KR20230006837A - 인간 IL-4Rα의 특정 에피토프를 사용한 항체 결합 및 항체의 응용 - Google Patents
인간 IL-4Rα의 특정 에피토프를 사용한 항체 결합 및 항체의 응용 Download PDFInfo
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Abstract
인간 IL-4R 항체 또는 그의 항원 결합 단편이 개시된다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 IL-4Rα와 특이적으로 결합하고 인간 IL-4Rα의 특정 에피토프와 결합한다. 더욱이, 또한 본 발명은 인간 IL-4R 결합제 또는 인간 IL-4/IL-13 신호 전달 경로에 대한 차단제를 스크리닝하는데 있어서 에피토프의 용도를 제공하고, 또는 특정 에피토프를 사용하여 결합제 또는 차단제의 효능을 평가하는데 사용된다.
Description
본 출원은 2020년 4월 24일에 출원된 중국 특허 출원 번호 CN202010331685.3의 우선권을 주장하며, 이는 전체가 참고로 여기에 포함된다.
본 발명은 생물학적 약학 분야, 특히 인간 IL-4Rα의 특정 에피토프 (epitope) 에 결합할 수 있는 항체 및 그의 응용에 관한 것이다.
인간 인터루킨 4 수용체 (IL-4R) 는 신체 전체의 다양한 조직 및 기관, 특히 편도선, 충수돌기, 림프절, 비장 및 골수와 같은 면역 기관에서 널리 발현되는 유형 I 막관통 단백질 (transmembrane protein) 이다. IL-4R은 인터루킨 4 (IL-4) 및 인터루킨 13 (IL-13) 과 같은 리간드에 결합할 때 다양한 면역 조절 효과를 발휘할 수 있으며, 예를 들어 Th2 세포의 분화를 촉진하기 위해, B 세포에 의한 IgE 항체의 분비를 조절하고, 대식세포 대체 활성화 등을 자극한다.
IL-4R은 2개의 폴리펩타이드 사슬로 구성된 이종이량체 (heterodimer) 이며, 그 중 α사슬 (IL-4Rα) 은 IL-4에 대해 높은 친화성을 갖는다. 또한 IL-4Rα는 IL-13 세포표면 수용체 (IL-13Rα) 의 α사슬과 다른 형태의 IL-4R 이종이량체를 형성하여 IL-13에 대해서도 높은 친화성을 갖는다.
단백질의 가용성 형태 (soluble form) (sIL-4Rα) 는 IL-4Rα로부터 생성될 수 있다. 상기 가용성 형태의 단백질은 염증-관련 신호의 범위, 예를 들어 IL-4 매개된 세포 증식 및 T-세포 매개된 IL-5 상향조절 등을 억제할 수 있다. 따라서, 단백질을 표적으로 하는 차단 항체 (blocking antibody) 는 알레르기성 비염, 비염, 천식 또는 습진 및 기타 질병의 치료 및 완화에 유익하다. 또한, IL-4와 IL-13은 모두 활성화된 T 세포, 단핵구, 비만 세포, 호염기구 및 호산구에 의해 대부분 생성되는 다양한 염증 관련 반응에 관여하는 매우 광범위한 생물학적 활성을 갖는 사이토카인이다. 두 인터루킨은 생물학적 기능에서 많은 공통점을 가지고 있으며, 상기의 주요 생물학적 효과는 TH2 세포의 분화 및 증식 촉진 효과, 활성화된 B 세포에 의한 IgE 항체 분비 촉진 효과 등이 있다. 연구에 따르면 IL-4와 IL-13은 자가면역 질환, 알레르기 질환, 종양 및 기타 질병의 면역 반응을 매개하는 데 매우 중요한 역할을 하며 항상 사람들이 주목하는 연구 핫스팟 중 하나이다.
sIL-4Rα는 IL-4에 대한 결합을 지배하고 다른 사이토카인과 관련이 있기 때문에 현재 많은 연구가 sIL-4Rα를 표적으로 하는 항체에 대해 진행되고 있으며 표적에 대한 인간 모노클로날 항체가 천식, 아토피 피부염 등의 질병 완화 및 치료에 효과적이라는 것이 임상적으로 입증된다. 그러나, 면역 반응에서 sIL-4Rα의 에피토프에 대한 연구는 거의 없으며 특정 에피토프는 아직 명확하게 알려져 있지 않다.
상기 기술적 과제를 위해 본 발명은 sIL-4Rα의 에피토프를 연구한다. 새로 획득한 항체가 인간 sIL-4Rα 및 시노몰구스 (cynomolgus) sIL-4Rα와 반응했을 때 나타나는 종 특이성에 따라, 본 발명은 sIL-4Rα에서 일부 위치를 선택하고 위치를 돌연변이시키고 관련 실험을 수행하여 결합 에피토프의 몇 가지 중요한 아미노산을 발견했다. 에피토프에 대한 이러한 결과는 sIL-4Rα 및 관련 항체에 대한 추가 연구에 매우 중요하다.
따라서, 본 발명의 목적은 인간 인터루킨 4 수용체 (IL-4R) 에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이며, 인간 IL-4R (IL-4Rα) 의 알파 사슬의 특정 에피토프에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공하는 것이다.
본 발명에 의해 제공되는 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 기초하여, 본 발명의
또 다른 목적은 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편 내의 주요 도메인(들)을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공하는 것이고; 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하기 위해; 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하기 위해; 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 생산하는 방법을 제공하고; 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하는 단계; 및 항체 또는 이의 항원 결합 단편 또는 약제학적 조성물의 약제학적 용도를 제공하기 위한 것이다.
본 발명에서 제공되는 인간 IL-4R의 알파 사슬의 특이적 에피토프에 기초하여,
본 발명의 추가 목적은 인간 IL-4R의 결합제 또는 인간 IL-4/IL-13 신호전달 경로의 차단제를 제조하는데 있어서 에피토프의 용도를 제공하는 것이며,
또는 결합제 또는 차단제의 효능을 평가하는데 있어서 에피토프의 용도를 제공하는 것이다.
한 측면에서, 본 발명은 인간 인터루킨-4 수용체 (IL-4R) 에 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 인간 IL-4R (IL-4Rα) 이고 서열 번호 1. (SEQ ID NO. 1.) 에 기재된 아미노산 서열 세트의 아미노산 잔기 D92, V94, D97, L67, L68, A96, H156, C207, Q63 및 L64 중 하나 이상을 포함한다.
바람직하게는, 에피토프는 서열 번호 1. 에 기재된 아미노산 서열 세트의 아미노산 잔기 D92, V94, 및 D97 중 하나 이상을 포함한다
본 발명의 특정 실시 예. 에 따르면, 에피토프는 서열 번호 1. 에 기재된 아미노산 서열 세트의 하기 아미노산 잔기를 포함한다.
(1) D92;
(2) D97;
(3) D92, V94, 및 D97;
(4) D92 및 V94;
(5) D92 및 D97; 또는
(6) V94 및 D97.
및/또는, 본 개시내용에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편 (antigen binding fragment) 은 서열 번호 1. 에 기재된 아미노산 서열 세트의 하기 아미노산 잔기를 인간 IL-4Rα의 에피토프에 결합한다:
(i) Q63 및 L64.
또한, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 사이노몰구스 IL-4R에 대한 종간 (cross-species) 결합 활성을 갖지 않는다. 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 시노몰구스 IL-4R에 결합하지 않으며; 보다 바람직하게는 시노몰구스 IL-4Rα에 결합하지 않고; 더욱 바람직하게는, 서열 번호 2. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 결합하지 않는다.
상기 종간 결합 활성과 관련하여, 본 발명은 인간 인터루킨-4 수용체 (IL-4R) 에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 인간 IL-4R (IL-4Rα) 의 알파 사슬에 위치하며 서열 번호 1. 에 기재된 아미노산 서열 세트의 아미노산 잔기 L67, L68 및 A96 중 하나 이상을 포함한다.
바람직하게는, 에피토프는 하기 서열 번호 1. 에 기재된 아미노산 서열 세트의 아미노산 잔기를 포함한다:
① L67 및L68;
② L67, L68, 및 A96; 또는
③ A96.
본 발명의 특정 실시 예. 에 따르면, 에피토프는 하기 서열 번호 1. 에 기재된 아미노산 서열 세트의 아미노산 잔기를 포함한다:
(A) L67, L68, A96, H156, 및 C207;
(B) A96, H156, 및 C207;
(C) L67, L68, H156, 및 C207;
(D) L67, L68, A96, 및 C207; 또는
(E) L67, L68, A96, 및 H156.
특히 바람직하게는, 본 발명에 따른 에피토프는 하기 서열 번호 1. 에 기재된 아미노산 서열 세트의 아미노산 잔기를 포함한다:
(P-1) D97, L67, 및 L68;
(P-2) D97, L67, L68, A96, 및 D92;
(P-3) D97, L67, L68, 및 D92;
(P-4) D97, Q63, 및 L64;
(P-5) D97, Q63, L64, 및 D92;
(P-6) D97, Q63, L64, D92, 및 A96; 또는
(P-7) D97, Q63, L64, L67, 및 L68.
본 발명에서 제공하는 항체의 항원 IL-4Rα에 대한 결합을 검출한 결과, 본 발명의 항체는 50, 30, 20 또는 10ng/ml 이하의 EC50 값으로 sIL-4Rα에 대한 결합 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한 본 발명의 항체는 100μl × 2500ng/ml에서 100μl × 0.5μg/ml로 코팅된 sIL-4Rα-97에 결합 활성을 나타내지 않으며, sIL-4Rα-97은 sIL-4Rα의 97번 아미노산 잔기 D에서 A로의 돌연변이에 의해 얻어진다. 본 개시내용의 항체가 100 μl × 2500 ng/ml에서, 100 μl × 0.5 μg/ml로 코팅된 sIl-4Rα-QSMDH 및 sIl-4Rα-63/64로부터 선택된 적어도 하나의 돌연변이 항원에 대해 결합 활성이 없거나 유의하게 더 낮은 결합 활성을 나타낸다. 결합 활성은 본 발명의 “발명을 실시하기 위한 구체적인 내용” 의 하기 "(I) 결합 활성 검출 방법" 부분에 기재된 절차에 따라 측정한다.
또한, 본 발명에서 제공되는 항체는 IL-4 또는 IL-13이 IL-4R에 결합하는 것을 차단할 수 있으므로, IL-4 또는 IL-13는 IL-4R에 결합하는 것의 차단제 또는 IL-4/IL-3 신호전달 경로의 차단제로 사용할 수 있다.
따라서, 구성되는 도메인의 아미노산 서열과 관련하여, 본 개시내용에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 하기와 같이 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2, HCDR3 및 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2, LCDR3의 조합을 포함한다.
