KR20230004590A - 다형성 교모세포종에서의 abcb5 표적화 - Google Patents

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KR20230004590A
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KR
South Korea
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abcb5
gbm
antibody
cancer
inhibitor
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KR1020227039356A
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마커스 에이치. 프랭크
나타샤 와이. 프랭크
Original Assignee
칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션
더 브리검 앤드 우먼즈 하스피털, 인크.
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Abstract

본 발명은 다형성 교모세포종 (GBM)을 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 요법 내성 GBM을 발생시킬 위험은 GBM 세포에서 ABCB5의 존재를 검출함으로써 평가될 수 있다. GBM 세포를 치료제, 예컨대 테모졸로미드에 대해 감작화시키는 데 ABCB5 차단을 이용하는 치료적 중재가 제공된다.

Description

다형성 교모세포종에서의 ABCB5 표적화
관련 출원
본 출원은 2020년 4월 15일에 출원된 미국 특허 가출원, U.S.S.N. 63/010,643을 35 U.S.C. § 119(e) 하에 우선권 주장하며, 그 전문은 본원에 참조로서 포함된다.
연방 정부 후원 연구
본 발명은 NIH/NEI에 의해 수여된 5 R01EY025794 05, 및 베테랑 어페어스(Veterans Affairs)에 의해 수여된 5 I01 BX000516 08 하에 정부 지원으로 만들어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
성인에서 가장 흔한 원발성 악성 뇌 종양인 다형성 교모세포종 (GBM)은 나쁜 예후 및 높은 치사율과 연관된다. 환자 생존은 임상적으로 승인된 약물, 예컨대 테모졸로미드 (TMZ) 및 베바시주맙에 대한 치료적 내성, 및 높은 비율의 종양 재발 때문에 여전히 참담하다. 기존 치료 요법의 최소의 유익한 효과로 인해, GBM 암 줄기 세포 (CSC)에 해당할 수 있는 요법-내성 암 하위집단을 표적화하는 신규 치료 전략에 대한 시급한 필요가 있다.
TMZ는 GBM의 치료를 위한 임상적으로 승인된 약물이며, 이는 환자 생존의 유의한 연장을 야기한다 (Stupp, R., et al., (2005). N Engl J Med 352, 987-996). 비록 세포독성 이미다조테트라진으로서 작용하지만, TMZ는 G2/M 정지를 유도할 수 있으며 (Newlands, E. S., et al., (1997). Cancer Treat Rev 23, 35-61, Filippi-Chiela, E. C., et al., (2013). BMC Cancer 13, 147), 이는 요법-내성 암 세포로 하여금 유사분열기 또는 M기로 진입하기 전에 DNA를 복구하게 하고, 따라서 약물-유도된 세포독성으로부터 세포 및 이들의 자손을 보호한다 (DiPaola, R. S. (2002). Clin. cancer res., 8: 3512-3519, 2002. Clin Cancer Res 8, 3311-3314, Sherry, C. J. (2000). Cancer Res 60, 3689-3695, Schwartz, G. K., and Shah, M. A. (2005). J Clin Oncol 23, 9408-9421). G2/M 이행을 위한 필수적인 단계는 사이클린 B1/CDK1 복합체의 활성화이다. 휴지 세포에서, 티로신 키나제 WEE1 및 MYT1은 CDK1의 억제성 인산화를 유도하며, 따라서 불활성 상태의 사이클린 B1/CDK1 복합체를 유지한다. 세포가 분열하는 것을 준비할 때, G2/M 이행의 주요 양성 조절자인 폴로 유사 키나제 (PLK1) (van Vugt, M. A., and Medema, R. H. (2005). Oncogene 24, 2844-2859)가 활성화된다. 후속적으로, PLK1은 WEE1 및 MYT1을 억제함으로써 CDK1의 발현을 유도한다. PLK1은 또한 결과적으로 CDK1의 탈인산화 및 활성화에 중추적인 역할을 하는 CDC25C를 활성화시킨다. 화학요법 약물 및 다른 DNA 손상제는 CHEK1을 인산화시키고 활성화시키는 감각 ATM/ATR 키나제를 활성화시킴으로써 이 경로를 심각하게 손상시킬 수 있다. CHEK1은 CDC25C를 인산화시키고 불활성화시키며, 따라서 불활성 인산화된 상태의 사이클린 B1/CDK1 복합체를 보유하고 결국 G2/M 정지를 초래한다.
다형성 교모세포종 (GBM)의 성장 및 화학요법내성에서의 ABCB5의 역할이 본원에서 검사되었다. ABCB5가 원발성 GBM 종양에서 발현되고, 발현이 전반적으로 불량한 생존과 유의하게 상관관계가 있었다는 것이 밝혀졌다. 게다가, ABCB5는 또한 확립된 인간 U-87 MG, LN-18, 및 LN-229 GBM 세포주에서 CD133-양성 CSC에 의해 발현되었다. 항체- 또는 shRNA-매개된 기능적 ABCB5 차단은 GBM 세포의 증식 및 생존을 억제하고 시험관내에서 이들을 테모졸로미드 (TMZ)-유도된 아폽토시스에 대해 감작화시켰다. 마찬가지로, 면역결핍 마우스를 사용한 생체내 인간 GBM 이종이식편 실험에서, 모노클로날 항체 치료는 돌연변이 TP53, 야생형 PTEN LN229 종양의 성장을 억제하고 LN229 종양을 TMZ 요법에 대해 감작화시켰다. ABCB5 차단이 TMZ-유도된 G2/M 정지를 억제하고 TMZ-매개된 세포 사멸을 증대시킨다는 것이 입증되었다. 따라서, 본원에 개시된 데이터는 ABCB5가 GBM 화학요법내성 마커이고 ABCB5를 표적화하는 것이 GBM 요법을 개선시키는 데 유용하다는 것을 입증한다.
본 발명은, 일부 측면에서, ABCB5+ 암 줄기 세포 활성을 조정하는 방법 및 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 측면은 다형성 교모세포종 (GBM)을 갖는 대상체에게 ATP-결합 카세트 서브패밀리 B 구성원 5 (ABCB5)의 억제제 및 화학요법제를 투여함으로써 GBM을 치료하는 방법에 관한 것이며, 여기서 화학요법제는 GBM을 치료하기 위한 유효량의 알킬화제이다. 일부 실시양태에서, 알킬화제는 테모졸로미드이다.
화학요법내성 암을 치료하는 방법이 다른 측면에서 제공된다. 방법은 화학요법내성 암을 갖는 대상체를 확인하는 단계, 유효량의 ABCB5 억제제를 투여하여 대상체의 암 세포에서 화학요법 유도된 G2/M 정지를 역전시키는 단계 및 대상체에게 화학요법제를 투여하여 암 세포 사멸을 촉진하는 단계를 수반한다.
암을 G2/M 세포 주기 정지의 세포를 갖는 암으로 확인하고 대상체에게 유효량의 ABCB5 억제제를 투여하여 세포에서 G2/M 세포 주기 정지를 역전시킴으로써 대상체에서 암을 치료하는 방법이 다른 측면에서 제공되며, 여기서 암은 G2/M 세포 주기 정지와 연관된다.
일부 실시양태에서 대상체는 암 세포 사멸을 촉진하기 위해 화학요법제가 추가로 투여된다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 알킬화제이다. 일부 실시양태에서, 알킬화제는 테모졸로미드이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 ABCB5+ 암을 갖는 것으로 확인된다.
일부 실시양태에서, ABCB5의 억제제는 항-ABCB5 항체 또는 그의 단편이다. 일부 실시양태에서, 항-ABCB5 항체 또는 그의 단편은 단백질의 세포외 폴리펩티드의 시클릭 형태 또는 선형 형태에 대한 특이성을 갖는다. 다른 실시양태에서, 항-ABCB5 항체 또는 그의 단편은 ABCB5 PIP2 결합 부위의 형태를 변경한다. 일부 실시양태에서, 항-ABCB5 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서 항체는 ABCB5 및 RTK에 특이적인 이중특이적 항체이다.
일부 실시양태에서, ABCB5의 억제제는 PIP2 길항제이다.
일부 실시양태에서, ABCB5의 억제제는 지질 유사체이다.
일부 실시양태에서, ABCB5의 억제제는 억제성 핵산이다.
일부 실시양태에서, ABCB5의 억제제는 효소이다.
일부 실시양태에서, ABCB5의 억제제는 항-수용체 티로신 키나제 (RTK) 항체이다.
일부 실시양태에서, ABCB5의 억제제는 인슐린 수용체 (InsR)의 억제제이다.
일부 실시양태에서, ABCB5의 억제제는 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 (IGF1R)의 억제제이다.
일부 실시양태에서, ABCB5의 억제제는 신호 통합 어댑터 분자 (IRS-1)의 억제제이다.
다른 측면에서 본 발명은 대상체로부터 다형성 교모세포종 (GBM) 암 세포를 단리하고 GBM 암 세포가 ABCB5를 발현하는 지 여부를 결정하는 검정을 수행함으로써 GBM을 화학요법내성 암으로 확인하는 방법이며, 여기서 GBM 암 세포가 ABCB5를 발현하는 경우에 GBM은 화학요법내성 암이다.
본 발명의 각각의 제한은 본 발명의 다양한 실시양태를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 하나의 요소 또는 요소의 조합을 수반하는 본 발명의 각각의 제한은 본 발명의 각각의 측면에 포함될 수 있는 것으로 예상된다. 본 발명은 그의 적용에서 하기 설명에 제시되거나 또는 도면에 예시된 구성 요소의 구축 및 배열의 세부 사항으로 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태가 가능하고 다양한 방식으로 실시되거나 또는 수행될 수 있다. 또한, 본원에 사용된 어구 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이고 제한으로 여겨져서는 안 된다. 본원에서 "포함하는", 또는 "갖는", "함유하는", "수반하는", 및 그의 변형의 사용은 이후에 열거되는 항목 및 그의 등가물뿐만 아니라 추가적인 항목을 포함하는 것으로 의미된다.
첨부 도면은 일정한 비율로 그려진 것으로 의도되지 않는다. 도면에서, 다양한 도면에 예시된 각각의 동일한 또는 거의 동일한 구성 요소는 유사한 숫자로 나타내어진다. 명확성을 위해, 모든 구성 요소가 모든 도면에서 표지되지 않을 수 있다. 도면에서:
도 1A-1G. 인간 GBM에서의 ABCB5 발현. 1A. TCGA로부터의 GBM (n = 146) 및 LGG (희소돌기아교세포종: n = 189, 희소성상세포종: n = 129, 성상세포종: n = 194) 뇌 종양에 대한 총 사례의 백분율로서 카피 수 변경을 도시하는 막대 그래프. 1B. TCGA로부터의 GBM (n = 152) 및 LGG (희소돌기아교세포종: n = 191, 희소성상세포종: n = 130, 성상세포종: n = 194) 뇌 종양에서의 ABCB5의 mRNA 발현 (log2)의 분포를 제시하는 개별 데이터 포인트로 오버레이된 상자 수염 그림. 데이터는 던의 다중 비교 검정을 사용한 크러스컬-월리스 검정을 사용하여 분석되었다 (****P＜0.0001). 상자는 제1 사분위수에서 제3 사분위수까지 이르고; 중앙값은 실선에 의해 표시된다. 1C. 3개의 GBM 하위유형 (고전: n = 59; 중간엽: n = 51; 전신경: n = 46)에서의 ABCB5의 mRNA 발현 (log2)의 분포를 제시하는 개별 데이터 포인트로 오버레이된 상자 수염 그림 (좌측). 상자는 제1 사분위수에서 제3 사분위수까지 이르고; 중앙값은 실선에 의해 표시된다. 모든 GBM 하위유형 함께 (n = 155, 높은 사건 = 58, 낮은 사건 = 65) 및 각각의 하위유형 별개 (고전: n = 59, 높은 사건 = 24, 낮은 사건 = 24; 중간엽: n = 51, 높은 사건 = 20, 낮은 사건 = 19; 신경주위: n = 66, 높은 사건 = 17, 낮은 사건 = 19)에 대한 OS를 도시하는 카플란-마이어 플롯 (우측). OS는 백분율로 표현되고 시간은 개월로 표현된다. 1D. 임상 GBM에서의 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) (좌측) 및 ABCB5 (우측)에 대한 대표적인 면역조직화학적 염색. 1E. GBM 세포주로부터의 ABCB5 발현의 qRT-PCR. 오차 막대는 SD를 나타낸다. 1F. GBM 세포주에서의 ABCB5 mRNA 발현의 네스티드 PCR 분석. 흑색종 세포주인 G3361이 양성 대조군으로서 사용되었다. 물이 음성 대조군으로서 사용되었다. 1G. 인간 GBM 세포주 상 ABCB5 발현의 대표적인 유세포 분석법 (FITC, FL1 형광).
도 2A-2C. CD133-양성 GBM 줄기 세포는 ABCB5를 발현한다. 2A. TCGA로부터의 GBM (n = 152) 및 LGG (희소돌기아교세포종: n = 191, 희소성상세포종: n = 130, 성상세포종: n = 194) 뇌 종양에서의 CD133의 mRNA 발현 (log2)의 분포를 제시하는 개별 데이터 포인트로 오버레이된 상자 수염 그림. 데이터는 던의 다중 비교 검정을 사용한 크러스컬-월리스 검정을 사용하여 분석되었다 (**P＜0.01, ****P＜0.0001). 상자는 제1 사분위수에서 제3 사분위수까지 이르고; 중앙값은 실선에 의해 표시된다. 2B. 인간 GBM 세포 상 ABCB5 (FITC, FL1 형광) 및 CD133 (APC, FL4 형광) 공동-발현의 대표적인 이중-색상 유세포 분석법. ABCB5 및 CD133을 공동-발현하는 세포는 각각의 형광 플롯의 상단 우측 사분면에서 발견된다. 제시된 데이터는 n=3 독립적인 실험을 나타낸다. 2C. LN-229 및 LN-18 GBM 세포주에 대해 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같은 CD133의 발현 (APC, FL4 형광). 막대 그래프는 비처리된 대조군 세포에 대한 CD133 양성의 배수 변화를 도시한다. 데이터는 웰치의 보정을 사용한 독립표본 t-검정을 사용하여 분석하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다 (n = 6, ****P＜0.0001).
