KR20230024862A - 비드 결합체, 제조 방법, 이를 포함하는 생물학적 분석 시스템 및 분석 방법 - Google Patents

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Abstract

나노 비드 및 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 올리고-뉴클레오타이드 사이에 충분한 길이를 갖는 연결기가 개재된 비드 결합체, 비드 결합체의 제조 방법, 비드 결합체를 이용하여 생물학적 샘플 내에 표적 핵산 분자를 검출하는 분석 키트 및 분석 방법이 개시된다. 비드 결합체를 이용하여 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자를 특이적으로 신속하게 검출하고, 분석의 민감도를 향상시킬 수 있다.

Description

비드 결합체, 제조 방법, 이를 포함하는 생물학적 분석 시스템 및 분석 방법{CONJUGATED BEAD, PROCESS THEREOF AND BIOLOGICAL ASSAY SYSTEM AND ASSAY PROCESS INLCUIDG THEREOF}
본 발명은 나노 비드에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 생물학적 샘플 내에 존재하는 핵산 분자를 특이적으로 검출 및 정제할 수 있는 비드 결합체 및 이를 이용하여 생물학적 샘플 내에 존재하는 핵산 분자를 분석할 수 있는 시스템 및 분석 방법에 관한 것이다.
2019년 말에 중국에서 발생한 코로나바이러스-19(COVID-19)가 세계적으로 유행하면서, 감염성 질병을 조기에 진단할 수 있는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)과 같은 핵산 증폭 반응에 대한 관심이 높아지고 있다. PCR은 COVID-19 이전에도 암, 바이러스 또는 박테리아 등이 야기하는 감염성 질병을 진단하는데 널리 사용되었다.
예를 들어, 자궁경부암(cervical cancer)을 일으키는 주요 병원체인 인유두종바이러스 (Human papillomavirus, HPV)의 감염 여부를 진단할 때, 현재는 자궁경부에 면봉을 넣어 세포를 채취한 뒤, 염색을 통해 암세포의 유무를 관찰하는 세포진(cyotodiagnosis) 검사가 주로 이루어지고 있다. 이러한 세포진 검사는 민감도가 50-70%로 다소 낮아, 이를 보완하기 위해 추가적으로 HPV 유전자 검사를 실시하여, 자궁경부 세포 내에서 HPV의 존재 유무를 판별한다. HPV 유전자 검사가 양성이라면 세포진 검사의 결과가 음성이라도 자궁경부암의 발병 확률이 높기 때문에 현재는 추가적으로 PCR 검사를 많이 사용하고 있다.
현재 HPV 검진에 사용되는 방법은 크게 2가지로 팹 테스트(pap smear test)와 pad형 검출 방법이 있다. 팹 테스트는 자궁경부에 면봉을 넣어 세포를 채취하여 PCR 반응을 통해 HPV 바이러스 유무를 확인하는 방법이다. Pad형 검출 방법은 패드를 착용하여 분비물 내 HPV 바이러스를 채취하여 PCR로 HPV 바이러스 유무를 확인하는 방법이다.
팹 테스트의 경우, 침습적이고 전문 의료진이 있어야 검출할 수 있다는 단점이 있다. Pad형 검출 방법은 검사하기 전 24-72 시간 전부터 샤워나 질 세척이 불가능하고 오랜 시간 동안 패드를 착용하는 단점이 있다. 따라서 urine 내에 존재하는 DNA나 RNA를 검출하여 HPV 바이러스 존재 유무를 알아낼 수 있다면, 기존의 검사방법이 가진 단점을 충분히 보완할 수 있으며, 상대적으로 짧은 시간 내에 HPV 감염 여부를 확인할 수 있다.
중합효소연쇄반응(PCR)을 수행하기 위해서는 샘플로부터 질병 특이적인 핵산 분자를 추출하여야 한다. 샘플 내에 존재하는 핵산 분자를 추출하는 방식은 크게 컬럼(column)을 이용하는 방식과 자성 비드(magnetic bead)를 이용한 방식으로 나뉜다. 컬럼을 이용하는 방식에서 샘플 내 존재하는 세포를 lysis하고 컬럼을 이용하여 포집한 후, PCR을 통해 검사한다. 자성 비드를 이용하는 방식에서 자성 비드의 표면 전하와, 샘플 내의 핵산 분자 사이의 전하-전하(charge-charge) 상호작용을 통해 원하는 핵산 분자를 포집하고 정제한다. 하지만 이러한 방식들은 샘플 내에 다양한 단백질이나 inhibitor 또는 genomic DNA, RNA 또한 비특이적으로 포집하기 때문에 추가적인 정제 과정이 요구된다. 아울러, 샘플 내에 존재하는 다양한 inhibitor로 인하여 PCR 반응을 수행하여도 정확도가 낮다.
특히, 뇨(urine) 내에는 다양한 inhibitors와 단백질, DNA, RNA가 존재하는데, 뇨의 총량에 비해 극소량으로 존재한다. 현재 적용되고 있는 컬럼을 이용한 정제 방법과 자성 비드를 이용한 정제 방법은 뇨(urine) 내의 전하를 갖는 모든 물질이 분리된다. 목적하였던 핵산 분자 이외에 다른 이물질이 같이 분리되므로, PCR 반응의 정확도가 떨어질 뿐만 아니라, 추가적인 정제 과정이 요구되며, PCR 반응의 민감도(specificity)가 저하되는 문제가 있다.
본 발명의 목적은 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자를 특이적으로 분리, 검출할 수 있는 비드 결합체, 그 제조 방법, 비드 결합체를 이용하여 생물학적 샘플 내의 표적 핵산 분자를 분석할 수 있는 키트 및 분석 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자를 신속하고 용이하게 수행할 수 있는 비드 결합체, 그 제조 방법, 비드 결합체를 이용하여 생물학적 샘플 내의 표적 핵산 분자를 분석할 수 있는 키트 및 분석 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자의 검출 민감도(sensitivity)를 향상시킬 수 있는 비드 결합체, 그 제조 방법, 비드 결합체를 이용하여 생물학적 샘플 내의 표적 핵산 분자를 분석할 수 있는 키트 및 분석 방법을 제공하고자 하는 것이다.
일 측면에서, 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 올리고-뉴클레오타이드의 일 말단이 나노 비드 표면에 축합(conjugation)한 비드 결합체로서, 상기 나노 비드의 표면과 상기 올리고-뉴클레오타이드 사이에 하기 화학식 1의 구조를 갖는 연결기가 개재되어 있는 비드 결합체가 개시된다.
[화학식 1]
Figure pat00001
(화학식 1에서 R1은 직접 결합 또는 C1-C20 지방족 탄화수소기임; R2 및 R3는 각각 독립적으로 C3-C20 2가의 지방족 탄화수소 연결기임; R1 왼쪽의 별표는 나노 비드 표면에 연결되는 부위를 나타내고, R3 우측의 별표는 올리고-뉴클레오타이드의 말단에 연결되는 부위를 나타냄.
일례로, 화학식 1의 상기 R2 및 R3는 각각 독립적으로 C3-C20 알킬렌기일 수 있다.
하나의 예시적인 측면에서, 상기 나노 비드는 무기 소재로 이루어질 수 있다.
상기 무기 소재는 산화철, 실리카, 유리 또는 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 비금속 소재, 및 금, 은, 구리 이들의 조합 및 이들의 합금으로 구성되는 군에서 선택되는 금속 소재 중에서 적어도 하나일 수 있다.
다른 예시적인 측면에서, 상기 나노 비드는 유기 소재로 이루어질 수 있다.
상기 유기 소재는 폴리스틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리 아크릴 아마이드, 이들의 조합 또는 이들의 공중합체로 구성되는 군에서 선택되는 고분자 수지, 및 플루란, 플루란 아세테이트, 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 아가로즈, 키토산, 이들의 조합 및 이들의 공중합체로 구성되는 군에서 선택되는 다당류 중에서 적어도 하나일 수 있다.
선택적으로, 상기 나노 비드는 자성체로 이루어질 수 있다.
상기 표적 핵산 분자는 종양 또는 병원체에서 유래할 수 있다.
상기 병원체는 병원성 바이러스, 병원성 박테리아 또는 병원성 원생동물을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 표적 핵산 분자는 인유두종바이러스(human papillomavirus)에서 유래할 수 있다.
다른 측면에서, 전술한 비드 결합체를 제조하는 방법으로서, 하기 화학식 2로 표시되는 아미노기가 표면에 연결된 나노 비드와, 하기 화학식 3으로 표시되는 카르복실산을 반응시켜, 상기 나노 비드의 표면을 하기 화학식 4의 구조를 갖는 연결기(linker)로 변형시키는 단계; 상기 화학식 4의 구조를 갖는 연결기로 표면이 변형된 상기 나노 비드와, 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하며, 말단이 하기 화학식 5의 지방족 티올로 변형된 올리고-뉴클레오타이드를 반응시키는 단계를 포함하는 방법이 개시된다.
[화학식 2]
Figure pat00002
[화학식 3]
Figure pat00003
[화학식 4]
Figure pat00004
[화학식 5]
Figure pat00005
(화학식 2 내지 화학식 5에서, R1, R2, R3 및 별표는 각각 청구항 제1항에서 정의된 것과 동일함)
또 다른 측면에서, 전술한 비드 결합체를 포함하는, 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자를 검출하는 분석 키트가 개시된다.
상기 생물학적 샘플은 뇨(urine), 타액, 객담, 혈액 및 비인두 도말물을 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 분석 키트는 상기 비드 결합체를 구성하는 상기 올리고-뉴클레오타이드에 특이적으로 결합한 표적 핵산 분자와, 핵산 중합 효소 및 핵산 중합 반응용 완충 용액을 포함하는 핵산 증폭 키트, 전기영동 키트 또는 차세대 염기서열분석(next generation sequencing) 키트일 수 있다.
또 다른 측면에서, 전술한 비드 결합체를 생물학적 샘플과 반응시키는 단계; 상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산과 상기 올리고-뉴클레오타이드가 결합된 상기 비드 결합체를 분리하는 단계; 및 상기 올리고-뉴클레오타이드와 상기 표적 핵산 분자의 결합 여부를 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자를 분석하는 방법이 개시된다.
예를 들어, 상기 올리고-뉴클레오타이드와 상기 표적 핵산 분자의 결합 여부를 검출하는 단계는, 상기 올리고-뉴클레오타이드에 결합된 표적 핵산 분자를 주형으로 사용한 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.
선택적으로, 상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 상기 표적 핵산 분자와 상기 올리고-뉴클레오타이드가 결합된 비드 결합체를 분리하는 단계는 자석을 이용하여 수행될 수 있다.
필요한 경우, 상기 비드 결합체를 상기 생물학적 샘플과 반응시키는 단계 이전에, 상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 핵산 분자를 단일 가닥 핵산 분자로 변형시키는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 전술한 비드 결합체를 생물학적 샘플과 반응시키는 단계; 및 상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자와 상기 올리고-뉴클레오타이드가 결합된 상기 비드 결합체를 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자를 정제하는 방법이 개시된다.