(1) SEQ ID NOs. 35, 36, 및 37 에 명시 된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; 및, SEQ ID NOs. 53, 54, 및 55 에 명시 된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3;
(2) SEQ ID NOs. 41, 42, 및 43 에 명시 된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; 및, SEQ ID NOs. 59, 60, 및 61 에 명시 된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3;
(3) SEQ ID NOs. 44, 45, 및 46 에 명시 된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; 및, SEQ ID NOs. 56, 57, 및 62 에 명시 된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3;
(4) SEQ ID NOs. 44, 47, 및 46 에 명시 된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; 및 SEQ ID NOs. 63, 64, 및 65 에 명시 된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3;
(5) SEQ ID NOs. 48, 49, 및 46 에 명시 된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; 및 SEQ ID NOs. 66, 67, 및 68 에 명시 된 , LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3;
(6) SEQ ID NOs. 44, 50, 및 51 에 명시 된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; 및, SEQ ID NOs. 56, 57, 및 69 에 명시 된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3; 또는
(7) SEQ ID NOs. 52, 36, 및 37 에 명시 된 HCDR1, HCDR2, 및 HCDR3; 및, SEQ ID NOs. 53, 54, 및 55 에 명시 된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3.
상기에서 제공되는 경쇄 및 중쇄 CDR의 조합은 본 발명에서 제공되는 특정 항체 또는 그의 단편으로부터 유래된다. 주어진 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 가변 영역 아미노산 서열에 함유된 CDR은 당업자에 의해 일상적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 특정 실시 예. 에 따르면, 가변 영역의 아미노산 서열에서 CDR을 정의하기 위해 IMGT 도구가 사용?다. 당업계에 공지된 방법에 의해 정의된 경쇄 및 중쇄 CDR의 조합은 모두 본 발명의 범위 내에 포함된다.
본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편에서, 바람직하게는, 중쇄 가변 영역은 하기 서열을 포함한다: 서열 번호 3., 서열번호 7., 서열번호 9, 서열번호 11., 서열번호 15., 서열번호 17., 서열번호 19., 서열번호 23., 또는 서열번호 27 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열; 및/또는 바람직하게는 경쇄 가변 영역은 하기와 같은 서열을 포함한다: 서열번호 4., 서열번호 8., 서열번호 10., 서열번호 12., 서열번호 16., 서열번호 18., 서열번호 20., 서열번호 28., 서열번호 33., 또는 서열번호 34. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열.
본 발명의 특정 실시 예. 에 따르면, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편에서:
(1) 중쇄 가변영역은 서열번호 3. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 3. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함; 및, 경쇄 가변영역은 서열번호 4. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 4. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함;
(2) 중쇄 가변영역은 서열번호 7. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 7. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함; 및, 경쇄 가변영역은 서열번호 8. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 8. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함;
(3) 중쇄 가변영역은 서열번호 9. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 9. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함; 및, 경쇄 가변영역은 서열번호 10. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 10. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함;
(4) 중쇄 가변영역은 서열번호 11. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 11. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함; 및, 경쇄 가변영역은 서열번호 12. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 12. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함;
(5) 중쇄 가변영역은 서열번호 15. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 15. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함; 및, 경쇄 가변영역은 서열번호 16. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 16. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함;
(6) 중쇄 가변영역은 서열번호 17. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 17. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함; 및, 경쇄 가변영역은 서열번호 18. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 18. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함;
(7) 중쇄 가변영역은 서열번호 19. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 19. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함; 및, 경쇄 가변영역은 서열번호 20. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 20. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함;
(8) 중쇄 가변영역은 서열번호 27. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 27. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함; 및, 경쇄 가변영역은 서열번호 34. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 34. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함;
(9) 중쇄 가변영역은 서열번호 27. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 27. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함; 및, 경쇄 가변영역은 서열번호 33. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 33. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함;
(10) 중쇄 가변영역은 서열번호 27. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 27. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함; 및, 경쇄 가변영역은 서열번호 28. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 28. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함;
(11) 중쇄 가변영역은 서열번호 23. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 23. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함; 및, 경쇄 가변영역은 서열번호 34. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 34. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함;
(12) 중쇄 가변영역은 서열번호 23. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 23. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함; 및, 경쇄 가변영역은 서열번호 33. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 33. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함; 또는
(13) 중쇄 가변영역은 서열번호 23. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열번호 23. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함; 및, 경쇄 가변영역은 서열번호 28. 에 기재된 아미노산 서열 세트또는 서열번호 28. 에 기재된 아미노산 서열과 적어도 75%의 동일성을 갖는 아미노산 서열 세트를 포함;
특히, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 적어도 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하며, 상기 둘 모두 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4와 같은 배열로 상기 CDR 및 프레임워크 영역 (FR, Framework Regions) 을 포함한다.
추가로, "적어도 75% 동일성"으로 인한 아미노산 서열의 최대 25% 차이는 중쇄 가변 영역 또는 경쇄 가변 영역의 임의의 프레임워크 영역, 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역 이외의 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 임의의 도메인 또는 서열에 존재한다. 이러한 차이는 임의의 위치에서 아미노산 결실, 추가 또는 치환에 기인할 수 있으며, 치환은 보존적 치환 또는 비보존적 치환일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간 인터루킨-4 수용체 (IL-4R) 에 결합하고, 바람직하게는 인간 IL-4R (IL-4Rα)의 알파 사슬, 보다 바람직하게는 인간 가용성 IL-4Rα (sIL-4Rα) 에 결합한다
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체는 모노클로날 항체 또는 단일 사슬 항체일 수 있다. 바람직하게는, 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체, 또는 완전히 또는 부분적으로 인간화 항체이다. 바람직하게는, 항원 결합 단편은 표적에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 단편이다. 예를 들어, 항원 결합 단편은 항체의 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 또는 Fv 단편 (예: scFv) 이다.
바람직하게는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 또는 뮤린 불변 영역, 바람직하게는 인간 또는 뮤린 중쇄 불변 영역 (CH) 및/또는 경쇄 불변 영역 (CL)
을 추가로 포함한다. 더욱 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함한다. 예를 들어, 항체는 면역글로불린, 특히 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM 이고, 예를 들어 인간 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 이고, 보다 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 의 하위유형이다. .
바람직하게는, 본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IgG, IgA, IgM, IgD, 또는 IgE의 중쇄 불변 영역 및/또는 카파 또는 람다 유형의 경쇄 불변 영역을 포함한다. 예를 들어, 중쇄 불변 영역은 IgG (예: IgG1 또는 IgG4) 유형이고 경쇄 불변 영역은 카파 유형입니다. 더욱 바람직하게는, 모노클로날 항체의 중쇄 불변 영역은 핵산 서열에 의해 서열번호 70. 또는 서열번호 71. 에 기제된 아미노산 서열 세트, 또는 핵산 서열에 의해 서열번호 70. 또는 서열번호 71. 에 기제된 아미노산 서열 세트와 적어도 75% 동일성을 갖는 암호화된 아미노산 서열을 포함; 모노클로날 항체의 경쇄 불변 영역은 핵산 서열에 의해 서열번호 72. 에 기제된 아미노산 서열 세트, 또는 핵산 서열에 의해 서열번호 72. 에 기제된 아미노산 서열 세트와 적어도 75% 동일성을 갖는 암호화된 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 상기에서, "적어도 75% 동일성" 은 75%, 80%, 85%, 90%, 심지어 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 와 같이 75%와 100% 사이의 임의의 퍼센트 동일성입니다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 상기에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명에 따른 핵산 분자는 벡터 내로 클로닝될 수 있고, 이는 차례로 숙주 세포 내로 형질전환되거나 형질감염된다. 따라서, 추가적인 측면에서, 본 발명은 또한 상기에 따른 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다. 벡터는 진핵생물 발현 벡터, 원핵생물 발현 벡터, 인공 염색체, 파지 벡터 등일 수 있다.
본 발명에 따른 벡터 또는 핵산 분자는 보존 또는 항체 발현 등을 위해 숙주 세포에 형질전환 또는 형질감염시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 추가적인 측면에서, 본 발명은 상기에 따른 핵산 분자 및/또는 벡터를 포함한 숙주세포, 또는 상기에 따른 핵산 분자 및/또는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 박테리아 또는 곤충, 진균, 식물 또는 동물 세포와 같은 임의의 원핵 또는 진핵 세포일 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 예를 들어, 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역 또는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄는 본 발명에 따른 핵산 분자로부터 수득될 수 있고, 이어서 항체 항체의 선택적인 다른 도메인과 조립함으로써 얻어진다. 대안적으로, 본 발명에 따른 숙주 세포는 숙주 세포가 항체의 중쇄 가변 영역 및/또는 경쇄 가변 영역 또는 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 발현하도록 하는 조건 하에 배양되고 항체로 조립한다. 선택적으로, 상기 방법은 생산된 항체를 회수하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 핵산 분자, 벡터 및/또는 숙주 세포는 조성물, 보다 구체적으로 제약 조성물, 예컨대 제약 제제에 실제로 필요한 만큼 다양한 목적을 위해 포함될 수 있다.
따라서, 추가의 측면에서, 본 발명은 또한 상기에 따른 항체 또는 그의 단편, 핵산 분자, 벡터 및/또는 숙주 세포, 및 임의로 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물, 바람직하게는 제약 조성물을 제공한다.
약제학적 조성물은 바람직하게는 경구 투여 및 비경구 투여(피하, 근육내 및 정맥내 투여 포함)를 위한 특정 투여 형태로 제조될 수 있으며, 고체 투여 형태, 액체 투여 형태, 반액체 투여 형태, 에어로졸 투여 형태 및 좌제 투여 형태 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 예를 들어, 경구 투여에 적합한 투여 형태는 정제, 캡슐, 과립, 산제, 환제, 분말, 로젠지, 시럽 및 현탁액을 포함하고; 비경구 투여에 적합한 투여 형태는 수성 또는 비수성 용액 및 에멀젼, 예를 들어 피하 주사를 포함한다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 항체 약물에 대해 치료학적으로 유효한 비경구 또는 비경구(비경구) 경로를 통해 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 개시내용에 따른 제약 조성물은 전신 또는 국소 투여를 위한 제약상 허용되는 부형제 (예를 들어, 부형제 (ehicle) ) 를 함유하는 제제로 형성된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 의약 제조에서의 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포 및/또는 조성물의 용도를 제공한다. 바람직하게는, 약제는 인간 인터루킨 4 수용체 (IL-4R) 또는 인간 인터루킨 4 (IL-4) 와 인간 인터루킨 13 (IL-13) 의 신호 전달 경로와 관련된 질병 또는 장애의 예방, 치료 또는 개선을 위한 것이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 또한 항체 또는 그의 항원-결합 단편, 핵산 분자, 벡터, 숙주 세포, 및/또는 본 발명에 따른 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 (예를 들어, 치료 유효량) 투여하는 것을 포함하는, 질환 또는 장애를 예방, 치료 또는 개선하는 방법을 제공할 수 있다. 바람직하게는, 질병 또는 장애는 상기 기재된 바와 같이 인간 인터루킨 4 수용체(IL-4R), 또는 인간 인터루킨 4(IL-4) 또는 인간 인터루킨 13(IL-13) 신호전달 경로와 관련이 있다.