도 3A-3E. 항체-매개된 ABCB5 차단은 GBM 세포의 증식을 억제하고 아폽토시스를 유도한다. 3A. MTT 검정에 의해 분석된 세포 증식 (n = 9). LN-229, LN-18, 및 U-87 MG GBM 세포는 0-200 μg/ml ABCB5 mAb 또는 이소형 대조군 mAb와 함께 72시간 동안 인큐베이션되었다. 통계적 유의성은 시닥의 다중 비교 검정을 사용한 이원 ANOVA를 사용하여 결정되었다 (*P＜0.05, **P＜0.01, ****P＜0.0001). 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 3B. LN-229에 대해 이중 색상 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같은 아폽토시스 세포의 백분율에 대한 대표적인 플롯 (좌측). 초기 및 후기 아폽토시스 단계에서의 세포는 각각의 형광 플롯의 하단 우측 및 상단 우측 사분면에서 발견된다 (각각). 막대 그래프는 LN-229, LN-18, 및 U-87 MG 세포주에 대한 결합된 데이터를 제시한다 (우측). 데이터는 독립표본 t-검정을 사용하여 분석하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다 (**P＜0.01) (n = 6). 3C. ABCB5 mAb- vs. 이소형 대조군 mAb-처리된 LN-229 및 U-87 MG GBM 이종이식편의 생체내 종양 성장 속도 (n = 5) (좌측). 통계적 유의성은 독립표본 t-검정을 사용하여 결정되었다 (**P＜0.01, ns = 유의하지 않음). 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 막대 그래프 (우측)는 독립표본 t-검정을 사용하여 분석된, 항-ABCB5 mAb- vs. 이소형 대조군 mAb-처리된 LN-229 및 U-87 MG GBM 이종이식편의 평균 종양 중량 (n = 5)을 도시한다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다 (*P＜0.05, ns = 유의하지 않음). 3D. 항-ABCB5 mAb 또는 이소형 대조군 mAb-처리된 LN-229 GBM 이종이식편에서의 Ki-67 및 절단된 카스파제-3 발현에 대한 대표적인 면역조직화학적 염색. 3E. 막대 그래프는 항-ABCB5 mAb- vs. 이소형 대조군 mAb-처리된 GBM 종양 이종이식편에서의 Ki-67- (상단) 또는 절단된 카스파제-3- (하단) 양성 핵의 백분율을 나타낸다. 데이터는 독립표본 t-검정을 사용하여 분석하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다 (**P＜0.01, ***P＜0.001) (n = 5).
도 4A-4E. 항체-매개된 ABCB5 차단에 의한 GBM에서의 TMZ-유도된 성장 억제 효과의 증대. 4A. 100 μg/ml ABCB5 mAb 또는 이소형 대조군 mAb와 함께 2시간 동안 미리-인큐베이션되고, 이어서 72시간 동안 TMZ (0-1000 μM)로 처리된, LN-229, LN-18, 및 U-87 MG 인간 GBM 세포의 MTT 검정에 의해 분석된 세포 증식 (n = 9). 오차 막대는 SEM을 나타낸다 (*P＜0.05, ****P＜0.0001). 통계적 유의성은 시닥의 다중 비교 검정을 사용한 이원 ANOVA를 사용하여 결정되었다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 4B. LN229에 대해 이중 색상 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같은 아폽토시스 세포의 백분율. 초기 및 후기 아폽토시스 단계에서의 세포는 각각의 형광 플롯의 하단 우측 및 상단 우측 사분면에서 발견된다 (각각) (n = 3). 4C. 막대 그래프는 ABCB5 mAb 또는 이소형 대조군 mAb의 존재 하에 TMZ로 처리된 그룹의 평균 LN-229 또는 U-87 MG 종양 부피를 나타낸다. 데이터는 독립표본 t-검정에 의해 분석하였다 (이소형 대조군: LN229 n = 6, U-87 MG n = 4; ABCB5 mAb: LN229 n = 6, U-87 MG n = 5). 오차 막대는 SEM을 나타낸다 (*P＜0.05, ns = 유의하지 않음). 4D. 이소형 대조군 mAb, ABCB5 비히클 대조군, 또는 이소형 대조군 mAb 또는 ABCB5 mAb의 존재 하에 TMZ로 처리된 LN-229 GBM 이종이식편에서의 Ki-67 및 절단된 카스파제-3 발현에 대한 대표적인 면역조직화학적 염색. 4E. 막대 그래프는 ABCB5 mAb 또는 이소형 대조군 mAb의 존재 하에 TMZ로 처리된 그룹의 Ki-67 및 절단된 카스파제-3 양성 핵의 평균 백분율을 나타낸다. 데이터는 독립표본 t-검정을 사용하여 분석하였다 (n = 5). 오차 막대는 SEM을 나타낸다 (*P＜0.05, **P＜0.01).
도 5A-5C. ABCB5-양성 GBM 세포에서의 세포-주기-관련 전사체의 풍부화. 5A. FACS-분류된 ABCB5-양성 및 ABCB5-음성 GBM 세포 (n=3)의 마이크로어레이 분석에 의해 검출된 모든 유전자의 PCA. 5B. 489개의 총 질환 및 기능 카테고리 중 관심 키워드를 갖는 카테고리의 백분율. 5C. ABCB5-양성과 ABCB5-음성 GBM 세포 (n=3) 사이에서 풍부화될 IPA에 의해 결정된 질환 및 기능. 제공된 주석에 대한 p-값은 IPA 지식 베이스에서 해당 프로세스와 연관된 유전자의 총 수에 대한 해당 프로세스에 참여하는 포커스 유전자의 수를 사용하여 피셔 정확 검정에 의해 계산된다. 본 발명자들의 연구에 의해 확인된 유전자는 우측에 열거되었다.
도 6A-6D. 항체-매개된 ABCB5 차단은 TMZ-유도된 G2/M 정지로부터 GBM 세포를 방출한다. 6A. 더블릿 제거를 위한 FL2H 대 FL2W 분석 후 LN-229 세포에서의 대표적인 유세포 분석 DNA 함량 (프로피듐 아이오다이드, FL2 형광) 분석. 6B. 막대 그래프는 LN-229, U-87 및 LN-18 GBM 세포 (n = 8)의 유세포 분석법으로부터의 G2/M 정지에서의 세포의 백분율을 나타낸다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다 (*P＜0.05). 6C. LN-229 세포에서의 세포 주기 체크포인트 분자의 웨스턴 블롯 분석. 분자량은 좌측에 표시된다 (kDa). 6D. 항-ABCB5 mAb 또는 이소형 대조군 mAb의 존재 하에 TMZ로 처리된 마우스로부터의 이종이식편 종양에서의 세포 주기 체크포인트 분자의 웨스턴 블롯 분석 (n = 3). 분자량은 좌측에 표시된다 (kDa).
도 7A-7E. ABCB5의 녹다운은 ABCB5 차단의 성장-억제를 모방하고 TMZ-유도된 G2/M 정지로부터 GBM 세포를 방출한다. 7A. 짧은 헤어핀 녹다운 (KD) 후 LN-229 및 U-87 MG GBM 세포의 IP-웨스턴 블롯. 5 mg 초음파처리 및 프리클리어된 단백질은 레인당 로드하였다. 분자량은 좌측에 표시된다 (kDa). 7B. MTT 검정에 의해 분석된 세포 증식 (n = 6). 막대 그래프는 LN-229 및 U-87 MG GBM 세포의 OD570 측정을 나타낸다. 데이터는 독립표본 t-검정을 사용하여 분석하였다. 오차 막대는 SEM을 나타낸다 (*P＜0.05). 7C. 72시간 동안 다양한 농도의 TMZ (0-1000 μM)로의 처리 후 ABCB5 KD LN-229 또는 U-87 MG 인간 GBM 세포 및 이들의 상응하는 대조군 KD 세포 변이체의 MTT 검정에 의해 분석된 세포 증식. 통계적 유의성은 이원 ANOVA에 이어 시닥의 다중 비교 검정을 사용하여 결정되었다 (**P＜0.01, ***P＜0.001, ****P＜0.0001) (n = 7). 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 7D. 더블릿 제거를 위한 FL2H 대 FL2W 분석 후 LN-229 세포에서의 유세포 분석 DNA 함량 (프로피듐 아이오다이드, FL2 형광) 분석. 7E. LN-229 및 U-87 MG GBM 세포에서의 세포 주기 체크포인트 분자의 웨스 분석. 하부 밴드는 로딩 대조군 (ACTB)이 상부 밴드인 p-CDC2 (Tyr15) 및 CDC2를 제외하고는 ACTB를 도시한다. 분자량은 좌측에 표시된다 (kDa).
다형성 교모세포종 (GBM)은 항암 요법에 대한 종양 내성으로 인한 불량한 예후 및 높은 재발률을 갖는 악성 뇌 종양이다. GBM의 성장 및 화학요법내성에서의 ABCB5의 역할이 본원에서 밝혀졌다. ABCB5가 원발성 GBM 종양에서 발현되며, 여기서 그의 발현이 전반적으로 불량한 생존과 유의하게 상관관계가 있었다는 것이 밝혀졌다. 즉 항체- 또는 억제성 핵산에 의한 기능적 ABCB5 차단은 GBM 세포의 증식 및 생존을 억제하고 이들을 항암 약물, 예컨대 테모졸로미드 (TMZ)-유도된 아폽토시스에 대해 감작화시켰다. 면역결핍 마우스를 사용한 생체내 인간 GBM 이종이식편 실험은 모노클로날 항체 치료가 돌연변이 TP53, 야생형 PTEN LN229 종양의 성장을 억제하고 LN229 종양을 암 요법, 예컨대 TMZ에 대해 감작화시켰다는 것을 입증하였다.
ABCB5 차단이 내성 암 세포에서 약물-유도된 G2/M 정지를 억제함으로써, 약물-매개된 세포 사멸을 증대시킨다는 것이 본원에서 입증되었다. 따라서, ABCB5는 GBM 화학요법내성 마커뿐만 아니라 현재 암 요법을 개선시키기 위한 치료적 표적이다. 암 세포가 G2/M 세포 주기 단계에서 정지하는 경우에, 세포는 DNA 복구 메커니즘을 겪고 약물에 대한 내성을 발생시킬 수 있다. 본원에 입증된 바와 같이, ABCB5는 세포 주기 조절자로서 중요한 역할을 한다. ABCB5 차단은 G2/M 세포 주기 정지로부터 내성 종양 세포를 동원하고, 이들이 달리 이들의 DNA의 복구를 겪는 것을 방지한다. 따라서, ABCB5 차단은 종양 세포 사멸을 유도하는 신규 메커니즘으로서 G2/M 세포 주기-연관된 DNA 복구를 억제하며, 이는 암, 예컨대 GBM의 치료에서 치료적 이점을 부여하는 것으로 본원에 제시된다. 항체에 의한 직접 ABCB5 차단에 더하여, ABCB5를 차단하는 약리학적 작용제뿐만 아니라 ABCB5가 신호 전달에 중요한 특정 수용체 티로신 키나제 (RTK) 및 연관 신호 어댑터의 차단제가 이들 방법에 따라 기능할 것이다. 이와 관련하여 신호전달 어댑터의 차단제일 예시적인 차단제는 RTK 인슐린 수용체 (InsR) 또는 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 (IGF1R)의 신호를 통합하는 인슐린 수용체 기질 1 (IRS-1), 또는 ABCB5가 신호 전달에 요구되는 InsR 또는 IGF1R 이들 자체의 차단제이다. 이러한 차단제는 ATM/ATR 및 CHK1/CHK2의 차단을 초래하는 억제를 생산하고, 이는 p-PLK1 S137/T210 증가 및 이로써 G2/M기로부터의 진행을 야기한다.
수용체 티로신 키나제 (RTK)의 티로신 자가인산화는 키나제 활성의 조절 및 세포내 신호전달 경로의 모집 및 활성화에 중요한 역할을 한다. 자가인산화는 순차적이고 정확히 정렬된 분자간 (트랜스) 반응에 의해 매개된다. 수용체 티로신 키나제의 비대칭 접촉 계면에서의 기능 돌연변이 또는 종양원성 활성화 돌연변이의 병리학적 손실은 각각 비대칭 이량체 형성 및 트랜스 자가인산화를 저해하거나 또는 용이하게 할 수 있다. 한 실시양태에서, RTK는 섬유모세포 성장 인자 수용체 (FGFR), 예를 들어, 섬유모세포 성장 인자 수용체 1 (FGFR1), 섬유모세포 성장 인자 수용체 2 (FGFR2), 섬유모세포 성장 인자 수용체 3 (FGFR3), 또는 섬유모세포 성장 인자 수용체 4 (FGFR4)이다.
ABCB5는 악성 흑색종, 결장직장암, 간세포, 구강 편평 및 메르켈 세포 암종, 및 안구 표면 편평 신생물에서의 종양 성장, 침해성, 및 다중약물 내성 (MDR)의 주요 매개체로서 확립되었다. 다른 암의 종양형성에서의 그의 역할은 공지되어 있지 않다. 꽤 놀랍게도 ABCB5가 암에서 약물 내성을 야기하는 G2/M 체크포인트 조절을 조정하는 데 고유한 역할을 하고 ABCB5 신호전달의 파괴가 약물 내성을 역전시키는 데 충분하다는 것이 발견되었다. 이는 GBM에서의 TMZ-유도된 G2/M 정지에서 특히 주목할 만하다. TMZ 내성 암을 신속히 확인하고 이들을 역전시키는 능력은 암을 치료하기 위한 이 어려운 치료에 유의한 발전을 제공한다.
TMZ가 여전히 GBM에서 주요 치료제 중 하나이지만, 50% 미만의 환자가 TMZ 요법에 반응한다 (Woo, J. Y., et al., (2015) Continuous Low-Dose Temozolomide Chemotherapy and Microvessel Density in Recurrent Glioblastoma. J Korean Neurosurg Soc 58, 426-431). GBM에서, TMZ가 암 세포로 하여금 유사분열 진입 전에 이들의 DNA를 복구하게 하는 생존-촉진 메커니즘인 ATM/ATR-Chk1/2의 활성화를 통해 G2/M 정지를 유도할 수 있다는 것이 확립되었다. 세포-주기 정지의 억제는 유사분열 참사 및 세포 사멸을 초래할 수 있다 (Hirose, Y., et al., (2001) Abrogation of the Chk1-mediated G(2) checkpoint pathway potentiates temozolomide-induced toxicity in a p53-independent manner in human glioblastoma cells. Cancer Res 61, 5843-5849). 세포 주기 조절-관련 유전자 카테고리, 예컨대 세포 주기: 이수성 (3.22), 세포 주기: 방추 체크포인트 (2.36), 및 세포 주기: G2/M 이행 (2.28)의 특이적 풍부화가 ABCB5-양성 GBM 세포에서 발견되었고 (실시예, 도 5B), 이는 ABCB5 차단이 G2/M 세포 주기 정지의 해제를 통해 TMZ의 성장 억제 및 아폽토시스-촉진 효과를 강화할 수 있다는 것을 시사한다.
