KR20230021699A - 항-nme 항체 및 암 또는 암 전이의 치료 방법 - Google Patents

항-nme 항체 및 암 또는 암 전이의 치료 방법 Download PDF

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신시아 밤다드
브누아 스마게
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미네르바 바이오테크놀로지 코포레이션
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Abstract

본 출원은 항-NME 항체 및 질환의 치료 또는 예방에서의 이의 용도를 개시한다.

Description

항-NME 항체 및 암 또는 암 전이의 치료 방법
본 출원은 NME 단백질, NME 단백질로부터 유래된 펩타이드 및 이의 펩타이드로부터 생성된 항체 또는 상기 펩타이드에 결합하는 능력에 의해 선택되는 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다. 본 출원은 또한 환자에서 NME의 발현과 연관된 질환을 치료하거나 예방하는 것에 관한 것이다.
NDPK(뉴클레오사이드 다이포스페이트 단백질 키나제(nucleoside diphosphate protein kinase)) 단백질은, 이들이 모두 NDPK 도메인을 함유하기 때문에 함께 그룹으로 엮인 단백질 패밀리이다. 발견된 첫 번째 NME 단백질은 이전에는 NM23 단백질로 불렸으며, NM23-H1 및 NM23-H2이었다. 수십 년 동안, 이들이 조혈 세포의 분화를 유도하는지 또는 분화를 방지하였는지는 불분명하였다. 본 발명자들은 이전에, NM23-H1이 이량체인 경우 MUC1* 성장 인자 수용체에 결합하여 분화를 방지하지만, 보다 높은 농도에서 NM23-H1은 육량체가 되며, MUC1*에 결합하지 않고, 분화를 유도함을 발견하였다. NM23은 이것이 일부 매우 공격적인 암에서 하향-발현되는 것을 발견하였 때, 전이 억제자로 지칭되었던 적도 있다. 본 발명자들은 이전에, NM23-H1 이량체가 대부분의 암에서 과발현되는 MUC1* 성장 인자 수용체의 세포외 도메인에 결합하여, 이를 이량체화하고, 이러한 결합이 암 세포의 성장을 촉진한다는 것을 발견하였다. 역으로, 보다 고농도에서, NM23은 MUC1*에 결합하지 않는 사량체 및 육량체를 형성하고, 종양 형성을 촉진하지 않는다. 매우 최근에 보다 많은 NME 패밀리 단백질(NME 1 내지 NME 10)이 발견되었지만, 현재까지 이들의 기능은 설명되지 않고 있다. NME7은 새로 발견된 NME 패밀리 단백질이지만, 이의 NDPK 도메인은 다른 NME 패밀리 구성원과는 달리 효소 활성을 갖지 않는다. NME7은 성인 조직에서 전혀 발현되지 않거나 극도로 낮은 수준으로 발현된다.
본 출원은 NME 패밀리의 구성원에 대해서 제조된 항체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. NME 패밀리는 NME7 패밀리일 수 있다. 항체는 NME7에 결합할 수 있다. NME7AB 또는 NME7AB-유사 단백질에 결합할 수 있다. 항체는 NME7-X1에 결합할 수 있다. 항체는 NME7과 이의 동족 결합 파트너(cognate binding partner) 사이의 결합을 저해할 수 있다. 동족 결합 파트너는 MUC1*일 수 있다. 동족 결합 파트너는 MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 부분일 수 있다. 일 양상에서, 도 6 내지 도 9에 열거된 것들(서열번호 88 내지 145)로부터 선택되는 펩타이드에 결합하는 항체가 생성되거나, 이러한 능력에 대해 선택될 수 있다. 바람직하게는, 펩타이드는 도 9에 열거된 펩타이드(서열번호 141 내지 145)로부터 선택될 수 있다.
펩타이드는, 도 6 내지 도 9에 열거된 펩타이드(서열번호 88 내지 145)에 고도로 상동성인 펩타이드, 또는 이러한 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 잔기가 첨가되거나 제거된 펩타이드일 수 있다. 일 양상에서, 항체는 NME1이 아닌 NME7AB 또는 NME7-X1에 결합하는 능력에 대해 선택될 수 있다. 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 2가 항체, 1가 항체, 이중특이적 항체, 가변 영역을 함유하는 항체 단편 또는 항체 모방체일 수 있다. 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 항체는 단쇄 scFv일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 NME7AB의 영역에 고도로 상동성이거나 이와 동일한 펩타이드를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체의 암을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 펩타이드는 도 6에 열거된 펩타이드 중 하나 이상과 적어도 80% 상동성일 수 있다. 펩타이드는 도 7에 열거된 펩타이드 중 하나 이상과 적어도 80% 상동성일 수 있다. 펩타이드는 도 8에 열거된 펩타이드 중 하나 이상과 적어도 80% 상동성일 수 있다. 펩타이드는 도 9에 열거된 펩타이드 중 하나 이상과 적어도 80% 상동성일 수 있다. 펩타이드는 도 6 내지 도 9에 열거된 펩타이드(서열번호 88 내지 145)로부터 선택될 수 있다. 펩타이드는 도 9에 열거된 펩타이드(서열번호 141 내지 145)로부터 선택될 수 있다. 또는, 펩타이드는, 도 6 내지 도 9에 열거된 펩타이드(서열번호 88 내지 145)에 고도로 상동성인 펩타이드, 또는 이러한 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 잔기가 첨가되거나 제거된 펩타이드일 수 있다. 펩타이드는 스페이서 또는 링커를 통해 또 다른 펩타이드에 연결될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이며, 여기서 CAR의 표적화 세포외 부분은 NME 패밀리의 구성원의 적어도 하나의 펩타이드 단편을 포함한다. NME 패밀리는 NME7 패밀리일 수 있다. NME7 패밀리의 구성원은 NME7일 수 있다. 또는, NME7 패밀리의 구성원은 NME7AB 또는 NME7AB-유사 단백질일 수 있다. NME7 패밀리의 구성원은 또한 NME7-X1일 수 있다. CAR의 표적화 세포외 부분은 도 6 내지 도 9에 열거된 펩타이드(서열번호 88 내지 145) 중의 펩타이드를 포함할 수 있다. 펩타이드는 도 9에 열거된 펩타이드(서열번호 141 내지 145)로부터 선택될 수 있다. 펩타이드는, 도 6 내지 도 9에 열거된 펩타이드(서열번호 88 내지 145)에 고도로 상동성인 펩타이드, 또는 이러한 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 잔기가 첨가되거나 제거된 펩타이드를 포함할 수 있다. 펩타이드는 스페이서 또는 링커를 통해 또 다른 펩타이드에 연결될 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 청구범위 제3항에 따른 키메라 항원 수용체를 면역계 세포 내에서 조작하고, 세포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 암 또는 암 전이를 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다.
다른 양상에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 위한 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이며, 여기서 키메라 항원 수용체의 표적화 세포외 부분은 NME7AB, NME7AB-유사 단백질 또는 NME7-X1에 결합하는 항체의 부분을 포함한다. 항체의 부분은 단쇄 scFv일 수 있거나, 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 NME 패밀리 구성원의 펩타이드 단편으로 인간을 면역화시키는 단계를 포함하는, 인간에게 암 또는 전이성 암에 대한 백신 접종하는 방법에 관한 것이다. NME 패밀리는 NME7 패밀리일 수 있다. NME7 패밀리의 구성원은 NME7 또는 NME7b일 수 있다. NME7 패밀리의 구성원은 NME7AB 또는 NME7AB-유사 단백질일 수 있다. NME7 패밀리는 NME7-X1일 수 있다. 면역화 펩타이드는 도 6 내지 도 9에 열거된 펩타이드(서열번호 88 내지 145)로부터의 펩타이드일 수 있다. 바람직하게는, 펩타이드는 도 9에 열거된 펩타이드(서열번호 141 내지 145)로부터 선택될 수 있다. 면역화 펩타이드는, 도 6 내지 도 9에 열거된 펩타이드(서열번호 88 내지 145)에 고도로 상동성인 펩타이드, 또는 이러한 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 잔기가 첨가되거나 제거된 펩타이드를 포함할 수 있다. 면역화 펩타이드는 스페이서 또는 링커를 통해 또 다른 펩타이드에 연결될 수 있다.
추가의 또 다른 양상에서, 본 발명은 NME7, NME7b, NME7AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 저해하는 핵산을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. 핵산은 NME7, NME7AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 억제하는 안티-센스 핵산일 수 있다. 핵산은 NME7, NME7AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 저해하는 저해성 RNA, siRNA, RNAi 또는 shRNA일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 NME7, NME7b, NME7AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 저해하는 유전자 편집된 핵산을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다. NME7, NME7b, NME7AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 저해하는 유전자 편집된 핵산은 세포 내로 삽입될 수 있으며, 그 다음, 환자에게 투여될 수 있다. NME7, NME7b, NME7AB-유사 단백질 또는 NME7-X1의 발현을 저해하는 유전자 편집된 핵산은 바이러스 벡터를 사용하여 세포 내로 삽입될 수 있다. 바이러스 벡터는 렌티바이러스 시스템일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 암 세포를 NME7AB, NME7b, NME7AB-유사 단백질 또는 NME7-X1, 2i 또는 5i와 접촉시키는 단계를 포함하는, 암 세포를 성장시키는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은 NME7AB, NME7b, NME7AB-유사 단백질 또는 NME7-X1, 2i 또는 5i를 함유하는 배지 내에서 세포를 배양하는 단계, 또는 인간 NME7AB, NME7b, NME7AB-유사 단백질 또는 NME7-X1을 발현하는 동물, 또는 NME7AB, NME7b, NME7AB-유사 단백질 또는 NME7-X1이 투여된 동물에서 세포를 성장시키는 단계를 포함할 수 있다. 암 세포는 유방암, 전립선암, 난소암, 결장직장 암, 췌장암, 간암, 흑색종 또는 뇌암 세포일 수 있다. 후보 약물은 세포 상에서 시험될 수 있다. 약물의 효능은, 암 성장을 무-약물(no drug) 대조군과 비교하거나, 전이 마커 또는 줄기세포 마커의 발현 수준을 무-약물 대조군과 비교하거나, 무-약물 대조군과 비교하여 낮은 세포 카피 수(copy number)로부터 동물에서 종양을 형성하는 생성된 세포의 능력을 비교하고, 암 또는 전이 치료용 후보 약물의 효능을 결정함으로써 평가될 수 있다. 세포는 암 치료를 위해 평가되는 환자로부터 얻어질 수 있고, 그 환자에게 효과적일 약물은 전술한 방법을 사용하여 얻은 결과에 기초하여 선택된다. 세포는 암 치료를 위해 평가되는 환자로부터 얻어지지 않을 수 있지만, 그 환자에게 효과적일 약물은 전술한 방법을 사용하여 얻은 결과에 기초하여 선택된다.
다른 양상에서, 본 발명은 NME의 서열로부터 유래되는 서열을 갖는 펩타이드 또는 펩타이드 모방체로부터 항체 또는 항체-유사 분자를 생성시키는 방법에 관한 것이다. NME는 NME7일 수 있다. 펩타이드는 항체 또는 항체-유사 분자를 생성시키기 위한 면역원으로서 사용될 수 있다. 펩타이드는 항-NME7 항체를 생성시키기 위해 동물에게 투여될 수 있다. 펩타이드는 항-NME7 항체를 생성시키기 위해 인간에게 투여될 수 있다. 펩타이드는 도 6 내지 도 9에 열거된 서열(서열번호 88 내지 145)을 가질 수 있다. 바람직하게는, 펩타이드는 도 9에 열거된 펩타이드(서열번호 141 내지 145)로부터 선택될 수 있다. 펩타이드는, 도 6 내지 도 9에 열거된 펩타이드(서열번호 88 내지 145)에 고도로 상동성인 펩타이드, 또는 이러한 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하 또는 1개 이하의 아미노산 잔기가 첨가되거나 제거된 펩타이드를 포함할 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 하기를 포함하는, 암의 존재 또는 암의 진행을 검출하는 방법에 관한 것이다:
1) 암 환자 또는 암이 발병할 위험이 있는 환자로부터 샘플을 얻는 단계;
2) 샘플을 NME7 패밀리의 구성원의 수준 또는 NME7 패밀리의 구성원을 암호화하는 핵산의 수준을 검출하거나 측정할 수 있는 검정에 적용하는 단계;
3) 시험 샘플에서 측정된 NME7 패밀리의 구성원 또는 NME7 패밀리의 구성원-암호화 핵산의 수준을 대조군 환자 또는 대조군 세포에서의 수준과 비교하는 단계;
4) NME7 패밀리의 구성원 또는 NME7 패밀리의 구성원을 암호화하는 핵산의 수준이 대조군과 비교하여 상승되는지를 결정하는 단계; 및
5) 시험이 비교되는 대조군이 이전에 암을 진단받은 공여자로부터 유래된 것인 경우, 시험 샘플의 공여자가 암을 가지고 있거나, 암이 진행되었다고 결론 내리는 단계. 이러한 방법에서, 순환계 또는 조직 내에서 NME7 패밀리의 구성원의 검출은 환자에서 암의 지표(indicator)일 수 있다. NME7 패밀리의 구성원은 NME7, NME7b, NME7-X1 또는 NME7AB-유사 단백질일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 방법에 관한 것이다:
환자에서 NME7 패밀리의 구성원 또는 MUC1*의 존재를 검출하는 단계; 및
항-NME7 항체 또는 항-MUC1*항체 또는 항체들을 NME7 패밀리의 구성원 또는 MUC1* 발현을 나타내는 환자에게 투여하는 단계. NME7 패밀리의 구성원은 NME7, NME7b, NME7-X1 또는 NME7AB-유사 단백질일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 암을 치료하거나 예방하는 방법에 관한 것이다:
1) 암이 의심되는 환자, 암이 발병할 위험이 있는 환자 또는 전이성 암이 발병할 위험이 있는 환자로부터 샘플을 얻는 단계;
2) NME7 패밀리의 구성원 또는 NME7 패밀리의 구성원을 암호화하는 핵산의 양을 측정하는 단계로서, 측정된 수준은 대조군 샘플에서 측정된 것보다 상당히 더 높은, 상기 단계;
3) 환자가 암을 가지고 있거나 환자에서 보다 공격적인 암 또는 전이성 암이 발병되었음을 결정하는 단계;
4) NME7 패밀리의 구성원의 발현을 억제하거나, NME7의 절단을 저해하거나, 표적에 대한 NME7의 결합을 저해하는 치료제를 유효량으로 환자에게 투여하는 단계. NME7 패밀리의 구성원의 표적은 MUC1*일 수 있다. NME7 패밀리의 구성원의 표적은 MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 부분일 수 있다. NME7 패밀리의 구성원은 NME7, NME7b, NME7-X1 또는 NME7AB-유사 단백질일 수 있다.
암에 관한 상기 방법 중 임의의 방법에서, 암은 유방암, 전립선암, 난소암, 결장직장암, 췌장암, 간암, 흑색종 또는 뇌암을 포함할 수 있다.
일 양상에서, 본 발명은 서열번호 145 또는 서열번호 169의 NME7 B3 펩타이드에 결합하는 NME7 특이적 항체 또는 이의 단편에 관한 것이다. 이러한 항체는 단클론성 항체 또는 2가, 1가, Fab 또는 단쇄 가변 단편 항체(scFv)일 수 있다. 항체는 항체 약물 접합체에 연결될 수 있다. 약물은 독소 또는 프로-톡신(pro-toxin)에 연결될 수 있다.
본 발명은 또한 항체를 암호화하는 단리된 핵산에 관한 것이다.
본 발명은 상기에 논의된 단클론성 항체를 발현하는 단리된 하이브리도마에 관한 것이다. 이러한 항체는 NME1이 아닌 NME7AB 또는 NME7-X1에 특이적으로 결합할 수 있다. 이러한 항체는 NME7AB와 MUC1* 세포외 도메인 사이 또는 NME7-X1과 MUC1* 세포외 도메인 사이의 상호작용을 방해할 수 있다. 또는, 이러한 항체는 NME7AB와 PSMGFR 사이 또는 NME7-X1과 PSMGFR 사이의 결합을 방해할 수 있다. 추가로, 이러한 항체는 NME7AB와 N-10 사이 또는 NME7-X1과 N-10 사이의 결합을 방해할 수 있다.
또 다른 양상에서, 이러한 항체는 NME7AB와 MUC1* 세포외 도메인 사이 또는 NME7-X1과 MUC1* 세포외 도메인 사이의 상호작용을 방해할 수 없다. NME7AB 또는 NME7-X1은 N-10 펩타이드(서열번호 170)에 결합할 수 있지만, C-10 펩타이드(서열번호 171)에는 결합하지 않을 수 있다. 특히, 항체는 5A1, 4A3, 5D4 또는 4P3일 수 있다.
항체는 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역 내의 아미노산 서열:
CDR1 영역 YTFTNYGMN(서열번호 439);
CDR2 영역 WINTYTGEPTYVDDFKG(서열번호 440); 및
CDR3 영역 LRGIRPGPLAY(서열번호 441); 및
하기를 포함하는 경쇄 가변 영역 내의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
CDR1 영역 SASSSVSYMN(서열번호 444);
CDR2 영역 GISNLAS(서열번호 445); 및
CDR3 영역 QQRSSYPPT(서열번호 446).
이러한 상기 항체의 예는 5A1이다.
또 다른 양상에서, 항체는 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역 내의 아미노산 서열:
CDR1 영역 NTFTEYTMH(서열번호 429);
CDR2 영역 GFNPNNGVTNYNQKFKG(서열번호 430); 및
CDR3 영역 RYYHSTYVFYFDS(서열번호 431); 및
하기를 포함하는 경쇄 가변 영역 내의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
CDR1 영역 SASQGISNYLN(서열번호 434);
CDR2 영역 YTSSLHS(서열번호 435); 및
CDR3 영역 QQYSKLPYT(서열번호 436).
이러한 상기 항체의 예는 5D4이다.
또 다른 양상에서, 항체는 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역 내의 아미노산 서열:
CDR1 영역 NTFTEYTMH(서열번호 388);
CDR2 영역 GFNPNNGVTNYNQKFKG(서열번호 389); 및
CDR3 영역 RYYHSLYVFYFDY(서열번호 390); 및
하기를 포함하는 경쇄 가변 영역 내의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
CDR1 영역 SASQGISNYLN(서열번호 393);
CDR2 영역 YTSSLHS(서열번호 394); 및
CDR3 영역 QQYSKLPYT(서열번호 395).
이러한 상기 항체의 예는 4A3이다.
또 다른 양상에서, 항체는 하기를 포함하는 중쇄 가변 영역 내의 아미노산 서열:
CDR1 영역 NTFTEYTMH(서열번호 388);
CDR2 영역 GFNPNNGVTNYNQKFKG(서열번호 389); 및
CDR3 영역 RYYHSLYVFYFDY(서열번호 390); 및
하기를 포함하는 경쇄 가변 영역 내의 아미노산 서열을 포함할 수 있다:
CDR1 영역 ITSTDIDDDMN(서열번호);
CDR2 영역 EGNTLRP(서열번호); 및
CDR3 영역 LQSDNLPLT(서열번호).
이러한 상기 항체의 예는 4P3이다.
항체는 인간, 인간화된 또는 조작된 항체 모방체일 수 있다.
항체는 비-인간, 예컨대, 뮤린 또는 낙타과일 수 있다.
본 발명은 또한 환자에게 상기에 기재된 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료를 위해서 환자에게 투여하는 것에 관한 것이다.
본 발명은 또한 환자에게 상기에 기재된 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 환자에서 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 환자 시편 및 정상 시편을 상기 항체와 접촉시키는 단계 및 두 시편으로부터의 결과를 비교하는 단계를 포함하는 암 또는 암 전이를 진단하는 방법에 관한 것이며, 여기서 환자 시편 내의 항체에 대한 양성 결합의 존재는 환자에서 암 또는 암 전이의 존재를 나타낸다. 항체는 조영제(imaging agent)에 연결될 수 있다. 환자 시편은 수술 중(intra-operative)을 포함하는 생체내, 시험관내의 혈액, 체액, 조직, 순환 세포일 수 있다.
본 발명은 또한 항-NME7AB 항체 또는 이의 단편을 발현하도록 조작된 세포에 관한 것이다. 이러한 세포는 면역 세포, 예컨대, T 세포 또는 NK 세포, 또는 줄기세포 또는 전구 세포, 바람직하게는 이후에 T 세포가 되도록 분화되는 줄기세포 또는 전구 세포일 수 있다.
세포는 종영 연관 항원을 인식하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 포함할 수 있다. 항-NME7 항체의 발현은 유도성일 수 있다. 항-NME7AB 항체를 암호화하는 핵산은 Foxp3 인핸서 또는 프로모터에 삽입될 수 있다. 항-NME7AB 항체는 NFAT-유도성 시스템에 존재할 수 있다. NFATc1 반응 요소는 Foxp3 인핸서 또는 프로모터 영역 내에 삽입된 항체 서열의 상류에 삽입될 수 있다.
항-NME7AB 항체 또는 이의 단편은 NME7 B3 펩타이드에 결합할 수 있거나, MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 펩타이드에 대한 NME7AB 또는 NME7-X1의 결합을 방해할 수 있다.
CAR은 종양 연관 항원 및 항-NME7 항체를 인식할 수 있다. 종양 연관 항원은 MUC1*일 수 있다.
본 발명은 또한 면역원성 도출 부분으로서 도 6 내지 도 9에 열거된 NME7AB로부터 유래된 1종 이상의 펩타이드 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%의 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하는 조성물을 포함하는 항암 백신에 관한 것이다. 펩타이드는 서열번호 141 내지 145의 펩타이드 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%의 서열 동일성을 갖는 펩타이드일 수 있다. 펩타이드는 서열번호 145의 펩타이드 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%의 서열 동일성을 갖는 펩타이드일 수 있다.
또 다른 양상에서, 본 발명은 상기에 기재된 항체를 포함하는 BiTE에 관한 것이다.
추가의 또 다른 양상에서, 본 발명은 항-NME7AB 항체를 생성시키는 방법에 관한 것이며, 여기서 NME7 B3 펩타이드 내의 시스테인 잔기는 이황화 결합을 회피하도록 돌연변이된다.
추가의 또 다른 양상에서, 본 발명은 세포를 NME7AB 또는 NME7-X1과 함께 배양하는 단계를 포함하는, 전이 가능성이 증가된 세포를 생성시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 NME7AB 또는 NME7-X1을 발현하도록 조작된 세포, NME7AB 또는 NME7-X1을 발현하는 트랜스제닉 동물에 관한 것이며, 여기서 NME7AB 또는 NME7-X1은 인간일 수 있고, 또한 NME7AB 또는 NME7-X1의 발현은 유도성일 수 있다.
특허 또는 출원 파일은 컬러로 실행된 적어도 하나의 도면을 포함한다. 컬러 도면이 포함된 본 특허 또는 특허 출원 간행물의 사본은 요청 및 필요한 수수료 지불 시 특허청에서 제공된다.
본 발명은 본 명세서의 하기에 제공되는 상세한 설명, 및 단지 예시로서 제공되므로 본 발명을 제한하고자 하는 것이 아닌 첨부 도면을 통해서 보다 완전히 이해될 것이다.
도 1은 NME7-AB가 MUC1* 세포외 도메인 펩타이드를 이량체화한다는 것을 나타낸 ELISA 샌드위치 검정으로부터의 HRP 신호의 그래프.
도 2는 전통적인 배지 또는 NME7을 함유하는 배지에서 배양된 후 T47D 암 세포에 대한 줄기세포 마커 및 암 줄기세포 마커에 대한 유전자 발현의 RT-PCR 측정치의 그래프(여기서 비-부착성이 된 세포(부유체(floater))를 부착된 채로 유지된 세포와 별개로 분석하였다.
도 3은 DU145 전립선 암 세포에 대한 다양한 줄기 및 추정 암 줄기세포 마커에 대한 유전자 발현의 RT-PCR 측정치의 그래프. 세포를 전통 배지 또는 NME1 이량체("NM23") 또는 NME7(NME7-AB)을 함유하는 배지에서 배양하였다. Rho 키나제 저해제는 계대 2에 의해서, 세포가 부착된 채로 남아있기 때문에 사용되지 않았다.
도 4는 줄기세포를 보다 미경험 상태로 반전시킨다고 이미 밝혀진 2i 저해제(GSK3-베타 및 MEK 저해제)가 또한 NME7AB만큼은 아니지만 암 세포를 보다 전이성인 상태로 유도한다는 것을 나타낸 전이 마커 및 만능 줄기세포(pluripotent stem cell) 마커의 RT-PCR 측정치의 그래프.
도 5는 인간 NME1과 인간 NME7-A 또는 -B 영역 간의 서열 정렬.
도 6은 NME1과 서열 동일성이 낮고, 암의 치료 또는 예방을 위해 치료용 항-NME7 항체를 생성하는 능력에 대해 선택된, 인간 NME7의 면역원성 펩타이드를 열거한 도면.
도 7은 암의 치료 또는 예방을 위해 치료용 항-NME7 항체를 생성시키는 능력에 대해 선택된, 구조적 온전성 또는 MUC1*에 대한 결합에 중요할 수 있는 인간 NME7의 면역원성 펩타이드를 열거한 도면.
도 8은 암의 치료 또는 예방을 위해 치료용 항-NME7 항체를 생성시키는 능력에 대해 선택된, 구조적 온전성 또는 MUC1*에 대한 결합에 중요할 수 있는 인간 NME1의 면역원성 펩타이드를 열거한 도면.
도 9는 NME1에 대한 낮은 서열 동일성 및 암에 관여하는 박테리아 NME1 단백질에 대한 상동성에 대해 선택된 인간 NME7로부터의 면역원성 펩타이드를 열거한 도면. 이들 펩타이드는 암의 치료 또는 예방을 위한 치료용 항-NME7 항체를 생성시키는 능력 면에서 바람직하다. 본 도면에서 도시된 펩타이드는 C-말단 단부에 공유 결합된 시스테인을 포함하고 첨가한다.
도 10A 내지 도 10B는 NME7-AB(도 10A) 또는 NME1(도 10B)이 플레이트에 흡착된 ELISA 검정의 그래프이고, NME7 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3에 의해서 생성된 항-NME7 항체를 NME1이 아닌 NME7에 결합하는 능력에 대해서 시험한다. C20은 항-NME1 항체이다.
도 11은 생성된 항-NME7 항체를 NME1의 결합을 저해하지 않고 표면 고정된 MUC1* 펩타이드에 대한 NME7-AB의 결합을 저해하는 능력에 대해서 시험한 ELISA 검정의 그래프.
도 12는 유방암 세포를 항체를 생성시키거나 선택하는 데 사용된 NME7 항체 또는 NME7로부터 유래된 짧은 펩타이드의 존재 또는 부재 하에서 성장시킨 암 세포 성장 실험의 그래프. 또한 거의 전체 NME7-AB 펩타이드인 아미노산 100 내지 376으로의 면역화에 의해서 생성된 항체가 암 세포 성장을 저해하는 것으로 나타났다.
도 13은 유방암 세포를 항체를 생성시키거나 선택하는 데 사용된 NME7 항체의 조합물 또는 NME7로부터 유래된 짧은 펩타이드의 조합물의 존재 또는 부재 하에서 성장시킨 암 세포 성장 실험의 그래프. 항체 및 이의 면역화 NME7-AB 펩타이드 둘 다 암 세포의 성장을 저해하였다.
도 14A 및 도 14B는 암 세포를 보다 전이성인 상태로 형질전환시킬 수 있는 NME7-AB 또는 2i 저해제에서 그리고 NME7 유래 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3의 존재 또는 부재 하에서 암 세포를 성장시켰을 때의 과학자 관찰 표. NME7-AB 펩타이드는 RT-PCR 측정에서 전이 마커, 특히 CXCR4의 발현이 증가된 것으로 나타난 부유체 세포로의 부착성 암 세포의 전이를 저해하였다.
도 15A 내지 도 15C는 각각은 암 세포를 보다 전이성인 상태로 형질전환시키는 NME7-AB 또는 2i 저해제에서 성장한 T47D 유방암 세포에서 CXCR4 및 기타 전이 마커의 발현의 RT-PCR 측정치의 그래프 및 전이성 형질전환에 대한 항-NME7 항체의 저해성 효과의 그래프. 도 15A는 항-NME7 항체의 존재 또는 부재 하에서 NME7AB 또는 2i에서 성장한 T47D 암 세포의 CXCR4 발현의 PCR 그래프를 도시한다. 도 15B는 NME7AB 면역화 펩타이드의 존재 하에서 72시간 또는 144시간 동안 2i 저해제에서 성장시킨 T47D 유방암 세포에서 CXCR4, CHD1 및 SOX2 발현의 RT-PCR 측정치의 그래프를 도시하고, 펩타이드 자체가 전이성 형질전환에 대해서 저해성임을 나타낸다. 도 15A의 저해성 콤보 2 및 3에 사용된 펩타이드 A1, A2 및 B1도 펩타이드로서 저해성이다. 펩타이드 B3이 가장 저해성이며, 이는 도 15A에서 시험된 가장 저해성 항체인 항체 61에 대한 면역화 펩타이드이다. 도 15C는 Y축의 스케일이 감소된 도 15B의 그래프를 도시한다.
도 16은 도 31에서 CXCR4의 RT-PCR 측정에 사용된 샘플에서 기록된 RNA 수준의 표뿐만 아니라 CXCR4 발현 및 대조군 하우스키핑 유전자에 대한 역치 사이클 수를 도시한 도면.
도 17은 인간 줄기 세포 및 암 세포의 패널에서 NME7-X1의 발현의 RT-PCR 측정치의 그래프.
도 18은 인간 줄기 세포 및 암 세포의 패널에서 NME7, NME7a, NME7b 및 NME7-X1의 발현의 RT-PCR 측정치의 그래프. NME7a는 전장 NME7이고, NME7b는 DM10 도메인의 작은 부분이 누락되었으며, NME7-X1은 DM10 도메인 전체 및 제1 NDPK A 도메인의 N-말단의 작은 부분이 누락되었다. NME7으로 표시된 막대는 NME7a 및 NME7b 둘 다를 검출한 프라이머가 사용되었음을 의미한다.
도 19A 내지 19F는 NME7 유래 펩타이드로의 면역화에 의해 생성된 항체를 사용하여 NME7 종의 발현에 대해 다양한 암 세포주가 프로빙된 웨스턴 블롯의 사진. 도 19A는 A1 펩타이드에 결합하는 항체 52가 전장 NME7, NME7AB 또는 NME7-X1의 존재에 대해 세포의 패널을 프로빙하는데 사용된 웨스턴 블롯을 나타낸다. 도 19B는 B1 펩타이드에 결합하는 항체 56이 전장 NME7, NME7AB 또는 NME7-X1의 존재에 대해 세포의 패널을 프로빙하는데 사용된 웨스턴 블롯을 나타낸다. 도 19C는 B3 펩타이드에 결합하는 항체 61이 전장 NME7, NME7AB 또는 NME7-X1의 존재에 대해 세포의 패널을 프로빙하는데 사용된 웨스턴 블롯을 나타낸다. 도 19D는 NME7 A 및 B 도메인 둘 다에 대해 생성된 상업적으로 입수 가능한 다클론성 항체 H278을 사용하여 NME7의 존재에 대해 세포의 패널을 프로빙한 웨스턴 블롯을 나타낸다. 도면에 나타난 바와 같이, 항체 H278은 또한 NME1을 인식한다. 도 19E는 상업적으로 입수 가능한 항-NME7 항체 B9에 대해 웹사이트에 공개된 겔을 나타내는데, 이는 그것이 전장 NME7의 겉보기 분자량을 갖는 종에 결합함을 나타낸다. 도 19F는 본 발명자들이 항-NME7 항체 B9를 사용하여 NME1만 로딩된 겔을 프로빙한 웨스턴 블롯을 나타낸다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, 항체 B9는 NME1뿐만 아니라 전장 NME7을 인식한다. 이것은 항체 H278과 같이, B9가 NME1의 A 도메인이 NME7AB의 A 도메인과 고도로 상동성인 NME7의 A 및 B 도메인 둘 다에 대해 발생했기 때문에 놀라운 것이 아니다.
도 20A 내지 도 20C는 표준 배지와 비교하여 NME7-AB를 함유하는 무혈청 배지에서 배양된 후 암 세포에서 전이 마커의 RT-PCR 측정치의 그래프. 도 20A는 MUC1-양성 난소암 세포주인 SK-OV3이 전이 마커 CXCR4, CDH1(일명 E-카드헤린), SOX2 및 NME7-X1의 발현을 증가시켰음을 나타내고; 도 20B는 MUC1-음성 난소암 세포주인 OV-90이 전이 마커 CXCR4 및 NME7-X1의 증가된 발현을 나타내고; 도 20C는 최소 수준의 MUC1을 발현하는 유방암 세포주인 MDA-MB가 전이 마커 CDH1(일명 E-카드헤린) 및 SOX2의 발현을 증가시켰다는 것을 나타낸다.
도 21A 내지 도 21F는 분석된 암 세포주의 웨스턴 블롯의 사진 및 설명을 나타낸다. 도 21A 및 21B에서의 웨스턴 블롯의 경우, 모든 암 샘플을 40ug/㎖의 농도로 겔에 로딩되도록 정규화하였다. 도 21A에서, 다양한 암 세포주를 항-탠덤 반복 단클론성 항체 VU4H5를 사용하여 전장 MUC1의 발현에 대해 프로빙한다. 도 21B에서, 다양한 암 세포주를 다클론성 항-PSMGFR 항체를 사용하여 절단된 형태 MUC1*의 발현에 대해 프로빙한다. 도 21C는 분석된 암 세포주의 설명이다. 도 21D는 "BT474(모세포)"로 표시된 HER2 양성 BT474 유방암 세포가 도면에서 "BTres1"로 표시된 허셉틴 및 기타 화학요법 약물에 대한 내성을 획득할 때까지 MUC1 또는 MUC1*을 거의 또는 전혀 발현하지 않는다는 것을 나타낸다. 모 세포는 허셉틴의 준치사(sub-lethal) 수준에서 세포를 배양함으로써 허셉틴, 탁솔, 옥소루비신 및 사이클로포스파마이드에 내성을 갖도록 만들었다. 도 21D는 세포가 허셉틴에 대한 내성을 획득함에 따라 HER2의 발현 수준은 변하지 않았지만 MUC1*의 발현은 극적으로 증가되었음을 나타낸다. 도 21E는 항-MUC1* Fab의 존재 또는 부재 하에서 허셉틴을 사용한 처리에 반응하여 약물 내성 전이성 세포와 비교한 모 BT474 세포의 성장 그래프를 도시한다. 도면에서 인지할 수 있는 바와 같이, BT474 모 세포는 세포 성장에서 허셉틴 농도 의존적 감소를 나타낸 반면, 2개의 허셉틴 내성 세포주인 BTRes 1과 BTRes2는 허셉틴 처리에 대한 반응으로 암 세포 성장에서 감소를 나타내지 않는다. 그러나, 항-MUC1* Fab로 처리되는 경우, 내성 세포주는 암 세포 성장에서 허셉틴 농도 의존적 감소를 나타낸다. 도 21F는 항-MUC1* Fab의 존재 또는 부재 하에서 탁솔을 사용한 처리에 대한 반응으로, 약물 내성 BTRes1 세포와 비교한 모 BT474 세포의 세포 사멸 백분율의 그래프를 나타낸다.
도 22A 내지 도 22E는 공동 면역침전 실험의 웨스턴 블롯 사진. T47D 유방암 세포 추출물을 MUC1 세포질 꼬리에 대한 항체인 Ab-5 또는 대조군 항체인 IgG와 함께 인큐베이션시키고, 공동 면역침전시켰다. 겔을 2개의 상이한 상업적으로 입수 가능한 항-NME7 항체 B9(도 22A) 및 CF7(도 22B)로 블로팅하였다. 두 겔 모두 약 33kDa 및 약 30kDa에서 고유한 NME7 밴드를 나타낸다. 겔을 제거하고, MUC1*, 항-PSMGFR(도 22C) 및 (도 22D)의 세포외 도메인에 대한 항체로 재프로빙하였는데, 이는 NME7 종 및 MUC1*이 상호작용함을 나타낸다. 재조합 NME7-AB와 재조합 NME7-X1을 함께 혼합하고, 겔에서 전개시킨 다음, 항-NME7 항체로 프로빙하였는데, 이는 유방암 세포에서 자연적으로 발생하고, MUC1*와 상호작용하는 2개의 고유한 NME7 종이 NME7-AB-유사 종 및 NME7-X1임을 나타낸다(도 22E).
도 23A 내지 도 23C는 공동 면역침전 실험의 웨스턴 블롯 사진. 인간 유도 만능 줄기(human induced pluripotent stem), iPS7 또는 배아 줄기, HES3, 세포 추출물을 MUC1 세포질 꼬리에 대한 항체인 Ab-5 또는 대조군 항체인 IgG와 함께 인큐베이션시키고, 공동 면역침전시켰다. 겔을 상업적으로 입수 가능한 항-NME7 항체 B9로 블로팅하였다(도 23A). 두 세포 유형은 모두 약 33kDa 및 약 30kDa에서 고유한 NME7 밴드를 나타낸다. 겔을 제거하고, MUC1*, 항-PSMGFR(도 23B)의 세포외 도메인에 대한 항체로 재프로빙하였는데, 이는 NME7 종 및 MUC1*이 상호작용함을 나타낸다. 재조합 NME7-AB와 재조합 NME7-X1을 함께 혼합하고, 겔에서 전개시킨 다음, 항-NME7 항체로 프로빙하였는데, 이는 유방암 세포에서 자연적으로 발생하고, MUC1*와 상호작용하는 2개의 고유한 NME7 종이 NME7-AB-유사 종 및 NME7-X1임을 나타낸다(도 23C).
도 24는 NME7-AB에 결합하는 능력에 대해 새로운 항-NME7 항체를 검정하는 ELISA 실험의 그래프. NME7-AB는 MUC1*의 세포외 도메인에 결합하는 것으로 알려져 있다. 다중-웰 플레이트의 표면을 재조합 NME7-AB로 코팅하였다. 항-NME7-AB 항체를 웰에 별도로 첨가하였다. 표준 세척을 수행하고 HRP-접합 2차 항체를 첨가하여 시각화하였다. 인지될 수 있는 바와 같이, 10개의 새로운 항-NME7 항체 중 7개가 NME7-AB에 강하게 결합하였다.
도 25는 NME1에 결합하는 능력 또는 바람직하게는 무능력에 대해 새로운 항-NME7 항체를 검정하는 ELISA 실험의 그래프. 다중-웰 플레이트의 표면을 MUC1* 세포외 도메인에 결합하는 것으로 또한 알려진 재조합 NME1-S120G 이량체로 코팅하였다. 항-NME7-AB 항체를 웰에 별도로 첨가하였다. 표준 세척을 수행하고 HRP-접합 2차 항체를 첨가하여 시각화하였다. 인지될 수 있는 바와 같이 단지 하나의 항체가 NME1에 대한 최소 결합을 나타내었다.
도 26은 ELISA 경쟁적 저해 검정의 그래프. NME7-AB/항-NME7 항체 복합체는 MUC1* 세포외 도메인 펩타이드인 PSMGFR로 코팅된 다중-웰 플레이트에 첨가하기 전에 제조되었다. NME7-AB는 MUC1* 세포외 도메인에 각각 결합할 수 있는 2개의 유사-동일 도메인 A 및 B가 있음을 상기하기 바란다. B 도메인 내의 NME7 B3 펩타이드에 결합하는 항체는 NME7 A 도메인에 결합하지 않는다. 따라서 NME7-AB/MUC1* 상호작용의 부분적인 저해만이 예상된다.
도 27은 ELISA 변위 검정의 그래프. NME7-AB를 먼저 플레이트 상의 표면 고정된 MUC1* 세포외 도메인 펩타이드에 결합시킨 다음, 항-NME7 항체의 첨가에 의해 파괴시켰다.
도 28은 ELISA 변위 검정의 그래프. 이러한 경우, 다중-웰 플레이트를 PSMGFR 서열이 누락된 10개의 N-말단 아미노산을 갖는 절두된 MUC1* 펩타이드, N-10으로 코팅하였다. NME7-AB는 N-10 펩타이드에 결합하는 것으로 알려져 있다. NME7-AB를 플레이트 상의 표면 고정된 N-10 펩타이드에 결합시킨 다음, 항-NME7 항체의 첨가에 의해 파괴시켰다.
도 29는 최적인 4nM 또는 8nM에서 성장 인자로서 NME7-AB만을 함유하는 정상 권장 배지인 RMPI, 무혈청 배지 또는 8nM에서 성장 인자로서 NME1 S120G 이량체만을 함유하는 무혈청 배지에서 배양된 T47D 유방암 세포의 샘플에 존재하는 RNA의 양의 그래프를 도시하며; NME1은 동종이량체이고 NME7-AB는 2개의 유사-동일 도메인으로 구성된 단량체이기 때문에 8nM NME1은 4nM NME7-AB의 몰 당량이다. 암 세포를 항-NME7 B3 항체의 존재 또는 부재 하에서 배양하였다. 본 실험에서, 부유 세포를 부착 세포로부터 분리하여 별도로 분석하였다. 중요한 데이터는 부유체 세포가 암 줄기세포라고 주장한다. 샘플에서 RNA 양의 증가 또는 감소는, 작용제가 생성된 주어진 집단에서 세포 수를 각각 증가시켰거나 감소시켰다는 것을 주장한다.
도 30은 최적인 4nM 또는 8nM에서 성장 인자로서 NME7-AB만을 함유하는 정상 권장 배지인 RPMI, 무혈청 배지 또는 8nM에서 성장 인자로서 NME1 S120G 이량체만을 함유하는 무혈청 배지에서 배양된 T47D 유방암 세포 중의 전이 마커 CXCR4의 PCR 측정치의 그래프를 도시하며; NME1은 동종이량체이고 NME7-AB는 2개의 유사-동일 도메인으로 구성된 단량체이기 때문에 8nM NME1은 4nM NME7-AB의 몰 당량이다. 암 세포를 항-NME7 B3 항체의 존재 또는 부재 하에서 배양하였다. 본 실험에서, 부유 세포를 부착 세포로부터 분리하여 별도로 분석하였다. 중요한 데이터는 부유체 세포가 암 줄기세포라고 주장한다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, NME7-AB 배지에서의 성장은 세포의 부유체 집단에서 CXCR4를 증가시키고, 항-NME7 B3 항체는 발현을 감소시키는데, 이는 항-NME7 항체가 암 줄기세포의 생성을 감소시켰다고 주장한다.
