KR20230010778A - 매트릭스가 결합된 나노소낭 및 그의 용도 - Google Patents

매트릭스가 결합된 나노소낭 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20230010778A
KR20230010778A KR1020227046472A KR20227046472A KR20230010778A KR 20230010778 A KR20230010778 A KR 20230010778A KR 1020227046472 A KR1020227046472 A KR 1020227046472A KR 20227046472 A KR20227046472 A KR 20227046472A KR 20230010778 A KR20230010778 A KR 20230010778A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
extracellular matrix
nanovesicles
ecm
cells
derived
Prior art date
Application number
KR1020227046472A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102595381B1 (ko
Inventor
스티븐 프란시스 베드렉
루아 휴레이헬
조지 에스. 핫세
후안 디에고 나란조 구티에레스
Original Assignee
유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 filed Critical 유니버시티 오브 피츠버그 - 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
Priority to KR1020237036580A priority Critical patent/KR20230151088A/ko
Publication of KR20230010778A publication Critical patent/KR20230010778A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102595381B1 publication Critical patent/KR102595381B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3633—Extracellular matrix [ECM]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/22—Urine; Urinary tract, e.g. kidney or bladder; Intraglomerular mesangial cells; Renal mesenchymal cells; Adrenal gland
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/36—Skin; Hair; Nails; Sebaceous glands; Cerumen; Epidermis; Epithelial cells; Keratinocytes; Langerhans cells; Ectodermal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/38—Stomach; Intestine; Goblet cells; Oral mucosa; Saliva
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/362—Skin, e.g. dermal papillae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3604—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix characterised by the human or animal origin of the biological material, e.g. hair, fascia, fish scales, silk, shellac, pericardium, pleura, renal tissue, amniotic membrane, parenchymal tissue, fetal tissue, muscle tissue, fat tissue, enamel
    • A61L27/3629—Intestinal tissue, e.g. small intestinal submucosa
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3687—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by the use of chemical agents in the treatment, e.g. specific enzymes, detergents, capping agents, crosslinkers, anticalcification agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/3683—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment
    • A61L27/3691—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix subjected to a specific treatment prior to implantation, e.g. decellularising, demineralising, grinding, cellular disruption/non-collagenous protein removal, anti-calcification, crosslinking, supercritical fluid extraction, enzyme treatment characterised by physical conditions of the treatment, e.g. applying a compressive force to the composition, pressure cycles, ultrasonic/sonication or microwave treatment, lyophilisation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/36—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix
    • A61L27/38—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells
    • A61L27/3804—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses containing ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof, e.g. transplant tissue, natural bone, extracellular matrix containing added animal cells characterised by specific cells or progenitors thereof, e.g. fibroblasts, connective tissue cells, kidney cells
    • A61L27/3834—Cells able to produce different cell types, e.g. hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, marrow stromal cells, embryonic stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/54—Biologically active materials, e.g. therapeutic substances
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L27/00—Materials for grafts or prostheses or for coating grafts or prostheses
    • A61L27/50—Materials characterised by their function or physical properties, e.g. injectable or lubricating compositions, shape-memory materials, surface modified materials
    • A61L27/56—Porous materials, e.g. foams or sponges
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
    • A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
    • A61L2300/254—Enzymes, proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
    • A61L2300/40—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices characterised by a specific therapeutic activity or mode of action
    • A61L2300/412—Tissue-regenerating or healing or proliferative agents
    • A61L2300/414—Growth factors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2400/00—Materials characterised by their function or physical properties
    • A61L2400/12—Nanosized materials, e.g. nanofibres, nanoparticles, nanowires, nanotubes; Nanostructured surfaces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.
    • C12N2310/141—MicroRNAs, miRNAs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/30—Special therapeutic applications
    • C12N2320/32—Special delivery means, e.g. tissue-specific

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

본 명세서에서는, 분리된 ECM 유래 나노소낭 및 약학적으로 혀용가능한 담체를 포함하는 조성물을 개시한다. ECM 유래 나노소낭을 생산하는 방법도 개시된다. 이들 ECM 유래 나노소낭은 약학적 조성물, 바이오 스캐폴드 및 장치에 포함될 수 있다. 이들 ECM 유래 나노소낭을 이용한 방법이 개시된다.

