KR20230008777A

KR20230008777A - 관절 건강을 위한 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20230008777A
Application number: KR1020227042436A
Authority: KR
Inventors: 자틴더 라나; 닐렌 시몬스
Original assignee: 이노포스, 엘엘씨
Priority date: 2020-05-07
Filing date: 2021-04-12
Publication date: 2023-01-16
Also published as: US20210346447A1; JP2023524286A; BR112022022116A2; CA3176312A1; EP4146016A1; CN115484835A; US20230346864A1; WO2021225756A1

Abstract

골 구조, 연골 구조 또는 이들 둘 다를 유지하거나, 골 재흡수를 최소화하거나, 연골 분해를 예방하거나, 골 밀도를 증가시키거나, 연골 완전성을 보호함으로써 건강한 관절을 증진시키거나, 골 건강, 연골 건강 또는 이들 둘 다에 영향을 주는 효소의 작용을 감소시키거나, 관절 운동 또는 기능을 개선시키거나, 관절 통증을 완화시키거나, 관절 불편감을 완화시키거나, 관절 통증 및 불편감을 완화시키거나, 관절 강직을 완화시키거나, 관절 동작 또는 유연성 범위를 개선시키거나, 운동성을 증진시키는 등을 위한 조성물 및 방법으로서, 여기서 조성물은 아나카르디움 옥시덴탈레 엘의 종피의 식물 추출물의 치료 유효량을 포함하며, 여기서 식물 추출물은 총 카테킨 함량에 대해 강화된 것인 조성물 및 방법.

Description

관절 건강을 위한 조성물 및 방법

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2020년 5월 7일에 출원된 미국 출원 번호 63/021,406 및 2021년 3월 26일에 출원된 미국 출원 번호 63/166,458에 대하여 우선권을 주장하며, 이들의 내용은 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야. 본 발명은 일반적으로 관절 염증, 관절 통증, 관절 강직, 연골 분해를 조정할 수 있거나 운동성, 동작 범위, 유연성, 관절 신체 기능 또는 이들의 임의의 조합을 개선시키는 식물 추출물 또는 상기 식물 추출물을 포함하는 그의 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 임의적으로 칼슘, 마그네슘, 아연, 붕소, 비타민 D, 비타민 K, 글루코사민 및/또는 콘드로이틴 화합물, 비-스테로이드성 항염증제/진통제, COX/LOX 억제제, 글루코사민 화합물, 신경병성 통증 경감제 등과 같은 다른 관절 관리 작용제와 조합하여 사용될 수 있다.

류마티스 관절염 ('RA')은 가장 일반적인 만성 자가면역 질환 중 하나이다. 그의 초기 병기는 만성 다기관 질환으로 진행하기 전에 윤활 관절에서의 국소 종창 및 강직을 수반한다. 염증 반응으로 인한 윤활 조직 세포충실성 및 관절 손상 둘 다에서의 증가가 RA의 병리학적 특색이다. RA에서의 핵심적인 염증 캐스케이드는 인터류킨-6 ('IL-6') 및 종양 괴사 인자-α ('TNF-α')와 같은 염증유발성 시토카인의 전신성 과다생산 및 발현, 가속 골/관절 합병증을 수반한다. RA에서의 윤활막 염증은 전신성으로 확산되어 증가된 시토카인 방출 (예를 들어, IL-1β, IL-6 및 IL-18) 및 C-반응성 단백질 ('CRP')과 같은 급성 반응성 단백질 ('ARP')의 비정상적으로 높은 수준에 의해 나타내어지는 만성 염증으로 무증상적으로 변환되며, 이는 지속적인 염증 및 관절 손상으로 이어진다.

따라서, RA의 병리는 복잡하며, RA의 바탕이 되는 병인은 미지로 남아있다. 연골 및 골에서의 파괴적인 변화, 및 관절의 운동성을 제한하는 골 증생이 발생한다. 관절염은 심각한 장애를 야기하며, 궁극적으로는 일상 업무를 수행하는 사람의 능력에 영향을 주고, 삶의 질을 제한하며, 조기 사망을 야기할 수 있다. 신체의 어떠한 부분도 관절염으로부터 염증이 생기거나 또는 통증성이 될 수 있다. 이는 전세계 성인 인구의 대략 0.5-1.0%을 이환하는 가장 흔한 염증성 장애 중 하나이며, 여성이 남성에 비해 3배 더 많이 이환된다.

현재 이용가능한 치료가 개선된 효율을 나타내고 있기는 하지만, 비-스테로이드성 항염증 약물 (NSAID), 예컨대 인도메타신; 질환-조정 항류마티스 약물 (DMARD), 예컨대 메토트렉세이트, 술파살라진, 레플루노미드 및 히드록시클로로퀸; 및 코르티코스테로이드, 예컨대 프레드니솔론 및 메틸프레드니솔론의 사용은 몇 가지 부정적인 작용과 연관되어 있다. 따라서, 근골격계 장애를 가진 환자는 증상 경감을 위한 대안적인 방법을 모색하고 있다.

아라키돈산 및 그의 대사물은 염증의 중요한 매개인자이다. 아라키돈산 ('AA')은 막 인지질의 구성요소로서, 그의 대사물 형성에서의 속도-제한 단계는 포스포리파제의 활성화를 통해 매개되는 세포 막 인지질 풀로부터의 그의 방출에 의존한다. 관절염에서는 포스포리파제 A2 ('PLA2') 활성이 증가되는데, TNF-α 및 IL-1을 포함한 시토카인이 PLA2의 활성을 자극하는 것으로 보고되어 있다. 그의 방출 후, AA는 2가지 경로 중 하나에 의해 대사될 수 있는데 - 시클로옥시제나제 ('COX')에 의해 프로스타글란딘 ('PGE2'), 프로스타시클린 및 트롬복산과 같은 에이코사노이드를 산출하거나, 또는 이는 5-리폭시제나제 ('5-LOX')에 의해 대사되어 류코트리엔 및 리폭신의 생산을 초래할 수 있다. 이들 에이코사노이드는 세포내 메신저로 작용하며, 통증 및 염증 반응에서의 신호 전달의 조절에서 중요한 역할을 한다. 아라키돈산 대사 경로의 예시는 도 1에 제공되어 있다.

시클로옥시제나제 - 프로스타글란딘-엔도퍼옥시드 신타제 (PTGS, EC 1.14.99.1)로도 공지된 프로스타노이드 신타제 -는 프로스타글란딘, 프로스타시클린 및 트롬복산을 포함하여 프로스타노이드로 지칭되는 중요한 생물학적 매개인자의 형성을 담당하는 효소이다. COX는 아라키돈산으로부터 프로스타노이드로의 생합성 경로의 중심적인 효소이다. 2가지 공지된 동종효소 - COX-1 및 COX-2가 존재한다. COX-1은 위 점막의 보호 및 신장 관류의 유지와 같은 생리학적 기능에 수반된 프로스타글란딘의 생산을 담당하는 구성적 이소형을 나타낸다. COX-2는 정상적인 조건 하에서는 대부분의 세포에서 발현되지 않으나, 염증 동안 상승된 수준이 발견된다. COX-2는 염증 조직에서 우세한 이소형으로서, 인터류킨-1 ('IL-1') 및 종양 괴사 인자 ('TNF-α')를 포함한 몇 가지 염증유발성 시토카인에 의해 그의 유도가 용이하게 될 수 있다. 비-스테로이드성 항염증 약물 (NSAID)에 의한 COX의 약리학적 억제는 염증 및 통증의 증상으로부터의 경감을 제공할 수 있다.

따라서, 원치 않는 부작용을 예방하기 위해서는, COX-2를 선택적으로 억제하는 것이 COX-1에 의해 형성되는 프로스타글란딘에 의해 제어되는 중요한 생리학적 과정에 영향을 주지 않으면서 그의 진통 및 항염증 효과를 위해 실용적인 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, 구성적 동종효소로서의 COX-2의 상승작용성 효과를 신장 혈류 및 사구체 여과율을 유지하는 것에 연관시키는 보고가 존재함으로써, 그의 선택적 억제가 일부 부정적인 효과로 이어질 수 있음을 시사하고 있다. 이들 효과는 선택적 COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브 및 로페콕시브)가 더 우수한 위 내약성으로 골관절염 및 류마티스 관절염 통증에서 통상적인 NSAID의 것과 유사한 효능을 제공하였으며 신장 부작용에 있어서 NSAID와 동등하였던 임상 시험에서 대상체에 의해 경험되었다. 따라서, 이들 효소 중 어느 하나의 완전한 선택적 억제와 달리, 이들 동종효소의 억제를 야기하기에 충분히 강하지만 불필요한 부정적 결과를 회피하기에 충분히 적당한 화합물을 가정하여 보유하는 것이 합리적이다.

COX-2의 증가된 발현 및 그에 따른 그의 산물 PGE2의 합성은 또한 암, 심혈관계 질환 및 염증에서의 핵심 작용인자인 MMP-9의 유도와 강하게 연관되는 것으로 밝혀졌다. 따라서, COX-2 효소의 억제는 MMP-9 발현 및 활성의 조절을 초래할 수 있으며, 그것은 특히 암 세포의 침습 및 이동을 조정하고, 아테롬성경화증의 진행을 예방 또는 지연하며 플라크를 안정화시키고, 대식세포 프로테이나제 발현을 조절하고, 만성 치주염 및 치은염을 예방하고, 간 질환의 리모델링을 제어할 수 있다.

아라키돈산 ('AA') 대사 경로의 다른 부문은 5-리폭시제나제 ('5-LOX') 경로를 통하는 것으로서, LTA4로부터 유래된 류코트리엔 (LTB4, LTC4, LTD4 및 LTE4)이 최종 생체활성 대사물이다. 리폭시제나제 경로는 류마티스 관절염 ('RA') 염증 과정에서 중요하며, RA 환자로부터의 윤활액은 많은 양의 류코트리엔을 함유하는 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 5-LOX는 RA 및 OA 윤활막에 존재하며, 5-LOX는 대부분 내층 및 내층하 대식세포, 호중구 및 비만 세포에서 발현된다. 이와 같은 경로의 다른 구성요소 - 5-LOX의 하류 산물인 LTB4 -는 강력한 염증유발성 화학주성 작용제이며, RA에서의 관절 염증의 중요한 매개인자로서 연루되어 있다. RA 환자의 혈청에는 비활성 관절염을 가진 환자 또는 정상 대상체에 비해 보다 높은 수준의 LTB4가 존재한다. 5-LOX 효소의 특정 억제제 - 화이자(Pfizer)의 PF-4191834 -가 래트 모델에서 관절염-연관 통증 및 염증을 감소시킨다는 것이 발견되어 있지만, 5-LOX 조정인자에 대한 단일 치료 양태는 불충분한 것으로 보인다.

바람직하게는, 항염증 산물은 더 우수한 안전성 프로파일을 가지면서도 광범위한 항염증 활성을 보유하는 아라키돈산 ('AA') 대사의 주요 대사 경로 둘 다의 억제를 포괄한다.

시토카인으로서 작용하며 면역 세포에 의해 분비되는 또 다른 염증 매개인자는 고도-운동성 그룹 단백질 1 ('HMG-1') 및 암포테린으로도 공지된 고도 운동성 그룹 박스 1 단백질 ('HMGB1')이다. HMGB1은 인간에서 HMGB1 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. 히스톤과 마찬가지로, HMGB1은 가장 중요한 염색질 단백질에 속한다. HMGB1은 30 kDa 핵 및 세포질 단백질이며, 면역 및 염증의 조절에서 다중 기능을 갖는 자가-유래 면역 활성화인자이다.

HMGB1은 염증 및 손상의 시점에 대식세포, 단핵구 및 수지상 세포와 같은 선천성 면역 세포에 의해 능동적으로 방출될 수 있다. 예를 들어, 대식세포 및 단핵구는 외인성 박테리아 내독소 (예를 들어, 리포폴리사카라이드 또는 LPS), 또는 내인성 염증유발성 시토카인 예컨대 종양 괴사 인자 ('TNF-α'), 인터류킨-1 베타 ('IL-1β') 및 인터페론 감마 ('IFN-γ')에 의한 자극에 반응하여 시간- 및 용량-의존적 방식으로 HMGB1을 능동적으로 방출한다.

HMGB1은 또한 괴사성 또는 손상된 세포에 의해 수동적으로 방출될 수 있으며, 이웃 면역 세포에 손상을 소통함으로써 선천성 면역 세포가 손상에 반응하는 것 및 추가로 염증을 유도하는 것 둘 다를 가능하게 하는 것에 의해 염증 반응을 유도할 수 있다. HMGB1 단백질은 진행성 글리코실화 최종 산물에 대한 수용체 ('RAGE') 및/또는 톨-유사 수용체 (TLR-2/4)를 통한 세포내 신호전달을 촉발하며, 이는 다시 다양한 백혈구 부착 분자, 염증유발성 시토카인 및 케모카인의 발현으로 이어지는 미토겐-활성화 단백질 키나제 ('MARK') 경로 및 후속적인 활성화된 B 세포의 핵 인자 카파-경쇄-인핸서 ('NF-κB') 매개 염증과 같은 다양한 신호전달 경로를 활성화시킨다.

HMGB1은 염증 활성에서 중요한 역할을 하며, 광범위한 면역 반응에 수반된다. HMGB1은 수지상 세포 ('DC')의 성숙 및 이동, 뿐만 아니라 이들 세포 및 단핵구의 활성화를 유도하여, TNF-α, IL-1β, IL-6 및 대식세포 염증성 단백질 1 ('MIP-1')과 같은 염증유발성 시토카인을 생산한다. HMGB1은 또한 단핵구, 대식세포, 호중구 및 DC에 대한 화학주성 인자로서 작용하여 염증을 지속시키고 선천성 면역 반응을 도출한다.

HMGB1은 침습 병원체로부터의 것 대신 손상된 자신으로부터 기원하는 위험 신호의 선도적인 예로 간주된다. HMGB1은 시토카인의 방출을 통한 염증 반응의 증폭을 초래하는 선천성 수용체의 활성화를 매개하며, 이는 다시 이들 매개인자의 유도를 추가로 증진하는 추가적인 HMGB1의 방출을 유도한다. TNF-α, IL-1β 및 IFN-γ와 같은 염증유발성 시토카인은 초기 염증 단계를 매개하는 것으로 공지되어 있는 한편, HMGB1은 패혈증 및 조직 손상에서 후기 단계 결정인자로 간주되고 있다.

HMGB1을 표적화하는 것은 염증성 질환에서의 치료 개입을 위한 실용적인 접근법일 수 있는데, 이는 패혈증, 관절염, 암 및 당뇨병을 포함한 많은 질환의 발병기전에서 중대한 매개인자로 식별되어 있기 때문이다. 예를 들어, (1) 류마티스 관절염을 가진 환자의 윤활액, (2) 생존한 환자와 비교한 생존하지 못한 패혈증 환자, (3) 고형 종양의 침습 및 전이, 및 (4) 당뇨병 및 그의 합병증에서 HMGB1의 수준이 상승되는 것으로 밝혀져 있다.

결과적으로, 많은 약리학적 작용제가 HMGB1의 방출 또는 HMGB1 활성을 억제하는 그의 잠재력에 대하여 연구되어 왔다 (도 2 참조). 여기에는 내독소-유도 HMGB1 방출을 억제하는 것 뿐만 아니라 실험적인 패혈증으로부터 동물을 보호하는 것으로 밝혀져 있는 동콰이 또는 당귀 ("중국당귀" - 안젤리카 시넨시스(Angelica sinensis)), 녹차 (카멜리아 시센시스(Camellia sisensis)) 및 단셴(Danshen) ("레드 세이지" 또는 "차이니즈 세이지" - 살비아 밀토리자(Saliva miltorrhiza))의 수성 추출물과 같은 전통적인 허브 의약이 포함된다. 과학적 조사는 이들 허브 추출물이 강한 항염증 및 항관절염 효과를 가지고 있음을 입증하였다. 폴리사카라이드, 페놀산, 페닐프로파노이드 에스테르, 트리테르펜 글리코시드, 프탈리드, 플라보노이드, 트리테르페노이드 사포닌, 디테르펜 및 트리테르펜을 포함한 광범위한 식물화학물질이 단리되어 있으며, 허브의 생물학적 효과를 담당하는 것으로 입증되어 있다.

