KR20230018863A - 밀(Triticum aestivum)의 미성숙배 조직배양 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 출수기가 단축된 밀 식물체의 미성숙배를 조직배양하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 밀의 미성숙배 조직배양 방법은 대량으로 안정적인 미성숙배를 공급할 수 있다. 특정 LED 조건으로 광주기를 연장하여 출수기가 단축된 밀 식물체 및 상기 밀의 미성숙배 배양 조건에 의해 지속적으로 미성숙배를 수집하고 이를 이용하여 우수 형질전환체를 단기간에 대량으로 생산할 수 있다. 이에 따라 형질전환에 소요되는 기간, 비용, 노력 등을 획기적으로 절감할 수 있다.

Description

밀(Triticum aestivum)의 미성숙배 조직배양 방법{Method for culturing immature embryos of wheat(Triticum aestivum)}
본 발명은 출수기가 단축된 밀 식물체의 미성숙배를 조직배양하는 방법에 관한 것이다.
보통밀(Triticum aestivum L., AABBDD, 2n = 6x = 42)은 연간 생산량이 7억 9500만톤에 달하는 식량 작물로서 현재 인간에게 제공되는 칼로리 중 35%를 차지하는 주식이다(FAO, 2018; Ali et al., 2020). 국내에서 밀의 1인당 연간소비량은 2019년 기준 34.2 kg이며 이는 주식인 쌀 다음으로 많은 소비가 이루어지고 있다(Statistics Korea, 2019).
밀 소비량은 꾸준하게 늘고 있으나 대부분의 밀은 수입에 의존하고 있다. 2019년 식용 밀 수입량은 240만톤(Korea Customs Service, 2020)을 넘어섰으나 국내 밀 재배면적은 6,600 ha에서 3,736 ha로 급감하면서 생산량은 1만5천톤에 불과하다(Statistics Korea, 2019). 이로 인한 밀 자급률은 최근 3년간 평균 1.5%대로 매우 낮은 실정이다(Kim et al., 2019). 최근 정부에서 안정적인 국산 밀 공급 체계 구축을 위한 2018년 밀 산업 중장기 발전 대책을 내 놓았고, 밀 산업 육성법을 제정하여 2020년 2월 28일 본격적으로 시행됨에 따라 밀의 2022년 목표 자급률을 9.9%로 설정하였다(Kim et al., 2020). 따라서 정부의 정책 취지에 맞추어 국내 밀의 품질 향상과 가공 적성에 맞춘 우수한 국산 밀 품종 개발을 위한 여러 육종 소재 개발이 시급한 과제이다.
보통밀은 염색체의 크기가 17 Gb로 매우 크고 42개의 염색체와 85%의 반복된 DNA 서열을 포함하는 복잡성으로 인해 신품종을 육성하기 위한 분자 육종 연구에 많은 어려움이 있다(Paux et al., 2006). 최근 작물 육종 기술 중 외부에서 도입된 유전자가 존재하지 않지만 특정 유전 형질이 변형된 특성을 갖게 하여 새로운 품종을 확보하는 기술인 신육종기술(New Plant Breeding Techniques)이 개발되면서 국내의 기존 작물 육종 기술에 접목한 활용에 대해서 많은 검토가 이루어 지고 있다(KISTEP, 2018).
작물 형질전환은 기존의 육종으로는 불가능한 새로운 유전자를 도입할 수 있는 기술로 이용되지만 유전자 변형 기술을 개발하는데 상당한 어려움이 있다(Bhalla et al., 2006). 밀에서의 형질전환은 최초로 1992년 유전자총(particle bombardment)을 이용하여 배발생 캘러스(embryogenic callus)에 제초제(Basta) 저항성 유전자(Bar gene)를 전달하는 실험이 성공적으로 이루어졌다(Vasil et al., 1992). 또한 Agrobactrium-mediated 방법을 이용하여 미성숙배로 유발된 캘러스를 이용하여 nptii(neomycin phosphotransferase II)유전자를 도입하였다(Cheng et al., 1997). 하지만 성공적인 형질전환은 미성숙배 유도 환경에 따라서 무작위로 발생하며 매우 낮은 형질전환 효율을 보인다. Altpeter et al.(1996)에 의하면 7,650개의 배아를 이용하였을 때 0.3%의 효율로 형질전환이 발생하였고 Cheng et al. (1997)의 실험에서는 이용된 조직에 따라서 최저 0.14%에서 최대 2.8%로 매우 낮은 확률로 발생했다. 형질전환 기술은 여러가지 육종 소재를 개발하기 위한 매우 좋은 방법이나 성공률을 높이기 위한 선행 요건이 필요하다. 이를 위하여 최적의 미성숙배의 생육 조건과 조직배양의 연속성을 위한 미성숙배의 지속적인 공급이 매우 중요하다.
미성숙배 배양(immature embryogenesis)기술은 높은 재분화(Regeneration)율로 인하여 형질전환의 효율을 높이기 위하여 자주 활용되는 방법 중에 하나이다(Mur
Figure pat00001
n et al., 2012). 하지만 밀의 개화 후 일정 기간에만 미성숙배를 수집할 수 있기 때문에 매우 노동집약적이고 많은 시간과 공간이 필요하다(Alikina et al., 2016). 따라서, 안정적이고 대량의 미성숙배 공급이 형질전환 효율을 높이기 위한 중요한 요건 중 하나이다. 최근 Watson et al.(2018)에 의하면 장일 식물인 밀의 일장을 22시간으로 늘린 장일 처리를 통한 출수기 단축으로 1년에 6세대까지 세대를 진전시킬 수 있는 스피드육종법이 발표되었다. 국내에서도 국립식량과학원에서 국내 밀 품종 금강, 백강, 조경, 중모2008을 이용하여 출수 소요 일수를 단축시킨 사례가 있다(Cha et al., 2019).