본원에 제공된 데이터는 TMZ를 사용한 치료가 ATM 및 CHEK1의 인산화 및 활성화, CDC25C의 억제성 Ser216 인산화, CDK1의 억제성 Tyr15 인산화의 유지, 억제성 키나제 WEE1 및 MYT1의 활성화, 및 마지막으로, 사이클린 B1의 축적을 유도함으로써 GBM 세포에서 G2/M 정지를 유발하였지만, ABCB5 차단이 이 정지-유도 신호전달을 억제하였다는 것을 입증한다. ABCB5 mAb의 존재 하에 TMZ를 사용한 GBM 세포의 치료는 CDC25C 및 CDK1의 억제성 인산화를 제거함으로써, CDC25C 및 사이클린 B1/CDK1 복합체를 활성화시켰다. ATM 및 CHEK1의 ABCB5 mAb-매개된 억제 및 억제성 키나제 WEE1 및 MYT1을 억제하는 PLK1의 활성화에 의해 유발된 CDC25C 및 CDK1의 활성화는 G2/M 이행의 주요 양성 조절자를 나타낸다. ATM 및 CHEK1의 불활성화를 통한 G2/M 체크포인트의 폐지는 GBM 및 다른 암 세포를 약물 세포독성에 대해 감작화시킨 것으로 나타났다. 이들 보고에 대한 필연적인 결과로서, 본 발명자들의 데이터는 TMZ 및 ABCB5 mAb를 사용한 조합된 치료 시 GBM 세포의 증가된 아폽토시스, 및 감소된 증식으로부터 명백한 바와 같이 ABCB5 차단에 의한 TMZ-유도된 G2/M 정지의 감쇠가 GBM 세포를 약물-매개된 사멸에 대해 감작화시켰다는 것을 나타낸다.
더욱이, 인간 GBM에서 유의한 종양간 이질성이 있고 GBM 분자 하위유형은 다양한 환자 결과와 연관된다. 전신경 또는 2차 GBM은 야생형 PTEN 상태를 갖는 IDH 및 TP53에서의 돌연변이를 특징으로 한다 (신경 분화의 특색을 갖고 보다 좋은 결과와 연관됨) (Olar, A., and Aldape, K. D. (2014) Using the molecular classification of glioblastoma to inform personalized treatment. J Pathol 232, 165-177). 원발성 GBM은 EGFR 증폭 및 PTEN 손실을 갖는 중간엽 분자 하위유형을 보유한다. 이는 노령에서 존재하고 전형적으로 보다 나쁜 결과를 갖는다. ABCB5 차단이 시험관내 모든 세포주에서 유의한 항-종양 활성을 나타냈지만, 종양 성장에 대한 생체내 억제 효과는 TP53-돌연변이 PTEN-야생형 암에서 가장 현저하였다는 것이 본원에서 제시되었다.
본원에 개시된 데이터는 GBM에서의 ABCB5의 신규 역할을 정의하고 ABCB5-매개된 GBM 종양 진행 및 화학요법내성의 기초가 되는 분자 메커니즘을 밝힌다. 이들은 화학요법-감수성의 부여를 통해 GBM과 싸우는 것뿐만 아니라 종양 성장을 구동시키는 바로 그 하위집단을 표적화하는 것에 있어서 신규 '투 히트(two hit)' 치료 전략으로서의 ABCB5 표적화의 역할을 지지한다.
ABCB5는 약물 내성 암 세포의 단리를 위한 중요한 마커이다. 중요한 세포 조절에 수반되는 세포내 신호전달 경로의 일부로서 기능하는 ABCB5(+)는 세포 표면 상에 발현되고 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트 (PtdIns(4,5)P2, 또한 간단히 PIP2로 공지됨), 및, 더 낮은 정도로, PIP1 및 PIP3에 대한 수용체로서의 역할을 한다. PIP2는 원형질막에서 풍부화된 세포막의 미량의 포스포이노시톨 인지질 구성 요소이며, 여기서 이는, 예를 들어, PI3K 경로를 통한 수용체 티로신 키나제 (RTK)를 통한 신호전달, 또는 G-단백질-커플링된 수용체의 IP3/DAG 경로를 조절하는 다수의 중요한 신호전달 단백질에 대한 기질이다. ABCB5의 억제를 통한 ABCB5-PIP2 경로의 억제는 ABCB5에 대한 PIP2 결합 및 후속적으로 PIP3을 생산하는 PIP2 인산화를 차단한다. 따라서 이 경로의 방해는 티로신 키나제 수용체 (예를 들어, VEGFR1, EGFR 및 AXL)의 하류 PI3K 신호전달의 억제를 초래한다. PIP2의 ABCB5 결합은, 다른 기능 중에서, PIP3에 대한 인산화의 그의 비율을 증가시키는 역할을 할 수 있고 따라서 ABCB5를 발현하지 않는 세포에서 PIP2의 신호전달 역할을 증진시키는 줄기 세포-특이적 상호작용을 나타낸다. ABCB5-PIP2 결합은 소분자 ABCB5 경쟁적 리간드 또는 기질, 또는 그를 포함하는 조성물에 의해 억제될 수 있으며, 이는 또한 주요 ABCB5-의존적 생물학적 줄기 세포 기능의 하류 신호전달을 억제한다.
본 발명은 또한 질환을 갖거나 또는 가질 위험이 있는 대상체, 예를 들어 암을 갖거나 또는 가질 위험이 있는 대상체의 치료에 유용할 수 있다. 대상체는 인간 또는 척추 포유동물을 의미할 것이다. 바람직하게는 대상체는 인간이다. 암을 발생시킬 위험이 있는 대상체는 암을 발생시킬 높은 확률을 갖는 것이다. 이들 대상체는, 예를 들어, 그의 존재가 암을 발생시킬 보다 높은 가능성과 상관관계를 갖는 것으로 입증된 유전자 이상을 갖는 대상체, 및 암 원인 인자, 예컨대 담배, 석면, 또는 다른 화학 독소에 노출된 대상체, 또는 이전에 암에 대해 치료되었고 명백한 차도가 있는 대상체를 포함한다. 암을 가질 위험이 있는 대상체는 또한 전암성 병변을 갖는 대상체를 포함한다. 전암성 병변은 변경된 특성을 갖고 피부암으로 변할 위험을 지니는 조직의 영역이다. 전암성 병변은, 예를 들어, UV 방사선, 유전학, 발암물질, 예컨대 비소, 타르 또는 x-선 방사선에 대한 노출에 의해 야기될 수 있다.
암을 갖는 대상체는 검출가능한 암 세포를 갖는 대상체이다. 암은 악성 또는 비-악성 암일 수 있다. 암 또는 종양은 담도암; 뇌암; 유방암; 자궁경부암; 융모막암종; 결장암; 자궁내막암; 식도암; 위암; 상피내 신생물; 림프종; 간암; 폐암 (예를 들어 소세포 및 비-소세포); 흑색종; 신경모세포종; 구강암; 난소암; 췌장암; 전립선암; 직장암; 육종; 피부암; 고환암; 갑상선암; 및 신장암뿐만 아니라 다른 암종 및 육종을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 암은 ABCB5를 발현하는 암 세포를 포함한다.
임의로, 치료 전에 ABCB5 양성 줄기 세포의 존재는 본원에 기재된 결합 분자를 사용하여 검출될 수 있다. 본 발명에 의해 제공된 검출 또는 진단 방법은 일반적으로 본 발명의 하나 이상의 분자를 대상체 내 또는 그로부터의 샘플과 접촉시키는 단계를 수반한다. 비록 생체내 검출 방법이 또한 구상되지만, 바람직하게는, 샘플은 먼저 대상체로부터 수거된다. 샘플은 암 줄기 세포를 보유하는 것으로 의심되는 임의의 신체 조직 또는 체액을 포함할 수 있다. 예를 들어, 줄기 세포는 통상적으로 종양 덩어리 내 또는 그 주위에서 발견된다.
ABCB5는 ATP-결합 카세트 수송체 서브패밀리 B의 구성원이다. 이는 ABCB5 유전자에 의해 코딩되는 막관통 단백질이다. ATP-결합 카세트 (ABC) 수송체는 생리학 및 병리학에서 중추적인 역할을 한다. 이들은 작은 이온, 당, 및 펩티드에서 보다 복잡한 유기 분자에 이르는 구조적으로 다양한 분자의 수송에 수반된다.
본 발명의 방법은 단독으로 또는 암을 치료하기 위한 항암 약물과 조합되어, ABCB5에 대한 PIP1, PIP2 또는 PIP3 결합을 경쟁적으로 억제하거나 또는 ABCB5-의존적 수용체 티로신 키나제 및 G 단백질 커플링된 수용체 신호 전달을 파괴하는 합성 화합물 및 천연 발생 물질을 이용하는, 암 세포에서의 ABCB5의 파괴를 수반한다.
따라서, 일부 측면에서, ABCB5에 대한 PIP1, PIP2 또는 PIP3 결합을 경쟁적으로 억제하고 따라서 ABCB5-의존적 신호 전달을 억제하는 화합물은 본 발명에 따라 유용하다. 일부 실시양태에서 이들 화합물은 PtdIns-(1,2-디옥타노일), sn-1 및 sn-2 위치에서 C8:0 지방산을 함유하는 천연 포스파티딜이노시톨 (PtdIns)의 합성 유사체 (CAS 등록 번호 899827-36-2)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 화합물은 ABCB5+ 암을 치료하는 데 유용하다.
일부 측면에서, ABCB5 억제제는, 예를 들어, PSC 833 (발스포다르), 조수퀴다르, 타리퀴다르, 및 라니퀴다르를 포함한다. 다른 실시양태에서, 암을 치료하는 방법에 유용한 ABCB5 억제제는 심장 질환/혈관 질환의 치료를 위한 ABCB1 작용제이다. 비-제한적인 예는 하기 화합물 중 임의의 것을 포함한다: 베라파밀, 레세르핀, 니페디핀, 디곡신, 퀴니딘, 니카르디핀, 프라조신, 딜티아젬, 아미트리프틸린, 로자탄, 프라바스타틴, 아세부톨롤, 아세틸살리실산, 티몰롤, 나돌롤, 데브리소퀸, 에제티미브, 톨밥탄, 피타바스타틴, 카나글리플로진, 클로피도그렐, 티카그렐러, 아픽사반, 코비메티닙, 셀렉시팍, 암브리센탄, 메토프롤롤, 아테놀롤, 브로모크립틴 암로디핀, 이버멕틴, 클래리트로마이신, 케토코나졸, 리토나비르, 사퀴나비르, 넬피나비르, 인디나비르, 리팜피신, 시프로플록사신, 스파플록사신, 레보플록사신, 그레파플록사신, 레보밀나시프란, 시메프레비르, 이도부딘, 아타자나비르, 텔라프레비르, 피닥소미신, 라미부딘, 소포스부비르, 복실라프레비르, 피브렌타스비르, 글레카프레비르, 레테르모비르, 오메프라졸, 니자티딘, 돔페리돈, 란소프라졸, 라니티딘, 판토프라졸, 및 돌루테그라비르.
본 발명의 방법에 유용한 다른 기타 ABCB5 억제제는 하기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다: 시클로스포린, 시메티딘, 알도스테론, 타크로리무스, 페노바르비탈, 덱사메타손, 카르바마제핀, 콜키신, 로페라미드, 이미프라민, 히드로코르티손, 시탈로프람, 타우로콜산, 펙소페나딘, 프레드니손, 에스트론, 디아제팜, 디기톡신, 메틸프레드니솔론, 쿠에티아핀, 올란자핀, 클로자핀, 프레드니솔론, 베타메타손, 알리트레티노인, 베쿠로늄, 스타놀론, 에피나스틴, 에스트리올, 스핑고신, 세리바스타틴, 레비티라세탐, 페니토인, 라모트리진, 시타글립틴, 케타졸람, 실로도신, 리바록사반, 다비가트란 에텍실레이트, 페소테로딘, 인다카테롤, 클로바잠, 리나글립틴, 미라베그론, 보수티닙, 플루티카손 푸로에이트, 미코페놀레이트 모페틸, 다파글리플로진, 유메클리디늄, 에독사반, 닌테다닙, 옴비타스비르, 엘바스비르, 그라조프레비르, 오다나카팁, 바리시티닙, 유비데카레논, 에르투글리플로진, 스타놀론 아세테이트, 에스트라디올 아세테이트, 에스트라디올 벤조에이트, 에스트라디올 시피오네이트, 에스트라디올 디에난테이트, 에스트라디올 발레레이트, 테스토스테론 프로피오네이트, 아수나프레비르, 소마토스타틴, 아바트롬보팍, 벤라팍신, 트리미프라민, 타크린, 엘레트립탄, 수마트립탄, 시롤리무스, 파리타프레비르, 다사부비르, 에리트로마이신, 그라미시딘 D, 이트라코나졸, 테트라사이클린, 발리노마이신, 토피라메이트, 테르페나딘, 암프레나비르, 셀리프롤롤, 탈리놀롤, 플루펜틱솔, 트리플루오페라진, 로다민 6G, 심바스타틴, 발스포다르, 세르리포나제 알파, 커큐민, 아스코르브산, 클로르프로마진, 페노티아진, 아토르바스타틴, 브롬페리돌, 모르핀, 펜타조신, 프로프라놀롤, 네오스티그민, 목시덱틴, 메플로퀸, 플루티카손, 플루티카손 프로피오네이트, 엘라골릭스, 클로로퀸, 팔리페리돈, 루수트롬보팍, 포사코나졸, 디피리다몰, 퀴닌, 인도메타신, 아세트아미노펜, 할로페리돌, 날록손, 만니톨, 베트릭사반, 클로미펜, 오마다사이클린, 그라피프판트, 라로트렉티닙, 레베페나신, 테노포비르 디소프록실, 테노포비르 알라페나미드, 테노포비르, 레디파스비르, 실데나필, 바데나필, 카베르골린, 프루칼로프라이드, 리스페리돈, 트라마돌, 아지트로마이신, 플루코나졸, 라놀라진, 세티리진, 테가세로드, 및 독세핀.
일부 실시양태에서, ABCB5 억제제는 소분자 또는 지질 유사체일 수 있는 PIP2 길항제이다.