Description

매트릭스가 결합된 나노소낭 및 그의 용도{MATRIX BOUND NANOVESICLES AND THEIR USE}
관련 출원의 교차 참조
본 출원은, 2016년 3월 2일 출원되고 본원에서 참조문헌으로 포함된 미국 가출원 번호 62/302,626의 우선권을 주장한다.
본 발명은 생물학적 스캐폴드(scaffolds) 분야, 구체적으로 세포외 기질(extracellular matrix, ECM)로부터 유래된 나노소낭 및 그의 용도에 관한 것이다.
세포외 기질로 구성된 생물학적 스캐폴드는 외과용 망(surgical mesh) 물질들로 개발되어 왔고, 다른 무엇보다도 복부 탈장 수술(ventral hernia repair)(Alicuban et al., Hernia. 2014;18(5):705-712), 근골격의 복원(musculoskeletal reconstruction)(Mase et al., Orthopedics. 2010;33(7):511), 식도의 복원(esophageal reconstruction)(Badylak et al., Tissue Eng Part A. 2011; 17(11-12):1643-50), 경막 교체(dura mater replacement)(Bejjani et al., J Neurosurg. 2007;106(6):1028-1033), 힘줄 수술(tendon repair)(Longo et al., Stem Cells Int. 2012;2012:517165), 유방 복원(breast reconstruction)(Salzber, Ann Plast Surg. 2006;57(1):1-5)을 포함하는 많은 임상적 적용으로 사용되어 왔다(Badylak et al., Acta Biomater. 2009;5(1):1-13). 이러한 바이오물질들(biomaterials)의 용도는 전형적으로 기능적이고 적절한 위치를 갖는(site-appropriate) 조직의 적어도 부분적인 복원과 관련된다; "구조적 리모델링(constructive remodeling)"으로 언급된 과정. 이러한 세포외 기질-기반의 물질들은 그 기원에 있어 가장 흔하게 이종(xenogenic)이고(예를 들면, 사람 숙주에서 사용하기 위한 돼지), 다른 무엇보다도 진피(dermis), 방광(UBM) 및 소장 점막하 조직(small intestinal submucosa, SIS)과 같은 기원 조직(source tissue)의 탈세포화(decellularization)에 의해 준비된다. 이러한 이종의 스캐폴드(scaffolds)는 선천적(innate) 또는 적응성의(adaptive) 부정적인(adverse) 면역 반응을 일으키지 않는다(Badylak et al., Ann Biomed Eng. 2014;42(7):1517-1527).
임상 응용의 결과를 결정하는 요인은 많이 있으며, 무엇보다도 수술 기술, 임상적 상태를 위해 선정된 바이오스캐폴드의 적합성(appropriateness), 동종(allogeneic) 또는 이종의 기원 조직 공여자(donor), 및 환자의 기저질환(co-morbidities)을 포함한다(Badylak et al., Ann Biomed Eng. 2014;42(7):1517-1527). 아마도 결과의 주요한 결정 요인은 탈세포화 기술, 종말살균법(terminal sterilization), 및 수화 상태(state of hydration)를 포함하는, 바이오스캐폴드가 처리되는 방법일 것이다(Badylak et al., Ann Biomed Eng. 2014;42(7):1517-1527). 부적절한 탈세포화, 화학적 가교제(crosslinking agents)의 사용, 및 생체 내 설치(in vivo placement) 이후 적절한 기계적 하중(mechanical loading)의 부족이 안 좋은 결과에 기여한다고 알려져 왔다(Badylak et al., Ann Biomed Eng. 2014;42(7):1517-1527; Crapo et al., Biomaterials. 2011;32(12):3233-43).
특정 바이오스캐폴드를 사용한 결과는 이식 후 최종 생산물(즉, 후처리)에 대한 숙주 조직 반응에 의해 결정된다. ECM 유도와 관련된 숙주 반응의 다양한 구성요소 중, 부위 적합 구성(site-appropriate constructive) 및 기능 조직 재형성(functional tissue remodeling)은 혈관신생, 신경분포, 줄기세포 모집(stem cell recruitment), 항균 활성 및 선천적 면역 반응의 조절이다 (Londono and Badylak, Ann Biomed Eng. 2015;43(3):577-592). 또한, 동종 및 이종 적용 사이에는 분명한 차이점이 있다. 예를 들어, 간 ECM으로 구성된 ECM 바이오스캐폴드는 간장 동모양 혈관 내피 세포(hepatic sinusoidal endothelial cell)의 표현형을 지원하는 반면, 이종 조직 및 기간관에서 수집된 ECM은 그렇지 않다(Sellaro et al., Tissue Eng. 2007;13(9):2301-2310). 유사하게, 폐 ECM은 부위 적절한 줄기 세포 분화를 촉진한다(Coriella et al., Tissue Eng Part A. 2010;16(8):2565-2580). 그러나, 세포 및 ECM 사이의 명확한 혼선(cross-talk)이 있지만, ECM이 신호를 보내고 세포 행동을 지시하는 메커니즘과 그 반대의 경우는 거의 알려져 있지 않다. 이러한 효과에 대한 구성요소 및 메커니즘을 확인하고 이러한 효과를 활용하여 ECM이 특정 용도에 맞게 생물학적으로 조작될 수 있는 필요성이 남아 있다. 이러한 구성요소 및 메커니즘이 확인되면, 의료 기기에 사용하기 위해 조작될 수 있고, 세포의 증식, 생존 및 분화에 영향을 주는 방식으로 구현할 수 있다.
본 발명은 나노소낭(nanovesicles)이 ECM 섬유 네트워크(fibrillar network) 내에 삽입되는(embedded) 것을 개시한다. 이러한 매트릭스가 결합된 나노소낭은 ECM 스캐폴드 제조 공정 동안 분해 및 변성으로부터 그들의 화물(cargo)를 보호한다. 미세소낭은 이전에 체액 및 세포 배양 상등액에서 거의 독점적으로 확인되었다. 따라서, 매트릭스가 결합된 나노소낭의 존재는 놀랍다. 이러한 나노소낭은 계면활성제 및/또는 효소적 분해에 내성을 지니고, 상이한 마이크로 RNA 클러스터를 포함하고 있으며, miR-145가 풍부하기 때문에 다른 마이크로소낭과는 다르다. 개시되는 나노소낭은 다른 미세소낭에서 발견되는 특징적인 표면 단백질을 갖지 않는다. 나노소낭은 바이오스캐폴드 및 장치에서 활용할 수 있는 독특한 생물학적 특성을 제공한다.
본 명세서에서는 ECM에서 유래된, 분리된 나노소낭 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물이 개시된다. 일부 실시양태에서, 상기 나노소낭은 CD63 또는 CD81을 발현하지 않거나, 또는 CD63loCD81lo이다.
추가적인 실시양태에서, 세포외 기질에 결합된 나노소낭을 분리하는 방법이 개시된다. 이러한 방법은 절단된(digested) 세포외 기질을 생산하기 위하여, 효소로 세포외 기질을 절단시키고, 콜라겐 섬유 잔해(remnants)를 제거하여 섬유가 없는(fibril-free) 상층액을 생산하기 위하여 상기 절단된 세포외 기질을 원심분리하고, 고체 물질들을 분리하기 위하여 상기 섬유가 없는 상층액을 원심분리한 뒤 상기 고체 물질들을 버퍼에 현탁시키는 단계 및 세포외 기질로부터 나노소낭을 분리하기 위해 다양함 염을 사용하는 단계를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
추가적인 실시양태에서, 관심 있는(interest) 세포외 기질 상에서 세포 증식, 이동 및/또는 분화를 유도하는 방법이 개시된다. 이들 방법은 개시된 나노소낭을 이용한다. 상기 방법은 두 번째(second) 세포외 기질로부터 유래된 분리된 나노소낭을 관심 있는 세포외 기질에 도입하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 세포외 기질로부터 유래된 분리된 나노소낭을 포함하는 바이오스캐폴드가 개시된다. 추가의 실시양태에서, 세포외 기질로부터 유래된 분리된 나노소낭을 포함하거나 코팅한 의료 장치가 개시된다.
본 발명의 상기 및 다른 목적, 특징 및 이점은 첨부된 도면을 참조하여 진행되는 이하의 상세한 설명으로부터 더욱 명백해질 것이다.
도 1A-1C. UBM, SIS 또는 Dermis로부터 핵산 농도, 및 시판의 동등물의 비교. (A) UBM, (B) SIS, 및 (C) Dermis 샘플의, 절단되지 않은(undigested) ECM 스캐폴드, 및 단백질분해효소(Proteinase) K 또는 콜라게나아제(Collagenase)로 절단된(digested) 샘플 1 mg 건조 중량 당 총 핵산 및 dsDNA의 농도. 총 핵산 농도는 260 nm에서 UV 흡광도로 평가하였다. dsDNA 농도는 피코그린 dsDNA 정량 시약으로 평가하였다. 분리에서 분리까지의 가변성은 표준편차로 표시된다. 데이터는 평균±s.d.로 표시되며, 샘플당 n=3 분리로 표시된다.
도 2A-2D. 탈세포화된(decellularized) ECM 스캐폴드의 효소 절단는 작은 RNA 분자를 방출함. (A) 절단되지 않은 UBM(컨트롤), 및 단백질분해효소 K 또는 콜라게나아제의 절단물으로부터 추출한, RNase A, DNase I 또는 처리되지 않은 핵산의 아가로스 겔 전기영동. (B) DNase I 처리 전(상부 패널) 및 처리 후(하부 패널) 콜라게나아제로 절단된 UBM으로부터 추출된 핵산의 작은 RNA 패턴을 나타내는 전기페로그램(Electropherogram). (C) DNase I 처리 후 콜라게나아제로 절단된 샘플로부터 작은 RNA 패턴을 나타내는 전기페로그램. (D) 생물학적 스캐폴드의 작은 RNA 분자는 핵분해효소(nuclease)의 분해로부터 보호된다.
도 3A-3F. 나노소낭이 삽입된 ECM의 동정. 둥근 구조의 오스뮴(osmium)으로 양성 염색된, 수화된 UBM의 TEM 영상이 확인됨(A). MBV가 섬유 내에 갇혀있을 때 펩신 프로테아제(Pepsin protease)로의 효소 절단은 부분 절단된다. 콜라게나아제 또는 단백질분해효소 K를 통한 완전 절단은 TEM 이미지에서와 같이, ECM 섬유에서 MBV가 완전 분리되는 결과를 나타낸다(B). 세 가지 산업 및 실험실에서 생산된 생산물은 단백질분해효소 K로 절단된 ECM(100 mg)은(C) 모든 샘플에서 ECM 내에 삽입된 MBV의 존재를 나타낸다. MBV 단백질 화물 서명(cargo signature)은 ECM 생산물에 대한 SDS-page Silverstain을 사용하여 측정하였다. 단백질 서명은 각 샘플별로 상이하다(D). 웨스턴블롯 분석은 두 개의 엑소좀 내(exosomal) 표면 마커 CD-63 및 CD-81에서 수행되었다. 인간 골수 유래 중간엽 줄기세포 및 인간 혈청 대조군을 비교하여 발현 수준을 검출할 수 없었다(E). MBV 크기의 검증은 Nanosight을 통해 측정되었다. 입자 크기는 MBV와 일치하였다(F). 데이터는 평균±s.d., n=1로 나타내었다.
도 4A-4C. 작은 RNA 서열 데이터는 상용 제푼 및 병렬적 실험실 제작 제품간의 상호의 miRNA 뿐만 아니라 나노소낭 내 존재하는 miRNA의 존재를 나타낸다(A). IPA(Ingenuity pathway analysis)는 확인된 miRNA 내에 포함된 다른 세포 기능 경로(예를 들어, 세포주기, 세포사멸 및 세포성장)가 있음을 나타낸다(B).
도 5A-5F. C2C12에서 나노소낭 흡수(A). N1E-115 세포를 이용한 신경 돌기 확장 검사(B). PVSC(n=3)는 스크래치 분석에서 볼 수 있듯이 이동성에 영향을 주는 유의적인 형태학적 변화를 보였다(C). 혈구계수기를 사용하여 세포수에서 관찰된 증가를 정량화하였다(D). UBM 바이오스캐폴드로부터 분리된 나노소낭은 건설적인 M2 대식세포 표현형을 촉진한다. (E) 골수를 C57bl/6 마우스로부터 분리하고 대식세포-콜로니-자극 인자(MCSF)가 보충된 배지에서 배양하여 대식세포를 유도하였다. 대식세포를 20 ng/ml IFNγ 및 100 ng/ml LPS로 처리하여 M1 대식세포를 유도하였고, 20 ng/ml IL-4를 처리하여 M2 대식세포를 유도하였으며, UBM 공급원으로부터 수득한 분리된 엑소좀 5 ug/ml(단백질/부피)을 처리하였다. 대식세포는 판-대식세포(pan-macrophage) 마커(F4/80)와, M1(iNOS) 및 M2(Fizz1) 표현형에 대한 강한 지표로 고정하고 면역 표지하였다. 대식세포로 처리된 나노소낭은 주로 F4/80+ Fizz1+이며, M2와 "유사한" 표현형을 나타낸다. (F) THP-1 유전자 발현은 UBM 엑소좀 형질 도입에 의해 변화된다. A:THP-1은 UBM 분리된 엑소좀(n=3)으로 형질도입되었으며, 유전자 발현은 M1 및 M2 관련 마커(iNOS, TNFa, STAT1, STAT2, STAT5A, STAT5B, IRF3, IRF4, IRF5, IL1RN, CD206, TGM2, STAT3, STAT6, KLF4, PPARg) 모두에 대해 qPCR에 의해 24시간 후에 평가되었다. 위의 모든 실험에서 나노소낭 노출량은 50 ug/ml(단백질/부피)이다.
도 6. 서로 다른 출처에서 딥 시퀀싱(deep sequencing)에서 mir-145p의 판독 결과를 보여주는 표. Mir-145-5p는 세포외 기질(섬유 아세포)과 관련된 것들을 제외하고는 혈장, 소변, 세포 배양액 또는 세포로부터의 엑소좀에서 높게 발현되지 않는다. 이는 세포외 기질 스캐폴드(Extracellular matrix Scaffolds)로부터 분리된 엑소좀과 다른 비율로 모든 조직에서 발현된다. Let-7b-5p 존재를 대조군으로 사용하였다. 참고문헌은 Huang et al. BMC Genomics. 2013;14:319. doi:10.1186/1471-2164-14-319; Ben-Dov et al., PLoS ONE. 2016;11(1):e0147249. doi:10.1371/journal.pone.0147249; Ji et al., PLoS ONE. 2014;9(10):e110314. doi:10.1371/journal.pone.0110314; Stevanato et al., PLoS ONE. 2016;11(1):e0146353. doi:10.1371/journal.pone.0146353; Kuchen et al.,　Immunity. 2010;32(6):828-839. doi:10.1016/j.immuni.2010.05.009 이다.
도 7. 다른 조직과 세포주 사이의 Mir-145 발현 프로파일. Mir-145는 정상 조직에서 높게 발현된다. 이는 종양에서 더 적은 정도로 표현된다. 이는 T 또는 B 세포 종양이나 특정 세포주에서 발현되지 않는다. 서열번호 1을 나타낸다.
도 8A 및 도 8B. 추가적인 분리 방법을 보여주는 개략도. 본 발명에 대한 추가적인 설명은 실시예 7에서 개시된다.
도 9A 및 9B. A.KCl 분리. KCl을 첨가하면 초원심분리로 ECM로부터 매트릭스에 결합된 나노소낭(MBV)을 분리할 수 있지만 KCl 농도를 높이면 차이점이나 이점이 나타나지 않는다. (ns= 유의차 없음, *= p <0.05) B. 0.2M KCl을 PBS에 첨가하여 분리한 MBV의 TEM.
도 10. RNA 정량. 세 가지 방법으로, RNase 처리 전후의 RNA 양을 분리된 매트릭스 결합된 나노소낭(MBV)에 대해 정량화되었다. 단백질분해효소 K(효소 기반) 및 KCl(염분 분리)을 사용했을 때 MBV의 양은 차이가 없었지만 콜라게나아제를 사용할 때 더 큰 수확량이 있었다.
도 11A-11B. 염 및 한외여과(Ultrafiltration). A. 콜라게나아제 0.1과 함께 초원심분리(UC) 분리된 MBVs의 양은 초원심분리(UC) 및 한외여과(UF)과 함께 KCl로 분리된 MBVs와 비교되었다. 0.8 M KCl에 노출된 후 펠렛화된 ECM은 0.1 mg/mL의 콜라게나아제 절단되었고, KCl 처리 후 여전히 ECM에 MBV가 남아 있음을 보여주었다. KCl 및 초원심분리는 다른 방법보다 4배 더 높은 MBV 수율을 제공했다. 괄호 안은 ECM 물질 초기량(starting amount). B. Nanosight로 측정된 0.8 M KCl 및 한외여과로 분리된 MBV의 입자 크기 분포는 10-300 nm의 입자 크기를 보여준다.
도 12A-12B. KCl의 효과. A. MBV는 물, PBS 및 KCl 농도를 증가시킨 PBS에 ECM을 재현탁하여 분리하였다. 최종 펠렛을 단리하기 위해 한외여과가 사용되었다. MBVs는 PBS와, KCl와 함께한 PBS로 단리될 수 있었지만, PBS에 물을 넣어 재부유 시키면 MBV가 생성되지 않았다. B. PBS, KH2PO4 완충액 및 0.4M KCl을 함유하는 KH2PO4 완충액에 ECM을 재현탁하여 MBV를 분리하였다. MBVs가 분리된 PBS는 MBVs가 실행 가능하고 물속에서 파열하지 않는다는 것을 보여주면서 동일한 양의 MBVs로 PBS 및 물 모두에서 머물렀다. KH2PO4 완충액으로 MBV를 분리할 수는 없지만 KCl을 첨가하면 분리를 담당하는 염이 첨가된 MBV가 나타난다.
도 13A-13B. mL 당 30 및 60 uL의 콜라게나아제 및 KCl로부터 MBVs에 24시간 노출 후 골수 유래 대식세포의 유전자 발현. 콜라게나아제로 분리된 MBVs와 KCl로 분리된 MBVs는 유사한 유전자 발현 패턴을 보였다 A. 그러나 콜라게나아제로 분리된 MBV는 ARG 및 INOS 발현이 더 높았다 B.
도 14A-14D. ECM 바이오스캐폴드로부터 유래된 MBVs는 신경교종세포 생존을 억제. ECM 용해성 분획 또는 MBV의 세포 생존능에 대한 영향을 처리 24시간 후 MTT 분석에 의해 측정하였다. 고급 일차 인간 신경아교 세포(High grade primary human glioma cells)(A), 저급 일차 인간 신경교종세포(B), 인간 미세아세포(human microglia cells)(C) 및 신경전구세포(neural progenitor cells)(D).
도 15. ECM 바이오스캐폴드 및 ECM 바이오스캐폴드로부터 유래된 MBVs의 가용성 분획은 식도암 세포 생존력을 억제. MTT 분석으로 암세포 생존력을 평가했다.
도 16A-16C. (A) 분말 UBM-ECM 및 SIS-ECM 100 mg을 0.1 mg/ml 콜라게나아제 제 용액으로 16 시간 반응시켰다. 분해 생성물을 진행성 원심분리하여 MBV를 분리하였다. 수득된 정제 MBV를 투과전자현미경으로 100,000배 배율로 이미지화 하였다. (B) 분리된 MBVs의 핵산 함량은 Exo-Glow를 사용하여 표지하였다. 표지된 입자는 골수 유래 대식세포와 함께 4시간 동안 배양하고 형광현미경을 사용하여 영상화하였다. 대조군으로써, 세포가 없는 표지된 MBV를 사용하여 노출시간을 설정했다. (C) 유전자 발현을 나타내는 대표적인 히트 맵(heat map)은 치료에 반응하여 변화한다. 세포를 1 ml의 배지 및 다음 중 하나의 배지로 처리하였다: (1) MIFNg + LPS 표현형(M1 유사)을 촉진하기 위해 20 ng/ml IFNγ 및 100 ng/ml LPS, (2) MIL-4 표현형(M2 유사)을 촉진하기 위해 20 ng/ml IL-4, (3) MECM 표현형을 촉진하기 위해, 250 ug/ml의 UBM-ECM, 또는 SIS-ECM 또는, (4) MMBV 표현형을 촉진하기 위해 25 ug/ml UBM-MBVs, 또는 SIS-MBVs. 펩신(1 mg/ml) 및 콜라게나아제(0.1 mg/ml)를 각각의 ECM 및 MBV에 대한 기준선 대조군으로 사용했다.
도 17. 골수 유래 대식세포를 C57bl/6 마우스로부터 수집하고 대식세포로 성숙시켰다. 세포를 다음 조건 중 하나를 사용하여 처리하였다: (1) MIFNg + LPS 표현형(M1 유사)을 촉진하기 위해 20 ng/ml IFNγ 및 100 ng/ml LPS, (2) MIL-4 표현형(M2 유사)을 촉진하기 위해 20 ng/ml IL-4, (3) MECM 표현형을 촉진하기 위해 250 ug/ml의 UBM-ECM, 또는 SIS-ECM, (4) MMBV 표현형을 촉진하기 위해 25 ug/ml의 M-MBVs, 또는 SIS-MBVs. 펩신(1 mg/ml) 및 콜라게나아제(0.1 mg/ml)를 각각의 ECM 및 MBV에 대한 기준선 대조군으로 사용했다. 세포를 PBS로 세척하고, 2% 파라포름알데히드로 45분 동안 고정시켰다. 쥐 특이적 1차항체 및 형광체가 결합된 2차항체를 사용하여, 표적 단백질 발현을 정성적으로 평가할 수 있었다. 판-대식세포 마커로 F4/80을 사용하였고 M1 유사의 마커로는 TNFa 및 iNOS를, M2 유사의 마커에는 Fizz1 및 Arginase1을 사용하였다. 노출시간은 이소타입 및 적절한 사이토카인 대조군을 사용하여 설정되었고 전체적으로 일정하게 유지되었다.
도 18A-18C. MBV 처리는 BMDM 기능 분석에 대한 ECM 효과에 탁월하다. 대식세포는 MCSF 대조군, 250 mg/ml ECM, 25 mg/ml MBV 또는 사이토카인 대조군 IFNg + LPS 또는 IL-4에 24시간 노출시켰다. (A) 대식세포 상등액을 5% 인산에서 1% 설파닐아미드(sulfanilamide)와 10분간 혼합한 후 물에서 0.1% N-1-나프틸에틸렌디아민(NED; N-1-napthylethylenediamine) 디하이드로 클로라이드를 첨가하였다. 용액을 540 nm에서 분광광도계로 판독하고 질산나트륨 생산 수준을 평가하기 위해 아질산나트륨의 표준곡선과 비교했다. (B) 처리된 대식세포는 Vybrant Phagocytosis Kit FITC로 표지된 E. coli 비드(beads)와 함께 2시간 동안 배양되었다. 세포를 고정시키고 DAPI로 염색하였다. 형광현미경을 사용하여 Cell Profiler 소프트웨어를 사용하여 세포를 시각화하고 세포의 평균 형광 강도를 정량화했다. (C) 대식세포를 250 mg/ml ECM, 25 mg/ml MBV, 또는 사이토카인 대조군 IFNγ + LPS 또는 IL4로 18시간 동안 처리하였다. 처리된 모든 대식세포를 PBS로 세척하고 무혈청, 무항생제 배지에서 5시간 동안 배양하였다. 대식세포의 분비된 생성물을 함유하는 배지를 수집하고 트립신 간장 배지(tryptic soy broth)와의 1:10의 비율 및 1x104 CFU/ml의 S.aureus를 사용하였다. 박테리아 성장은 570 nm에서의 흡광도를 측정하여 평가하였다. (값: 평균 흡광도±표준 편차, N= 4, *p<0.05).
도 19A-19E. 대식세포 miRNA 억제 (A-C). 각각 50 nM의 억제제를 이용한 특정 miRNAs, miR-145-5p, miR-145-3p 및 miR-125-b-5p의 선택적인 억제. TaqMan miRNA qPCR 분석법에 의해 억제 후 상대적으로 풍부한 miRNA 수준이 측정되었다. (D) MBVs에 노출된 세포, 또는 스크램블 대조군 miRNA의 억제제, MMU-miR-145-5p 억제제, MMU-miR-143-3p 억제제, MMU-miR-125B-5P 억제제, 또는 이들 세 개의 억제제 조합으로 형질감염된 세포의 유전자 발현 분석은 qPCR을 사용하여 평가하였다. 결과는 트리뷰 소프트웨어(Tree-view software)를 사용하여 히트 맵 형식으로 제공된다; 모든 배수 변화는 배지 대조군과 관련된다. Scale bar scoring system은 다음과 같다: 0.1배 변화(-3) 이하, 0.1-0.29배 변화(-2), 0.3-0.69(-1), 0.7-1.29(0), 1.3-1.9(+1), 2.0-4.9(+2), 5.0 이상(+3). (E) BMDM는 다음 중 하나의 50 ㎚에 4시간 동안 노출된다: 스크램블 대조군, mmu-miR-125b-5p 억제제, mmu-miR-143-3p 억제제, mmu-miR-145-5p 또는 세 개의 조합(믹스). 처리 배지를 정상 성장 배지로 18시간 동안 교체하였다. 이어서 세포를 4% PFA로 고정시켰다. 세포를 M1-유사 표현형 TNFα 및 iNOS의 마커, 또는 M2-유사 표현형 Fizz1 및 Arginase1의 마커에 대한 항-쥐 항체와 함께 배양하였다. 노출시간은 음성 이소형 대조군(negative isotype control) 및 사이토카인-처리 대조군에 기초하여 확립되었고, 시험된 각 마커에 대해 일정하게 유지되었다. 세포핵을 DAPI로 염색하였다. 이미지는 200X 배율로 촬영했다. 결과는 miRNA 억제가 MMBV 표현형 형성에 miR-125b-5p, miR-143-3p 및 miR-145-5p의 역할을 암시하는, 여러 탐침된 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있음을 보여준다.
혈소판 생산으로 1967년 전자현미경에 의해 처음으로 확인된(Wolf, Br J Haematol. 1967;13:269-288; Hargett et al., Pulm Circ. 2013; 3(2):329-40) 세포외 소낭(extracellular vesicles; EV)은 RNA, 단백질, 효소 및 지질을 전달하는 능력으로 인해 세포 간 소통의 강력한 매개체로서 다양한 생리학적 및 병리학적 과정에 영향을 미친다. EV의 생산과 방출은 원핵생물과 진핵생물 모두에서 진화적으로 보존되어 세포 생리학에서 소포 매개 과정의 중요성을 강조한다 (Deatherage and Cookson, Infect Immun. 2012 Jun; 80(6): 1948-1957). EV는 직경이 50-1,000 nm 범위인 나노크기의 매트릭스가 결합된 소낭으로, 이들의 크기, 기원 및 방출 형태에 따라 다음의 세 가지 주요 그룹으로 분류된다: 나노소낭(nanovesicles), 엑소좀(exosomes) 및 아폽토시스 바디(apoptotic bodies)(Nawaz et al., Nat Rev Urol. 2014;11(12):688-701; van der Pol et al., Pharmacol Rev. 2012;64(3):676-705).
EV는 다양한 생리 조건 하에서 다양한 세포 유형에 의해 분비되며 타액, 소변, 비강 및 기관지 세척액, 양수액, 모유, 혈장, 혈청 및 정액과 같은 생물학적 유체에서 확인된다(Yanez-Mo et al., J Extracell Vesicles. 2015; 4:27066). 체액 및 세포 배양 상등액에서 EV가 확인되었지만 EV는 ICAM-1 및 αM 및 β2 인테그린과 같은 접착 분자의 존재를 통해 ECM 성분에 고정될 수 있다 (Escola et al., J. Biol. Chem. 1998;273 20121-20127; Thery et al., J. Cell Biol. 1999;147:599-610; Thery et al., J. Immunol. 2001;166: 7309-7318).
"매트릭스 소낭(matrix vesicles)"은 또한 뼈, 연골(cartilage) 및 상아전질(predentin)의 매트릭스에 선택적으로 고정하는 것으로 나타났다(Anderson, J Cell Biol. 1969;41:59-72; Anderson, Curr Rheumatol Rep. 2003;5:222-226). 보다 적절하게 석회화 소낭(calcification vesicles)이라고 기술되는데, 이 멤브레인 나노입자는 연골세포(chondrocytes), 골아세포(osteoblasts) 및 상아모세포(odontoblasts)의 산물이며, 모든 골격 조직에서 석회화의 초기 부위로 작용하는 것으로 나타났다(Anderson, Clin Orthop Relat Res. 1995; (314):266-80). 그러나, 매트릭스 소낭이 엑소좀 및 마이크로소낭과 유사한 세포 간 신호전달에 관여하는지 여부는 여전히 불확실하다(Sharpiro et al., Bone. 2015; 79:29-36). 본원에 개시된 것은 연조직(soft tissue)의 간질 매트릭스(interstitial matrix) 내에, 특히 세포외 매트릭스(ECM)라고 일컫는 무세포 바이오스캐폴드(acellular bioscaffolds)의 매트릭스 내에서 단단히 결합된 나노소낭의 놀라운 발견이다. 이 바이오스캐폴드는 세포막을 용해/파열시키고 이어서 세포 잔해물을 제거하도록 특별히 고안된 방법을 사용하여 방광, 진피 및 소장 점막과 같은 공급원 세포의 세포제거(탈세포화)에 의해 준비된다. 이러한 나노소낭은 재생의학 및 조직공학 전략에 사용될 수 있다(De Jong et al, Front Immunol. 2014;5:608; Malda et al.; Nat Rev Rheumatol. 2016 (Epub ahead of print); Lamichhane et al., Tissue Eng Part B Rev. 2015;21(1):45-54). 생체 및 병리학적 과정을 모니터하는 진단 및 예후적 바이오마커로서 이들의 유용성은, 조직 수복의 잠재적 치료 용도 이외에도, 조성물, 화물 및 조절된 방출 메커니즘은 새로운 의미를 제공한다.
본 명세서에서는 실험실에서 제조한 ECM 바이오스캐폴드 및 상업적으로 이용 가능한 ECM 바이오스캐폴드 내에 나노소낭들, 특히 엑소좀이 삽입되어 있고 결합되어 있음을 개시한다. 이러한 나노소낭의 함량을 측정하여 특정 표적 세포에 차별적으로 영향을 미친다는 사실이 입증되었다. 개시된 연구를 보면, 이들 ECM 유래의 나노소낭을 포함하는 약학적 조성물이 바이오스캐폴드 및 의료장치를 제조하는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 이러한 약학적 조성물은 또한 특정 표적 세포 집단의 성장, 이동 및 다른 생물학적 특성을 표적화하는데 사용될 수 있다.
용어
달리 명시하지 않는 한, 기술용어는 일반적인 사용법에 따라 사용된다. 분자생물학의 일반적인 용어정의는 Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); and Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8)에서 찾아볼 수 있다.
본 명세서의 다양한 실시예에 대한 검토를 용이하게 하기 위해, 특정 용어에 대한 다음의 설명이 제공된다:
투여(Administration): 선택한 경로로 대상에 조성물을 도입한다. 경로는 국부적(local)일 수도 있고 전신적(systemic)일 수 있다. 예를 들어, 선택된 경로가 정맥인 경우, 조성물은 대상의 정맥 내로 조성물을 도입함으로써 투여된다. 선택된 경로가 국부적인 경우, 조성물은 조직 내로 조성물을 도입함으로써 투여될 수 있다.
변화(Alter): 세포, 폴리 뉴클레오타이드 또는 폴리펩티드와 같은 관심있는 물질의 유효량 또는 적절량에서 통계적으로 유의한 변화. 변화는 증가 또는 감소 일 수 있다. 상기 변화는 생체 내(in vivo) 또는 시험관 내(in vitro)에서 일어날 수 있다. 몇몇 실시태양에서, 물질의 유효량을 변화시키는 것은 물질의 유효량(수준), 세포의 증식 및/또는 생존, 또는 효소와 같은 단백질의 활성의 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 증가 또는 감소를 포함할 수 있다.
선암종(Adenocarcinoma): 신체의 여러 부분에서 발생할 수있는 악성 종양의 한 유형. 이것 선상 기원(glandular origin), 선 특성(glandular characteristics), 또는 둘 다를 가진 상피 조직의 신조직형성(neoplasia)이다.
아폽토시스(Apoptosis): 다세포 생물에서 일어나는 프로그래밍된 세포사멸의 과정. 아폽토시스는 특징적인 세포 변화(형태학) 및 사망이 포함된다. 이러한 변화는 수포(blebbing), 세포 수축, 핵 분열, 염색질 응축, 염색체 DNA 단편화 및 글로벌 mRNA 붕괴를 포함한다.
생체 적합성(Biocompatible): 포유동물 대상에 이식될 때, 대상에서 부작용을 유발하지 않는 모든 물질. 생체 적합성 물질은 개체에 도입될 때 의도된 기능을 수행할 수 있고 그 개체에 대해 독성 또는 해롭지 않으며 피험자에서 물질의 면역 학적 거부를 유도하지도 않는다.
바이오스캐폴드(Bioscaffold): 생체 적합성이 있는 바이오스캐폴드, 일반적으로 고체 지지체 또는 젤.
암(Cancer): 분화 감퇴, 성장 속도 증가, 주변 조직 침윤으로 특징적인 퇴화(anaplasia)를 겪은 양성(benign) 또는 악성(malignant) 종양으로, 전이가 가능하다. 예를 들어, 갑상선암은 갑상선 조직에서 발생하는 종양이며 식도암은 식도 조직에서 발생하는 종양이다. 잔여 암(residual cancer)은 암을 줄이거나 근절하기 위해 피험자에게 주어진 어떤 형태의 치료 후에도 피험자에 남아있는 암이다. 전이성 암은 전이성 암이 유래된 근원(원발성)암의 기원 부위가 아닌 신체의 하나 이상의 부위에서의 종양이다. 암에는 고형 종양이 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
cDNA(상보적인 DNA): 내부, 비코딩부분(인트론) 및 전사를 결정하는 조절 서열이 결여된 DNA 조각. cDNA는 세포에서 추출한 메신저 RNA로부터 역전사에 의해 실험실에서 합성된다. cDNA는 또한 상응하는 RNA 분자에서 번역제어를 담당하는 비번역영역(UTR)을 포함할 수 있다.
원심분리(Centrifugation): 원심력이 혼합물에 가해져 혼합물의 고밀도 성분이 혼합물 내의 다른 덜 치밀한 성분에 비해 원심 분리기의 축으로부터 멀어지는 과정. 혼합물에 적용되는 힘은 원심분리기 로터의 속도와 스핀의 반지름의 함수이다. 대부분의 적용에서, 스핀의 힘은 원심 분리 튜브의 바닥에 침전물(펠릿)이 모일 것이고, 남아있는 용액은 적절하게 "표면의 액체(supernate)" 또는 "상등액(supernatant)"라고 불린다. 다른 유사한 응용 분야에서, 밀도 기반 분리 또는 구배 원심 분리" 기술은 원하는 성분보다 밀도가 높고 밀도가 낮은 성분을 함유하는 혼합물로부터 특정 종을 분리하는데 사용된다.
원심 분리기 로터의 원운동 동안, 적용되는 힘은 반경과 스핀의 각속도의 곱이며, 여기서 힘은 전통적으로 "g", 지구 표면의 중력으로 인한 표준 가속도의 상대적 가속으로 표현된다. 적용되는 원심력은 "상대적 원심력"(RCF)으로 불리며 "g"의 배수로 표시된다.
화학요법(Chemotherapy); 화학요법 제제: 본 명세서에서, 비정상적인 세포 성장을 특징으로 하는 질환의 치료에 치료적 유용성을 갖는 임의의 화학적 제제. 그러한 질병은 종양, 신조직형성 및 암 뿐만 아니라 건선과 같은 과증식 성장을 특징으로 하는 질병을 포함한다. 한 실시양태에서, 화학요법 제제는 고형 종양과 같은 신조직형성 치료에 사용되는 제제이다. 한 실시양태에서, 화학요법 제제는 방사성 분자이다. 당업자는 화학요법 제제를 쉽게 확인할 수 있다(예를 들어, Slapak and Kufe, Principles of Cancer Therapy, Chapter 86 in Harrison's Principles of Internal Medicine, 14th edition; Perry et al., Chemotherapy, Ch. 17 in Abeloff, Clinical Oncology 2nd ed., ⓒ 2000 Churchill Livingstone, Inc; Baltzer L., Berkery R. (eds): Oncology Pocket Guide to Chemotherapy, 2nd ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1995; Fischer DS, Knobf MF, Durivage HJ (eds): The Cancer Chemotherapy Handbook, 4th ed. St. Louis, Mosby-Year Book, 1993). 화학요법 제제는 당업자에게 공지된 것들을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니나 다음을 포함할 수 있다: 5-플루오로우라실(5-fluorouracil; 5-FU), 아자티오프린(azathioprine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 항대사성물질(예를 들어, Fludarabine), 항종양약[예를 들어, 에토포시드(Etoposide), 독소루비신(Doxorubicin), 메토트렉세이트(methotrexate) 및 빈크리스틴(Vincristine)], 카보플라틴(carboplatin), 시스플라틴(cis-platinum) 및 탁솔과 같은 탁산(taxanes).
접촉(Contacting): 직접적인 물리적 결합에 배치. 고체 및 액체 형태 모두 포함.
사이토카인(Cytokine): 용어 "사이토카인"은 나노 또는 피코 몰농도에서 체액 조절제 역할을 하며 정상 또는 병리학적 조건 하에서 개별 세포 및 조직의 기능적 활성을 조절하는 수용성 단백질 및 펩타이드의 다양한 그룹의 총칭으로 사용된다. 이 단백질은 세포간 상호 작용을 매개하여 세포외 환경에서 일어나는 과정을 조절한다. 사이토카인의 예로는 종양괴사인자(tumor necrosis factor)-α, 인터루킨(interleukin; IL)-6, IL-10, IL-12, 형질전환 성장인자 및 인터페론(interferon)-γ를 포함하지만 이에 한정되지 않는다.
디제너레이트 변이체(Degenerate variant): 유전 코드의 결과로서 디제너레이트 서열을 포함하는 PDGF 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드. 20개의 천연 아미노산이 있으며, 대부분이 하나 이상의 코돈으로 지정된다. 따라서, 염기서열에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 변하지 않는 한 모든 디제너레이트 뉴클레오타이드 서열이 포함된다.
분화(Differentiation): 비교적 특수화되지 않은 세포(예를 들어, 배아세포)가 성숙한 세포 특유의 구조적 및/또는 기능적 특징을 얻는 과정을 의미한다. 마찬가지로 "분화하다(differentiate)"는 이 공정을 나타낸다. 전형적으로, 분화 동안 세포 구조 및 기능적 능력이 변화하고 조직 특이적 단백질 및 비-단백질 분자가 나타난다.
DNA(deoxyribonucleic acid): DNA는 대부분의 생물체의 유전물질을 포함하는 긴 사슬 고분자이다(일부 바이러스는 리보 핵산(RNA)을 포함하는 유전자를 가짐). DNA 폴리머의 반복단위는 4개의 다른 뉴클레오타이드이며, 각각은 인산기가 부착된 데옥시리보스 당(deoxyribose sugar)에 결합된 아데닌(A), 구아닌(G), 시토신(C) 및 티민(T)과 같은 네 개의 염기중 하나를 포함한다. 폴리펩티드 내의 각 아미노산 또는 중지 신호(stop signal)에 대한 뉴클레오타이드(코돈이라 칭함)의 트리플렛이 코딩된다. 코돈은 또한 DNA 서열이 전사되는 mRNA에서 3개 뉴클레오타이드의 상응하는 (및 상보적인) 서열에 사용된다.
달리 명시하지 않는 한, DNA 분자에 대한 모든 언급은 그 DNA 분자의 역보체를 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 단일가닥이 요구되는 것을 제외하고, DNA 분자는 비록 단일가닥만 묘사하기 위해 작성되었지만, 이중가닥 DNA 분자의 두 가닥을 포함한다. 따라서, 특정 단백질 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산 분자에 대한 언급은 센스가닥 및 그의 역보체 모두를 포함한다. 예를 들어, 개시된 핵산 분자의 역보체 서열로부터 프로브 또는 프라이머를 생성하는 것이 적절하다.
풍성한(Enriched): 혼합물 내의 나노소낭과 같은 관심의 대상인 성분이 존재하는 공정으로, 농축 공정 전과 비교하여 농축 공정 후의 혼합물 내의 다른 바람직하지 않은 성분의 양에 대한 관심 대상 성분의 양의 증가된 비율을 가진다.
세포외 매트릭스(ECM): 구조적 및 기능적 생체 분자, 및/또는 구조 단백질, 특이적 단백질, 프로테오글리칸(proteoglycans), 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans) 및 조직 내에서 세포를 둘러싸고 지지하는 성장 인자를 포함하지만 이에 한정되지 않는 생체 고분자(biomacromolecules)의 복합체 혼합물이며, 달리 명시되지 않는 한 무세포이다. ECM 제제(preparation)는 본원에 기술되고 당업계에 공지된 방법을 통해 공급원 조직으로부터 제거된 세포인 것을 의미하는 "탈세포화(decellularized)" 또는 "무세포(acellular)"로 간주될 수 있다. "ECM 유도 나노소낭", "매트릭스 결합 나노소낭" 또는 "ECM에서 추출된 나노소낭"과 같은 "ECM 유도 물질"은 천연 ECM 또는 시험관 출처에서 제조된 나노소낭이며, 여기서 ECM은 배양된 세포에 의해 생성되며 하나 이상의 고분자 요소(성분; constituents)을 포함한다. ECM 유래 나노소낭 하기에서 정의된다.
발현된(Expressed): 핵산 서열의 단백질로의 번역. 단백질은 발현되어 세포 내 유지되거나, 세포 표면막의 구성 요소가 되거나, 세포외 기질 또는 배지로 분비될 수 있다.
발현 조절 서열(Expression Control Sequences): 작동 가능하게 연결된 이종 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열. 발현 조절 서열은 발현 조절 서열이 핵산 서열의 전사(transcription), 적절하게는 번역(translation)을 컨트롤 및 조절할 때 핵산 서열에 작동 가능하게 연결된다. 따라서, 발현 조절 서열은 적절한 프로모터, 인핸서, 전사 터미네이터, 단백질 코딩 유전자 앞에 있는 개시코돈(ATG), 인트론에 대한 스플라이싱 시그널, mRNA의 적절한 번역을 허용하기 위한 유전자의 정확한 판독 프레임의 보수(maintenance), 및 스탑코돈을 포함한다. "조절 서열"이라는 용어는 최소한 발현에 영향을 미칠 수 있는 성분을 포함하는 것으로 의도되며, 그의 존재가 유리한 추가 성분, 예를 들어 리더 서열 및 융합 파트너 서열을 또한 포함할 수 있다. 발현 조절 서열은 프로모터를 포함할 수 있다.
겔(Gel): 액체와 고체 사이의 물질 상태이며 일반적으로 액체 매체에서 팽창 된 가교 고분자 네트워크로 정의된다. 전형적으로, 겔은 고체 및 액체 모두를 함유하는 2개의 상 콜로이드 분산액이고, 여기서 고체의 양은 "sol"로 지칭되는 2개의 상 콜로이드 분산액에서의 양보다 크다. 따라서 "겔"은 액체의 일부 속성(즉, 모양이 탄력 있고 변형 가능)과 고체의 속성 중 일부를 가진다(예를 들어, 모양이 2차원에서 3차원을 유지하기에 충분하도록 이산되어 있음). "겔화 시간(Gelation time)"이라고도 하는 "겔 시간(gel time)"은 조성이 적당한 스트레스 하에서 비유동성(non-flowable)이되는 데 걸리는 시간을 의미한다.
신경초종(Glioma): 신경 교세포에서 발생하는 종양. 신경교종에는 상직근종(ependymomas), 성상세포종(astrocytomas), 희소돌기세포종(oligodendrogliomas), 뇌간신경교종(brainstem gliomas), 시신경 신경교종(optic nerve gliomas) 및 혼합 신경교종(mixed gliomas)이 포함된다. 신경교종은 등급에 따라 특징지어질 수 있다. 세계 보건기구(WHO)는 신경교종을 I-IV로 분류한다. 저등급 신경교종(WHO 등급 II)은 분화가 잘 되어(퇴행성(anaplastic)이 아님), 양성 경향을 보이며 일반적으로 예후가 좋다. 그러나 시간이 지남에 따라 재발하고 등급이 증가할 수 있으므로 악성(malignant)으로 분류된다. 고급(WHO 등급 III-IV) 신경교종은 미분화 또는 퇴행성(anaplastic)이다. 고급 신경교종은 악성(malignant)이며 예후가 좋지 않다. 신경교종은 천막상(supratentorial)[대뇌 내 천막(tentorium) 위, 주로 성인에서 발견됨] 천막하(infratentorial)(대뇌 내 천막 위, 주로 어린이에게서 발견됨), 또는 뇌교(pontine)[뇌간의 뇌교(pons)에 위치]에서 나타난다. 신경교종의 증상은 종양이 중추 신경계 내에서 어디에 영향을 받는지에 달려 있다. 두뇌 신경교종의 증상은 두통, 구토, 발작 및 뇌신경 장애이다. 시신경 신경교종의 증상은 시각적 손실이다. 척수 신경교종의 증상은 말단의 통증, 허약 또는 무감각이다. 일반적으로 신경교종은 뇌척수액을 통해 퍼지고 척수에 "전이(drop metastases)"를 일으킬 수 있다.
성장 인자(Growth factor): 세포 성장, 생존 및/또는 분화를 촉진시키는 물질. 성장 인자는 성장 촉진제(마이토젠)로서 기능하는 분자, 세포 이동을 자극하는 성장 억제제(예: 음성 성장 인자) 인자, 화학주성 제제로 작용하거나 종양 세포의 세포이동 또는 침투를 억제하는 인자, 세포의 분화된 기능을 조절하는 인자, 세포 사멸에 관여하는 인자, 또는 성장 및 분화에 영향을 미치지 않으면서 세포의 생존을 촉진하는 인자로서 기능하는 분자를 포함한다. 성장 인자의 예는 섬유 아세포 성장 인자(예를 들어, FGF-2), 표피 성장 인자(EGF), 섬모 신경 영양 인자(CNTF) 및 신경 성장 인자(NGF) 및 actvin-A이다.
질병의 억제(또는 치료): 질병이나 상태의 완전한 발달을 억제하거나, 치유를 촉진한다. "치료"는 질병 또는 병리학적 상태의 증상 또는 징후를 개선시키기위한 치료적 개입을 의미한다. 본 명세서에서 질병 또는 병리학적 상태와 관련하여 용어 "개선"은 치료의 관찰 가능한 유익한 효과를 나타낸다. 유익한 효과는 예를 들어 감수성이 있는 대상에서 질병의 임상 증상의 발병이 지연되거나, 통증, 회복 시간의 단축 또는 개선과 같은 질병의 일부 또는 모든 임상 증상의 중증도의 감소에 의해 입증 될 수 있고, 피험자의 전반적인 건강 또는 복지에서, 또는 특정 질환에 특유한 당업계에 널리 공지된 다른 매개 변수에 의해 결정될 수 있다.
분리된(Isolated): "분리된" 생물학적 성분(핵산, 단백질 세포 또는 나노소낭과 같은)은 생물체 또는 ECM의 세포에서 다른 생물학적 성분으로부터 실질적으로 분리 또는 정제되었고, 상기 겅분은 자연적으로 발생한다. "분리된" 핵산 및 단백질에는 표준 정제방법으로 정제된 핵산 및 단백질이 포함된다. 분리된 나노소낭은 ECM의 섬유성 물질로부터 제거된다. 이 용어는 또한 화학적으로 합성된 핵산뿐만 아니라 숙주 세포에서의 재조합 발현에 의해 제조된 핵산 및 단백질을 포함한다.
표지(Label): 검출을 용이하게 하기 위해, 항체 또는 단백질과 같은 다른 분자에 직접 또는 간접적으로 접합되거나, 또는 나노소낭에 포함되거나 또는 나노소낭에 부착될 수 있는 검출 가능한 화합물 또는 조성물. 표지의 특정적이고 제한되지 않는 예는 형광 태그, 효소 결합 및 방사성 동위 원소를 포함한다.
