃｖ－Ｖ１）の変異部位及びアミノ酸変異状況は、Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｑ３８０Ｌであり、変異体２（ＴＡ－Ｃｖ－Ｖ２）の変異部位及びアミノ酸変異状況は、Ｒ４１６Ｔ＋Ｔ７Ｃ＋Ｓ４７Ｃ＋Ｒ４０５Ｅ＋Ｋ９０Ｇ＋Ａ９５Ｐ＋Ｋ３０４Ｄ＋Ｑ３８０Ｌ＋Ｉ２９７Ｌである。
ＴＡ－Ａｃアミノ基転移酵素のアミノ酸配列は、配列番号２：
ＭＧＬＴＶＱＫＩＮＷＥＱＶＫＥＷＤＲＫＹＬＭＲＴＦＳＴＱＮＥＹＱＰＶＰＩＥＳＴＥＧＤＹＬＩＴＰＧＧＴＲＬＬＤＦＦＮＱＬＣＣＶＮＬＧＱＫＮＱＫＶＮＡＡＩＫＥＡＬＤＲＹＧＦＶＷＤＴＹＡＴＤＹＫＡＫＡＡＫＩＩＩＥＤＩＬＧＤＥＤＷＰＧＫＶＲＦＶＳＴＧＳＥＡＶＥＴＡＬＮＩＡＲＬＹＴＮＲＰＬＶＶＴＲＥＨＤＹＨＧＷＴＧＧＡＡＴＶＴＲＬＲＳＦＲＳＧＬＶＧＥＮＳＥＳＦＳＡＱＩＰＧＳＳＣＳＳＡＶＬＭＡＰＳＳＮＴＦＱＤＳＮＧＮＹＬＫＤＥＮＧＥＬＬＳＶＫＹＴＲＲＭＩＥＮＹＧＰＥＱＶＡＡＶＩＴＥＶＳＱＧＶＧＳＴＭＰＰＹＥＹＶＰＱＩＲＫＭＴＫＥＬＧＶＬＷＩＳＤＥＶＬＴＧＦＧＲＴＧＫＷＦＧＹＱＨＹＧＶＱＰＤＩＩＴＭＧＫＧＬＳＳＳＳＬＰＡＧＡＶＶＶＳＫＥＩＡＡＦＭＤＫＨＲＷＥＳＶＳＴＹＡＧＨＰＶＡＭＡＡＶＣＡＮＬＥＶＭＭＥＥＮＬＶＥＱＡＫＮＳＧＥＹＩＲＳＫＬＥＬＬＱＥＫＨＫＳＩＧＮＦＤＧＹＧＬＬＷＩＶＤＩＶＮＡＫＴＫＴＰＹＶＫＬＤＲＮＦＲＨＧＭＮＰＮＱＩＰＴＱＩＩＭＥＫＡＬＥＫＧＶＬＩＧＧＡＭＰＮＴＭＲＩＧＡＳＬＮＶＳＲＧＤＩＤＫＡＭＤＡＬＤＹＡＬＤＹＬＥＳＧＥＷＱＱＳである。
ＭＧＬＴＶＱＫＩＮＷＥＱＶＫＥＷＤＲＫＹＬＭＲＴＦＳＴＱＮＥＹＱＰＶＰＩＥＳＴＥＧＤＹＬＩＴＰＧＧＴＲＬＬＤＦＦＮＱＬＣＣＶＮＬＧＱＫＮＱＫＶＮＡＡＩＫＥＡＬＤＲＹＧＦＶＷＤＴＹＡＴＤＹＫＡＫＡＡＫＩＩＩＥＤＩＬＧＤＥＤＷＰＧＫＶＲＦＶＳＴＧＳＥＡＶＥＴＡＬＮＩＡＲＬＹＴＮＲＰＬＶＶＴＲＥＨＤＹＨＧＷＴＧＧＡＡＴＶＴＲＬＲＳＦＲＳＧＬＶＧＥＮＳＥＳＦＳＡＱＩＰＧＳＳＣＳＳＡＶＬＭＡＰＳＳＮＴＦＱＤＳＮＧＮＹＬＫＤＥＮＧＥＬＬＳＶＫＹＴＲＲＭＩＥＮＹＧＰＥＱＶＡＡＶＩＴＥＶＳＱＧＶＧＳＴＭＰＰＹＥＹＶＰＱＩＲＫＭＴＫＥＬＧＶＬＷＩＳＤＥＶＬＴＧＦＧＲＴＧＫＷＦＧＹＱＨＹＧＶＱＰＤＩＩＴＭＧＫＧＬＳＳＳＳＬＰＡＧＡＶＶＶＳＫＥＩＡＡＦＭＤＫＨＲＷＥＳＶＳＴＹＡＧＨＰＶＡＭＡＡＶＣＡＮＬＥＶＭＭＥＥＮＬＶＥＱＡＫＮＳＧＥＹＩＲＳＫＬＥＬＬＱＥＫＨＫＳＩＧＮＦＤＧＹＧＬＬＷＩＶＤＩＶＮＡＫＴＫＴＰＹＶＫＬＤＲＮＦＲＨＧＭＮＰＮＱＩＰＴＱＩＩＭＥＫＡＬＥＫＧＶＬＩＧＧＡＭＰＮＴＭＲＩＧＡＳＬＮＶＳＲＧＤＩＤＫＡＭＤＡＬＤＹＡＬＤＹＬＥＳＧＥＷＱＱＳである。
その変異体１（ＴＡ－Ａｃ－Ｖ１）の変異部位及びアミノ酸変異状況は、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｌ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｉ３８９Ｆ＋Ｖ２５２Ｉ＋Ｌ４０４Ｑ＋Ｅ１７１Ｄであり、変異体２（ＴＡ－Ａｃ－Ｖ２）の変異部位及びアミノ酸変異状況は、Ｌ３Ｓ＋Ｖ５Ｓ＋Ｃ６０Ｙ＋Ｆ１６４Ｌ＋Ａ１７８Ｌ＋Ｓ１８７Ａ＋Ｉ１８０Ｖ＋Ｌ３７０Ａ＋Ｇ４１１Ｄ＋Ｓ１８６Ｇ＋Ｙ３８４Ｆ＋Ｉ３８９Ｆ＋Ｖ２５２Ｉ＋Ｅ４２４Ｑ＋Ｍ４２３Ｋである。
ＫＲＥＤ－Ａｃケト還元酵素のアミノ酸配列は、配列番号３：
ＭＡＲＶＡＧＫＶＡＩＶＳＧＡＡＮＧＩＧＫＡＴＡＱＬＬＡＫＥＧＡＫＶＶＩＧＤＬＫＥＥＤＧＱＫＡＶＡＥＩＫＡＡＧＧＥＡＡＦＶＫＬＮＶＴＤＥＡＡＷＫＡＡＩＧＱＴＬＫＬＹＧＲＬＤＩＡＶＮＮＡＧＩＮＹＳＧＳＶＥＳＴＳＬＥＤＷＲＲＶＱＳＩＮＬＤＧＶＦＬＧＴＱＶＡＩＥＡＭＫＫＳＧＧＧＳＩＶＮＬＳＳＩＳＧＬＩＧＤＰＭＬＡＡＹＶＡＳＫＧＧＶＲＬＦＴＫＳＡＡＬＨＣＡＫＳＧＹＫＩＲＶＮＳＶＨＰＧＹＩＷＴＰＭＶＡＧＬＴＫＥＤＡＡＡＲＱＫＬＶＤＬＨＰＩＧＨＬＧＥＰＮＤＩＡＹＧＩＬＹＬＡＳＤＥＳＫＦＶＴＧＳＥＬＶＩＤＧＧＹＴＡＱである。
ＭＡＲＶＡＧＫＶＡＩＶＳＧＡＡＮＧＩＧＫＡＴＡＱＬＬＡＫＥＧＡＫＶＶＩＧＤＬＫＥＥＤＧＱＫＡＶＡＥＩＫＡＡＧＧＥＡＡＦＶＫＬＮＶＴＤＥＡＡＷＫＡＡＩＧＱＴＬＫＬＹＧＲＬＤＩＡＶＮＮＡＧＩＮＹＳＧＳＶＥＳＴＳＬＥＤＷＲＲＶＱＳＩＮＬＤＧＶＦＬＧＴＱＶＡＩＥＡＭＫＫＳＧＧＧＳＩＶＮＬＳＳＩＳＧＬＩＧＤＰＭＬＡＡＹＶＡＳＫＧＧＶＲＬＦＴＫＳＡＡＬＨＣＡＫＳＧＹＫＩＲＶＮＳＶＨＰＧＹＩＷＴＰＭＶＡＧＬＴＫＥＤＡＡＡＲＱＫＬＶＤＬＨＰＩＧＨＬＧＥＰＮＤＩＡＹＧＩＬＹＬＡＳＤＥＳＫＦＶＴＧＳＥＬＶＩＤＧＧＹＴＡＱである。
その変異体１（ＫＲＥＤ－Ａｃ－Ｖ１）の変異部位及びアミノ酸変異状況は、Ｅ１４４Ｓ＋Ａ９４Ｎ＋Ｎ１５６Ｖであり、変異体２（ＫＲＥＤ－Ａｃ－Ｖ２）の変異部位及びアミノ酸変異状況は、Ｅ１４４Ｓ＋Ａ９４Ｔ＋Ｎ１５６Ｔである。
ＣＨＭＯ－Ｒｓシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列は、配列番号４：
ＭＴＡＱＩＳＰＴＶＶＤＡＶＶＩＧＡＧＦＧＧＩＹＡＶＨＫＬＨＮＥＱＧＬＴＶＶＧＦＤＫＡＤＧＰＧＧＴＷＹＷＮＲＹＰＧＡＬＳＤＴＥＳＨＬＹＲＦＳＦＤＲＤＬＬＱＤＧＴＷＫＴＴＹＩＴＱＰＥＩＬＥＹＬＥＳＶＶＤＲＦＤＬＲＲＨＦＲＦＧＴＥＶＴＳＡＩＹＬＥＤＥＮＬＷＥＶＳＴＤＫＧＥＶＹＲＡＫＹＶＶＮＡＶＧＬＬＳＡＩＮＦＰＤＬＰＧＬＤＴＦＥＧＥＴＩＨＴＡＡＷＰＥＧＫＮＬＡＧＫＲＶＧＶＩＧＴＧＳＴＧＱＱＶＩＴＡＬＡＰＥＶＥＨＬＴＶＦＶＲＴＰＱＹＳＶＰＶＧＮＲＰＶＴＫＥＱＩＤＡＩＫＡＤＹＤＧＩＷＤＳＶＫＫＳＡＶＡＦＧＦＥＥＳＴＬＰＡＭＳＶＳＥＥＥＲＮＲＩＦＱＥＡＷＤＨＧＧＧＦＲＦＭＦＧＴＦＧＤＩＡＴＤＥＡＡＮＥＡＡＡＳＦＩＲＳＫＩＡＥＩＩＥＤＰＥＴＡＲＫＬＭＰＴＧＬＹＡＫＲＰＬＣＤＮＧＹＹＥＶＹＮＲＰＮＶＥＡＶＡＩＫＥＮＰＩＲＥＶＴＡＫＧＶＶＴＥＤＧＶＬＨＥＬＤＶＬＶＦＡＴＧＦＤＡＶＤＧＮＹＲＲＩＥＩＲＧＲＮＧＬＨＩＮＤＨＷＤＧＱＰＴＳＹＬＧＶＴＴＡＮＦＰＮＷＦＭＶＬＧＰＮＧＰＦＴＮＬＰＰＳＩＥＴＱＶＥＷＩＳＤＴＶＡＹＡＥＲＮＥＩＲＡＩＥＰＴＰＥＡＥＥＥＷＴＱＴＣＴＤＩＡＮＡＴＬＦＴＲＧＤＳＷＩＦＧＡＮＶＰＧＫＫＰＳＶＬＦＹＬＧＧＬＧＮＹＲＮＶＬＡＧＶＶＡＤＳＹＲＧＦＥＬＫＳＡＶＰＶＴＡである。
ＭＴＡＱＩＳＰＴＶＶＤＡＶＶＩＧＡＧＦＧＧＩＹＡＶＨＫＬＨＮＥＱＧＬＴＶＶＧＦＤＫＡＤＧＰＧＧＴＷＹＷＮＲＹＰＧＡＬＳＤＴＥＳＨＬＹＲＦＳＦＤＲＤＬＬＱＤＧＴＷＫＴＴＹＩＴＱＰＥＩＬＥＹＬＥＳＶＶＤＲＦＤＬＲＲＨＦＲＦＧＴＥＶＴＳＡＩＹＬＥＤＥＮＬＷＥＶＳＴＤＫＧＥＶＹＲＡＫＹＶＶＮＡＶＧＬＬＳＡＩＮＦＰＤＬＰＧＬＤＴＦＥＧＥＴＩＨＴＡＡＷＰＥＧＫＮＬＡＧＫＲＶＧＶＩＧＴＧＳＴＧＱＱＶＩＴＡＬＡＰＥＶＥＨＬＴＶＦＶＲＴＰＱＹＳＶＰＶＧＮＲＰＶＴＫＥＱＩＤＡＩＫＡＤＹＤＧＩＷＤＳＶＫＫＳＡＶＡＦＧＦＥＥＳＴＬＰＡＭＳＶＳＥＥＥＲＮＲＩＦＱＥＡＷＤＨＧＧＧＦＲＦＭＦＧＴＦＧＤＩＡＴＤＥＡＡＮＥＡＡＡＳＦＩＲＳＫＩＡＥＩＩＥＤＰＥＴＡＲＫＬＭＰＴＧＬＹＡＫＲＰＬＣＤＮＧＹＹＥＶＹＮＲＰＮＶＥＡＶＡＩＫＥＮＰＩＲＥＶＴＡＫＧＶＶＴＥＤＧＶＬＨＥＬＤＶＬＶＦＡＴＧＦＤＡＶＤＧＮＹＲＲＩＥＩＲＧＲＮＧＬＨＩＮＤＨＷＤＧＱＰＴＳＹＬＧＶＴＴＡＮＦＰＮＷＦＭＶＬＧＰＮＧＰＦＴＮＬＰＰＳＩＥＴＱＶＥＷＩＳＤＴＶＡＹＡＥＲＮＥＩＲＡＩＥＰＴＰＥＡＥＥＥＷＴＱＴＣＴＤＩＡＮＡＴＬＦＴＲＧＤＳＷＩＦＧＡＮＶＰＧＫＫＰＳＶＬＦＹＬＧＧＬＧＮＹＲＮＶＬＡＧＶＶＡＤＳＹＲＧＦＥＬＫＳＡＶＰＶＴＡである。
その変異体１（ＣＨＭＯ－Ｒｓ－Ｃｖ－Ｖ１）の変異部位及びアミノ酸変異状況は、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖであり、変異体２（ＣＨＭＯ－Ｒｓ－Ｃｖ－Ｖ２）の変異部位及びアミノ酸変異状況は、Ｆ５０８Ｙ＋Ｆ４３５Ｎ＋Ｌ４３８Ａ＋Ｔ４３６Ｓ＋Ｆ２８０Ｖ＋Ｓ４４１Ｖ＋Ｌ５１０Ｖである。
ＣＨＭＯ－Ｒｒシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼのアミノ酸配列は、配列番号５：
ＭＴＴＳＩＤＲＥＡＬＲＲＫＹＡＥＥＲＤＫＲＩＲＰＤＧＮＤＱＹＩＲＬＤＨＶＤＧＷＳＨＤＰＹＭＰＩＴＰＲＥＰＫＬＤＨＶＴＦＡＦＩＧＧＧＦＳＧＬＶＴＡＡＲＬＲＥＳＧＶＥＳＶＲＩＩＤＫＡＧＤＦＧＧＶＷＹＷＮＲＹＰＧＡＭＣＤＴＡＡＭＶＹＭＰＬＬＥＥＴＧＹＭＰＴＥＫＹＡＨＧＰＥＩＬＥＨＣＱＲＩＧＫＨＹＤＬＹＤＤＡＬＦＨＴＥＶＴＤＬＶＷＱＥＨＤＱＲＷＲＩＳＴＮＲＧＤＨＦＴＡＱＦＶＧＭＧＴＧＰＬＨＶＡＱＬＰＧＩＰＧＩＥＳＦＲＧＫＳＦＨＴＳＲＷＤＹＤＹＴＧＧＤＡＬＧＡＰＭＤＫＬＡＤＫＲＶＡＶＩＧＴＧＡＴＡＶＱＣＶＰＥＬＡＫＹＣＲＥＬＹＶＶＱＲＴＰＳＡＶＤＥＲＧＮＨＰＩＤＥＫＷＦＡＱＩＡＴＰＧＷＱＫＲＷＬＤＳＦＴＡＩＷＤＧＶＬＴＤＰＳＥＬＡＩＥＨＥＤＬＶＱＤＧＷＴＡＬＧＱＲＭＲＡＡＶＧＳＶＰＩＥＱＹＳＰＥＮＶＱＲＡＬＥＥＡＤＤＥＱＭＥＲＩＲＡＲＶＤＥＩＶＴＤＰＡＴＡＡＱＬＫＡＷＦＲＱＭＣＫＲＰＣＦＨＤＤＹＬＰＡＦＮＲＰＮＴＨＬＶＤＴＧＧＫＧＶＥＲＩＴＥＮＧＶＶＶＡＧＶＥＹＥＶＤＣＩＶＹＡＳＧＦＥＦＬＧＴＧＹＴＤＲＡＧＦＤＰＴＧＲＤＧＶＫＬＳＥＨＷＡＱＧＴＲＴＬＨＧＭＨＴＹＧＦＰＮＬＦＶＬＱＬＭＱＧＡＡＬＧＳＮＩＰＨＮＦＶＥＡＡＲＶＶＡＡＩＶＤＨＶＬＳＴＧＴＳＳＶＥＴＴＫＥＡＥＱＡＷＶＱＬＬＬＤＨＧＲＰＬＧＮＰＥＣＴＰＧＹＹＮＮＥＧＫＰＡＥＬＫＤＲＬＮＶＧＹＰＡＧＳＡＡＦＦＲＭＭＤＨＷＬＡＡＧＳＦＤＧＬＴＦＲである。
ＭＴＴＳＩＤＲＥＡＬＲＲＫＹＡＥＥＲＤＫＲＩＲＰＤＧＮＤＱＹＩＲＬＤＨＶＤＧＷＳＨＤＰＹＭＰＩＴＰＲＥＰＫＬＤＨＶＴＦＡＦＩＧＧＧＦＳＧＬＶＴＡＡＲＬＲＥＳＧＶＥＳＶＲＩＩＤＫＡＧＤＦＧＧＶＷＹＷＮＲＹＰＧＡＭＣＤＴＡＡＭＶＹＭＰＬＬＥＥＴＧＹＭＰＴＥＫＹＡＨＧＰＥＩＬＥＨＣＱＲＩＧＫＨＹＤＬＹＤＤＡＬＦＨＴＥＶＴＤＬＶＷＱＥＨＤＱＲＷＲＩＳＴＮＲＧＤＨＦＴＡＱＦＶＧＭＧＴＧＰＬＨＶＡＱＬＰＧＩＰＧＩＥＳＦＲＧＫＳＦＨＴＳＲＷＤＹＤＹＴＧＧＤＡＬＧＡＰＭＤＫＬＡＤＫＲＶＡＶＩＧＴＧＡＴＡＶＱＣＶＰＥＬＡＫＹＣＲＥＬＹＶＶＱＲＴＰＳＡＶＤＥＲＧＮＨＰＩＤＥＫＷＦＡＱＩＡＴＰＧＷＱＫＲＷＬＤＳＦＴＡＩＷＤＧＶＬＴＤＰＳＥＬＡＩＥＨＥＤＬＶＱＤＧＷＴＡＬＧＱＲＭＲＡＡＶＧＳＶＰＩＥＱＹＳＰＥＮＶＱＲＡＬＥＥＡＤＤＥＱＭＥＲＩＲＡＲＶＤＥＩＶＴＤＰＡＴＡＡＱＬＫＡＷＦＲＱＭＣＫＲＰＣＦＨＤＤＹＬＰＡＦＮＲＰＮＴＨＬＶＤＴＧＧＫＧＶＥＲＩＴＥＮＧＶＶＶＡＧＶＥＹＥＶＤＣＩＶＹＡＳＧＦＥＦＬＧＴＧＹＴＤＲＡＧＦＤＰＴＧＲＤＧＶＫＬＳＥＨＷＡＱＧＴＲＴＬＨＧＭＨＴＹＧＦＰＮＬＦＶＬＱＬＭＱＧＡＡＬＧＳＮＩＰＨＮＦＶＥＡＡＲＶＶＡＡＩＶＤＨＶＬＳＴＧＴＳＳＶＥＴＴＫＥＡＥＱＡＷＶＱＬＬＬＤＨＧＲＰＬＧＮＰＥＣＴＰＧＹＹＮＮＥＧＫＰＡＥＬＫＤＲＬＮＶＧＹＰＡＧＳＡＡＦＦＲＭＭＤＨＷＬＡＡＧＳＦＤＧＬＴＦＲである。
その変異体１（ＣＨＭＯ－Ｒｒ－Ｖ１）の変異部位及びアミノ酸変異状況は、Ｐ１９０Ｌ＋Ｙ５５９Ｍ＋Ｃ２４９Ｖ＋Ｃ３９３Ｖ＋Ｃ２５７Ａ＋Ｍ４５Ｔであり、変異体２（ＣＨＭＯ－Ｒｒ－Ｖ２）の変異部位及びアミノ酸変異状況は、Ｙ５５９Ｍ＋Ｐ１９０Ｌ＋Ｐ５０４Ｖである。
次の実施例で使用するリン酸塩緩衝液（ＰＢ）は、リン酸水素二ナトリウム－リン酸二水素ナトリウム緩衝液である。
（実施例１）
ＰＶＡ膜によるアミノ基転移酵素ＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡ（架橋酵素）の包埋固定：
ＰＶＡ Ｉ溶液の調製であった。５０ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）ＰＶＡ（２００ＫＤａ）及び３０ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）酢酸、５０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｗ／ｖ）硫酸を混合した。
ＰＶＡ膜によるカプセル化であった。ＰＶＡ Ｉ溶液のｐＨを６．０に調整し、溶液から２０ｍＬ取り出して、ＴＡ－ＣＶ架橋酵素凝集体（ＣＬＥＡ）の懸濁液と混合し（ＴＡ－ＣＶ架橋酵素凝集体ＣＬＥＡの懸濁液の組成としては、０．５ｇのＴＡ－ＣＶの架橋酵素が２ｍＬの０．１Ｍ リン酸塩緩衝液（ＰＢ、ｐＨ ７．０）に含まれており、且つ１ｍＬごとは２ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサールリン酸）を含む）２０分間撹拌して、混合系を形成させた。それを３Ｄ多孔質シリカゲルテンプレートに注ぎ、各テンプレートのウェルは正方形であり、容積は約０．１～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約２～５平方センチメートルであり、３７℃で乾燥して、膜包埋酵素を得た。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．０）＋０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液に３時間浸漬して、膜包埋酵素を緩衝液から取り出し、次に０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．０）で当該膜包埋酵素を３回洗浄して、実施例１のＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
ＰＶＡ膜によるアミノ基転移酵素ＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡ（架橋酵素）の包埋固定：
ＰＶＡ Ｉ溶液の調製であった。５０ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）ＰＶＡ（２００ＫＤａ）及び３０ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）酢酸、５０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｗ／ｖ）硫酸を混合した。