그러나 기존의 방법으로는 대량 생산 효율이 낮아 출수기가 단축되고 대량 생산이 가능하도록 재배된 밀 식물체의 미성숙배를 조직배양하는 기술의 개발이 요구되고 있는 실정이다.
대한민국등록특허 제10-1273385호
1. Murin, R. et al., 2012. Regeneration of immature and mature embryos from diverse sets of wheat genotypes using media containing different auxins. Acta Agron Hung 60 : 87-108. 2. Alikina, O. et al., 2016. Tissue culture efficiency of wheat species with different genomic formulas. Crop Breed Appl Biot 16 : 307-314. 3. Cha, J. K. et al., 2019. Heading Date and Growth Character of Korean Wheat Cultivars by Controlling Photoperiod for Rapid Generation Advancement. Korean J Breed Sci 52(1) : 20-24.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, LED 생육 조건에서 출수기가 단축된 밀 식물체의 미성숙배를 안정적으로 대량 수득하고, 이를 형질전환에 사용함으로써 새로운 품종의 개발 기간이 단축된, 밀의 미성숙배 조직배양 방법을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 밀(Triticum aestivum)의 종자를 발아시켜 유묘기 식물체(seedling)를 수득하는 단계; 상기 유묘기 식물체를 밀폐된 생장조절실에서 24시간 중 21 내지 23시간의 발광다이오드(light emitting diode; LED) 조건 및 1 내지 3시간의 암 조건 하에 생육하는 단계; 상기 생육하는 단계에서 개화된 이삭으로부터 영과(caryopsis)를 분리한 후 종자 소독하여 미성숙배를 분리하는 단계; 및 상기 미성숙배를 계대배양하여 유도된 캘러스를 재분화 배지에서 재분화하는 단계를 포함하는, 밀의 미성숙배 조직배양 방법을 제공한다.
상기 밀의 종자는 형질전환에 특화된 품종을 포함할 수 있다.
상기 형질전환에 특화된 품종은 Bobwhite일 수 있다.
상기 발아는 3 내지 5주간 수행하는 것일 수 있다.
상기 LED 조건에서 측정된 광합성 광량 자속 밀도(PPFD, Photosynthetic Photon Flux Density)는 650 내지 1,450 μmol/m-2·s-1 이고 LED 조도(Illuminance)는 28 내지 53 Klux 일 수 있다.
상기 LED 광원의 파장은 400 내지 460 nm의 청색광 및 580 내지 680 nm의 적색광일 수 있다.
상기 생육하는 단계에서 생육된 밀 이삭의 출수 소요일은 30 내지 39일일 수 있다.
상기 개화된 이삭은 개화 후 4 내지 14일째 이삭일 수 있다.
상기 개화 후 4 내지 14일째 이삭으로부터 수득한 미성숙배의 재분화율은 14 내지 82%일 수 있다.
상기 개화 후 4 내지 14일째 이삭으로부터 수득한 미성숙배에서 CDC 유전자의 발현이 증가할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 밀의 미성숙배 조직배양 방법에 의해 배양된 미성숙배를 포함하는 재분화된 밀 식물체를 제공한다.
본 발명에 따른 밀의 미성숙배 조직배양 방법은 대량으로 안정적인 미성숙배를 공급할 수 있다. 특정 LED 조건으로 광주기를 연장하여 출수기가 단축된 밀 식물체 및 상기 밀의 미성숙배 배양 조건에 의해 지속적으로 미성숙배를 수집하고 이를 이용하여 우수 형질전환체를 단기간에 대량으로 생산할 수 있다. 이에 따라 형질전환에 소요되는 기간, 비용, 노력 등을 획기적으로 절감할 수 있다.
도 1은 밀 묘목이 분주된 포트와 광원의 배치, 광조건 등의 생장조절실 모습을 나타내는 것이다. (A) 생장조절실 내부 광원과 포트 배치의 개략도 (B)-(C) 생장조절실에서 사용된 LED의 광 스펙트럼 조건 (D) LED 조도 (E) 광합성 광량 자속 밀도(PPFD) (F) 파종일로부터 개화일까지의 온도 프로파일이다.
도 2는 파종 후 자연 온실 조건 및 LED 조건에서 자란 Bobwhite의 상대적인 모습을 나타내는 것이다(왼쪽은 LED 조건, 오른쪽은 자연 온실 조건). (A) 파종 후 4일 째 (B) 파종 후 9일 째 (C) 파종 후 15일 째 (D) 파종 후 19일 째 (E) 파종 후 28일 째 (F) 파종 후 31일 째의 모습니다.
도 3은 캘러스 유도 배지에 놓인 미성숙 종자 및 배아의 크기를 나타내는 것이다. (A) 개화 후 5일부터 11일까지 수집한 영과(caryopsis) (B) 개화 후 5일째와 11일째의 미성숙 배아의 크기 비교 (C) 캘러스 유도 배지에서 배양된 1-1.5mm의 미성숙 배아 크기이다.