대식세포(Macrophage): 백혈구의 한 유형으로 세포 찌꺼기, 이물질, 미생물 및 암세포를 탐식하고 분해한다. 식세포(phagocytosis)에서의 역할 외에도 이 세포들은 발달, 조직 유지 및 수리, 그리고 림프구와 같은 면역 세포를 비롯한 다른 세포를 모집하고(recruit) 영향을 주는 타고난 면역 및 적응 면역 모두에서 중요한 역할을 한다. 대식세포는 M1 및 M2로 지칭되는 표현형을 포함하여 많은 표현형에 존재할 수 있다. 주로 염증(pro-inflammatory) 기능을 수행하는 대식세포를 M1 대식 세포(CD86+/CD68+)라고 하며, 염증을 줄이고 조직 수복을 조장하고 조절하는 대식세포를 M2 대식세포(CD206+/CD6 +)라고 한다. 대식세포의 다양한 표현형을 식별하는 마커는 종에 따라 다르다. 마크로파지 표현형은 M1과 M2의 극한 사이의 스펙트럼으로 표현된다.
포유동물(Mammal): 이 용어는 인간과 사람이 아닌 포유동물을 포함한다. 유사하게, "개체(subject)"라는 용어는 인간 및 가축(veterinary) 대상을 모두 포함한다.
전이(Metastasis): 신체의 한 위치에서 다른 위치로 암이 퍼진다. 전이는 암세포가 원래 종양 부위를 떠나 혈류, 림프계, 대뇌 척수 또는 연장을 통해 이동하는 일련의 복잡한 단계에 의해 발생한다.
마이크로 RNA: 길이가 약 17 내지 약 25 뉴클레오티드 염기인 작은 비코딩 RNA(small non-coding RNA)로서, 전형적으로 표적 mRNA 번역을 억제함으로써 유전자 발현을 사후-전사적(post-transcriptionally)으로 조절한다. miRNA는 음성 조절 자로서 기능할 수 있어 특정 miRNA의 양이 많을수록 표적 유전자 발현 수준이 낮아진다. miRNA는 초기 miRNA(pri-miRNA), 조기 miRNA(pre-miRNA) 및 성숙 miRNA 세 가지 형태로 나뉜다. 초기 miRNAs(pri-miRNAs)는 약 수백 개 ~ 1kb 이상의 줄기-루프(stem-loop) 구조의 전사물로 발현된다. pri-miRNA 전사체는 Drosha라 불리는 RNase II 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 의해 핵내에서 절단되어 줄기 루프 기저부 근처의 줄기의 두 가닥을 절단한다. Drosha는 3' 말단에 5' 인산염(phosphate)과 2개의 뉴클레오티드 오버행(overhang)을 남긴 채 엇갈림 컷으로 RNA 이중을 절단한다. 절단 산물인 조기 miRNA(pre-miRNA)는 약 60 내지 약 110 뉴클레오타이드 길이이고, 헤어핀 구조는 폴드-백(fold-back) 방식으로 형성된다. Pre-miRNA는 Ran-GTP와 Exportin-5에 의해 핵에서 세포질로 이동한다. Pre-miRNAs는 Dicer라고 불리는 또 다른 RNase II 엔도뉴클레아제(endonuclease)에 의해 세포질에서 추가적으로 처리된다. Dicer는 5' 인산염 및 3' 오버행을 인식하고, 줄기-루프 교차점에서 루프를 절단하여 miRNA 이중 가닥을 형성한다. miRNA 이중 가닥은 RNA 유도성 사일런싱 복합체(RISC)에 결합하며, 여기서 안티센스 가닥은 우선적으로 분해되고 센스 가닥 성숙한 miRNA는 RISC를 표적 부위로 향하게 한다. 성숙한 miRNA는 miRNA의 생물학적 활성 형태이며 길이가 약 17 내지 약 25 뉴클레오티드이다.
나노소낭(Nanovesicle): 직경이 약 10 nm에서 약 1,000 nm 인 나노입자인 세포외 소포. 나노소낭은 다른 분자 중에서 생물학적으로 활성인 신호분자(예: 마이크로 RNA, 단백질)를 운반하는 지질막 결합 입자이다. 일반적으로, 나노소낭은 지질 이중층에 의해 제한되고, 생물학적 분자가 동봉되고 및/또는 이중층에 내장될 수 있다. 따라서, 나노소낭은 원형질막(plasma membrane)으로 둘러싸인 루멘(lumen)을 포함한다. 상이한 형태의 소낭은 세포외 기질 또는 분비물과 같은, 직경, 세포내 기원(subcellular origin), 밀도, 형태, 침강 속도(sedimentation rate), 지질 조성, 단백질 마커, 핵산 함량 및 기원에 따라 구별될 수 있다. 나노소낭은 ECM(위 참조) 및/또는 miR 함유량으로부터 매트릭스가 결합된 나노소낭과 같은 같이, 그 기원에 따라 확인될 수 있다.
"엑소좀(exosome)"은 세포에 의해 분비되는 막질의 소포이며 직경이 10 ~ 150 nm이다. 일반적으로 말기 엔도좀(late endosomes) 또는 다소포체(multivesicular bodies)는 한정된 엔도솜 막에서부터 봉입된 나노소낭까지 소포의 내향 발아(inward budding) 및 절단(scission)에 의해 형성되는 루멘 내부 소포(intralumenal vesicles)를 함유한다. 이러한 루멘 내부 소포는 원형질막과 융합하여 외포작용(exocytosis) 동안, 일반적으로 혈액, 뇌척수액이나 타액과 같은 체액으로 다소포체 루멘에서 세포외 환경으로 방출된다. 엑소좀은 막의 세그먼트가 함입하고(invaginates) 흡수될 때 세포 내로 생성된다. 더 작은 소포로 부서지면서 궁극적으로 세포에서 배출되는 내재화된 부분은 mRNA와 miRNA와 같은 단백질과 RNA 분자를 포함한다. 혈장 유래 엑소좀은 대부분 리보좀 RNA가 부족하다. 세포외 기질 유래 엑소좀은 특정 miRNA 및 단백질 성분을 포함하며, 혈액, 소변, 타액, 정액 및 뇌척수액과 같은 거의 모든 체액에 존재하는 것으로 나타났다.
"ECM으로부터 유래한 나노소낭", "매트릭스가 결합된 나노소낭" 또는 "ECM 유래 나노소낭"은 세포외 기질에 존재하는 10 nm-1000 nm 크기의 막결합 입자이고, 세포 행동에 영향을 미치는 단백질, 지질, 핵산, 성장 인자 및 사이토카인과 같은 생물학적으로 활성 신호 분자를 포함한다. 용어는 서로 바꿔서 사용할 수 있으며 동일한 소포를 지칭한다. 이 나노소낭은 ECM 안에 묻혀 있으며 ECM에 결합되어 있고, 단순히 표면에 부착되어 있지 않다. 이러한 나노소낭은 동결 융해 및 펩신, 엘라스타제(elastase), 히알루로니다제(hyaluronidase), 프로테이나제 K 및 콜라게나제와 같은 단백질분해효소로 융해 및 절단, 및 계면활성제(detergents)로 절단하는 것과 같은 내성이 강한 분리조건이다. 일반적으로, 이들 나노소낭은 miR-145 및, miR-181, miR-143 및 miR-125 중 선택적으로 풍부하게 한다. 이 나노소낭은 CD63 또는 CD81을 발현하지 않거나 이들 마커를 간신히 검출할 수 있다(CD63loCD81lo). ECM은 조직으로부터의 ECM일 수 있고, 배양된 세포로부터 생산될 수 있고, 또는 상업적 공급원으로부터 구입될 수 있다.
핵산(Nucleic acid): 포스포디에스테르(phosphodiester) 결합, 관련된 자연 발생 구조 변이체, 및 이들의 합성 비천연 발생 유사체를 통해 연결된 뉴클레오타이드 단위(리보 뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오티드, 관련된 자연 발생형 구조 변이체 및 합성된 비자연 발생형 유사체)로 구성된 중합체. 따라서, 이 용어는 뉴클레오티드 중합체를 포함하는데, 여기서 뉴클레오타이드 및 이들 사이의 결합은 이에 한정되지 않으나, 예를 들어 포스포로티오에이트(phosphorothioates), 포스포로아미데이트(phosphoramidates), 메틸포스포네이트(methyl phosphonates), 키랄-메틸포스포네이트(chiral-methyl phosphonates), 2-O-메틸리보뉴클레오티드(2-O-methyl ribonucleotides), 펩타이드-핵산(PNA) 등과 같이, 비자연적으로 발생하는 합성 아날로그를 포함한다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 자동 DNA 합성기를 사용하여 합성할 수 있다. 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 전형적으로 약 50개 이하의 뉴클레오타이드를 갖는 짧은 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 뉴클레오타이드 서열이 DNA 서열(즉, A, T, G, C)에 의해 나타낼 때, 이것은 또한 "U"가 치환 된 RNA 서열(즉, A, U, G, C)을 포함한다.
통상적인 표기법이 뉴클레오타이드 서열을 기술하기 위해 본원에서 사용된다: 단일가닥 염기서열의 좌단은 5'-말단이고; 이중가닥 염기서열의 좌측 방향을 5'-방향이라 한다. 초기 RNA 전사체에 뉴클레오티드를 5'에서 3' 방향 추가를 전사 방향이라고 한다. mRNA와 동일한 서열을 갖는 DNA 가닥은 "코딩가닥(coding strand)"으로 불린다. 관심서열의 5'에 위치한 핵산 서열상의 서열은 "상류서열(upstream sequences)"로 지칭되며, 관심 서열에 3'에 위치하는 뉴클레오타이드 서열은 "하류서열(downstream sequences)"로 언급된다.
"암호화(encoding)"는 정의된 뉴클레오타이드 서열(예를 들어, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산 서열 및 그로부터 생기는 생물학적 특성을 갖는 생물학적 과정에서, 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는, 유전자, cDNA 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오타이드 내의 특정 뉴클레오타이드 서열의 고유한 특성을 지칭한다. 따라서 유전자에 의해 생성된 mRNA의 전사와 번역이 세포 또는 다른 생물 시스템에서 단백질을 생성한다면 유전자는 단백질을 암호화한다. mRNA 서열과 동일하고 일반적으로 서열목록에서 제공되는 뉴클레오타이드 서열 및 유전자 또는 cDNA의 전사를 위한 주형으로 사용되는 비-코딩 가닥은 그 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 산물을 암호화함으로써 언급될 수 있다. 달리 명시하지 않는 한, "아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로의 디제너레이스 형태이고 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 단백질과 RNA를 암호화하는 염기서열은 인트론(introns)을 포함할 수 있다.
"재조합 핵산(Recombinant nucleic acid)"은 야생형 유전자와 같이 함께 자연적으로 결합되지 않은 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 의미한다. 이는 적절한 숙주세포를 형질전환하는데 사용될 수 있는 증폭되거나 조립된 핵산을 포함하는 핵산 벡터를 포함한다. 일례에서, 재조합 핵산은 자연 발생적이지 않은 서열을 갖는 것이거나 그렇지 않으면 분리된 2개의 서열의 인위적인 조합에 의해 만들어진 서열을 갖는 것이다. 이러한 인위적 조합은 종종 화학 합성 또는 보다 일반적으로 유전자 공학 기술에 의한 것과 같이 핵산의 분리된 단편의 인공조작에 의해 달성된다. 재조합 핵산을 포함하는 숙주세포는 "재조합 숙주 세포"라고 불린다. 재조합 핵산은 비암호화 기능(예를 들어, 프로모터, 복제 기점, 리보솜 결합 부위 등)을 제공할 수 있다.
제1서열은 그의 서열이 제2서열인 폴리뉴클레오티드와 특이적으로 혼성화되는 경우 제2서열에 대한 "안티센스"이다. 따라서 두 서열은 상보적이다.
작동 가능하게 연결된(Operably linked): 제1핵산서열은 제1핵산서열이 제2핵산서열과 기능 관계에 놓일 때 제2핵산서열과 작동 가능하게 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 코딩서열의 전사 또는 발현에 영향을 주면 프로모터는 코딩 서열에 작동 가능하게 연결된다. 일반적으로, 작동 가능하게 연결된 DNA 서열은 연속적이며, 필요한 경우 두 개의 단백질 코딩영역을 동일한 판독 프레임에서 결합시킨다.
약학적으로 허용 가능한 담체(Pharmaceutically acceptable carriers): 약학적으로 허용되는 담체는 통상적이다. Remington's Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition, 1975는 본원에 개시된 융합 단백질의 약학 전달에 적합한 조성물 및 제형을 기술한다. 일반적으로, 담체의 성질은 사용되는 특정 투여 방식에 의존할 것이다. 예를 들어, 비경구용 제형은 통상적으로 비히클(vehicle)로서 물, 생리 식염수, 평형 염용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등과 같은 약학적으로 및 생리학적으로 허용 가능한 유체를 포함하는 주사 가능한 유체를 포함한다. 고체 조성물(예: 분말, 환제, 정제 또는 캡슐형태)의 경우, 통상적인 무독성 고체 담체는 예를 들어 약학 등급의 만니톨, 락토오스, 전분 또는 마그네슘 스테아레이트(magnesium stearate)를 포함할 수 있다. 물학적으로 중성인 담체 이외에, 투여될 약제 조성물은 소량의 비독성 보조물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 방부제 및 pH 완충제 등, 예를 들어 아세트산 나트륨(sodium acetate) 또는 소르비탄 모노라우레이트(sorbitan monolaurate)를 함유할 수 있다.
중합체(Polymer): 호모 폴리머(homopolymers), 블록 코폴리머(block copolymers), 랜덤 코폴리머 및 그라프트 코폴리머(graft copolymers)를 포함한 반복 모노머 유닛으로 구성된 분자. "중합체"는 선형 중합체뿐만 아니라, 고도로 분지된, 수지상(dendritic) 및 스타 중합체(star polymers)를 포함하는 분지형 중합체를 포함한다. "중합 개시제(polymerizing initiator)"는 자유 라디칼 생성에 의해 단량체 또는 거대 단량체의 중합을 개시할 수 있는 임의의 물질 또는 자극을 의미한다. 예시적인 중합 개시제는 전자기 방사선, 열 및 화학적 화합물을 포함한다.
폴리 펩타이드(Polypeptide): 길이 또는 번역 후 변형(예: 당화 또는 인산화)에 상관없이 모든 아미노산 사슬. "잔기(residue)"는 아미드 결합 또는 아미드 결합 모방체에 의해 폴리 펩타이드에 혼입된 아미노산 또는 아미노산 유사체를 지칭하며, 잔기의 "위치(position)"는 아미노산 서열에서의 위치를 나타낸다. 폴리펩티드는 아미노 터미널(N-터미널) 말단 및 카복시 터미널 말단을 갖는다. 폴리펩티드에서의 보존적 치환은 폴리펩티드의 생물학적 또는 생화학적 기능의 변화 또는 손실을 초래하지 않는 유사한 생화학적 특성을 갖는 아미노산에 대한 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함하는 변형이다. 이러한 보존적 치환은 생성된 단백질의 활성에 최소한의 영향을 미칠 수 있다. 표 1은 단백질의 원래 아미노산을 대체할 수있는 아미노산을 나타내며 보존적 치환으로 간주된다.
본래 잔기(Original Residue) 보존적 치환(Conservative Substitutions)
Ala ser
Arg lys
Asn gln; his
Asp glu
Cys ser
Gln asn
Glu asp
Gly pro
His asn; gln
Ile leu; val
Leu ile; val
Lys arg; gln; glu
Met leu; ile
Phe met; leu; tyr
Ser thr
Thr ser
Trp tyr
Tyr trp; phe
Val ile; leu
성장인자 또는 사이토카인과 같은 단백질의 생화학적 기능을 변화시키지 않으면서 하나 이상의 보존적 변화 또는 최대 10개의 보존적 변화(예를 들어, 2개의 치환된 아미노산, 3개의 치환된 아미노산, 4개의 치환된 아미노산 또는 5개의 치환된 아미노산 등)가 폴리 펩타이드에서 이루어질 수 있다.질병 예방 또는 치료: 질병을 "예방"하는 것은 암과 같은 질병의 경향이 있는 것으로 알려진 환자에게 질병의 부분적 또는 전체적 발달을 억제하는 것을 의미한다. 경향이 있는 사람의 예로는 가족 중 유방암의 병력이 있거나, 대상이 흑색 종과 같은 상태에 쉽게 걸릴 수 있는 요인에 노출된 사람이다. "치료"는 질병 또는 병리학적 상태의 증상 또는 징후를 개선시키기 위한 치료적 개입을 의미한다. 몇몇 실시 양태에서, 치료는 종양의 크기의 감소, 전이의 수 및/또는 크기의 감소, 또는 종양의 증상의 감소를 지칭한다.
증식(Proliferation): 세포 분열시 세포의 수는 증가한다. 세포 분열 과정을 유사분열(mitosis)이라고 한다.
프로모터(Promoter): 프로모터는 핵산의 전사를 지시하는 핵산 제어 서열의 배열이다. 프로모터는 전사 개시부위 부근에 필요한 핵산서열, 예를 들면, 중합 효소 II 타입 프로모터의 경우, TATA 요소를 포함한다. 프로모터는 선택적으로 전사의 개시위치로부터 수천 염기쌍만큼 떨어진 부위에 위치할 수 있는 말단 인핸서(distal enhancer) 또는 리프레서 요소(repressor elements)를 또한 포함한다. 구성적 및 유도성 프로모터가 모두 포함된다(Bitter et al., Methods in Enzymology 153 : 516-544, 1987 참조).
프로모터의 특이적이고 비제한적인 예는 포유 동물 세포(예: 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터) 또는 포유류 바이러스(예: 레트로 바이러스 긴 말단 반복, 아데노 바이러스 후기 프로모터, 우두 바이러스 7.5K 프로모터)의 게놈으로부터 유도된 프로모터를 포함한다. 재조합 DNA 또는 합성 기술에 의해 생산된 프로모터도 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 숙주의 삽입된 유전자 서열의 효율적인 전사를 촉진하는 프로모터 서열을 함유하는 발현 벡터에 삽입될 수 있다. 발현 벡터는 전형적으로 복제 기점, 프로모터, 및 형질전환된 세포의 표현형 선택을 허용하는 특정 핵산서열을 함유한다.
스캐폴드(Scaffold): 일반적으로 세포의 부착 및 증식에 적합한 표면을 제공하고 또한 안정성 및 지지력을 제공하는 생체 적합성 물질을 포함하는 구조물. 스캐폴드는 증식하는 세포의 집단에 의해 가정된 3차원 형상 또는 형태에 영향을 미치거나 한계를 정하기 위해 특정 모양 또는 형태일 수 있다. 이러한 형상 또는 형태는 필름(예를 들어, 제3치수보다 실질적으로 큰 2차원을 갖는 형태), 리본, 코드, 시트, 편평한 디스크, 실린더, 구 및 비정질 형상을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 스캐폴드는 분해 과정에서 생체 활성 분자를 방출하는 ECM 스캐폴드와 같은 생체 활성 분자를 방출하는 유도성 템플릿(inductive templates) 역할을 할 수 있다.
줄기세포(Stem cell): 하나 이상의 주어진 세포 유형(cell type)의 완전히 차별화된 기능성 세포를 생성할 수 있는 자가 재생성(self-renewing) 세포. 생체 내에서 줄기 세포의 역할은 동물의 정상적인 생활 동안 죽거나 파괴된 세포를 대체하는 것이다. 일반적으로 줄기세포는 제한없이 분화할 수 있으며 전능성(totipotent)이다. 분열 후에 줄기세포는 줄기세포로 남아 있거나, 전구세포가되거나, 또는 최종 분화를 진행할 수 있다. 일반적으로, 전구세포는 분열할 수 있고 다능성(pluripotent)일 수 있다. 분화 후에, 전구 세포는 전구세포로 남아 있거나, 최종 분화를 진행할 수 있다. "체세포 전구 세포(somatic precursor cell)"는 인간과 같은 동물의 몸체로부터 적어도 하나의 주어진 세포 유형의 완전히 분화된 기능세포를 생성할 수 있는 세포이다. 신경 전구세포는 완전히 분화된 신경세포, 예컨대 아드레날린 또는 콜린성 뉴런을 생성할 수 있지만 이에 국한되지는 않는다. 조혈 줄기세포는 혈액 세포를 생성한다.
치료 유효량: 치료되는 대상에서 원하는 효과를 얻기에 충분한 양의 특정 물질, 예를 들어 나노소낭. 피험자에게 투여될 때, 시험관 내 효과를 달성하는 것으로 나타난, 표적 조직 농도(예를 들어, 뼈에서)를 달성할 투약량이 일반적으로 사용될 것이다.
이식(Transplanting): 나노소낭과 같은 생체 적합성 기질을 필요로 하는 대상에 배치.
종양(Tumor): 양성(benign) 또는 악성(malignant)일 수 있는 세포의 비정상적인 성장. 종양의 악성 타입은 비정상적이거나 통제되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진다. 악성 종양과 관련된 다른 특징으로는 전이, 인접 세포의 정상 기능 간섭, 비정상적인 수준에서의 사이토카인 또는 기타 분비물의 방출, 염증 또는 면역 반응의 억제 또는 악화, 림프절(lymph nodes) 등과 같은 주변 조직 또는 원거리 조직 또는 기관의 침범을 포함한다. "전이성 질환"은 원래 종양 부위를 떠나 예를 들어 혈류 또는 림프계를 통해 신체의 다른 부위로 이동한 암 세포를 의미한다.
개인의 종양의 양은 종양의 수, 부피 또는 무게로 측정할 수 있는 "종양 부담(tumor burden)"이다. 주변 조직을 침범하거나 전이될 수 있는 종양을 "악성 종양(malignant)"이라고 한다. 혈액 종양의 예로는 급성 백혈병(acute leukemias)(예: 11q23 양성 급성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 급성 골수성 백혈병 및 골수강세포, 전골수성세포, 골수괴사성세포, 단핵세포 및 적혈구혈증), 만성 백혈병(chronic leukemias)(만성 골수성(과립구) 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 만성 림프구성 백혈병), 다혈성 빈혈(polycythemia vera), 림프종(lymphoma), 호지킨병(Hodgkin's disease), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)(무통 및 높은 등급 형태), 다발성 골수종(multiple myeloma), 월데스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia), 중쇄 질환(heavy chain disease), 골수 이형성 증후군(myelodysplastic syndrome), 털이있는 세포 백혈병(hairy cell leukemia) 및 골수 이형성증(myelodysplasia)을 포함하는 백혈병이 포함된다.
육종(sarcomas) 및 암종(carcinomas)과 같은 고형 종양의 예로는, 섬유 육종(fibrosarcoma), 점액 육종(myxosarcoma), 지방 육종(liposarcoma), 연골 육종(chondrosarcoma), 골육종 육종(osteogenic sarcoma) 및 기타 육종, 윤활종(synovioma), 중피종(mesothelioma), 유잉 종양(Ewing's tumor), 평활근 육종(leiomyosarcoma), 횡문근 육종(rhabdomyosarcoma), 대장 암종(colon carcinoma), 림프성 악성 종양(lymphoid malignancy), 췌장암(pancreatic cancer), 유방암(기저유방암, 관암종(ductal carcinoma) 및 소엽성 유암(lobular breast carcinoma)을 포함), 폐암, 난소암, 전립선암, 간세포 암종, 편평세포 암종, 기저세포 암종(basal cell carcinoma), 선암종(adenocarcinoma), 땀샘 암종(sweat gland carcinoma), 갑상선 수질 암종(medullary thyroid carcinoma), 유두 갑상선암종(papillary thyroid carcinoma), 갈색세포종 피지선 암종(pheochromocytomas sebaceous gland carcinoma), 유두상 암종(papillary carcinoma), 유두선암(papillary adenocarcinomas), 수질 암종(medullary carcinoma), 기관지 암종(bronchogenic carcinoma), 신장세포 암종(renal cell carcinoma), 간암(hepatoma), 담도 암종(bile duct carcinoma), 융모 암종(choriocarcinoma), 윌 름 종양(Wilms' tumor), 자궁 경부암(cervical cancer), 고환 종양(testicular tumor), 정상피종(seminoma), 방광암(bladder carcinoma) 및 중추 신경계(CNS) 종양[예: 신경교종, 성상 세포종(astrocytoma), 수모세포종(medulloblastoma), 두개 인두종(craniopharyrgioma), 뇌실막 종양(ependymoma), 혈관종(pinealoma), 혈관 모세포종(hemangioblastoma), 뇌신경 세포종(acoustic neuroma), 희소돌기아교세포종(oligodendroglioma), 수막종(meningioma), 흑색종(melanoma), 신경 모세포종(neuroblastoma) 및 망막 모세포종(retinoblastoma)]이 있다. 하나의 비제한적인 예로, 종양은 신경교종이다.
한외여과(Ultrafiltration): 힘(압력 또는 농도 구배와 같은)이 반투과막을 통해 분리되는 멤브레인 여과 유형. 한외여과막은 전형적으로 막의 분자량 차단(molecular weight cut off; MWCO)을 특징으로 한다. 물과 저분자량의 용질(solutes)이 침투되어 막을 통과하는 동안, 고형물과 고분자량의 용질이 잔류물에 유지된다. 상이한 유형의 모듈을 한외여과 공정에 사용될 수 있다. 이러한 모듈의 예는, 플라스틱 또는 종이 튜브의 내부에 주조된 중합체 막을 사용하는 관형 요소이며; 다중 중공 섬유를 포함하는 중공사 디자인; 편평한 멤브레인 시트가 중앙 천공 튜브 둘레에 감겨지고 관형 강철 압력 용기 케이싱에 끼워지는 얇은 그물 스페이서 재료에 의해 분리되는 나선형 감기 모듈(spiral wound modules); 및 여과액이 통과하는 매쉬형 물질로 분리된 평판 상에 배치된 막을 사용하는 판 및 프레임 조립체를 포함한다.
벡터(Vector): 숙주세포에 도입되어 형질전환된 숙주세포를 생산할 수 있는 핵산 분자. 벡터는 복제기점과 같은 숙주세포에서 복제를 허용하는 핵산서열을 포함할 수 있다. 벡터는 또한 하나 이상의 선택 가능한 마커 유전자 및 당업계에 공지된 다른 유전 요소를 포함할 수 있다. 벡터는 아데노 바이러스, 레트로 바이러스 또는 렌티 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터일 수 있다. 벡터는 Sleeping Beauty plasmid 또는 Prince Charming plasmid와 같은 비바이러스성 벡터일 수 있다.
다르게 설명되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시 내용이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 단수의 용어 "a", "an" 및 "the"는 문맥에 달리 명시되어 있지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 마찬가지로 "A 또는 B"는 문맥 상 달리 명시하지 않는 한 "A", "B" 및 "A 및 B"를 포함한다. 달리 명시하지 않는 한, "약(about)"은 5% 이내를 나타낸다. 핵산 또는 폴리펩타이드에 대해 주어진 모든 기본 크기 또는 아미노산 크기 및 모든 분자량 또는 분자량 값은 근사치이며 설명을 위해 제공되는 것으로 이해해야 한다. 여기에 기술된 것과 유사한 또는 동등한 방법 및 물질이 본원의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질은하기에 기술된다. 용어 "함유하다(comprises)"는 "포함한다(includes)"를 의미한다. 본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허출원, 특허 및 기타 참고문헌은 그 전체가 참고문헌으로 인용된다. 충돌이 있는 경우 용어의 설명을 포함하여 본 명세서가 우선한다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 단지 예시적인 것이며 제한하려는 것은 아니다.
세포외 기질(ECM)로부터 추출한 나노소낭
본 명세서에서는 나노소낭이 세포외 기질에 매립되어 있음을 개시하고 있다. 이러한 나노소낭은 분리될 수 있고 생물학적으로 활성이다. 따라서, 이러한 나노소낭은 단독으로 또는 다른 ECM과 함께 치료 목적으로 사용될 수 있다. 이 나노소낭은 단독으로 또는 다른 ECM으로 생물학적 스캐폴드에 사용될 수 있다. 이러한 나노소낭은 또한 세포의 증식, 분화 및 또는 이동을 변화시키는 것과 같은 시험관 내에서 사용된다.
세포외 기질은 구조 단백질, 특이 적 단백질, 프로테오글리칸, 글리코사미노글리칸 및 포유동물 조직 내에서 세포를 둘러싸고 지지하는 성장인자를 포함하는, 구조적 및 기능적 생체분자 및/또는 생체 고분자의 복합 혼합물이며, 무세포이다. 일반적으로, 개시되는 매트릭스가 결합된 나노소낭들은 임의의 유형의 세포외 매트릭스(ECM)에 내장되며, 이 위치로부터 분리될 수 있다. 따라서, 개시되는 매트릭스가 결합된 나노소낭들은 ECM의 표면 상에 분리 가능하게 존재하지 않는다.
세포외 매트릭스는 예를 들어 제한없이, 미국특허 제 4,902,508호; 4,956,178; 5,281,422; 5,352,463; 5,372,821; 5,554,389; 5,573,784; 5,645,860; 5,771,969; 5,753,267; 5,762,966; 5,866,414; 6,099,567; 6,485,723; 6,576,265; 6,579,538; 6,696,270; 6,783,776; 6,793,939; 6,849,273; 6,852,339; 6,861,074; 6,887,495; 6,890,562; 6,890,563; 6,890,564; 및 6,893,666;에 개시되고, 이들 각각은 그 전체가 참고로 포함된다. 그러나, ECM은 임의의 조직 또는 ECM이 배양된 세포에 의해 생성되고 네이티브 ECM의 하나 이상의 중합체 성분(구성요소)을 포함하는 임의의 시험관 출처로부터 제조될 수 있다. ECM 제제(preparations)는 세포가 공급원 조직이나 배양물에서 제거되었음을 의미하는 "탈세포화(decellularized)" 또는 "무세포(acellular)"로 간주될 수 있다.
일부 실시양태에서, ECM은 척추 동물, 예를 들어 인간, 원숭이, 돼지, 소, 양 등을 포함하나 이에 한정되지 않고, 포유류 척추 동물로부터 분리된다. ECM은 비뇨기 방광, 내장, 간, 심장, 식도, 비장, 위 및 진피를 포함하는 모든 기관 또는 조직으로부터 유래될 수 있다. 특정 제한적이지 않은 실시예에서, 세포외 기질은 식도 조직(esophageal tissue), 요로 방광(urinary bladder), 소장 점막하층(small intestinal submucosa), 진피(dermis), 제대혈(umbilical cord), 심낭(pericardium), 심장 조직(cardiac tissue) 또는 골격근(skeletal muscle)으로부터 분리된다. ECM은 예를 들어 및 제한없이, 점막하층(submucosa), 상피 기저막(epithelial basement membrane), 고유막(tunica propria) 등을 포함하는 기관으로부터 수득된 임의의 부분 또는 조직을 포함할 수 있다. 하나의 비 한정적인 실시양태에서, ECM은 방광(urinary bladder)으로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, ECM은 종양 조직으로부터 유래한다.
ECM은 기저막(basement membrane)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 다른 비한정적인 실시양태에서, ECM은 기저막의 적어도 일부를 포함한다. ECM 물질은 모세혈관 내피세포 또는 섬유세포와 같은 원래 조직을 포함하는 세포요소의 일부를 보유할 수도 있고 보유하지 않을 수도 있다. 일부 실시양태에서, ECM은 기저막 표면 및 비기저막 표면 모두를 함유한다.
하나의 비한정적인 실시양태에서, ECM은 돼지 방광 주머니(또한 방광 매트릭스 또는 UBM으로 알려져 있음)로부터 수확된다. 간단히 말하면, ECM은 돼지와 같은 포유류에서 방광 조직을 제거하고 지방 조직을 포함하는 잔여 외부 결합 조직을 제거함으로써 준비된다. 모든 잔여 뇨는 수돗물을 반복적으로 사용하여 제거된다. 조직은 우선 조직을 상피화 용액, 예를 들어 제한없이 고장식염수(hypertonic saline)(예: 1.0 N 식염수)에 10분 내지 4시간 동안 침지시킴으로써 박리된다. ㄱ고장식염수 용액에 노출은 밑에 있는 기저막에서 상피 세포를 제거한다. 선택적으로, 칼슘 킬레이트제(calcium chelating agent)를 식염수에 첨가할 수 있다. 초기 박리 과정 후에 남아있는 조직은 상피 기저막 및 상피 기저막으로부터 루멘에서 먼(abluminal) 조직층을 포함한다. 상대적으로 연약한 상피 기저막은 내강 표면의 기계적 마모에 의해 항상 손상되고 제거된다. 이 조직은 다음으로 대부분의 루멘으로부터 먼 조직(abluminal tissues)을 제거하지만 상피성 기저막과 고유막(tunica propria)를 유지하기 위해 추가 치료를 받게된다. 외측의 혈청(outer serosal), 외벽(adventitial), 중막 근막(tunica muscularis mucosa), 점막하조직(tunica submucosa) 및 대부분의 근막 점막(muscularis mucosa)은 기계적 마모에 의해 또는 효소 처리(예를 들어, 트립신 또는 콜라게나아제)의 조합에 의한 수화 및 마모에 의해 나머지 상피 조직으로부터 제거된다. 이러한 조직의 기계적 제거는, 예를 들어 Adson-Brown forceps 및 Metzenbaum scissors로 장간막 조직을 제거하고, 젖은 거즈로 싸인 외과용 핸들(scalpel handle) 또는 다른 단단한 물체로 종방향으로 닦는 동작을 사용하여 근층(tunica muscularis) 및 점막하조직(tunica submucosa)을 닦아낸다. 레이드, 레이저 및 기타 조직 분리 방법을 포함하는 자동화된 로봇 절차도 고려된다. 이러한 조직이 제거된 후, 생성된 ECM은 주로 상피 기저막과 그 아래에 있는 고유막(tunica propria)으로 구성된다.
또 다른 실시양태에서, ECM은 외과용 핸들 및 젖은 거즈로 종방향으로 닦는 동작을 통해, 돼지의 방광 조직을 연마하여 장막(tunica serosa) 및 근층(tunica muscularis) 모두를 포함하는 외층을 제거함으로써 제조된다. 조직 절편의 외전에 따라, 점막(tunica mucosa)의 루멘 부분(luminal portion)은 동일한 닦는 동작을 사용하여 밑에 있는 조직으로부터 박리된다. 점막하 조직의 천공을 예방하기 위해주의를 기울인다. 이 조직을 제거한 후, 결과로 생긴 ECM은 주로 점막하조직(tunica submucosa)으로 구성된다(미국특허 제 9,277,999 호의 도 2 참조, 이는 본원에 참조로써 포함됨).
ECM은 또한 분말로서 제조될 수 있다. 이러한 분말은 문헌 [Gilbert et al., Biomaterials 26 (2005) 1431-1435]의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 본원에서 그 전체가 참고 문헌으로 인용된다. 예를 들어, UBM 시트는 동결 건조된 다음 액체 질소에 담그기 위해 작은 시트로 절단된다. 그런 다음 냉동된 물질을 분쇄하여 파티클이 ECM이 분쇄된 회전식 칼 분쇄기에 놓일만큼 충분히 작도록 할 수 있다. 유사하게, ECM 조직 내에 NaCl을 침전시킴으로써, 재료는 균질한 크기의 입자로 파쇄되어 급속 동결, 동결 건조 및 분말화될 수 있다.
하나의 비한정적인 실시양태에서, ECM은 소장 점막하층 또는 SIS로부터 유도된다. 시판되는 제제는 SURGISIS™, SURGISIS-ES™, STRATASIS™ 및 STRATASIS-ES™(Cook Urological Inc., Indianapolis, IN) 및 GRAFTPATCH™(Organogenesis Inc .; Canton Mass.)를 포함 하나 이에 한정되지 않는다. 또 다른 비한정적인 실시양태에서, ECM은 진피로부터 유도된다. 상업적으로 입수 가능한 제제는 PELVICOL™(미국의 PERMACOL™, Bard, Covington, GA), REPLIFORM™(Microvasive, Boston, MA) 및 ALLODERM™ (LifeCell, Branchburg, NJ) 등이 있다. 또 다른 실시 양태에서, ECM은 방광으로부터 유래된다. 상업적으로 입수 가능한 제제는 UBM(ACell Corporation; Jessup, MD)을 포함 하나 이에 한정되지 않는다.
나노소낭은 하기 개시된 방법을 사용하여 세포외 기질로부터 유도(방출)될 수 있다. 일부 실시양태에서, ECM은 펩신, 콜라게나아제, 엘라스타아제, 히알루로니다아제 또는 프로테이나아제 K와 같은 효소로 절단되고, 나노소낭은 분리된다. 다른 실시양태에서, 나노소낭은 글리신 HCL, 시트르산, 수산화 암모늄과 같은 용액으로 pH를 변화시킴으로써, 예컨대 EDTA, EGTA와 같은 킬레이트제의 사용으로 이온강도에 의해 ECM으로부터 방출되고 분리되며, 염화칼슘(KCl), 염화나트륨, 염화 마그네슘, 요오드화 나트륨, 티오시안산 나트륨과 같은 염을 사용하거나, 또는 구아니딘 HCl 또는 우레아와 같은 변성 조건에 ECM을 노출시킴으로써 카오트로픽 효과(chaotropic effects)를 나타낼 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노소낭은 그들의 자연 환경에 있지 않으며, 따라서 천연 나노소낭과 상이한 특성을 갖는다. 특정 실시예에서, 나노소낭은 펩신, 엘라스타아제, 히알루론산 분해효소(hyalunornidase), 프로테이나나제 K, 염 용액 또는 콜라게나아제와 같은 효소로 ECM을 절단한 후에 제조된다. ECM은 동결-해동(freeze-thawed)되거나 기계적 분해될 수 있다.
일부 실시양태에서, CD63 및/또는 CD81의 발현은 나노소낭상에서 검출될 수 없다. 따라서, 나노소낭은 CD63 및/또는 CD81을 발현하지 않는다. 특정 실시예에서, CD63 및 CD81은 나노소낭 상에서 검출될 수 없었다. 다른 실시양태에서, 나노소낭은 웨스턴블롯으로 검출 가능한 CD63 및 CD81의 거의 발현되지 않는 수준을 발현한다. 이 나노소낭은이 CD63loCD81lo이다. 당업자는 예를 들어 CD63 및 CD81에 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 CD63loCD81lo인 나노소낭을 용이하게 확인할 수 있다. 형광 표지된 세포분류(FACS) 및 형광 표지된 항체와 같은 절차를 사용하여 CD63 및 CD81의 저함량 및 고함량에 대한 임계값을 결정함으로써 이러한 마커의 낮은 수준을 설정할 수 있다. 개시된 나노소낭은 생물학적 유체 내 나노소낭의 존재로 인해 ECM의 표면에 일시적으로 부착될 수 있는 나노소낭과는 상이하다. 일부 실시양태에서, 나노소낭의 외부 표면은 효소 및/또는 계면활성제의 사용을 포함할 수있는 탈세포화 공정을 거친다.
특정 실시양태에서, 상기 나노소낭은 하나 이상의 miRNA를 포함한다. 특정 비제한적인 실시예에서, 상기 나노소낭은 miR-145 및 miR-181을 포함한다. MiR-145 및 miR-181은 당업계에 공지되어 있다. miR-145 핵산서열은 MiRbase Accession No. MI0000461에 제공되며, 본 명세서에 참고로 인용된다. miR-145 핵산서열은 CACCUUGUCCUCACGGUCCAGUUUCCCAGGAAUCCCUUAGAUGCUAAGAUGGGGAUUCCUGGAAAUACUGUUCUUGAGGUCAUGGU(서열번호 1)이다. miR-181 핵산 서열은 miRbase Accession No. MI0000269로 제공되며, 이는 본원에 참고로 인용된다. miR-181 핵산 서열은 AGAAGGGCUAUCAGGCCAGCCUUCAGAGGACUCCAAGGAACAUUCAACGCUGUCGGUAGAGUUUGGGAUUGAGAAAAAACCACUGACCGUUGACUGUACCUUGGGGUCCUUA(서열번호 2)이다.
본원에 개시된 나노소낭은 약학 전달용 조성물로 제제화될 수 있으며, 하기에서 논의되는 바와 같이 바이오스캐폴드(bioscaffold) 및 장치에 사용된다. 나노소낭은 아래에 개시된 여러 가지 방법에 사용된다.
ECM으로부터 나노소낭의 분리
ECM으로부터 나노소낭을 분리하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 일부 실시양태에서, 이들 방법은 효소로 ECM을 절단하여 절단된 ECM을 생성시키는 것을 포함한다. 특정 실시양태에서, ECM은 펩신, 엘라스타제, 히알루로니다제, 콜라게나아제 및/또는 프로테이나아제 K로 절단된다. 다른 실시양태에서, ECM은 계면활성제로 처리된다. 추가의 실시양태에서, 상기 방법은 효소의 사용을 포함하지 않는다. 특정 비제한적인 실시예에서, 상기 방법은 염화칼륨과 같은, 염과 같은 나노소낭을 분리하기 위해 카오트로픽제 또는 이온 강도를 이용한다. 추가의 실시양태에서, ECM은 나노소낭을 분리하기 전에 나노소낭 함량을 증가시키도록 조작될 수 있다.
일부 실시양태에서, ECM은 효소로 절단된다. ECM은 약 12 내지 약 48시간, 예컨대 약 12 내지 약 36시간 동안 효소로 절단될 수 있다. ECM은 효소로 약 12시간, 약 24시간 동안, 약 36 또는 약 48시간 동안 절단될 수 있다. 하나의 특정 비제한적인 실시예에서, ECM은 실온에서 효소로 절단된다. 그러나, 절단 약 4℃ 또는 약 4℃ 내지 25℃의 온도에서 발생할 수 있다. 일반적으로 ECM은 콜라겐 원섬유를 제거하기에 충분한 시간 및 온도에서 효소로 절단된다. 절단 과정은 조직의 출처에 따라 달라질 수 있다. 선택적으로, ECM은 효소로 절단하기 전 또는 후에 동결 및 해동에 의해 처리된다. ECM은 이온성 및/또는 비이온성 계면활성제로 처리할 수 있다.
그런 다음 절단된 ECM을 원심분리와 같은 처리를 하여 섬유가 없는 상층액을 분리한다. 일부 실시양태에서 절단된 ECM은 예를 들어 약 300 내지 약 1000 g의 제1단계 원심분리한다. 따라서, 절단된 ECM은 약 400 g 내지 약 750 g, 예컨대 약 400 g, 약 450 g, 약 500 g 또는 약 600 g에서 원심분리될 수 있다. 이러한 원심 분리는 약 10분 내지 약 15분 동안, 예컨대 약 10분 내지 약 12분 동안, 예컨대 약 10분, 약 11분, 약 12분, 약 14분, 약 14분 또는 약 15분 동안 수행할 수 있다. 절단 ECM을 포함하는 상층액이 수집된다.
일부 실시양태에서, 절단된 ECM은 또한 약 2000 g 내지 약 3000 g에서 제2단계 원심분리될 수 있다. 따라서, 절단된 ECM은 약 2,000 g, 2,500 g, 2,750 g 또는 3,000 g과 같이, 약 2,500 g 내지 약 3,000 g으로 원심분리될 수 있다. 이러한 원심분리는 예컨대 약 20 내지 약 25분 동안, 예컨대 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29 또는 약 30분과 같이, 약 20 내지 약 30분 동안 수행될 수 있다. 절단된 ECM을 포함하는 상층액이 수집된다.
추가의 실시양태에서, 절단된 ECM은 약 10,000 내지 약 15,000 g에서 제3단계 원심분리될 수 있다. 따라서, 절단된 ECM은 약 10,000 g, 11,000 g 또는 12,000 g과 같이 약 10,000 g 내지 약 12,500 g으로 원심분리될 수 있다. 이러한 원심분리는 예를 들어 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34, 약 35, 약 36, 약 37, 약 38, 약 39 또는 약 40분과 같이, 약 25 내지 약 40분 동안, 약 25 내지 약 30분 동안 수행될 수 있다.
이러한 원심분리 단계 중 제1단계, 제2단계 또는 세 단계 모두가 독립적으로 이용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세 가지 원심분리 단계가 모두 이용된다. 원심분리 단계는 2, 3, 4 또는 5회 반복될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 모든 세 가지 원심분리 단계가 3번 반복된다. 절단된 ECM을 포함하는 상층액이 수집된다.
일부 실시양태에서, 절단된 ECM은 약 500 g에서 약 10분 동안 원심분리되고, 약 2,500 g에서 약 20분간 원심분리되고 및/또는 약 30분 동안 약 10,000 g에서 원심분리된다. 세 단계와 같은 이 단계는 2회, 3회, 4회 또는 5회 반복되며, 예를 들어 3회이다. 따라서, 하나의 비한정적인 실시예에서, 절단된 ECM은 약 500 g에서 약 10분간 원심분리되고, 약 2,500 g에서 약 20분간 원심분리되고, 약 30분 동안 약 10,000 g에서 원심분리된다. 이 세 단계를 3회 반복한다. 따라서, 섬유가 없는 상층액이 생성된다.
그런 다음 섬유가 없는 상층액을 원심분리하여 나노소낭을 분리한다. 일부 실시양태에서, 섬유가 없는 상층액은 약 100,000 g 내지 약 150,000 g에서 원심분리된다. 따라서, 섬유가 없는 상층액은 약 100,000 g 내지 약 125,000g, 예컨대 약 100,000 g, 약 105,000 g, 약 110,000 g, 약 115,000 g 또는 약 120,000 g에서 원심분리된다. 이러한 원심분리는 약 60 내지 약 90분, 예컨대 약 70 내지 약 80분, 예를 들어 약 60, 약 65, 약 70, 약 75, 약 80, 약 85 또는 약 90분 동안 수행할 수 있다. 하나의 비제한적인 실시예에서, 섬유가 없는 상등액은 약 70,000분 동안 약 100,000 g에서 원심분리된다. 고체 물질이 수집되며 이는 나노소낭이다. 그런 다음 이러한 나노소낭은 한정되지 않으나, 버퍼와 같은 관심있는 담체에서 재현탁될 수 있다.
