CN115484835A - 用于关节健康的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于维持骨骼结构、软骨结构或两者，最小化骨重吸收，防止软骨退变，增加骨密度，通过保护软骨完整性促进健康的关节，减少影响骨骼健康、软骨健康或两者的酶的作用，改善关节运动或功能，减轻关节疼痛，减轻关节不适，减轻关节疼痛和不适，减轻关节僵硬，改善关节的活动范围或灵活性，促进移动性等等的组合物和方法，其中所述组合物包含治疗有效量的腰果(Anacardium occidentale L)种皮的植物提取物，其中所述植物提取物富含总儿茶素含量。

Description

用于关节健康的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年5月7日提交的美国申请第63/021,406号以及于2021年3月26日提交的美国申请第63/166,458号的优先权，所述美国申请的内容以引用的方式并入本文。
背景技术
发明领域.本发明总体上涉及一种植物提取物或包含其的组合物，所述植物提取物可以调节关节炎症、关节疼痛、关节僵硬、软骨退变，或改善活动度、活动范围、灵活性、关节物理功能或其任何组合。本发明还可以任选地与其他关节管理剂如钙、镁、锌、硼、维生素D、维生素K、葡萄糖胺和/或软骨素化合物、非类固醇抗炎剂/止痛剂、COX/LOX抑制剂、葡萄糖胺化合物、神经性疼痛缓解剂等组合使用。
类风湿性关节炎(‘RA’)是最常见的慢性自身免疫性疾病之一。其早期阶段包括滑膜关节局部肿胀和僵硬，之后发展为慢性多系统疾病。滑膜组织的细胞构成和由于炎症反应引起的关节损伤都增加是RA的病理学特征。RA的关键炎性级联涉及促炎性细胞因子如白介素-6(‘IL-6’)和肿瘤坏死因子α(‘TNF-α’)的全身过度产生和表达，从而加速骨/关节并发症。RA的滑膜炎症会全身扩散，并无声地转化为慢性炎症，表现为细胞因子释放(例如IL-1β、IL-6和IL-18)增加和异常高水平的急性反应蛋白(‘ARP’)如C反应蛋白(‘CRP’)，从而导致持续炎症和关节损伤。
因此，RA的病理非常复杂，并且RA的基础病因仍然未知。出现了软骨和骨骼的破坏性变化，以及限制关节活动的骨生长。关节炎可以导致严重残疾，并最终影响一个人进行日常工作的能力，限制生活质量，并导致过早死亡。身体的任何部位都可能因关节炎而发炎或疼痛。它是最常见的炎性病症之一，影响着全球成年人口的约0.5-1.0％，受影响的女性是男性的三倍。
虽然目前可用的治疗已经提高了效率，但非类固醇抗炎药(NSAID)如吲哚美辛；改善疾病的抗类风湿药物(DMARD)如甲氨蝶呤、柳氮磺胺、来氟米特和羟氯喹以及皮质类固醇如泼尼松龙和甲泼尼松龙的使用与若干种不良反应相关联。因此，肌肉骨骼病症患者一直在寻找缓解症状的替代方法。
花生四烯酸及其代谢物是炎症的重要媒介。花生四烯酸(‘AA’)是膜磷脂的组分，其代谢物形成的速率限制步骤取决于磷脂酶激活介导其从细胞膜磷脂池释放。在关节炎中，磷脂酶A2(‘PLA2’)活性增加，已经报告了包括TNF-α和IL-1在内的细胞因子会刺激PLA2的活性。在其释放之后，AA可以通过两种途径之一代谢：通过环氧合酶(‘COX’)产生类二十烷酸如前列腺素(‘PGE2’)、前列环素和血栓素，或者它可以通过5-脂氧合酶(‘5-LOX’)代谢而产生白三烯和脂氧素。这些类二十烷酸充当细胞内信使，在疼痛和炎症反应的信号转导调控中起重要作用。图1提供了花生四烯酸代谢途径的说明。
环氧合酶是一种前列腺素类合成酶，也称为前列腺素-内过氧化物合成酶(PTGS，EC 1.14.99.1)，它是一种负责被称为前列腺素类的重要生物媒介，包括前列腺素、前列环素和血栓素的形成的酶。COX是从花生四烯酸到前列腺素的生物合成途径中的中心酶。有两种已知同工酶，即COX-1和COX-2。COX-1表示负责产生涉及如保护胃粘膜和维持肾脏灌注等生理功能的前列腺素的组成型同种型。COX-2在正常条件下在大部分细胞中不表达，但在炎症过程中水平升高。COX-2是发炎组织中占主导地位的同工酶，其诱导可以通过若干种促炎性细胞因子，包括白介素-1(‘IL-1’)和肿瘤坏死因子(‘TNF-α’)来促进。非类固醇抗炎药(NSAID)对COX的药理抑制可以缓解炎症和疼痛症状。
因此，为了防止不必要的副作用，选择性地抑制COX-2的镇痛和抗炎作用而不影响由COX-1形成的前列腺素控制的重要生理过程似乎是可行的。然而，有报告称COX-2作为组成型同工酶在维持肾脏血流量和肾小球滤过率方面的协同作用表明其选择性抑制可能导致一些不良作用。受试者们在临床试验中经历了这些作用，其中选择性COX-2抑制剂(例如塞来昔布和罗非昔布)对骨关节炎和类风湿性关节炎疼痛的功效与传统的NSAID相似，具有更好的胃耐受性，在肾脏副作用方面与NSAID相当。因此，有理由假设有一种强得足以抑制这些同工酶又适中得足以避免不必要的不良后果，而不是完全选择性地抑制任一种酶的化合物。
还发现COX-2的表达增加及其产物PGE2的合成与MMP-9的诱导密切相关，MMP-9在癌症、心血管疾病和炎症中起关键作用。因此，抑制COX-2酶可以调控MMP-9的表达和活性，从而可以调节癌细胞浸润和迁移，防止或延迟动脉粥样硬化进展和稳定斑块，调控巨噬细胞蛋白酶表达，预防慢性牙周炎和牙龈炎，控制肝脏疾病重构等。
花生四烯酸(‘AA’)代谢途径的另一段是通过5-脂氧合酶(‘5-LOX’)途径，其中从LTA4衍生的白三烯(LTB4、LTC4、LTD4和LTE4)是最终生物活性代谢物。已知脂氧合酶途径在类风湿性关节炎(‘RA’)炎性过程中很重要，而且RA患者的滑膜液含有大量白三烯。例如，5-LOX存在于RA和OA滑膜中，其中5-LOX主要在内膜和亚内膜巨噬细胞、中性粒细胞和肥大细胞中表达。该途径的另一个组成部分LTB4是5-LOX的下游产物，是一种有效的促炎性趋化剂，已经被认为是RA中关节炎症的重要媒介。RA患者血清中的LTB4水平高于非活动性关节炎患者或正常受试者。尽管在大鼠模型中发现5-LOX酶的特异性抑制剂来自Pfizer的PF-4191834能减轻关节炎相关的疼痛和炎症，但5-LOX调节剂的单一治疗方式似乎还不足。
优选地，抗炎产品涵盖对花生四烯酸(‘AA’)代谢的两种主要代谢途径的抑制，具有广泛的抗炎活性，同时还具有更好的安全性。
另一种用作细胞因子并由免疫细胞分泌的炎症媒介是高迁移群Box 1蛋白(‘HMGB1’)，也称为高迁移群蛋白1(‘HMG-1’)和两性蛋白。HMGB1是一种在人类体内由HMGB1基因编码的蛋白质。和组蛋白一样，HMGB1是最重要的染色质蛋白之一。HMGB1是一种30kDa细胞核和胞质蛋白，是一种自衍生免疫激活剂，在调节免疫力和炎症方面具有多种功能。
在炎症和损伤时，HMGB1可以通过先天免疫细胞如巨噬细胞、单核细胞和树突状细胞主动释放。例如，巨噬细胞和单核细胞响应外源性细菌内毒素(例如脂多糖或LPS)或内源性促炎细胞因子(如肿瘤坏死因子(‘TNF-α’)、白介素-1β(‘IL-1β’)和干扰素γ(‘IFN-γ’)的刺激，以时间和剂量依赖性方式主动释放HMGB1。
HMGB1还可以通过坏死或受损细胞被动释放，并可以通过将伤害传递给邻近的免疫细胞来诱导炎症反应，从而使先天免疫细胞既能响应损伤又能进一步诱导炎症。HMGB1蛋白通过晚期糖基化终末产物受体(‘RAGE’)和/或Toll样受体(TLR-2/4)触发细胞内信号传导，进而激活各种信号传导途径，如丝裂原激活蛋白激酶(‘MARK’)途径以及随后的活化B细胞核因子κ-轻链增强子(‘NF-κB’)介导的炎症，从而导致各种白细胞粘附分子、促炎性细胞因子和趋化因子的表达。
HMGB1在炎性活性中起重要作用，并参与广泛的免疫反应。HMGB1诱导树突状细胞(‘DC’)成熟和迁移，以及激活这些细胞和单核细胞产生促炎性细胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6和巨噬细胞炎性蛋白1(‘MIP-1’)。HMGB1还充当单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞的趋化因子，以维持炎症并引发先天免疫反应。
HMGB1被视为危险信号的一个典型实例，它起源于自身受损而不是病原体入侵。HMGB1通过细胞因子的释放介导先天受体的激活，导致炎性反应的扩增，而细胞因子的释放又诱导额外的HMGB1释放，从而进一步促进这些媒介的诱导。已知促炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β和IFN-γ介导炎症的早期阶段，而HMGB1则被视为脓毒症和组织损伤的晚期阶段决定者。
靶向HMGB1可能是炎性疾病治疗干预的一种实用方法，因为它已经被确定为许多疾病，包括脓毒症、关节炎、癌症和糖尿病的发病机制中的关键媒介。例如，已经发现HMGB1水平在以下情况下有所升高：(1)类风湿性关节炎患者的滑膜液，(2)没有存活下来的脓毒症患者与存活的患者相比，(3)实体瘤浸润和转移，(4)糖尿病及其并发症。
因此，已经研究了许多药理学制剂抑制HMGB1释放或HMGB1活性的潜力(参见图2)。这些包括传统的草药，如冬归或当归(“雌参”，Angelica sinensis)、绿茶(Camelliasisensis)和丹参(“红鼠尾草”或“中国鼠尾草”，Saliva miltorrhiza)的水性提取物，已经发现它们能抑制内毒素诱导的HMGB1释放，以及保护动物免受实验性脓毒症影响。科学研究已经证明，这些草药提取物有很强的抗炎和抗关节炎作用。已经分离出多种植物化学物质，包括多糖、酚酸、苯丙素酯、三萜苷、苯酞、类黄酮、三萜皂苷、二萜和三萜，并证明它们负责草药的生物作用。
因此，植物医学在这些疾病中的大部分的管理中起重要作用，植物是天然抗氧化剂的潜在来源。研究表明，摄入茶、草药、水果和蔬菜中发现的多酚化合物与这些疾病的低风险相关联。因此，对表现出抗炎活性的植物和作为潜在治疗剂的促健康植物成分的研究兴趣日益浓厚。药用植物可以提供长时间暴露可能有毒的化学抗氧化剂的安全、成本有效、生态的替代物。