도 4는 미성숙 배아의 캘러스 유도 및 재분화 과정을 나타내는 것이다(왼쪽이 자연 온실 조건, 오른쪽이 LED 조건). (A)캘러스 유도 배지에서의 2주 째 모습 (B) 동일한 배지로 옮긴 후 2주 째 모습 (C) 재분화 배지로 옮긴 후 2주 째 모습이다.
도 5는 두 가지 생육 조건 각각으로부터 수집된 미성숙 배아의 평균 재분화 효율 및 재분화된 묘목 비율의 비교를 나타내는 것이다. (A) 평균 재분화 효율 비교(오차막대는 표준오차) (B) 평균 재분화 묘목 비율의 비교이다.
도 6은 두 가지 생육 조건 각각으로부터 수집된 이삭의 항산화 효소 활성 분석을 나타내는 것이다. (A) 아스코르브산 과산화효소(APX) 활성 비교 (B) 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 활성 비교 (C) 카탈라아제(CAT) 활성 비교 (D) 과산화효소(POD) 활성 비교이다.
도 7은 두 가지 생육 조건 각각으로부터 수집된 이삭의 광합성 및 세포분열 연관유전자에 대한 발현 분석을 나타내는 것이다. (A) PsaA 유전자의 발현 분석 (B) PsbA 유전자의 발현 분석 (C) CDC 유전자의 발현 분석이다.
본 발명은 자연광이 차단된 밀폐 생육조절실을 구축하고, LED 조건을 이용하여 22시간으로 일장을 처리시 출수기가 단축된 밀 식물체의 미성숙배를 이용하여 조직배양 효율 및 안정성을 검증하였다.
본 발명은 밀(Triticum aestivum)의 종자를 발아시켜 유묘기 식물체(seedling)를 수득하는 단계; 상기 유묘기 식물체를 밀폐된 생장조절실에서 24시간 중 21 내지 23시간의 발광다이오드(light emitting diode; LED) 조건 및 1~3시간의 암조건 하에 생육하는 단계; 상기 생육하는 단계에서 개화된 이삭으로부터 영과(caryopsis)를 분리한 후 종자 소독하여 미성숙배를 분리하는 단계 및 상기 미성숙배를 계대배양하여 유도된 캘러스를 재분화 배지에서 재분화하는 단계를 포함하는, 밀의 미성숙배 조직배양 방법에 관한 것이다.
상기‘밀(Triticum aestivum)의 종자’는 형질전환에 특화된 품종일 수 있으며, 봄밀(Spring wheat)인 금강, 조품, 백강, 아리흑, Bobwhite 또는 Fielder, 겨울밀(Winter wheat)인 Karl92, Ventnor, U1275, Jagger, Yangmai15 또는 Everest 등을 포함할 수 있고, 바람직하게는 Bobwhite일 수 있다.
상기 종자의 발아는 춘화처리 효과를 제공하기 위하여, 3 내지 7℃에서 3 내지 5주간 수행할 수 있고, 바람직하게는 4℃에서 4주간 수행할 수 있다.
상기 생육하는 단계에서, 상기‘밀폐된 생장조절실’은 자연광이 차단되고 LED 광원만을 이용하는 통제된 생장조절실일 수 있다.
상기 LED 조건은 극도의 장일 조건으로서, 구체적으로는 24시간 중 21 내지 23시간의 광조건 및 1 내지 3시간의 암조건일 수 있고, 바람직하게는 22시간의 광조건 및 2시간의 암조건일 수 있다.
상기 LED 조건에서 측정된 광합성 광량 자속 밀도(Photosynthetic Photon Flux Density, PPFD)는 650 내지 1,450 μmol/m-2·s-1 이고 조도(Illuminance)는 28 내지 53 Klux일 수 있다. 또한 LED 광원의 파장은 400 내지 460 nm의 청색광 및 580 내지 680 nm의 적색광일 수 있다.
상기 LED 조건에서 생육된 밀 이삭의 출수 소요일은 30 내지 39일일 수 있으며, 구체적으로는 31 내지 37일일 수 있다. 자연 온실 조건의 출수 소요일은 67 내지 91일로, LED 조건에서 생육된 밀의 출수기를 자연 온실 조건과 비교하여 36일에서 54일까지 단축시킬 수 있으며 이와 같이 현저하게 단축된 출수일을 이용하여 밀 품종의 형질전환 효율을 높일 수 있다.
상기 형질전환 효율을 높이기 위한 조직배양 효율을 검정하기 위하여 개화 후 4 내지 14일째 이삭으로부터 미성숙배를 수득할 수 있으며, 바람직하게는 개화 후 11일째 이삭일 수 있다. 이 때의 미성숙배의 크기는 직경 1.0 내지 1.5mm 사이로, 크기가 균질하게 분포된 미성숙배를 얻을 수 있다. 상기 미성숙배를 캘러스 유도 배지에서 4주간 계대배양 후 생성된 캘러스를 재분화 배지로 옮겨 25℃에서 광조건으로 재분화를 유도하여 재분화율(Regeneration Efficiency)과 소식물체 출현 비율(Ratio of regenerated plantlets)을 분석하였다. 그 결과, LED 조건에서의 재분화율은 평균 43.18%로, 평균 45.05%을 보인 자연 온실 조건(정상 조건)과 비교하여 유의한 차이가 없다는 것을 확인하였다.
상기 개화 후 4 내지 14일째 이삭으로부터 수득한 미성숙배를 이용하여 생육 연관유전자 발현 분석을 수행한 결과, CDC 유전자의 발현 증가가 나타났다. 세포 분열의 직접적인 연관 유전자인 CDC 유전자의 증가된 발현은, 본 발명에 따른 LED 조건에서 자연 온실 조건보다 빠른 생장을 할 수 있음을 보여주었다.
