JP2023524286A - 関節の健康のための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

骨構造、軟骨構造または両方を維持するため、骨の再吸収を最小限に抑えるため、軟骨分解を防止するため、骨密度を増加させるため、軟骨の完全性を保護することによって健康な関節を促進するため、骨の健康、軟骨の健康、または両方に影響を与える酵素の作用を減少させるため、関節の動きまたは機能を改善するため、関節の痛みを軽減するため、関節の不快感を軽減するため、関節の痛みおよび不快感を軽減するため、関節のこわばりを軽減するため、関節の可動域または柔軟性を改善するため、可動性を促進するためなどの組成物及び方法が提供され、組成物は、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌの種皮の治療有効量の植物抽出物を含み、植物抽出物は、全カテキン含有量について富化されている。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０２０年５月７日に出願された米国特許出願第６３／０２１，４０６号、及び２０２１年３月２６日に出願された米国特許出願第６３／１６６，４５８号に対する優先権を主張し、それらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。

発明の分野
本発明は、一般に、関節の炎症、関節痛、関節硬直、軟骨の劣化、又は可動性、可動域、可動性、関節の身体機能、又はそれらの任意の組合せを調節することができる植物抽出物又はその組成物に関する。本発明は、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、ホウ素のような他の関節管理剤（ビタミンＤ、ビタミンＫ、グルコサミン及び／又はコンドロイチン化合物、非ステロイド性抗炎症剤／鎮痛剤、ＣＯＸ／ＬＯＸ阻害剤、グルコサミン化合物、神経障害性疼痛緩和剤など）と組み合わせて使用することも可能である。

関節リウマチ（「ＲＡ」）は最も一般的な慢性自己免疫疾患の１つである。その初期段階は、慢性多系統疾患に進行する前に、滑膜関節の局所的な腫脹と硬直を伴う。関節リウマチの病理学的特徴は、滑膜組織の細胞密度の増加と膨張性乳房反応による関節損傷の両方である。ＲＡにおける主要な炎症カスケードには、全身性の過剰産生及びインターロイキン－６（「ＩＬ－６」）及び腫瘍壊死因子－α（「ＴＮＦ－α」）などの炎症誘導性サイトカインの発現が関与し、骨／関節合併症を促進する。ＲＡの滑膜炎は全身に広がり、サイトカイン放出の増加（ＩＬ－ＩＩβ、ＩＬ－６、ＩＬ－１８など）及びＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）などの急性反応性タンパク質（「ＡＲＰ」）の異常な高値によって発現する慢性炎症に静かに変化し、持続的な炎症及び関節損傷をもたらす。

従って、ＲＡの病理は複雑であり、ＲＡの根底にある病因は不明のままである。軟骨及び骨の破壊的変化、及び関節の可動性を制限する骨の増殖が起こる。関節炎は重度の障害を引き起こすことがあり、最終的には日常業務を遂行する能力に影響を及ぼし、生活の質を制限し、早死を引き起こす。関節炎では、体のどの部分にも炎症や痛みが生じる。これは最も一般的な炎症性疾患の１つであり、世界の成人人口の約０．５～１．０％に影響を及ぼし、女性は男性の３倍以上に罹患している。

現在利用可能な治療法は効率を改善したが、インドメタシンなどの非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、及びヒドロキシクロロキンなどの疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）；及びプレドニゾロンやメチルプレドニゾロンなどのコルチコステロイドの使用はいくつかの副作用と関連している。従って、筋骨格系障害の患者は、症状緩和のための別の方法を模索してきた。

アラキドン酸とその代謝産物は炎症の重要なメディエーターである。アラキドン酸（「ＡＡ」）は、その代謝産物の形成における律速段階が、ホスホリパーゼの活性化を介した細胞膜リン脂質プールからのその放出に依存する、膜リン脂質の成分である。ホスホリパーゼＡ２（「ＰＬＡ２」）活性は関節炎で増加し、ＴＮＦ－ａ及びＩＬ－１を含むサイトカインはＰＬＡ２の活性を刺激することが報告されている。放出後、ＡＡはシクロオキシゲナーゼ（「ＣＯＸ」）によって２つの経路のうちの１つによって代謝され、プロスタグランジン（「ＰＧＥ２」）、プロスタサイクリン、トロンボキサンなどのエイコサノイドを生成するか、又は５－リポキシゲナーゼ（「５－ＬＯＸ」）によって代謝され、ロイコトリエンとリポキシンを生成する。これらのエイコサノイドは、細胞内メッセンジャーとして作用し、疼痛及び炎症反応におけるシグナル伝達の調節において重要な役割を果たす。アラキドン酸代謝経路の例を図１に示す。

シクロオキシゲナーゼ：プロスタグランジン－エンドペルオキシドシンターゼとしても知られるプロスタグランジン－エンドペルオキシドシンターゼ（ＰＴＧＳ、ＥＣ１．１４．９９．１）－は、プロスタグランジン、プロスタサイクリン及びトロンボキサンを含むプロスタノイドと呼ばれる重要な生物学的メディエーターの形成に関与する酵素である。ＣＯＸはアラキドン酸からプロスタノイドへの生合成経路の中心的な酵素である。ＣＯＸ－１とＣＯＸ－２の２つのアイソザイムが知られている。ＣＯＸ－１は、胃粘膜の保護及び腎潅流の維持のような生理学的機能に関与するプロスタグランジンの産生に対する構成的イソホミ責任を表す。ＣＯＸ－２は、ほとんどの細胞で正常な条件下では発現しないが、炎症中に上昇する。ＣＯＸ－２は、炎症組織における優性アイソザイムであり、その誘導は、インターロイキン－１（「ＩＬ－１」）及び腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ－α」）を含むいくつかの炎症誘導性サイトカインによって促進され得る。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）によるＣＯＸの薬理学的阻害は、炎症や疼痛の症状を緩和することができる。

従って、望ましくない副作用を防止するために、ＣＯＸ－１によって形成されるプロスタグランジンによって制御される重要な生理学的プロセスに影響を与えることなく、その鎮痛及び抗炎症作用に対してＣＯＸ－２を選択的に阻害することが現実的であると思われる。しかし、ＣＯＸ－２が構成的アイソザイムとして腎血流量と糸球体濾過量の維持に相乗効果を示すことから、ＣＯＸ－２が選択的に阻害されると、いくつかの副作用が生じる可能性があるとの報告がある。これらの作用は、選択的ＣＯＸ－２阻害薬（例えば、セレオキシブ及びロフェコキシブ）が、変形性関節症及び関節リウマチにおける従来のＮＳＡＩＤと同等の有効性を示し、胃の忍容性が良好で、腎副作用においてＮＳＡＩＤと同等であった臨床試験の被験者によって経験された。従って、これらの酵素のいずれかの完全な選択的阻害とは対照的に、これらのアイソザイムの阻害を引き起こすのに十分であるが、不必要な有害な結果を回避するのに十分な程度の化合物を仮定し、有することは合理的である。

ＣＯＸ－２の発現増加、従って、その産物ＰＧＥ２の合成も、癌、心血管疾患、及び炎症の主要なプレイヤーであるＭＭＰ－９の誘導と強く関連することが見出された。従って、ＣＯＸ－２酵素の阻害は、ＭＭＰ－９の発現及び活性の調節をもたらし、これは、癌細胞の浸潤及び遊走を調節し、アテローム性動脈硬化症の進行を予防又は遅延し、プラークを安定化し、マクロファージプロテイナーゼ発現を調節し、慢性歯周炎及び歯肉炎を予防し、肝疾患のリモデリングを制御し得る。

アラキドン酸（「ＡＡ」）代謝経路の他の部分は５－リポキシゲナーゼ（「５－ＬＯＸ」）経路を介しており、ここでＬＴＡ４由来のロイコトリエン（ＬＴＢ４、Ｌ．ＴＣ４、ＬＴＤ４、及びＬＴＥ４）は最終生理活性代謝物である。リポキシゲナーゼ経路は関節リウマチ（「ＲＡ」）炎症過程において重要であり、ＲＡ患者からの滑液は多量のロイコトリエンを含むことが知られている。例えば、５－ＬＯＸは、ＲＡ及びＯＡ滑膜に存在し、５－ＬＯＸは、主に、内層及び下層のマクロファージ、好中球、及び肥満細胞に発現される。この経路のもう１つの構成要素であるＬＴＢ４は、５－ＬＯＸの下流産物であり、強力な炎症誘導性走化性物質であり、ＲＡにおける関節炎症の重要なメディエーターとして関与している。非活動性関節炎患者や健常者に比べて、ＲＡ患者の血清中のＬＴＢ４濃度が高い。Ｐｆｉｚｅｒの５－ＬＯＸ酵素－ＰＦ－４１９１８３４の特異的阻害剤は、ラットモデルにおいて関節炎関連疼痛及び炎症を減少させることが見出されているが、５－ＬＯＸモジュレーターに対する単一の治療法は不十分であるように思われる。

好ましくは、抗炎症産物は、アラキドン酸（「ＡＡ」）代謝の両方の主要代謝経路の阻害を包含し、広範囲の抗炎症活性を有する一方で、より良好な安全性プロファイルを有する。

サイトカインとして作用し、免疫細胞によって分泌される炎症のもう１つのメディエーターは、高移動度グループタンパク質１（「ＨＭＧ－１」）及び両性テリンとしても知られる高移動度グループボックス１タンパク質（「ＨＭＧＢ１」）である。ＨＭＧＢ１は、ヒトにおいてＨＭＧＢ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ヒストンと同様に、ＨＭＧＢ１は最も重要なクロマチンタンパク質の一つである。ＨＭＧＢ１は、３０ｋＤａの核及び細胞質タンパク質であり、免疫及び炎症の調節において複数の機能を有する自己由来免疫活性化因子である。

ＨＭＧＢ１は、炎症及び損傷時にマクロファージ、単球、及び樹状細胞などの先天性免疫細胞によって能動的に放出され得る。例えば、マクロファージ及び単球は、外因性細菌性エンドトキシン（例えば、リポ多糖、又はＬＰＳ）、又は腫瘍壊死因子（「ＴＮＲ－α」）、インターロイキン－１β（「ＩＬ－１β」）、及びインターフェロンγ（「ＩＦＮ－γ」）などの内因性炎症誘導性サイトカインによる刺激に応答して、時間及び用量依存的にＨＭＧＢ１を能動的に放出する。

ＨＭＧＢ１はまた、壊死又は損傷した細胞によって受動的に放出される可能性があり、隣接する免疫細胞に傷害を伝達することによって炎症反応を誘発することができ、自然免疫細胞が損傷に反応し、さらに炎症を誘発することを可能にする。ＨＭＧＢ１タンパク質は、進行グリコシル化最終産物（「ＲＡＧＥ」）及び／又はＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ－２／４）の受容体を介した細胞内シグナル伝達を誘導し、この受容体は、次に、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（「ＭＡＲＫ」）経路として種々のシグナル伝達経路を活性化し、続いて、炎症を媒介する活性化Ｂ細胞の核因子カッパー鎖エンハンサー（「ＮＦ－κＢ」）を活性化し、種々の白血球接着分子、炎症誘導性サイトカイン、及びケモカインの発現を導く。

ＨＭＧＢ１は炎症活性に重要な役割を果たし、広範囲の免疫応答に関与している。ＨＭＧＢｌは、樹状細胞（「ＤＣ」）の成熟と遊走、ならびにＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、及びマクロファージ炎症性タンパク質１（「ＭＩＲ－Ｇ」）のような炎症性サイトカインを誘導するこれらの細胞及び単球の活性化を誘導する。ＨＭＧＢｌはまた、単球、マクロファージ、好中球、及びＤＣに対する走化性因子としても働き、炎症を維持し、先天性免疫応答を誘導する。

ＨＭＧＢ１は、侵入病原体からではなく、損傷自己に由来する危険信号の主な例と考えられている。ＨＭＧＢ１は、先天性受容体の活性化を仲介し、サイトカインの放出を介して炎症反応の増幅をもたらし、それによってさらにＨＭＧＢ１の放出が誘導され、これらのメディエーターの誘導がさらに促進される。ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＦＮ－γなどの炎症誘導性サイトカインは炎症の初期段階を媒介することが知られているが、ＨＭＧＢ１は敗血症及び組織損傷の後期独裁因子と考えられている。

ＨＭＧＢ１を標的とすることは、敗血症、関節炎、癌、及び糖尿病を含む多くの疾患の病因において重要なメディエーターとして同定されているため、炎症性疾患における治療介入のための実用的アプローチである可能性がある。例えば、ＨＭＧＢ１のレベルは、（１）関節リウマチ患者の滑液、（２）生存した患者と比較して生存しなかった敗血症患者、（３）固形腫瘍の浸潤及び転移、（４）糖尿病及びその合併症において上昇することが明らかにされている。