腰果树(Anacardium occidentale Linn)原产于亚马逊，随后被移植到印度、东非和其他国家进行种植。这种树会结出非常奇特的果子或果实，呈膨大的花梗形式。外形上，在该花梗的末端，腰果生长在它自己灰色的肾形硬壳中。这种壳有一层柔软坚韧的外皮和一层薄而硬的内皮，称为果皮或种皮，它包裹着果仁。这两层皮之间是含有腰果壳液的蜂窝状结构。这种液体包含漆树酸、腰果酚和强心酚，以及其他成分。漆树酸是水杨酸，而腰果酚和强心酚是取代酚。
已经对这种果实的不同部位的用途进行了研究。除了作为可食用的食物以外，腰果的汁液可用于饮料，而果实提取物已经显示出在体重管理方面的益处。已经提取腰果壳液用于各种工业和农业应用，包括摩擦衬里、油漆、层压树脂、橡胶复合树脂、腰果水泥、聚氨酯类聚合物、表面活性剂、环氧树脂、铸造化学品、化学中间体、杀昆虫剂和杀真菌剂。腰果种皮已经用于制革材料。
如上所述，需要具有抗炎活性的有效、无毒、天然化合物。更具体地，需要具有关节炎症、关节疼痛、关节僵硬、软骨退变调节功效的有效、无毒、天然化合物。本发明提供了一种这样的解决方案。
发明内容
简而言之，本公开针对可用于关节健康管理的标准化植物提取物和含有那些提取物的组合物，以及改善关节健康的相关方法。
更具体地，本文提供了一种包含儿茶素的植物提取物组合物，其中所述提取物已经标准化至以所述提取物的总重量计为约15.0重量％或更高的总儿茶素含量。所述植物提取物组合物由于其抗炎活性而表现出促进关节健康，并包含来自腰果属的至少一种提取物。优选地，所述植物提取物是来自腰果的至少一种提取物。更优选地，所述植物提取物至少来自腰果果实的种皮。
在一个实施方式中，本发明针对腰果果实的种皮提取物，基于所述提取物的总重量，所述提取物包含约15.0重量％或更高的总儿茶素。
在另一个实施方式中，本发明提供了一种用于在有需要的哺乳动物中减轻关节僵硬和不适的组合物，所述组合物包含治疗有效量的腰果种皮的植物提取物，其中所述植物提取物富含总儿茶素含量。所述植物提取物还可以富含总多酚。
在一个实施方式中，基于人类等效剂量，用于在有需要的哺乳动物中减轻关节僵硬和不适的组合物中植物提取物的治疗有效量可以是至少约500.0mg/kg或更大的量。在另一个实施方式中，基于人类等效剂量，所述组合物中的植物提取物的治疗有效量是约500.0mg/kg至约2000.0mg/kg的量。在另一个实施方式中，基于人类等效剂量，所述组合物中的植物提取物的治疗有效量是约1000.0mg/kg至约2000.0mg/kg的量。
在一个实施方式中，将用于在有需要的哺乳动物中减轻关节僵硬和不适的组合物中的植物提取物标准化至以所述提取物的总重量计为至少约15.00重量％的总儿茶素含量。
在一个实施方式中，用于在有需要的哺乳动物中减轻关节僵硬和不适的组合物减轻了患有关节僵硬和不适的哺乳动物中的环氧合酶和5-脂氧合酶介导的炎症。
在一个实施方式中，用于在有需要的哺乳动物中减轻关节僵硬和不适的组合物还包含药物载体。
用于在有需要的哺乳动物中减轻关节僵硬和不适的组合物可以是膳食补充剂。
在另一个方面，本发明提供了一种用于在有需要的哺乳动物中改善软骨重建或更新功能的组合物，所述组合物包含治疗有效量的腰果种皮的植物提取物，其中所述植物提取物富含总儿茶素含量。
基于人类等效剂量，用于在有需要的哺乳动物中改善软骨重建或更新功能的组合物中植物提取物的治疗有效量可以是至少约500.0mg/kg或更大的量。优选地，基于人类等效剂量，所述组合物中的植物提取物的治疗有效量是约500.0mg/kg至约2000.0mg/kg的量。更优选地，基于人类等效剂量，所述组合物中的植物提取物的治疗有效量是约1000.0mg/kg至约2000.0mg/kg的量。
在另一个实施方式中，将用于在有需要的哺乳动物中改善软骨重建或更新功能的组合物中的植物提取物标准化至以所述提取物的总重量计为至少约15.00重量％的总儿茶素含量。
在一个实施方式中，用于在有需要的哺乳动物中改善软骨重建或更新功能的组合物减轻了需要软骨重建或更新功能的哺乳动物的环氧合酶和5-脂氧合酶介导的炎症。
用于在有需要的哺乳动物中改善软骨重建或更新功能的组合物还可以包含药学上可接受的载体。
此外，用于在有需要的哺乳动物中改善软骨重建或更新功能的组合物可以是膳食补充剂。
在另一个方面，提供了一种在有需要的哺乳动物中减轻关节僵硬和不适的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含腰果种皮的植物提取物的组合物，其中所述植物提取物富含总儿茶素含量。
在一个方面，将用于在有需要的哺乳动物中减轻关节僵硬和不适的方法中的植物提取物标准化至以所述提取物的总重量计为至少约15.00重量％的总儿茶素含量。所述植物提取物还可以富含总多酚。
在一个方面，用于在有需要的哺乳动物中减轻关节僵硬和不适的方法减轻了患有关节僵硬和不适的哺乳动物中的环氧合酶和5-脂氧合酶介导的炎症。
在另一个实施方式中，提供了一种在有需要的哺乳动物中改善软骨重建或更新功能的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含腰果种皮的植物提取物的组合物，其中所述植物提取物富含总儿茶素含量。所述植物提取物还富含总多酚。
可以将用于在有需要的哺乳动物中改善软骨重建或更新功能的方法中的植物提取物标准化至以所述提取物的总重量计为至少约15.00重量％的总儿茶素含量。
在一个方面，在有需要的哺乳动物中改善软骨重建或更新功能的方法减轻了需要软骨重建或更新功能的哺乳动物的环氧合酶和5-脂氧合酶介导的炎症。
含有腰果种皮的植物提取物的组合物还可以包含药学上可接受的载体。此类组合物的非限制性实例包括膳食补充剂和局部组合物。
附图说明
图1A和图1B是花生酸代谢途径的一般说明。
图2是不同部位的HMGB1介导的促炎性反应的一般说明。
图3是腰果种皮提取物在275nm波长下在0分钟(开始)到20分钟的保留时间内的HPLC色谱图。
图4是腰果种皮提取物的LC/MS和LC/PDA(280和350nm波长)色谱图。
图5是说明使用不同浓度的腰果种皮提取物时的COX-1抑制百分比的图。
图6是说明使用不同浓度的腰果种皮提取物时的COX-2抑制百分比的图。
图7是说明使用不同浓度的腰果种皮提取物时的5-LOX抑制百分比的图。
图8是说明在室内氛围(21％O2)(‘RA’)、95％O2(‘O2’)无腰果种皮提取物、DMSO(‘媒剂’)、阳性对照物水杨酸钠(‘SS 2μM’)和95％O2有腰果种皮提取物(‘CT’)下检测巨噬细胞培养物上清液中的HMGB1(释放％)的条形图。
图9是说明所用软骨诱导型关节炎(‘CIA’)实验设计的流程图。
图10是说明各研究组从第9天到第21天的关节炎严重程度指数变化的图。
图11是说明各研究组的关节炎严重程度评分曲线下面积(‘AUC’)的条形图。
图12是说明各研究组从初免到第21天的足爪厚度变化的图。
图13是说明CIA模型中各研究组的大鼠足爪水肿曲线下面积的条形图。
图14是说明CIA模型中各研究组从初免到第21天的作为关节炎严重程度度量的大鼠踝直径变化的图。
图15是说明CIA模型中各研究组的大鼠踝直径曲线下面积的条形图。
图16是说明CIA模型中从初免到第21天各研究组中大鼠的疼痛敏感性反应的图。
图17是说明CIA模型中各研究组从初免到第21天的压缩阈值变化百分比(测量为疼痛敏感性提高百分比)的条形图。
图18是说明未标准化的尿液CTX-II原始数据的条形图。
图19是说明标准化至总蛋白的尿液CTX-II的条形图。
图20是说明标准化至尿液中肌酐浓度的尿液CTX-II的条形图。
图21是说明CIA模型中模型诱导后3周时各研究组的血清IL-1β的条形图。
图22是说明CIA模型中模型诱导后3周时各研究组的血清TNF-α的条形图。
图23是说明CIA模型中模型诱导后3周时各研究组的血清PIIANP的条形图。
图24是说明CIA模型中模型诱导后3周时各研究组的血清MMP-13的条形图。
图25是说明各研究组的CIA大鼠踝关节的组织病理学结果的四个条形图，(A)软骨破坏，(B)骨骼侵蚀，(C)炎症，(D)基质完整性/GAG损失。
图26是各研究组的踝关节切片的苏木精、伊红和番红O-固绿染色。
具体实施方式
本发明基于惊讶地发现腰果(Anacardium occidentale Linn)的种皮中某些类黄酮含量非常高。特别地，已经发现腰果种皮的提取物包含主要组分儿茶素和表儿茶素，以及原花青素。本文的数据表明腰果种皮提取物可能具有抗炎应用。
本发明的其他方面涉及使用本公开的组合物的方法，如用于维持骨结构、软骨结构或两者，最小化骨重吸收，防止软骨退变，增加骨密度，通过保护软骨完整性来促进健康的关节，减少影响骨健康、软骨健康或两者的酶的作用，改善关节运动或功能，减轻关节疼痛，减轻关节不适，减轻关节疼痛和不适，减轻关节僵硬，改善关节活动范围或灵活性，促进移动性等等。
在以下描述中，阐述了某些具体细节以便提供对本公开的各个实施方式的透彻理解。然而，本领域技术人员应理解，本发明可以在没有这些细节的情况下实践。
在本说明书中，除非另外指出，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围都将理解为包括所叙述的范围内的任何整数的值，并且在适当时，包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。而且，除非另外指示，否则本文关于任何物理特征如聚合物亚单位、尺寸或厚度叙述的任何数量范围都将理解为包括所叙述的范围内的任何整数。除非另外指出，否则如本文所用，术语“约”和“基本上由……组成”意指所指出的范围、值或结构±20％。如本文所用的术语“一个”和“一种”是指“一个(种)或多个(种)”所列举的组分。可选物(例如，“或”)的使用应理解为意指可选物之一、两者或其任何组合。除非上下文另有要求，否则贯穿本说明书和权利要求书，措辞“包含”及其变化形式以及同义术语如“包括”和“具有”及其变化形式将理解为开放式包括首尾的意义；即，“包括但不限于”。
贯穿本说明书，提及“一个实施方式”或“一实施方式”意指结合该实施方式描述的具体特征、结构或特性包括在本发明的至少一个实施方式中。因而，贯穿本说明书，在不同位置出现的短语“在一个实施方式中”或“在一实施方式中”未必都是指同一个实施方式。此外，在一个或多个实施方式中，具体的特征、结构或特性可以用任何合适的方式进行组合。