도 31은 최적인 4nM 또는 8nM에서 성장 인자로서 NME7-AB만을 함유하는 정상 권장 배지인 RMPI, 무혈청 배지 또는 8nM에서 성장 인자로서 NME1 S120G 이량체만을 함유하는 무혈청 배지에서 배양된 T47D 유방암 세포 중의 줄기세포 마커 및 전이 마커 SOX2의 PCR 측정치의 그래프를 도시하며; NME1은 동종이량체이고 NME7-AB는 2개의 유사-동일 도메인으로 구성된 단량체이기 때문에 8nM NME1은 4nM NME7-AB의 몰 당량이다. 암 세포를 항-NME7 B3 항체의 존재 또는 부재 하에서 배양하였다. 본 실험에서, 부유 세포를 부착 세포로부터 분리하여 별도로 분석하였다. 중요한 데이터는 부유체 세포가 암 줄기세포라고 주장한다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, NME7-AB 배지에서의 성장은 세포의 부유체 집단에서 SOX2 발현을 증가시키고, 항-NME7 B3 항체는 발현을 감소시키는데, 이는 항-NME7 항체가 암 줄기세포의 생성을 감소시켰다고 주장한다.
도 32는 최적인 4nM 또는 8nM에서 성장 인자로서 NME7-AB만을 함유하는 정상 권장 배지인 RMPI, 무혈청 배지 또는 8nM에서 성장 인자로서 NME1 S120G 이량체만을 함유하는 무혈청 배지에서 배양된 T47D 유방암 세포 중의 줄기세포 마커 및 전이성 성장 인자 수용체 MUC1의 PCR 측정치의 그래프를 도시하며; NME1은 동종이량체이고 NME7-AB는 2개의 유사-동일 도메인으로 구성된 단량체이기 때문에 8nM NME1은 4nM NME7-AB의 몰 당량이다. 암 세포를 항-NME7 B3 항체의 존재 또는 부재 하에서 배양하였다. 본 실험에서, 부유 세포를 부착 세포로부터 분리하여 별도로 분석하였다. 중요한 데이터는 부유체 세포가 암 줄기세포라고 주장한다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, NME7-AB 배지에서의 성장은 세포의 부유체 집단에서 MUC1 발현을 증가시키고, 항-NME7 B3 항체는 발현을 감소시키는데, 이는 항-NME7 항체가 암 줄기세포의 생성을 감소시켰다고 주장한다.
도 33A 내지 도 33B는 암 세포의 꼬리 정맥 주사 후 제6일에 면역 손상된 nu/nu 마우스의 IVIS 사진. 도 33A는 500,000개의 T47D-wt 유방암 세포를 주사한 마우스의 IVIS 사진을 도시한다. 도 33B는 최소 배지에서 NME7-AB에서 10일 동안 성장시킨 10,000개의 T47D 유방암 세포를 주사한 마우스의 IVIS 사진을 도시한다. 부유 세포를 수집하였다. 이러한 부유 세포를 본 명세서에서 암 줄기세포, CSC로 지칭한다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, 야생형 암 세포를 주사한 마우스는 전이의 징후를 보이지 않는다. 그러나, 암 줄기세포가 아닌, 50배 적은 양의 세포를 주사한 마우스는 주사한 암 세포가 분명히 전이하고 있는 것으로 나타났다.
도 34A 내지 도 34D는 암 세포의 꼬리 정맥 주사 후 제10일에 면역 손상된 nu/nu 마우스의 IVIS 사진. 도 34A는 500,000개의 T47D-wt 유방암 세포를 주사한 마우스의 IVIS 사진을 도시한다. 도 34B는 10,000개의 T47D-CSC(암 줄기세포)를 주사한 마우스의 IVIS 사진을 도시한다. 도 34C는 10,000개의 T47D-CSC(암 줄기세포)를 주사하고, 제7일에 항-NME7 항체를 주사한 마우스의 IVIS 사진을 도시한다. 도 34D는 방출된 광자의 IVIS 측정치의 수기 기록을 도시한다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, 치료를 위해 선택된 마우스는 비교 가능한 T47D-CSC 마우스보다 더 전이성이다. 제1 항체 주사의 효능은 유리 NME7-AB의 제6일 주사에 의해 차단되었을 수 있다. 500,000개의 T47D-wt 세포를 주사한 대조군 마우스는 배경 또는 생존 암 세포일 수 있는 광자의 약한 방출을 나타낸다.
도 35A 내지 도 35C는 암 세포의 꼬리 정맥 주사 후 제12일에 면역 손상된 nu/nu 마우스의 IVIS 사진. 도 35A는 500,000개의 T47D-wt 유방암 세포를 주사한 마우스의 IVIS 사진을 도시한다. 도 35B는 항-NME7 항체로 처리하지 않은 10,000개의 T47D-CSC(암 줄기세포)를 주사한 마우스가 IVIS 사진을 찍을 수 있기 전에 과도한 종양 부하로 사망했음을 도시한다. 도 35C는 10,000개의 T47D-CSC(암 줄기세포)를 주사하고, 제7일 및 제10일에 항-NME7 항체를 주사한 마우스의 IVIS 사진을 도시한다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, 항-NME7 항체로 처리한 마우스는 암 전이가 제거되고 있다. 500,000개의 T47D-wt 세포를 주사한 대조군 마우스는 더 약한 광자 방출을 나타내는데, 이는 더 적은 수의 생존 암 세포를 나타내거나 배경일 수 있다.
도 36A 내지 도 36B는 암 세포의 꼬리 정맥 주사 후 제14일에 면역 손상된 nu/nu 마우스의 IVIS 사진. 도 36A는 500,000개의 T47D-wt 유방암 세포를 주사한 마우스의 IVIS 사진을 도시한다. 도 36B는 10,000개의 T47D-CSC(암 줄기세포)를 주사하고, 제7일, 제10일 및 제12일에 항-NME7 항체를 주사한 마우스의 IVIS 사진을 도시한다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, 항-NME7 항체로 처리한 마우스는 암 세포 전이가 거의 완전이 없다. 500,000개의 T47D-wt 세포를 주사한 대조군 마우스는 광자 방출을 나타내지 않는다.
도 37A 내지 도 37V는 암 세포 꼬리 정맥 주사 후 제6일에서부터 제26일까지 면역 손상된 nu/nu 마우스의 IVIS 사진의 시간 경과를 도시한 도면. 도 37A, 도 37C, 도 37E, 도 37G, 도 37I, 도 37K, 도 37M 및 도 37O는 제0일에 꼬리 정맥에 500,000개의 T47D-wt 세포를 주사한 마우스의 IVIS 사진을 도시한다. 도 37B, 도 37D, 도 37F, 도 37H, 도 37J, 도 37L, 도 37N 및 도 37P는 제0일에 10,000개의 T47D 암 줄기세포를 꼬리 정맥에 주사하고, 제7일부터 제17일까지 항-NME7 항체를 투여하고, 그 때 치료를 중단하고, 그 다음 제21일에 재개한 마우스의 IVIS 사진을 도시한다. 도 37Q, 도 37R, 도 37S, 도 37T 및 도 37U는 항-NME7 항체 처리를 중단한 제17일부터, 항체 처리를 재개한 제21일을 지나서, 제26일까지 처리된 마우스의 IVIS 확대 사진을 도시한다. 도 37V는IVIS 측정의 스케일 막대를 나타낸다. 이러한 시간 경과에서 인지될 수 있는 바와 같이, NME7에서 성장한 암 세포는 쉽게 전이되며, 이러한 전이는 NME7에 결합하는 항체를 처리함으로써 효과적으로 치료, 예방 또는 반전될 수 있다.
도 38A 내지 도 38C는 500,000개의 T47D 야생형 유방암 세포 또는 10,000개의 T47D 암 줄기세포를 주사한 후 제6일에서부터 제19일까지 면역 손상된 nu/nu 마우스의 IVIS 사진의 시간 경과를 도시한 도면. 도 38A는 꼬리 정맥(i.v.)에 주사된 마우스를 도시한다. 도 38B는 복강내(i.p.) 주사된 마우스를 도시한다. 도 38C는 피하 주사(s.c.)된 마우스를 도시한다.
도 39A 내지 39C는 B3 펩타이드에 결합하는 항-NME7 항체로 염색된 인간 폐 조직 시편을 도시한 도면. 도면은 정상 조직에서 NME7 발현의 결여는 종양 등급 및 전이가 증가함에 따라 NME7의 발현이 증가함을 나타낸다.
도 40A 내지 도 40C는 B3 펩타이드에 결합하는 항-NME7 항체로 염색된 인간 소장 조직 시편을 도시한 도면. 도면은 정상 조직에서 NME7 발현의 결여는 종양 등급 및 전이가 증가함에 따라 NME7의 발현이 증가함을 나타낸다.
도 41A 내지 41D는 B3 펩타이드에 결합하는 항-NME7 항체로 염색된 인간 결장 조직 시편을 도시한 도면. 도면은 정상 조직에서 NME7 발현의 결여는 종양 등급 및 전이가 증가함에 따라 NME7의 발현이 증가함을 나타낸다.
도 42A 내지 도 42F는 10,000개의 루시페라제 양성 T47D 전이성 유방암 줄기세포를 꼬리 정맥에 주사하고, 8F9A4A3이라고도 알려진 항-NME7AB 항체 4A3로 처리한 각각 대략 20g의 체중의 암컷 nu/nu 마우스의 사진. 암 세포를 영상화하기 위해, 루시페라제 기질인 루시페린을 IVIS 기기로 촬영하기 10분 전에 복강내에 주사한다. 도 42A 내지 도 42C는 동물을 아래로 향하게 한 IVIS 사진을 도시한다. 도 42D 내지 도 42F는 동물을 위로 향하게 한 IVIS 사진을 도시한다. 도 42A 및 도 42D는 인산염 완충 식염수 용액을 주사한 대조군 동물을 도시한다. 도 42B 및 도 42E는 전이성 암 세포를 주사하기 24시간 전에 동물에게 항-NME7AB 항체 4A3을 주사한 후, 22일 동안 총 12회 항체 주사를 위해 대략 격일로 동물에 주사한 예방 모델을 도시한다. 도 42C 및 도 42F는 전이성 암 세포를 주사한 후 24시간 후에 동물에게 항-NME7AB 항체 4A3을 주사하고, 그 다음 20일 동안 총 11회 항체 주사를 위해 대략 격일로 동물에 주사한 반전 모델을 도시한다.
도 43A 내지 도 43F는 10,000개의 루시페라제 양성 T47D 전이성 유방암 줄기세포를 꼬리 정맥에 주사하고, 8F9A5A1이라고도 알려진 항-NME7AB 항체 5A1 및 5F3A5D4라고도 알려진 5D4로 처리한 각각 대략 20g의 체중의 암컷 nu/nu 마우스의 사진. 암 세포를 영상화하기 위해, 루시페라제 기질인 루시페린을 IVIS 기기로 촬영하기 10분 전에 복강내에 주사한다. 도 43A 내지 도 43C는 동물을 아래로 향하게 한 IVIS 사진을 도시한다. 도 43D 내지 도 43F는 동물을 위로 향하게 한 IVIS 사진을 도시한다. 도 43A 및 도 43D는 인산염 완충 식염수 용액을 주사한 대조군 동물을 도시한다. 도 43B, 도 43E, 도 43C 및 도 43F는 전이성 암 세포를 주사하기 24시간 전에 동물에게 항-NME7AB 항체를 주사한 후, 22일 동안 총 12회 항체 주사를 위해 대략 격일로 동물에 주사한 예방 모델을 도시한다. 제27일에 영상을 찍었다.
도 44A 내지 도 44D는 제0일에 32nM의 최종 농도로 NME7AB와 혼합된 10,000개의 루시페라제 양성 T47D 전이성 유방암 줄기세포를 꼬리 정맥에 주사한 암컷 nu/nu 마우스의 사진. 제1일 및 제2일에 동물에게 본 발명자들이 전이를 증가시키는 것으로 발견한 더 많은 32nM NME7AB를 꼬리 정맥에 주사하였다. 이것은 확립된 전이의 반전을 입증하기 위한 시스템이다. 제7일에, 동물을 개별 항-NME7AB 항체 8F9A5A1, 8F9A4A3 또는 5F3A5D4로 처리하였다. 도 44A는 인산염 완충 식염수 용액을 주사한 대조군 동물을 도시한다. 도 44B는 5A1이라고도 알려진 항-NME7AB 단클론성 항체 8F9A5A1로 처리된 동물을 도시한다. 도 44C는 4A3이라고도 알려진 항-NME7AB 단클론성 항체 8F9A4A3으로 처리된 동물을 도시한다. 도 44D는 5D4이라고도 알려진 항-NME7AB 단클론성 항체 5F3A5D4로 처리된 동물을 도시한다. 녹색 화살표는 표시된 기간 동안 낮은 항체 투여량(5 내지 7㎎/㎏)을 나타내고, 적색 화살표는 높은 투여량(15㎎/㎏)을 나타낸다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, 항-NME7AB 항체로 처리된 동물은, 항체로 처리될 군 내의 다수의 동물이 임의의 처리 전에 더 많은 전이를 가졌음에도 불구하고, 대조군 동물보다 전이가 적다. 높은 농도의 항-NME7AB 항체는 낮은 농도보다 더 효과적이다. 예를 들어, 제11일과 제17일 사이에, 동물을 고용량으로 처리하였고, 처리된 동물의 대부분은 약 제17일까지 전이가 제거되었다. 그러나, 1회의 저용량 항체는 전이 재발을 초래하였다. 동물은 제32일까지 고용량 치료에 다시 반응한다.
도 45A 내지 도 45B는 제0일에 32nM의 최종 농도로 NME7AB와 혼합되고, 그 다음 마트리겔과 1:1 vol:vol로 혼합된, 10,000개의 루시페라제 양성 T47D 전이성 유방암 줄기세포를 우측 옆구리에 피하 주사한 암컷 nu/nu 마우스의 사진. 종양 생착을 제0일 내지 제6일 진행하도록 하였다. 이어서 동물을 항-NME7AB 항체로 꼬리 정맥 주사에 의해서 정맥내 처리하였다. 대조군 동물에게 PBS를 주사하였다. 도 45A는 대조군 동물의 IVIS 사진을 나타낸다. 도 45B는 15㎎/㎏의 총 농도로 항-NME7AB 항체 5A1, 4A3 및 5D4의 칵테일을 꼬리 정맥에 주사한 동물의 IVIS 사진을 도시한다. 항체 또는 PBS를 제7일과 제18일 사이에 4회 투여하였다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, 항-NME7AB 항체 처리 동물은 대조군보다 전이가 적었다. 처리된 군에서 5마리의 동물 중 2마리는 대조군보다 더 큰 원발성 종양을 갖는다. 이는 항-NME7AB 항체가 암 세포의 확산을 방지하여 원발성 종양에 집중되어 있기 때문일 수 있다. 본 실험에서, PCR 분석은 NME7AB와 배양한 지 11일 후에 T47D 유방암 세포가 CXCR4를 109배, OCT4를 2배, NANOG를 3.5배, MUC1을 2.7배 상향조절한 것으로 나타났다.
도 46A 내지 도 46Q는 제0일에 32nM의 최종 농도로 NME7AB와 혼합되고, 그 다음 마트리겔과 1:1 vol:vol로 혼합된, 10,000개의 루시페라제 양성 T47D 전이성 유방암 줄기세포를 우측 옆구리에 피하 주사한 암컷 nu/nu 마우스의 사진. 종양 생착을 제0일 내지 제6일 진행하도록 하였다. 이어서 동물을 항-NME7AB 항체로 꼬리 정맥 주사에 의해서 정맥내 처리하였다. 대조군 동물에게 PBS를 주사하였다. 제38일에, 동물을 희생시키고, 간을 수거하고, 이어서 IVIS로 분석하여 간에 전이된 암 세포를 검출하였다. 도 46A 내지 도 46B는 PBS만을 주사한 대조군 동물의 전신 IVIS 사진을 도시한다. 도 46C 내지 도 46D는 항-NME7AB 항체 5A1을 주사한 대조군 동물의 전신 IVIS 사진을 도시한다. 도 46E 도 46F는 항-NME7AB 항체 4A3을 주사한 대조군 동물의 전신 IVIS 사진을 도시한다. 도 46G 내지 도 46H는 항-NME7AB 항체 5D4를 주사한 대조군 동물의 전신 IVIS 사진을 도시한다. 도 46A, 도 46C, 도 46E 및 도 46G는 치료 전 제7일에 촬영한 IVIS 사진이다. 도 46B, 도 46D, 도 46F 및 도 46H는 항-NME7AB 항체 치료 또는 모의 실험 후 제31일에 촬영한 IVIS 사진이다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, PBS 대조군의 동물은 전신 IVIS 사진에서 전이(청색점)를 나타낸 반면, 항-NME7AB 항체로 처리한 동물은 그렇지 않았다. 도 46I 내지 도 46P는 희생 후 동물로부터 수거한 간 및 폐의 사진 및 IVIS 사진을 도시한다. 도 46I, 도 46K, 도 46M, 도 46O는 일반 사진이다. 도 46J, 도 46L, 도 46N 및 도 46P는 전이된 암 세포를 나타내는 IVIS 사진이다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, 항-NME7AB 항체는 유방암 전이의 1차 부위인 간으로의 전이를 크게 저해하였다. 도 46Q는 대조군 동물 대 처리 동물로부터 수거된 간에 대해 IVIS 기기에 의해 방출되고 열거된 측정된 광자의 막대 그래프이다.
도 47A 내지 도 47F는 NME7AB의 존재에 대해 다양한 암 세포주가 염색되는 면역형광 실험의 사진. 도 47A는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된 T47D 유방암 세포를 도시한다. 도 47B는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된, 1500s라고도 알려진 ZR-75-1 유방암 세포를 도시한다. 도 47C는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된 H1975 비소세포 폐암 세포를 도시한다. 도 47D는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된 H292 비소세포 폐암 세포를 도시한다. 도 47E는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된 HPAFII 췌장암 세포를 도시한다. 도 47F는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된 DU145 전립선암 세포를 도시한다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, 본 발명자들이 시험한 모든 암 세포주는 NME7AB에 대해 강력하고 막성인 염색을 나타낸다. 본 실험에 사용된 단클론성 항체는 5D4였다. 동시에, NME7AB 항체 5A1 및 4A3을 사용하여 동일한 세포주를 염색하고 동일한 결과를 생성하였다.
도 48A 내지 도 48I는 NME7AB의 존재에 대해 다양한 폐암 세포주가 염색되는 면역형광 실험의 사진. 도 48A 내지 도 48C는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된 선암종인 H1975 비소세포 폐암 세포를 도시한다. 도 48A는 DAPI 및 항-NME7AB 염색의 오버레이이다. 도 48B는 항-NME7AB 염색 단독을 나타낸다. 도 48C는 DAPI 및 항-NME7AB 염색 오버레이의 확대도이다. 도 48D 내지 도 48F는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된, 점막표피양 폐 암종인 H292 비소세포 폐암 세포를 도시한다. 도 48D는 DAPI 및 항-NME7AB 염색의 오버레이이다. 도 48E는 항-NME7AB 염색 단독을 나타낸다. 도 48F는 DAPI 및 항-NME7AB 염색 오버레이의 확대도이다. 도 48G 내지 도 48I는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된 전이성 기관지폐포 암종인 H358 비소세포 폐암 세포를 도시한다. 도 48G는 DAPI 및 항-NME7AB 염색의 오버레이이다. 도 48H는 항-NME7AB 염색 단독을 나타낸다. 도 48I는 DAPI 및 항-NME7AB 염색 오버레이의 확대도이다.
도 49A 내지 도 49I는 NME7AB에서의 배양 전 후의 암 세포주, 유방 T47D, 폐 H1975, 폐 H358 및 췌장 HPAFII의 PCR 그래프. 도 49A는 유방 전이 마커 CXCR4를 측정하였다. 도 49B는 줄기세포 마커 OCT4를 측정하였다. 도 49C는 전이 마커 ALDH1을 측정하였다. 도 49D는 줄기세포 마커 SOX2를 측정하였다. 도 49E는 줄기세포 마커 NANOG를 측정하였다. 도 49F는는 E-카드헤린이라고도 공지된 마커 CDH1을 측정하였다. 도 49G는 전이 마커 CD133을 측정하였다. 도 49H는 줄기세포 마커 ZEB2를 측정하였다. 도 49I는 줄기, 암 및 전이 마커 MUC1을 측정하였다. 종양 구체로도 알려진 부유체 세포는 독립적으로 고정부(anchorage)를 성장시킬 수 있게 되며, 부착 세포보다 더 증가된 전이 마커를 나타낸다. 암 줄기세포를 주사한 동물은 NME7AB 배양 부유체 세포를 주사한 동물이다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, 전이 마커, 줄기세포 마커 또는 상피에서 중간엽으로의 전이(epithelial to mesenchymal transition: EMT)의 마커는 NME7AB에서 배양 후 증가하는데, 이는 보다 전이성 상태로의 변화를 나타낸다.
도 50A 내지 도 50D는 NME7AB와의 배양에서 10일 후 NCI-H358 모 세포 또는 NCI-H358 세포인 10,000개의 암 세포를 꼬리 정맥에 주사한 NSG 마우스의 IVIS 사진. 도 50A 및 도 50C는 NME7AB에서 10일 동안 성장시킨 NCI-H358 폐암 세포를 주사한 마우스의 IVIS 사진을 도시한다. 도 50B 및 도 50D는 모체 NCI-H358 세포를 주사한 마우스의 IVIS 사진을 도시한다. 도 50A 및 도 50B는 마우스를 아래로 향하게 하여 영상화한 IVIS 사진을 도시한다. 도 50C 및 도 50D는 마우스를 위로 향하게 하여 영상화한 IVIS 사진을 도시한다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, NME7AB 성장 세포는 전이 가능성이 크게 증가하였다.
도 51은 NME1 또는 NME7AB라고도 알려진 이량체 NM23-H1에서 배양물에서 2 또는 3 계대 전 및 후의 MUC1 음성 전립선암주 PC3의 PCR 그래프. 그래프는 줄기세포 마커, 암 세포 마커 및 전이 마커의 배수 차이를 도시한다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, NME1 또는 NME7AB의 반복 배양은 줄기, 암 및 전이 마커의 상향조절을 유도하지만, MUC1의 발현도 5 내지 8배 상향조절한다.
정의
본 출원에서, 단수 표현은 단일 대상 및 복수의 대상 둘 다를 지칭하는 데 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약" 또는 "실질적으로"는 일반적으로, 정확한 수로 한정되지 않는 재량을 제공한다. 예를 들어, 폴리펩타이드 서열의 길이에 대한 맥락에서 사용된 바와 같이, "약" 또는 "실질적으로"는, 폴리펩타이드가 언급된 수의 아미노산으로 제한되지 않아야 함을 나타낸다. N-말단 또는 C-말단에 첨가되거나 제거된 몇몇 아미노산은, 이의 결합 활성과 같은 기능적 활성이 존재하는 한, 포함될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 1종 이상 추가적인 치료제"와 조합한" 투여는 동시(동반되는) 투여 및 임의의 순서의 연속 투여를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "아미노산" 및 "아미노산들"은 모든 자연 발생 L-α-아미노산을 지칭한다. 이러한 정의는 노르류신, 오르니틴 및 호모시스테인을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 일반적으로, 용어 "아미노산 서열 변이체"는 참조(예를 들어, 천연(천연) 서열) 폴리펩타이드와 비교하여 아미노산 서열이 약간 상이한 분자를 지칭한다. 아미노산 변경은 천연 아미노산 서열에서의 치환, 삽입, 결실 또는 이러한 변화의 임의의 바람직한 조합일 수 있다.
치환 변이체는, 천연 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기가 제거되고, 동일한 위치에서 이의 자리에 상이한 아미노산이 삽입된 것이다. 치환은 분자에서 단지 하나의 아미노산이 치환된 단일 치환일 수 있거나, 동일한 분자에서 2개 이상의 아미노산이 치환된 다중 치환일 수 있다.
서열 내의 아미노산에 대한 치환기는, 아미노산이 속한 부류의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 아이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양전하성(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음전하성(산성) 아미노산은 아스파트산 및 글루탐산을 포함한다. 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 나타내는 단백질, 단편 또는 이들의 유도체, 및 번역 동안 또는 번역 후에 예를 들어, 글리코실화, 단백질분해 절단, 항체 분자 또는 다른 세포성 리간드에 대한 연결 등에 의해 상이하게 변형되는 유도체가 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.
삽입 변이체는, 천연 아미노산 서열 내의 특정 위치에 있는 아미노산에 바로 인접하여 하나 이상의 아미노산이 삽입된 것이다. 아미노산에 바로 인접해 있다는 것은, 아미노산의 α-카복시 또는 α-아미노 작용기에 연결됨을 의미한다.
결실 변이체는, 천연 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산이 제거된 것이다. 본래, 결실 변이체는 분자의 특정 영역에서 1개 또는 2개의 아미노산이 결실될 것이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "단편" 또는 "기능적 유도체"는 본 발명의 폴리펩타이드의 생물학적 활성 아미노산 서열 변이체 및 단편, 뿐만 아니라 유기 유도체화제와의 반응, 번역-후 변형, 비-단백질성 중합체를 갖는 유도체 및 면역어드헤신(immunoadhesin)을 포함하는 공유 변형을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "담체"는, 사용되는 투여량 및 농도에서 노출되는 세포 또는 포유동물에 무독성인 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함한다. 종종, 약제학적으로 허용 가능한 담체는 pH 완충 용액이다. 약제학적으로 허용 가능한 담체의 예는 비제한적으로, 완충제, 예컨대, 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기산; 아스코르브산을 비롯한 항산화제; 저분자량(잔기가 약 10개 미만인) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대, 폴리바이닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 라이신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대, EDTA; 당 알코올, 예컨대, 만니톨 또는 솔비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대, 나트륨; 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대, TWEEN®, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 PLURONICS® 등을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용 가능한 담체 및/또는 희석제"는, 임의의 모든 용매, 분산 배지, 코팅제, 항박테리아제, 항진균제, 등장성제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약제학적 활성 성분에 대한 이러한 배지 및 작용제의 용도는 당업계에 널리 공지되어 있다. 임의의 통상적인 배지 또는 작용제가 활성 성분과 비융화성인 경우를 제외하고는, 치료 조성물에서 이의 사용이 고려된다. 보조적인 활성 성분이 또한 조성물 내로 혼입될 수 있다.
특히, 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 제형화하는 것이 유리하다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 투여 단위 형태는 치료될 포유동물 대상체를 위한 일원화된 용량으로서 적합한 물리적 개별 단위를 지칭하며; 각각의 단위는 필요한 약제학적 담체와 연관된 바람직한 치료 효과를 발휘하도록 계산된 활성 물질을 예정된 양으로 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 설명은 (a) 활성 물질의 고유한 특징 및 달성되어야 하는 특정 치료 효과, 및 (b) 신체적 건강이 손상된 병변이 있는 병태를 갖는 살아 있는 대상체에서 질환의 치료를 위한 활성 물질과 같은 컴파운딩(compounding) 분야에 내재하는 한계에 의해 설명되며, 이들에 직접 좌우된다.
기본적인 활성 성분은 편리하고, 효과적인 투여를 위해 유효량으로, 투여 단위 형태로 약제학적으로 허용 가능한 적합한 담체와 함께 컴파운딩된다. 단위 투여 형태는 예를 들어, 기본적인 활성 화합물을 0.5㎍ 내지 약 2000㎎ 범위의 양으로 함유할 수 있다. 비율로서 표현하면, 활성 화합물은 일반적으로 담체의 약 0.5㎍/㎖ 로 존재한다. 보조 활성 성분을 함유하는 조성물의 경우, 투여량은 상기 성분의 통상적인 용량 및 투여 방식을 참고하여 결정된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "벡터", "폴리뉴클레오타이드 벡터", "작제물" 및 "폴리뉴클레오타이드 작제물"은 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 벡터는 RNA, DNA, 레트로바이러스 코트에 캡슐화된 RNA, 아데노바이러스 코트에 캡슐화된 DNA, 또 다른 바이러스 또는 바이러스-유사 형태(예컨대, 헤르페스 심플렉스 및 아데노-구조물, 예컨대, 폴리아마이드)에 패키징된 DNA를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 몇몇 형태들 중 임의의 형태로 존재할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "숙주 세포"는 본 발명의 벡터의 수여자일 수 있거나 수여자였던 개별 세포 또는 세포 배양물을 포함한다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하고, 자손은 본질적으로는, 자연적, 우연적 또는 고의적인 돌연변이 및/또는 변화로 인해 본래 모 세포와 (형태 또는 총 DNA 상보체의 면에서) 완전히 일치하지 않을 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "대상체"는 척추동물, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 치료를 위한 "포유동물"는 인간, 가축 및 농장용 동물, 동물원, 스포츠 또는 애완 동물, 예컨대, 개, 고양이, 소, 말, 양, 돼지 등을 비롯하여 포유동물로서 분류되는 임의의 동물을 지칭한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "치료"는 유익하거나 목적하는 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 본 발명의 목적에 있어서, 유익하거나 목적하는 임상 결과는, 검출 가능하거나 검출 불가능하든 간에, 증상의 완화, 질환 정도의 감소, 안정화된(즉, 악화되지 않는) 질환 상태, 질환 진행의 지연 또는 서행, 질환 상태의 개선 또는 경감, 및 (부분적이거나 전체적이든지 간에) 차도 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. "치료"는 또한 치료를 받지 않을 경우 예상되는 생존율과 비교하여, 생존율을 연장시키는 것을 의미할 수 있다. "치료"는 치유적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치 둘 모두를 지칭한다. 치료가 필요한 개체는, 이미 장애를 앓고 있는 개체뿐만 아니라 장애가 예방되어야 하는 개체를 포함한다. 질환의 "경감"은, 질환 상태의 정도 및/또는 바람직하지 못한 임상 징후가 줄어들고/거나 진행 시간이 치료를 받지 않는 상황과 비교하여 둔화되거나 길어지는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "A1" 펩타이드, "A2" 펩타이드, "B1" 펩타이드, "B2" 펩타이드 및 "B3" 펩타이드는 인간 NME1에 결합하지 않지만(또는 상당히 적게 결합하나) 인간 NME7AB에 결합하는 항체를 생성하거나 선택하는 데 사용되는 NME7로부터 유래된 펩타이드를 지칭한다. 이들 항체를 생성하는 데 사용되는 펩타이드는 NME7AB 및 NME7-X1 둘 모두에 공통적이며, 하기에 제시되어 있다.
A1은 NME7A 펩타이드 1(A 도메인): MLSRKEALDFHVDHQS(서열번호 141)이고,
A2는 NME7A 펩타이드 2(A 도메인): SGVARTDASES(서열번호 142)이고,
B1은 NME7B 펩타이드 1(B 도메인): DAGFEISAMQMFNMDRVNVE(서열번호 143)이고,
B2는 NME7B 펩타이드 2(B 도메인): EVYKGVVTEYHDMVTE(서열번호 144)이고,
B3은 NME7B 펩타이드 3(B 도메인): AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(서열번호 145)이다.
추가로, 명료화를 위해서, (대문자 "A"를 가진) NME7A는 NME7의 소단위 A 부분을 지칭한다. (소문자 "a"를 가진) NME7a는 본 출원 어디에서든지 기술되는 전장 NME7을 지칭한다. 또한 (대문자 "B"를 가진) NME7B는 NME7의 소단위 B 부분을 지칭한다. (소문자 "b"를 가진) NME7b는 본 출원 어디에서든지 기술되며, DM10 영역을 부분적으로 포함하지 않는 NME7의 종을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "항체-유사"는, 항체의 일부를 함유하지만 자연에서 자연 발생하는 항체는 아닌 방식으로 조작될 수 있는 분자를 의미한다. 예는, CAR(키메라 항원 수용체) T 세포 기술 및 Ylanthia® 기술 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. CAR 기술은 T 세포의 일부에 융합된 항체 에피토프를 사용하여, 신체의 면역계가 특이적인 표적 단백질 또는 세포를 공격하도록 한다. Ylanthia® 기술은, 이후에, 표적 단백질로부터의 펩타이드 에피토프에 결합하는지에 대해서 스크리닝되는 합성 인간 fab의 컬렉션(collection)인 "항체-유사" 라이브러리로 이루어진다. 그런 다음, 선택된 Fab 영역은 스캐폴드 또는 골격 내로 조작되어, 항체를 닮게 될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "NME 패밀리 구성원 단백질을 저해하기 위한 작용제의 유효량"은, 예를 들어, NME 패 밀리 구성원 단백질과 이의 동족 수용체 사이의 활성화 상호작용을 방해하는 데 있어서의 작용제의 유효량을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "NME 유래 단편"은, NME의 단편이거나, NME 단편인 펩타이드 서열에 고도로 상동성인 펩타이드 서열을 지칭한다.
본 명세서에서, "MUC1*" 세포외 도메인은 주로 PSMGFR 서열(GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 6))에 의해서 정의된다. MUC1 절단의 정확한 부위는 이를 클리핑(clipping)하는 효소에 좌우되고, 절단 효소는 세포 유형, 조직 유형 또는 세포의 진화 시간에 따라 달라지기 때문에, MUC1*세포외 도메인의 정확한 서열은 N-말단에서 달라질 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "PSMGFR"은 GTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGA(서열번호 6)로 제시된 바와 같은 MUC1 성장 인자 수용체의 일차 서열에 대한 두문자어이다. 이와 관련하여, "N-10 PSMGFR" 또는 단순히 "N-10", "N-15 PSMGFR" 또는 단순히 "N-15", 또는 "N-20 PSMGFR" 또는 단순히 "N-20"에서와 같이 "N-수"는 PSMGFR의 N-말단에서 결실된 아미노산 잔기의 수를 지칭한다. 마찬가지로, "C-10 PSMGFR", 또는 단순히 "C-10", "C-15 PSMGFR" 또는 단순히 "C-15", "C-20 PSMGFR" 또는 단순히 "C-20"에서와 같이 "C-수"는 PSMGFR의 C-말단에서 결실된 아미노산 잔기의 수를 지칭한다. 결실과 부가의 혼합물이 또한 가능하다. 예를 들어, N+20/C-27은 20개의 아미노산이 N-말단에서 PSMGFR에 부가되고, 27개의 아미노산이 C-말단으로부터 결실되는 야생형 MUC1의 펩타이드 단편을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "MUC1*의 세포외 도메인"은 탠덤 반복 도메인을 포함하지 않는 MUC1 단백질의 세포외 부분을 지칭한다. 대부분의 경우, MUC1*은 절단 생성물이며, 여기서, MUC1* 부분은 탠덤 반복부를 포함하지 않는 짧은 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포질 꼬리로 이루어진다. MUC1이 절단되는 정확한 위치는, MUC1이 하나 초과의 효소에 의해 절단될 수 있는 것으로 보이기 때문에, 아마도 알려져 있지 않다. MUC1*의 세포외 도메인은 PSMGFR 서열 대부분을 포함할 것이지만, 부가적인 10개 내지 20개의 N-말단 아미노산을 가질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "높은 상동성"은, 임의의 2개의 폴리펩타이드 간의 지정된 중복 영역에서 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 55% 이상, 60% 이상, 65% 이상, 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이 상, 95% 이상 또는 97% 이상의 동일성인 것으로 간주된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 수가 1 내지 10인 "NME 패밀리 단백질" 또는 "NME 패밀리 멤버 단백질"은, 이들 모두가 적어도 하나의 NDPK(뉴클레오타이드 다이포스페이트 키나제) 도메인을 갖기 때문에, 함께 단백질로 분류된다. 일부 경우, NDPK 영역은, ATP가 ADP로 전환되는 것을 촉매할 수 있다는 점에서, 기능적이지 않다. NME 단백질은 형식상 H1 및 H2로 넘버링되는 NM23 단백질로서 알려져 있었다. 최근, NME 패밀리 구성원 10개가 식별되어 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 NM23 및 NME는 상호 교환 가능하다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 NME1, NME2, NME5, NME6, NME7, NME8 및 NME9은 천연 단백질뿐만 아니라 NME 변이체를 지칭하는 데 사용된다. 일부 경우, 이들 변이체는 천연 서열 단백질보다 용해성이며, 이. 콜라이(E. coli)에서 더 잘 발현되거나 또는 더 용해성이다. 예를 들어, 명세서에서 사용되는 바와 같은 NME7은, 천연 단백질 또는 변이체, 예컨대, 변이가 이, 콜라이에서 용해성의 적절하게 접혀진 단백질을 고 수율로 발현되게 할 수 있기 때문에 우수한 상업적인 이용 가능성을 갖는 NME7AB 의미할 수 있다. NME7AB는 주로 NME7 A 및 NME7 B 도메인으로 이루어지지만, 천연 단백질의 N-말단에 존재하는 DM10 도메인(서열번호 39)을 대부분 포함하지 않는다. 본 명세서에서 지칭되는 바와 같은 "NME1"은 "NM23-H1"과 상호 교환 가능하다. 본 발명은 또한 NME 단백질의 정확한 서열에 의해 제한되지 않는 것으로 의도된다. NM23-S120G로도 지칭되는 돌연변이체 NME1-S120G는 출원 전체에서 상호 교환 가능하게 사용된다. S120G 돌연변이체 및 P96S 돌연변이체는 이들의 이량체 형성 선호도 때문에 바람직하지만, 본 명세서에서 NM23 이량체, NME1 이량체, 이량체 NME1 또는 이량체 NM23으로 지칭될 수 있다.
본 명세서에서 지칭되는 바와 같은 NME7은 분자량이 약 42kDa인 천연 NME7을 의미하도록 의도된다.
"NME7의 패밀리"는 전장 NME7뿐만 아니라, 분자량이 30kDa, 33kDa인 자연 발생 절단된 형태 또는 인공적으로 생성된 절단된 형태, 또는 분자량이 약 25kDa인 절단된 형태, DM10 리더 서열을 포함하지 않거나 부분적으로 포함하지 않는 변이체, 예컨대, NME7b, NME7-X1, NME7AB 또는 재조합 NME7 단백질, 또는 효율적인 발현을 허용하도록 변경될 수 있거나 또는 NME7을 보다 효과적이거나 또는 상업적으로 보다 활력이 있도록 만드는 다른 특징, 용해성 또는 수율을 증가시키도록 변경될 수 있는 이의 변이체를 의미하도록 의도되며, DM10 리더 서열(서열번호 162)은 서열번호 82 또는 147로 표시되는 NME7의 NME7 아미노산 1 내지 91이다. "NME7의 패밀리"는 또한 암 세포에서 발현되는 30kDa 내지 33kDa 범위의 단백질인 "NME7AB-유사" 단백질을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "줄기세포를 미경험 상태로 유지시키거나 프라이밍된(primed) 줄기세포를 미경험 상태로 반전시키는 작용제"는, 단독으로 또는 조합하여, 줄기세포를 미경험 상태로 유지시켜, 세포가 배아의 내부 세포 덩어리를 닮게 만드는 단백질, 작은 분자 또는 핵산을 지칭한다. 예는 인간 NME 단백질, 특히 NME1, NME7, NME7-X1, NME7AB, NME6, 2i(문헌[Silva J et al, 2008; Hanna et al, 2010]), 5i(문헌[Theunissen TW et al, 2014]), 핵산, 예컨대, MBD3, CHD4(문헌[Rais Y1 et al, 2013), BRD4 또는 JMJD6(문헌[Liu W et al 2013])의 발현을 억제시키는 siRNA에 높은 서열 일치성을 갖는 인간 NME1 이량체, 박테리아, 진균, 효모, 바이러스 또는 기생충 NME 단백질 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "NME7AB", "NME7AB" 및 "NME-AB"는 상호 교환 가능하게 사용된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "전분화능(pluripotency)을 촉진하는 작용제" 또는 "체세포를 줄기-유사 또는 암-유사 상태로 반전시키는 작용제"는, 단독으로 또는 조합하여, 유전적 시그니처가 줄기세포 또는 암 세포를 보다 근접하게 닮은 시그니처로 이동되도록 소정의 유전자의 발현을 유도하거나 발현을 억제하는 단백질, 작은 분자 또는 핵산을 지칭한다. 예는 NME1 이량체, NME7, NME7-X1, NME7AB, 2i, 5i, 핵산, 예컨대, MBD3, CHD4, BRD4 또는 JMJD6의 발현을 억제하는 siRNA, 인간 NME1, NME2, NME5, NME6, NME7, NME8 또는 NME9, 바람직하게는 NDPK 도메인을 갖는 영역에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 미생물 NME 단백질 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "작은 분자"로 지칭되는 작용에 대한 언급에서, 이는 분자량이 50Da 내지 2000Da, 보다 바람직하게는 150Da 내지 1000Da, 보다 더 바람직하게는 200Da 내지 750Da인 합성 화학 또는 화학적 기반의 분자일 수 있다.
본 명세서에서, "자연 생성물"로 지칭되는 작용제에 대한 언급에서, 이는 분자가 자연에 존재하는 한, 화학적 분자 또는 생물학적 분자일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, FGF, FGF-2 또는 bFGF는 섬유아세포 성장 인자를 지칭한다(문헌[Xu RH et al, 2005; Xu C et al, 2005]).
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "Rho 연관 키나제 저해제"는 소분자, 펩타이드 또는 단백질일 수 있다(문헌[Rath N, et al, 2012]). Rho 키나제 저해제는 본 명세서 및 다른 어디에서도 ROCi 또는 ROCKi 또는 Ri로 약칭된다. 특이적인 rho 키나제 저해제의 사용은 예시적인 것으로 의미되며, 임의의 다른 rho 키나제 저해제를 대체할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "암 줄기세포" 또는 "종양 개시 세포"는, 보다 전이적인 상태 또는 보다 공격적인 암과 관련된 유전자의 수준을 발현하는 암 세포를 지칭한다. 용어 "암 줄기세포" 또는 "종양 개시 세포"는 또한 동물에게 이식되는 경우 종양을 발생시키는 데 있어서 훨씬 더 적은 수의 세포가 필요한 암 세포를 지칭할 수 있다. 암 줄기세포 및 종양 개시 세포는 종종 화학요법 약물에 내성이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "줄기/암", "암-유사", "줄기-유사"는, 세포가 줄기세포 또는 암 세포의 특징을 획득하며, 줄기세포, 암 세포 또는 암 줄기세포의 유전자 발현 프로파일의 중요한 요소를 공유하는 상태를 지칭한다. 줄기-유사 세포는, 덜 성숙한 상태로의 유도를 수행하고 있는, 예컨대, 전분화능 유전자의 발현을 증가시키는 체세포일 수 있다. 줄기-유사 세포는 또한 일부 탈분화를 수행하였거나, 또는 이들이 이들의 말기 분화를 변경할 수 있는 준-안정 상태에 있는 세포를 지칭한다. 암-유사 세포는 아직까지는 완전히 특징규명되지 않았지만 암 세포의 형태 및 특징을 나타내는, 예컨대, 고정부-독립적으로 성장할 수 있거나 또는 동물에서 종양을 발생시킬 수 있는 암 세포일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 길이가 서로 다른 "스페이서" 또는 "링커"는 펩타이드 내 어디에서든지 혼입될 수 있다. 스페이서 부착은 통상적으로 아마이드 연결을 통해 이루어지지만, 다른 작용기도 가능하다.