結果として、多くの薬理学的薬剤が、ＨＭＧＢ１又はＨＭＧＢ１活性の放出を阻害する可能性について研究されている（図２参照）。これらには、ドングアイ又はダングギの水抽出物（「女性ニンジン」－Ａｎｇｅｌｉｃａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ）のような伝統的なハーブ薬が含まれる。緑茶（Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｓｅｎｓｅｓ）及びＤａｎｓｈｅｎ（Ｒｅｄ ｓａｇｅ又はＣｈｉｎｅｓｅ ｓａｇｅ）は、エンドトキシン誘導性ＨＭＧＢｌ放出を阻害し、実験的敗血症から動物を保護することがわかっている。科学的研究により、これらのハーブ抽出物は強力な抗炎症及び抗関節炎作用を有することが実証されている。多糖類、フェノール酸、フェニルプロパノイドエステル、トリテルペングリコシド、フタリド、フラボノイド、トリテルペノイドサポニン、ジテルペン及びトリテルペンを含む広範囲の植物化学物質が単離され、ハーブの生物学的影響の原因であることが実証されている。

植物医学はこれらの疾患の大部分の管理において重要な役割を果たし、植物は天然抗酸化剤の潜在的供給源である。紅茶、ハーブ、果物、野菜に含まれるポリフェノール化合物の摂取は、これらの疾患のリスクが低いことが研究によって示されている。その結果、抗炎症活性を示し、潜在的な治療剤として健康促進植物成分を示す植物に対する研究の関心が高まっている。薬用植物は、化学的抗酸化剤に代わる安全で、費用対効果が高く、生態学的な選択肢を提供することができる。抗酸化剤は、長期曝露で毒性を示す可能性がある。

カシューツリー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｄｄｅｎｔａｌｅ Ｌｉｎｎ）はもとはアマゾンからであり、その後インド、東アフリカなどに移植されて栽培されている。木は非常に特異なリンゴや果実を、腫れた果柄の形で生産する。この脚の端の外側では、カシューナッツは灰色の腎臓の形をした硬い殻の中で成長する。この殻は、軟らかい革のような外皮と、穀粒を取り囲む殻又は種皮と呼ばれる薄い硬い内皮とを有する。これら２つのスキンの間にはカシューナッツ殻液体を含む蜂の巣状構造がある。この液体は、とりわけアナカルジウム酸、カルダノール、及びカルドールを含む。アナカルジン酸はサリチル酸であり、カルダノール及びカルドールは置換フェノールである。

果実の種々の部分は、食用食物であることに加えて、カシューリンゴからの果汁は飲料に使用され、果実エキスは体重管理において利点を示した。カシューナッツ殻液は、摩擦ライニング、塗料、ラミネート樹脂、ゴム配合樹脂、カシューセメント、ポリウレタンベースのポリマー、界面活性剤、エポキシ樹脂、鋳物用化学品、化学中間体、殺虫剤、殺菌剤など、様々な産業及び農業用途のために抽出されている。カシュー種皮は日焼け材料に使用されている。

上述したように、抗炎症活性を有する有効で無毒の天然化合物が必要である。より具体的には、関節炎症、関節痛、関節硬直、軟骨劣化調節効果を有する、効果的で非毒性の天然化合物が必要とされている。本発明は、そのような解決策の１つを提供する。

簡単に説明すると、本開示は、関節の健康管理に有用な抽出物を含有する標準化された植物抽出物及び組成物、ならびに関節の健康を改善するための関連する方法に向けられている。

より具体的には、本明細書では、カテキンを含む植物抽出物組成物であり、ここで、抽出物は、抽出物の全重量に基づいて、約１５．０重量％以上の全カテキン含有量に標準化されている。植物抽出物組成物は、その抗炎症活性により促進された関節の健康を示し、少なくともＡｎａｃａｒｄｉｕｍ属からの抽出物を含む。好ましくは、植物抽出物は、少なくともＡｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌからの抽出物であり、より好ましくは、植物抽出物は、少なくともＡｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌの果実の種皮からの抽出物である。

１つの実施形態において、本発明は、抽出物の全重量に基づいて、約１５．０重量％以上の全カテキンを含むＡｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌ．の果実の種皮抽出物に向けられる。

さらなる実施形態において、本発明は、それを必要とする哺乳動物における関節の剛性及び不快感を減少させるための組成物を提供し、この組成物は、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌの種皮の治療有効量の植物抽出物を含み、ここで、植物抽出物は、全カテキン含有量に対して富化される。植物抽出物は、全ポリフェノールについてさらに富化することができる。

１つの実施形態において、それを必要とする哺乳動物における関節の剛性及び不快感を減少させるための組成物中の植物抽出物の治療有効量は、少なくとも約５００．０ｍｇ／ｋｇ又はそれ以上の量であり、ヒトの等価投与に基づくものであり得る。さらに別の実施形態では、組成物中の植物抽出物の治療有効量は、ヒト等価投与量に基づいて、約５００．０ｍｇ／ｋｇ～約２０００．０ｍｇ／ｋｇの量である。さらに別の実施形態では、組成物中の植物抽出物の治療有効量は、ヒト等価投与量に基づいて、約１０００．０ｍｇ／ｋｇ～約２０００．０ｍｇ／ｋｇの量である。

１つの実施形態において、それを必要とする哺乳動物における関節の剛性及び不快感を低減するための組成物中の植物抽出物は、抽出物の全重量に基づいて、少なくとも約１５．００重量％の全カテキン含有量に標準化される。

１つの実施形態において、それを必要とする哺乳動物における関節の剛性及び不快感を低減するための組成物は、関節の剛性及び不快感を有する哺乳動物におけるシクロオキシゲナーゼ及び５－リポキシゲナーゼ媒介性炎症を緩和する。

１つの実施形態において、それを必要とする哺乳動物における関節の剛性及び不快感を低減するための組成物は、薬学的担体をさらに含む。

それを必要とする哺乳類における関節の硬直及び二次苦痛を減少させるための組成物は、栄養補助食品であり得る。

別の態様において、本発明は、それを必要とする哺乳動物における軟骨再構築又は再生機能を改善するための組成物を提供し、ここで、植物抽出物は、全カテキン含有量に対して富化される、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌ Ｌの種皮の治療有効量の植物抽出物を含む。

それを必要とする哺乳動物における軟骨再構築又は再生機能を改善するための組成物中の植物抽出物の治療有効量は、ヒト等価投与量に基づいて、少なくとも約５００．０ｍｇ／ｋｇ以上であり得る。好ましくは、組成物中の植物抽出物の治療有効量は、ヒト等価投与量に基づいて、約５００．０ｍｇ／ｋｇ～約２０００．０ｍｇ／ｋｇの量である。より好ましくは、組成物中の植物抽出物の治療有効量は、ヒト等価投与量に基づいて、約１０００．０ｍｇ／ｋｇ～約２０００．０ｍｇ／ｋｇの量である。

さらなる実施形態において、軟骨再構築又は再生機能を改善するための組成物中の植物抽出物は、抽出物の全重量に基づいて、少なくとも約１５．００重量％の全カテキン含有量に標準化される。

１つの実施形態において、軟骨の再構築又は再生機能を必要とする哺乳動物における軟骨の再構築又は再生機能を改善するための組成物は、軟骨の再構築又は再生機能を必要とする哺乳動物におけるシクロオキシゲナーゼ及び５－リポキシゲナーゼ媒介性炎症を軽減する。

それを必要とする哺乳動物における軟骨再構築又は再生機能を改善するための組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。

さらに、それを必要とする哺乳動物における軟骨再構築又は再生機能を改善するための組成物は、栄養補助食品であり得る。

別の態様において、それを必要とする哺乳動物における関節の剛性及び不快感を減少させる方法は、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌの種皮の植物抽出物を含む組成物の治療有効量を投与することを含み、ここで植物抽出物は全カテキン含有量に対して富化される。

一態様では、それを必要とする哺乳動物における関節の剛性及び不快感を減少させる方法における植物抽出物は、抽出物の全重量に対して、少なくとも約１５．００重量％の全カテキン含有量に標準化される。植物抽出物は、全ポリフェノールについてさらに富化することができる。

１つの態様において、それを必要とする哺乳動物における関節の剛性及び不快感を低減する方法は、関節の剛性及び不快感を有する哺乳動物におけるシクロオキシゲナーゼ及び５－リポキシゲナーゼ媒介性炎症を緩和する。

別の実施形態では、それを必要とする哺乳動物における軟骨再構築又は再生機能を改善するための方法が、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌの種皮の植物抽出物を含む組成物の治療有効量を投与することを含み、ここで植物抽出物は全カテキン含有量に対して富化される、方法が提供される。植物抽出物はさらに全ポリフェノールについて富化される。

それを必要とする哺乳動物における軟骨再構築又は再生機能を改善する方法における植物抽出物は、抽出物の全重量に基づいて、少なくとも約１５．００重量％の全カテキン含有量に標準化することができる。

ある態様において、軟骨再構築又は再生機能を必要とする哺乳動物における軟骨再構築又は再生機能を改善する方法は、軟骨再構築又は再生機能を必要とする哺乳動物におけるシクロオキシゲナーゼ及び５－リポキシゲナーゼ媒介性炎症を緩和する。

Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌ Ｌ．の種皮の植物抽出物を含有する組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含むことができる。そのような組成物の非限定的な例には、食物性サプリメント及び局所組成物が含まれる。

図１Ａは、アラキコン酸代謝経路の一般的な例である。 図１Ｂは、アラキコン酸代謝経路の一般的な例である。 図２は、種々の部位におけるＨＭＧＢ１媒介性炎症誘導性応答の一般的な例である。 図３は、０分（開始）から２０分の保持時間にわたる２７５ｎｍ波長のカシュー種皮抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムである。 図４は、カシュー種皮抽出物のＬＣ／ＭＳ及びＬＣ／ＰＤＡ（２８０及び３５０ｎｍの波長）クロマトグラムである。 図５は、種々の濃度のカシュー種皮抽出物を用いたＣＯＸ－１阻害のパーセンテージを示すグラフである。 図６は、種々の濃度のカシュー種皮抽出物を用いたＣＯＸ－２阻害のパーセンテージを示すグラフである。 図７は、種々の濃度のカシュー種皮抽出物を用いた５－ＬＯＸ阻害のパーセンテージを示すグラフである。 図８は、室内雰囲気（２１％Ｏ_２）（「ＲＡ」）、カシュー種子抽出物を含まない９５％Ｏ_２（「Ｏ_２」）（カシュー種子抽出物なし）、ＤＭＳＯ（「ベヒクル」）、陽性対照サリチル酸ナトリウム（「Ｓ２μＭ」）及び９５％Ｏ_２（カシュー種子抽出物（「ＣＴ」）あり）におけるマクロファージ細胞培養上清中のＨＭＧＢ１（放出％）の検出を示す棒グラフである。 図９は、使用された軟骨誘導性関節炎（「ＣＩＡ」）実験デザインを示すプロセス図である。 図１０は、各試験群の９日目から２１日目までの関節炎重症度指数の変化を示すグラフである。 図１１は、各試験群の関節炎重症度スコア曲線下面積（「ＡＵＣ」）を示す棒グラフである。 図１２は、各試験群について、プライミングから２１日目までの足の厚さの変化を示すグラフである。 図１３は、ＣＩＡモデルにおける各試験群のラット足浮腫の曲線下面積を示す棒グラフであり、 図１４は、ＣＩＡモデルの各試験群について、プライミングから２１日目までの関節炎の重症度の尺度としてラットの足首直径の変化を示すグラフである。 図１５は、ＣＩＡモデルにおける各試験群のラット足首直径の曲線下面積を示す棒グラフである。 図１６は、ＣＩＡモデルにおけるプライミングから２１日目までの各試験群のラットの疼痛感受性反応を示すグラフである。 図１７は、ＣＩＡモデルの各研究グループについて、プライミングから２１日目までの疼痛感受性改善のパーセンテージとして測定された圧迫閾値の変化率を示す棒グラフである。 図１８は、正常化せずに尿中ＣＴＸ－ＩＩ生データを示す棒グラフである。 図１９は、全タンパク質に対して標準化された尿ＣＴＸ－ＩＩを示す棒グラフである。 図２０は、尿中クレアチニン濃度で標準化された尿ＣＴＸ－ＩＩを示す棒グラフである。 図２１は、モデル導入後３週間のＣＩＡモデルにおける各試験群の血清ＩＬ－１βを示す棒グラフである。 図２２は、モデル導入後３週間のＣＩＡモデルにおける各試験群の血清ＴＮＦ－αを示す棒グラフである。 図２３は、モデル導入後３週間のＣＩＡモデルにおける各試験群の血清ＰＩＩＡＮＰを示す棒グラフである。 図２４は、モデル導入後３週間のＣＩＡモデルにおける各試験群の血清ＭＭＰ－１３を示す棒グラフである。 （Ａ）軟骨破壊、及び（Ｂ）骨侵食に関する各試験群のＣＩＡラット足関節の組織病理学的所見を示す４つの棒グラフである。 （Ｃ）炎症、及び（Ｄ）マトリックス完全性／ＧＡＧ喪失に関する各試験群のＣＩＡラット足関節の組織病理学的所見を示す４つの棒グラフである。 図２６は、各試験群の足関節切片のヘマトキシリン・エオシン・サフラニンＯ－ｆａｓｔ ｇｒｅｅｎ染色である。

本発明は、カシュー（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌｉｎｎ）の種皮がある種のフラボノイドにおいて実質的に高いという驚くべき発見に基づいている。特に、カシュー種皮の抽出物は、プロシアニジンと同様に、主要成分としてカテキン及びエピカテキンを包含することが発見された。本明細書に記載されたデータは、カシュー種皮抽出物が抗炎症用途を有し得ることを示す。