따라서, 식물의약은 이들 질환 대부분의 관리에 있어서 중요한 역할을 하며, 식물이 천연 항산화제의 잠재적인 공급원이 된다. 연구는 차, 허브, 과실 및 채소에서 발견되는 폴리페놀계 화합물의 소비가 이들 질환의 낮은 위험성과 연관되는 것으로 제시한 바 있다. 결론적으로, 잠재적인 치료제로서의 항염증 활성을 나타내는 식물 및 건강-증진 식물구성성분에 대한 점증하는 연구 관심이 존재한다. 의약용 식물은 연장된 노출 시 독성일 수 있는 화학적 항산화제에 대한 안전하고 비용-효과적이며 생태학적인 대안을 제공할 수 있다.

캐슈 나무 (아나카르디움 옥시덴탈레 린(Anacardium occidentale Linn))는 원래는 아마존 기원이며, 나중에 경작을 위하여 인디아, 동아프리카 및 기타 나라들로 이식되었다. 상기 나무는 팽창된 화경 형태의 매우 특이한 열매 또는 과실을 생산한다. 이와 같은 화경의 말단 외부로 그의 고유한 회색 색상 신장-형상 경질 외피 내에서 캐슈 너트가 성장한다. 이와 같은 외피는 연질의 가죽질 외부 껍질, 그리고 커넬을 둘러싸는 깍지 또는 종피로 지칭되는 얇은 경질의 내부 껍질을 가지고 있다. 이들 2종 껍질 사이에는 캐슈 너트 외피 액을 함유하는 벌집 구조가 존재한다. 상기 액은 기타 성분 중에서도 특히 아나카르드산, 카르다놀 및 카르돌을 포함한다. 아나카르드산은 살리실산인 한편, 카르다놀 및 카르돌은 치환된 페놀이다.

과실의 다양한 부분이 그의 용도에 대하여 연구되어 있다. 식용 식품인 것 이외에, 캐슈 애플로부터의 주스는 음료에서 사용되는 한편, 과실 추출물은 체중 관리에서 이익을 나타내고 있다. 캐슈 너트 외피 액은 마찰 라이닝, 페인트, 라미네이팅 수지, 고무 컴파운딩 수지, 캐슈 시멘트, 폴리우레탄 기재 중합체, 계면활성제, 에폭시 수지, 파운드리 화학물질, 화학적 중간체, 살곤충제 및 살진균제를 포함한 다양한 산업 및 농업 적용분야용으로 추출되고 있다. 캐슈 종피는 태닝 재료에 사용되고 있다.

상기에서 주지된 바와 같이, 항염증 활성을 갖는 효과적인 비독성 천연 화합물에 대한 필요성이 존재한다. 보다 구체적으로, 관절 염증, 관절 통증, 관절 강직, 연골 분해 조정 효능을 갖는 효과적인 비독성 천연 화합물에 대한 필요성이 존재한다. 본 발명은 그와 같은 한 가지 해결책을 제공한다.

간단하게 말하자면, 본 개시내용은 관절 건강 관리에 유용한 표준화된 식물 추출물 및 그러한 추출물을 함유하는 조성물, 및 관절 건강을 개선시키는 관련된 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로, 카테킨을 포함하는 식물 추출물 조성물로서, 여기서 추출물은 추출물의 총 중량을 기준으로 하여 약 15.0 중량% 이상의 총 카테킨 함량으로 표준화된 것인 식물 추출물 조성물이 본원에 제공된다. 식물 추출물 조성물은 그의 항염증 활성으로 인하여 증진된 관절 건강을 나타내며, 적어도 아나카르디움( Anacardium ) 속으로부터의 추출물을 포함한다. 바람직하게는, 식물 추출물은 적어도 아나카르디움 옥시덴탈레 엘.(Anacardium occidentale L.)로부터의 추출물이다. 보다 바람직하게는, 식물 추출물은 적어도 아나카르디움 옥시덴탈레 엘.의 과실의 종피로부터의 것이다.

하나의 실시양태에서, 본 발명은 추출물의 총 중량을 기준으로 하여 약 15.0 중량% 이상의 총 카테킨을 포함하는 아나카르디움 옥시덴탈레 엘.의 과실의 종피의 추출물에 관한 것이다.

추가 실시양태에서, 본 발명은 관절 강직 및 불편감의 감소를 필요로 하는 포유동물에서 관절 강직 및 불편감을 감소시키기 위한 조성물로서, 아나카르디움 옥시덴탈레 엘의 종피의 식물 추출물의 치료 유효량을 포함하며, 여기서 식물 추출물은 총 카테킨 함량에 대해 강화된 것인 조성물을 제공한다. 식물 추출물은 총 폴리페놀에 대해 추가로 강화될 수 있다.

하나의 실시양태에서, 관절 강직 및 불편감의 감소를 필요로 하는 포유동물에서 관절 강직 및 불편감을 감소시키기 위한 조성물 중 치료 유효량의 식물 추출물은 인간 등가 투약을 기준으로 하여 적어도 약 500.0 mg/kg 이상의 양으로 존재할 수 있다. 추가 실시양태에서, 조성물 중 식물 추출물의 치료 유효량은 인간 등가 투약을 기준으로 하여 약 500.0 mg/kg 내지 약 2000.0 mg/kg의 양이다. 또 다른 추가 실시양태에서, 조성물 중 식물 추출물의 치료 유효량은 인간 등가 투약을 기준으로 하여 약 1000.0 mg/kg 내지 약 2000.0 mg/kg의 양이다.

하나의 실시양태에서, 관절 강직 및 불편감의 감소를 필요로 하는 포유동물에서 관절 강직 및 불편감을 감소시키기 위한 조성물 중 식물 추출물은 추출물의 총 중량을 기준으로 하여 적어도 약 15.00 중량%의 총 카테킨 함량으로 표준화된다.

하나의 실시양태에서, 관절 강직 및 불편감의 감소를 필요로 하는 포유동물에서 관절 강직 및 불편감을 감소시키기 위한 조성물은 관절 강직 및 불편감을 가진 포유동물에서 시클로옥시제나제 및 5-리폭시제나제 매개 염증을 완화시킨다.

하나의 실시양태에서, 관절 강직 및 불편감의 감소를 필요로 하는 포유동물에서 관절 강직 및 불편감을 감소시키기 위한 조성물은 제약 담체를 추가로 포함한다.

관절 강직 및 불편감의 감소를 필요로 하는 포유동물에서 관절 강직 및 불편감을 감소시키기 위한 조성물은 식이 보충제일 수 있다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 연골 재건 또는 재생 기능의 개선을 필요로 하는 포유동물에서 연골 재건 또는 재생 기능을 개선시키기 위한 조성물로서, 아나카르디움 옥시덴탈레 엘의 종피의 식물 추출물의 치료 유효량을 포함하며, 여기서 식물 추출물은 총 카테킨 함량에 대해 강화된 것인 조성물을 제공한다.

연골 재건 또는 재생 기능의 개선을 필요로 하는 포유동물에서 연골 재건 또는 재생 기능을 개선시키기 위한 조성물 중 식물 추출물의 치료 유효량은 인간 등가 투약을 기준으로 하여 적어도 약 500.0 mg/kg 이상의 양일 수 있다. 바람직하게는, 조성물 중 식물 추출물의 치료 유효량은 인간 등가 투약을 기준으로 하여 약 500.0 mg/kg 내지 약 2000.0 mg/kg의 양이다. 보다 바람직하게는, 조성물 중 식물 추출물의 치료 유효량은 인간 등가 투약을 기준으로 하여 약 1000.0 mg/kg 내지 약 2000.0 mg/kg의 양이다.

추가 실시양태에서, 연골 재건 또는 재생 기능의 개선을 필요로 하는 포유동물에서 연골 재건 또는 재생 기능을 개선시키기 위한 조성물 중 식물 추출물은 추출물의 총 중량을 기준으로 하여 적어도 약 15.00 중량%의 총 카테킨 함량으로 표준화된다.

하나의 실시양태에서, 연골 재건 또는 재생 기능의 개선을 필요로 하는 포유동물에서 연골 재건 또는 재생 기능을 개선시키기 위한 조성물은 관절 재건 또는 재생 기능을 필요로 하는 포유동물에서 시클로옥시제나제 및 5-리폭시제나제 매개 염증을 완화시킨다.

연골 재건 또는 재생 기능의 개선을 필요로 하는 포유동물에서 연골 재건 또는 재생 기능을 개선시키기 위한 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

추가로, 연골 재건 또는 재생 기능의 개선을 필요로 하는 포유동물에서 연골 재건 또는 재생 기능을 개선시키기 위한 조성물은 식이 보충제일 수 있다.

또 다른 측면에서는, 아나카르디움 옥시덴탈레 엘의 종피의 식물 추출물을 포함하며, 여기서 식물 추출물은 총 카테킨 함량에 대해 강화된 것인 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 관절 강직 및 불편감의 감소를 필요로 하는 포유동물에서 관절 강직 및 불편감을 감소시키는 방법이 제공된다.

한 측면에서, 관절 강직 및 불편감의 감소를 필요로 하는 포유동물에서 관절 강직 및 불편감을 감소시키는 방법에서의 식물 추출물은 추출물의 총 중량을 기준으로 하여 적어도 약 15.00 중량%의 총 카테킨 함량으로 표준화된다. 식물 추출물은 총 폴리페놀에 대해 추가로 강화될 수 있다.

한 측면에서, 관절 강직 및 불편감의 감소를 필요로 하는 포유동물에서 관절 강직 및 불편감을 감소시키는 방법은 관절 강직 및 불편감을 가진 포유동물에서 시클로옥시제나제 및 5-리폭시제나제 매개 염증을 완화시킨다.

또 다른 실시양태에서는, 아나카르디움 옥시덴탈레 엘의 종피의 식물 추출물을 포함하며, 여기서 식물 추출물은 총 카테킨 함량에 대해 강화된 것인 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 연골 재건 또는 재생 기능의 개선을 필요로 하는 포유동물에서 연골 재건 또는 재생 기능을 개선시키는 방법이 제공된다. 상기 식물 추출물은 총 폴리페놀에 대해 추가로 강화된다.

연골 재건 또는 재생 기능의 개선을 필요로 하는 포유동물에서 연골 재건 또는 재생 기능을 개선시키는 방법에서의 식물 추출물은 추출물의 총 중량을 기준으로 하여 적어도 약 15.00 중량%의 총 카테킨 함량으로 표준화될 수 있다.

한 측면에서, 연골 재건 또는 재생 기능의 개선을 필요로 하는 포유동물에서 연골 재건 또는 재생 기능을 개선시키는 방법은 연골 재건 또는 재생 기능을 필요로 하는 포유동물에서 시클로옥시제나제 및 5-리폭시제나제 매개 염증을 완화시킨다.

아나카르디움 옥시덴탈레 엘.의 종피의 식물 추출물을 함유하는 조성물은 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 그와 같은 조성물의 비-제한적인 예는 식이 보충제 및 국소 조성물을 포함한다.

도 1i 및 1ii는 아라키돈산 대사 경로의 일반적인 예시이다.
도 2는 다양한 부위에서의 HMGB1-매개 염증유발성 반응의 일반적인 예시이다.
도 3은 0분 (개시) 내지 20분의 체류 시간에 걸친 275 nm 파장에서의 캐슈 종피 추출물의 HPLC 크로마토그램이다.
도 4는 캐슈 종피 추출물의 LC/MS 및 LC/PDA (280 및 350 nm의 파장) 크로마토그램이다.
도 5는 다양한 농도의 캐슈 종피 추출물을 사용한 백분율 COX-1 억제를 예시하는 그래프이다.
도 6은 다양한 농도의 캐슈 종피 추출물을 사용한 백분율 COX-2 억제를 예시하는 그래프이다.
도 7은 다양한 농도의 캐슈 종피 추출물을 사용한 백분율 5-LOX 억제를 예시하는 그래프이다.
도 8은 실내 분위기 (21% O₂) ('RA'), 캐슈 종피 추출물이 없는 95% O₂ ('O2'), DMSO ('비히클'), 양성 대조군인 나트륨 살리실레이트 ('SS 2μM') 및 캐슈 종피 추출물이 있는 95% O₂ ('CT')에서의 대식세포 세포 배양 상청액 중 HMGB1의 검출 (% 방출)을 예시하는 막대 그래프이다.
도 9는 이용된 연골-유도 관절염 ('CIA') 실험 설계를 예시하는 과정 도표이다.
도 10은 각 연구 그룹에 대한 9일차부터 21일차까지의 관절염 중증도 지수에서의 변화를 예시하는 그래프이다.
도 11은 각 연구 그룹에 대한 관절염 중증도 점수 곡선하 면적 ('AUC')을 예시하는 막대 차트이다.
도 12는 각 연구 그룹에 대한 프라이밍부터 21일차까지의 발 두께에서의 변화를 예시하는 그래프이다.
도 13은 CIA 모델에서의 각 연구 그룹에 대한 래트의 발 부종의 곡선하 면적을 예시하는 막대 차트이다.
도 14는 CIA 모델에서의 각 연구 그룹에 대한 프라이밍부터 21일차까지의 관절염 중증도 척도로서의 래트의 발목 직경에서의 변화를 예시하는 그래프이다.
도 15는 CIA 모델에서의 각 연구 그룹에 대한 래트의 발목 직경의 곡선하 면적을 예시하는 막대 차트이다.
도 16은 CIA 모델에서의 프라이밍부터 21일차까지의 각 연구 그룹에서의 래트의 통증 민감도 반응을 예시하는 그래프이다.
도 17은 CIA 모델에서의 각 연구 그룹에 대한 프라이밍부터 21일차까지의 통증 민감도 개선의 백분율로서 측정된 압축 임계치에서의 백분율 변화를 예시하는 막대 차트이다.
도 18은 정규화 없는 소변 CTX-II 미가공 데이터를 예시하는 막대 차트이다.
도 19는 총 단백질에 대하여 정규화된 소변 CTX-II를 예시하는 막대 차트이다.
도 20은 소변 중 크레아티닌 농도에 대하여 정규화된 소변 CTX-II를 예시하는 막대 차트이다.
도 21은 모델 유도 후 3주 동안의 CIA 모델에서의 각 연구 그룹에 대한 혈청 IL-1β를 예시하는 막대 차트이다.
도 22는 모델 유도 후 3주 동안의 CIA 모델에서의 각 연구 그룹에 대한 혈청 TNF-α를 예시하는 막대 차트이다.
도 23은 모델 유도 후 3주 동안의 CIA 모델에서의 각 연구 그룹에 대한 혈청 PIIANP를 예시하는 막대 차트이다.
도 24는 모델 유도 후 3주 동안의 CIA 모델에서의 각 연구 그룹에 대한 혈청 MMP-13을 예시하는 막대 차트이다.
도 25는 (A) 연골 파괴, (B) 골 침식, (C) 염증 및 (D) 매트릭스 완전성/GAG 손실에 있어서의 각 연구 그룹에 대한 CIA 래트의 발목 관절의 조직병리학적 발견을 예시하는 4개의 막대 차트이다.
도 26은 각 연구 그룹에 대한 발목 관절 절편의 헤마톡실린 및 에오신 및 사프라닌 O-패스트 그린 염색물이다.