NME, NME7 및 NME7의 단백질 패밀리
본 발명자들은 NME7 및 NME7-X1이 초기 인간 줄기세포 및 또한 대부분의 암 세포에서 고도로 발현됨을 발견하였다(도 17, 도 18, 도 19A 내지 도 19F, 도 22, 도 23, 도 39, 도 40, 도 41, 도 47, 도 48). 도 17은 인간 줄기 세포 및 암 세포의 패널에서 NME7-X1의 발현의 RT-PCR 측정치의 그래프. 도 18은 인간 줄기 세포 및 암 세포의 패널에서 NME7, NME7a, NME7b 및 NME7-X1의 발현의 RT-PCR 측정치의 그래프. NME7a는 전장 NME7이고, NME7b는 DM10 도메인의 작은 부분이 누락되었으며, NME7-X1은 DM10 도메인 전체 및 제1 NDPK A 도메인의 N-말단의 작은 부분이 누락되었다. NME7으로 표시된 막대는 NME7a 및 NME7b 둘 다를 검출한 프라이머가 사용되었음을 의미한다. 도 19A 내지 19F는 NME7 유래 짧은 펩타이드로의 면역화에 의해 생성된 항체를 사용하여 NME7 종의 발현에 대해 다양한 암 세포주가 프로빙된 웨스턴 블롯의 사진. 도 19A는 NME7 유래 펩타이드 A1에 결합하는 본 발명의 항체 #52로 프로빙된 웨스턴을 도시한다. 도 19B는 NME7 유래 펩타이드 B1에 결합하는 본 발명의 항체 #56으로 프로빙된 웨스턴을 도시한다. 도 19C는 NME7 유래 펩타이드 B3에 결합하는 본 발명의 항체 #61로 프로빙된 웨스턴을 도시한다. 도 22A 내지 도 22E는 공동 면역침전 실험의 웨스턴 블롯 사진. T47D 유방암 세포 추출물을 MUC1 세포질 꼬리에 대한 항체인 Ab-5 또는 대조군 항체인 IgG와 함께 인큐베이션시키고, 공동 면역침전시켰다. 겔을 2개의 상이한 상업적으로 입수 가능한 항-NME7 항체 B9(도 22A) 및 CF7(도 22B)로 블로팅하였다. 두 겔 모두 약 33kDa 및 약 30kDa에서 고유한 NME7 밴드를 나타낸다. 겔을 제거하고, MUC1*, 항-PSMGFR(도 22C) 및 (도 22D)의 세포외 도메인에 대한 항체로 재프로빙하였는데, 이는 NME7 종 및 MUC1*이 상호작용함을 나타낸다. 재조합 NME7-AB와 재조합 NME7-X1을 함께 혼합하고, 겔에서 전개시킨 다음, 항-NME7 항체로 프로빙하였는데, 이는 유방암 세포에서 자연적으로 발생하고, MUC1*와 상호작용하는 2개의 고유한 NME7 종이 NME7-AB-유사 종 및 NME7-X1임을 나타낸다(도 22E). 도 23A 내지 도 23C는 공동 면역침전 실험의 웨스턴 블롯 사진. 인간 유도 만능 줄기, iPS7 또는 배아 줄기, HES3, 세포 추출물을 MUC1 세포질 꼬리에 대한 항체인 Ab-5 또는 대조군 항체인 IgG와 함께 인큐베이션시키고, 공동 면역침전시켰다. 겔을 상업적으로 입수 가능한 항-NME7 항체 B9로 블로팅하였다(도 23A). 두 세포 유형은 모두 약 33kDa 및 약 30kDa에서 고유한 NME7 밴드를 나타낸다. 겔을 제거하고, MUC1*, 항-PSMGFR(도 23B)의 세포외 도메인에 대한 항체로 재프로빙하였는데, 이는 NME7 종 및 MUC1*이 상호작용함을 나타낸다. 재조합 NME7-AB와 재조합 NME7-X1을 함께 혼합하고, 겔에서 전개시킨 다음, 항-NME7 항체로 프로빙하였는데, 이는 유방암 세포에서 자연적으로 발생하고, MUC1*와 상호작용하는 2개의 고유한 NME7 종이 NME7-AB-유사 종 및 NME7-X1임을 나타낸다(도 23C). 도 39A 내지 39C는 B3 펩타이드에 결합하는 항-NME7 항체로 염색된 인간 폐 조직 시편을 도시한 도면. 도면은 정상 조직에서 NME7 발현의 결여는 종양 등급 및 전이가 증가함에 따라 NME7의 발현이 증가함을 나타낸다. 도 40A 내지 도 40C는 B3 펩타이드에 결합하는 항-NME7 항체로 염색된 인간 소장 조직 시편을 도시한 도면. 도면은 정상 조직에서 NME7 발현의 결여는 종양 등급 및 전이가 증가함에 따라 NME7의 발현이 증가함을 나타낸다. 도 41A 내지 41D는 B3 펩타이드에 결합하는 항-NME7 항체로 염색된 인간 결장 조직 시편을 도시한 도면. 도면은 정상 조직에서 NME7 발현의 결여는 종양 등급 및 전이가 증가함에 따라 NME7의 발현이 증가함을 나타낸다. 도 47 및 도 48은 NME7이 광범위한 암 세포주의 세포외 수용체에 의해서 발현되고, 이에 결합한다는 것을 나타낸 면역형광 사진을 도시한 도면을 나타낸다.
추가로, 본 발명자들은, NM23-H1과 유사하게, NME7이 줄기세포 및 암 세포 둘 다 상에 존재하는 MUC1* 성장 인자 수용체에 결합하여, 이를 이량체화한다는 것을 입증하였다(도 1). 도 5는 NME1과 NME7 A 및 NME7 B 도메인의 서열 정렬을 도시한다.
본 발명자들은 최근, NME7이 매우 초기의 배아 줄기세포에서 발현되는 원시 형태의 NME1(NM23-H1)임을 발견하였다. NME7은 성인 조직에서는 전혀 발현되지 않거나, 극도로 낮은 수준을 발현된다. 그러나, 본 발명자들은, NME7이 암성 세포 및 조직에서 높은 수준으로 발현되고, 전이성 암 세포 및 조직에서는 심지어 더 높은 수준으로 발현된다는 것을 발견하였다. 절단된 형태의 NME7은 세포외 수용체에 결합하여 이를 활성화시킬 수 있는 분비된 형태일 수 있다. 본 발명자들은 전장 NME7, MW 42kDa뿐만 아니라 약 33kDa 및 30kDa인 NME7 종을 검출한다. 33kDa 종 및 30kDa 종은 암 세포로부터 분비된다. 웨스턴 블롯은 세포 파쇄물에서 전장 NME7을 검출하지만, 이들의 조건화된 배지에서는 더 작은 30kDa 내지 33kDa NME7 종을 검출한다. NME7을 인식하는 항체 또는 DM10 도메인만을 인식하는 항체를 사용하여 프로빙된 웨스턴 블롯은, 조건화된 배지 내로 분비되는 보다 낮은 분자량의 NME7 종이 DM10 도메인을 포함하지 않는다는 것을 나타낸다. 이들 데이터는, 자연 발생 NME7 종이 본 발명자들이 생성한 재조합 NME7AB와 대등하는 생각과 일치하는데, 그 이유는 이들이 거의 동일한 분자량을 가지며, 둘 다가 분비되고, 둘 다가 단백질을 세포 내에서 보유할 수 있는 DM10 도메인의 91개 아미노산이 존재하지 않기 때문이다.
본 발명자들은 새로운 NME7 아이소폼인 NME7-X1을 발견하였고, 또한 이는 암에서 과발현되며 특히 전립선암에서 과발현됨을 발견하였다(도 17, 도 18, 도 19 및 도 22). 분자량이 약 30kDa인 NME7-X1은 NME7 아미노산 125 내지 376을 포함하는 반면, 본 발명자들이 생성한 분자량이 약 33kDa인 재조합 NME7AB는 아미노산 92 내지 376에 걸쳐 있고, 따라서, 33개보다 많은 N-말단 아미노산을 포함한다. NME7b는 아미노산 37 내지 376에 걸쳐 있고, DM10 도메인의 단지 37개의 아미노산을 포함하지 않으며, 또한 전립선암에서 과발현된다(도 18). 본 발명자들은 인간 재조합 NME7-X1을 생성시켰으며, 이는 자연 발생 약 33kDa NME7 종보다 바로 아래에서 전개되며, 절단 생성물 또는 대안적인 아이소폼인 자연 발생 "NME7AB-유사" 단백질인 것으로 보이는, 암 세포에서 분비되는 30kDa NME7 종임을 나타낸다.
본 발명자들은 암 세포주 패널을 시험하였으며, 암 세포주가 NME7, 및 NME7AB, 예컨대, NME7AB-유사 단백질 또는 대안적인 아이소폼, 예컨대, NME7-X1과 유사한 절두물일 수 있는 보다 낮은 분자량의 종을 높은 수준으로 발현한다는 것을 발견하였다.
NM23-H1(NME1이라고도 함)은 이량체이어야 하는 반면, NME7은 MUC1* 세포외 도메인에 대해 2개의 결합 부위를 가진 단량체이다. 본 발명자들은 DM10 도메인을 포함하지 않는 재조합 인간 NME7을 생성시켰으며, 본 발명자들은 이를 NME7AB로 칭한다. 샌드위치 ELISA 결합 검정은, 재조합 NME7AB가 2개의 PSMGFR 펩타이드에 동시에 결합하며, 여기서, MUC1*의 세포외 도메인이 PSMGFR 서열을 대부분 또는 모두 포함함을 나타낸다(도 1). 나노입자 결합 검정에서, NME7은 또한 MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 부분에 결합하여 이를 이량체화할 수 있는 것으로 나타났다.
NME7을 불능화시키거나, NME7과 이의 결합 파트너와의 상호작용을 차단하거나 이의 발현을 억제하는 작용제는 강력한 항암 치료제이다. 이러한 작용제는 항체, 소분자 또는 핵산일 수 있다. 이들은 NME7에 직접 작용하거나, NME7 발현을 조절하는 분자, 또는 NME7을 암-촉진 형태로 절단하는 효소에 작용할 수 있다.
본 발명자들은, NM23-H1 이량체와 유사하게, 재조합 NME7AB 단량체가 임의의 다른 성장 인자, 사이토카인 또는 혈청의 부재 하에 전분화능 인간 줄기세포 성장을 완전히 지지할 수 있었음을 발견하였다. 본질적으로 PSMGFR 서열을 포함하며 줄기세포의 분화를 유도하는 NME7과 MUC1* 세포외 도메인 사이의 상호작용을 경쟁적으로 저해하는 것은, NME7과 MUC1*의 상호작용이 줄기세포 성장을 촉진하고, 분화를 저해한다는 것을 나타낸다.
그 다음, 본 발명자들은, NME7AB 단독이 또한 인간 암 세포 성장을 완전히 지지할 수 있음을 나타내었다. NME7AB가 보통의 암 세포 성장 배지에 첨가되었을 때, 이는 암 세포 성장, 특히 MUC1-양성 및 MUC1*-양성 암 세포의 성장을 자극하였다. NME7과 MUC1*의 상호작용을 저해하면, 암 세포 성장을 저해하였다. MUC1* 성장 인자 수용체를 항-MUC1* Fab로 차단하면, 암 세포 성장을 강력하게 저해하였다. 유사하게는, NME7에 결합하는 항체는 암 세포 성장을 저해한다. 항-NME7 항체에 의한 암 성장 저해의 일례에서, 다클론성 항체는 아미노산 100 내지 376에 걸쳐 있는 NME7의 부분을 사용하여 동물을 면역화시킴으로써 생성되었다(도 12 및 도 13). 그러나, 본 발명자들은, NME7AB 또는 NME7-X1로부터의 보다 짧은 펩타이드로부터의 면역화에 의해서 생성된 항체가 또한 암 성장을 저해한다는 것을 발견하였다. 특히, 이들은 MUC1 및 MUC1*-양성 암의 성장을 저해한 다. 본 발명의 항-NME7 항체는, 종양 구체를 형성할 수 있고, 원발성 종양 및 전이로부터 이동할 수 있는 비-부착성 "부유체" 세포의 형성을 저해하였다(도 14, 도 16, 도 29). 본 발명의 항-NME7 항체는 전이 및 현재 전이의 특징이라고 여겨지는 줄기세포 마커의 상향조절을 저해하였다(도 15, 도 30, 도 31, 도 32).
NME7은 암 전이를 유발한다.
추가로, 본 발명자들은, NME7AB를 함유하는 최소 배지에서 암 세포를 배양하는 것은 광범위하게 다양한 암 세포가 보다 전이성 상태로 형질전환되도록 유도하였음을 발견하였다. 이러한 유도된 전이성 상태에 대한 증거는 부착 성 세포 성장으로부터 비-부착성 세포 성장, 즉, "부유체" 세포로의 변화, 및 부유 세포에서 특히 상향조절된 특이적인 전이 마커의 수반되는 상향조절을 포함한다. NME7AB에서 배양된 후 상향조절되는 이들 전이 마커는, CXCR4, CHD1(E-카드헤린이라고도 함), MUC1, ALDH1, CD44 및 만능 줄기세포 마커, 예컨대, OCT4, SOX2, NANOG, KLF2/4, FOXa2, TBX3, ZEB2 및 c-Myc(도 2, 도 3, 도 20, 도 49, 도 51)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. NME7AB에서 배양된 암 세포는 시험 동물 내로 이종 이식되었을 때 급격하게 더 높은 이식률을 가졌으며, 이러한 이식률은 90%를 초과하였다. 또한 매우 적은 수의 이식된 암 세포로도 시험 동물에서 종양이 형성되었으며, 이는, NME7AB가 이러한 암 세포를 전이성 암 세포로도 알려진 암 줄기세포로 형질전환시켰다는 증거이다. NME7AB에서 배양되고, 에스트로겐 방출 펠릿을 보유하는 NOD/SCID/GAMMA 마우스의 꼬리 정맥에 주입된 암 세포는 일반 배지에서 성장된 모 세포에 비해 적은 수의 세포로부터 동물에서 전이되는 펠릿을 방출한다(도 33 내지 도 38). 암 세포가, 본질적으로 NME7AB와 동등한 NME7 절단 생성물 또는 대체 아이소폼을 만들기 때문에, 본 명세서에 기술된 방법은 NME7AB를 사용하는 것으로 제한되지 않으며; 다른 NME7 종이 마찬가지로 작용할 수 있었다. 예를 들어, 본 발명자들은 또 다른 NME7 아이소폼인 NME7-X1이 암 세포에 의해 발현됨을 발견하였다. 이는, X1 아이소폼이 N-말단으로부터 33개의 아미노산이 누락되었다는 것을 제외하고는, 본 발명자들의 재조합 NME7AB와 동일하다. NME7-X1은 NME7AB와 유사하게 작용하는 것으로 예상된다. "NME7AB-유사" 단백질 또한 암 세포에서 검출되었으며, 이는 약 33Da 종이다.
본 발명자들은, 발명자들의 이전 연구가, NME7AB가 단독이 인간 줄기세포를 보다 조기의 미경험 상태로 반전시킬 수 있음을 나타내었다는 것을 주목한다. 본 발명자들은, 줄기세포를 보다 미경험 상태로 반전시키는 다른 시약의 존재 하에 암 세포를 배양하면, 암 세포를 보다 전이성 상태로 형질전환시킴을 발견하였다. 본 발명자들은, 암 세포 NME7AB(도 2) 또는 키메라 NME1(도 3)에서 또는 "2i" 저해제(도 4)가 각각 보통의 암 세포를 전이성 암 세포로 형질전환시킬 수 있으며, 이들 또한 암 줄기세포 "CSC" 또는 종양 개시 세포 "TIC"로 지칭된다. 그러나, NME7AB는 암 세포를 2i보다 더 양호한 NM23-H1이라고도 공지된 NME1보다 더 양호하게 전이성 상태가 되게 유도하였다.
2i는 연구자들이 인간 줄기세포를 보다 미경험 상태로 반전시키게 하는 것으로 발견한 2개의 생화학적 저해제에 대해 주어진 명칭이다. 2i는 MEK 및 GSK3-베타 저해제 PD0325901 및 CHIR99021이며, 이들은 배양 배지에 각각 약 1mM 및 3mM의 최종 농도로 첨가된다. NME7AB 및 NME7-X1은 암 세포를 전이성 세포로 형질전환시키기 위해 최소 배지의 별개의 배취에 첨가되었을 때, 약 4nM의 최종 농도로 존재하긴 하지만, 보다 낮은 농도 및 보다 높은 농도도 약 1nM 내지 16nM의 범위에서 양호하게 작용한다. 인간 NME1 이량체 또는 박테리아 NME1 이량체는 4nM 내지 32nM의 최종 농도로 사용되며, 16nM이 이들 실험에 전형적으로 사용되고, 여기서, 인간 NME는 S120G 돌연변이를 보유한다. 야생형을 사용하는 경우, 보다 낮은 농도가 필요할 수 있다. 이들 정확한 농도가 중요한 것은 아니다. NME1 단백질이 이량체이고, 이것이 발생하는 농도 범위는 낮은 나노몰 범위로 존재하지만, 특정 돌연변이는 보다 높은 농도에서 이량체로서 유지될 수 있게 하는 것이 중요하다. 유사하게는, NME7 단백질의 농도는 달라질 수 있다. NME7AB 및 NME7-X1은 단량체이고, 암 세포를 전이성 세포로 변환시키는 데 사용된 농도는 단백질을 단량체로 유지시킬 수 있어야 한다.
NME7, NME7AB, NME7-X1, 및 2i 저해제 MEKi 및 GSK3i 외에도, 다른 시약 및 저해제가 줄기세포를 보다 미경험 상태로 반전시키는 것으로 나타났다. 이들 저해제, "i"는 JNKi, p38i, PKCi, ROCKi, BMPi, BRAFi, SRCi뿐만 아니라 성장 활성화 인자 LIF를 포함한다(문헌[afni et al 2013, Chan et al 2013, Valamehr et al 2014, Ware et al 2014, Theunissen et al 2014]. 이들 시약은 또한 암 세포를 보다 전이성 상태로 진행시키는 데 사용될 수 있다. 그런 다음, 줄기세포를 보다 미경험 상태로 반전시키는 임의의 단일 인자, 또는 저해제 또는 성장 인자의 조합물을 사용하여 보다 전이성 상태로 형질전환시키도록 유도되었던 세포는 암 전이를 치료하거나 예방하기 위한 약물을 확인하거나 시험하는 디스커버리 툴로서 사용될 수 있다.
다양한 분자 마커는 전이성 암 세포의 지표로서 제안되었다. 서로 다른 유형의 암들은, 상향조절되는 상이한 분자를 가질 수 있다. 예를 들어, 수용체 CXCR4는 전이성 유방암에서 상향조절되며, 한편, CHD1으로도 알려져 있는 E-카드헤린은 전이성 전립선암에서 더 상향조절된다. 이들 특이적인 전이 마커 외에도, 전분화능에 대한 전형적인 마커, 예컨대, OCT4, SOX2, NANOG 및 KLF4는 암이 전이성으로 됨에 따라 상향조절된다. 출발 암 세포 및 이후의 전이성 암 세포는 이들 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해 PCR에 의해 검정된다. 본 발명자들은, 암 세포를 보다 전이성 상태로 형질전환시키는 시약, 예컨대, NME7AB에서 배양된 이들 암 세포가 전이 마커 및 만능 줄기세포 마커의 발현 증가에 의해 입증되는 바와 같이, 전이성 암 세포로서 작용한다는 것을 예증하였다.
암 세포 집단이 전이성인지 아닌지에 대한 기능 시험은, 매우 적은 수, 예를 들어, 200개의 세포를 면역-손상된 마우스에 이식하고, 이들 세포가 종양으로 발병되는지 알아보는 것이다. 전형적으로, 면역-손상된 마우스에서 종양을 형성하기 위해서는 5백만 내지 6백만개의 암 세포가 필요하다. 본 발명자들은, 50개만큼 적은 수의 NME-유도 전이성 암 세포가 마우스에서 종양을 형성하였음을 나타내었다. 또한 시험 기간 전체 동안에 인간 NME7AB, NME1 또는 NME7-X1이 주사된 마우스에서 원거리 전이가 발병되었다.
하나의 특정 시험에서, T47D 인간 유방암 세포를 표준 RPMI 배지에서 14일 동안 배양하였으며, 이때, 배지를 48시간마다 교환하였고, 약 75% 컨플루언트되었을 때, 트립신처리에 의해 계대시켰다. 이어서, 세포를 6-웰 플레이트 내에 플레이팅하고, 4nM NME7AB가 보충된 최소 줄기세포 배지(실시예 1 참조)에서 배양하였다. 배지를 48시간마다 교환하였다. 약 4일까지, 일부 세포는 표면으로부터 탈착되어, 부유한다. "부유체"가 전이 마커의 RT-PCR 측정에 의해 입증되는 바와 같이 가장 높은 전이 잠재력을 갖는 세포이기 때문에, "부유체"를 보유하기 위해 배지를 조심스럽게 교환한다. 7일 또는 8일에, 부유체를 수거하고, 계수한다. RT-PCR 측정을 위해 샘플을 유지한다. 측정된 주요 마커는 CXCR4이며, 이는 NME7AB에서 간단히 배양된 후 40배 내지 200배 상향조절된다.
새로 수거된 부유체 전이성 세포를, 90-일 서방형 에스트로겐 펠릿이 이식되었던 암컷 nu/nu 무흉선 마우스의 옆구리에 이종 이식하였다. 부유체 세포를 각각 10,000개, 1,000개, 100개 또는 50개 세포로 이종 이식하였다. 또한 6마리로 이루어진 각각의 군 내의 마우스 중 절반에는 32 nM NME7AB를 본래 이식 부위 근처에 매일 주사하였다. NME7AB가 없는 RPMI 배지에서 배양된 모 T47D 세포를 또한 대조군으로서 6백만개, 10,000개 또는 100개로 마우스에게 이식하였다. NME7-유도 부유체 세포를 이식한 마우스는 50개만큼 적은 수의 세 포가 이식되었을 때에도 종양이 발병되었다. 부유체 세포를 이식하고, NME7AB를 매일 주사한 마우스에서는 또한 원거리 종양이 발병되거나 다양한 기관에서 원거리 전이가 발병되었다. NME7AB에서 배양된 암 세포를 이식한 후, 인간 NME7AB를 주사한 12마리의 마우스 중 11마리, 또는 92%의 마우스에서 주사 부위에서 종양이 발병되었다. 이식 후 인간 NME7AB를 주사하지 않은 12마리의 마우스 중 단지 7마리 또는 58%의 마우스에서만 종양이 발병되었다. 종양을 나타내고, 인간 NME7AB가 주사된 11마리의 마우스 중 9마리 또는 82%의 마우스에서, 주사 부위로부터 원거리에서 다중 종양이 발병되었다. NME7AB를 주사하지 않은 마우스 중 어떤 마우스에서도 가시적인 다중 종양이 발병되지 않았다.
희생시킨 후, RT-PCR 및 웨스턴 블롯은, NME7AB를 주사한 마우스 상의 원거리 범프(bump)가 사실상 인간 유방 종양이었음을 나타내었다. 이들 기관에 대한 유사한 분석은, 원거리 범프 외에도, 마우스에서, 이식된 인간 유방암 세포의 인간 유방암 특징이 간 및 폐로 무작위로 전이되었음을 나타내었다. 예상된 바와 같이, 6백만개 세포를 이식한 마우스만 종양을 성장시켰다.
본 발명자들은, 인간 재조합 NME7AB가 NME7-X1 및 30kDa 내지 33kDa NME7 절단 생성물과 크기 및 서열 면에서 유사함을 입증하였다. 본 발명자들은, NME7AB가 암성 성장을 촉진하고, 암 세포가 종양 개시 세포(TIC)로도 지칭되는 고도로 전이성인 암 줄기세포(CSC) 상태로 가속화하도록 함을 발견하였다. 따라서, 본 발명자들은, NME7-X1, 및 DM10 도메인을 제거한 NME7 절단 생성물이 또한 암성 성장을 촉진하고, 암 세포가 종양 개시 세포(TIC)로도 지칭되는 고도로 전이성인 암 줄기세포(CSC) 상태로 가속화하도록 한다고 결론 내린다. 일례에서, NME7AB를 임의의 다른 성장 인자 또는 사이토카인의 부재 하에 무혈청 배지 중의 암 세포에 첨가하였다. 7일 내지 10일 이내에, 암 세포는 전이성 암 세포의 지표인 분자 마커, 예컨대, CXCR4의 발현의 100배 초과의 증가에 의해 입증되는 바와 같이, 고도로 전이성인 CSC/TIC로 반전되었다. 일례에서, T47D 유방암 세포를 표준 RPMI 배지 또는 최소 줄기세포 배지(실시예 1)에서 배양하였으며, 이 배지에 재조합 NME7AB를 16nM의 최종 농도로 첨가하였다. 10일 후, 세포를 수집하고, CSC의 분자 마커의 발현에 대해 RT-PCR로 분석하였으며, 이러한 발현은 10배 내지 200배만큼 상승되었다(도 2). 이는, 본 발명자들이 하나의 유형의 암 세포를 보다 전이성 상태로 형질전환시킨 방법을 나타내는 구체적인 상세한 예이다. 이러한 방식으로 형질전환되는 암 세포는 광범위하게 존재하며, 줄기세포를 보다 미경험 상태로 반전시키며 또한 암 세포를 보다 전이성 상태로 진행시키는 시약이 광범위하게 존재하며, 첨가되는 시약이 암 세포를 형질전환시키는 농도도 광범위하기 때문에, 본 발명은 이들 상세한 사항에 의해 제한되지 않아야 한다. 다른 유형의 암 세포는, 전이 마커의 급격한 상향조절 및 이식된 매우 적은 수의 암 세포로부터 종양을 형성하는 능력을 위해서는 NME7AB에서 보다 장기간 동안 배양될 필요가 있었다. 예를 들어, NME7AB, 2i, 인간 NME1, 또는 인간 NME1 또는 인간 NME7에 대해 높은 상동성을 갖는 박테리아 NME1에서 배양된 전립선암 세포는 2회 내지 3회의 계대 후, 전이 마커의 급격한 증가를 나타내었다.
전이 마커 CXCR4는 특히 전이성 유방암 세포에서 상승되는 한편, CHD1은 특히 전이성 전립선암에서 상승된다. 본 명세서에서, 본 발명자들은, 만능 줄기세포 마커, 예컨대, OCT4, SOX2, NANOG, KLF2/4 및 TBX3 또한 암 세포가 보다 전이성 세포로 형질전환될 때 상향조절된다는 것을 발견하였다.
DU145 전립선암 세포를 유사하게 배양하였으며, NME7AB에서 배양된 세포 또한 CSC 마커의 발현의 급격한 증가를 나타내었다(도 3). 전립선암 세포에서, CHD1(즉, E-카드헤린) 및 CXCR4는 다른 만능 줄기세포 마커와 함께, NME7AB에서 성장되지 않은 대조군 암 세포에 비해서 상향조절되었다. 도 20A 내지 도 20C는, 난소 암 세포주 SK-OV3, OV-90 및 유방암 세포주 MDA-MB가 모두 부착성 세포를 비-부착성 부유체 세포로 전이시켰으며, NME7AB와 배양한 지 72시간 또는 144시간 후, 전이 마커의 발현을 증가시켰음을 나타낸다. 난소암 세포, 췌장암 세포 및 흑색종 세포가 또한 NME7AB에서 배양되었으며, 배양 3일 후에 보다 전이성 상태로 형질전환되었다. 도 21은 유방암 세포, 난소암 세포, 췌장암 세포 및 흑색종 세포가 MUC1 및 MUC1*를 발현한다는 것을 나타낸다.
본 명세서에서, 본 발명자들은, NME7AB가 광범위한 암 세포를 보다 전이성 상태로 형질전환시킨다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 또한 암 세포가 재조합 NME7AB 33kDa과 대략 동일한 분자량을 갖는 자연 발생 종을 발현하고(도 17, 도 18), 도 19, 및 도 22), 또한 NME7AB와 유사하게 DM10 도메인을 포함하지 않고, 또한 N-말단에 33개의 아미노산이 누락된 것을 제외하고는 NME7AB와 동일한 서열인 대체 아이소폼 NME7-X1 30kDa을 발현한다는 것을 발견하였다. 공동-면역침전 실험을 T47D 유방암 세포 상에서 수행하였으며, 여기서, 세포 추출물을 MUC1 세포질 꼬리에 대한 항체인 Ab-5 또는 대조군 항체인 IgG와 함께 인큐베이션시키고, 공동-면역침전시켰다. 면역침전된 종을 겔 전기영동에 의해 분리하였다. 겔을 2개의 상이한 상업적으로 입수 가능한 항-NME7 항체로 블로팅하였다. 두 겔 모두 약 33kDa 및 약 30kDa에서 고유한 NME7 밴드를 나타낸다(도 22A 및 도 22B). 겔을 제거하고, MUC1*, 항-PSMGFR(도 22C 및 도 22D)의 세포외 도메인에 대한 항체로 재프로빙하였는데, 이는 NME7 종 및 MUC1*이 상호작용함을 나타낸다. 재조합 NME7AB와 본 발명자들이 만든 재조합 NME7-X1을 함께 혼합하고, 겔에서 전개시킨 다음, 항-NME7 항체로 프로빙하였는데, 이는 유방암 세포에서 자연적으로 발생하고, MUC1*와 상호작용하는 2개의 고유한 NME7 종이 NME7AB-유사 종 및 NME7-X1임을 나타낸다(도 22E). 유사한 실험을 인간 줄기세포에서 수행하였다. 도 23A 내지 도 23C는 공동 면역침전 실험의 웨스턴 블롯 사진. 인간 유도 만능 줄기, iPS7 또는 배아 줄기, HES3, 세포 추출물을 MUC1 세포질 꼬리에 대한 항체인 Ab-5 또는 대조군 항체인 IgG와 함께 인큐베이션시키고, 공동 면역침전시켰다. 겔을 상업적으로 입수 가능한 항-NME7 항체 B9로 블로팅하였다(도 23A). 두 세포 유형은 모두 약 33kDa 및 약 30kDa에서 고유한 NME7 밴드를 나타낸다. 겔을 제거하고, MUC1*, 항-PSMGFR(도 23B)의 세포외 도메인에 대한 항체로 재프로빙하였는데, 이는 NME7 종 및 MUC1*이 상호작용함을 나타낸다. 재조합 NME7AB와 본 발명자들이 만든 재조합 NME7-X1을 함께 혼합하고, 겔에서 전개시킨 다음, 항-NME7 항체로 프로빙하였는데, 이는 유방암 세포에서 자연적으로 발생하고, MUC1*와 상호작용하는 2개의 고유한 NME7 종이 NME7AB-유사 종 및 NME7-X1임을 나타낸다(도 23C). NME7AB가 재조합 단백질이기 때문에, 본 발명자들은 자연 발생 종이 1개 내지 15개의 부가적인 여분의 아미노산을 함유할 수 있는지 또는 동일한 겉보기 분자량으로 전개되지만 재조합 NME7AB보다 1개 내지 15개의 부가적인 아미노산을 포함하지 않을 수 있는지 알지 못한다. "NME7AB-유사"란, 본 발명자들은, 대략 33kDa의 겉보기 분자량으로 전개되는 NME7 종이 암 세포 성장을 자극할 수 있고, 보다 전이성 상태로의 암 세포의 변이를 유도하고, 인간 줄기세포의 전분화능 성장을 전적으로 지지할 수 있다는 점에서, 재조합 NME7AB가 수행하는 방식으로 작용할 수 있음을 의미한다.
본 발명자들은, NME7 및 보다 낮은 분자량의 NME7 종을 발현하는 암 세포주 및 암 세포 집단이, CSC 또는 전이성 암 세포인 일부 암 세포를 함유한다고 결론 내린다. 이들 암은 보다 전이성으로 될 수 있거나, NME7AB, NME7-X1 또는 보다 낮은 분자량의 NME7 종에서 세포를 배양함으로써 전이성 세포 집단을 증가시킬 수 있다. 도 19는 NME7뿐만 아니라 33kDa에서 보다 낮은 분자량을 가진 종인 NME7AB-유사 및 30kDa에서 NME7-X1을 모두 발현하는 암 세포 패널의 웨스턴 블롯을 도시한다. 도 21은, 유방암 세포주 T47D, 전립선암 세포주 PC3 및 DU145, 유방암 세포주 BT-474, 둘 다 흑색종 세포주인 CHL-1 및 A2058, 및 둘 다 췌장 세포주인 CAPAN-2 및 PANC-1이 MUC1 및 MUC1*을 발현함을 나타낸다. 도 21A에서, BT474 세포가 MUC1 또는 MUC1*를 발현하지 않는 것으로 보이지만, 본 발명자들은 이전에(문헌[Fessler et al 2009]), 이들 HER2 양성 유방암 세포가 화학요법 약물에 대해 내성으로 될 때, 즉, 전이성으로 될 때, 이들 세포는 MUC1*의 발현을 증가시킴으로써 이를 수행한다는 것을 나타내었다(도 21D). 항-MUC1* Fab를 사용하여 MUC1*수용체를 차단하는 것은 허셉틴(도 21E), 탁솔(도 21F)뿐만 아니라 다른 화학치료제에 대한 이들의 내성을 반전시켰다. 이들 유형의 암 및 NME7 및 보다 낮은 분자량, 예컨대, 33kDa, 30kDa의 NME7 종을 발현하는 다른 유형의 암은 보다 전이성으로 될 수 있거나, NME7AB, NME7-X1 또는 보다 낮은 분자량의 NME7 종에서 세포를 배양함으로써 전이성 세포 집단을 증가시킬 수 있다.
이에 반해서, 이들 암 및 NME7과 보다 저분자량의 NME7 종, 예컨대, 33kDa 또는 30kDa NME7 종을 발현하는 다른 암 유형의 전이 잠재력은 세포를 항-NME7 항체로 치료함으로써 반전될 수 있다. 항-NME7 항체, 또는 NME7AB 또는 NME7-X1에 결합하는 항체는 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암 및 간암을 비롯한 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여된다. 본 발명자들이, NME7AB가 MUC1* 성장 인자 수용체에 결합하고 이를 활성화시킴으로써 NME7AB의 종양원성 효과를 발휘함을 나타내었기 때문에, 항-NME7 항체는 유방암, 폐암, 간암, 췌장암, 위암, 결장직장암, 전립선암, 뇌암, 흑색종, 신장암 및 다른 암 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 MUC1* -양성 암에 대해 효과적일 것이다. 항-NME7 항체, 항-NME7AB 항체 또는 항-NME7-X1 항체는, NME7AB, NME7AB-유사, NME7-X1 양성 또는 MUC1*양성인 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여된다.
효과적인 요법을 위한 환자 암 세포의 시험
NME7AB, NME7-X1뿐만 아니라 2i, 및 줄기세포를 보다 미경험 상태로 반전시키는 다른 시약은 또한 암 세포가 보다 전이성 상태로 형질전환되도록 유도한다. 이들 시약 중 임의의 하나 또는 조합물을 사용한 치료 후, 암 세포는 보다 높은 이식률을 가지며, 시험 동물에서 종양을 형성하는 데 있어서 100,000배까지 더 적은 수의 세포를 필요로 한다. 따라서, 본 개시내용에서 언급되는 방법은 환자의 원발성 종양 세포를 시험 동물 내로 이종 이식시킬 수 있는 데 사용될 수 있다.
그 다음, 후보물질 치료제를 수여자 동물에서 시험할 수 있다. 이러한 방식으로 확인된 효과적인 치료제는 공여자 환자 또는 유사한 암을 가진 다른 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 특정 환자 또는 특정 유형의 암에 효과적인 치료제를 확인하는 방법은 하기 단계를 포함한다: 1) 세포주, 환자, 또는 시험될 치료제를 투여될 환자 로부터 암 세포를 얻는 단계; 2) 암 세포를, NME7AB, NME7-X1, 인간 NME1, 인간 NME1 또는 NME7에 대해 높은 상동성을 갖는 박테리아 NME1, 2i, 또는 줄기세포를 보다 미경험 상태로 반전시키는 것으로 공지된 다른 시약 내에서 배양하는 단계; 3) 생성된 암 세포를, 인간 NME7AB, NME7-X1, 인간 NME1, 인간 NME1 또는 NME7에 대해 높은 상동성을 갖는 박테리아 NME1, 2i, 또는 줄기세포를 보다 미경험 상태로 반전시키는 것으로 공개된 다른 시약이 또한 투여될 수 있는 시험 동물 또는 동물이 인간 NME7AB 또는 NME7-X1에 대해서 트랜스제닉인 시험 동물에게 이식하는 단계; 4) 후보물질 항암 치료제를 동물에게 투여하는 단계; 5) 치료제의 효능을 평가하는 단계; 및 6) 효과적인 치료제를 공여자 환자 또는 유사한 암을 가진 또 다른 환자에게 투여하는 단계.
항-NME7 항체
항-NME7 항체는 강력한 항암제이다. NME7은 암 세포의 성장을 촉진하며, 암 세포가 보다 전이성 상태 또는 보다 공격적인 상태로 진행되는 것을 촉진하는 성장 인자이다. NME7 및 절두된 형태의 NME7은 약 33kDa 또는 30kDa이며, 임의의 다른 성장 인자 또는 사이토카인을 포함하지 않는 무혈청 배지에서조차 암 성장을 전적으로 지지하는 것으로 나타났다. 풀-다운 검정, ELISA 및 나노입자 결합 실험에서, 본 발명자들은, 성장 인자 수용체 MUC1*이 NME7 및 NME7AB의 결합 파트너임을 나타내었다. 모든 다른 성장 인자 또는 사이토카인을 제거함으로써 이러한 상호작용을 촉진하는 것은 암 줄기세포 마커의 발현을 증가시켰다. 혈청의 존재 하에서조차 NME7에 특이적으로 결합하는 다클론성 항체를 사용하여 이러한 상호작용을 차단하는 것은 암 세포를 능동적으로 살해하였다. 따라서, 항-NME7 항체 또는 항-NME7AB 항체는 암 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여될 수 있는 강력한 항암제이다. 모든 암들 중 75% 초과는 MUC1* 양성이다. MUC1*는 MUC1의 막투과 절단 생성물이며, 여기서, 대부분의 세포외 도메인은 탈락되었으며, 따라서, 대부분의 PSMGFR 서열을 함유하며, PSMGFR 서열의 경계에 9개 내지 20개의 부가적인 아미노산 N-말단을 함유할 수 있는 세포외 도메인의 일부가 남겨진다.
본 발명의 일 양상은 항-NME7 항체를 유효량으로 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하거나 예방하는 방법이다. 일례에서, 항-NME7 항체는 NME7AB에 결합할 수 있다. 또 다른 예에서, 항-NME7 항체는 NME7-X1에 결합할 수 있다. 또 다른 예에서, 환자에게 투여되는 항-NME7 항체는 암의 촉진 시 NME7과 이의 표적 사이의 결합을 저해하거나 방지한다. 일례로, 표적은 절단된 MUC1의 세포외 도메인이다. 보다 구체적으로는, 암을 촉진하는 NME7 표적은 MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 영역이다. 일 양상에서, 효과적인 치료제는 NME7 종과, 주로 MUC1*의 PSMGFR 부분 또는 PSMGFR 펩타이드로 이루어진 MUC1*세포외 도메인 사이의 상호작용을 방해하거나 저해하는 것이다. 암 치료 또는 예방용 작용제는, NME7, NME7AB-유사 절단 생성물, 또는 NME7-X1을 비롯한 대체 아이소폼의 발현 또는 기능을 직접 또는 간접적으로 저해하는 작용제이다. 일례로, 효과적인 항암 치료제는, NME7 종에 결합하거나 이의 종양원성 활성을 불능화시키는 것이다. 암 치료 또는 예방에 효과적인 치료제는, NME7, NME7AB-유사 절단 생성물, 또는 대체 아이소폼 또는 NME7-X1에 결합하거나 이들을 불능화시키는 작용제이다. 일 양상에서, NME7 종에 결합하는 치료제는 항체이다. 항체는 다클론성 항체, 단클론성 항체, 이중특이적 항체, 2가 항체, 1가 항체, 단쇄 항체, scFv, 기원이 동물일 수 있는 항체 모방체, 인간-동물 키메라 항체, 인간화된 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 항체는 NME7 종 또는 이의 단편과 함께 인큐베이션되거나 이를 사용하여 면역화됨으로써 생성될 수 있거나, NME7, NME7AB-유사 절단 생성물, 또는 NME7-X1을 비롯한 대체 아이소폼을 비롯한 NME7 종에 결합하는 능력에 대해 예를 들어, 항체 라이브러리 또는 항체 풀로부터 선택될 수 있다.
항-NME7 항체의 생성
항-NME7 항체는 숙주 동물에서와 같이 환자의 외부에서 생성되거나 환자 내에서 생성될 수 있다. 항체는 NME7 또는 NME7 단편의 면역화에 의해 생성되거나, 목적하는 NME7 종, 예컨대, NME7AB 또는 NME7-X1로의 결합 능력에 기초하여 자연 항체, 합성 항체, 전체 항체 또는 항체 단편일 수 있는 항체 라이브러리 또는 항체 풀로부터 선택될 수 있다. 일 양상에서, 항체는 도 6 내지 도 9에 열거된 펩타이드부터 선택되는 펩타이드를 사용한 면역화에 의해 생성되거나, 이러한 펩타이드에 결합하는 능력에 대해 선택된다. 또 다른 양상에서, 항체는 인간 NME1의 서열과 일치하지 않는 서열을 갖는 펩타이드로부터 생성되거나, 항체는 NME7 종에 대한 결합 능력 및 인간 NME1에 대한 결합 불능에 대해서 선택된다.
암 성장을 저해하고 전이로의 전이를 저해하는 항체를 유발하는 NME7 또는 NME7-X1 유래의 펩타이드 또는 그 자체가 저해성인 펩타이드를 식별하는 데 사용되는 하나의 방법은 하기와 같다: 1) 인간 NME1, 인간 NME7, 인간 NME7-X1, 및 인간 NME1 또는 인간 NME7 중 하나에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 몇몇 박테리아 또는 진균 NME 단백질의 단백질 서열을 정렬하는 단계; 2) 모든 NME 중에서 높은 서열 상동성을 갖는 영역을 식별하는 단계; 3) NME7 또는 NME7-X1에 고유하지만, 높은 서열 상동성을 갖는 영역에 측접하는 펩타이드 서열을 식별하는 단계. 이어서, 펩타이드를 합성하고, 이를 사용하여 인간 또는 숙주 동물에서 항체를 생성시킨다. 생성된 항체는, 1) 이들이 NME1이 아닌 NME7AB 또는 NME7-X1에 결합하거나; 2) 암 성장을 저해하는 능력을 갖거나; 3) 암 세포가 더 전이성인 상태로 전이되는 것을 저해하는 능력을 갖거나; 4) 생체내에서 전이를 저해하면 치료 용도를 위해서 선택된다. 일부 경우에, 치료용 용도를 위한 항체는 MUC1* 세포외 도메인에 대한, PSMGFR 펩타이드에 대한 또는 N-10 펩타이드에 대한 NME7AB 또는 NME7-X1의 결합을 방해하는 능력에 대해서 선택된다.