일례로, 상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 상기 표적 핵산 분자와 상기 올리고-뉴클레오타이드가 결합된 상기 비드 결합체를 분리하는 단계는 자석을 이용하여 수행될 수 있다.
생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 올리고-뉴클레오타이드는 나노 비드의 표면에 결합되는 소정 길이를 갖는 연결기를 통하여 나노 비드의 표면에 축합(conjugation)된 비드 결합체가 개시된다. 생물학적 샘플 내에 존재하는 핵산 분자 중에서, 나노 비드의 표면에 결합한 올리고-뉴클레오타이드에 표적 핵산 분자만이 특이적으로 결합할 수 있다. 따라서 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자를 특이적으로 분리, 검출할 수 있다.
뿐만 아니라, 나노 비드와 올리고-뉴클레오타이드 사이에 소정 길이를 갖는 연결기를 도입하여, 분자 내의 입체 장해(steric hindrance)를 최소화하고, 연결기와 올리고-뉴클레오타이드의 염기 사이의 비-특이적 결합을 억제하고, 나노 비드와 연결기 사이의 특이적 결합을 구현할 수 있다.
표적 핵산 분자만을 특이적으로 분리, 검출하기 때문에, 별도의 추가적인 정제 과정이 필요 없다. 따라서 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자를 정제하는 과정이 단순해지면서, 신속하고 용이하게 표적 핵산 분자를 분리할 수 있다.
뿐만 아니라, 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자만 특이적으로 분리, 정제되므로, 최종적으로 생물학적 샘플 내에 표적 핵산 분자가 존재하는지의 여부를 분석할 때, 분석의 민감도를 향상시킬 수 있다.
도 1은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따른 비드 결합체의 구성을 개략적으로 도시한 모식도이다.
도 2는 본 발명의 예시적인 실시형태에 따른 비드 결합체를 제조하는 과정을 개략적으로 도시한 모식도이다.
도 3은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 제조된 비드 결합체를 이용하여 생물학적 샘플로부터 표적 핵산 분자를 분리하는 과정을 개략적으로 도시한 모식도이다.
도 4는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 비드 결합체의 평균 입자 크기를 DLS 방법을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 비드 결합체의 평균 표면전하를 Zetasizer를 이용하여 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6a 내지 도 6d는 각각 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 비드 결합체를 이용하여 PCR 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 예시적인 실시예에 따라 합성된 비드 결합체를 이용하여 추출된 표적 핵산 분자의 검출을 전기영동을 이용하여 측정한 결과를 보여주는 사진이다.
현재 바이러스성 질병, 세균성 질병, 암의 발현 여부를 알아내기 위해서는 뇨(urine), 타액, 객담, 비인두 도말물 또는 혈액 등의 생물학적 샘플(검체)을 획득한 후, 생물학적 샘플 내부의 DNA나 RNA와 같은 핵산 분자를 정제 및 추출하는 과정이 필요하다. 생물학적 샘플 내에는 다양한 inhibitor와 DNA, RNA가 존재하고 검출하고자 하는 핵산 분자의 양은 전체 생물학적 샘플 내에 상대적으로 매우 낮은 농도로 존재한다.
현재 사용하는 핵산 추출 방식은 생물학적 샘플 내의 전하가 있는 모든 물질을 포집 후 정제한다. 그 다음은 정제된 핵산을 이용하여 중합효소연쇄반응과 같은 핵산 증폭 반응을 이용한 검사를 수행하기 때문에 정확도와 효율이 낮다는 단점이 있다. 또한 생물학적 샘플의 채취 방식이 침습적이고 불편하며 전문적인 의료진의 도움이 필요하다는 단점이 있다.
본 발명자들은 생물학적 샘플 내에서 특정 표적 핵산 분자만 검출하여, 신속하고 용이하며, 높은 민감도로 바이러스, 병원체의 감염 여부 및/또는 암의 발병 여부를 신속, 정확하게 검출, 분석할 수 있는 비드 결합체를 개발하였다. 생물학적 샘플 내에 원하는 특이적 핵산 분자만 검출, 분석할 수 있도록, 나노 비드 표면에 원하는 핵산 분자와 특이적으로 반응할 수 있는 올리고-뉴클레오타이드가 축합된(conjugated) 비드 결합체를 사용하여 특정 핵산 분자를 포집, 정제 및 검출할 수 있다.
이하, 필요한 경우에 첨부하는 도면을 참조하면서 본 발명을 설명한다.
도 1은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따른 비드 결합체의 구성을 개략적으로 도시한 모식도이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 비드 결합체(100)는 나노 비드(112)와, 말단이 연결기(L)을 통하여 나노 비드(112)의 표면에 축합(conjugation)하며, 표적(target) 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 올리고-뉴클레오타이드(122)를 포함한다. 나노 비드(112)의 표면과 올리고-뉴클레오타이드(122) 사이에 개재되는 연결기(L)는 하기 화학식 1의 구조를 가질 수 있다.
[화학식 1]
Figure pat00006
(화학식 1에서 R1은 직접 결합 또는 C1-C20 지방족 탄화수소기임; R2 및 R3는 각각 독립적으로 C3-C20인 2가의 지방족 탄화수소 연결기임; R1 왼쪽의 별표는 나노 비드 표면에 연결되는 부위를 나타내고, R3 우측의 별표는 올리고-뉴클레오타이드의 말단에 연결되는 부위를 나타냄.
화학식 1에서 R1은 직접 결합이거나, C1-C20 알킬기, C2-C20 알케닐기, C2-C20 알키닐기 및 C1-C20 알킬 에테르기로 구성되는 군에서 선택되는 지방족 탄화수소기일 수 있다. 일례로, 화학식 1의 R1을 구성하는 지방족 탄화수소기는 C1-C10 알킬기, C2-C20 알케닐기, C2-C20 알키닐기 및 C1-C20 알킬 에테르기로 구성되는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 화학식 1에서 R2 및 R3는 각각 독립적으로 C3-C20 알킬렌기(alkylene group), 예를 들어 C3-10 알킬렌기 또는 C5-10 알킬렌기 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
나노 비드(112)와 올리고-뉴클레오타이드(122) 사이에 개재되는 연결기(L)는 각각 최소한 탄소 개수 3개를 가지는 2개의 지방족 탄화수소 연결기인 R2 및 R3를 포함한다. 소정 길이를 갖는 연결기(L)를 도입하여, 비드 결합체(100)를 구성하는 나노 비드(112)와, 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고-뉴클레오타이드(122)는 충분한 거리를 가지고 이격된다. 이에 따라, 비드 결합체(100)에서 나노 비드(112)와 올리고-뉴클레오타이드(122) 사이의 분자내(intra-molecular) 및/또는 분자간(inter-molecular) 입체 장해(steric hindrance)를 최소화할 수 있다.
아울러, 비드 결합체(100)를 합성 또는 제조하는 과정에서, 초기 비드(110, 도 2 참조)를 구성하는 나노 비드(112)의 표면에 직접 또는 간접적으로 연결된 반응성 작용기인 아민기(-NH2)와, 연결기(L)를 형성하기 위해 적용된 카르복실산기(-COOH) 사이에서 아마이드(amide) 결합이 특이적으로 형성될 수 있으며, 카르복실산기와 올리고-뉴클레오타이드(122)를 구성하는 염기에 존재하는 반응성 아민기 사이의 비-특이적 결합을 억제할 수 있다.
비드 결합체(100)에서 나노 비드(112)와 올리고-뉴클레오타이드(122) 사이에 개재되는 연결기(L)의 일단은 올리고-뉴클레오타이드(122)의 5' 말단 또는 3' 말단에 연결될 수 있다. 일례로, 연결기(L)의 일단은 올리고-뉴클레오타이드(122)의 5' 말단에 연결될 수 있다.
예시적인 측면에서, 나노 비드(112)는 무기 소재로 이루어질 수 있다. 일례로, 나노 비드(112)를 형성하는 무기 소재는 산화철, 실리카, 유리 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 비금속 소재 및/또는 금, 은, 구리, 이들의 조합 및 이들의 합금으로 구성되는 군에서 선택되는 금속 소재일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
다른 예시적인 측면에서, 나노 비드(112)는 유기 소재로 이루어질 수 있다. 유기 소재는 고분자 소재일 수 있다. 예를 들어, 나노 비드(112)를 형성하는 유기 소재는 폴리스틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리 아크릴 아마이드, 이들의 조합 및 이들의 공중합체로 구성되는 군에서 선택되는 고분자 수지 및/또는 플루란, 플루란 아세테이트, 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 아가로즈, 키토산, 이들의 조합 또는 이들의 공중합체와 같은 다당류 소재일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
다른 선택적인 측면에서, 나노 비드(112)는 다공성 소재 또는 상자성 소재일 수 있다. 일례로, 나노 비드(110)는 자성체로 이루어질 수 있다. 나노 비드(112)가 상자성 소재로 이루어진 경우, 후술하는 바와 같이, 자석을 이용하여 비드 결합체(110)에 특이적으로 결합한 표적 핵산 분자를 용이하게 분리, 정제할 수 있다.
예시적인 측면에서, 올리고-뉴클레오타이드(120)는 20 내지 100개, 예를 들어, 20 내지 50개의 뉴클레오타이드로 이루어질 수 있다. 올리고-뉴클레오타이드(122)가 20 내지 100개의 뉴클레오타이드로 이루어진 경우, 올리고-뉴클레오타이드(122)는 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자와 엄격한 조건에서 혼성화할 수 있다. 이에 따라, 올리고-뉴클레오타이드(122)에 특이적인 표적 핵산 분자를 높은 민감도로 분리, 정제할 수 있다.
본 명세서에서 “폴리뉴클레오타이드”, "핵산 분자" 또는 "핵산"은 교환 가능하게 사용되며, 임의 길이의 뉴클레오타이드(nucleotide)의 중합체(polymer)를 지칭하며, DNA (예컨대 cDNA) 및 RNA 분자를 포괄적으로 포함한다. 핵산 분자의 구성 단위인 “뉴클레오타이드”는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기, 및/또는 그 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소(polymerase)에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체 내로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 당 또는 염기가 변형된 유사체 (analogue), 예컨대 메틸화 뉴클레오타이드 및 그 유사체를 포함할 수 있다.
뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변이를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈(codon) 또는 동일한 아미노산을 암호화하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성(degeneracy)에 의해, 아르기닌(Arg) 또는 세린(Ser)에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 암호화하는 코돈을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
또한, 뉴클레오타이드에서의 변이가 단백질 자체에 변화를 가져올 수도 있다. 단백질의 아미노산에 변화를 가져오는 변이인 경우에도 본 발명의 단백질과 거의 동일한 활성을 나타내는 것이 얻어질 수 있다.