本発明の他の態様は、骨構造、軟骨構造または両方を維持するため、骨の再吸収を最小限に抑えるため、軟骨の分解を防止するため、骨密度を増加させるため、軟骨の完全性を保護することにより健康な関節を促進するため、骨の健康、軟骨の健康、またはその両方に影響を与える酵素の作用を減少させるため、関節の動きまたは機能を改善するため、関節の痛みを緩和するため、関節の不快感を緩和するため、関節の痛みと不快感を緩和するため、関節のこわばりを緩和するため、関節の可動域または柔軟性を改善するため、可動性を促進するためなど、本開示の組成物を使用する方法に関する。

以下の説明では、本開示の様々な実施形態の完全な理解を提供するために、特定の詳細が記載される。しかしながら、当業者は、本発明がこれらの詳細なしに実施され得ることを理解するであろう。

本明細書では、特に断らない限り、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、又は整数範囲は、列挙された範囲内の任意の整数の値、及び、適宜、それらの分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むと理解されるべきである。また、特に断らない限り、ポリマーサブユニット、サイズ、又は厚さのような任意の物理的特徴に関して本明細書に記載される任意の数の範囲は、列挙された範囲内の任意の整数を含むと理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「約」及び「本質的に」は、他に指示されない限り、示された範囲、値又は構造の平均±２０％である。本明細書で使用される用語「１つ（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、列挙された成分の「１つ以上」を指す。代替案（例えば、「又は」）の使用は、選択肢の一方、両方又はそれらの任意の組合せを意味するものと理解されるべきである。文脈上別異の解釈を要する場合を除き、本明細書及び請求の範囲を通して、用語「含む」及びその変形、例えば、「含む（comprises）」及び「含んでいる（comprising）」、ならびに「含む（include）」の同義語の用語及びそれらの「有する」及び変形は、オープンで包括的な意味で、すなわち「含むが、これらに限定されない」として解釈されるべきである。

本明細書を通して、「一実施形態」又は「ある実施形態」というときは、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造又は特徴が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書中の様々な箇所における「一実施形態における」又は「ある実施形態における」という語句の外観は、必ずしもすべて同じ実施形態を参照するものではない。さらに、特定の特徴、構造、又は特徴は、１つ以上の実施形態において、任意の適切な方法で組み合わせることができる。

本出願では、「組成物」という用語は、自然状態、生物学的プロセス、または病気もしくは障害に関連する特定の状態を治療、改善、促進、増加、管理、制御、維持、最適化、修正、軽減、阻害、または防止する製品を指す。例えば、組成物は、対象における酸化の阻害及び／又は炎症などを改善する。「組成物」という用語は、限定されるものではないが、医薬品（即ち、ドラッグ）、市販薬、化粧品、食品、食品成分、又は有効量の抽出物、その少なくとも１つの成分、又はそれらの混合物を含む栄養補助組成物を含む。例示的な組成物には、クリーム、化粧ローション、パック又は粉末、又はエマルジョン、ローション、被覆フォーム、錠剤、プラスター、顆粒、又は軟膏が含まれる。組成物はまた、有効量の抽出物を注入した飲料、又は有効量の抽出物を含有する茶飽和飲料などの飲料を含むことができる。有効量の抽出物を含有する食品組成物の非限定的な例としては、焼成品、タンパク質粉末、肉製品、乳製品、及び菓子が挙げられる。

さらに、本明細書で使用される「医薬組成物」または「医薬組成物」は、本開示の植物抽出物の製剤、および生物学的に活性な抽出物を哺乳動物、例えばヒトに送達するために当技術分野で一般に認められている媒体を指す。例えば、本開示の医薬組成物は、独立した組成物として、または処方薬、店頭販売（ＯＴＣ）薬、植物薬、漢方薬、ホメオパシー剤、機能性食品、または政府機関によって審査および承認されたその他の形態のヘルスケア製品の成分として処方または使用され得る。本開示の例示的な栄養補助食品組成物は、スタンドアロン組成物として、または食品、新規食品、機能性食品、飲料、バー、食品フレーバー、食品添加物、医療食品、栄養補助食品、またはハーブ製品中の栄養成分または生物活性成分として処方または使用することができる。当技術分野において一般に受け入れられる培地は、そのための全ての薬学的又は栄養学的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む。

本明細書で使用される場合、「抽出物」または「植物抽出物」という用語は、少なくとも植物Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ属（例えば、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｈｕｍｉｌｅ、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｔｈｏｎｉａｎｕｍ、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｎａｎｕｍ、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｎｅｇｒｅｎｓｅ、及び／又はＡｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ）、好ましくはＡｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌのうちの物質の１つ以上の活性成分を含む、固体、粘性、または液体の物質または調製物を指す。好ましくは、活性成分は、カシューの種皮の抽出物に由来する。抽出物は、水、炭素数１～４の低級アルコール（例えば、メタノール、エタノール、ブタノールなど）、エチレン、アセトン、ヘキサン、エーテル、クロロホルム、酢酸エチル、酢酸ブチル、ジクロロメタン、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（「ＭＦ」）、ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）、１，３－ブチレングリコール、プロピレングリコール、及びそれらの組み合わせだけでなく、そのような溶媒中の粗抽出物の画分などの溶媒を用いて調製される。有効成分（複数可）の抽出及び保存が確実である限り、任意の抽出方法を用いることができる。

本明細書で使用される場合、「について富化された」とは、抽出又は他の調製物の前の植物材料又は他の供給源の重量に見出される１つ以上の活性化合物の量又は活性と比較して、１つ以上の活性成分の量又は活性の少なくとも２倍の増加を有する植物抽出物又は他の調製物を指し、特定の実施形態では、抽出又は他の調製物の前の植物材料又は他の供給源の重量は、乾燥重量、湿重量、又はそれらの組み合わせであってもよい。

本明細書で使用される場合、純粋な化合物、組成物、抽出物、抽出物混合物、抽出物の成分、及び／又は活性剤もしくは成分、又はそれらの組み合わせの用語「有効量」又は「治療有効量」は、所望の結果を達成するのに十分な投薬量及び期間において有効な量を指す。より具体的には、「有効量」又は「治療有効量」とは、ヒトなどの哺乳動物に投与した場合に、（１）哺乳動物における骨及び軟骨の喪失を治療又は予防すること；（２）骨及び軟骨の健康を促進すること；（３）哺乳動物における骨及び軟骨の喪失を抑制すること；（４）哺乳動物における骨密度を増加させること；（５）哺乳動物における骨粗鬆症を治療又は予防すること；（６）哺乳動物における骨及び軟骨の炎症を修飾すること；（７）骨及び軟骨の完全性を保護すること；及び（８）関節の剛性及び不快感を減少させることのいずれか１つ以上を含む治療を施すのに十分である本開示の抽出物又は組成物の量を指す。「治療有効量」を構成する本開示の化合物又は組成物の量は、主な活性成分の量、治療される状態及びその重症度、投与方法、治療期間、又は治療される対象の体重及び年齢に依存して変化するが、自身の知識及びこの開示を考慮して、当業者によって決定することができる。

用語「薬学的に許容される」とは、合理的な利益／リスク比に見合った、過度の毒性、不適合性、不安定性、刺激性などを伴わずに、ヒト及び下等動物の組織と接触して使用するのに適した、薬物、医薬、抽出物又は不活性成分を意味する。

「投与する（administer）」、「投与される」、「投与する（administers）」、および「投与すること」という用語は、静脈内、動脈内、経口、非経口、口腔、局所、経皮、直腸、筋肉内、皮下、骨内、経粘膜、または腹腔内投与経路を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている経路を介して対象に組成物を提供することとして定義される。好ましい実施形態において、組成物を投与する経口経路が適している。

本明細書で使用される場合、用語「対象」又は「個体」は、組成物が投与され得る哺乳動物を含む。「哺乳動物」の非限定的な例としては、ヒト、ヒト以外の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、げっ歯類（トランスジェニック及び非トランスジェニックマウスを含む）などが挙げられる。いくつかの実施形態において、対象はヒト以外の哺乳動物であり、いくつかの実施形態において、対象はヒトである。

本明細書で使用される場合、用語「担体」は、投与に適した形態で、１以上の植物抽出物を可溶性かつ均一な状態に維持するのを助け、非毒性であり、有害な様式で他の成分と相互作用しない組成物を指す。

本明細書で使用される「サプリメント」とは、自然状態又は生物学的プロセスに関連する特定の状態、構造または機能を改善、促進、支援、増加、調節、管理、制御、維持、最適化、修正、軽減、阻害、または防止する製品を指す（すなわち、疾患を診断、治療、緩和、治癒、または予防するために使用されない）。ある実施形態において、サプリメントは、栄養サプリメントである。例えば、骨と軟骨の健康に関連する状態に関しては、栄養補助食品を使用して、骨と軟骨の完全性を維持し、骨の再吸収を最小限に抑え、軟骨の劣化を最小限に抑え、骨と軟骨の完全性を保護することで健康な骨と軟骨を促進し、骨と軟骨の健康に影響を与え、骨粗鬆症の状態を改善し、骨の再構築をサポートし、痛みを緩和し、不快感を緩和し、こわばりを緩和し、可動域を改善し、柔軟性を改善し、可動性を促進するなどの酵素の作用を減少することができ、ある実施形態では、栄養サプリメントは、ダイエット、食品、またはその両方のカテゴリーであり、医薬品ではない。

特に断らない限り、本開示全体にわたって記載されている全ての割合及びパーセンテージは重量基準である。

特定の実施形態において、本開示の化合物および組成物（例えば、医薬品、栄養補助食品）は、骨の健康を促進し、骨の健康を改善し、骨の健康を維持し；骨障害を治療または管理し；骨の健康をサポートし；通常の快適な可動域および／または柔軟性をサポートし；可動域および／または柔軟性を改善し；骨を分解する有害な酵素の作用を減らし；骨吸収に影響を与える酵素の作用を変更し；正常な骨機能で動きを改善し；身体の可動性を向上させ；身体の可動性を管理および／または維持し；骨量減少による痛みおよび／またはこわばりを軽減し；身体機能を改善し；柔軟性と快適な動きを促進または強化し；健康な骨の機能と快適さを促進し；骨の不快感を和らげ；運動、作業、過度の運動、またはそれらの組み合わせによって引き起こされる骨の不快感を和らげ；軟骨の完全性を保護することにより、健康な骨を促進し；関節軟骨を維持し；関節軟骨をサポートし；軟骨の劣化を治療、予防、または管理し；軟骨の劣化を最小限に抑え；関節の潤滑のために滑液を維持することにより、関節の健康または快適さを促進し；関節の安定性と関節の柔軟性をサポートし；関節を活性化し、可動性を促進し；柔軟な関節と強い軟骨を促進し；関節への安定した血流を維持して、柔軟性および／または強度の向上をサポートし；運動、作業、過度の運動、またはそれらの組み合わせの後に、関節の快適さと幅広い可動域を促進するのに十分な量で投与され得；または本明細書に記載の他の関連適応症であり、一般に患者に対して許容可能な毒性を有するものを対象とする。

本発明は、抗炎症活性を示し、従って関節の健康を促進する植物抽出物を提供する。より具体的には、本発明は、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ属からのカシュー種皮の植物抽出物に関する。本明細書に示されるように、そのような植物抽出物は、関節の剛性及び不快感を減少させ、関節機能を改善することが見出されている。さらに、本発明による植物抽出物は、μＣＴＸ－ＩＩの還元及び関節構造の完全性の保護に基づく軟骨保護を提供する。本発明による植物抽出物は、改善された軟骨再構築又は再生を提供する。最後に、本発明による植物抽出物は、ＯＡの症状の改善、異化経路の抑制、関節構造の完全性の保護、及び軟骨の再構築又は再生機能の改善において、グルコサミン／コンドロイチンサプリメントよりも有効であると考えられる。

先に述べたように、本発明による有用な関節健康植物抽出物は、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ属からの植物抽出物を含む。より具体的には、抽出物は、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｈｕｍｉｌｅ、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｔｈｏｎｉａｍｉｍ、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｎａｎｕｍ、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｎｅｇｒｅｎｓｅ、及び／又はＡｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅの１種以上から選択される植物抽出物である。好ましくは、植物抽出物は、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌ．種からのものである。一実施形態では、植物抽出物は、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌ．種の種皮のものである。

本発明による合同健康組成物は、活性成分として機能し得る１以上の化合物を含んでもよい。化合物は植物抽出物の成分であり得る。例えば、化合物は、植物抽出物が得られる植物に存在する植物化学物質であり得る。化合物は、抗炎症活性を示すことに少なくとも部分的に関与し得る。該化合物は、関節の健康を促進することができる任意の化合物であり得る。一実施形態において、化合物は、フィトケミカルカテキン、エピカテキン、及び／又はプロシアニジン（例えば、Ａ、Ｂ、三量体、四量体）から選択される。

一般に、植物の１つ以上の部分は、根、茎、葉、花、果実、種子、及び種子の種皮を含むが、これらに限定されない植物抽出物を生産するために使用することができる。本発明では、少なくとも種子の種皮が、単独で又は他の植物部品と共に、植物抽出物を製造するために使用される。Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ植物由来の種皮は、種々の供給源から商業的に得ることができる。カシュー種皮の抽出物は、任意の適切な抽出技術を用いて得ることができる。