암의 치료를 위한 항-NME7 항체의 용도
암 성장 또는 보다 전이성 상태로의 변이를 저해하는 항체는 항암 치료제로서 사용되도록 선택되며, 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여될 수 있다. 선택된 항체는 예를 들어, 인간 키메라 항체 또는 전체 인간 항체를 조작하거나 제조함으로써 추가로 최적화될 수 있다. 이러한 접근법의 효능을 입증하기 위해, 본 발명자들은 암성 기능에 중요한 것으로 의심되는 NME7 영역으로부터 NME7 펩타이드를 선택하였다. 이어서, 본 발명자들은 이들 펩타이드를 사용하여 항체를 생성한 다음, 생성되는 항체뿐만 아니라 면역화 펩타이드 둘 다를 하기 능력에 대해 시험하였다: a) 암성 성장을 저해하는 능력; 및 b) 암 세포로부터 전이성 암 세포로의 유도 전이를 저해하는 능력. NME7 펩타이드를 항체 생성을 위한 면역화 작용제로서, 그리고 그 자체를 저해제로서 선택하였다(도 9 및 실시예 7). 펩타이드 A1(서열번호141), A2(서열번호142), B1(서열번호143), B2(서열번호144) 및 B3(서열번호145), 여기서, A는 펩타이드가 유래되는 도메인, 즉, NDPK A 도메인을 지칭하고, B는 펩타이드가 NDPK B 도메인으로부터 유래됨을 나타낸다(도 5). 각각의 펩타이드는 면역원으로서 사용되었으며, 다클론성 항체의 제조를 위해 2마리의 토끼에게 각각 주사되었다. 면역화된 토끼의 혈액으로부터 수집한 항체를 면역화 펩타이드를 사용하여 유도체화된 칼럼에서 정제하였다. 이어서, 정제된 항체를 인간 NME7로의 결합 능력에 대해 시험하였다. 목적하는 바와 같이 생성된 모든 항체는 인간 NME1이 아니라 인간 NME7에 결합하였다(도 10A 및 도 10B, 실시예 8). 이들 결과는, 서열이 NME1에서 정확하게 일치하지는 않지만 NME7에서 발견되는 펩타이드를 선택함으로써, NME1이 아니라 NME7에 특이적으로 결합하는 항체가 생성된다는 것을 나타낸다. NME1이 건강한 기능을 가지기 때문에, 대부분의 경우, NME1을 방해하지 않는 항체를 생성하는 것이 바람직하다. 항체를 또한 MUC1* 세포외 도메인 펩타이드에 대한 NME7의 결합을 저해하는 능력에 대해 시험하였다. 도 11에 도시된 ELISA 실험은, 항체가, NME1의 결합을 저해했던 것보다 MUC1* 세포외 도메인 펩타이드에 대한 NME7AB의 결합을 훨씬 더 크게 저해하였음을 나타낸다. NME7 A 도메인 및 B 도메인 각각이 PSMGFR 펩타이드에 결합할 수 있다는 것을 상기하기 바란다. 따라서, PSMGFR 펩타이드에 대한 NME7AB 결합의 완전한 저해는 단 하나의 도메인으로부터 유래된 단일 항체 또는 펩타이드로 달성될 수 없다. 이들 항체와 각각의 면역 펩타이드도 암 세포 성장을 저해하였다(도 12 및 도 13). 이 항체는 또한 NME7AB에서 성장하는 암 세포로 인한 비-부착성 "부유체" 세포의 형성을 저해하였다(도 14). 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, B3 펩타이드로의 면역화에 의해서 생성된 다클론성 항체는 전이성 부유체 세포의 수를 95% 감소시켰는데, 이는 B3 펩타이드에 결합하는 항-NME7 항체가 암 전이를 저해하는 데 있어서 가장 효과적임을 나타낸다. 유사하게, 항체는 전이 마커 CXCR4의 발현을 저해하였다(도 15A). 다시 말하지만, B3 항체는 CXCR4의 발현을 억제하는 데 가장 효율적이었고; 막대로 표지된 NME7 FL(NME7 부유체 세포)은 B3 항체 61이 20배로 감소한 CXCR4의 70배 증가를 나타낸다(NME7+61 FL로 표지된 막대). 또한 면역 펩타이드 자체는 T47D 암 세포가 NME7AB 또는 2i에서 성장했을 때 CXCR4 및 기타 전이 마커의 상향 조절을 저해하였다.
그러나, 이는 NME7 및 NME7 종의 암성 기능을 저해하는 항체를 생성하는 펩타이드를 선택하는 일례이다. 인간 NME1, 인간 NME7, 인간 NME7-X1, 및 인간 NME1 또는 NME7에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 박테리아 NME 단백질 사이에서의 서열 정렬은 5개의 상동성 영역을 식별하였다. 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3가 모두 암 성장 또는 전이성 상태로의 변이를 저해한 항체를 생성하였다는 사실은, 이들 펩타이드가 유래되는 5개의 영역이 암의 촉진에 있어서 이의 기능에 중요한 NME7의 영역임을 의미한다. 이들 영역으로부터의 다른 펩타이드가 또한 암 성장 및 전이를 저해할 항-NME7 항체를 생성할 것이며, 따라서, 강력한 항암 치료제이다. 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3로부터 생성된 항체는 암 성장을 저해하는 것으로 나타났으며, 보다 전이성 상태로의 전이를 저해하였다. 동일하거나 유사한 펩타이드를 사용한 면역화에 의해 생성된 단클론성 항체 및 이러한 단클론성 항체의 후속적인 시험은, 당업계에 공지된 인간화 또는 다른 조작 후, 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여될 항체를 식별할 것이다.
특정 실험에서, 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3를 사용한 면역화에 의해 생성된 항체뿐만 아니라 면역화 펩타이드 자체를 배양 중인 암 세포에 첨가하여, 항체 또는 면역화 펩타이드의 첨가가 암 세포 성장을 저해할 것인지를 살펴보았다. 낮은 농도에서 개별적으로 첨가되어도, 항체뿐만 아니라 면역화 펩타이드는 암 세포 성장을 저해하였다(일례를 위해서, 도 12). 그러나, 보다 고농도에서 첨가되거나 조합하여 첨가되었을 때, 항체뿐만 아니라 면역화 펩타이드는 암 세포 성장을 강력하게 저해하였다(도 13). 면역화 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3의 상응하는 인간 NME7 아미노산 수는 서열번호 82 또는 147을 갖는 인간 전장 NME7으로부터 각각 127 내지 142, 181 내지 191, 263 내지 282, 287 내지 301, 343 내지 371이다.
명확성을 위해서, NME7의 잔기 수가 논의될 때, 이들 수는 서열번호82 또는 147에 표시된 바와 같이 NME7의 잔기 수를 지칭한다.
암 성장 저해 실험에서 사용된 항체 및 도 12에 도시된 항체 중 하나는 NME7의 아미노산 100 내지 376(서열번호 82 또는 147)에 상응하는 NME7 펩타이드를 사용한 면역화에 의해 생성되었다. 보다 높은 친화성이고, 특이적인 항-NME7 항체를 생성시키기 위해서, 하기 단계들이 후속된다: 인간 NME7 아미노산 100 내지 376을 함유하는 펩타이드로 동물을 면역화시키고, 이어서, 1) 인간 NME1에 결합하는 항체를 탈락시키는 단계; 2) NME7AB, 2i 또는 보다 전이성 상태로의 암 세포의 변이를 유도하는 다른 NME를 저해하는 항체를 선택하는 단계; 3) 암 세포의 성장을 저해하는 항체를 선택하는 단계; 4) MUC1* 양성 암 세포의 성장을 저해하는 항체를 선택하는 단계; 5) MUC1* 세포외 도메인으로의 NME7AB 또는 NME7-X1의 결합을 저해하는, 본질적으로 PSMGFR 펩타이드에 대한 결합을 저해하는 항체를 선택하는 단계; 및/또는 6) 도 9에 열거된 펩타이드 - A1, A2, B1, B2 또는 B3 펩타이드 중 하나 이상에 결합하는 항체를 선택하는 단계.
보다 높은 친화성을 가진 단클론성 항체, 또는 더 긴 펩타이드로부터 생성되는 단클론성 항체는 보다 효과 적인 항체 치료제일 수 있다. 대안적으로, 효능을 증가시키기 위해, 항-NME7, 항-NME7AB 또는 항-NME7-X1 항체의 조합물이 환자에게 투여된다.
항-NME7 항체는 암 세포의 전이성 암 세포로의 전이를 저해한다.
항-NME7 항체는 암 줄기세포(CSC) 또는 종양 개시 세포(TIC)라고도 지칭되는 전이성 암 세포로의 암 세포의 전이를 저해한다. 본 발명자들이, NME7AB의 존재 하에 광범위하게 다양한 암 세포를 배양하면, NME7AB가 보통의 암 세포로부터 전이성 CSC 또는 TIC로의 변이를 유발함을 입증하였음을 상기하기 바란다. 따라서, NME7, NME7AB 또는 NME7- X1에 결합하는 항체는 보다 전이성 상태로의 암 세포의 진행을 저해할 것이다.
암 세포는 줄기세포를 보다 미경험 상태로 반전시키는 작용제의 존재 하에 배양되었을 때, 보다 전이성 상태로 형질전환된다. 본 발명자들은, NME7AB, 인간 NME1 이량체, 박테리아 NME1 이량체, 또는 "2i"로 지칭되는 MEK 및 GSK3-베타 저해제에서 암 세포를 배양하면, 세포가 보다 전이성 상태로 된다는 것을 입증하였다. 세포가 보다 전이성 상태로 전이됨에 따라서, 세포는 비-부착성 또는 덜 부착성인 상태가 되고, 배양 플레이트로부터 부유한다. 이들 부유하는 세포인 "부유체"를 부착성인 세포로부터 개별적으로 수집하였으며, 이들은, a) 전이성 유전자를 훨씬 더 높은 수준으로 발현하고; b) 매우 낮은 카피 수로 마우스 내로 이종 이식되었을 때, 종양을 형성하는 것으로 나타났다. RT-PCR 측정값에서, 특이적인 전이 마커, 예컨대, 유방암의 경우 CXCR4, 전립선암의 경우 CHD1, 및 다른 만능 줄기세포 마커, 예컨대, OCT4, SOX2, NANOG, KLF4 및 다른 마커는 NME7AB에서 배양된 암 세포에서 급격하게 과발현되었으며, 본 명세서 및 도면에서 "부유체"로 지칭되는 비-부착성이된 세포에서 극적으로 과발현되었다.
일례에서, NME7-유래 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3를 사용한 면역화에 의해 생성된 NME7AB 특이적인 항체뿐만 아니라 면역화 펩타이드 그 자체를 NME7AB 또는 2i와 함께 배지에 첨가하여, 이들이 보통의 암 세포에서 전이성 암 줄기세포로의 형질전환을 저해하였는지 확인하였다. 항체 및 펩타이드를 전이성 변환을 유발하는 작용제 와 함께 개별적으로 첨가하였으며; 이 경우, NME7AB 또는 2i 저해제 PD0325901 및 CHIR99021였다. NME7AB 및 2i를 개별적으로 사용하여, 형질전환되는 암 세포를 보다 공격적인 전이성 상태로 유도하였다. 2i를 사용하여, 배지에 첨가된 항체가 단순히 NME7AB를 모두 흡수하였는지에 대해 논쟁이 없도록 할 수 있었으며, 따라서, 원인 물질(causative agent)은 배지에 효과적으로 존재하지 않았다(실시예 10).
실험이 진행됨에 따라, 2명의 과학자들이 시각적인 관찰을 독립적으로 기록하였다(도 14). 가장 놀라운 관찰은, 항체 및 펩타이드가 부유체 세포의 수를 급격하게 감소시킨 것이며, 이는, 항체 및 펩타이드가 전이성 암 세포로의 형질전환을 저해한다는 제1 지표였다. 특히, B3 펩타이드를 사용한 면역화로부터 항체가 생성된 세포는 임의의 부유체 세포를 거의 생성하지 않았다. mRNA를 부유체 세포, 부착성 세포 및 대조군 암 세포 모두로부터 추출하였다. 세포의 생존력 및 성장을 나타내는 mRNA의 양을 측정하였다. 항체로 처리한 세포는 훨씬 더 적은 양의 mRNA를 가졌으며, 이는 살아있는 분화성 세포가 더 적음을 나타내고(도 16), 이는, 항-NME7AB 항체가 암 세포 성장뿐만 아니라 보다 전이성 상태로의 암 세포의 전이를 저해함을 나타낸다. RT-PCR을 사용하여, CXCR4를 비롯한 전이 마커의 발현 수준을 측정하였다. 항-NME7 항체를 사용한 치료는 전이 마커, 예컨대, CXCR4의 양을 크게 감소시켰으며, 이는, 항-NME7 항체 또는 펩타이드가 전이성 암으로의 전이를 저해한다는 것을 나타낸다(도 15A 내지 도 15C). 이들 결과는, NME7AB에 결합하는 항체가 전이성 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여될 수 있음을 나타낸다.
NME7 AB 또는 NME7-X1 유래의 펩타이드는 온전한 NME7 AB 및 NME7-X1의 결합을 경쟁적으로 저해하고, 항암제이다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 암의 치료 또는 예방을 위한 치료제는 NME7 서열 유래의 펩타이드이며, 이는 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여된다. 일 양상에서, 전체 NME7보다 더 짧고, NME7의 발암 활성을 부여할 수 없고, NME7의 표적에 결합하고, 암을 촉진하는 온전한 NME7과 이의 표적과의 상호작용을 경쟁적으로 저해해야 하는 NME7-유래 펩타이드가 환자에게 투여된다. NME7AB가 발암 활성을 완전히 부여할 수 있기 때문에, NME7AB의 서열은 보다 짧은 펩타이드(들)에 대한 공급원으로서 바람직하며, 여기서, 펩타이드 자체는 암성 성장 또는 다른 종양원성 활성 또는 발암 활성을 촉진할 수 없는 것이 확인되어야 한다. 바람직한 실시형태에서, NME7AB의 일부의 서열을 가지며, 바람직하게는 길이가 약 12개 내지 56개 아미노산인 하나 이상의 펩타이드가 환자에게 투여된다. 반감기를 증가시키기 위해, 펩타이드는 펩타이드 모방체, 예컨대, 비자연 골격을 갖는 펩타이드 또는 L에 대한 D-형태 아미노산을 갖는 펩타이드일 수 있다. 또 다른 경우에서, 항암 치료제는 펩타이드 또는 펩타이드 모방체이며, 여기서, 펩타이드는 NME7, NME7AB 또는 NME7-X1, 또는 이의 표적이며, 본 명세서에서 일부 경우에 "FLR"로도 지칭되는 PSMGFR 펩타이드를 포함하는 MUC1* 세포외 도메인의 적어도 하나의 부분과 고도로 상동성인 서열을 갖는다.
도 6 내지 도 9는 NME7과 이의 동족 표적 사이의 결합을 저해하는 것으로 예측되는 바람직한 아미노산 서열의 목록을 제공한다. 추가로 더 바람직한 실시형태에서, 암 환자 또는 암이 발병할 위험이 있는 환자에게 투여하기 위해 선택된 펩타이드는 이들이 NME7 결합 파트너에 결합하고, 그 자체는 종양원성 활성을 부여하지 않기 때문에 선택된다. 추가로 더 바람직한 실시형태에서, NME7 결합 파트너는 MUC1*의 세포외 도메인이다. 추가로 더 바람직한 실시형태에서, NME7 결합 파트너는 PSMGFR 펩타이드이다.
용어 "종양원성 활성 또는 발암 활성을 부여하는"은, 펩타이드 그 자체는 암의 성장을 지지하거나 촉진할 수 없음을 의미한다. NME7로부터 유래된 펩타이드 또는 펩타이드들이 종양 형성을 촉진할 수 있는지의 여부를 시험하는 또 다른 방식은, 펩타이드가 인간 줄기세포의 전분화능 성장을 지지할 수 있는지를 시험하는 것이다. 전분화능 인간 줄기세포 성장을 지지하는 NME 단백질 및 펩타이드는 또한 암 성장을 지지한다. 또 다른 방법에서, 펩타이드가 체세포를 덜 성숙한 상태로 반전시킬 수 있다면 이러한 펩타이드는 탈락된다
NME7AB의 단편은 암 세포 성장 및 보다 전이성 상태로의 암 세포의 전이를 저해한다. 입증된 바와 같이, 개별적으로(도 12) 또는 조합하여(도 13) 첨가된 NME7 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3는 암 세포의 성장을 저해한다. 또한 NME7 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3는 보다 전이성 상태로의 암 세포의 전이를 저해하였다(도 15).
따라서, NME7에 특이적인 펩타이드 및 NME7AB 또는 NME7-X1에 특이적인 펩타이드를 사용하여 면역화함으로써 생성되는 항체는 NME7 종의 암성 작용을 차단할 것이며, 강력한 항암제일 것이다. 유사하게는, 이들 결과는, NME7에 특이적이고 NME7AB 또는 NME7-X1에 특이적인 펩타이드가 NME7 종의 암성 작용을 차단할 것임을 나타낸다. 본 발명의 일 양상에서, 펩타이드는 도 6에 도시된 목록으로부터 선택된다. 본 발명의 일 양상에서, 펩타이드는 도 7에 도시된 목록으로부터 선택된다. 본 발명의 일 양상에서, 펩타이드는 도 8에 도시된 목록으로부터 선택된다. 본 발명의 추가의 또 다른 양상에서, 펩타이드는 도 9에 도시된 목록으로부터 선택된다. 이들 항체는 면역화에 의해서 생성될 수 있거나 다른 수단에 의해서 생성되거나 선택될 수 있고, 이어서 NME7, NME7AB, NME7-X1 또는 NME7 유래 펩타이드 A1(서열번호 141), A2(서열번호 142), B1(서열번호 143), B2(서열번호 144) 또는 B3(서열번호 145)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 NME7 유래 펩타이드에 결합하는 능력에 대해서 선택될 수 있다. 이러한 항체는 다클론성, 단클론성, 이중특이적, 2가, 1가, 단쇄, scFv, 인간 또는 인간화될 수 있거나 특이적 표적에 결합하는 인식 영역을 제시하는 단백질 스캐폴드와 같은 항체 모방체일 수 있다.
암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-NME7 항체는 당업계에 공지된 표준 방법에 의해 생성될 수 있으며, 여기서, 이들 방법은 NME7, NME7AB 또는 보다 짧은 형태의 NME7AB를 인지하는 항체 또는 항체-유사 분자를 생성하는 데 사용되며, 여기서, N-말단을 형성하는 부가적인 10개 내지 25개의 아미노산은 존재하지 않는다. 이러한 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 이러한 항체는 다클론성, 단클론성, 이중특이적, 2가, 1가, 단쇄, scFv, 인간 또는 인간화될 수 있거나 특이적 표적에 결합하는 인식 영역을 제시하는 단백질 스캐폴드와 같은 항체 모방체일 수 있다.
NME7 유래 펩타이드 A1(서열번호 141), A2(서열번호 142), B1(서열번호 143), B2(서열번호 144) 또는 B3(서열번호 145)로의 면역화에 의해서 생성된 항-NME7 항체 또는 A1, A2, B1, B2 또는 B3 펩타이드에 결합하는 항체는 NME7AB 및 NME7-X1에 결합하지만 일부 건강한 세포의 기능에 필요할 수 있는 NME1에 대한 결합에 저항하는 항체이다. 이러한 항체는 NME7AB 또는 NME7-X1의 이의 표적 수용체, MUC1*에 대한 결합을 저해한다. A1, A2, B1, B2 또는 B3 펩타이드에 결합하는 항체는 암 또는 전이로 진단되거나 이것이 발병할 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 이러한 항체는 다클론성, 단클론성, 이중특이적, 2가, 1가, 단쇄, scFv일 수 있거나 특이적 표적에 결합하는 인식 영역을 제시하는 단백질 스캐폴드와 같은 항체 모방체일 수 있다.
B3 펩타이드로의 면역화에 의해서 생성되는 항-NME7 항체 또는 B3 펩타이드에 결합하는 항체는 NME7AB 및 NME7-X1의 인식에 특히 특이적이다. 이러한 항체는 또한 NME7AB 또는 NME7-X1의 이의 표적 수용체, MUC1*에 대한 결합을 저해하는 데 매우 효과적이다. B3 펩타이드에 결합하는 항체는 또한 암 또는 암 전이를 예방, 저해 및 반전시키는데 예외적으로 효과적이다. 이러한 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 이러한 항체는 다클론성, 단클론성, 이중특이적, 2가, 1가, 단쇄, scFv일 수 있거나 특이적 표적에 결합하는 인식 영역을 제시하는 단백질 스캐폴드와 같은 항체 모방체일 수 있다.
B3 펩타이드로 면역화된 토끼에서 생성된 다클론성 항체 #61이 전이 마커 CXCR4의 상향조절을 차단하는 항체 #61에 의해서 입증되는 바와 같이 암 세포의 암 줄기세포로의 형질전환을 저해하였다는 것을 주목하기 바란다(도 15).
NME7로부터 유래된 B3 펩타이드(서열번호 145)는 항-NME7 항체의 생성을 복잡하게 만드는 14번 위치에서 시스테인을 갖는다. 본 발명자들은 시스테인 14를 세린으로 돌연변이시켜 AIFGKTKIQNAVHSTDLPEDGLLEVQYFF(서열번호 169)를 만들었고, 동물을 면역화시켜 항-NME7 단클론성 항체를 생성시켰다. 생성된 항체는 천연 B3 서열뿐만 아니라 B3Cys14Ser 펩타이드에 결합한다. 7개의 고 친화성 및 특이적 단클론성 항체를 생성시켰다: 8F9A5A1, 8F9A4A3, 5F3A5D4, 5D9E2B11, 5D9E10E4, 5D9G2C4 및 8H5H5G4. 그러나, 다양한 서열 정렬은 단지 3개의 고유한 서열 항체가 존재함을 나타내었다: 하기에 제시된 바와 같은 8F9A5A1, 8F9A4A3, 8F9A4P3 및 5F3A5D4. 볼드체 및 밑줄친 영역은 CDR 서열을 나타낸다.
Figure pct00001
Figure pct00002
단클론성 항체 5D9E2B11, 5D9E10E4, 5D9G2C4 및 8H5H5G4 모두는 5D4라고도 알려진 5F3A5D4와 동일한 서열을 갖는다. 본 명세서에서, 본 발명자들이 5D4라고도 하는 항체 5F3A5D4를 지칭하는 경우, 그것은 5D9E2B11, 5D9E10E4, 5D9G2C4 및 8H5H5G4에 적용된다는 것이 이해된다. 도 24 및 도 25에서 인지될 수 있는 바와 같이, 항-NME7 항체 8F9A5A1, 8F9A4A3 및 5F3A5D4 모두는 NME1이 아닌 NME7AB에 결합한다. 이는 NME7의 A 도메인이 정상 세포 기능에 필요한 NME1과 높은 상동성을 갖기 때문에 중요하다. 항암 치료제 또는 항전이 치료제의 경우 NME7AB를 저해하는 것이 필수적이지만 NME1은 저해하지 않아야 할 것이다.
도 26, 도 27 및 도 28은 이들 항-NME7 항체가 또한 MUC1* PSMGFR 펩타이드 및 N-10 PSMGFR 펩타이드에 대한 NME7AB의 결합을 방해할 수 있음을 나타낸다. 인지될 수 있는 바와 같이, MUC1* 펩타이드로부터 NME7AB의 전체 변위는 존재하지 않는다. 그러나, NME7AB는 각각 MUC1*에 결합할 수 있는 A 도메인과 B 도메인으로 구성된다. 이러한 항체는 MUC1*에 대한 B 도메인의 결합을 방해하도록 설계되었고; NME7AB의 A 도메인은 여전히 플레이트 표면의 MUC1* 펩타이드에 결합할 수 있다. 유용한 치료제의 경우, 항체는 MUC1*에 대한 하나의 도메인의 결합을 방해하기만 하면 되며, 그렇게 함으로써 MUC1* 성장 인자 수용체의 리간드 유도 이량체화 및 활성화가 차단될 것이다. NME7 B3 펩타이드 또는 B3Cys14Ser 펩타이드(서열번호 169)에 결합하는 항체 또는 항체 모방체는 암 또는 전이로 진단되거나 이의 발병 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있다.
동물 모델에서 암 세포를 전이시키는 것이 어렵다는 것은 당업계에 널리 공지되어 있다. 인간 종양에서 100,000개 중 1개 또는 심지어 1,000,000개 중 1개 정도의 암 세포가 종양에서 떨어져 나와, 다른 곳에 이식되어 전이를 시작할 수 있는 것으로 추정된다[문헌[Al-Hajj et al., 2003]]. 일부 연구자들은 면역 손상된 마우스에 주입된 T47D 유방암 세포가 약 12주 후에 전이될 것이라고 보고한다[문헌[Harrell et al 2006]]. 다른 연구자들은 AsPC-1 췌장암 세포가 약 4주 후에 전이될 것이라고 보고한다[문헌[Suzuki et al, 2013]].
본 명세서에서, 본 발명자들은 T47D 유방암 세포가 유일한 성장 인자로서 재조합 NME7AB를 함유하는 무혈청 배지에서 10일 동안 성장되었음을 나타낸다. NME7AB에서 성장했을 때 암 세포의 약 25%가 부유하기 시작했고 분열을 멈췄지만 여전히 생존할 수 있는 것으로 관찰되었다. PCR 측정은 이러한 "부유" 세포가 유방암 전이 인자 CXCR4의 발현을 크게 상향조절함을 나타내었다.
본 명세서에 제시된 일부 도면에서, 이들 부유체 세포는 암 줄기 세포(CSC)라고 지칭된다. 면역 손상된 암컷 nu/nu 마우스에게 90일 방출 에스트로겐 펠릿을 이식하였다. 500,000개의 T47D-wt 세포 또는 10,000개의 T47D-CSC(암 줄기세포)를 nu/nu 마우스의 꼬리 정맥(i.v.), 피하(s.c.) 또는 복강내 공간(i.p.)에 주사하였다. 이 암 세포는 루시페라제를 발현하도록 조작되었다. 종양 또는 암 세포를 시각화하기 위해서, 동물에게 루시페린을 주입한 다음, 10분 후 IVIS 기기에서 시각화한다. 도 33A 및 도 33B의 IVIS 측정에서 볼 수 있는 바와 같이, 6일까지 꼬리 정맥에 주입된 500,000개의 T47D-wt 세포는 살아있는 암 세포 또는 암 세포 생착의 징후를 나타내지 않는다.
극명하게 대조적으로, 꼬리 정맥에 주사된 10,000개의 T47D-CSC는 전이되었다. 제6일에 IVIS 측정 전에, T47D-CSC 마우스에게 32nM의 재조합 NME7AB를 주사하였다. 다음날, 두 CSC 마우스 중 하나에 15㎎s/㎏에 해당하는 농도에서 200uL 부피의 항-NME7 단클론성 항체 8F9A5A1, 8F9A4A3 및 5F3A5D4의 칵테일을 주사하였다. NME7AB와 항-NME7 항체의 거의 동시 주사는 항체의 효과를 무효화했을 가능성이 있다. 도 34는 제10일까지 처리된 마우스가 거의 완전히 전이되었음을 나타낸다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, 치료를 위해 선택된 마우스는 비교 가능한 T47D-CSC 마우스보다 더 전이성이다.
제10일에 그 동물에게 항-NME7 항체를 다시 주사하였다. 제12일의 IVIS 측정(도 35)은 항체 처리된 마우스가 전이를 제거하기 시작했음을 나타낸다. 제14일까지(도 36) 미처리 마우스는 만연한 전이로 사망하였고, 처리된 마우스는 전이가 없어졌다. 도 37은 500,000개의 T47D-wt 세포를 주사한 마우스와 항-NME7 처리를 제공받은 T47D-CSC를 주사한 마우스에서 항체 처리가 중단된 제17일까지 IVIS 측정의 시간 경과를 나타낸다. 인지될 수 있는 바와 같이, 제17일에 암 세포의 작은 클러스터가 남아 있었고, 제19일에는 더 커졌다. 21일까지 전이가 퍼졌고 항체 치료가 재개되었다. 도면에 나타난 바와 같이, 항-NME7 항체 치료를 재개한 후 동물은 모든 전이가 소실되었으며, 건강에 이상이 없는 것으로 나타났다.
도 38은 피하 또는 복강내 주사된 동물에 대한 IVIS 시간 경과를 나타낸다. 피하 또는 복강내로 CSC가 주사된 동물에 대한 항체 주사에도 항-NME7 항체가 s.c. 또는 i.p로 주사되었다. 이들 동물에서, 항체 주사는 제17일에 중단되었고, 재개되지 않았다. 도 39 내지 도 40은 B3 펩타이드로의 면역화에 의해서 생성된 다클론성 항-NME7 항체가 진행성 암 및 전이성 암을 염색하지만 정상 조직 또는 저등급 암은 염색하지 않는다는 것을 나타내며, 이에 의해서 100,000개 암 세포 중에서 단지 1개 또는 1,000,000개 암 세포 중에서 1개가 전이성 암 세포일 것이다. 종합하면, 이들 데이터는 항-NME7 항체 8F9A5A1, 8F9A4A3 및 5F3A5D4 또는 8F9A5A1, 또는 8F9A4A3, 또는 5F3A5D4를 암으로 진단되거나 이의 발병 위험이 있는 환자에게 투여하면 암 전이를 예방, 저해 또는 반전시킬 수 있음을 나타낸다.
항-NME7AB 항체의 칵테일로 전이성 동물을 치료하는 것 외에도, 본 발명자들은 또한 단클론성 항-NME7AB 항체를 개별적으로 투여하였고, 이들이 암 전이를 예방할 뿐만 아니라 반전시킬 수 있음을 나타내었다. 하나의 입증에서, 각각 대략 20g 체중의 암컷 nu/nu 마우스에게 8 내지 10주령 사이에 90일 에스트로겐 방출 펠릿을 이식했다. 성장 인자 NME7AB가 보충된 무혈청 배지에서 10 내지 15일 동안 배양함으로써 암 세포를 전이성으로 만들었다. 부착성 세포와 부유 세포 둘 다 전이 마커의 상향 조절을 나타내며, 동물에서는 4 내지 7일 이내에 전이할 수 있다. 이 경우, 시험관내 배양 제11일에 부유 세포를 수거하여 실험 동물의 꼬리 정맥에 주사하였다. 예방 모델을 시험하기 위해서, 전이성 암 세포를 주입하기 24시간 전에, 동물의 하나의 군에게 꼬리 정맥으로 항-NME7AB 항체 8F9A4A3 15㎎/㎏을 주사하고, 그 후 대략 48시간마다 동일한 투여량을 주사하였다. 도 42A 내지 도 42F는 10,000개의 루시페라제 양성 T47D 전이성 유방암 줄기세포를 꼬리 정맥에 주사하고, 8F9A4A3이라고도 알려진 항-NME7AB 항체 4A3로 처리한 암컷 nu/nu 마우스의 사진을 나타낸다. 암 세포를 영상화하기 위해, 루시페라제 기질인 루시페린을 IVIS 기기로 촬영하기 10분 전에 복강내에 주사한다. 도 42A 내지 도 42C는 동물을 아래로 향하게 한 IVIS 사진을 도시한다. 도 42D 내지 도 42F는 동물을 위로 향하게 한 IVIS 사진을 도시한다. 도 42A 및 도 42D는 인산염 완충 식염수 용액을 주사한 대조군 동물을 도시한다. 도 42B 및 도 42E는 전이성 암 세포를 주사하기 24시간 전에 동물에게 항-NME7AB 항체 4A3을 주사한 후, 22일 동안 총 12회 항체 주사를 위해 대략 격일로 동물에 주사한 예방 모델을 도시한다. 도 42C 및 도 42F는 전이성 암 세포를 주사한 후 24시간 후에 동물에게 항-NME7AB 항체 4A3을 주사하고, 그 다음 20일 동안 총 11회 항체 주사를 위해 대략 격일로 동물에 주사한 반전 모델을 도시한다. 도면에서 인지할 수 있는 바와 같이, 항-NME7AB 항체 8F9A4A3은 확립된 전이를 예방할 뿐만 아니라 반전시킬 수 있다.
항-NME7AB 항체 5A1 및 5D4를 또한 전이 예방에서 시험하였고, 암 전이를 상당히 저해한다는 것을 발견하였다. 도 43A 내지 도 43F는 10,000개의 루시페라제 양성 T47D 전이성 유방암 줄기세포를 꼬리 정맥에 주사하고, 8F9A5A1이라고도 알려진 항-NME7AB 항체 5A1 및 5F3A5D4라고도 알려진 5D4로 처리한 각각 대략 20g의 체중의 암컷 nu/nu 마우스의 사진을 도시한다. 암 세포를 영상화하기 위해, 루시페라제 기질인 루시페린을 IVIS 기기로 촬영하기 10분 전에 복강내에 주사한다. 도 43A 내지 도 43C는 동물을 아래로 향하게 한 IVIS 사진을 도시한다. 도 43D 내지 도 43F는 동물을 위로 향하게 한 IVIS 사진을 도시한다. 도 43A 및 도 43D는 인산염 완충 식염수 용액을 주사한 대조군 동물을 도시한다. 도 43B, 도 43E, 도 43C 및 도 43F는 전이성 암 세포를 주사하기 24시간 전에 동물에게 항-NME7AB 항체를 15㎎/㎏으로 주사한 후, 22일 동안 총 12회 항체 주사를 위해 대략 격일로 동물에 주사한 예방 모델을 도시한다. 사진은 제24일 또는 제27일에 촬영되었다. 구체적으로, 항체 5A1로 처리된 군의 마우스 #1을 제27일에 촬영하였으며, 마우스 #2 및 #3은 동물이 제26일에 사망했기 때문에 제24일에 촬영하였다.
항-NME7AB 항체 5A1 및 5D4를 또한 전이 반전 모델에서 시험하였고, 확립된 암 전이를 크게 저해하는 것을 발견하였다. 본 실험에서, 동물에게 제0일에 꼬리 정맥으로 32nM의 최종 농도에서 NME7AB와 혼합된 10,000개의 T47D 전이성 암 세포를 주사하였다. 또한 동물을 더 많은 NME7AB로 제3일과 제4일에 2회 주사하였는데, 여기서 본 발명자들의 실험은 전이를 반전시키기가 더 어려워졌다는 것을 나타내었다. 첫 번째 항체 주사는 제7일이었다. 각각의 실험 동물의 전이 정도는 다소 다양하기 때문에, 본 발명자들은 전이성 암 세포의 명백한 제거가 항 NME7AB 치료로 인한 것임을 확인하기를 원했다. 따라서 본 발명자들은 고용량과 저용량을 번갈아 가며 동물을 치료하였다. 도 44에서 명확하게 인지될 수 있는 바와 같이, 고용량 항-NME7AB는 전이를 제거하는데, 이는 완전히 근절되지 않으면 재발하고, 심지어는 더 낮은 투여량으로 증가한다. 본 실험은 NME7-B3 펩타이드에 결합할 수 있는 시험된 3개의 항-NME7AB 항체, 5A1, 4A3 및 5D4 모두가 농도 의존적 방식으로 암 전이를 저해한다는 것을 나타낸다. 도 44A 내지 도 44D는 32nM의 최종 농도로 NME7AB와 혼합된 10,000개의 루시페라제 양성 T47D 전이성 유방암 줄기세포를 꼬리 정맥에 주사한 암컷 nu/nu 마우스의 사진을 도시한다. 이어서 동물에게 32nM NME7AB를 꼬리 정맥에 주사한 후 개별 항-NME7AB 항체로 치료하였다. 도 44A는 인산염 완충 식염수 용액을 주사한 대조군 동물을 도시한다. 도 44B는 항-NME7AB 단클론성 항체 8F9A5A1로 처리된 동물을 도시한다. 도 44C는 항-NME7AB 단클론성 항체 8F9A4A3으로 처리된 동물을 도시한다. 도 44D는 항-NME7AB 단클론성 항체 5F3A5D4로 처리된 동물을 도시한다. 녹색 화살표는 표시된 기간 동안 낮은 항체 투여량(5 내지 7㎎/㎏)을 나타내고, 적색 화살표는 높은 투여량(15㎎/㎏)을 나타낸다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, 항체를 15㎎/㎏으로 투여하는 경우 전이가 상당히 사라진다.
본 발명의 항-NME7AB 항체가 전이를 저해할 수 있음을 입증하는 것에 더하여, 본 발명자들은 암 전이의 생리학을 보다 밀접하게 모방할 원발성 종양으로부터의 전이에 대한 이들의 효과를 시험하였다. 본 발명자들은 NME7AB를 함유하는 최소 무혈청 배지에서 10 내지 15일 동안 암 세포를 배양함으로써 암 줄기 세포(CSC)라고도 공지된 T47D 전이성 유방암 세포를 생성시켰다. 이어서, 이러한 T47D CSC를 90일 에스트로겐 방출 펠릿이 이식된 NSG 마우스의 우측 옆구리에 피하 이식하였다. 이식된 암 세포는 루시페라제 양성이어서, 루시페라제 기질인 루시페린을 주사한 후 암 세포가 광자를 방출하고, IVIS 기기로 촬영하여 이식된 암 세포를 측정하고 위치를 찾아낼 수 있다. 도 45A 내지 도 45B는 제0일에 32nM의 최종 농도로 NME7AB와 혼합되고, 그 다음 마트리겔과 1:1 vol:vol로 혼합된, 10,000개의 루시페라제 양성 T47D 전이성 유방암 줄기세포를 우측 옆구리에 피하 주사한 암컷 nu/nu 마우스의 사진을 도시한다. 종양 생착을 제0일 내지 제6일 진행하도록 하였다. 이어서 동물을 항-NME7AB 항체로 꼬리 정맥 주사에 의해서 정맥내 처리하였다. 대조군 동물에게 PBS를 주사하였다. 도 45A는 대조군 동물의 IVIS 사진을 나타낸다. 도 45B는 15㎎/㎏의 총 농도로 항-NME7AB 항체 5A1, 4A3 및 5D4의 칵테일을 꼬리 정맥에 주사한 동물의 IVIS 사진을 도시한다. 항체 또는 PBS를 제7일과 제18일 사이에 4회 투여하였다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, 항-NME7AB 항체 처리 동물은 대조군보다 전이가 적었다(전신의 청색 점). 처리된 군에서 5마리의 동물 중 2마리는 대조군보다 더 큰 원발성 종양을 갖는다. 이는 항-NME7AB 항체가 암 세포의 확산을 방지하여 원발성 종양에 집중되어 있기 때문일 수 있다. 본 실험에서, 암 세포의 주사 전에 수행된 PCR 분석은 NME7AB와 배양한 지 11일 후에 T47D 유방암 세포가 CXCR4를 109배, OCT4를 2배, NANOG를 3.5배, MUC1을 2.7배 상향조절한 것으로 나타났다.
또 다른 실험에서, 본 발명자들은 원발성 종양에서부터 유방암이 전형적으로 전이되는 기관으로의 전이에 대한 본 발명의 항-NME7AB 항체의 효과를 시험하였다. 유방암은 일반적으로 간, 폐, 뼈, 뇌의 순으로 전이된다. 본 발명자들은 NME7AB를 함유하는 최소 무혈청 배지에서 11일 동안 배양함으로써 T47D 전이성 유방암 세포를 생성시켰다. 이어서, 이러한 T47D CSC를 90일 에스트로겐 방출 펠릿이 이식된 NSG 마우스의 우측 옆구리에 피하 이식하였다. 도 46A 내지 도 46P는 제0일에 32nM의 최종 농도로 NME7AB와 혼합되고, 그 다음 마트리겔과 1:1 vol:vol로 혼합된, 10,000개의 루시페라제 양성 T47D 전이성 유방암 줄기세포를 우측 옆구리에 피하 주사한 암컷 nu/nu 마우스의 사진을 도시한다. 종양 생착을 제0일 내지 제6일 진행하도록 하였다. 이어서 동물을 항-NME7AB 항체로 꼬리 정맥 주사에 의해서 정맥내 처리하였다. 대조군 동물에게 PBS를 주사하였다. 제38일에, 동물을 희생시키고, 간을 수거하고, 이어서 IVIS로 분석하여 간에 전이된 암 세포를 검출하였다. 도 46A 내지 도 46B는 PBS만을 주사한 대조군 동물의 전신 IVIS 사진을 도시한다. 도 46C 내지 도 46D는 항-NME7AB 항체 5A1을 주사한 대조군 동물의 전신 IVIS 사진을 도시한다. 도 46E 도 46F는 항-NME7AB 항체 4A3을 주사한 대조군 동물의 전신 IVIS 사진을 도시한다. 도 46G 내지 도 46H 도 46F는 항-NME7AB 항체 5D4를 주사한 대조군 동물의 전신 IVIS 사진을 도시한다. 도 46A, 도 46C, 도 46E 및 도 46G는 치료 전 제7일에 촬영한 IVIS 사진이다. 도 46B, 도 46D, 도 46F 및 도 46H는 항-NME7AB 항체 치료 또는 모의 실험 후 제31일에 촬영한 IVIS 사진이다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, PBS 대조군의 동물은 전신 IVIS 사진에서 전이(청색점)를 나타낸 반면, 항-NME7AB 항체로 처리한 동물은 그렇지 않았다. 도 46I 내지 도 46P는 희생 후 동물로부터 수거한 간 및 폐의 사진 및 IVIS 사진을 도시한다. 도 46I, 도 46K, 도 46M, 도 46O는 일반 사진이다. 도 46J, 도 46L, 도 46N 및 도 46P는 전이된 암 세포를 나타내는 IVIS 사진이다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, 항-NME7AB 항체는 유방암 전이의 1차 부위인 간으로의 전이를 크게 저해하였다. 도 46Q는 대조군 동물 대 처리 동물로부터 수거된 간에 대해 IVIS 기기에 의해 방출되고 열거된 측정된 광자의 막대 그래프이다. IVIS 측정치의 삽입 그래프에서 인지될 수 있는 바와 같이, 꼬리 정맥에 세포를 주입했을 때 간으로의 전이의 저해는 전이의 저해 순위를 따르며, 이는 NME7AB-MUC1* 상호작용을 방해할 수 있는 효력의 순위와도 일치한다.
본 발명자들은 배양된 암 세포주가 NME7AB를 발현하는지를 결정하기 위해 많은 암 세포주의 면역형광 영상화를 수행하였다. 도 47A 내지 도 47F 및 도 48A 내지 도 48I가 명확하게 나타내는 바와 같이, 본 발명자들이 시험한 각각의 MUC1 양성 암 세포주는 NME7AB에 대해 양성이고, 이의 결합은 막성이며, NME7AB가 암 세포로부터 분비되어 그것이 MUC1*의 세포외 도메인에 결합하는 것과 일치한다. 도 47A 내지 도 47F는 NME7AB의 존재에 대해 다양한 암 세포주가 염색되는 면역형광 실험의 사진을 도시한다. 도 47A는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된 T47D 유방암 세포를 도시한다. 도 47B는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된, 1500s라고도 알려진 ZR-75-1 유방암 세포를 도시한다. 도 47C는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된 H1975 비소세포 폐암 세포를 도시한다. 도 47D는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된 H292 비소세포 폐암 세포를 도시한다. 도 47E는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된 HPAFII 췌장암 세포를 도시한다. 도 47F는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된 DU145 전립선암 세포를 도시한다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, 본 발명자들이 시험한 모든 암 세포주는 NME7AB에 대해 강력하고 막성인 염색을 나타낸다. 본 실험에 사용된 단클론성 항체는 5D4였다. 동시에, NME7AB 항체 5A1 및 4A3을 사용하여 동일한 세포주를 염색하고 동일한 결과를 생성하였다.