추가의 실시양태에서, ECM은 효소로 절단되지 않는다. 이러한 방법에서, ECM은 인산 완충 식염수와 같은 등장성 식염수에 현탁된다. 이어서, 염의 최종 농도가 약 0.1 M보다 커지도록 현탁액에 염을 첨가한다. 농도는 예를 들어, 약 3 M 이하, 예를 들어, 약 0.1 M 염 내지 약 3 M, 또는 약 0.1 M 내지 약 2 M 일 수 있다. 염은 예를 들어 약 0.1 M, 0.15 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.7 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M, 0.9 M, 1.0 M, 1.1 M, 1.2 M, 1.3 M, 1.4 M, 1.5 M, 1.6 M, 1.7 M, 1.8 M, 1.9 M 또는 2 M이다. 일부 비제한적인 실시예에서, 염은 염화칼륨, 염화나트륨 또는 염화마그네슘이다. 다른 실시양태에서, 염은 염화나트륨, 염화마그네슘, 요오드화 나트륨, 티오시안산 나트륨, 나트륨염, 리튬염, 세슘염 또는 칼슘염이다.
일부 실시양태에서, ECM은 약 10분 내지 약 2시간, 예컨대 약 15분 내지 약 1시간, 약 30분 내지 약 1시간 또는 약 45분 내지 약 1시간 동안 염 용액에 현탁된다. ECM은 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115 또는 120 분 동안 염 용액에서 현탁될 수 있다. ECM은 한정되지 않으나 약 4℃ 내지 약 25 또는 약 4℃ 내지 약 37℃와 같이, 4℃ 내지 50℃의 온도에서 염 용액에서 현탁될 수 있다. 특정 비한정적인 실시예에서, ECM은 약 4℃에서 염 용액에 현탁된다. 다른 특정 비제한적인 실시예에서, ECM은 약 25℃(실온)에서 염 용액에 현탁된다. 추가의 비제한적 실시예에서, ECM은 약 37℃에서 염 용액에 현탁된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 세포외 기질을 약 0.4 M 초과의 염 농도에서 배양하는 단계; 절단된 세포외 기질을 원심분리하여 콜라겐 섬유 잔사를 제거하고, 상등액을 분리하는 단계; 상등액을 원심분리하여 고체 물질을 분리하는 단계; 및 고체 물질을 담체에 현탁시킴으로써, 세포외 기질로부터 나노소낭을 단리하는 단계를 포함한다.
염 용액에서 배양한 후, ECM을 원심분리하여 콜라겐 섬유를 제거한다. 일부 실시양태에서, 절단된 ECM은 또한 약 2000 g 내지 약 5000 g에서 원심분리될 수 있다. 따라서, 절단된 ECM은 약 2,500 g 내지 약 4,500 g, 예컨대 약 2,500 g, 약 3,000 g, 약 3,500 g, 약 4,000 g 또는 약 4,500 g으로 원심분리될 수 있다. 하나의 특정 비제한적인 실시예에서, 원심분리는 약 3,500 g이다. 이러한 원심분리는 약 20 내지 약 40 분, 예를 들어 약 25 내지 약 35분 동안, 예를 들어 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30 분, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34 또는 약 35분 동안 수행될 수 있다. 그 후, 상등액을 수집한다.
추가의 실시양태에서, 그 후 상청액은 약 100,000 내지 약 150,000 g의 제3 단계 원심분리될 수 있다. 따라서, 절단된 ECM은 약 100,000 g, 110,000 g 또는 120,000 g과 같이, 약 100,000 g 내지 약 125,000 g으로 원심분리될 수 있다. 이러한 원심분리는 약 30분 내지 약 2.5시간 동안, 예를 들어 약 1시간 내지 약 3시간 동안, 예를 들어 약 30분, 약 45분, 약 60분, 약 90분 또는 약 120분(2 시간) 동안 수행될 수 있다. 고체 물질을 수집하고 용액, 예컨대 완충 식염수에 현탁시켜 나노소낭을 분리시킨다.
또 다른 실시양태에서, ECM은 이에 한정되지 않으나, 인산완충 식염수와 같은 등장성 완충염 용액에 현탁된다. 원심분리 또는 다른 방법을 사용하여 큰 입자를 제거할 수 있다(아래 참조). 그런 다음, 약 10 nm 내지 약 10,000 nm 사이, 예를 들어 약 10 nm 내지 약 300 nn 사이의 입자와 같은, 약 10 nm 내지 약 10,000 nm 사이의 입자인 ECM으로부터 매트릭스에 결합된 나노소낭을 분리하기 위해 한외 여과가 이용된다.
특정 비제한적인 실시예에서, 등장성 완충 식염수 용액은 약 0.164 mM의 총 염 농도 및 약 7.2 내지 약 7.4의 pH를 갖는다. 일부 실시양태에서, 등장성 완충 식염수 용액은 0.002 M KCl 내지 약 0.164 M KCl, 예컨대 약 0.0027 M KCl(인산 완충 식염수 중의 KCL 농도)를 포함한다. 그런 다음 이 현탁액을 초원심분리로 처리한다.
등장성 완충 염 용액에서 배양한 후, ECM을 원심분리하여 콜라겐 섬유를 제거한다. 일부 실시양태에서, 절단된 ECM은 또한 약 2000 g 내지 약 5000 g에서 원심분리될 수 있다. 따라서, 절단된 ECM은 약 2,500 g 내지 약 4,500 g, 예컨대 약 2,500 g, 약 3,000 g, 약 3,500 g, 약 4,000 g 또는 약 4,500 g으로 원심분리될 수 있다. 하나의 특정 비제한적인 실시예에서, 원심분리는 약 3,500 g이다. 이러한 원심분리는 약 20 내지 약 40분, 예를 들어 약 25 내지 약 35분 동안, 예를 들어 약 20, 약 21, 약 22, 약 23, 약 24, 약 25, 약 26, 약 27, 약 28, 약 29, 약 30 분, 약 31, 약 32, 약 33, 약 34 또는 약 35 분 동안 수행될 수 있다.
미세여과(microfiltration) 및 원심분리를 사용하여 현탁액으로부터 큰 분자량 물질을 제거할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 200 nm 이상과 같은 큰 크기의 분자 물질이 미세여과를 사용하여 제거된다. 다른 실시양태에서, 큰 크기의 물질은 원심분리의 사용에 의해 제거된다. 제3의 실시양태에서, 미세여과 및 초원심분리는 큰 분자량 물질을 제거하는데 사용된다. 약 10,000 nm 초과, 약 1,000 nm 초과, 약 500 nm 초과 또는 약 300 nm 초과와 같은 물질과 같이 큰 분자량 물질은 현탁된 ECM으로부터 제거된다. 그런 다음 미세여과 또는 상등액의 유출물(effluent)을 한외여과한다. 따라서, 약 10,000 nm 미만, 약 1,000 nm 미만, 약 500 nm 미만, 또는 약 300 nm 미만의 입자를 포함하는 유출물이 수집되어 이용된다. 이 유출물은 분자량 컷오프(MWCO)가 3,000 내지 100,000인 막으로 한외여과한다. 본 실시예에서는 100,000MWCO가 사용되었다.
사용 방법
엑소좀과 같은 나노소낭은 특정 표적 세포에 방향성을 가지며 멤브레인의 물리적 특성에 의존한다. 따라서 나노소낭은 내용물을 전달하는 데 사용할 수 있다. 또한, 매트릭스가 결합된 나노소낭은 세포의 증식, 분화 및 이동을 유도하는데 사용될 수 있다. 그들은 또한 미분화 상태에서 세포를 유지하는데 사용될 수 있다. 개시된 나노소낭의 효과는 국부적, 국소적 또는 전신적일 수 있다. 따라서, 이러한 나노소낭은 시험관 내 및 생체 내에서 모두 사용된다.
엑소좀과 같은 나노소낭은 특정 mRNA, miRNA 및 단백질을 풍부하게 한다(Bobrie, et al., 2011). 소낭이 간질 내에 있는 동안 이 화물은 프로테이나아제 및 RNase에 의한 분해로부터 보호되며 수용 세포에 의해 일단 흡수되면 생체 활성을 유지한다. 이런 방식으로 유전자 발현에 기초한 개별 세포에 제한되는 상호 신호 전달 및 효소 활성의 전달을 촉진한다(Lee, et al., 2011).
ECM 유래의 나노소낭은, 한정되지 않지만 RNA 및 DNA를 포함하는 내용물을 수용체 세포에 전달하는데 사용될 수 있다. 이러한 분자는 내재적(endogenous)일 수 있으며, 또는 분자 기술을 사용하여 ECM 유래 나노소낭에 도입될 수 있다.
특정 실시양태에서, ECM 유래의 나노소낭은 핵산 분자 또는 단백질과 같은 치료제가 담지될 수 있다. 이들은 외인성 핵산, 예를 들어 단백질을 암호화하는 핵산에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 ECM로 유도된 나노소낭에 혼입될 수 있다. 관심의 대상이 되는 핵산 분자의 혼입을 달성하기 위해, 다음의 사용 방법이 있지만 이에 제한되지는 않는다;(참조로 본원에 개시된 미국 공개 특허출원 제 2015/0216899호 참조):
(a) 일렉트로 포레이션(Electroporation). 이 방법으로, 100-200 V/cm의 전기장으로 잠깐 충격을 줌으로써 나노소낭에 다수의 구멍이 만들어진다. DNA/RNA는 전기장에 의해 만들어진 구멍을 통해 들어갈 수 있다.
(b) 리포펙션(Lipofection). 이 방법은 일반적으로 형질감염(transfection)이라고하며, 원하는 유전체 구조를 포함하고 있는 매우 작은 소포를 통해 DNA/RNA로 나노소낭을 변형시키는데 사용할 수 있다. 소포는 막과 융합되며 (배지의 상단에 있는 두 개의 기름 얼룩이 융합되는 것과 유사) 소포의 내용물과 세포가 결합된다. 시장에는 사용 준비가 된 다수의 형질전환 키트가 있다; 예를 들어, Panomics의 DELIVERX™ siRNA Transfection Kit(카탈로그 번호 DX0002), Roche의 FUGENE® HD Transfection Reagent(카탈로그 번호 04709691001), Invitrogen의 LIPOFECTAMINE™ 2000(카탈로그 번호 11668-027).
(c) 열 충격(heat shock)을 이용한 형질전환(transformation). Ca2+(CaCl2)와 같은 2가 양이온의 존재 하에서 나노소낭을 냉각시키면 멤브레인이 RNA 또는 DNA 플라스미드 또는 조각이 투과할 수 있게 된다. 나노소낭은 DNA와 함께 잠시 열 충격(42℃에서 30-120초 동안)으로 배양하며, 이는 DNA가 나노소낭으로 들어가게 한다. 이 방법은 응축된 원형 플라스미드 DNA에 효과적일 수 있으며, 엑소좀성(exosomal) 또는 지질성(lipid) 나노소낭 성분에 효과가 있을 수 있다.
일부 실시양태에서, 절단된 ECM 유래의 나노소낭(매트릭스가 결합된 나노소낭)은 핵산 또는 단백질 분자와 같은 외부적으로 첨가된 치료제로 로딩될 수 있다. 핵산은 siRNA, miRNA 또는 mRNA와 같은, DNA 또는 RNA일 수 있다. 특정 측면에서, 분리된 엑소좀은 miRNA를 포함할 수 있다. miRNA는 예를 들어, miR-145 및/또는 miR-181의 추가적인 양일 수 있다. ECM 유래 나노소낭은 단백질, 성장 인자 또는 작은 분자로 로딩될 수 있다.
일부 실시양태에서, 나노소낭은 RNA/DNA를 함유하도록 조작되거나 목적 유전자를 함유하도록 변형될 수 있으며, 분리되어 그의 수용체 세포로 전달되어 그의 생물학적 기능 또는 생존에 영향을 미칠 수 있다. 결과적으로, 나노소낭은 그 내용물을 표적 세포의 세포질로 전달할 수 있으며, 이는 표적 세포에서 특정 단백질로의 mRNA 번역으로 이어진다. 또한, 나노소낭은 특정 유전자의 번역을 조절할 수 있는 마이크로 RNA 및 siRNA와 같은 작은 코딩(small coding) 및 비코딩(non-coding) RNA를 운반 및 전달할 수 있다.
일부 실시양태에서, 핵산은 폴리펩타이드를 암호화한다. 적합한 폴리펩타이드는 성장인자, 효소, 사이토카인 또는 호르몬을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 적절한 성장 인자로는 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 렐락신(relaxin); 프로렐락신; 난포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체 형성 호르몬(LH)과 같은 당단백 호르몬; 간 성장인자; 프로스타글란딘, FGF-α 및 FGF-β와 같은 섬유아세포 성장인자(FGF); 프로락틴(prolactin); 태반락토겐(placental lactogen), 종양 괴사 인자; 뮬러(mullerian)-억제 물질; 마우스 성선 자극 호르몬(gonadotropin) 관련 펩타이드; 인히빈(inhibin); 액틴; 혈관내피 성장인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장인자; 혈소판 성장인자; TGF-α 및 TGF-β와 같은 형질전환 성장인자(TGFs); 인슐린 유사 성장인자-I 및 -II; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도인자; 인터페론-α, β 및 γ와 같은 인터페론; 대식세포-CSF(M-CSF)와 같은 콜로니 자극인자(CSF); 과립구-대식세포-CSF(GM-CSF); 과립구-CSF(G-CSF); IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12; IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, LIF, G-CSF, GM-CSF, M-CSF, EPO, kit-ligand, FLT-3 또는 MDA-7 등의 인터루킨(IL)을 포함한다. 호르몬의 예는 성장 호르몬, 프로락틴, 태반 락토겐, 황체 형성 호르몬, 난포 자극 호르몬, 융모성 성선 자극 호르몬, 갑상선 자극 호르몬, 렙틴, 부신피질 자극 호르몬, 안지오텐신 I, 안지오텐신 II, 베타-엔돌핀 글루카곤, 베타-멜라닌세포 자극 호르몬, 콜레시스토키닌(cholecystokinin), 엔도셀린(endothelin) I, 갈라닌(galanin), 위 억제 펩티드(gastric inhibitory peptide), 글루카곤, 인슐린, 리포트로핀(lipotropins), 뉴로피신(neurophysins), 소마토스타틴(somatostatin), 칼시토닌(calcitonin), 칼시토닌 유전자 관련 펩타이드, 베타-칼시토닌 유전자 관련 펩타이드, 악성 종양의 고칼슘혈증(hypercalcemia), 부갑상선 호르몬 호르몬 관련 단백질, 부갑상선 호르몬 관련 단백질, 글루카곤 유사 펩티드, 판크레아스타틴(pancreastatin), 췌장 펩티드, 펩티드 YY, PHM, 세크레틴(secretin), 혈관활동 장 펩티드, 옥시토신, 바소프레신(vasopressin), 바소토신(vasotocin), 엔케팔린아미드(enkephalinamide), 메르포르핀아미드(metorphinamide), 알파 멜라닌세포 자극 호르몬, 심방 나트륨 이뇨 인자(atrial natriuretic factor), 아밀린, 아밀로이드 P 성분, 코르티코트로핀 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출인자, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 펩타이드 Y, 물질 K, 물질 P 및 갑상선 호르몬 방출 호르몬을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 적합한 효소는 ACP 불포화 효소(desaturase), ACP 히드록실라제(hydroxylase), ADP-포도당 피로포릴레이즈(ADP-glucose pyrophorylase), ATPase, 알코올 탈수소 효소, 아밀라아제, 아밀로글루코시다제, 카탈라아제, 셀룰라아제, 시클로옥시게나제, 디카르복실라아제, 덱스트리나아제, 에스테라제, DNA 중합효소, RNA 중합효소, 히아루론 신타아제(hyaluron synthase), 갈락토시다제, 글루카나아제, 글루코스 옥시다제, GTP 효소, 헬리카아제(helicase), 헤미셀룰라아제, 히알루로니다제, 인테그라아제(integrase), 인베르타아제(invertase), 이성화 효소(isomerase), 키나아제, 락타아제, 리파아제, 리폭시게나아제(lipoxygenase), 리아제(lyase), 리소자임, 펙틴에스테르(pectinesterase), 퍼옥시다아제, 포스파타제, 포스포리파아제, 포스포릴라아제, 폴리갈락투로나아제, 프로티나아제, 펩티다아제, 풀룰라나아제(pullulanase), 재조합 효소, 역전사 효소, 토포이소머라아제, 크실라아나제 또는 리포터 유전자를 포함한다.
일부 실시양태에서, ECM 유래의 나노소낭은 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학적 조성물에 포함될 수 있으며, 당업자에게 공지된 임의의 방법에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 정맥 내(intravenously), 비강 내(nasally), 피내(intradermally), 동맥 내(intraarterially), 복강 내(intraperitoneally), 병변 내(intralesionally), 두개 내(intracranially), 관절 내(intraarticularly), 인공 호흡기 내(intraprostaticaly), 늑막 내(intrapleurally), 기관지 내(intratracheally), 유리체강 내(intravitreally), 질내(intravaginally), 직장 내(intrarectally), 국소적으로(topically), 종양 내로(intratumorally), 근육 내(intramuscularly), 피하(subcutaneously), 결막 하(subconjunctival), 소포내(intravesicularlly), 점막으로(mucosally), 심막 내(intrapericardially), 복강 내(intraumbilically), 안구 내(intraocularally), 구강으로(orally), 국소적으로, 국부적으로, 주사, 주입, 연속 주입, 표적 세포를 직접 담그는 국부화된 관류, 카테터를 통해, 장기 세척을 통해, 심장 챔버에 직접적으로, 기관 또는 기관의 일부 또는 관심 있는 질병 부위에 직접 주입되거나, 다른 방법 또는 이들 방법의 임의의 조합에 의해 수행될 수 있다. 국소 투여는 화학 요법으로 유도한 탈모증 또는 기타 피부 과증식 장애를 예방하기 위해 암과 같은 피부의 치료에 특히 유리할 수 있다. 다르게는, 정위(orthotopic), 피내(intradermal), 피하, 근육 내, 복강 내 또는 정맥 내 주사에 의한 투여일 수 있다.
생체 내 사용에 있어서, 조성물은 생리학적으로 허용되는 담체, 완충제 또는 다른 부형제를 포함하는 약학적으로 허용 가능한 조성물로서 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 액체로 제형화된다. 다른 실시양태에서, 조성물은 겔 또는 분말로 제형화된다. 다른 실시양태에서, 조성물은 분무기에서와 같이 분무로 제형화된다. 추가의 실시양태에서, 조성물은 겔 또는 시간-방출 캡슐로서 제제화될 수 있다. 폐의 상태를 치료하기 위해 에어로졸 전달을 사용할 수 있다. 에어로졸의 부피는 일반적으로 약 0.01 ml 내지 약 0.5 ml이다.
개시된 방법은 약, 적어도 약, 또는 많아도 약 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 15.5, 16.0, 16.5, 17.0, 17.5, 18.0, 18.5, 19.0, 19.5, 20.0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 410, 420, 425, 430, 440, 445, 450, 460, 470, 475, 480, 490, 500, 510, 520, 525, 530, 540, 550, 560, 570, 575, 580, 590, 600, 610, 620, 625, 630, 640, 650, 660, 670, 675, 680, 690, 700, 710, 720, 725, 730, 740, 750, 760, 770, 775, 780, 790, 800, 810, 820, 825, 830, 840, 850, 860, 870, 875, 880, 890, 900, 910, 920, 925, 930, 940, 950, 960, 970, 975, 980, 990, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500, 3600, 3700, 3800, 3900, 4000, 4100, 4200, 4300, 4400, 4500, 4600, 4700, 4800, 4900, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000 나노그램(ng), 마이크로그램(mcg), 밀리그램(mg)의 나노소낭 또는 그로부터 유도될 수 있는 임의의 범위를 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 수치는 또한 ng/kg, μg/kg, mg/kg 또는 g/kg로 표시되는 환자의 체중 및 이들 값으로부터 유도할 수 있는 임의의 범위에 기초하여 환자에게 투여되는 투여량일 수 있다.
다르게, 조성물은 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8, 2.9, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3, 3.4, 3.5, 3.6, 3.7, 3.8, 3.9, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.1, 5.2, 5.3, 5.4, 5.5, 5.6, 5.7, 5.8, 5.9, 6.0, 6.1, 6.2, 6.3, 6.4, 6.5, 6.6, 6.7, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5, 7.6, 7.7, 7.8, 7.9, 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.1, 9.2, 9.3, 9.4, 9.5, 9.6, 9.7, 9.8, 9.9, 10.0, 10.5, 11.0, 11.5, 12.0, 12.5, 13.0, 13.5, 14.0, 14.5, 15.0, 15.5, 16.0, 16.5, 17.0, 17.5, 18.0, 18.5, 19.0, 19.5, 20.0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260, 265, 270, 275, 280, 285, 290, 295, 300, 305, 310, 315, 320, 325, 330, 335, 340, 345, 350, 355, 360, 365, 370, 375, 380, 385, 390, 395, 400, 410, 420, 425, 430, 440, 441, 450, 460, 470, 475, 480, 490, 500, 510, 520, 525, 530, 540, 550, 560, 570, 575, 580, 590, 600, 610, 620, 625, 630, 640, 650, 660, 670, 675, 680, 690, 700, 710, 720, 725, 730, 740, 750, 760, 770, 775, 780, 790, 800, 810, 820, 825, 830, 840, 850, 860, 870, 875, 880, 890, 900, 910, 920, 925, 930, 940, 950, 960, 970, 975, 980, 990, 1000 ng/ml, μg/ml, mg/ml, 또는 g/ml의 나노소낭의 농도, 또는 그 중에서 유도할 수 있는 임의의 범위를 가질 수 있다. 투여량은 치료될 상태에 따라 다양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 상태는 탈장(hernia), 찢어진 또는 손상된 근육, 찢어진 또는 손상된 힘줄, 또는 뇌졸중이다.
조성물은 대상체에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20회 이상, 또는 그로부터 유도될 수 있는 임의의 범위, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24시간 마다 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7일 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5주 마다, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12개월 마다, 또는 그로부터 유도될 수 있는 임의의 범위로 투여될 수 있다. 상기 조성물은 1 일 1회, 1일 2회, 1일 3회, 1일 4회, 1일 5회, 또는 매일 6회(또는 거기에서 유도될 수 있는 임의의 범위) 및/또는 필요에 따라 환자에게 투여될 수 있다. 다르게는, 조성물은 환자에게 2, 4, 6, 8, 12 또는 24시간마다(또는 그로부터 유도될 수 있는 임의의 범위) 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 증상을 경험한 후에 특정 기간동안 또는 특정 투여횟수로 조성물을 투여한다.
대상에게 투여된 조성물의 실제 투여량은 신체적 및 생리학적 인자, 예컨대 체중, 상태의 중증도, 치료되는 질병의 유형, 사전적 또는 동시의 치료적 개입, 환자의 특발성 및 투여 경로로 정해질 수 있다. 투여에 책임이 있는 종사자는 어떤 경우에도 조성물 내 활성 성분의 농도 및 개별 대상에 대한 적절한 용량을 결정할 것이다. 일부 실시양태에서, 상태는 탈장, 찢어진 또는 손상된 근육, 찢어진 또는 손상된 힘줄 또는 뇌졸중이다.
개시된 방법에 사용하기 위한 ECM 유도 나노소낭을 포함하는 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체에 적합하게 함유된다. 담체는 비독성이고, 생체 적합성이며, 나노소낭의 생물학적 활성에 유해한 영향을 미치지 않도록 선택된다. ECM 유래 나노소낭은 고체, 반고체, 겔, 액체 또는 기체 형태의 국소 전달(즉, 골격근 또는 다른 조직과 같은 신체의 특정 위치) 또는 전신 전달을 위한 제형, 정제, 캡슐, 산제, 과립제, 연고제, 용액제제, 보관제, 흡입제 및, 경구, 비경구 또는 외과적 투여를 위한 주사제와 같이 제제화될 수 있다. 조성물의 국부 투여는 의료 장치를 코팅함으로써 적절하다(하기 참조). 추가의 활성성분, 예를 들어 화학요법제(하기 참조)가 이들 조성물에 첨가될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. ECM 유래 나노소낭은 또한 폴리프로필렌 메쉬 또는 임의의 생체 적합성 물질과 같은 표면에 부착될 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
주사(injectable), 주입(infusion) 또는 관개(irrigation) 및 국소 전달을 통한 비경구 전달에 적합한 담체는 증류수, 생리학적 인산염 완충 식염수, 정상 또는 젖산 링거 용액, 덱스트로스 용액, 행크 용액 또는 프로판디올을 포함한다. 또한, 무균의 고정된 오일은 용매 또는 현탁 매질로서 사용될 수 있다. 이 목적을 위해 합성 모노- 또는 디-글리세라이드를 포함한 모든 생체적합성 오일을 사용할 수 있다. 또한, 올레산과 같은 지방산은 주사제의 제조에 사용된다. 담체 및 제제는 액체, 현탁액, 중합성 또는 비중합성 겔, 페이스트 또는 연고로서 배합될 수 있다.
담체는 또한 약제의 전달을 유지(즉, 연장, 지연 또는 조절)하거나 약제의 전달, 섭취, 안정성 또는 약동학을 향상시키기 위한 전달 비히클(delivery vehicle)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 사용하는 조성물은 제한 없이 완충액, 하이드로겔, 방부제 및/또는 안정화제를 포함한다. 이러한 제제는 조성물 중의 ECM 유래 나노소낭의 보다 긴 반감기를 제공할 수 있다. 상기 조성물은 또한 화학 화합물, 핵산분자, 폴리펩타이드, 성장인자, 사이토카인 또는 소분자와 같은, 관심있는 임의의 추가 치료제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 일부 실시양태에서, 치료제는 마이크로 RNA 또는 단백질이다.
약학적 조성물은 히드록시프로필셀룰로오스(hydroxypropylcellulose)와 같은 계면 활성제(surfactant)를 포함할 수 있다. 분산액은 또한 글리세롤, 액체 폴리에틸렌글리콜, 및 이들의 혼합물 및 오일에서 제조될 수 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건 하에서 이러한 제제에는 미생물의 성장을 막기 위한 방부제가 함유되어 있다. 상기 조성물은 액체 용액(liquid solutions) 또는 현탁액(suspensions)으로서 주사 가능한 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 또한 액체의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태일 수 있다. 상기 조성물은 겔일 수 있다. 이들 제제는 또한 유화될 수 있다.
전형적인 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다. 예를 들어, 조성물은 인산완충식염수 1 ml 당 10 mg 미만, 10 mg 미만, 25 mg 미만, 50 mg 미만 또는 약 100 mg 미만의 인간혈청알부민을 함유할 수 있다. 다른 약학적으로 허용 가능한 담체는 염, 방부제, 완충제 등을 포함하는 수용액, 비독성 부형제를 포함한다.
비수성(non-aqueous) 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 기름 및 에틸올레에이트(ethyloleate)와 같은 주사용 유기 에스테르가 있다. 수성 담체는 물, 알콜성/수성 용액, 식염수 용액, 비경구제, 예컨대 염화나트륨, 링거 덱스트로즈 등을 포함한다. 정맥 비히클은 유체 및 영양 보충제(replenishers)를 포함한다. 방부제에는 항균제, 항진균제, 항산화제, 킬레이트제 및 불활성 가스가 포함된다. 약학적 조성물의 다양한 성분의 pH 및 정확한 농도는 잘 알려진 파라미터에 따라 조정된다.
경구 투여를 위한 제형은 예를 들어 약학적 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로스, 탄산 마그네슘 등과 같은 전형적인 부형제를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 용액, 현탁액, 정제, 환제, 캡슐제, 서방형 제제 또는 분말의 형태를 취한다.
특정 실시양태에서, 조성물은 자가(autologous) 조성물일 수 있고 또는 치료될 동일한 환자로부터 수득될 수 있다. 특히, 인간과 같은 개체로부터의 세포외 기질을 수확하여 ECM 유래의 나노소낭의 분리에 사용할 수 있다. 이어서, 조성물은 동일한 공여자(자가)에게 약제학적 조성물로 투여될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 동종이형(allogenic)일 수 있고, 이는 ECM 유래의 나노소낭의 분리를 위한 ECM 및 치료될 수혜 생물체(recipient organism)를 제공하는 공여 유기체는 동일한 종이지만 상이한 개체(동종 이형)이다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 외래성(xenogenic)일 수 있다. 따라서 나노소낭은 대상에게 투여하기 전에 다른 종의 ECM으로부터 유도된다. 이 목적을 위해, ECM은 공여자, 예를 들어 돼지와 같은 동물로부터 취해지며 나노소낭은 상기 ECM으로부터 분리된다. 이어서, ECM 유래의 나노소낭은 약학적 조성물로 상이한 종의 개체에게 투여된다. 하나의 비제한적인 실시예에서, 개체는 인간이다.
또한, 개시된 조성물의 시험관 내(in vitro) 및 생체 외(ex vivo) 용도가 있다. 세포 증식, 이동 및/또는 분화를 변화시키기 위해 ECM 유래의 나노소낭을 첨가할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포 증식, 이동 및/또는 분화가 유도된다. 다른 실시양태에서, 세포 증식, 이동 및/또는 분화가 억제된다. 나노소낭은 세포외 기질과 함께 또는 세포외 기질 없이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 이에 한정되지 않으나, 혈관 주위 줄기세포와 같은 줄기세포일 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포는 대식세포 또는 단핵세포일 수 있다.
일부 실시양태에서, 관심의 대상인 세포외 기질 상에서 세포 증식, 이동 및/또는 분화를 변화시키는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 상기 방법은 제2의 세포외 기질로부터 유래된 분리된 나노소낭을 목적하는 세포외 기질로 도입하는 것을 포함한다. 추가적인 ECM 유래 나노소낭은 ECM상에서 성장한 세포의 세포 증식, 이동 및/또는 분화를 변화시킨다. 일부 실시양태에서, 세포는 이에 한정되지 않으나, 혈관 주위 줄기세포와 같은 줄기세포일 수 있다. 다른 실시양태에서, 세포는 대식세포 또는 단핵세포일 수 있다.
관심 세포외 기질 및 ECM 유도 나노소낭은 자가유래(autologous), 동종이형 유래(allogeneic) 또는 이종유래(xenogeneic)일 수 있다. 관심 세포외 기질 및 ECM 유래 나노소낭은 동일하거나 상이한 조직으로부터 유래될 수 있다. 관심 세포외 기질 및 ECM 유도 나노소낭은 동일하거나 다른 종으로부터 유해될 수 있다. 특정 비제한적인 실시예에서, 관심 세포외 기질 및/또는 ECM 유도 나노소낭은 인간 또는 돼지이다.
세포는 관심있는 임의의 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 줄기세포 또는 전구세포이다. 다른 실시양태에서, 세포는 대식세포, 근육아세포(myoblast), 혈관 주위 줄기세포(perivascular stem cell) 또는 신경 모세포종 세포(neuroblastoma cell)이다. 스캐폴드 및 장치 상에 개시된 ECM 유래 나노소낭의 용도는 하기에 개시된다.
종양 치료방법
생체 내(in vivo) 또는 시험관 내(in vitro)에서 종양세포의 증식을 감소시키기 위한 방법을 본원에 개시한다. 생체 내 또는 시험관 내에서 종양 세포의 아폽토시스(apoptosis)를 증가시키는 방법도 본원에 개시된다. 또한, 생체 내 또는 시험관 내에서 종양세포의 이동을 감소시키기 위한 방법을 본 명세서에 개시한다. 이들 방법은 종양세포를 본원에 개시된 유효량의 ECM 유도 나노소낭과 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양세포는 신경교종세포(glioma cells)이다. 다른 실시양태에서, ECM 유도 나노소낭은 방광(urinary bladder)으로부터 유래된 것이다. 추가의 실시양태에서, 종양세포는 신경교종세포이고, ECM 유도 나노소낭은 방광 ECM으로부터 분리된다. 추가의 실시양태에서, 종양세포는 식도선암 세포(esophageal adenocarcinoma cells)이다. 다른 실시양태에서, ECM 유래 나노소낭은 식도 ECM으로부터 분리된다. 추가의 실시양태에서, 종양세포는 식도선암이며, ECM-유도 나노소낭은 식도 ECM으로부터 분리된다. ECM 유래 나노소낭은 또한 종양 조직으로부터 생성될 수 있다. ECM은 사람이나 가축(veterinary) 개체로부터 유래될 수 있다.
본원에 개시된 모든 방법은 임의의 유형의 신경교종 또는 신경교종세포에 사용될 수 있다. 신경교종은 상행부종(ependymoma), 성상세포종(astrocytoma), 희소돌기아교종(oligodendroglioma), 뇌간신경교종(brainstem glioma), 시신경신경교종(optic nerve glioma) 또는 혼합신경교종일 수 있다. 신경교종은 WHO 등급 I, II, III 또는 IV일 수 있다. 신경교종은 저등급 신경교종 또는 고등급(WHO 등급 III-IV) 신경교종일 수 있다. 신경교종은 천막상(supratentorial), 천막하(infratentorial) 또는 뇌교(pontine)의 신경교종일 수 있다.
또한, 대상체의 종양을 치료하기 위한 방법이 제공된다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 대상의 기존 종양을 치료하는 것을 포함한다. 추가의 실시양태에서, 양성 질환으로의 악성 병변으로의 전환을 방지하거나 대상에서의 전이를 예방하기위한 방법을 본 명세서에 개시한다. 일부 비제한적인 실시예에서, 상기 방법은 대상에서 종양의 증상을 감소시킨다. 추가의 비제한적인 실시예에서, 종양은 고형 종양이다. 일부 실시양태에서, 종양세포는 신경교종세포이다. 다른 실시양태에서, ECM 유도 나노소낭은 방광 ECM으로부터 분리된다. 추가의 실시양태에서, 종양세포는 신경교종세포이고, ECM 유도 나노소낭은 방광 ECM으로부터 분리된다. 추가의 실시양태에서, 종양세포는 식도선암세포이다. 다른 실시양태에서, ECM 유래 나노소낭은 식도 ECM으로부터 분리된다. 추가의 실시양태에서, 종양세포는 식도선암이며, ECM 유도 나노소낭은 식도 ECM으로부터 분리된다.
일반적으로, 상기 방법은 양성 또는 악성 종양과 같은 종양을 갖는 개체를 선택하는 단계 및 본원에 개시된 바와 같은 약학적 유효량의 ECM 유도 나노소낭을 개체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 신경교종을 가진 대상과 같은, 치료가 필요한 대상을 선택하는 단계, 및 치료적 유효량의 ECM 유도 나노소낭을 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이에 한정되지 않으나 화학요법제와 같은 추가의 제제를 관심 개체에 투여할 수 있다. 이에 한정되지 않으나, 종양의 외과적 절제술과 같은 추가적인 치료가 또한 환자에게 투여될 수 있다.
종양은 양성이거나 악성일 수 있다. 종양은 고형 종양 또는 림프증식성(lymphoproliferative) 종양일 수 있다. 종양은 신경교종을 포함하지만 이에 국한되지 않는 임의의 관심 종양일 수 있다. 다른 실시양태에서, 종양은 림프종, 유방암, 폐암 또는 결장암이다. 추가적인 예는 피부 종양, 유방 종양, 뇌종양, 자궁 경부암, 고환암, 두경부 종양, 위장관 종양, 비뇨 생식기계 종양, 부인과계 종양, 유방, 내분비계 종양, 피부 종양, 연조직 및 뼈의 육종, 중피종, 흑색종, 중추신경계의 신생물 또는 백혈병이 있다. 일부 실시양태에서, 종양은 비강, 부비동 종비(paranasal sinuses), 비인두(nasopharynx), 구강, 인두(oropharynx), 후두(larynx), 하인두(hypopharynx), 타액선 및 부신경절종(paragangliomas)의 종양과 같은 두경부 종양이다. 다른 실시양태에서, 종양은 비소세포폐암(non-small cell lung cancer) 또는 소세포폐암(small cell lung cancer)과 같은 폐 종양이다. 추가의 실시양태에서, 종양은 식도, 위, 췌장, 간, 담즙 트리(biliary tree), 소장, 결장, 직장 및 항문 영역의 암과 같은 위장관(gastrointestinal tract) 종양일 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 종양은 신장, 요도(urethra), 방광, 전립선, 요도, 음경 및 고환의 암과 같은 비뇨 생식기계(genitourinary system)의 종양일 수 있다. 일부 실시양태에서, 종양은 자궁경부(cervix), 질(vagina), 외음부(vulva), 자궁체(uterine body), 임신성 영양융합질환(gestational trophoblastic diseases), 난소(ovarian), 난관(fallopian tube), 복강(peritoneal) 또는 유방(breast)과 같은 부인과(gynecologic) 종양이다. 다른 실시양태에서, 종양은 갑상선 종양, 부갑상선 종양, 부신피질 종양, 췌장내분비 종양, 유암종(carcinoid tumor) 및 카르시노이드 증후군(carcinoid syndrome)과 같은 내분비계(endocrine system) 종양이다. 종양은 연조직 및 뼈의 육종, 중피종, 피부암, 피부 흑색종(cutaneous melanomas) 및 안내안흑색종(intraocular melanomas)을 포함하는 흑색종, 중추신경 종양, 망막 모세포종(retinoblastoma)을 포함하는 유년기 암, Wilm 's 종양, 신경 섬유종증, 신경 모세포종, 유잉 육종 종양, 횡문근육종(rhabdomyosarcoma)이다. 종양은 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphomas), 피부 T 세포 림프종, 일차 중추신경계 림프종 및 호지킨병(Hodgkin's disease)을 포함하는 림프종일 수 있다. 종양은 급성 백혈병, 만성 골수성 백혈병 및 림프성 백혈병과 같은 백혈병일 수 있다. 종양은 혈장 세포 신생물, 알수 없는 원발 부위의 암, 복막암 종양증(peritoneal carcinomastosis), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), AIDS 관련 림프종, AIDS 관련 원발성 중추 신경계 림프종, AIDS 관련 호지킨병 및 AIDS 관련 항문암(anogenital cancers), 간으로의 전이암, 뼈로의 전이암, 악성 흉막(malignant pleural) 및 심낭 삼출(pericardial effusions) 및 악성 복수(malignant ascites)를 포함한다. 특정 비제한적인 실시예에서 종양은 흑색종(melanoma) 또는 결장암이다.
종양의 치료는 일반적으로 종양의 진단 후 또는 전구체 상태(예: 이형성증 또는 양성 종양의 발생)가 시작된 후에 시작된다. 예를 들어, 암의 초기 단계에서, 예를 들어, 단계 I 진단 중 또는 이형성증 진단 당시와 같은 상태의 증상을 피험자에게서 나타내기 전에 치료를 시작할 수 있다. 그러나 치료는 이에 한정되지 않으나, I 단계, II 단계, III 단계 및 IV 단계와 같은 질병의 모든 단계에서 시작할 수 있다. 일부 실시예에서, 치료는 악성 종양 또는 전이성 종양으로 전환될 수있는 양성 종양을 가진 개체에게 투여된다. 종양의 존재는 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있으며, 전형적으로 세포학적 및 형태학적 평가를 포함한다. 종양은 확립된 종양일 수 있다.
악성 암과 같은 상태의 발생 후 시작된 치료는 증상 중 하나의 증상의 중증도를 감소시키거나, 증상을 완전히 제거하거나, 전이, 종양 부피 또는 종양 수를 감소시킬 수 있다. 일부 실시예에서, 종양은 치료 후에 발견되지 않게 된다. 본원의 한 측면에서, 전이와 같은 종양의 형성은 지연, 예방 또는 감소된다. 다른 측면에서, 원발 종양의 크기는 감소된다. 또 다른 측면에서, 종양의 증상이 감소된다. 또 다른 측면에서, 종양 부피가 감소된다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 종양을 갖는 개체의 치료를 위한 것이다. 본원에 개시된 약학적으로 유효한 양의 ECM 유도 나노소낭은 개체에게 투여된다. 특정 비제한적인 실시예에서, ECM 유래 나노소낭은 방광으로부터 분리된다. 다른 비한정적인 실시예에서, ECM 유도 나노소낭은 식도로부터 분리된다. 일부 실시양태에서, 투여는 종양세포 증식을 감소시키고, 종양세포 아폽토시스를 증가시키고 및/또는 종양세포 이동을 감소시킨다. 투여는 종양에 직접 진행될 수 있다. 특정 비제한적인 실시예에서, 종양은 신경아교종이다.
이형성증 또는 초기(양성) 전구체 상태를 검출할 때의 치료와 같은, 상태의 발생 전 치료는, 본 명세서에서 상태를 발생시키는 "위험에 처한" 환자의 치료로 지칭된다. 일부 실시양태에서, ECM 유도 나노소낭 또는 ECM 유도 나노소낭을 포함하는 약학적 조성물과 같은 조성물의 투여는 본원에 기재된 상태가 발생하는 동안 또는 그 후에 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 개체는 바렛 식도(Barrett’s esophagus)를 갖지 않는다. 다른 실시양태에서, 개체는 바렛 식도를 갖는다.
약학적 조성물은 ECM 유도 나노소낭 및 임의로 하나 이상의 추가의 화학요법제를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 종양을 치료하는데 사용된다. 이러한 조성물은 종양 내 세포의 증식에 영향을 미치거나 또는 임의의 관심있는 종양의 발병 위험을 지연, 예방, 발병 또는 감소시키거나, 치료하거나, 전이 발병율을 감소시키기 위해, 환자에게 투여하기 위한 다양한 방법으로 제제화될 수 있다. 본 명세서에 기재된 조성물은 또한 초기 병변의 전이를 방지하는 적용으로 제제화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국부투여, 예컨대 종양 내 투여를 위해 제형화된다. 따라서, 약학적 조성물은 인간 또는 가축용 의약에 사용하기 위해 제형화된, 국소 사용 및 전신 사용을 위해 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 주사 또는 카테터에 의해 투여될 수 있다.
개시된 방법 및 조성물은 인간 개체를 치료하기 위해 전형적으로 사용될 수 있지만, 다른 영장류, 개, 고양이, 말 및 소와 같은 다른 척추 동물에서 유사하거나 동일한 질병을 치료하는 데에도 사용될 수 있다. 적합한 투여 형태는 각 개체에 대해 개별적으로 의사에 의해 가장 잘 결정될 수 있다. 다양한 약학적으로 허용가능한 담체 및 이들의 제제는 표준 제제법은, 예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin. See also Wang, Y. J. and Hanson, M. A., Journal of Parenteral Science and Technology, Technical Report No. 10, Supp. 42: 2S, 1988에 기재되어 있다. 약학적 조성물의 투여형태는 선택된 투여방식에 따라 결정될 것이다. 일부 실시양태에서, 개체는 인간이고, ECM 유도 나노소낭은 인간 조직으로부터 유래된 것이다.
일부 실시양태에서, 종양과 같은 대상 영역 또는 관심 조직의 세포 내로 국부적으로 투여되는 경우, 개시된 조성물은 종양세포 증식을 감소시키고 종양세포 아폽토시스를 증가시키며 및/또는 종양세포 이동을 감소시킨다. ECM 유래 나노소낭은 비경구 투여, 예컨대 정맥 내(intravenous), 복강 내(intraperitoneal), 근육 내(intramuscular), 복강 내(intraperitoneal), 흉부 내(intrasternal) 또는 관절 내(intraarticular) 주사 또는 주입, 또는 설하, 경구, 국소, 비내 또는 경점막(transmucosal) 투여에 의해 또는 폐 흡입(pulmonary inhalation)에 의해 투여될 수 있다. 적절한 투여 경로는 종양의 제시(presentation)에 기초하여 의사에 의해 선택될 수 있다.