일부 실시양태에서, ABCB5 억제제는 항-ABCB5 항체 또는 단편이다. 일부 실시양태에서, ABCB5 항체는 예를 들어, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체, 단일-쇄 항체, F(ab')2, Fab, Fd, Fv 또는 단일-쇄 Fv 단편을 포함하는 목록으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, ABCB5 항체는 ABCB5의 3차원 입체형태의 세포외 루프에 결합하는 인간 항-ABCB5 항체 또는 ABCB5-결합 단편이다. 일부 실시양태에서 인간 항-ABCB5 항체는 ABCB5의 비-선형 형태의 세포외 루프를 인식하고 그에 특이적으로 결합하기 위한 친화도 성숙을 받는다. 본원에 기재된 인간 항-ABCB5 항체 또는 ABCB5-결합 단편은 ABCB5의 비-선형 형태의 세포외 루프에 특이적으로 결합하기 위한 친화도 성숙을 포함하는 방법에 의해 제조가능한 항체에 상응하는 서열을 갖는다.
일부 실시양태에서 항체는 ABCB5의 세포외 폴리펩티드의 시클릭 형태 또는 선형 형태에 대한 특이성을 갖는 ABCB5 항체 또는 ABCB5-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 조성물은 ABCB5 PIP2 결합 부위의 형태를 변경하는 ABCB5 항체 또는 ABCB5-결합 단편을 포함한다.
다른 실시양태에서 항체는 ABCB5 및 RTK에 특이적인 이중특이적 항체이다. 이중특이적 항체는 단일 항체 (또는 항체 단편)를 닮지만 2개의 상이한 항원 결합 부위를 가질 수 있다. 이중특이적 항체는 적어도 2개의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 가질 수 있다. 이중특이적 항체 및 단편은 또한 이종항체의 형태일 수 있다. 이종항체는 함께 연결된 2개 이상의 항체, 또는 항체 결합 단편 (예를 들어, Fab)이며, 각각의 항체 또는 단편은 상이한 특이성을 갖는다.
ABCB5-RTK 이중특이적 항체는 신호전달 경로를 조정한다. 일부 실시양태에서, 이중특이적 항체를 사용하는 신호전달 경로의 조정은 항체가 없거나 또는 단일특이적 항체를 사용하는 것과 비교하여 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% 또는 99.9% 만큼 신호전달 경로 활성에서의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신호전달 경로의 상향조절은 꺼져있거나 또는 실질적으로 활성이 아닌 경로를 켜거나 또는 개시하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적 신호전달 경로의 하향조절은 켜져있거나 또는 실질적으로 활성인 경로를 끄거나 또는 실질적으로 차단하는 것을 포함할 수 있다. 1개 이상의 신호전달 경로의 조정은 표적 세포(들)의 거동, 예컨대 세포 증식, 세포 성장, 세포 분화, 세포 생존, 또는 세포 분비의 감소에서의 특정 변화를 야기할 수 있다.
항체 접합체가 또한 제공된다. 접합체는 본 개시내용의 임의의 항체 및 작용제를 포함한다. 작용제는 치료제, 영상화제, 표지 작용제, 또는 치료적 및/또는 표지 목적에 유용한 작용제로부터 선택될 수 있다.
항체 (또는 이중특이적 버전 또는 그의 단편)와 특이적 항원 (또는 에피토프) 사이의 결합 상호작용의 강도 또는 친화도는 상호작용의 해리 상수 (KD)의 측면으로 표현될 수 있으며, 여기서 보다 작은 KD는 보다 큰 친화도를 나타낸다.
용어 "특이적 결합" 또는 "항원-특이적 항체"는 상이한 항원의 혼합물에 존재하는 특정 항원에 우선적으로 결합하는 항체의 능력을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 특이적 결합 상호작용은 샘플에서 바람직한 항원과 바람직하지 않은 항원 (또는 "표적"과 "비-표적" 항원) 사이를 구별할 것이며, 일부 실시양태에서 약 10 초과 내지 100-배 이상 (예를 들어, 약 1000- 또는 10,000-배 초과)이다. 특정 실시양태에서, 이들이 항체-항원 복합체에 특이적으로 결합될 때 항체와 항원 사이의 친화도는 10-6M 미만, 10-7 M 미만, 10-8 M 미만, 10-9 M 미만, 10-10 M 미만, 10-11M 미만, 또는 약 10-12M 미만, 또는 그 미만의 KD (해리 상수)를 특징으로 한다.
일부 실시양태에서 ABCB5 억제제는 억제성 핵산이다. 억제성 핵산에 의한 유전자 녹다운을 위한 다양한 전략은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 소간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 이중 가닥 RNA (dsRNA), miRNA, 및 관련 기술분야에 공지된 다른 소간섭 핵산-기반 분자를 포함하는 RNA 간섭 (RNAi) 및/또는 마이크로RNA (miRNA) 경로를 사용하는 유전자 녹다운 전략이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 벡터-기반 RNAi 양상 (예를 들어, shRNA 또는 shRNA-mir 발현 구축물)이 세포에서 유전자의 발현을 감소시키는 데 사용된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 치료적 조성물은 소간섭 핵산, 예컨대 shRNA를 발현하는 단리된 플라스미드 벡터 (예를 들어, 관련 기술분야에 공지되거나 또는 본원에 개시된 임의의 단리된 플라스미드 벡터)를 포함한다. 단리된 플라스미드는 종양-특이적, 예를 들어, GBM-특이적, 소간섭 핵산, 예를 들어, shRNA를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 단리된 플라스미드 벡터는 개체를 감염시킬 수 있는 바이러스에 패키징된다. 예시적인 바이러스는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 및 관련 기술분야에 공지되고 본원에 개시된 다른 것을 포함한다.
본원에 기재된 바와 같은, 화합물, 항체뿐만 아니라 코딩 핵산 또는 핵산 세트, 이를 포함하는 벡터, 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포는 제약상 허용되는 담체 (부형제)와 혼합되어 표적 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 제약 조성물을 형성할 수 있다. "허용되는"은 담체가 조성물의 활성 성분과 양립할 수 있고 (바람직하게는, 활성 성분을 안정화시킬 수 있고) 치료될 대상체에게 유해하지 않아야 한다는 것을 의미한다. 완충제를 포함하는 제약상 허용되는 부형제 (담체)는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다.
본 방법에 사용될 제약 조성물은 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함할 수 있다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알콜 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신; 단당류, 이당류, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트란을 포함하는 다른 탄수화물; 킬레이트제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)TM, 플루로닉스(PLURONICS)TM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 화합물 또는 항체를 함유하는 리포솜을 포함한다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 목적하는 직경을 갖는 리포솜을 생성하기 위해 정의된 기공 크기의 필터를 통해 압출된다.
화합물 또는 항체, 또는 코딩 핵산(들)은 또한, 예를 들어, 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타실레이트) 마이크로캡슐, 콜로이드 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼에 포획될 수 있다.
다른 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 지속-방출 포맷으로 제제화될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 화합물 또는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 매트릭스는 성형 물품, 예를 들어 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
본원에 기재된 제약 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위한, 단위 투여 형태, 예컨대 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액, 또는 좌제일 수 있다. 고체 조성물, 예컨대 정제를 제조하기 위해, 주요 활성 성분은 제약 담체, 예를 들어, 종래의 정제화 성분, 예컨대 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 인산이칼슘 또는 검, 및 다른 제약 희석제, 예를 들어, 물과 혼합되어 본 발명의 화합물, 또는 그의 비-독성 제약상 허용되는 염의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비제제(preformulation) 조성물을 형성할 수 있다. 이들 예비제제 조성물을 균질한 것으로 지칭할 때, 이는 조성물이 동등하게 효과적인 단위 투여 형태, 예컨대 정제, 환제 및 캡슐로 용이하게 세분될 수 있도록 활성 성분이 조성물 전체에 걸쳐 고르게 분산되는 것을 의미한다. 이어서, 이 고체 예비제제 조성물은 0.1 내지 약 500 mg의 본 발명의 활성 성분을 함유하는 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분된다. 신규 조성물의 정제 또는 환제는 코팅되거나 또는 달리 배합되어 장기간 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제는 내부 투여 및 외부 투여 구성 요소를 포함할 수 있으며, 후자는 전자 위에 외피의 형태이다. 2개의 구성 요소는 위에서의 붕해에 저항하는 역할을 하고 내부 구성 요소로 하여금 십이지장으로 무손상 통과하거나 또는 방출이 지연되도록 하게하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용될 수 있으며, 이러한 물질은 다수의 중합체 산 및 셸락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질과 중합체 산의 혼합물을 포함한다.
적합한 표면-활성제는, 특히, 비-이온성 작용제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄 (예를 들어, 트윈TM 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄 (예를 들어, 스판(Span)TM 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면-활성제를 포함하는 조성물은 편리하게는 0.05 내지 5% 표면-활성제를 포함할 것이고, 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 필요한 경우, 다른 성분, 예를 들어 만니톨 또는 다른 제약상 허용되는 비히클이 첨가될 수 있다는 것이 인식될 것이다.
적합한 에멀젼은 상업적으로 입수가능한 지방 에멀젼, 예컨대 인트라리피드(Intralipid)TM, 리포신(Liposyn)TM, 인포누트롤(Infonutrol)TM, 리포푼딘(Lipofundin)TM 및 리피피산(Lipiphysan)TM을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 미리-혼합된 에멀젼 조성물 중에 용해되거나 또는 대안적으로 오일 (예를 들어, 대두유, 홍화유, 면실유, 참기름, 옥수수유 또는 아몬드유) 및 인지질 (예를 들어, 난 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과 혼합 시 형성된 에멀젼 중에 용해될 수 있다. 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스가 에멀젼의 긴장성을 조정하기 위해 첨가될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 최대 20% 오일, 예를 들어, 5 내지 20%를 함유할 것이다.
에멀젼 조성물은 화합물 또는 항체를 인트라리피드TM 또는 그의 구성 요소 (대두유, 난 인지질, 글리세롤 및 물)와 혼합함으로써 제조된 것일 수 있다.
흡입 또는 취입을 위한 제약 조성물은 제약상 허용되는, 수성 또는 유기 용매, 또는 이들의 혼합물 중 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 제시된 바와 같은 적합한 제약상 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국부 또는 전신 효과를 위해 경구 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다.
바람직하게는 멸균의 제약상 허용되는 용매 중 조성물은 기체의 사용에 의해 분무될 수 있다. 분무된 용액은 분무 장치로부터 직접적으로 호흡될 수 있거나 또는 분무 장치가 안면 마스크, 텐트 또는 간헐적 양압 호흡 기계에 부착될 수 있다. 용액, 현탁액 또는 분말 조성물은 적절한 방식으로 제제를 전달하는 장치로부터, 바람직하게는 경구로 또는 비강으로 투여될 수 있다.
본원에 기재된 화합물 또는 항체뿐만 아니라 코딩 핵산 또는 핵산 세트, 이를 포함하는 벡터, 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포 중 임의의 것이 암을 치료하는 데 유용하다. 본원에 개시된 방법을 실시하기 위해, 유효량의 본원에 기재된 제약 조성물은 적합한 경로를 통해, 예컨대, 예를 들어, 볼러스로서 또는 일정 기간에 걸친 연속 주입에 의한 정맥내 투여로, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활막내, 척수강내, 경구, 흡입 또는 국소 경로에 의해 치료를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 인간)에게 투여될 수 있다. 제트 분무기 및 초음파 분무기를 포함하는, 액체 제제를 위한 상업적으로 입수가능한 분무기가 투여에 유용하다. 액체 제제는 직접적으로 분무될 수 있고 동결건조된 분말은 재구성 후 분무될 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 항체는 플루오로카본 제제 및 계량 흡입기를 사용하여 에어로졸화되거나, 또는 동결건조되고 분쇄된 분말로서 흡입될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 인식되는 바와 같이, 유효량은 치료되는 특정 상태, 상태의 중증도, 연령, 신체 상태, 크기, 성별 및 체중을 포함하는 개별 환자 파라미터, 치료 기간, 동시 요법의 특성 (존재하는 경우), 특정 투여 경로 및 의료 종사자의 지식 및 전문지식 내의 유사 인자에 따라 달라진다. 경험적 고려 사항, 예컨대 반감기는 일반적으로 투여량의 결정에 기여할 것이다. 예를 들어, 인간 면역계와 양립할 수 있는 항체, 예컨대 인간화 항체 또는 완전 인간 항체는 항체의 반감기를 연장하고 항체가 숙주의 면역계에 의해 공격받는 것을 방지하는 데 사용될 수 있다. 투여의 빈도는 요법의 과정에 걸쳐 결정되고 조정될 수 있고, 일반적으로 표적 질환/장애의 치료 및/또는 억제 및/또는 개선 및/또는 지연에 기반하나, 반드시 그런 것은 아니다. 대안적으로, 항체의 연속적인 지속 방출 제제가 적절할 수 있다. 지속 방출을 달성하기 위한 다양한 제제 및 장치는 관련 기술분야에 공지되어 있다.
한 예에서, 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 항체에 대한 투여량은 경험적으로 화합물 또는 항체의 1회 이상의 투여(들)가 제공된 개체에서 결정될 수 있다. 개체에게 증가하는 투여량의 화합물이 제공된다. 화합물의 효능을 평가하기 위해, 질환/장애의 지표를 따를 수 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 화합물 또는 항체 중 임의의 것의 투여를 위해, 초기 후보 투여량은 약 2 mg/kg일 수 있다. 본 개시내용의 목적을 위해, 전형적인 매일, 매주, 2주마다, 또는 3주마다 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 0.1 μg/kg 내지 3 μg/kg, 30 μg/kg, 100 μg/kg, 300 μg/kg, 0.6 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg, 100 mg/kg 또는 그 초과 중 임의의 것의 범위일 수 있다. 수일, 수주, 수개월, 또는 그 초과에 걸친 반복된 투여의 경우, 상태에 따라, 증상의 목적하는 억제가 발생할 때까지 또는 표적 질환 또는 장애, 또는 그의 증상을 완화시키기에 충분한 치료 수준이 달성될 때까지 치료가 지속된다. 예시적인 투여 요법은 3주마다 약 3 mg/kg의 초기 용량, 이어서 6주에 1회의 약 1 mg/kg의 화합물 또는 항체의 유지 용량, 또는 이어서 3주마다 약 1 mg/kg의 유지 용량을 투여하는 것을 포함한다. 그러나, 다른 투여량 요법이 의사가 달성하기를 원하는 약동학적 붕괴의 패턴에 따라 유용할 수 있다. 예를 들어, 적어도 1종의 추가적인 면역 요법제와의 조합 치료에서 3주마다 1회의 1 mg/kg의 투여량이 고려된다. 일부 실시양태에서, 약 3 μg/mg 내지 약 3 mg/kg 범위의 투여량 (예컨대 약 3 μg/mg, 약 10 μg/mg, 약 30 μg/mg, 약 100 μg/mg, 약 300 μg/mg, 약 1 mg/kg, 및 약 3 mg/kg)이 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 투여 빈도는 매주, 2주마다, 3주마다, 4주마다, 5주마다, 6주마다, 7주마다, 8주마다, 9주마다, 또는 10주마다 1회; 또는 매달, 2개월마다, 또는 3개월마다, 또는 그 초과마다 1회이다. 이 요법의 진행은 종래의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다. 투여 요법 (사용되는 화합물 또는 항체를 포함함)은 시간에 따라 달라질 수 있다.