ＰＶＡ膜によるカプセル化であった。ＰＶＡ Ｉ溶液のｐＨを６．０に調整し、溶液から２０ｍＬ取り出して、ＴＡ－ＣＶ架橋酵素凝集体（ＣＬＥＡ）の懸濁液と混合し（ＴＡ－ＣＶ架橋酵素凝集体ＣＬＥＡの懸濁液の組成としては、０．５ｇのＴＡ－ＣＶの架橋酵素が２ｍＬの０．１Ｍ リン酸塩緩衝液（ＰＢ、ｐＨ ７．０）に含まれており、且つ１ｍＬごとは２ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサールリン酸）を含む）２０分間撹拌して、混合系を形成させた。それを３Ｄ多孔質シリカゲルテンプレートに注ぎ、各テンプレートのウェルは正方形であり、容積は約０．１～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約２～５平方センチメートルであり、３７℃で乾燥して、膜包埋酵素を得た。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．０）＋０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液に３時間浸漬して、膜包埋酵素を緩衝液から取り出し、次に０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．０）で当該膜包埋酵素を３回洗浄して、実施例１のＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
（比較例１）
前記実施例１の３Ｄ多孔質シリカゲルテンプレートを耐高温シリカゲルディスクに置き換えて平面のＰＶＡ膜包埋酵素を形成させ、シリカゲルディスクの底面積は８０平方センチメートルであった。
同時に、分子量の異なるＰＶＡ、ＰＶＡの濃度、酵素とＰＶＡの比率などのパラメータの、ＰＶＡ固定化酵素の活性及び安定性に対する影響を検討した。
変換及び安定性試験：
転化研究で採用するモデル反応：
前記反応式でＲ１、Ｒ２はそれぞれ独立してＨ、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換シクロアルキル基、置換又は非置換アラルキル基、置換又は非置換ヘテロシクリル基、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基から選ばれてもよいし、Ｒ１とＲ２が接続して環をなしてもよい。
０．１ｇのケトンマトリックス１を０．３５ｍＬのメタノールに溶解して、アミノ供与体として３．０モル当量のイソプロピルアミン塩酸塩を加え、反応系に５ｍｇのＰＬＰを加え、次に０．３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ ７．０で希釈して対象反応系を形成させた。３ｍｇのＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡ又は３ｍｇのＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡを含む実施例１の三次元的に構造されたＰＶＡ膜固定化酵素又は３ｍｇのＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡを含む比較例１の平面のＰＶＡ膜固定化酵素を触媒として使用した。３０℃で２０時間反応させた後、ＨＰＬＣ法で転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、１１回繰り返す転化率を測定して、表２に記録した。
前記実施例１の３Ｄ多孔質シリカゲルテンプレートを耐高温シリカゲルディスクに置き換えて平面のＰＶＡ膜包埋酵素を形成させ、シリカゲルディスクの底面積は８０平方センチメートルであった。
同時に、分子量の異なるＰＶＡ、ＰＶＡの濃度、酵素とＰＶＡの比率などのパラメータの、ＰＶＡ固定化酵素の活性及び安定性に対する影響を検討した。
変換及び安定性試験：
転化研究で採用するモデル反応：
前記反応式でＲ１、Ｒ２はそれぞれ独立してＨ、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換シクロアルキル基、置換又は非置換アラルキル基、置換又は非置換ヘテロシクリル基、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基から選ばれてもよいし、Ｒ１とＲ２が接続して環をなしてもよい。
０．１ｇのケトンマトリックス１を０．３５ｍＬのメタノールに溶解して、アミノ供与体として３．０モル当量のイソプロピルアミン塩酸塩を加え、反応系に５ｍｇのＰＬＰを加え、次に０．３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ ７．０で希釈して対象反応系を形成させた。３ｍｇのＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡ又は３ｍｇのＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡを含む実施例１の三次元的に構造されたＰＶＡ膜固定化酵素又は３ｍｇのＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡを含む比較例１の平面のＰＶＡ膜固定化酵素を触媒として使用した。３０℃で２０時間反応させた後、ＨＰＬＣ法で転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、１１回繰り返す転化率を測定して、表２に記録した。
さらに、ＰＶＡの分子量、ＰＶＡの濃度、酵素とＰＶＡ溶液の比率のＰＶＡ固定化酵素の活性及び安定性に対する影響の結果を表３に示す。
混合系のｐＨの酵素活性及び安定性に対する影響を表４に示す。
（実施例２）
ＰＶＡ膜によるアミノ基転移酵素ＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡの包埋固定：
ＰＶＡ ＩＩ溶液の調製：１２％～１５％（ｗ／ｖ）ＰＶＡ水溶液。
ＰＶＡ膜による包埋であった。３０ｍＬのＰＶＡ溶液に３ｇのＣＬＥＡ湿潤粒子、及び５０ｍｇのＰＬＰを加え、均一に撹拌して混合系を形成させ、３Ｄ多孔質シリカゲルテンプレートに注ぎ、各テンプレートのウェルは円形であり、容積は約０．１５～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約３～５平方センチメートルであり、３７℃で乾燥して、膜包埋酵素を得た。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ ７．０緩衝液に一晩浸漬して、緩衝液から膜包埋酵素を取り出し、次に０．１Ｍ ＰＢ ７．０緩衝液で当該膜包埋酵素を２回洗浄して、実施例２のＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
ＣＬＥＡを添加する前に、一定の量のＰＥＧ４００～ＰＥＧ６０００をそれぞれＰＶＡ ＩＩ溶液に溶解して、対照実験を行った。
実施例１の基質のタイプでの変換及び安定性試験：
０．１ｇのケトンマトリックス１を０．３５ｍＬのメタノールに溶解して、アミノ供与体として３．０モル当量のイソプロピルアミン塩酸塩を加え、反応系に５ｍｇのＰＬＰを加え、次に０．３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ ７．０で希釈して対象反応系を形成させた。約６平方センチメートルの比表面積を有し６ｍｇのＴＡ－Ｃｖ ＣＬＥＡを包埋した実施例２の各ＰＶＡ膜固定化酵素を切り取って触媒とし、ＰＬＰを添加しない状態で対照反応を行った。３０℃で４時間反応させた後、ＨＰＬＣ法で転化率を検出し、１回の反応は２０時間で、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、試験結果を図１に示す。
ＰＶＡ膜によるアミノ基転移酵素ＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡの包埋固定：
ＰＶＡ ＩＩ溶液の調製：１２％～１５％（ｗ／ｖ）ＰＶＡ水溶液。
ＰＶＡ膜による包埋であった。３０ｍＬのＰＶＡ溶液に３ｇのＣＬＥＡ湿潤粒子、及び５０ｍｇのＰＬＰを加え、均一に撹拌して混合系を形成させ、３Ｄ多孔質シリカゲルテンプレートに注ぎ、各テンプレートのウェルは円形であり、容積は約０．１５～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約３～５平方センチメートルであり、３７℃で乾燥して、膜包埋酵素を得た。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ ７．０緩衝液に一晩浸漬して、緩衝液から膜包埋酵素を取り出し、次に０．１Ｍ ＰＢ ７．０緩衝液で当該膜包埋酵素を２回洗浄して、実施例２のＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
ＣＬＥＡを添加する前に、一定の量のＰＥＧ４００～ＰＥＧ６０００をそれぞれＰＶＡ ＩＩ溶液に溶解して、対照実験を行った。
実施例１の基質のタイプでの変換及び安定性試験：
０．１ｇのケトンマトリックス１を０．３５ｍＬのメタノールに溶解して、アミノ供与体として３．０モル当量のイソプロピルアミン塩酸塩を加え、反応系に５ｍｇのＰＬＰを加え、次に０．３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ ７．０で希釈して対象反応系を形成させた。約６平方センチメートルの比表面積を有し６ｍｇのＴＡ－Ｃｖ ＣＬＥＡを包埋した実施例２の各ＰＶＡ膜固定化酵素を切り取って触媒とし、ＰＬＰを添加しない状態で対照反応を行った。３０℃で４時間反応させた後、ＨＰＬＣ法で転化率を検出し、１回の反応は２０時間で、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、試験結果を図１に示す。
図１から分かるように、実施例２のＰＶＡ膜固定化酵素は活性と安定性が非常に優れており、１４サイクルの使用後に活性が低下しなかった。ＰＬＰを添加しなかった時には活性がやや低いが、安定性の方がＰＬＰを添加した時の安定性と同様に優れており、また図１から分かるように、ＰＥＧ４００又はＰＥＧ６０００を添加すると反応速度を高めることができる。
さらに、ＰＥＧの分子量及び混合系中のＰＥＧの濃度の酵素活性及び安定性に対する影響を検討し、結果を表５に示す。
（実施例３）
ＰＶＡ－有機溶媒膜によるＴＡ－ＣＶ湿細胞遊離酵素又はＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡの包埋固定：
７．０ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）ＰＶＡ溶液と、５ｍＬのＴＡ－ＣＶ遊離酵素溶液（５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰを含有する）又は１ｇのＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡを混合し、３０分間撹拌して混合系を形成させ、混合系をガラス製又は耐高温プレートに注いで、室温で３時間静置し、次に１５ｍＬの有機溶媒アセトニトリルを軽やかに３Ｄ多孔質シリカゲルテンプレートに注ぎ、各テンプレートのウェルは円形であり、容積は約０．１５～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約３～５平方センチメートルであり、３７℃で乾燥して、膜包埋酵素を形成させた。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ ７．０＋０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液に２～３時間浸漬して、膜包埋酵素を緩衝液から取り出し、次に０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．０）で当該膜包埋酵素を３回洗浄して、実施例３の２種のＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
実施例１の基質のタイプでの変換及び安定性試験：
０．１ｇのケトンマトリックス１を０．３５ｍＬのメタノールに溶解して、アミノ供与体として３．０モル当量のイソプロピルアミンを加え、反応系に５ｍｇのＰＬＰを加え、次に０．３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ ７．０で希釈して対象反応系を形成させた。約６平方センチメートルの比表面積を有しＴＡ－ＣＶ湿細胞又はＣＬＥＡを包埋して作製したＰＶＡ膜固定化酵素を切り取って触媒とした。３０℃で２０時間反応させた後、ＨＰＬＣ法で転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、試験結果を表６及び図２に示す。
ＰＶＡ－有機溶媒膜によるＴＡ－ＣＶ湿細胞遊離酵素又はＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡの包埋固定：
７．０ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）ＰＶＡ溶液と、５ｍＬのＴＡ－ＣＶ遊離酵素溶液（５ｍｇ／ｍＬのＰＬＰを含有する）又は１ｇのＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡを混合し、３０分間撹拌して混合系を形成させ、混合系をガラス製又は耐高温プレートに注いで、室温で３時間静置し、次に１５ｍＬの有機溶媒アセトニトリルを軽やかに３Ｄ多孔質シリカゲルテンプレートに注ぎ、各テンプレートのウェルは円形であり、容積は約０．１５～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約３～５平方センチメートルであり、３７℃で乾燥して、膜包埋酵素を形成させた。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ ７．０＋０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液に２～３時間浸漬して、膜包埋酵素を緩衝液から取り出し、次に０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．０）で当該膜包埋酵素を３回洗浄して、実施例３の２種のＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