ECM 유래 나노소낭이 예를 들어 주사 또는 주입을 위해, 비경구용 조성물로써 제공될 때, 이들은 일반적으로 수성 담체, 예를 들어 약 3.0 내지 약 8.0의 pH, 바람직하게는 약 3.5 내지 약 7.4의 pH, 약 7.2 내지 약 7.4의 pH의 등장 완충용액에 현탁된다. 유용한 완충액은 구연산 나트륨-시트르산(sodium citrate-citric acid) 및 인산 나트륨-인산(sodium phosphate-phosphoric acid) 및 아세트산 나트륨-아세트산(sodium acetate-acetic acid) 완충액을 포함한다.
저장소 형태 또는 "depot" 서방형 제제(slow release preparation)를 사용하여 주사 또는 전달 후 약학적으로 유효량의 제제가 혈류로 전달될 수 있다.
서방성 조성물의 적합한 예는 적합한 중합체 물질(예를 들어, 성형된 물건, 예를 들어, 필름 또는 마이크로 캡슐의 형태의 반투과성 중합체 매트릭스), 적합한 소수성 물질(예를 들어, 수용성 오일 내 에멀젼) 또는 이온 교환 수지 및 용장성 용해성 유도체(예를 들어, 난용성 염)를 포함할 수 있다. 서방형 제제는 종양의 위치에 따라 구강, 직장, 비경구, 대장 내, 질 내, 복강 내, 국소적으로(분말, 연고, 겔, 점적 또는 경피 패치에 의해), 턱밑(bucally), 또는 경구 또는 비강 스프레이로 투여될 수 있다. 약학적 조성물은 생분해성 중합체 및/또는 다당류 겔화제 및/또는 생체 접착성 중합체, 양친매성 중합체, 입자의 계면 특성을 변경시키는 작용제 및 약학적 활성 물질을 포함하는 입자의 형태일 수 있다. 이러한 조성물은 활성 물질의 제어된 방출을 허용하는 특정 생체적합성 특징을 나타낸다. 미국특허 제 5,700,486호 참조.
개시된 방법에서 유용한 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제는 통상적이다. 예를 들어, 비경구용 제형은 통상적으로 약학적으로 및 생리학적으로 허용가능한 유체 비히클인 물, 생리 식염수, 다른 균형된 염용액, 수성 덱스트로스, 글리세롤 등과 같은 주사 가능한 유체를 포함한다. 포함될 수 있는 부형제는 예를 들어 인간 혈청 알부민 또는 혈장 제제(plasma preparations)와 같은 단백질이다. 원한다면, 투여될 약학적 조성물은 소량의 비독성 보조물질, 예컨대 습윤제 또는 유화제, 방부제 및 pH 완충제 등, 예를 들어 나트륨 아세테이트(sodium acetate) 또는 소르비탄 모노라우레이트(sorbitan monolaurate)를 함유할 수 있다. 상기 투여 형태를 제조하는 실제 방법은 당업자에게 공지되어 있거나 명백할 것이다.
투여되는 활성 화합물(들)의 양은 치료되는 대상, 고통의 중증도 및 투여 방식에 따라 좌우되고, 처방 임상의의 판단에 맡기는 것이 가장 바람직하다. 이러한 범위 내에서, 투여될 제제는 치료되는 대상에서 원하는 효과를 달성하는데 효과적인 양으로 활성성분(들)의 양을 함유할 것이다. 만성적인 투여가 이루어 지도록 매일, 격주, 주간, 격월 또는 월간과 같은 정의된 시간 간격과 같은 여러 치료법이 계획된다. 질병의 억제 또는 예방이 필요할 때, 예를 들어 특정 연령의 개체에서, 또는 환경에 노출 전에 투여가 시작될 수 있다.
정확한 투여량은 특정 분획의 효능, 환자의 연령, 체중, 성 및 생리적 상태에 기초하여 당업자에 의해 용이하게 결정된다. 적합한 농도는 약 1 ng/ml 내지 100 g/ml를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
사이토카인, 케모카인 또는 화학요법제와 같은 추가의 제제를 투여할 수 있다. 이들은 개시된 약학적 조성물에 포함될 수 있다. 인터페론(IFN) α, β 또는 γ, IL-1, IL-6 및 IL-10과 같은 인터루킨(IL) 또는 인터페론(IFN)과 같은 사이토카인을 투여할 수 있다. 하나의 실시양태에서, 종양의 예방 및 치료를 위해, 외과적 치료가 개체에게 투여될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 상기 투여는 순차적이다. 다른 실시예에서 상기 투여는 동시에 수행된다.
화학요법제의 예는 알킬화제, 항대사성 물질(antimetabolites), 천연 생성물 또는 호르몬 및 이들의 길항제이다. 알킬화제의 예로는 질소 머스터드[예: 메스로레타민(mechlorethamine), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 멜팔란(melphalan), 우라실 머스타드(uracil mustard) 또는 클로람부실(chlorambucil)], 알킬 술포네이트[예: 부술판(busulfan)], 니트로소우레아(nitrosoureas)[예: 카르민스틴(carmustine), 로뮤스틴(lomustine), 세미스틴(semustine), 스트렙토조신(streptozocin) 또는 다카바진(dacarbazine)]를 포함한다. 항대사성 물질의 예로는 엽산 유사체[예: 메토트렉세이트(methotrexate)], 피리미딘 유사체[예: 5-FU 또는 시타라빈(cytarabine)] 및 머크 푸투린(mercaptopurine) 또는 티오구아닌(thioguanine)과 같은 퓨린 유사체를 포함한다. 천연 생성물의 예로는 빈카 알칼로이드(vinca alkaloids)[예: 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine)], 에피포도필로톡신(epipodophyllotoxins)[예: 에토포시드(etoposide) 또는 테니포시드(teniposide)], 항생제[예: 닥티노마이신(dactinomycin), 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 블레오마이신(bleomycin), 플리카마이신(plicamycin) 또는 마이토신 C(mitocycin C)] 및 L-아스파라긴 효소와 같은 효소를 포함한다. 기타 제제(miscellaneous agents)의 예는 백금 배위 착물(platinum coordination complexes)[예: 시스플라틴으로도 알려진 시스-디아민-디클로로 백금 II(cis-diamine-dichloroplatinum II)], 치환된 요소[예: 히드록시우레아(hydroxyurea)], 메틸 히드라진 유도체[예: 프로카바진(procarbazine)] 및 부영질 억제제(adrenocrotical suppressants)[예: 마이토테인(mitotane) 및 아미노글루테티미드(aminoglutethimide)]를 포함한다. 호르몬 및 길항제의 예로는 부신피질스테로이드(adrenocorticosteroids)[예: 프레드니손(prednisone)], 프로게스틴(progestins)[예: 히드록시프로게스테론 카프로에이트(hydroxyprogesterone caproate), 메드록시프로게스테론 아세테이트(medroxyprogesterone acetate) 및 마그네스트롤 아세테이트(magestrol acetate)], 에스트로겐(estrogens)[예: 디에틸스틸베스트롤(diethylstilbestrol) 및 에티닐 에스트라디올(ethinyl estradiol)], 항에스트로겐(antiestrogens)[예: 타목시펜(tamoxifen)] 및 안드로겐(androgens)[예: 프로피오네이트 테스토스테론(testosterone proprionate) 및 플루옥시메테론(fluoxymesterone)]. 가장 일반적으로 사용되는 화학요법 약물의 예는 아드리아마이신(Adriamycin), 알케란(Alkeran), Ara-C, BiCNU, 부슬판(Busulfan), CCNU, Carboplatinum, 시스플라틴(Cisplatinum), 사이톡산(Cytoxan), 다우노루비신(Daunorubicin), DTIC, 5-FU, 플루다라빈(Fludarabine), 하이드리아(Hydrea), 아이다루비신(Idarubicin), 이포스파미드(Ifosfamide), 메토트렉사트(Methotrexate), 미스라마이신(Mithramycin), 마이토마이신(Mitomycin), 미톡산트론(Mitoxantrone), 질소 머스터드(Nitrogen Mustard), 탁솔(Taxol)(또는 다른 탁솔, 예컨데 도세탁셀), Velban, 빈크리스틴(Vincristine), VP-16이 포함되어 있는 반면, 젬시타빈(Gemcitabine)(Gemzar), 헤르셉틴(Herceptin), 이리노테칸(Irinotecan)(Camptosar, CPT-11), 류스타틴(Leustatin), 나벨빈(Navelbine), Rituxan STI-571, 탁소텔(Taxotere), 토포테칸)Topotecan)(Hycamtin), 젤로다(Xeloda)(Capecitabine), Zevelin 및 칼시트리올(calcitriol)를 포함하는 새로운 일부 추가의 약물을 포함한다. 사용 가능한 면역 조절제의 비제한적인 예는 AS-101 (Wyeth-Ayerst Labs.), bropirimine(Upjohn), 감마 인터페론(Genentech), GM-CSF(과립구 대식세포 콜로니 자극인자, Genetics Institute), IL-2(Cetus or Hoffman-LaRoche), 인간 면역글로불린(Cutter Biological), IMREG(Imreg of New Orleans, La.), SK & F 106528 및 TNF (종양 괴사인자; Genentech).
M2 대식세포를 증가시키는 방법
대식세포는 손상 후 정상적인 조직 발달에 대한 정상적인 치유의 중요한 조절인자인 것으로 나타났다. 개시된 나노소낭은 대식세포 표현형에 대한 전체 ECM의 영향을 반복할 수 있어 M2 유사, 조절 또는 프로-리모델링 대식세포의 증가를 유도한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 임의의 조성물은 조절성 M2 마크로파지를 유도하는 것과 같이, 대식세포 표현형을 변형시키는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 ECM 유도 나노소낭을 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 투여함으로써 개체에서 M2 대식세포를 유도함으로써 대상체 내에 M2 대식세포를 유도하는 방법이 개시되어 있다. 추가의 실시양태에서, 개체에서 M1 (전염증성) 대식세포를 감소시키는 방법이 개시된다. 상기 방법은 본 명세서에 개시된 바와 같이 ECM 유도 나노소낭을 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 투여함으로써 개체에서 M1 대식세포를 억제하는 것을 포함한다. 개체는 염증이나 상처가 있는, 관심있는 개체라면 어떤 개체든 가능하다. 일부 비제한적 실시예에서, 개체는 이에 한정되지 않으나, 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 또는 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis)과 같은 염증성 장애를 갖는다. 다른 비제한적인 실시예에서, 개체는 장기 이식 수혜자, 이식편대숙주 질환(graft versus host disease)을 갖는 개체, 심근경색(myocardial infarction)을 가진 개체 또는, 이에 한정되지 않으나 외과적 상처 또는 비수술 외상성 상처를 가진 개체와 같이 상처가 있는 개체이다. 따라서, 본원에 개시된 바와 같이, 치료적 유효량의 ECM 유도 나노소낭을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함하여, 이를 필요로 하는 개체에서 상처 치유를 촉진시키는 방법으로 개시된다. 투여는 상처 부위 또는 이식 부위와 같이 국부적일 수 있다.
개인의 외과 수술로 인한 문합(anastomotic) 및 기타 상처의 치유를 촉진시키는 방법이 제공된다. 이들 방법은 문합 또는 다른 수술 전, 후 및/또는 그 동안 개인에게 본 명세서에 개시된 ECM 유도 나노소낭을 포함하는 조성물의 유효량의 투여를 포함한다. 문합은 두 개의 관형 구조물을 연결하는 것이다. 예를 들어 장의 중간 부분을 제거하고 나머지 부분을 연결하여 장을 재구성하는 경우이다. 피부 치유와 달리, 문합 상처의 치유 과정은 일반적으로 시야가 가려져 있다. 또한 적어도 위장관에서 상처 치유는 합병증이 없을 경우 신속하게 진행되나, 합병증은 종종 추가적인 수술로 교정해야 한다. Thornton, F. and Barbul, A., Surg. Clin. North Am. 77:549 573 (1997)
상처의 치유를 자극하는 방법은 또한, 수술 상처, 절제 상처(excisional wounds), 진피 및 표피의 손상과 관련된 깊은 상처, 안구 조직 상처, 치수 조직 상처, 구강 상처, 당뇨벙성 궤양, 피부 궤양, 큐빗 궤양(cubitus ulcers), 동맥 궤양, 정맥 울상 궤양(venous stasis ulcers) 및 열 또는 화학 물질에 의한 화상을 포함한다. 또한, 정맥 순환 시스템의 복귀 및/또는 불충분의 손상에 의해 유발되는 만성 정맥 다리 궤양(chronic venous leg ulcers)과 같은 허혈 및 허혈성 손상(schemia and ischemic injury)으로 인한 상처에 대한 방법이 제공된다. 본 명세서에 개시된 ECM 유도 나노소낭을 포함하는 약학적 유효량의 조성물은 피부 손실 후 피부 재구성을 촉진시키는데 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 개시된 ECM 유도 나노소낭을 포함하는 치료학적 유효량의 조성물은 표피 및 표피의 두께의 인장 강도를 증가시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 개시된 방법은 정상 개체 및 손상된 상처 치유를 갖는 개체에서의 상이한 유형의 상처의 치유를 자극하는데 사용된다.
창상 환경(wound bed)에 대한 피부 이식편의 접착력을 증가시키고 창상 환경으로부터의 재상피화(re-epithelialization)를 자극하는 방법이 또한 본 명세서에서 제공된다. 이식의 종류에는 다음이 포함된다: 자가피부 이식편(autologous skin graft), 인공 피부(artificial skin), 동종 이식편(allografts), 자가 피부 이식(autodermic graft), 자가 표피 이식(autoepidermic grafts), avacular grafts, Blair-Brown grafts, 골 이식(bone graft), brephoplastic grafts, cutis graft, 지연 이식(delayed graft), 진피 이식(dermic graft), 표피 이식(epidermic graft), 근막 이식(fascia graft), 전층피부 이식(full thickness graft), 이종 이식(heterologous graft), 이종이식(xenograft), 동종이식(homologous graft), 과형성 이식(hyperplastic graft), 층판 이식(lamellar graft), 그물피부 이식(mesh graft), 점막 이식(mucosal graft), Ollier-Thiersch graft, omenpal graft, 패치 이식(patch graft), 경상 이식(pedicle graft), 관통 이식(penetrating graft), 부분층 피부 이식(split skin graft), 후층 피부 이식(thick split graft). 상기 방법은 본원에 개시된 ECM 유도 나노소낭을 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 이식 물과 함께 투여하여 이식편의 부착 및 수용을 증가시키는 것을 포함한다.
마모(abrasion) 또는 화학적 손상으로 인한 물집과 화상을 치료하는 방법도 제공된다. 이 방법은 피부 또는 내부 장기의 치료를 포함한다. 이러한 방법은 예를 들어 화학요법제로 치료하거나 시클로포스파미드(cyclophosphamide)의 처리로 인한 난소 손상; 방사선 요법 또는 화학 요법으로 유발된 방광염; 또는 고용량 화학 요법으로 유발된 장 손상의 치료가 포함된다. 상기 방법은 물집 또는 화상의 치유를 촉진시키기 위해 본원에 개시된 ECM 유도 나노소낭을 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함한다.
피부의 치료를 위해, 본원에 개시된 ECM 유도 나노소낭을 포함하는 조성물의 치료적 유효량은 피부의 감염된 부위, 예컨대 연고의 형태로 국소투여될 수 있다. 한 실시양태에서, 연고는 피부에 용이하게 적용하기에 적합한 견고성을 갖는 완전히 균질한 반고체 외부 약제이다. 이러한 연고는 지방, 지방유, 라놀린, 바셀린, 파라핀, 왁스, 경질 연고, 수지, 플라스틱, 글리콜, 고급 알콜, 글리세롤, 물 또는 유화제 및 현탁제를 포함할 수 있다. 이들 성분을 베이스로 하여, 미끼(decoy) 화합물을 골고루 혼합할 수 있다. 염기에 따라 혼합물은, 식물성 및 동물성 오일 및 지방, 왁스, 바셀린(VASELINE®) 및 유동 파라핀(liquid paraffin)과 같은 염기를 사용하여, 유성 연고(oleaginous ointment), 유화 연고(emulsified ointment) 또는 수용성 연고(water-soluble ointment) 형태일 수 있다. 유화 연고는 유성(oleaginous) 물질 및 물, 유화제로 유화된 물로 구성된다. 이들은 물 중에서 오일 형태(O/W) 또는 오일 중에서 물 형태(W/O)를 취할 수 있다. 물 중에서 오일 형태(O/W)는 친수성 연고가 될 수 있다. 오일 중 물 형태(W/O)는 초기에는 수성상(aqueous phase)을 갖지 않으며 친수성 바셀린 및 정제된 라놀린(lanoline)을 포함할 수 있거나, 수분 연고(water-absorption ointment)(수성상 포함) 및 수화된 라놀린을 함유할 수 있다. 수용성 연고는 주성분으로서 완전히 수용성 마크로골 염기(Macrogol base)를 함유할 수 있다.
약학적으로 허용가능한 담체는 5% 스테아릴알콜 또는 석유 젤리(petroleum jelly)를 단독으로 함유하는 VASELINE®과 같은 석유 젤리, 또는 액체 파라핀을 함유하는 석유 젤리를 포함한다. 이러한 담체는 약학적 조성물을 정제, 환제, 당-코팅제, 캡슐, 액체 제제, 겔제, 연고, 시럽, 슬러리 및 현탁액과 같이 소비에 적합한 형태로 처방할 수 있게 한다. 영향받은 부위 또는 관심 조직 내의 세포에 국부적으로 투여될 때, ECM 유래 나노소낭을 포함하는 조성물은 합성 또는 천연 친수성 중합체를 담체로 함유하는 조성물로 투여될 수 있다. 이러한 중합체의 실시예는 히드록시프로필 셀룰로오스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. ECM 유래 나노소낭을 포함하는 조성물은 적절한 용매 중에서 친수성 중합체와 혼합될 수 있다. 그런 다음 공기 건조와 같은 방법으로 용매를 제거한 다음, 나머지는 원하는 형태(예: 시트)로 성형하고 목표 위치에 적용한다. 이러한 친수성 중합체를 함유하는 제제는 수분 함량이 낮을 때 잘 유지된다. 사용시 물을 흡수하여 잘 보관되는 젤이 된다. 시트의 경우, 셀룰로오스, 전분 및 그 유도체 또는 합성 고분자 화합물과 같은 다가 알코올에 상기와 유사한 친수성 고분자를 혼합하여 견고성을 조절할 수 있다. 이렇게 형성된 친수성 시트가 사용될 수 있다. 본원에 개시된 ECM 유도 나노소낭을 포함하는 치료학적 유효량의 조성물은 또한 상처에 대한 붕대 및 드레싱에 혼입될 수 있다.
스캐폴드 및 장치
포유류 세포외 기질, 예를 들어 인간 또는 돼지 세포외 기질과 같은 세포외 기질로부터 유도된 나노소낭을 포함하는 장치도 개시된다. 본 명세서에 개시된 임의의 ECM 유래 나노소낭은 장치의 구성요소 상에 코팅되거나 내장될 수 있다. 상기 장치는 수술용 메쉬(surgical mesh), 스텐트(stent), 맥박 조정기(pacemaker), 카테터(catheter), 심장 판막(heart valve), 바이오 센서(biosensor), 약물 전달 장치 또는 정형 외과 임플란트(orthopedic implant)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이 장치는 손상되거나 찢어진 힘줄이나 근육을 치료하는데 사용할 수 있다. 스캐폴드 또는 장치는 측두하악관절장애(temporomandibular joint disorder)의 치료를 위한 것일 수 있는데, 예를 들어 본 명세서에 참고로 인용된 미국특허 제 9,277,999 호를 참조한다.
포유류 세포외 기질, 예를 들어 인간 또는 돼지 세포외 기질과 같은 세포외 기질로부터 유래된 나노소낭을 포함하는 바이오스캐폴드(bioscaffold)가 개시된다. 본 명세서에 개시된 임의의 ECM 유래 나노소낭은 생물학적으로 융화가 가능한 바이오스캐폴드에 포함될 수 있다. 이러한 바이오스캐폴드는 장치에 통합될 수 있다.
본원에 개시된 장치를 제조하는데 사용되는 중합체 성분은 바람직하게는 생체 적합성(biocompatible)이다. "생체적합성"은 고분자 조성물 및 그 정상적인 생체 내 분해 생성물이 세포적합성(cytocompatible)이고, 유용하고 실용적인 및/또는 허용가능한 내성 범위 내의 환자에서 실질적으로 비독성이고 비발암성임을 의미한다. "세포적합성"은 중합체가 세포 집단 및/또는 중합체 조성물을 보유할 수 있고, 장치, 및 이들의 분해 생성물은 실용적인 및/또는 허용가능한 내성 범위 내의 야생형(정상, 비-암성) 세포에 대해서 세포 독성 및/또는 발암성이 아임을 의미한다. 예를 들어, 중합체를 인간 상피세포 배양물에 넣었을때 생존력, 성장성, 접착력 및 세포수에 악영향을 미치지 않는다. 하나의 비한정적인 실시양태에서, 조성물 및/또는 장치는 주어진 관할구역에서 적용 가능한 규제기준에 따라 인간환자에서 사용하기에 수용가능한 정도로 "생체 적합성"이다. 또 다른 실시예에서, 생체적합성 중합체는 환자에게 이식될 때 신체의 세포 및 조직에 실질적인 부작용 또는 실질적인 해를 끼치지 않으며, 예를 들어 중합체 조성물 또는 장치는 이식된 스캐폴드(scaffold)로부터 조직에 해를 입히는 괴사 또는 감염을 야기하지 않는다.
스캐폴드 및 장치는 상처치유, 조직 개질(tissue remodeling) 및 조직 재생(tissue regeneration)을 포함하는 다수의 의학용도에 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, 비제한적으로, 스캐폴드는 상처치유에 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 장치 또는 바이오스캐폴드는 세포외 기질을 포함할 수 있다. 특정 비제한적인 실시예에서, 세포외 기질은 식도세포(esophageal cells), 요로방광세포(urinary bladder cells), 소장 점막하층(small intestinal submucosa) 또는 진피(dermis)이다.
특정 실시양태에서, ECM은 자가(autologous)일 수 있으며, ECM 및 ECM 유도 나노소낭은 동일한 대상으로부터 유래된다. 특히, 사람과 같은 개체로부터의 ECM을 수거하여 나노소낭의 분리에 사용할 수 있다. 이러한 ECM 유래 나노소낭은 같은 개체의 ECM과 함께 사용할 수 있다. 따라서, 바이오스캐폴드 또는 장치는 동일한 개체로부터의 ECM 및 ECM 유도 나노소낭을 함유하여 제조된다.
또 다른 실시양태에서, ECM은 동종(allogenieic)일 수 있으며, ECM 및 ECM 유도 나노소낭은 동일한 종의 상이한 개체로부터 유래된다. 특히, 사람과 같은 개체로부터의 ECM을 수거하여 나노소낭의 분리에 사용할 수 있다. 이러한 ECM 유래 나노소낭은 다른 개체의 ECM과 함께 사용할 수 있습니다. 따라서, 바이오스캐폴드 또는 장치는 상이한 개체이지만 동일한 종으로부터의 ECM 및 ECM 유래 나노소낭을 함유하여 생성된다.
또 다른 실시양태에서, ECM은 이종(xenogenic)일 수 있으며, ECM 및 ECM 유래 나노소낭이 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 하나의 비한정적인 실시예에서, 인간과 같은 개체부터의 ECM을 수거하여 나노소낭의 분리에 사용할 수 있다. 이러한 ECM 유래 나노소낭은 돼지와 같은 다른 종의 ECM과 함께 사용할 수 있다. 또 다른 비제한적인 실시예에서, 돼지와 같은 개체로부터의 ECM을 수거하여 나노소낭의 분리에 사용할 수 있다. 이러한 ECM 유래 나노소낭은 사람과 같은 다른 종의 ECM과 함께 사용할 수 있다. 따라서, 상이한 종으로부터의 ECM 및 ECM 유래 나노소낭을 함유하는 바이오스캐폴드 또는 장치가 제조된다.
추가의 실시양태에서, ECM 및 ECM 유래 나노소낭은 동일한 조직 출처에 속한다. 또 다른 실시양태에서, ECM 및 ECM 유래의 나노소낭은 상이한 조직 출처로부터 유래된다. 따라서, 일부 비제한적 실시예에서, ECM 및 ECM 유래 나노소낭은 식도조직, 요로방광, 소장 점막하층, 진피, 제대혈, 심낭, 심장 조직 또는 골격근 또는 이 조직들이 배양된 세포들로부터 생산될 수 있다. 다른 비한정적인 실시예에서, ECM 유래 나노소낭은 식도조직, 요로방광, 소장 점막하층, 진피, 제대혈, 심낭, 심장 조직 또는 골격근 세포로부터 생산되며, ECM은 이 조직 출처로부터 유래되지 않는다. 추가의 비제한적인 예에서, ECM은 식도조직, 요로방광, 소장 점막하층, 진피, 제대, 심낭, 심장 조직 또는 골격근으로부터 생성되며, ECM 유래 나노소낭은 이 조직 공급원으로부터 유래되지 않는다.
하나의 비 한정적인 실시양태에서, ECM 유래 나노소낭 이외에, 스캐폴드(또는 장치)는 생체 활성제(bioactive agents)와 같은 다른 약제를 포함한다. 이러한 생체 활성제는 조직치유, 조직개질 및/또는 혈관신생(angiogenesis)을 용이하게 하는데 사용될 수 있다. 다른 비한정적인 실시양태에서, 스캐폴드(또는 장치)는 박테리아 및 다른 병원체를 막거나(ward off), 줄기세포와 같은 선택된 세포 유형을 모집하거나, 또는 세포의 분화를 유도하기 위한 부가적인 생체 활성제를 포함한다. 또 다른 비한정적인 실시양태에서, 바이오스캐폴드는 상처가 배출되도록 하거나 세포가 통과하여 결합조직을 침착하도록 공극을 포함한다.
상기와 같이, 스캐폴드 또는 장치는 ECM 유래 나노소낭 외에 ECM을 포함할 수 있다. 또 다른 비한정적인 실시양태에서, 세포 및 생체 활성제의 조합은 환자의 부위에 이식하기 전 또는 이식하는 동안 ECM 유래 나노소낭을 포함하는 스캐폴드 또는 장치에 첨가된다. 개시된 나소낭은 이들 스캐폴드 중 어느 하나에 적용될 수 있거나 또는 이들 중 하나로 통합될 수 있다.
스캐폴드는 임의의 적합한 합성 중합체 성분, 생물학적 중합체 성분 또는 이들의 배합물을 포함할 수 있다. "생물학적 중합체(들)"는 포유류 또는 척추조직 및, 세포외 기질과 같은 생물학적 출처로부터 수득될 수 있는 중합체이다. 생물학적 고분자는 추가적인 공정단계에 의해 변형될 수 있다. 중합체는 일반적으로 예를 들어, 단일 중합체(mono-polymer), 공중합체(copolymer), 중합체 블렌드(polymeric blend), 블록중합체(block polymer), 블록공중합체(block copolymer), 가교 중합체(cross-linked polymer), 비가교 중합체, 선형-, 분지형-, 빗형태의-, 별모양의- 및/또는 수상돌기형 중합체를 포함할 수 있고, 여기서 중합체는 예를 들어 하이드로겔, 다공성메쉬, 섬유, 직조메쉬(woven mesh) 또는 부직메쉬(non-woven mesh), 예를 들어 전착(electrodeposition)에 의해 형성된 부직메쉬 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드에 적합한 중합체 성분은 생분해성(biodegradable)이고 생체적합성인 중합체일 수 있다. "생분해성"은 일단 체액 및/또는 조직과 접촉하여 이식 및 배치된 중합체가 화학적, 생화학적 및/또는 효소 적 과정을 통해 부분적으로 또는 완전히 분해됨을 의미한다. 이러한 화학반응의 비제한적인 실시예는 산/염기 반응, 가수분해 반응 및 효소적 절단을 포함한다. 특정 비제한적인 실시양태에서, 생분해성 중합체는 동종중합체(homopolymers), 공중합체 및/또는, 글리콜라이드(glycolide), 락티드(lactide), 카프로락톤(caprolactone), 디옥사논(dioxanone) 및 트리메틸렌 카보네이트(trimethylene carbonate) 중 하나 이상을 포함하지만 이에 제한되지 않는 폴리머 블렌드(polymeric blend)를 포함할 수 있다. 생분해성 중합체의 비제한적인 실시예는 폴리(에스테르 우레탄)요소 엘라스토머[poly(ester urethane) urea elastomers](PEUU) 및 폴리(에테르 에스테르 우레탄)요소 엘라스토머[poly(ether ester urethane) urea elastomers](PEEUU)를 포함한다. 다른 비한정적인 실시양태에서, 중합체는 불안정한 화학적 잔기(labile chemical moieties)를 포함하며, 이에 제한되지 않는 예로써 에스테르(esters), 무수물(anhydrides), 폴리무수물(polyanhydrides) 또는 아미드(amides)가 포함되며, 이들은 제한없이 예를 들어 스캐폴드의 분해 속도 및/또는 스캐폴드로부터 치료제의 방출 속도를 제어하는데 용이하다. 대안적으로, 중합체는 일단 원위치(in situ)로 배치되면 화학반응에 민감한 빌딩블록(building blocks)으로서 펩티드 또는 생체 고분자를 함유할 수 있다. 하나의 비제한적인 실시예에서, 중합체는 효소적 안정성(enzymatic lability)을 중합체에 부여하는 아미노산 서열 알라닌-알라닌-리신을 포함하는 폴리펩티드이다. 또 다른 비한정적인 실시양태에서, 중합체 조성물은 ECM으로부터 유도 생체 고분자 성분을 포함할 수 있다. 예를 들어, 중합체 조성물은 생체 고분자 콜라겐을 포함할 수 있으며, 동일 반응계에 존재하는 콜라게나아제가 콜라겐을 분해할 수 있다.
중합체 성분은 상처 또는 조직의 예상되는 치유율과 유사한 시간계(timescale)에서 인 시츄(in situ)로 분해되도록 선택될 수 있다. 인 시츄 분해 속도의 비제한적인 실시예는 1주 내지 1년 사이 또는 예를 들어 2주 내지 10개월 사이 및 1개월 내지 6개월 사이의 증분(increments)을 포함한다.
생분해성 스캐폴드의 기계적 특성은, 정상 스트레인 하 및 이식 부위에서 천연 조직(native tissue)에 대한 스트레스 하에서 작동하도록 최적화될 수 있다. 특정 비제한적인 실시양태에서, 스캐폴드의 기계적 성질은 근막(fascia), 결합 조직(connective tissue), 뼈, 연골(cartilage), 혈관, 근육, 힘줄(tendon), 지방 등과 같은 천연 연조직의 것과 유사하거나 동일하게 최적화된다.
스캐폴드의 기계적 성질 또한 외과적 치료에 적합하도록 최적화될 수 있다. 하나의 비한정적인 실시양태에서, 스캐폴드는 유연하고 부위에 봉합될 수 있다. 또 다른 하나는, 스캐폴드는 접힐 수 있으며 최소한 침습적인 복강경 방법(laparoscopic methods)으로 현장에 전달할 수 있다.
생분해성 스캐폴드의 물리적 및/또는 기계적 성질은 의도된 용도에 따라 최적화될 수 있다. 최적화될 수 있는 변수는 중합체 성분을 포함하는 네트워크에서의 물리적, 화학적 또는 광-광적(photo-oxidative) 가교의 정도, 네트워크 내의 중합체 성분의 비율, 중합체 성분의 분자량 분포, 및 중합체를 가공하는 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 중합체는 전형적으로 반결정질(semicrystalline)이며, 그의 물리적 특성 및/또는 형태는, 단량체 조성, 다분산도(polydispersity), 평균 분자량, 가교 결합 및 용융/결정화 조건을 포함하는 다수의 인자에 의존한다. 예를 들어, 중합체 용융물의 냉각 동안의 유동 및/또는 전단 조건은 조성물 중의 결정질 구조 형성에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 하나의 비한정적인 실시양태에서, 스캐폴드는 스캐폴드의 강도 및 내구성을 제공하지만 스캐폴드의 기계적 특성이 조직 재생을 필요로 하는 상처 또는 부위를 둘러싼 고유 조직과 유사하도록 엘라스토머(elastomeric)인 중합체 성분을 포함한다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 특정 비제한적인 실시양태에 따르면, 생분해성 스캐폴드의 하나 이상의 중합체 성분은 엘라스토머성이다. 하나의 비제한적인 실시예에서, 스캐폴드는 연골과 유사한 물리적 특성을 갖는다. 특정 비제한적인 실시양태에서, 생분해성 스캐폴드는 고팽창성(highly distensible) 중합체 성분을 포함한다. 적합한 중합체의 실시예는 약 20 % 내지 800%, 또는 325% 내지 600% 사이의 임의 증분을 포함하여, 약 100% 내지 약 900% 범위의 파단 변형(breaking strain)을 갖는 중합체를 포함한다. 다른 비한정적인 실시양태에서, 중합체의 파단 변형은 그 사이의 임의 증분을 포함하여 50% 내지 100%이다. 또한, 10 MPa 내지 30 MPa의 인장강도(tensile strengths)를 갖는 중합체, 예컨대 5 내지 25 MPa 및 8 내지 20 MPa 사이의 증분을 포함하는 중합체를 선택하는 것이 종종 유용하다. 특정 비제한적인 실시양태에서, 초기 탄성률(initial modulus)은 10 kPa 내지 100 MPa 사이이고, 10 MPa 내지 90 MPa 사이 및 20 MPa 내지 70 MPa 사이에서 증가한다.
본 발명은 하기의 비한정적인 실시예에 의해 예시된다.
실시예
재료 및 방법
화학물질 및 시약. Porcine Stomach Mucosa 유래의 펩신은 MP Biomedical (Solon, OH)에서 입수했다. Clostridium histolyticum 유래의 콜라게나아제는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO)에서 입수했다. Proteinase K 솔루션인 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit 및 RNase A는 Thermo Scientific(Waltham, MA)에서 구입했다. RNase-free DNase는 Qiagen(Valencia, CA)에서 입수했다.
ECM 바이오스캐폴드 생산.
진피 ECM. 진피 ECM은 이전과 같이 제조하였다. 간단히, 전체 두께의 피부은 시판 체중(~ 110 kg)의 돼지(Tissue Source, Inc., Lafayette, IN)로부터 수확하고, 기계적 박리(delamination) 후 0.25% 트립신(Thermo Fisher Scientific, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)으로 6시간, 70% 에탄올로 10시간, 3% H2O2로 15분, 용액 변화와 함께 0.26% EDTA/0.69% Tris 중 1% Triton X-100 추가 16시간, 0.1% 과초산/4% 에탄올(Rochester Midland, Rochester, NY)로 2시간 동안 처리함으로써 피하 지방(subcutaneous fat) 및 표피(epidermis)를 제거하였다. 마지막 단계 후에 물과 인산염 완충식염수(PBS)를 번갈아 가면서 각 화학적 변화 사이에 물 세척을 수행했다. 모든 화학물질 노출은 300 rpm의 궤도 진탕기에서 교반하에 수행되었다. 이어서, 진피 ECM을 #40 메시 스크린을 갖는 와일밀(Wiley Mill)을 사용하여 동결 건조시키고 미립자 형태로 분쇄하였다.
요로 방광 매트릭스(UBM). UBM은 기존에 기술된 대로 준비되었다(Wolf et al., Biomaterials 2012 Oct; 33 (29) : 7028-38). 시판 체중 동물에서 얻은 돼지의 방광은 Tissue Source, LLC에서 구입했다. (Lafayette, Indiana). 간단히 말하면, 장막(tunica serosa), 외근층(tunica muscularis externa), 점막하조직(tunica submucosa) 및 근층(tunica muscularis)이 기계적으로 제거되었다. 점막(tunica mucosa)의 루미날 방광세포(luminal urothelial cells)는 탈이온수(DI)로 세척하여 기저막으로부터 해리시켰다. 나머지 조직은 기저막과 점막 하부의 고유판으로 이루어졌으며, 4% 에탄올을 넣은 0.1% 과초산에서 300 rpm으로 2시간 동안 교반하여 탈 세포화시켰다. 이 조직을 인산염 완충식염수(PBS)와 멸균수로 광범위하게 헹구었다. 이어서, UBM을 #60 메시스크린을 갖는 와일밀(Wiley Mill)을 사용하여 동결 건조하고 미립자 형태로 분쇄하였다.
소장 점막하조직(Small Intestinal Submucosa; SIS). SIS 바이오스캐폴드의 제조는 이전에 설명되었다. 간단히, 공장(jejunum)은 6개월 된 시판 체중(240-260 lbs)의 돼지에서 수확하여 세로로 나누었다. 점막의 표면층은 기계적으로 제거되었다. 마찬가지로, 장막 및 외근층은 기계적으로 제거되어 점막하층과 기저(basilar) 부분을 남겼다. 조직의 탈세포화 및 소독(disinfection)은 4% 에탄올을 함유한 0.1% 과초산에서 300 rpm으로 2시간 동안 교반함으로써 완료되었다. 이 조직을 인산염 완충식염수(PBS)와 멸균수로 광범위하게 헹구었다. 그 다음, SIS를 #60 메시스크린을 갖는 와일밀(Wiley Mill)을 사용하여 동결건조시키고 미립자 형태로 분쇄하였다.
BARD XenMatrix TM (돼지 진피), ACell ® MatriStem ® (돼지 UBM) 및 Cook ® Biotech, Biodesign ® (돼지 SIS)는 각 장치 제조업체에서 제공한 것이다.
ECM 샘플의 효소적 절단(enzymatic digestion). ECM 샘플을 동결건조하여 수작업으로 작은 조각으로 절단하고 와일밀 #60 메시스크린을 사용하여 분말로 분쇄하였다. 효소적 절단은 상온에서 24시간 동안 완충액(50 mM Tris-HCl, pH8, 200 mM NaCl) 중의 0.1 mg/ml 프로테이나아제 K로; 실온에서 24시간 동안 완충액(50 mM 트리스 pH8, 5 mM CaCl2, 200 mM NaCl) 중 콜라게나아제 0.1 mg/ml; 또는 완충액(0.01 M HCl) 중의 1 mg/ml 펩신을 실온에서 24시간 동안 처리하여, 각 샘플의 5 mg/ml 건조 중량을 절단시켜 수행하였다. 핵산 추출 전, 펩신 가용화 샘플을 NaOH로 pH 8.0으로 중화시켰다. 효소처리 없이 염분 완충액(50 mM Tris-HCl, pH 8, 200 mM NaCl) 또는 산완충액(0.01 M HCl)에 각 시료의 5 mg/ml 건조 중량을 재현탁하여 절단되지 않은 시료(대조군)를 준비하였다.
핵산 추출 및 프로파일링. 같은 부피의 페놀:클로로포름, pH8을 첨가하여 ECM 분말 시료에서 핵산을 추출하였다. 샘플을 간단히 볼텍싱하고, 12,000 x g에서 10분간 원심분리하고, 수성상을 새로운 튜브로 옮겼다. 1/10th 부피의 3 M 아세트산 나트륨 및 3 부피의 100% 에탄올을 첨가하여 핵산을 침전시키고, 역전으로(inversion) 혼합하고 20,000 x g, 4℃에서 20분간 원심분리하였다. 핵산 펠렛을 75% 에탄올로 1회 세척하고, 핵산분해 효소가 없는 물에 재현탁하였다. 회수된 핵산의 염기길이는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies)를 사용하거나 2%(wt/vol) 아가로스겔 및 브롬화 에티듐(ethidium bromide) 염색법으로 전기영동하여 분석하였다. 전체 핵산의 정량은 Thermo Scientific NanoDrop 1000 분광광도계를 사용하여 260 nm에서 UV 흡광도로 수행하였다. dsDNA의 정량은 제조업체 권장 프로토콜에 따라 Quant-iT PicoGreen dsDNA 분석키트를 사용하여 수행했다.
RNA 분리. 세포질 RNA 뿐만 아니라 ECM "자유 RNA"(탈세포롸 과정의 결과로 ECM 바이오스캐폴드 내에 함입됨)는 miRNeasy Mini 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 분리했다. 나노소낭 RNA는 제조사의 지침에 따라 SeraMir kti(SBI, Mountain View, CA)를 통해 분리되었다. RNA를 분리하기 전에 샘플은 RNase(ABI, Foster City, CA) 2 unit (10 μg / mL)을 37℃에서 30분 동안 처리하여 잔여 RNA("자유 RNA")와 같은 오염 RNA를 분해시켰다. RNase 억제제(ABI, Foster City, CA)를 첨가하여 반응을 종결시켰다. Nanodrop 분광 광도계(NanoDrop, Wilmington, DE)를 사용하여 RNA 양을 측정하고 Agilent Bioanalyzer 2100(Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 통해 품질을 결정하였다.
나노소낭 분리. 절단(digest)은 500 g(10분), 2,500 g(20분) 및 10,000 g(30분)의 연속 원심분리를 통해 콜라겐 섬유 잔해를 제거했다. 상기 원심분리 단계 각각을 3회 실시하였다. 섬유가 없는 상층액을 4℃에서 70분 동안 100,000 g(Beckman Coulter Optima L-90K 초원심분리기)으로 원심분리하였다. 100,000 g 펠릿을 세척하고 500 ㎕의 PBS에 현탁시켰다. 상기 절차는 ECM이 없는 절단효소(digest enzyme) 상에서 대조군으로서 수행되었다.
나노소낭 이미징. 전송 전자 현미경 (Transmission electron microscopy; TEM) 이미징은 탄소 코팅 그리드(carbon-coated grids)에 로딩되고 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에 고정된 ECM 소포에서 실시되었다. 그리드는 고해상도 AMT 디지털 카메라가 장착된 JEOL 1210 투과 전자 현미경으로 80 kV에서 이미징되었다. MV의 크기는 JEOL TEM 소프트웨어를 사용하여 대표 이미지로부터 결정하였다.
겔 전기영동 및 웨스턴 블로팅. 나노소낭 단백질 농도는 Pierce의 바이신코닉산(bicinchoninic acid) 단백질 정량 분석 키트(Pierce Chemical, Rockford, IL)를 사용하여 측정하고 5% β-머캅토에탄올(β-mercaptoethanol)(Sigma, St. Louis, MO)을 함유한 얇은 판 버퍼(lamellae buffer)(R & D Systems, Minneapolis, MN)에 재현탁했다. 5%-15% 농도구배 SDS-PAGE(Bio-Rad, Hercules, CA)의 웰에 같은 농도의 단백질을 넣었다. 겔은 이중 증류수에서 러닝버퍼(running buffer)(25 mM Tris 염기, 192 mM 글리신 및 0.1% SDS) 중 150 mV에서 Mini-Protean 전기영동 모듈 어셈블리(Bio-Rad)를 사용하여 실행한 후, 폴리비닐리덴 디플루오라이드 멤브레인(polyvinylidene difluoride membranes)(Millipore, Bedford, MA)에 트랜스퍼 버퍼(transfer buffer)(25 mM Tris, pH 7.5, 192 mM 글리신, 20% 메탄올 및 0.025% 나트륨 도데 실 설페이트)로 280 mA에서 45분 동안 처리하였다. 이어서 멤브레인을 Pierce 단백질이 없는 블로킹 완충액(Pierce Chemical, Rockford, IL)으로 45분 동안 블로킹하고 일차 항체인 CD63 및 CD81 (SBI, Mountain View, CA)과 함께 밤새 배양하였다. 멤브레인을 적당한 이차 항체와 함께 항온처리하기 전후에 각각 15분 동안 3회 세척하였다. 세척된 멤브레인을 화학 발광기질(Bio-Rad)에 노출시킨 후 켐닥 터치 장치(chemidoc touch instrument)(Bio-Rad)를 사용하여 시각화하였다.
나노소낭 크기 결정. 나노소낭은 입자가 없는 PBS로 희석하고 설명된대로 Nanoparticle Tracking Analysis (NTA)를 사용하여 그 크기를 결정했다(Webber, J.　&　Clayton, A.　How pure are your vesicles?). 간략하게, NTA 측정은 NanoSight LM10 장비(NanoSight NTA 2.3 Nanoparticle Tracking and Analysis Release Version Build 0025)를 사용하여 수행되었다. 나노소낭 입자의 크기 분포는 빠른 비디오 캡처 및 입자 추적 소프트웨어가 장착된 NanoSight LM10 시스템(NanoSight, Wiltshire, United Kingdom)으로 브라운 운동 속도(rate of Brownian motion)를 측정하여 분석했다. 나노소낭은 입자가 없는 PBS로 희석하고 NanoSight 샘플 칸막이에 주입했다. 평균±표준편차(SD) 크기 분포가 결정되었다.
RNA 시퀀싱. 작은 RNA 라이브러리는 Ion Total RNA Seq Kit v 2를 사용하여 제조사의 지침에 따라 준비했다. 간단히, 10~200nt 범위의 RNA의 비드 기반 사이즈 선택 후, cDNA는 역전사 및 PCR에 이어서 색인 서열분석 어댑터의 하이브리드화 및 라이게이션(ligation)에 의해 생성되었다. 증폭된 라이브러리를 다시 비드 기반 방법을 사용하여 크기를 선택하고 라이브러리 분석기에서 실행하여 라이브러리 크기 분포가 예상대로 이루어졌는지 확인했다. Ion One Touch 2 System을 사용하여 준비된 라이브러리와 템플리트화된(templated) Ion Sphere™ Particle(ISP) 농축액의 자동화된 유화 PCR을 수행했다. 시퀀싱은 단일 P1 시퀀싱 칩을 사용하여 Ion Proton에서 수행하였다. 모든 시퀀스 데이터가 보고되도록 품질 필터가 제거되었다. 시퀀스는 품질 관리(FASTQC)를 위해 분석되었고 인간 게놈(HG19)에 토렌트 스위트를 사용하여 정렬(aligned)되었다. 출력 파일(.bam)을 업로드하고 miRBase V.20에 매핑한 다음 CLC Genomic(Qiagen, Valencia, CA)을 사용하여 더 분석했다. 읽기(reads)는 백만 분의 읽기(RPM)로 표준화되었다.
생체 경로 분석(ingenuity pathway analysis). RNA 시퀀싱을 통해 확인된 miRNA를 Ingenuity Pathway Analysis(IPA)로 분석하여 miRNA 신호경로 시그니처를 결정했다.