본 발명은 캐슈 (아나카르디움 옥시덴탈레 린)의 종피에 특정 플라보노이드가 실질적으로 많다는 놀라운 발견을 기반으로 한다. 구체적으로, 캐슈 종피의 추출물이 주요 구성요소로서 카테킨 및 에피카테킨, 뿐만 아니라 프로시아니딘을 포함한다는 것이 발견되었다. 본원에서 주지되는 데이터는 캐슈 종피 추출물이 항염증 적용성을 가질 수 있다는 것을 입증한다.

본 발명의 다른 측면은 골 구조, 연골 구조 또는 이들 둘 다를 유지하는 것, 골 재흡수를 최소화하는 것, 연골 분해를 예방하는 것, 골 밀도를 증가시키는 것, 연골 완전성을 보호함으로써 건강한 관절을 증진시키는 것, 골 건강, 연골 건강 또는 이들 둘 다에 영향을 주는 효소의 작용을 감소시키는 것, 관절 운동 또는 기능을 개선시키는 것, 관절 통증을 완화시키는 것, 관절 불편감을 완화시키는 것, 관절 통증 및 불편감을 완화시키는 것, 관절 강직을 완화시키는 것나, 관절 동작 또는 유연성 범위를 개선시키는 것, 운동성을 증진시키는 것 등을 위해 본 개시내용의 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.

하기 상세한 설명에서는, 본 개시내용의 다양한 실시양태의 철저한 이해를 제공하기 위하여 특정의 구체적인 세부사항이 제시된다. 그러나, 관련 기술분야의 통상의 기술자라면 본 발명이 이들 세부사항 없이도 실시될 수 있다는 것을 이해할 것이다.

본 상세한 설명에서, 달리 지시되지 않는 한, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비 범위, 또는 정수 범위는 인용된 범위 내의 임의의 정수값을 포함하는 것으로, 그리고 적절한 경우에는 그의 분수 (예컨대 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 임의의 물리적 특색, 예컨대 중합체 서브유닛, 크기, 또는 두께와 관련하여 본원에 인용된 임의의 수치 범위는, 달리 지시되지 않는 한, 인용된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약"은, 달리 지시되지 않는 한, 지시된 범위, 값, 또는 구조의 ±20%를 의미한다. 본원에 사용된 단수 용어는 열거되는 구성요소의 "하나 이상"을 지칭한다. 대안 (예를 들어, "또는")의 사용은 어느 하나, 둘 다, 또는 이들 대안의 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, 단어 "포함하다" 및 그의 변형, 예컨대, "포함한다" 및 "포함하는", 뿐만 아니라 "수반하다" 및 "갖는다" 및 이들의 변형과 같은 동의 용어는 개방형의 포괄적인 의미; 즉 "포함하나 그에 제한되지는 않는"으로 해석되어야 한다.

본 명세서 전반에 걸친 언급 "하나의 실시양태" 및 "한 실시양태"는 실시양태와 연계되어 기술되는 특정한 특색, 구조 또는 특징이 본 발명의 적어도 하나의 실시양태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서의 "하나의 실시양태에서" 또는 "한 실시양태에서"라는 구의 출현이 반드시 모두 동일한 실시양태를 지칭하는 것은 아니다. 게다가, 특정한 특색, 구조 또는 특징은 하나 이상의 실시양태에서 임의의 적합한 방식으로 조합될 수 있다.

본 출원에 있어서, "조성물"이라는 용어는 천연 상태, 생물학적 과정 또는 질환 또는 장애와 연관되어 있는 특정한 병태를 치료하거나, 개선시키거나, 증진시키거나, 증가시키거나, 관리하거나, 제어하거나, 유지하거나, 최적화하거나, 조정하거나, 감소시키거나, 억제하거나 또는 예방하는 제품을 지칭한다. 예를 들어, 조성물은 대상체에서 산화의 억제를 개선시키고/거나 염증을 감소시키는 것 등을 한다. 조성물이라는 용어는 유효량의 추출물, 그의 적어도 1종의 구성요소 또는 이들의 혼합물을 포함하는 제약 (즉 약물), 일반의약품 (OTC), 화장품, 식품, 식품 성분 또는 식이 보충제 조성물을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적인 조성물은 크림, 화장용 로션, 팩 또는 분말, 또는 에멀젼, 로션, 리니멘트 폼, 정제, 플라스터, 그래뉼 또는 연고를 포함한다. 조성물은 또한 음료, 예를 들어, 유효량의 추출물이 주입된 음료, 또는 유효량의 추출물을 함유하는 차 사첼을 포함할 수 있다. 유효량의 추출물을 함유하는 식품 조성물의 비-제한적인 예는 베이킹된 상품, 단백질 분말, 육류 제품, 유제품 및 과자류를 포함한다.

추가로, 본원에 사용된 "제약 조성물" 또는 "기능식품 조성물"은 본 개시내용의 식물 추출물 및 포유동물 예컨대 인간에의 생물학적 활성 추출물의 전달용으로 관련 기술분야에서 일반적으로 허용되는 매질의 제제를 지칭한다. 예를 들어, 본 개시내용의 제약 조성물은 독립형 조성물로서, 또는 처방 약물, 일반의약품 (OTC) 의약, 식물성 약물, 허브 의약, 동종요법제, 기능성 식품, 또는 정부 당국에 의해 검토 및 승인된 임의의 다른 형태 건강 관리 제품에서의 구성요소로서 제제화되거나 사용될 수 있다. 본 개시내용의 예시적인 기능식품 조성물은 독립형 조성물로서, 또는 식품, 신규 식품, 기능성 식품, 음료, 바, 식품 향미제, 식품 첨가제, 의료용 식품, 식이 보충제 또는 허브 제품에서의 영양 또는 생체활성 구성요소로서 제제화되거나 사용될 수 있다. 관련 기술분야에서 일반적으로 허용되는 매질은 그를 위한 모든 제약상 또는 기능식품상 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함한다.

본원에 사용된 바와 같이, "추출물" 또는 "식물 추출물"이라는 용어는 적어도 식물 속 아나카르디움 (예를 들어, 아나카르디움 휴밀레(Anacardium humile), 아나카르디움 오토니아눔(Anacardium othonianum), 아나카르디움 기간테움(Anacardium giganteum), 아나카르디움 나눔(Anacardium nanum), 아나카르디움 네그렌세(Anacardium negrense), 및/또는 아나카르디움 옥시덴탈레(Anacardium occidentale)), 바람직하게는 아나카르디움 옥시덴탈레 엘.의 물질 중 1종 이상의 활성 성분을 포함하는 고체, 점착질 또는 액체 물질 또는 조제물을 지칭한다. 바람직하게는, 활성 성분은 캐슈 종피의 추출물로부터 유래된다. 추출물은 물, 1 내지 4개의 탄소 원자의 저급 알콜 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 에틸렌, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸 아세테이이트, 부틸 아세테이트, 디클로로메탄, N,N-디메틸포름아미드 ('DMF'), 디메틸 술폭시드 ('DMSO'), 1,3-부틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 및 이들의 조합과 같은 용매, 뿐만 아니라 이와 같은 용매 중 조 추출물의 분획을 사용하여 제조된다. 활성 성분(들)의 추출 및 보존을 그것이 보장하는 한, 어떠한 추출 방법도 이용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, "에 대해 강화된"은 추출 또는 기타 조제 전에 미가공 식물 재료 또는 기타 공급원의 중량에서 발견되는 1종 이상의 활성 화합물의 양 또는 활성과 비교 시 1종 이상의 활성 화합물의 양 또는 활성에서의 적어도 2-배 이상 증가를 갖는 식물 추출물 또는 기타 조제물을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 추출 또는 기타 조제 전의 식물 재료 또는 기타 공급원의 중량은 건조 중량, 습윤 중량 또는 이들의 조합일 수 있다.

본원에 사용된 바와 같이, 순수한 화합물, 조성물, 추출물, 추출물 혼합물, 추출물의 구성요소, 및/또는 활성 작용제 또는 성분, 또는 이들의 조합의 "유효량" 또는 "치료 유효량"이라는 용어는 원하는 결과를 달성하기에 충분한 투약량으로 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 보다 구체적으로, "유효량" 또는 "치료 유효량"은 포유동물, 예컨대 인간에게 투여되었을 때 하기 중 어느 하나 이상을 포함한 치료를 달성하기에 충분한 본 개시내용의 추출물 또는 상기 추출물을 함유하는 조성물의 양을 지칭한다: (1) 포유동물에서 골 및 연골의 손실을 치료 또는 예방함; (2) 골 및 연골 건강을 증진시킴; (3) 포유동물에서 골 및 연골의 손실을 저해함; (4) 포유동물에서 골 밀도를 증가시킴; (5) 포유동물에서 골다공증을 치료 또는 예방함; (6) 포유동물에서 골 및 연골의 염증을 조정함; (7) 골 및 연골 완전성을 보호함; 및 (8) 관절 강직 및 불편감을 감소시킴. "치료 유효량"을 구성하는 본 개시내용의 화합물 또는 조성물의 양은 주요 활성 성분의 양, 치료되는 병태 및 그의 중증도, 투여 방식, 치료 지속기간, 또는 치료되는 대상체의 체중 및 연령에 따라 달라지게 되지만, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 그 자신의 지식 및 본 개시내용에 유념하여 결정될 수 있다.

"제약상 허용되는"이라는 용어는 합리적인 이익/위험 비에 부합하여 과도한 독성, 비상용성, 불안정성, 자극 등이 없이 인간 및 하등 동물 조직과의 접촉에서 사용하기에 적합한 약물, 약제, 추출물 또는 불활성 성분을 의미한다.

"투여하다", "투여되는", "투여한다" 및 "투여하는 것"이라는 용어는 비제한적으로 정맥내, 동맥내, 경구, 비경구, 협측, 국소, 경피, 직장, 근육내, 피하, 골내, 점막경유 또는 복막내 투여 경로를 포함한 관련 기술분야에 공지되어 있는 경로를 통하여 대상체에게 조성물을 제공하는 것으로 정의된다. 바람직한 실시양태에서는, 조성물의 경구 투여 경로가 적합하다.

본원에 사용된 바와 같이, "대상체" 또는 "개체"라는 용어는 조성물이 투여될 수 있는 포유동물을 포함한다. "포유동물"의 비-제한적인 예는 인간, 비-인간 영장류, 개, 고양이, 말, 소, 설치류 (트랜스제닉 및 비-트랜스제닉 마우스 포함) 등을 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 비-인간 포유동물이며, 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.

본원에 사용된 바와 같이, "담체"라는 용어는 1종 이상의 식물 추출물을 투여에 적합한 형태의 가용성이며 균질한 상태로 유지하는 것을 돕는 것으로서, 비독성이고 유해한 방식으로 다른 구성요소와 상호작용하지 않는 조성물을 지칭한다.

본원에 사용된 "보충제"는 천연 상태 또는 생물학적 과정과 연관되어 있는 특정한 병태, 구조 또는 기능을 개선시키거나, 증진시키거나, 지지하거나, 증가시키거나, 조절하거나, 관리하거나, 제어하거나, 유지하거나, 최적화하거나, 조정하거나, 감소시키거나, 억제하거나 또는 예방하는 (즉 질환을 진단하거나, 치료하거나, 감퇴시키거나, 치유하거나 또는 예방하는데 사용되지 않음) 제품을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 보충제는 식이 보충제이다. 예를 들어, 골 및 연골 건강-관련 상태와 관련하여서는, 골 및 연골 완전성을 유지하는 것, 골 재흡수를 최소화하는 것, 연골 분해를 최소화하는 것, 골 및 연골 완전성을 보호함으로써 건강한 골 및 연골을 증진시키는 것, 골 및 연골 건강에 영향을 주는 효소의 작용을 감소시키는 것, 골다공증 상태를 개선시키는 것, 골 재건을 지지하는 것, 통증을 완화시키는 것, 불편감을 경감시키는 것, 강직을 경감시키는 것, 동작 범위를 개선시키는 것, 유연성을 개선시키는 것, 운동성을 증진시키는 것 등을 위해 식이 보충제가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 식이 보충제는 특정 카테고리의 식이, 식품 또는 둘 다이며, 약물이 아니다.

달리 지시되지 않는 한, 본 개시 전체에 걸쳐 언급되는 모든 비율 및 백분율은 중량 기준이다.

특정 실시양태에서, 본 개시내용의 화합물 및 조성물 (예를 들어, 제약, 기능식품)은 골 건강을 증진시키거나; 골 건강을 개선시키거나; 골 건강을 유지하거나; 골 장애를 치료 또는 관리하거나; 골 건강을 지지하거나; 정상적이며 편안한 범위의 동작 및/또는 유연성을 지지하거나; 동작 및/또는 유연성의 범위를 개선시키거나; 골을 파괴하는 유해 효소의 작용을 감소시키거나; 골 흡수에 영향을 주는 효소의 작용을 변경하거나; 정상적인 골 기능을 사용한 운동을 개선시키거나; 신체 운동성을 개선시키거나; 신체 운동성을 관리하고/거나 유지하거나; 골 손실로 인한 통증 및/또는 강직을 완화시키거나; 신체 기능을 개선시키거나; 유연성 및 편안한 운동을 증진 또는 향상시키거나; 건강한 골 기능 및 편의성을 증진시키거나; 골 불편감을 완화시키거나; 운동, 작업, 과로 또는 이들의 임의의 조합에 의해 야기되는 골 불편감을 완화시키거나; 연골 완전성을 보호함으로써 건강한 골을 증진시키거나; 관절 연골을 유지하거나; 관절 연골을 지지하거나; 연골 분해를 치료, 예방 또는 관리하거나; 연골 분해를 최소화하거나; 관절 윤활을 위한 윤활액을 유지하는 것에 의해 관절 건강 또는 편의성을 증진시키거나; 관절 안정성 및 관절 유연성을 지지하거나; 관절을 소생시키고 운동성을 증진시키거나; 유연한 관절 및 강한 연골을 증진시키거나; 관절로의 일관된 혈류를 유지함으로써 향상된 유연성 및/또는 강도를 지지하거나; 운동, 작업, 과로 또는 이들의 임의의 조합 후 관절 편의성 및 광범위한 동작 범위를 증진시키는데; 또는 본원에서 기술되는 임의의 다른 연관 지표에 충분한 양으로, 그리고 일반적으로 환자에 대한 허용되는 독성으로 투여될 수 있다.

본 발명은 항염증 활성을 나타내며 그에 따라 관절 건강을 증진시키는 식물 추출물을 제공한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 아나카르디움 속 캐슈 종피의 식물 추출물에 관한 것이다. 본원에 제시된 바와 같이, 그와 같은 식물 추출물은 관절 강직 및 불편감을 감소시키고 관절 기능을 개선시키는 것으로 밝혀졌다. 추가로, 본 발명에 따른 식물 추출물은 μCTX-II의 감소를 기반으로 하는 연골 보호 및 관절 구조 완전성의 보호를 제공한다. 본 발명에 따른 식물 추출물은 개선된 연골 재건 또는 재생을 제공한다. 마지막으로, 본 발명에 따른 식물 추출물은 OA의 증상을 개선시키고, 이화 경로를 저해하며, 관절 구조 완전성을 보호하고, 연골 재건 또는 재생 기능을 개선시키는데 있어서 글루코사민/콘드로이틴 보충제에 비해 더 효과적인 것으로 보인다.