実施例１の基質のタイプでの変換及び安定性試験：
０．１ｇのケトンマトリックス１を０．３５ｍＬのメタノールに溶解して、アミノ供与体として３．０モル当量のイソプロピルアミンを加え、反応系に５ｍｇのＰＬＰを加え、次に０．３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ ７．０で希釈して対象反応系を形成させた。約６平方センチメートルの比表面積を有しＴＡ－ＣＶ湿細胞又はＣＬＥＡを包埋して作製したＰＶＡ膜固定化酵素を切り取って触媒とした。３０℃で２０時間反応させた後、ＨＰＬＣ法で転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、試験結果を表６及び図２に示す。
２０時間の反応後に転化率は依然として９８％に達しており、且つ１０サイクルの使用後に安定しており活性を失わなかった。
（実施例４）
ＰＶＡ－有機溶媒でのＴＡ－ＣＶ包埋による大比表面積の固定化ＴＡ－ＣＶの製造：
５．０ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）ＰＶＡ溶液と、５ｍＬのＴＡ－ＣＶ遊離酵素溶液（酵素濃度は０．１ｇ／ｍＬであり、５ｍｇ／ｍＬ ＰＬＰを含有している）を混合し、２０分間撹拌して混合系を形成させ、気泡を抜き出して、０．１ｍＬの混合系を３Ｄ多孔質シリカゲルテンプレートに滴加して、各テンプレートのウェルは円形又は方形であり、容積は約０．１５～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約３～５平方センチメートルであった。室温で３時間静置し、次に０．０６ｍＬの有機溶媒アセトン又はアセトニトリルを軽やかにウェルに滴加して、３７℃で乾燥して、各ウェルにおいて中空のブロック状の成膜包埋酵素を形成させた。これらの中空のブロック状の成膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ ７．０＋０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液に２～３時間浸漬した。次に緩衝液を除去して、さらに０．１Ｍ ＰＢ ７．０で中空のブロック状の成膜包埋酵素を３回洗浄して実施例４の各ＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
成膜包埋酵素の一部に対するグルタルアルデヒドでのさらなる改質であった。０．１Ｍ ＰＢ ７．０で成膜包埋酵素を再懸濁して、グルタルアルデヒドを滴加し、１００ｍＬの懸濁液当たり１～２ｇのグルタルアルデヒドを滴加し、室温で穏やかに２時間撹拌して、緩衝液を除去し、０．１Ｍ ＰＢ ７．０でグルタルアルデヒド改質後の中空のブロック状の成膜包埋酵素を３回洗浄して、グルタルアルデヒド改質ＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
実施例１の基質のタイプでの反応活性及び安定性試験：
０．１ｇのケトンマトリックスを０．３５ｍＬのメタノールに溶解して、アミノ供与体として３．０モル当量のイソプロピルアミン塩酸塩を加え、反応系に５ｍｇの補因子ＰＬＰを加え、次に０．３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ ７．０で希釈して対象反応系を形成させた。約６平方センチメートルの比表面積を有しＴＡ－ＣＶ遊離酵素（アセトン乾燥）を包埋したＰＶＡ膜固定化酵素、約６平方センチメートルの比表面積を有しＴＡ－ＣＶ遊離酵素（アセトン乾燥且つグルタルアルデヒド改質）を包埋したＰＶＡ膜固定化酵素、約６平方センチメートルの比表面積を有しＴＡ－ＣＶ遊離酵素（アセトニトリル乾燥）を包埋したＰＶＡ膜固定化酵素、約６平方センチメートルの比表面積を有しＴＡ－ＣＶ遊離酵素（アセトニトリル乾燥且つグルタルアルデヒド改質）を包埋したＰＶＡ膜固定化酵素を切り取って触媒とした。３０℃で２０時間反応させた後に１０サイクル繰り返し、ＨＰＬＣ法で反応２０時間の転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、試験結果を表７に示す。
ＰＶＡ－有機溶媒でのＴＡ－ＣＶ包埋による大比表面積の固定化ＴＡ－ＣＶの製造：
５．０ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）ＰＶＡ溶液と、５ｍＬのＴＡ－ＣＶ遊離酵素溶液（酵素濃度は０．１ｇ／ｍＬであり、５ｍｇ／ｍＬ ＰＬＰを含有している）を混合し、２０分間撹拌して混合系を形成させ、気泡を抜き出して、０．１ｍＬの混合系を３Ｄ多孔質シリカゲルテンプレートに滴加して、各テンプレートのウェルは円形又は方形であり、容積は約０．１５～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約３～５平方センチメートルであった。室温で３時間静置し、次に０．０６ｍＬの有機溶媒アセトン又はアセトニトリルを軽やかにウェルに滴加して、３７℃で乾燥して、各ウェルにおいて中空のブロック状の成膜包埋酵素を形成させた。これらの中空のブロック状の成膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ ７．０＋０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液に２～３時間浸漬した。次に緩衝液を除去して、さらに０．１Ｍ ＰＢ ７．０で中空のブロック状の成膜包埋酵素を３回洗浄して実施例４の各ＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
成膜包埋酵素の一部に対するグルタルアルデヒドでのさらなる改質であった。０．１Ｍ ＰＢ ７．０で成膜包埋酵素を再懸濁して、グルタルアルデヒドを滴加し、１００ｍＬの懸濁液当たり１～２ｇのグルタルアルデヒドを滴加し、室温で穏やかに２時間撹拌して、緩衝液を除去し、０．１Ｍ ＰＢ ７．０でグルタルアルデヒド改質後の中空のブロック状の成膜包埋酵素を３回洗浄して、グルタルアルデヒド改質ＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
実施例１の基質のタイプでの反応活性及び安定性試験：
０．１ｇのケトンマトリックスを０．３５ｍＬのメタノールに溶解して、アミノ供与体として３．０モル当量のイソプロピルアミン塩酸塩を加え、反応系に５ｍｇの補因子ＰＬＰを加え、次に０．３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ ７．０で希釈して対象反応系を形成させた。約６平方センチメートルの比表面積を有しＴＡ－ＣＶ遊離酵素（アセトン乾燥）を包埋したＰＶＡ膜固定化酵素、約６平方センチメートルの比表面積を有しＴＡ－ＣＶ遊離酵素（アセトン乾燥且つグルタルアルデヒド改質）を包埋したＰＶＡ膜固定化酵素、約６平方センチメートルの比表面積を有しＴＡ－ＣＶ遊離酵素（アセトニトリル乾燥）を包埋したＰＶＡ膜固定化酵素、約６平方センチメートルの比表面積を有しＴＡ－ＣＶ遊離酵素（アセトニトリル乾燥且つグルタルアルデヒド改質）を包埋したＰＶＡ膜固定化酵素を切り取って触媒とした。３０℃で２０時間反応させた後に１０サイクル繰り返し、ＨＰＬＣ法で反応２０時間の転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、試験結果を表７に示す。
さらに、脱水剤とＰＶＡ－酵素混合系の比率の酵素活性及び安定性に対する影響を検討し、結果を表８に示す。
表７のデータから分かるように、実施例４のＰＶＡ膜固定化酵素を触媒とて使用した時に、１０サイクル後に活性が低下しなかった。ＧＡ改質の場合には、酵素活性がやや低いが、安定性の方がＧＡ改質なしの時の安定性と同様に優れていた。
（実施例５）
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるＴＡ－ＣＶ遊離酵素の包埋固定：
ＰＶＡ溶液：水において１２％（ｗ／ｖ）溶液を調製した。
補因子－ポリマー溶液（ＣＦＰ溶液）：２％ｗ／ｖ ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）（３ＫＤａ～７０ＫＤａ）を溶解して、５ｍｇ／ｍＬで補因子（ＰＬＰ）を加え、室温で０．５～３時間混合した。
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるＴＡ－ＣＶ遊離酵素の包埋固定：
ＰＶＡ溶液：水において１２％（ｗ／ｖ）溶液を調製した。
補因子－ポリマー溶液（ＣＦＰ溶液）：２％ｗ／ｖ ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）（３ＫＤａ～７０ＫＤａ）を溶解して、５ｍｇ／ｍＬで補因子（ＰＬＰ）を加え、室温で０．５～３時間混合した。
３５ｍＬのＰＶＡ溶液と５ｍＬのＣＦＰ溶液を３０分間充分に混合し、次に５ｍＬの酵素溶液（酵素濃度０．１ｇ／ｍＬ）及び３～５ｍｇの補因子ＰＬＰを加え、室温で３０分間混合して混合系を形成させた。次に混合系を３Ｄ的に構造された多孔質シリカゲルテンプレートに注ぎ、３７℃で乾燥して、膜包埋酵素を得、各テンプレートのウェルは円形又は方形であり、容積は約０．１５～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約３～５平方センチメートルであった。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ ７．０緩衝液に一晩浸漬した。緩衝液を除去した後、０．１Ｍ ＰＢ ７．０で膜包埋酵素を２回洗浄して実施例５のＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
実施例１の基質のタイプでの活性及び安定性試験：
０．１ｇのケトンマトリックス１を０．３５ｍＬのメタノールに溶解して、アミノ供与体として３．０モル当量のイソプロピルアミンを加え、反応系に５ｍｇのＰＬＰを加え、次に０．３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ ７．０で希釈して対象反応系を形成させた。約３～４平方センチメートルの比表面積を有し３ｍｇのＴＡ－ＣＶ遊離酵素を包埋した実施例４のＰＶＡ膜固定化酵素を切り取って触媒とし、ＰＬＰを添加しない状態で対照反応を行った。３０℃で２０時間反応させた後に１４サイクル繰り返し、ＨＰＬＣ法で反応４時間の転化率を測定し、試験結果を図３に示す。
実施例１の基質のタイプでの活性及び安定性試験：
０．１ｇのケトンマトリックス１を０．３５ｍＬのメタノールに溶解して、アミノ供与体として３．０モル当量のイソプロピルアミンを加え、反応系に５ｍｇのＰＬＰを加え、次に０．３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ ７．０で希釈して対象反応系を形成させた。約３～４平方センチメートルの比表面積を有し３ｍｇのＴＡ－ＣＶ遊離酵素を包埋した実施例４のＰＶＡ膜固定化酵素を切り取って触媒とし、ＰＬＰを添加しない状態で対照反応を行った。３０℃で２０時間反応させた後に１４サイクル繰り返し、ＨＰＬＣ法で反応４時間の転化率を測定し、試験結果を図３に示す。
図３から分かるように、形成させたＰＶＡ膜固定化酵素は活性と安定性が非常に優れており、１４サイクルの使用後に活性が低下しなかった。ＰＬＰを添加しなかった時には活性がやや低いが、安定性の方がＰＬＰを添加した時の安定性と同様に優れていた。
さらに、ＰＥＩの分子量及び混合系中のＰＥＩの濃度の酵素活性及び安定性に対する影響を検討し、結果を表９に示す。
さらに、ＰＥＩの分子量及び混合系中のＰＥＩの濃度の酵素活性及び安定性に対する影響を検討し、結果を表９に示す。
（実施例６）
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡの包埋固定：
ＰＶＡ溶液：水において１２％ｗ／ｖ溶液を調製した。
ＣＦＰ溶液：水において２％ｗ／ｖ ＰＥＩ（３ＫＤａ～７０ＫＤａ）溶液を調製し、５ｍｇ／ｍＬで補因子（ＰＬＰ）を加え、室温で０．５～３時間混合した。
３ｇのＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡを１０ｍＬのＣＦＰ溶液に懸濁し、３０ｍＬのＰＶＡ溶液と充分に混合して混合系を形成させた。次に混合系を多孔質シリカゲルテンプレートに注いで、３７℃で乾燥して膜包埋酵素を形成させ、各テンプレートのウェルは円形又は方形であり、容積は約０．１５～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約３～５平方センチメートルであった。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ ７．０緩衝液に一晩浸漬した。膜包埋酵素を緩衝液から取り出し、次に０．１Ｍ ＰＢ ７．０で２回洗浄して、実施例６のＰＶＡ膜包埋固定化酵素を得た。
実施例１の基質のタイプでの活性及び安定性試験：