就本申请而言，术语“组合物”是指治疗、改善、促进、提高、管理、控制、维持、优化、调节、减轻、抑制或预防与天然状态、生物过程或疾病或病症相关联的特定状况的产品。例如，组合物在受试者中改善氧化抑制和/或减轻炎症等。术语组合物包括但不限于包括有效量的提取物、其至少一种组分或其混合物的药品(即药物)、非处方药(OTC)、化妆品、食品、食品成分或膳食补充剂组合物。示例性组合物包括霜剂、化妆用洗剂、面膜或粉剂，或作为乳液、洗剂、搽剂泡沫、片剂、膏剂、颗粒或软膏。组合物还可以包括饮料，例如加入有效量的提取物的饮料，或含有有效量的提取物的茶包。含有有效量的提取物的食品组合物的非限制性实例包括烘焙食品、蛋白粉、肉制品、乳制品和糖果。
如本文所用的“药物组合物”或“营养组合物”是指本公开的植物提取物和本领域通常接受用于递送生物活性提取物至哺乳动物，例如人类的介质的制剂。例如，本公开的药物组合物可以配制为或用作单独组合物，或者作为处方药、非处方(OTC)药、植物药、草药、顺式治疗剂、功能食品或由政府机构审查和批准的任何其他形式的卫生保健产品中的组分。本公开的示例性营养组合物可以配制为或用作单独组合物，或者作为食品、新食品、功能食品、饮料、棒、食品调味剂、食品添加剂、医学食品、膳食补充剂或草药产品中的营养或生物活性组分。本领域通常接受的介质包括所有药学上或营养上可接受的载体、稀释剂或其赋形剂。
如本文所用，术语“提取物”或“植物提取物”是指包括至少腰果属植物(例如Anacardium humile、Anacardium othonianum、Anacardium giganteum、Anacardiumnanum、Anacardium negrense和/或腰果(Anacardium occidentale))，优选腰果(Anacardium occidentale L)的物质的一种或多种活性成分的固体、半流体或液体物质或制剂，。优选地，所述活性成分源自于腰果种皮的提取物。所述提取物是使用溶剂如水、1至4个碳原子的低级醇(例如甲醇、乙醇、丁醇等)、乙烯、丙酮、己烷、醚、三氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺(‘DMF’)、二甲亚砜(‘DMSO’)、1,3-丁二醇、丙二醇及其组合来制备，但也可以使用粗提取物在此类溶剂中的级分来制备。可以采用任何提取方法，只要它确保所述活性成分的提取和保存即可。
如本文所用，“富含”是指植物提取物或其他制剂中一种或多种活性化合物的量或活性与进行提取或其他制备前在植物原材料或其他来源的重量中发现的一种或多种活性化合物的量或活性相比增加至少两倍。在某些实施方式中，进行提取或其他制备前植物材料或其他来源的重量可以是干重、湿重或其组合。
如本文所用，术语纯化合物、组合物、提取物、提取物混合物、提取物组分和/或活性剂或成分或其组合的“有效量”或“治疗有效量”是指在剂量和时间周期上足以有效实现所期望的结果的量。更具体地，“有效量”或“治疗有效量”是指本公开的提取物或含有所述提取物的组合物在施用至哺乳动物如人类时足以实现治疗的量，所述治疗包括以下任一项或多项：(1)治疗或预防哺乳动物的骨骼和软骨损失；(2)促进骨骼和软骨健康；(3)抑制哺乳动物的骨骼和软骨损失；(4)增加哺乳动物的骨密度；(5)治疗或预防哺乳动物的骨质疏松；(6)调节哺乳动物的骨骼和软骨炎症；(7)保护骨骼和软骨完整性；(8)减轻关节僵硬和不适。本公开的化合物或组合物的构成“治疗有效量”的量取决于主要活性成分的量、所治疗的状况及其严重程度、施用方式、治疗持续时间或欲治疗的受试者的体重和年龄而变化，但是可以由本领域普通技术人员根据其自身的知识和本公开来决定。
术语“药学上可接受”意指那些药物、药剂、提取物或惰性成分适合与人类和较低等动物接触使用而没有过度毒性、不相容性、不稳定性、刺激性等，并与合理的利益/风险比相称。
术语“施用”定义为通过本领域已知的途径，包括但不限于静脉内、动脉内、口服、肠胃外、颊、局部、透皮、直肠、肌肉内、皮下、骨内、透粘膜或腹膜内施用途径将组合物提供给受试者。在优选实施方式中，施用组合物的口服途径是合适的。
如本文所用，术语“受试者”或“个体”包括可能向其施用组合物的哺乳动物。“哺乳动物”的非限制性实例包括人类、非人类灵长动物、犬科动物、猫科动物、马科动物、牛科动物、啮齿动物(包括转基因和非转基因小鼠)等。在一些实施方式中，所述受试者是非人类哺乳动物，而在一些实施方式中，所述受试者是人。
如本文所用，术语“载体”是指有助于维持一种或多种植物提取物处于可溶性均质状态并且呈适合施用的形式的组合物，它无毒并且不以有害方式与其他组分相互作用。
如本文所用，“补充剂”是指改善、促进、支持、提高、调控、管理、控制、维持、优化、调节、减轻、抑制或预防与天然状态或生物过程相关联的具体状况、结构或功能的产品(即，并非用于诊断、治疗、缓解、治愈或预防疾病)。在某些实施方式中，补充剂是膳食补充剂。例如，就骨骼和软骨健康相关状况而言，膳食补充剂可用于保持骨骼和软骨完整性、最小化骨重吸收、最小化软骨退变、通过保护骨骼和软骨完整性来促进健康的骨骼和软骨、减少影响骨骼和软骨健康的酶的作用、改善骨质疏松状况、支持骨骼重建、减轻疼痛、减轻不适、减轻僵硬、改善活动范围、改善灵活性、促进移动性等等。在某些实施方式中，膳食补充剂是膳食、食品或二者的专用类别，而不是药物。
除非另外指出，否则贯穿本公开叙述的所有比例和百分比都以重量计。
在某些实施方式中，本公开的化合物和组合物(例如，药物组合物、营养组合物)可以以足以实现以下各项的量施用：促进骨骼健康；改善骨骼健康；维持骨骼健康；治疗或管理骨骼病症；支持骨骼健康；支持正常和舒适的运动范围和/或灵活性；改善运动范围和/或灵活性；减少破坏骨骼的有害酶的作用；改变影响骨骼吸收的酶的作用；改善移动与正常骨骼功能；改善物理移动性；管理和/或维持物理移动性；减轻由于骨损失导致的疼痛和/或僵硬；改善物理功能；促进或增强灵活性和舒适移动；促进健康骨骼功能和舒适；缓解骨骼不适；缓解由锻炼、工作、用力过度或其任何组合造成的骨骼不适；通过保护软骨完整性促进健康的骨骼；维持关节软骨；支持关节软骨；治疗、预防或管理软骨退变；最小化软骨退变；通过保持用于关节润滑的滑膜液来促进关节健康或舒适；支持关节稳定性和关节灵活性；恢复关节和促进移动性；促进灵活的关节和强壮的软骨；维持流到关节的稳定血流量以支持增强灵活性和/或强度；在锻炼、工作、用力过度或其任何组合之后促进关节舒适和广泛的活动范围；或本文所述的任何其他相关适应症，以及通常对患者具有可接受的毒性。
本发明提供了一种表现出抗炎活性并因此促进关节健康的植物提取物。更特别地，本发明针对来自于腰果属的腰果种皮的植物提取物。如本文所示，已经发现这种植物提取物能减轻关节僵硬和不适，并改善关节功能。此外，根据本发明的植物提取物提供了基于μCTX-II减少的软骨保护和关节结构完整性的保护。根据本发明的植物提取物提供了改善的软骨重建或更新。最后，根据本发明的植物提取物似乎比葡萄糖胺/软骨素补充剂更有效地改善OA症状，抑制分解代谢途径，保护关节结构完整性，以及改善软骨重建或更新功能。
正如上文所述，根据本发明的有用关节健康植物提取物包括来自于腰果属的植物提取物。更特别地，所述提取物是选自Anacardium humile、Anacardium othonianum、Anacardium giganteum、Anacardium nanum、Anacardium negrense和/或腰果(Anacardiumoccidentale)的一个或多个物种的植物提取物。优选地，所述植物提取物来自于腰果(Anacardium occidentale L)物种。在一个实施方式中，所述植物提取物来自于腰果(Anacardium occidentale L)物种的种皮。
根据本发明的关节健康组合物可以包括能作为活性成分起作用的一种或多种化合物。所述化合物可能是所述植物提取物的组分。例如，所述化合物可以是获得所述植物提取物的植物中存在的植物化学成分。所述化合物可能至少部分负责表现出抗炎活性。所述化合物可以是能够促进关节健康的任何化合物。在一个实施方式中，所述化合物选自植物化学成分儿茶素、表儿茶素和/或原花青素(例如A、B、三聚体、四聚体)。
通常，植物的一个或多个部位可用于生产植物提取物，包括但不限于根、茎、叶、花、果实、种子和种子的种皮。在本发明中，至少使用种子的种皮(单独或与其他植物部位一起)来生产植物提取物。来自于腰果属植物的种皮可以从不同的来源商购。腰果种皮的提取物可以使用任何合适的提取技术获得。
就此而言，可以收集并粉碎植物的一个或多个部位，特别是植物的种皮。此后，可以使用合适的溶剂提取粉碎的材料。可以在浓缩步骤中除去溶剂。例如，可以对所提取的材料进行过筛或过滤，以产生上清液和滤饼。可以压榨滤饼以除去显著部分的液体，所述液体可以加入到上清液中。然后可以对滤饼进行脱水并用作纤维来源。可以蒸馏上清液以除去溶剂或其一部分，以形成植物提取物液体浓缩物。除去的溶剂可以循环利用。可以干燥(例如通过喷雾干燥)浓缩物以提供干燥的植物提取物。可以如本文所述对这种干燥的植物提取物进行测定和/或标准化。优选地，干燥的植物提取物源自于腰果(Anacardiumoccidentale)，特别是腰果(Anacardium occidentale L)植物的种皮。
适合用于提取工艺的溶剂包括水、醇或其混合物。示例性醇溶剂包括但不限于C1-C7醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和丁醇)、水醇或醇与水的混合物(例如水乙醇)、多元醇(例如丙二醇和丁二醇)和脂肪醇。这些醇溶剂中的任一种都可以以混合物的形式使用。在一个实施方式中，使用乙醇、水或其组合(例如约70％乙醇与约30％水的混合物)来提取所述植物提取物。在另一个实施方式中，仅使用水来提取所述植物提取物。
在一个实施方式中，可以使用有机溶剂提取技术来获得所述植物提取物。在另一个实施方式中，可以使用溶剂顺序分级来获得所述植物提取物。还可以使用全水乙醇提取技术来获得所述植物提取物。通常，这被称为一次性提取。