이전에 언급된 바와 같이, 본 발명에 따른 유용한 관절 건강 식물 추출물은 아나카르디움 속으로부터의 식물 추출물을 포함한다. 보다 구체적으로, 추출물은 아나카르디움 휴밀레, 아나카르디움 오토니아눔, 아나카르디움 기간테움, 아나카르디움 나눔, 아나카르디움 네그렌세 및/또는 아나카르디움 옥시덴탈레 종 중 1종 이상으로부터 선택되는 식물 추출물이다. 바람직하게는 식물 추출물은 아나카르디움 옥시덴탈레 엘. 종으로부터의 것이다. 하나의 실시양태에서, 식물 추출물은 아나카르디움 옥시덴탈레 엘. 종의 종피로부터의 것이다.

본 발명에 따른 관절 건강 조성물은 활성 성분으로서 기능할 수 있는 1종 이상의 화합물을 포함할 수 있다. 화합물은 식물 추출물의 구성요소일 수 있다. 예를 들어, 화합물은 식물 추출물이 수득되는 식물에 존재하는 식물화학물질일 수 있다. 화합물은 적어도 부분적으로 항염증 활성을 나타내는 것을 담당할 수 있다. 화합물은 관절 건강을 증진시킬 수 있는 임의의 화합물일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 화합물은 식물화학물질 카테킨, 에피카테킨 및/또는 프로시아니딘 (예를 들어, A, B, 삼량체, 사량체)로부터 선택된다.

일반적으로, 비제한적으로 뿌리, 줄기, 잎, 꽃, 과실, 종자 및 종자의 종피를 포함한 하나 이상의 식물 부분이 식물 추출물을 생산하는데 사용될 수 있다. 본 발명에서는, 식물 추출물을 생산하는데 - 단독으로 또는 다른 식물 부분과 함께 - 적어도 종자의 종피가 사용된다. 아나카르디움 식물의 종피는 다양한 공급원으로부터 상업적으로 수득될 수 있다. 캐슈 종피의 추출물은 임의의 적합한 추출 기술을 사용하여 수득될 수 있다.

이와 관련하여, 식물의 하나 이상의 부분, 특히 식물의 종피는 수집되고 밀링될 수 있다. 이후, 밀링된 재료는 적합한 용매를 사용하여 추출될 수 있다. 용매는 농축 단계에서 제거될 수 있다. 예를 들어, 추출된 재료는 상청액 및 케이크를 생성하기 위하여 스크리닝 또는 여과될 수 있다. 케이크는 상청액에 첨가될 수 있는 액체의 실질적인 부분을 제거하기 위하여 가압될 수 있다. 이어서, 케이크는 탈수되어 섬유 공급원으로서 사용될 수 있다. 상청액은 용매 또는 그의 일부를 제거하여 식물 추출물 액체 농축물을 형성하기 위하여 증류될 수 있다. 제거된 용매는 재순환될 수 있다. 농축물은 건조된 식물 추출물을 제공하기 위하여 (예를 들어, 분무 건조에 의해) 건조될 수 있다. 이와 같이 건조된 식물 추출물은 본원에서 기술되는 바와 같이 검정 및/또는 표준화될 수 있다. 바람직하게는, 건조된 식물 추출물은 아나카르디움 옥시덴탈레, 특히 아나카르디움 옥시덴탈레 엘. 식물의 종피로부터 유래한다.

추출 과정에 적합한 용매는 물, 알콜 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 예시적인 알콜계 용매는 C₁-C₇ 알콜 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올 및 부탄올), 히드로-알콜 또는 알콜과 물의 혼합물 (예를 들어, 히드로-에탄올), 다가 알콜 (예를 들어, 프로필렌 글리콜 및 부틸렌 글리콜) 및 지방 알콜을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이들 알콜계 용매 중 어느 것은 혼합물의 형태로 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 식물 추출물은 에탄올, 물 또는 이들의 조합 (예를 들어, 약 70% 에탄올과 약 30% 물의 혼합물)을 사용하여 추출된다. 또 다른 실시양태에서, 식물 추출물은 단지 물만을 사용하여 추출된다.

하나의 실시양태에서, 식물 추출물은 유기 용매 추출 기술을 사용하여 수득될 수 있다. 또 다른 실시양태에서는, 용매 순차 분별이 식물 추출물을 수득하는데 사용될 수 있다. 총 히드로-에탄올계 추출 기술이 식물 추출물을 수득하는데 사용될 수도 있다. 일반적으로, 이는 일괄 추출로 지칭된다.

총 에탄올 추출이 또한 사용될 수 있다. 이와 같은 기술은 용매로서 에탄올을 사용한다. 이와 같은 추출 기술은 수용성 화합물 이외에 지용성 및/또는 친지성인 화합물을 갖는 식물 추출물을 생성시킬 수 있다.

식물 추출물을 수득하는데 사용될 수 있는 추출 기술의 또 다른 예는 초임계 유체 이산화탄소 추출 ('SFE')이다. 이와 같은 추출 절차에서는, 추출될 재료가 어떠한 유기 용매에도 노출되지 않을 수 있다. 그보다는, 이산화탄소가 초임계 조건 (> 31.3℃ 및 >73.8 bar)로 - 개질제의 존재 또는 부재 하에 - 추출 용매로서 사용될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자라면, 최고의 추출물 수율을 수득하기 위하여 온도 및 압력 조건이 달라질 수 있다는 것을 인지할 것이다. 총 헥산 및 에틸 아세테이트 추출 기술과 유사하게, 이와 같은 기술은 지용성 및/또는 친지성 화합물의 추출물을 생성시킬 수 있다.

상기 과정에서 생성되는 식물 추출물은 추출되는 재료에 존재하는 매우 다양한 식물화학물질을 포함할 수 있다. 식물화학물질은 지용성이거나 수용성일 수 있다. 추출 용액의 수집 후, 용매는 증발되어 추출물을 초래할 수 있다. 식물 추출물은 특정한 화합물의 명시된 양으로 표준화될 수 있다. 예를 들어, 식물 추출물은 활성 성분 또는 식물화학물질의 명시된 양으로 표준화될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 식물 추출물은 추출물의 총 중량을 기준으로 하여 약 15.0 중량% 이상의 카테킨 함량으로 표준화된다.

관절 건강 조성물에 존재하는 식물 추출물의 양은 염증 억제의 원하는 수준, 특정한 식물 추출물 또는 그의 구성요소의 염증 억제 수준 및 기타 인자를 포함한 몇 가지 인자에 따라 달라질 수 있다. 바람직하게는, 식물 추출물은 조성물의 총 중량을 기준으로 하여 약 0.005 중량% 이상, 예를 들어 약 0.005 중량% 내지 약 50.00 중량%의 양으로 존재한다.

관절 건강 조성물은 1종 이상의 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 담체는 대상체에의 투여에 적합한 형태를 가지는 항염증 조성물에의 식물 추출물의 도입을 가능하게 하는 것을 도울 수 있다. 많은 수의 허용되는 담체가 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 담체는 임의의 적합한 담체일 수 있다. 담체는 바람직하게는 인간을 포함한 동물에의 투여에 적합한 것으로서, 식물 추출물 및/또는 임의의 활성 성분의 원하는 활성에 실질적으로 영향을 주지 않으면서 담체로서 작용할 수 있을 수 있다. 담체는 원하는 투여 경로 및 조성물의 투약량 형태를 기반으로 하여 선택될 수 있다.

적합한 투약량 형태는 액체 및 고체 형태를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 조성물은 겔, 시럽, 슬러리 또는 현탁액의 형태로 존재한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 드링크 샷 또는 액체 농축물과 같은 액체 투약량 형태로 존재한다. 추가 실시양태에서, 조성물은 정제, 환제, 캡슐, 당의정 또는 분말과 같은 고체 투약량 형태로 존재한다. 액체 또는 고체 투약량 형태로 존재하는 경우, 조성물은 전달을 위한 식품에의 도입에 적합한 식품 전달 형태로 존재할 수 있다. 고체 형태 (특히 정제 및 캡슐 형태)에서 사용하기에 적합한 담체의 예는 유기 및 무기 불활성 담체 재료 예컨대 젤라틴, 전분, 스테아르산마그네슘, 활석, 검, 이산화규소, 스테아르산, 셀룰로스 등을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 담체는 실질적으로 불활성일 수 있다.

예로서, 규화 미세결정질 셀룰로스가 담체 또는 결합제로서 사용될 수 있다. 규화 미세결정질 셀룰로스는 미세결정질 셀룰로스와 콜로이드성 이산화규소의 물리적 혼합물이다. 한 가지 그와 같은 적합한 형태의 규화 미세결정질 셀룰로스는 뉴저지주 패터슨 소재 펜웨스트 파마슈티칼 캄파니(Penwest Pharmaceutical Co.)로부터 입수가능한 프로솔브(ProSolv) SMCC^® 90이다. 규화 미세결정질 셀룰로스에 의해 제공되는 것 이외에, 이산화규소가 가공 조제로서 조성물에 첨가될 수 있다. 예를 들어, 이산화규소는 정제와 같은 고체 투약량 단위의 제조에서 압축 동안 분말의 유동을 개선시키기 위한 활택제로서 포함될 수 있다.

또 다른 실시양태에서, 담체는 적어도 메밀 또는 스펠트밀과 같은 기능성 담체이다. 조성물에의 기능성 담체의 첨가에 의해, 상기에서 언급된 것들과 같은 표준 담체와 비교하여 더 낮은 혈당 지수와 같은 추가적인 이익이 제공될 수 있다. 추가로, 기능성 담체는 알레르겐 무함유일 수 있으며 (예를 들어, 메밀), 생산 과정에 그것을 첨가하는 것에 의해, 본 발명의 식물 추출물은 이러한 기능성 담체의 플라보노이드, 예컨대 루틴 및 퀘르세틴으로부터 이익을 얻을 수 있다. 추가로, 이들 기능성 담체의 높은 섬유 함량은 장 통과를 용이하게 하고 조절할 수도 있다. 마지막으로, 스펠트밀에서 발견되는 셀레늄의 부가되는 미네랄 이익은 대사를 도울 수 있다.

항염증 조성물은 윤활제 및/또는 활택제와 같은 다른 불활성 성분을 포함할 수 있다. 윤활제는 제조 동안, 예컨대 다이로부터의 배출 동안 정제의 취급을 돕는다. 활택제는 정제 압축 동안 분말 유동을 개선시킨다. 스테아르산이 허용되는 윤활제/활택제의 예이다.

항염증 조성물은 정제 및 캡슐과 같은 고체 투약량 형태로 제조될 수 있다. 이와 같은 형태는 개체에 의해 레스토랑과 같은 섭식 장소로 용이하게 수송될 수 있으며, 식료품의 소비 전에, 동안 또는 후에 용이하게 섭취될 수 있는 제품을 제공한다. 조성물은 체중, 식료품 크기 또는 탄수화물 (예를 들어, 당) 함량과 같은 적절한 파라미터를 기반으로 하여 개체가 섭취할 단위의 적절한 수를 결정하는 것을 가능하게 하는 적합한 양의 식물 추출물 및/또는 활성 성분을 함유하는 투약량 단위로 제제화될 수 있다.

추가 실시양태에서, 본 개시내용에 따른 조성물은 카테킨, 에피카테킨 또는 이들의 조합을 함유하는 플라반에 대해 강화된 아나카르디움 추출물을 포함한다. 특정 실시양태에서, 아나카르디움 추출물 중 주요 활성 성분은 카테킨, 에피카테킨 또는 이들의 조합을 함유하는 플라반을 포함하며, 여기서 추출물은 종피로부터의 이들 활성 성분에 대해 강화된다.

하나의 실시양태에서, 식물 추출물은 치료 유효량, 예컨대 약 500.0 mg/kg 이상, 바람직하게는 약 500.0 mg/kg 내지 약 2000.0 mg/kg, 보다 바람직하게는 약 1000.0 mg/kg 내지 약 2000.0 mg/kg의 양으로 조성물에 존재한다. 조성물은, 예를 들어, 인간 등가 투약에 대해 1일에 식물 추출물 약 500.00 mg/kg 내지 약 2000.0 mg/kg의 투약량으로 투여될 수 있다. 조성물은 단일 용량 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 한 예에서, 화합물은 1일에 최대 3회 용량으로 투여된다. 예를 들어, 화합물은 식사 전에, 식사 동안 또는 식사 후에 투여될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 조성물은 캐슈 종피 추출물을 치료 유효량으로 함유하는 항염증 특성을 갖는 식이 보충제이다.

투약량은 일부 개체 및/또는 일부 식료품에 효과적일 수 있는 단일 단위에서의 억제 효과의 수준을 제공하는 한편, 또한 다른 개체 및/또는 다른 식료품에 효과적일 수 있는 다른 억제 효과의 수준을 제공하기 위한 상대적으로 간단한 투약량 증가를 가능하게 하도록 선택될 수 있다.

억제 조성물은 경구 섭취에 적합화된 형태로 존재할 수 있다. 이와 같은 형태는 식물 추출물의 명시된 용량을 제공하도록 의도된 단일 투약량 형태로서 구성될 수 있다. 예를 들어, 단일 투약량 형태는 분말, 환제, 정제, 캡슐 또는 드링크 샷일 수 있다. 단일 투약량 형태는, 예를 들어, 인간 등가 투약에 대해 약 500.0 mg/kg 내지 약 2000.0 mg/kg의 식물 추출물을 포함할 수 있다.

실시예

실시예 - 재료 및 화학적 프로파일링

실시예 1 - 캐슈 종피 원료 (사전-추출) 중 총 카테킨 (플라바놀) 및 폴리페놀 정량화

HPLC에 의해 플라바놀의 정량화를 수행하고, 결과를 하기 표 1에 나타내었다 -

중량 백분율로서, 캐슈 종피 원료 중 총 카테킨 함량은 원료의 총 중량을 기준으로 하여 7.000%였다.

총 폴리페놀 (안토시아닌, 플라바놀, 히드록시신남산 및 가용성 프로안토시아니딘)은 폴린-시오칼튜(Folin-Ciocalteu)의 방법에 의해 정량화될 수 있다. 일반적으로 갈산이 선택의 참조 표준으로서 인식되어 있으며, 이에 따라 총 폴리페놀 결과는 갈산 당량으로서 기록하였다.

갈산의 원액 (1 mg/mL)을 연속 희석하여, 총 폴리페놀의 평가를 위한 표준 곡선을 생성시키는데 사용하였다. 샘플 캐슈 종피 및 갈산 표준을 희석된 폴린 시약 (물 중 7%)과 함께 단독으로 96 웰 플레이트에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 이어서 200 g/L의 Na₂CO₃을 첨가하였다. 진탕 후, 96 웰 플레이트를 40℃에서 20분 동안 인큐베이션한 다음, 755 nm에서 분광광도측정법에 의해 분석하였다.

총 폴리페놀의 정량화는 UV-Vis 분광법에 의해 755 nm 파장에서 수행하였다. 폴린-시오칼튜의 방법에 의한 총 폴리페놀의 정량화는 갈산 당량 (mg/g)으로 나타내었을 때 1420 mg/g의 총 폴리페놀로 귀결되었다. 중량 백분율로서, 캐슈 종피 원료 중 총 폴리페놀 함량은 원료의 총 중량을 기준으로 하여 대략 25.000%였다.

실시예 2 - 캐슈 종피로부터의 70% 에탄올 추출물의 제조

건조된 캐슈 종피 분말 (아나카르디움 옥시덴탈레 엘.) (60 g)을 3개의 100 ml 스테인리스강 튜브에 로딩하고, 써모 사이언티픽(Thermo Scientific)™ 디오넥스(Dionex)™ ASE 350 가속 용매 추출기로 80℃의 온도 및 1500 psi의 압력에서 DI수 중 70% 에탄올의 용매를 사용하여 2회 추출하였다. 추출물 용액을 여과하고, 수집하였다. 조합된 에탄올 추출물 용액을 진공 하에서 회전 증발기로 증발시켜 조질 캐슈 종피 추출물을 수득하였다.