또한 본 발명의 다른 양태로 상기 밀의 미성숙배 조직배양 방법에 의해 배양된 미성숙배를 포함하는, 재분화된 밀 식물체를 제공한다.
이하, 본 발명에 따른 실시예를 첨부된 도면에 의거하여 구체적으로 설명하되, 하기에 설명하는 실시예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
재료 준비
실험에서 사용된 재료는 밀 형질전환에 특화된 품종 Bobwhite (Accession no : SH98-26)를 미국 농림부(USDA-ARS)에서 분양 받아 공주대학교 연구포장에서 2018년 10월부터 2019년 6월까지 증식된 종자를 이용하였다. 수확한 종자는 2개월간 건조시킨 뒤 물에 적신 30.48 cm X 45.72 cm의 종자발아 크레이프 종이(Saran Hand Made Paper Industry, Damdama, India)를 이용하여 발아시켰다. 발아는 4℃에서 4주간 지속하여 춘화처리의 효과를 제공하였다. 발아된 유묘기 식물체(seedling)는 직경 11cm의 플라스틱 포트에 원예용상토(Cham Grow, Chungcheongnam province, Korea)를 사용하여 1구당 1립씩 옮겨 심었다. 비료는 유기질비료를 사용했으며 유묘기 식물체를 처음 옮겨 심을 때 1구에 1g씩 분주했다. 1주일의 안정기 이후 포트는 공주대학교 스마트온실과 국립식량과학원으로 이동하여 각각 생육되었다.
실시예 1. LED 생육 조건에서의 세대 단축 효과
1-1. LED 조건 및 자연 온실 조건
LED 조건은 공주대학교 스마트온실의 생장조절실(3.9 m × 2.83 m × 2.8 m)에서 진행되었다. 구체적으로 자연광이 차단된 밀폐된 생장조절실에서 발광다이오드(LED)를 이용하여 극단적인 장일 조건(22h)으로 생육되었다. 높이 80cm의 베드 위에 유기묘 식물체가 심어진 포트를 배치하였으며, 도 1A에서 보는 바와 같이 포트와 광원까지의 거리는 117cm 떨어져 있다.
사용된 광원은 식물생장 LED PLANT 300WB (YUNLIGHTING, Gyeonggi province, Korea)이며 도 1B 및 도 1C를 참고하면 상기 광원의 스펙트럼은 420 nm, 450 nm의 청색광 및 670 nm의 적색광이 높게 나타났다. 충분한 광조건을 위하여 각 베드 당 LED가 3개씩 설치되었다.
식물생장 LED의 조도(Illuminance)와 광합성 광량 자속 밀도(PPFD, Photosynthetic Photon Flux Density)는 식물의 위치에서 각각 40.68 ± 11 Klux, 1013.77 ± 334 μmol/m-2·s-1으로 조절하였다. 실제로 측정된 PPFD와 조도 값은 포트 높이에서 각각 678.78±42 μmol/m-2·s-1, 29.43±1.2 Klux였으나 출수된 밀 이삭 높이에서는 각각 1,431.21±36 μmol/m-2·s-1, 52.55±1.1 Klux으로 측정되었다(도1D, E).
생장조절실의 일장 조건은 24시간 중 일장을 22시간으로 하고 2시간 소등으로 설정하였다. 생장조절실의 온도는 수냉식냉방기 HWC-2470(AIRREX, Gyeonggiprovince, Korea)을 이용하여 22℃로 설정하였다. 실제 측정 온도는 일출 전(04~06시) 평균 19.68℃로 가장 낮았고 주간에는 평균 23.63℃이었으며 생육 기간 동안 월평균 23.63℃로 측정되었다(도 1F).
자연 온실 생육은 국립식량과학원 온실에서 진행되었으며 비닐하우스는 매일 오전 9시에 개방하고 오후 5시에 폐쇄하으며 이삭의 절반가량이 개화된 시점을 개화기로 판단하여 라벨 꼬리표를 달아 구분하였다. 높이 20cm 파렛트 위에 식물을 위치하여 추가적인 광원없이 태양광을 이용하였다. 온실 내부의 온도는 냉방시설 없이 환기를 통하여 각 파종 시기의 생장 기간의 기후에 맞게 조절되었다. 동절기의 급격한 기온 하강을 막기 위해 야간에 양옆의 비닐 및 출입문을 닫아 기온을 조절하였다.
1-2. 생육 조사
생육 조사는 농촌진흥청 농업과학기술 연구조사분석기준(RDA, 2012)에 따라 수행되었다. 출수기는 동일 파종 포트의 40%가 잎집에서 이삭이 2/3이상 나왔을 때로 출수 일수(Days to heading)를 파종일부터 출수기까지의 일수로 계산하였다. 개화기는 소수에서 수술이 나왔을 때를 기준으로 하여 각 분얼마다 조사하였고 동일 파종일의 포트에서 40% 이상이 개화 하였을 때로 개화 일수(Days to flowering)를 파종일부터 개화일까지의 일수로 계산하였다.