０．１ｇのケトンマトリックス１を０．３５ｍＬのメタノールに溶解して、アミノ供与体として３．０モル当量のイソプロピルアミンを加え、反応系に５ｍｇのＰＬＰを加え、次に０．３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ ７．０で希釈して対象反応系を形成させた。６ｍｇのＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡを包埋した比表面積が約５ｃｍ２である実施例６のＰＶＡ膜包埋固定化酵素を触媒として、ＰＬＰを添加しない状態で対照反応を行った。３０℃で２０時間反応させた後に１４サイクル繰り返し、ＨＰＬＣ法で転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、試験結果を図４に示す。
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡの包埋固定：
ＰＶＡ溶液：水において１２％ｗ／ｖ溶液を調製した。
ＣＦＰ溶液：水において２％ｗ／ｖ ＰＥＩ（３ＫＤａ～７０ＫＤａ）溶液を調製し、５ｍｇ／ｍＬで補因子（ＰＬＰ）を加え、室温で０．５～３時間混合した。
３ｇのＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡを１０ｍＬのＣＦＰ溶液に懸濁し、３０ｍＬのＰＶＡ溶液と充分に混合して混合系を形成させた。次に混合系を多孔質シリカゲルテンプレートに注いで、３７℃で乾燥して膜包埋酵素を形成させ、各テンプレートのウェルは円形又は方形であり、容積は約０．１５～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約３～５平方センチメートルであった。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ ７．０緩衝液に一晩浸漬した。膜包埋酵素を緩衝液から取り出し、次に０．１Ｍ ＰＢ ７．０で２回洗浄して、実施例６のＰＶＡ膜包埋固定化酵素を得た。
実施例１の基質のタイプでの活性及び安定性試験：
０．１ｇのケトンマトリックス１を０．３５ｍＬのメタノールに溶解して、アミノ供与体として３．０モル当量のイソプロピルアミンを加え、反応系に５ｍｇのＰＬＰを加え、次に０．３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ ７．０で希釈して対象反応系を形成させた。６ｍｇのＴＡ－ＣＶ ＣＬＥＡを包埋した比表面積が約５ｃｍ２である実施例６のＰＶＡ膜包埋固定化酵素を触媒として、ＰＬＰを添加しない状態で対照反応を行った。３０℃で２０時間反応させた後に１４サイクル繰り返し、ＨＰＬＣ法で転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、試験結果を図４に示す。
図４から分かるように、ＰＶＡ膜包埋固定化酵素の活性と安定性は非常に優れており、１４サイクルの使用後に活性が低下しなかった。ＰＬＰを添加しなかった時には活性がやや低いが、安定性の方がＰＬＰを添加した時の安定性と同様に優れていた。
（実施例７）
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるＴＡ－Ａｃ遊離酵素の包埋固定：
ＰＶＡ溶液：水において１２％ｗ／ｖ溶液を調製した。
ＣＦＰ溶液：水において２％ｗ／ｖ ＰＥＩ（３ＫＤａ～７０ＫＤａ）溶液を調製し、５ｍｇ／ｍＬで補因子（ＰＬＰ）を加え、室温で０．５～３時間混合した。
３５ｍＬのＰＶＡ溶液と５ｍＬのＣＦＰ溶液を３０分間充分に混合し、次に５ｍＬのＴＡ－Ａｃ酵素溶液（酵素濃度０．１）及び３～５ｍｇの補因子ＰＬＰを加え、室温で３０分間混合して、混合系を得た。次に混合系を３Ｄ多孔質シリカゲルテンプレートに注ぎ、各テンプレートのウェルは円形又は方形であり、容積は約０．１５～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約３～５平方センチメートルであり、３７℃で乾燥して、膜包埋酵素を得た。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ ７．０に一晩浸漬した。膜包埋酵素を緩衝液から取り出し、次に０．１Ｍ ＰＢ ７．０で２回洗浄して、実施例７のＰＶＡ膜包埋固定化酵素を得た。
実施例１の基質のタイプでの活性及び安定性試験：
具体的には、ケトンマトリックス２（直前式参照）で、実施例１で使用したケトンマトリックス１を置き換えた。
水性緩衝系における試験であった。０．１ｇのケトンマトリックス２を１ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ ７．０緩衝液に懸濁し、アミノ供与体として３．０モル当量のイソプロピルアミン塩酸塩を加え、反応系に５ｍｇのＰＬＰを加え、１０ｍｇのＴＡ－Ａｃ遊離酵素を含む実施例７のＰＶＡ膜包埋固定化酵素を触媒とした。３０℃で２０時間反応させた後に５サイクル繰り返し、ＨＰＬＣ法で転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、試験結果を表１０に示す。
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるＴＡ－Ａｃ遊離酵素の包埋固定：
ＰＶＡ溶液：水において１２％ｗ／ｖ溶液を調製した。
ＣＦＰ溶液：水において２％ｗ／ｖ ＰＥＩ（３ＫＤａ～７０ＫＤａ）溶液を調製し、５ｍｇ／ｍＬで補因子（ＰＬＰ）を加え、室温で０．５～３時間混合した。
３５ｍＬのＰＶＡ溶液と５ｍＬのＣＦＰ溶液を３０分間充分に混合し、次に５ｍＬのＴＡ－Ａｃ酵素溶液（酵素濃度０．１）及び３～５ｍｇの補因子ＰＬＰを加え、室温で３０分間混合して、混合系を得た。次に混合系を３Ｄ多孔質シリカゲルテンプレートに注ぎ、各テンプレートのウェルは円形又は方形であり、容積は約０．１５～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約３～５平方センチメートルであり、３７℃で乾燥して、膜包埋酵素を得た。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ ７．０に一晩浸漬した。膜包埋酵素を緩衝液から取り出し、次に０．１Ｍ ＰＢ ７．０で２回洗浄して、実施例７のＰＶＡ膜包埋固定化酵素を得た。
実施例１の基質のタイプでの活性及び安定性試験：
具体的には、ケトンマトリックス２（直前式参照）で、実施例１で使用したケトンマトリックス１を置き換えた。
水性緩衝系における試験であった。０．１ｇのケトンマトリックス２を１ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ ７．０緩衝液に懸濁し、アミノ供与体として３．０モル当量のイソプロピルアミン塩酸塩を加え、反応系に５ｍｇのＰＬＰを加え、１０ｍｇのＴＡ－Ａｃ遊離酵素を含む実施例７のＰＶＡ膜包埋固定化酵素を触媒とした。３０℃で２０時間反応させた後に５サイクル繰り返し、ＨＰＬＣ法で転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、試験結果を表１０に示す。
二相性系における試験であった。０．１ｇのケトンマトリックス２を非水相としての１ｍＬのＭＴＢＥに溶解し、水相として１ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ ７．０を加え、アミノ供与体として３．０モル当量のイソプロピルアミンを加え、反応系に５ｍｇのＰＬＰを加えて対象反応系を形成させ、１０ｍｇのＴＡ－Ａｃ遊離酵素を含む実施例７のＰＶＡ膜固定化酵素を触媒とした。３０℃で２０時間反応させた後に５サイクル繰り返し、ＨＰＬＣ法で転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、試験結果を表１０に示す。
表１０のデータから分かるように、実施例７のＰＶＡ膜固定化酵素は活性と安定性が非常に優れており、５サイクルの使用後に活性が低下しなかった。
ＰＶＡの分子量、ＰＶＡの濃度、酵素とＰＶＡ溶液の比率の酵素の活性及び安定性に対する影響を検討し、結果を表１１に示す。
（実施例８）
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるケト還元酵素の包埋固定：
ＰＶＡ溶液：水において１２％（ｗ／ｖ）溶液を調製した。
ＣＦＰ溶液：水に２％（ｗ／ｖ）ＰＥＩ（３ＫＤａ～７０ＫＤａ）を溶解して調製し、所望により５ｍｇ／ｍＬで補因子（ＮＡＤ＋又はＰＬＰ）を加え、室温で０．５～３時間混合した。
３５ｍＬのＰＶＡ溶液と５ｍＬのＣＦＰ溶液を３０分間充分に混合し、次に５ｍＬのＫＲＥＤ－Ａｃ又はＫＲＥＤ－Ｃｍ酵素溶液（酵素濃度０．１ｇ／ｍＬ）及び４ｍｇの補因子ＮＡＤ＋を加え、室温で３０分間混合して混合系を形成させた。次に混合系を３Ｄシロキサンテンプレートに注ぎ、各テンプレートのウェルは円形又は方形であり、容積は約０．１５～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約３～５平方センチメートルであった。３７℃で乾燥して膜包埋酵素を形成させた。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ ７．０に一晩浸漬した。膜包埋酵素を緩衝液から取り出し、次に０．１Ｍ ＰＢ ７．０で２回洗浄して、実施例８のＮＡＤ＋含有ＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
ＰＬＰで補因子ＮＡＤ＋を置き換えて前記工程を繰り返して、実施例８のＰＬＰ含有ＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
活性及び安定性試験：
転化研究で採用するモデル反応：
前記反応式でＲ１、Ｒ２はそれぞれ独立してＨ、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換シクロアルキル基、置換又は非置換アラルキル基、置換又は非置換ヘテロシクリル基、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基から選ばれてもよいし、又はＲ１とＲ２が接続して環をなしてもよい。
０．１ｇのケトンマトリックス３又は４を０．５ｍＬのイソプロパノールに溶解して、反応系に０．５ｍＬの補因子ＮＡＤ＋を５ｍｇ含有する０．１Ｍ ＰＢ ７．０を加えて対象反応系を形成させ、対象反応系に３０ｍｇのケト還元酵素ＫＲＥＤ－Ａｃ（ケトンマトリックス３で活性確認）又はケト還元酵素ＫＲＥＤ－Ｃｍ（ケトンマトリックス４で活性確認）を包埋した実施例８のＰＶＡ膜包埋固定化酵素を入れて触媒とした。３０℃で２０時間反応させた後に１１サイクル繰り返し、ＧＣ法で転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、結果を図５、図６に示し、図５に対応する基質はケトンマトリックス３であり、図６に対応する基質はケトンマトリックス４であった。
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるケト還元酵素の包埋固定：
ＰＶＡ溶液：水において１２％（ｗ／ｖ）溶液を調製した。
ＣＦＰ溶液：水に２％（ｗ／ｖ）ＰＥＩ（３ＫＤａ～７０ＫＤａ）を溶解して調製し、所望により５ｍｇ／ｍＬで補因子（ＮＡＤ＋又はＰＬＰ）を加え、室温で０．５～３時間混合した。
３５ｍＬのＰＶＡ溶液と５ｍＬのＣＦＰ溶液を３０分間充分に混合し、次に５ｍＬのＫＲＥＤ－Ａｃ又はＫＲＥＤ－Ｃｍ酵素溶液（酵素濃度０．１ｇ／ｍＬ）及び４ｍｇの補因子ＮＡＤ＋を加え、室温で３０分間混合して混合系を形成させた。次に混合系を３Ｄシロキサンテンプレートに注ぎ、各テンプレートのウェルは円形又は方形であり、容積は約０．１５～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約３～５平方センチメートルであった。３７℃で乾燥して膜包埋酵素を形成させた。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ ７．０に一晩浸漬した。膜包埋酵素を緩衝液から取り出し、次に０．１Ｍ ＰＢ ７．０で２回洗浄して、実施例８のＮＡＤ＋含有ＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
ＰＬＰで補因子ＮＡＤ＋を置き換えて前記工程を繰り返して、実施例８のＰＬＰ含有ＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
活性及び安定性試験：
転化研究で採用するモデル反応：
前記反応式でＲ１、Ｒ２はそれぞれ独立してＨ、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換シクロアルキル基、置換又は非置換アラルキル基、置換又は非置換ヘテロシクリル基、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基から選ばれてもよいし、又はＲ１とＲ２が接続して環をなしてもよい。
０．１ｇのケトンマトリックス３又は４を０．５ｍＬのイソプロパノールに溶解して、反応系に０．５ｍＬの補因子ＮＡＤ＋を５ｍｇ含有する０．１Ｍ ＰＢ ７．０を加えて対象反応系を形成させ、対象反応系に３０ｍｇのケト還元酵素ＫＲＥＤ－Ａｃ（ケトンマトリックス３で活性確認）又はケト還元酵素ＫＲＥＤ－Ｃｍ（ケトンマトリックス４で活性確認）を包埋した実施例８のＰＶＡ膜包埋固定化酵素を入れて触媒とした。３０℃で２０時間反応させた後に１１サイクル繰り返し、ＧＣ法で転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、結果を図５、図６に示し、図５に対応する基質はケトンマトリックス３であり、図６に対応する基質はケトンマトリックス４であった。
図５から分かるように、実施例８のＰＶＡ膜固定化酵素ＫＲＥＤ－Ａｃはケトンマトリックス３に対して活性と安定性が非常に優れており、転化率は９９％に達しており、１１サイクル繰り返し使用後に活性の損失がなかった。ＰＬＰでＣＦＰ溶液を調製した場合に、活性はＮＡＤ＋をはるかに上回った。