본 발명에 의해 제공되는 상기 용도 또는 방법에서, 질환 또는 장애는 자가면역 질환, 알레르기 질환, 종양 또는 암을 포함한다.
바람직하게는, 질환 또는 장애는 자가면역 질환 또는 알레르기 질환, 예를 들어 피부염(예: 아토피성 피부염), 천식(예: 염증성 천식, 예를 들어 염증성 천식 2형), 만성 식도염(예: 호산구성 식도염), 습진, 비염(예: 알레르기성 비염), 비용종(예: 비용종을 동반한 만성 비부비동염), 결막염, 염증성 장질환(예: 궤양성 대장염, 크론병), 염증성 신경병증, 관절염(예: 류마티스 관절염), 다발성 경화증, 홍반성 루푸스, 건선, 또는 인슐린 및 인슐린 비의존성 당뇨병, 및 기타 면역 또는 알레르기 관련 질병을 포함한다..
대안적으로, 질환 또는 장애는 종양 또는 암, 예컨대 장암, 흑색종, 피부암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 중피종, 전립선암, 방광암, 항문암, 교모세포종, 성상세포종, 간암, 신장암, 식도암, 위암, 폐암, 두경부암, 골수종, 골암, 에이즈 관련 카포시 육종, 호지킨 또는 비호지킨 림프종, 전립선암, 전립선 종양, 림프종 , 췌장암 등을 포함한다.
바람직하게, 제약은 상기와 같은 질병 또는 장애 중 하나 이상의 예방, 치료 또는 개선을 위한 것이다.
바람직하게, 대상은 포유동물, 바람직하게는 영장류이고; 더 바람직하게는, 대상은 인간이다.
본 발명에 의해 제공된 인간 IL-4R(IL-4Rα)의 알파 사슬의 특이적 에피토프에 기초하여, 상기는 또한 인간 IL-4R 또는 인간 IL-4/IL-13 신호전달 경로의 차단제에 대한 스크리닝에서 특정 에피토프의 용도를 제공하고, 또는 결합제 또는 차단제의 효능을 평가하는데 있어서 특정 에피토프의 용도를 제공한다. 상기 기재된 바와 같이, 에피토프는 서열 번호 1. 에 기재된 아미노산 서열 세트의 아미노산 잔기D92, V94, D97, L67, L68, A96, H156, C207, Q63 및 L64 중 하나 이상을 포함한다.
바람직하게는, 에피토프는 서열 번호 1. 에 기재된 아미노산 서열 세트의 아미노산 잔기 D92, V94, 및 D97 중 하나 이상을 포함한다.
본 발명의 특정 실시 예. 에 따르면, 에피토프는 서열 번호 1. 에 기재된 아미노산 서열 세트에서 하기 아미노산 잔기를 포함한다:
(1) D92;
(2) D97;
(3) D92, V94, 및 D97;
(4) D92 및 V94;
(5) D92 및 D97; 또는
(6) V94 및 D97.
및/또는, 에피토프는 서열 번호 1. 에 기재된 아미노산 서열 세트에서 하기 아미노산 잔기를 포함한다: (i) Q63 및 L64
및/또는, 에피토프는 서열 번호 1. 에 기재된 아미노산 서열 세트에서 아미노산 잔기 L67, L68, 및 A96 를 포함한다:
바람직하게는, 에피토프는 서열 번호 1. 에 기재된 아미노산 서열 세트에서 하기 아미노산 잔기를 포함한다:
② L67 및 L68;
③ L67, L68, 및 A96; 또는
③ A96.
본 발명의 특정 실시 예. 에 따르면, 에피토프는 서열 번호 1. 에 기재된 아미노산 서열 세트에서 하기 아미노산 잔기를 포함한다:
(A) L67, L68, A96, H156, 및 C207;
(B) A96, H156, 및 C207;
(C) L67, L68, H156, 및 C207;
(D) L67, L68, A96, 및 C207; 또는
(E) L67, L68, A96, 및 H156.
특히 바람직하게는, 에피토프는 서열 번호 1. 에 기재된 아미노산 서열 세트에서 하기 아미노산 잔기를 포함한다:
(P-1) D97, L67, 및 L68;
(P-2) D97, L67, L68, A96, 및 D92;
(P-3) D97, L67, L68, 및 D92;
(P-4) D97, Q63, 및 L64;
(P-5) D97, Q63, L64, 및 D92;
(P-6) D97, Q63, L64, D92, 및 A96; 또는
(P-7) D97, Q63, L64, L67, 및 L68.
상기와 같은 특정 에피토프의 용도에 기초하여, 본 발명은 인간 인터루킨 4 수용체 (IL-4R) 에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 인간 인터루킨 4(IL-4) 또는 인간 인터루킨 13(IL-13) 특이적으로 신호전달 경로를 차단하는 차단제에 대한 하기와 같은 단계를 포함하는 스크리닝 방법을 제공한다: 스크리닝될 제제를 인간 IL-4R 또는 그의 일부와 접촉시킨 다음, 제제가 본 발명에 따른 에피토프에 결합할 수 있는지 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 상기에 따른 에피토프에 결합할 수 있는 제제가 검출되는 경우, 이는 결합제 또는 차단제로서 식별된다.
대안적으로, 본 발명은 또한 하기 단계를 포함하는 제제의 효능을 평가하는 방법을 제공한다: 평가할 제제를 인간 인터루킨 4 수용체 (IL-4R) 또는 그의 일부와 접촉시킨 후 제제 본 발명에 따른 에피토프에 결합할 수 있다.
제제가 본 개시내용에 따른 에피토프에 결합할 수 있는 것으로 검출되는 경우, 인간 인터루킨 4 수용체 (IL-4R) 에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 인간 인터루킨 4 (IL-4) 또는 인간 인터루킨 13 (IL-13) 신호전달 경로를 특이적으로 차단하는 차단제로서 확인되고, 이에 따라 본 발명에 기재된 질환 또는 장애를 예방, 치료 또는 개선하는데 효능이 있다.
본 발명에 따른 결합제 또는 차단제의 스크리닝 방법 또는 제제의 효능 평가 방법에서, 바람직하게는, 스크리닝 또는 평가될 제제는 항체, 예를 들어 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체이다. 보다 바람직하게는 인간 IL-4R 또는 그의 일부를 면역원으로 하여 동물을 면역화함으로써 항체를 수득한다.
결합제 또는 차단제의 스크리닝 방법 또는 제제의 효능 평가 방법에서, 바람직하게는, 본 발명에 따른 제제가 에피토프에 결합할 수 있는지 여부를 검출하는 것은 다음과 같이 수행될 수 있다: 인간 IL-4R 또는 이의 일부의 부위 지향적 돌연변이유발을 통해 본 발명에 따른 에피토프에 포함된 하나 이상의 아미노산 잔기를 돌연변이시키는 단계, 돌연변이 후의 인간 IL-4R 또는 이의 일부에 대한 제제의 결합 활성 또는 친화도를 돌연변이 전의 것과 비교 시 현저히 낮거나 심지어 손실된 경우, 본 발명에 따른 에피토프에 결합할 수 있는 제제를 확인하는 단계.
구체적으로, 본 발명에 따른 결합제 또는 차단제의 스크리닝 방법 또는 제제의 효능 평가 방법은 다음과 같은 단계를 포함할 수 있다:
1) 인간 인터루킨 4 수용체 (IL-4R) 또는 이의 일부의 부위-지정 돌연변이유발을 통해 본 발명에 따른 에피토프에 포함된 하나 이상의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 인간 IL-4R 또는 이의 일부의 돌연변이체를 수득하는 단계 ;
2) 인간 IL-4R 또는 이의 일부 및 인간 IL-4R의 변이체 또는 이의 일부와 스크리닝된 제제 또는 평가 대상인 제제를 각각 접촉시키고, 각각에 대한 결합 활성 또는 친화도를 검출하는 단계;
3) 돌연변이된 인간 IL-4R 또는 이의 일부에 대한 제제의 결합 활성 또는 친화도가 인간 IL-4R 또는 이의 일부에 대한 제제의 결합 활성 또는 친화도와 비교하여 상당히 더 낮거나 심지어 손실되는 경우, 본 발명에 따른 에피토프에 결합할 수 있는 제제를 확인하는 단계.
당업자는 결합 활성 또는 친화도가 유의하게 더 낮은지 또는 손실되는지를 일상적으로 결정할 수 있다. 예를 들어, 인간 IL-4R의 변이체 또는 이의 일부에 대한 제제의 결합 활성 또는 친화도가 돌연변이 전의 결합 활성 또는 친화도의 10분의 1인 경우, 결합 활성 또는 친화도가 현저히 낮은 것으로 결정할 수 있다.
바람직하게는, 단계 1)에서, 에피토프에 포함된 하나 이상의 아미노산 잔기는 상응하는 위치에서 알라닌 또는 사이노몰구스 인터루킨 4 수용체의 아미노산 잔기로 돌연변이되어 인간 IL-4R 또는 그의 일부의 돌연변이체를 수득한다. .
바람직하게는, 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 인간 IL-4R의 부분은 인간 IL-4R, 추가로 인간 sIL-4R 알파의 알파 사슬이다. 따라서, 바람직하게는 인간 IL-4Rα를 사용하여 방법을 수행하고 인간 IL-4Rα의 돌연변이체를 수득한다. 또한, 상기 방법은 인간 sIL-4Rα를 사용하여 수행할 수 있으며, 하기 표 3. 에 열거된 인간 sIL-4Rα의 돌연변이체 중 하나 이상을 단계 1)에서 돌연변이체로 사용한다.
본 발명에서 인간 IL-4Rα는 NCBI 수탁번호 NP_000409.1의 서열을 의미하며; 인간 sIL-4Rα의 아미노산 서열은 서열 번호 1.; 그리고 시노몰구스 sIL-4Rα의 아미노산 서열은 서열 번호 2. 로 제시된다
.
실험은 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 인간 인터루킨 4 수용체 (IL-4R) 의 알파 사슬 (IL-4Rα) 에 위치한 에피토프에 결합한다는 것을 증명하고, 에피토프는 서열 번호 1. 에 기재된 아미노산 서열 세트의 아미노산 잔기 D92, V94, D97, L67, L68, A96, H156, C207, Q63 및 L64. 1 중 하나 이상을 포함한다. 면역 반응에서 sIL-4Rα의 에피토프는 이전에 덜 연구되며, 본 발명에서는 IL-4R에 대한 항-IL-4R 항체의 결합에서 중요한 위치가 처음으로 정의된다.
따라서, 본 발명은 IL-4R의 신규 에피토프에 결합하는 인간 IL-4R, 특히 IL-4Rα에 대한 항체를 제공한다. 항체는 인간 IL-4R, 특히 IL-4Rα에 대한 신규하고 유용하며 효과적인 항체일 수 있다. 또한, 본 발명은 인간 IL-4Rα에 대한 상기에 의해 제공된 항체의 결합에서 중요한 위치를 설명함으로써 IL-4R, 특히 인간 IL-4Rα에 대한 잠재적인 항체 또는 약물의 개발에 대한 대안적 접근을 제공한다.