일부 실시양태에서, 정상 체중의 성인 환자의 경우, 약 0.1 내지 5.0 mg/kg 범위의 용량이 투여될 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 투여량은 10 mg/kg일 수 있다. 특정 투여량 요법, 즉, 용량, 시기 및 반복은 특정 개체 및 그 개체의 병력뿐만 아니라 개별 작용제의 특성 (예컨대 작용제의 반감기, 및 관련 기술분야에 널리 공지된 다른 고려 사항)에 의존할 것이다.
본 개시내용의 목적을 위해, 본원에 기재된 바와 같은 화합물 또는 항체의 적절한 투여량은 이용되는 특정 화합물 또는 항체, 항체, 및/또는 비-항체 펩티드 (또는 그의 조성물), 질환/장애의 유형 및 중증도, 화합물 또는 항체가 예방적 또는 치료적 목적을 위해 투여되는 지 여부, 이전 요법, 환자의 임상 이력 및 길항제에 대한 반응, 및 담당의의 재량에 의존할 것이다. 전형적으로 임상의는 목적하는 결과를 달성하는 투여량이 도달될 때까지, 화합물 또는 항체를 투여할 것이다. 일부 실시양태에서, 목적하는 결과는 종양 크기의 감소, 증가된 무진행 생존 기간 및/또는 전체 생존이다. 투여량이 목적하는 결과를 야기하였는 지 여부를 결정하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 1종 이상의 화합물 또는 항체의 투여는, 예를 들어, 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료적 또는 예방적인 지 여부, 및 숙련된 의사에게 공지된 다른 인자에 따라 연속적이거나 또는 간헐적일 수 있다. 화합물 또는 항체의 투여는 미리 선택된 기간에 걸쳐 본질적으로 연속적일 수 있거나 또는, 예를 들어, 표적 질환 또는 장애가 발생하기 전, 그 동안, 또는 그 후 일련의 이격된 용량일 수 있다
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는"은 장애, 질환의 증상, 또는 질환 또는 장애에 대한 소인을 치료, 치유, 완화, 경감, 변경, 구제, 개선, 향상 또는 영향을 미치기 위한 목적을 갖는, 표적 질환 또는 장애, 질환/장애의 증상, 또는 질환/장애에 대한 소인을 갖는 대상체에게의 1종 이상의 활성제를 포함하는 조성물의 적용 또는 투여를 지칭한다. 표적 질환/장애를 완화시키는 것은 질환의 발생 또는 진행을 지연시키거나, 또는 질환 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. 치료는 질환과 싸우거나, 질환이 보다 나빠지는 것을 예방하거나, 또는 요법의 부재 하에 비해 질환의 진행을 느리게 하기 위해 대상체가 질환을 발생시킬 가능성뿐만 아니라 대상체가 질환을 발생시킨 후 치료를 감소시킨다.
질환을 완화시키는 것이 반드시 치유 결과를 필요로 하는 것은 아니다. 본원에 사용된 바와 같이, 표적 질환 또는 장애의 발생을 "지연시키는"은 질환의 진행을 연기하고/거나, 저해하고/거나, 느리게 하고/거나, 지연시키고/거나, 안정화시키고/거나, 미루는 것을 의미한다. 이 지연은 질환의 이력 및/또는 치료되는 개체에 따라 다양한 길이의 시간의 것일 수 있다. 질환의 발생을 "지연"시키거나 또는 완화시키거나, 또는 질환의 발병을 지연시키는 방법은 방법을 사용하지 않는 것과 비교할 때, 제공된 기간에서 질환의 하나 이상의 증상을 발생시킬 확률을 감소시키고/거나 제공된 기간에서 증상의 정도를 감소시키는 방법이다. 이러한 비교는 전형적으로 통계적으로 유의한 결과를 제공하기에 충분한 다수의 대상체를 사용하는 임상 연구를 기반으로 한다.
질환의 "발생" 또는 "진행"은 질환의 초기 징후 및/또는 후속 진행을 의미한다. 질환의 발생은 관련 기술분야에 널리 공지된 바와 같은 표준 임상 기술을 사용하여 검출가능하고 평가될 수 있다. 그러나, 발생은 또한 검출할 수 없는 진행을 지칭한다. 본 개시내용의 목적을 위해, 발생 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 지칭한다. "발생"은 출현, 재발, 및 발병을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같은 표적 질환 또는 장애의 "발병" 또는 "출현"은 초기 발병 및/또는 재발을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 화합물 또는 항체는 생체내에서 ABCB5 또는 ABCB5-PIP2 경로에서의 다른 산물의 활성을 적어도 20% (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과)만큼 억제하기에 충분한 양으로 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다. 다른 실시양태에서, 화합물 또는 항체는 ABCB5 또는 ABCB5-PIP2 경로에서의 다른 산물의 활성 수준을 적어도 20% (예를 들어, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과)만큼 감소시키는 데 효과적인 양으로 투여된다.
의학의 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 종래의 방법이 치료될 질환의 유형 또는 질환의 부위에 따라, 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 데 사용될 수 있다. 이 조성물은 또한 다른 종래의 경로를 통해 투여되며, 예를 들어, 비경구로, 국소로, 경구로, 흡입 분무에 의해, 직장으로, 비강으로, 협측으로, 질로 또는 이식된 저장소를 통해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 복강내, 종양내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 척수강내, 병변내, 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다. 또한, 이는 예컨대 1-, 3-, 또는 6-개월 데포 주사가능한 또는 생분해성 물질 및 방법을 사용하는 주사가능한 데포 투여 경로를 통해 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 예에서, 제약 조성물은 안구내로 또는 유리체내로 투여된다.
주사가능한 조성물은 다양한 담체, 예컨대 식물성 오일, 디메틸락타미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카르보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올, 및 폴리올 (글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)을 함유할 수 있다. 정맥내 주사의 경우, 수용성 화합물 또는 항체는 드립 방법에 의해 투여될 수 있으며, 이에 의해 화합물 또는 항체 및 생리학상 허용되는 부형제를 함유하는 제약 제제가 주입된다. 생리학상 허용되는 부형제는, 예를 들어, 5% 덱스트로스, 0.9% 염수, 링거 용액 또는 다른 적합한 부형제를 포함할 수 있다. 근육내 제제, 예를 들어, 화합물 또는 항체의 적합한 가용성 염 형태의 멸균 제제는 제약 부형제, 예컨대 주사용수, 0.9% 염수, 또는 5% 글루코스 용액 중에 용해되고 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 1종 초과의 화합물 또는 항체, 또는 화합물 또는 항체와 또 다른 적합한 치료제의 조합이 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여될 수 있다. 화합물 또는 항체는 또한 작용제의 유효성을 증진시키고/거나 보완하는 역할을 하는 다른 작용제와 함께 사용될 수 있다.
표적 질환/장애에 대한 치료 효능은 관련 기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다.
예컨대 본 개시내용에 기재된 것을 수반하는 치료 방법은 본원에 개시된 표적 질환 또는 장애를 위한 다른 유형의 요법과 함께 이용될 수 있다. 예는 화학요법, 면역 요법 (예를 들어 치료적 항체, 항체, CAR T 세포, 또는 암 백신을 수반하는 요법), 수술, 방사선, 유전자 요법 등, 또는 항-감염 요법을 포함한다. 이러한 요법은 본 개시내용에 따른 치료와 동시에 또는 순차적으로 (임의의 순서로) 투여될 수 있다. 일부 경우에, 표적 질환은 암 (예를 들어, 본원에 개시된 것)이고 조합 요법은 면역 체크포인트 (예를 들어, 억제성 체크포인트) 길항제를 수반한다. 예는 PD-1/PD-L1 길항제 (예를 들어, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아벨루맙, 더발루맙 및 아테졸리주맙), LAG3 길항제, TIM-3 길항제, VISTA 길항제, TIGIT 길항제, CSF1R 길항제, CD112R (PVRIG) 길항제, PVR (CD155) 길항제, PD-L2 길항제, A2AR 길항제, B7-H3 길항제, B7-H4 길항제 또는 BTLA 길항제를 포함한다. 추가적인 예는 자극성 체크포인트의 활성을 증진시키는 활성화제, 예컨대 CD122 (IL2) 효능제, 4-1BB, ICOS 리간드, GITR, 및 OX40을 포함한다.
추가적인 치료제와 공동-투여될 때, 각각의 작용제에 적합한 치료 유효 투여량은 부가 작용 또는 상승작용으로 인해 낮아질 수 있다.
본원에 기재된 방법의 효능은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있고 숙련된 의료 전문가에게 명백할 것이다. 예를 들어, 항체-기반 면역요법의 효능은 대상체의 생존 또는 대상체 또는 그의 조직 또는 샘플에서의 암 부담에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법은 대상체에서의 요법의 안전성 또는 독성에 기반하여, 예를 들어 대상체의 전반적인 건강 및/또는 유해 사례 또는 심각한 유해 사례의 존재에 의해 평가된다.
본 발명은 그의 적용에서 하기 설명에 제시되거나 또는 도면에 예시된 구성 요소의 구축 및 배열의 세부 사항으로 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태가 가능하고 다양한 방식으로 실시되거나 또는 수행될 수 있다. 또한, 본원에 사용된 어구 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이고 제한으로 여겨져서는 안 된다. 본원에서 "포함하는", 또는 "갖는", "함유하는", "수반하는", 및 그의 변형의 사용은 이후에 열거된 항목 및 그의 등가물뿐만 아니라 추가적인 항목을 포함하는 것으로 의미된다.
본원에 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용된 과학 및 기술 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 추가로, 문맥에 의해 요구되지 않는 한, 단수 용어는 복수를 포함할 것이고 복수 용어는 단수를 포함할 것이다. 본 개시내용의 방법 및 기술은 일반적으로 관련 기술분야에 널리 공지된 종래의 방법에 따라 수행된다. 일반적으로, 본원에 기재된 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 유전학 및 단백질 및 핵산 화학 및 혼성화와 관련하여 사용된 명명법, 및 그의 기술은 관련 기술분야에서 널리 공지되고 통상적으로 사용되는 것이다. 본 개시내용의 방법 및 기술은 일반적으로 관련 기술분야에 공지된 종래의 방법에 따라 및 달리 지시되지 않는 한 본 명세서 전체에 걸쳐 인용되고 논의되는 다양한 일반적이고 보다 구체적인 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 결코 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 출원 전체에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌 (문헌 참조, 허여된 특허, 공개된 특허 출원, 및 공동 계류 중인 특허 출원을 포함함)의 전문은 본원에 명백히 참조로 포함된다.
실시예
물질 및 방법:
글리오비스(GlioVis). 교모세포종 및 저등급 신경교종 성인 뇌 종양 카피 수 변경 및 TCGA로부터의 RNA-seq 데이터세트는 ABCB5 및 PROM1 (CD133)에 대해 질의되었지만, 하위유형에 기반한 교모세포종 생존 및 환자 결과는 RNA-seq 데이터세트로부터의 ABCB5 발현에 대해 질의되었다.
세포 배양. 인증된 인간 GBM 세포주 U-87 MG, LN-18 및 LN-229를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATCC, 버지니아주 매너서스)으로부터 수득하였다. LN-18 및 LN-229를 DMEM 중에 배양하고, U-87 MG를 10% (v/v) FBS (인비트로젠 깁코(Invitrogen GIBCO), 매사추세츠주 월섬) 및 1% (v/v) 페니실린/스트렙토마이신 (론자 바이오-휘태커(Lonza Bio-Whittaker), 메릴랜드주 워커스빌)으로 보충된 EMEM (ATCC, 버지니아주 매너서스) 중에 배양하였다. ABCB5의 항체-매개된 억제를 위해, GBM 세포를 지정된 용량의 항-ABCB5 모노클로날 항체 (mAb) (클론 3C2-1D12) 또는 MOPC31C 이소형 대조군 mAb (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스)와 함께 72시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 실험을 마이코플라스마 (론자, 뉴햄프셔주 포츠머스)에 대해 음성으로 시험된 세포주로 수행하였다.
RNA 추출 및 RT PCR. RNA를 알엔이지 플러스(RNeasy Plus) 단리 키트 (퀴아젠, 메릴랜드주 저먼타운)를 사용하여 U-87 MG, LN-18 및 LN-229 GBM 또는 G3361 흑색종 세포로부터 제조하고 제조업체의 지침에 따라 어드밴티지 RT-포-PCR(Advantage RT-for-PCR) 키트 (클론테크(Clontech), 캘리포니아주 마운틴뷰)를 사용하여 역-전사시켰다. 이어서, cDNA를 인간 피부 세포에 대해 이전에 기재된 바와 같이 완전 ABCB5 오픈 리딩 프레임 (ORF; 전사체 변이체 2, mRNA NCBI 참조 서열: NM_178559.5)의 PCR 증폭에 적용시켰다. 시퀀싱 반응을 위해, 이어서 PCR 산물을 네스티드 PCR을 위한 주형으로서 사용하였다. 모든 PCR은 Q5 높은 충실도 폴리머라제 (NEB, 매사추세츠주 입스위치)를 사용하였다. 인간 LN-229, LN-18, 및 U-87 MG 교모세포종 세포주에 의해 발현된 ABCB5의 완전 ORF 서열 (전사체 변이체 2, mRNA NCBI 참조 서열: NM_178559.5)을 하기 수탁 번호 하에 진뱅크(GenBank) 데이터베이스에 제출하였다: MK803369, MK803368, MK803366, MK803367.