この点に関して、植物の１つ以上の部分、特に植物の種皮を収集し、粉砕することができる。その後、粉砕された物質は、適切な溶媒を用いて抽出することができる。溶媒は、濃縮段階で除去することができる。例えば、抽出された物質をスクリーニング又は濾過して、上清及びケーキを作製することができる。ケーキを押して液体のかなりの部分を除去することができ、これを上清に加えることができる。その後、ケーキを脱水し、繊維源として使用することができる。上清を蒸留して溶媒又はその一部を除去し、植物抽出液濃縮物を形成することができる。除去された溶媒は、再利用することができる。濃縮物を乾燥（例えば、スプレー乾燥）して、乾燥植物抽出物を得ることができる。この乾燥植物抽出物は、本明細書に記載されるようにアッセイ及び／又は標準化することができる。好ましくは、乾燥植物抽出物は、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｓ、特に植物Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌ Ｌの種皮から誘導される。

抽出プロセスに適した溶媒としては、水、アルコール、又はそれらの混合物が挙げられる。例示的なアルコール溶媒には、限定されないが、Ｃ１－Ｃ７アルコール（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、およびブタノール）、ヒドロアルコールまたはアルコールと水の混合物（例えば、ヒドロエタノール）、多価アルコール（例えば、プロピレングリコールおよびブチレングリコール）、及び脂肪アルコールが含まれる。これらのアルコール性溶媒のいずれも混合物の形態で使用することができる。一実施形態において、植物抽出物は、エタノール、水、又はそれらの組み合わせ（例えば、約７０％エタノール及び約３０％水の混合物）を用いて抽出される。別の実施形態では、植物抽出物は、水のみを用いて抽出される。

一実施形態では、植物抽出物は、有機溶媒抽出技術を用いて得ることができ、別の実施形態では、溶媒連続分画を用いて植物抽出物を得ることができる。全水－エタノール抽出技術も植物抽出物を得るために用いることができる。一般に、これは一括抽出と呼ばれる。

全エタノール抽出も使用できる。この方法では、溶媒としてエタノールを用いる。この抽出技術は、水溶性化合物に加えて脂溶性及び／又は親油性化合物を有する植物抽出物を生成することができる。

植物抽出物を得るために使用できる抽出技術の別の例は、超臨界流体二酸化炭素抽出（「ＳＦＥ」）である。この抽出手順では、抽出する材料を有機溶媒にさらしてはならない。むしろ、二酸化炭素は、超臨界条件下（＞３１．３℃、＞７３．８ｂａｒ）で、修飾剤の有無にかかわらず、抽出溶媒として使用することができる。当業者は、温度及び圧力条件を変化させて、抽出物の最良の収率を得ることができることを理解するであろう。この技術は、全ヘキサン及び酢酸エチル抽出技術と同様に、脂溶性及び／又は親油性化合物の抽出物を生成することができる。

このプロセスで生成された植物抽出物は、抽出材料中に存在する広範な植物化学物質を含むことができる。植物性化学物質は、脂溶性又は水溶性であり得る。抽出溶液の回収後、溶媒を蒸発させて、抽出物を得ることができる。植物抽出物は、特定の化合物の特定量に標準化することができる。例えば、植物抽出物は、特定量の活性成分又は植物化学物質に標準化することができる。一実施形態において、植物抽出物は、抽出物の全重量に基づいて、約１５．０ｗｔ％以上のカテキン含有量に標準化される。

関節健康組成物中に存在する植物抽出物の量は、炎症抑制の所望のレベル、特定の植物抽出物又はその成分の炎症抑制レベル、及び他の因子を含むいくつかの因子に依存し得る。好ましくは、植物抽出物は、組成物の全重量に基づいて、約０．００５ｗｔ％以上、例えば約０．００５ｗｔ％～約５０．００ｗｔ％の量で存在する。

関節の健康組成物は、１つ以上の許容可能な担体を含むことができる。担体は、対象への投与に適した形態を有する抗炎症組成物への植物抽出物の取り込みを可能にするのを助けることができる。広い数の許容可能な担体が当技術分野で知られており、担体は任意の適切な担体であり得る。担体は、ヒトを含む動物への投与に好適であり、植物抽出物及び／又は任意の活性成分の所望の活性に実質的に影響を与えることなく担体として作用することができる。担体は、組成物の所望の投与経路及び投薬形態に基づいて選択することができる。

適切な投薬形態は、液体及び固体形態を含む。一実施形態において、組成物は、ゲル、シロップ、スラリー、又は懸濁液の形態である。別の実施形態では、組成物は、飲料ショット又は液体濃縮物のような液体投薬形態である。さらなる態様において、組成物は、錠剤、丸剤、カプセル剤、糖衣錠、又は粉末のような固体投薬形態で存在する。液体又は固体投薬形態の場合、組成物は、送達のための食品中への組込みに適した食品送達形態であり得る。固体形態（特に錠剤およびカプセル形態）で使用するための適切な担体の例には、限定されないが、ゼラチン、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ガム、二酸化ケイ素、ステアリン酸、セルロースなどの有機及び無機不活性担体が含まれる。
担体は実質的に不活性であり得る。

一例として、ケイ化微結晶セルロースを担体又は結合剤として使用することができる。ケイ化微結晶セルロースは、微結晶セルロースとコロイド状二酸化ケイ素との物理的混合物である。このようなケイ化微結晶セルロースの好適な形態の一つは、ケイ化微結晶セルロースによって提供されるものに加えて、ニュージャージー州パターソンのＰｅｎｗｅｓｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｐａｔｔｅｒｓｏｎから入手可能なＰｒｏＳｏｌｖ ＳＭＣＣ（登録商標）９０である。例えば、二酸化ケイ素は、錠剤のような固体投与単位の製造における圧縮中の粉末の流れを改善するために、グライダントとして含まれ得る。

別の実施形態では、担体は、ソバ又はスペルトのような少なくとも機能的担体である。機能性担体を組成物に添加することにより、上記のような標準的担体と比較してより低い血糖指数のような付加的利益を提供することができる。さらに、機能性担体は、アレルゲンを含まない（例えば、ソバ）ことができ、それらを生産工程に加えることによって、本発明の植物抽出物は、ルチン及びクエルセチンのようなこれらの機能性担体のフラボノイドから利益を得ることができる。さらに、これらの機能性担体の高繊維含量は、腸管通過を促進し、調節する可能性がある。最後に、スペルトに含まれるセレンの付加的なミネラルベネフィットは、代謝に役立つ可能性がある。

抗炎症組成物は、潤滑剤及び／又は流動促進剤のような他の不活性成分を含むことができる。潤滑剤は、押し抜き機からの押し出しの間のように、製造中の錠剤の取扱いを助ける。
流動促進剤は、錠剤圧縮中の粉末流動を改善する。ステアリン酸は、許容可能な潤滑剤／流動促進剤の例である。

抗炎症組成物は、錠剤及びカプセルのような固体投薬形態で作ることができる。この形態は、食物を摂取する前、摂取中、摂取後に、個人がレストランなどの食事場所に容易に輸送できる製品を提供する。組成物は、適切な量の植物抽出物及び／又は活性成分を含有する投与単位に処方することができ、これにより、個体は、体重、食品のサイズ、又は炭水化物（例えば、糖）含有量などの適切なパラメータに基づいて、適切な数の単位を取ることができる。

さらなる実施形態では、本開示の組成物は、カテキン、エピカテキン、又はそれらの組み合わせを含有するフラバンのために富化されたアナカルジウム抽出物を含む。ある実施形態では、アナカルジウムの抽出物中の主要活性成分は、カテキン、エピカテキン、又はそれらの組み合わせを含有するフラバンを含み、ここで、抽出物は、種皮からのこれらの活性成分のために富化される。

一実施形態では、植物抽出物は、組成物中に、約５００．０ｍｇ／ｋｇ以上、好ましくは約５００．０ｍｇ／ｋｇ～約２０００．０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１０００．０ｍｇ／ｋｇ～約２０００．０ｍｇ／ｋｇの量などの治療有効量で存在する。組成物は、例えば、ヒト等価投与のために植物抽出物の約５００．００ｍｇ／ｋｇ～約２０００．０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与することができる。組成物は、単回用量として、又は複数回用量として投与することができる。１つの例において、化合物は、１日当たり最大３回投与される。例えば、化合物は、食事の前、食事の間、又は食事の後に投与することができる。一実施形態において、組成物は、治療有効量のカシュー種皮抽出物を含有する抗炎症特性を有する栄養補助食品である。

投与量は、一部の個体及び／又は一部の食品に有効であり得る単一の単位における阻害効果のレベルを提供するように選択することができ、一方、他の個体及び／又は他の食品に有効であり得る阻害効果の他のレベルを提供するように比較的単純な投薬量の増加を可能にすることもできる。

阻害組成物は、経口摂取に適した形態であり得る。この形態は、植物抽出物の特定の投与量を提供することを意図した単一の投薬形態として構成することができる。例えば、単一投薬形態は、粉末、丸剤、錠剤、カプセル剤、又はドリンク剤であり得る。単一投薬形態は、例えば、ヒト等価投薬のための約５００．０ｍｇ／ｋｇ～約２０００．０ｍｇ／ｋｇの植物抽出物を含むことができる。

実施例－材料及び化学プロファイリング
実施例１－生の（抽出前）カシュー種皮材料の全カテキン（フラバノール）及びポリフェノール定量
フラバノールの定量はＨＰＬＣにより行われ、結果を下記の表１に示す。

重量パーセントでは、原料の全重量に基づくと、カシュー種皮原料の全カテキン含量は７．０００％であった。

全ポリフェノール（アントシアニン、フラバノール、ヒドロキシけい皮酸、及び可溶性プロアントシアニジン）は、Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕの方法により定量することができる。ガリン酸は一般に標準品として選択されており、全ポリフェノールの結果は没食子酸当量として報告されている。

没食子酸原液（１ｍｇ／ｍＬ）を連続希釈し、全ポリフェノールの推定のための標準曲線を作成するために使用した。試料カシュー試験及び没食子酸標準品を、希釈フォリン試薬（７％水溶液）と共に９６ウェルプレートに単独で添加し、室温で１０分間インキュベートし、次に２００ｇ／ＬのＮａ_２ＣＯ_３を添加した。振とう後、９６ウェルプレートを４０℃で２０分間インキュベートし、次に分光光度法により７５５ｎｍで分析した。

全ポリフェノールの定量を７５５ｎｍ波長のＵＶ－Ｖｉｓ分光法により行った。Ｆｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ法による全ポリフェノールの定量では、没食子酸当量（ｍｇ／ｇ）で表される全ポリフェノールは１４２０ｍｇ／ｇであった。重量パーセントでは、原料の全重量に基づくと、カシュー種皮原料の全ポリフェノール含量は約２５，０００％であった。

実施例２－カシュー種皮からの７０％エタノール抽出物の調製
乾燥カシュー試験粉末（Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌ．）（６０ｇ）を３本の１００ｍｌステンレス鋼管に装填し、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｄｉｏｎｅｘ（商標）ＡＳＥ ３５０ Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ Ｓｏｌｖｅｎｔ Ｅｘｔｒａｃｔｏｒを用いて、温度８０℃、圧力１５００ｐｓｉでＤＩ水中７０％エタノールの溶媒を用いて２回抽出した。抽出液を濾過し、回収した。合わせたエタノール抽出液を減圧下で回転蒸発器で蒸発させ、粗カシュー種皮抽出物を得た。

抽出結果を以下に示す。

実施例３－カシュー種皮抽出物のカテキン定量
カシュー種皮抽出物中に存在する遊離カテキンを、フォトダイオードアレイ検出器付き日立高速液体クロマトグラフ（「ＨＰＬＣ／ＰＤＡ」）と共に、Ｃ１８逆相カラム（Ｌｕｎａ（登録商標）＞５μｍ Ｃ１８（２）１００Å ＬＣカラム２５０×４．６ｍｍ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳから入手可能）を用いて測定した。移動相Ａの溶媒は０．１０％リン酸（「Ｈ_３ＰＯ_４」）であり、移動相Ｂの溶媒はアセトニトリル（「ＡＣＮ」）であり、これを２７５ｎｍのＵＶ吸光度及び３５℃のカラム温度で１．０ｍｌ／ｍｉｎの定格流量で溶出に用い、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏ．のカテキン標準品を用いた。標準品をメタノール（「ＭｅＯＨ」）：０．１％Ｈ_３ＰＯ_４（１：１比）に、カテキン（Ｃ１２５１）を０．５ｍｇ／ｍｌ、エピカテキン（Ｅｌ ７５３）を０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。試験試料を、容量フラスコ中の０．１％Ｈ_３ＰＯ_４中の５０％ＭｅＯＨ中２ｍｇ／ｍｌで調製し、溶解するまで超音波処理し（約１０分）、次に室温まで冷却し、十分に混合し、そして０．４５ｐｍナイロンシリンジフィルターを通して濾過した。ＨＰＬＣ分析は、２０μｌの試料をＨＰＬＣに注入することによって実施した。下記の表２にＨＰＬＣ分析法の勾配表を示す。