본 발명의 핵산 분자 또는 폴리뉴클레오타이드가 가지는 특징을 갖는 범위에서, 본 발명의 펩타이드 및 핵산 분자는 서열목록에 기재된 아미노산 서열 또는 염기 서열에 한정되지 않는다는 것은 통상의 기술자에게 명확하다.
한편, 본 명세서에서 용어 "아미노산"은 가장 넓은 의미로 사용되고, 자연-발생 L-아미노산 또는 잔기를 포함하는 것으로 의도된다. 자연-발생 아미노산에 대해 통상적으로 사용되는 1-문자 약어 및/또는 3-문자 약어가 본 명세서에 사용될 수 있다.
아미노산은 D-아미노산뿐만 아니라 화학적으로-변형된 아미노산, 예컨대 아미노산 유사체, 단백질에 통상적으로 혼입되지 않는 자연-발생 아미노산, 예컨대 노르류신과 같이 아미노산의 특징인 것으로 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 특성을 갖는 화학적으로-합성된 화합물을 포함한다. 예를 들어, 천연 페닐알라닌 또는 프롤린과 동일한 펩타이드 화합물의 입체형태 제한을 허용하는 페닐알라닌 또는 프롤린의 유사체 또는 모방체가 아미노산의 정의 내에 포함된다. 이러한 유사체 및 모방체는 본 명세서에서 아미노산의 "기능적 균등물"로서 지칭될 수 있다. 된다. 아미노산의 다른 예는 문헌(Roberts and Vellaccio, The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, Eds. Gross and Meiehofer, Vol. 5, p. 341(Academic Press, Inc.: N. Y. 1983))에 열거되어 있다.
예를 들어, 표준고체-상 합성기술에 의해 합성된 합성 펩타이드는 유전자에 의해 암호화되는 아미노산으로 제한되지 않으며, 이에 따라 주어진 아미노산에 대해 보다 광범위하게 다양한 치환을 허용한다. 유전자 코드에 의해 암호화되지 않는 아미노산은 본 명세서에서 "아미노산 유사체"로 지칭될 수 있다. 예를 들어, 아미노산 유사체는 Glu 및 Asp에 대한 2-아미노아디프산(Aad); Glu 및 Asp에 대한 2-아미노피멜산(Apm); Met, Leu 및 다른 지방족 아미노산에 대한 2-아미노부티르산(Abu); Met, Leu 및 다른 지방족 아미노산에 대한 2-아미노헵탄산(Ahe); Gly에 대한 2-아미노부티르산(Aib); Val, Leu 및 Ile에 대한 시클로헥실알라닌(Cha); Arg 및 Lys에 대한 호모아르기닌(Har); Lys, Arg 및 His에 대한 2,3-디아미노프로피온산(Dap); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신 (EtGly); Gly, Pro 및 Ala에 대한 N-에틸글리신(EtGly); Asn 및 Gln에 대한 N-에틸아스파라긴(EtAsn); Lys에 대한 히드록시리신(Hyl); Lys에 대한 알로히드록시리신(AHyl); Pro, Ser 및 Thr에 대한 3-(및 4-)히드록시프롤린(3Hyp, 4Hyp); Ile, Leu 및 Val 에 대한 알로-이소류신(AIle); Arg에 대한 4-아미디노페닐알라닌; Gly, Pro 및 Ala 에 대한 N-메틸글리신(MeGly, 사르코신); Ile에 대한 N-메틸이소류신(MeIle); Met 및 다른 지방족 아미노산에 대한 노르발린(Nva); Met 및 다른 지방족 아미노산을 위한 노르류신(Nle); Lys, Arg 및 His에 대한 오르니틴 (Orn); Thr, Asn및 Gln에 대한 시트룰린 (Cit) 및 메티오닌 술폭시드 (MSO); 및 Phe에 대한 N-메틸페닐알라닌 (MePhe), 트리메틸페닐알라닌, 할로-(F-, Cl-, Br- 또는 I-)페닐알라닌 또는 트리플루오릴페닐알라닌을 포함한다.
본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 자연적으로 존재하는 것으로부터 분리하였거나, 재조합 기술(recombinant technique)에 의하여 또는 화학적으로 합성된 단백질, 단백질 단편 및 펩타이드를 모두 포함한다.
하나의 측면에서, 펩타이드 변이체, 예컨대 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 펩타이드 변이체가 제공된다. 본 명세서에서 용어 “펩타이드 변이체 (peptide variants)”란 하나 또는 그 이상의 아미노산이 펩타이드의 아미노산 서열에 치환(substitutions), 결실(deletions), 첨가(additions) 및/또는 삽입(insertions)되어 있으면서, 원래의 아미노산으로 구성된 펩타이드와 거의 동일한 생물학적 기능을 발휘하는 것을 말한다. 펩타이드 변이체는 원래의 펩타이드와 70%이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 동일성(identity)을 가지고 있어야 한다.
이러한 펩타이드 변이체로서 “보존성”이라고 알려진 아미노산 변이체가 포함될 수 있다. 변이체는 또한 비-보존성(non-conservative)의 변화를 포함할 수도 있다. 예시적인 측면에서, 변이체 폴리펩타이드의 서열은 5개 또는 그 이하의 아미노산이 치환, 결실, 부가 또는 삽입되어, 원래의 서열과 달라진다. 변이체는 또한 펩타이드의 면역원성(immunogenicity), 2차 구조(secondary structure) 및 수치료성(hydropathic nature)에 최소한의 영향을 주는 아미노산들의 결실 또는 부가에 의해 변화될 수 있다.
“보존성” 치환이란 하나의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되었을 때에도 폴리펩타이드의 2차구조 및 수치료성(hydropathic nature) 등의 특성에 큰 변화가 없는 것을 의미한다. 아미노산 변이는 아미노산 곁사슬 치환기의 상대적 유사성, 예컨대 극성(polarity), 전하(charge), 수용성(solubility), 소수성(hydrophobicity), 친수성(hydrophilicity) 및/또는 양친화성(amphipathic nature) 등의 유사성을 기초로 하여 얻어질 수 있다. 일례로, 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 또는 펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H. Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다.
상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에 따른 펩타이드 및/또는 단백질을 암호화하는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 정렬(align)하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 정렬된 서열을 분석한 경우에, 최소 61%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다. 서열비교를 위한 정렬 방법은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있다.
본 명세서에서 "엄격한 조건(stringent condition)에서 혼성화(hybridization)"는 2개의 단일 가닥 핵산 분자가 적어도 70%, 예를 들어 80% 이상 또는 90% 이상의 뉴클레오타이드가 상보적(complementary) 뉴클레오타이드로 이루어진 것을 지칭한다.
일례로, 표적 핵산 분자와 특이적으로 결합하는 올리고-뉴클레오타이드(122)는 프로브(probe) 또는 프라이머(primer)일 수 있다. 본 명세서에서 "프라이머"는 일반적으로 주형(template) 핵산 분자의 일부에 상보적인(complementary) 핵산 분자를 지칭한다.
일례로, 프라이머는 주형 핵산 분자 가닥의 일부에 상보적일 수 있다. 프라이머는 핵산 증폭 반응에서 표적 핵산 분자의 합성을 위한 핵산의 가닥일 수 있으며, 이 경우 프라이머는 주형 가닥에 혼성화(hybridization)할 수 있고, 뉴클레오타이드는 중합 효소(polymerase)의 도움을 받아 프라이머의 말단(들)에 첨가될 수 있다. 따라서, 표적 핵산 분자가 복제되는 동안, 표적 핵산 분자의 복제를 촉매하는 중합 효소는 표적 핵산 분자에 부착된 프라이머의 3' 말단에 복제를 개시하여 표적 핵산 분자의 반대 가닥을 합성, 복제할 수 있다.
선택적인 측면에서, 프라이머는 주형 핵산 분자에 완전히 또는 부분적으로 상보성일 수 있다. 프라이머는 주형 핵산에 대한 서열 동일성 또는 상동성 또는 상보성을 나타낼 수 있다. 프라이머 및 주형 핵산 간 상동성 또는 서열 동일성 또는 상보성은 프라이머의 길이를 기반으로 할 수 있다. 예를 들어, 프라이머가 약 20개의 뉴클레오타이드로 이루어지는 경우, 주형 핵산에 대하여 10개 이상의 인접한 핵산 염기에 상보적인 염기를 포함할 수 있다.
한편, 올리고-뉴클레오타이드(122)는 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합할 수 있다. 표적 핵산 분자의 종류에 대해서는 후술한다.
이어서, 도 2를 참조하면서 본 발명의 예시적인 실시형태에 따른 비드 결합체를 제조, 합성하는 방법에 대하여 설명한다. 도 2의 좌측 상단에 나타낸 바와 같이, 나노 비드(112)의 표면에 하기 화학식 2로 표시되는 아민기가 연결된 초기 비드(110)와, 하기 화학식 3의 구조를 갖는 카르복실산을 반응시켜, 나노 비드(110)의 표면이 하기 화학식 4의 구조를 갖는 연결기(제 1 연결기, L1)로 개질된(modified) 비드 중간체(110A)를 합성한다.
[화학식 2]
Figure pat00007
[화학식 3]
Figure pat00008
[화학식 4]
Figure pat00009
(화학식 2 내지 화학식 4에서, R1, R2, R3 및 별표는 각각 화학식 1에서 정의된 것과 동일함)
예시적인 측면에서, 나노 비드(112) 표면에 화학식 2의 구조를 갖는 아민기가 연결된 초기 비드(110)는 pH 5-6으로 조절된 완충액(buffer solution)에서 활성화될 수 있다. 초기 비드(110)를 활성화시킬 수 있는 완충액은 MES(2-[Nmorpholino] ethane sulfonic acid) 완충액, 인산 완충액(phosphate buffer), 아세트산 나트륨(sodium acetate), 인산나트륨(sodium phosphate) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
한편, 초기 비드(110)를 구성하는 나노 비드(112)의 표면에 연결된 아민기와, 화학식 2의 구조를 갖는 지방족 카르복실산의 말단을 구성하는 카르복실산기가 반응하여 안정적인 아마이드 결합을 형성할 수 있도록, 적절한 활성화제(activator)가 사용될 수 있다. 사용 가능한 활성화제는 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride), NHS(N-hydroxysuccinimide), sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide), CMC(1-cyclohexyl-3- (2-morpholinoethyl)carbodiimide), DCC(dicyclohexyl carbodiimide), DIC(Diisopropyl carbodiimide) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일례로, 이러한 활성화제는 초기 비드(110)를 구성하는 나노 비드(112)의 표면에 연결된 아민기에 대하여 10 내지 200 몰당량, 예를 들어 50 내지 150 몰당량의 비율로 첨가될 수 있다.