qPCR. iNOS, TNFa, STAT1, STAT2, STAT5A, STAT5B, IRF3, IRF4, IRF5, IL1RN, CD206, TGM2, STAT3, STAT6, KLF4, PPARg의 상대적인 발현 수준을 결정하기 위해 Sybr Green 유전자 발현 분석(ABI, Foster City, CA)이 사용되었다. 결과를 정상화(normalize)하기 위해 β-글루쿠로니다제(β-GUS) 대조군을 사용하여 ΔΔCt 방법으로 분석하였다. 폴드 변화는 나노소낭 대조군을 기준으로 계산되었다.
세포 배양. 혈관 주위 줄기세포(PVSC)는 이전에 기술된 바와 같이 분리되었다(Timothy et al., Biomaterials. 2013 Sep; 34(28): 6729-6737). 분리된 세포를 20% 태아소혈청(FBS, Thermo fisher), 100 U/mL 페니실린(penicillin) 및 100 μg/mL 스트렙토마이신(streptomycin)(Sigma Aldrich)이 함유된 고포도당 Dulbecco 's modified Eagle 배지(DMEM, Invitrogen)에서 37℃, 5% CO2에서 배양하였다.
C2C12 근육 근섬세포를 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)으로부터 수득하고, ATCC 지침에 따라 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Sigma Aldrich)을 첨가한 DMEM(Invitrogen)에서 배양하였다.
THP-1 인간 단핵구는 ATCC에서 얻었으며 37℃, 5% CO2의 가습 분위기에서, RPMI, 10% FBS, 1% 페니실린/스트렙토마이신 및 0.05 mM β-머캅토에탄올로 유지시켰다. 웰 당 2백만 THP-1 세포를 320 nM 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(phorbol 12-myristate 13-acetate)(PMA)로 24시간 동안 플레이팅하여 대식세포로의 분화를 유도하였다. 접착성 대식세포를 PBS로 세척하고 신선한 배지에 넣은 후, 신선한 배지에서 72시간 배양하여 휴식시켰다. PMA로 분화되고 휴지된 THP1 대식세포는 인간 말초혈액 대식세포와 거의 구별할 수 없는 활성을 나타내는 것으로 나타났다(Diagneault et al., PLoS One　2010 Jan 13;5(1):e8668). 이전에 기술된 바와 같이(Sicari et al., Biomaterials　2014 Oct;35(30):8605-12) 마우스 골수 유래 대식세포(BMDM)를 분리하고 특성화하였다. 간략하게, 6-8주된 C57bl/6 마우스에서 골수를 수확했다. 무균 기술을 사용하여 근위부 뒷다리(proximal hind limb)에서 발에 이르는 피부를 제거하고 족근(tarsus) 및 무릎관절(stifle)을 탈구시키고 경골(tibia)을 분리했다. 유사하게, coxafemoral 관절은 대퇴골의 고립을 위해 탈구되었다. 뼈를 얼음에 보관하고 DMEM, 10% 태아소혈청(FBS), 10% L929 상청액, 0.1% 베타-머캅토에탄올, 10 ㎜ 비필수 아미노산 및 10 ㎎ hepes 완충액으로 이루어진 대식세포 완전 배지를 함유하는 멸균된 접시에서 헹구었다. 각 뼈의 말단을 절단한 다음 골수강(marrow cavity)을 30 게이지 바늘을 사용하여 완전한 배지로 플러시했다. 수확된 세포를 세척하고 106 세포/ml로 도말하고, 48시간마다 완전한 배지 교환으로 7일 동안 대식세포로 분화시켰다. 마우스 신경 모세포종(neuroblastoma) 세포주인 N1E-115 세포를 열-불활성화된 10% 소태아혈청을 첨가 한 Dulbecco 's modified Eagle 배지(DMEM)에서 성장시켰다. 나노소낭을 첨가하기 전에 1백만 세포를 6 웰 플레이트에 도말했다.
나노소낭 형광 라벨링. 나노소낭은 제조지침에 따라 Exo-glow(SBI, Mountain View, CA)를 사용하여 라벨링했다. 간단히, 500 ㎕의 재현탁된 나노소낭(resuspended naniclesicles)을 Exo-glow로 표지하고 37℃에서 10분 동안 배양한다. 100 ㎕ ExoQuick-TC를 첨가하여 반응을 정지시키고 샘플을 얼음에 30분 동안 두었다. 그 후 샘플을 14,000g에서 10분간 원심분리하였다. 상등액을 제거하고 펠렛을 500 ㎕의 1X PBS로 재현탁한다. 그 다음, 인 비트로(In-vitro)에서 세포를 4시간 동안 표지된 나노소낭에 노출시키고 Axio Observer Z1 현미경을 통해 영상화하였다.
인 비트로 스크래치 분석(In-vitro scratch assay). 세포를 상기와 같이 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 배양이 합류(24시간 후 배양)되었을 때, 나노소낭을 배양배지에 첨가하였다. p-200 피펫 팁을 사용하여 "상처"를 시뮬레이션하는 합류 세포층을 통해 두 개의 수직선을 채점했다. Axio Observer Z1 현미경으로 20분마다 이미지를 수집했다.
이동(migration) 분석. 나노소낭의 세포 기능을 수행하는 능력은 혈관주위 줄기세포(PVSC)에 대하여 8mm CytoSelect 세포이동분석(Cell Biolabs, San Diego, CA)을 통해 평가되었다. PVSC는 0.5% 열-비활성화된 FCS를 함유하는 성장인자를 첨가하지 않은 배지에서 14-17시간 동안 결핍되었고(starved), 나노소낭으로 처리되었다. 결핍된 세포를 트립신으로 수확하고, 4105 세포=mL의 농도로 무혈청 배지에 재현탁하고, 습윤 95% 공기=5% CO2 37℃ 배양기에서 1시간 동안 예비배양하였다. 96-웰 멤브레인 챔버 인서트를 공급기 트레이상에 놓고, 웰 당 40,000 세포의 최종 농도를 위해 100 μL의 세포 현탁액을 멤브레인 챔버의 각 웰에 첨가하였다. 플레이트를 덮고 95% 공기=5% CO2의 가습 분위기 하에 37℃에서 4시간 동안 항온처리하였다. 깨끗한 수확 트레이의 각 웰에 세포분리 용액 150 마이크로 리터를 첨가하였다. 96-웰 멤브레인 챔버를 공급기 트레이로부터 분리하고, 멤브레인 챔버의 상부면상의 남아있는 세포를 흡입에 의해 제거하고, 멤브레인 챔버를 세포분리 용액을 함유하는 수확 트레이 상에 놓고, 세포배양 배양기에서 1시간 동안 배양하였으며, 멤브레인의 바닥의 모든 세포를 수확 트레이 웰로 린스하였다. CyQuant GR Dye=세포용해 용액을 용해 완충액(1:75)에 염료를 희석하여 준비하고, 멤브레인 챔버를 수확 트레이에서 꺼내고, 50 mL의 염료=세포용해 용액을 수확 트레이의 각 웰에 첨가하였다. 트레이를 실온에서 20분 동안 배영하여 세포를 용해시키고 핵산을 염색시켰다. 각 웰의 내용물 150 마이크로 리터를 형광 측정에 적합한 플레이트로 옮겼다. 형광은 SpectraMax M2 플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 480-520 nm에서 측정하였다. 각각의 실험 조건을 3 반복으로 시험하고, 이동된 세포의 평균수를 각 조건에 대해 결정하였다. 2개의 쌍으로 된 t-테스트를 사용하여 나노소낭 처리된 세포와 대조군 사이의 유의한 차이를 검출하였다. P 값 <*0.05는 유의한 것으로 간주되었다.
대식세포 면역표지. ECM 분해물은 대식세포 표현형을 나타냈다. 대식세포가 포함된 미세소낭(microvesicles)이 대식세포 표현형에 유사한 효과를 갖는지를 평가하기 위해 대식세포 면역표지가 수행되었다. 초기 마우스 골수 유래의 대식세포(BMDM)를 분리하고, 전염증성(pro-inflammatory) "M1 유사" 및 "M2 유사"(각각) 표현형의 강한 지표자인 마커(iNOS 및 Fizz-1)를 사용하였다. 면역 형광 염색법에 사용된 일차 항체는: (1) 판대식세포 마커의 경우, 1:200 희석한 단일클론 항-F4/80(압캠, 캠브리지, MA), (2) M1 마커의 경우, 1:100 희석한 폴리클론 항-iNOS(압캠, 캠브리지, MA), (3) M2 마커의 경우, 폴리클론 항-Fizz1(Peprotech, Rocky Hill, NJ). 세포를 PBS, 0.1% Triton-X, 0.1% Tween-20, 4% 염소 혈청 및 2% 소혈청 알부민으로 구성된 블로킹 용액(blocking solution)에서 배양하여 실온에서 1시간 동안 비특이적 결합을 방지하였다. 블로킹 용액을 제거하고 세포를 일차 항체에서 4℃에서 16시간 동안 배양했다. PBS에서 세척 후, 세포를 실온에서 1시간 동안 형광 접합된 이차 항체(Alexa Fluor donkey anti-rat 488 or donkey anti-rabbit 488, Invitrogen, Carlsbad, CA)에 배양하였다. PBS로 다시 세척한 후, 핵을 영상화 전에 4'6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 대조염색하였다. 살아있는 세포 현미경(live-cell microscope)을 사용하여 각 웨에 대해 세 개의 20×필드의 이미지를 촬영했다. ECM 처리 대식세포에 대한 빛 노출시간은 대조군으로 사용되는 사이토킨-처리된 대식세포에 대해 설정된 것들을 기준으로 표준화되었다. 양성 F4/80, iNOS 및 Fizz-1 비율에 대해 CellProfiler 파이프라인을 사용하여 이미지를 정량화했다.
ECM 바이오스캐폴드 물질에서 핵산의 정량
ECM-나노소낭의 발견은, 탈세포화(decellularization) 과정의 잔재물로서 핵산의 다른 형태의 존재에 대한 바이오스캐폴드를 평가하는 연구의 예기치 않은 결과였다. 이중가닥 DNA(dsDNA)의 정량화는 탈세포화 효율을 평가하는 기준(metric)으로 일반적으로 사용되지만 RNA나 단일가닥 DNA(ssDNA)와 같은 다른 형태의 핵산의 정량은 이러한 분석에서 무시된다. 핵산의 다른 형태가 ECM 바이오스캐폴드에 존재하는지를 결정하기 위해, 핵산을 페놀:클로로포름 방법을 사용하여 분쇄된 (무 세포) ECM-스캐폴드 물질로부터 추출하였다. dsDNA의 정량은 PicoGreen 분석을 사용하여 수행되었으며 총 핵산의 정량은 RNA를 포함한 모든 형태의 핵산을 검출하는 260 nm의 UV 흡광도로 수행되었다. 그 결과, dsDNA의 양은 탈세포화된 ECM-스캐폴드 재료에 존재하는 총 핵산의 일부분만을 나타냈다(도 1). 놀랍게도, 이들 ECM-스캐폴드는 핵산 추출 전에 다양한 프로테아제로 먼저 효소적으로 절단된다면, 총 핵산의 양은 절단되지 않은 (대조군) 샘플에 비해 유의하게 증가한다는 것이 관찰되었다. 중요한 것은, 총 핵산의 증가는 dsDNA의 증가 때문이 아니라 핵산의 대체 형태가 ECM에 캡슐화되어 ECM으로 보호된다는 것을 의미한다. 이 패턴은 방광 매트릭스(UBM) 및 ACELL® MATRISTEM ™(도 1 A); 소장 점막하층(SIS) 및 쿡바이오텍(COOK BIOTECH®)에 의해 제조된 SIS(도 1B); 진피 및 Bard® XENMATRIX ™(도 1C)의 실험실 생산 및 시판용 등가물을 포함한 모든 형태의 ECM 스캐폴드 재료에서 관찰되었다. 또한 실험실에서 제조된 스캐폴드 및 이들의 상업적으로 사용가능한 동등물 사이의 핵산 농도도 비슷하므로 실험 결과가 표준 실험실 탈세포화 프로토콜의 결과물이 아님을 입증했다.
생물학적 스캐폴드의 효소적 절단은 작은 RNA 분자를 방출함
RNA가 ECM-스캐폴드에 존재하는지를 결정하기 위해, 핵산 추출물을 DNase I 또는 RNase A 핵산분해효소에 노출시키고, 생성물을 아가로오스겔 전기영동(Agarose gel electrophoresis)으로 분석하였다(도 2A). 그 결과, DNase I 처리가 ~25-200bp 사이에서 퍼진 밴드(smeared band)를 제외한 모든 핵산 물질을 제거함을 보여주었다. 상호적으로(Reciprocally), 이러한 짧은 길이의 핵산 분자가 실제로 작은 RNA 분자임을 나타내며, RNase A 처리는 이 작은 핵산 분획을 제거한다. 또한, 절단되지 않은 대조군 샘플과 비교하여, 이들 작은 RNA 분자는 ECM 스캐폴드가 효소적으로 절단된 후에만 효율적으로 추출될 수 있고(도 2A), 그 결과는 도 1에서 관찰된 총 핵산의 증가와 동등하였다. 핵산 프렙(preps)은 Agilent 2100 Bioanalyzer를 사용하여 추가 분석되었다(도 2B). 그 결과, 핵산분해효소에 노출되지 않은 샘플(도 2 B, 상단부)과 비교하여, DNase I 처리는 25-200bp 범위 내의 작은 RNA 분자를 제외한 모든 핵산 물질을 제거하여(하단부), ECM 스캐폴드 내 작은 RNA 분자의 존재를 확인했다. 도 2A 및 2B에 나타된 결과는 실험실에서 생산된 UBM 스캐폴드를 사용하여 얻었지만, 이 작은 RNA 분자는 시험된 모든 생물학적 스캐폴드에서 순차적으로 확인되었다(도 2C). 흥미롭게도, 핵산 추출 전에 효소적으로 절단된 ECM-스캐폴드를 RNase A 핵산분해효소로 전처리하는 것은 작은 RNA 분자를 제거하는데 실패했다(도 2D). RNase A가 효소적으로 절단된 형태의 ECM으로부터 작은 RNA 분자를 제거할 수 없다는 것은, RNA 화물을 핵산분해효소 활성으로부터 보호하는 나노소낭으로의 통합에 의해 RNA 분해효소로부터 RNA가 보호되고 있음을 보여 준다(Koga et al., J Gastrointest Oncol. 2011; 2(4): 215-222).
ECM에 내포된 나노소낭의 동정
ECM 내에 삽입된 나노소낭의 첫 번째 증거는 사산화 오스뮴(osmium tetroxide)이 고정된 UBM 시트에서 투과전자현미경(TEM)을 사용하여 얻어졌다. 둥근 구조는 오스뮴에 대해 양성 반응을 나타내어 지질막의 존재를 나타낸다(도 3A). 이러한 관찰은 ECM-스캐폴드 물질의 효소적 절단 후에 이들 나노소낭이 매트릭스로부터 분리될 수 있음을 입증하였다. 부분적으로만 ECM-스캐폴드를 절단시키는 펩신 프로테아제(Pepsin protease)를 이용한 효소 절단(도 3B, 왼쪽)은 이러한 나노소낭이 문자 그대로 매트릭스 자체의 콜라겐 네트워크에 짜여져 있음을 나타낸다. 그러나, 콜라게나아제 또는 프로테이나아제 K와 ECM-스캐폴드의 완전 절단 후, 이 나노소낭은 섬유 네트워크에서 완전히 분리될 수 있다. 이 소포의 구조, 구성 및 크기는 나노소낭 및 엑소좀에서 예상되는 것과 호환된다. 초원심분리와 결합된 효소 절단의 전략을 이용함으로써, 상업적으로 이용가능한 제품을 포함하는 모든 시험된 형태의 ECM-스캐폴드 물질로부터 이들 나노소낭을 분리하고 정제하였다(도 3 C). 이 결과는 세포외 기질 내에 박혀 있는 나노소낭의 첫 확인을 나타낸다.
그런 다음 SDS PAGE와 실버스테인(Silverstain)을 통해 다른 제품들 사이에서 나노소낭 단백질 화물을 평가했다. 서로 다른 상업용 제품 및 이들과 병행한 자체제품(in-house) 간의 밴드 패턴은 뚜렷하게 다르다는 것이 발견되었다. 흥미롭게도, 자체제품, UBM 및 SIS 제품 모두 유사한 밴딩 패턴을 나타내었다(도 3 D).
CD63 및 CD81은 엑소좀에 가장 일반적으로 사용되는 검증 표면 마커이다. 웨스턴 블롯 분석을 사용하여(도 3E) CD63 또는 CD81의 모든 샘플에서 양성 밴드는 검출되지 않았다. 양성 대조군, 인간 골수유래 중간엽 줄기세포 엑소좀은 두 개의 마커에 대해 양성이었지만, 인간 혼주혈청(pooled serum) 엑소좀은 CD63에만 양성이었다. 이것은 ECM 내에 박혀있는 나노소낭 및 엑소좀이 순환하는 엑소좀과는 다른 특성을 가지고 있음을 나타낸다.
Nanoparticle Tracking Analysis(NTA)는 각 샘플에 대한 나노소낭의 평균 크기를 결정하기 위해 수행되었다. 모든 샘플은 107 nm~216 nm 범위의 나노소낭 크기와 일치하는 것으로 나타났다(도 3F).
NGS는 나노소낭 화물 내 독특한 miRNA 시그니처를 발견함
다른 상업적 제품 및 평행한 자체에서 분리된 ECM 나노소낭을 RNAse로 30분 동안 처리하여 RNA 분리단계 전에 탈세포화 과정("자유 RNA")에서 남은 임의의 RNA를 분해했다. 이 단계는 RNA 시퀀싱 데이터가 나노소낭 내의 RNA만을 나타낼 수 있도록 하기 위해 수행되었다. 흥미롭게도 나노소낭은 RNA 화물을 보호할 수 있었으며 RNA 농도에서 주목할 만한 변화는 발견되지 않았다. RNA 시퀀싱을 수행하여 각 샘플에서 특유의 작은 RNA 프로필을 결정했다. 서열분석 데이터는 인간게놈(HG19)에 정렬되기 전에 fastQC를 사용하여 품질 검사를 받았다. 그런 다음 추가 분석을 위해 샘플을 표준화하고 miRBase(release 21)에 매핑했다. 33-240개의 miRNA가 샘플당 확인되었으며 MIRNA가 ECM에 내포된 나노소낭에 풍부하게 존재함을 확인했다(도 4A). 자체제품의 진피 표본은 다른 miRNA가 가장 적게 나타났지만(33), 자체체품 UBM이 가장 많았다(240). 특히 상업용 제품 및 자체 제품간에 50% 이상의 상호(mutual) miRNA가 있었으며, ACELL®MATRISTEM® 및 UBM 사이에는 거의 80%가 겹쳤다(도 4 A). Ingenuity pathway analysis(IPA)는 경로, 세포 및 생리 기능을 확인하는 데 사용되었다. 놀랍게도, 모든 샘플은 세포 발달, 세포 성장 및 증식, 세포 사멸 및 생존, 세포 운동 및 세포주기에 유의적으로 관여하는 것으로 밝혀졌다(도 4B). 또한 miRNA가 결합 조직 발달 및 기능(자체 제품 UBM 제외), 유기체 발달(자체 제품 진피 및 COOK® Biotech 제외) 및 장기 개발(BARD XENMATRIX TM 제외)에서 중요한 역할을 한다는 것을 확인했다(도 4C). 모든 샘플의 miRNA는 또한 조직 손상 및 이상(abnormalities)에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 자체 제품 UBM은 골격 및 근육 질환과 관련된 유일한 샘플이었다. 이러한 결과는 ECM이 하류(downstream)에 미치는 영향을 부분적으로 설명할 수 있다.
ECM에 내포된 나노소낭에의 노출은 세포의 행동을 바꿀 수 있음
UBM으로부터 분리된 나노소낭은 Orange Acridine 화학에 기초하여 표지되었다. 도 5A에서, 적색 형광은 RNA를 나타내지만 녹색 DNA를 나타낸다. 성공적인 나노소낭 내용물 표지(content labeling)가 시연되었으며, 근육 모세포(muscle myoblast) C2C12 세포에 의해 휩싸인 나노소낭 화물이 시연되었다. 이 실험은 분리된 나노소낭 내용물이 표적 세포와 통합될 수 있다는 개념을 증명한다.
신경 모세포종 세포(N1E-115)는 UBM-ECM 분해물 치료 5일 후 신경돌기 확장을 갖는 것으로 밝혀졌다. 그 효과는 콜라게나아제으로 절단된 UBM으로부터 분리된 나노소낭만을 사용하여 모방되었다. 인상적으로, UBM 나노소낭에 노출된지 3일 이내에 N1E-115 세포는 신경돌기 확장을 보였으나 대조군에서는 변화가 없었다(도 5B).
그런 다음 나노소낭에 노출된 혈관주위 줄기세포(Perivascular stem cell, PVSC)가 융합된 배양물에서 긁힌 부위(scratched area)를 다시 채우는 능력에 영향을 줄 수 있는지를 결정했다. 도 5C에 묘사된 것처럼, 나노소낭에 노출된 PVSC는 노출 24시간 후 스크래치 분석에서 상처 부위에 대한 완전한 합류를 회복하는 속도가 더 빠르다. 또한, 대조군에 비해 나노소낭에 노출된 것에서 96시간 후에 세포 수의 증가가 관찰되었다(도 5D).
ECM에 내포된 나노소낭의 영향을 대식세포 분극(macrophage polarization)으로 평가하였다. ECM 분해산물(UBM 및 SIS와 같은)이 M2 "유사" 표현형을 촉진할 수 있다는 것이 밝혀졌다(Sicari et al., Biomaterials　2014 Oct;35(30):8605-12) BMDM은 24시간 동안 UBM으로부터 분리된 나노소낭에 노출되었다. 나노소낭에 노출되면 IL-4에 노출된 대조군과 유사한 M2 "유사" 대식세포 활성화가 촉진되었다. M2 대식세포 표현형은 Fizz-1 면역형광법(immunofluorescence) 염색을 사용하여 확인되었다. 주목할만한 변화는 M1 마커 iNOS에서 발견되지 않았다.
qPCR을 사용하여 24시간 동안 THP-1 세포에서 나노소낭 노출 후, M1 및 M2 관련 마커 모두에 대해 유전자 발현을 조사하였다. M1 마커에는 유의한 변화가 나타났다. TNF-α, STAT5A/B 및 IRF5 유전자 발현 수준의 증가가 관찰되었지만 STAT1/2 발현 수준은 감소했다. M2 관련 마커 패널에서, TGM2 및 IRF4는 나노소낭 노출 후 증가를 보였으나 IRF4 만 통계적으로 유의한 것으로 나타났다.
추가 분리 방법
도 8A 및 도 8B에 도시된 프로토콜은 조직 내의 엑소좀의 분리를 허용한다. 조직(전처리, 동결건조, 냉동, 생검, 부검 또는 다른 출처)의 조각(piece)은 먼저 효소적으로 절단시킨 후 차별화된 원심분리를 통해 최종 샘플에서 원하지 않는 세포, 세포 잔재물 및 기타 오염원을 제거한다. 이러한 원심분리 단계 후에, 상층액은 이오딕사놀(iodixanol), 자당(sucrose) 또는 다른 밀도 구배(gradient) 매질로 만들어질 수 있는 밀도장벽(density barrier)을 포함하는 구배 위에 놓는다. 이 배지의 농도는 분리될 엑소좀의 조직 및 프로파일에 따라 다양할 수 있다. 그런 다음 구배(gradient)를 초원심분리한 다음, 밀도 장벽의 분획을 수집하고 다시 한번 초원심분리하여 밀도 구배 매질 및 기타 원하지 않는 잔여물을 씻어낸다. 최종 보존 된 펠렛은 조직의 초기 조각으로부터 분리된 엑소좀이다.
조직으로부터 수집된 엑소좀은 본 명세서에 개시된 임의의 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 방법은 또한 프로파일링, 세포 치료 및 조직 샘플에 존재하는 엑소좀의 추가 특성 분석에도 사용된다.
세포를 모집하고, 세포 성장을 촉진시키며, 세포 분화를 촉진시키는 ECM-ㄴ나노소낭의 사용
이전 연구에 따르면 (무세포) ECM 바이오스캐폴드 물질은 구조적, 기능적 골격근 복구 및 재생을 촉진할 수 있다(Mase et al., Orthopedics. 2010;33(7):511; Sicari et al., Tissue Eng Part A. 2012; 18(19-20): 1941-1948). ECM-나노소낭은 온전한 ECM 스캐폴드로 관찰된 기능성 근육 리모델링 반응을 재현할 수 있다. 체적 근육 손실(volumetric muscle loss)의 마우스 모델이 사용된다. 근육 손상부위에 ECM 스캐폴드를 배치하면 구조적 개조결과(constructive remodeling outcome)에 대한 반흔 조직 침착(scar tissue deposition)의 기본응답(default response)에서 크게 벗어나는 것으로 나타났다(Sicari et al., Tissue Eng Part A. 2012; 18(19-20): 1941-1948). ECM 나노소낭은 내인성 줄기/전구세포, 지역적 혈관신생(regional angiogenesis), 내재적 면역 반응의 신경 자극 전달(innervation) 및 조절(modulation)의 모집(recruitment) 및 분화(differentiation)를 포함하여 온전한 생물학적 스캐폴드에 기인한 많은 효과를 촉진한다.
a. 체적 근육 손실의 마우스 모델: αSMA 프로모터의 조절하에 GFP를 발현하는 αSMA-GFP 마우스 모델(C57BL6)이 본 연구에 사용되었다. 이 형질전환 마우스 모델(Yokota et al., Stem Cells. 2006;24(1):13-22; Kalajzic et al., Bone. 2008;43(3):501-510)은 골격근 재생 동안 선조세포(progenitor cells)가 침투하는 것을 추적할 수 있다. 마우스의 대퇴근 근육에 심각한 크기의 결함이 생긴다. 간단히 말하자면, 허벅지의 근위-원위축(proximal-distal axis)에 평행한 0.5-1.0 cm 절개가 대퇴사두근(quadriceps muscle) 바로 위에 만들어진다. 무균 생검 펀치(sterile biopsy punch)를 사용하여 약 3 mm2(약 70% 결함)의 근육 부분을 제거한다. 결함은 다음 시험 항목 중 하나로 대체된다: 1) ECM 하이드로겔, 2) 멸균 PBS에 현탁된 ECM-나노소낭 또는 3) PBS 비히클 대조군. 수리되지 않은 결함은 대조군 역할을 한다. ECM-하이드로겔 시험 물질은 결함 내에 겹쳐져 있으며, 동일한 ECM 시트로 덮여 있고, 조직 수확시 상해 및/또는 이식 부위를 명확히 식별할 수 있도록 비분해성 폴리프로필렌 봉합사(non-degradable polypropylene sutures)를 배치한다. ECM-나노소낭 및 PBS 대조군 치료는 부상 부위 경계의 상처 가장자리에 직접 주입하여 시행한다. 나노소낭 정량 및 용량반응 실험은 생체 내 연구에 사용될 적절한 농도를 결정하기 위한 가이드라인으로 사용된다. ECM-나노소낭 치료를 받는 동물들은 무작위로 2개의 분리된 그룹으로 나뉘어진다: 그룹 1은 부상시 단일 주사를 받고, 그룹 2는 부상당한 후 4 및 7일에 추가 주사를 받는다. 마우스는 수술 후 조기(3, 6, 12 및 24시간), 및 후기(4, 7, 14 및 28일)를 포함하는 지정된 시간대에 희생된다. 매번, 결함 부위는 주위의 원주 조직(native tissue)의 작은 부분으로 외과적으로 옮겨진다. 표본크기는 0.05 미만의 유의성을 얻기 위해 전력분석(power analysis)에 의해 결정되고 통계분석이 수행된다.
조직형태학적 분석(Histomorphologic Analysis). 체외 표본(explanted specimens)을 포르말린에 고정시키고 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin)으로 염색한다. 조직 절편은 염증 및 조직 개조 반응의 측면에 대해 이전에 검증된 정량적 기준을 사용하여 평가된다(Valentin et al., J Bone Joint Surg Am. 2006;88(12):2673-86). 기준에는 세포 침투 밀도, 침윤 세포의 표현형, 혈관 형성(vascularity), 결합 조직 구성, 캡슐화(encapsulation) 및 이식 부위 내 근육세포의 존재 등이 포함됩니다. 봉합 부위는 형태학적평가에서 회피된다.
면역표지(immunolabelling)에 의한 대식세포 표현형의 결정. 면역표지는 알려진 바와 같이 임플란트 부위(implant sites)의 섹션에서 수행된다(Brown et al., Acta Biomater. 2012;8:978, 2012). 각각의 체외 표본은 판대식세포 마커(CD68), M1 대식세포 표현형 마커(CCR7) 및 M2 대식세포 표현형 마커(Fizz1)에 대한 항체에 노출된다. 면역표지된 표본을 검사하고 Nuance multi-spectral imaging system이 장착된 Nikon e600 현미경을 사용하여 이미지화한다. 형광 이미지는 자가형광 제거 및 정량분석을 위해 스펙트럼 비혼합(spectral unmixing) 및 재착색(re-coloring)을 거친다. M1(CCR7+) 세포에 대한 M2(Fizz1+) 세포의 수의 비율을 결정하기 위해 이미지를 맹검방식(blinded fashion)으로 평가한다.
기능 평가. 개조된(remodeled) 조직의 기능은 인 비트로 근육 수축 연구에 의해 평가된다. 인 비트로 장기 바스 시스템(organ bath system)은 전기장 자극에 반응하여 개조된 근육과 손상되지 않은 근육 모두에서 분리된 대퇴사두근 스트립에 의해 생성되는 수축력을 연구하는데 사용된다. 최대 트위치 응답(maximal twitch response)을 생성하기 위한 최적의 전압 및 조직 길이가 결정되고 기록된다. 재생된 조직의 기능적 신경 분포는 또한 표지된 알파-방갈로톡신(alpha-bungarotoxin) 및 베타-튜불린3(beta-tubulin 3)에 대한 면역표지를 사용하여 평가되어 신경 섬유 및 기능적 모터 종판(endplates)을 확인한다. 근육 수축 및 신경 라벨링의 조합은 근력과 기능의 평가를 용이하게 한다.
혈관주위 세포(perivascular cells)의 이동. 혈관주위 전구세포의 손상부위로의 침윤은 CD146 및 NG2에 대한 양성 염색으로 공동 위치된(co-localized ) GFP-신호의 검출을 통해 평가된다. 골격근(MyoD, 골격근 액틴, 미오신 및 칼케스트린(calsequestrin)), 신경(베타-튜불린3, 신경섬유(neurofilament), GFAP) 및 혈관(CD31, von Willebrand factor)에 대한 마커를 사용하여, 골격근 결손의 조직 개조에 대해 혈관주위 세포의 기여를 시간경과에 따라 조직학적으로 평가한다. GFP 라벨과 함께 이러한 마커의 공동위치는 골격근육 조직개조의 핵심구조로 이러한 세포의 차별을 식별하는데 사용된다. 또한, 혈관주위 세포, 즉 CD146, NG2 및 CD133에 대한 면역마커를 사용하여 재건된 조직 내 미분화된 혈관주위 세포의 존재를 확인한다. 근육 섹션은 또한 증식에서 분화로의 재생에서의 형태변화를 형태학적으로 평가하기 위해, 세포증식의 다중마커(예: Ki67, PCNA)에 대해 면역조직화학적으로 염색된다.
바이오스캐폴드로부터 분리된 ECM-나노소낭의 첨가는 구고적 M2-유사 대식세포 표현형에 대한 면역조절반응을 증가시키고, 증가된 신경분포를 동반하여 새로운 근육섬유로 이동하는 혈관주위세포의 증가된 분화를 촉진시킨다. 그러나 개선이 이루어졌지만 모든 근육기능이 완전히 회복되지는 않았다.
따라서, ECM에 내포된 나노소낭은 순환하는 엑소좀과는 다른 생물학적 특성 및 기능을 갖는 엑소좀의 독특한 부류를 나타내며, 건설적이고 기능적인 리모델링과 관련된 ECM 스캐폴드의 유도적 성질의 많은 부분을 중재한다.
ECM 유래의 나노소낭은 염(KCl)을 첨가하여 PBS에서 ECM을 재현탁시킴으로써 분리될 수 있음
요로방광(UBM)에서 동결건조된 ECM 100 ㎎을 PBS에 재현탁하고, 37℃에서 30분 동안 수화시킨 후, 상이한 농도의 KCl을 UBM-PBS 현탁액에 첨가하였다. KCl 현탁액을 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 시료를 4,500G에서 30분 동안 원심분리하여 ECM 성분을 제거하고 상층액을 수집하여 0.2 μM 필터를 통과시킨 후 초원심분리 튜브로 옮기고 100,000G에서 2시간 동안 초원심분리하여 MBV를 수득하였다.
실시예 9-14)에서 멤브레인-결합소포(MBVs)라고도 불리는 ECM-유도 나노소낭의 양은 RNase 처리 후 RNA의 양을 측정함으로써 비교하였다. 최종 샘플을 37℃에서 20분 동안 0.5 ㎍/㎕의 농도로 RNase A로 처리한 다음, RNA를 분리하고 샘플로부터 정량하였다. MBVs와 같은 세포외 소포가 RNase에 의한 분해로부터 RNA를 보호한다고 알려져 있기 때문에, RNA의 양은 MBV의 양과 관련이 있다. 왜냐하면 보호되지 않은 RNA는 RNase에 의해 분해되어 정량화될 수 없기 때문이다.
이 방법을 통해 PBS에 KCl을 첨가하면 MBV의 양을 나타내는 RNase 내성 RNA의 양이 증가하지만 0.4 M을 초과하는 KCl의 추가농도는 분리될 수 있는 MBV의 양을 증가시키지 않는다는 것이 확인되었다(도 9A). Transmission Electron Microscopy는 KCl을 사용하여 분리된 MBVs의 특징적인 형태와 크기를 보여준다(도 9B).
MBVs의 염분 분리는 효소 분리와 비슷한 수의 MBV를 산출함
다른 방법으로 얻은 MBVs의 양을 비교하기 위해 두 가지 효소기반 방법(콜라게나아제 및 프로테이나아제 K)과 KCl을 이용한 염분분리를 사용하여 MBV를 분리했다. MBVs는 RNase 처리 전후의 RNA 양에 근거하여 정량화되었다.
RNase 처리 전후의 RNA 양 사이에 유의한 차이는 발견되지 않았으며, 프로테이나아제 K 및 KCl에 대해서는 소포 외부의 RNA 양이 적다는 것을 암시한다. 콜라게나아제-분리된 MBVs의 RNase 처리 전후에 더 큰 차이가 있었다. 이것은 RNA의 외부 원천(outside source)을 의미한다. 콜라게나아제는 박테리아에서 정제되기 때문에 콜라게나아제의 추가 잔여 RNA를 포함할 수 있다. 효소의 사용을 제거할 수 있다는 것은 효소 제제와 함께 포함될 수 있는 것과 같은 외부의 원하지 않는 성분의 제제로의 도입을 방지한다.
프로테이나아제 K 처리 후 18시간 및 24시간 동안 분리된 MBVs의 양에는 차이가 없었으므로 이 방법으로 얻을 수 있는 MBV의 최대량에 도달했다. 동일한 양이 KCl로 분리된 MBVs에서 얻어졌는데, 이들 방법이 비슷한 효율을 보임을 보여준다. 1 mg/mL의 농도에서 24시간 동안 콜라게나아제를 처리하면 프로테이나아제 K 및 염(KCl)을 동시에 사용하는 것보다 많은 양의 MBV가 생성된다(도 10).
KCl로 분리된 MBVs의 높은 순도는 한외여과와 같은 세포외 소포를 분리하는 효율적인 방법의 사용을 허용함
초원심분리(Ultracentrifugation)는 수율 및 순도 사이의 적절한 균형을 제공하기 때문에 세포외 소포를 분리하는 가장 일반적으로 사용되는 방법이다. 단백질 농축에 사용되는 한외여과(ultrafiltration)와 같은 방법은 시료에 존재하는 단백질을 동시에 분리할 때 순도를 희생시키면서 높은수율을 제공한다. 한외여과는 높은 수율에도 불구하고, 효소기반의 MBV 분리에는 적합하지 않다. 효소가 한외여과가 MBV와 분리할 수 없는 ECM 구성요소의 절단으로부터 작은 조각을 생성하기 때문이다. 또한 한외여과는 단백질을 농축하는 방법이기 때문에 최종 MBV 제제 과정에서 ECM 절단에 사용되는 효소를 농축한다. MBV의 해리를 위한 염의 사용은 매트릭스로부터 어떠한 조각(fragments)도 생성시키지 않고 ECM을 현탁상태로 유지시킨다. 그런 다음 MBV가 상등액에 보관되는 동안 ECM은 일반적인 원심분리 단계로 제거할 수 있다. MBVs를 가진 상층액은 MBVs를 분리하기 위해 한외여과될 수 있다.
콜라게나아제 0.1 mg/mL로 초원심분리(UC) 분리된 MBV의 양을 UC 및 한외여과(UF)와 함께 KCl로 분리된 MBV와 비교하였다. KCl이 ECM에 존재하는 모든 MBV를 해리시킬 수 있는지를 결정하기 위해, 0.8 M KCl에 노출시킨 후 펠렛화 된 ECM을 0.1 mg/mL의 콜라게나아제로 절단시켜, KCl 처리 후에 여전히 ECM에 MBV가 남아 있음을 보여주었다. KCl 및 한외여과의 사용은 비교된 모든 방법의 MBV 중 가장 많은 양을 산출하여 4배 높은 수율을 보였다(도 11A). 한외여과로 수득한 MBVs를 NANOSIGHT®를 사용하여 분석하여 한외여과가 소포를 보존하고 있는지를 확인하였다(도 11B).
한외여과의 사용은 PBS를 사용하여 MBV를 분리할 수 있게 함
인산염 완충식염수는 0.01 mM PO4 3-, 0.137 M NaCl 및 0.0027 M KCl로 구성된다. NaCl 및 KCl의 조합은 0.139 M의 염 총 농도에 해당한다. 한외여과가 MBV를 보다 높은 수율로 분리할 수 있다는 점을 감안할 때, MBV는 PBS만을 사용하여 분리할 수 있다(도 4A). 그것이 PBS 내에서 염의 효과이며 ECM의 재현탁이 아니라는 것을 입증하기 위해, 샘플을 물에 재현탁하였고 MBV를 생성하지 않았다.
재현탁을 위한 물의 사용은 또한 물과 같은 저삼투압성 배지(hypotonic medium)에 ECM을 놓으면 MBV가 파열될 수 있는지 여부를 묻는 결과를 낳을 수 있는데, 이는 위에서 설명한 대로 물 제제에서 MBV가 없는 원인이다. 이 질문에 대답하기 위해, PBS로 분리된 MBVs는 한외여과 컬럼에서 배지 교환을 거쳐 PBS-분리된 MBVs가 물에 재현탁되도록 하였다. MBVs는 도 4B에 도시된 바와 같이 혼합물에서 여전히 검출가능하였다. 또한, MBVs가 염의 사용에 의해 분리되었다는 것을 보다 확실하게 보여주기 위해, ECM을 KCl을 포함하거나 포함하지 않는 인산염 칼륨(KH2PO4) 완충액에 재현탁시켰다. KH2PO4 버퍼만으로는 MBV를 분리할 수 없었다. 그러나, KCl을 첨가하면, MBV가 수득되었다(도 4B).
염-분리된 MBVs는 효소-분리된 MBVs에 필적하는 생물학적 활성을 갖음
염의 사용으로 해리되고 분리된 MBV가 효소의 사용으로 분리된 MBV와 동일한 생물학적 성질을 갖는지 여부를 시험하기 위해, 마우스 골수 유도된 대식세포를 24시간 동안 두 방법으로 분리한 MBV에 노출시켰다. 효소분리 및 염분리(BMDM 배지 1 mL 당 30 uL)를 위해 동일한 양의 MBV를 사용하였고, 염분리된 대량의 MBVs를 시험하였다(60 uL/mL). 24시간 노출 후 RNA를 세포에서 수집하고 RT-PCR을 수행하고 정량적 PCR을 사용하여 CD206, PDK4, STAT1 TNFa KLF4, ARG1, INOS에 대한 유전자 발현을 분석했다. 그 결과, 같은 부피 및 시간에 노출되었을 때 콜라게나아제의 효소 및 염의 사용으로 분리된 MBVs는 유전자 발현에 대해 유사한 효과를 나타내지만, 염분리된 MBV는 콜라게나아제 분리된 MBVs 및 콜라게나아제 대조군보다 INOS 및 ARG1 발현이 낮았다(도 5B). 이것은 효소기반의 방법과 함께 분리된 효소절단에 의해 생성된 ECM 조각 때문일 수 있다. 콜라게나아제가 이들 MBVs의 분리 효소로 사용되었기 때문에, BMDM은 또한 MBVs를 분리하기 위해 사용된 동일한 양의 콜라게나아제를 사용하여 얻은 샘플로 처리하였으며, 동일한 분리 프로토콜을 사용했지만 ECM(콜라게나아제 대조군)을 추가하지 않았다. 결과에서 알 수 있듯이 잔존 콜라게나아제 효소는 세포의 유전자 발현에도 영향을 줄 수 있다.
종양 세포에 대한 MBVs의 효력
도 14 및 15는 종양 세포에 대한 매트릭스-결합 나노소낭의 효과를 보여주는 결과를 제공한다. 두 가지 유형의 종양, 신경교종 및 식도암에 미치는 영향을 나타낸다.
매트릭스-결합 나노소낭은 대식세포 표현형에 대한 세포외 기질 효과를 반복함
이미에 설명된 ECM 유래 나노소낭은 매트릭스 결합 소포(MBVs)라고도 불리우며, 이들로부터 유래된 ECM 바이오스캐폴드의 대식세포 활성화 효과를 재현할 수 있다. 특정한 miRNA, miRNA125b-5p, 143-3p 및 145-5p의 억제는, MBV 처리된 대응물(counterparts)과 비교할 때 반대유전자)(opposite gene) 발현 프로파일 및 단백질 발현을 유도하여 대식세포 표현형의 조절 촉진에 잠재적인 역할을 함축한다. 따라서 MBVs 및 이들의 miRNA 화물은 ECM 바이오스캐폴드에 대한 대식세포 반응과 건설적인 개조과정 전반에 중요한 역할을 한다.
미립자 UBM-ECM 또는 SIS-ECM을 0.1% 콜라게나아제 용액으로 실온에서 16시간 동안 효소분해시켰다. 생성된 ECM은 MBV를 추출하기 위해 증가하는 g 힘에서 원심분리시켰다. MBVs는 투과전자현미경(TEM)을 사용하여 100,000X 배율로 가시화되었다(도 16A). MBVs의 세포질 섭취(uptake)는 MBVs에 아크리딘 오렌지(acridine orange)를 라벨링함으로써 결정되었다. 표지된 MBV는 배양 배지에 첨가한 지 2시간 후에 BMDM 내에서 볼 수 있었다(도 16B). 대식세포 활성화에 대한 MBV의 효과는 표면마커, 사이토카인, 전사인자 및 대사마커(metabolic markers)를 포함하여 대식 세포 활성화의 마커로 사용되는 25개 이상의 일반적인 마커의 qPCR 분석에 의해 평가 되었다. MBVs로 처리된 대식세포의 유전자 발현 프로파일은 ECM으로 처리된 대식세포의 유전자 발현 프로파일과 거의 동일하였다(도 16C). 펩신 또는 콜라게나아제에 대식세포를 노출시킨 후에 유전자 발현에 거의 또는 전혀 영향을 주지 않았고, 이는 MBV를 추출하기 전에 ECM을 분해하는데 사용되는 이러한 효소가 대식세포 활성화를 초래하지 않음을 나타낸다. IFNγ+LPS (MIFNγ+LPS) 또는 IL-4 (MIL-4)에 대한 BMDM의 노출은 대조되는 프로필을 가진 유전자 발현의 특이한 변화를 이끌어 냈다.
도 17에 나타낸 바와 같이, BMDM의 단백질 발현을 평가하기 위해 면역표지를 수행하였다. 유전자 발현 결과와 유사하게, MBV 처리군은 ECM 처리군과 거의 동일한 단백질 발현 프로파일을 가졌다. 그러나, 유전자 발현 데이타와 대조적으로, ECM 그룹 및 그의 대응 MBV 그룹 모두 IFNγ+LPS 처리된 그룹보다는 IL-4 처리된 그룹과 유사한 단백질 발현 프로파일을 가졌다. SIS-ECM 및 UBM-ECM 및 해당 MBVs를 이용한 대식세포 처리로 Fizz-1 및 Arg-1(MIL-4 표현형과 관련된 마커)이 양성으로 나타났다. iNOS 발현은 SIS-MBV 군에서 약간만 나타났다. TNF-α는 UBM-MBV 군에서만 검출되었다. TNF-α 및 iNOS는 모두 MIFNγ+LPS 표현형과 관련된 마커이다. 대조군에서는 이러한 단백질의 발현이 관찰되지 않았다. 99% 이상의 세포가 F4/80을 발현하여 대식세포 분화 상태를 확인했다.
도 18에 도시된 바와 같이, MBV-SIS로 처리된 대식세포의 분비된 생성물은 tryptic soy broth 대조군(p= 0.033)과 비교할 때 황색 포도상 구균의 성장을 상당히 감소시켰다. miR-125, miR-143 및 miR-145의 억제제 또는 이들의 조합(Mix)으로 각각 처리된 대식세포의 조건화된 배지는 황색 포도상 구균의 성장을 감소시키지 않았다. 대조적으로, 스크램블 대조군(Scr)으로 처리된 대식세포의 분비된 생성물은 tryptic soy broth 대조군(p= 0.018)과 비교했을 때 S. aureus의 성장을 유의하게 감소시켰다.
Naive 및 IL-4로 처리한 대식세포는 산화질소를 생성하지 않았다. IFN-γ/LPS로 처리한 대식세포는 산화질소를 유의하게 증가시켰다. UBM으로부토 유래된 MBV는 산화질소 생산을 유의하게 증가시키는 유일한 치료그룹이었으며, 이는 UBM MBV가 잠재적으로 대식세포 전염증반응(pro-inflammatory responses) 또는 항균활성(anti-microbial activity)에 영향을 미칠 수 있음을 암시한다. 어떤 miR 치료도 산화질소 활동을 증가시키지 않았다.
FITC-E. Coli 입자의 섭취로 측정한 식균작용(phagocytosis)의 기저 수준은 모든 대식세포에 의해 나타났다. IFN-γ/LPS 처리는 식균활성을 현저히 증가시켰다. ECM 및 ECM-유래 MBV 처리는 식균 섭취(phagocytic uptake)를 현저히 증가시켰다. 데이터가 가르키는 MBVs는 식균작용 유도에 더 강력하거나, ECM 스캐폴드에서 방출될 때 더 활동적이 될 수 있다. UBM 또는 SIS로 처리한 대식세포 간에는 식균 작용에 유의한 차이가 없었다. 그러나 UBM으로부터의 MBV는 SIS-MBV로 치료한 대식세포와 비교하여 대식세포의 식균작용을 현저히 증가시켰다.
UBM-MBV 및 SIS-MBV를 RNase로 30분 동안 처리하여 ECM 탈세포화 과정 또는 MBV 분리 과정 중에 누적될 수 있는 임의의 잔여 RNA를 분해시켰다. 그런 다음 RNase 반응을 멈추고 MBV에서 RNA를 분리했다. MBV에서 추출한 RNA로부터 작은 cDNA 라이브러리(libraries)를 만들었다. 라이브러리는 이온 양성자 플랫폼(Ion Proton platform)으로 읽었다. 서열분석 데이터는 인간 게놈과 정렬하기 전에 크기와 Phred 점수를 기준으로 트리밍되었다. 작은 RNA 읽기의 34% 이상이 인간 게놈 내 알려진 서열에 매핑되었다. 리드(Reads)는 miRBase에 주석이 추가되었다(release 21). UBM-MBVs 및 SIS-MBVs에서 가장 자주 확인된 miRNA 서열은 하기 표에 나타낸다:
Figure pat00001
강조 표시된 miRNA는 대식세포 활성화에 관여하기 때문에 하류분석(downstream analysis)을 위해 선택되었다(Chaudhuri et al., J Immunol, 2011. 187(10): p. 5062-8; Banerjee et al., J Biol Chem, 2013. 288(49): p. 35428-36; Zang et al., Int J Mol Med, 2013. 31(4): p. 797-802). MBV가 대식세포를 활성화시키는 메커니즘을 연구하기 위해, BMDM에서 miR-145-5p, miR-143-3p 및 miR-125b-5p가 억제되었다. miRNA의 성공적인 억제는 qPCR에 의해 나타났다(도 19A). miR-145 발현 수준은 70% 이상 감소하였고 miR-143 발현 수준은 65% 감소하였고 miR-125b 발현 수준은 95% 이상 감소하였다.
대식세포는 손상 후 정상적인 조직 발달에 대한 정상적인 치유의 중요한 조절인자인 것으로 나타났다. 본원에서 MBVs는 대식세포 표현형에 대한 전체적인 ECM의 영향을 크게 요할 수 있음을 개시한다. 따라서, ECM과 같은 MBVs는 대식세포를 유도하기 위한 것처럼, 대식세포 표현형을 변형시키는데 사용될 수 있다.
개시된 발명의 원리가 적용될 수 있는 다수의 가능한 실시예를 고려하여, 예시된 실시예는 본 발명의 바람직한 예일 뿐이며, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 오히려, 본 발명의 범위는 다음의 청구범위에 의해 한정된다. 따라서 우리는 이러한 청구의 범위 및 정신에서 나오는 모든 것을 우리의 발명으로 주장한다.
<110> UNIVERSITY OF PITTSBURGH - OF THE COMMONWEALTH SYSTEM OF HIGHER EDUCATION Badylak, Stephen F Huleihel, Luai Hussey, Geroge S Naranjo Gutierrez, Juan Diego <120> MATRIX BOUND NANOVESICLES AND THEIR USE <130> 8123-96454-02 <150> 62/302,626 <151> 2016-03-02 <150> PCT/US2017/020360 <151> 2017-03-02 <160> 3 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 88 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 1 caccuugucc ucacggucca guuuucccag gaaucccuua gaugcuaaga uggggauucc 60 uggaaauacu guucuugagg ucaugguu 88 <210> 2 <211> 110 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 2 agaagggcua ucaggccagc cuucagagga cuccaaggaa cauucaacgc ugucggugag 60 uuugggauuu gaaaaaacca cugaccguug acuguaccuu gggguccuua 110 <210> 3 <211> 24 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 guccaguuuu cccaggaauc ccuu 24