ＨＰＬＣカテキン定量化の結果、カシュー種皮抽出物は、抽出物の全重量に基づいて、カテキン含有量９．４０％、エピカテキン含有量６．１２％、全カテキン含有量１５．５２重量％を提供した。従って、カシュー種皮抽出物は、抽出物の全重量に基づいて、約１５．００重量％以上の全カテキン含有量に標準化することができる。２７５ｎｍ波長のカシュー種皮抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを図３に示す。上記実施例１に示すように、生カシュー種皮エキスの全カテキン含有量は、原料の重量に対して約７．００重量％に過ぎない。従って、本発明によるカシュー種皮抽出物は、１つ以上のフラバン、特に全カテキンに対して濃縮される。別の態様では、カシュー種皮抽出物は、カテキン及びエピカテキンについて富化される。

カシュー種皮抽出物中の全ポリフェノールは、抽出物の全重量に基づいて約５５．００重量％であった。従って、本発明によるカシュー種皮抽出物は、全ポリフェノールに対して富化される。

実施例４－カシュー種皮抽出物の化学プロファイリング
カシュー種皮抽出物中に存在するフラボノイド化合物を、超高圧液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）及び質量分析（ＡＣＱＵＩＴＹ（登録商標）ＵＰＬＣ ＩＣｌａｓｓ及びＸＥＶＱ（登録商標）ＧＳ－ＸＴ－ＱＴｏｆシステム（いずれもＷａｔｅｒ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ ＵＳＡから入手可能）を用いて測定した。使用したカラムは、カラム温度４０℃、試料温度１５℃のＡＣＱＵＩＴＹ ＨＳＣ Ｔ３ ２．１×１００ｍｍ、１．８ｐｍであり、移動相については、溶媒Ａは水（０．１％ギ酸）中の１０％アセトニトリル（「ＡＣＮ」）、溶媒ＢはＡＣＭであり、収集範囲は１００～１５００ダルトン（「Ｄａ」）、回収モードはエレクトロスプレーイオン化（「ＥＳＩ」）（－）であった。下記の表３にＨＰＬＣ条件を示す。

ピーク同定は正確な質量のみに基づいていた。フラバン－３－オールのジグルカテキン、カテキン及びエピカテキンを、以下の一般構造を有するカシュー種皮抽出物の主要成分として同定した。

１：Ｒ_１＝Ｈ、Ｒ_２＝ＯＧ、Ｒ_３＝ＯＨ；（－）－エピガロカテニン－３－Ｏ－没食子酸塩
２：Ｒ_１＝Ｈ、Ｒ_２＝ＯＨ、Ｒ_３＝Ｈ；（－）－エピカテニン
３：Ｒ_１＝ＯＨ、Ｒ_２＝Ｈ、Ｒ_３＝Ｈ；（－）－カテニン

プロシアニジンフィアボノイドは、Ａ型及びＢ型プロシアニジン、プロシアニジン四量体、及びプロシアニジン三量体を含む抽出物中にも検出され、プロシアニジンの主成分はＢ型プロシアニジンであった。

プロシアニジンＢ２、又は（－）－エピカテキン－（４β→８）－（－）－エピカテキン

上記の化合物に加えて、同定された化合物には、とりわけ、バクシヘインＡ、６’’－ｐ－クルナロイルプルニン、及びドゥナリアノシドＢが含まれた。分析から得られたカシュー種皮抽出物のＬＣ／ＭＳ及びＬＣ／ＰＤＡクロマトグラムを図４に示す。

実施例５－７－インビトロバイオアッセイ
カシュー種皮の抽出物を食品グレードのエタノールで調製し、次に、上述のように濾過し、乾燥した。残りのアッセイ調製物には、研究グレードの試薬を使用した。抽出物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、５０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にし、次に、各バイオアッセイのための適切な緩衝液中で作業濃度まで希釈した。

実施例５－ＣＯＸ－１及びＣＯＸ－２阻害
カシュー種皮抽出物を、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（Ｍｉｌｐｉｔａｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳ）のシクロオキシゲナーゼ－１（「ＣＯＸ－１」）阻害剤スクリーニングキット（カタログ＃Ｋ５４８）を用いてＣＯＸ－１阻害について試験した。このスクリーニングキットは、ＣＯＸ酵素によって生成される生成物である有機過酸化物プロスタグランジンＧ２の生成を経時的に測定するものである。抽出物を、ＣＯＸアッセイ緩衝液を用いてＤＭＳＯ中の作業濃度に溶解し、５％ＤＭＳＯの最終濃度にした。陽性対照としてＳＣ－５６０ ＣＯＸ－１阻害剤を用いた。ＣＯＸ－１酵素を滅菌水中で再構成し、－８０℃で保存した。使用直前にＣＯＸ補因子及びアラキドン酸溶液を希釈した。ＣＯＸプローブ、ＣＯＸ補因子、及びＣＯＸ－１酵素溶液を、アラキドン酸溶液を迅速に添加して反応を開始する前に、試験試料及び対照に添加した。蛍光は、励起５３５ｎｍ、発光５９０ｎｍの波長で１０分間毎分測定した。曲線の直線部分の勾配（図５）を推定し、阻害されていない対照の阻害率を計算した。図５を参照すると、種々の程度のＣＯＸ－１阻害が、カシュー種皮抽出物の濃度に依存して観察された。カシュー種皮抽出物ＣＯＸ－１阻害は、約４ｐｇ／ｍＬから少なくとも約２０００ｐｇ／ｍＬ、より具体的には約１５ｐｇ／ｍＬから約２５０ｐｇ／ｍＬであり、ＩＣ５０は３２μｇ／ｍＬであった。

カシュー種皮抽出物を、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ（Ｍｉｌｐｉｔａｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳ）のシクロオキシゲナーゼ－２（「ＣＯＸ－２」）阻害剤スクリーニングキット（カタログ＃Ｋ５４７）を用いてＣＯＸ－２阻害について試験した。このスクリーニングキットは、ＣＯＸ酵素によって生成される生成物である有機過酸化物プロスタグランジンＧ２の生成を経時的に測定するものである。抽出物を、ＣＯＸアッセイ緩衝液を用いてＤＭＳＯ中の作業濃度に溶解し、最終濃度１０％ＤＭＳＯにした。陽性対照としてセレコキシブ非ステロイド性抗炎症薬（「ＮＳＡＩＤ」）を用いた。ＣＯＸ－２酵素を滅菌水中で再構成し、－８０℃で保存した。使用直前にＣＯＸ補因子及びアラキドン酸溶液を希釈した。ＣＯＸプローブ、ＣＯＸ補因子、及びＣＯＸ－１酵素溶液を、アラキドン酸溶液を迅速に添加して反応を開始する前に、試験試料及び対照に添加した。蛍光は、励起５３５ｎｍ、発光５９０ｎｍの波長で１０分間毎分測定した。曲線の直線部分の勾配（図６）を推定し、阻害されていない対照の阻害率を計算した。図６を参照すると、種々の程度のＣＯＸ－２阻害が、カシュー種皮抽出物の濃度に依存して観察された。カシュー種皮抽出物ＣＯＸ－２阻害は、約４ｐｇ／ｍＬ～少なくとも約２０００μｇ／ｍＬ、より具体的には約３０μｇ／ｍＬ～約２５０μｇ／ｍＬであり、ＩＣ５０は８６μｇ／ｍＬであった。従って、本明細書に提示した結果に基づいて、カシュー種皮抽出物は、ＣＯＸ－１及びＣＯＸ－２の活性又は放出を改善する合理的な活性を有することができ、ＣＯＸ－１及びＣＯＸ－２によって媒介される炎症性疾患におけるその使用を示唆する。

実施例６－５－ＬＯＸ阻害
Ｃａｓｈｅｗ種皮抽出物を、リポキシゲナーゼ阻害剤スクリーニングアッセイキット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ、ＵＳから入手可能）及びジャガイモ５－リポキシゲナーゼ酵素（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌから入手可能）を用いて５－ＬＱＸ阻害について試験した。このキットは、リポキシド化反応で生成されるヒドロペルオキシドを測定する。

抽出物をメタノールに溶解し、最終作業濃度とした。５－ＬＯＸ酵素、クロマゲン及びリノール酸溶液を使用直前に調製した。陽性対照としてノルジヒドログアヤレチン酸（「ＮＤＧＡ」）を用いた。５－ＬＯＸ酵素を試験試料及び対照に添加し、室温で５分間インキュベートして、酵素／阻害剤相互作用を可能にした。反応を開始するためにリノール酸基質をプレートに添加し、次にプレートを室温で１０分間振とうした。反応中に生成したヒドロペルオキシドを可視化するためにクロマゲンを添加し、プレートを室温でさらに５分間振とうした。次に、吸光度を４９２ｎｍで読み取った。抽出物濃度の阻害パーセントを、非阻害対照ウェルと比較して計算した。

カシュー種皮抽出物は、１０種類の濃度（０、７、１．５、３．０、６．０、１１．９、１５．６、３１、２、６２．５、１２５．０、及び２５０．０μｇ／ｍＬ）で５－ＬＯＸ阻害活性について試験された。ＮＤＧＡを、１００％５－ＬＯＸ酵素阻害で１００μＭの陽性対照として使用した。図７を参照すると、カシュー種皮抽出物５－ＬＯＸ阻害は、約３２μｇ／ｍＬ～少なくとも約２５０μｇ／ｍＬ、より具体的には約３２ｐｇ／ｍＬ～約１２５μｇ／ｍＬであり、カシュー種皮抽出物について５５μｇ／ｍＬのＩＣ５０が観察された。従って、本明細書に提示された結果に基づいて、カシュー種皮抽出物は、５－ＬＱＸの活性又は放出を改善する合理的な活性を有し得ることから、５－ＬＯＸによって媒介される炎症性疾患におけるその使用が示唆される。

実施例７－ＨＭＧＢ１阻害
ＨＭＧＢｌ実験手順
細胞培養。マウスマクロファージ様細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳからＲＡＷ ２６４．７（ＡＴＣＣ（登録商標）ＴＬＢ－７１（商標））として入手可能）は、１０％ウシ胎児血清（Ａｔｌａｎｔａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ、Ｇｅｏｒｇｉａ、ＵＳ）を添加した、ダルベッコ変法イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）（（ＤＭＥＭ）（ＡＴＣＣ（登録商標）３０－２００２（商標））、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳ）で培養された。細胞を正常酸素条件下（５％ＣＯ_２／２１％Ｏ_２）に維持し、７０～８０％凝集まで増殖させ、２日ごとに継代培養した。

抽出／薬剤調製。カシュー種皮抽出物は、－２０℃で粉末状で保存された。細胞を抽出物で処理する前に、抽出物の原液量をジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）（ＡＭＲＥＳＣＯ、Ｉｎｃ、Ｓｏｌｏｎ、Ｏｈｉｏ、ＵＳから入手）で最終濃度５０ｍｇ／ｍＬに調整し、－２０℃で保存した。抽出物を無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ培地（Ｃｉｂｃｏ－ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳから入手）で最終濃度０．２５ｍｇ／ｍＬに希釈し、０．２μｍ ＰＥＳシリンジフィルター（ＶＷＲ、Ｒａｄｎｏｒ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、ＵＳから入手）で濾過滅菌した。サリチル酸ナトリウム（ＡＭＲＥＳＣＯ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｌｏｎ、Ｏｈｉｏ、ＵＳから入手）を、マクロファージからの高酸素誘導ＨＭＧＢ１放出を減弱させることができる陽性対照として２～２０ｍＭで調製した。

高酸素曝露。高酸素症へのマウスマクロファージＲＡＷ ２６４．７細胞の曝露は、密封し、加湿したプレキシグラスチャンバー（Ｂｉｌｌｕｐｓ－Ｒｏｔｈｅｎｂｅｒｇ、Ｄｅｌ Ｍａｒ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳ）から入手）で３７℃で２４時間９５％Ｏ_２／５％ＣＯ_２でフラッシュした。

ＨＭＧＢ１のＥＬＩＳＡ。細胞外ＨＭＧＢ１のレベルを測定するために、ＲＡＷ ２６４．７細胞を、６ウェルプレート中で無血清Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ培地（Ｇｉｂｃｏ－ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳ）で培養し、２１％Ｏ_２（室内空気）に維持するか、又はカシュー種皮抽出物の有無にかかわらず９５％Ｏ_２に２４時間曝露した。高酸素曝露後、培養培地中のＨＭＧＢ１レベルをＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）により測定した。細胞培養培地を回収し、５００ｇで５分間、４℃でペレット化し、次に、等量の細胞培養上清を、Ａｍｉ ｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－４遠心ユニット（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳ）を用いて約６倍濃縮した。濃縮直後に、等量の細胞培養上清濃縮物を、製造業者の指示に従ってＥＬＩＳＡによりＨＭＧＢ１を測定するために９６ウェルプレートにロードした（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ，Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｍｏｎｄ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＵＳから入手）。プレート吸光度は、Ｔｈｅｒｍｏ Ｍｕｌｔｉｓｅａｎ Ｅｘマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳ）上で４５０ｎｍ（基準として６３０ｎｍを使用）での光学密度（「ＯＤ」）値を読み取ることにより測定した。
試料細胞培養上清中のＨＭＧＢ１レベルを、標準曲線と比較することによって測定し、さらに濃度係数を適用することによって補正した。