ABCB5 및 CD133 발현의 유세포 분석법. U-87 MG, LN-18 및 LN-229 GBM 세포를 베르센(Versene) (인비트로젠 깁코, 매사추세츠주 월섬)을 사용하여 수거하고 FITC-접합된 마우스 모노클로날 항-ABCB5 항체 (클론 3C2-1D12) 또는 CFS-접합된 마우스 IgG1 이소형 대조군 (R&D 시스템즈(R&D Systems), 미네소타주 미니애폴리스) 및 APC-접합된 CD133/2 (293C3) (밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotech), 매사추세츠주 캠브리지) 또는 APC-접합된 마우스 이소형 대조군 (R&D 시스템즈, 미네소타주 미니애폴리스)으로 염색하였다.
안정한 ABCB5 녹다운 교모세포종 세포 변이체의 생성. 안정한 LN-229 및 U-87 MG ABCB5 녹다운 (KD) 또는 이들의 각각의 sh대조군 세포 변이체의 생성에 이어 퓨로마이신 선택 (2 μg/mL)을 달성하였다. ABCB5 KD 세포주에서의 ABCB5 단백질 발현의 감소를 면역침전 (IP)-웨스턴 블롯에 의해 확인하였다. 간단하게, 각각 5 mg의 초음파처리 및 프리클리어된 총 세포 용해물을 단백질 A/G 아가로스를 포함하는 2 μg의 항-ABCB5 토끼 pAb (앱전트(Abgent)/앱셉타(Abcepta), 캘리포니아주 샌디에이고)와 함께 3시간 동안 4℃에서 인큐베이션 전에, RIPA 완충제 (보스턴 바이오프로덕츠(Boston BioProducts), 매사추세츠주 애슐랜드) 플러스 프로테아제 억제제 (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스) 중에서 제조하였다. 3회 세척한 후, SDS-Page 및 웨스턴 블롯팅을 동일한 항체를 사용하여 수행하였다.
세포 증식 검정. 세포 증식을 제조업체의 프로토콜에 따라 MTT 세포 증식 검정 키트 (트레비젠(Trevigen), 메릴랜드주 게이더스버그)에 의해 측정하였다. 간단하게, 1 x 104개의 세포를 96-웰 플레이트의 웰당 100 μl 배양 배지로 시딩하였다. TMZ의 부재 또는 존재 하에 항-ABCB5 mAb 또는 이소형 대조군 mAb로 처리한 후, 10 μl의 MTT 시약을 각각의 웰에 첨가하였다. 보라색 결정의 포르마잔이 가시적이면, 100 μl의 세제 시약을 첨가하였고, 결정이 가용성이 될 때까지 세포를 암실에서 2-4시간 동안 인큐베이션하였다. 흡광도를 570 nm에서 측정하고 배양 배지 단독으로 이루어지고 상기와 동일한 방식으로 프로세싱된 블랭크 웰에 대해 보정하였다.
생체내 종양 이종이식편 연구. 잭슨 래보래토리(Jackson Laboratory) (메인주 바 하버)로부터 구입한 6주령 암컷 NOD/SCID IL2rγ-/- (NSG) 마우스를 보스턴 칠드런'즈 호스피털(Boston Children's Hospital) 및 하버드 메디컬 스쿨(Harvard Medical School)의 기관 가이드라인에 따라 유지시켰고 실험을 승인된 실험 프로토콜에 따라 수행하였다. 인간 이종이식편을 수용자 NSG 마우스의 우측 플랭크로의 인간 GBM LN-229 및 U-87 MG 세포의 피하 주사 (5 x 106개 세포/접종물)에 의해 확립하였다. 종양 성장에 대한 ABCB5 차단의 효과를 결정하기 위해, 마우스에게 종양 접종 1주 전에 시작하여 주당 3회 1 mg 항-ABCB5 mAb 또는 1 mg 이소형 대조군 mAb를 복강내로 주사하였다. 이종이식편 종양의 TMZ (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스) 감작화에 대한 ABCB5 차단의 효과를 결정하기 위해, LN-229 GBM 이종이식편을 상기 기재된 바와 같이 NSG 마우스에서 확립하였다. 종양이 100 mm3의 부피에 도달하면, 마우스를 0.1 mg TMZ 또는 그의 비히클의 존재 하에 1 mg 항-ABCB5 mAb 또는 1 mg 이소형 대조군 mAb를 받은 4개의 그룹 (n = 그룹당 6)으로 무작위화하였다. 항-ABCB5 mAb 또는 이소형 대조군 mAb의 복강내 주사를 TMZ의 매일 복강내 주사의 개시 1주 전에 시작하였다. TMZ를 10% DMSO 중에 새롭게 용해시키고 매 주사 전에 염수 중에 희석하였다. 종양 부피를 확립된 공식 종양 부피 (mm3) = π/6 x 0.5 x 길이 x (너비)2에 따라 매주 2회 측정하였다.
면역조직화학. GBM 종양 이종이식편의 탈파라핀화된 5-μm 절편 상 Ki-67 및 절단된 카스파제-3에 대한 면역조직화학적 염색을 항-Ki67 (벡터 래보래토리즈(Vector Laboratories), 캘리포니아주 벌링게임) 및 항-절단된 카스파제-3 (쎌 시그널링 테크놀로지(Cell Signaling Technology), 매사추세츠주 댄버스) 항체를 사용하여 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (Wilson, B. J., et al., (2011) ABCB5 identifies a therapy-refractory tumor cell population in colorectal cancer patients. Cancer Res 71, 5307-5316). 이종이식편 종양에서의 Ki-67 및 절단된 카스파제-3 발현의 정량적 분석을 위해, 슬라이드를 매사추세츠주 보스턴 소재의 다나-파버/하버드 캔서 센터(Dana-Farber/Harvard Cancer Center), 리서치 패톨로지 코어스 (Research Pathology Cores)에 의해 제공된 아페리오 디지털 패톨로지 서비스(Aperio Digital Pathology Service)를 통해 스캔하였다. 핵 염색 알고리즘을 양성 세포의 열거에 이용하였다.
아폽토시스 검정. GBM 세포를 72시간 동안 TMZ의 부재 또는 존재 하에 항-ABCB5 mAb 또는 이소형 대조군 mAb로 처리하였다. 항체-매개된 ABCB5 차단에 의한 아폽토시스의 유도를 제조업체의 프로토콜에 따라 APC 아넥신 V 및 PI (BD 바이오사이언시스(BD Biosciences), 매사추세츠주 빌레리카) 염색을 사용하는 유세포 분석에 의해 검출하였다.
마이크로어레이 분석. 마이크로어레이 분석을 HTA 2.0 인간 어레이를 사용하는 다나-파버 캔서 인스티튜트(Dana-Farber Cancer Institute)에서의 마이크로어레이 코어 시설에 의해 수행하였다. U-87 MG, LN-18, 및 LN-229 GBM 세포주로부터 단리된 FACS-분류된 ABCB5-양성 및 ABCB5-음성 세포를 비교하였다. 데이터를 RMA 정규화 방법을 사용한 R 바이오컨덕터(Bioconductor) 올리고 패키지를 사용하여 전처리하였다. 차등 발현 유전자 (DEG)를 미리 정의된 기준을 사용한 R 바이오컨덕터 림마 패키지를 사용하여 확인하고, 이어서 이들 유전자를 인제뉴어티(Ingenuity) 경로 분석으로 입력하였다.
세포 주기 분석. 세포 주기 분포를 제조업체의 프로토콜에 따라 PI/RNase 염색 완충제 (BD 바이오사이언시스, 매사추세츠주 빌레리카)를 사용하는 유세포 분석에 의해 결정하였다. 간단하게, 수거된 세포를 PBS 중에 세척하고 밤새 차가운 70% 에탄올 중에 고정시켰다. 고정된 세포를 PBS 중에 세척하고 PI/RNase 염색 완충제 중에 재현탁시켰다. 37℃에서 30분 동안 인큐베이션 후, G0/G1, S, 및 G2/M기에서의 세포의 분획을 488 nm의 여기 파장 및 630 nm의 방출 파장에서의 유세포 분석에 의해 분석하였다.
웨스턴 블롯. 단백질 용해물을 프로테아제 억제제 칵테일 (시그마-알드리치, 미주리주 세인트 루이스)로 보충된 RIPA 완충제 (쎌 시그널링 테크놀로지, 매사추세츠주 댄버스) 중에서 배양된 GBM 세포 또는 절제된 인간 GBM 이종이식편 종양으로부터 제조하였다. 정규화된 단백질 용해물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에 진행시키고 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막 (GE 헬스케어 라이프 사이언시스 (GE Healthcare Life Sciences), 펜실베니아주 피츠버그)으로 옮겼다. 막을 토끼 항-β-액틴 (D6A8), 마우스 항-β-액틴 (8H10D10) 항-포스포-ATM (Ser1981) (D6H9), 항-ATM (D2E2), 항-포스포-CHEK1 (Ser345) (133D3), 항-CHEK1 (2G1D5), 항-포스포-CDC25C (Ser216) (63F9), 항-CDC25C (5H9), 항-포스포-PLK1 (Thr210) (D5H7), 항-PLK1 (208G4), 항-사이클린 B1 (D5C10), 항-포스포-CDC2 (Tyr15) (10A11), 항-CDC2, 항-포스포-WEE1 (Ser642) (D47G5), 항-WEE1 (D10D2) 또는 항-MYT1 (쎌 시그널링 테크놀로지, 매사추세츠주 댄버스)과 함께 인큐베이션하고, 후속적으로 퍼옥시다제-연결된 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 반응 밴드를 화학발광 기질 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific), 매사추세츠주 월섬)을 사용하여 검출하였다.
모세관 웨스턴 블롯 분석. 모세관 웨스턴 분석을 제조업체의 지침에 따라 웨스턴 블롯 시스템 (프로틴심플(ProteinSimple)) 상에서 수행하였다. 간단하게, 단백질 용해물을 RIPA 완충제 중에서 배양된 GBM 세포로부터 제조하고 샘플 완충제 중에 2 μg/μL로 희석하였다. 희석된 샘플을 형광 마스터 혼합물과 결합시키고 5분 동안 95℃에서 가열하였다. 제조된 샘플, 차단 시약, 1차 항체 (CDC25C, PLK1, 사이클린 B1, CDC2, WEE1 및 MYT1의 경우 1:20 희석, CHEK1의 경우 1:10 희석, 포스포-CHEK1, 포스포-CDC25C, 포스포-PLK1, 포스포-CDC2 및 포스포-WEE1의 경우 1:5 희석, 및 마우스 및 토끼-β-액틴의 경우 1:80 희석), 2차 항체, 및 화학발광 기질을 검정 플레이트에서 지정된 웰로 피펫팅하였다. 전기영동 및 면역검출 단계를 완전히 자동화된 모세관 시스템에서 수행하였다. 데이터를 컴패스 소프트웨어 (프로틴심플)를 사용하여 분석하였다.
통계. 데이터는 3회 이상의 독립적인 실험의 평균 ± SEM으로 표현된다. 단일 합동 분산을 사용한 던의 다중 비교 검정을 사용한 크러스컬-월리스 검정을 사용하여 TCGA RNA-seq 데이터에서의 통계적 차이를 결정하였으며, P＜0.05는 유의한 것으로 간주된다. GBM RNA-seq 데이터에서의 및 상이한 GBM 하위유형에 대한 높은 ABCB5 발현과 낮은 ABCB5 발현 사이의 컷오프를 결정하기 위해, R 패키지 맥스스탯(maxstat)을 사용하여 최대로 선택된 순위 통계에 기반하는 컷포인트를 확인하였다. 상이한 그룹 사이의 마커의 발현 수준, 아폽토시스 세포의 백분율, 세포의 DNA 함량, 및 종양 중량에서의 통계적 차이를 독립표본 및 대응표본 t-검정에 의해 결정하였으며, P＜0.05는 유의한 것으로 간주된다. 상이한 그룹 사이의 세포 성장 속도 또는 종양 성장 속도에서의 통계적 차이를 이원 ANOVA 및 시닥의 다중 비교 검정을 사용하여 결정하였으며, P＜0.05는 유의한 것으로 간주된다.
데이터 이용가능성. 인간 LN-229, LN-18, 및 U-87 MG 교모세포종 세포주에 의해 발현된 ABCB5의 완전 ORF 서열 (전사체 변이체 2, mRNA NCBI 참조 서열: NM_178559.5)을 하기 수탁 번호 하에 진뱅크 데이터베이스에 제출하였다: MK803369, MK803368, MK803366, MK803367. 마이크로어레이 분석을 GSE127895 수탁 번호 하에 진 익스프레션 옴니버스(Gene Expression Omnibus)에 기탁하였다.
실시예 1: ABCB5는 GBM 원발성 종양 및 세포주에서 발현된다.
ABCB5 카피 수 변경을 검사하였다. 더 캔서 게놈 아틀라스(The Cancer Genome Atlas) (TCGA)로부터의 GBM 및 저등급 신경교종 (LGG) 시퀀싱 데이터에서의 발현을 결정하였다. 희소돌기아교세포종 (19.6%), 희소성상세포종 (22.5%), 및 성상세포종 (25.3%)과 비교하여, 카피 수 증가에서의 증진된 증가를 GBM (77.4%)에서 볼 수 있다 (도 1A). 다양한 뇌암에서의 ABCB5 mRNA 발현의 평균 사이에서 통계적으로 유의한 차이가 있었다 (H=138.1, P＜0.0001). ABCB5 mRNA 발현은 희소돌기아교세포종 (-0.66 ± 0.05 log2(계수), P＜0.0001), 희소성상세포종 (-0.62 ± 0.06 log2(계수), P＜0.0001), 및 성상세포종 (-0.64 ± 0.06 log2(계수), P＜0.0001)과 비교하여 GBM (0.51 ± 0.11 log2(계수), 평균 ± SEM)에서 유의하게 더 높았다 (도 1B). 희소돌기아교세포종과 희소성상세포종 (P>0.99), 희소성상세포종과 성상세포종 (P>0.99), 또는 희소돌기아교세포종과 성상세포종 (P>0.99) 사이에서 ABCB5 mRNA 발현의 통계적으로 유의한 차이는 없었다. ABCB5가 모든 3개의 GBM 하위유형의 GBM TCGA mRNA 발현 데이터세트에서 검출되었다 (고전: 0.16 ± 0.15 log2(계수), 중간엽: 0.90 ± 0.20 log2(계수), 전신경: 0.48 ± 0.18 log2(계수), 평균 ± SEM) (도 1C, 좌측). 본 발명자들은 또한 모든 GBM 하위유형에 대해 ABCB5 mRNA 발현과 전체 생존 (OS)의 상관관계를 검사하였다 (도 1C, 우측). 모든 GBM 하위유형을 함께 고려할 때, 낮은 ABCB5 발현과 비교하여 높은 ABCB5 발현의 경우 중앙값 OS가 더 낮은 유의한 추세가 있었다 (12.6 vs. 14.9개월) (최적 컷오프 높음/낮음 = log2(0.06), P=0.053). 중간엽 하위유형의 경우, 낮은 ABCB5 발현에 비해 높은 ABCB5 발현의 경우 중앙값 생존이 유의하게 더 낮았다 (10.4 vs. 15.9개월) (최적 컷오프 = log2(0.92), P=0.031). 고전 및 전신경 하위유형의 경우, 각각 14.0 vs. 14.9개월 (높은 vs. 낮은 ABCB5 발현, 최적 컷오프 = log2(1.55), P=0.953) 및 12.5 vs. 14.9개월 (높은 vs. 낮은 ABCB5 발현, 최적 컷오프 = log2(0.03), P=0.453)로 중앙값 생존이 근소하게 더 낮았다. 이들 결과는 GBM, 가장 특히 중간엽 하위유형에서의 ABCB5 발현의 임상 유의성을 추가로 강조하였다. 면역조직화학적 분석은 단백질 수준에서 환자-유래된 원발성 GBM 종양 생검 물질에서의 ABCB5 발현을 확인하였다 (도 1D).