図６から分かるように、実施例８で得たＰＶＡ膜包埋固定化酵素ＫＲＥＤ－Ｃｍは活性と安定性が非常に優れており、転化率は９９％に達しており、１０サイクル繰り返し使用後に活性の損失がなかった。ＰＬＰでＣＦＰ溶液を調製した場合に、活性はＮＡＤ＋をはるかに上回った。
補因子の酵素系中の濃度について検討し、結果を表１２に示す。
（実施例９）
以下、ＰＶＡ膜包埋固定化アミノ基転移酵素ＴＡ－Ｂｔとその補酵素ＬＤＨ、ＦＤＨの共架橋酵素、アミノ基転移酵素ＴＡ－Ｂｔとその補酵素ＬＤＨ、ＦＤＨの共架橋酵素を、共架橋酵素と略称する。
ＰＶＡ Ｉ溶液の調製であった。５０ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）ＰＶＡ（２００ＫＤａ）及び３０ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）酢酸、５０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｗ／ｖ）硫酸を混合した。
ＰＶＡ膜によるカプセル化であった。ＰＶＡ Ｉ溶液のｐＨを４～６．５に調整し、溶液から２０ｍＬ取り出して、共架橋酵素懸濁液と混合し（共架橋酵素懸濁液の組成としては、０．５ｇのＴＡ－ＢｔとＬＤＨ及びＦＤＨの共架橋酵素が２ｍＬの０．１Ｍ リン酸塩緩衝液（ＰＢ、ｐＨ ７．０）に含まれており、且つ１ｍＬは２ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサールリン酸）を含む）２０分間撹拌して、混合系を形成させた。それを３Ｄ多孔質シリカゲルテンプレートに注ぎ、各テンプレートのウェルは正方形であり、容積は約０．１～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約２～５平方センチメートルであり、３７℃で乾燥して、膜包埋酵素を得た。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．０）＋０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液に３時間浸漬して、膜包埋酵素を緩衝液から取り出し、次に０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．０）で当該膜包埋酵素を３回洗浄して、実施例１のＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
活性及び安定性試験：
転化研究で採用する反応モデル：
前記反応式でＲは、Ｈ、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換シクロアルキル基、置換又は非置換アラルキル基、置換又は非置換ヘテロシクリル基、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基、ハロゲンから選ばれてもよい。
５ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、続いて１００ｍｇの前記基質５、８０ｍｇのギ酸アンモニウム及び５ｍｇのＰＬＰを加えて、ｐＨを７．５～８．０に調整し、次に５ｍｇのＮＡＤ＋及び１０ｍｇの膜固定化酵素（５０～８０％の水を含有する湿潤物）を加えた。３０℃で２０時間反応させて、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。具体的には、ＴＡ－Ｂｔと補酵素の共固定化酵素中の主酵素と補酵素の比率の酵素活性及び安定性に対する影響を検討し、結果を表１３に示す。
以下、ＰＶＡ膜包埋固定化アミノ基転移酵素ＴＡ－Ｂｔとその補酵素ＬＤＨ、ＦＤＨの共架橋酵素、アミノ基転移酵素ＴＡ－Ｂｔとその補酵素ＬＤＨ、ＦＤＨの共架橋酵素を、共架橋酵素と略称する。
ＰＶＡ Ｉ溶液の調製であった。５０ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）ＰＶＡ（２００ＫＤａ）及び３０ｍＬの１０％（ｗ／ｖ）酢酸、５０％（ｖ／ｖ）メタノール、１０％（ｗ／ｖ）硫酸を混合した。
ＰＶＡ膜によるカプセル化であった。ＰＶＡ Ｉ溶液のｐＨを４～６．５に調整し、溶液から２０ｍＬ取り出して、共架橋酵素懸濁液と混合し（共架橋酵素懸濁液の組成としては、０．５ｇのＴＡ－ＢｔとＬＤＨ及びＦＤＨの共架橋酵素が２ｍＬの０．１Ｍ リン酸塩緩衝液（ＰＢ、ｐＨ ７．０）に含まれており、且つ１ｍＬは２ｍｇのＰＬＰ（ピリドキサールリン酸）を含む）２０分間撹拌して、混合系を形成させた。それを３Ｄ多孔質シリカゲルテンプレートに注ぎ、各テンプレートのウェルは正方形であり、容積は約０．１～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約２～５平方センチメートルであり、３７℃で乾燥して、膜包埋酵素を得た。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．０）＋０．５Ｍ ＮａＣｌ緩衝液に３時間浸漬して、膜包埋酵素を緩衝液から取り出し、次に０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．０）で当該膜包埋酵素を３回洗浄して、実施例１のＰＶＡ膜固定化酵素を得た。
活性及び安定性試験：
転化研究で採用する反応モデル：
前記反応式でＲは、Ｈ、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換シクロアルキル基、置換又は非置換アラルキル基、置換又は非置換ヘテロシクリル基、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基、ハロゲンから選ばれてもよい。
５ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、続いて１００ｍｇの前記基質５、８０ｍｇのギ酸アンモニウム及び５ｍｇのＰＬＰを加えて、ｐＨを７．５～８．０に調整し、次に５ｍｇのＮＡＤ＋及び１０ｍｇの膜固定化酵素（５０～８０％の水を含有する湿潤物）を加えた。３０℃で２０時間反応させて、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。具体的には、ＴＡ－Ｂｔと補酵素の共固定化酵素中の主酵素と補酵素の比率の酵素活性及び安定性に対する影響を検討し、結果を表１３に示す。
（実施例１０）
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜での包埋によるＴＡ－Ｂｔと補酵素Ｄ－ＬＤＨ、ＦＤＨの共同固定化：
ＰＶＡ（２００ＫＤａ）溶液：水において１２％（ｗ／ｖ）溶液を調製した。
ＣＦＰ溶液：２％（ｗ／ｖ）ＰＥＩ（３ＫＤａ～７０ＫＤａ）の水溶液を調製し、５ｍｇ／ｍＬで補因子（ＰＬＰ）を加え、室温で０．５～３時間混合した。
３５ｍＬのＰＶＡ溶液と５ｍＬのＣＦＰ溶液を３０分間充分に混合し、次に５ｍＬのＴＡ－Ｂｔ酵素溶液（酵素濃度０．０８ｇ／ｍＬ）、０．０８ｇの補酵素Ｄ－ＬＤＨ、０．１ｇの補酵素ＦＤＨ及び４ｍｇの補因子ＮＡＤ＋を加え、室温で３０分間混合して、混合系を形成させた。次に混合系を３Ｄシロキサンテンプレートに注ぎ、各テンプレートのウェルは円形又は方形であり、容積は約０．１５～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約３～５平方センチメートルであった。３７℃で乾燥して膜包埋酵素を形成させた。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ ７．０に一晩浸漬した。膜包埋酵素を緩衝液から取り出し、次に０．１Ｍ ＰＢ ７．０で２回洗浄して、実施例１０のＰＬＰ及びＮＡＤ＋含有ＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を得た。
実施例９のモデルを用いた活性及び安定性試験：
５ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、続いて１００ｍｇの前記基質５、８０ｍｇのギ酸アンモニウム及び５ｍｇのＰＬＰを加えて、ｐＨを７．５～８．０に調整し、次にＮＡＤ＋を５ｍｇ、ＰＬＰ及びＮＡＤ＋を１０ｍｇ含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素（５０～８０％の水を含有する湿潤物）を加えた。３０℃で２０時間反応させて、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、ＰＬＰを添加しない状態で対照反応を行った。
３０℃で４時間反応させた後に９サイクル繰り返し、ＨＰＬＣ法で転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、試験結果を図７に示す。
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜での包埋によるＴＡ－Ｂｔと補酵素Ｄ－ＬＤＨ、ＦＤＨの共同固定化：
ＰＶＡ（２００ＫＤａ）溶液：水において１２％（ｗ／ｖ）溶液を調製した。
ＣＦＰ溶液：２％（ｗ／ｖ）ＰＥＩ（３ＫＤａ～７０ＫＤａ）の水溶液を調製し、５ｍｇ／ｍＬで補因子（ＰＬＰ）を加え、室温で０．５～３時間混合した。
３５ｍＬのＰＶＡ溶液と５ｍＬのＣＦＰ溶液を３０分間充分に混合し、次に５ｍＬのＴＡ－Ｂｔ酵素溶液（酵素濃度０．０８ｇ／ｍＬ）、０．０８ｇの補酵素Ｄ－ＬＤＨ、０．１ｇの補酵素ＦＤＨ及び４ｍｇの補因子ＮＡＤ＋を加え、室温で３０分間混合して、混合系を形成させた。次に混合系を３Ｄシロキサンテンプレートに注ぎ、各テンプレートのウェルは円形又は方形であり、容積は約０．１５～０．２立方センチメートルであり、ウェルの表面積は約３～５平方センチメートルであった。３７℃で乾燥して膜包埋酵素を形成させた。膜包埋酵素を０．１Ｍ ＰＢ ７．０に一晩浸漬した。膜包埋酵素を緩衝液から取り出し、次に０．１Ｍ ＰＢ ７．０で２回洗浄して、実施例１０のＰＬＰ及びＮＡＤ＋含有ＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を得た。
実施例９のモデルを用いた活性及び安定性試験：
５ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、続いて１００ｍｇの前記基質５、８０ｍｇのギ酸アンモニウム及び５ｍｇのＰＬＰを加えて、ｐＨを７．５～８．０に調整し、次にＮＡＤ＋を５ｍｇ、ＰＬＰ及びＮＡＤ＋を１０ｍｇ含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素（５０～８０％の水を含有する湿潤物）を加えた。３０℃で２０時間反応させて、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、ＰＬＰを添加しない状態で対照反応を行った。
３０℃で４時間反応させた後に９サイクル繰り返し、ＨＰＬＣ法で転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討し、試験結果を図７に示す。
図７から分かるように、得られたＰＶＡ膜固定化酵素は活性と安定性が非常に優れており、９サイクルの使用後に明らかな活性の損失がなく、且つ反応系にＰＬＰを加えなかった時にはＰＬＰを添加した時と活性及び安定性が同様に優れていた。
（実施例１１）
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼの固定化：
固定化方法は実施例１０と同じであり、ただしＰＶＡカプセル化した酵素は、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼＣＨＭＯ－Ｒｓ又はＣＨＭＯ－Ｂｐに変え、又はシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼＣＨＭＯとその補酵素のアルコール脱水素酵素ＡＤＨ－Ｔｂ又はグルコース脱水素酵素ＧＤＨの混合酵素であってもよく、具体的な酵素組成を表１４に示す。
活性及び安定性試験：
転化研究で採用する反応モデル：
前記反応式でＲはＨ、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換シクロアルキル基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換アラルキル基、置換又は非置換ヘテロシクリル基、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基から選ばれてもよいし、又はＲがそれに接続されたヘテロ環と縮合環系を形成させる。
次の基質６を利用した反応で、ＣＨＭＯのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、続いて５０ｍｇの基質６、１００ｍｇのグルコース及び５ｍｇのＮＡＤＰ＋、５０ｍｇのアルコール脱水素酵素ＡＤＨ－Ｔｂ、５ｍｇのグルコース脱水素酵素ＧＤＨを加え、次に２０ｍｇのシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で２０時間反応させて、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
次の反応条件で、ＣＨＭＯと補酵素ＧＤＨのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、続いて５０ｍｇの基質６、１００ｍｇのグルコース及び５ｍｇのＮＡＤＰ＋を加え、次に３０ｍｇのＣＨＭＯとＧＤＨの混合酵素の共固定化酵素を加えた。３０℃で２０時間反応させて、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
次の反応条件で、ＣＨＭＯと補酵素ＡＤＨ－ＴｂのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、続いて５０ｍｇの基質６、２００μＬのイソプロパノール及び５ｍｇのＮＡＤＰ＋を加え、次に３０ｍｇのＣＨＭＯとＡＤＨの混合酵素の共固定化酵素を加えた。３０℃で２０時間反応させて、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