統計分析。データは、１～３回の独立した実験の平均（ＳＥＭ）の平均±標準誤差として示した。データは、Ｆｉｓｈｅｒの最小有意差（「ＬＳＤ」）事後分析及びＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍバージョン６ソフトウェア（ＧｒａｆｔＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳ）を用いた一元分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて分析した。Ｐ値＜０．０５を統計学的に有意とみなした。

ＨＭＧＢ１実験結果
図８を参照すると、高酸素（「Ｏ_２」）は、２１％Ｏ_２（「ＲＡ」）で処理された細胞と比較して、ＨＭＧＢ１レベルの有意な増加をもたらした。これらのＨＭＧＢ１の上昇レベルは、カシュー種皮抽出物（「ＣＰ」）による処理のために、正常レベル（処理なしで室内空気（ＲＡ）に曝露された細胞）に近づくほど低下した。陽性対照のサリチル酸ナトリウム（「ＳＳ」）でも同様の低下が観察された。両治療群（ＳＳ及びＣＴ）の減少は統計学的に有意であった。従って、本明細書に提示された結果に基づいて、カシュー種皮抽出物は、ＨＭＧＢ１の活性又は放出を改善する合理的な活性を有し得ることから、ＨＭＧＢ１によって媒介される炎症性疾患におけるその使用が示唆される。

上記データは、Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｌａｌｅ Ｌ．の種皮の植物抽出物が抗炎症活性を示す１つ以上の化合物を有することを示す。より具体的には、カシュー種皮抽出物は、ＣＯＸ－１、ＣＯＸ－２、５－ＬＧＸ、及び／又はＨＭＧＢ１の活性又は放出を改善する合理的な活性を有することができる。

実施例８－コラーゲン誘導ラット足関節炎誘導におけるＡｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌ．抽出物の有効性
ラットにおけるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）モデルは、関節リウマチ（ＲＡ）の最も一般的に研究されている自己免疫モデルであり、ヒトＲＡにおける免疫介在性多発性関節炎に類似するいくつかの病理学的特徴を有する。免疫化から疾患発現までの期間が最も短いことから、このモデルは治療効果の評価に適している。その病態生理学の間、牛鼻中隔からのヘテロジェニックＩＩ型コラーゲン（ＣＩＩ）の接種後、ラットは、抗原に対する体液性及び細胞性応答の両方を開始する。この感作によって、宿主は自己を認識できず、関節軟骨にのみ存在するＩＩ型コラーゲンを攻撃することになる。誘導されると、ラットは炎症性疼痛及び腫脹、軟骨の分解、滑膜過形成、汎形成、単核細胞浸潤、変形、及び不動性を経験する。従って、このモデルは、関節炎に関連した徴候及び症状を軽減するために低、中及び高用量で経口投与したカシュー種皮抽出物の有効性を評価するのに理想的である。

軟骨は関節構造の主成分であり、緻密で高度に組織化された細胞外マトリックス（「ＥＣＭ」）に埋め込まれた軟骨細胞からなる。ＥＣＭは軟骨細胞によって合成され、グリコサミノグリカン（「ＧＡＧ」）及び関連プロテオグリカンと共にＩＩ型コラーゲンを主に含むコラーゲンネットワークで構成される。正確な病理学的配列は不明であるが、関節のすべての構造的構成要素が関節炎の病因に関与している。アグリカンの分解とともに、コラーゲンの分解は関節炎の中心的な特徴である。腫瘍壊死因子（「ＴＮＦ」）－α及びインターロイキン（「ＩＬ」）－１βのような炎症誘導性サイトカインは、アグリカナーゼ及びマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ１３のような）産生の刺激につながる一連の事象を介して、関節軟骨における軟骨マトリックス分解において重要な役割を果たすことが知られている。ＴＮＦ－αは炎症過程の駆動力として知られているが、ＩＬ－１βは他の膨張促進性サイトカイン及びケモカインの動員を調整していると考えられている。一緒になると、病気の進行を増幅し、持続させ、永続させることができる。劣化軟骨は、関節リウマチ（「ＲＡ」）と変形性関節症（「ＯＡ」）の両方における主要な臨床症状の一つである。特に、ＩＩ型コラーゲンの尿中Ｃ末端テロペプチド（「μＣＴＸ－ＩＩ」）は、診断、疾患の重症度の決定、又は疾患進行の予測、予後、及び治療の有効性のモニタリングの目的に使用することができる、軟骨劣化のバイオマーカーについて、はるかに研究され、十分に参照されている。その結果、これらのメディエーターのいずれかを抑制することは、ＯＡ／ＲＡにおいて治療的利点を有する可能性があり、また、関節炎の初期段階において、軟骨細胞がコラーゲン及びアグリカンのような分解性細胞外マトリックスを再構築し、補充する努力があることも注目されている。この同化特性は、コラーゲン合成を表すＰＩＩＡＮＰの血清レベルを測定することによって評価することができる。

ラットにおけるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を開発し、疾患誘導後３週間経口投与したカシュー皮膚抽出物の有効性を評価するために利用した。試験には７群のラット（ｎ＝９ラット／群）を含めた。ラットは、目的交配雄Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗ ｌｅｙラット（７～８週齢、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）であった。動物を２週間馴化し、必要体重に達させた後、各群に無作為に割り付けた。ラット（３匹／ケージ）をポリプロピレン製ケージに収容し、尾部の番号で個別に同定した。個々のケージは、プロジェクト番号、被験物質、用量、群及び動物番号を示すケージカードで識別した。Ｈａｒｌａｎ Ｓｏｆｔ Ｃｏｂ寝具（Ｅｎｖｉｇｏ Ｔｅｋｌａｎｄ ７０８７、Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）を使用し、少なくとも週２回交換した。動物には淡水及びげっ歯類用飼料（Ｔｅｋｌａｄ ２０１８、Ｅｎｖｉｇｏ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）を自由に与え、試験期間を通して１２時間明暗周期で温度制御室（２２．２℃）に収容した。

試験ラットを無作為に割り付け、以下に記した７つの試験品のうちの１つを投与した。

^＊ＣＭＣ＝カルボキシメチルセルロース；ＭＴＸ＝メトトレキサート；ＣＮＴ＝カシュー種皮抽出物；Ｇ＝グルコサミン；Ｃ＝コンドロイチン。Nair, A. B., et al., J Basic Clin Pharm, "A simple practice guide for dose conversion between animals and human", Mar 2016, Vol. 7, No. 2, p.p. 27-31。

ＣＩＡ試験で使用したＡｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌ．抽出物を、上記実施例１に記載のように調製し、実施例２に記載の全カテキン含有量について定量し、抽出物の全カテキン含有量が全重量で１８．４％である抽出物を用いた。

上の表４に記されているように、ラットを体重に基づいて各群９匹（９匹）のラットを７つの治療群に無作為に割り付けた。投与開始日のラットの平均体重は１８９．７±１１．７ｇであった。動物を表４に従って、メトトレキサート、カシュー皮膚抽出物、及びグルコサミン及びコンドロイチンを３週間、毎日経口投与した。メトトレキサートは、ＣＩＡラットのような自己免疫媒介性関節炎の治療に最適に使用される有効な免疫抑制剤である。正常対照ラット及びＣＩＡラットは、担体ベヒクル（０．５％カルボキシメチルセルロース）のみで処理した。

誘導前２週間、ラットに０．５％ＣＭＣに懸濁した各被験物質を１０ｍｌ／ｋｇ／ラットで強制経口投与した。溶液中の試料を、被験物質の均一性を維持するために経口投与前にボルテックスした。足関節直径、足の厚さ、及び疼痛感受性の測定は、ベースラインのプライミング時に関節炎を誘導する前に行った。

誘導には、牛鼻中隔（Ｅｌａｓｔｉｎ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｏｗｅｎｓｖｉｌｌｅ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）由来のコラーゲンＩＩ型及び不完全フロイントアジュバント（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ由来の「ＩＦＡ」）を用いた。すべての材料は、製造者が推奨する適切な温度に維持した。調製時に、６０ｍｇのコラーゲンを秤量し、磁気撹拌機を備えた６０ｍｌサイズのフラスコ中で予備冷却した０．１Ｍ酢酸１５ｍｌに加えて、４ｍｇ／ｍｌ濃度を得た。混合物を４℃で一晩穏やかに撹拌することにより溶解し、翌朝、溶解したコラーゲンを等容量のＩＦＡ（１５ｍｌ）で乳化して、最終濃度２ｍｇ／ｍｌコラーゲンを得た。次に、イソフルランで鎮静させたラットを、２６ｇの針に取り付けた１ｍｌシリンジを用いて、２つの部位で尾部の基部にある乳化コラーゲン４００μｌで皮内にプライムした。溶解した混合物を氷バケット中に保持し、注入時にグループ間で撹拌し、均一なコンシステンシーを維持した。

誘導後、全ラットがプライミング後にそれぞれの処理材料を受け続けた。ラットには、計５週間の投与（すなわち、誘導の２週間前及び誘導の３週間後）を行った。

追加投与前にラットの関節炎指数を評価した。２ｍｇ／ｍｌのＩＩ型コラーゲンを、１００μｌ／ラット／部位で等容量のＩＦＡで乳化し、導入前処理で示されたものと同じ調製物に従い、追加接種した。７日目に抗原を注射する前に足の厚さ、足首の直径及び疼痛感受性の測定を行った。

存命期間中、関節炎重症度指数、足の厚さ、足首の直径及び疼痛感受性をモニターした。試験終了時に尿及び血清を採取し、バイオマーカー分析を行った。プライミング後の全群について２２日目に剖検を実施した。剖検時に、各ラットの足関節を組織病理学的分析のために採取した。尿軟骨分解マーカー（ＣＴＸ－ＩＩ）、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－ＩＩβ、及びＩＬ－６）、軟骨合成マーカー（ＰＩＩＡＮＰ）及びマトリックス分解プロテアーゼ（ＭＭＰ１３）を測定した。

すべての動物実験は、実験動物の管理及び使用に関する指針に適合した施設のガイドラインに従って実施され、施設の動物管理使用委員会（ＩＡＣＵＣ）（承認番号ＩＡ－Ｐ０２－０９２６１９）によって検討及び承認された。実験設計を図９に示す。

関節炎重症度指数、足の厚さ、足関節直径、及び疼痛感受性データなどの臨床所見を以下のように集計した。

関節炎重症度指数。ラットでは、試験期間中、疾患の進行が緩慢なままであった。下記のデータに見られるように、全投与群のラットでは、種々の程度の重症度抑制が認められた。特に、１００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇのＣＮＴを投与したラットでは、１０日目から関節炎の重症度が統計学的に有意に抑制され、試験期間中、この有意性が継続した（図１０、表５）。ベヒクル処理ラットはプライミング後１０日目に関節炎症状を示したが、１００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇのＣＮＴで処理したラットはプライミング後１３日目に症状を開始した（すなわち、関節炎症状の発症が７２時間遅れた）。５０ｍｇ／ｋｇのＣＮＴおよび１５０ｍｇ／ｋｇのＧ＋１２０ｍｇ／ｋｇのＣ群は、プライミング後１１日目に関節炎症状を発現した。比較のために、メトトレキサート群の疾患発症はプライミング後１４日目であった。曲線下面積を示すすべての図について、直線台形規則を用いて、９～２１日目の曲線下面積を計算した。阻害％＝｛（治療の平均値－ＣＩＡ＋の平均値）／（対照の平均値－ＣＩＡ＋の平均値）｝×１００。

足の厚さ。重症度スコアと一致して、１００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇのＣＮＴを投与したラットでは、１２日目から足の腫脹が統計学的に有意に減少し、試験期間中この有意性が維持された（図１１、表６）。５０ｍｇ／ｋｇのＣＮＴ群は、ＧＣ群と比較して、統計学的に有意ではないが、足の厚さのより良好な減少を示した。これらの低下に対する腫脹曲線下の全面積（７日目～２１日目）を考慮すると、１００ｍｇ／ｋｇのＣＮＴ群及び２００ｍｇ／ｋｇのＣＮＴ群では、プラセボ投与ＣＩＡ群と比較して、足浮腫が統計学的に有意に５５．８％及び６８．７％減少した（図１２）。Ｐ値は０．１５及び０．３６であり、足浮腫の３６．６％及び２３．５％の低下が、ベヒクルで処理したＣＩＡと比較して、５０ｍｇ／ｋｇのＣＮＴ及びＧＣで処理したラットでそれぞれ観察された。メトトレキサート群は９０．２％の減少を示した。

足関節の直径。誘導後１５日目まで１００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇのＣＮＴを投与したラットでは、足関節直径の減少に統計学的に有意な同様のパターンが観察された（図１３、表７）。その後、試験期間中、２００ｍｇ／ｋｇ群のみで、残りの群で足関節直径の統計学的に有意な減少が認められた。１７日目及び２１日目の足関節直径の減少は、１００ｍｇ／ｋｇのＣＮＴ群では統計学的に有意ではなかった。５０ｍｇ／ｋｇのＣＮＴを投与したラットでは、誘導後１３日目、１５日目、１９日目に足関節直径の統計学的に有意な減少が認められた。対照的に、ＧＣ投与ラットでは、試験期間中に足関節直径の有意な減少は認められなかった。ここで、カシュー種皮抽出物から、２００ｍｇ／ｋｇのＣＮＴ群のみが、曲線下面積を７～２１日間考慮した場合、足関節幅において統計学的に有意な減少（すなわち、７０．３％）を示した。ＡＵＣでは、５０ｍｇ／ｋｇのＣＮＴ群、１００ｍｇ／ｋｇのＣＮＴ群、及びＧＣ群で、足関節直径の統計学的に有意ではない４９．３％、５０．９％、３６．２％の減少が観察された。メトトレキサート群は８９．１％の減少を示した（図１４）。