GBM은 상당한 종양간 이질성을 나타내고, 즉, 전구 병변의 증거 없이 완전히 발달된 고등급 신경교종으로서 나타나는 원발성 GBM, 또는 보다 덜 악성 성상세포종으로부터 발달한 2차 GBM으로 구별될 수 있다는 것이 인식되어 왔다. 더욱이, TCGA 분석은 이들의 게놈 변경 및 특징적인 분자 지표에 기반하여 별개의 GBM 분자 하위유형의 존재를 확인하였다. 이들 중에서, IDH 및 TP53에서의 돌연변이를 갖는 전신경 하위유형은 2차 GBM에 해당하고 보다 좋은 결과와 연관된다. 동형접합 PTEN 손실을 지니는 중간엽 하위유형은 원발성 GBM에 해당하고 보다 나쁜 결과와 연관된다. 본원에서, 본 발명자들은 이러한 분자 하위유형의 대표적인 GBM 세포주, 즉 TP53에서의 돌연변이를 지니고 PTEN 야생형인 LN-229 및 LN-18 세포주, 및 PTEN 손실 및 야생형 TP53을 특징으로 하는 U-87 MG 세포주에서의 ABCB5 발현 및 기능을 검사하였다. 본 발명자들은 qRT-PCR (도 1E), 네스티드 RT-PCR (도 1F) 및 유세포 분석법 (도 1G)에 의해 ABCB5가 모든 3개의 인간 GBM 세포주 (LN-229, LN-18, 및 U-87 MG)에서 발현되는 것을 발견하였으며, 이는 40.6% (40.6 ± 0.8%, 평균 ± SEM)의 LN-229, 31.8% (31.8 ± 2.1%, 평균 ± SEM)의 LN-18 및 16.5% (16.5 ± 0.9%, 평균 ± SEM)의 U-87 MG GBM 세포 상에서 ABCB5의 세포 표면 발현을 나타냈다.
실시예 2: ABCB5는 CD133-양성 GBM 줄기 세포에 의해 발현되고 항체-매개된 ABCB5 차단은 CD133-양성 줄기 세포의 빈도를 감소시킨다.
GBM 세포의 하위집단 상 ABCB5 발현의 발견에 기반하여 (도 1G), ABCB5가 GBM CSC에 대한 치료적 내성을 부여할 것이며, 이는 CD133에 의해 표시된다는 것이 가정되었다. 이를 추가로 시험하기 위해, TCGA로부터의 GBM 및 LGG RNA-seq 데이터에서의 CD133 mRNA 발현을 먼저 검사하였다. ABCB5와 유사하게, 평균 사이에서 CD133 mRNA 발현의 통계적으로 유의한 차이가 있었다 (H=71.46, P＜0.0001). CD133 mRNA 발현은 희소돌기아교세포종 (7.21 ± 0.08 log2(계수), P＜0.0001), 희소성상세포종 (7.34 ± 0.08 log2(계수), P＜0.0001), 및 성상세포종 (7.64 ± 0.09 log2(계수), P＜0.0001)과 비교하여 GBM (8.39 ± 0.14 log2(계수), 평균 ± SEM)에서 유의하게 더 높았다 (도 2A). 희소돌기아교세포종과 희소성상세포종 (P>0.99) 또는 희소성상세포종과 성상세포종 (P=0.40) 사이에서 발현의 통계적으로 유의한 차이는 없었다. 추가적으로, 통계적으로 유의한 차이가 희소돌기아교세포종과 성상세포종 (P=0.004) 사이에서 관측되었다. CD133 발현은 GBM 및 LGG TCGA RNA-seq 데이터에서 ABCB5와 양의 상관관계가 있었다 (r s (667)=0.26, P＜0.0001). 게다가, 이중-색상 유세포 분석은 2.2%의 LN-229, 6.4%의 LN-18 및 3.4%의 U-87 MG 인간 GBM 세포 상에서 ABCB5 및 CD133의 공동-발현을 확인하였다 (도 2B). 더욱이, 100%의 CD133-양성 LN-229 및 U-87 MG 세포 및 93%의 CD133-양성 LN-18 세포가 ABCB5를 발현하였다. CD133-양성 GBM 줄기 세포의 종양형성 가능성에 대한 증거를 고려하면, CD133-양성 CSC 상 ABCB5의 발현은 ABCB5를 기능적으로 억제함으로써 GBM 성장을 표적화할 가능성을 나타낸다.
정상 줄기 세포 및 인간 결장직장암에서의 ABCB5의 신규 항-아폽토시스 기능의 발견과 함께, ABCB5가 또한 GBM 줄기 세포 유지 및 종양 침해성에 요구될 수 있다는 것이 가정되었다. LN-229, LN-18, 및 U-87 MG 세포를 100 μg/ml 항-ABCB5 모노클로날 항체 (mAb) (3C2-1D12) 또는 이소형-매치된 대조군 mAb와 함께 72시간 동안 인큐베이션하고 CD133 (APC, FL4 형광)의 발현을 유세포 분석에 의해 결정하였을 때, 본 발명자들은 항-ABCB5 mAb로의 GBM 세포주 LN-229 및 LN-18의 시험관내 처리가 이소형 대조군으로의 처리와 비교하여 CD133-양성 CSC 하위집단의 빈도를 2-배 초과만큼 감소시켰다는 것을 발견하였지만 (ABCB5 mAb vs. 이소형 대조군: 0.35 ± 0.03% vs. 0.83 ± 0.03%, P＜0.0001, 평균 ± SEM) (도 2C), 항-ABCB5 mAb로의 처리 후 U-87 MG 세포에서 CD133-양성 세포 빈도의 유의한 차이는 관측되지 않았다 (ABCB5 mAb vs. 이소형 대조군: 1.24 ± 0.02% vs. 1.02 ± 0.13%, P=0.1664, 평균 ± SEM). 이들 차등적인 반응은 연구 하에 GBM 세포주의 유전자 이질성에 의해 설명될 수 있다. 예를 들어, LN229 및 LN18 세포주는 TP53 야생형 및 PTEN 돌연변이인 U-87 MG와 비교하여, DNA 복구 유전자, 예컨대 TP53에서의 증가된 돌연변이 부담 및 야생형 PTEN 상태를 갖는다. 게다가, 이들 결과는, U-87 MG에서, CD133-양성 GBM 줄기 세포가 이들의 생존을 위한 추가적인 ABCB5-독립적인 경로를 이용할 수 있고 생체내에서 ABCB5 차단에 대한 감쇠된 반응을 나타낼 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 3: 항체-매개된 ABCB5 차단은 인간 GBM에서 증식을 억제하고, 아폽토시스를 촉진한다.
GBM의 성장에서의 CD133-양성 CSC의 유의성을 고려하여, GBM 세포 증식에 대한 CSC 빈도의 감소의 효과를 검사하였다. 본 발명자들은 LN-229, LN-18, 및 U-87 MG 세포를 0-200 μg/ml ABCB5 mAb 또는 이소형 대조군 mAb와 함께 72시간 동안 인큐베이션하고 3-(4,5- 디메틸티아졸-2-일) -2,5-디페닐테트라졸륨 디페닐테트라졸륨 브로마이드포르 (MTT) 검정에 의해 세포 증식을 분석하였다. 분산 분석 (ANOVA)에 의해 결정된 바와 같이 ABCB5 mAb-처리된 세포와 이소형 대조군 mAb-처리된 세포 사이에서 통계적으로 유의한 차이가 있었다 (F(1, 144)=48.42, P＜0.0001). 다중 비교 검정은 항-ABCB5 mAb가 GBM 세포의 증식을 억제하였고 이 억제가 농도 ≥ 20 μg/ml에서 통계적으로 유의하였다는 것을 나타냈다 (농도, 조정된 P-값: 20, 0.0293; 50, 0.0021; 100, ＜0.0001; 200, ＜0.0001) (도 3A). 더욱이, 항체-매개된 ABCB5 차단은 GBM 세포의 증가된 아폽토시스를 야기하였다. 100 μg/ml ABCB5 mAb vs. 이소형-매치된 대조군 항체와 함께 72시간 동안 인큐베이션된 LN-229, LN-18, 및 U-87 MG 세포는, 아넥신-V (APC, FL4 형광) 및 프로피듐 아이오다이드 (FL2 형광) 염색을 사용하는 이중 색상 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같이 아폽토시스 세포 (초기 + 후기)의 백분율에서의 2.3-배 증가를 나타냈다 (ABCB5 mAb vs. 이소형 대조군: 23.90 ± 3.5% vs. 10.55 ± 1.6%, P＜0.01, 평균 ± SEM) (도 3B). 이들 결과는 정상 줄기 세포에서의 그의 역할과 유사하게, ABCB5가 GBM에서 성장-유도 및 항-아폽토시스 분자로서의 역할을 한다는 것을 시사한다.
생체내에서 GBM 성장에서의 ABCB5의 잠재적인 역할을 평가하기 위해, 확립된 인간-대-마우스 GBM 이종이식 모델에서 종양 성장에 대한 ABCB5 차단의 효과를 시험하였다 (Singh, S. K.,et al., (2004) Identification of human brain tumour initiating cells. Nature 432, 396-401). 이 실험에서, 시험관내 ABCB5 차단에 대해 차등적인 CD133-양성 GBM 줄기 세포 반응을 나타낸 LN-229 및 U-87 MG GBM 세포주를 이용하여 이 시험관내 반응이 종양 성장에 대한 생체내 효과로 바뀌는 지 여부를 시험하였다. LN-18 세포주는 공개된 보고와 일치하게, 재현가능하게 종양을 형성하는 데 실패하였기 때문에, 생체내 연구로부터 배제되었다. LN-229 및 U-87 MG GBM 세포를 기재된 바와 같은 면역결핍 NSG 마우스로 피하로 주사하였다 (Singh, S. K.,et al., (2004) Identification of human brain tumour initiating cells. Nature 432, 396-401). 종양 이종이식편의 검사는 LN-229 GBM 세포가 주사된 마우스에서 ABCB5의 기능적 차단 후 시간이 지나면서 감소된 종양 성장을 나타냈다 (도 3C, 좌측). 독립표본 t-검정에 의해, LN-229의 경우 종점 종양 부피에서 통계적으로 유의한 감소가 관측되었지만 (ABCB5 mAb vs. 이소형 대조군: 158.1 ± 22.26 mm3 vs. 68.13 ± 14.75 mm3, P=0.0098, 평균 ± SEM) U-87 MG GBM 세포는 아니었다 (ABCB5 mAb vs. 이소형 대조군: 473.3 ± 156.5 mm3 vs. 460.4 ± 111.7 mm3, P=0.95, 평균 ± SEM). LN-229의 경우 종양 중량이 또한 이소형 대조군과 비교하여 항-ABCB5 mAb로 처리된 마우스에서 감소하였지만 U-87 MG GBM 세포는 아니었다 (ABCB5 mAb vs. 이소형 대조군: 31일째 LN-229: 0.315 gm ± 0.043 gm vs. 0.181 gm ± 0.032 gm, P=0.0372; 24일째 U-87 MG (종양 부담으로 인해 초기에 희생된 마우스): 0.75 gm ± 0.23 gm vs. 0.724 gm ± 0.149 gm, P=0.926, 평균 ± SEM) (도 3C, 우측). 이들 결과는 GBM 종양이 이들의 유전자 종양간 이질성 및 다른 성장 속도에 기반하여 mAb-매개된 ABCB5 차단에 대해 차등적인 반응을 나타낼 수 있다는 것을 시사한다.
LN-229 종양에서의 ABCB5 차단의 성장 억제 및 아폽토시스-촉진 효과를 ABCB5 mAb vs. 이소형 대조군-처리된 마우스의 종양 이종이식편에서 증식 마커 Ki-67 및 아폽토시스 마커 절단된 카스파제-3의 발현을 평가함으로써 추가로 입증하였다. ABCB5 mAb-처리된 종양 이종이식편의 면역조직화학적 분석 (도 3D)은 Ki-67에서 2.0-배 감소 (ABCB5 mAb vs. 이소형 대조군: 22.1 ± 3.1% vs. 43.3 ± 3.2%, P=0.003, 평균 ± SEM) (도 3E, 좌측) 및 절단된 카스파제-3에서 3.6-배 증가 (ABCB5 mAb vs. 이소형 대조군: 4.0 ± 0.4% vs. 1.1 ± 0.3%, P=0.0008, 평균 ± SEM) (도 3E, 우측) 양성 핵을 나타냈으며, 이는 이 GBM 모델 시스템에서의 ABCB5의 종양형성 및 항-아폽토시스 역할을 강조한다.
실시예 4: 표적화된 ABCB5 차단은 시험관내 및 생체내에서 GBM 세포 증식의 TMZ-매개된 억제를 증대시키고 약물-유도된 아폽토시스 촉진한다.