还可以使用全乙醇提取。这种技术使用乙醇作为溶剂。这种提取技术可以产生具有脂溶性和/或亲脂性化合物以及水溶性化合物的植物提取物。
可用于获得所述植物提取物的提取技术的另一个实例是超临界流体二氧化碳提取(‘SFE’)。在这种提取程序中，欲提取的材料可以不暴露于任何有机溶剂。相反，可以使用超临界状态(>31.3℃和>73.8巴)的二氧化碳作为提取溶剂(有或无改性剂)。本领域技术人员会认识到，可以改变温度和压力条件以获得提取物的最佳产率。与全己烷和乙酸乙酯提取技术相似，这种技术可以产生脂溶性和/或亲脂性化合物的提取物。
所述过程中产生的植物提取物可以包括所提取的材料中存在的多种植物化学成分。所述植物化学成分可以是脂溶性或水溶性的。收集提取物溶液后，可以蒸发溶剂，得到所述提取物。所述植物提取物可以标准化至规定量的特定化合物。例如，所述植物提取物可以标准化至规定量的活性成分或植物化学成分。在一个实施方式中，所述植物提取物标准化至以所述提取物的总重量计约15.0重量％或更高的儿茶素含量。
所述关节健康组合物中存在的植物提取物的量可以取决于若干种因素，包括所期望的炎症抑制水平、特定植物提取物或其组分的炎症抑制水平和其他因素。优选地，所述植物提取物以所述组合物的总重量计占约0.005重量％或更高，例如约0.005重量％至约50.00重量％的量存在。
所述关节健康组合物可以包括一种或多种可接受的载体。所述载体可以有助于将所述植物提取物并入具有适合施用给受试者的形式的抗炎组合物中。本领域已知许多可接受的载体，并且所述载体可以是任何合适的载体。所述载体优选地适合施用给动物，包括人类，并且能够作为载体起作用而基本上不影响所述植物提取物和/或任何活性成分的所期望的活性。所述载体可以基于所述组合物的所期望施用途径和剂型进行选择。
合适的剂型包括液体和固体形式。在一个实施方式中，所述组合物呈凝胶、糖浆、浆液或悬液形式。在另一个实施方式中，所述组合物呈液体剂型，如口服液(drink shot)或液体浓缩物。在另一个实施方式中，所述组合物以固体剂型如片剂、丸剂、胶囊、糖衣丸剂或粉剂存在。当呈液体或固体剂型时，所述组合物可以呈适合并入食品中以备递送的食品递送形式。适合用于固体形式(特别是片剂和胶囊形式)的载体的实例包括但不限于有机和无机惰性载体材料如明胶、淀粉、硬脂酸镁、滑石、树胶、二氧化硅、硬脂酸、纤维素等。所述载体可以是基本上惰性的。
作为实例，硅化微晶纤维素可用作载体或粘合剂。硅化微晶纤维素是微晶纤维素和胶体二氧化硅的物理混合物。一种此类合适形式的硅化微晶纤维素是可从新泽西州帕特森市的彭维斯特制药公司获得的ProSolv
Figure BDA0003922690130000191
90。二氧化硅以及由硅化微晶纤维素提供的可以加入所述组合物作为加工助剂。例如，可以包括二氧化硅作为助流剂，以在制造固体剂量单位如片剂时在压片过程中改善粉末的流动性。
在另一个实施方式中，所述载体至少是功能性载体如荞麦或斯佩耳特小麦。通过在所述组合物中加入功能性载体，可以提供额外的益处，如与标准载体如上文提到的那些相比更低的血糖生成指数。此外，功能性载体可以是无过敏原的(例如荞麦)，并且通过将它们加入生产过程中，本发明的植物提取物可能受益于这些功能性载体的类黄酮如芸香苷和槲皮苷。此外，这些功能性载体的高纤维含量还可以促进和调控肠道通过。最后，在斯佩耳特小麦中发现的硒的附加矿物质益处可能有助于代谢。
所述抗炎组合物可以包括其他惰性成分如润滑剂和/或助流剂。润滑剂有助于在制造过程中如从模具脱模过程中对片剂进行处理。助流剂改善了压片过程中的粉末流动性。硬脂酸是可接受的润滑剂/助流剂的实例。
所述抗炎组合物可以制造成固体剂型如片剂和胶囊。这种形式提供了可以由个体容易地运输到进餐场所如餐厅，并在摄入食物之前、过程中或之后服用的产品。所述组合物可以配制成含有适量植物提取物和/或活性成分的剂量单位，从而允许个体根据适当的参数如体重、食物量或碳水化合物(例如糖)含量来确定要服用的单位的适当数量。
在其他实施方式中，根据本公开的组合物包含富含含儿茶素、表儿茶素或其组合的黄烷的腰果属提取物。在某些实施方式中，腰果属提取物中的主要活性成分包含含儿茶素、表儿茶素或其组合的黄烷，其中所述提取物富含来自种皮的这些活性成分。
在一个实施方式中，所述植物提取物以治疗有效量如约500.0mg/kg或更高、优选约500.0mg/kg至约2000.0mg/kg、更优选约1000.0mg/kg至约2000.0mg/kg的量存在于所述组合物中。对于人类等效剂量，所述组合物可以例如以每天约500.00mg/kg至约2000.0mg/kg所述植物提取物的剂量施用。所述组合物可以作为单剂或以多剂施用。在一个实例中，所述化合物每天施用至多三剂。例如，所述化合物可以在餐前、餐中或餐后施用。在一个实施方式中，所述组合物是具有抗炎性质的膳食补充剂，含有治疗有效量的腰果种皮提取物。
可以选择剂量以在单个单位中提供可能对一些个体和/或一些食品有效的抑制作用水平，同时还允许相对简单的剂量增加以提供可能对其他个体和/或其他食品有效的其他抑制作用水平。
所述抑制组合物可以呈适于口服摄入的形式。这种形式可以配置为旨在提供规定剂量的植物提取物的单一剂型。例如，所述单一剂型可以是粉剂、丸剂、片剂、胶囊或口服液。对于人类等效剂量，所述单一剂型可以包括例如约500.0mg/kg至约2000.0mg/kg植物提取物。
实施例
实施例–材料和化学剖析
实施例1–原料(提取前)腰果种皮材料的总儿茶素(黄烷醇)和多酚定量
通过HPLC对黄烷醇进行定量，结果提供在下表1中–
总儿茶素 儿茶素当量
儿茶素 43.4mg/g
表儿茶素 40.1mg/g
以重量百分比表示，以原材料的总重量计，腰果种皮原材料的总儿茶素含量是7.000％。
总多酚(花青素、黄烷醇、羟基肉桂酸和可溶性原花青素)可以通过福林-肖卡方法进行定量。没食子酸通常被认为是参考标准物选择，因此总多酚结果报告为没食子酸当量。
对没食子酸(1mg/mL)储备溶液进行连续稀释，用于生成标准曲线以供估算总多酚。将腰果种皮样品和没食子酸标准物单独与稀释的福林试剂(7％水溶液)一起加入96孔板，室温孵育10分钟，然后加入200g/L Na2CO3。摇匀后，将96孔板在40℃孵育20分钟，然后在755nm下通过分光光度法加以分析。
通过紫外可见光谱法在755nm波长下对总多酚进行定量。通过福林-肖卡方法对总多酚进行定量得到1420mg/g总多酚，以没食子酸当量(mg/g)表示。以重量百分比表示，以原材料的总重量计，腰果种皮原材料的总多酚含量是约25.000％。
实施例2–由腰果种皮制备70％乙醇提取物
将干燥的腰果种皮粉末(Anacardium occidentale L.)(60g)装入三个100ml不锈钢管中，并使用Thermo ScientificTMDionexTMASE 350加速溶剂提取器在80℃的温度和1500psi的压力下用含70％乙醇的DI水溶剂提取两次。过滤并收集提取物溶液。将所合并的乙醇提取物溶液用旋转蒸发仪在真空下蒸发，得到粗腰果种皮提取物。
提取结果提供在下表2中–
表2–腰果种皮的提取
Figure BDA0003922690130000221
实施例3–腰果种皮提取物的儿茶素定量
使用C18反相柱(
Figure BDA0003922690130000222
5μm C18(2)
Figure BDA0003922690130000223
LC柱250×4.6mm，可得自
Figure BDA0003922690130000224
美国加利福尼亚州托伦斯市)与带有光电二极管阵列检测器的日立高效液相色谱仪(‘HPLC/PDA’)来测定腰果种皮提取物中存在的游离儿茶素。对于流动相A来说，溶剂是含0.10％磷酸(‘H3PO4’)的水，对于流动相B来说，溶剂B是乙腈(‘ACN’)，其用于以1.0ml/min的流速洗脱，并使用275nm下的UV吸光度和35℃的柱温。所用的儿茶素参比标准物来自于西格玛奥德里奇公司。将所述参比标准物溶解在甲醇(‘MeOH’):0.1％H3PO4(1:1比率)中，儿茶素(C1251)浓度为0.5mg/ml，表儿茶素(E1753)浓度为0.1mg/ml。在容量瓶中在含50％MeOH的0.1％H3PO4中以2mg/ml制备测试样品，超声处理直至溶解(约10分钟)，然后冷却至室温，充分混合，并通过0.45μm尼龙注射式过滤器过滤。通过将20μl样品注入HPLC中进行HPLC分析。下表2提供了HPLC分析方法的梯度表–
表2–HPLC分析方法的梯度表
Figure BDA0003922690130000231
腰果种皮提取物中的HPLC儿茶素定量结果提供了以所述提取物的总重量计，对于15.52重量％的总儿茶素含量，儿茶素含量为9.40重量％，表儿茶素含量为6.12重量％。因此，腰果种皮提取物可以标准化至以所述提取物的总重量计约15.00重量％或更高的总儿茶素含量。腰果种皮提取物在275nm波长下的HPLC色谱图提供在图3中。如上面的实施例1所示，以原材料的总重量计，原料腰果种皮提取物的总儿茶素含量仅为约7.00重量％。因此，根据本发明的腰果种皮提取物富含一种或多种黄烷，特别是总儿茶素。在另一方面，腰果种皮提取物富含儿茶素和表儿茶素。
以提取物的总重量计，腰果种皮提取物中的总多酚为约55.00重量％。因此，根据本发明的腰果种皮提取物富含总多酚。
实施例4–腰果种皮提取物的化学剖析
使用超高压液相色谱(‘HPLC’)和质谱(
Figure BDA0003922690130000241
UPLC I类和
Figure BDA0003922690130000242
GS-XT-QTof系统，两者都可得自美国马萨诸塞州米尔福德市的沃特世公司)测定腰果种皮提取物中存在的类黄酮化合物。所用的柱是
Figure BDA0003922690130000243
UPLC HSS T3 2.1×100mm，1.8μm，柱温为40℃，样品温度为15℃。对于流动相来说，溶剂A是含10％乙腈(‘ACN’)的水(0.1％甲酸)，溶剂B是ACN。采集范围是100-1500道尔顿(‘Da’)，采集模式是电喷雾电离(‘ESI’)(-)。下表3提供了HPLC条件–