본 발명의 실시 예. 는 첨부된 도면을 참조하여 하기에 상세히 설명되며, 여기서:
도 1. 인간 IL-4Rα(서열_1; 서열번호 1) 및 사이노몰구스 IL-4Rα(서열_2; 서열번호 2)의 정렬을 나타낸다.
도 2. 본 발명의 항체의 안정성을 나타내며, 여기서 패널 2A는 40℃에서 2주 동안 보관한 후의 결과를 나타내고; 패널 2B는 40°C에서 4주 동안 보관한 후의 결과를 보여준다.
도 1. 인간 IL-4Rα(서열_1; 서열번호 1) 및 사이노몰구스 IL-4Rα(서열_2; 서열번호 2)의 정렬을 나타낸다.
도 2. 본 발명의 항체의 안정성을 나타내며, 여기서 패널 2A는 40℃에서 2주 동안 보관한 후의 결과를 나타내고; 패널 2B는 40°C에서 4주 동안 보관한 후의 결과를 보여준다.
본 발명에서, 용어 "에피토프" 는 항체 또는 이의 단편이 항원 및 항원의 서열에서 아미노산 잔기(들)의 상응하는 위치(들)에 결합하는 경우, 결합 부위에 상응하는 항원의 아미노산 잔기(들)를 지칭한다; 또한 에피토프의 아미노산 잔기의 돌연변이는 102ng/ml 이상의 결합 활성 감소 또는 하기 "(I) 결합 활성 검출 방법"에 기술된 절차에 따라 측정된 결합 활성의 손실을 초래할 것이다.
하기 실험 절차 또는 정의가 본 발명에 포함된다. 본 발명은 또한 당업계의 다른 통상적인 기술에 의해 구현될 수 있으며, 하기 실험 절차에 제한되지 않는다는 점에 유의해야 한다.
(I) 결합 활성 검출 방법
1. 시약의 준비
항원 조제: 항원을 PBS 중 100㎍/ml 용액으로 조제하고, 서브패키징 후 -20℃의 냉장고에 보관한다.
검출될 항체의 제조: 검출될 항체를 1% BSA를 함유하는 PBS로 원하는 농도 0, 0.032, 0.16, 0.8, 4, 20, 100, 500 및 2500ng/ml로 희석한다.
2차 항체 작업 용액의 제조: 2차 항체 스톡 용액(Goat Anti-Human IgG-Fc Secondary Antibody (HRP), sino biological, Cat Number: SSA001)을 1% BSA가 포함된 PBS로 16000배 희석하여 작업 용액을 얻는다. 예를 들어, 1% BSA를 포함하는 PBS 15999㎕에 2차 항체 스톡 용액 1㎕를 첨가하고, 얻어진 혼합물을 상하를 반복하여 잘 혼합한다. 원하는 부피의 2차 항체 작업 용액은 실험 요구 사항에 따라 확장하여 준비할 수 있다.
2. ELISA 검출
100μg/ml 항원 용액 50μl를 PBS 9.95ml에 첨가하고, 얻어진 혼합물을 상하 반전시켜 잘 혼합하여 0.5μg/ml 항원 코팅 용액을 얻는다. 제조된 항원 코팅 용액을 12채널 피펫(RAININ)을 사용하여 피펫팅하고 96웰 플레이트(Corning)에 웰당 100㎕씩 첨가한다. 96웰 플레이트를 방부제 필름으로 싸고(또는 덮고) 4°C의 냉장고에서 밤새 인큐베이션한다. 다음날, 96-웰 플레이트를 제거하고, 그 안의 용액을 버리고, 플레이트를 깨끗한 종이 타월로 가볍게 두드려 건조시킨다. PBS를 96웰 플레이트에 웰당 300㎕씩 첨가한다. 플레이트를 실온에서 3분 동안 방치한 후, 그 안의 용액을 버리고 플레이트를 깨끗한 종이 타월로 가볍게 두드려 건조시킨다. 그 다음, 플레이트를 3회 세척한다. 2% BSA를 함유하는 PBS를 96-웰 플레이트에 웰당 300㎕ 첨가한다. 96웰 플레이트를 방부제 필름으로 싸고(또는 덮고) 37°C의 항온 인큐베이터에서 2시간 동안 인큐베이션한다. 96-웰 플레이트를 제거하고, 그 안의 용액을 버리고, 96-웰 플레이트를 깨끗한 종이 타월로 가볍게 두드려 건조시킨다. 0.05% Tween-20(Beyotime, Cat Number: ST825)을 함유하는 PBS를 96-웰 플레이트에 웰당 300㎕를 첨가한다. 플레이트를 실온에서 3분 동안 방치한 후, 그 안의 용액을 버리고 플레이트를 깨끗한 종이 타월로 가볍게 두드려 건조시킨다. 그 다음, 플레이트를 3회 세척한다.
상기와 같이 순차적으로 희석된 검출하고자 하는 항체를 웰당 100㎕씩 해당 웰에 각각 첨가하고 각 샘플을 3개의 웰에 복제한다. 96웰 플레이트를 방부제 필름으로 싸고(또는 덮고) 37°C의 항온 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 96-웰 플레이트를 제거하고, 그 안의 용액을 버리고, 96-웰 플레이트를 깨끗한 종이 타월로 가볍게 두드려 건조시킨다. 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS를 96-웰 플레이트에 웰당 300㎕ 첨가한다. 플레이트를 실온에서 3분 동안 방치한 후, 그 안의 용액을 버리고 플레이트를 깨끗한 종이 타월로 가볍게 두드려 건조시킨다. 그 다음, 플레이트를 3회 세척한다. 2차 항체 작업 용액을 96-웰 플레이트에 웰당 100㎕ 첨가한다. 96웰 플레이트를 방부제 필름으로 싸고(또는 덮고) 37°C의 항온 인큐베이터에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 그런 다음 96-웰 플레이트를 제거하고 그 안의 용액을 버리고 깨끗한 종이 타월로 플레이트를 가볍게 두드려 건조시킨다. 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS를 96-웰 플레이트에 웰당 300㎕ 첨가한다. 플레이트를 실온에서 3분 동안 방치한 후, 그 안의 용액을 버리고 플레이트를 깨끗한 종이 타월로 가볍게 두드려 건조시킨다. 그 다음, 플레이트를 3회 세척한다. TMB 기질 용액(SurModics, Cat Number: TMDS-1000-01)을 96웰 플레이트에 웰당 100㎕를 첨가한다. 그런 다음 플레이트를 37°C의 항온 인큐베이터에서 5분 동안 인큐베이션한 다음 2M H2SO4 용액을 즉시 96웰 플레이트에 첨가하여 반응을 중지시킨다. 96웰 플레이트를 flexstation 3(Molecular Devices)에 놓고 OD450 값을 읽고 계산 및 분석을 위해 데이터를 수집한다.
(II) 세포 기능 활성 검출 방법
1. 시약의 준비
인간 IL-4의 제조 (Invivogen, Cat Number: rhIL-4) : 인간 IL-4를 PBS 중 100㎍/ml 용액으로 제조하고, 이를 서브패키징한 후 -20℃의 냉장고에 보관한다.
인간 IL-13의 제조 (Invivogen, Cat Number: rhIL-13) : 인간 IL-13을 PBS 중 100㎍/ml 용액으로 제조하고, 이를 서브패키징한 후 -20℃에서 냉장고에 보관한다.
Quanti-blue(I) 용액의 제조 : Quanti-blueTM 분말 팩을 멸균 250mL 병에 부은 다음 멸균수 100mL를 첨가한다. 수득된 혼합물을 부드럽게 혼합하고, 병을 37℃에서 30분 동안 수조에 넣는다. 분말이 완전히 용해되면 병을 4°C의 어두운 곳에서 밤새 냉장고에 넣는다. 그 후, 그 안의 용액을 튜브당 10mL씩 소포장하고 -20°C에서 암소에 보관했습니다. 용액은 6개월 동안 보관할 수 있다.
검출할 항체의 제조: 검출할 항체를 10% FBS(Hyclone, Cat number SV30184.02)를 함유하는 DMEM 배지(HyClone, Cat number SH30022.01)에 원하는 농도(1000, 200, 40, 8, 1.6, 0.32, 0.064, 0.0128, 0.00256, 0ng/ml)까지 희석한다.
2. 세포 배양
냉동 HEK-Blue™ IL-4/IL-13 세포(Invivogen, Cat number hkb-il413)를 액체 질소에서 제거하고 37°C 수조에서 부드럽게 흔들어 빠르게 용해한다. 용해된 세포 현탁액을 15 ml 원심분리 튜브에 옮기고, DMEM 배지(10% FBS, 10 μg/ml Blasticidin, 100 μg/ml Zeocin 및 100 μg/ml Normocin 함유)를 튜브에 10 ml로 첨가하고, 그런 다음 튜브를 800rpm에서 5분 동안 원심분리한다. 상층액을 빨아내고 남은 세포 펠렛을 1회 세척한다. 10 ml의 DMEM 배지를 세포에 첨가하여 세포 밀도를 1×105 - 1×106 cells/ml로 조정한다. 그런 다음 세포 현탁액을 T75 세포 배양 병(Nunc)으로 옮기고 고정 배양을 위해 37°C, 5% CO2 인큐베이터(Thermo)에 넣는다. 2-3일마다 세포 현탁액을 취하여 800 rpm에서 5분 동안 원심분리하고 얻은 세포를 10 ml의 배양 배지에 재현탁하고 이로부터 1 x 106 세포를 계수하고 새로운 T75 세포로 옮긴다. 동시에 배양 배지가 10 ml로 보충된 배양 병. 세포는 하기 실험을 수행하기 전에 세포의 양호한 성장 상태 (세포는 투명하고, 방추형 및 부착형) 를 달성하기 위해 연속적으로 2-3회 계대배양된다
3. 차단 실험
성장 상태가 좋은 세포가 들어있는 T75 세포병을 취하여 그 안의 상층액을 버리고 10 ml의 PBS로 부착된 세포를 조심스럽게 떼어낸다. 분리된 세포를 15 ml 원심분리 튜브에 옮기고 800 rpm에서 5분간 원심분리하고 세포 펠렛을 10 ml PBS에 재현탁시킨다. 세포를 다시 800rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액을 버리고 남은 세포 펠릿을 10% FBS가 포함된 DMEM 배지 5ml에 재현탁하고 세포 계수 후 배지를 보충하여 세포를 조정한다. 6.6×105 세포/ml의 밀도. 세포 현탁액을 384 웰 플레이트에 웰당 30㎕씩 첨가한다. 상기와 같이 제조된 상이한 농도에서 검출하고자 하는 항체를 384웰 플레이트의 웰에 있는 세포에 웰당 10㎕씩 첨가한다(각 샘플은 3개의 웰에서 복제됨). 인간 IL-4 또는 인간 IL-13을 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 2.5ng/ml로 희석하고, 2.5ng/ml 인간 IL-4 또는 인간 IL-13을 384웰 플레이트의 상응하는 웰에 첨가한다, 10 웰당 ㎕, 각 웰의 최종 세포 수가 2×104가 되도록, 인간 IL-4 또는 인간 IL-13의 최종 농도는 0.5ng/ml, 각 웰의 최종 부피는 384웰 플레이트는 50㎕이다. 384-웰 플레이트를 세포의 고정 배양을 위해 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 넣는다.