試験結果を表１４に示す。
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼの固定化：
固定化方法は実施例１０と同じであり、ただしＰＶＡカプセル化した酵素は、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼＣＨＭＯ－Ｒｓ又はＣＨＭＯ－Ｂｐに変え、又はシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼＣＨＭＯとその補酵素のアルコール脱水素酵素ＡＤＨ－Ｔｂ又はグルコース脱水素酵素ＧＤＨの混合酵素であってもよく、具体的な酵素組成を表１４に示す。
活性及び安定性試験：
転化研究で採用する反応モデル：
前記反応式でＲはＨ、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換シクロアルキル基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換アラルキル基、置換又は非置換ヘテロシクリル基、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基から選ばれてもよいし、又はＲがそれに接続されたヘテロ環と縮合環系を形成させる。
次の基質６を利用した反応で、ＣＨＭＯのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、続いて５０ｍｇの基質６、１００ｍｇのグルコース及び５ｍｇのＮＡＤＰ＋、５０ｍｇのアルコール脱水素酵素ＡＤＨ－Ｔｂ、５ｍｇのグルコース脱水素酵素ＧＤＨを加え、次に２０ｍｇのシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼを含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で２０時間反応させて、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
次の反応条件で、ＣＨＭＯと補酵素ＧＤＨのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、続いて５０ｍｇの基質６、１００ｍｇのグルコース及び５ｍｇのＮＡＤＰ＋を加え、次に３０ｍｇのＣＨＭＯとＧＤＨの混合酵素の共固定化酵素を加えた。３０℃で２０時間反応させて、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
次の反応条件で、ＣＨＭＯと補酵素ＡＤＨ－ＴｂのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、続いて５０ｍｇの基質６、２００μＬのイソプロパノール及び５ｍｇのＮＡＤＰ＋を加え、次に３０ｍｇのＣＨＭＯとＡＤＨの混合酵素の共固定化酵素を加えた。３０℃で２０時間反応させて、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
試験結果を表１４に示す。
（実施例１２）
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるアルケン還元酵素の固定化：
固定化方法は実施例１０と同じであり、ただしＰＶＡカプセル化した酵素は、アルケン還元酵素ＥＲＥＤ－Ｓｃ又はＥＲＥＤ－Ｃｈｒに変え、アルケン還元酵素とその補酵素のグルコース脱水素酵素ＧＤＨ又はギ酸アンモニウム脱水素酵素ＦＤＨの混合酵素であってもよく、２種の酵素の重量比率は、ＥＲＥＤ：ＧＤＨ（又はＦＤＨ）＝５：１であった。
活性及び安定性試験：
転化研究で採用する反応モデル：
前記反応式でＲ１、Ｒ２はそれぞれ独立してＨ、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換シクロアルキル基、置換又は非置換アラルキル基、置換又は非置換ヘテロシクリル基、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基から選ばれてもよいし、又はＲ１とＲ２が環をなす。
次の基質７の反応で、ＥＲＥＤのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．０～８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、続いて１００ｍｇの基質７を加え、続いて２０ｍｇのＮＡＤ（Ｐ）＋、８０ｍｇのギ酸アンモニウム、５ｍｇのＦＤＨ、及び３０ｍｇのアルケン還元酵素を含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させて、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
次の基質７の反応で、ＥＲＥＤとＦＤＨのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．０～８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、続いて１００ｍｇの基質７を加え、続いて２０ｍｇのＮＡＤ（Ｐ）＋、８０ｍｇのギ酸アンモニウム、及び４０ｍｇのアルケン還元酵素とＦＤＨの混合酵素を含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させて、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
次の反応で、ＥＲＥＤとＧＤＨのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．０～８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、続いて１００ｍｇの基質７を加え、続いて２０ｍｇのＮＡＤ（Ｐ）＋、１２０ｍｇのグルコース、及び４０ｍｇのアルケン還元酵素とＧＤＨの混合酵素を含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させて、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。試験結果を表１５に示す。
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるアルケン還元酵素の固定化：
固定化方法は実施例１０と同じであり、ただしＰＶＡカプセル化した酵素は、アルケン還元酵素ＥＲＥＤ－Ｓｃ又はＥＲＥＤ－Ｃｈｒに変え、アルケン還元酵素とその補酵素のグルコース脱水素酵素ＧＤＨ又はギ酸アンモニウム脱水素酵素ＦＤＨの混合酵素であってもよく、２種の酵素の重量比率は、ＥＲＥＤ：ＧＤＨ（又はＦＤＨ）＝５：１であった。
活性及び安定性試験：
転化研究で採用する反応モデル：
前記反応式でＲ１、Ｒ２はそれぞれ独立してＨ、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換シクロアルキル基、置換又は非置換アラルキル基、置換又は非置換ヘテロシクリル基、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基から選ばれてもよいし、又はＲ１とＲ２が環をなす。
次の基質７の反応で、ＥＲＥＤのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．０～８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、続いて１００ｍｇの基質７を加え、続いて２０ｍｇのＮＡＤ（Ｐ）＋、８０ｍｇのギ酸アンモニウム、５ｍｇのＦＤＨ、及び３０ｍｇのアルケン還元酵素を含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させて、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
次の基質７の反応で、ＥＲＥＤとＦＤＨのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．０～８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、続いて１００ｍｇの基質７を加え、続いて２０ｍｇのＮＡＤ（Ｐ）＋、８０ｍｇのギ酸アンモニウム、及び４０ｍｇのアルケン還元酵素とＦＤＨの混合酵素を含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させて、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
次の反応で、ＥＲＥＤとＧＤＨのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ（ｐＨ ７．０～８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに入れ、続いて１００ｍｇの基質７を加え、続いて２０ｍｇのＮＡＤ（Ｐ）＋、１２０ｍｇのグルコース、及び４０ｍｇのアルケン還元酵素とＧＤＨの混合酵素を含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させて、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。試験結果を表１５に示す。
（実施例１３）
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるイミン還元酵素の固定化：
固定化方法は実施例１０と同じであり、ただしＰＶＡカプセル化した酵素は、イミン還元酵素ＩＲＥＤ－Ｓｔｒ又はＩＲＥＤ－Ｂｃに変え、アルケン還元酵素とその補酵素のグルコース脱水素酵素ＧＤＨ又はギ酸アンモニウム脱水素酵素ＦＤＨの混合酵素であってもよく、２種の酵素の比率は、ＥＲＥＤ：ＧＤＨ（又はＦＤＨ）＝４：１であった。
活性及び安定性試験：
転化研究で採用する反応モデル：
前記反応式でＲ１、Ｒ２はそれぞれ独立してＨ、置換又は非置換アルキル基、置換又は非置換シクロアルキル基、置換又は非置換アリール基、置換又は非置換アラルキル基、置換又は非置換ヘテロシクリル基、置換又は非置換ヘテロシクロアルキル基から選ばれてもよいし、又はＲ１とＲ２がそれに接続されたヘテロ環若しくは芳香環と縮合環系を形成させる。
次の基質８採用して次の方法で、ＩＲＥＤのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
２ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ ７．０～８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに加え、次に１００ｍｇの前記基質８、１０ｍｇのＮＡＤ（Ｐ）＋、６０ｍｇのギ酸アンモニウム、１０ｍｇのＦＤＨ、及び４０ｍｇのＩＲＥＤを含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させた後、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
基質８を採用して次の方法で、ＩＲＥＤとＦＤＨのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
２ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ ７．０～８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに加え、且つ１００ｍｇの前記基質８を加え、次に１０ｍｇのＮＡＤ（Ｐ）＋、６０ｍｇのギ酸アンモニウムを加え、次に５０ｍｇのＩＲＥＤとＦＤＨの混合酵素を含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させた後、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
次の方法で、ＩＲＥＤとＧＤＨのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ ７．０～８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに加え、続いて１００ｍｇの基質８を加え、さらに１０ｍｇのＮＡＤ（Ｐ）＋、１００ｍｇのグルコース、及び５０ｍｇのＩＲＥＤとＧＤＨの混合酵素を含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させた後、転化率試験を行った。試験結果を表１６に示す。
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるイミン還元酵素の固定化：
固定化方法は実施例１０と同じであり、ただしＰＶＡカプセル化した酵素は、イミン還元酵素ＩＲＥＤ－Ｓｔｒ又はＩＲＥＤ－Ｂｃに変え、アルケン還元酵素とその補酵素のグルコース脱水素酵素ＧＤＨ又はギ酸アンモニウム脱水素酵素ＦＤＨの混合酵素であってもよく、２種の酵素の比率は、ＥＲＥＤ：ＧＤＨ（又はＦＤＨ）＝４：１であった。
活性及び安定性試験：
転化研究で採用する反応モデル：
次の基質８採用して次の方法で、ＩＲＥＤのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
２ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ ７．０～８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに加え、次に１００ｍｇの前記基質８、１０ｍｇのＮＡＤ（Ｐ）＋、６０ｍｇのギ酸アンモニウム、１０ｍｇのＦＤＨ、及び４０ｍｇのＩＲＥＤを含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させた後、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