表3–用于分析腰果种皮提取物的HPLC条件
Figure BDA0003922690130000244
峰鉴定仅基于准确质量。鉴定出黄烷-3-醇二没食子酰基儿茶素、儿茶素和表儿茶素为腰果种皮提取物的主要组分，具有以下通用结构–
Figure BDA0003922690130000245
在所述提取物中还检测到了原花青素类黄酮，包括A型和B型原花青素、原花青素四聚体和原花青素三聚体，其中B型原花青素是原花青素的主要组分。
Figure BDA0003922690130000251
原花青素B2，或(-)-表儿茶素-(4β→8)-(-)-表儿茶素
除了刚刚提到的那些化合物以外，所鉴定的化合物还包括vaccihein A、6"-对香豆酰基洋李苷和dunalianoside B等。从所述分析获得的腰果种皮提取物的LC/MS和LC/PDA色谱图示出在图4中。
实施例5-7–体外生物测定
用食品级乙醇制备腰果种皮提取物，然后如上所述进行过滤和干燥。对于其余测定制剂，使用研究级试剂。将提取物溶解在二甲亚砜(‘DMSO’)中至最终浓度为50mg/mL，然后在各生物测定的适当缓冲液中稀释到工作浓度。
实施例5–COX-1和COX-2抑制
使用来自于BioVision(美国加利福尼亚州米尔皮塔斯市)的环氧合酶-1(‘COX-1’)抑制剂筛选试剂盒(目录号K548)测试了腰果种皮提取物的COX-1抑制。这种筛选试剂盒测量由COX酶产生的产物有机过氧化物前列腺素G2随时间过程的产生。将提取物在DMSO和COX测定缓冲液中溶解到工作浓度，最终浓度为5％DMSO。使用SC-560COX-1抑制剂作为阳性对照物。在无菌水中重构COX-1酶并储存在-80℃。COX辅因子和花生四烯酸溶液在即将使用前进行稀释。将COX探针、COX辅因子和COX-1酶溶液加入测试样品和对照物，然后快速加入花生四烯酸溶液以开始反应。在以下波长处每分钟测量荧光持续10分钟：激发535nm，发射590nm。推衍曲线的线性部分的斜率(图5)，并计算未受抑制的对照物的抑制百分比。参考图5，取决于腰果种皮提取物的浓度，观察到不同程度的COX-1抑制。观察约4μg/mL至至少约2000μg/mL、更特别地约15μg/mL至约250μg/mL的腰果种皮提取物的COX-1抑制，IC50为32μg/mL。
使用来自于BioVision(美国加利福尼亚州米尔皮塔斯市)的环氧合酶-2(‘COX-2’)抑制剂筛选试剂盒(目录号K547)测试了腰果种皮提取物的COX-2抑制。这种筛选试剂盒测量由COX酶产生的产物有机过氧化物前列腺素G2随时间过程的产生。将提取物在DMSO和COX测定缓冲液中溶解到工作浓度，最终浓度为10％DMSO。使用塞来昔布非类固醇抗炎药(‘NSAID’)作为阳性对照物。在无菌水中重构COX-2酶并储存在-80℃。COX辅因子和花生四烯酸溶液在即将使用前进行稀释。将COX探针、COX辅因子和COX-1酶溶液加入测试样品和对照物，然后快速加入花生四烯酸溶液以开始反应。在以下波长处每分钟测量荧光持续10分钟：激发535nm，发射590nm。推衍曲线的线性部分的斜率(图6)，并计算未受抑制的对照物的抑制百分比。参考图6，取决于腰果种皮提取物的浓度，观察到不同程度的COX-2抑制。观察约4μg/mL至至少约2000μg/mL、更特别地约30μg/mL至约250μg/mL的腰果种皮提取物的COX-2抑制，IC50为86μg/mL。因此，基于本文呈现的结果，腰果种皮提取物可能在改善COX-1和COX-2的活性或释放方面具有合理的活性，从而建议将它用于由COX-1和COX-2介导的炎性疾病。
实施例6–5-LOX抑制
使用脂氧合酶抑制剂筛选测定试剂盒(可得自美国密歇根州安娜堡的开曼化学公司)和马铃薯5-脂氧合酶(可得自开曼化学公司)测试了腰果种皮提取物的5-LOX抑制。这种试剂盒测量脂氧合反应中产生的氢过氧化物。
将提取物溶解在甲醇中达到最终工作浓度。在即将使用前制备5-LOX酶、发色体和亚油酸溶液。使用去甲二氢愈创木酸(‘NDGA’)作为阳性对照物。将5-LOX酶加入测试样品和对照物，室温孵育五分钟以允许酶/抑制剂相互作用。将亚油酸底物加入板中以引发反应，然后在室温下将板振摇10分钟。加入发色体以观察反应过程中形成的氢过氧化物，并在室温下将板再振摇五分钟。然后在492nm读取吸光度。计算提取物浓度的抑制百分比，与未受抑制的对照孔相比较。
测试了10种不同浓度(0.7、1.5、3.0、6.0、11.9、15.6、31.2、62.5、125.0和250.0μg/mL)的腰果种皮提取物的5-LOX抑制活性。使用100μM NDGA作为具有100％5-LOX酶抑制的阳性对照物。参考图7，对约32μg/mL至至少约250μg/mL、更特别地约32μg/mL至约125μg/mL观察到腰果种皮提取物的5-LOX抑制，对腰果种皮提取物观察的IC50为55μg/mL。因此，基于本文呈现的结果，腰果种皮提取物可能在改善5-LOX的活性或释放方面具有合理的活性，从而建议将它用于由5-LOX介导的炎性疾病。
实施例7–HMGB1抑制
HMGB1实验程序–
细胞培养物.鼠类巨噬细胞样细胞(可作为RAW 264.7(
Figure BDA0003922690130000272
TIB-71TM)得自美国弗吉尼亚州马纳萨斯市的美国典型培养物保藏中心(ATCC))在补充有10％胎牛血清(来自于美国乔治亚州劳伦斯维尔的亚特兰大生物制品公司)的杜尔贝科改良伊格尔培养基(‘DMEM’)((DMEM)(
Figure BDA0003922690130000271
30-2002TM)，来自美国弗吉尼亚州马纳萨斯市的美国典型培养物保藏中心(ATCC))中进行培养。将细胞维持在常氧条件(5％CO2/21％O2)下，允许生长至70-80％汇合，每两(2)天进行传代培养。
提取物/药物制备.腰果种皮提取物以粉末形式储存在-20℃。用提取物处理细胞之前，将提取物的储备溶液体积在二甲亚砜(‘DMSO’)(来自于美国俄亥俄州索伦镇的阿姆雷斯科公司)中调节至最终浓度为50mg/mL，并储存在-20℃。将提取物在无血清Opti-MEMTMI培养基(来自于美国马里兰州盖瑟斯堡市的Gibco-BRL)中稀释到0.25mg/mL的最终浓度，并通过0.2μm PES注射式过滤器(来自于美国宾夕法尼亚州拉德纳镇的VWR)过滤灭菌。制备2-20μM水杨酸钠(来自于美国俄亥俄州索伦镇的阿姆雷斯科公司)作为阳性对照物，所述水杨酸钠可以减弱高氧诱导的HMGB1从巨噬细胞释放。
高氧暴露.鼠类巨噬细胞RAW 264.7细胞暴露于高氧在用95％O2/5％CO2冲洗的密封加湿Plexiglas室(来自于美国加利福尼亚州德尔马市的比卢普斯罗森堡公司)中实现，在37℃持续24小时。
HMGB1 ELISA.为了确定细胞外HMGB1的水平，将RAW 264.7细胞在6孔板中的无血清Opti-MEMTMI培养基(来自于美国马里兰州盖瑟斯堡市的Gibco-BRL)中培养，并在有或无腰果种皮提取物的情况下保持在21％O2(室内空气)下或暴露于95％O2持续24小时。在高氧暴露后，通过ELISA(酶联免疫吸附测定法)测量培养基中的HMGB1水平。收集细胞培养基，在4℃以500g离心5分钟。然后使用Amicon Ultra-4离心装置(来自于美国马萨诸塞州伯灵顿市的EMD Millipore)将等体积的细胞培养物上清液浓缩大约6倍。浓缩后立即将等体积的细胞培养物上清液浓缩物装载到96孔板上，以便根据制造商的说明书(来自于美国华盛顿州雷德蒙市的Chondrex公司)通过ELISA确定HMGB1。通过在Thermo Multiscan Ex微孔板读板器(来自于美国马萨诸塞州沃尔瑟姆市的赛默科技公司)上在450nm处(使用630nm作为参比)读取光密度(‘OD’)值来确定板的吸光度。通过与标准曲线进行比较来确定样品细胞培养物上清液中的HMGB1水平，并通过应用浓缩因子进一步校正。
统计分析.数据呈现为一至三个独立实验的均值±均值标准误差(SEM)。通过使用单向方差分析(ANOVA)，使用飞世尔最小显著性差异(‘LSD’)事后分析和GraphPad Prism第6版软件(来自于美国加利福尼亚州拉乔拉市的格拉夫派得软件公司)来分析数据。<0.05的P值被视为统计显著的。
HMGB1实验结果–
参考图8，可见与用21％O2(‘RA’)处理的细胞相比，高氧(‘O2’)引起HMGB1水平显著增高。由于用腰果种皮提取物处理(‘CT’)，这些升高的HMGB1水平降到更接近正常水平(暴露于室内空气(RA)的细胞)。对阳性对照物水杨酸钠(‘SS’)观察到类似的降低。两个处理组(SS和CT)的降低是统计显著的。因此，基于本文呈现的结果，腰果种皮提取物可能在改善HMGB1的活性或释放方面具有合理的活性，从而建议将它用于由HMGB1介导的炎性疾病。
以上数据说明了腰果种皮的植物提取物具有一种或多种表现出抗炎活性的化合物。更特别地，腰果种皮提取物可能在改善COX-1、COX-2、5-LOX和/或HMGB1的活性或释放方面具有合理的活性。实施例8–腰果提取物在胶原诱导性大鼠足爪关节炎诱导方面的功效
大鼠胶原诱导性关节炎(CIA)模型是最常研究的类风湿性关节炎(RA)自身免疫模型，有若干个病理学特征与人类RA的免疫介导性多关节炎类似。免疫与疾病表现之间的持续时间最短使该模型更适宜用于治疗功效评价。在其病理生理过程中，接种来自牛鼻中隔的异种II型胶原(CII)后，大鼠对该抗原产生体液和细胞反应。这种致敏随后将导致宿主不能识别自身，并攻击它自己的II型胶原(这种胶原仅仅存在于关节软骨中)。诱导后，大鼠会经历炎性疼痛和肿胀、软骨退变、滑膜增生、血管翳形成、单核细胞浸润、畸形和不活动。因此，该模型对评价低、中、高剂量口服施用的腰果种皮提取物在减轻关节炎相关体征和症状方面的有效性是理想的。