도 48A 내지 도 48I는 NME7AB의 존재에 대해 다양한 폐암 세포주가 염색되는 면역형광 실험의 사진을 도시한다. 도 48A 내지 도 48C는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된 선암종인 H1975 비소세포 폐암 세포를 도시한다. 도 48A는 DAPI 및 항-NME7AB 염색의 오버레이이다. 도 48B는 항-NME7AB 염색 단독을 나타낸다. 도 48C는 DAPI 및 항-NME7AB 염색 오버레이의 확대도이다. 도 48D 내지 도 48F는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된, 점막표피양 폐 암종인 H292 비소세포 폐암 세포를 도시한다. 도 48D는 DAPI 및 항-NME7AB 염색의 오버레이이다. 도 48E는 항-NME7AB 염색 단독을 나타낸다. 도 48F는 DAPI 및 항-NME7AB 염색 오버레이의 확대도이다. 도 48G 내지 도 48I는 다양한 농도의 항-NME7AB 항체 5D4로 염색된 전이성 기관지폐포 암종인 H358 비소세포 폐암 세포를 도시한다. 도 48G는 DAPI 및 항-NME7AB 염색의 오버레이이다. 도 48H는 항-NME7AB 염색 단독을 나타낸다. 도 48I는 DAPI 및 항-NME7AB 염색 오버레이의 확대도이다.
또한 NME7AB를 함유하는 무혈청 배지에서 이들 세포주를 배양하면 줄기세포 및 전이 마커의 발현이 더욱 증가하였다. 특히, 비-부착성이 된 세포(본 명세서에서 부유체라고 지칭됨)는 부착성 대응물보다 줄기세포 및 전이 마커의 발현이 훨씬 더 높다. 도 49A 내지 도 49I는 NME7AB에서의 배양 전 후의 암 세포주, 유방 T47D, 폐 H1975, 폐 H358 및 췌장 HPAFII의 PCR 그래프. 도 49A는 유방 전이 마커 CXCR4를 측정하였다. 도 49B는 줄기세포 마커 OCT4를 측정하였다. 도 49C는 전이 마커 ALDH1을 측정하였다. 도 49D는 줄기세포 마커 SOX2를 측정하였다. 도 49E는 줄기세포 마커 NANOG를 측정하였다. 도 49F는는 E-카드헤린이라고도 공지된 마커 CDH1을 측정하였다. 도 49G는 전이 마커 CD133을 측정하였다. 도 49H는 줄기세포 마커 ZEB2를 측정하였다. 도 49I는 줄기, 암 및 전이 마커 MUC1을 측정하였다. 종양 구체로도 알려진 부유체 세포는 독립적으로 고정부(anchorage)를 성장시킬 수 있게 되며, 부착 세포보다 더 증가된 전이 마커를 나타낸다. 암 줄기세포를 주사한 동물은 NME7AB 배양 부유체 세포를 주사한 동물이다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, 전이 마커, 줄기세포 마커 또는 상피에서 중간엽으로의 전이(epithelial to mesenchymal transition: EMT)의 마커는 NME7AB에서 배양 후 증가하는데, 이는 보다 전이성 상태로의 변화를 나타낸다. 도 50은 NME7AB와의 배양에서 10 내지 12일 후 10,000개의 H358 폐암 모 세포 또는 H358 세포를 꼬리 정맥에 주사한 NSG 마우스의 제6일 IVIS 사진을 도시한다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, NME7AB에서 배양한 NCI-H358 폐암 세포는 자체적으로 전이성 세포인 것으로 보고된 모 세포에 비해 전이 가능성이 크게 증가하였다. 단지 10,000개 세포로부터의 NCI-H358 NME7AB 전이성 암 줄기세포로부터 6일 동안의 전이의 기능적 증가는 도 49와 일치하며, 이는 H358 세포가 NME7AB에서 배양 후 전이 마커의 발현을 크게 증가시킴을 나타낸다.
도 51은 NME1 또는 NME7AB라고도 알려진 이량체 NM23-H1에서 배양물에서 2 또는 3 계대 전 및 후의 MUC1 음성 전립선암주 PC3의 PCR 그래프를 도시한다. 그래프는 줄기세포 마커, 암 세포 마커 및 전이 마커의 배수 차이를 도시한다. 도면에서 인지될 수 있는 바와 같이, NME1 또는 NME7AB의 반복 배양은 줄기, 암 및 전이 마커의 상향조절을 유도하지만, MUC1의 발현도 5 내지 8배 상향조절한다.
종합적으로, 이러한 데이터는 DM10 도메인이 없는 NME7이 암 세포에 의해 분비되고, 탠덤 반복 도메인이 없는 MUC1의 세포외 도메인에 결합하여, NME7이 MUC1* 세포외 도메인을 이량체화하는데, 이것이 암 세포 성장을 증가시키고, 암 세포의 전이 가능성을 증가시킨다는 것을 입증한다. NME7AB와 MUC1* 세포외 도메인 간의 상호작용을 방해하는 항체가 암 세포 성장을 저해하고, 암 전이를 저해할 것임은 당연하다. 본 명세서에서, 본 발명자들은 NME7AB와 MUC1* 세포외 도메인 간의 상호작용을 저해하는 항-NME7AB 항체가 실제로 암 세포 성장과 암 전이를 저해한다는 것을 나타내었다. 따라서, 항-NME7AB 항체는 암의 치료 또는 예방을 위해 암 또는 전이로 진단되거나 이의 발병할 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있다.
NME1은 모든 세포의 세포질에서 발현되고 넉아웃되면 치명적일 수 있고, 중요하게는 NME1 A 도메인이 NME7 A 도메인에 대해 높은 서열 상동성을 갖기 때문에, 치료 용도를 위한 항-NME7AB 항체는 NME1이 아닌 NME7AB 또는 NME7-X1에 결합하는 것이 중요하다. 본 발명의 일 양상에서, 치료 용도에 최적일 항체는 NME7AB 또는 NME7-X1에 고유하고, NME1 서열에 존재하지 않는 펩타이드에 결합하는 능력에 대해 선택되었다. 도 6 내지 도 9는 NME7AB 고유 펩타이드를 열거한다.
바람직한 실시형태에서, 암 또는 암 전이의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여하기에 적합한 항체는 NME7 B3 펩타이드에 결합하는 항체의 군으로부터 선택된다. 추가로 더 바람직한 실시형태에서, 암 또는 암 전이의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여하기에 적합한 항체는 NME7 B3 펩타이드에 결합하고, NME7AB에 결합하지만, NME1에 결합하지 않는 항체의 군으로부터 선택된다. 시험관내 및 생체내에서 이러한 항암 활성 및 항전이 활성을 입증한 암 또는 암 전이의 치료 또는 예방을 위한 치료 용도에 적합한 항체의 예는 항-NME7 항체 5A1, 4A3 및 5D4를 포함한다. 이들은 예시일 뿐이며, 본 명세서에 기재된 바와 같이 생성되고, 본 명세서에 기재된 바와 같이 선택된 다른 항체는 동일한 항암 및 항전이 활성을 가질 것이다. 이러한 항체는 scFv 또는 항체 모방체를 포함하는 완전한 항체 또는 이의 단편일 수 있으며, 여기서 항체의 가변 도메인은 항체를 모방하는 단백질 스캐폴드에 혼입된다. 항체는 뮤린, 낙타과, 라마, 인간 또는 인간화를 포함하는 인간 또는 비인간 종의 것일 수 있고, 단클론성, 다클론성, scFv 또는 이의 단편일 수 있다.
암 또는 전이의 치료 또는 예방을 위한 항-NME7 항체는 다수의 상이한 치료 포맷으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 이의 단편은 독립형(stand-alone) 항체 또는 항체 단편으로서 환자에게 투여될 수 있거나, 항체 약물 접합체(ADC)와 같은 독소에 부착되거나, 이중특이적 항체 또는 BiTE(이중특이적 T 세포 관여기) 내로 통합되거나, 키메라 항원 수용체(CAR) 내로 통합되거나, CAR을 또한 발현하는 세포에 의해 발현되도록 조작된다. 세포는 면역 세포, T 세포, NK 세포 또는 줄기세포 또는 전구 세포일 수 있으며, 이것은 그 다음 T 세포 또는 NK 세포로 분화될 수 있다.
본 명세서에 기재된 임의의 항체 또는 이의 단편은 암의 지표 또는 암에 대한 감수성일 NME7AB 또는 NME7-X1의 존재에 대해 체액, 세포, 조직 또는 신체 표본을 프로빙하기 위한 진단 시약으로 사용될 수 있다. 진단 용도를 위한 항체는 조영제, 핵산 태그에 연결될 수 있고, 낙타과를 포함한 임의의 종의 것일 수 있고, 시험관내, 생체내 또는 수술 중에 혈액, 세포 또는 조직과 같은 체액 상에서 또는 전신 적용에 사용될 수 있다.
치료적으로 유용하거나 진단적으로 유용한 항-NME7 항체에 대한 선택 기준은 항체가 혼입될 치료 또는 진단의 형식 또는 양식에 좌우된다. 항체 또는 항체 단편이 암 또는 암 전이의 치료 또는 예방을 위한 독립형 작용제로서 환자에게 투여되는 경우, 항체는 i) NME1이 아닌 NME7AB 또는 NME7-X1에 결합하는 능력; ii) PSMGFR 펩타이드에 결합하는 능력; iii) N-10 펩타이드에 결합하는 능력; iv) NME7AB 또는 NME7-X1과 MUC1* 세포외 도메인 사이의 상호작용 또는 NME7AB 또는 NME7-X1과 N-10 펩타이드 사이의 상호작용을 방해하는 능력에 대해서 선택된다. 항체는 또한 NME7 B3 펩타이드에 결합하는 능력에 대해 선택될 수 있다. 이 치료 포맷은 또한 CAR 및 분비된 항-NME7 항체를 발현하도록 조작된 세포를 포함한다.
다른 양식은 항-NME7 항체에 대한 다른 선택 기준을 필요로 한다. 항-NME7 항체가 ADC에 혼입되는 경우, ADC는 표적 세포에 의해 내재화되어 표적 세포의 사멸을 촉발해야 한다. NME7AB 또는 NME7-X1은 MUC1*의 세포외 도메인에 결합될 것이다. 항체가 MUC1* 세포외 도메인에 대한 NME의 결합을 방해하는 경우 독소-접합 항체는 내재화되지 않고 세포가 사멸되지 않을 것이다. 유사하게, 항-NME7 항체가 CAR 또는 BiTE에 혼입되는 경우, NME7AB 또는 NME7-X1 사이의 상호작용이 방해될 수 없거나 면역 세포가 더 이상 이의 사멸제를 암 세포에 지향시킬 수 없게 될 것이다. 항-NME7 항체를 진단 시약으로 사용하는 경우, NME7AB 또는 NME7-X1 간의 상호작용이 방해되거나, 항체 및 연관 표지가 씻겨 나갈 수 없다. 따라서 ADC, CAR T 또는 CAR-NK, BiTE 또는 진단 응용의 경우, 항-NME7 항체는 i) NME1가 아닌 NME7AB 또는 NME7-X1에 결합하는 능력; ii) PSMGFR 펩타이드에 결합하는 능력; iii) N-10 펩타이드에 결합하는 능력, iv) MUC1* 세포외 도메인과의 상호작용 또는 NME7AB 또는 NME7-X1과 N-10 펩타이드 사이의 상호작용을 방해하지 않고 NME7AB 또는 NME7-X1에 결합하는 능력에 대해서 선택된다. 항체는 또한 NME7 B3 펩타이드에 결합하는 능력에 대해 선택될 수 있다.
본 발명의 일 양상에서, 세포는 본 발명의 항-NME7AB 항체 또는 이의 단편을 발현하도록 조작된다. 세포는 T 세포 또는 NK 세포와 같은 면역 세포일 수 있거나, T 세포 또는 NK 세포와 같은 보다 성숙한 면역 세포로 분화될 수 있는 줄기세포 또는 전구 세포일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 항-NME7AB 항체를 발현하도록 조작된 세포는 또한 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된다. 바람직한 실시형태에서, CAR은 종양 연관 항원을 인식한다. 바람직한 실시형태에서, CAR은 MUC1*을 표적화한다. 보다 바람직한 실시형태에서, CAR은 항-MUC1* 항체 MNC2에 의해 종양에 지향된다. 본 발명의 또 다른 양상에서, CAR을 발현하도록 조작된 세포는 또한 항-NME7 항체를 유도 가능하게 발현하도록 조작된다. 일례에서, 항-NME7AB 항체를 암호화하는 핵산은 Foxp3 인핸서 또는 프로모터에 삽입된다. 또 다른 예에서, 항-NME7AB 항체는 NFAT-유도성 시스템에 존재한다. 일 양상에서, NFAT-유도성 시스템은 항-NME7AB 항체 서열의 상류에 삽입된 NFATc1 반응 요소를 혼입한다. 이들은 IL-2 프로모터, Foxp3 인핸서 또는 프로모터 또는 다른 적합한 프로모터 또는 인핸서에 삽입될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상에서, NME7AB 또는 NME7-X1에 고유한 펩타이드는 암 또는 암 전이에 대해 사람을 면역화시키거나 사람에게 백신 접종하는 데 사용되는 실체에 혼입된다. 바람직한 실시형태에서, 펩타이드는 Cys-14-Ser 돌연변이를 갖는 NME7 B3 펩타이드일 수 있는 NME7 B3 펩타이드의 전부 또는 일부를 포함한다.
본 발명의 또 다른 양상은 숙주 동물에서 항-NME7AB 항체를 생성시키는 방법을 포함하며, 여기서 동물은 NME7 B3 펩타이드로 면역화된다. 바람직한 실시형태에서, NME7 B3 펩타이드는 NME7 특이적 항체 생성을 저해하는 이황화 결합 형성을 피하기 위해 세린으로 돌연변이된 시스테인 14(서열번호 169)를 갖는다.
본 발명의 또 다른 양상은 NME7AB 또는 NME7-X1로 세포를 배양하는 것을 포함하는 향상된 전이 가능성을 갖는 세포를 생성시키는 방법을 포함한다. 이러한 세포는 약물 발견의 다수의 양상에서 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은 NME7AB 또는 NME7-X1을 발현하도록 조작된 세포를 포함한다. NME7AB 또는 NME7-X1은 인간 서열일 수 있다. 이들의 발현은 유도성일 수 있다. 일 양상에서, 세포는 인간 NME7AB 또는 NME7-X1을 발현할 수 있는 트랜스제닉 동물일 수 있는 동물로 이후에 발달되는 난자이다.
NME7은 MUC1* 성장 인자 수용체의 세포외 도메인에 결합하여 이를 이량체화한다. 조직 연구는 종양 등급 및 전이가 증가함에 따라 MUC1*이 증가함을 나타낸다. 본 명세서에서 본 발명자들은 종양 등급 및 전이가 증가함에 따라 NME7 발현이 증가함을 나타내다(도 39 내지 도 41). 본 명세서에서 본 발명자들은 NME7과 MUC1*의 상호작용을 저해하는 항체가 종양 성장 및 전이를 저해한다는 것을 나타내었다.
다른 NME 패밀리 구성원은 MUC1* 성장 인자 수용체의 세포외 도메인에 결합하여 이를 이량체화할 수 있다. 예를 들어, 본 발명자들은 NME1, NME2 및 NME6이 이량체로 존재할 수 있고, MUC1* 세포외 도메인에 결합하여, 이를 이량체화한다는 것을 나타내었다. NME7AB 및 NME7-X1는 MUC1* 세포외 도메인에 결합할 수 있는 두 개의 도메인을 갖고, 단량체로서 이들은 MUC1* 성장 인자 수용체를 이량체화하고, 활성화한다. 본 발명자들은 본 발명에 이르러서 항-NME7 항체가 암 및 암 전이를 저해한다는 것을 나타내었다. 유사하게, 이들 다른 NME 단백질에 결합하는 항체 또는 항체 모방체는 암 또는 전이로 진단되거나 이의 발병 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있는 항암 또는 항전이 치료제일 수 있다. 본 발명의 일 양상에서, 암 또는 전이의 치료를 위해 치료용으로 사용될 수 있는 항체는 NME1, NME2, NME3, NME4, NME5, NME6, NME7, NME8, NME9 또는 NME10에 결합하는 항체이다. 본 발명의 한 양상에서, 치료 항체 또는 항체 모방체는 NME 단백질 및 이의 동족 성장 인자 수용체의 결합을 저해한다. 본 발명의 일 양상에서, 치료용 항체 또는 항체 모방체는 MUC1*의 세포외 도메인과 NME 단백질의 상호작용을 저해한다. 본 발명의 또 다른 양상에서, 치료용 항체 또는 항체 모방체는 NME1, NME2, NME3, NME4, NME5, NME6, NME7, NME8, NME9 또는 NME10으로부터 유래된 펩타이드에 결합하고, 여기서 펩타이드는 NME7 A1, A2, B1, B2 또는 B3 펩타이드에 상동성이다.
하기는 NME7과 다른 NME 패밀리 구성원 간의 상동성 및 동일성 정렬을 나타내는 서열 정렬이다. 밑줄 또는 밑줄 및 볼드체 서열은 NME7 펩타이드 A1(서열번호 141), A2(서열번호 142), B1(서열번호 143), B2(서열번호 144) 및 B3(서열번호 145)에 해당한다.
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예로서, NME7 상동성 펩타이드("상동성 펩타이드"), 특히 A1, A2, B1, B2 또는 B3 펩타이드에 상동성인 항체 또는 항체 모방체가 암으로 진단되거나 이의 발병 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있다.
A1, A2, B1, B2 또는 B3 펩타이드에 상동성인 펩타이드
A1, A2, B1, B2 또는 B3 펩타이드에 상동성인 펩타이드는 하기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 것을 포함할 수 있다:
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일부 경우에, 다른 NME 단백질로부터 유래된 펩타이드는 프레임을 이동하거나 확장된 펩타이드가 암 또는 암 전이를 저해하는 항체를 생성하는 NME7 펩타이드에 대해 더욱 상동성이도록 NME7 펩타이드를 확장함으로써 NME7 A1, A2, B1, B2 또는 B3 펩타이드에 더 상동성이도록 만들 수 있다. 또 다른 예로서, NME7 상동성의 연장된 펩타이드("연장된 펩타이드")에 결합하는 항체 또는 항체 모방체가 암으로 진단되거나 이의 발병 위험이 있는 환자에게 투여될 수 있다.
A1, A2, B1, B2 또는 B3 펩타이드에 상동성인 연장된 펩타이드
연장된 펩타이드인 A1, A2, B1, B2 또는 B3 펩타이드에 상동성인 펩타이드는 하기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 것을 포함할 수 있다:
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일부 NME 단백질은 정상 세포 성장 또는 발달에 필요한 기능을 발휘한다. 예를 들어, NME1은 정상 세포 기능에 필요하다고 생각된다. 다른 NME 단백질은 기능이 정상 세포 또는 조직에 필요한 촉매 도메인을 갖는다. 이러한 경우에, 치료용 항체는 표적화된 암 연관 NME에 결합하지만 비표적화 NME에는 결합하지 않는 능력을 기반으로 선택될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 제시된 항-NME7 항체인 8F9A5A1, 8F9A4A3 및 5F3A5D4는 NME7AB에는 결합하지만 NME1에는 결합하지 않는 능력에 대해 선택되었고; 이들은 암 및 암 전이를 저해하는 능력을 기반으로 추가로 선택되었다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 항-NME7 항체, 항체 단편, 예를 들어, scFv, 또는 항체 모방체의 단편은 면역 세포에서 발현되도록 조작된 키메라 항원 수용체(CAR) 내에 혼입된다. 면역 세포는 항-NME7 CAR, 항-MUC1* CAR, 또는 둘 다를 발현하도록 조작될 수 있다. CAR 중 하나는 유도성 프로모터로부터 발현될 수 있다. 대안적으로, 면역 세포는 항-MUC1* CAR 및 유도성 항-NME7 항체 또는 항체 단편과 같은 CAR을 발현하도록 조작될 수 있다. 일부 예에서 유도성 프로모터는 NFAT 반응 요소를 함유할 수 있다. 일 양상에서, 이들 조작된 종은 T 세포, NK 세포 또는 수지상 세포에서 발현된다. 면역 세포는 환자 또는 기증자로부터 얻을 수 있다. 일부 경우에, 면역 분자, 예컨대, MHC, 면역관문 저해제 또는 면역관문 저해제에 대한 수용체가 예를 들어, CrisPR 또는 CrisPR-유사 기술을 사용하여 돌연변이되거나 절단된다. 또 다른 양상에서, ITAM 분자, Fos 또는 Jun은 환자 또는 기증자 유래 면역 세포에서 Talens, Sleeping Beauty, CrisPR 또는 CrisPR-유사 기술을 통해 돌연변이되거나 유전적으로 절제된다.
본 발명의 일 양상에서, CAR T 포맷에서 사용하기 위한 항-NME7 항체 또는 항체 모방체는 NME7에 특이적이지만 MUC1*의 세포외 도메인에 대한 NME7의 결합을 방해하지 않는 항체 또는 항체 모방체의 군으로부터 선택된다. 이러한 방식으로, CAR T를 종양에 표적화하는 항-NME7 항체 또는 항체 모방체는 단순히 수용체로부터 리간드를 뽑지 않을 것이고, 따라서 T 세포는 표적 암 세포에 그랜자임 B를 주입할 수 없을 것이다. 이러한 항체 또는 항체 모방체는 동물을 NME7 펩타이드 A1, A2, B1, B2 또는 B3과 같은 NME7 펩타이드로 면역화함으로써 생성되거나 NME7 펩타이드 A1, A2, B1, B2 또는 B3에 결합하는 능력으로 인해 선택된다. 항체 또는 항체 모방체는 NME7에 특이적으로 결합하지만 NME1 또는 NME2에는 결합하지 않는 능력 및 또한 NME7과 MUC1* 세포외 도메인 간의 결합을 방해하는 무능력에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, ELISA 설정에서, PSMGFR 펩타이드는 표면에 고정된다. 표지된 NME7AB는 표면 고정된 MUC1* 세포외 도메인에 결합하도록 허용하고, NME7AB 표지의 검출은 시험 항체 또는 항체 모방체의 존재 또는 부재 하에 측정된다. 본 발명의 일 양상에서, NME7AB와 표면-고정된 MUC1* 세포외 도메인 펩타이드 사이의 결합을 감소시키지 않는 항체는 CAR 내로 혼입되고 면역 세포에서 발현되도록 조작된 항체로서 선택되고, 이어서 암 또는 암 전이의 치료 또는 예방을 위한 환자에게 투여된다.
본 발명의 일 양상에서, 항-NME7 항체 또는 이의 단편은 암 또는 암 전이로 진단되거나 이의 발병 위험이 있는 환자에게 투여된다. 일 양상에서, 항-NME7 항체 또는 항체 단편은 특히 "A1, A2, B1, B2 또는 B3 펩타이드에 상동성인 펩타이드" 및 "A1, A2, B1, B2 또는 B3에 상동성인 확장된 펩타이드" 섹션에서 상기에 논의된 NME 펩타이드에 결합한다.
또 다른 양상에서, 항체, 항체 단편 또는 항체 모방체는 A1, A2, B1, B2 또는 B3(서열번호 141 내지 145) 중에서 선택되는 NME7 유래 펩타이드에 결합한다. 또 다른 양상에서, 항체, 항체 단편 또는 항체 모방체는 B3 펩타이드의 대부분 또는 전부를 포함하는 NME7 펩타이드에 결합한다. 본 발명의 일 양상에서, 항-NME7 항체, 항체 단편 또는 항체 모방체는 하기에 제시된 항-NME7 항체 8F9A4A3("4A3")(서열번호 1001-1015), 8F9A5A1("5A1")(서열번호 1016 - 1030) 또는 8H5H5G4("5G4")(서열번호 1031 - 1045)의 가변 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다.
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본 발명의 또 다른 양상에서, CAR을 발현하도록 조작된 면역 세포는 암 또는 암 전이로 진단되거나 이의 발병 위험이 있는 환자에게 투여되고, 여기서 면역 세포는 또한 유도성 프로모터로부터 발현될 수 있는 항-NME7 항체 또는 항체 단편을 발현하도록 조작된다. 일 양상에서, CAR은 항-MUC1* 항체 단편에 의해서 안내된다. 하나의 경우에, CAR은 huMNC2-CAR44이다. 일 양상에서, 항-NME7 항체 또는 항체 단편은 상기 "A1, A2, B1, B2 또는 B3 펩타이드에 상동성인 펩타이드" 및 "A1, A2, B1, B2 또는 B3에 상동성인 확장된 펩타이드" 섹션에 열거된 NME7 펩타이드에 결합한다. 또 다른 양상에서, 항체 또는 항체 단편은 A1, A2, B1, B2 또는 B3(서열번호 141 내지 145) 중에서 선택되는 NME7 유래 펩타이드에 결합한다. 또 다른 양상에서, 항체, 항체 단편 또는 항체 모방체는 B3 펩타이드를 포함하는 NME7 펩타이드에 결합한다. 본 발명의 일 양상에서, 항-NME7 항체, 항체 단편 또는 항체 모방체는 항-NME7 항체 8F9A4A3, 8F9A5A1 또는 8H5H5G4의 가변 도메인으로부터 유래된 서열을 포함한다.
이러한 항체는 인간 항체 또는 인간화된 항체일 수 있다. 이러한 항체는 다클론성, 단클론성, 이중특이적, 2가, 1가, 단쇄, scFv일 수 있거나 특이적 표적에 결합하는 인식 영역을 제시하는 단백질 스캐폴드와 같은 항체 모방체일 수 있다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 항체는 비-인간 기원, 인간 또는 인간화될 수 있다. 항체를 인간화하는 방법은 마우스 가변 영역의 전부 또는 일부를 예를 들어, 서열번호 1001 내지 1045로서 열거된 서열에 제시된 바와 같은 가장 밀접하게 일치하는 인간 항체 서열의 V- 및 J- 영역에 융합시키는 것을 포함한다. 단쇄 작제물이 아닌 전체 항체도 만들 수 있다. 예를 들어, 중쇄 가변 마우스 서열은 인간 V- 및 J- 영역에 융합된 다음 IgG1, IgG2 또는 IgG3의 인간 중쇄 불변 영역에 융합된다. 유사하게, 경쇄 가변 마우스 서열은 인간 V- 및 J- 영역에 융합된 다음 IgG1, IgG2 또는 IgG3의 인간 카파 또는 람다 불변 영역에 융합된다. 플라스미드는 함께 발현되고, 회합하여 완전한 항체(서열번호 1047-1051)를 형성한다.
본 발명의 또 다른 양상에서, 소분자는 NME7, NME7AB 또는 NME7-X1의 종양형성 효과를 저해하는 능력에 대해 선택된 항암제이다. 예를 들어, 고속대량처리(high throughput) 스크린은 암을 치료할 작은 분자를 식별한다. 다중-웰 플레이트에서, NME7AB를 함유하는 배지에서 암 세포가 배양된 웰에 소분자를 별도로 첨가한다. 소분자가 부유체가 되는 세포의 양을 감소시키고/시키거나 전이 마커, 예컨대, CXCR4, CHD1 또는 만능 줄기 세포 마커의 발현을 감소시킨다면, 그 작은 분자는 항암 약물 후보이다. 항암제인 소분자를 식별하는 또 다른 방법은 NME7, NME7AB 또는 NME7-X1에 결합하거나 NME7 종의 발현을 억제하는 소분자를 선택하는 것이다. 또 다른 고속대량처리 스크린은 NME7AB가 MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 펩타이드에 결합하는 것을 저해하는 소분자를 선택하는 것이며, 이러한 소분자는 항암제가 될 것이다.
NME7AB 및 NME7-X1의 서열은 NME7-X1이 NME7AB가 갖는 N-말단 서열의 일부가 누락되어 있다는 것만 상이하다. 실험은, NME7AB와 거의 동일한 자연 발생 NME7 종이 존재한다는 것을 나타내며, 이를 본 발명자들은 NME7AB-유사 종이라고 부른다. NME7-X1에 결합하는 항체는 항체가 구별할 수 있는 구조적 차이가 없는 한 NME7AB를 모방하는 자연 발생 종에도 결합할 수 있다. 따라서 NME7-X1을 억제하지만 NME7AB-유사 종은 저해하지 않으려는 경우 또는 그 반대의 경우, siRNA, 안티센스 핵산 또는 유전자 편집 기술을 사용하여 하나의 발현을 저해하지만 다른 하나는 저해하지 않을 수 있다.
하나의 경우에, 항암 치료제는 NME7, NME7-X1 또는 NME7AB-유사 종의 특이적 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는 핵산이다. 이러한 핵산은 NME7 종을 직접 억제하는 siRNA, RNAi, 안티센스 핵산 등일 수 있다. 본 발명의 또 다른 양상에서, 핵산은 예를 들어, 이를 조절하는 분자의 발현을 변경함으로써 NME7 종을 간접적으로 억제할 수 있다. 예를 들어, 슈퍼 인핸서 BRD4는 NME7의 발현을 억제한다. 따라서, 암의 치료 또는 예방에 효과적인 치료제는 BRD4의 발현을 증가시키는 작용제이다. 효과적인 치료제는 BRD4의 보조 인자인 JMJD6의 발현을 증가시키는 작용제일 수 있다.
NME7AB 또는 NME7-X1, 또는 전체 단백질로부터 유래된 펩타이드는 동물에서 항-NME7 또는 항-NME7-X1 항체를 생성시키는 데 사용되며, 이는 본 발명자들이 암 성장을 저해하고, 암 세포가 전이성 암 세포로 전이하는 것을 저해하는 것으로 입증한 것이었다. 유사하게, NME7 유래 펩타이드는 암을 치료 또는 예방하거나 암 세포가 전이성 암 세포로 전이하는 것을 저해하는 항체를 생성하도록 인간에게 투여될 수 있다. NME7 펩타이드 또는 단백질은 수여자에서 항-NME7, 항-NME7AB 또는 항-NME7-X1 항체의 생산을 자극하기 위해 하나의 유형의 백신으로 사람에게 투여된다. 도 12 및 도 13에 도시된 결과는 NME7, 특히 NME7-X1 또는 NME7AB 서열에서 유래된 펩타이드 컬렉션으로 사람을 면역시키는 것이 단일 펩타이드로의 면역화 것보다 더 효과적인 백신일 수 있음을 나타낸다. 상기 펩타이드 또는 단백질은 면역 반응의 자극을 돕기 위해 당업자에게 공지된 담체 단백질 또는 기타 보조제에 추가로 접합될 수 있다.
DM10 도메인 외부에 있는 NME7 펩타이드는 암의 치료 또는 예방을 위한 항체를 생성하는 데 바람직하다. 암 또는 전이를 예방하기 위해 환자에게 투여할 수 있는 펩타이드는 도 6 내지 도 9에 열거된 펩타이드의 서열을 함유한다. A1, A2, B1, B2 및 B3은 NME7AB 및 NME7-X1에 결합하는 항체를 생성하는 펩타이드의 예이고, 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여된다. 본 발명은 NME7 또는 NME7-X1에서 자연 발생하는 것과 같은 정확한 서열의 펩타이드에 제한되지 않는다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 펩타이드 서열의 여러 아미노산의 치환은 여전히 천연 단백질 서열을 특이적으로 인식하는 항체를 생성시킬 수 있다. 본 발명이 암 성장을 저해하거나 일반 암 세포에서 전이성 암 세포로의 전이를 저해하기 위해 본 명세서에서 입증된 펩타이드로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3을 식별하기 위해서 본 명세서에서 사용된 방법은 또한 본 명세서에서 입증된 펩타이드와 동등하거나 이보다 더 효과적일 수 있는 다른 펩타이드 서열을 식별하는 데 사용할 수 있다.
인간 NME7AB 또는 NME7-X1의 부분을 포함하거나 NME7AB 또는 NME7-X1에 결합하는 항체 단편을 포함하는 키메라 항원 수용체 분자는 항암 치료제이고, 암 또는 암 전이의 치료 또는 예방을 위해서 환자에게 투여된다.
일례에서, 항-NME7 항체의 인식 단위 또는 가변 영역은 CAR(키메라 항원 수용체) 기술 또는 CAR T 기술로서 공지된 기술을 사용하여 T 세포의 분자에 융합된다. 암을 치료하거나 예방하기 위해 치료용으로 사용될 수 있는 항체 또는 이의 단편의 가장 중요한 특징은, NME7을 인식하고, 암을 촉진하는 표적과 NME7과의 상호작용을 방지하는 항체-유사 가변 영역의 식별이다. 일례로, 표적은 MUC1*의 PSMGFR 영역이다.
항체, 항체 단편 또는 단쇄 항체는 CAR이라도 알려져 있는 키메라 항원 수용체를 비롯한 키메라 분자 내로 조작될 수 있으며, 그런 다음 이러한 분자는 T 세포와 같은 면역계 세포 내로 형질주입되거나 형질도입된 다음, 환자에게 투여된다. 인간화된 항체 또는 항체 단편, 전형적으로 scFv는 CAR의 세포외 도메인의 대부분을 포함한다. 항체 단편은, 막관통 도메인으로서 CD8과 같은 면역계 신호전달 분자 및 세포질 신호전달 모티프, 예컨대, 활성화 도메인으로도 지칭되는 T 세포 수용체 신호전달 분자, 또는 비제한적으로 CD3-제타, CD28, 41bb, OX40을 포함하는 공자극성 도메인에 생화학적으로 융합된다. CAR은 T 세포 또는 다른 세포, 바람직하게는 면역계 세포 내로 형질주입되고, 환자에게 투여될 수 있다. 본 명세서에서, 본 발명자들은, 세포외 부분이 항-NME7, 항NME7AB 또는 항-NME7-X1 항체, 항체 단편 또는 단쇄, scFv 항체 단편을 함유하는 CAR을 기재한다. 바람직한 실시형태에서, 항체 또는 항체 단편은 인간 항체 또는 인간화된 항체이다.
효과적인 항-NME7 항체 또는 항-NME7-X1 항체 또는 단편은 천연 NME7, NME7AB 또는 NME7-X1에 결합하는 능력을 가질 것이다. 실제로, CAR의 세포외 도메인이 조작되는 모 항체는 NME7, NME7AB 또는 NME7-X1 유래 펩타이드를 동물에게 면역화함으로써 생성된다. 본 발명의 일 양상에서, 면역화 펩타이드는 NME7 아미노산 1 내지 376으로 구성된다. 본 발명의 일 양상에서, 면역화 펩타이드는 NME7 아미노산 92 내지 376으로 구성된다. 본 발명의 또 다른 양상에서, 면역화 펩타이드는 NME7 아미노산 125 내지 376으로 구성된다. 본 발명의 또 다른 양상에서, 면역화 펩타이드는 도 6 내지 도 8에 열거된 서열로 제조된다. 본 발명의 다른 양상에서, 면역화 펩타이드는 도 9에 열거된 서열로 제조된다. 대안적으로, 모 항체 또는 항체 단편은 항체 라이브러리 또는 항체 풀로부터 선택되며, 이러한 항체는 자연 항체, 합성 항체 또는 이들의 단편일 수 있으며, 여기서, 이들 항체는 NME7, NME7AB 또는 NME7-X1, 도 6 내지 도 8에 열거된 펩타이드 또는 도 9에 열거된 펩타이드에 대한 결합 능력에 대해 선택된다.
CAR의 표적화 부분은 항체 또는 항체 단편일 필요가 없다. 본 명세서에서, 본 발명자들은, 세포외 도메인이 NME7 단편을 함유하는 CAR을 기재한다. NME7-유래의 펩타이드(들)는 상이한 종류의 CAR 내에서 조작되며, 여기서, 세포외 도메인의 표적화 부분은 항체 또는 항체 단편이기보다는 단백질 단편 또는 펩타이드이다. 펩타이드 CAR은 면역계 세포, 전형적으로 T 세포 내로 형질감염 또는 형질도입된다. NME7 단편 또는 NME7-유래의 펩타이드는 이들의 동족 결합 파트너에의 결합 능력에 대해 선택되지만, 온전한 NME7, NME7AB 또는 NME7-X1로서 작용할 수 없으며, 종양원성 활성을 부여하지 않아야 한다. NME7 단편 또는 NME7-유래의 펩타이드는, 막관통 도메인 CD8과 같은 면역계 신호전달 분자 및 세포질 신호전달 모티프, 예컨대, 활성화 도메인으로도 지칭되는 T 세포 수용체 신호전달 분자, 또는 비제한적으로 CD3-제타, CD28, 41bb, OX40을 포함하는 공자극성 도메인에 생화학적으로 융합된다.
본 발명의 일 양상에서, NME7 단편은 NME7 NDPK B 도메인의 대부분이거나 모두이다. 본 발명의 다른 양상에서, NME7 단편은 도 6 내지 도 9에 열거된 펩타이드 서열 중 하나 이상 함유하는 NME7 펩타이드이다. 실험은, NME7, NME7의 단편, NME7AB 또는 NME7-X1을 조작된 면역 세포 치료제를 위한 키메라 항원 수용체(CAR)의 표적화 부분으로서 사용하는 전략에 있어서, 상당히 큰 NME7AB의 단편 또는 NME7-X1이 더 짧은 펩타이드, 예를 들어, 길이가 15개 아미노산 미만인 펩타이드보다 더 효과적일 것임을 가리킨다. 대안적으로, 각각이 상이한 NME7AB 유래의 펩타이드를 가진 CAR의 컬렉션은 수집해서 면역계 세포 내로 형질감염되거나 형질도입되고, 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여될 수 있다. 도 12 및 도 13에 도시된 실험은 이러한 접근법의 타당성을 뒷받침한다.
NME7 단편을 이의 세포외 도메인에 함유하는 CAR은 면역계 세포, 전형적으로 T 세포 내로 형질주입되거나 형질도입되고, 암의 치료 또는 예방을 위해 환자에게 투여될 수 있다. 일 양상에서, 암은 MUC1*-양성 암이다. 또 다른 양상에서, 암은 전이성 암이다.
NME7을 절단하는 효소를 저해하는 작용제는 암을 치료하거나 예방하는 데 사용될 수 있다. 일부 형태의 NME7은 세포 내에서 격리되며, 따라서, 세포로부터 분비되지 않으며, 이때, 이들은 암을 촉진하는 성장 인자로서 작용할 수 있다. 전장 NME7은 42kDa이다. 그러나, 본 발명자들은, DM10 도메인을 포함하지 않으며 본 발명자들이 생성한 재조합 NME7AB와 본질적으로 일치하는 것으로 보이는 약 33kDa NME7 종이 암 세포 및 줄기세포로부터 분비된다는 것을 발견하였다. 이러한 약 33kDa NME7 종 및 다른 약 25kDa NME7 종은, NME7의 절단을 저해한 작용제에 의해 제거될 절단 생성물일 수 있다.
환자 샘플에서 NME7, 또는 본 발명자들이 NME7AB-유사 종이라고 지칭하는 약 33kDa NME7 종, 또는 NME7-X1의 상승된 수준의 검출은 암의 존재, 또는 보다 공격적인 상태 또는 전이성 상태로의 암의 진행을 나타내는 진단 지표이다. 본 발명자들은, 조기 단계의 미경험 줄기세포 및 암 세포, 특히 MUC1*-양성 암 세포 둘 다가, DM10 도메인을 포함하지 않는 약 33kDa NME7 및 NME7-X1을 높은 수준으로 발현한다는 것을 발견하였다.
NME7-X1은 최근에 NME7의 이론적인 대체 아이소폼으로서 단백질 데이터베이스에 열거되었으나, 이는 조직 또는 세포에서 전혀 검출되지 않았다. 본 발명자들은, PCR에 의해 NME7-X1을 NME7으로부터 구별하는 프라이머를 설계하였다. 인간 NME7, NME7a, NME7b 및 NME7-X1의 발현 수준을, 섬유아세포, 인간 배아 줄기세포, 인간 iPS 세포, T47D 인간 유방암 세포, DU145 인간 전립선암 세포, PC3 인간 전립선암 세포, HEK295 인간 태아 간 세포 및 다른 인간 줄기세포주를 포함하는 세포 패널에서 PCR에 의해 측정하였다. NME7은 줄기세포에서보다 암 세포에서 더 높은 수준으로 발현된다. 특히, NME7-X1은 섬유아세포 또는 줄기세포에서보다 전립선암 세포에서 10배 더 높게 발현되고, 유방암 세포에서 3배 더 높게 발현된다. NME7-X1은 섬유아세포 또는 줄기세포에서보다 HEK293 태아 간 세포에서 약 5배 더 높게 발현되며, 따라서, NME7-X1이 간암에서 상승된다는 것을 예측한다. NME7b는 줄기세포에서보다 전립선암 세포에서 17배 내지 25배 더 높게 발현된다.
환자 샘플에서 NME7 종의 상승된 수준의 검출은, 환자가 암을 갖거나 암 발병 위험이 있을지에 대한 지표일 것이다. NME7 종의 수준은 PCR, 혼성화 계획, 사이클링 표지 기술, FISH, 면역세포화학, IHC, 웨스턴 블롯, 면역침전, 샌드위치 검정, ELISA 검정 등에 의해 측정되거나 평가될 수 있다. 환자 샘플은 체액 샘플, 혈액 샘플, 젖, 소변, 세포, 액체 생검, 생검 등일 수 있다. 암을 진단받은 환자에서, NME7 종의 상승된 수준은 전이 잠재력 증가의 지표이다. NME7-X1의 상승된 수준은 전립선암의 지표이다. 본 발명의 항체는 NME7 종을 검출하고 구별하는 데 사용되며, 진단 도구로서 사용된다.
성체 세포 및 조직은 NME7을 유의미한 수준으로 발현하지 않거나 NME7을 분비하지 않기 때문에, 암을 진단하거나, 보다 공격적이거나 전이성 형태를 진단하거나, 보다 공격적인 형태로의 이동을 진단하기 위한 효과적인 방식은, 환자, 세포 또는 조직 컬렉션, 또는 배양된 세포로부터의 샘플에서 NME7의 수준을, 건강한 샘플 내의 NME7의 수준과 비교하거나, 건강한 성체 세포 또는 조직에 존재하는 것으로 공지된 NME7의 수준과 비교하여 측정하는 것이다. NME7의 증가된 수준은 암의 존재, 전이성 암의 존재 또는 전이의 개시를 나타낸다. NME7의 증가된 수준은 또한 MUC1*-양성 암의 지표이다. NME7의 존재에 대해 분석된 샘플은 배양된 세포주 또는 환자 유래의 세포일 수 있는 세포 컬렉션, 체액, 혈액 샘플, 조직 표본 또는 생검 표본일 수 있다. 따라서, 암의 존재 또는 암의 진행을 검출할 진단 검정은 하기 단계를 포함한다: 1) 암 환자 또는 암이 발병할 위험이 있는 환자로부터 샘플을 얻는 단계; 2) 해당 샘플을, NME7의 수준, 또는 NME7을 암호화하는 핵산의 수준을 검출하거나 측정할 수 있는 검정으로 처리하는 단계; 3) 시험 샘플에서 측정된 NME7 단백질 또는 NME7-암호화 핵산의 수준을 대조군 환자 또는 대조군 세포에서의 수준과 비교하는 단계; 4) NME7 또는 NME7을 암호화하는 핵산의 수준이 대조군과 비교하여 상승되는지 확인하는 단계; 및 5) 시험이 비교되는 대조군이 이전에 암을 진단받은 공여자로부터 유래된 것이라면, 시험 샘플의 공여자가 암을 가지고 있거나, 암이 진행되었다고 결론 내리는 단계.