基質８を採用して次の方法で、ＩＲＥＤとＦＤＨのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
２ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ ７．０～８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに加え、且つ１００ｍｇの前記基質８を加え、次に１０ｍｇのＮＡＤ（Ｐ）＋、６０ｍｇのギ酸アンモニウムを加え、次に５０ｍｇのＩＲＥＤとＦＤＨの混合酵素を含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させた後、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
次の方法で、ＩＲＥＤとＧＤＨのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
３ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ ７．０～８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに加え、続いて１００ｍｇの基質８を加え、さらに１０ｍｇのＮＡＤ（Ｐ）＋、１００ｍｇのグルコース、及び５０ｍｇのＩＲＥＤとＧＤＨの混合酵素を含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させた後、転化率試験を行った。試験結果を表１６に示す。
（実施例１４）
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるニトリル加水分解酵素の固定化：
固定化方法は実施例１０と同じであり、ただしＰＶＡカプセル化した酵素は、ニトリル加水分解酵素ＮＩＴ－Ａｎ若しくはＮＩＴ－Ｎｃ酵素溶液（酵素濃度０．１ｇ／ｍＬ）又はＮＩＴ－Ａｎ若しくはＮＩＴ－Ｎｃ架橋酵素凝集体の懸濁液（０．５ｇ／ｍＬ）に変えた。
活性及び安定性試験：
転化研究で採用する反応モデル：
次の基質９採用して次の方法で、ニトリル加水分解酵素のＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
２ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ ７．０～８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに加え、且つ１００ｍｇの前記基質９を加え、次に２０ｍｇのＮＩＴを含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させた後、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
試験結果を表１７に示す。
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるニトリル加水分解酵素の固定化：
固定化方法は実施例１０と同じであり、ただしＰＶＡカプセル化した酵素は、ニトリル加水分解酵素ＮＩＴ－Ａｎ若しくはＮＩＴ－Ｎｃ酵素溶液（酵素濃度０．１ｇ／ｍＬ）又はＮＩＴ－Ａｎ若しくはＮＩＴ－Ｎｃ架橋酵素凝集体の懸濁液（０．５ｇ／ｍＬ）に変えた。
活性及び安定性試験：
転化研究で採用する反応モデル：
次の基質９採用して次の方法で、ニトリル加水分解酵素のＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
２ｍＬの０．１Ｍ ＰＢ緩衝液（ｐＨ ７．０～８．０）を１０ｍＬの反応フラスコに加え、且つ１００ｍｇの前記基質９を加え、次に２０ｍｇのＮＩＴを含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させた後、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
試験結果を表１７に示す。
（実施例１５）
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるアンモニア分解酵素の固定化：
固定化方法は実施例１０と同じであり、ただしＰＶＡカプセル化した酵素は、アンモニア分解酵素ＰＡＬ－Ａｎ又はＰＡＬ－Ｓｓに変えた。
活性及び安定性試験：
転化研究で採用する反応モデル：
次の基質１０を採用して次の方法で、アンモニア分解酵素ＰＡＬのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
８ｍＬの４Ｍ アミノギ酸アンモニウム水溶液（ｐＨ ９．０～９．５）を１０ｍＬの反応フラスコに加え、且つ１００ｍｇの前記基質１０を加え、次に４０ｍｇのＮＩＴを含有するＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させた後、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
試験結果を表１８に示す。
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるアンモニア分解酵素の固定化：
固定化方法は実施例１０と同じであり、ただしＰＶＡカプセル化した酵素は、アンモニア分解酵素ＰＡＬ－Ａｎ又はＰＡＬ－Ｓｓに変えた。
活性及び安定性試験：
転化研究で採用する反応モデル：
次の基質１０を採用して次の方法で、アンモニア分解酵素ＰＡＬのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
試験結果を表１８に示す。
（実施例１６）
ＰＶＡ－ＣＦＰ膜によるアミノ酸脱水素酵素の固定化：
固定化方法は実施例１０と同じであり、ただしＰＶＡカプセル化した酵素は、アミノ酸脱水素酵素ＡＡＤＨ－Ｂｃ又はＡＡＤＨ－Ｂｓに変え、又はアミノ酸脱水素酵素とその補酵素のグルコース脱水素酵素ＧＤＨ若しくはギ酸アンモニウム脱水素酵素ＦＤＨの混合酵素であってもよく、２種の酵素の比率は、ＡＡＤＨ：ＧＤＨ（又はＦＤＨ）＝４：１であった。
活性及び安定性試験：
転化研究で採用する反応モデル：
次の基質１１又は１２を採用して次の方法で、ＡＡＤＨのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性を検出した。
５ｍＬの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液（ｐＨ ８．０～９．０）を１０ｍＬの反応フラスコに加え、次に１００ｍｇの基質１１又は１２、１０８ｍｇの塩化アンモニウムを加えて、ｐＨを７．５～８．０に調整し、次に１０ｍｇのＮＡＤ＋、１５０ｍｇのグルコース及び１０ｍｇのＧＤＨを加え、最後に２０ｍｇのＡＡＤＨを包埋したＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させた後、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
ＡＡＤＨとＦＤＨの共固定化酵素の活性の検出方法は次のとおりであった。
５ｍＬの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液（ｐＨ ８．０～９．０）を１０ｍＬの反応フラスコに加え、次に１００ｍｇの基質１１又は１２、１０８ｍｇの塩化アンモニウムを加えて、ｐＨを７．５～８．０に調整し、次に１０ｍｇのＮＡＤ＋、８０ｍｇのギ酸アンモニウム、及び５０ｍｇのＡＡＤＨとＦＤＨの混合酵素を包埋したＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させた後、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。
ＡＡＤＨとＧＤＨのＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素の活性の検出方法は次のとおりであった。
５ｍＬの０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－Ｃｌ緩衝液（ｐＨ ８．０～９．０）を１０ｍＬの反応フラスコに加え、次に１００ｍｇの基質１１又は１２、１０８ｍｇの塩化アンモニウムを加えて、ｐＨを７．５～８．０に調整し、次に１０ｍｇのＮＡＤ＋、１５０ｍｇのグルコース、及び５０ｍｇのＡＡＤＨとＧＤＨの混合酵素を包埋したＰＶＡ－ＣＦＰ膜固定化酵素を加えた。３０℃で１６時間反応させた後、転化率を検出し、１回の反応終了後に固定化酵素を分離して、次回の反応で繰り返し使用し、繰り返し使用回数について検討した。試験結果を表１９に示す。
上記の説明から分かるように、本発明に記載の実施例は次の技術的効果を実現している。
本願は、ＰＶＡ多孔質膜を採用してそれを担体として酵素を包埋の方式で固定化し、包埋固定化のフローはシンプルであり、条件が穏やかで、精製酵素又は粗酵素にいずれも良好な固定化効果を有し、且つ酵素はＰＶＡ多孔質膜に包埋固定化されると比較的安定しており、使用中に浸出しにくく、採用するＰＶＡ多孔質膜の多孔質構造は反応物と生成物をよりよく送達できるため、連続フロー生体触媒への使用に適する。前記包埋固定は機械的な固定であるため、酵素に対して幅広い適合性を有する。ＰＶＡ多孔質膜を三次元的に構造させることによって、立体的構造を持たせ、さらに、より大きい表面積を有するため、より多くの包埋部位を提供し、さらに、酵素の高い活性及び安定性を保証した上で、酵素の担載容量を高めている。
本願は、ＰＶＡ多孔質膜を採用してそれを担体として酵素を包埋の方式で固定化し、包埋固定化のフローはシンプルであり、条件が穏やかで、精製酵素又は粗酵素にいずれも良好な固定化効果を有し、且つ酵素はＰＶＡ多孔質膜に包埋固定化されると比較的安定しており、使用中に浸出しにくく、採用するＰＶＡ多孔質膜の多孔質構造は反応物と生成物をよりよく送達できるため、連続フロー生体触媒への使用に適する。前記包埋固定は機械的な固定であるため、酵素に対して幅広い適合性を有する。ＰＶＡ多孔質膜を三次元的に構造させることによって、立体的構造を持たせ、さらに、より大きい表面積を有するため、より多くの包埋部位を提供し、さらに、酵素の高い活性及び安定性を保証した上で、酵素の担載容量を高めている。
上述したのが、本発明を限定するためではなく、本発明の好ましい実施例に過ぎず、当業者に自明なように、本発明は様々な修正及び変更を有してもよい。本発明の趣旨と原則を逸脱せず、修正、同等な置換、改善などを行った場合に、そのいずれも本発明の保護範囲に含まれるものとする。
Claims (13)
- ＰＶＡ多孔質膜及び前記ＰＶＡ多孔質膜に包埋されている酵素を含み、前記ＰＶＡ多孔質膜は、三次元的に構造されたＰＶＡ多孔質膜であり、前記酵素は、アミノ基転移酵素、Ｄ－乳酸脱水素酵素、シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、ケト還元酵素、アルケン還元酵素、ニトリル加水分解酵素、アンモニア分解酵素、アミノ酸脱水素酵素、イミン還元酵素、アルコール脱水素酵素、ギ酸アンモニウム脱水素酵素、グルコース１－脱水素酵素及びそれらの変異体のいずれか一種から選ばれることを特徴とするＰＶＡ膜固定化酵素。
- 前記三次元的に構造されたＰＶＡ多孔質膜は、突起又は凹溝によって形成された三次元構造を有し、好ましくは、前記酵素が遊離酵素又は架橋酵素凝集体であることを特徴とする請求項１に記載のＰＶＡ膜固定化酵素。
- 前記アミノ基転移酵素は、クロモバクテリウム・ビオラセウム ＤＳＭ３０１９１（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＤＳＭ３０１９１）に由来するアミノ基転移酵素又はアルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）に由来するアミノ基転移酵素、又はバチルス・チューリンゲンシス（Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）に由来するアミノ基転移酵素であり、
前記ケト還元酵素は、アセトバクター属ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１）に由来するケト還元酵素、又はカンジダ・マケドニエンシス ＡＫＵ４５８８（Ｃａｎｄｉｄａ ｍａｃｅｄｏｎｉｅｎｓｉｓ ＡＫＵ４５８８）に由来するケト還元酵素であり、
前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼは、ロドコッカス属Ｐｈｉ１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｐｈｉ１）に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、又はブラキモナス・ペトロレオボランス（Ｂｒａｃｈｙｍｏｎａｓ ｐｅｔｒｏｌｅｏｖｏｒａｎｓ）に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼ、又はロドコッカス・ルバー－ＳＤ１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ－ＳＤ１）に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼであり、
前記アンモニア分解酵素は、アスペルギルス・ニゲル ＣＢＳ ５１３．８８（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＣＢＳ ５１３．８８）に由来するアンモニア分解酵素及びソレノステモン・スクテラリオイデス（Ｓｏｌｅｎｏｓｔｅｍｏｎ ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｏｉｄｅｓ）に由来するアンモニア分解酵素であり、