软骨是关节结构的主要组部分并且由嵌在致密的高度组织化细胞外基质(‘ECM’)中的软骨细胞组成。ECM由软骨细胞合成，由胶原网络构成，主要含有II型胶原，以及糖胺聚糖(‘GAG’)和相关蛋白聚糖。虽然确切的病理序列尚不清楚，但关节的所有结构组成部分都参与关节炎的发病机制。胶原退变连同聚蛋白多糖分解是关节炎的主要特征。已知促炎性细胞因子如肿瘤坏死因子(‘TNF’)-α和白介素(‘IL’)-1β通过刺激聚蛋白多糖酶和基质金属蛋白酶(如MMP13)产生的事件级联在关节软骨的软骨基质退变中起重要作用。尽管已知TNF-α为炎性过程的驱动力，但认为IL-1β编排征募其他促炎性细胞因子和趋化因子。它们一起可以扩增、保持和维持疾病过程。软骨退变是类风湿性关节炎(‘RA’)和骨关节炎(‘OA’)的主要临床表现之一。特别地，II型胶原的尿液C端端肽(‘μCTX-II’)是迄今为止研究最多、最常提及的软骨退变生物标志物，可用于诊断、确定疾病严重程度或预测疾病进展、预后和监测治疗功效的目的。因此，抑制这些媒介中的任一种都可能在OA/RA方面有治疗优势。还要注意，在关节炎的早期阶段，软骨细胞会努力重建和补足退变的细胞外基质如胶原和聚蛋白多糖。可以通过测量代表胶原合成的PIIANP的血清水平来评估这种合成代谢性能。
开发大鼠胶原诱导性关节炎(CIA)模型，并用于在疾病诱导后三周时评价口服施用腰果皮提取物的功效。研究包括七组大鼠(n＝9只/组)。所述大鼠是有目的繁殖的雄性Sprague–Dawley大鼠(7-8周龄，马萨诸塞州威尔明顿市的查尔斯河实验室公司)。使动物们适应两周以达到所要求的体重，然后随机分配到相应的组。将大鼠(3只/笼)圈养在聚丙烯笼中，通过尾巴上的编号进行个体识别。各个笼子用标明项目编号、测试物品、剂量水平、组和动物数量的笼子卡片鉴别。使用Harlan软玉米芯垫(Envigo Tekland 7087，印第安纳州印第安纳波利斯市Envigo公司)，每周更换至少两次。在整个研究中，动物任意供应淡水和啮齿动物饲料(Teklad 2018，印第安纳州印第安纳波利斯市Envigo公司)，并圈养在按照12小时明暗循环的温度控制室内(22.2℃)。
将研究大鼠随机分组，如表4所示施用七种研究物品之一–
表4
组 N(大鼠数量) 剂量(mg/kg)
G1 对照物+媒剂(0.5％CMC<sup>*</sup>) 9 0.0
G2 CIA+媒剂(0.5％CMC) 9 0.0
G3 CIA+MTX 9 0.5
G4 CIA+低剂量CNT 9 50.0
G5 CIA+中剂量CNT 9 100.0
G6 CIA+高剂量CNT 9 200.0
G7 葡萄糖胺+软骨素 9 150.0G+120.0C
*CMC＝羧甲基纤维素；MTX＝甲氨蝶呤；CNT＝腰果种皮提取物；G＝葡萄糖胺；C＝软骨素。剂量基于Nair,A.B.等人,《基础与临床药理学杂志》,“动物和人之间的剂量转换的简单实践指南(A simple practice guide for dose conversion between animals andhuman)”,2016年3月,第7卷,第2期,第27-31页。
如上面的实施例1所述来制备CIA研究所用的腰果提取物，并根据实施例2对总儿茶素含量进行定量，所述提取物的总儿茶素含量以所述提取物的总重量计为18.4％。
如上面的表4所指出，基于体重将大鼠随机分到七个处理组，每组九(9)只大鼠。在治疗开始当天，大鼠平均体重为189.7±11.7g。根据表4，用甲氨蝶呤、腰果皮提取物(三个剂量)以及葡萄糖胺和软骨素每日口服治疗动物，持续三周。甲氨蝶呤是有效的免疫抑制剂，最佳用于治疗自身免疫介导的关节炎如CIA大鼠。正常的对照大鼠和CIA大鼠仅用载体媒剂(0.5％羧甲基纤维素)处理。
在诱导前两(2)周，以10ml/kg/大鼠给大鼠管饲新鲜制备的悬浮在0.5％CMC中的相应测试材料。口服施用前对溶液中的样品进行涡旋，以保持测试材料的均质性。诱导关节炎前在初免时进行基线踝直径、足爪厚度和疼痛敏感性测量。
为了诱导，使用来自牛鼻中隔的II型胶原(密歇根州欧文斯维尔市弹力蛋白产品公司)和不完全弗氏佐剂(‘IFA’，来自密苏里州圣路易斯市西格玛公司)。所有材料都按照制造商的推荐保持在合适的温度下。在制备时，称取60mg胶原，加入具有磁力搅拌器的60ml大小烧瓶中的预冷15ml 0.1M乙酸中，得到4mg/ml浓度。通过在4℃轻轻搅拌过夜使混合物溶解。次日早晨，用等体积的IFA(15ml)使溶解的胶原乳化，以达到2mg/ml胶原最终浓度。然后使用装配26g针头的1ml注射器在用异氟烷镇静的大鼠的尾巴根部的两个部位皮内初免400μl乳化的胶原。将溶解的混合物保存在冰桶中，并在注射时进行组间搅拌，以保持均匀稠度。
诱导后，所有大鼠在初免后继续接受相应的治疗材料。大鼠接受了总共5周治疗(即，诱导前2周和诱导后3周)。
在注射强化剂量前评估大鼠的关节炎指数。按照与诱导前处理所指示相同的制备，以100μl/大鼠/部位接种强化剂量2mg/ml用等体积IFA乳化的II型胶原。第7天在注射抗原前进行足爪厚度、踝直径和疼痛敏感性测量。
在生存期间，监测关节炎严重程度指数、足爪厚度、踝直径和疼痛敏感性。研究结束时收集尿液和血清以用于生物标志物分析。初免后第22天对所有组进行尸检。尸检时，收集各大鼠的踝关节以用于组织病理学分析。测量尿液软骨退变标志物(CTX-II)、促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)、软骨合成标志物(PIIANP)和基质退变蛋白酶(MMP13)。
所有动物实验都按照符合实验室动物护理和使用指南的机构指南来进行，该指南由机构动物护理和使用委员会(IACUC)审查和批准(批准号IA-P02-092619)。实验设计如图9所描绘。
关节炎严重程度指数、足爪厚度、踝直径和疼痛敏感性数据等临床发现汇编如下。
关节炎严重程度指数.在研究持续时间内，大鼠继续显示出疾病缓慢进展。如下面的数据所示，用所有处理组处理的大鼠都显示出不同程度的严重程度抑制。特别地，用100mg/kg和200mg/kg CNT处理的大鼠从第10天起显示出关节炎严重程度得到了统计上显著的抑制，并在研究持续时间内持续这种显著性(图10，表5)。尽管媒剂处理的大鼠在初免后第10天显示出关节炎症状，但用100mg/kg和200mg/kg CNT处理的大鼠在初免后第13天(即，关节炎症状的出现延迟了72小时)开始出现症状。50mg/kg CNT组和150mg/kg G+120mg/kg C组在初免后第11天开始出现关节炎症状。为了比较，甲氨蝶呤组的疾病发作在初免后第14天。对于说明曲线下面积的所有图，都使用线性梯形规则计算9-21天的曲线下面积。抑制％＝{(治疗均值-CIA+均值)/(对照均值-CIA+均值)}*100。
表5–与媒剂处理的CIA+相比的关节炎严重程度指数的p值
Figure BDA0003922690130000331
足爪厚度.与严重程度评分一致，用100mg/kg和200mg/kg CNT处理的大鼠从第12天开始显示出统计上显著的足爪肿胀减轻，并在研究持续时间内保持这一显著性(图11，表6)。与GC组相比，50mg/kg CNT组显示出统计上不显著但更大程度的足爪厚度降低。当考虑这些减轻的肿胀曲线下总面积(第7天-第21天)时，与媒剂处理的CIA组相比，100mg/k和200mg/kg CNT组的大鼠显示出了统计上显著的足爪水肿减轻，分别为55.8％和68.7％(图12)。与媒剂处理的CIA相比，对用50mg/kg CNT和GC处理的大鼠分别观察到36.6％和23.5％的足爪水肿减轻百分比，P值分别为0.15和0.36。甲氨蝶呤组显示出90.2％减轻。
表6–与媒剂处理的CIA+相比的足爪厚度的P值
Figure BDA0003922690130000341
踝直径.在诱导后第15天，对用100mg/kg和200mg/kg CNT处理的大鼠观察到统计上显著的类似踝直径降低模式(图13，表7)。此后，只有200mg/kg组在研究的其余持续时间内显示出了统计上显著的踝直径降低。对于100mg/kg CNT组，第17天和第21天的踝直径降低在统计上不显著。在诱导后第13天、第15天和第19天，用50mg/kg CNT处理的大鼠显示出了统计上显著的踝直径降低。相比之下，GC处理的大鼠在研究过程中没有经历踝直径显著降低。这里，在考虑第7天至第21天的曲线下面积时，相对于腰果种皮提取物，只有200mg/kgCNT组显示出统计上显著的踝宽度降低(即，70.3％)。就AUC而言，对50mg/kg CNT组、100mg/kg CNT组和GC组分别观察到踝直径的统计上不显著的49.3％、50.9％和36.2％降低。甲氨蝶呤组显示出89.1％降低(图14)。
表7–与媒剂处理的CIA+相比的踝直径的P值
Figure BDA0003922690130000351
疼痛敏感性.在初免日、强化日、第12天、第13天、第15天、第17天、第19天和第21天，使用连接到电子监测器的Randall-Selitto探头测量对压力的反应作为疼痛敏感性的度量。在那些天监测了左后腿和右后腿，并使用它们的平均值进行数据分析。相对于媒剂处理的CIA大鼠的变化报告为那些天的疼痛耐受性。对甲氨喋呤组大鼠观察到最高疼痛耐受性(14.1-67.1％，对比媒剂处理的CIA)，其次是200mg/kg组(13.5-43.8％，对比媒剂处理的CIA)和100mg/kg组(11.8-25.8％，对比媒剂处理的CIA)(图15和16)。对于所有监测时间点，50mg/kg CNT组和GC组的大鼠都显示出了类似的疼痛敏感性降低。当与媒剂处理的CIA大鼠相比时，所有组在从第12天起的所有时间点都观察到统计上显著的疼痛抑制(表8)。
表8–与媒剂处理的CIA+相比的疼痛耐受性P值
Figure BDA0003922690130000361
生物标志物–
尿液CTX-II–
测定.将大鼠尿液样品1:3稀释，使用来自Mybiosource的大鼠CTX-II ELISA试剂盒测量CTX-II的存在，如下。将稀释的尿液加入涂有CTX-II抗体的微板，允许在37℃结合2小时。然后加入针对CTX-II的生物素缀合抗体，并允许在37℃与来自大鼠尿液的CTX-II结合1小时。彻底洗涤微板以除去未结合的尿液和抗体，之后加入酶缀合的亲和素抗体以与生物素缀合的抗体结合供用于特异性检测。允许亲和素抗体在37℃结合1小时。重复洗涤，加入酶底物，使板在37℃显色30分钟。加入停止溶液后，在450nm处读取吸光度，乘以稀释因子，基于CTX-II标准曲线的吸光度读数计算CTX-II的浓度。
标准化.