疼痛感受性。疼痛感受性の尺度としての圧力に対する反応を、プライミング日、ブースト、１２日目、１３日目、１５日目、１７日目、１９日目及び２１日目に電子モニターに取り付けたＲａｎｄａｌｌ－Ｓｅｌｉｔｔｏプローブを用いて測定した。その日に左右の後肢をモニターし、その平均値をデータ分析に用いた。ベヒクル処理ＣＩＡラットからの変化は、当日の疼痛耐性として報告されている。最も高い疼痛耐性が認められたのは、メトトレキサート群（１４．１～６７．１％対ベヒクル処理ＣＩＡ）であり、次に２００ｍｇ／ｋｇ群（１３．５～４３．８％対ベヒクル処理ＣＩＡ）及び１０００ｍｇ／ｋｇ群（１１．８～２５．８％対ベヒクル処理ＣＩＡ）であった（図１５及び３６）。５０ｍｇ／ｋｇ ＣＮＴ群及びＧＣ群のラットでは、モニタリングしたすべての時点で疼痛感受性に同様の低下が認められた。ベヒクル処理ＣＩＡラットと比較した場合、すべての群で１２日目の時点で統計学的に有意な疼痛抑制が観察された（表８）。

バイオマーカー
尿ＣＴＸ－ＩＩ
アッセイ。ラット尿検体を１：３に希釈し、ＭｙｂｉｏｓｏｕｒｃｅのＲａｔ ＣＴＸ－ＩＩ ＥＬＩＳＡキットを用いてＣＴＸ－ＩＩの存在を以下のように測定した。ＣＴＸ－ＩＩ抗体を被覆したマイクロプレートに希釈尿を加え、３７℃で２時間結合させた。ＣＴＸ－ＩＩに対するビオチン結合抗体を加え、３７℃で１時間ラット尿からＣＴＸ－ＩＩに結合させた後、マイクロプレートを十分に洗浄して未結合尿と抗体を除去した後、酵素結合アビジン抗体を加えてビオチン結合抗体に結合させ、特異的に検出した。アビジン抗体を３７℃で１時間結合させ、洗浄を繰り返し、酵素基質を加え、３７℃で３０分間培養し、停止液を加えた後、４５０ｎｍでの吸光度に希釈倍数を乗じ、ＣＴＸ－ＩＩ標準曲線の吸光度から算出したＣＴＸ－ＩＩの濃度を読み取った。

標準化。クレアチン－ＣＴＸ－ＩＩ量を、クレアチニンパラメータアッセイキット（Ｒ＆Ｄシステム）を用いて、以下のように尿中クレアチニン量に標準化した。尿を１：２０に希釈し、マイクロプレート中でアルカリ性ピクリン酸（５部０．１３％ピクリン酸：１部１Ｎ ＮａＯＨ）と混合し、室温で３０分間インキュベートした。吸光度を４９２ｎｍで読み取り、クレアチニン標準曲線の吸光度の測定値に基づいて尿中クレアチニン量を計算した。

タンパク質／ＣＴＸ－ＩＩ量を、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、以下のようにして尿中全タンパク質量に標準化した。尿を１：２０に希釈し、マイクロプレート中でビシンコニン酸（ＢＣＡ）試薬と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。吸光度は５８０ｎｍで測定し、尿中のタンパク質濃度はウシ血清アルブミン標準曲線の吸光度測定値に基づいて算出した。

結果。
図１７～１９に示すように、ベヒクル処理ＣＩＡラットでは、疾患の重症度を確認する正常対照と比較して、尿中ＣＴＸ－ＩＩレベルの統計学的に有意な増加（生データで３．５倍、タンパク質及びクレアチニンの正常化で２倍）が観察された。臨床所見（関節炎の重症度、足の腫脹及び足首の直径）と一致して、カシュー種皮抽出物で処理したラットは軟骨分解の用量相関的予防を示した。マトリックス分解の最大阻害は、高用量（２００ｍｇ／ｋｇ）のカシュー種皮抽出物で処理したラットで観察され、続いて中用量（１００ｍｇ／ｋｇ）で観察された。実際、タンパク質（５３．４％阻害対ベヒクル；ｐ＝０．０４）又はクレアチニン（３３．０％阻害；ｐ＝０．１１）によって値が正常化された場合、２００ｍｇ／ｋｇ群のラットで観察された阻害率はいずれの投与群よりも高かった。メトトレキサートは、生データにおいて、ベヒクル処理された疾患ＣＩＡラットと比較して、軟骨の有意な分解（最大５３．８％保護；Ｐ＝０．００５）を保っているようであった。これらの値は、ベヒクル処理ＣＩＡラットと比較して、メトトレキサート群でタンパク質（２２．９％、ｐ＝０．３７）及びクレアチニン（２７．２％、ｐ＝０．２２）で正常化した場合、中等度であった。１００ｍｇ／ｋｇで投与したカシュー種皮抽出物は、未処理ＣＩＡラットと比較して、生データ、タンパク質正規化及びクレアチニン正規化に対してそれぞれ２３．２％（ｐ＝０．２９）、３３．０％（ｐ＝０．２０）及び２１．３％（ｐ＝０．３６）の軟骨保護を示した。５０ｍｇ／ｋｇのカシュー種皮抽出物及びＧＣ群のラットでは、軟骨保護はわずかであった。５０ｍｇ／ｋｇカシュー種皮抽出物で１７．８％、１９．０％、１２．３％、ＧＣ処理群で１６．３％、１６．５％、１７．９％の減少が生データ、タンパク質標準化及びクレアチニン標準化ＣＴＸ－ＩＩで観察された。

サイトカインＩＬ－１β／ＩＬ－６／ＴＮＦ－α
試料回収。試験終了時に、各動物について心臓穿刺からの血液を採取し、血液を３０００ｒｐｍで１５分間回転させた。各ラットから約７００～８００μｌの血清を分離した。
いずれの試料も使用するまで－８０℃に保存した。

ＥＬＩＳＡアッセイ。サイトカインＩＬ－１β／ＩＬ－６／ＴＮＦ－ａの存在を、ラットＩＬ－１β／ＩＬ－６／ＴＮＦ－α Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、Ｍｉｎｎｅｓｏｔa）を用いて、以下のように測定した。未希釈血清を、ポリクローナル１Ｌ－１β／Ｉ Ｌ－６／ＴＮＦ－α抗体で被覆したマイクロプレートに添加し、室温で２時間結合させた。マイクロプレートを徹底的に洗浄して結合していない血清を除去し、次にポリクローナル酵素結合ＩＬ－１β／ＩＬ－６／ＴＮＦ－α抗体を添加し、室温で２時間結合させた。洗浄を繰り返し、酵素基質を添加し、プレートを室温で３０分間発色させた。停止溶液の添加後、４５０ｎｍで吸光度を読み取り、ＩＬ－１β／ＩＬ－６／ＴＮＦ－α標準曲線の吸光度測定値に基づいて計算したＩＬ－１β／ＩＬ－６／ＴＮＦ－ａの濃度を測定した。

血清ＩＬ－Ｉβ、ＩＬ－６、およびＴＮＦ－αの結果
ＩＬ－１β、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６などの炎症誘導性サイトカインは、単独で、又はＯＡ／ＲＡの病因における炎症の開始、動員、進行、及び持続において重要な役割を果たす。これらのサイトカインのレベルを低下させる薬剤は、ＯＡ／ＲＡに関連する症状を緩和する可能性がある。

図２１を参照すると、ベヒクル（０．５％のＣＭＣ）で処理したＣＩＡラットで血清ＩＬ－１βの統計的に有意な増加が観察された。ＩＬ－１βの血清レベルのこの増加は、ベヒクルで処理したＣＩＡラットと比較して、陽性対照メトトレキサート（８６．４％減少、ｐ＝０．０１）及び２００ｍｇ／ｋｇのＣＮＴ（５３．１％減少、ｐ＝０．０１）によって有意に減少した。１００ｍｇ／ｋｇのＣＮＴ投与群のラットでは、ＩＬ－１βの血清中濃度が統計学的に有意ではないが３８．３％低下した。ラットでは、５０ｍｇ／ｋｇのＣＮＴ群で血清ＩＬ－１β値が有意ではないが３．７％上昇した（図２１）。

同様に、カシュー皮膚抽出物の結果として、ＴＮＦ－αの血清レベルが低下した（図２２）。ＴＮＦ－αのレベルは、正常対照及びメトトレキサート、１００ｍｇ／ｋｇのＣＮＴ及びＧＣで処理したラットでは０以下であった。これらのレベルは、ベヒクル処理ＣＩＡラットと比較した場合、統計学的に有意であった。５０ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇのＣＮＴの低下率は、それぞれ５２．１％（ベヒクル処理ＣＩＡラットに対してｐ＝０．１４）及び９８．３％（ベヒクル処理ＣＩＡラットに対してｐ＝０．０７）であったが、ベヒクル処理ＣＩＡラットと比較すると、個々のラット間でばらつきがあるため、統計的有意性には達しなかった。

カシュー種皮抽出物処理はラット血清ＩＬ－６レベルに影響を及ぼさず、すべての血清値はブランク以下であった。しかし、ＩＬ－１β及びＴＮＦαデータは、関節炎指数、足関節直径及び足の厚さのような生涯試験臨床測定で観察されたものを反映している。

ＩＩＡ型コラーゲンＮ－プロペチド（ＰＨＡＮＰ）
ＯＡ及びＲＡ患者のＰＩＩＡＮＰレベルは低下し、ＩＩＡ型コラーゲン合成がこれらの疾患で変化する可能性を示唆した。従って、このバイオマーカーに基づくＩＩＡ型コラーゲン合成の測定は、関節疾患患者におけるカシュー種皮抽出物の有効性を決定するのに有用である。

ＥＬＩＳＡアッセイ。ＰＩＩＡＮＰの存在は、以下のように、ラットＩＩＡ型コラーゲンＮ－Ｐｒｏｐ（ＰＩＩＡＮＰ）ＥＬＩＳＡキット（ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ。Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて測定した。ＰＩＩＡＮＰ抗体及びＭＲＰ結合ＰＩＩＡＮＰ抗体を被覆したマイクロプレートに未希釈血清を加え、３７℃で１時間結合させた後、マイクロプレートを十分に洗浄し、クロマゲン溶液を加えて３７℃で１５分間結合させ、停止溶液を加えた後、４５０ｎｍで吸光度を測定し、ＰＩＩＡＮＰ標準曲線の吸光度測定値からＰＩＩＡＮＰ濃度を算出した。

血清ＰＩＩＡＮＰの結果
正常対照ラットは血清ＰＩＩＡＮＰレベルの５３．０％の増加を示したが、対照群と比較しベヒクルで処理したＣＩＡラットでは血清ＰＩＩＡＮＰの統計学的に有意な減少（３４．７％対対照）が観察され（ｐ＝０．０００２）、このモデルの誘導を示した（図２３参照）。対照的に、陽性対照メトトレキサートで処理したＣＩＡラットは、ベヒクル処理疾患モデルと比較した場合、血清ＰＩＩＡＮＰの有意な増加を示した（ＣＩＡ＋ベヒクルと比較して４１％、ｐ＝０．００１）。カシュー皮膚抽出物群のラットは、ベヒクル処理ＣＩＡ群と比較して、血清ＰＩＩＡＮＰの２０．６％（５０ｍｇ／ｋｇ）、２５．３％（１００ｍｇ／ｋｇ）及び２７．０％（２００ｍｇ／ｋｇ）の増加を示した。中間用量（１００ｍｇ／ｋｇ）及び高用量（２００ｍｇ／ｋｇ）で観察された増加は、ベヒクル処理ＣＩＡラットと比較して統計学的に有意であった。これらの結果は、カシュー皮膚抽出物処理ラットが処理に応答して合成されるコラーゲンの量が増加したことを示す。このことは、治療がこの動物モデルに特徴的なコラーゲン分解表現型の逆転に寄与することを示している。少なくともこのカテゴリーにおいて、ＧＣ群は、軟骨再生活性を示すベヒクルで処理したＣＩＡラットと比較して、ＰＩＩＡＮＰ群で統計学的に有意な増加（４４．３％、ｐ＝０．００１）を示した。

マトリックスメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ－１３）
マトリックスメタロプロテイナーゼ１３は炎症の調節因子であり、変形性関節症の関節軟骨におけるＩＩ型コラーゲン分解に重要な役割を果たす酵素である。また、軟骨のプロテオグリカン、ＩＶ型及びＩＸ型コラーゲン、オステオネクチン、ペルレカンを分解する。