예를 들어, 나노 비드(112) 표면에 아민기가 연결된 초기 비드(110)와 화학식 2의 구조를 갖는 지방족 카르복실산 사이의 반응은 실온에서 12-24시간 동안 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 필요에 따라, 초기 비드(110)와 지방족 카르복실산 사이의 반응이 완료된 후, 전술한 완충액을 사용한 세척 과정이 수행될 수 있다.
이어서, 나노 비드(112) 표면에 화학식 4의 구조를 갖는 제 1 연결기(L1)로 1차 변형 또는 개질된 비드 중간체(110A)를, 올리고-뉴클레오타이드(122)의 일 말단이 하기 화학식 5의 지방족 티올로 변형된 올리고-뉴클레오타이드(122)를 반응시켜, 나노 비드(112)의 표면에 화학식 1의 구조를 갖는 최종 연결기(L)를 통하여 올리고-뉴클레오타이드(122)가 연결된 비드 결합체(100)를 합성, 제조한다.
[화학식 5]
Figure pat00010
(화학식 5에서, R3 및 별표는 각각 화학식 1에서 정의된 것과 동일함)
비드 중간체(110A)와 변형된 올리고-뉴클레오타이드(120) 사이의 반응은 실온에서 12-24 시간 진행될 수 있으며, 예를 들어 pH 7-8의 조건에서 수행될 수 있다. 필요에 따라, 반응 이전에 변형된 올리고-뉴클레오타이드(120)의 말단 티올기를 활성화시키기 위한 환원제가 사용될 수 있다. 일례로, 올리고-뉴클레오타이드(122)의 일단에 연결된 티올기를 활성화시키는 환원제는 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(tris(2-carboxyethyl)phosphine: TCEP), 트리스(3-히드록시프로필)포스핀 (tris(3-hydroxypropyl)phosphine: THPP), 디티오트레이톨(dithiothreitol: DTT), 2-머캅토에탄올 (mercaptoethanol: ME), 2-머캅토에틸아민(mercaptoethylamine: MEA), 이들의 조합 및 이들의 염(예를 들어, 염산염)으로 구성되는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
필요한 경우, 중간체 비드(110A) 표면에 결합하지 않은 변형된 올리고-뉴클레오타이드(120)가 제거될 수 있다.
도 2 및 화학식 1로 나타낸 바와 같이, 최종적으로 제조, 합성된 비드 결합체(100)는 나노 비드(112)와 올리고-뉴클레오타이드(122) 사이에 개재되는 연결기(L)는 각각 적어도 3개의 탄소 원자를 포함하는 2가의 지방족 탄화수소 연결기(R2, R3)를 포함한다. 이에 따라, 나노 비드(112)와 올리고-뉴클레오타이드(122)가 바로 연결되지 않으며, 소정 거리를 두고 이격된다. 본 발명의 비드 결합체(100)를 구성하는 나노 비드(112)와 올리고-뉴클레오타이드(122) 사이의 분자내 및/또는 분자간 입체 장해를 방지, 최소화할 수 있다.
한편, 본 발명에서는 나노 비드(112)의 표면에 아민기가 연결된 초기 비드(110)를 화학식 3의 구조를 갖는 카르복실산과 반응시켜, 아마이드 결합을 갖는 제 1 연결기(L1)를 갖는 비드 중간체(110A)를 합성하고, 비드 중간체(110A)를 올리고-뉴클레오타이드(122)의 말단에 화학식 5의 구조를 갖는 지방족 티올로 변형된 올리고-뉴클레오타이드(120)를 반응시켜 최종적으로 나노 비드(112)와 올리고-뉴클레오타이드(122) 사이에 소정의 길이를 갖는 연결기(L)가 개재된 비드 결합체(100)를 합성한다.
즉, 나노 비드(112)의 표면에 연결된 반응성 작용기인 아민기가 올리고-뉴클레오타이드의 말단에 형성되는 카르복실산기와 바로 반응하지 않으며, 나노 비드(112)의 표면에 연결된 아민기는 1차로 화학식 2의 구조를 갖는 카르복실산의 카르복실산기와 아마이드 결합을 형성한다. 이에 따라, 나노 비드(112)의 표면에 연결된 아민기와, 화학식 2의 구조를 갖는 카르복실산의 카르복실산기 사이에서 아마이드 결합이 특이적으로 형성될 수 있다.
본 발명에 따르면, 올리고-뉴클레오타이드(122)를 구성하는 염기는 나노 비드(112)와 직접 연결되지 않는다. 비드 결합체(100)를 구성하는 올리고-뉴클레오타이드(122)를 구성하는 염기는 나노 비드(112)와의 직접적인 결합에 의한 입체 장해가 억제된다. 이에 따라, 올리고-뉴클레오타이드(122)는 표적 핵산 분자와 효율적으로 혼성화되기 때문에, 본 발명의 비드 결합체(100)를 적용하여 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자의 존재 여부를 검출, 탐지할 수 있다.
반면, 나노 비드의 표면에 올리고-뉴클레오타이드를 축합(conjugation)하는 경우, 나노 비드와 올리고-뉴클레오타이드 사이에서 분자내 및/또는 분자간 입체 장해가 야기될 수 있다. 또한, 예를 들어, 나노 비드의 표면에 연결된 카르복실산기와 올리고-뉴클레오타이드의 일단에 변형된 아민기 사이에서 아마이드 결합을 가지도록 축합(conjugation)하고자 하는 경우, 나노 비드 표면에 연결된 카르복실산기는 올리고-뉴클레오타이드의 일단에 위치하는 아민기와 반응할 뿐만 아니라, 올리고-뉴클레오타이드를 구성하는 염기 중에서 아데닌(adenine), 사이토신(cytosine), 구아닌(guanine)에 존재하는 반응성 1차 아민기에도 반응하여 아마이드 결합을 형성한다. 즉, 나노 비드와 올리고-뉴클레오타이드 사이에서 아마이드 결합은 비-특이적으로 형성된다.
나노 비드와 올리고-뉴클레오타이드를 구성하는 염기 사이에 비-특이적인 아마이드 결합에 의하여, 올리고-뉴클레오타이드를 구성하는 염기에 입체 장해가 유발되고, 입체 장해가 유발된 염기를 포함하는 올리고-뉴클레오타이드는 표적 핵산 분자와 특이적인 혼성화가 효율적으로 이루어지지 못한다. 이에 따라, 나노 비드와 올리고-뉴클레오타이드 사이에 직접적인 아마이드 결합을 유도하는 경우, 올리고-뉴클레오타이드의 변형으로 인하여 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자의 존재 여부를 검출, 탐지하는데 한계가 있다.
계속해서, 본 발명에 따른 비드 결합체를 이용하여 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자의 존재를 분석하는 방법 및 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자를 정제하는 방법에 대하여 설명한다. 도 3은 본 발명의 예시적인 실시형태에 따라 제조된 비드 결합체를 이용하여 생물학적 샘플로부터 표적 핵산 분자를 분리하는 과정을 개략적으로 도시한 모식도이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 생물학적 샘플과 전술한 비드 결합체(100)를 반응시키고, 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자와 올리고-뉴클레오타이드(122)가 결합된 비드 결합체(100)를 분리하여, 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자를 선택적으로 분리, 정제할 수 있다.
예를 들어, 생물학적 샘플은 뇨(urine), 타액, 객담, 혈액 및 비인두 도말물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 생물학적 샘플 내에 존재하는 핵산 분자가 DNA 형태인 경우, 생물학적 샘플과 비드 결합체(100)가 반응하기 전에 생물학적 샘플 내의 핵산 분자를 단일 사슬 핵산 분자로 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 단일 사슬 핵산 분자로의 변형은 생물학적 샘플에 열을 가하여 수행될 수 있고, 이 경우 열처리는 70 내지 100℃에서 2 내지 10분간 수행될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
생물학적 샘플 내에는 표적 핵산 분자 이외에도, 다양한 비표적 핵산 분자가 존재할 수 있다. 본 발명에 따른 비드 결합체(100)의 외측에는 표적 핵산 분자와 혼성화할 수 있는 올리고-뉴클레오타이드(122)가 결합하고 있다. 따라서, 표적 핵산 분자가 존재하는 생물학적 샘플에 본 발명에 따른 비드 결합체(100)를 반응시키면, 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자만이 본 발명에 따른 비드 결합체(100)를 구성하는 올리고-뉴클레오타이드(122)에 특이적으로 결합한다. 반면, 생물학적 샘플 내에 존재하는 비표적 핵산 분자들은 본 발명에 따른 비드 결합체(100)에 결합하지 못하고, 생물학적 샘플 내에 자유 핵산 분자(free nucleic acid molecule)로 잔존한다.
이어서, 생물학적 샘플 중에서 본 발명에 따른 비드 결합체(100)와 특이적으로 결합한 표적 핵산 분자만을 분리, 정제할 수 있다. 예를 들어, 나노 비드(112)가 자성체로 이루어진 경우, 자석을 이용하여 비드 결합체(100)를 샘플 내에 잔존하는 비표적 핵산 분자와 분리할 수 있다. 이에 따라, 생물학적 샘플 내에 존재하는 핵산 분자 중에서 본 발명에 따른 비드 결합체(100)와 특이적으로 결합한 표적 핵산 분자만을 민감도 있게 분리, 정제할 수 있다.
전술한 실시형태에 따라 비드 결합체에 결합한 표적 핵산 분자만을 특이적으로 정제, 분리한 뒤, 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자의 존재 여부를 분석할 수 있다.
한편, 생물학적 샘플에서 분리, 정제된 비드 결합체(100)의 외측에 위치하는 올리고-뉴클레오타이드(112)에 표적 핵산 분자가 특이적으로 결합할 수 있다. 이 상태에서 표적 핵산 분자를 주형으로 하고, 올리고-뉴클레오타이드(122)를 프라이머(primer)로 사용하는 핵산 증폭 반응을 수행하면, 올리고-뉴클레오타이드(122)의 말단에서 표적 핵산 분자에 상보적인 뉴클레오타이드가 합성된다. 이에 따라, 표적 핵산 분자에 대응되는 다수의 핵산 분자가 증폭(amplification)되고, 증폭 산물의 존재 여부를 확인하여, 생물학적 샘플 내에 표적 핵산 분자의 존재 여부를 검출, 분석할 수 있다.
예를 들어, 올리고-뉴클레오타이드(122)가 특이적으로 결합하는 표적 핵산 분자는 병원체, 또는 암(cancer) 또는 종양(tumor)에서 유래할 수 있으며, DNA 또는 RNA 형태일 수 있다.
병원체에서 유래하는 핵산 분자는 병원체의 감염 여부를 나타내는 인자 또는 마커인 핵산 분자일 수 있다. 예를 들어, 병원체에서 유래하는 핵산 분자는 병원성 바이러스, 병원성 박테리아 또는 병원성 원생동물에서 유래하는 핵산 분자를 포함할 수 있다. 일례로, 표적 핵산 분자는 병원성 항원 또는 이의 단편, 이들의 변이체 또는 유도체를 포함하는 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자일 수 있다.