肌酸–使用肌酐参数测定试剂盒(R&D Systems)将CTX-II量标准化至尿液中肌酐的量，如下。将尿液1:20稀释，与碱性苦味酸混合(5份0.13％苦味酸:1份1N NaOH)在微板中，室温孵育30分钟。在492nm读取吸光度，基于肌酐标准曲线的吸光度读数计算尿液中的肌酐量。
蛋白质–使用Pierce BCA蛋白测定试剂盒(ThermoFisher Scientific)将CTX-II量标准化至尿液中总蛋白的量，如下。将尿液1:20稀释，与二喹啉甲酸(BCA)试剂混合在微板中，在37℃孵育30分钟。在580nm读取吸光度，基于牛血清白蛋白标准曲线的吸光度读数计算尿液中的蛋白质浓度。
结果.
如图17至图19所说明，与正常对照组相比，对媒剂处理的CIA大鼠观察到尿液CTX-II水平的统计上显著的增加(原始数据增加3.5倍，用蛋白质和肌酐标准化的数据增加2倍)，从而确认了疾病的严重程度。与临床观察(关节炎严重程度、足爪肿胀和踝直径)一致，用腰果种皮提取物处理的大鼠显示出了对软骨退变的剂量相关预防作用。对用高剂量(200mg/kg)腰果种皮提取物处理的大鼠观察到最高基质破坏抑制，中等剂量(100mg/kg)次之。实际上，当值通过蛋白质(53.4％抑制，对比媒剂；P＝0.04)或肌酐(33.0％抑制；P＝0.11)标准化时，对200mg/kg组的大鼠观察到的抑制百分比值高于任一处理组。与原始数据中经媒剂处理的患病CIA大鼠相比，甲氨蝶呤似乎避免了显著软骨退变(高达53.8％保护；P＝0.005)。相对于媒剂处理的CIA大鼠，甲氨蝶呤组的这些值在利用蛋白质(22.9％，p＝0.37)和肌酐(27.2％；p＝0.22)将它们标准化时是中等的。就原始数据、蛋白质标准化和肌酐标准化而言，与未处理CIA大鼠相比，以100mg/kg施用腰果种皮提取物分别显示出23.2％(p＝0.29)、33.0％(p＝0.20)和21.3％(p＝0.36)的软骨保护。50mg/kg腰果种皮提取物组和GC组的大鼠显示出最小程度的软骨保护。在原始数据、蛋白质标准化和肌酐标准化CTX-II中，分别观察到50mg/kg腰果种皮提取物的17.8％、19.0％和12.3％减少，以及GC处理组的16.3％、16.5％和17.9％减少。
细胞因子IL-1β/IL-6/TNF-α–
样品收集.研究完成时，收集各动物的心脏穿刺血液。血液以3000rpm旋转15分钟。从各大鼠分离约700-800μl血清。两种都保存在-80℃，直到使用。
ELISA测定.使用大鼠IL-1β/IL-6/TNF-αQuantikine ELISA试剂盒(R&D Systems，明尼苏达州明尼阿波利斯)测量细胞因子IL-1β/IL-6/TNF-α的存在，如下。将未稀释的血清加入涂有多克隆IL-1β/IL-6/TNF-α抗体的微板，允许在室温结合2小时。彻底洗涤微板以除去未结合的血清，然后加入多克隆酶缀合的IL-1β/IL-6/TNF-α抗体，允许在室温结合2小时。重复洗涤，加入酶底物，使板在室温下显色30分钟。加入停止溶液后，在450nm读取吸光度，基于IL-1β/IL-6/TNF-α标准曲线的吸光度读数计算IL-1β/IL-6/TNF-α浓度。
血清IL-1β、IL-6和TNF-α的结果.
促炎性细胞因子如IL-1β、TNF-α和IL-6单独或协同在OA/RA发病机制中的炎症引发、征募、进展和延续中起关键作用。降低这些细胞因子水平的剂可以缓解与OA/RA相关的症状。
参考图21，对用媒剂(0.5％CMC)处理的CIA大鼠观察到血清IL-1β的统计上显著的增高。与用媒剂处理的CIA大鼠相比，阳性对照物甲氨蝶呤(86.4％降低，p＝0.01)和200mg/kg CNT(53.1％降低，p＝0.01)显著降低了血清IL-1β水平的这种增高。100mg/kg CNT处理组的大鼠显示出血清IL-1β水平的统计上不显著的38.3％降低。50mg/kg CNT组的大鼠的血清IL-1β水平存在不显著3.7％增高(图21)。
同样，血清TNF-α水平由于腰果皮提取物而降低(图22)。发现正常对照组以及用甲氨蝶呤、100mg/kg CNT和GC处理的大鼠的TNF-α水平低于0。当与媒剂处理的CIA大鼠相比时，这些水平是统计上显著的。虽然发现50mg/kg和200mg/kg CNT的降低百分比分别为52.1％(p＝0.14，对比用媒剂处理的CIA大鼠)和98.3％(p＝0.07，对比用媒剂处理的CIA大鼠)，但当与媒剂处理的CIA大鼠相比时，它们由于个体大鼠间的差异而未能实现统计显著性。
腰果种皮提取物处理对大鼠血清IL-6水平没有影响，发现所有血清值都低于空白。然而，IL-1β和TNFα数据反映了在生存期研究临床测量中观察到的结果，如关节炎指数、踝直径和足爪厚度。
IIA型胶原N-前肽(PIIANP)
OA和RA患者中的PIIANP水平下降，表明IIA型胶原合成在这些疾病中可能改变。因此，基于该生物标志物的IIA型胶原合成测量可用于确定腰果种皮提取物在关节疾病患者中的功效。
ELISA测定.使用大鼠IIA型前胶原N-前肽(PIIANP)ELISA试剂盒(MyBiosource，加利福尼亚州圣地亚哥市)测量PIIANP的存在，如下。将未稀释的血清加入涂有PIIANP抗体以及HRP缀合的PIIANP抗体的微板上，允许在37℃结合一小时。彻底洗涤微板，加入发色体溶液，允许在37℃结合15分钟。加入停止溶液后，在450nm处读取吸光度，基于PIIANP标准曲线的吸光度读数计算PIIANP的浓度。
血清PIIANP的结果
尽管正常对照大鼠显示出血清PIIANP水平增高53.0％，但与对照组相比，对用媒剂处理的CIA大鼠观察到血清PIIANP水平的统计上显著的降低(34.7％，对比对照组)(p＝0.0002)，从而表明模型的诱导(参见图23)。相比之下，当与媒剂处理的疾病模型相比时，用阳性对照物甲氨蝶呤处理的CIA大鼠的血清PIIANP显著增高(41％，p＝0.001，与CIA+媒剂相比)。与媒剂处理的CIA组相比，腰果皮提取物组的大鼠显示出血清PIIANP增高20.6％(50mg/kg)、25.3％(100mg/kg)和27.0％(200mg/kg)。当与媒剂处理的CIA大鼠相比时，对中剂量(100mg/kg)和高剂量(200mg/kg)观察到的增高是统计上显著的。这些结果表明，腰果皮提取物处理的大鼠响应所述处理合成的胶原的量增加。这表明所述处理有助于逆转该动物模型特有的胶原退变表型。至少在这个类别中，当与用媒剂处理的CIA大鼠相比时，GC组显示出了PIIANP组的统计上显著的增高(44.3％，p＝0.001)，从而表明了软骨再生活性。
基质金属蛋白酶13(MMP-13)
基质金属蛋白酶13是炎症的调控因子，并且是骨关节炎中在关节软骨中的II型胶原退变方面起重要作用的酶。它还能降解软骨中的蛋白多糖、IV型和IX型胶原、骨连接素和基底膜蛋白多糖。
ELISA测定.使用MMP-13大鼠基质金属蛋白酶13(MMP-13)ELISA试剂盒(MyBioSource，加利福尼亚州圣地亚哥市)测量未稀释大鼠血清中的MMP-13的存在，如下。将未稀释的血清加入涂有MMP-13抗体的微板。在37℃下2小时后，血清中的MMP-13与板结合，吸出未结合的血清。将对MMP-13特异的生物素缀合抗体加入孔中，允许在37℃结合1小时。对板进行彻底洗涤，并向板加入亲和素缀合辣根过氧化物酶(HRP)。在37℃下1小时之后，重复洗涤并向板加入酶底物。在37℃显色20分钟之后，加入停止溶液，在450nm读取吸光度。基于MMP-13标准曲线的吸光度读数计算MMP-13的浓度。
血清MMP-13的结果
参考图24，可见所有组的血清MMP-13浓度都低于标准曲线。因此，结果是不确定的。
组织病理学
程序和评价.尸检时，小心地将踝关节解剖出来，固定在10％缓冲福尔马林中，并送到全国组织学(美国华盛顿州韦拉代尔)进行进一步组织病理学分析。然后用Calci-Clear Rapid将固定的标本脱钙一天半，并嵌入石蜡中。从各大鼠获得标准化5μm连续切片，用苏木精和伊红(HE)和番红O-固绿染色，以能够评估蛋白多糖含量。使用改良Mankin系统(Mankin等人,1981)对关节组成部分的结构和细胞变化进行评分，作为疾病进展和/或治疗功效的指标。组织学分析由全国组织学认证的病理学家进行。