추출 결과는 하기 표 2에 제공되어 있다 -

표 2 - 캐슈 종피의 추출

실시예 3 - 캐슈 종피 추출물 중 카테킨 정량화

포토다이오드 어레이 검출기가 구비된 히타치(Hitachi) 고성능 액체 크로마토그래프 ('HPLC/PDA')와 함께 C18 역상 칼럼 (루나(Luna)^® 5 μm C18(2) 100 Å LC 칼럼 250 x 4.6 mm, 미국 캘리포니아주 토란스 소재 페노메넥스(Phenomenex)^®로부터 입수가능)을 사용하여 캐슈 종피 추출물에 존재하는 유리 카테킨을 결정하였다. 이동상 A의 경우, 용매는 물 중 0.10% 인산 ('H₃PO₄')이었으며, 이동상 B의 경우, 용매 B는 아세토니트릴 ('ACN')이었는데, 이들을 275 nm에서의 UV 흡광도 및 35℃의 칼럼 온도로 1.0 ml/분의 유량에서 용리에 사용하였다. 사용된 카테킨 참조 표준은 시그마-알드리치 캄파니(Sigma-Aldrich Co.)의 것이었다. 참조 표준은 0.5 mg/ml 농도의 카테킨 (C1251) 및 0.1 mg/ml의 에피카테킨 (E1753)을 사용하여 메탄올 ('MeOH') : 0.1% H₃PO₄ (1:1 비) 중에 용해시켰다. 부피측정 플라스크에서 0.1% H₃PO₄ 중 50% MeOH 중에 2 mg/ml로 시험 샘플을 제조하고, 용해될 때까지 (대략 10분) 초음파처리한 다음, 실온으로 냉각시키고, 잘 혼합한 후, 0.45 μm 나일론 시린지 필터를 통해 여과하였다. 20 μl 샘플을 HPLC에 주입하는 것에 의해 HPLC 분석을 수행하였다. 하기 표 2는 HPLC 분석 방법의 구배 표를 제공한다 -

표 2 - HPLC 분석 방법의 구배 표

캐슈 종피 추출물에서의 HPLC 카테킨 정량화 결과는 추출물의 총 중량을 기준으로 하여 15.52 중량%의 총 카테킨 함량에 대해 9.40%의 카테킨 함량 및 6.12%의 에피카테킨 함량을 제공하였다. 따라서, 캐슈 종피 추출물은 추출물의 총 중량을 기준으로 하여 약 15.00 중량% 이상의 총 카테킨 함량으로 표준화될 수 있다. 275 nm 파장에서의 캐슈 종피 추출물의 HPLC 크로마토그램은 도 3에 제공되어 있다. 상기 실시예 1에 제시된 바와 같이, 미가공 캐슈 종피 추출물의 총 카테킨 함량은 원료의 총 중량을 기준으로 하여 단지 약 7.00 중량%였다. 이에 따라, 본 발명에 따른 캐슈 종피 추출물은 1종 이상의 플라반, 특히 총 카테킨에 대해 강화된다. 또 다른 측면에서, 캐슈 종피 추출물은 카테킨 및 에피카테킨에 대해 강화된다.

캐슈 종피 추출물 중 총 폴리페놀은 추출물의 총 중량을 기준으로 하여 약 55.00 중량%였다. 따라서, 본 발명에 따른 캐슈 종피 추출물은 총 폴리페놀에 대해 강화된다.

실시예 4 - 캐슈 종피 추출물의 화학 프로파일링

초고압 액체 크로마토그래피 ('HPLC') 및 질량 분광계 (둘 다 미국 매사추세츠주 밀포드 소재 워터 코포레이션(Water Corporation)으로부터 입수가능한 액퀴티(ACQUITY)^® UPLC I-클래스 및 제보(XEVO)^® GS-XT-QTof 시스템)를 사용하여 캐슈 종피 추출물에 존재하는 플라보노이드 화합물을 결정하였다. 사용된 칼럼은 40℃의 칼럼 온도 및 15℃의 샘플 온도를 사용하는 액퀴티^® UPLC HSS T3 2.1x100 mm, 1.8 μm이었다. 이동상의 경우, 용매 A는 물 중 (0.1% 포름산) 10% 아세토니트릴 ('ACN')이었으며, 용매 B는 ACN이었다. 획득 범위는 100-1500 달톤 ('Da')이었으며, 획득 양식은 전기분무 이온화 ('ESI') (-)였다. 하기 표 3은 HPLC 조건을 제공한다 -

표 3 - 캐슈 종피 추출물을 분석하기 위한 HPLC 조건

피크 식별은 정확한 질량만을 기반으로 하였다. 플라반-3-올 디갈로일 카테킨, 카테킨 및 에피카테킨이 캐슈 종피 추출물의 주요 구성요소로서 식별되었는데, 하기의 일반적인 구조를 가졌다 -

A- 및 B-유형 프로시아니딘, 프로시아니딘 사량체 및 프로시아니딘 삼량체를 포함한 프로시아니딘 플라보노이드 역시 추출물에서 검출되었는데, B-유형 프로시아니딘이 프로시아니딘의 주요 구성요소였다.

상기 언급된 것들 이외에, 식별된 화합물에는 특히 박시헤인 A, 6"-p-쿠마로일프루닌 및 두날리아노시드 B가 포함되었다. 분석으로부터 수득된 캐슈 종피 추출물의 LC/MS 및 LC/PDA 크로마토그램은 도 4에 예시되어 있다.

실시예 5-7 - 시험관내 생물검정

식품-등급 에탄올을 사용하여 캐슈 종피의 추출물을 제조한 다음, 상기 기술된 바와 같이 여과하고, 건조시켰다. 나머지 검정 조제물에는 연구 등급 시약을 사용하였다. 추출물을 50 mg/mL의 최종 농도로 디메틸 술폭시드 ('DMSO') 중에 용해시킨 다음, 각 생물검정에 적절한 완충제 중에 작업 농도로 희석하였다.

실시예 5 - COX-1 및 COX-2 억제

바이오비전(BioVision) (미국 캘리포니아주 밀피타스 소재)의 시클로옥시제나제-1 ('COX-1') 억제제 스크리닝 키트 (카탈로그 # K548)를 사용하여 COX-1 억제에 대해 캐슈 종피 추출물을 시험하였다. 이러한 스크리닝 키트는 시간 경과에 따라 COX 효소에 의해 생성되는 산물인 유기 퍼옥시드 프로스타글란딘 G2의 생산을 측정한다. 5% DMSO의 최종 농도로 COX 검정 완충제를 갖는 DMSO 중에 추출물을 작업 농도로 용해시켰다. SC-560 COX-1 억제제를 양성 대조군으로서 사용하였다. COX-1 효소를 멸균수 중에 재구성하고, -80℃에서 저장하였다. COX 보조인자 및 아라키돈산 용액을 사용 직전에 희석하였다. COX 프로브, COX 보조인자 및 COX-1 효소 용액을 시험 샘플 및 대조군에 첨가한 후, 아라키돈산 용액을 빠르게 첨가하여 반응을 개시하였다. 하기 파장으로 10분 동안 매분 형광을 측정하였다: 여기- 535 nm, 방출 590 nm. 곡선의 선형 부분의 기울기 (도 5)를 추론하고, 비억제된 대조군의 퍼센트 억제를 계산하였다. 도 5를 참조하면, 캐슈 종피 추출물의 농도에 따라 다양한 COX-1 억제 정도가 관찰되었다. 32 μg/mL의 IC₅₀을 동반하여, 캐슈 종피 추출물 COX-1 억제는 약 4 μg/mL 내지 적어도 약 2000 μg/mL, 보다 특히 약 15 μg/mL 내지 약 250 μg/mL인 것으로 관찰되었다.

바이오비전 (미국 캘리포니아주 밀피타스 소재)의 시클로옥시제나제-2 ('COX-2') 억제제 스크리닝 키트 (카탈로그 # K547)를 사용하여 COX-2 억제에 대해 캐슈 종피 추출물을 시험하였다. 이러한 스크리닝 키트는 시간 경과에 따라 COX 효소에 의해 생성되는 산물인 유기 퍼옥시드 프로스타글란딘 G2의 생산을 측정한다. 10% DMSO의 최종 농도로 COX 검정 완충제를 포함하는 DMSO 중에 추출물을 작업 농도로 용해시켰다. 셀레콕시브 비스테로이드성 항염증 약물 ('NSAID')를 양성 대조군으로서 사용하였다. COX-2 효소를 멸균수 중에 재구성하고, -80℃에서 저장하였다. COX 보조인자 및 아라키돈산 용액을 사용 직전에 희석하였다. COX 프로브, COX 보조인자 및 COX-1 효소 용액을 시험 샘플 및 대조군에 첨가한 후, 아라키돈산 용액을 빠르게 첨가하여 반응을 개시하였다. 하기 파장으로 10분 동안 매분 형광을 측정하였다: 여기- 535 nm, 방출 590 nm. 곡선의 선형 부분의 기울기 (도 6)를 추론하고, 비억제된 대조군의 퍼센트 억제를 계산하였다. 도 6을 참조하면, 캐슈 종피 추출물의 농도에 따라 다양한 COX-2 억제 정도가 관찰되었다. 86 μg/mL의 IC₅₀을 동반하여, 캐슈 종피 추출물 COX-2 억제는 약 4 μg/mL 내지 적어도 약 2000 μg/mL, 보다 특히 약 30 μg/mL 내지 약 250 μg/mL인 것으로 관찰되었다. 따라서, 본원에서 제시된 결과로 볼 때, 캐슈 종피 추출물은 COX-1 및 COX-2의 활성 또는 방출을 호전시키는데 있어서 합리적인 활성을 가질 수 있음으로써, COX-1 및 COX-2에 의해 매개되는 염증성 질환에서의 그의 용도를 시사하였다.

실시예 6 - 5-LOX 억제

리폭시제나제 억제제 스크리닝 검정 키트 (미국 미시간주 앤 아버 소재 카이만 케미칼(Cayman Chemical)로부터 입수가능) 및 감자 5-리폭시제나제 효소 (카이만 케미칼로부터 입수가능)를 사용하여, 5-LOX 억제에 대하여 캐슈 종피 추출물을 시험하였다. 이와 같은 키트는 리폭시겐화 반응에서 생산되는 히드로퍼옥시드를 측정한다.

추출물을 최종 작업 농도로 메탄올 중에 용해시켰다. 5-LOX 효소, 크로마겐(Chromagen) 및 리놀레산 용액을 사용 직전에 제조하였다. 노르디히드로구아이아레트산 ('NDGA')을 양성 대조군으로서 사용하였다. 5-LOX 효소를 시험 샘플 및 대조군에 첨가하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션함으로써 효소/억제제 상호작용을 가능하게 하였다. 리놀레산 기질을 플레이트에 첨가하여 반응을 개시한 다음, 실온에서 10분 동안 플레이트를 진탕하였다. 크로마겐을 첨가하여 반응 동안 형성되는 히드로퍼옥시드를 가시화하고, 플레이트를 또 다시 5분 동안 실온에서 진탕하였다. 다음에, 492 nm에서 흡광도를 판독하였다. 비억제된 대조군 웰과 비교하여 추출물 농도의 퍼센트 억제를 계산하였다.

10가지 상이한 농도 (0.7, 1.5, 3.0, 6.0, 11.9, 15.6, 31.2, 62.5, 125.0 및 250.0 μg/mL)에서 캐슈 종피 추출물을 그의 5-LOX 억제 활성에 대하여 시험하였다. 100% 5-LOX 효소 억제를 나타내는 100 μM에서 NDGA를 양성 대조군으로서 사용하였다. 도 7을 참조하면, 캐슈 종피 추출물에 대하여 관찰된 55 μg/mL의 IC₅₀을 동반하여, 캐슈 종피 추출물 5-LOX 억제는 약 32 μg/mL 내지 적어도 약 250 μg/mL, 보다 특히 약 32 μg/mL 내지 약 125 μg/mL인 것으로 관찰되었다. 따라서, 본원에서 제시된 결과로 볼 때, 캐슈 종피 추출물은 5-LOX의 활성 또는 방출을 호전시키는데 있어서 합리적인 활성을 가질 수 있음으로써, 5-LOX에 의해 매개되는 염증성 질환에서의 그의 용도를 시사하였다.

실시예 7 - HMGB1 억제

HMGB1 실험 절차 -

세포 배양. 10% 소 태아 혈청 (미국 조지아주 로렌스빌 소재 아틀란타 바이올로지칼스(Atlanta Biologicals))이 보충된 둘베코 변형 이글 배지 ('DMEM') (미국 버지니아주 마나사스 소재 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)의 (DMEM) (ATCC^® 30-2002™)) 중에서 뮤린 대식세포-유사 세포 (미국 버지니아주 마나사스 소재 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)로부터 RAW 264.7 (ATCC^® TIB-71™)로서 입수가능)를 배양하였다. 상기 세포를 정상산소 조건 (5% CO₂ / 21% O₂)하에서 유지함으로써, 70-80% 전면생장률로 성장하도록 하면서, 2일마다 계대배양하였다.

추출물 / 약물 제조. 캐슈 종피 추출물을 -20℃에서 분말 형태로 저장하였다. 추출물로 세포를 처리하기 전에, 원액 부피의 추출물을 디메틸 술폭시드 ('DMSO') (미국 오하이오주 솔론 소재 암레스코, 인크.(AMRESCO, Inc.)) 중 50 mg/mL의 최종 농도로 조정하고, -20℃에서 저장하였다. 추출물을 무혈청 옵티(Opti)-MEM™ I 배지 (미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재 깁코-BRL(Gibco-BRL) 중에 0.25 mg/mL의 최종 농도로 희석하고, 0.2 μm PES 시린지 필터 (미국 펜실베이니아 라드노르 소재 VWR)에 의해 여과 멸균하였다. 양성 대조군으로서 나트륨 살리실레이트 (미국 오하이로 솔론 소재 암레스코, 인크.)를 2-20 μM로 준비하였는데, 이는 대식세포로부터의 과잉산소-유도 HMGB1 방출을 감쇠시킬 수 있었다.

과잉 산소 노출. 95% O₂ / 5% CO₂로 플러싱되는 밀봉 가습 플렉시글라스(Plexiglas) 챔버 (미국 캘리포니아주 델 마르 소재 빌룹스-로텐버그(Billups-Rothenberg)) 내에서 37℃로 24시간 동안 과잉산소에의 뮤린 대식세포 RAW 264.7 세포의 노출을 달성하였다.

HMGB1 ELISA. 세포외 HMGB1의 수준을 결정하기 위해, RAW 264.7 세포를 6-웰 플레이트 내의 무혈청 옵티-MEM™ I 배지 (미국 메릴랜드주 게이터스 버그 소재 깁코-BRL) 중에서 배양하고, 24시간 동안 21% O₂ (실내 공기) 또는 캐슈 종피 추출물이 있거나 없는 95% O₂에의 노출 중 어느 하나로 유지하였다. 과잉산소 노출 후, ELISA (효소-연결 면역흡착 검정)에 의해 배양 배지 중 HMGB1의 수준을 측정하였다. 세포 배양 배지를 수집한 후, 4℃에서 5분 동안 500g로 펠렛화하였다. 다음에, 아미콘 울트라(Amicon Ultra)-4 원심분리 장치 (미국 매사추세츠주 벌링턴 소재 EMD 밀리포어(EMD Millipore))를 사용하여, 동일 부피의 세포 배양 상청액을 대략 6-배 농축시켰다. 농축 직후, 동일 부피의 세포 배양 상청액 농축물을 ELISA에 의한 HMGB1의 결정을 위하여 제조자의 지침에 따라 (미국 워싱턴주 레드몬드 소재 콘드렉스, 인크.(Chondrex, Inc.)) 96-웰 플레이트 상에 로딩하였다. 써모 멀티스캔(Thermo Multiscan) Ex 마이크로플레이트 판독기 (미국 매사추세츠주 월섬 소재 써모 사이언티픽)에서 450 nm (630 nm를 참조로 사용)로 광학 밀도 ('OD') 값을 판독하는 것에 의해 플레이트 흡광도를 결정하였다. 표준 곡선과의 비교에 의해 샘플 세포 배양 상청액에서 HMGB1 수준을 결정하고, 농축 계수를 적용하는 것에 의해 추가로 보정하였다.