4. 데이터 통계
384 웰 플레이트를 5% CO2 인큐베이터에서 22시간 동안 인큐베이션한 후, 45 μl의 Quanti-blue 용액을 새로운 384 웰 플레이트의 각 웰에 첨가한다. 22시간 동안 인큐베이션된 플레이트의 각 웰에 있는 상등액을 피펫으로 옮기고 새로운 384웰 플레이트의 해당 웰에 웰당 5μl씩 첨가한 다음, 37°C에서 60분 동안 인큐베이션한다. 384 웰 플레이트를 flexstation 3에 놓고 OD650 값을 읽고 계산 및 분석을 위해 데이터를 수집한다.
본 발명은 특정 예. 를 참조하여 하기에 예시된다. 상기 실시 예. 는 단지 본 발명을 예시하고 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하지 않는다는 것이 당업자에 의해 이해될 것이다.
다음 실시 예. 의 실험 절차는 달리 명시되지 않는 한 모두 통상적인 것이다. 다음 실시 예. 에 사용된 원료 및 시약은 달리 명시되지 않는 한 모두 상업적으로 이용 가능한 제품이다.
인간 sIL-4Rα: NP_000409.1, Met1-His232, 서열 번호 1. 에 명시;
시노몰구스 sIL-4Rα: EHH60265.1, Met1-Arg232, 서열 번호 2. 에 명시.
실시 예 1. 뮤린, 키메라 및 인간화 항체의 제조
10마리의 마우스를 인간 sIL-4Rα(서열번호 1)로 면역화하고; 마우스의 혈액을 채취하여 "(I) 결합 활성 검출 방법" 및 "(II) 세포 기능 활성 검출 방법"에 기재된 절차에 따라 검출한다. 두 개의 검출 결과에 대한 종합적인 분석에 따르면, 가장 좋은 결과를 보인 두 마리의 마우스가 각각 융합을 위해 선택된다.
다른 융합에서 얻은 상등액은 "(I) 결합 활성 검출 방법" 및 "(II) 세포 기능 활성 검출 방법"에 설명된 절차에 따라 다시 검출된다. 두 가지 검출 결과를 종합적으로 분석한 결과, 활성이 가장 높은 모 클론을 서브클로닝 대상으로 선택한다. "(I) 결합 활성 검출 방법" 및 "(II) 세포 기능 활성 검출 방법"에 기재된 절차에 따른 검출을 통해 14개의 뮤린 모노클로날 항체를 최종적으로 스크리닝한다. 14개의 모노클로날 항체의 서열을 분석하여 9쌍의 새로운 서열을 갖는 항체를 얻는다. 항체의 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 다음과 같다. IMGT 도구에 의해 정의된 CDR에는 밑줄이 그어져 있다.
Y0188-1
중쇄 가변 영역 (서열 번호 3.; CDR 순차적으로: 서열 번호 35., 서열 번호 36., 서열 번호 37.)
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNTYGMHWVRQAPGKGLEWVAHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRWFRAMDYWGQGTSVTVSS
경쇄 가변 영역(서열 번호 4.; CDR 순차적으로: 서열 번호 53., 서열 번호 54., 서열 번호 55.)
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQEKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
Y0188-2
중쇄 가변 영역 (서열 번호 5.; CDR 순차적으로: 서열 번호 38., 서열 번호 39., 서열 번호 40.)
EVQLIESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNMYAMDWVRQAPGKGLEWVARIRSKGSNFETNYADSVKDRFTISRDDSQSMVYLQMINLKTEDTAMYYCVRHRGGAWFAYWGQGTLVSVSA
경쇄 가변 영역(서열 번호 6.; CDR 순차적으로: 서열 번호 56., 서열 번호 57., 서열 번호 58.)
DIVVTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDVAIYYCQHSRELPLTFGAGTKLELK
Y0188-3
중쇄 가변 영역 (서열 번호 7.; CDR 순차적으로: 서열 번호 41., 서열 번호 42., 서열 번호 43.)
QVQLVETGGGLVRPGNSLKLSCVTSGFTFSNYRMHWLRQPPGKRLEWIAVITVKSNNYGANYAESVKGRFAISRDDSKSSVYLEMNRLREEDTATYFCSRERAYGNPFDYWGQGTTLTVSS
경쇄 가변 영역(서열 번호 8.; CDR 순차적으로: 서열 번호 59., 서열 번호 60., 서열 번호 61.)
DIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGYLSWLQQKPDGTIKRLIYAASTLDSGVPKRFSGSRSGSDYSLTISSLESEDFADYYCLQYGSYPYTFGGGTKLEIK
Y0188-4
중쇄 가변 영역 (서열 번호 9.; CDR 순차적으로: 서열 번호 44., 서열 번호 45., 서열 번호 46.)
Heavy chain variable region (SEQ ID NO: 9; CDRs sequentially: SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46)
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNMYAMNWVRQAPGQGLEWVARIRSKSNNYATYYADSVKDRFIISRDDSESMVYLQMSNLRAADTAMYYCVRHLRAMDYWGQGTSVTVSS
경쇄 가변 영역(서열 번호 10.; CDR 순차적으로: 서열 번호 56., 서열 번호 57., 서열 번호 62.)
DIVLTQSPASLTVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPITFGSGTKLEIK
Y0188-6
중쇄 가변 영역 (서열 번호 11.; CDR 순차적으로: 서열 번호 44., 서열 번호 47., 서열 번호 46.)
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFSFNMYAMNWVRQAPGKGLEWVARIRTKSNHYSTYYADSVKDRFTISRDDSASMFYLQMNNLKTEDTAMYFCVRHLRAMDYWGQGTSVTVSS
경쇄 가변 영역(서열 번호 12.; CDR 순차적으로: 서열 번호 63., 서열 번호 64., 서열 번호 65.)
DIVLTQSPASLVVSLGQRATISCRASQSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNVQSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDVATYYCHHNRDLPFTFGSGTKLEIK
Y0188-8
중쇄 가변 영역 (서열 번호 13.; CDR 순차적으로: 서열 번호 38., 서열 번호 39., 서열 번호 40.)
EVQLIESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNMYAMDWVRQAPGKGLEWVARIRSKGSNFETNYADSVKDRFTISRDDSQSMVYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHRGGAWFAYWGQGTLVTVSA
경쇄 가변 영역(서열 번호 14.; CDR 순차적으로: 서열 번호 56., 서열 번호 57., 서열 번호 58.)
DIVVTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDVAIYYCQHSRELPLTFGAGTKLELK
Y0188-9
중쇄 가변 영역 (서열 번호 15.; CDR 순차적으로: 서열 번호 48., 서열 번호 49., 서열 번호 46.)
EVQLVESGGGLVRPKGSLKLSCAASGFSFNTYAMNWVRQAPGKGLEWIVWIRSKSHNYATYYADSVKDRFTISRDDSESMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRHLRAMDYWGQGTSVTVSS
경쇄 가변 영역(서열 번호 16.; CDR 순차적으로: 서열 번호 66., 서열 번호 67., 서열 번호 68.)
DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVSASGYSYMHWYQQKPGQPPKLLIYLASNLQSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCQHSRELPPTFGGGTKLEIK
Y0188-10
중쇄 가변 영역 (서열 번호 17.; CDR 순차적으로: 서열 번호 44., 서열 번호 50., 서열 번호 51.)
EVRLVESGGGLVQPKGSLKLSCEASGFSFNMYAMNWVRQAPGKGLEWITHIRSKSNNYATYYADSVKDRFIISRDDSESMVYLQMNNLKTEDTAMYYCVRLLRALDYWGQGTSVTVSS
경쇄 가변 영역(서열 번호 18.; CDR 순차적으로: 서열 번호 56., 서열 번호 57., 서열 번호 69.)
DIVLTQSPASLAVFLGQRATISCRASKSVSTSGYSYMHWYQQKAGQPPKLLIYLASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDAATYYCHHSRELPITFGSGTKLEMK
Y0188-14
중쇄 가변 영역 (서열 번호 19.; CDR 순차적으로: 서열 번호 52., 서열 번호 36., 서열 번호 37.)
Heavy chain variable region (SEQ ID NO: 19; CDRs sequentially: SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 37)
EVQLVESGGGLVQPKGSLKLSCAASGFTFNMYGMHWVRQAPGKGLEWVAHIRSKSSNYATYYADSVKDRLTISRDDSQSMLYLQMNNLKTEDTAMYYCVRWFRAMDYWGQGTSVTVSS
경쇄 가변 영역(서열 번호 20.; CDR 순차적으로: 서열 번호 53., 서열 번호 54., 서열 번호 55.)
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKASQDVSTAVAWYQEKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSGTDYTLTISSVQAEDLALYYCQQHYSTPLTFGAGTKLELK
9개의 키메라 항체는 상기 가변 영역 서열을 사용하고 중쇄 불변 영역을 코딩하는 서열 번호 71. 에 기제된 아미노산 서열 세트 및 경쇄 불변 영역을 코딩하는 서열 번호 72 에 기제된 아미노산 서열 세트를 사용한다. 9개의 키메라 항체를 발현 및 정제하여 murine 항체의 이름에 Q를 더한 이름으로 명명한다. 키메라 항체의 IC50 값은 "(II) 세포 기능 활성 검출 방법"에 기재된 절차에 따라 검출하며, 친화도 (KD 인간 sIL-4Rα에 대한 키메라 항체의) 는 BIACORE 기기에 의해 측정된다. 그 결과를 하기 표 1. 에 나타낸다.
| 키메라 항체 | IC50 (ng/ml) (차단 IL-4) |
IC50 (ng/ml) (차단 IL-13) |
KD (M) |
| Y0188-1Q | 242.6 | 1146 | 2.96E-09 |
| Y0188-2Q | 283.2 | 1279 | 2.31E-09 |
| Y0188-3Q | 231.2 | 745.3 | 3.20E-09 |
| Y0188-4Q | 1309.0 | 3088 | 4.91E-09 |
| Y0188-6Q | 121.6 | 999.3 | 4.05E-09 |
| Y0188-8Q | 239.7 | 583.8 | 2.72E-09 |
| Y0188-9Q | 357.8 | 1546 | 3.67E-09 |
| Y0188-10Q | 130.9 | 808.3 | 4.17E-09 |
| Y0188-14Q | 30.18 | 55.16 | 2.91E-09 |
클론 번호 14. 로부터의 키메라 항체 (Y0188-14Q) 를 선택하고 인간화하여 중쇄 가변 영역의 7개 인간화 서열 및 경쇄 가변 영역의 7개 인간화 서열을 얻는다. 중쇄 및 경쇄 가변 영역의 인간화 아미노산 서열은 다음과 같다. IMGT 도구에 의해 정의된 CDR에는 밑줄이 그어져 있다.