ＥＬＩＳＡアッセイ。未希釈ラット血清中のＭＭＰ－１３の存在を、ＭＭＰ－１３ラットマトリックスメタロプロテイナーゼ１３（ＭＭＰ－１３）ＥＬＩＳＡキット（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、以下のように測定した。未希釈血清を、ＭＭＰ－１３抗体でコーティングしたマイクロプレートに添加した。３７℃で２時間後、血清中のＭＭＰ－１３をプレートに結合させ、結合していない血清を吸引した。ＭＭＰ－１３に特異的なビオチン結合抗体をウェルに添加し、３７℃で１時間結合させ、プレートを徹底的に洗浄し、アビジン結合ウマラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）をプレートに添加した。３７℃で１時間後、洗浄を繰り返し、酵素基質をプレートに添加した。３７℃で２０分間展開した後、停止溶液を加え、４５０ｎｍで吸光度を読み取った。ＭＭＰ－１３の濃度は、ＭＭＰ－１３標準曲線の吸光度測定値に基づいて算出した。

血清ＭＭＰ－１３の結果
図２４を参照すると、血清ＭＭＰ－１３濃度は、全群について標準曲線よりも低かった。
従って、この結果は決定的なものではなかった。

組織病理学
手順及び評価。剖検時に、足関節を注意深く解剖し、１０％緩衝ホルマリンで固定し、さらに病理組織学的分析のために全国組織学（Ｖｅｒａｄａｌｅ、ＷＡ、ＵＳＡ）に送付し、固定した標本をカルシウムで脱灰し、１日半かけてカルシウムで脱灰し、パラフィンに包埋した。各ラットから標準化した５ｐｍ連続切片を得、ヘマトキシリン及びエオシン（ＨＥ）及びサフラニンＯ－ｆａｓｔグリーンで染色し、プロテオグリカン含有量の評価を可能にした。修正Ｍａｎｋｉｎシステム（Ｍａｎｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１）を用いて、疾患の進行及び／又は治療効果の指標として、関節構成要素の構造的及び細胞的変化をスコア化した。組織学的分析は、Ｎａｔｉｏｎｗｉｄｅ Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙの認定病理医が行った。

結果。組織病理学的データは関節炎の重症度スコアと一致した。正常対照ラットと比較して、ベヒクル処理ＣＩＡラットは重度の滑膜炎、顕著な軟骨分解、滑膜過形成、パンヌス形成及び骨侵食を示した（図２５及び２６）。ベヒクル処理ＣＩＡラットは、正常対照と比較して、骨侵食、炎症、及びＧＡＧ喪失の重症度がそれぞれ４．４倍、５倍、４．８倍、及び４．４倍増加した。対照的に、メトトレキサートで処理したラットは、ベヒクルで処理したＣＩＡラットと比較した場合、軟骨破壊（ベヒクルよりも５０．７％低い）、骨侵食（ベヒクルよりも７１．２％低い）、炎症（ベヒクルよりも５５．８％低い）、及びＧＡＧ喪失（ベヒクルよりも５０．７％低い）において比較的低い交互変化を有した。同様に、カシュー皮膚抽出物で処理したラットは、ベヒクルで処理したＣＩＡラットと比較して、足関節の組織病理学的検査値の用量相関性の改善を示した。特に、２００ｍｇ／ｋｇのカシュー皮膚抽出物で処理した動物は、ベヒクルで処理したＣＩＡラットと比較して、軟骨破壊、骨侵食、炎症及びＧＡＧ喪失の重症度のそれぞれ５４．５％、５９．８％、５０．５％及び５４．５％の減少を示した。これらの減少のうち、骨侵食及び炎症軽減は、ベヒクル処理ＣＩＡラットと比較して、２００ｍｇ／ｋｇ投与群で統計学的に有意であった。ベヒクルで処理したＣＩＡラットと比較して、１００ｍｇ／ｋｇカシュー皮膚抽出物で処理したＣＩＡラットでは、軟骨破壊、骨侵食、炎症、及びＧＡＧ喪失のそれぞれ３５．７％、５１．２％、４５．３％、及び３５．７％のような中等度の低下が観察された。骨侵食変化は、ベヒクルで処理したＣＩＡラットと比較して、１００ｍｇ／ｋｇ投与ラットで統計学的に有意であった。５０ｍｇ／ｋｇのカシュー皮膚抽出物又はＧＣ群で処理した動物は、病理組織学的検査で評価した全カテゴリーにおいて非常に類似したパターンを示し、これはＣＩＡに関連する症状の緩和に最小限の活性を示すか、又は全く活性を示さないベヒクル処理ＣＩＡラットと非常に類似していた。

コラーゲン誘導ラット足関節炎誘導におけるＡｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌ．抽出物の有効性の概要

ラットにおけるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を開発し、疾患誘導後３週間経口投与したカシュー種皮抽出物の有効性を評価するために利用した。試験報告書には７群のラットが含まれており、各群９匹のラットが含まれている。３群のラットにカシュー種皮抽出物を、低用量５０ｍｇ／ｋｇ、中用量１００ｍｇ／ｋｇ、高用量２００ｍｇ／ｋｇの３種類の用量で経口投与した。カシュー種皮抽出物群の有効性は、０．５ｍｇ／ｋｇで投薬した免疫抑制薬メトトレキサート群、及びグルコサミンとコンドロイチン（１５０Ｇ＋１２０Ｃ ｍｇ／ｋｇ）を毎日３週間投与した群と比較した。正常対照ラット及びＣＩＡラットには、０．５％カルボキシムエチルセルロースのみを担体ベヒクルとして処理した。存命期間中、関節炎重症度指数、足の厚さ、足首の直径及び疼痛感受性をモニターした。試験終了時に尿及び血清を採取し、バイオマーカー分析を行った。剖検時に、各ラットの足関節を組織病理学的分析のために採取した。尿軟骨分解マーカー（ＣＴＸ－ＩＩ）、炎症性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－ＩＩβ、およびＩＬ－６）、軟骨合成マーカー（ＰＩＩＡＮＰ）及びマトリックス分解プロテアーゼ（ＭＭＰ１３）を測定し、各治療の有効性を決定した。

疾患モデルの導入は、関節炎重症度指数の漸進的な増加、そして後に尿及び血清の関節炎関連バイオマーカー、ならびに組織病理学的所見を伴った。ラットは種々の程度の反応を示した。カシュー種皮抽出物は、用量と相関し、測定可能な有効性を示し、関節炎の症状緩和において高用量で有意な影響を示した。関節炎の重症度、足の厚さ、足首の直径、及び疼痛感受性に関する総合データを比較したところ、カシュー皮膚抽出物を中用量及び高用量で投与したＣＩＡラットは、関節炎の主要徴候において統計学的に有意な減少を示した。ＧＣ及び５０ｍｇ／ｋｇカシュー皮膚抽出物群のラットでは、この試験ではわずかな有効性しか示さなかった。

バイオマーカーからのデータは存命観察と一致した。２００ｍｇ／ｋｇのカシュー種皮抽出物で処理したＣＩＡラットにおいて、データをタンパク質で正規化した場合、μＣＴＸ－ＩＩで統計学的に有意な減少（５３．４％阻害対溶媒；Ｐ＝０．０４）が観察された。同様に、カシュー種皮抽出物を投与したラットでは、溶媒投与群と比較して、血清ＩＬ－１（２００ｍｇ／ｋｇカシュー種皮抽出物、５３．１％低下、Ｐ＝０．０１）及びＴＮＦ－α（１００ｍｇ／ｋｇカシュー種皮抽出物）濃度の統計学的に有意な低下が観察された。低用量カシュー種皮抽出物はＩＬ－１βとＴＮＦ－αの抑制に感染性であったが、ＧＣ処理ラットはＴＮＦ－αの統計学的に有意な減少を示した。カシュー種皮抽出物（１００ｍｇ／ｋｇ及び２００ｍｇ／ｋｇ）及びＧＣ投与群は、ベヒクル処理群と比較して、同化マーカーの増加に関して有意水準に達した。

さらに、組織病理学的データは関節炎の重症度スコアと良く一致した。ベヒクルで処理したラットは重度の滑膜炎、顕著な軟骨変性、骨及び軟骨のびまん性壊死、滑膜過形成、パンヌス形成、骨浸食、及び建築構造の喪失を経験したが、カシュー種皮抽出物及びメトトレキサートで処理したＣＩＡラットは、マトリックス完全性において比較的中等度の形態学的変化を有し、関節骨損傷を減少させた。カシュー種皮抽出物（２００ｍｇ／ｋｇ）処理ラットは、組織病理学データの修正Ｍａｎｋｉｎスコア分析から炎症及び骨浸食の統計学的に有意な減少を示した。ＧＣ又は５０ｍｇ／ｋｇのカシュー種皮抽出物で処理したラットでは、関節構造損傷の顕微鏡的改善はわずかであった。

従って、存命測定（関節炎の重症度、足の厚さ、足首の直径及び疼痛感受性）、尿中ＣＴＸ－ＩＩ、血清ＩＬ－１β及びＴＮＦ－α、ならびに組織病理学的分析のデータに基づき、１００ｍｇ／ｋｇ又は２００ｍｇ／ｋｇのカシュー種皮抽出物を経口投与したところ、ＧＣ投与群よりも有意に優れていた。ラットにＧＣを投与すると、同化（ＰＩＩＡＮＰ）マーカー及びＴＮＦ－αに統計学的に有意な変化が認められた。集合的データは、関節構造と機能を支持するためのカシュー種皮抽出物の潜在的使用を支持する。

上記の説明は、本発明のいくつかの方法及び材料を開示している。本発明は、製造方法及び装置の改善だけでなく、方法及び材料の改善にも感受性である。このような修飾は、本明細書に開示された本発明のこの開示又は実施を考慮することにより、当業者に明らかになるであろう。さらに、別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。従って、本発明は、本明細書に開示された特定の実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲に具体化された本発明の真の範囲及び精神内に入る全ての変更及び代替物を包含することを意図している。

Claims (20)

1. Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｌａｌｅ Ｌの種皮の治療有効量の植物抽出物を含む、それを必要とする哺乳動物における関節の剛性及び不快感を低減させるため、ならびに／又は軟骨再構築もしくは軟骨再生機能を改善するための組成物であって、植物抽出物は、全カテキン含有量について富化される組成物。
2. 組成物中の植物抽出物の治療有効量が、ヒト等価投薬量に基づいて、少なくとも約５００．０ｍｇ／ｋｇ以上の量である、請求項１に記載の組成物。
3. 組成物中の植物抽出物の治療有効量が、ヒト等価投与量に基づいて、約５００．０ｍｇ／ｋｇ～約２０００．０ｍｇ／ｋｇの量である、請求項２に記載の組成物。
4. 組成物中の植物抽出物の治療有効量が、ヒト等価投与量に基づいて、約１０００．０ｍｇ／ｋｇ～約２０００．０ｍｇ／ｋｇの量である、請求項３に記載の組成物。
5. 植物抽出物が、抽出物の全重量に基づいて、少なくとも約１５．００重量％の全カテキン含有量に標準化される、請求項１に記載の組成物。
6. 組成物が、関節の剛性及び不快感を有する哺乳動物におけるシクロオキシゲナーゼ及び５－リポキシゲナーゼ媒介性炎症を改善する、請求項１に記載の組成物。
7. 植物抽出物が、全ポリフェノール含量についてさらに濃縮される、請求項１に記載の組成物。
8. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
9. 組成物が栄養補助食品である、請求項１に記載の組成物。
10. Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｓ Ｌの種皮の植物抽出物を含む治療有効量の組成物を投与することを含む、それを必要とする哺乳動物における関節の剛性及び不快感を低減するための方法であって、植物抽出物は全カテキン含有量について富化される方法。
11. Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌの種皮の植物抽出物を含む組成物であって、植物抽出物は、哺乳動物における関節の剛性及び不快感を低減させる治療に使用するために全カテキン含有量について富化される、組成物。
12. 植物抽出物が、抽出物の全重量に基づいて、少なくとも約１５．００重量％の全カテキン含有量に標準化される、請求項１０に記載の方法。
13. 植物抽出物が、全ポリフェノール含量についてさらに富化される、請求項１０に記載の方法。
14. 方法が、関節の剛性及び不快感を有する哺乳動物におけるシクロオキシゲナーゼ及び５－リポキシゲナーゼ媒介性炎症を改善する、請求項１０に記載の方法。
15. Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌの種皮の植物抽出物を含む治療有効量の組成物を投与することを含む、それを必要とする哺乳動物における軟骨再構築又は再生機能を改善するための方法であって、植物抽出物は全カテキン含有量に対して富化される方法。
16. Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｅ Ｌの種皮の植物抽出物を含む組成物であって、植物抽出物は、哺乳動物における軟骨の再構築又は再生機能の改善に使用するための全カテキン含有量について富化される組成物。
17. 植物抽出物が、抽出物の全重量に基づいて、少なくとも約１５．００重量％の全カテキン含有量に標準化される、請求項１５に記載の方法。
18. 植物抽出物が、全ポリフェノール含量についてさらに富化される、請求項１５に記載の方法。
19. 方法が、軟骨の再構築又は再生機能を必要とする哺乳動物におけるシクロオキシゲナーゼ及び５－リポキシゲナーゼ媒介性炎症を改善する、請求項１５に記載の方法。
20. Ａｎａｃａｒｄｉｕｍ ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｓ Ｌの種皮の植物抽出物を含む組成物であって、植物抽出物は、哺乳動物における関節の剛性及び不快感を低減させる処置、ならびに／又は哺乳動物における軟骨の再構築若しくは再生機能の改善に使用するために、全カテキン含有量について富化される組成物。

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