생장조절실의 LED 조건에서 생육된 Bobwhite를 4주간 춘화처리하여 1엽이 나온 상태에서 파종하고 생육 조사를 하였다. 도 2A-C를 참조하면 생장조절실과 자연 온실에서 성장한 Bobwhite는 3엽기까지 서로 유사한 생육 성장 속도를 나타내었다. 파종 15일 후 LED 조건에서 분얼기가 시작되었지만 자연 온실 조건에서는 4엽기에 그쳤으며(도 2D), 파종 19일 후 LED 조건에서는 유수형성기와 절간 신장기로 전환되어 간장(clum length)과 바이오매스의 성장이 자연 온실 조건보다 월등히 높게 나타났다(도 2E). 파종 후 28일 후, LED 조건에서 대부분의 분얼이 절간 신장을 끝내고 지엽이 나타나기 시작하였으나 자연 온실 조건에서는 절간신장기에 들어가기 시작한 것으로 확인되었고(도 2F), 파종 후 31일째 LED 조건에서의 Bobwhite를 처음 출수하였다(도 2G).
자연 온실 조건의 Bobwhite는 파종일에 따라 출수 소요일은 67 내지 91일로 다양했고 LED 조건으로 생육된 Bobwhite의 출수 소요일은 31 내지 37일로 조사되어 출수일이 단축되었음을 확인하였다(표 1). 따라서, LED 조건에서의 생육은 세대 단축 효과를 나타냈고, 광조건 및 온도 조절에 따라 출수기를 조절할 수 있음을 나타내었다.
생육 조건 파종일(m/d)
Sowing		 출수일(m/d)
Heading		 개화일(m/d)
Flowering		 개화일수(days)
Days to flowering
자연 온실 1/29 4/28 5/02 94
2/06 5/09 5/12 96
2/13 5/09 5/12 89
3/04 5/18 5/21 78
3/11 5/21 5/24 74
3/17 5/22 5/26 70
LED 조건 2/07 3/15 3/18 40
4/10 5/17 5/20 40
5/20 6/24 6/27 38
7/13 8/17 8/20 34
실시예 2. 미성숙배 조직배양 효율 검정
2-1. 조직배양
미성숙배의 배양은 배아의 크기가 직경 1.0~1.5 mm가 되었을 때 수행하였으며 일반적으로 개화 후 11일이 되었을 때의 이삭을 이용하였다. 수확한 이삭의 내영과 외영이 제거된 영과(caryopsis)를 분리하여 종자 소독을 실시하였다. 종자 소독은 50ml 원추형 튜브(SPL, Gyeonggi province, Korea)에 담아서 70% 에틸알코올과 10% 차아염소산나트륨용액을 이용하여 수행하였다. 소독된 종자는 멸균수를 이용하여 알코올과 차아염소산나트륨를 제거한 후 클린벤치에서 첨예 형태의 의료용 메스 11호(Feather Safety Razor, Osaka province, Japan)를 이용하여 미성숙배를 분리하였고 캘러스 유도 배지에 페트리 접시 1개당 20개씩 치상하여 25℃에서 암조건으로 캘러스를 유도하였다. 치상 후 2주마다 동일 성분의 배지로 계대배양을 수행하였으며, 미성숙배 배양 4주 후에 생성된 캘러스를 재분화 배지로 옮겨 25℃에서 광조건으로 재분화를 유도하였다.
2-2. 조직배양 효율
Bobwhite의 개화기를 조사하기 위해 각 이삭마다 수술이 나온 날을 확인하여 이름표를 달아 이삭 전체의 개화일을 종합하였다. 표 1을 참고하면, 각 파종일 별 개화일은 출수 후 3일로 LED 조건과 자연 온실 조건에서 모두 동일하게 나타났다.
개화 후 생육 촉진된 이삭의 발달 과정을 자연 온실 조건의 생육과 비교하기 위하여, 개화 후 5일부터 하루 간격으로 영과를 수집하여 그 크기와 미성숙배의 크기를 조사하였다. 도 3A를 살펴보면, 발달중인 영과의 길이는 개화 후 5일에서 4 mm였으며 11일에서는 6.5 mm였다. LED 조건에서 성장한 Bobwhite의 출수 후 영과 발달 과정은 기존의 자연 조건의 생육 연구와 비교하였을 때 영과의 외관적 특성에서 차이가 나타나지 않았다.
LED 조건에서 성장한 Bobwhite의 미성숙배의 크기는 배축을 기준으로 개화 후 9일에 직경 0.8 mm이고 개화 후 11일에 1.0~1.2 mm로 측정되었다(도 3B). 도 3C를 보면 개화 후 11일된 이삭을 캘러스 유도 배지에서 배양한 미성숙배는 1.0~1.5 mm 사이로 균일하게 측정되어 조직배양 효율을 검정하기에 적합하였다.
조직배양의 재분화율(Regeneration Efficiency)을 높이기 위하여 개화 후 11일 된 영과로부터 미성숙배를 채취하여 캘러스를 유도하였다(도 4). 도 4A-B에서 보는 바와 같이 치상한 미성숙배는 크기에 상관없이 모두 캘러스가 유도되었으나 관능적 평가에서 배발생 캘러스(embryogenic callus)와 재분화 하지 않는 캘러스(amorphous callus)를 구분할 수 없어 재분화율을 통해 두 생육 조건에서 채취한 미성숙배의 조직배양 효율을 비교하였다. 추가적으로 동일 캘러스에서 배발생 캘러스의 발생 빈도를 측정하기 위하여 재분화한 소식물체(plantlet, 도 4C)의 개수를 취합하여 캘러스와의 비율을 계산하였다.