중쇄 가변 영역:
> HV3-15-14H (서열 번호 21.; CDR 순차적으로: 서열 번호 52., 서열 번호 36., 서열 번호 37.) EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSMYGMHWVRQAPGKGLEWVGHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCTTWFRAMDYWGQGTLVTVSS
>HV3-48-14H (서열 번호 22.; CDR 순차적으로: 서열 번호 52., 서열 번호 36., 서열 번호 37.)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYGMHWVRQAPGKGLEWVSHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWFRAMDYWGQGTLVTVSS
>HV3-73*2-14H (서열 번호 23.; CDR 순차적으로: 서열 번호 52., 서열 번호 36., 서열 번호 37.)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSMYGMHWVRQASGKGLEWVGHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRWFRAMDYWGQGTLVTVSS
>HV3-72-14H (서열 번호 24.; CDR 순차적으로: 서열 번호 52., 서열 번호 36., 서열 번호 37.)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYGMHWVRQAPGKGLEWVGHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNSLYLQMNSLKTEDTAVYYCARWFRAMDYWGQGTLVTVSS
>Y01-14H (서열 번호 25.; CDR 순차적으로: 서열 번호 52., 서열 번호 36., 서열 번호 37.)
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSMYGMHWVRQAPGKGLEWVSHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWFRAMDYWGQGTLVTVSS
>162-14H (서열 번호 26.; CDR 순차적으로: 서열 번호 52., 서열 번호 36., 서열 번호 37.)
EVQLVESGGGLEQPGGSLRLSCAGSGFTFRMYGMHWVRQAPGKGLEWVSHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKWFRAMDYWGQGTTVTVSS
>VH73-14H (서열 번호 27.; CDR 순차적으로: 서열 번호 52., 서열 번호 36., 서열 번호 37.)
EVQLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSMYGMHWVRQASGKGLEWVGHIRSKSSNYATYYADSVKDRFTISRDDSKNTAYLQMNSLKTEDTAVYYCTRWFRAMDYWGQGTTVTVSS
경쇄 가변 영역:
>Y01-14L (서열 번호 28.; CDR 순차적으로: 서열 번호 53., 서열 번호 54., 서열 번호 55.)
EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCKASQDVSTAVAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRHTGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQHYSTPLTFGQGTKVEIK
>164-14L (서열 번호 29.; CDR 순차적으로: 서열 번호 53., 서열 번호 54., 서열 번호 55.)
DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCKASQDVSTAVAWYLQKSGQSPQLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGFYYCQQHYSTPLTFGQGTKLEIK
>KV4-14L (서열 번호 30.; CDR 순차적으로: 서열 번호 53., 서열 번호 54., 서열 번호 55.)
DIVMTQSPDSLAVSLGERATINCKASQDVSTAVAWYQQKPGQPPKLLIYWASTRHTGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK
> KV1-27-14L (서열 번호 31.; CDR 순차적으로: 서열 번호 53., 서열 번호 54., 서열 번호 55.)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKVPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK
>KV1-9-14L (서열 번호 32.; CDR 순차적으로: 서열 번호 53., 서열 번호 54., 서열 번호 55.)
DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK
> KV1-NL1-14L (서열 번호 33.; CDR 순차적으로: 서열 번호 53., 서열 번호 54., 서열 번호 55.)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLLYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK
> KV1D-43-14L (서열 번호 34.; CDR 순차적으로: 서열 번호 53., 서열 번호 54., 서열 번호 55.)
AIRMTQSPFSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPAKAPKLFIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQHYSTPLTFGGGTKVEIK
49개의 인간화 항체는 짝을 이룬 경쇄 및 중쇄 가변영역의 인간화 서열을 사용하고, 중쇄 가변 영역을 코딩하는 서열 번호 71. 에 기재된 아미노산 서열 세트 및 경쇄 가변 영역을 코딩하는 서열 번호 72. 에 기재된 아미노산 서열 세트를 사용하여 구성된다. 인간화 항체를 발현시키고, "(II) 세포 기능 활성 검출 방법"에 기재된 절차에 따라 항체의 IC50 값을 검출하고, 항체의 세포 기능 활성(KD)을 BIACORE 기기로 확인한다. 가변 영역의 바람직한 6개의 조합이 얻어진다. 그 결과를 하기 표 2. 에 나타낸다.
| 인간화 항체 | IC50 (ng/ml) (차단 IL-4) |
KD (M) |
| B4 (VH73-14H/KV1D-43-14L) | 61.95 | 6.42E-09 |
| B5 (VH73-14H/KV1-NL1-14L) | 25.06 | 2.31E-09 |
| B7 (VH73-14H/Y01-14L) | 122.0 | 5.45E-09 |
| E4 (HV3-73*2-14H/KV1D-43-14L) | 41.37 | 6.12E-09 |
| E5 (HV3-73*2-14H/KV1-NL1-14L) | 11.80 | 1.85E-09 |
| E7 (HV3-73*2-14H/Y01-14L) | 45.75 | 4.72E-09 |
실시 예 2. 결합 에피토프에 대한 연구
2.1 인간 IL-4Rα 및 시노몰구스 IL-4Rα에 대한 항체 결합의 종 차이
항원은 Cynomolgus sIL-4Rα(EHH60265.1, Met1-Arg232; SEQ ID NO. 2)를 사용하고, 항원에 대한 항체의 결합 활성은 "(I) 결합 활성 검출 방법"에 기재된 절차에 따라 검출한다.
2.2 돌연변이될 항원 서열의 위치 선택
인간 IL-4Rα 및 시노몰구스 IL-4Rα의 서열은 도 1. 에 도시된 바와 같이 정렬된다. 인간 IL-4Rα의 서열이 시노몰구스 IL-4Rα의 서열과 다른 일부 위치는 항체가 IL-4Rα에 결합하는 중요한 위치일 가능성이 있어 항체가 사이노몰구스 서열이 아닌 인간 서열에 결합한다. 따라서 인간 IL-4Rα 서열에서 아미노산이 시노몰구스 IL-4Rα 서열과 다른 위치에 단일 점 돌연변이 또는 결합 돌연변이가 발생하고, 사이노몰구스 IL-4Rα 서열에서 상응하는 위치(들)에서 아미노산(들)을 아미노산(들)으로 변경하기 위해; 및 차등 아미노산(들)이 존재하는 위치(들) 부근의 비알라닌 아미노산(들), 아미노산(들)을 알라닌으로 변경하기 위해 단일 점 돌연변이 또는 결합 돌연변이를 적용한다. 이어서, 돌연변이 조합이 상이 인간 sIL-4Rα의 돌연변이체를 구축하고(하기 표 3. 참조) "(II) 세포 기능 활성 검출 방법"에 기재된 절차에 따라 활성을 확인한다.
| 번호. | 돌연변이 또는 돌연변이 조합 | 번호. | 돌연변이 또는 돌연변이 조합 |
| sIL-4R-QSMDH | sIL-4R-L67Q/L68S/A96M/H156D/C207H | sIL-4R-63/64 | sIL-4R-Q63A/L64A |
| sIL-4R-MDH | sIL-4R-A96M/H156D/C207H | sIL-4R-65/66 | sIL-4R-V65A/F66A |
| sIL-4R-QSDH | sIL-4R-L67Q/L68S/H156D/C207H | sIL-4R-92 | sIL-4R-D92A |
| sIL-4R-QSMH | sIL-4R-L67Q/L68S/A96M/C207H | sIL-4R-94 | sIL-4R-V94A |
| sIL-4R-QSMD | sIL-4R-L67Q/L68S/A96M/H156D | sIL-4R-97 | sIL-4R-D97A |
| sIL-4R-S | sIL-4R-L68S | sIL-4R-92/94/97 | sIL-4R-D92A/V94A/D97A |
| sIL-4R-Q | sIL-4R-L67Q | sIL-4R-92/94 | sIL-4R-D92A/V94A |
| sIL-4R-92/97 | sIL-4R-D92A/D97A | ||
| sIL-4R-94/97 | sIL-4R-V94A/D97A |
2.3 결합 활성 검출
6개의 인간화 고활성 항체의 항원에 대한 결합 활성은 표 3. 에 나타낸 인간 sIL-4Rα 단백질 및 sIL-4Rα의 다른 변이체를 이용하여 "(I) 결합 활성 검출 방법"에 기재된 절차에 따라 검출한다. 항원 및 항체를 1차 항체로 사용합니다. 결과는 표 4. 에 나와 있다.
9개의 키메라 항체의 항원에 대한 결합 활성은 표 3. 에 나타낸 인간 sIL-4Rα 단백질 및 sIL-4Rα의 상이한 변이체를 항원으로 사용하고 항체를 1차 항체로 사용함으로써 유사하게 검출된다. 결과는 표 5. 에 나와 있다.
인간과 시노몰구스 sIL-4Rα 사이의 아미노산이 다른 위치와 그 부근에서 아미노산이 변이된 sIL-4Rα 변이체에 대한 항체의 결합 활성이 변화하거나 심지어는 sIL-4Rα에 대한 결합 활성과 비교하여 역전된 항체의 결합 활성이 스크리닝을 통해 밝혀진다.
| 항원 | B5 | E5 | B4 | E4 | B7 | E7 |
| sIL-4R-His | 결합 (18.4) | 결합 (12.2) | 결합 (10.8) | 결합 (13.2) | 결합 (9.47) | 결합 (12.1) |
| sIL-4R-QSMDH | 약한 결합(2.48e+03) | 결합 (646) | 약한 결합 (2.29e+03) | 약한 결합 (1.15e+04) | 약한 결합 (1.43e+04) | 약한 결합 (6.45e+03) |
| sIL-4R-MDH | 결합 (13.2) | 결합 (9.06) | 결합 (9.58) | 결합 (9.54) | 결합 (9.12) | 결합 (8.81) |
| sIL-4R-QSDH | 결합 (43.1) | 결합 (23.2) | 결합 (84.5) | 결합 (83.9) | 결합 (328) | 결합 (244) |
| sIL-4R-QSMH | 결합 (674) | 결합 (512) | 약한 결합 (1.54e+03) | 약한 결합 (1.67e+03) | 약한 결합 (3.72e+03) | 약한 결합 (2.01e+03) |
| sIL-4R-QSMD | 결합 (345) | 결합 (174) | 약한 결합 (1.64e+03) | 약한 결합 (2.39e+03) | 약한 결합 (2.32e+03) | 약한 결합 (5.26e+03) |
| sIL-4R-63/64 | 결합 (18.3) | 결합 (12.9) | 결합 (15.9) | 결합 (15.3) | 결합 (29.4) | 결합 (24.1) |
| sIL-4R-65/66 | 결합 (14.8) | 결합 (11.5) | 결합 (13.2) | 결합 (12.3) | 결합 (11.1) | 결합 (12.1) |
| sIL-4R-Q | 결합 (16.8) | 결합 (11) | 결합 (12.7) | 결합 (11.4) | 결합 (11.1) | 결합 (12.3) |
| sIL-4R-S | 결합 (19.3) | 결합 (10.9) | 결합 (16.8) | 결합 (15.6) | 결합 (35.5) | 결합 (35) |
| sIL-4R-92 | 결합 (24.6) | 결합 (14.1) | 결합 (31.3) | 결합 (29.2) | 결합 (166) | 결합 (131) |
| sIL-4R-94 | 결합 (19.9) | 결합 (14.4) | 결합 (18.9) | 결합 (15) | 결합 (12.9) | 결합 (15.6) |
| sIL-4R-97 | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. |
| sIL-4R-92/94/97 | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. |
| sIL-4R-92/94 | 결합 (19.4) | 결합 (11.8) | 결합 (25) | 결합 (23.5) | 결합 (162) | 결합 (126) |
| sIL-4R-92/97 | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. |
| sIL-4R-94/97 | 약한 결합(2.33e+03) | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. | N.D. |
"N.D." 표에서 항체 농도가 2500ng/ml에 도달하더라도 결합 활성이 나타나지 않음을 의미한다.