结果.组织病理学数据与关节炎严重程度评分一致。当与正常对照大鼠相比时，媒剂处理的CIA大鼠显示出严重滑膜炎、明显软骨退变、滑膜增生、血管翳形成和骨骼侵蚀(图25和图26)。与正常对照组相比，媒剂处理的CIA大鼠显示出软骨破坏、骨骼侵蚀、炎症和GAG损失的严重程度分别增加了4.4倍、5倍、4.8倍和4.4倍。相比之下，当与媒剂处理的CIA大鼠相比时，用甲氨蝶呤处理的大鼠在软骨破坏(比媒剂低50.7％)、骨骼侵蚀(比媒剂低71.2％)、炎症(比媒剂低55.8％)和GAG损失(比媒剂低50.7％)方面的变化相对较低。同样地，相对于媒剂处理的CIA大鼠，用腰果皮提取物处理的大鼠在踝关节的组织病理学读数方面显示出剂量相关性改善。特别地，当与媒剂处理的CIA大鼠相比时，用200mg/kg腰果皮提取物处理的动物在软骨破坏、骨骼侵蚀、炎症和GAG损失的严重程度方面分别显示出54.5％、59.8％、50.5％和54.5％降低。在这些降低中，当与媒剂处理的CIA大鼠相比时，200mg/kg处理组的骨骼侵蚀和炎症缓解是统计上显著的。相对于媒剂处理的CIA大鼠，对用100mg/kg腰果皮提取物处理的CIA大鼠观察到软骨破坏、骨骼侵蚀、炎症和GAG损失的适度降低分别如35.7％、51.2％、45.3％和35.7％。相对于用媒剂处理的CIA大鼠，100mg/kg处理的大鼠的骨骼侵蚀变化是统计上显著的。用50mg/kg腰果皮提取物处理的动物或GC组在组织病理学评估的所有类别中都显示出非常相似的模式，与媒剂处理的CIA大鼠非常相似，在减轻CIA相关症状方面具有极低甚至没有活性。
腰果提取物在胶原诱导性大鼠足爪关节炎诱导方面的功效的概述–
开发大鼠胶原诱导性关节炎(CIA)模型，并用于在疾病诱导后三周时评价口服施用腰果种皮提取物的功效。研究报告包括七组大鼠，每组九(9)只大鼠。所述组中有三组大鼠用腰果种皮提取物以三种不同的剂量，分别为低剂量50mg/kg、中剂量100mg/kg和高剂量200mg/kg进行口服处理。将腰果种皮提取物组的效果与用免疫抑制药物甲氨喋呤以0.5mg/kg剂量处理的组以及用葡萄糖胺和软骨素(150G+120Cmg/kg)处理每日一次持续三周的组进行比较。正常的对照大鼠和CIA大鼠仅用载体媒剂0.5％羧甲基纤维素处理。在生存期间，监测关节炎严重程度指数、足爪厚度、踝直径和疼痛敏感性。研究结束时收集尿液和血清以用于生物标志物分析。尸检时，收集各大鼠的踝关节以用于组织病理学分析。测量尿液软骨退变标志物(CTX-II)、促炎性细胞因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)、软骨合成标志物(PIIANP)和基质退变蛋白酶(MMP13)以确定各处理的功效。
通过逐渐增加的关节炎严重程度指数以及随后伴随尿液和血清关节炎相关生物标志物以及组织病理学发现来确认疾病模型的诱导。大鼠对所述处理显示出了不同程度的反应。腰果种皮提取物显示出剂量相关性可测量功效，在较高剂量下在缓解关节炎症状方面有显著影响。当比较关节炎严重程度、足爪厚度、踝直径和疼痛敏感性的整体数据时，用中剂量和高剂量腰果皮提取物处理的CIA大鼠在关节炎的主要体征方面显示出统计上显著的降低。在本研究中，GC和50mg/kg腰果皮提取物组的大鼠显示出微乎其微的功效。
来自生物标志物的数据与寿命期观察结果一致。当数据用蛋白质标准化时，对用200mg/kg腰果种皮提取物处理的CIA大鼠观察到μCTX-II的统计上显著的降低(53.4％抑制，对比媒剂；P＝0.04)。同样，当与媒剂处理组相比时，对用腰果种皮提取物处理的大鼠观察到血清IL-1(200mg/kg腰果种皮提取物，53.1％降低，P＝0.01)和TNF-α(100mg/kg腰果种皮提取物)水平的统计上显著的降低。尽管低剂量腰果种皮提取物在抑制IL-1β和TNF-α方面无效，但GC处理的大鼠显示出TNF-α的统计上显著的降低。当与媒剂处理组相比时，腰果种皮提取物(100mg/kg和200mg/kg)和GC处理组实现了显著水平的合成代谢标志物增加。
此外，组织病理学数据与关节炎严重程度评分非常一致。尽管媒剂处理的大鼠经历了严重滑膜炎、明显软骨退变、弥漫性骨骼和软骨坏死、滑膜增生、血管翳形成、骨骼侵蚀和总体结构丧失，但用腰果种皮提取物和甲氨蝶呤处理的CIA大鼠在基质完整性方面具有相对温和的形态变化，以及减少的关节骨骼损伤。根据组织病理学数据的改良Mankin评分分析，腰果种皮提取物(200mg/kg)处理的大鼠在炎症和骨骼侵蚀方面显示出统计上显著的降低。用GC或50mg/kg腰果种皮提取物处理的大鼠就关节结构损伤而言产生了微乎其微的微观改善。
因此，基于生存期测量数据(关节炎严重程度、足爪厚度、踝直径和疼痛敏感性)、尿液CTX-II、血清IL-1β和TNF-α以及组织病理学分析，口服施用100mg/kg或200mg/kg腰果种皮提取物的表现显著优于GC处理组。用GC处理大鼠在合成代谢(PIIANP)标志物和TNF-α方面产生了统计上显著的变化。全体数据支持腰果种皮提取物用于支持关节结构和功能的潜在用途。
上面的描述公开了本发明的若干种方法和材料。本发明易于在方法和材料方面做出修改，以及在制造方法和设备方面做出改变。考虑本公开或实践本文公开的发明时，此类修改对本领域技术人员显而易见。此外，除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同的含义。因此，不希望本发明受限于本文公开的具体实施方式，而是希望它涵盖落在如所附权利要求书中体现的本发明的真正范围和精神内的所有修改和替代方案。

Claims (20)

1.一种用于在有需要的哺乳动物中减轻关节僵硬和不适和/或改善软骨重建或软骨更新功能的组合物，所述组合物包含治疗有效量的腰果(Anacardium occidentale L)种皮的植物提取物，其中所述植物提取物富含总儿茶素含量。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中基于人类等效剂量，所述组合物中的所述植物提取物的所述治疗有效量为至少约500.0mg/kg或更大的量。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中基于人类等效剂量，所述组合物中的所述植物提取物的所述治疗有效量为约500.0mg/kg至约2000.0mg/kg的量。
4.根据权利要求3所述的组合物，其中基于人类等效剂量，所述组合物中的所述植物提取物的所述治疗有效量为约1000.0mg/kg至约2000.0mg/kg的量。
5.根据权利要求1所述的组合物，其中将所述植物提取物标准化至以所述提取物的总重量计为至少约15.00重量％的总儿茶素含量。
6.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物改善了患有关节僵硬和不适的哺乳动物中的环氧合酶和5-脂氧合酶介导的炎症。
7.根据权利要求1所述的组合物，其中所述植物提取物还富含总多酚含量。
8.根据权利要求1所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载体。
9.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物是膳食补充剂。
10.一种在有需要的哺乳动物中减轻关节僵硬和不适的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含腰果种皮的植物提取物的组合物，其中所述植物提取物富含总儿茶素含量。
11.一种包含腰果种皮的植物提取物的组合物，其中所述植物提取物富含总儿茶素含量以用于在哺乳动物中减轻关节僵硬和不适的治疗。
12.根据权利要求10所述的方法，其中将所述植物提取物标准化至以所述提取物的总重量计为至少约15.00重量％的总儿茶素含量。
13.根据权利要求10所述的方法，其中所述植物提取物还富含总多酚含量。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述方法改善了患有关节僵硬和不适的哺乳动物中的环氧合酶和5-脂氧合酶介导的炎症。
15.一种在有需要的哺乳动物中改善软骨重建或更新功能的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含腰果种皮的植物提取物的组合物，其中所述植物提取物富含总儿茶素含量。
16.一种包含腰果种皮的植物提取物的组合物，其中所述植物提取物富含总儿茶素含量以用于在哺乳动物中改善软骨重建或更新功能。
17.根据权利要求15所述的方法，其中将所述植物提取物标准化至以所述提取物的总重量计为至少约15.00重量％的总儿茶素含量。
18.根据权利要求15所述的方法，其中所述植物提取物还富含总多酚含量。
19.根据权利要求15所述的方法，其中所述方法改善了需要软骨重建或更新功能的哺乳动物中的环氧合酶和5-脂氧合酶介导的炎症。
20.一种包含腰果种皮的植物提取物的组合物，其中所述植物提取物富含总儿茶素含量以用于在哺乳动物中减轻关节僵硬和不适的治疗和/或用于在哺乳动物中改善软骨重建或更新功能。
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