前記アルケン還元酵素は、サッカロミケス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来するアルケン還元酵素及びクリセオバクテリウム属ＣＡ４９（Ｃｈｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ＣＡ４９）に由来するアルケン還元酵素であり、
前記イミン還元酵素は、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．）に由来するイミン還元酵素及びバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）に由来するイミン還元酵素であり、
前記アミノ酸脱水素酵素は、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ）に由来するロイシン脱水素酵素及びバチルス・スファエリカス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｈａｅｒｉｃｕｓ）に由来するフェニルアラニン脱水素酵素であり、
前記ニトリル加水分解酵素は、アスペルギルス・ニゲル ＣＢＳ ５１３．８８（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＣＢＳ ５１３．８８）に由来するニトリル加水分解酵素及びニューロスポラ・クラッサ ＯＲ７４Ａ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ＯＲ７４Ａ）に由来するニトリル加水分解酵素であり、
好ましくは、前記クロモバクテリウム・ビオラセウム ＤＳＭ３０１９１（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｖｉｏｌａｃｅｕｍ ＤＳＭ３０１９１）に由来するアミノ基転移酵素が配列番号１に示されるアミノ酸配列を有し、前記アミノ基転移酵素の変異体のアミノ酸配列が配列番号１に示されるアミノ酸配列に変異が起きて得られるアミノ酸配列であり、前記変異が、少なくとも、７位、４７位、９０位、９５位、２９７位、３０４位、３８０位、４０５位及び４１６位の１つの変異部位を含み、且つ７位のトレオニンがシステインに変異し、４７位のセリンがシステインに変異し、９０位のリシンがグリシンに変異し、９５位のアラニンがプロリンに変異し、２９７位のイソロイシンがロイシンに変異し、３０４位のリシンがアスパラギン酸に変異し、３８０位のグルタミンがロイシンに変異し、４０５位のアルギニンがグルタミン酸に変異し、４１６位のアルギニンがトレオニンに変異し、又は前記アミノ基転移酵素の変異体のアミノ酸配列が、前記変異が起きて得られるアミノ酸配列の前記変異部位を有し、且つ前記変異が起きて得られるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、
好ましくは、前記アルスロバクター・シトレウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｔｒｅｕｓ）に由来するアミノ基転移酵素が配列番号２に示されるアミノ酸配列を有し、前記アミノ基転移酵素の変異体のアミノ酸配列が配列番号２に示されるアミノ酸配列に変異が起きて得られるアミノ酸配列であり、前記変異が、少なくとも、３位、５位、６０位、１６４位、１７１位、１７８位、１８０位、１８６位、１８７位、２５２位、３７０位、３８４位、３８９位、４０４位、４１１位、４２３位及び４２４位の１つの変異部位を含み、且つ３位のロイシンがセリンに変異し、５位のバリンがセリンに変異し、６０位のシステインがチロシンに変異し、１６４位のフェニルアラニンがロイシンに変異し、１７１位のグルタミン酸がアスパラギン酸に変異し、１７８位のアラニンがロイシンに変異し、１８０位のイソロイシンがバリンに変異し、１８６位のセリンがグリシンに変異し、１８７位のセリンがアラニンに変異し、２５２位のバリンがイソロイシンに変異し、３７０位のロイシンがアラニンに変異し、３８４位のチロシンがフェニルアラニンに変異し、３８９位のイソロイシンがフェニルアラニンに変異し、４０４位のロイシンがグルタミンに変異し、４１１位のグリシンがアスパラギン酸に変異し、４２３位のメチオニンがリシンに変異し、４２４位のグルタミン酸がグルタミンに変異し、又は前記アミノ基転移酵素の変異体のアミノ酸配列が、前記変異が起きて得られるアミノ酸配列の前記変異部位を有し、且つ前記変異が起きて得られるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、
好ましくは、前記アセトバクター属ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＣＣＴＣＣ Ｍ２０９０６１）に由来するケト還元酵素が配列番号３に示されるアミノ酸配列を有し、前記ケト還元酵素の変異体のアミノ酸配列が配列番号３に示されるアミノ酸配列に変異が起きて得られるアミノ酸配列であり、前記変異が、少なくとも、９４位、１４４位及び１５６位の１つの変異部位を含み、且つ９４位のアラニンがアスパラギンに変異し、１４４位のグルタミン酸がセリンに変異し、１５６位のアスパラギンがトレオニン若しくはバリンに変異し、又は前記ケト還元酵素の変異体のアミノ酸配列が、前記変異が起きて得られるアミノ酸配列の前記変異部位を有し、且つ前記変異が起きて得られるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、
好ましくは、前記ロドコッカス属Ｐｈｉ１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ． Ｐｈｉ１）に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼが配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼの変異体のアミノ酸配列が配列番号４に示されるアミノ酸配列に変異が起きて得られるアミノ酸配列であり、前記変異が、少なくとも、２８０位、４３５位、４３６位、４３８位、４４１位、５０８位及び５１０位の１つの変異部位を含み、且つ２８０位のフェニルアラニンがチロシンに変異し、４３５位のフェニルアラニンがアスパラギンに変異し、４３６位のフェニルアラニンがセリンに変異し、４３８位のロイシンがアラニンに変異し、４４１位のセリンがバリンに変異し、５１０位のロイシンがバリンに変異し、又は前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼの変異体のアミノ酸配列が、前記変異が起きて得られるアミノ酸配列の前記変異部位を有し、且つ前記変異が起きて得られるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であり、
好ましくは、前記ロドコッカス・ルバー－ＳＤ１（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｒｕｂｅｒ－ＳＤ１）に由来するシクロヘキサノンモノオキシゲナーゼが配列番号５に示されるアミノ酸配列を有し、前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼの変異体のアミノ酸配列が配列番号５に示されるアミノ酸配列に変異が起きて得られるアミノ酸配列であり、前記変異が、少なくとも、４５位、１９０位、２４９位、２５７位、３９３位、５０４位及び５５９位の１つの変異部位を含み、且つ４５位のメチオニンはトレオニンに変異し、１９０位のプロリンがロイシンに変異し、２４９位のシステインがバリンに変異し、２５７位のシステインがアラニンに変異し、３９３位のシステインがバリンに変異し、５０４位のプロリンがバリンに変異し、５５９位のチロシンがメチオニンに変異し、又は前記シクロヘキサノンモノオキシゲナーゼの変異体のアミノ酸配列が、前記変異が起きて得られるアミノ酸配列の前記変異部位を有し、且つ前記変異が起きて得られるアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする請求項１又は２に記載のＰＶＡ膜固定化酵素。 - 前記ＰＶＡ膜固定化酵素は、各酵素の補酵素及び補因子をさらに含み、前記補酵素及び前記補因子は前記ＰＶＡ多孔質膜に包埋されていることを特徴とする請求項１に記載のＰＶＡ膜固定化酵素。
- 前記ＰＶＡ多孔質膜にはポリエチレングリコール及び／又はポリエチレンイミンをさらに有し、
好ましくは、前記ポリエチレングリコールの分子量がＰＥＧ４００～ＰＥＧ６０００であり、
好ましくは、前記ポリエチレンイミンの分子量が３ＫＤａ～７０ＫＤａであり、
好ましくは、前記ポリエチレングリコールと前記ＰＶＡ多孔質膜の質量比が５：４～７５：４であり、前記ポリエチレンイミンと前記ＰＶＡ多孔質膜の質量比が１：１２～１：２４０であることを特徴とする請求項１ないし４のいずれか一項に記載のＰＶＡ膜固定化酵素。 - 前記酵素は、粗酵素であることを特徴とする請求項１に記載のＰＶＡ膜固定化酵素。
- 前記酵素の担載容量は、０．０５～０．４ｇの遊離酵素／ｃｍ２膜又は０．０３～０．０６ｇの乾燥した架橋酵素凝集体／ｃｍ２膜であることを特徴とする請求項１又は６に記載のＰＶＡ膜固定化酵素。
- 請求項１ないし７のいずれか一項に記載のＰＶＡ膜固定化酵素の製造方法であって、
酵素及びＰＶＡ溶液を含む原料を所定の時間混合して、混合系を得るステップＳ１と、
前記混合系を金型に加えて前記混合系に乾燥処理を行って、膜包埋酵素を得ることであって、前記金型は、三次元的に構造されたＰＶＡ多孔質膜を形成させるために三次元的に構造された金型であるステップＳ２と、
リン酸緩衝液で前記膜包埋酵素に浸漬処理を行って洗浄した後、前記ＰＶＡ膜固定化酵素を得るステップＳ３とを含み、
好ましくは、前記混合系のｐＨが６．０～６．５であることを特徴とする製造方法。 - 前記ステップＳ１は、
その中の酵素が架橋酵素凝集体である酵素懸濁液、又はその中の酵素が細胞を除去した遊離酵素である酵素溶液を調製することと、
前記懸濁液又は前記酵素溶液と前記ＰＶＡ溶液を所定の時間混合して、前記混合系を得ることとを含み、
好ましくは、前記所定の時間が１０～６０分であり、前記ＰＶＡ溶液のＰＶＡの分子量が２０ＫＤａ～２００ＫＤａであり、好ましくは、前記ＰＶＡ溶液中のＰＶＡの含有量が１０～５０ｇ／１００ｍＬであり、好ましくは、前記ＰＶＡ溶液には酢酸、メタノール及び硫酸が分散されており、好ましくは、前記ＰＶＡ溶液のｐＨが５．５～６．５であり、好ましくは、前記酵素と前記ＰＶＡ溶液の比率が１～５０ｇ／１００ｍＬであり、好ましくは、前記懸濁液又は前記酵素溶液がリン酸緩衝液、任意選択の補因子及び任意選択の補酵素をさらに含み、好ましくは、前記補酵素と前記酵素の重量比率が１０：１～１：１０であることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。 - 前記ステップＳ１は、
ＰＶＡ水溶液、架橋酵素粒子を混合して、前記混合系を形成させることを含み、
好ましくは、前記架橋酵素粒子と前記ＰＶＡ水溶液の比率が１～５０ｇ／１００ｍＬであり、好ましくは、前記所定の時間が１０～６０分であり、好ましくは、前記架橋酵素粒子が酵素、任意選択の補因子及び任意選択の補酵素を含むことを特徴とする請求項８に記載の製造方法。 - 前記ステップＳ１は、
ＰＶＡ水溶液、改質剤溶液を第１の所定時間混合して、第２混合系を形成させることと、
前記第２混合系と酵素系を第２の所定時間混合して、前記混合系を形成させることとを含み、
好ましくは、前記ＰＶＡ水溶液の濃度が５～３０ｇ／１００ｍＬであり、好ましくは、前記改質剤溶液が、補因子が分散されているポリエチレングリコール水溶液及び／又は補因子が分散されているポリエチレンイミン水溶液を含み、好ましくは、前記ポリエチレングリコールの分子量がＰＥＧ４００～ＰＥＧ６０００であり、好ましくは、前記混合系中の前記ポリエチレングリコールの濃度が３～１０ｇ／１００ｍＬであり、好ましくは、前記ポリエチレンイミンの分子量が３ＫＤａ～７０ＫＤａであり、より好ましくは、前記ポリエチレンイミンの分子量が３ＫＤａ～５０ＫＤａであり、好ましくは、前記混合系中の前記ポリエチレンイミンの濃度が０．１～１ｇ／１００ｍＬであり、より好ましくは、前記混合系中の前記ポリエチレンイミンの濃度が０．１～０．３ｇ／１００ｍＬであり、好ましくは、前記酵素系が酵素、任意選択の補因子、任意選択の補酵素及びリン酸緩衝液を含み、好ましくは、前記酵素は酵素が細胞を除去した遊離酵素又は架橋酵素凝集体であり、好ましくは、前記酵素系中の前記補因子の濃度が１～２０ｍｇ／ｍＬであり、好ましくは、前記酵素系中の前記補酵素と前記酵素の重量比率が１０：１～１：１０であり、好ましくは、前記酵素と前記ＰＶＡ溶液の比率が１～５０ｇ／１００ｍＬであることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。 - 前記ステップＳ２は、
前記混合系を金型に置いて第３の所定時間静置した後、前記金型に、アセトニトリル、エタノール及びアセトンからなる群からいずれか一種又は複種選ばれる脱水促進剤を加えて乾燥処理を行うことを含み、
好ましくは、前記脱水促進剤と混合系の体積比率が１：１０～５：１であり、好ましくは、前記第３の所定時間が２～４時間であり、好ましくは、前記金型が三次元的に構造された金型であり、前記三次元的に構造された金型が突起又は凹溝を有することを特徴とする請求項８ないし１１のいずれか一項に記載の製造方法。 - 前記ステップＳ３は、
前記膜包埋酵素を前記リン酸緩衝液に２～１６時間浸漬した後、新しい前記リン酸緩衝液で前記膜包埋酵素を洗浄して、前記ＰＶＡ膜固定化酵素を得ることを含むことを特徴とする請求項８ないし１１のいずれか一項に記載の製造方法。
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