통계 분석. 데이터는 1 내지 3회 개별 실험의 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로 제시하였다. 피셔의 최소 유의 차이 ('LSD') 사후 검정 분석 및 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 버전 6 소프트웨어 (미국 캘리포니아주 라 졸라 소재 그래프패드 소프트웨어(GraftPad Software))를 사용하는 일원 분산분석 (ANOVA)을 사용하여 데이터를 분석하였다. <0.05의 P-값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.

HMGB1 실험 결과 -

도 8을 참조하면, 과잉산소 ('O2')는 21% O₂ ('RA')를 사용하여 처리된 세포과 비교하여 HMGB1 수준에서의 유의한 증가를 초래한 것으로 볼 수 있다. 이러한 상승된 HMGB1 수준은 캐슈 종피 추출물 ('CT')을 사용한 처리로 인하여 정상 수준 (처리 없이 실내 공기 (RA)에 노출된 세포)에 더 가깝게 감소되었다. 양성 대조군인 나트륨 살리실레이트 ('SS')에서 유사한 감소가 관찰되었다. 처리 그룹 (SS 및 CT) 둘 다에서의 감소는 통계적으로 유의하였다. 따라서, 본원에서 제시된 결과로 볼 때, 캐슈 종피 추출물은 HMGB1의 활성 또는 방출을 호전시키는데 있어서 합리적인 활성을 가질 수 있음으로써, HMGB1에 의해 매개되는 염증성 질환에서의 그의 용도를 시사하였다.

상기 데이터는 아나카르디움 옥시덴탈레 엘.의 종피의 식물 추출물이 항염증 활성을 나타내는 1종 이상의 화합물을 갖는다는 것을 예시한다. 보다 구체적으로, 캐슈 종피 추출물은 COX-1, COX-2, 5-LOX 및/또는 HMGB1의 활성 또는 방출을 호전시키는데 있어서 합리적인 활성을 가질 수 있다.

실시예 8 - 콜라겐-유도 래트 발 관절염 유도에서의 아나카르디움 옥시덴탈레 엘. 추출물의 효능

래트에서의 콜라겐-유도 관절염 (CIA) 모델은 류마티스 관절염 (RA)의 가장 흔하게 연구되는 자가면역 모델로서, 몇 가지 병리학적 특색이 인간 RA에서의 면역 매개 다발관절염과 유사하다. 면역화와 질환 발현 사이의 그의 가장 짧은 기간은 모델을 치료 효능 평가용으로 더 실현가능하게 만든다. 소 비중격으로부터의 이종 유형 II 콜라겐 (CII) 접종 후, 그의 병태생리 동안, 래트는 항원에 대한 체액성 및 세포성 반응 둘 다를 탑재하게 된다. 이와 같은 민감화는 차후 숙주를 자기를 인식하는데 실패함으로써 관절 연골에 배타적으로 존재하는 그 자체의 유형 II 콜라겐을 공격하는 것으로 이끌게 된다. 유도 시, 래트는 염증성 통증 및 종창, 연골 분해, 윤활막 증식증, 판누스 형성, 단핵 세포 침윤, 변형 및 부동성을 겪게 된다. 따라서, 이와 같은 모델은 관절염과 연관된 징후 및 증상을 감소시키는데 있어서의 저, 중간 및 고 용량으로 경구 투여된 캐슈 종피 추출물의 효과성을 평가하는데 이상적이다.

연골은 관절 구조의 주요 구성요소로서, 조밀하고 고도로 조직화되어 있는 세포외 매트릭스 ('ECM') 중에 매립되어 있는 연골 세포로 구성된다. ECM은 연골세포에 의해 합성되며, 글리코사미노글리칸 ('GAG') 및 연관 프로테오글리칸과 함께 주로 유형 II 콜라겐을 함유하는 콜라겐성 네트워크로 구성된다. 정확한 병리학적 순서는 공지되어 있지 않지만, 관절의 모든 구조적 구성요소가 관절염의 발병기전에 수반된다. 아그레칸 파괴와 함께, 콜라겐의 분해가 관절염의 중심적인 특색이다. 종양 괴사 인자 ('TNF')-α 및 인터류킨 ('IL')-1β와 같은 염증유발성 시토카인은 아그레카나제 및 매트릭스 메탈로프로테이나제 (예컨대 MMP13) 생산의 자극으로 이어지는 이벤트의 캐스케이드를 통하여 관절 연골에서의 연골 매트릭스 분해에 중요한 역할을 하는 것으로 공지되어 있다. TNF-α가 염증 과정의 구동력으로 공지되어 있기는 하지만, IL-1β가 다른 염증유발성 시토카인 및 케모카인을 동원하는 것을 조정하는 것으로 여겨지고 있다. 이들은 함께 질환 과정을 증폭하고, 지속하며, 영속시킬 수 있다. 분해된 연골은 류마티스 관절염 ('RA') 및 골관절염 ('OA') 둘 다의 주요 임상 소견 중 하나이다. 특히, 유형 II 콜라겐의 소변 C-말단 텔로펩티드 ('μCTX-II')는 오래전부터 가장 많이 연구되어 왔으며, 빈번하게 진단, 질환 중증도 결정 또는 질환 진행 예측, 예후 및 치료 효능 모니터링의 목적으로 사용될 수 있는 연골 분해의 바이오마커로 지칭된다. 결과적으로, 이들 매개인자 중 어느 것의 저해는 OA/RA에서 치료 이점을 가질 수 있다. 관절염의 초기 병기에서는, 콜라겐 및 아그레칸과 같은 분해되는 세포외 매트릭스를 재건하고 보충하려는 연골세포에 의한 노력이 존재한다는 것도 주지되어야 한다. 이와 같은 동화 특성은 콜라겐 합성을 나타내는 PIIANP의 혈청 수준을 측정하는 것에 의해 평가될 수 있다.

래트에서의 콜라겐 유도 관절염 (CIA)을 발생시키고, 질환 유도 후 3주 동안 경구로 투여되는 캐슈 껍질 추출물의 효능을 평가하는데 이용하였다. 연구는 7개의 래트 그룹 (n=9 래트/그룹)을 포함하였다. 래트는 목적 사육 수컷 스프라그-돌리 래트 (7-8주령, 매사추세츠주 윌밍턴 소재 찰스 리버 래보러토리즈 인크.(Charles River Laboratories Inc.))였다. 2주 동안 동물을 순화시켜 요구 체중을 달성한 후, 무작위로 그의 각 그룹에 할당하였다. 폴리프로필렌 케이지에 래트 (3마리/케이지)를 수용하였으며, 그의 꼬리상의 숫자에 의해 개별적으로 식별하였다. 개별 케이지는 프로젝트 번호, 시험 항목, 용량 수준, 그룹 및 동물 번호를 표시하는 케이지 카드를 사용하여 식별하였다. 하를란 소프트 콥(Harlan Soft cob) 베딩 (인디애나주 인디애나폴리스 엔비고 7087 소재 엔비고 테크랜드(Envigo Tekland))을 사용하였으며, 적어도 2회/주 교체하였다. 신선한 물 및 설치류 사료 식이 (인디애나주 인디애나폴리스 엔비고 2018 소재 테크라드(Teklad))를 임의로 동물에게 제공하였으며, 연구 내내 12-시간 광-암 주기로 온도-조절 실내 (22.2℃)에 수용하였다.

연구 래트를 무작위화하여, 표 4에 주지되어 있는 바와 같은 7개 연구 항목 중 하나를 투여하였다 -

표 4

^* CMC = 카르복시메틸셀룰로스; MTX = 메토트렉세이트; CNT = 캐슈 종피 추출물; G = 글루코사민; C = 콘드로이틴. 문헌 [Nair, A.B. et al., J Basic Clin Pharm, "A simple practice guide for dose conversion between animals and human", Mar 2016, Vol. 7, No. 2, pp. 27-31]을 기반으로 한 투약.

상기 실시예 1에서 기술된 바와 같이 CIA 연구에 사용된 아나카르디움 옥시덴탈레 엘. 추출물을 제조하고 실시예 2에 따라 총 카테킨 함량에 대하여 정량화한 바, 추출물은 추출물의 총 중량을 기준으로 하여 18.4%의 총 카테킨 함량을 가졌다.

상기 표 4에 주지되어 있는 바와 같이, 그의 체중을 기준으로 각 그룹에 9마리의 래트씩 7개 치료 그룹으로 래트를 무작위화하였다. 치료 개시 당일에, 래트의 평균 체중은 189.7 ± 11.7 g이었다. 메토트렉세이트, 3가지 투약량의 캐슈 껍질 추출물, 그리고 글루코사민 및 콘드로이틴을 사용하여 3주 동안 매일 표 4에 따라 동물을 경구 치료하였다. 메토트렉세이트는 CIA 래트와 같은 자가면역 매개 관절염을 치료하는데 최적으로 사용되는 효과적인 면역저해제이다. 정상 대조군 래트 및 CIA 래트를 담체 비히클 (0.5% 카르복시메틸 셀룰로스) 단독으로 치료하였다.

유도 전 2주 동안, 새로 제조된 0.5% CMC 중에 현탁된 각 시험 재료를 사용하여 10 ml/kg/래트로 래트를 위관영양하였다. 시험 재료의 균질성을 유지하기 위하여, 경구 투여 전에 용액 중 샘플을 볼텍싱하였다. 기준선을 위한 프라이밍 시의 관절염 유도 전에, 발목 직경, 발 두께 및 통증 민감도 측정을 수행하였다.

유도에는, 소 비중격으로부터의 콜라겐 유형-II (미시간주 오웬스빌 소재 엘라스틴 프로덕츠 캄파니(Elastin Products Company)) 및 불완전 프로인트 아주반트 (미주리주 세인트루이스 소재 시그마(Sigma)의 'IFA')를 사용하였다. 모든 재료는 제조자에 의해 권장되는 바와 같은 적합한 온도로 유지하였다. 제조 시에는, 60 mg의 콜라겐을 칭량하여, 자석 교반기가 구비된 60 ml 크기 플라스크 중 사전-냉각된 15 ml 0.1 M 아세트산에 첨가함으로써, 4 mg/ml 농도를 산출하였다. 4℃에서 밤새 약하게 교반함으로써, 혼합물을 용해시켰다. 다음날 아침에, 동일 부피의 IFA (15 ml)를 사용하여 용해된 콜라겐을 에멀젼화함으로써, 2 mg/ml 콜라겐의 최종 농도를 달성하였다. 다음에, 26 g 바늘이 구비된 1 ml 시린지를 사용하여, 이소플루란을 사용하여 진정된 래트를 400 μl의 에멀젼화된 콜라겐에 의해 그의 꼬리 기저부 2개 부위에 피내로 프라이밍하였다. 용해된 혼합물은 얼음 버켓에서 유지하였으며, 균일한 농밀도를 보존하기 위하여 그룹 간 주사 시에 교반하였다.

유도-후에는, 프라이밍 후 그의 각 치료 재료를 모든 래트에 계속 투여하였다. 래트는 총 5주의 치료 (즉 유도 전 2주 및 유도 후 3주)를 투여받았다.

부스터 용량의 주사 전에, 관절염 지수에 대하여 래트를 평가하였다. 유도-전 치료에서 지시된 것과 동일한 준비 후, 100 μl/래트/부위로 동일 부피의 IFA를 사용하여 에멀젼화된 2 mg/ml 유형 II 콜라겐의 부스터 용량을 접종하였다. 7일차에, 항원 주사 전에 발 두께, 발목 직경 및 통증 민감도 측정을 수행하였다.

살아있는 동안, 관절염 중증도 지수, 발 두께, 발목 직경 및 통증 민감도를 모니터링하였다. 연구 종료 시에는 바이오마커 분석을 위하여 소변 및 혈청을 수집하였다. 프라이밍 후 모든 그룹에 대하여 22일차에 부검을 수행하였다. 부검 시에는, 조직병리학 분석을 위하여 각 래트로부터의 발목 관절을 수집하였다. 소변 연골 분해 마커 (CTX-II), 염증유발성 시토카인 (TNF-α, IL-1β 및 IL-6), 연골 합성 마커 (PIIANP) 및 매트릭스 분해 프로테아제 (MMP13)를 측정하였다.

모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 안내에 부합하는 학회 지침에 따라 수행하였으며, 동물 실험 윤리 위원회 (IACUC)에 의해 검토 및 승인되었다 (승인 번호 IA-P02-092619). 실험 설계는 도 9에 도시되어 있다.

관절염 중증도 지수, 발 두께, 발목 직경 및 통증 민감도 데이터와 같은 임상적 발견을 하기와 같이 편집하였다.

관절염 중증도 지수 . 연구 기간 동안, 래트는 느린 질환의 진행을 계속해서 나타내었다. 하기 데이터에서 볼 수 있는 바와 같이, 모든 치료 그룹을 사용하여 치료된 래트가 다양한 정도의 중증도 억제를 나타내었다. 특히, 100 mg/kg 및 200 mg/kg CNT를 사용하여 치료된 래트가 10일차부터 관절염 중증도의 통계적으로 유의한 저해를 나타내었으며, 연구 기간 동안 이와 같은 유의성이 계속되었다 (도 10, 표 5). 비히클 치료된 래트는 프라이밍 후 10일차에 관절염 증상을 나타낸 한편, 100 mg/kg 및 200 mg/kg CNT를 사용하여 치료된 래트는 프라이밍 후 13일차에 증상을 개시하였다 (즉 관절염 증상 발병의 72-시간 지연). 50 mg/kg CNT 및 150 mg/kg G + 120 mg/kg C 그룹은 프라이밍 후 11일차에 관절염 증상을 개시하였다. 비교하자면, 메토트렉세이트 그룹의 질환 발병은 프라이밍 후 14일차였다. 곡선하 면적을 예시하는 모든 도면에 있어서, 선형 사다리꼴 규칙을 사용하여 9-21일차 동안의 곡선하 면적을 계산하였다. % 억제 = {(치료의 평균 값 - CIA+의 평균 값) / (대조군의 평균 값 - CIA+의 평균 값)}*100.

표 5 - 비히클-치료된 CIA+와 비교한 관절염 중증도 지수에 대한 P-값

발 두께 . 중증도 점수와 일치하여, 100 mg/kg 및 200 mg/kg CNT 치료된 래트는 12일차부터 시작하여 발 종창에서의 통계적으로 유의한 감소를 나타내었으며, 연구 기간 동안 이와 같은 유의성을 유지하였다 (도 11, 표 6). 50 mg/kg CNT 그룹은 GC 그룹과 비교하여 발 두께에서의 통계적으로 유의하지는 않으나 더 우수한 감소를 나타내었다. 이러한 감소의 종창 곡선하 총 면적 (7일차 - 21일차)을 고려할 때, 래트는 각각 100 mg/k 및 200 mg/kg CNT 그룹에서 비히클 치료된 CIA 그룹과 비교하여 발 부종에서의 통계적으로 유의한 55.8% 및 68.7% 감소를 나타내었다 (도 12). 50 mg/kg CNT 및 GC를 사용하여 치료된 래트의 경우 각각 비히클 치료된 CIA과 비교하여 발 부종에서 0.15 및 0.36의 P-값을 동반한 36.6% 및 23.5%의 퍼센트 감소가 관찰되었다. 메토트렉세이트 그룹은 90.2% 감소를 나타내었다.