조직 배양에서 발생한 모든 캘러스와 재분화된 소식물체(plantlet)를 각 단계 별로 조사하여 자연 온실 조건의 미성숙배와 LED 조건의 미성숙배에서 유도된 캘러스 비율, 재분화율을 측정하였다. 측정된 결과는 F-검정(F-value)를 통한 분산 검정 후 t-검정(t-test)를 이용하여 두 집단 간의 평균의 차이에 대한 유의성을 검정하였고, Microsoft Excel 프로그램(Microsoft Corporation, WA, USA)의 데이터 분석 기능을 이용하였다.
자연 온실 조건에서 생육된 미성숙배는 개화기가 다른 샘플을 이용하여 6번의 반복 실험을 진행하였고, LED 조건에서 생육된 미성숙배는 14번의 반복 실험을 진행하였다. 표 2에서 보는 바와 같이, 반복실험 별 재분화율은 자연 온실 조건과 LED 조건 모두 최소 14%에서 최대 81%로 큰 차이를 보였으나 각각의 재분화율의 평균값은 각각 45.05%와 43.18%로 비슷하게 나타났다.
생육 조건 횟수 미성숙배 개수 캘러스 유도율1)(%) 재분화율2)(%) 캘러스당 발생 슈트 비율3)
자연 온실 1회 73 100 20.55 1.37
2회 131 100 56.49 0.76
3회 86 100 73.26 1.16
4회 50 100 50.00 2.00
5회 65 100 20.00 1.54
6회 50 100 50.00 2.00
합계 Total 455 평균 Mean 45.05a 1.47b
LED 조건 1회 77 100 79.22 1.66
2회 50 100 38.00 1.53
3회 37 100 81.08 1.97
4회 42 100 76.19 1.91
5회 50 100 28.00 1.64
6회 50 100 44.00 1.64
7회 50 100 20.00 2.00
8회 50 100 52.00 1.31
9회 50 100 60.00 1.78
10회 50 100 14.00 2.57
11회 50 100 26.00 2.00
12회 50 100 28.00 1.21
13회 50 100 36.00 1.22
14회 50 100 22.00 1.09
합계 Total 686 평균 Mean 43.18a 1.68b
1)캘러스당 생성된 미성숙배의 비율
2)재분화 배지로 이동 후 묘목을 생성한 캘러스의 백분율
3)배발생 캘러스당 재분화된 묘목의 수
a,b : 동일한 열의 동일한 문자는 유의한 차이가 없음을 나타냄(p > 0.05)
또한, 두 배양 조건에서 치상된 미성숙배 개수의 합은 각각 455, 686개이고 캘러스당 발생한 슈트의 비율의 평균은 각각 1.47, 1.68로 나타났다. 두 집단간의 재분화율과 캘러스당 발생한 슈트 비율에 유의한 차이가 있는지 통계적으로 검정하기 위해 t-test를 진행하였다. 그 결과 자연 온실 조건과 LED 조건에서 생육한 Bobwhite에서 수집한 미성숙배의 재분화율 및 캘러스당 발생한 슈트 비율은 통계적으로 유의한 차이가 발견되지 않았으며 두 결과 모두 표준 오차 안의 값을 나타냈다(도 5). 이를 통하여 고도의 장일 조건에 의하여 출수가 촉진된 Bobwhite를 이용한 미성숙배 조직배양의 효율은 자연 온실 조건과 비교하였을 때 차이가 없는 것으로 나타났다.
실시예 3. 스트레스 발생 여부 분석
3-1 항산화 효소 활성 분석
식물의 성장과정에서 활성 산소(Reactive oxygen species, ROS)의 생성은 APX, SOD, CAT, POD와 같은 항산화 효소로 인해서 농도를 체계적으로 조절한다. 고도의 장일 조건으로 인하여 출수기가 단축된 Bobwhite의 산화 스트레스 여부를 검정하기 위해 개화 후 14일 된 이삭의 총 단백질을 추출하여 항산화 효소 활성을 검정하였다.
두 배양 조건에서 수집된 이삭을 액체 질소를 이용하여 막자사발로 마쇄하였고 곱게 갈린 이삭 샘플 100mg을 2ml 튜브(Eppendorf AG, Hambur, Germany)에 옮겨 담은 후 단백질 추출 용액 [0.2 M phosphate buffer (pH 7.0), 0.1 mM EDTA]을 0.5ml씩 분주하여 균질하게 혼합하였다. 효율적인 단백질 추출을 위하여 추출버퍼에 혼합된 이삭 샘플을 얼음에서 5분간 배양한 후, 원심분리기에서 13,000rpm으로 4℃에서 20분간 원심분리 후 상등액을 1.5ml 튜브(Eppendorf AG, Hamburg province, Germany)에 옮겨 담아 항산화 효소 활성 분석에 이용하였다. 총 단백질 함량은 Bradford 분석(Bradford, 1976)을 이용하여 확인하였으며 슈퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD), 과산화효소(peroxidase, POD), 카탈라아제(catalase, CAT) 및 아스코르브산 과산화효소(ascorbate peroxidase, APX) 단백질의 활성을 측정하였다.