이러한 검정에서, 시험 샘플이 비교되는 대조군 샘플은 비-암성 세포, 배양된 세포, 건강한 공여자 유래의 샘플, 공여자 유래의 비-암성 샘플, 또는 시험 샘플의 공여자 유래의 샘플일 수 있으며, 여기서, 대조군 샘플은 이전 시점에서 공여자로부터 취하였다. 이러한 샘플의 공급원은 암의 존재 또는 진행에 대해 시험되고 있는 환자로부터 취한 체액, 뇌척수액, 골수 샘플, 혈액, 조직, 세포, 생검 조직 또는 세포, 환자의 세포로부터 유래된 배양된 세포 등을 비롯한 임의의 표본일 수 있다. 시험 샘플이 비교되는 샘플의 공급원은 체액, 뇌척수액, 골수 샘플, 혈액, 조직, 세포, 생검 조직 또는 세포, 또는 건강한 공여자 또는 시험 환자로부터 유래될 수 있는 배양된 세포일 수 있으며, 여기서, 샘플은 이전의 시점에서 취하였다. 시험 샘플이 비교되는 측정된 수준은 이전에 기록된 데이터로부터 유래될 수 있으며, 시험 샘플과의 비교를 위해 목록으로 컴파일링될 수 있다.
치료진단법(theranostics)
이어서, NME7 단백질 또는 NME7을 암호화하는 핵산의 수준이 상승된 것으로 진단받은 환자를, NME7의 발현을 억제하거나, NME7의 절단을 저해하거나, 이러한 상호작용이 암을 촉진하는 표적에 대한 NME7의 결합을 저해하는 치료제로 치료한다. NME7, 또는 NME7의 절단 생성물의 중요한 표적은 MUC1*이다. NME7은 MUC1*의 세포외 도메인에 결합하여, 이를 이량체화한다. 따라서, NME7 수준이 상승된 것으로 진단받은 환자는, NME7을 저해하는 치료제 및/또는 MUC1의 절단된 형태의 이량체화를 저해하는 치료제를 사용한 치료로부터 이득을 얻을 것이며, MUC1의 세포외 도메인은 PSMGFR 서열을 일부 또는 모두 포함한다. 따라서, 암 치료의 적합성, 및 암의 치료 또는 예방을 위한 치료제의 유효량의 투여를 평가하는 것은 하기 단계로 이루어질 것이다: 1) 암이 의심되는 환자, 암이 발병할 위험이 있는 환자, 또는 전이성 암이 발 병할 위험이 있는 환자로부터 샘플을 얻는 단계; 2) NME7, 이의 절단 생성물 또는 NME7을 암호화하는 핵산의 양을 측정하는 단계로서, 측정된 수준이 대조군 샘플에서 측정된 것보다 상당히 더 높은, 상기 단계; 3) 환자가 암을 갖고 있거나 환자에서 보다 공격적인 암 또는 전이성 암이 발병되었음을 확인하는 단계; 4) NME7의 발현을 억제하거나, NME7의 절단을 저해하거나, 표적에 대한 NME7의 결합을 저해하는 치료제를 유효량으로 환자에게 투여하고/투여하거나 MUC1의 발현을 억제하거나, MUC1*로의 MUC1의 절단을 저해하거나, 표적에 대한 MUC1*의 결합을 저해하는 치료제를 유효량으로 환자에게 투여하는 단계. 바람직한 실시형태에서, 표적에 대한 NME7의 결합을 저해하는 치료제는 NME7과 MUC1*와의 상호작용을 저해한다. 더 바람직한 실시형태에서, 이러한 치료제는 이것과 본질적으로 PSMGFR 서열을 포함하는 MUC1*의 세포외 도메인과의 상호작용을 저해한다. 바람직한 실시형태에서, 표적에 대한 MUC1*의 결합을 저해하는 치료제는 MUC1*와 NME7 사이의 상호작용을 저해한다. 더 바람직한 실시형태에서, MUC1*와 NME7 사이의 상호작용을 저해하는 치료제는, 본질적으로 NME7AB의 서열을 포함하는 NME7의 부분에 MUC1*이 결합하는 것을 저해한다.
화학적으로 변형된 펩타이드
폴리펩타이드 또는 항체 치료제는 순환 반감기가 짧고, 단백질용해성 분해되고, 용해도가 낮을 수 있다. 본 발명의 생물약제의 약물동력학 및 약력학을 개선하기 위해서, 면역원성을 감소 또는 증가시키고, 단백질용해성 절단을 감소시키기 위한 아미노산의 조작과 같은 방법이 수행될 수 있으며; 면역글로불린 및 알부민과 같은 혈청 단백질에 대한 펩타이드의 융합 또는 접합이 수행될 수 있으며; 보호 및 서방성을 위해 생물약제, 예컨대, 본 발명의 펩타이드 및 항체용 약물 전달 비히클 내로의 혼입이 또한 수행될 수 있고; 자연 중합체 또는 합성 중합체에 대한 접합이 또한 고려된다. 특히, 합성 중합체 접합을 위해, 페길화(pegylation) 또는 아실화, 예컨대, N-아실화, S-아실화 등이 또한 고려된다.
핵산 작제물
본 발명은 또한 본 명세서에 기술된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공하며, 여기서, 핵산 분자는 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된다. 본 발명은 또한 폴리펩타이드의 제조를 위한 숙주-벡터 시스템을 제공하며, 이러한 시스템은 폴리펩타이드의 발현에 적합한 숙주 세포 내로 도입된 본 발명의 발현 벡터를 포함한다. 적합한 숙주 세포는 박테리아 세포, 예컨대, 이. 콜라이(E. coli), 효모 세포, 예컨대, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 곤충 세포, 예컨대, 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 또는 포유동물 세포, 예컨대, COS, HEK 또는 CHO 세포일 수 있다.
본 발명은 또한 폴리펩타이드의 제조를 허용하고 결과적으로 제조된 폴리펩타이드를 회수하는 조건 하에서, 본 명세서에 기재된 숙주-벡터 시스템의 세포를 성장시킴으로써 본 발명의 폴리펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명을 실시하는 데 유용한 폴리펩타이드는 원핵 또는 진핵 발현 시스템에서 발현에 의해 제조될 수 있다.
재조합 유전자가 발현되고, 폴리펩타이드는 임의의 수의 방법을 이용하여 정제될 수 있다. 유전자는 예를 들어, 비제한적으로 pZErO와 같은 박테리아 발현 벡터 내로 서브클로닝될 수 있다.
폴리펩타이드는 임의의 기술에 의해 정제되어, 안정한 생물학적 활성 단백질이 후속적으로 형성될 수 있다. 예를 들어, 비제한적으로, 인자들은 세포로부터 가용성 단백질 또는 봉입체(inclusion body)로서 회수될 수 있으며, 이로부터 인자는 8M 구아니디늄 염산염 및 투석에 의해 정량적으로 추출될 수 있다. 인자를 더 정제하기 위해서, 비제한적으로 종래의 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 상이한 당 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피 또는 겔 여과를 비롯한 임의의 수의 정제 방법이 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되었을 때, 폴리펩타이드는 기능적으로 동등한 분자를 포함하며, 이 분자에서 서열 내의 잔기에 대해 아미노산 잔기가 치환되어, 침묵 변화 또는 보존 변화가 초래된다. 예를 들어, 서열 내의 하나 이상 아미노산 잔기는 유사한 극성을 가진 또 다른 아미노산에 의해 치환될 수 있으며, 이는 기능적 동등물로서 작용하여, 침묵 변경 또는 보존 변경이 초래된다. 서열 내의 아미노산에 대한 치환기는, 아미노산이 속한 부류의 다른 구성원으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 비극성(소수성) 아미노산은 알라닌, 류신, 아이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌을 포함한다. 극성 중성 아미노산은, 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민을 포함한다. 양전하성(염기성) 아미노산은 아르기닌, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 음전하성(산성) 아미노산은 아스파트산 및 글루탐산을 포함한다. 잠재적인 글리코실화 아미노산은, 세린, 트레오닌 및 아스파라긴을 포함한다. 동일하거나 유사한 생물학적 활성을 나타내는 단백질, 단편 또는 이들의 유도체, 및 번역 동안 또는 번역 후에 예를 들어, 글리코실화, 단백질분해 절단, 항체 분자 또는 다른 세포성 리간드에 대한 연결 등에 의해 상이하게 변형되는 유도체가 또한 본 발명의 범주 내에 포함된다.
당업자에게 공지된, DNA 단편을 벡터 내로 삽입시키는 임의의 방법이 사용되어, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 발현 벡터를 적절한 전사/번역 조절 신호 및 단백질 암호 서열을 사용하여 작제할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 및 합성 기술 및 생체내 재조합(유전 재조합)을 포함할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열의 발현은, 폴리펩타이드가 재조합 DNA 분자로 변형된 숙주에서 발현되도록, 제2 핵산 서열에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드의 발현은 당업계에 공지된 프로모터/인핸서 요소에 의해 제어될 수 있다. 폴리펩타이드의 발현을 제어하는 데 사용될 수 있는 프로모터는, 문헌[Squinto et al., (1991, Cell 65:1-20)에 기재된 바와 같은 긴 말단 반복부; SV40 조기(early) 프로모터 영역(문헌[Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310], CMV 프로모터, M-MuLV 5' 말단 반복부, 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부에 함유된 프로모터(문헌[Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797]), 헤르페스 티미딘 키나제 프로모터(문헌[Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445]), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열(문헌[Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42]); 원핵 발현 벡터, 예컨대, β-락타마제 프로모터(문헌[Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731]), 또는 tac 프로모터(문헌[DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25]), (또한 문헌["Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74-94] 참고); 효모 또는 다른 진균 유래의 프로모터 요소, 예컨대, Gal 4 프로모터, ADH(알코올 데하이드로게나제) 프로모터, PGK(포스포글리세롤 키나제) 프로모터, 알칼리 포스파타제 프로모터, 및 조직 특이성을 나타내고 트랜스제닉 동물에 이용되어온 하기 동물 전사 조절 영역: 췌장 선포 세포(acinar cell)에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 영역(문헌[Swift et al., 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515]); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역(문헌[Hanahan, 1985, Nature 315:115-122]), 림프모양 세포(lymphoid cell)에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역(문헌[Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444]), 고환 세포, 유방 세포, 림프모양 세포 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 조절 영역(문헌[Leder et al., 1986, Cell 45:485-495]), 센다이 바이러스, 렌티바이러스, 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역(문헌[Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276]), 간에서 활성인 알파-페토단백질 유전자 조절 영역(문헌[Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235:53-58]); 간에서 활성인 알파 1-안티트립신 유전자 조절 영역(문헌[Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171]), 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈 유전자 조절 영역(문헌[Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94]); 뇌 내의 희돌기세포에서 활성인 미엘린 베이직 단백질 유전자 조절 영역(문헌[Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712]); 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역(문헌[Shani, 1985, Nature 314:283-286]), 및 시상하부에서 활성인 성선자극 방출 호르몬 유전자 조절 영역(문헌[Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378]) 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
따라서, 본 발명에 따르면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하며 박테리아 또는 진핵 숙주에서 복제될 수 있는 발현 벡터가 사용되어, 숙주를 형질주입시키고, 이로써, 이러한 핵산이 발현되어 폴리펩타이드가 제조될 수 있게 하며, 이어서, 이러한 폴리펩타이드는 생물학적 활성 형태로 회수될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 생물학적 활성 형태는 관련 수용체에 결합할 수 있고 분화된 기능을 야기할 수 있고/있거나 수용체를 발현하는 세포의 표현형에 영향을 미칠 수 있는 형태를 포함한다.
핵산 삽입물을 함유하는 발현 벡터는 비제한적으로, 적어도 3개의 일반적인 접근법에 의해 확인될 수 있다: (a) DNA-DNA 혼성화, (b) "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부재, 및 (c) 삽입된 서열의 발현. 제1 접근법에서, 발현 벡터 내에 삽입된 외래 핵산의 존재는, 삽입된 핵산 서열에 상동성인 서열을 포함하는 프로브를 사용하여 DNA-DNA 혼성화에 의해 검출될 수 있다. 제2 접근법에서, 재조합 벡터/숙주 시스템은 벡터 내로의 외래 핵산 서열의 삽입에 의해 유발되는 특정 "마커" 유전자 기능(예를 들어, 티미딘 키나제 활성, 항생제에 대한 내성, 형질전환 표현형, 배큘로바이러스(baculovirus)에서의 폐색체(occlusion body) 형성 등)의 존재 또는 부재에 기초하여 식별 및 선택될 수 있다. 예를 들어, efl 핵산 서열이 벡터의 마커 유전자 서열 내에 삽입되면, 삽입체를 함유하는 재조합이 마커 유전자 기능의 부재에 의해 식별될 수 있다. 제3 접근법에서, 재조합 발현 벡터는 재조합 작제물에 의해 발현되는 외래 핵산 생성물을 분석함으로써 식별될 수 있다. 이러한 검정은 예를 들어, 관심대상 핵산 생성물의 물성 또는 기능적 특성을 기초로 할 수 있으며, 예를 들어, 검출 가능한 항체 또는 이의 일부로 태깅될 수 있는 수용체 또는 이의 일부에 대한 리간드의 결합, 또는 관심대상 단백질 또는 이의 일부에 대해 제조된 항체에 대한 결합에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드, 특히 변형된 폴리펩타이드는 숙주 세포에서 일시적으로, 구성적으로 또는 영구적으로 발현될 수 있다.
본 출원에서 언급되는 질환 또는 장애의 치료에 유용한 유효 용량은 당업자에게 알려진 방법을 사용하여 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Fingl, et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodman and Gilman, eds. Macmillan Publishing Co, New York, pp. 1-46 (1975)] 참고). 본 발명에 따라 사용하기 위한 약제학적 조성물은, 생체내 투여되기 전에, 담체 또는 표적화 분자(예를 들어, 항체, 호르몬, 성장 인자 등)에 연결되고/연결되거나 리포좀, 미세캡슐 및 제어 방출형 제제 내에 혼입된 전술한 폴리펩타이드를 약물학적으로 허용 가능한 액체, 고체 또는 반고체 담체 형태로 포함한다. 예를 들어, 약제학적 조성물은 수용액, 예컨대, 멸균 물, 식염수, 포스페이트 완충제 또는 덱스트로스 용액 내에 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 활성제는 이러한 치료가 필요한 환자에 게 이식될 수 있는 고체(예를 들어, 왁스) 또는 반고체(예를 들어, 젤라틴성) 제형에 포함될 수 있다. 투여 경로는 정맥내, 척추강내, 피하, 자궁내, 관련 조직 내로의 주사, 동맥내, 비내, 경구 또는 이식 장치를 통한 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 투여 방식일 수 있다.
투여에 의해, 본 발명의 활성제가 신체 전반적으로 또는 국소화된 영역에 분포될 수 있다. 예를 들어, 신경계의 먼 영역을 수반하는 일부 조건에서, 작용제의 정맥내 또는 척추강내 투여가 바람직할 수 있다. 일부 상황에서, 활성제를 함유하는 이식물이 병변 영역 또는 그 부근에 위치될 수 있다. 적합한 이식물은, 젤폼, 왁스, 스프레이 또는 미세입자-기재 이식물 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 폴리펩타이드를 약물학적으로 허용 가능한 비히클에 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 조성물은 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 정맥내, 척추강내, 동맥내, 비내, 경구, 피하, 복강내 투여, 또는 국소 주사 또는 수술적 이식 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 당업계에 공지된 임의의 적절한 투여 방식이 사용될 수 있다. 서방형 제형이 또한 제공된다.
유전자 요법
유전자 요법은 발현된 핵산 또는 발현 가능한 핵산을 대상체에게 투여함으로써 수행되는 요법을 지칭한다. 본 발명의 이러한 실시형태에서, 핵산은 치료 효과를 매개하는, 핵산의 암호화된 단백질을 생성한다.
당업자에게 이용가능한 임의의 유전자 치료 방법이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예시적인 방법이 하기에 기재된다.
유전자 치료 방법에 대한 일반적인 검토에 대해서는 문헌[Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); 및 Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); May, TIBTECH 11(5):155-215 (1993)]을 참고하기 바란다. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술 분야에 일반적으로 공지된 방법은 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); 및 Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]에 기재되어 있다.
환자에게 핵산을 전달하는 것은 직접적일 수 있으며, 이 경우 환자는 핵산 또는 핵산-운반 벡터에 직접 노출되며, 또는 전달은 간접적일 수 있고, 이 경우 세포는 우선 시험관내에서 핵산으로 형질전환되고, 이어서 환자에게 이식된다. 이들 2개의 접근법은 각각 생체내 또는 생체외 유전자 요법으로서 알려져 있다.
구체적인 실시형태에서, 핵산 서열은 생체내에서 직접 투여되며, 여기서 핵산 서열이 발현되어, 암호화된 생성물을 생성시킨다. 이는 당업계에 공지된 수많은 방법 중 임의의 방법을 사용하여 달성될 수 있으며, 예를 들어, 이들을 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 작제하고, 이러한 벡터 일부를 투여하여, 이들이 예를 들어, 결함이 있거나 약화된 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해, 또는 네이키드 DNA의 직접 주사에 의해, 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질주입제로의 코팅, 리포좀, 미세입자 또는 미세캡슐 내에서의 캡슐화에 의해 세포내 성분으로 되거나, 핵에 들어가는 것으로 알려진 펩타이드에 연결된 상태에서의 투여에 의해, 수용체-매개 엔도사이토시스에 적용되는 리간드에 연결된 상태로 대상체에게 투여함으로써 작제될 수 있다(예를 들어, 문헌[Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)] 참고)(이것은 수용체를 특이적으로 발현하는 세포 유형을 표적으로 하는 데 사용될 수 있음). 다른 실시형태에서, 핵산-리간드 복합체가 형성될 수 있으며, 이 복합체에서, 리간드는 엔도좀을 방해하기 위해 융합생성(fusogenic) 바이러스 펩타이드를 포함하며, 따라서, 핵산은 리포좀 분해를 피할 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 핵산은 특정 수용체를 표적화함으로써, 세포 특이적 흡수 및 발현을 위해 생체내에서 표적화될 수 있다. 대안적으로, 핵산은 상동성 재조합에 의해 발현용 숙주 세포 DNA 내에서 세포내로 도입되고 혼입될 수 있다(문헌[Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)]).
구체적인 실시형태에서, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 바이러스 벡터가 사용된다. 유전자 요법에 사용되어야 하는 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은 하나 이상의 벡터 내로 클로닝되며, 이러한 벡터는 환자에 대한 유전자의 전달을 촉진한다. 렌티바이러스 벡터, 예컨대, 레트로바이러스 벡터 및 다른 벡터, 예컨대, 아데노바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스는 사용될 수 있는 바이러스 벡터의 예이다. 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 올바른 패키징 및 숙주 세포 DNA 내로의 통합에 필수적인 성분을 함유한다.
아데노바이러스는 특히 경증 질환을 유발하는 호흡기 상피를 자연적으로 감염시키기 때문에, 유전자를 호흡기 상피에 전달하기 위한 매력적인 비히클이다. 아데노바이러스-기재 전달 시스템에 대한 다른 표적은 간, 중추신경계, 내피 세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 비-분화성 세포를 감염시킬 수 있는 이점을 갖는다. 또한 아데노-연관 바이러스(AAV) 또한 유전자 요법에서 사용되도록 제안되었다.
유전자 요법에 대한 또 다른 접근법은, 전기천공, 리포펙션, 칼슘 포스페이트 매개 형질감염 또는 바이러스 감염과 같은 방법에 의해, 유전자를 조직 배양 중인 세포 내로 전달하는 단계를 수반한다. 통상적으로, 이송 방법은 선택 마커를 세포에 전달하는 것을 포함한다. 이어서, 세포를 선택되도록 두어, 전달된 유전자를 얻고, 이를 발현하고 있는 세포를 단리시킨다. 그런 다음, 이들 세포를 환자에게 전달한다.
이러한 실시형태에서, 핵산은, 생성되는 재조합 세포의 생체내 투여 전에, 세포 내로 도입된다. 이러한 도입은 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이러한 방법은 형질감염, 전기천공, 미세주사, 핵 산 서열을 함유하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터를 사용한 감염, 세포 융합, 염색체-매개 유전자 이송, 미세세포(micrcell)-매개 유전자 이송, 스페로플라스트(spheroplast) 융합 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 외래 유전자를 세포 내에 도입하는 수많은 기술이 당업계에 공지되어 있으며, 이들 방법은 본 발명에 따라 사용될 수 있되, 단, 수여자 세포의 필수적인 발달 및 생리학적 기능은 방해를 받지 않아야 한다. 이러한 기술은 핵산을 세포에 안정하게 전달하며, 따라서, 핵산은 세포에 의해 발현될 수 있고, 바람직하게는 유전될 수 있고 이의 세포 자손에 의해 발현될 수 있다.
유전자 요법을 위해 핵산이 도입될 수 있는 세포는 임의의 목적하는 이용 가능한 세포 유형을 포함하며, 상피 세포, 내피 세포, 케라틴 생성 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 간세포; 혈액 세포, 예컨대, T-림프구, B-림프구, 단핵구, 대식세포, 중성구, 호산구, 거핵세포, 과립세포; 다양한 줄기세포 또는 전구세포, 특히 예를 들어, 골수, 제대혈, 말초 혈액, 태아 간으로부터 얻어지는 조혈 줄기세포 또는 조혈 전구세포 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
바람직한 실시형태에서, 유전자 요법에 사용되는 세포는 환자에서 자가(autologous)이다.
재조합 세포가 유전자 요법에 사용되는 일 실시형태에서, 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열은, 이들 서열이 세포 또는 이의 자손에 의해 발현될 수 있도록 세포 내로 도입되며, 그런 다음, 재조합 세포는 치료 효과를 위해 생체내에 투여된다. 구체적인 실시형태에서, 줄기세포 또는 전구세포가 사용된다. 시험관내에서 단리 및 유지될 수 있는 임의의 줄기세포 및/또는 전구세포는 잠재적으로는 본 발명의 이러한 실시형태에 따라 사용될 수 있다.
구체적인 실시형태에서, 유전자 요법을 목적으로 도입되는 핵산은 암호 영역에 작동적으로 연결된 유도성 프로모터를 포함하며, 따라서, 핵산의 발현은 적절한 전사 유도제의 존재 또는 부재를 조절함으로써 조절될 수 있다.
치료 조성물
치료 화합물의 제형화는 일반적으로 당업계에 공지되어 있으며, 편리하게는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., USA]를 참고할 수 있다. 예를 들어, 매일 체중 1㎏ 당 약 0.05ng 내지 약 20㎎이 투여될 수 있다. 투여량 치료법은 최적의 치료 반응을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 몇몇 분할 용량이 매일 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 긴급성에 의해 지시되는 바와 같이 비례해서 감소될 수 있다. 활성 화합물은 종래의 방식, 예컨대, 경구, 정맥내(수용성인 경우), 근육내, 피하, 비내, 안내, 피내 또는 좌제 경로 또는 이식(예를 들어, 서방형 분자를 복강내 경로에 의해 사용하거나, 시험관 내에서 감작되고 수여자에게 입양 전달되는(adoptively transferred) 단핵구 또는 수지상 세포와 같은 세포를 사용함으로써)에 의해 투여될 수 있다. 투여 경로에 따라, 펩타이드는, 효소, 산 및 상기 성분을 불활성화시킬 수 있는 다른 자연적인 조건의 작용으로부터 펩타이드를 보호하기 위해 물질 내에서 코팅될 필요가 있을 수 있다.
예를 들어, 펩타이드의 낮은 친유성은, 펩타이드 결합을 절단할 수 있는 효소에 의해 위장관에서와 산 가수분해에 의해 위(stomach)에서 펩타이드가 파괴될 수 있게 할 것이다. 비경구 투여 이외의 경로에 의해 펩타이드를 투여하기 위해, 펩타이드는 이의 불활성화를 방지하는 물질에 의해 코팅되거나 이러한 물질과 함께 투여될 것이다. 예를 들어, 펩타이드는 아주반트 내에서 투여되거나, 효소 저해제와 함께 공동-투여되거나 리포좀 내에서 투여될 수 있다. 본 명세서에서 고려되는 아주반트는 레소르시놀, 비-이온성 계면활성제, 예컨대, 폴리옥시에틸렌 올레일 에터 및 n-헥사데실 폴리에틸렌 에터를 포함한다. 효소 저해제는 췌장 트립신 저해제, 다이아이소프로필플루오로포스페이트(DEP) 및 트라실롤을 포함한다. 리포좀은 수-중-유-중-수 CGF 에멀션뿐만 아니라 종래의 리포좀을 포함한다.
활성 화합물은 비경구 또는 복강내로 투여될 수도 있다. 분산액은 또한 글리세롤 액체 폴리에틸렌 글리콜, 이들의 혼합물 및 오일 내에서 제조될 수 있다. 저장 및 사용을 위한 통상적인 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 방지하기 위해 보존제를 함유한다.
주사용으로 적합한 약제학적 형태는 멸균 수용액(수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 모든 경우, 이러한 형태는 멸균되어야 하고, 용이한 주사기 사용성(syringability)이 존재하는 범위까지 유체성이어야 한다. 이는 제조 및 보관 조건 하에 안정해야 하고, 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보존되어야 한다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및 식물유를 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예를 들어, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 테오머살 등에 의해 유발될 수 있다. 많은 경우, 당 또는 염화나트륨과 같은 등장성제를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물의 흡수 연장은 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 유발될 수 있다.
멸균 주사 용액은, 필요한 양의 활성 화합물을 전술한 다양한 다른 성분과 함께 적절한 용매 내에서 혼입하고, 필요한 경우, 여과 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 다양한 멸균 활성 성분을, 염기성 분산 매질 및 전술한 것으로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결-건조 기술이며, 이는 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 임의의 부가적인 목적하는 성분이 더해진 활성 성분 분말을 제공한다.
펩타이드가 상기에 기재된 바와 같이 적합하게 보호될 때, 활성 화합물은 예를 들어, 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용(assimilable edible) 담체와 함께 경구 투여될 수 있거나, 활성 화합물은 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐 내에 포함될 수 있거나, 정제로 압축될 수 있거나, 식품과 함께 직접 혼입될 수 있다. 경구 치료 투여를 위해, 활성 화합물은 부형제와 함께 혼입되고, 섭취 가능한 정제, 협측 정제(buccal tablet), 트로키, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 제제는 활성 화합물을 적어도 1중량% 함유해야 한다. 조성물 및 제제의 백분율은 물론 달라질 수 있고, 편리하게는 단위 중량의 약 5% 내지 약 80%일 수 있다. 치료적으로 유용한 이러한 조성물 중의 활성 화합물의 양은, 적합한 용량이 수득될 양이다. 본 발명에 따라 바람직한 조성물 또는 제제는, 경구 투여 단위 형태가 활성 화합물을 0.1㎍ 내지 2000㎎으로 함유하도록 제조된다.
정제, 알약, 캡슐 등은 또한 하기를 함유할 수도 있고: 결합제, 예컨대, 트래거캔스검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대, 다이칼슘 포스페이트; 붕괴제, 예컨대, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 윤활제, 예컨대, 마그네슘 스테아레이트; 및 감미제, 예컨대, 수크로스, 락토스 또는 사카린이 첨가될 수 있거나, 풍 미제, 예컨대, 페퍼민트, 윈터그린(wintergreen) 오일 또는 체리향이 첨가될 수 있다. 투여 단위 형태가 캡슐인 경우, 이는 상기 유형의 물질 외에도 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질은 코팅제로서 존재하거나, 그렇지 않으면 투여 단위의 물리적 형태를 변경하기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약 또는 캡슐은 쉘락, 당 또는 둘 다를 사용하여 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 활성 화합물, 감미제로서 수크로스, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 풍미제, 예컨대, 체리향 또는 오렌지향을 함유할 수 있다. 물론, 임의의 투여 단위 형태를 제조하는 데 사용되는 임의의 물질은 약제학적으로 순수하고, 이용되는 양에서 실질적으로 무독성이어야 한다. 또한 활성 화합물은 서방형 제제 및 제형 내로 혼입될 수 있다.
전달 시스템
다양한 전달 시스템은 공지되어 있고, 본 발명의 화합물을 투여하는 데 사용될 수 있으며, 예를 들어, 리포좀, 미세입자, 미세캡슐, 화합물을 발현시킬 수 있는 재조합 세포 내에서의 캡슐화, 수용체-매개 엔도사이토시스, 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서의 핵산의 작제 등이 있다. 도입 방법은 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 비내, 안내, 경막외 및 경구 경로 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 화합물 또는 조성물은 임의의 편리한 경로, 예를 들어, 주입 또는 불러스 주사, 상피 라이닝 또는 점액피부 라이닝(예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 투여 또는 국소 투여일 수 있다. 또한 본 발명의 약제학적 화합물 또는 조성물을 뇌실내 및 척추강내 주사를 비롯한 임의의 적합한 경로에 의해 중추신경계 내로 도입하는 것이 바람직할 수 있으며; 뇌실내 주사는 예를 들어, 저장소, 예컨대, Ommaya 저장소에 부착된 뇌실내 카테터에 의해 촉진될 수 있다. 예를 들어, 흡입기 또는 네뷸라이저의 사용에 의한 폐 투여가 또한 이용될 수 있으며, 제형은 에어로졸제를 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 본 발명의 약제학적 화합물 또는 조성물을 치료가 필요한 영역에 국소 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이는 비제한적으로 예를 들어, 수술 동안의 국소 주입, 국소 적용, 예를 들어, 수술 후 상처 드레싱과 함께 국소 적용, 주사, 카테터, 좌제, 또는 이식에 의해 달성될 수 있고, 상기 이식은 시알라스틱 막(sialastic membrane)과 같은 막 또는 섬유를 비롯한 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체 또는 펩타이드를 비롯한 단백질을 투여할 때, 단백질이 흡수되지 않는 물질을 사용하기 위해서는 주의를 기울여야 한다. 또 다른 실시형태에서, 화합물 또는 조성물은 비히클, 특히 리포좀 내에서 전달될 수 있다. 추가의 다른 실시형태에서, 화합물 또는 조성물은 제어 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 일 실시 형태에서, 펌프가 사용될 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다. 추가의 다른 실시형태에서, 제어 방출 시스템은 치료 표적에 근접하여 위치될 수 있으며, 따라서, 전신 용량의 단지 일부가 필요할 수 있다.
서열 목록 프리 텍스트
a, g, c, t 이외의 뉴클레오타이드 부호의 사용과 관련하여, 이들은 WIPO 표준 ST.25, 부록 2, 표 1에 기재되어 있는 관례를 따르며, 여기서, k는 t 또는 g를 나타내며; n은 a, c, t 또는 g를 나타내며; m은 a 또는 c; r은 a 또는 g를 나타내며; s는 c 또는 g를 나타내며; w는 a 또는 t를 나타내고, y는 c 또는 t를 나타낸다.
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Figure pct00058
서열번호 2, 3 및 4는 MUC1 수용체 및 절두된 아이소폼을 세포막 표면으로 안내하기 위한 N-말단 MUC-1 신호전달 서열을 기재한다. 최대 3개의 아미노산 잔기가 서열번호 2, 3 및 4에서의 변이체에 의해서 제시된 바와 같이 C-말단 단부에 존재하지 않을 수 있다.
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실시예
실시예 1 - 최소 무혈청 베이스("MM")(500㎖)의 성분
400㎖ DME/F12/GlutaMAX I(Invitrogen# 10565-018)
100㎖ 넉아웃 혈청 대체물(KO-SR, Invitrogen# 10828-028)
5㎖ 100x MEM 비-필수 아미노산 용액(Invitrogen# 11140-050)
0.9㎖(0.1mM) "β-머캅토에탄올(55 mM 스톡, Invitrogen# 21985-023).
실시예 2 - 단백질 작제물의 생성
재조합 NME7을 생성시키기 위해서, 효율적으로 그리고 가용성 형태로 발현될 수 있는 재조합 NME7을 제조하기 위해, 먼저 작제물을 제조하였다. 제1 접근법은 천연 NME7(a), 또는 N-말단 결실을 갖는 대체 스플라이스 변이체 NME7(b)를 암호화할 작제하는 것이었다. 일부 경우, 작제물은 히스티딘 태그 또는 스트렙(strep) 태그를 가지고 있어서, 정제에 도움이 되었다. NME7-a, 이. 콜라이에서 불량하게 발현되는 전장 NME7 및 NME7-b는 모두 이. 콜라이에서 발현되지 않았다. 그러나, 제조된 신규한 작제물은 DM10 서열이 결실되어 있었으며, NME7은 분자량 계산치가 33kDa인 NDPK A 및 B 도메인을 본질적으로 포함하였다.
이러한 신규 NME7AB는 이. 콜라이에서 매우 양호하게 발현되었으며, 용해성 단백질로서 존재하였다. NME7AB를 먼저 NTA-Ni 칼럼 상에서 정제한 다음, Sephadex 200 칼럼 상의 크기 배제 크로마토그래피(FPLC)에 의해 더 정제하였다. 분획을 수집하고, SDS-PAGE에 의해 시험하여, NME7AB의 가장 높고, 가장 순수한 발현을 갖는 분획을 식별하였다. 가장 순수한 조합 분획에 대한 FPLC 트레이스(trace)를 조합하였다. 이어서, 정제된 NME7AB 단백질을 시험하였고, 이는 인간 줄기세포의 성장을 전적으로 지지하고, 이러한 줄기세포를 가장 미경험 사전-X-불활성화 상태로 반전시키는 것으로 나타났다. 정제된 NME7AB는 또한 암 세포의 성장을 가속화시키는 것으로 나타났다.
실시예 3 - NME7AB 가 2개의 MUC1* 세포외 영역 펩타이드에 동시에 결합한다는 것을 나타낸 ELISA 검정
결과를 도 1에 도시한다. C-말단 시스테인을 보유하는 PSMGFR 펩타이드(PSMGFR-Cys)를 Imject Maleimide 활성화된 BSA 키트(써모 피셔사)를 사용하여 BSA에 공유 커플링시켰다. BSA에 커플링된 PSMGFR-Cys를 0.1M 탄산염/중탄산염 완충제 pH 9.6에서 10ug/㎖로 희석시키고, 50uL를 96웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 4℃에서 밤새 인큐베이션시킨 후, 플레이트 PBS-T로 2회 세척하고, 3% BSA 용액을 첨가하여, 웰 상에 남아있는 결합 부위를 차단하였다. 실온에서 1시간 후, 플레이트를 PBS-T 및 NME7으로 2회 세척하고, PBS-T + 1% BSA로 희석시키고, 상이한 농도로 첨가하였다. 실온에서 1시간 후, 플레이트를 PBS-T 및 항-NM23-H7(B-9, 산타 크루즈 바이오테크놀로지사)로 3회 세척하고, PBS-T + 1% BSA에서 희석시키고, 1/500의 희석비로 첨가하였다. 실온에서 1시간 후, 플레이트를 PBS-T 및 염소 항 마우스-HRP로 3회 세척하고, PBS-T + 1% BSA에서 희석시키고, 1/3333의 희석비로 첨가하였다. 실온에서 1시간 후, 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고, NME7의 결합을 ABTS 용액(피어스사(Pierce))을 사용해 415nm에서 측정하였다.
ELISA MUC1* 이량체화: NME7 결합에 대한 프로토콜을 사용하였고, NME7을 11.6ug/㎖ 농도로 사용하였다.
실온에서 1시간 후, 플레이트를 PBS-T 및 His-태깅된 PSMGFR 펩타이드(PSMGFR-His) 또는 바이오티닐화된 PSMGFR 펩타이드(PSMGFR-바이오틴)로 3회 세척하고, PBS-T + 1% BSA에서 희석시키고, 상이한 농도로 첨가하였다. 실온에서 1시간 후, 플레이트를 PBS-T 및 항-His태그-HRP(압캠사(Abcam)) 또는 스트렙타비딘-HRP(피어스사(Pierce))로 3회 세척하고, PBS-T + 1% BSA에서 희석시키고, 1/5000의 농도로 첨가하였다. 실온에서 1시간 후, 플레이트를 PBS-T로 3회 세척하고, PSMGFR 펩타이드가, BSA에 커플링된 또 다른 PSMGFR 펩타이드(항-His 항체 또는 스트렙타비딘에 의해 신호를 전달할 수 없었음)에 이미 결합된 NME7에 결합했는지의 여부를 ABTS 용액(피어스사)을 사용하여 415nm에서 측정하였다.
실시예 4 - 인간 재조합 NME7AB 의 기능 시험
전분화능을 유지하고 분화를 저해하는 능력에 대해 재조합 NME7AB를 시험하기 위해, NME7의 가용성 변이체인 NME7AB를 생성시키고, 정제하였다. 인간 줄기세포(iPS cat# SC101a-1, 시스템 바이오사이언시스사(System Biosciences))를 지시서에 따라 마우스 섬유아세포 피더 세포 층 상에서 4ng/㎖ bFGF에서 4회 계대 동안 성장시켰다. 그런 다음, 이들 기원 줄기세포를, 단클론성 항-MUC1*항체인 MN-C3으로 12.5ug/웰로 코팅했던 6-웰 세포 배양 플레이트(VitaTM, 써모 피셔사) 상에 플레이팅하였다. 세포를 웰당 300,000개 세포의 밀도로 플레이팅하였다. 베이스 배지는 하기로 이루어진 최소 줄기세포 배지였다: 400㎖ DME/F12/GlutaMAX I(Invitrogen# 10565-018), 100 ㎖ 넉아웃 혈청 대체물(KO-SR, Invitrogen# 10828-028), 5㎖ 100x MEM 비-필수 아미노산 용액(Invitrogen# 11140-050) 및 0.9㎖(0.1mM) β-머캅토에탄올(55mM 스톡, Invitrogen# 21985-023). 베이스 배지는 임의의 배지일 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 베이스 배지는 다른 성장 인자 및 사이토카인을 포함하지 않는다. 베이스 배지에, 안정적인 이량체로서 다시 접혀지고 정제된 8nM NME7AB 또는 8nM NM23-H1을 첨가하였다. 배지를 48시간마다 교환하였고, 플레이팅 3일 후에 수거하고, 계대시켜야 했다. 줄기세포를 NM23-H1 이량체 또는 NME7 단량체에서 성장시켰을 때, 유사한 만능 줄기세포 성장이 달성되었다.
NME7 및 NM23-H1(NME1) 이량체 둘 다 전분화능적으로 성장하였으며, 100% 컨플루언트에 도달할 때에도 분화되지 않았다. 사진에서 인지될 수 있는 바와 같이, NME7 세포는 NM23-H1 이량체에서 성장한 세포보다 더 빠르게 성장하였다. 처음에 수거한 세포 계수치는, NME7에서의 배양이 NM23-H1 이량체에서의 배양보다 세포를 1.4배 더 많이 생성하였음을 확인해 주었다. 전형적인 전분화능 마커에 대한 ICC 염색은, NME7AB가 인간 줄기세포 성장, 전분화능을 전적으로 지지하였으며, 분화를 저지하였음을 확인해 주었다.
약 30kDa 내지 33kDa의 NME7 종은 대체 스플라이스 아이소폼이거나 절단과 같은 번역후 변형된 것일 수 있으며, 이는 세포로부터 분비될 수 있다.
실시예 5 - 줄기세포를 보다 미경험 상태로 반전시키는 조건 하에 세포를 배양함으로써, 암 세포의 전이성 암 세포로 전이의 유도
암 세포를 일반적으로 혈청-함유 배지, 예컨대, RPMI에서 배양한다. 본 발명자들은, 줄기세포를 보다 미경험 상태로 반전시키는 시약의 존재 하에 암 세포를 배양하면, 암 세포를 보다 전이성 상태로 형질전환시킴을 발견하였다.
본 발명자들은, NME7AB, 인간 NME1 이량체, 박테리아 NME1 이량체, NME7-X1 및 "2i" 저해제가 각각 보통의 암 세포를 암 줄기세포 "CSC" 또는 종양 개시 세포 "TIC"라고도 지칭되는 전이성 암 세포로 형질전환시킬 수 있었다는 것을 입증하였다. 2i는 연구자들이 인간 줄기세포를 보다 미경험 상태로 반전시키게 하는 것으로 발견한 2개의 생화학적 저해제에 대해 주어진 명칭이다. 2i는 MEK 및 GSK3-베타 저해제 PD0325901 및 CHIR99021이며, 이들은 배양 배지에 각각 약 1mM 및 3mM의 최종 농도로 첨가된다.
NME7AB 및 NME7-X1은 암 세포를 전이성 세포로 형질전환시키기 위해 최소 배지의 별개의 배취에 첨가되었을 때, 약 4nM의 최종 농도로 존재하긴 하지만, 보다 낮은 농도 및 보다 높은 농도도 약 1nM 내지 16nM의 범위에서 양호하게 작용한다. 인간 NME1 이량체 또는 박테리아 NME1 이량체는 4nM 내지 32nM의 최종 농도로 사용되며, 16nM이 이들 실험에 전형적으로 사용되고, 여기서, 인간 NME는 S120G 돌연변이를 보유한다. 야생형을 사용하는 경우, 보다 낮은 농도가 필요할 수 있다. 이들 정확한 농도가 중요한 것은 아니다. NME1 단백질이 이량체이고, 이것이 발생하는 농도 범위는 낮은 나노몰 범위로 존재하지만, 특정 돌연변이는 보다 높은 농도에서 이량체로서 유지될 수 있게 하는 것이 중요하다.
유사하게는, NME7 단백질의 농도는 달라질 수 있다. NME7AB 및 NME7-X1은 단량체이고, 암 세포를 전이성 세포로 변환시키는 데 사용된 농도는 단백질을 단량체로 유지시킬 수 있어야 한다. 다양한 분자 마커는 전이성 암 세포의 지표로서 제안되었다. 서로 다른 유형의 암들은, 상향조절되는 상이한 분자를 가질 수 있다. 예를 들어, 수용체 CXCR4는 전이성 유방암에서 상향조절되며, 한편, CHD1으로도 알려져 있는 E-카드헤린은 전이성 전립선암에서 더 상향조절된다.
이들 특이적인 전이 마커 외에도, 전분화능에 대한 전형적인 마커, 예컨대, OCT4, SOX2, NANOG 및 KLF4는 암이 전이성으로 됨에 따라 상향조절된다. 출발 암 세포 및 이후의 전이성 암 세포는 이들 유전자의 발현 수준을 측정하기 위해 PCR에 의해 검정될 수 있다.