병원성 항원은 개체, 특히 포유동물 개체, 특히 인간 내 면역학적 반응을 일으키는 병원성 유기체, 특히 박테리아, 바이러스 또는 원생동물과 같은 병원성 유기체로부터 유래될 수 있다. 일례로, 병원성 항원은 박테리아, 바이러스 또는 원생동물 유기체의 표면에 위치한 표면 항원 또는 그 일부일 수 있다.
일례로, 병원성 항원은 감염성 질병과 관련된 병원체로부터 유도된 펩타이드 또는 단백질 항원일 수 있다. 보다 구체적으로, 병원성 항원은 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 아나플라즈마 속(Anaplasma genus), 아나플라즈마 파고사이토필리움(Anaplasma phagocytophilum), 브라질구충(Ancylostoma braziliense), 십이지장충(Ancylostoma duodenale), 용혈성 아카노박테리아균(Arcanobacterium haemolyticum), 회충(Ascaris lumbricoides), 아스페르길루스 속(Aspergillus genus), 아스트로비리다에(Astroviridae), 바베시아 속(Babesia genus), 탄저균(Bacillus anthracis), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 바르토넬라 헨셀라에(Bartonella henselae), BK 바이러스, 블라스토시스티스 호미니스(Blastocystis hominis), 블라스토미세스 더마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 백일해균(Bordetella pertussis), 보렐리아 부르그도르페리(Borrelia burgdorferi), 보렐리아 속(Borrelia genus), 보렐리아 종(Borrelia spp), 브루셀라 속(Brucella genus), 말레이사상충(Brugia malayi), 부니아바이러스 과(Bunyaviridae family), 부르크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia) 및 다른 부르크홀데리아 종, 부르크홀데리아 말레이(Burkholderia mallei), 부르크홀데리아 슈도말레이, 칼리시비리다에 과(Caliciviridae family), 캄필로박터 속(Campylobacter genus), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 칸디다 종(Candida spp), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis), 클라미도필라 뉴모니아(Chlamydophila pneumoniae), 클라미도필라 프시타시(Chlamydophila psittaci), CJD 프리온, 간흡충(Clonorchis sinensis), 클로스트리디움 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실리(Clostridium difficile), 클로스트리듐 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리듐 페르프린젠스, 클로스트리듐 종(Clostridium spp), 클로스트리듐 테타니(Clostridium tetani), 콕시디오이데스 종(Coccidioides spp), 코로나바이러스(coronaviruses), 디프테리아균(Corynebacterium diphtheria), 콕시엘라부르네티(Coxiella burnetii), 크리민 콩고 출혈열 바이러스(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus), 크립토콕쿠스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 크립토스포리디움 속(Cryptosporidium genus), 사이토메갈로바이러스(Cytomegalovirus, CMV), 뎅기 바이러스(Dengue viruses) (DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4), 이핵아메바(Dientamoeba fragilis), 에볼라바이러스(Ebolavirus, EBOV), 에키노코쿠스 종(Echinococcus genus), 에를리히아 샤펜시스(Ehrlichia chaffeensis), 엘리키아 에윈기(Ehrlichia ewingii), 엘리키아 속(Ehrlichia genus), 이질 아메바(Entamoeba histolytica), 장구균 속(Enterococcus genus), 장내 바이러스 속(Enterovirus genus), 장내 바이러스(Enteroviruses), 주로 콕사키 A 바이러스(Coxsackie A virus) 및 장내 바이러스 71 (EV71), 표피사상균 종(Epidermophyton spp), 엡스테인-바 바이러스(Epstein-Barr Virus, EBV), 대장균(Escherichia coli) O157:H7, O111 및 O104:H4, 간질(Fasciola hepatica) 및 거대 간질(Fasciola gigantica), FFI 프리온, 필라리오이데아 상과(Filarioidea superfamily), 플라비바이러스(Flaviviruses), 야토병균(Francisella tularensis), 푸소박테리움 속(Fusobacterium genus), 게오트리쿰 칸디둠(Geotrichum candidum), 지알디아편모충(Giardia intestinalis), 악구충속 종(Gnathostoma spp), GSS 프리온, 구아나리토 바이러스(Guanarito virus), 헤모필루스 듀크레이(Haemophilus ducreyi), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori), 헤니파바이러스(Henipavirus) (Hendra virus Nipah virus), 간염 A 바이러스, 간염 B 바이러스(HBV), 간염 C 바이러스(HCV), 간염 D 바이러스, 간염 E 바이러스, 단순포진 바이러스 1 및 2 (HSV-1 및 HSV-2), 히스토플라스마 캡슐라툼(Histoplasma capsulatum), HIV(인간 면역결핍 바이러스, Human immunodeficiency virus), 호르테아 웨넥키(Hortaea werneckii), 인간 보카바이러스(Human bocavirus)(HBoV), 인간 헤르페스 바이러스 6(Human herpesvirus 6, HHV-6) 및 인간 헤르페스 바이러스 7 (HHV-7), 인간 메타뉴모바이러스(Human metapneumovirus, hMPV), 인유두종바이러스(Human papillomavirus, HPV), 인간 파라인플루엔자 바이러스(Human parainfluenza viruses, HPIV), 인플루엔자 바이러스, 일본 뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), JC 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스, 킨젤라 킨가에(Kingella kingae), 클레브시엘라 글라눌로마티스(Klebsiella granulomatis), 쿠루 프리온(Kuru prion), 라싸 바이러스(Lassa virus), 레지오넬라 뉴모필라(Legionella pneumophila), 레슈마니아 속(Leishmania genus), 렙토스피라 속(Leptospira genus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 림프구성 맥락수막염바이러스(Lymphocytic choriomeningitis virus) (LCMV), 마츄포 바이러스(Machupo virus), 말라세지아 종(Malassezia spp), 마르부르그 바이러스(Marburg virus), 홍역 바이러스(Measles virus), 메타고니무스 요카가와이(Metagonimus yokagawai), 마이크로스포리디아 필룸(Microsporidia phylum), 전염성 연속종 바이러스(Molluscum contagiosum virus) (MCV), 귀밑샘염 바이러스(Mumps virus), 나균(Mycobacterium leprae) 및 마이코박테리아 레프로마토시스(Mycobacterium lepromatosis), 마이코박테리움 투베쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 우르세란스(Mycobacterium ulcerans), 마이코플라즈마 폐렴(Mycoplasma pneumoniae), 파울러 자유아메바(Naegleria fowleri), 아메리카 구충(Necator americanus), 임균(Neisseria gonorrhoeae), 수막염균(Neisseria meningitides), 노카디아 아스테로이드(Nocardia asteroids), 노카디아 종(Nocardia spp), 온코세르카 볼부루스(Onchocerca volvulus), 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia tsutsugamushi), 오르토믹소 바이러스과(Orthomyxoviridae family, 인플루엔자), 브라질 파라콕시디오이디즈(Paracoccidioides brasiliensis), 폐흡충종(Paragonimus spp), 폐디스토마(Paragonimus westermani), 파보바이러스(Parvovirus) B19, 파스퇴렐라 속(Pasteurella genus), 플라스모디움 속(Plasmodium genus), 폐포자충(Pneumocystis jirovecii), 폴리오바이러스(Poliovirus), 라비 바이러스(Rabies virus), 호흡기 합포체 바이러스(Respiratory syncytial virus, RSV), 리노바이러스(Rhinovirus), 리노바이러스, 리케치아 아카리(Rickettsia akari), 리케치아 속(Rickettsia genus), 발진티푸스 리케치아(Rickettsia prowazekii), 로키산 홍반열 리케치아(Rickettsia rickettsia), 발진열 리케치아(Rickettsia typhi), 리프트벨리열 바이러스(Rift Valley fever virus), 로타바이러스(Rotavirus), 풍진 바이러스(Rubella virus), 사비아 바이러스(Sabia virus), 살모넬라 속(Salmonella genus), 천공 개선충(Sarcoptes scabiei), SARS 코로나바이러스, 주혈흡충 속(Schistosoma genus), 중증열성혈소판감소증후군바이러스(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus, SFTSV), 시겔라 속(Shigella genus), 신놈브레 바이러스(Sin Nombre virus), 한타바이러스(Hantavirus), 스포로트릭스 셴키(Sporothrix schenckii), 스타필로코커스 속(Staphylococcus genus), 스타필로코커스 속, 스트렙토코커스 아갈락티아(Streptococcus agalactiae), 폐렴연쇄구균(Streptococcus pneumoniae)과 같은 폐렴균, 화농성연쇄구균(Streptococcus pyogenes), 분선충(Strongyloides stercoralis), 테니아 속(Taenia genus), 유구조충(Taenia solium), 진드기매개뇌염(Tickborne encephalitis virus, TBEV), 견회충(Toxocara canis) 또는 고양이 회충(Toxocara cati), 톡소플라즈마 곤디(Toxoplasma gondii), 트레포네마 팔리둠(Treponema pallidum), 선모충(Trichinella spiralis), 질트리코 모나스(Trichomonas vaginalis), 백선균 종(Trichophyton spp), 편충(Trichuris trichiura), 트리파노소마 브루세이(Trypanosoma brucei), 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi), 우레아플라즈마 우레알리티쿰(Ureaplasma urealyticum), 수두 대상 포진 바이러스(Varicella zoster virus) (VZV), 수두 대상 포진 바이러스 (VZV), 천연두 메이저(Variola major) 또는 천연두 마이너(Variola minor), vCJD 프리온, 베네스 웰라형 마뇌염 바이러스(Venezuelan equine encephalitis virus), 비브리오 콜레라(Vibrio cholera), 웨스트 나일 바이러스(West Nile virus), 서부형 마뇌염 바이러스(Western equine encephalitis virus), 반크로프트 사상충(Wuchereria bancrofti), 황열병 바이러스(Yellow fever virus), 여시니아 엔테로콜리티카(Yersinia enterocolitica), 여시니아 페스티스(Yersinia pestis), 및 여시니아 슈도투베르쿨로시스(Yersinia pseudotuberculosis)로부터 유도될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
올리고-뉴클레오타이드(122)가 특이적으로 결합하는 표적 핵산 분자가 암 또는 종양에서 유래할 수 있다. 예시적인 측면에서, 암 또는 종양에서 유래하는 표적 핵산 분자는 암 또는 종양에 특이적인 핵산 분자이거나, 암 또는 종양의 발병 여부를 나타내는 인자(factor) 또는 마커(marker)인 핵산 분자일 수 있다. 일례로, 암 또는 종양은 위암, 폐암, 간암, 대장암, 소장암, 피부암, 췌장암, 전립선암을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
선택적인 측면에서, 암 또는 종양에서 유래하는 표적 핵산 분자는 종양 항원 또는 이의 단편, 이들의 변이체 또는 유도체인 단백질 또는 펩타이드를 암호화하는 핵산 분자일 수 있다.