Claims (56)

  1. 포유류의 세포외 기질(extracellular matrix)에서 유래된 분리된 나노소낭(nanovesicles) 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물로서, a) 상기 나노소낭은 ⅰ) CD63 또는 CD81을 발현하지 않거나, 또는 ⅱ) CD63loCD81lo이고, b) 상기 나노소낭은 M2 대식세포를 유도하는 것인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 포유류의 세포외 기질은 사람의 세포외 기질인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 세포외 기질은 식도 조직(esophageal tissue), 방광, 소장 점막하 조직(small intestinal submucosa), 진피(dermis), 탯줄, 심막(pericardium), 심장 조직(cardiac tissue), 종양 조직(tumor tissue), 또는 골격근으로부터 유래된, 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 나노소낭은 microRNA (miR)-145, miR-181, 또는 miR-145 및 miR-181을 포함하는 것인, 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 세포외 기질은 효소에 의해 절단되는(digested) 것인, 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 효소는 펩신, 콜라게나제(collagenase), 엘라스타제(elastase), 히알루로니다제(hyaluronidase) 또는 프로테이나제 K(proteinase K)인, 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 담체는 버퍼, 겔, 방부제, 및 안정제(stabilizing agent)로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 제제를 포함하는 것인, 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 외인성(exogenous) 치료제를 더 포함하는, 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 치료제는 화합물, 핵산 분자, 폴리펩티드, 성장인자(growth factor) 또는 사이토카인(cytokine) 인, 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 치료제는 miRNA 또는 단백질인, 조성물.
  11. 하기 단계를 포함하는 세포외 기질로부터 나노소낭을 분리하는 방법:
    a) 절단된(digested) 세포외 기질을 생산하기 위하여 효소로 세포외 기질을 절단시키는 단계;
    b) 콜라겐 섬유 잔해(remnants)를 제거하여 섬유가 없는(fibril-free) 상층액을 생산하기 위하여 상기 절단된 세포외 기질을 원심분리하는 단계;
    c) 고체 물질들을 분리하기 위하여 상기 섬유가 없는 상층액을 원심분리하는 단계; 및
    d) 상기 고체 물질들을 담체에 현탁시키고,
    그에 따라 세포외 기질로부터 나노소낭을 분리하고. 여기서 나노소낭은 CD63 또는 CD81을 발현하지 않거나, 또는 CD63loCD81lo이고, 상기 나노소낭은 M2 대식세포를 유도하는 것인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 효소는 펩신, 콜라게나제, 엘라스타제, 히알루로니다제 또는 프로테이나제 K인, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 b) 단계에 따라 콜라겐 섬유 잔해(remnants)를 제거하여 섬유가 없는(fibril-free) 상층액을 생산하기 위하여 상기 절단된 세포외 기질을 원심분리하는 단계는 ⅰ) 300 g 내지 1000 g에서 10분 내지 15분 동안, ⅱ) 2000 g 내지 3000 g에서 20분 내지 30분 동안 및/또는 ⅲ) 10,000 g 내지 15,000 g에서 25분 내지 40분 동안 원심분리하는 단계를 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 b) 단계에 따라 콜라겐 섬유 잔해(remnants)를 제거하여 섬유가 없는(fibril-free) 상층액을 생산하기 위하여 상기 절단된 세포외 기질을 원심분리하는 단계는 ⅰ) 500 g에서 10분 동안 원심분리하는 단계, ⅱ) 2,500 g에서 20분 동안 원심분리하는 단계, 및/또는 ⅲ) 10,000 g에서 30분 동안 원심분리하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 b) 단계에 따라 절단된 세포외 기질을 원심분리하는 단계는 반복되는 것인, 방법.
  16. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 c) 단계에 따라 섬유가 없는 상층액을 원심분리하는 단계는 100,000 g 내지 150,000 g에서 60분 내지 90분 동안 원심분리하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 c) 단계에 따라 섬유가 없는 상층액을 원심분리하는 단계는 100,000 g에서 70분 동안 원심분리하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 세포외 기질은 포유류의 세포외 기질인, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 포유류의 세포외 기질은 사람의 세포외 기질인, 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 세포외 기질은 식도 조직, 방광, 소장 점막하 조직, 진피, 탯줄, 심막, 심장 조직 또는 골격근으로부터 분리된, 방법.
  21. 두 번째(second) 세포외 기질로부터 유래된 분리된 나노소낭을 첫번째 세포외 기질에 도입하는 단계를 포함하는, 첫번째 세포외 기질 상에서 세포 증식(proliferation), 이동(migration) 및 분화(differentiation)를 조절하는 방법으로,
    여기서 나노소낭은 CD63 또는 CD81을 발현하지 않거나, 또는 CD63loCD81lo이고, 상기 나노소낭은 M2 대식세포를 유도하고,
    여기서 두 번째 세포외 기질로부터 유래된 나노소낭은 첫번째 세포외 기질에 대한 세포 증식, 이동 및 분화를 조절하는 것인, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 첫번째 세포외 기질 및 두 번째 세포외 기질은 같은 종(species)으로부터 유래된 것인, 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 첫번째 세포외 기질 및 두 번째 세포외 기질은 다른 종으로부터 유래된, 방법.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫번째 세포외 기질 및 두 번째 세포외 기질은 다른 조직(tissues)으로부터 유래된, 방법.
  25. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫번째 세포외 기질 및 두 번째 세포외 기질은 같은 조직으로부터 유래된, 방법.
  26. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫번째 세포외 기질 및 두 번째 세포외 기질은 사람으로부터 유래된, 방법.
  27. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 첫번째 세포외 기질은 돼지로부터 유래된, 방법.
  28. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포(progenitor cell)인, 방법.
  29. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 대식세포(macrophage), 근아세포(myoblast), 혈관주위 줄기세포(perivascular stem cell) 또는 신경모세포종 세포(neuroblastoma cell)인, 방법.
  30. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 기질은 생체 외(ex vivo)에서 사용하기 위한 것인, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 세포외 기질은 의료 장치의 위 또는 내부에 코팅되어 있는 것인, 방법.
  32. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 기질은 생체 내(in vivo)에서 사용하기 위한 것인, 방법.
  33. 세포외 기질 및 이종의(heterologous) 세포외 기질로부터 유래된 나노소낭을 포함하는 바이오스캐폴드(bioscaffold)로서, 여기서 나노소낭은 CD63 또는 CD81을 발현하지 않거나, 또는 CD63loCD81lo이고, 상기 나노소낭은 M2 대식세포를 유도하는 것인, 바이오스캐폴드.
  34. 제33항에 있어서, 상기 나노소낭은 포유류의 세포외 기질로부터 유래된 것인, 바이오 스캐폴드.
  35. 제34항에 있어서, 상기 포유류의 세포외 기질은 사람 또는 돼지의 세포외 기질인, 바이오스캐폴드.
  36. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 기질은 식도 조직, 방광, 소장 점막하 조직 또는 진피로부터 유래된, 바이오스캐폴드.
  37. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종의 세포외 기질은 나노소낭의 유래 조직과 다른 조직으로부터 유래된, 바이오스캐폴드.
  38. 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종의 세포외 기질은 나노소낭의 유래 종과 다른 종으로부터 유래된, 바이오스캐폴드.
  39. 제1항 또는 제2항의 조성물 또는 제33항 내지 제35항 중 어느 한 항의 바이오 스캐폴드를 포함하거나, 또는 상기 조성물 또는 바이오스캐폴드로 코팅된 의료 장치.
  40. 제39항에 있어서, 상기 장치는 외과용 망(surgical mesh), 스텐트(stent), 심박 조율기(pacemaker), 카테터(catheter), 인공심장판막(heart valve), 바이오센서(biosensor), 약물 전달장치(drug delivery device) 또는 정형외과용 임플란트(orthopedic implant)인, 의료 장치.
  41. a) 절단된 세포외 기질을 생산하기 위해 0.1 M 내지 3M의 염 농도로 세포외 기질을 배양하는 단계;
    b) 콜라겐 섬유 잔해를 제거하고 섬유가 없는 상층액을 생산하기 위해 절단된 세포외 기질을 원심분리하고, 섬유가 없는 상층액을 분리하는 단계;
    c) 고체 물질들을 분리하기 위하여 상기 섬유가 없는 상층액을 원심분리하는 단계; 및
    d) 상기 고체 물질들을 담체에 현탁시키는 단계를 포함하는 세포외 기질로부터 나노소낭을 분리하는 방법으로, 그에 따라 세포외 기질로부터 나노소낭을 분리하고, 여기서 나노소낭은 CD63 또는 CD81을 발현하지 않거나, 또는 CD63loCD81lo이고, 상기 나노소낭은 M2 대식세포를 유도하는 것인, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 염은 염화칼륨(potassium chloride), 염화나트륨(sodium chloride) 또는 염화마그네슘(magnesium chloride)인, 방법.
  43. a) 현탁액을 형성하기 위하여 등장성 완충액(isotonic buffered saline solution)에 세포외 기질을 현탁시키는 단계; 및
    b) 현탁액으로부터 입자들(particles)을 분리하기 위하여 한외여과(ultrafiltration)를 수행하는 단계;
    를 포함하는 세포외 기질로부터 나노소낭을 분리하는 방법이되, 여기서 입자는 10 nm 내지 10,000 nm 사이의 지름이고, 그에 따라 세포외 기질로부터 나노소낭을 분리하고, 여기서 나노소낭은 CD63 또는 CD81을 발현하지 않거나, 또는 CD63loCD81lo이고, 상기 나노소낭은 M2 대식세포를 유도하는 것인, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 입자는 10 nm 내지 300 nm 사이의 지름인, 방법.
  45. 제41항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포외 기질은 포유류의 세포외 기질인, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 포유류의 세포외 기질은 사람의 세포외 기질인, 방법.
  47. 제45항에 있어서, 상기 세포외 기질은 식도 조직, 방광, 소장 점막하 조직, 진피, 탯줄, 심막, 심장 조직 또는 골격근으로부터 분리된, 방법.
  48. 제1항 또는 제2항의 조성물의 유효량을 포함하는 종양 세포의 증식 감소, 아폽토시스 증가 또는 이동 감소용 약학적 조성물이되, 상기 유효량은 각각 증식 감소, 아폽토시스 증가 또는 이동 감소에 충분하고, 상기 종양세포는 신경교종 세포 및 식도선암 세포인, 약학적 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 상기 종양 세포는 생체 내(in vivo)의 세포인, 약학적 조성물.
  50. 제48항에 있어서, 상기 종양 세포는 시험관 내(in vitro)의 세포인, 약학적 조성물.
  51. 제48항에 있어서, 상기 세포외 기질은 방광 또는 식도로부터 유래된, 약학적 조성물.
  52. 제1항 또는 제2항의 조성물의 유효량을 포함하는 종양 세포의 증식 감소, 아폽토시스 증가 또는 이동 감소용 약학적 조성물의 치료적 유효량을 포함하는 종양 치료용 약학적 조성물로서, 여기서 유효량은 종양을 치료하기 충분하고, 상기 종양세포는 신경교종 세포(glioma cell) 및 식도선암 세포(esophageal adenocarcinoma cell)인, 약학적 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 세포외 기질은 식도 조직 또는 방광으로부터 유래된, 약학적 조성물.
  54. 제1항 또는 제2항의 조성물의 치료적 유효량을 포함하는 상처 치료용 약학적 조성물.
  55. 제54항에 있어서, 상기 조성물은 M2 대식세포(macrophage)를 증가시키는 것인, 약학적 조성물.
  56. 제54항에 있어서, 상기 조성물의 치료적 유효량은 상처에 국소적으로 투여되는, 약학적 조성물.
KR1020227046472A 2016-03-02 2017-03-02 매트릭스가 결합된 나노소낭 및 그의 용도 KR102595381B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020237036580A KR20230151088A (ko) 2016-03-02 2017-03-02 매트릭스가 결합된 나노소낭 및 그의 용도