표 6 - 비히클-치료된 CIA+와 비교한 발 두께에 대한 P-값

발목 직경 . 100 mg/kg 및 200 mg/kg CNT를 사용하여 치료된 래트에서 유도 후 15일차까지 통계적으로 유의한, 유사한 발목 직경 감소 패턴이 관찰되었다 (도 13, 표 7). 그 이후로는, 200 mg/kg 그룹만이 나머지 연구 기간 동안 발목 직경에서의 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다. 100 mg/kg CNT 그룹의 경우, 17 및 21일차의 발목 직경에서의 감소는 통계적으로 유의하지 않았다. 50 mg/kg CNT를 사용하여 치료된 래트는 유도 후 13, 15 및 19일차에 발목 직경에서의 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다. 반면, GC 치료된 래트는 연구 과정에서 발목 직경에서의 유의한 감소를 겪지 않았다. 여기에서, 7 내지 21일차 동안의 곡선하 면적을 고려할 때, 캐슈 종피 추출물 중 200 mg/kg CNT 그룹만이 발목 폭에서의 통계적으로 유의한 감소 (즉 70.3%)를 나타내었다. 50 mg/kg CNT, 100 mg/kg CNT 및 GC 그룹의 경우, AUC에 대해 각각 발목 직경에서의 통계적으로 비-유의한 49.3%, 50.9% 및 36.2%의 감소가 관찰되었다. 메토트렉세이트 그룹은 89.1% 감소를 나타내었다 (도 14).

표 7 - 비히클 치료된 CIA+와 비교한 발목 직경에 대한 P-값

통증 민감도 . 프라이밍 당일, 부스트 당일, 12, 13, 15, 17, 19 및 21일차에, 전자 모니터에 장착된 랜달-셀리토(Randall-Selitto) 프로브를 사용하여 통증 민감도 척도로서의 압력에 대한 반응을 측정하였다. 좌측 및 우측 뒷다리 둘 다를 해당 일차에 모니터링하고, 그의 평균을 데이터 분석에 사용하였다. 비히클 치료된 CIA 래트로부터의 변화를 해당 일차의 통증 내성으로 기록하였다. 최고 통증 내성은 메토트렉세이트 (14.1-67.1% vs 비히클 치료된 CIA) 그룹의 래트에서 관찰되었으며, 200 mg/kg (13.5-43.8% vs 비히클 치료된 CIA) 및 100 mg/kg (11.8-25.8% vs 비히클 치료된 CIA)이 후속하였다 (도 15 및 16). 50 mg/kg CNT 및 GC 그룹의 래트는 모니터링된 모든 시점에 대해 통증 민감도에서의 유사한 감소를 나타내었다. 비히클 치료된 CIA 래트와 비교하였을 때, 모든 그룹의 12일차 기준 모든 시점에서 통계적으로 유의한 통증 억제가 관찰되었다 (표 8).

표 8 - 비히클 치료된 CIA+와 비교한 통증 내성에 대한 P-값

바이오마커 -

소변 CTX -II -

검정. 래트 소변 샘플을 1:3으로 희석하고, 하기와 같이 마이바이오소스(Mybiosource)의 래트 CTX-II ELISA 키트를 사용하여 CTX-II의 존재를 측정하였다. 희석된 소변을 CTX-II 항체로 코팅된 마이크로플레이트에 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 결합시켰다. 다음에, CTX-II에 대한 바이오틴-접합 항체를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 래트 소변으로부터의 CTX-II에 결합시켰다. 마이크로플레이트를 철저히 세척하여 비결합 소변 및 항체를 제거한 후, 특이적 검출을 위하여 바이오틴-접합 항체에 결합하도록 효소-접합 아비딘 항체를 첨가하였다. 상기 아비딘 항체를 37℃에서 1시간 동안 결합시켰다. 세척을 반복하고, 효소 기질을 첨가한 후, 37℃에서 30분 동안 플레이트를 발색시켰다. 중지 용액의 첨가 후, 450 nm에서 흡광도를 판독하고, 희석 계수를 곱하여, CTX-II 표준 곡선의 흡광도 판독치를 기준으로 CTX-II의 농도를 계산하였다.

정규화

크레아틴 - 크레아티닌 파라미터 검정 키트 (R&D 시스템즈(R&D Systems))를 사용하여 하기와 같이 CTX-II 양을 소변 중 크레아티닌의 양에 대하여 정규화하였다. 소변을 1:20 희석하고, 마이크로플레이트에서 알칼리성 피크레이트와 혼합한 후 (5 부의 0.13% 피크르산 : 1 부의 1 N NaOH), 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 492 nm에서 흡광도를 판독하고, 크레아티닌 표준 곡선의 흡광도 판독치를 기준으로 소변 중 크레아티닌 양을 계산하였다.

단백질 - 피어스(Pierce) BCA 단백질 검정 키트 (써모피셔 사이언티픽(ThermoFisher Scientific))를 사용하여 하기와 같이 CTX-II 양을 소변 중 총 단백질의 양에 대하여 정규화하였다. 소변을 1:20 희석하고, 마이크로플레이트에서 비신코닌산 (BCA) 시약과 혼합한 후, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 580 nm에서 흡광도를 판독하고, 소 혈청 알부민 표준 곡선의 흡광도 판독치를 기준으로 소변 중 단백질 농도를 계산하였다.

결과.

도 17-19에 예시된 바와 같이, 정상 대조군과 비교하여 비히클-치료된 CIA 래트에서 소변 CTX-II 수준에서의 통계적으로 유의한 증가 (미가공 데이터에서 3.5-배, 그리고 정규화된 단백질 및 크레아티닌에서 2-배)가 관찰됨으로써, 질환의 중증도를 확증하였다. 임상적 관찰 (관절염 중증도, 발 종창 및 발목 직경)과 일치하여, 캐슈 종피 추출물을 사용하여 치료된 래트는 연골 분해의 용량 상관 예방을 나타내었다. 매트릭스 파괴의 최고 억제는 고 용량 (200 mg/kg)의 캐슈 종피 추출물을 사용하여 치료된 래트에서 관찰되었으며, 중간-용량 (100 mg/kg)이 후속하였다. 실제로, 단백질 (53.4% 억제 vs 비히클; p = 0.04) 또는 크레아티닌 (33.0% 억제; p = 0.11)에 의해 값을 정규화하였을 때, 200 mg/kg 그룹의 래트에서 관찰되는 퍼센트 억제 값이 치료 그룹 중 어떠한 것보다 더 높았다. 미가공 데이터에서, 메토트렉세이트는 비히클 치료된 질환에 걸린 CIA 래트과 비교하여 연골의 유의한 분해를 억누르는 것으로 보였다 (최대 53.8% 보호; P=0.005). 비히클 치료된 CIA 래트에 대비하여 메토트렉세이트 그룹에서의 단백질 (22.9%, p=0.37) 및 크레아티닌 (27.2%; p = 0.22)을 사용하여 이들을 정규화하였을 때, 이들 값은 중간 정도였다. 100 mg/kg으로 투여된 캐슈 종피 추출물은 비치료된 CIA 래트과 비교하여 각각 미가공 데이터, 단백질 정규화된 것 및 크레아티닌 정규화된 것에서 23.2% (p=0.29), 33.0% (p=0.20) 및 21.3% (p=0.36) 연골 보호를 나타내었다. 50 mg/kg 캐슈 종피 추출물 및 GC 그룹의 래트는 최소한의 연골 보호를 나타내었다. 각각 미가공 데이터, 단백질 정규화된 및 크레아티닌 정규화된 CTX-II에서, 각각 50 mg/kg 캐슈 종피 추출물의 경우 17.8%, 19.0% 및 12.3%, 그리고 GC 치료 그룹의 경우 16.3%, 16.5% 및 17.9%의 감소가 관찰되었다.

시토카인 IL- 1β / IL-6 / TNF -α -

샘플 수집. 연구 완료 시, 각 동물에 대하여 심장 천자로부터의 혈액을 수집하였다. 혈액을 3000 rpm으로 15분 동안 회전시켰다. 각 래트로부터, 약 700-800 μl의 혈청을 단리하였다. 샘플 둘 다를 사용 시까지 -80℃로 유지하였다.

ELISA 검정. 래트 IL-1β/IL-6/TNF-α 퀀티카인(Quantikine) ELISA 키트 (미네소타주 미네아폴리스 소재 R&D 시스템즈)를 사용하여 하기와 같이 시토카인 IL-1β / IL-6 / TNF-α의 존재를 측정하였다. 비희석된 혈청을 폴리클로날 IL-1β/IL-6/TNF-α 항체로 코팅된 마이크로플레이트에 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 결합시켰다. 마이크로플레이트를 철저하게 세척하여 비결합 혈청을 제거한 다음, 폴리클로날 효소-접합 IL-1β/IL-6/TNF-α 항체를 첨가하고, 실온에서 2시간 동안 결합시켰다. 세척을 반복하고, 효소 기질을 첨가한 후, 실온에서 30분 동안 플레이트를 발색시켰다. 중지 용액의 첨가 후, 450 nm에서 흡광도를 판독하고, IL-1β/IL-6/TNF-α 표준 곡선의 흡광도 판독치를 기준으로 IL-1β / IL-6 / TNF-α의 농도를 계산하였다.

혈청 IL- 1β , IL-6 및 TNF -α에 대한 결과

IL-1β, TNF-α 및 IL-6와 같은 염증유발성 시토카인은 단독으로 또는 동시에 OA/RA 발병기전에서의 염증의 개시, 동원, 진행 및 영속화에 중요한 역할을 한다. 이들 시토카인의 수준을 감소시키는 작용제는 OA/RA와 연관되어 있는 증상을 감퇴시킬 수 있다.

도 21을 참조하면, 비히클 (0.5% CMC)을 사용하여 치료된 CIA 래트에서 혈청 IL-1β에서의 통계적으로 유의한 증가가 관찰되었다. 비히클을 사용하여 치료된 CIA 래트와 비교하여 IL-1β의 혈청 수준에서의 이와 같은 증가는 양성 대조군 메토트렉세이트 (86.4% 감소, p=0.01) 및 200 mg/kg CNT (53.1% 감소, p=0.01)에 의해 유의하게 감소되었다. 100 mg/kg CNT 치료된 그룹의 래트는 IL-1β의 혈청 수준에서의 통계적으로 비-유의한 38.3% 감소를 나타내었다. 50 mg/kg CNT 그룹의 래트에서는, 혈청 IL-1β 수준에서의 통계적으로 비-유의한 3.7% 증가가 존재하였다 (도 21).

유사하게, TNF-α의 혈청 수준은 캐슈 껍질 추출물의 결과로서 감소되었다 (도 22). 정상 대조군, 및 메토트렉세이트, 100 mg/kg CNT 및 GC를 사용하여 치료된 래트에 대해 TNF-α의 수준은 0 미만인 것으로 밝혀졌다. 비히클 치료된 CIA 래트와 비교하였을 때, 이들 수준은 통계적으로 유의하였다. 50 mg/kg 및 200 mg/kg CNT에 대한 퍼센트 감소가 비히클 치료된 CIA 래트와 비교하였을 때 각각 52.1% (p=0.14 vs 비히클을 사용하여 치료된 CIA 래트) 및 98.3% (p=0.07 vs 비히클을 사용하여 치료된 CIA 래트)인 것으로 밝혀지기는 하였지만, 이들은 개별 래트간의 변이로 인하여 통계적 유의성을 달성하는데 실패하였다.

캐슈 종피 추출물 치료는 래트 혈청 IL-6 수준에는 효과가 없어서, 발견된 모든 혈청 값이 블랭크 미만이었다. 그러나, IL-1β 및 TNFα 데이터는 관절염 지수, 발목 직경 및 발 두께와 같은 살아있는 동안의 연구 임상 측정에서 관찰되었던 것을 반영하였다.

유형 IIA 콜라겐 N- 프로펩티드 ( PIIANP )

PIIANP의 수준이 OA 및 RA를 가진 환자에서 감소하는 것은 유형 IIA 콜라겐 합성이 이들 질환에서 변경될 수 있다는 것을 시사하고 있다. 따라서, 이와 같은 바이오마커를 기준으로 한 유형 IIA 콜라겐 합성의 측정은 관절 질환을 가진 환자에서 캐슈 종피 추출물의 효능을 결정하는데 유용하다.

ELISA 검정. 래트 전구콜라겐 유형 IIA N-Prop (PIIANP) ELISA 키트 (캘리포니아주 샌디에고 소재 마이바이오소스)를 사용하여 하기와 같이 PIIANP의 존재를 측정하였다. 비희석된 혈청을 PIIANP 항체 뿐만 아니라 HRP-접합 PIIANP 항체로 코팅된 마이크로플레이트에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 결합시켰다. 마이크로플레이트를 철저하게 세척하고, 크로마겐 용액을 첨가한 후, 37℃에서 15분 동안 결합시켰다. 중지 용액의 첨가 후, 450 nm에서 흡광도를 판독하고, PIIANP 표준 곡선의 흡광도 판독치를 기준으로 PIIANP의 농도를 계산하였다.

혈청 PIIANP에 대한 결과

정상 대조군 래트는 혈청 PIIANP 수준에서의 53.0% 증가를 나타낸 한편, 비히클을 사용하여 치료된 CIA 래트에서는 대조군 그룹과 비교하여 혈청 PIIANP에서의 통계적으로 유의한 감소 (34.7% vs. 대조군)가 관찰되었으며 (p=0.0002), 이는 모델의 유도를 지시한다 (도 23 참조). 반면, 양성 대조군 메토트렉세이트를 사용하여 치료된 CIA 래트는 비히클 치료된 질환 모델과 비교하였을 때 혈청 PIIANP에서의 유의한 증가 (CIA+비히클 대비 41%, p=0.001)를 나타내었다. 캐슈 껍질 추출물 그룹의 래트는 비히클 치료된 CIA 그룹과 비교하여 혈청 PIIANP에서의 20.6% (50 mg/kg에서), 25.3% (100 mg/kg에서) 및 27.0% (200 mg/kg에서) 증가를 나타내었다. 중간-용량 (100 mg/kg) 및 고-용량 (200 mg/kg)에 대해 관찰된 증가는 비히클 치료된 CIA 래트와 비교하였을 때 통계적으로 유의하였다. 이러한 결과는 캐슈 껍질 추출물 치료된 래트가 치료에 반응하여 증가된 양의 콜라겐이 합성되었다는 것을 지시한다. 이는 상기 치료가 이와 같은 동물 모델의 특징인 콜라겐 분해 표현형의 반전에 기여하였다는 것을 나타낸다. 적어도 이와 같은 카테고리에서, GC 그룹은 비히클을 사용하여 치료된 CIA 래트와 비교하였을 때 PIIANP 그룹에서의 통계적으로 유의한 증가 (44.3%, p=0.001)를 나타내었으며, 이는 연골 재생 활성을 지시한다.

매트릭스 메탈로프로테이나제 13 ( MMP -13)

매트릭스 메탈로프로테이나제 13은 염증의 조절인자로서, 골관절염에서 관절 연골의 유형 II 콜라겐 분해에 중요한 역할을 하는 효소이다. 그것은 연골에서 프로테오글리칸, 유형 IV 및 유형 IX 콜라겐, 오스테오넥틴 및 페를레칸도 분해시킨다.