표 4. 의 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이, L67, L68, A96, H156, C207의 5개 위치에 대하여, 시노몰구스 IL-4Rα 의 대응하는 위치의 아미노산 잔기 중 어느 하나의 아미노산 잔기가 변이된다; L67 및 L68이 돌연변이된 위치의 조합에 포함될 때, 본 발명에서 제공되는 인간화 항체의 결합 활성은 sIL-4R-His에 대한 결합 활성에 비해 유의하게 낮고; 한편, L67 및 L68이 개별적으로 돌연변이된 경우, 본 발명의 인간화 항체는 sIL-4R-His에 대한 원래의 결합 활성을 유지한다.
3개의 위치 D92, V94 및 D97에 대해, 상기 어느 하나의 아미노산 잔기가 알라닌으로 돌연변이되고; 돌연변이된 위치의 조합에 D97이 포함되거나 D97만 돌연변이된 경우, 본 발명에서 제공되는 인간화 항체의 결합 활성은 sIL-4R-His에 대한 결합 활성과 비교하여 유의하게 낮다.
| Y0188-1Q | Y0188-2Q | Y0188-3Q | Y0188-4Q | Y0188-6Q | Y0188-8Q | Y0188-9Q |
| -H결합 (9.67) |
결합 (10.2) | 결합 (25.8) | 결합 (12.3) | 결합 (10.6) | 결합 (11.4) | 결합 (12.7) |
| o -HN.D. | N.D. | 결합 (445) | N.D. | 결합 (665) | N.D. | N.D. |
| QN.D. | 결합 (220) | N.D. | 결합 (34) | 결합 (8.57) | 결합 (293) | 결합 (413) |
| -M결합 (8.55) | 결합 (10.2) | N.D. | 결합 (9.09) | 결합 (10.5) | 결합 (11.7) | 결합 (9.82) |
| -Q결합 (230) | 결합 (32.8) | 결합 (15.9) | 결합 (17.8) | 결합 (8.79) | 결합 (37) | 결합 (336) |
| -QN.D. | 결합 (89.2) | N.D. | 결합 (25) | 결합 (13.7) | 결합 (74) | 결합 (130) |
| -QN.D. | 결합 (39.5) | N.D. | 결합 (14.6) | 결합 (12.6) | 결합 (42.9) | 결합 (57.7) |
| 6결합 (6.52) | 결합 (8.08) | 약한 결합 (1.36e+03) | N.D. | N.D. | 결합 (9.8) | 약한 결합 (6.94e+03) |
| 6결합 (16.4) | 결합 (11.1) | 결합 (218) | 결합 (410) | 결합 (267) | 결합 (16.3) | 결합 (469) |
| 결합 (6.18) | 결합 (6.15) | 결합 (23.5) | 결합 (9.86) | 결합 (12.6) | 결합 (10.3) | 결합 (8.78) |
| 결합 (5.89) | 결합 (6.68) | 결합 (22.9) | 결합 (4.79) | 결합 (7.61) | 결합 (11.4) | 결합 (14.2) |
| -9약한 결합 (1.1e+03) | 결합 (10.6) | N.D. | 결합 (31.3) | 결합 (105) | 결합 (9.57) | 약한 결합 (1.49e+03) |
| -9결합 (4.25) | 결합 (6.31) | 결합 (43.4) | 결합 (6.61) | 결합 (7.61) | 결합 (6.97) | 결합 (8.74) |
| -9N.D. | 결합 (8.05) | N.D. | N.D. | N.D. | 결합 (8.69) | N.D. |
| -94N.D. | 결합 (15.3) | N.D. | N.D. | N.D. | 결합 (13.2) | N.D. |
| 9결합 (10.1) | 결합 (10.5) | N.D. | 결합 (13) | 결합 (17.4) | 결합 (6.98) | 결합 (27.6) |
| 9N.D. | 결합 (11.4) | N.D. | N.D. | N.D. | 결합 (6.99) | N.D. |
| 9N.D. | 결합 (10.9) | N.D. | N.D. | N.D. | 결합 (7.06) | N.D. |
"N.D." 표에서 항체 농도가 2500ng/ml에 도달하더라도 결합 활성이 나타나지 않음을 의미한다.
표 5. 의 데이터로부터 명백한 바와 같이, 3개의 위치 D92, V94 및 D97에 대해, 상기 어느 하나의 아미노산 잔기가 알라닌으로 돌연변이되고; D97이 돌연변이된 위치의 조합에 포함되거나 D97만 돌연변이된 경우, Y0188-2Q 및 Y0188-8Q를 제외하고 본 발명에서 제공되는 키메라 항체의 결합 활성은 . sIL-4R-His에 대한 결합 활성에 비해 유의하게 낮다.
5개의 위치 L67, L68, A96, H156 및 C207에 대하여, 상기 어느 하나의 아미노산 잔기는 시노몰구스 IL-4Rα의 상응하는 위치의 아미노산으로 돌연변이되고; L67 및 L68 또는 L67, L68 및 A96이 돌연변이된 위치의 조합에 포함될 때 키메라 항체 Y0188-1Q, Y0188-3Q 및 Y0188-10Q의 결합 활성은 sIL-4R-His에 대한 결합 활성과 비교하여 상당히 낮고; 한편, L67 및 L68이 개별적으로 돌연변이된 경우, Y0188-2Q 및 Y0188-8Q를 제외한 키메라 항체는 모두 sIL-4R-His에 대한 원래의 결합 활성을 유지한다. 또한, A96에 대하여, 변이 위치의 조합에 A96을 포함시킨 경우, 키메라 항체 Y0188-3Q의 결합 활성은 sIL-4R-His에 대한 결합 활성과 비교하여 현저히 낮다.
2개의 위치 Q63 및 L64에 대하여, 양쪽 위치가 모두 알라닌으로 돌연변이될 때, Y0188-1Q, Y0188-2Q 및 Y0188-8Q를 제외한 키메라 항체의 결합 활성은 sIL-4R-His에 대한 결합 활성에 비해 현저히 낮다.
실시 예 3. 항체의 안정성
항체 E5 및 B5는 10mM 히스티딘, 150mM NaCl, pH 6에서 각각 0.59mg/mL, 0.54mg/mL 및 6.44mg/mL로 제형화되며, 40 oC 에서 2주 및 4주 동안 보관되며, "(II) 세포 기능 활성 검출 방법"에 설명된 절차에 따라 검출된다. 항체 농도 대 OD650 값의 그래프를 플로팅하고(도 2.), 이로부터 IC50(ng/mL)을 계산한다. 그 결과를 하기 표 6. 에 나타낸다.
| 항체 | IC50 (ng/ml; 2 주) (차단 IL-4) |
IC50 (ng/ml; 4 주) (차단 IL-4) |
| E5 | 26.7 | 24.4 |
| B5 | 31.1 | 29.1 |
본 발명의 실시예에 대한 상기 설명은 본 발명을 제한하려는 것이 아니며, 당업자는 본 발명의 사상을 벗어나지 않고 본 발명에 다양한 변경 및 수정을 가할 수 있으며, 이는 본 발명의 첨부된 청구항의 범위 내에 있어야 한다.
Claims (22)
- 인간 IL-4R(IL-4Rα)의 알파 사슬에 위치하고 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 세트의 아미노산 잔기 D92, V94, D97, L67, L68, A96, H156, C207, Q63 및 L64 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 인간 인터루킨-4 수용체(IL-4R) 및 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항에 있어서,
상기 에피토프는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 세트의 아미노산 잔기 D92, V94, 및 D97 중 하나 이상을 포함하고; 보다 바람직하게는 상기 에피토프는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 세트의 하기 아미노산 잔기를 포함하고:
(1) D92;
(2) D97;
(3) D92, V94, 및 D97;
(4) D92 및 V94;
(5) D92 및 D97; 또는
(6) V94 및 D97;
바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 세트의 하기 아미노산 잔기를 포함하는 인간 IL-4Rα의 에피토프에 결합하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편 :
(i) Q63 및 L64.
- 제1항 내지 제2항 어느 한 항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 사이노몰구스 IL-4R에 대한 종간 교차 결합 활성을 갖지 않고, 바람직하게는 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 시노몰구스 IL-4R에 결합하지 않고; 보다 바람직하게는 시노몰구스 IL-4Rα에 결합하지 않고; 및 더욱 바람직하게는, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열에 결합하지 않고;
바람직하게는, 상기 에피토프는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 세트의 아미노산 잔기 L67, L68, 및 A96 중 하나 이상을 포함하고; 바람직하게는, 상기 에피토프는 다음을 포함하고:
① L67 및 L68;
② L67, L68 및 A96; 또는
③ A96;
보다 바람직하게는, 상기 에피토프는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 세트의 하기 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(A) L67, L68, A96, H156 및 C207;
(B) A96, H156 및 C207;
(C) L67, L68, H156 및 C207;
(D) L67, L68, A96 및 C207; 또는
(E) L67, L68, A96 및 H156.
- 제1항 내지 제3항 어느 한 항에 있어서, 상기 에피토프는 서열번호 1에 기재된 아미노산 서열 세트의 하기 아미노산 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편:
(P-1) D97, L67 및 L68;
(P-2) D97, L67, L68, A96 및 D92;
(P-3) D97, L67, L68 및 D92;
(P-4) D97, Q63 및 L64;
(P-5) D97, Q63, L64 및 D92;
(P-6) D97, Q63, L64, D92 및 A96; 또는
(P-7) D97, Q63, L64, L67 및 L68.