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662302626P 2016-03-02 2016-03-02
US62/302,626 2016-03-02
KR1020187027771A KR20180123054A (ko) 2016-03-02 2017-03-02 매트릭스가 결합된 나노소낭 및 그의 용도
PCT/US2017/020360 WO2017151862A1 (en) 2016-03-02 2017-03-02 Matrix bound nanovesicles and their use

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187027771A Division KR20180123054A (ko) 2016-03-02 2017-03-02 매트릭스가 결합된 나노소낭 및 그의 용도

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237036580A Division KR20230151088A (ko) 2016-03-02 2017-03-02 매트릭스가 결합된 나노소낭 및 그의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20230010778A true KR20230010778A (ko) 2023-01-19
KR102595381B1 KR102595381B1 (ko) 2023-10-26

Family

ID=59744430

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227046472A KR102595381B1 (ko) 2016-03-02 2017-03-02 매트릭스가 결합된 나노소낭 및 그의 용도
KR1020237036580A KR20230151088A (ko) 2016-03-02 2017-03-02 매트릭스가 결합된 나노소낭 및 그의 용도
KR1020187027771A KR20180123054A (ko) 2016-03-02 2017-03-02 매트릭스가 결합된 나노소낭 및 그의 용도

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237036580A KR20230151088A (ko) 2016-03-02 2017-03-02 매트릭스가 결합된 나노소낭 및 그의 용도
KR1020187027771A KR20180123054A (ko) 2016-03-02 2017-03-02 매트릭스가 결합된 나노소낭 및 그의 용도

Country Status (9)

Country Link
US (2) US20190117837A1 (ko)
EP (2) EP4268892A3 (ko)
JP (3) JP6984898B2 (ko)
KR (3) KR102595381B1 (ko)
CN (1) CN109152737B (ko)
AU (2) AU2017227790B2 (ko)
CA (1) CA3013223A1 (ko)
ES (1) ES2965061T3 (ko)
WO (1) WO2017151862A1 (ko)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2976638T3 (es) 2014-03-21 2024-08-06 Univ Pittsburgh Commonwealth Sys Higher Education Hidrogel esterilizado de modo terminal que proviene de matriz extracelular
WO2018161034A1 (en) 2017-03-02 2018-09-07 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Extracellular matrix (ecm) hydrogel and soluble fraction thereof for the treatment of cancer
EP4252842A3 (en) 2017-03-02 2023-10-25 University of Pittsburgh- Of the Commonwealth System of Higher Education Ecm hydrogel for treating esophageal inflammation
CA3060956A1 (en) 2017-05-05 2018-11-08 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Ocular applications of matrix bound vesicles (mbvs)
US12070530B2 (en) 2017-11-09 2024-08-27 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Decellularization and functionalization of extracellular matrix biomaterials
CA3098149A1 (en) * 2018-05-03 2019-11-07 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Matrix bound vesicles (mbvs) containing il-33 and their use
EP3879980A4 (en) * 2018-11-15 2022-08-24 Washington University EXTRACELLULAR VESICLES DERIVED FROM STEM CELLS AND METHODS OF USE THEREOF
US20220347225A1 (en) * 2019-08-07 2022-11-03 Konkuk University Industrial Cooperation Corp. Composition comprising skeletal muscle stem cell-derived exosome as active ingredient for improving skin condition
CN110393823A (zh) * 2019-08-09 2019-11-01 苏州苏新瑞可医疗科技有限公司 一种3d生物打印的水凝胶墨水及其制备方法
KR20220087483A (ko) * 2019-10-23 2022-06-24 유니버시티 오브 피츠버그-오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션 자가면역 질환 치료를 위한 mbv의 용도
CN111068119A (zh) * 2019-12-31 2020-04-28 南昌大学第二附属医院 一种富含脂肪源细胞外囊泡基质胶的制备方法及应用
JP2023514821A (ja) 2020-02-28 2023-04-11 テキサス メディカル センター 癒着阻止および組織治癒向上のための噴霧可能刺激応答性マイクロヒドロゲル
EP4005577A1 (en) * 2020-11-26 2022-06-01 Novadip Biosciences Cellular and/or extracellular extracts for preventing and/or treating cancer and/or inflammation
CN113332312B (zh) * 2021-02-01 2023-02-24 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 一种基于物理整粒的自成形血小板纳米囊泡及其制备方法
CN114081957A (zh) * 2021-11-02 2022-02-25 姜海涛 一种心脏靶向载药外泌体及其制备方法、应用和运载体
CN115845137A (zh) * 2021-09-24 2023-03-28 北京博辉瑞进生物科技有限公司 一种用于组织修复的改性sis膜、其制备方法及应用
WO2023070130A2 (en) * 2021-10-22 2023-04-27 The Brigham And Women’S Hospital, Inc. Mirna reprogramming of smooth muscle cells into endothelial cells
CN114134110B (zh) * 2021-12-13 2024-03-26 四川泊麦科技发展股份有限公司 一种基于超滤离心法获取外泌体的制备方法
EP4201439A1 (en) * 2021-12-23 2023-06-28 Axenoll Life Sciences AG A three-dimensional biocompatible matrix and its uses in wound management
WO2023196970A1 (en) * 2022-04-08 2023-10-12 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Matrix bound nanovesicles encapsulated in hydrogels

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110044374A (ko) * 2009-10-23 2011-04-29 (주) 수파드엘릭사 암세포의 성장 및/또는 전이 억제용 약학 조성물
WO2012108842A1 (en) * 2011-02-11 2012-08-16 Agency For Science, Technology And Research Methods of detecting therapeutic exosomes

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4956178A (en) 1988-07-11 1990-09-11 Purdue Research Foundation Tissue graft composition
US4902508A (en) 1988-07-11 1990-02-20 Purdue Research Foundation Tissue graft composition
IT1243390B (it) 1990-11-22 1994-06-10 Vectorpharma Int Composizioni farmaceutiche in forma di particelle atte al rilascio controllato di sostanze farmacologicamente attive e procedimento per la loro preparazione.
US5281422A (en) 1991-09-24 1994-01-25 Purdue Research Foundation Graft for promoting autogenous tissue growth
US5352463A (en) 1992-11-13 1994-10-04 Badylak Steven F Tissue graft for surgical reconstruction of a collagenous meniscus and method therefor
US6485723B1 (en) 1995-02-10 2002-11-26 Purdue Research Foundation Enhanced submucosal tissue graft constructs
US5695998A (en) 1995-02-10 1997-12-09 Purdue Research Foundation Submucosa as a growth substrate for islet cells
EP0820301B1 (en) 1995-04-07 2002-07-24 Purdue Research Foundation Tissue graft for urinary bladder reconstruction
US5554389A (en) 1995-04-07 1996-09-10 Purdue Research Foundation Urinary bladder submucosa derived tissue graft
CA2160647C (en) 1995-10-16 2002-05-28 Thomas William Garay Helical bearing anchor catcher
DE69734218T2 (de) 1996-12-10 2006-07-06 Purdue Research Foundation, West Lafayette Gewebetransplantat aus der Magensubmukosa
US6379710B1 (en) 1996-12-10 2002-04-30 Purdue Research Foundation Biomaterial derived from vertebrate liver tissue
US6696270B2 (en) 1996-12-10 2004-02-24 Purdue Research Foundation Gastric submucosal tissue as a novel diagnostic tool
US6576265B1 (en) 1999-12-22 2003-06-10 Acell, Inc. Tissue regenerative composition, method of making, and method of use thereof
US6579538B1 (en) 1999-12-22 2003-06-17 Acell, Inc. Tissue regenerative compositions for cardiac applications, method of making, and method of use thereof
US20060292227A1 (en) * 2005-06-23 2006-12-28 Mcpherson Timothy B Extracellular matrix material particles and methods of preparation
WO2010099463A2 (en) 2009-02-27 2010-09-02 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Joint bioscaffolds
US10231997B2 (en) 2012-08-15 2019-03-19 The University Of Chicago Exosome-based therapeutics against neurodegenerative disorders
KR20170005854A (ko) * 2014-05-18 2017-01-16 칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션 엑소솜과 관련된 방법 및 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20110044374A (ko) * 2009-10-23 2011-04-29 (주) 수파드엘릭사 암세포의 성장 및/또는 전이 억제용 약학 조성물
WO2012108842A1 (en) * 2011-02-11 2012-08-16 Agency For Science, Technology And Research Methods of detecting therapeutic exosomes

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DEUTSCH D E et al., "Purification and further characterization of isolated matrix vesicles from rat alveolar bone" *
HIRSCHMAN et al., "Neutral Peptidase Activities in Matrix Vesicles from Bovine Fetal Alveolar Bone and Dog Osteosarcoma" *
Olivier G. De Jong et al., "Extracellular Vesicles: Potential Roles in Regenerative Medicine" *

Also Published As

Publication number Publication date
CN109152737B (zh) 2024-07-12
JP7343920B2 (ja) 2023-09-13
EP3423038B1 (en) 2023-11-01
EP3423038A4 (en) 2019-11-13
EP3423038A1 (en) 2019-01-09
CN109152737A (zh) 2019-01-04
JP2022024085A (ja) 2022-02-08
AU2023203780A1 (en) 2023-07-13
US20210260246A1 (en) 2021-08-26
EP4268892A2 (en) 2023-11-01
JP6984898B2 (ja) 2021-12-22
EP4268892A3 (en) 2024-01-24
CA3013223A1 (en) 2017-09-08
AU2017227790A1 (en) 2018-08-09
JP2019513125A (ja) 2019-05-23
US20190117837A1 (en) 2019-04-25
KR102595381B1 (ko) 2023-10-26
WO2017151862A1 (en) 2017-09-08
JP2023156525A (ja) 2023-10-24
KR20230151088A (ko) 2023-10-31
ES2965061T3 (es) 2024-04-10
KR20180123054A (ko) 2018-11-14
AU2017227790B2 (en) 2023-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102595381B1 (ko) 매트릭스가 결합된 나노소낭 및 그의 용도
JP6726726B2 (ja) 組織再生のためのエキソソームおよびマイクロリボ核酸
JP2023075258A (ja) 筋ジストロフィーの処置における心筋球由来細胞およびこのような細胞によって分泌されたエキソソーム
EP3985118A1 (en) C/ebp alpha short activating rna compositions and methods of use
US20220218757A1 (en) Therapeutically active cells and exosomes
JP7525396B2 (ja) 表皮水疱症を処置するための方法及び組成物
WO2019152549A1 (en) Methods for therapeutic use of exosomes and y-rnas
JP2022513311A (ja) カーゴ積載細胞外小胞
WO2016166600A1 (en) Delivery of microrna using mesenchymal stem cell microparticles
da Silva Genetic engineering of Mesenchymal Stromal Cells to express anti-cancer proteins
JP2023184168A (ja) 脈管障害の予防又は治療用医薬組成物
CA3158896A1 (en) Ctgf gene-specific double-stranded oligonucleotide, and a composition for preventing and treating fibrotic diseases and respiratory-related diseases comprising same

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
A107 Divisional application of patent
GRNT Written decision to grant