ELISA 검정. MMP-13 래트 매트릭스 메탈로프로테이나제 13 (MMP-13) ELISA 키트 (캘리포니아주 샌디에고 소재 마이바이오소스)를 사용하여 하기와 같이 비희석된 래트 혈청 중 MMP-13의 존재를 측정하였다. 비희석된 혈청을 MMP-13 항체로 코팅된 마이크로플레이트에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 후, 혈청 중 MMP-13이 플레이트에 결합된 바, 비결합 혈청을 흡인하였다. MMP-13에 대하여 특이적인 바이오틴-접합 항체를 웰에 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 결합시켰다. 플레이트를 철저하게 세척하고, 아비딘 접합된 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)를 플레이트에 첨가하였다. 37℃에서 1시간 후, 세척을 반복하고, 효소 기질을 플레이트에 첨가하였다. 37℃에서 20분 동안 발색시킨 후, 중지 용액을 첨가하고, 450 nm에서 흡광도를 판독하였다. MMP-13 표준 곡선의 흡광도 판독치를 기준으로 MMP13의 농도를 계산하였다.

혈청 MMP -13에 대한 결과

도 24를 참조하면, 혈청 MMP-13 농도는 모든 그룹에서 표준 곡선에 비해 더 낮은 것으로 밝혀진 것으로 볼 수 있다. 이에 따라, 결과는 미확정적이었다.

조직병리학

절차 및 평가. 부검 시, 발목 관절을 조심스럽게 절제 분리하여, 10% 완충 포르말린 중에 고정한 후, 추가의 조직병리학 분석을 위하여 네이션와이드 히스톨로지(Nationwide Histology) (미국 워싱턴주 베라데일 소재)로 보냈다. 다음에, 고정된 시편을 칼시-클리어 래피드(Calci-Clear Rapid)를 사용하여 하루 반 동안 탈석회화한 후, 파라핀 중에 매립하였다. 각 래트로부터 표준화된 5 μm 연속 절편을 수득한 후, 프로테오글리칸 함량의 평가를 가능하게 하기 위하여 헤마톡실린 및 에오신 (HE) 및 사프라닌 O-패스트 그린으로 염색하였다. 변형 만킨(Mankin) 시스템 (Mankin et al., 1981)을 사용하여, 질환 진행 및/또는 치료 효능의 지표로서 관절 구성요소의 구조적 및 세포 변경을 점수화하였다. 조직학적 분석은 네이션와이드 히스톨로지에서 공인된 병리학자에 의해 수행하였다.

결과. 조직병리학 데이터는 관절염의 중증도 점수와 연결되었다. 정상 대조군 래트와 비교하였을 때, 비히클 치료된 CIA 래트는 중증의 윤활막염, 현저한 연골 분해, 윤활막 증식증, 판누스 형성 및 골 침식을 나타내었다 (도 25 및 26). 비히클 치료된 CIA 래트는 정상 대조과 비교하여 연골 파괴, 골 침식, 염증 및 GAG 손실의 중증도에서의 각각 4.4-, 5-, 4.8- 및 4.4-배 증가를 나타내었다. 반면, 메토트렉세이트를 사용하여 치료된 래트는 비히클 치료된 CIA 래트와 비교하였을 때 상대적으로 더 낮은 연골 파괴 (비히클에 비해 50.7% 더 낮음), 골 침식 (비히클에 비해 71.2% 더 낮음), 염증 (비히클에 비해 55.8% 더 낮음) 및 GAG 손실 (비히클에 비해 50.7% 더 낮음)의 변경을 나타내었다. 유사하게, 캐슈 껍질 추출물을 사용하여 치료된 래트는 발목 관절의 조직병리학 판독치에 있어서 비히클 치료된 CIA 래트 대비 용량 상관 개선을 나타내었다. 특히, 200 mg/kg 캐슈 껍질 추출물을 사용하여 치료된 동물은 비히클 치료된 CIA 래트와 비교하였을 때 연골 파괴, 골 침식, 염증 및 GAG 손실의 중증도에서의 각각 54.5%, 59.8%, 50.5% 및 54.5% 감소를 나타내었다. 이러한 감소 중, 골 침식 및 염증 감퇴는 200 mg/kg 치료 그룹에 대해 비히클 치료된 CIA 래트와 비교하였을 때 통계적으로 유의하였다. 100 mg/kg 캐슈 껍질 추출물을 사용하여 치료된 CIA 래트에서는, 비히클 치료된 CIA 래트 대비 연골 파괴, 골 침식, 염증 및 GAG 손실에 있어서 각각 35.7%, 51.2%, 45.3% 및 35.7%와 같은 중간 정도의 감소가 관찰되었다. 골 침식 변화는 100 mg/kg 치료된 래트에 대해 비히클을 사용하여 치료된 CIA 래트 대비 통계적으로 유의하였다. 50 mg/kg 캐슈 껍질 추출물 또는 GC 그룹을 사용하여 치료된 동물은 조직병리학에서 평가된 모든 카테고리에서 매우 유사한 패턴을 나타내었으며, CIA와 연관되어 있는 증상을 감퇴시키는데 있어서 활성이 최소한이거나 없는 비히클 치료된 CIA 래트와 매우 비슷하였다.

콜라겐-유도 래트 발 관절염 유도에서의 아나카르디움 옥시덴탈레 엘. 추출물의 효능 요약 -

래트에서의 콜라겐 유도 관절염 (CIA)을 발생시키고, 질환 유도 후 3주 동안 경구로 투여된 캐슈 종피 추출물의 효능을 평가하는데 이용하였다. 연구 보고서는 그룹당 래트 9마리씩 7개의 래트 그룹을 포함하였다. 그룹 중 3개의 래트는 하기 3가지 상이한 투약량의 캐슈 종피 추출물을 사용하여 경구로 치료하였다 - 50 mg/kg의 저 용량, 100 mg/kg의 중간-용량 및 200 mg/kg의 고-용량. 캐슈 종피 추출물 그룹의 효과성을 3주 동안 매일 0.5 mg/kg으로 투약된 면역저해 약물 메토트렉세이트를 사용하여 치료된 그룹, 그리고 글루코사민 및 콘드로이틴 (150G+120C mg/kg)을 사용하여 치료된 그룹에 대비하여 비교하였다. 정상 대조군 래트 및 CIA 래트는 담체 비히클인 0.5% 카르복시메틸 셀룰로스만으로 치료하였다. 살아있는 기간 동안, 관절염 중증도 지수, 발 두께, 발목 직경 및 통증 민감도를 모니터링하였다. 연구 종료 시에는 바이오마커 분석을 위하여 소변 및 혈청을 수집하였다. 부검 시에는, 조직병리학 분석용으로 각 래트의 발목 관절을 수집하였다. 각 치료의 효능을 결정하기 위해 소변 연골 분해 마커 (CTX-II), 염증유발성 시토카인 (TNF-α, IL-1β 및 IL-6), 연골 합성 마커 (PIIANP) 및 매트릭스 분해 프로테아제 (MMP13)를 측정하였다.

질환 모델의 유도는 점진적으로 증가되는 관절염 중증도 지수에 의해, 그리고 이후 동반되는 소변 및 혈청 관절염 관련 바이오마커 뿐만 아니라 조직병리학적 발견에 의해 확증되었다. 래트는 치료에 대하여 다양한 반응 정도를 나타내었다. 캐슈 종피 추출물은 보다 높은 투약량에서 관절염의 증상을 감퇴시키는데 있어서 유의한 효과를 가지는 용량 상관성이며 측정가능한 효능을 나타내었다. 관절염 중증도, 발 두께, 발목 직경 및 통증 민감도의 전체적인 데이터를 비교하였을 때, 중간- 및 고 용량의 캐슈 껍질 추출물을 사용하여 치료된 CIA 래트는 관절염의 초회 징후에서의 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다. 이와 같은 연구에서, GC 및 50 mg/kg 캐슈 껍질 추출물 그룹의 래트는 최소한의 효능을 나타내었다.

바이오마커로부터의 데이터는 살아있는 동안의 관찰과 일치하였다. 200 mg/kg 캐슈 종피 추출물을 사용하여 치료된 CIA 래트에서는, 단백질을 사용하여 데이터를 정규화하였을 때 μCTX-II에서의 통계적으로 유의한 감소 (53.4% 억제 vs. 비히클; P = 0.04)가 관찰되었다. 유사하게, 캐슈 종피 추출물을 사용하여 치료된 래트에서는, 비히클 치료된 그룹과 비교하였을 때 혈청 IL-1 (200 mg/kg 껍질 종피 추출물, 53.1% 감소, P=0.01) 및 TNF-α (100 mg/kg 캐슈 종피 추출물) 수준에서의 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다. 저 용량의 캐슈 종피 추출물은 IL-1β 및 TNF-α를 저해하는데 있어서 감염성이었던 한편, GC 치료된 래트는 TNF-α에서의 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다. 캐슈 종피 추출물 (100 mg/kg 및 200 mg/kg) 및 GC 치료된 그룹은 비히클 치료된 그룹과 비교하였을 때 동화 마커의 증가에 대해 유의성 수준을 달성하였다.

게다가, 조직병리학 데이터는 관절염의 중증도 점수와 충분하게 연결되었다. 비히클-치료된 래트는 중증의 윤활막염, 현저한 연골 변성, 골 및 연골의 확산성 괴사, 윤활막 증식증, 판누스 형성, 골 침식 및 구조적인 구조의 손실을 겪은 한편, 캐슈 종피 추출물 및 메토트렉세이트를 사용하여 치료된 CIA 래트는 매트릭스 완전성의 상대적으로 중간 정도인 형태구조 변경 및 감소된 관절 골 손상을 나타내었다. 캐슈 종피 추출물 (200 mg/kg) 치료된 래트는 조직병리학 데이터의 변형 만킨 점수 분석에서 염증 및 골 침식에서의 통계적으로 유의한 감소를 나타내었다. GC 또는 50 mg/kg의 캐슈 종피 추출물을 사용하여 치료된 래트는 관절 구조 손상의 최소한의 현미경적 개선으로 이어졌다.

이에 따라, 살아있는 동안의 측정 (관절염 중증도, 발 두께, 발목 직경 및 통증 민감도), 소변 CTX-II, 혈청 IL-1β 및 TNF-α, 및 조직병리학 분석으로부터의 데이터로 볼 때, 100 mg/kg 또는 200 mg/kg으로 경구 투여된 캐슈 종피 추출물은 GC 치료된 그룹보다 유의하게 우월한 역할을 하였다. GC를 사용한 래트의 치료는 동화 (PIIANP) 마커 및 TNF-α에서의 통계적으로 유의한 변화를 산출하였다. 집합적인 데이터는 관절 구조 및 기능을 지지하기 위한 캐슈 종피 추출물의 잠재적인 사용을 지지하였다.

상기 상세한 설명은 본 발명의 몇 가지 방법 및 재료에 대해 개시하고 있다. 본 발명은 방법 및 재료에 있어서의 변형, 뿐만 아니라 제작 방법 및 장비에 있어서의 변경에 대하여 감수성이다. 본원에서 개시되는 본 발명의 이와 같은 개시내용 또는 실시를 고려하면, 그와 같은 변형이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 드러나게 될 것이다. 추가로, 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 결론적으로, 본원에서 개시되는 특정 실시양태로 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니며, 그 대신 이로써 첨부된 청구범위에서 구현되는 바와 같은 본 발명의 진정한 범주 및 취지 내에 속하는 모든 변형 및 대안을 포괄하고자 하는 것이다.

Claims

관절 강직 및 불편감의 감소 및/또는 연골 재건 또는 연골 재생 기능의 개선을 필요로 하는 포유동물에서 관절 강직 및 불편감을 감소시키고/거나 연골 재건 또는 연골 재생 기능을 개선시키기 위한 조성물로서, 아나카르디움 옥시덴탈레 엘(Anacardium occidentale L)의 종피의 식물 추출물의 치료 유효량을 포함하며, 여기서 식물 추출물은 총 카테킨 함량에 대해 강화된 것인 조성물.
제1항에 있어서, 조성물 중 식물 추출물의 치료 유효량이 인간 등가 투약을 기준으로 하여 적어도 약 500.0 mg/kg 이상의 양인 조성물.
제2항에 있어서, 조성물 중 식물 추출물의 치료 유효량이 인간 등가 투약을 기준으로 하여 약 500.0 mg/kg 내지 약 2000.0 mg/kg의 양인 조성물.
제3항에 있어서, 조성물 중 식물 추출물의 치료 유효량이 인간 등가 투약을 기준으로 하여 약 1000.0 mg/kg 내지 약 2000.0 mg/kg의 양인 조성물.
제1항에 있어서, 식물 추출물이 추출물의 총 중량을 기준으로 하여 적어도 약 15.00 중량%의 총 카테킨 함량으로 표준화된 것인 조성물.
제1항에 있어서, 조성물이 관절 강직 및 불편감을 가진 포유동물에서 시클로옥시제나제 및 5-리폭시제나제 매개 염증을 호전시키는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 식물 추출물이 총 폴리페놀 함량에 대해 추가로 강화된 것인 조성물.
제1항에 있어서, 제약상 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
제1항에 있어서, 조성물이 식이 보충제인 조성물.
아나카르디움 옥시덴탈레 엘의 종피의 식물 추출물을 포함하며, 여기서 식물 추출물은 총 카테킨 함량에 대해 강화된 것인 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 관절 강직 및 불편감의 감소를 필요로 하는 포유동물에서 관절 강직 및 불편감을 감소시키는 방법.
포유동물에서 관절 강직 및 불편감을 감소시키는 치료에 사용하기 위한, 아나카르디움 옥시덴탈레 엘의 종피의 식물 추출물을 포함하며, 여기서 식물 추출물은 총 카테킨 함량에 대해 강화된 것인 조성물.
제10항에 있어서, 식물 추출물이 추출물의 총 중량을 기준으로 하여 적어도 약 15.00 중량%의 총 카테킨 함량으로 표준화된 것인 방법.
제10항에 있어서, 식물 추출물이 총 폴리페놀 함량에 대해 추가로 강화된 것인 방법.
제10항에 있어서, 방법이 관절 강직 및 불편감을 가진 포유동물에서 시클로옥시제나제 및 5-리폭시제나제 매개 염증을 호전시키는 것인 방법.
아나카르디움 옥시덴탈레 엘의 종피의 식물 추출물을 포함하며, 여기서 식물 추출물은 총 카테킨 함량에 대해 강화된 것인 조성물의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 연골 재건 또는 재생 기능의 개선을 필요로 하는 포유동물에서 연골 재건 또는 재생 기능을 개선시키는 방법.
포유동물에서 연골 재건 또는 재생 기능을 개선시키는데 사용하기 위한, 아나카르디움 옥시덴탈레 엘의 종피의 식물 추출물을 포함하며, 여기서 식물 추출물은 총 카테킨 함량에 대해 강화된 것인 조성물.
제15항에 있어서, 식물 추출물이 추출물의 총 중량을 기준으로 하여 적어도 약 15.00 중량%의 총 카테킨 함량으로 표준화된 것인 방법.
제15항에 있어서, 식물 추출물이 총 폴리페놀 함량에 대해 추가로 강화된 것인 방법.
제15항에 있어서, 방법이 연골 재건 또는 재생 기능을 필요로 하는 포유동물에서 시클로옥시제나제 및 5-리폭시제나제 매개 염증을 호전시키는 것인 방법.
포유동물에서 관절 강직 및 불편감을 감소시키는 치료에 사용하고/거나 포유동물에서 연골 재건 또는 재생 기능을 개선시키는데 사용하기 위한, 아나카르디움 옥시덴탈레 엘의 종피의 식물 추출물을 포함하며, 여기서 식물 추출물은 총 카테킨 함량에 대해 강화된 것인 조성물.