일례로, 암 또는 종양에서 유래하는 표적 핵산 분자는 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, 알파-5-베타-1-인테그린, 알파-5-베타-6-인테그린, 알파-액티닌-4/m, 알파-메틸아실-코엔자임 A 라세메이즈, ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, 베타-카테닌/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA125, 칼레티쿨린(calreticulin), CAMEL, CASP-8/m, 카뎁신 B(cathepsin B), 카뎁신 L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, 코액토신-유사 단백질, 콜라주(collage) XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, 사이클린 B1, 사이클린 D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEKCAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, 헵신, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HNE, 호메오박스 NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-L1, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, 미숙 라미닌 수용체, 칼리크레인(kallikrein)-2, 크레인-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, 맘마글로빈(mammaglobin) A, MART-1/멜란-A, MART-2, MART-2/m, 기질 단백질(matrix protein) 22, MC1R, M-CSF, ME1/m, 메소텔린(mesothelin), MG50/PXDN, MMP11, MN/CA IX-항원, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, 미오신 클래스 I/m, NA88-A, N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제-V, 네오-PAP, 네오-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, 오스테오칼신, 오스테오폰틴, p15, p190 마이너 bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PAP, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-키나제, Pin-1, Pml/PAR알파, POTE, PRAME, PRDX5/m, 프로스테인, 프로테이나제-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP-1, 서바이빈, 서바이빈-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGF베타, TGF베타RII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, 티로시나제, UPA, VEGFR1, VEGFR-2/FLK-1, WT1 및 림프성 혈구의 면역글로불린 유전자형 또는 림프구 혈구의 T 세포 수용체 유전자형, 이들의 단편, 이들의 변이체 또는 이들의 유도체를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이들의 전사체(transcript) 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
따라서, 본 발명은 또한 전술한 비드 결합체(100)를 포함하는 분석용 조성물을 이용하여 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자를 검출하는 분석 키트에 관한 것이다.
예를 들어, 분석 키트는 비드 결합체(100)를 구성하는 올리고-뉴클레오타이드(122)에 특이적으로 결합한 표적 핵산 분자와, 핵산 중합 효소 및 핵산 증폭 반응용 완충액을 포함하는 핵산 증폭 키트일 수 있다. 핵산 증폭 반응용 완충액은 비드 결합체(100) 및 핵산 중합 효소 이외에도, 디옥시리보뉴클레오타이드 트리포스페이트(dNTP) 및/또는 뉴클레오타이드 트리포스페이트(NTP), 핵산 증폭 반응에 따른 증폭 산물의 존재 여부를 검출할 수 있도록 형광 물질 및/또는 방사선 동위원소 등으로 표지된(labeled) 탐침(probe) 및 중합 효소 안정화제 등과 같은 기능성 첨가제를 더욱 포함할 수 있다.
중합 효소 안정화제는 소혈청알부민(bovine serum albumin, BSA)이나, 셀룰로오스, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스, 글리코사미노글리칸, 풀루란, 알긴산, 카라기난, 아리비노갈락탄, 헤미셀룰로오스, 덱스트란, 키토산, 글리콜 키토산, 전분 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 다당류를 포함할 수 있다. 핵산 증폭 반응용 완충액 중에 중합 효소 안정화제의 함량은 0.01 내지 10%(w/v), 예를 들어 0.5 내지 5%(w/v) 또는 0.5 내지 3%(w/v)의 농도로 포함될 수 있다. 중합 효소 안정화제의 함량이 전술한 범위를 충족할 때, 핵산 증폭 반응이 효율적으로 이루어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "중합 효소(polymerase)"는 일반적으로 중합 반응을 촉매하는 물질을 의미한다. 중합 효소는 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체의 도입에 의해 주형 가닥과 쌍-형성된 핵산 프라이머를 연장시키는데 사용될 수 있다. 중합 효소는 포스포디에스테르 결합의 생성을 통해서 한번에 하나씩 주형 가닥에 부응하는 새로운 뉴클레오타이드를 첨가하여, 존재하는 뉴클레오타이드 사슬의 3' 말단을 연장시킴으로써 DNA의 새로운 가닥을 첨가할 수 있다.
이러한 핵산 중합 효소는 해당 중합 효소를 이용하여 표적 핵산 분자의 증폭 반응이 수행될 수 있다면, 특별히 제한되지 않는다. 보다 구체적으로, 중합 효소는 DNA 중합 효소, RNA 중합 효소, 열안정성 중합 효소, 야생형 중합 효소 및 변형 중합 효소를 포함한다. 보다 구체적으로, 중합 효소는 E. coli DNA 중합효소 I의 "클레나우(Klenow) 단편", 박테리오파아지 T7 DNA 중합 효소, 박테리오파지 T4 DNA 중합 효소, 029 (phi29) DNA 중합 효소제, Taq 중합 효소, Tth 중합 효소, Tli 중합 효소, Pfu 중합 효소, Pwo 중합 효소, VENT 중합 효소, DEEPVENT 중합 효소, EXTaq 중합 효소, LA-Taq 중합 효소, Sso 중합 효소, Poc 중합 효소, Pab 중합 효소, Mth 중합 효소, ES4 중합 효소, Tru 중합 효소, Tac 중합 효소, Tne 중합 효소, Tma 중합 효소, Tea 중합 효소, Tih 중합 효소, Tfi 중합 효소, 플래티늄 Taq 중합 효소, Tbr 중합 효소, Tfl 중합 효소, Pfutubo 중합 효소, Pyrobest 중합 효소, Pwo 중합 효소, KOD 중합 효소, Bst 중합 효소, Sac 중합 효소, 3'에서 5'으로의 엑소뉴클레아제 활성을 갖는 중합 효소, 및 이의 변이체 및 유도체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 일례로, 중합 효소는 다양한 박테리아 종으로부터 얻을 수 있는 열안정성 DNA 중합효소로서, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 및/또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일례로, 핵산 증폭 반응용 완충액에 중합 효소와, dNTP 및/또는 NTP는 프리믹스(premix) 형태로 상용화된 것을 사용할 수 있다. 일례로, 핵산 중합 효소와 dNTP (및/또는 NTP)는 핵산 증폭 반응용 완충액 중에 5 내지 40%(w/v), 예를 들어 10 내지 33%(w/v) 또는 15 내지 25%(w/v)의 함량으로 포함될 수 있다.
핵산 증폭 반응용 완축액에는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 및/또는 NTP 혼합물(ATP, CTP, GTP, TTP), 기타 핵산 증폭 반응 첨가제 및 핵산 중합효소 조인자를 포함할 수 있다. 핵산 증폭 반응을 수행할 때, 반응 용기에 반응에 필요한 성분들을 과량으로 공급하는 것이 바람직할 수 있다. 핵산 증폭 반응에 필요한 성분들의 과량은, 증폭 반응이 성분의 농도에 실질적으로 제한되지 않는 정도의 양을 의미한다. Mg2+와 같은 조인자, dNTP를 원하는 증폭 반응이 달성될 수 있을 정도로 반응액에 공급될 수 있다.
예를 들어, 핵산 증폭 반응에서 어닐링(annealing)은 표적 핵산 분자의 뉴클레오타이드 서열과 프라이머 서열 사이에 특이적 결합을 가증하게 하는 엄격한 조건 하에서 수행된다. 용어 어닐링 또는 프라이밍(priming)은 주형 핵산 분자에 올리고 뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 이에 따라 중합 효소가 뉴클레오타이드를 중합하여 주형 핵산 분자 또는 그 단편에서 상보적인 핵산 분자가 형성된다. 어닐링을 위한 엄격한 조건은 서열-의존적이며 주위 환경적 변수에 따라 다양하다. 예시적인 측면에서 핵산 증폭 반응용 완충액 중에 본 발명에 따른 비드 결합체(100)는 5 내지 40%(w/v), 예를 들어 5 내지 30%(w/v) 또는 5 내지 20%(w/v)의 농도로 포함될 수 있다.
필요한 경우, 핵산 증폭 반응용 완충액은 핵산 증폭 반응용 첨가제를 더욱 포함할 수 있다. 일례로, 핵산 증폭 반응용 첨가제는 만니톨(mannitol), 폴리에틸렌글리콜(예를 들어, PEG 10,000), 트레할로오스, 베타인 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다. 이때, 핵산 증폭 반응용 완충액 중에 상기 핵산 증폭 반응용 첨가제는 0.5 내지 30%(w/v), 예를 들어 0.5 내지 20%(w/v) 또는 1 내지 15%(w/v)의 농도로 첨가될 수 있다.
핵산 증폭 반응용 완충액은 핵산 증폭 반응을 위한 적절한 완충제를 포함할 수 있다. 완충제의 종류는 특별히 한정되지 않지만, 유기산, 글리신, 히스티딘, 글루타메이트, 숙시네이트, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 트리스(예를 들어, 트리스-EDTA), HEPES(Hydroxyethyl Piperazine Ethane Sulfonic acid), 아미노산 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택될 수 있다.
증폭된 표적 핵산 분자는 검출 가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 하나의 예시적인 측면에서, 표지 물질은 형광, 인광, 화학발광단 또는 방사성을 방출하는 물질일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 일례로, 표지 물질은 루오리신(fluorescein), 피코에리트린(phycoerythrin), 로다민(rhodamine), 리사민(lissamine) Cy-5 또는 Cy-3일 수 있다.
표적 핵산 분자를 증폭할 때, 올리고-뉴클레오타이드(122)의 5'-말단 및/또는 3' 말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하고, 핵산 증폭 반응(예를 들어, 실시간 중합효소연쇄반응)을 수행하면, 표적 핵산이 검출 가능한 형광 표지 물질로 표지될 수 있다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 핵산 증폭 반응(예를 들어, 실시간 중합효소연쇄반응)을 수행할 때, P32 및/또는 S35 등과 같은 방사성 동위원소를 본 발명에 따른 핵산 증폭 반응용 완충액에 첨가하여, 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다.
표지는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 실시되는 다양한 방법을 이용할 수 있다. 예를 들어, 닉 트랜스레이션(nick translation) 방법, 무작위 프라이밍 방법(Multiprime DNA labelling systems booklet, "Amersham"(1989)) 및 카이네이션 방법(Maxam & Gilbert, Methods in Enzymology, 65:499(1986))을 통해 수행될 수 있다. 표지는 형광, 방사능, 인광, 발색 측정, 중량 측정, X-선 회절 또는 흡수, 자기, 효소적 활성, 매스 분석, 결합 친화도, 혼성화 고주파, 나노-크리스탈에 의하여 검출할 수 있는 신호(signal)을 제공한다
핵산 증폭 반응, 예를 들어 중합효소연쇄반응(PCR)과 관련하여, 표적 핵산 분자와 올리고-뉴클레오타이드(122) 이중 사슬 분리를 위한 열변성(denaturation), 결합(annealing) 및 중합 반응(polymerization)은 올리고-뉴클레오타이드(122) 및 이에 특이적으로 결합하는 표적 핵산 분자의 조성 및 길이에 따라 적절하게 조정, 제어될 수 있다.