- 제1항 내지 제4항 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에서 하기 중쇄 상보성 결정 영역 HCDR1, HCDR2, HCDR3 및 경쇄 상보성 결정 영역 LCDR1, LCDR2, LCDR3 을 포함하고:(1) 서열 번호 35., 36., 37. 에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및 서열 번호 53., 54., 55. 에 기재된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3;
(2) 서열 번호 41., 42., 43. 에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및 서열 번호 59., 60., 61. 에 기재된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3;
(3) 서열 번호 44., 45., 46. 에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및 서열 번호 56., 57., 63. 에 기재된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3;
(4) 서열 번호 44., 47., 46. 에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및 서열 번호 63., 64., 65. 에 기재된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3;
(5) 서열 번호 48., 49., 46. 에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및 서열 번호 66., 67., 68. 에 기재된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3;
(6) 서열 번호 44., 50., 51. 에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및 서열 번호 56., 57., 69. 에 기재된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3; 또는
(7) 서열 번호 52., 36., 37. 에 기재된 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3; 및 서열 번호 53., 54., 55. 에 기재된 LCDR1, LCDR2, 및 LCDR3;
바람직하게는, 중쇄 가변 영역은 서열 번호 3., 7., 9., 10., 11.,15., 17., 19., 23., 27. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고:; 및/또는 바람직하게는 경쇄 가변 영역은 서열 번호 4., 8., 10., 12., 16., 18., 20., 2., 33., 34. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 아미노산 서열에 대해 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함 하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제5 어느 한 항에서 있어서,
(1) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 3. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 3. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역에서 서열 번호 4. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 4. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
(2) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 7. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 7. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역에서 서열 번호 8. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 8. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
(3) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 9. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 9. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역에서 서열 번호 10. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 10. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
(4) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 11. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 11. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역에서 서열 번호 12. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 12. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
(5) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 15. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 15. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역에서 서열 번호 16. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 16. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
(6) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 17. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 19. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역에서 서열 번호 18. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 18. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
(7) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 19. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 19. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역에서 서열 번호 20. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 20. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
(8) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 27. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 27. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역에서 서열 번호 34. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 34. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
(9) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 27. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 27. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역에서 서열 번호 33. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 33. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
(10) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 27. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 27. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역에서 서열 번호 28. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 28. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
(11) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 23. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역에서 서열 번호 34. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 34. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
(12) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 23. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역에서 서열 번호 33. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 33. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 또는
(13) 중쇄 가변 영역은 서열 번호 23. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 23. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 경쇄 가변 영역에서 서열 번호 28. 에 기재된 아미노산 서열 세트 또는 서열 번호 28. 에 기재된 아미노산 서열 세트에 제시된 아미노산 서열과 적어도 75% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함 하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제6항 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 인간 IL-4R(IL-4Rα)의 알파 사슬에, 보다 바람직하게는 인간 가용성 IL-4Rα(sIL-4Rα)에 결합하고;
바람직하게는, 항체는 모노클로날 항체 또는 단일 사슬 항체이고;
바람직하게는, 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체 또는 완전히 또는 부분적으로 인간화 항체이고; 바람직하게는, 항원 결합 단편은 IL-4R 또는 IL-4Rα에 특이적으로 결합할 수 있는 항체의 단편이고, 상기 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 인터루킨-4 수용체(IL-4R)에 결합하는 것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제7항 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편은 이의 인간 또는 뮤린 불변 영역, 바람직하게는 인간 또는 뮤린 중쇄 불변 영역(CH) 및/또는 경쇄 불변 영역(CL)을 추가로 포함하고;
바람직하게는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄 및 경쇄를 포함하고;
바람직하게는, 항체는 면역글로불린, 특히 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM, 예를 들어 인간 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM, 보다 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 하위유형이고;
보다 바람직하게는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 IgG, IgA, IgM, IgD, 또는 IgE의 중쇄 불변 영역 및/또는 카파 또는 람다 유형의 경쇄 불변 영역을 포함하고; 예를 들어, 중쇄 불변 영역은 IgG(예: IgG1 또는 IgG4) 유형이고 경쇄 불변 영역은 카파 유형인것을 특징으로 하는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
- 제1항 내지 제8항 어느 한 항에 있어서, 항체 또는 그의 항원 결합 단편의 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 중쇄 및/또는 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
- 제9항에따른, 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는, 벡터.
- 제9항에 따른 핵산 분자 또는 제10항에 따른 벡터를 포함하거나, 제9항에 따른 핵산 분자 또는 제10항에 따른 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 것을 특징으로 하는, 숙주 세포.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편, 제9항에 따른 핵산 분자, 제10항에 따른 벡터, 또는 제11항에 따른 숙주 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 조성물이고; 바람직하게는, 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하고;
바람직하게는, 약제학적 조성물은 경구 투여 및 비경구 투여를 위한 투여 형태로 제조하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제9항에 있어서 핵산 분자, 제10항에 있어서 벡터, 제11항에 있어서 숙주 세포, 또는 제12항 또는 제13항에 따른 예방용 약제의 제조에 있어서, 인간 인터루킨 4 수용체(IL-4R)와 관련된 질병 또는 장애, 또는 인간 인터루킨 4(IL-4) 또는 인간 인터루킨 13(IL-13) 신호 전달 경로와 관련된 질병 또는 장애의 예방, 치료 또는 개선을 위한 약제의 제조하는 것을 특징으로 하는 조성물의 용도.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 단편,
제 9항에따른 핵산 분자, 제 10항에 따른 벡터, 제 11항에 따른 숙주 세포, 또는 제 12항 또는 제 13항에 따른 조성물을 (예를 들어, 치료 유효량을), 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 인터루킨 4 수용체(IL-4R)와 연관되거나 인간 인터루킨 4(IL-4) 또는 인간 인터루킨 13(IL-13) 신호 전달 경로와 관련있는 질병 또는 장애의 예방, 치료 또는 개선 방법.
- 제14항 또는 제15항에 있어서,
상기 질환 또는 장애는 자가면역 질환, 알레르기 질환, 종양 또는 암을 포함하고;
바람직하게는, 질환 또는 장애는 자가면역 질환 또는 알레르기 질환, 예를 들어 피부염(예: 아토피 피부염), 천식(예: 염증성 천식, 예를 들어 염증성 천식 2형), 만성 식도염(예: 호산구성 식도염), 습진, 비염(알레르기성 비염 등), 비용종(비용종을 동반한 만성 비부비동염), 결막염, 염증성 장질환(예: 궤양성 대장염, 크론병), 염증성 신경병증, 관절염(류마티스성 관절염), 다발성 경화증, 홍반성 루푸스, 인슐린 및 인슐린 비의존성 당뇨병 및 기타 면역 또는 알레르기 관련 질병을 포함하고;
대안적으로, 바람직하게는, 질환 또는 장애는 종양 또는 암, 예컨대 장암, 흑색종, 피부암, 유방암, 자궁암, 자궁경부암, 자궁내막암, 난소암, 고환암, 중피종, 전립선암, 방광암, 항문암, 교모세포종, 성상세포종, 간암, 신장암, 식도암, 위암, 폐암, 두경부암, 골수종, 골암, 에이즈 관련 카포시 육종, 호지킨 또는 비호지킨 림프종, 전립선암, 전립선 종양 , 림프종 및 췌장암을 포함하는 것을 특징으로 하는, 용도 또는 방법.
- 제14항 내지 제16항 중 한 항에 있어서,
상기 약제는 제16항에 정의된 질환 또는 장애 중 하나 이상의 예방, 치료 또는 개선용이고;
바람직하게는, 대상은 포유동물, 바람직하게는 영장류이고; 더 바람직하게는, 대상은 인간인것을 특징으로 하는, 용도 또는 방법.
- 스크리닝할 제제를 인간 IL-4R 또는 이의 일부와 접촉시키는 단계;
상기 제제가 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 에피토프에 결합할 수 있는지 여부를 검출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는,
인간 인터루킨 4 수용체(IL-4R)에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 인간 인터루킨 4(IL-4) 또는 인간 인터루킨 13(IL-13) 신호전달 경로를 특이적으로 차단하는 차단제에 대한 스크리닝 방법.
- 평가할 제제를 인간 인터루킨 4 수용체(IL-4R) 또는 이의 일부와 접촉시키는 단계; , 상기 제제가 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 에피토프에 결합할 수 있는지 여부를 검출하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 제제의 효능을 평가하기 위한 방법.
- 제18항, 또는 제19항에 있어서,
상기 크리닝 또는 평가할 제제는 항체, 예컨대 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체이고;
바람직하게는, 항체는 면역원으로서 인간 IL-4R 또는 그의 일부로 동물을 면역화함으로써 수득되고;
바람직하게는, 제제가 에피토프에 결합할 수 있는지 여부는 간 IL-4R 또는 이의 일부의 부위 지향적 돌연변이유발을 통해 에피토프에 포함된 하나 이상의 아미노산 잔기를 돌연변이시키고, 인간 IL-4R 또는 이의 일부에 대한 제제의 결합 활성 또는 친화도를 돌연변이 전의 것과 비교하고 돌연변이된 인간 IL-4R 또는 이의 일부에 대한 제제의 결합 활성 또는 친화도가 현저히 낮거나 심지어 손실되는 것을 통하여 검출할 수 있는 것을 특징으로 하는,
결합제 또는 차단제의 스크리닝 방법 또는 제제의 효능 평가 방법.
- 제18항 내지 제20항 중 한 항에 있어서, 상기 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 1) 인간 IL-4R 또는 이의 일부의 부위 지향적 돌연변이유발을 통해 에피토프에 포함된 하나 이상의 아미노산 잔기를 돌연변이시켜 인간 IL-4R 또는 이의 일부의 돌연변이체를 수득하는 단계;
2) 인간 IL-4R 또는 이의 일부 및 인간 IL-4R의 변이체 또는 이의 일부와 스크리닝된 제제 또는 평가 대상인 제제를 각각 접촉시키고, 각각에 대한 결합 활성 또는 친화도를 검출하는 단계;
3) 돌연변이된 인간 IL-4R 또는 이의 일부에 대한 제제의 결합 활성 또는 친화도가 인간 IL-4R 또는 이의 일부에 대한 제제의 결합 활성 또는 친화도와 비교하여 현저히 낮거나 심지어 손실된 경우, 에피토프에 결합할 수 있는 제제를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 결합제 또는 차단제의 스크리닝 방법 또는 작용제의 효능 평가 방법.
- 제18항 내지 제21항 중 한 항에 있어서, 단계 1)에서, 에피토프에 포함된 하나 이상의 아미노산 잔기는 상응하는 위치에서 알라닌 또는 사이노몰구스 인터루킨 4 수용체의 아미노산 잔기로 돌연변이되어 인간 IL-4R 또는 그의 일부의 돌연변이체를 수득하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하고, 바람직하게는, 인간 IL-4R의 일부는 인간 IL-4R, 추가로 인간 sIL-4Rα의 알파 사슬이고; 바람직하게는, 방법은 인간 IL-4Rα를 사용하여 수행되고 인간 IL-4Rα의 돌연변이체가 수득되고;
바람직하게는, 방법은 인간 sIL-4Rα를 사용하여 수행되고 설명의 표 3에 나열된 인간 sIL-4Rα의 돌연변이체 중 하나 이상이 단계 1)에서 돌연변이체로 사용 되는 것을 특징으로 하는, 결합제 또는 차단제의 스크리닝 방법 또는 작용제의 효능 평가 방법
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