도 6을 참고하면, 항산화 효소 APX, SOD, CAT, POD의 활성은 자연 온실 조건과 LED 조건의 이삭에서 비슷한 경향을 보였다. APX 활성도는 자연 온실 조건과 LED 조건 각각 338.81, 361.05 U mg-1 protein이고 SOD 활성도는 각각 12.67, 14.10 U mg-1 protein, CAT 활성도는 각각 7.07, 7.19 U mg-1 protein, POD 활성도는 각각 36.62, 37.79 U mg-1 protein을 나타냈다. APX, SOD, CAT, POD 항산화 효소 모두 LED 조건에서 약간 높은 값을 나타냈으나(도 5A-B) 모두 표준 오차 범위 안의 값을 나타내어 유의한 차이를 보이지 않아 자연 온실 조건과 비교하였을 때 스트레스 반응을 하지 않은 것으로 판단하였다.
3-2. 생육 연관유전자 발현 분석
자연 온실 조건과 LED 조건의 차이에 따른 유전자 발현 차이를 검정하기 위하여 광합성 연관 유전자 2종(PsaA, PsbA)과 세포분열 연관 유전자 1종(CDC)에 대하여 qRT-PCR을 수행하였다. 자연 온실 조건과의 발현 차이를 보기 위해 개화 후 11일 된 이삭을 수집하여 RNA를 추출 후 qRT-PCR를 수행하였다.
Total RNA는 두 조건의 개화 후 11일 된 이삭을 수집하여 액체 질소로 급속 냉각 후에 막자사발을 이용하여 마쇄한 샘플을 100mg으로 정량하였다. 이후 RibospinTM Seed/ Fruit kit(GeneAll, Gyeonggi province, Korea)를 사용하여 제조사에서 제시한 실험방법에 따라 추출하였다. 추출된 total RNA의 1μg을 PrimeScript™ 1st strand cDNA Synthesis Kit (Takara, Tokyo province, Japan)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 cDNA를 합성하였다.
사용된 연관유전자는 광계Ⅰ P700 엽록소 a 아포단백질 A1(PsaA, TraesCS3B02 G185500.1, Ensembl Plants), 광계Ⅱ 단백질 D1 (PsbA, TraesCS1D02G179900.1, Ensembl Plants), 세포분열 조절 단백질(CDC, TraesCS4D02G267800.1, Ensembl Plants)이며, 앙상블 식물(Ensembl Plants)의 염기서열 정보를 이용하여 각 유전자에 대한 프라이머를 제작하였다(표 3).
프라이머 염기서열
PsaA-sence
(서열번호1)		 5’-GCAGTAGGTGGCAAAGTGGC-3’
PsaA-antisence
(서열번호2)		 5’-CTTTCCTTGCGATGGGCCTG-3’
PsbA-sence
(서열번호3)		 5’-GGCGGTTCCCTATTCAGTGC-3’
PsbA-antisence
(서열번호4)		 5’-CAGGCCAAGCAGCCAAGAAG-3’
CDC-sence
(서열번호5)		 5’-CGAGAAGGACATCGAGAGGG-3’
CDC-antisence
(서열번호6)		 5’-CTGGTACTTGCGGATGTCGG-3’
유전자 발현의 normalization을 위한 참조 유전자로 Actin유전자를 사용하였으며, 이에 대해 표 4에 표시된 프라이머를 사용하였다.
프라이머 염기서열
Actin-sence
(서열번호7)		 5’-GCTGTTCCAGCCATCTCATGT-3’
Actin-antisence
(서열번호8)		 5’-CGATCAGCAATTCCAGGAAAC-3’
합성된 cDNA는 Rotor gene-Q(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 제작된 프라이머로 정량적 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR 수행조건은 two-step 과정으로 95℃에서 5분간 변성 과정(denature step)후, 45사이클(95℃ 10초, 60℃ 20초)을 진행하고 melting curve를 65℃에서 95℃까지 진행하여 상대적 발현을 확인하였다. 또한 2-델타델타 CT(2-ΔΔCt)방법을 이용하여 각 유전자의 상대적 발현 값을 확인하였다. 모든 PCR 분석은 각 유전자마다 세 번의 반복 수행을 하였고 Actin을 대조군으로 하여 발현 패턴을 분석하였다.
PsaA와 PsbA는 엽록체 내에서 각각 광계 I과 광계 II를 구성하는 주요한 소단위체(subunit)의 하나로 알려져 있다. 식물의 광합성은 온도, 자외선, 일사량, 가뭄 및 염분과 같은 환경요인이 영향을 미치는 것으로 알려져 있으며, 광계 I은 엽록체에서 활성산소의 생성과 소거를 주도하는 주요 위치이지만 환경 조건에 의해 발생한 산화 스트레스(Oxidative stress)는 활성 산소로 인한 광계 I의 광억제(photoinhibition)현상을 일으킨다. 광계 II의 D1 단백질은 PsbA에 의해서 암호화 되며 빛 에너지를 이용하여 물 분자의 산화 반응 촉매를 담당하는 단백질이며, 특히 다양한 환경 스트레스에 대한 민감성에 관한 역할을 한다. 높은 조도와 산화 스트레스는 광계 II에 심각한 손상을 일으키며, 광계가 복구될 때 손상된 D1 단백질의 교체(turnover)가 활발히 이루어진다.
도 7을 참고하면, PsaA 유전자는 자연 온실 조건에 비하여 LED 조건에서 급격하게 발현이 증가하였으나 PsbA 유전자는 두 조건 사이에 차이가 없었다(도 7A-B).