생물학적 샘플 내에 존재할 수 있는 표적 핵산 분자를 증폭시킬 수 있다면, 핵산 증폭 반응은 특별히 한정되지 않는다. 일례로, 핵산 증폭 반응은, 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR), 역전사-중합효소연쇄반응(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR), 역전사 반응(Reverse Transcription), 상보적 DNA 합성(Complementary DNA Synthesis), 복구 연쇄 반응(repair chain reaction), 멀티플렉스 PCR, 전사-중재 증폭(transcription-mediated amplification; TMA), 자가 유지 염기서열 복제(self-sustained sequence replication)), 타깃 폴리뉴클레오타이드 염기서열의 선택적 증폭(selective amplification of target polynucleotide sequences), 컨센서스 서열 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(consensus sequence primed polymerase chain reaction; CP-PCR), 임의적 프라이밍 중합효소 연쇄 반응(arbitrarily primed polymerase chain reaction; AP-PCR, 루프-매개 등온 증폭(Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP), 실시간 염기순서기반 증폭(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification, NASBA), 가닥 변위 증폭(Strand Displacement Amplification, SDA), 다중 변위 증폭(Multiple Displacement Amplification, MDA), 회전환 증폭(Rolling Circle Amplification, RCA), 리가아제 연쇄반응(Ligase Chain Reaction, LCR), 헬리카제 의존형 증폭(Helicase Dependent Amplification, HDA), 분지-연장 증폭법(Ramification-extension Amplification Method, RAM), 전사 기반 증폭 시스템(in vitro transcription-based amplification system, TAS) 및 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
선택적인 실시형태에서, 비드 결합체(100)를 구성하는 올리고-뉴클레오타이드(122)와 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자의 결합 여부를 검출하기 위한 분석 키트는 전기영동 키트 또는 차세대 염기서열분석(next generation sequencing, NGS) 키트일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
이하, 예시적인 실시형태를 통하여 본 발명을 설명하지만, 본 발명이 하기 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되지 않는다.
합성예 1: 비드 결합체의 합성
아민 작용기가 표면에 연결된 나노 비드(실리카 비드, 바이오니아) 100 mg/ml의 농도로 100 mM MES buffer (pH 5.5) 1 ml에 분산시켰다. 나노 비드 표면의 아민기와 6-maleimidohexanic acid의 carboxyl기의 carbodiimide 반응을 이용하여, 나노 비드 표면에 아마이드 결합을 갖는 연결기로 1차 변형하기 위하여, EDC, NHS를 나노 비드 표면에 연결된 아미노기 100배의 몰당량 만큼 4 ml의 MES buffer에 용해시켰다. 그 후 용액을 나노 비드가 분산된 용액에 점적하여 12-24시간 실온에서 반응시켰다. 반응이 완료된 후, MES 버퍼를 사용하여 3회 washing하고, pH 7.4 100 mM tris 버퍼에 보관하였다. 1차 연결기 변형 반응이 완료된 중간체 나노 비드 표면의 maleimide기와 프라이머를 연결하기 위하여 5'말단이 1-헥실 티올기로 변형된 프라이머(인유두종바이러스(HPV) L1 영역에 특이적인 서열, 한국 코스모진텍에서 구입)를 이용하였다. 5'말단이 1-헥실 티올기로 변형된 프라이머(5'- TTTITIACIKKIGTIGAYACIAC - 3', 서열식별번호: 1, I는 ideoxyl thyimine, GP5+ 프라이머 또는 Thiol GP5+ 프라이머)를 1 ㎛ 농도의 Tris(2-carboxylethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)가 용해된 pH 7.4 버퍼에서 2시간 동안 환원시켰다. Maleimide기를 가지도록 1차 변형된 나노 비드 10 mg과 티올기가 부여된 프라이머 10 nM을 pH 7.4 tris 버퍼에서 12-24시간 실온 반응시켰다. 반응이 완료된 나노 비드를 tris 버퍼를 사용하여 3회 washing하고, 10 mg/ml의 농도로 pH 8.0 tris 버퍼에 보관하였다. 이하, 합성예 1에서 제조된 비드 결합체를 Thiol GP5+_NH2 비드로 지칭한다.
합성예 2: 비드 결합체의 합성
GP5+ 프라이머를 대신하여, 5' 말단이 1-헥실 티올기로 변형된 프라이머(5'- GAAAIAYIAAITGYAIIWCRWAYTCYTC - 3', 서열식별번호: 2, 이하, GP6+ 프라이머 또는 Thiol GP6+ 프라이머)를 사용한 것을 제외하고, 합성예 1의 절차를 반복하여 비드 결합체를 제조하였다. 이하, 합성예 2에서 제조된 비드 결합체를 Thiol GP6+_NH2 비드로 지칭한다.
비교 합성예 1: 아미노기 결합 나노 비드
아민기가 표면에 연결된 나노 비드를 표면 개질 및 프라이머와의 연결 없이 그대로 사용하였다. 이하, 비교 합성예 1의 나노 비드를 NH2 비드로 지칭한다.
비교 합성예 2: 아마이드 결합 나노 비드
나노 비드 표면에 연결된 아미노기와, 6-maleimidohxexanoic acid의 carboxyalic acid의 carboiimide 반응을 이용하여 나노 비드 표면에 아마이드 결합을 갖는 연결기로 표면 개질된 나노 비드를 사용하였다. 이하, 비교 합성예 2에서 제조된 나노 비드를 NH2-Maleimide 비드로 지칭한다.
비교 합성예 3: 하이드록시기 실리카 비드
하이드록시기가 표면에 존재하는 나노 비드(실리카 비드, 바이오니아)를 표면 개질 및 프라이머와의 연결 없이 그대로 사용하였다. 이하, 비교 합성예 3에서 제조된 비드를 COOH 비드로 지칭한다.
비교 합성예 4: 아마이드 비드 결합체 합성
카르복실산이 표면에 존재하는 나노비드(COOH 마그네틱 비드, 바이오니아)와 3'말단을 아민기로 치환한 올리고-뉴클레오타이드를 carbodiimide 반응을 이용하여 결합하였다. 카르복실산이 표면에 연결된 나노 비드(실리카 비드, 바이오니아) 100 mg/ml의 농도로 100 mM MES buffer (pH 5.5) 1 ml에 분산시켰다. 나노 비드 표면의 카르복실기와 프라이머를 연결하기 위하여 5' 말단이 아민기로 변형된 프라이머 (인유두종바이러스(HPV) L1 영역에 특이적인 서열, GP5+ 프라이머, 한국 코스모진텍에서 구입)를 이용하였다. 합성예 1의 절차를 반복하여 비드 결합체를 제조하였다. 비교 합성예 4에서 제조된 비드 결합체를 NH2 GP5+_COOH 비드로 지칭한다.
비교 합성예 5: 비드 결합체의 제조
GP5+ 프라이머를 대신하여, 5'말단이 아미노기로 변형된 GP6+ 프라이머를 사용한 것을 제외하고, 합성예 1의 절차를 반복하여 비드 결합체를 제조하였다. 이하, 비교 합성예 5에서 제조된 비드 결합체를 NH2 GP6+_COOH 비드로 지칭한다.
비교 합성예 6: 실리카 비드
표면에 작용기로 개질되지 않은 나노 비드 (실리카 비드, 바이오니아)를 표면 개질 및 프라이머와의 연결 없이 그대로 사용하였다. 비교 합성예 6에서 제조된 비드를 실리카 비드로 지칭한다.
실시예 1: 비드 결합체의 평균 입자 크기 측정
합성예 1 및 합성예 2에서 각각 최종적으로 제조된 비드 결합체와, 비교 합성예 1-5에서 각각 제조된 비드 결합체의 평균 입자 크기를 동적광산란(dynamic light scattering, DLS) 방법을 이용하여 측정하였다. 비드 결합체 및 실리카 비드의 평균 입자 크기를 측정한 결과를 도 4에 나타낸다. 도 4에 나타낸 바와 같이, 합성예 1 및 합성예 2에 따라 나노 비드 표면에서 아마이드 결합 및 설파이드 결합을 통하여 프라이머가 conjugation된 비드 결합체의 크기가 크게 증가한 것을 확인하였다.
실시예 2: 비드 결합체의 평균 표면전하 측정
합성예 1 및 합성예 2에서 각각 최종적으로 제조된 비드 결합체와, 비교 합성예 1-5에서 각각 제조된 비드 결합체의 평균 표면전하를 Zetasizer를 이용하여 측정하였다. 측정 결과를 도 5에 나타낸다. 측정 결과로부터, 나노 비드 표면의 연결기가 변경됨에 따라 평균 표면 전하가 변경된 것을 확인하였다.
실시예 3: 임상 검체를 이용하여 표적 핵산 분자의 추출 효율 평가
합성예 1 및 합성예 2에서 각각 제조된 비드 결합체와, 비교 합성예 3 내지 6에서 각각 제조된 비드 결합체의 핵산 분자의 분리 가능성을 확인하기 위해, 세포 유리 DNA(cell free DNA, cfDNA)의 포집 및 회수 효율을 평가하였다. 합성예 1 및 합성예 2에서 각각 제조된 비드 결합체가 특정 cfDNA에 특이적으로 결합하는 것을 확인하기 위하여 HPV 및 성매개병(sexually transmitted disease, STD) 양성이력이 있는 질 분비물 (cervix swab) 검체를 준비하였다. 추출 실험은 음성 소변에 준비한 검체를 희석하여 진행하였다. 비드 결합체의 cfDNA 최적 추출 pH (8-9)를 고려하여, pH 8.5 1M tris 완충액, 200 mM EDTA (ethylenediamine-N, N, N', N'- tetraacetic acid) 용액을 1:9 비율로 소변과 섞어주었다. Kingfisher Magmax 96 Cell-free DNA isolation kit를 이용하여 Kingfisher 장비를 이용하여 kingfisher magmax protocol을 이용하여 추출을 진행하였다.
(1) PCR을 이용한 cfDNA 추출 효율 평가
위에서 추출한 cfDNA 중에서 HPV cfDNA와 STD cfDNA의 증폭 여부를 확인하기 위하여 추출 용액에 Taq polymerase, primer, probe, dNTP, EvaGreen을 넣고 실시간 PCR(real time PCR, RT-PCR)을 진행하였다. HPV PCR의 경우, Invitrogen사의 platinum Ⅱ Hot start DNA Taq polymerase, dNTP, MgCl2 가 혼합된 mixture 12 μl, 자사의 GP5 & GP6 타겟팅 서열이 들어간 primer 5 μl, TE buffer 0.8 μl, EvaGreen 1.2 μl, urine 추출물 5 μl를 사용하였다. 핵산 증폭 반응을 수행하기 위하여, 각각의 샘플을 95℃에서 10분 동안 처리하고, 95℃에서 20초, 50℃에서 30초, 72℃에서 40초의 핵산 증폭 사이클을 45회 수행하고, 마지막으로 60~95℃에서 5초 처리하였다.