도 2는, NME7AB를 함유한 배지에서 배양된 T47D 유방암 세포의 RT-PCR 측정 그래프를 도시한다. rho I 키나제 저해제, ROCi, ROCKi 또는 Ri를 첨가하여, 형질전환된 세포가 플레이트로부터 탈착되어 부유하는 것을 방지하였다. 모 세포 및 NME7AB 배양된 세포에 대해서 다양한 전이 마커뿐만 아니라 만능 줄기세포 마커의 발현 수준을 측정하였다. 그 결과는, 부유 세포가 ROCi를 제공받은 세포와 비교하여 전이 마커 및 전분화능 마커를 보다 높은 양으로 발현한다는 것을 나타낸다. 본 발명자들은 이들 측정 결과가, 형질전환되지 않은 세포와, 형질전환되었지만 ROCi가 이들을 부착성으로 유지하는 세포의 평균이었기 때문이라고 생각하였다. 이는 도면에서 명백하게 인지될 수 있고, 여기서, "-Ri"는 ROCi를 제공받지 않은 부착성 세포이며, 따라서, 부유하는 고도로 전이성인 세포와 혼합되지 않았음을 의미한다.
전립선암 세포는 또한 NME1이라고도 하는 NM23 또는 NME7AB를 함유하는 배지에서 배양되었을 때, 보다 전이성 상태로 전이되었다. 본 명세서에서, 본 발명자들은, 지금까지 시험된 모든 세포주에 대해서, NME7AB, 인간 NME1 이량체 또는 인간 NME에 대해 높은 서열 상동성을 갖는 박테리아 NME에서의 배양이 보다 전이성 상태로의 전이를 유도한다는 것을 나타낸다.
도 4는 2i 저해제, NME7AB 또는 둘 다를 함유하는 배지에서 배양된 유방암 세포에 대한 전이 마커 및 전분화능 마커의 발현 수준에 대한 RT-PCR 측정의 그래프를 도시한다. 인지될 수 있는 바와 같이, 2i 저해제는 또한 암 세포의 보다 전이성인 상태로의 전이를 유도할 수 있다. 난소 암 세포주 SK-OV3, OV-90, 췌장암 세포주 CAPAN-2 및 PANC-1, 유방암 세포주 MDA-MB는 모두 NME7AB 및/또는 2i 저해제에서 배양되었을 때, 부착성으로부터 비-부착성으로의 형태학적 전이를 나타내었다.
도 20은 NME7AB에서 72시간 또는 144시간 동안 배양된 다양한 암 세포주에 대한 전이 마커 또는 전분화능 마커의 RT-PCR 측정 그래프를 나타낸다. 도 20A는, SK-OV3 세포가 NME7AB에서 배양되었을 때, 전이 마커 CHD1, SOX2 및 NME7-X1의 발현을 증가시킴을 나타낸다. 도 20B는, OV-90 세포가 NME7AB에서 배양된 후, 전이 마커 CXCR4 및 NME7-X1의 발현을 증가시킴을 나타낸다.
실시예 6 - NME7에서 배양된 암 세포가 전이성이 된다는 것에 대한 입증
암 세포 집단이 전이성인지 아닌지에 대한 기능 시험은, 매우 적은 수, 예를 들어, 200개의 세포를 면역-손상된 마우스에 이식하고, 이들 세포가 종양으로 발병되는지 알아보는 것이다. 전형적으로, 면역-손상된 마우스에서 종양을 형성하기 위해서는 5백만 내지 6백만개의 암 세포가 필요하다. 본 발명자들은, 50개만큼 적은 수의 NME-유도 전이성 암 세포가 마우스에서 종양을 형성하였음을 나타내었다. 또한, 시험 기간 전체 동안에 인간 NME7AB, NME1 또는 NME7-X1이 주사된 마우스에서 원거리 전이가 발병되었다.
T47D 인간 유방암 세포를 표준 RPMI 배지에서 14일 동안 배양하였으며, 이때, 배지를 48시간마다 교환하였고, 약 75% 컨플루언트되었을 때, 트립신처리에 의해 계대시켰다. 이어서, 세포를 6-웰 플레이트 내에 플레이팅하고, 4nM NME7AB가 보충된 최소 줄기세포 배지(실시예 1 참조)에서 배양하였다. 배지를 48시간마다 교환하였다. 약 4일까지, 일부 세포는 표면으로부터 탈착되어, 부유한다. "부유체"가 전이 마커의 RT-PCR 측정에 의해 입증되는 바와 같이 가장 높은 전이 잠재력을 갖는 세포이기 때문에, "부유체"를 보유하기 위해 배지를 조심스럽게 교환한다. 7일 또는 8일에, 부유체를 수거하고, 계수한다. RT-PCR 측정을 위해 샘플을 유지한다. 측정된 주요 마커는 CXCR4이며, 이는 NME7AB에서 간단히 배양된 후 40배 내지 200배 상향조절된다.
새로 수거된 부유체 전이성 세포를, 90-일 서방성 에스트로겐 펠릿이 이식되었던 암컷 nu/nu 무흉선 마우스의 옆구리에 이종 이식하였다. 부유체 세포를 각각 10,000개, 1,000개, 100개 또는 50개 세포로 이종 이식하였다. 또한, 6마리로 이루어진 각각의 군 내의 마우스 중 절반에는 32 nM NME7AB를 본래 이식 부위 근처에 매일 주사하였다. NME7AB가 없는 RPMI 배지에서 배양된 모 T47D 세포를 또한, 대조군으로서 6백만개, 10,000개 또는 100개로 마우스에게 이식하였다. NME7-유도 부유체 세포를 이식한 마우스는 50개만큼 적은 수의 세 포가 이식되었을 때에도 종양이 발병되었다. 부유체 세포를 이식하고, NME7AB를 매일 주사한 마우스에서는 또한 원거리 종양이 발병되거나 다양한 기관에서 원거리 전이가 발병되었다. NME7AB에서 배양된 암 세포를 이식한 후, 인간 NME7AB를 주사한 12마리의 마우스 중 11마리, 또는 92%의 마우스에서 주사 부위에서 종양이 발병되었다. 이식 후 인간 NME7AB를 주사하지 않은 12마리의 마우스 중 단지 7마리 또는 58%의 마우스에서만 종양이 발병되었다. 종양을 나타내고, 인간 NME7AB가 주사된 11마리의 마우스 중 9마리 또는 82%의 마우스에서, 주사 부위로부터 원거리에서 다중 종양이 발병되었다. NME7AB를 주사하지 않은 마우스 중 어떤 마우스에서도 가시적인 다중 종양이 발병되지 않았다.
희생시킨 후, RT-PCR 및 웨스턴 블롯은, NME7AB를 주사한 마우스 상의 원거리 범프(bump)가 사실상 인간 유방 종양이었음을 나타내었다. 이들 기관에 대한 유사한 분석은, 원거리 범프 외에도, 마우스에서, 이식된 인간 유방암 세포의 인간 유방암 특징이 간 및 폐로 무작위로 전이되었음을 나타내었다. 예상된 바와 같이, 6백만개 세포를 이식한 마우스만 종양을 성장시켰다.
상기에 기재된 것과 유사한 몇몇 실험을 수행하였으며, 본질적으로 동일한 결과로 수행되었다. 각각의 실험에서, 모든 적절한 대조군을 비롯하여 24마리 또는 52마리의 마우스가 존재하였다.
실시예 7 - 선택된 펩타이드는 이들의 서열이 NME7, A1, A2, B1, B2 및 B3에 고유하기 때문에, MUC1* 세포외 도메인 펩타이드에 대한 NME7 종의 결합을 저해한다.
NME7 펩타이드를 항체 생성을 위한 면역화 작용제로서 선택하였다. NME7 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3(도 9)를, 인간 NME1, 인간 NME7, 및 인간 NME1 또는 인간 NME7에 대해 상동성인 몇몇 박테리아 NME 중에서 서열 정렬 방법을 사용하여 선택하였다. 모두 중에서 높은 서열 상동성을 갖는 5개의 영역을 식별하였다. 그러나, 인간 NME1뿐만 아니라 인간 NME7을 저해할 항체를 생성할 펩타이드의 선택을 방지하기 위해서, 본 발명은 상동성 영역에 인접한 NME7 서열을 선택하였으며, 여기서, 이들 펩타이드는 인간 NME1과 상이한 서열을 가졌다. 본 발명자들은, 펩타이드 자체가 표면 상의 합성 MUC1* 펩타이드에 결합하고, 고정화된 펩타이드에 대한 인간 NME7 또는 인간 NME1의 결합을 저해할 수 있는지 알아보기 위해 ELISA 검정을 수행하였다(도 11). 도 11은, 펩타이드가, 고정화된 펩타이드에 대한 NME7 및 NME1의 결합을 저해하였음을 나타낸다. NME7 A 도메인 및 B 도메인 각각이 PSMGFR 펩타이드에 결합할 수 있다는 것을 상기하기 바란다. 따라서, PSMGFR 펩타이드에 대한 NME7AB 결합의 완전한 저해는 단 하나의 도메인으로부터 유래된 단일 항체 또는 펩타이드로 달성될 수 없다. 이는, 펩타이드가 유래된 영역이 MUC1*와 상호작용하였고, NME7의 영역에 결합하고 MUC1* 수용체에 대한 이의 결합을 저해할 항체를 생성시킬 영역이었음을 나타내었다.
또 다른 실험에서, 유리 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3를, NME7AB 또는 2i에서 배양함으로써 보다 전이성 상태로의 전이를 겪고 있는 배양 중인 암 세포에 첨가하였다. 도 14는, 암 세포를 NME7AB 또는 2i 저해제에서 성장시킬 때의 과학자들의 관찰 결과의 표를 나타내며, 유리 펩타이드가 부착성 세포에서 부유 세포로의 형태학적 변화를 저해하였으며, 이러한 형태학적 변화는 유방암 세포의 경우 전이 마커, 특히 CXCR4의 증가된 발현과 직접 상관관계가 있음을 나타낸다. RT-PCR 측정은, NME7AB 펩타이드가 전이 마커 CXCR4의 발현 증가를 저해하였음을 확인시켜 준다.
도 15는 NME7AB 또는 2i 저해제(이들 각각은 암 세포를 보다 전이성 상태로 형질전환시킴)에서 성장시킨 T47D 유방암 세포에서 CXCR4 발현 및 전이성 형질전환에 미치는 NME7-유래의 펩타이드, A1, A2, B1, B2 및 B3의 저해 효과에 대한 RT-PCR 측정 그래프를 나타낸다. 도 32는 도 15에서 CXCR4의 RT-PCR 측정에 사용된 샘플에서 기록된 RNA 수준의 표뿐만 아니라 CXCR4 발현 및 대조군 하우스키핑 유전자에 대한 역치 사이클 수를 도시한다.
실시예 8 - 항-NME7 항체는 인간 NME1이 아닌 인간 NME7에 특이적으로 결합한다.
인간 NME1은 건강한 기능을 가지며, 이를 항체로 차단하는 것이 인간에게 유해할 수 있기 때문에 본 발명자들은 NME7AB 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3를 사용한 면역화에 의해 생성한 NME7 항체가 인간 NME1이 아닌 NME7AB에 특이적으로 결합할 것인지 확인하기 위해 표준 ELISA 검정을 수행하였다. 도 24 내지 도 25의 ELISA는, 본 발명자들이 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3으로부터 생성된 모든 NME7 항체가 인간 NME1(도 25)이 아닌 인간 NME7AB(도 24)에 결합함을 나타낸다. 이들 항체를 생성하는 데 사용되는 펩타이드는 NME7AB 및 NME7-X1 둘 모두에 공통적이다. 이러한 검정은, 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3로부터 생성된 항체가 NME7AB에 특이적으로 결합하며, 확장에 의해서 NME7-X1에도 결합할 것임을 나타낸다.
NME7A 펩타이드 1(A 도메인): MLSRKEALDFHVDHQS(서열번호 141),
NME7A 펩타이드 2(A 도메인): SGVARTDASES(서열번호 142),
NME7B 펩타이드 1(B 도메인): DAGFEISAMQMFNMDRVNVE(서열번호 143),
NME7B 펩타이드 2(B 도메인): EVYKGVVTEYHDMVTE(서열번호 144),
NME7B 펩타이드 3(B 도메인): AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFF(서열번호 145).
실시예 9 - 항-NME7 특이적 항체 및 이를 생성시킨 펩타이드는 암 세포 성장을 저해한다.
토끼를 NME7 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3을 사용하여 면역화시키고, 항체를 생성시키고, 수집하고, 면역화 펩타이드가 접합된 칼럼 상에서 정제시켰다. T47D 유방암 세포를 플레이팅하고, 혈청이 보충된 RPMI 배지에서 ATCC 프로토콜에 따라 배양하였다. 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3을 사용한 면역화로부터 생성된 항체를 도 12에 제시된 농도로 첨가하였다. 면역화 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3 및 본 명세서에서 "FLR"라고 하는 MUC1*의 PSMGFR 세포외 도메인 펩타이드를 또한 성장 중인 T47D 유방암 세포에 개별적으로 첨가하였다. 탁솔 및 E6 항-MUC1*Fab를 대조군으로서 첨가하였다. 도 12의 그래프는, 생성된 항체뿐만 아니라 유리 펩타이드가 암 세포의 성장을 강력하게 저해하였음을 나타낸다. 건강한 세포 및 암 세포를 유사하게 살해하는 화학치료제인 탁솔을 사용한 저해와의 비교를 주목하기 바란다. 또한 비교를 위해, 아미노산 100 내지 376으로부터의 NME7의 큰 스트레치를 사용하여 생성된 다클론성 항체를 나타낸다. 이러한 항체가 암 성장의 강력한 저해제이긴 하지만, 이는 NME1뿐만 아니라 NME7에도 결합할 수 있기 때문에, 비-특이적 효과를 가질 수 있었다.
유사한 실험에서, 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3을 사용한 면역화로부터 생성된 항체뿐만 아니라 펩타이드 자체를 성장 중인 암 세포에 제시된 농도로 첨가하였다. 도 13에 도시된 세포 성장의 그래프는, 항체와 펩타이드의 조합물이 암 세포의 성장을 강력하게 저해하였음을 나타낸다. 이들 2개의 실험에서, 세포는 MUC1* 양성 유방암 세포였다.
실시예 10 - 항-NME7 항체는 암 세포의 전이성 암 세포로의 전이를 저해한다.
암 세포는 줄기세포를 보다 미경험 상태로 반전시키는 작용제의 존재 하에 배양되었을 때, 보다 전이성 상태로 형질전환된다. 본 발명자들은, NME7AB, 인간 NME1 이량체, 박테리아 NME1 이량체, 또는 "2i"로 지칭되는 MEK 및 GSK3-베타 저해제에서 암 세포를 배양하면, 세포가 보다 전이성 상태로 된다는 것을 입증하였다. 세포가 보다 전이성 상태로 전이됨에 따라서, 세포는 비-부착성인 상태가 되고, 배양 플레이트로부터 부유한다. 이들 부유하는 세포인 "부유체"를 부착성인 세포로부터 개별적으로 수집하였으며, 이들은, a) 전이성 유전자를 훨씬 더 높은 수준으로 발현하고; b) 마우스 내로 이종 이식되었을 때, 부유체 세포는 매우 낮은 수로 이식된 경우 종양을 생성시킬 수 있는 것으로 나타났다. RT-PCR 측정값에서, 특이적인 전이 마커, 예컨대, 유방암에서 CXCR4, 전립선암에서 CHD1, 및 다른 만능 줄기세포 마커, 예컨대, OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, c-Myc 및 다른 마커는 NME7AB에서 배양된 암 세포에서 급격하게 과발현되었으며, 본 명세서 및 도면에서 "부유체"로 지칭되는 비-부착성이된 세포에서 극적으로 과발현되었다.
본 명세서에서 본 발명자들은, NME7-유래 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3을 사용한 면역화에 의해 생성된 NME7-특이적 항체뿐만 아니라 펩타이드 자체가 암 세포에서 전이성 암 세포로의 전이를 저해함을 나타낸다. 이들 실험 중 제1 실험에서, A1, A2, B1, B2 및 B3을 사용한 면역화에 의해 생성된 항체를, T47D 유방암 세포를 NME7AB 또는 2i 저해제에서 배양함으로써 유도되는 전이성 전이를 저해하는 능력에 대해 시험하였다. 가장 놀라운 관찰은, 항체 및 펩타이드가 부유체 세포의 수를 급격하게 감소시킨 것이며, 이는, 항체 및 펩타이드가 전이성 암 세포로의 형질전환을 저해했다는 제1 지표였다. 특히, B3 펩타이드를 사용한 면역화로부터 항체가 생성된 세포는 임의의 부유체 세포를 거의 생성시키지 않았다.
도 14는, 어떠한 항체 치료도 제공받지 않은 대조군 웰과 비교하여, 각각의 항체에 대해 가시적인 부유체 세포의 백분율의 기록된 관찰을 나타낸다. mRNA를 부유체 세포 및 부착성 세포 둘 다로부터 추출하였다. RT-PCR을 사용하여, CXCR4를 비롯한 전이 마커의 발현 수준을 측정하였다. 항-NME7 항체를 사용한 치료는 전이 마커, 예컨대, CXCR4의 양을 크게 감소시켰으며, 이는, 이러한 항체가 전이성 암으로의 전이를 저해했음을 나타낸다(도 15 참고). 주목할 만하게는, 펩타이드 B3를 사용한 면역화에 의해 생성된 항체, 즉, 항체 #61은 보다 전이성 상태로의 전이를 본질적으로 완전히 저해하였다. 도 15B는, NME7AB 펩타이드, A1, A2, B1, B2 및 B3로 처리된 유방암 세포 단독이 2i 저해제를 함유하는 배지에서 세포를 배양함으로써 유도된 보다 전이성 상태로의 전이를 강력하게 저해할 수 있었음을 나타낸다. 이것이 생성한 항체 #61이었기 때문에, 펩타이드 B3이 특히 효과적이었다. 도 15C는 동일한 그래프를 나타내지만, Y-축은 전이 마커의 펩타이드 저해를 보여주기 위해 확대되었다. 세포의 생존력 및 성장을 나타내는 mRNA의 양을 측정하였다. 항체로 처리된 세포는 훨씬 더 적은 양의 mRNA를 가졌는데, 이는 보다 전이성 상태로의 전이를 저해하는 것 외에도, 항-NME7AB 항체가 암 세포의 성장을 저해하였음을 나타낸다. 도 16은 도 15A에서 도시된 저해 실험을 위해 회수된 RNA의 양을 나타낸 표를 도시한다.
실시예 11 - NME7-유래 펩타이드 A1, A2, B1, B2 및 B3을 사용하여 생성된 항-NME7 항체는 임의의 상업적으로 입수 가능한 항체를 사용하여 검출 불가능한 신규 NME7 종을 식별한다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 일부 항체는 표적 단백질의 선형 부분을 인지하고, 웨스턴 블롯 검정에서 사용될 수 있으며, 한편, 다른 항체는 비-선형 구조 모티프를 인식하고, 풀-다운 또는 면역침전 검정에서 사용될 수 있다. 본 출원 이전에, 절단된 NME7 또는 아이소폼 NME7-X1은 존재하는 것으로 알려지지 않았다. 출원 시점에서 상업적으로 입수 가능한 항체를 사용하면, 기존의 항체는 이들 중요한 NME7 종을 특이적으로 검출할 수 없었음을 나타낸다. B9(산타 크루즈 바이오테크놀로지사)는 NME7 아미노산 100 내지 376에 대해 생성된 단클론성 항체이다. 도 19D 내지 19F는 이 항체가 전장 42kDa NME7만을 검출함을 나타낸다. 또 다른 상업적으로 입수 가능한 항체인 H278은, NME7에 고유하지 않은 아미노산 서열을 포함하는 NME7 아미노산 100 내지 376에 대해 생성된 토끼 다클론성 항체이다. 도 19D 내지 19F는, 이러한 항체가 또한 17kDa인 NME1뿐만 아니라 전장 NME7, 및 NME7AB에 특이적인 것으로 보이지 않는 다른 밴드를 염색시킴을 나타낸다.
NME7AB 펩타이드 A1, A2, B1, B2 또는 B3를 사용한 면역화에 의해 생성된 NME7 항체는, 전장 42kDa 단백질을 포함하는 새로운 NME7 종, 절단 생성물 또는 대체 아이소폼일 수 있는 약 33kDa NME7 종, 절단 생성물 또는 대체 아이소폼일 수 있는 약 30kDa NME7 종을 식별하며, 여기서, 약 30kDa 종은 NME7-X1인 것으로 보인다. 도 19A 내지 도 19C는, 펩타이드 A1, B1 및 B3에 의해 생성된 항체가 T47D 유방암 세포, PC3 및 DU145 전립선암 세포, HEK293 태아 간 세포 및 백혈병 세포 IM-9, K562 및 MV411을 비롯한 광범위한 암 세포주에서 분비 형태의 NME7, NME7AB 및 NME7-X1을 식별한다는 것을 나타낸다.
실시예 12 - 항-NME7 항체의 생성
*NME7의 B3 영역의 서열, AIFGKTKIQNAVHCTDLPEDGLLEVQYFFC(서열번호)을 갖는 합성 펩타이드를 사용하여 토끼를 면역화시켰다. NME7 펩타이드 B3으로의 면역화로부터 생성된 항체는 MUC1* 양성 암 세포의 성장을 저해하였고, 또한 암 줄기세포의 형성을 저해하였는데, 암 줄기세포의 형성은 전이 마커의 상향조절, 고정부를 독립적으로 성장시키는 능력 및 200개만큼 적은 세포로부터 동물에서 종양을 형성할 수 있는 능력에 의해서 특징규명되는 반면, 보통 암 세포는 종양 생착을 위해서 전형적으로 약 4백만개의 세포의 이식을 필요로 한다.
일부 경우에, NME7 B3 펩타이드는 C14A 또는 C14V 돌연변이로 제조되었다. 이러한 서열은 항-NME7 항체를 보다 재현 가능하게 생성시켰다.
NME7 B3, C14A 돌연변이를 갖는 B3 또는 C14V 돌연변이를 갖는 B3으로의 면역화에 의해서 표준 방법에 따라서 마우스에서 단클론성 항체를 생성시켰다. 열거된 항체는 NME7, NME7-X1, NME7AB에 결합하는 능력으로 인해서 선택되었지만, 중요하게는 NME1에 결합하지 않았는데, 이는 일부 정상 세포 기능에 필요하다고 생각된다. 이들 항체는 또한 NME7 유래 펩타이드 B3, C14A 돌연변이를 갖는 B3, 및 C14V 돌연변이를 갖는 B3에 결합한다.
실험은, 이들 항-NME7 항체가 MUC1* 세포외 도메인에 대한 NME7의 결합을 저해하였지만, MUC1* 세포외 도메인 펩타이드에 대한 NME1의 결합을 차단하지 않았다는 것을 나타내었다. 추가로, 항체는 암 줄기세포의 형성을 저해하였다.
인용 참고문헌 목록
Figure pct00087
Figure pct00088
Figure pct00089
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당업자는 본 명세서에 구체적으로 기재된 본 발명의 특정 실시형태에 대한 다수의 등가물을 일상적인 실험을 사용하여 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 청구범위의 범주에 포함되도록 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> Minerva Biotechnologies Corporation <120> ANTI-NME ANTIBODY AND METHOD OF TREATING CANCER OR CANCER METASTASIS <130> 16831-163WO0 <140> PCT/US2021/036500 <141> 2021-06-08 <160> 1051 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1 Receptor - Mucin 1 precursor, Genbank Accession number: P15941 <400> 1 Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr 1 5 10 15 Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr Pro Gly 20 25 30 Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro Ser Ser 35 40 45 Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser Ser His 50 55 60 Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val Thr Leu 65 70 75 80 Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly Gln 85 90 95 Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr 100 105 110 Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro 115 120 125 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 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Leu 1160 1165 1170 Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg 1175 1180 1185 Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr 1190 1195 1200 His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr 1205 1210 1215 Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser 1220 1225 1230 Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val 1235 1240 1245 Ala Ala Ala Ser Ala Asn Leu 1250 1255 <210> 2 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal MUC-1 signaling sequence <400> 2 Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr 1 5 10 15 Val Leu Thr <210> 3 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal MUC-1 signaling sequence <400> 3 Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr 1 5 10 15 Val Leu Thr Val Val Thr Ala 20 <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-terminal MUC-1 signaling sequence <400> 4 Met Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu Leu Thr 1 5 10 15 Val Leu Thr Val Val Thr Gly 20 <210> 5 <211> 146 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Truncated MUC1 receptor isoform having nat-PSMGFR at its N-terminus and including the transmembrane and cytoplasmic sequences of a full-length MUC1 receptor <400> 5 Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys 1 5 10 15 Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val 20 25 30 Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro 35 40 45 Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu Val Ala Leu 50 55 60 Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys Arg Arg Lys 65 70 75 80 Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr Tyr His Pro 85 90 95 Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr Val Pro Pro 100 105 110 Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala Gly Asn Gly 115 120 125 Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala Ala Ser Ala 130 135 140 Asn Leu 145 <210> 6 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSMGFR sequence <400> 6 Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys 1 5 10 15 Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val 20 25 30 Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala 35 40 45 <210> 7 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSMGFR sequence <400> 7 Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser 20 25 30 Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala 35 40 <210> 8 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSMGFR sequence <400> 8 Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys 1 5 10 15 Thr Glu Ala Ala Ser Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val 20 25 30 Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala 35 40 45 <210> 9 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PSMGFR sequence <400> 9 Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr 1 5 10 15 Glu Ala Ala Ser Pro Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val Ser 20 25 30 Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala 35 40 <210> 10 <211> 216 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1 cytoplasmic domain nucleotide sequence <400> 10 tgtcagtgcc gccgaaagaa ctacgggcag ctggacatct ttccagcccg ggatacctac 60 catcctatga gcgagtaccc cacctaccac acccatgggc gctatgtgcc ccctagcagt 120 accgatcgta gcccctatga gaaggtttct gcaggtaacg gtggcagcag cctctcttac 180 acaaacccag cagtggcagc cgcttctgcc aacttg 216 <210> 11 <211> 72 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MUC1 cytoplasmic domain amino acid sequence <400> 11 Cys Gln Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala 1 5 10 15 Arg Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His 20 25 30 Gly Arg Tyr Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys 35 40 45 Val Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala 50 55 60 Val Ala Ala Ala Ser Ala Asn Leu 65 70 <210> 12 <211> 854 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NME7 nucleotide sequence (NME7: GENBANK ACCESSION AB209049) <400> 12 gagatcctga gacaatgaat catagtgaaa gattcgtttt cattgcagag tggtatgatc 60 caaatgcttc acttcttcga cgttatgagc ttttatttta cccaggggat ggatctgttg 120 aaatgcatga tgtaaagaat catcgcacct ttttaaagcg gaccaaatat gataacctgc 180 acttggaaga tttatttata ggcaacaaag tgaatgtctt ttctcgacaa ctggtattaa 240 ttgactatgg ggatcaatat acagctcgcc agctgggcag taggaaagaa aaaacgctag 300 ccctaattaa accagatgca atatcaaagg ctggagaaat aattgaaata ataaacaaag 360 ctggatttac tataaccaaa ctcaaaatga tgatgctttc aaggaaagaa gcattggatt 420 ttcatgtaga tcaccagtca agaccctttt tcaatgagct gatccagttt attacaactg 480 gtcctattat tgccatggag attttaagag atgatgctat atgtgaatgg aaaagactgc 540 tgggacctgc aaactctgga gtggcacgca cagatgcttc tgaaagcatt agagccctct 600 ttggaacaga tggcataaga aatgcagcgc atggccctga ttcttttgct tctgcggcca 660 gagaaatgga gttgtttttt ccttcaagtg gaggttgtgg gccggcaaac actgctaaat 720 ttactaattg tacctgttgc attgttaaac cccatgctgt cagtgaaggt atgttgaata 780 cactatattc agtacatttt gttaatagga gagcaatgtt tattttcttg atgtacttta 840 tgtatagaaa ataa 854 <210> 13 <211> 283 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NME7 amino acid sequence (NME7: GENBANK ACCESSION AB209049) <400> 13 Asp Pro Glu Thr Met Asn His Ser Glu Arg Phe Val Phe Ile Ala Glu 1 5 10 15 Trp Tyr Asp Pro Asn Ala Ser Leu Leu Arg Arg Tyr Glu Leu Leu Phe 20 25 30 Tyr Pro Gly Asp Gly Ser Val Glu Met His Asp Val Lys Asn His Arg 35 40 45 Thr Phe Leu Lys Arg Thr Lys Tyr Asp Asn Leu His Leu Glu Asp Leu 50 55 60 Phe Ile Gly Asn Lys Val Asn Val Phe Ser Arg Gln Leu Val Leu Ile 65 70 75 80 Asp Tyr Gly Asp Gln Tyr Thr Ala Arg Gln Leu Gly Ser Arg Lys Glu 85 90 95 Lys Thr Leu Ala Leu Ile Lys Pro Asp Ala Ile Ser Lys Ala Gly Glu 100 105 110 Ile Ile Glu Ile Ile Asn Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Lys Leu Lys 115 120 125 Met Met Met Leu Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val Asp His 130 135 140 Gln Ser Arg Pro Phe Phe Asn Glu Leu Ile Gln Phe Ile Thr Thr Gly 145 150 155 160 Pro Ile Ile Ala Met Glu Ile Leu Arg Asp Asp Ala Ile Cys Glu Trp 165 170 175 Lys Arg Leu Leu Gly Pro Ala Asn Ser Gly Val Ala Arg Thr Asp Ala 180 185 190 Ser Glu Ser Ile Arg Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg Asn Ala 195 200 205 Ala His Gly Pro Asp Ser Phe Ala Ser Ala Ala Arg Glu Met Glu Leu 210 215 220 Phe Phe Pro Ser Ser Gly Gly Cys Gly Pro Ala Asn Thr Ala Lys Phe 225 230 235 240 Thr Asn Cys Thr Cys Cys Ile Val Lys Pro His Ala Val Ser Glu Gly 245 250 255 Met Leu Asn Thr Leu Tyr Ser Val His Phe Val Asn Arg Arg Ala Met 260 265 270 Phe Ile Phe Leu Met Tyr Phe Met Tyr Arg Lys 275 280 <210> 14 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NM23-H1 nucleotide sequence (NM23-H1: GENBANK ACCESSION AF487339) <400> 14 atggtgctac tgtctacttt agggatcgtc tttcaaggcg aggggcctcc tatctcaagc 60 tgtgatacag gaaccatggc caactgtgag cgtaccttca ttgcgatcaa accagatggg 120 gtccagcggg gtcttgtggg agagattatc aagcgttttg agcagaaagg attccgcctt 180 gttggtctga aattcatgca agcttccgaa gatcttctca aggaacacta cgttgacctg 240 aaggaccgtc cattctttgc cggcctggtg aaatacatgc actcagggcc ggtagttgcc 300 atggtctggg aggggctgaa tgtggtgaag acgggccgag tcatgctcgg ggagaccaac 360 cctgcagact ccaagcctgg gaccatccgt ggagacttct gcatacaagt tggcaggaac 420 attatacatg gcagtgattc tgtggagagt gcagagaagg agatcggctt gtggtttcac 480 cctgaggaac tggtagatta cacgagctgt gctcagaact ggatctatga atga 534 <210> 15 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NM23-H1 describes amino acid sequence (NM23-H1: GENBANK ACCESSION AF487339) <400> 15 Met Val Leu Leu Ser Thr Leu Gly Ile Val Phe Gln Gly Glu Gly Pro 1 5 10 15 Pro Ile Ser Ser Cys Asp Thr Gly Thr Met Ala Asn Cys Glu Arg Thr 20 25 30 Phe Ile Ala Ile Lys Pro Asp Gly Val Gln Arg Gly Leu Val Gly Glu 35 40 45 Ile Ile Lys Arg Phe Glu Gln Lys Gly Phe Arg Leu Val Gly Leu Lys 50 55 60 Phe Met Gln Ala Ser Glu Asp Leu Leu Lys Glu His Tyr Val Asp Leu 65 70 75 80 Lys Asp Arg Pro Phe Phe Ala Gly Leu Val Lys Tyr Met His Ser Gly 85 90 95 Pro Val Val Ala Met Val Trp Glu Gly Leu Asn Val Val Lys Thr Gly 100 105 110 Arg Val Met Leu Gly Glu Thr Asn Pro Ala Asp Ser Lys Pro Gly Thr 115 120 125 Ile Arg Gly Asp Phe Cys Ile Gln Val Gly Arg Asn Ile Ile His Gly 130 135 140 Ser Asp Ser Val Glu Ser Ala Glu Lys Glu Ile Gly Leu Trp Phe His 145 150 155 160 Pro Glu Glu Leu Val Asp Tyr Thr Ser Cys Ala Gln Asn Trp Ile Tyr 165 170 175 Glu <210> 16 <211> 534 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NM23-H1 S120G mutant nucleotide sequence (NM23-H1: GENBANK ACCESSION AF487339) <400> 16 atggtgctac tgtctacttt agggatcgtc tttcaaggcg aggggcctcc tatctcaagc 60 tgtgatacag gaaccatggc caactgtgag cgtaccttca ttgcgatcaa accagatggg 120 gtccagcggg gtcttgtggg agagattatc aagcgttttg agcagaaagg attccgcctt 180 gttggtctga aattcatgca agcttccgaa gatcttctca aggaacacta cgttgacctg 240 aaggaccgtc cattctttgc cggcctggtg aaatacatgc actcagggcc ggtagttgcc 300 atggtctggg aggggctgaa tgtggtgaag acgggccgag tcatgctcgg ggagaccaac 360 cctgcagact ccaagcctgg gaccatccgt ggagacttct gcatacaagt tggcaggaac 420 attatacatg gcggtgattc tgtggagagt gcagagaagg agatcggctt gtggtttcac 480 cctgaggaac tggtagatta cacgagctgt gctcagaact ggatctatga atga 534 <210> 17 <211> 177 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NM23-H1 S120G mutant amino acid sequence (NM23-H1: GENBANK ACCESSION AF487339) <400> 17 Met Val Leu Leu Ser Thr Leu Gly Ile Val Phe Gln Gly Glu Gly Pro 1 5 10 15 Pro Ile Ser Ser Cys Asp Thr Gly Thr Met Ala Asn Cys Glu Arg Thr 20 25 30 Phe Ile Ala Ile Lys Pro Asp Gly Val Gln Arg Gly Leu Val Gly Glu 35 40 45 Ile Ile Lys Arg Phe Glu Gln Lys Gly Phe Arg Leu Val Gly Leu Lys 50 55 60 Phe Met Gln Ala Ser Glu Asp Leu Leu Lys Glu His Tyr Val Asp Leu 65 70 75 80 Lys Asp Arg Pro Phe Phe Ala Gly Leu Val Lys Tyr Met His Ser Gly 85 90 95 Pro Val Val Ala Met Val Trp Glu Gly Leu Asn Val Val Lys Thr Gly 100 105 110 Arg Val Met Leu Gly Glu Thr Asn Pro Ala Asp Ser Lys Pro Gly Thr 115 120 125 Ile Arg Gly Asp Phe Cys Ile Gln Val Gly Arg Asn Ile Ile His Gly 130 135 140 Gly Asp Ser Val Glu Ser Ala Glu Lys Glu Ile Gly Leu Trp Phe His 145 150 155 160 Pro Glu Glu Leu Val Asp Tyr Thr Ser Cys Ala Gln Asn Trp Ile Tyr 165 170 175 Glu <210> 18 <211> 459 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NM23-H2 nucleotide sequence (NM23-H2: GENBANK ACCESSION AK313448) <400> 18 atggccaacc tggagcgcac cttcatcgcc atcaagccgg acggcgtgca gcgcggcctg 60 gtgggcgaga tcatcaagcg cttcgagcag aagggattcc gcctcgtggc catgaagttc 120 ctccgggcct ctgaagaaca cctgaagcag cactacattg acctgaaaga ccgaccattc 180 ttccctgggc tggtgaagta catgaactca gggccggttg tggccatggt ctgggagggg 240 ctgaacgtgg tgaagacagg ccgagtgatg cttggggaga ccaatccagc agattcaaag 300 ccaggcacca ttcgtgggga cttctgcatt caggttggca ggaacatcat tcatggcagt 360 gattcagtaa aaagtgctga aaaagaaatc agcctatggt ttaagcctga agaactggtt 420 gactacaagt cttgtgctca tgactgggtc tatgaataa 459 <210> 19 <211> 152 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> NM23-H2 amino acid sequence (NM23-H2: GENBANK ACCESSION AK313448) <400> 19 Met Ala Asn Leu Glu Arg Thr Phe Ile Ala Ile Lys Pro Asp Gly Val 1 5 10 15 Gln Arg Gly Leu Val Gly Glu Ile Ile Lys Arg Phe Glu Gln Lys Gly 20 25 30 Phe Arg Leu Val Ala Met Lys Phe Leu Arg Ala Ser Glu Glu His Leu 35 40 45 Lys Gln His Tyr Ile Asp Leu Lys Asp Arg Pro Phe Phe Pro Gly Leu 50 55 60 Val Lys Tyr Met Asn Ser Gly Pro Val Val Ala Met Val Trp Glu Gly 65 70 75 80 Leu Asn Val Val Lys Thr Gly Arg Val Met Leu Gly Glu Thr Asn Pro 85 90 95 Ala Asp Ser Lys Pro Gly Thr Ile Arg Gly Asp Phe Cys Ile Gln Val 100 105 110 Gly Arg Asn Ile Ile His Gly Ser Asp Ser Val Lys Ser Ala Glu Lys 115 120 125 Glu Ile Ser Leu Trp Phe Lys Pro Glu Glu Leu Val Asp Tyr Lys Ser 130 135 140 Cys Ala His Asp Trp Val Tyr Glu 145 150 <210> 20 <211> 1023 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NM23-H7-2 sequence optimized for E. coli expression <400> 20 atgcatgacg ttaaaaatca ccgtaccttt ctgaaacgca cgaaatatga taatctgcat 60 ctggaagacc tgtttattgg caacaaagtc aatgtgttct ctcgtcagct ggtgctgatc 120 gattatggcg accagtacac cgcgcgtcaa ctgggtagtc gcaaagaaaa aacgctggcc 180 ctgattaaac cggatgcaat ctccaaagct ggcgaaatta tcgaaattat caacaaagcg 240 ggtttcacca tcacgaaact gaaaatgatg atgctgagcc gtaaagaagc cctggatttt 300 catgtcgacc accagtctcg cccgtttttc aatgaactga ttcaattcat caccacgggt 360 ccgattatcg caatggaaat tctgcgtgat gacgctatct gcgaatggaa acgcctgctg 420 ggcccggcaa actcaggtgt tgcgcgtacc gatgccagtg aatccattcg cgctctgttt 480 ggcaccgatg gtatccgtaa tgcagcacat ggtccggact cattcgcatc ggcagctcgt 540 gaaatggaac tgtttttccc gagctctggc ggttgcggtc cggcaaacac cgccaaattt 600 accaattgta cgtgctgtat tgtcaaaccg cacgcagtgt cagaaggcct gctgggtaaa 660 attctgatgg caatccgtga tgctggcttt gaaatctcgg ccatgcagat gttcaacatg 720 gaccgcgtta acgtcgaaga attctacgaa gtttacaaag gcgtggttac cgaatatcac 780 gatatggtta cggaaatgta ctccggtccg tgcgtcgcga tggaaattca gcaaaacaat 840 gccaccaaaa cgtttcgtga attctgtggt ccggcagatc cggaaatcgc acgtcatctg 900 cgtccgggta ccctgcgcgc aatttttggt aaaacgaaaa tccagaacgc tgtgcactgt 960 accgatctgc cggaagacgg tctgctggaa gttcaatact ttttcaaaat tctggataat 1020 tga 1023 <210> 21 <211> 340 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NM23-H7-2 sequence optimized for E. coli expression <400> 21 Met His Asp Val Lys Asn His Arg Thr Phe Leu Lys Arg Thr Lys Tyr 1 5 10 15 Asp Asn Leu His Leu Glu Asp Leu Phe Ile Gly Asn Lys Val Asn Val 20 25 30 Phe Ser Arg Gln Leu Val Leu Ile Asp Tyr Gly Asp Gln Tyr Thr Ala 35 40 45 Arg Gln Leu Gly Ser Arg Lys Glu Lys Thr Leu Ala Leu Ile Lys Pro 50 55 60 Asp Ala Ile Ser Lys Ala Gly Glu Ile Ile Glu Ile Ile Asn Lys Ala 65 70 75 80 Gly Phe Thr Ile Thr Lys Leu Lys Met Met Met Leu Ser Arg Lys Glu 85 90 95 Ala Leu Asp Phe His Val Asp His Gln Ser Arg Pro Phe Phe Asn Glu 100 105 110 Leu Ile Gln Phe Ile Thr Thr Gly Pro Ile Ile Ala Met Glu Ile Leu 115 120 125 Arg Asp Asp Ala Ile Cys Glu Trp Lys Arg Leu Leu Gly Pro Ala Asn 130 135 140 Ser Gly Val Ala Arg Thr Asp Ala Ser Glu Ser Ile Arg Ala Leu Phe 145 150 155 160 Gly Thr Asp Gly Ile Arg Asn Ala Ala His Gly Pro Asp Ser Phe Ala 165 170 175 Ser Ala Ala Arg Glu Met Glu Leu Phe Phe Pro Ser Ser Gly Gly Cys 180 185 190 Gly Pro Ala Asn Thr Ala Lys Phe Thr Asn Cys Thr Cys Cys Ile Val 195 200 205 Lys Pro His Ala Val Ser Glu Gly Leu Leu Gly Lys Ile Leu Met Ala 210 215 220 Ile Arg Asp Ala Gly Phe Glu Ile Ser Ala Met Gln Met Phe Asn Met 225 230 235 240 Asp Arg Val Asn Val Glu Glu Phe Tyr Glu Val Tyr Lys Gly Val Val 245 250 255 Thr Glu Tyr His Asp Met Val Thr Glu Met Tyr Ser Gly Pro Cys Val 260 265 270 Ala Met Glu Ile Gln Gln Asn Asn Ala Thr Lys Thr Phe Arg Glu Phe 275 280 285 Cys Gly Pro Ala Asp Pro Glu Ile Ala Arg His Leu Arg Pro Gly Thr 290 295 300 Leu Arg Ala Ile Phe Gly Lys Thr Lys Ile Gln Asn Ala Val His Cys 305 310 315 320 Thr Asp Leu Pro Glu Asp Gly Leu Leu Glu Val Gln Tyr Phe Phe Lys 325 330 335 Ile Leu Asp Asn 340 <210> 22 <211> 399 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-A <400> 22 atggaaaaaa cgctagccct aattaaacca gatgcaatat caaaggctgg agaaataatt 60 gaaataataa acaaagctgg atttactata accaaactca aaatgatgat gctttcaagg 120 aaagaagcat tggattttca tgtagatcac cagtcaagac cctttttcaa tgagctgatc 180 cagtttatta caactggtcc tattattgcc atggagattt taagagatga tgctatatgt 240 gaatggaaaa gactgctggg acctgcaaac tctggagtgg cacgcacaga tgcttctgaa 300 agcattagag ccctctttgg aacagatggc ataagaaatg cagcgcatgg ccctgattct 360 tttgcttctg cggccagaga aatggagttg tttttttga 399 <210> 23 <211> 132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-A <400> 23 Met Glu Lys Thr Leu Ala Leu Ile Lys Pro Asp Ala Ile Ser Lys Ala 1 5 10 15 Gly Glu Ile Ile Glu Ile Ile Asn Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Lys 20 25 30 Leu Lys Met Met Met Leu Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val 35 40 45 Asp His Gln Ser Arg Pro Phe Phe Asn Glu Leu Ile Gln Phe Ile Thr 50 55 60 Thr Gly Pro Ile Ile Ala Met Glu Ile Leu Arg Asp Asp Ala Ile Cys 65 70 75 80 Glu Trp Lys Arg Leu Leu Gly Pro Ala Asn Ser Gly Val Ala Arg Thr 85 90 95 Asp Ala Ser Glu Ser Ile Arg Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg 100 105 110 Asn Ala Ala His Gly Pro Asp Ser Phe Ala Ser Ala Ala Arg Glu Met 115 120 125 Glu Leu Phe Phe 130 <210> 24 <211> 444 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-A1 <400> 24 atggaaaaaa cgctagccct aattaaacca gatgcaatat caaaggctgg agaaataatt 60 gaaataataa acaaagctgg atttactata accaaactca aaatgatgat gctttcaagg 120 aaagaagcat tggattttca tgtagatcac cagtcaagac cctttttcaa tgagctgatc 180 cagtttatta caactggtcc tattattgcc atggagattt taagagatga tgctatatgt 240 gaatggaaaa gactgctggg acctgcaaac tctggagtgg cacgcacaga tgcttctgaa 300 agcattagag ccctctttgg aacagatggc ataagaaatg cagcgcatgg ccctgattct 360 tttgcttctg cggccagaga aatggagttg ttttttcctt caagtggagg ttgtgggccg 420 gcaaacactg ctaaatttac ttga 444 <210> 25 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-A1 <400> 25 Met Glu Lys Thr Leu Ala Leu Ile Lys Pro Asp Ala Ile Ser Lys Ala 1 5 10 15 Gly Glu Ile Ile Glu Ile Ile Asn Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Lys 20 25 30 Leu Lys Met Met Met Leu Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val 35 40 45 Asp His Gln Ser Arg Pro Phe Phe Asn Glu Leu Ile Gln Phe Ile Thr 50 55 60 Thr Gly Pro Ile Ile Ala Met Glu Ile Leu Arg Asp Asp Ala Ile Cys 65 70 75 80 Glu Trp Lys Arg Leu Leu Gly Pro Ala Asn Ser Gly Val Ala Arg Thr 85 90 95 Asp Ala Ser Glu Ser Ile Arg Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg 100 105 110 Asn Ala Ala His Gly Pro Asp Ser Phe Ala Ser Ala Ala Arg Glu Met 115 120 125 Glu Leu Phe Phe Pro Ser Ser Gly Gly Cys Gly Pro Ala Asn Thr Ala 130 135 140 Lys Phe Thr 145 <210> 26 <211> 669 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-A2 <400> 26 atgaatcata gtgaaagatt cgttttcatt gcagagtggt atgatccaaa tgcttcactt 60 cttcgacgtt atgagctttt attttaccca ggggatggat ctgttgaaat gcatgatgta 120 aagaatcatc gcaccttttt aaagcggacc aaatatgata acctgcactt ggaagattta 180 tttataggca acaaagtgaa tgtcttttct cgacaactgg tattaattga ctatggggat 240 caatatacag ctcgccagct gggcagtagg aaagaaaaaa cgctagccct aattaaacca 300 gatgcaatat caaaggctgg agaaataatt gaaataataa acaaagctgg atttactata 360 accaaactca aaatgatgat gctttcaagg aaagaagcat tggattttca tgtagatcac 420 cagtcaagac cctttttcaa tgagctgatc cagtttatta caactggtcc tattattgcc 480 atggagattt taagagatga tgctatatgt gaatggaaaa gactgctggg acctgcaaac 540 tctggagtgg cacgcacaga tgcttctgaa agcattagag ccctctttgg aacagatggc 600 ataagaaatg cagcgcatgg ccctgattct tttgcttctg cggccagaga aatggagttg 660 tttttttga 669 <210> 27 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-A2 <400> 27 Met Asn His Ser Glu Arg Phe Val Phe Ile Ala Glu Trp Tyr Asp Pro 1 5 10 15 Asn Ala Ser Leu Leu Arg Arg Tyr Glu Leu Leu Phe Tyr Pro Gly Asp 20 25 30 Gly Ser Val Glu Met His Asp Val Lys Asn His Arg Thr Phe Leu Lys 35 40 45 Arg Thr Lys Tyr Asp Asn Leu His Leu Glu Asp Leu Phe Ile Gly Asn 50 55 60 Lys Val Asn Val Phe Ser Arg Gln Leu Val Leu Ile Asp Tyr Gly Asp 65 70 75 80 Gln Tyr Thr Ala Arg Gln Leu Gly Ser Arg Lys Glu Lys Thr Leu Ala 85 90 95 Leu Ile Lys Pro Asp Ala Ile Ser Lys Ala Gly Glu Ile Ile Glu Ile 100 105 110 Ile Asn Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Lys Leu Lys Met Met Met Leu 115 120 125 Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val Asp His Gln Ser Arg Pro 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cagtttatta caactggtcc tattattgcc 480 atggagattt taagagatga tgctatatgt gaatggaaaa gactgctggg acctgcaaac 540 tctggagtgg cacgcacaga tgcttctgaa agcattagag ccctctttgg aacagatggc 600 ataagaaatg cagcgcatgg ccctgattct tttgcttctg cggccagaga aatggagttg 660 ttttttcctt caagtggagg ttgtgggccg gcaaacactg ctaaatttac ttga 714 <210> 29 <211> 237 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-A3 <400> 29 Met Asn His Ser Glu Arg Phe Val Phe Ile Ala Glu Trp Tyr Asp Pro 1 5 10 15 Asn Ala Ser Leu Leu Arg Arg Tyr Glu Leu Leu Phe Tyr Pro Gly Asp 20 25 30 Gly Ser Val Glu Met His Asp Val Lys Asn His Arg Thr Phe Leu Lys 35 40 45 Arg Thr Lys Tyr Asp Asn Leu His Leu Glu Asp Leu Phe Ile Gly Asn 50 55 60 Lys Val Asn Val Phe Ser Arg Gln Leu Val Leu Ile Asp Tyr Gly Asp 65 70 75 80 Gln Tyr Thr Ala Arg Gln Leu Gly Ser Arg Lys Glu Lys Thr Leu Ala 85 90 95 Leu Ile Lys Pro Asp Ala Ile Ser Lys Ala Gly Glu Ile Ile Glu Ile 100 105 110 Ile Asn Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Lys Leu Lys Met Met Met Leu 115 120 125 Ser 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<220> <223> Human NME7-A2 sequence optimized for E. coli expression <400> 46 atgaatcact ccgaacgctt tgtttttatc gccgaatggt atgacccgaa tgcttccctg 60 ctgcgccgct acgaactgct gttttatccg ggcgatggta gcgtggaaat gcatgacgtt 120 aaaaatcacc gtacctttct gaaacgcacg aaatatgata atctgcatct ggaagacctg 180 tttattggca acaaagtcaa tgtgttctct cgtcagctgg tgctgatcga ttatggcgac 240 cagtacaccg cgcgtcaact gggtagtcgc aaagaaaaaa cgctggccct gattaaaccg 300 gatgcaatct ccaaagctgg cgaaattatc gaaattatca acaaagcggg tttcaccatc 360 acgaaactga aaatgatgat gctgagccgt aaagaagccc tggattttca tgtcgaccac 420 cagtctcgcc cgtttttcaa tgaactgatt caattcatca ccacgggtcc gattatcgca 480 atggaaattc tgcgtgatga cgctatctgc gaatggaaac gcctgctggg cccggcaaac 540 tcaggtgttg cgcgtaccga tgccagtgaa tccattcgcg ctctgtttgg caccgatggt 600 atccgtaatg cagcacatgg tccggactca ttcgcatcgg cagctcgtga aatggaactg 660 tttttctga 669 <210> 47 <211> 222 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-A2 sequence optimized for E. coli expression <400> 47 Met Asn 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caaaacgttt 300 cgtgaattct gtggtccggc agatccggaa atcgcacgtc atctgcgtcc gggtaccctg 360 cgcgcaattt ttggtaaaac gaaaatccag aacgctgtgc actgtaccga tctgccggaa 420 gacggtctgc tggaagttca atactttttc aaaattctgg ataattga 468 <210> 57 <211> 155 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-B3 sequence optimized for E. coli expression <400> 57 Met Pro Ser Ser Gly Gly Cys Gly Pro Ala Asn Thr Ala Lys Phe Thr 1 5 10 15 Asn Cys Thr Cys Cys Ile Val Lys Pro His Ala Val Ser Glu Gly Leu 20 25 30 Leu Gly Lys Ile Leu Met Ala Ile Arg Asp Ala Gly Phe Glu Ile Ser 35 40 45 Ala Met Gln Met Phe Asn Met Asp Arg Val Asn Val Glu Glu Phe Tyr 50 55 60 Glu Val Tyr Lys Gly Val Val Thr Glu Tyr His Asp Met Val Thr Glu 65 70 75 80 Met Tyr Ser Gly Pro Cys Val Ala Met Glu Ile Gln Gln Asn Asn Ala 85 90 95 Thr Lys Thr Phe Arg Glu Phe Cys Gly Pro Ala Asp Pro Glu Ile Ala 100 105 110 Arg His Leu Arg Pro Gly Thr Leu Arg Ala Ile Phe Gly Lys Thr Lys 115 120 125 Ile Gln Asn Ala Val His Cys Thr Asp Leu Pro Glu Asp Gly Leu 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gaaattcagc aaaacaatgc caccaaaacg tttcgtgaat tctgtggtcc ggcagatccg 720 gaaatcgcac gtcatctgcg tccgggtacc ctgcgcgcaa