PsaA는 활성 산소 제거(ROS Scavenging)메커니즘에 관여하는 것으로 알려져 있다. 광계 I의 핵심단백질(core protein)로서 광계 I의 집합체 형성에 관여하게 되며 광계 I의 안정성을 유지하게 한다. LED 조건에서 PsaA의 발현이 증가한 것은 극도의 장일 조건으로 인한 산화 스트레스를 억제하기 위한 것으로 예상되며, LED 조건의 이삭의 활성 산소를 효율적으로 제거하여 안정적인 광합성률을 유지시키기 때문에 실시예 3-1의 항산화 효소 활성 분석에서 자연 온실 조건과 차이가 없는 결과를 유도한 것으로 보인다.
또한, PsbA의 발현 차이가 보이지 않은 것은 극도의 장일 조건과 산화 스트레스에 의한 광계 II의 손상된 D1 단백질의 교체에서 차이가 나타나지 않기 때문이다. PsbB도 활성 산소 제거에 관여한다고 보고되어 있으나 LED 조건에서는 PsaA가 우선적으로 발현되는 것으로 검정되었다.
CDC의 발현은 자연 온실 조건에 비하여 LED 조건에서 발현이 높게 나타났다(도 7C). 밀의 CDC 유전자는 다양한 조건의 발현 분석을 통해 세포 분열과 직접적으로 연관된 유전자로 세포 성장 과정에 연관되어 분열하는 조직에서 우선적으로 발현된다고 보고되어 있다. 따라서, LED 조건에서 성장한 Bobwhite는 자연 온실 조건에 비해 빠른 생장을 가지고 있으며 그로 인해 세포 분열의 효율이 증가하여 CDC의 발현이 증가한 것으로 판단된다. 이는 LED 조건에서 생육된 Bobwhite의 세대 단축 효과 및 촉진된 출수일을 뒷받침해주는 결과이다.
이상 실시예에서 살펴본 바와 같이, 극단적 장일 조건을 유도하여 밀의 출수기를 단축시키는 실험으로 LED 조건에서 형성된 미성숙배의 조직배양 효율이 자연 온실 조건에 대조하여 차이가 없음을 증명하였다. 또한 항산화 효소 활성 분석 결과 차이가 나타나지 않았으며, 연관된 표지 유전자 발현 검정을 통하여 일장과 세포분열과의 관계를 검정하여 LED 조건에서 생육된 밀 이삭의 안정성을 확인하였다. 이 결과는 밀 조직배양 및 형질전환 기술에 활용될 것으로 기대한다.
<110> KONGJU NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY-UNIVERSITY COOPERATION FOUNDATION <120> Method for culturing immature embryos of wheat(Triticum aestivum) <130> DP20210210 <160> 8 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PsaA-sence <400> 1 gcagtaggtg gcaaagtggc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PsaA-antisence <400> 2 ctttccttgc gatgggcctg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PsbA-sence <400> 3 ggcggttccc tattcagtgc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PsbA-antisence <400> 4 caggccaagc agccaagaag 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDC-sence <400> 5 cgagaaggac atcgagaggg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CDC-antisence <400> 6 ctggtacttg cggatgtcgg 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin-sence <400> 7 gctgttccag ccatctcatg t 21 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin-antisence <400> 8 cgatcagcaa ttccaggaaa c 21

Claims (11)

  1. 밀(Triticum aestivum)의 종자를 발아시켜 유묘기 식물체(seedling)를 수득하는 단계;
    상기 유묘기 식물체를 밀폐된 생장조절실에서 24시간 중 21 내지 23시간의 발광다이오드(light emitting diode; LED) 조건 및 1 내지 3시간의 암 조건 하에 생육하는 단계;
    상기 생육하는 단계에서 개화된 이삭으로부터 영과(caryopsis)를 분리한 후 종자 소독하여 미성숙배를 분리하는 단계; 및
    상기 미성숙배를 계대배양하여 유도된 캘러스를 재분화 배지에서 재분화하는 단계를 포함하는, 밀의 미성숙배 조직배양 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 밀의 종자는 형질전환에 특화된 품종을 포함하는 것을 특징으로 하는, 밀의 미성숙배 조직배양 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 형질전환에 특화된 품종은 Bobwhite인 것을 특징으로 하는, 밀의 미성숙배 조직배양 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 발아는 3 내지 5주간 수행하는 것을 특징으로 하는, 밀의 미성숙배 조직배양 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 LED 조건에서 측정된 광합성 광량 자속 밀도(PPFD, Photosynthetic Photon Flux Density)는 650 내지 1,450 μmol/m-2·s-1 이고 LED 조도(Illuminance)는 28 내지 53 Klux 인 것을 특징으로 하는 밀의 미성숙배 조직배양 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 LED 광원의 파장은 400 내지 460 nm의 청색광 및 580 내지 680 nm의 적색광인 것을 특징으로 하는, 밀의 미성숙배 조직배양 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 생육하는 단계에서 생육된 밀 이삭의 출수 소요일은 30 내지 39일인 것을 특징으로 하는, 밀의 미성숙배 조직배양 방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 개화된 이삭은 개화 후 4 내지 14일째 이삭인 것을 특징으로 하는, 밀의 미성숙배 조직배양 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 개화 후 4 내지 14일째 이삭으로부터 수득한 미성숙배의 재분화율은 14 내지 82%인 것을 특징으로 하는, 밀의 미성숙배 조직배양 방법.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 개화 후 4 내지 14일째 이삭으로부터 수득한 미성숙배에서 CDC 유전자의 발현이 증가한 것을 특징으로 하는, 밀의 미성숙배 조직배양 방법.
  11. 제 1항에 따른 방법에 의해 배양된 미성숙배를 포함하는, 재분화된 밀 식물체.
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