STD PCR의 경우, 자사의 Ezplex○R STD PCR Kit(체외 제허 18-828 호 분류번호[등급]: N05030.01[3])를 사용하였다. STD RQ mixture 10μl, Primer mix 6μl, urine 추출물 4μl를 사용하였다. 핵산 증폭 반응을 수행하기 위하여, 각각의 샘플을 25℃에서 2분, 50℃에서 2분, 95℃에서 10분 동안 순차 처리하고, 95℃에서 20초, 60℃에서 1분의 핵산 증폭 사이클을 40회 수행하였다. 본 실시예에 따른 핵산 증폭 측정 결과를 도 6에 나타낸다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 합성예 1 및 합성예 2에 따라 HPV L1 영역에 특이적인 프라이머가 결합된 비드 결합체는, HPV cfDNA에 대하여, 특이적 프라이머와 결합하지 않은 비교 합성예 3의 COOH 비드 또는 비교 합성예 6의 실리카 비드에 비하여 Cq값이 앞서 있음을 확인하였다. 반대로 STD cfDNA의 경우, 비교 합성예 1의 COOH 비드 또는 비교 합성예 6의 실리카 비드가 합성예 1 및 합성예 2의 비드 결합체에 비하여 Cq값이 앞서 있음을 확인하였다. 한편, 비교 합성예 4-5에서 연결기 없이 아미노기와 카르복실산기 사이에서 아마이드 결합을 형성한 비드 결합체와 비교해서, 합성예 1, 2에서 합성한 비드 결합체가 의도하였던 HPV 핵산을 보다 신속하고 효율적으로 증폭시켰다. 이러한 결과로부터 합성예 1 및 합성예 2의 비드 결합체가 비교합성예의 비드 또는 비드 결합체에 비하여 HPV cfDNA에 훨씬 특이적으로 결합한 것을 확인하였다.
(2) 전기영동을 이용한 cfDNA 추출 효율 평가
위에서 추출한 cfDNA 중에서 HPV cfDNA와 STD cfDNA를 확인하기 위하여 추출한 용액을 4 ㎕씩 로딩(loading)하여, 150V에서 20분간 전기영동을 수행하였다. 전기영동 평가 결과를 도 7에 나타낸다.
HPV의 경우, Invitrogen사의 platinum Ⅱ Hot start DNA Taq polymerase, dNTP, MgCl2 가 혼합된 mixture 12 μl, 자사의 GP5 & GP6 타겟팅 서열이 들어간 primer 5 μl, TE buffer 2 μl, urine 추출물 5 μl를 사용하여 실시간 PCR를 진행하였다. 실시간 PCR 진행 후 샘플 내의 효적 핵산을 증폭한 후, 아가로스 겔 상에서 전기영동 (150V, 20분)을 수행하였다. 실시간 핵산 증폭 반응(PCR)을 수행하기 위하여, 각각의 샘플을 95℃에서 5분 동안 처리하고, 95℃에서 20초, 50℃에서 30초, 72℃에서 40초의 핵산 증폭 사이클을 45회 수행하고, 마지막으로 60℃에서 5분, 10℃에서 순차 처리하였다.
STD PCR의 경우, 자사의 Ezplex○R STD PCR Kit(체외 제허 18-828 호 분류번호[등급]: N05030.01[3])를 사용하였다. STD RQ mixture 8 μl, Primer mix 2 μl, Internal control 2 μl, urine 추출물 4 μl를 사용하였다. 핵산 증폭 반응을 수행하기 위하여, 5℃에서 2분, 94℃에서 10분 동안 처리하고, 94℃에서 20초, 62℃에서 80초, 72℃에서 1분의 핵산 증폭 사이클을 40회 수행하고, 마지막으로 72℃에서 5분, 4℃에서 순차 처리하였다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 합성예 1 및 합성예 2에서 합성한 비드 결합체에 HPV의 밴드가 선명하게 나타났고, 비교 합성예 6의 실리카 비드에 비하여 STD 밴드가 선명하게 나타났다. 이러한 결과로부터 합성예 1 및 합성예 2에서 각각 제조한 비드 결합체가 비교 합성예에서 제조된 비드 또는 비드 결합체에 비하여 훨씬 특이적으로 HPV cfDNA와 결합하는 것을 확인하였다.
상기에서는 본 발명의 예시적인 실시형태 및 실시예에 기초하여 본 발명을 설명하였으나, 본 발명이 상기 실시형태 및 실시예에 기재된 기술사상으로 한정되는 것은 아니다. 오히려 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 전술한 실시형태 및 실시예를 토대로 다양한 변형과 변경을 용이하게 추고할 수 있다. 하지만, 이러한 변형과 변경은 모두 본 발명의 권리범위에 속한다는 점은, 첨부하는 청구범위에서 분명하다.
100: 비드 결합체
110: 초기 비드
112: 나노 비드
114: 비드 중간체
120: 변형 올리고-뉴클레오타이드
122: 올리고-뉴클레오타이드
L, L1: 연결기(linker)

Claims (20)

  1. 표적 핵산 분자에 특이적으로 결합하는 올리고-뉴클레오타이드의 일 말단이 나노 비드 표면에 축합(conjugation)한 비드 결합체로서, 상기 나노 비드의 표면과 상기 올리고-뉴클레오타이드의 5' 말단 사이에 하기 화학식 1의 구조를 갖는 연결기가 개재되어 있는 비드 결합체.
    [화학식 1]
    Figure pat00011

    (화학식 1에서 R1은 직접 결합 또는 C1-C20 지방족 탄화수소기임; R2 및 R3는 각각 독립적으로 C3-C20 2가의 지방족 탄화수소 연결기임; R1 왼쪽의 별표는 나노 비드 표면에 연결되는 부위를 나타내고, R3 우측의 별표는 올리고-뉴클레오타이드의 5' 말단에 연결되는 부위를 나타냄.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 R1은 직접 결합, 또는 C1-C10 알킬기, C2-C20 알케닐기, C2-C20 알키닐기 및 C1-C20 알킬 에테르기에서 선택되는 지방족 탄화수소기인 비드 결합체.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 R2 및 R3는 각각 독립적으로 C3-C20 알킬렌기인 비드 결합체.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 나노 비드는 무기 소재로 이루어지는 비드 결합체.
  5. 제 4항에 있어서,
    상기 무기 소재는 산화철, 실리카, 유리 또는 이들의 조합으로 구성되는 군에서 선택되는 비금속 소재, 및 금, 은, 구리 이들의 조합 및 이들의 합금으로 구성되는 군에서 선택되는 금속 소재 중에서 적어도 하나인 비드 결합체.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 나노 비드는 유기 소재로 이루어지는 비드 결합체.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 유기 소재는 폴리스틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리 아크릴 아마이드, 이들의 조합 또는 이들의 공중합체로 구성되는 군에서 선택되는 고분자 수지, 및 플루란, 플루란 아세테이트, 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 아가로즈, 키토산, 이들의 조합 및 이들의 공중합체로 구성되는 군에서 선택되는 다당류 중에서 적어도 하나인 비드 결합체.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 나노 비드는 자성체로 이루어지는 비드 결합체.
  9. 제 1항에 있어서,
    상기 표적 핵산 분자는 종양 또는 병원체에서 유래하는 비드 결합체.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 병원체는 병원성 바이러스, 병원성 박테리아 또는 병원성 원생동물을 포함하는 비드 결합체.
  11. 제 1항에 있어서,
    상기 표적 핵산 분자는 인유두종바이러스(human papillomavirus)에서 유래하는 비드 결합체.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 하나의 청구항에 기재된 비드 결합체를 포함하는, 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자를 검출하는 분석 키트.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 뇨(urine), 타액, 객담, 혈액 및 비인두 도말물을 포함하는 분석 키트.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 분석 키트는 상기 비드 결합체를 구성하는 상기 올리고-뉴클레오타이드에 특이적으로 결합한 표적 핵산 분자와, 핵산 중합 효소 및 핵산 중합 반응용 완충 용액을 포함하는 핵산 증폭 키트인 분석 키트.
  15. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 하나의 청구항에 기재된 비드 결합체를 생물학적 샘플과 반응시키는 단계;
    상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산과 상기 올리고-뉴클레오타이드가 결합된 상기 비드 결합체를 분리하는 단계; 및
    상기 올리고-뉴클레오타이드와 상기 표적 핵산 분자의 결합 여부를 검출하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자를 분석하는 방법.
  16. 제 15항에 있어서,
    상기 올리고-뉴클레오타이드와 상기 표적 핵산 분자의 결합 여부를 검출하는 단계는, 상기 올리고-뉴클레오타이드에 결합된 표적 핵산 분자를 주형으로 사용한 핵산 증폭 반응을 수행하는 단계를 포함하는 방법.
  17. 제 15항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 상기 표적 핵산 분자와 상기 올리고-뉴클레오타이드가 결합된 비드 결합체를 분리하는 단계는 자석을 이용하여 수행되는 방법.
  18. 제 15항에 있어서,
    상기 비드 결합체를 상기 생물학적 샘플과 반응시키는 단계 이전에, 상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 핵산 분자를 단일 가닥 핵산 분자로 변형시키는 단계를 더욱 포함하는 방법.
  19. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 하나의 청구항에 기재된 비드 결합체를 생물학적 샘플과 반응시키는 단계; 및
    상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 표적 핵산 분자와 상기 올리고-뉴클레오타이드가 결합된 상기 비드 결합체를 분리하는 단계를 포함하는 생물학적 샘플 내에서 표적 핵산 분자를 정제하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플 내에 존재하는 상기 표적 핵산 분자와 상기 올리고-뉴클레오타이드가 결합된 상기 비드 결합체를 분리하는 단계는 자석을 이용하여 수행되는 방법.
KR1020220116193A 2021-08-10 2022-09-15 비드 결합체, 제조 방법, 이를 포함하는 생물학적 분석 시스템 및 분석 방법 KR20230024862A (ko)

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AU2002359645A1 (en) * 2001-12-07 2003-07-09 University Of Massachusetts Targeted genetic risk-stratification using microarrays
KR100541916B1 (ko) * 2003-03-24 2006-01-10 바이오코아 주식회사 인유두종바이러스(ｈｐｖ)유전자형 분석용 서스펜션어레이 마이크로스피어 비드 조성물 및 그 검사 방법
US7968085B2 (en) * 2004-07-05 2011-06-28 Ascendis Pharma A/S Hydrogel formulations
KR20180007432A (ko) * 2016-07-13 2018-01-23 안웅식 Hpv 지노타이핑 다중분석 루미넥스 키트 및 이를 이용한 인유두종 바이러스의 유전자 검출 방법
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