tttttggtaa aacgaaaatc 780 cagaacgctg tgcactgtac cgatctgccg gaagacggtc tgctggaagt tcaatacttt 840 ttcaaaattc tggataattg a 861 <210> 59 <211> 286 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-AB, also known as NME7AB sequence optimized for E. coli expression <400> 59 Met Glu Lys Thr Leu Ala Leu Ile Lys Pro Asp Ala Ile Ser Lys Ala 1 5 10 15 Gly Glu Ile Ile Glu Ile Ile Asn Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Lys 20 25 30 Leu Lys Met Met Met Leu Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val 35 40 45 Asp His Gln Ser Arg Pro Phe Phe Asn Glu Leu Ile Gln Phe Ile Thr 50 55 60 Thr Gly Pro Ile Ile Ala Met Glu Ile Leu Arg Asp Asp Ala Ile Cys 65 70 75 80 Glu Trp Lys Arg Leu Leu Gly Pro Ala Asn Ser Gly Val Ala Arg Thr 85 90 95 Asp Ala Ser Glu Ser Ile Arg Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg 100 105 110 Asn Ala Ala His Gly Pro Asp Ser Phe Ala Ser Ala Ala Arg Glu Met 115 120 125 Glu Leu Phe 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NME7AB1 sequence optimized for E. coli expression <400> 61 Met Glu Lys Thr Leu Ala Leu Ile Lys Pro Asp Ala Ile Ser Lys Ala 1 5 10 15 Gly Glu Ile Ile Glu Ile Ile Asn Lys Ala Gly Phe Thr Ile Thr Lys 20 25 30 Leu Lys Met Met Met Leu Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val 35 40 45 Asp His Gln Ser Arg Pro Phe Phe Asn Glu Leu Ile Gln Phe Ile Thr 50 55 60 Thr Gly Pro Ile Ile Ala Met Glu Ile Leu Arg Asp Asp Ala Ile Cys 65 70 75 80 Glu Trp Lys Arg Leu Leu Gly Pro Ala Asn Ser Gly Val Ala Arg Thr 85 90 95 Asp Ala Ser Glu Ser Ile Arg Ala Leu Phe Gly Thr Asp Gly Ile Arg 100 105 110 Asn Ala Ala His Gly Pro Asp Ser Phe Ala Ser Ala Ala Arg Glu Met 115 120 125 Glu Leu Phe Phe Pro Ser Ser Gly Gly Cys Gly Pro Ala Asn Thr Ala 130 135 140 Lys Phe Thr Asn Cys Thr Cys Cys Ile Val Lys Pro His Ala Val Ser 145 150 155 160 Glu Gly Leu Leu Gly Lys Ile Leu Met Ala Ile Arg Asp Ala Gly Phe 165 170 175 Glu Ile Ser Ala Met Gln Met Phe Asn Met Asp Arg Val Asn Val Glu 180 185 190 Glu Phe Tyr Glu Val Tyr Lys Gly Val Val 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tgcttctgaa agcattagag ccctctttgg aacagatggc 600 ataagaaatg cagcgcatgg ccctgattct tttgcttctg cggccagaga aatggagttg 660 ttttttcctt caagtggagg ttgtgggccg gcaaacactg ctaaatttac taattgtacc 720 tgttgcattg ttaaacccca tgctgtcagt gaaggactgt tgggaaagat cctgatggct 780 atccgagatg caggttttga aatctcagct atgcagatgt tcaatatgga tcgggttaat 840 gttgaggaat tctatgaagt ttataaagga gtagtgaccg aatatcatga catggtgaca 900 gaaatgtatt ctggcccttg tgtagcaatg gagattcaac agaataatgc tacaaagaca 960 tttcgagaat tttgtggacc tgctgatcct gaaattgccc ggcatttacg ccctggaact 1020 ctcagagcaa tctttggtaa aactaagatc cagaatgctg ttcactgtac tgatctgcca 1080 gaggatggcc tattagaggt tcaatacttc ttcaagatct tggataatta g 1131 <210> 147 <211> 376 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7 a <400> 147 Met Asn His Ser Glu Arg Phe Val Phe Ile Ala Glu Trp Tyr Asp Pro 1 5 10 15 Asn Ala Ser Leu Leu Arg Arg Tyr Glu Leu Leu Phe Tyr Pro Gly Asp 20 25 30 Gly Ser Val Glu Met His Asp Val Lys Asn His Arg Thr Phe Leu Lys 35 40 45 Arg Thr Lys Tyr 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tttcccgagc 300 tctggcggtt gcggtccggc aaacaccgcc aaatttacca attgtacgtg ctgtattgtc 360 aaaccgcacg cagtgtcaga aggcctgctg ggtaaaattc tgatggcaat ccgtgatgct 420 ggctttgaaa tctcggccat gcagatgttc aacatggacc gcgttaacgt cgaagaattc 480 tacgaagttt acaaaggcgt ggttaccgaa tatcacgata tggttacgga aatgtactcc 540 ggtccgtgcg tcgcgatgga aattcagcaa aacaatgcca ccaaaacgtt tcgtgaattc 600 tgtggtccgg cagatccgga aatcgcacgt catctgcgtc cgggtaccct gcgcgcaatt 660 tttggtaaaa cgaaaatcca gaacgctgtg cactgtaccg atctgccgga agacggtctg 720 ctggaagttc aatacttttt caaaattctg gataat 756 <210> 161 <211> 254 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human NME7-X1 (optimized for E coli expression) <400> 161 Met Met Met Leu Ser Arg Lys Glu Ala Leu Asp Phe His Val Asp His 1 5 10 15 Gln Ser Arg Pro Phe Phe Asn Glu Leu Ile Gln Phe Ile Thr Thr Gly 20 25 30 Pro Ile Ile Ala Met Glu Ile Leu Arg Asp Asp Ala Ile Cys Glu Trp 35 40 45 Lys Arg Leu Leu Gly Pro Ala Asn Ser Gly Val Ala Arg Thr Asp Ala 50 55 60 Ser Glu Ser Ile Arg Ala Leu Phe 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Val Phe Ile Ala Glu Trp Tyr Asp Pro 1 5 10 15 Asn Ala Ser Leu Leu Arg Arg Tyr Glu Leu Leu Phe Tyr Pro Gly Asp 20 25 30 Gly Ser Val Glu Met His Asp Val Lys Asn His Arg Thr Phe Leu Lys 35 40 45 Arg Thr Lys Tyr Asp Asn Leu His Leu Glu Asp Leu Phe Ile Gly Asn 50 55 60 Lys Val Asn Val Phe Ser Arg Gln Leu Val Leu Ile Asp Tyr Gly Asp 65 70 75 80 Gln Tyr Thr Ala Arg Gln Leu Gly Ser Arg Lys 85 90 <210> 163 <211> 43 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment or variation of PSMGFR peptide <400> 163 Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu 1 5 10 15 Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe 20 25 30 Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr 35 40 <210> 164 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment or variation of PSMGFR peptide <400> 164 Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn 1 5 10 15 Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala 20 25 30 Ser Arg Tyr 35 <210> 165 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment or variation of PSMGFR peptide <400> 165 Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp 1 5 10 15 Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr 20 <210> 166 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment or variation of PSMGFR peptide <400> 166 Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu 1 5 10 15 Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn 20 <210> 167 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment or variation of PSMGFR peptide <400> 167 Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu 1 5 10 15 Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe 20 25 30 Asn Gln Tyr Lys Thr Glu 35 <210> 168 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fragment or variation of PSMGFR peptide <400> 168 Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp 1 5 10 15 Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr 20 25 30 Asn Leu 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Artificial Sequence <220> <223> Humanized 8H5H5G4 Heavy chain variable region sequence <400> 368 caggtccagc tggtacagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg tttccggaaa cacattcact gaatacacca tgcactgggt gcgacaggct 120 cctggaaaag ggcttgagtg gatgggaggt tttaatccta acaatggtgt tactaactac 180 aaccagaagt tcaagggcag agtcaccatg accgaggaca catctacaga cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc aagacgttac 300 taccatagta cctacgtgtt ctactttgac tcctggggcc aagggaccct ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 369 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized 8H5H5G4 Heavy chain variable region sequence (codon optimized) <400> 369 caggttcagc tggttcagtc tggcgccgaa gtgaagaaac ctggcgcctc tgtgaaggtg 60 tcctgcaagg tgtccggaaa taccttcacc gagtacacca tgcactgggt ccgacaggcc 120 cctggcaaag gacttgaatg gatgggcggc ttcaacccca acaacggcgt gaccaactac 180 aaccagaaat tcaagggccg cgtgaccatg accgaggaca caagcacaga caccgcctac 240 atggaactga gcagcctgag aagcgaggac accgccgtgt 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(for making full antibody - pair with either kappa or lambda constant region; 2 plasmids, express together) <400> 381 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcgccct gctccaggag cacctccgag 60 agcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120 tggaactcag gcgctctgac cagcggcgtg cacaccttcc cagctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcaacttcgg cacccagacc 240 tacacctgca acgtagatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagac agttgagcgc 300 aaatgttgtg tcgagtgccc accgtgccca gcaccacctg tggcaggacc gtcagtcttc 360 ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacgtgc 420 gtggtggtgg acgtgagcca cgaagacccc gaggtccagt tcaactggta cgtggacggc 480 gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagcca cgggaggagc agttcaacag cacgttccgt 540 gtggtcagcg tcctcaccgt tgtgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 600 aaggtctcca acaaaggcct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa aaccaaaggg 660 cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 720 caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctacccca 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8F9A4A3 Heavy chain variable region CDR3 <400> 390 Arg Tyr Tyr His Ser Leu Tyr Val Phe Tyr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 391 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8F9A4A3 Light chain variable region sequence - K-3,4,9,10,11 <400> 391 gaaacaactg tgacccagtc tccagcatcc ctgtccatgg ctataggaga aaaagtcacc 60 atcagatgca taaccagcac tgatattgat gatgatatga actggtacca gcagaagcca 120 ggggaacctc ctaagctcct tatttcagaa ggcaatactc ttcgtcctgg agtcccatcc 180 cgattctcca gcagtggcta tggtacagat tttgttttta caattgaaaa catgctctca 240 gaagatgttg cagattacta ctgtttgcaa agtgataact tgcctctcac gttcggctcg 300 gggacaaagt tggaaataaa acgg 324 <210> 392 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8F9A4A3 Translated protein, wherein the underlined sequence is the complementarity determining region (CDR) <400> 392 Glu Thr Thr Val Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Met Ala Ile Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Ser Thr Asp Ile Asp Asp Asp 20 25 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variable region sequence - H-1,4,7,8,12 <400> 396 gtccagctgc aacagtctgg acctgatctg gtgaagcctg ggacttcagt gaagatatcc 60 tgtaagactt ctggaaacac attcactgaa tacaccatgc actgggtgaa gcagagccat 120 ggaaagagcc ttgagtggat tggaggtttt aatcctaaca atggtgttac taactacaac 180 cagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaagt cctccagcac agcctacatg 240 gagctccgca gcctgacatc tgaggattct gcagtctatt actgtgcaag acgttactac 300 catagtacct acgtgttcta ctttgactcc tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360 tca 363 <210> 397 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E2B11 Translated protein, wherein the underlined sequence is the complementarity determining region (CDR) <400> 397 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Glu Tyr Thr 20 25 30 Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Gly Phe Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Arg Tyr Tyr His Ser Thr Tyr Val Phe Tyr Phe Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 398 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E2B11 Heavy chain variable region CDR1 <400> 398 Asn Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His 1 5 <210> 399 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E2B11 Heavy chain variable region CDR2 <400> 399 Gly Phe Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 400 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E2B11 Heavy chain variable region CDR3 <400> 400 Arg Tyr Tyr His Ser Thr Tyr Val Phe Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 <210> 401 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E2B11 Light chain variable region sequence - K-3,4,5,6,12 <400> 401 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtttca gcagaaacca 120 gatggaacta ttaagctcct gatctattac acatcaagtt tacattcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagtaa tgtggaacct 240 gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccttacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggagataaa acgg 324 <210> 402 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E2B11 Translated protein <400> 402 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 403 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E2B11 Translated protein, wherein the underlined sequence is the complementarity determining region (CDR) <400> 403 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 404 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E2B11 Light chain variable region CDR 1 <400> 404 Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 405 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E2B11 Light chain variable region CDR2 <400> 405 Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 406 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E2B11 Light chain variable region CDR3 <400> 406 Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 407 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E10E4 - Heavy chain variable region sequence - H-2,4,7,10,12 <400> 407 gtccagctgc aacagtctgg acctgatctg gtgaagcctg ggacttcagt gaagatatcc 60 tgtaagactt ctggaaacac attcactgaa tacaccatgc actgggtgaa gcagagccat 120 ggaaagagcc ttgagtggat tggaggtttt aatcctaaca atggtgttac taactacaac 180 cagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaagt cctccagcac agcctacatg 240 gagctccgca gcctgacatc tgaggattct gcagtctatt actgtgcaag acgttactac 300 catagtacct acgtgttcta ctttgactcc tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360 tca 363 <210> 408 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E10E4 Translated protein, wherein the underlined sequence is the complementarity determining region (CDR) <400> 408 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Glu Tyr Thr 20 25 30 Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Gly Phe Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Arg Tyr Tyr His Ser Thr Tyr Val Phe Tyr Phe Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 409 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E10E4 Heavy chain variable region CDR1 <400> 409 Asn Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His 1 5 <210> 410 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E10E4 Heavy chain variable region CDR2 <400> 410 Gly Phe Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 411 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E10E4 Heavy chain variable region CDR3 <400> 411 Arg Tyr Tyr His Ser Thr Tyr Val Phe Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 <210> 412 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E10E4 Light chain variable region sequence - K-2,6,8,14,15 <400> 412 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtttca gcagaaacca 120 gatggaacta ttaagctcct gatctattac acatcaagtt tacattcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagtaa tgtggaacct 240 gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccttacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggagataaa acgg 324 <210> 413 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E10E4 Translated protein, wherein the underlined sequence is the complementarity determining region (CDR) <400> 413 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 414 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E10E4 Light chain variable region CDR 1 <400> 414 Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 415 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E10E4 Light chain variable region CDR2 <400> 415 Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 416 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9E10E4 Light chain variable region CDR3 <400> 416 Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 417 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9G2C4 - Heavy chain variable region sequence - H-4,9,10,11,13 <400> 417 gtccagctgc aacagtctgg acctgatctg gtgaagcctg ggacttcagt gaagatatcc 60 tgtaagactt ctggaaacac attcactgaa tacaccatgc actgggtgaa gcagagccat 120 ggaaagagcc ttgagtggat tggaggtttt aatcctaaca atggtgttac taactacaac 180 cagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaagt cctccagcac agcctacatg 240 gagctccgca gcctgacatc tgaggattct gcagtctatt actgtgcaag acgttactac 300 catagtacct acgtgttcta ctttgactcc tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360 tca 363 <210> 418 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9G2C4 Translated protein, wherein the underlined sequence is the complementarity determining region (CDR) <400> 418 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Glu Tyr Thr 20 25 30 Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Gly Phe Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Arg Tyr Tyr His Ser Thr Tyr Val Phe Tyr Phe Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 419 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9G2C4 Heavy chain variable region CDR1 <400> 419 Asn Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His 1 5 <210> 420 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9G2C4 Heavy chain variable region CDR2 <400> 420 Gly Phe Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 421 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9G2C4 Heavy chain variable region CDR3 <400> 421 Arg Tyr Tyr His Ser Thr Tyr Val Phe Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 <210> 422 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9G2C4 Light chain variable region sequence - K-4,6,7,8,10 <400> 422 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtttca gcagaaacca 120 gatggaacta ttaagctcct gatctattac acatcaagtt tacattcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagtaa tgtggaacct 240 gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccttacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggagataaa acgg 324 <210> 423 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9G2C4 Translated protein, wherein the underlined sequence is the complementarity determining region (CDR) <400> 423 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 424 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9G2C4 Light chain variable region CDR 1 <400> 424 Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 425 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9G2C4 Light chain variable region CDR2 <400> 425 Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 426 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5D9G2C4 Light chain variable region CDR3 <400> 426 Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 427 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5F3A5D4 - Heavy chain variable region sequence - H-2,3,4,13,15 <400> 427 gtccagctgc aacagtctgg acctgatctg gtgaagcctg ggacttcagt gaagatatcc 60 tgtaagactt ctggaaacac attcactgaa tacaccatgc actgggtgaa gcagagccat 120 ggaaagagcc ttgagtggat tggaggtttt aatcctaaca atggtgttac taactacaac 180 cagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaagt cctccagcac agcctacatg 240 gagctccgca gcctgacatc tgaggattct gcagtctatt actgtgcaag acgttactac 300 catagtacct acgtgttcta ctttgactcc tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360 tca 363 <210> 428 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5F3A5D4 Translated protein, wherein the underlined sequence is the complementarity determining region (CDR) <400> 428 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Glu Tyr Thr 20 25 30 Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Gly Phe Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Arg Tyr Tyr His Ser Thr Tyr Val 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gatctattac acatcaagtt tacattcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagtaa tgtggaacct 240 gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccttacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggagataaa acgg 324 <210> 433 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5F3A5D4 Translated protein, wherein the underlined sequence is the complementarity determining region (CDR) <400> 433 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 434 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5F3A5D4 Light chain variable region CDR1 <400> 434 Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 435 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5F3A5D4 Light chain variable region CDR2 <400> 435 Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 436 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 5F3A5D4 Light chain variable region CDR3 <400> 436 Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 437 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8F9A5A1 - Heavy chain variable region sequence - H-3,4,6,10,11 <400> 437 atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 60 tgcaaggctt ctgggtatac cttcacaaac tatggaatga actgggtgaa gcaggctcca 120 ggaaagggtt taaagtggat gggctggata aacacctaca ctggagagcc aacatatgtt 180 gatgacttca agggacggtt tgccttctct ttggaaacct ctgccaccac tgcctatttg 240 cagatcaaca acctcaaaaa tgaggacacg tctacatatt tctgtgcaag attgaggggg 300 atacgaccgg gtcccttggc ttactggggc caagggactc tggtcactgt ctctgca 357 <210> 438 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8F9A5A1 Translated protein, wherein the underlined sequence is the complementarity determining region (CDR) <400> 438 Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu Thr 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly 20 25 30 Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met Gly 35 40 45 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Thr Thr Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ser Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Leu Arg Gly Ile Arg Pro Gly Pro Leu Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 439 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8F9A5A1 Heavy chain variable region CDR1 <400> 439 Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Gly Met Asn 1 5 <210> 440 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8F9A5A1 Heavy chain variable region CDR2 <400> 440 Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Val Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 441 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8F9A5A1 Heavy chain variable region CDR3 <400> 441 Leu Arg Gly Ile Arg Pro Gly Pro Leu Ala Tyr 1 5 10 <210> 442 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8F9A5A1 Light chain variable region sequence - K-1,2,3,4,5 <400> 442 gaaattttgc tcacccagtc tccagcaatc atagctgcat ctcctgggga gaaggtcacc 60 atcacctgca gtgccagctc aagtgtaagt tacatgaact ggtaccagca gaaaccagga 120 tcctccccca aaatatggat ttatggtata tccaacctgg cttctggagt tcctgctcgc 180 ttcagtggca gtgggtctgg gacatctttc tctttcacaa tcaacagcat ggaggctgaa 240 gatgttgcca cttattactg tcagcaaagg agtagttacc cacccacgtt cggagggggg 300 accaagctgg aaataaaacg g 321 <210> 443 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8F9A5A1 Translated protein, wherein the underlined sequence is the complementarity determining region (CDR) <400> 443 Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Ile Ala Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Ile Trp Ile Tyr 35 40 45 Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Phe Ser Phe Thr Ile Asn Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 444 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8F9A5A1 Light chain variable region CDR 1 <400> 444 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn 1 5 10 <210> 445 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8F9A5A1 Light chain variable region CDR2 <400> 445 Gly Ile Ser Asn Leu Ala Ser 1 5 <210> 446 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8F9A5A1 Light chain variable region CDR3 <400> 446 Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Pro Thr 1 5 <210> 447 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8H5H5G4 - Heavy chain variable region sequence - H-1,3,5,6,10 <400> 447 gtccagctgc aacagtctgg acctgatctg gtgaagcctg ggacttcagt gaagatatcc 60 tgtaagactt ctggaaacac attcactgaa tacaccatgc actgggtgaa gcagagccat 120 ggaaagagcc ttgagtggat tggaggtttt aatcctaaca atggtgttac taactacaac 180 cagaagttca agggcaaggc cacattgact gtagacaagt cctccagcac agcctacatg 240 gagctccgca gcctgacatc tgaggattct gcagtctatt actgtgcaag acgttactac 300 catagtacct acgtgttcta ctttgactcc tggggccaag gcaccactct cacagtctcc 360 tca 363 <210> 448 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8H5H5G4 Translated protein, wherein the underlined sequence is the complementarity determining region (CDR) <400> 448 Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser 1 5 10 15 Val Lys Ile Ser Cys Lys Thr Ser Gly Asn Thr Phe Thr Glu Tyr Thr 20 25 30 Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Gly Phe Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 50 55 60 Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 65 70 75 80 Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Arg Tyr Tyr His Ser Thr Tyr Val Phe Tyr Phe Asp Ser Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 449 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8H5H5G4 Heavy chain variable region CDR1 <400> 449 Asn Thr Phe Thr Glu Tyr Thr Met His 1 5 <210> 450 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8H5H5G4 Heavy chain variable region CDR2 <400> 450 Gly Phe Asn Pro Asn Asn Gly Val Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 451 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8H5H5G4 Heavy chain variable region CDR3 <400> 451 Arg Tyr Tyr His Ser Thr Tyr Val Phe Tyr Phe Asp Ser 1 5 10 <210> 452 <211> 324 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8H5H5G4 Light chain variable region sequence - K-2,5,8,9,15 <400> 452 gatatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60 atcagttgca gtgcaagtca gggcattagc aattatttaa actggtttca gcagaaacca 120 gatggaacta ttaagctcct gatctattac acatcaagtt tacattcagg agtcccatca 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagat tattctctca ccatcagtaa tgtggaacct 240 gaagatattg ccacttacta ttgtcagcag tatagtaagc ttccttacac gttcggaggg 300 gggaccaagc tggagataaa acgg 324 <210> 453 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8H5H5G4 Translated protein, wherein the underlined sequence is the complementarity determining region (CDR) <400> 453 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Val Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 454 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8H5H5G4 Light chain variable region CDR 1 <400> 454 Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 455 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8H5H5G4 Light chain variable region CDR2 <400> 455 Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser 1 5 <210> 456 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Monoclonal antibody 8H5H5G4 Light chain variable region CDR3 <400> 456 Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Tyr Thr 1 5 <210> 457 <400> 457 000 <210> 458 <400> 458 000 <210> 459 <400> 459 000 <210> 460 <400> 460 000 <210> 461 <400> 461 000 <210> 462 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Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 1047 <211> 326 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG2 heavy chain constant region sequence: (for making full antibody - pair with either kappa or lambda constant region; 2 plasmids, express together) <400> 1047 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 115 120 125 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 130 135 140 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 145 150 155 160 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 165 170 175 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 180 185 190 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 195 200 205 Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 210 215 220 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 225 230 235 240 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 245 250 255 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 260 265 270 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 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Leu Phe Pro Pro Ser Ser 1 5 10 15 Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp 20 25 30 Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro 35 40 45 Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn 50 55 60 Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys 65 70 75 80 Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val 85 90 95 Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 <210> 1050 <211> 232 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human IgG1 Fc region sequence: (to be fused to scFv for homo-dimerizes) <400> 1050 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 1 5 10 15 Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro 20 25 30 Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val 35 40 45 Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val 50 55 60 Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln 65 70 75 80 Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 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Val Val Asp Val Ser 35 40 45 His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu 50 55 60 Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr 65 70 75 80 Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn 85 90 95 Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro 100 105 110 Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln 115 120 125 Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val 130 135 140 Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val 145 150 155 160 Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro 165 170 175 Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr 180 185 190 Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val 195 200 205 Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu 210 215 220 Ser Pro Gly Lys 225

Claims (49)

  1. NME7 특이적 항체 또는 이의 단편으로서, 서열번호 145 또는 서열번호 169의 NME7 B3 펩타이드에 결합하는, NME7 특이적 항체 또는 이의 단편.
  2. 제1항에 있어서, 단클론성 항체인, 항체.
  3. 제1항에 있어서, 2가, 1가, Fab 또는 단쇄 가변 단편 항체(scFv)인, 항체.
  4. 제1항에 있어서, 항체 약물 접합체에 연결된, 항체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약물은 독소 또는 프로-톡신에 연결된, 항체.
  6. 제2항에 따른 단클론성 항체를 암호화하는, 단리된 핵산.
  7. 제2항에 따른 단클론성 항체를 발현하는, 단리된 하이브리도마.
  8. 제1항에 있어서, NME7AB 또는 NME7-X1에 특이적으로 결합하지만 NME1에 결합하지 않는, 항체.
  9. 제1항에 있어서, NME7AB와 MUC1* 세포외 도메인 사이 또는 NME7-X1과 MUC1* 세포외 도메인 사이의 상호작용을 방해하는, 항체.
  10. 제1항에 있어서, NME7AB와 PSMGFR 사이 또는 NME7-X1과 PSMGFR 사이의 결합을 방해하는, 항체.
  11. 제1항에 있어서, NME7AB와 N-10 사이 또는 NME7-X1과 N-10 사이의 결합을 방해하는, 항체.
  12. 제1항에 있어서, NME7AB와 MUC1* 세포외 도메인 사이 또는 NME7-X1과 MUC1* 세포외 도메인 사이의 상호작용을 방해하지 않되, 상기 NME7AB 또는 NME7-X1은 N-10 펩타이드(서열번호 170)에 결합하지만, C-10 펩타이드(서열번호 171)에는 결합하지 않는, 항체.
  13. 제2항에 있어서, 상기 항체는 5A1, 4A3, 4P3 또는 5D4인, 항체.
  14. 제2항에 있어서,
    CDR1 영역 YTFTNYGMN(서열번호 439);
    CDR2 영역 WINTYTGEPTYVDDFKG(서열번호 440); 및
    CDR3 영역 LRGIRPGPLAY(서열번호 441)
    를 포함하는 중쇄 가변 영역 내의 아미노산 서열; 및
    CDR1 영역 SASSSVSYMN(서열번호 444);
    CDR2 영역 GISNLAS(서열번호 445); 및
    CDR3 영역 QQRSSYPPT(서열번호 446)
    를 포함하는 경쇄 가변 영역 내의 아미노산 서열
    을 포함하는, 항체.
  15. 제2항에 있어서,
    CDR1 영역 NTFTEYTMH(서열번호 388);
    CDR2 영역 GFNPNNGVTNYNQKFKG(서열번호 389); 및
    CDR3 영역 RYYHSLYVFYFDY(서열번호 390)
    를 포함하는 중쇄 가변 영역 내의 아미노산 서열; 및
    CDR1 영역 SASQGISNYLN(서열번호 393);
    CDR2 영역 YTSSLHS(서열번호 394); 및
    CDR3 영역 QQYSKLPYT(서열번호 395)
    를 포함하는 경쇄 가변 영역 내의 아미노산 서열
    을 포함하는, 항체.
  16. 제2항에 있어서,
    CDR1 영역 NTFTEYTMH(서열번호 429);
    CDR2 영역 GFNPNNGVTNYNQKFKG(서열번호 430); 및
    CDR3 영역 RYYHSTYVFYFDS(서열번호 431)
    를 포함하는 중쇄 가변 영역 내의 아미노산 서열; 및
    CDR1 영역 SASQGISNYLN(서열번호 434);
    CDR2 영역 YTSSLHS(서열번호 435); 및
    CDR3 영역 QQYSKLPYT(서열번호 436)
    를 포함하는 경쇄 가변 영역 내의 아미노산 서열
    을 포함하는, 항체.
  17. 제2항에 있어서,
    CDR1 영역 NTFTEYTMH(서열번호 388);
    CDR2 영역 GFNPNNGVTNYNQKFKG(서열번호 389); 및
    CDR3 영역 RYYHSLYVFYFDY(서열번호 390)
    를 포함하는 중쇄 가변 영역 내의 아미노산 서열; 및
    CDR1 영역 ITSTDIDDDMN(서열번호);
    CDR2 영역 EGNTLRP(서열번호); 및
    CDR3 영역 LQSDNLPLT(서열번호)
    를 포함하는 경쇄 가변 영역 내의 아미노산 서열
    을 포함하는, 항체.
  18. 제1항에 있어서, 인간, 인간화된 또는 조작된 항체 모방체인, 항체.
  19. 제1항에 있어서, 비-인간인, 항체.
  20. 제19항에 있어서, 뮤린(murine) 또는 낙타과(camelid)인, 항체.
  21. 환자에게 암의 치료 또는 예방을 위해서 투여하는 방법으로서, 상기 환자에게 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 투여하는 방법.
  22. 환자에서 암 전이를 예방 또는 치료하는 방법으로서, 상기 환자에게 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체를 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 예방 또는 치료하는 방법.
  23. 암 또는 암 전이를 진단하는 방법으로서, 환자 시편 및 정상 시편을 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체와 접촉시키는 단계 및 두 시편으로부터의 결과를 비교하는 단계를 포함하되, 상기 환자 시편 내의 항체에 대한 양성 결합의 존재는 상기 환자에서 암 또는 암 전이의 존재를 나타내는, 암 또는 암 전이를 진단하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 항체는 제12항에 제시된 바와 같은, 암 또는 암 전이를 진단하는 방법.
  25. 제22항에 있어서, 상기 항체는 조영제(imaging agent)에 연결된, 암 또는 암 전이를 진단하는 방법.
  26. 제22항에 있어서, 상기 환자 시편은 수술 중(intra-operative)을 포함하는 생체내, 시험관내의 혈액, 체액, 조직, 순환 세포인, 암 또는 암 전이를 진단하는 방법.
  27. 항-NME7AB 항체 또는 이의 단편을 발현하도록 조작된, 세포.
  28. 제27항에 있어서, 상기 세포는 면역 세포인, 세포.
  29. 제27항에 있어서, 상기 면역 세포는 T 세포 또는 NK 세포인, 세포.
  30. 제27항에 있어서, 상기 세포는 줄기세포 또는 전구 세포인, 세포.
  31. 제30항에 있어서, 상기 줄기세포 또는 전구 세포는 추후에 분화되어 T 세포가 되는, 세포.
  32. 제27항에 있어서, 종양 연관 항원을 인식하는, 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR)를 포함하는, 세포.
  33. 제27항에 있어서, 상기 항-NME7 항체의 발현은 유도성인, 세포.
  34. 제27항에 있어서, 항-NME7AB 항체를 암호화하는 핵산이 Foxp3 인핸서 또는 프로모터에 삽입된, 세포.
  35. 제27항에 있어서, 항-NME7AB 항체는 NFAT-유도성 시스템에 존재하는, 세포.
  36. 제35항에 있어서, NFATc1 반응 요소가 Foxp3 인핸서 또는 프로모터 영역에 삽입된 항체 서열의 상류에 삽입된, 세포.
  37. 제27항에 있어서, 항-NME7AB 항체 또는 이의 단편은 NME7 B3 펩타이드에 결합하거나, MUC1* 세포외 도메인의 PSMGFR 펩타이드에 대한 NME7AB 또는 NME7-X1의 결합을 방해하는, 세포.
  38. 제28항에 있어서, 종양 연관 항원 및 항-NME7 항체를 인식하는 CAR을 발현하는 것을 포함하는, 면역 세포.
  39. 제38항에 있어서, 상기 종양 연관 항원은 MUC1*인, 면역 세포.
  40. 항암 백신으로서, 면역원성 도출 부분으로서 도 6 내지 도 9에 열거된 NME7AB로부터 유래된 1종 이상의 펩타이드 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%의 서열 동일성을 갖는 펩타이드를 포함하는 조성물을 포함하는, 항암 백신.
  41. 제40항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 141 내지 145의 펩타이드 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%의 서열 동일성을 갖는 펩타이드인, 항암 백신.
  42. 제41항에 있어서, 상기 펩타이드는 서열번호 145의 펩타이드 또는 이와 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 97%의 서열 동일성을 갖는 펩타이드인, 항암 백신.
  43. 제1항 내지 제17항의 항체를 포함하는, BiTE.
  44. 항-NME7AB 항체의 생성 방법으로서, 상기 NME7 B3 펩타이드 내의 시스테인 잔기가 이황화 결합을 회피하도록 돌연변이된, 항-NME7AB 항체의 생성 방법,
  45. 전이 가능성이 증가된 세포를 생성시키는 방법으로서, 상기 세포를 NME7AB 또는 NME7-X1과 함께 배양하는 단계를 포함하는, 전이 가능성이 증가된 세포를 생성시키는 방법.
  46. NME7AB 또는 NME7-X1을 발현하도록 조작된, 세포.
  47. NME7AB 또는 NME7-X1을 발현하는, 트랜스제닉(transgenic) 동물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 NME7AB 또는 NME7-X1이 인간인, 트랜스제닉 동물.
  49. 제48항에 있어서, NME7AB 또는 NME7-X1의 발현은 유도성인, 트랜스제닉 동물.
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