GBM 치료적 내성에서의 ABCB5의 잠재적인 역할을 추가로 분석하기 위해, 본 발명자들은 GBM 세포 배양을 mAb-매개된 ABCB5 차단과 조합된 TMZ 처리에 적용시켰다. LN-229, LN-18, 및 U-87 MG 세포를 100 μg/ml ABCB5 mAb 또는 이소형 대조군 mAb와 함께 2시간 동안 미리-인큐베이션하고, 이어서 72시간 동안 TMZ (0-1000 μM)로 처리하였다. MTT 검정에 의해 측정된 바와 같이, 세포 증식에서 통계적으로 유의한 감소가 ANOVA에 의해 관측되었고 (F(1,160)=1756, P＜0.0001) 다중 비교 검정은 GBM 세포의 증식에 대한 TMZ의 억제 효과가 ABCB5의 항체-매개된 차단에 의해 추가로 증대되었고 이 억제 효과가 TMZ의 가장 높은 농도 (1000 μM)를 제외하고는 측정된 모든 시점에서 통계적으로 유의하였다는 것을 나타냈다 (농도 ≤ 200 μM의 경우 조정된 P-값 ＜0.0001, 500 μM에서 P=0.0101) (도 4A). ABCB5의 표적화된 억제는 또한 아넥신-V (APC, FL4 형광) 및 프로피듐 아이오다이드 (FL2 형광) 염색을 사용하는 이중 색상 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같이 GBM 세포의 TMZ-유도된 아폽토시스를 증대시켰다. 100 μg/ml ABCB5 mAb와 함께 2시간 동안 미리-인큐베이션되고, 이어서 72시간 동안 100 μM TMZ로 처리된 GBM 세포는 이소형 대조군 mAb와 함께 인큐베이션된 것과 비교하여 아폽토시스 세포 (초기 + 후기)의 증가된 백분율 (2.3-배)을 나타냈으며 (ABCB5 mAb vs. 이소형 대조군: 43.5 ± 0.7% vs. 18.6 ± 1.2%, P＜0.0001, 평균 ± SEM) (도 4B), 이는 ABCB5가 인간 GBM에서 TMZ 내성의 매개체로서의 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다.
생체내에서 mAb-매개된 ABCB5 차단이 확립된 GBM 종양의 감작화를 야기하였는 지 여부를 시험하기 위해, 본 발명자들은 ABCB5 mAb 또는 이소형 대조군의 존재 하에 LN-229 및 U-87 MG 이종이식된 NSG 마우스를 TMZ 요법에 적용시켰다. LN-229 세포로 이종이식된 마우스는 이소형-매치된 대조군 mAb의 존재 하에 약물을 받은 마우스와 비교하여 ABCB5 mAb의 존재 하에 TMZ를 사용한 치료 후 종양 부피에서 1.4-배 감소를 나타냈다 (ABCB5 mAb vs. 이소형 대조군: 98.50 ± 20.34 mm3 vs. 138.6 ± 19.67 mm3, P=0.025, 평균 ± SEM). U-87 MG 세포로 이종이식된 마우스는 이소형-매치된 대조군 mAb의 존재 하에 약물을 받은 마우스와 비교하여 ABCB5 mAb의 존재 하에 TMZ를 사용한 치료 후 종양 부피에서 유의한 차이를 나타내지 않았다 (ABCB5 mAb vs. 이소형 대조군: 521.7 ± 75.52 mm3 vs. 372.3 ± 107.4 mm3, P=0.059, 평균 ± SEM) (도 4C). ABCB5 mAb의 존재 하에 TMZ로 처리된 LN-229 세포가 주사된 마우스로부터의 종양은 이소형 대조군 mAb 처리된 마우스와 비교하여 Ki-67에서 1.5-배 감소 (ABCB5 mAb vs. 이소형 대조군: 27.8 ± 2.1% vs. 40.9 ± 4.6%, P=0.03, 평균 ± SEM) 및 절단된 카스파제-3에서 3.0-배 증가 (ABCB5 mAb vs. 이소형 대조군: 4.8 ± 0.6% vs. 1.6 ± 0.2%, P=0.0013, 평균 ± SEM) (도 4D & E) 양성 핵을 나타냈다. 이들 발견은 TMZ에 대한 GBM 치료적 내성의 역전에서의 ABCB5 표적화의 잠재적인 역할을 강조하고 또한 종양 분자 하위유형 및 성장 속도에서의 차이에 기반하는 mAb-매개된 ABCB5 차단에 대한 GBM 종양의 차등적인 반응을 강조한다.
실시예 5: ABCB5의 항체-매개된 차단은 TMZ-유도된 G2/M 정지로부터 GBM 세포를 방출한다.
TMZ 및 mAb-매개된 ABCB5 차단의 존재 하에 GBM 종양 성장의 감쇠에 대한 원인이 되는 잠재적인 분자 메커니즘을 검사하기 위해, 본 발명자들은 U-87 MG, LN-18, 및 LN-229 GBM 세포주로부터 유세포 분석에 의해 분류된 ABCB5-양성 및 ABCB5-음성 세포의 마이크로어레이 유전자 발현 분석을 수행하였다. 마이크로어레이에 의해 검출된 모든 유전자에 대해 수행된 주요 구성 요소 분석 (PCA)은 PC1 및 PC2 상에서 세포주에 특이적인 분리를 나타냈지만 PC3은 ABCB5-양성 및 ABCB5-음성 세포를 분리하였다 (도 5A). 본 발명자들은 모든 3개의 세포주에서 ABCB5-양성과 ABCB5-음성 세포 사이의 1661개의 유전자 차등 발현 (P ＜0.05)의 목록을 생성하고 이 목록을 인제뉴어티 경로 분석 (IPA)으로의 입력으로서 사용하였다. IPA는 ABCB5-양성과 ABCB5-음성 세포 사이에서 풍부화될 489개의 질환 및 기능적 카테고리를 결정하였다. 현저하게도, 이들 총 카테고리의 13.7%가 세포 주기와 관련되었다 (암의 경우 5.9% 및 신경/신경계의 경우 7.6%와 비교됨) (도 5B). 특이적 풍부화 카테고리 (-log10(p-값)으로 보고됨)는, 암, 세포 사멸 및 생존 (5.41), 세포 주기: 이수성 (3.22), 세포 주기: 방추 체크포인트 (2.36), 세포 주기: G2/M 이행 (2.28), 세포 주기: 간기 (2.73), 세포 주기: 텔로미어 캡핑 (2.22), 세포 주기 진행 (2.19), 및 세포 주기: M기 (2.15)를 포함하였다 (도 5C).
이들 결과에 기반하여, 본 발명자들은 ABCB5 차단이 G2/M 체크포인트 조절자의 조정 및 약물-유도된 G2/M 정지의 후속 역전을 통해 GBM 화학요법내성을 역전시킬 수 있는 지 여부를 검사하였다. LN-229, LN-18, 및 U-87 MG 세포를 100 μg/ml ABCB5 mAb 또는 이소형 대조군 mAb와 함께 2시간 동안 미리-인큐베이션하고, 이어서 72시간 동안 100 μM TMZ로 처리하였다. 세포를 차가운 에탄올 중에 고정시키고, 프로피듐 아이오다이드/RNase 완충제 중에서 염색하였고, DNA 함량을 더블릿 제거를 위한 FL2H 대 FL2W 분석 후 유세포 분석에 의해 분석하였다 (도 6A). 본 발명자들은 ABCB5의 항체-매개된 기능적 억제가 이소형 대조군의 존재 하에 TMZ 처리를 받은 세포와 비교하여, ABCB5 mAb 및 TMZ 처리 후 세포 주기의 G2/M기에서 1.4-배 감소된 세포 축적에 의해 증명된 바와 같이, GBM 세포 배양에서 TMZ-유도된 G2/M 정지를 폐지할 수 있다는 것을 발견하였다 (ABCB5 mAb vs. 이소형 대조군: 18.9 ± 2.5% vs. 25.76 ± 4.6%, P=0.0225, 평균 ± SEM) (도 6B). 웨스턴 블롯 분석은 ABCB5 차단이, 세포 주기 정지-유도 체크포인트 분자 (ATM, CHK1, WEE1 및 MYT1)를 억제하고, 이들의 인산화를 유도하거나 (PLK1의 경우) 또는 이들의 억제성 인산화를 제거함으로써 (CDC25C 및 CDC2의 경우) G2기로부터의 세포가 유사분열하도록 구동시키는 분자의 활성화를 증대시킴으로써 TMZ-매개된 G2/M 정지를 역전시켰다는 것을 밝혀냈다 (도 6C). 이들의 시험관내 발견을 지지하여, 세포 주기 단백질 발현에서의 유사한 변화가 ABCB5 mAb 또는 이소형 대조군 mAb의 존재 하에 TMZ로 처리된 마우스로부터의 종양 이종이식편에서 관측되었다 (도 6D).
실시예 6: ABCB5의 녹다운은 ABCB5 차단의 성장-억제를 모방하고 TMZ-유도된 G2/M 정지로부터 GBM 세포를 방출한다.
짧은 헤어핀 RNA (shRNA)에 의한 ABCB5의 녹다운 (KD)을 면역침전 (IP)-웨스턴 블롯에 의해 확인하였다. ABCB5-표적화 shRNA로 형질감염된 LN-229 및 U-87 MG GBM 세포는 이들의 각각의 대조군 KD 세포 변이체와 비교하여 ABCB5 단백질 발현의 감소를 나타냈다 (LN-229 대조군 KD vs. ABCB5 KD: 3.83 x 108 vs. 2.15 x 108 통합된 밀도; U-87 MG 대조군 KD vs. ABCB5 KD: 4.10 x 108 vs. 3.34 x 108 통합된 밀도) (도 7A). 항체-매개된 ABCB5 차단과 유사하게, ABCB5 KD는 MTT 검정에 의해 측정된 바와 같이 이들의 각각의 대조군 KD 세포 변이체와 비교하여 LN-229 및 U-87 MG GBM의 증식을 감소시켰다 (대조군 KD vs. ABCB5 KD: 0.47 ± 0.05 OD570 vs. 0.34 ± 0.03 OD570, P=0.0406, 평균 ± SEM) (도 7B). TMZ (0-1000 μM)로의 ABCB5 KD 및 대조군 KD 세포주의 처리는 MTT 검정에 의해 측정되고 ANOVA에 의해 관측된 바와 같이 LN-229의 경우 세포 증식에서 통계적으로 유의한 감소를 나타냈고 (F(1,120)=197.2, P＜0.0001) 다중 비교 검정은 GBM 세포의 증식에 대한 TMZ의 억제 효과가 ABCB5의 항체-매개된 차단에 의해 추가로 증대되었고 이 억제 효과가 TMZ의 10 μM, 20 μM, 및 1000 μM의 가장 높은 농도를 제외하고는 측정된 모든 시점에서 통계적으로 유의하였다는 것을 나타냈다 (0-2 μM 및 500 μM의 경우 조정된 P-값 ＜0.0001, 50 μM에서 P=0.0002, 100 μM에서 P=0.0041, 200 μM에서 P=0.0008). 이 효과는 다중 비교 검정에 대해 상응하는 결과를 갖는 (1-2 μM 및 50-500 μM의 경우 조정된 P-값 ＜0.0001, 0 μM에서 P=0.0001) U-87 MG, ANOVA와 유사하였다 (F(1,119)=193.3, P＜0.0001) (도 7C).
유세포 분석 및 웨스턴 블롯팅을 사용하여 ABCB5의 KD가 G2/M 정지로부터 GBM 세포를 방출하고 G2/M 체크포인트 조절자를 조정하는 지 결정하였다. LN-229 ABCB5 KD 및 대조군 KD GBM 세포를 72시간 동안 100 μM TMZ로 처리하였다. 세포를 차가운 에탄올 중에 고정시키고, 프로피듐 아이오다이드/RNase 완충제로 염색하였고, DNA 함량을 더블릿 제거를 위한 FL2H 대 FL2W 분석 후 유세포 분석에 의해 분석하였다. ABCB5 KD는 TMZ를 받은 대조군 KD 세포와 비교하여 TMZ 처리 후 세포 주기의 G2/M기에서의 세포 축적의 감소에 의해 증명된 바와 같이, GBM 세포 배양에서 TMZ-유도된 G2/M 정지를 완화시킬 수 있다 (대조군 KD vs. ABCB5 KD: 27.5% vs. 24.2%) (도 7D). mAb-매개된 ABCB5 차단과 유사하게, shRNA-매개된 ABCB5 녹다운 (KD)은 LN229 및 U-87 MG 세포에서 TMZ-유도된 억제성 CHEK1 인산화 및 억제성 사이클린 B1 발현을 감소시키고, LN229 세포에서 TMZ-유도된 억제성 CDC25 인산화를 감소시키고, 또한 U-87 MG 세포에서 TMZ-유도된 억제성 CDC2 인산화를 감소시키고 PLK1 인산화를 유도하였다 (도 7E).
현재 연구에서, GBM에서 신규 치료적 표적으로서의 ABCB5의 사용을 검사하였다. 결과는 원발성 인간 GBM 종양 및 3개의 확립된 GBM 세포주에서의 ABCB5 발현을 나타냈다. 시험관내 mAb-기반 ABCB5 억제 전략 또는 종양 이종이식 모델에서의 생체내 ABCB5 차단을 사용하여, 본 발명자들은 ABCB5를 표적화하는 것이 종양 성장을 유의하게 억제하고 TP53-돌연변이 PTEN-야생형 GBM 하위유형을 TMZ 치료에 대해 감작화시킬 수 있다는 것을 처음으로 제시한다. 본 발명자들은 ABCB5 억제가 G2/M 체크포인트 조절자의 조정 및 TMZ-유도된 G2/M 정지의 후속 역전을 야기한다는 것을 입증한다.
보다 덜 공격적인 뇌 종양과 비교하여 인간 GBM에서의 특이적 ABCB5 과다발현의 발견 및 GBM 환자 중에서 ABCB5 발현과 OS의 유의한 상관관계는 GBM 공격성 및 치료적 내성의 결정요인으로서의 ABCB5의 잠재적인 역할을 암시한다. 이는 CD133-양성 GBM CSC 상 ABCB5의 관측된 발현 및 임상 GBM 표본에서의 CD133과 ABCB5 발현 사이의 유의한 양의 상관관계에 의해 추가로 지지된다. CD133-양성 GBM 하위집단은 CSC가 풍부하고 CD133-음성 집단과 비교하여 더 높은 비율의 자기-재생, 증식, 및 종양형성을 나타낸다. 게다가, CD133-양성 CSC의 풍부화가 방사선 및 화학요법 후 GBM 배양, 이종이식편, 및 임상 종양 표본에서 관측되며, 이는 GBM 진행 및 요법 내성에서의 이들의 역할을 강조한다. 본 발명자들의 데이터는 항체-매개된 ABCB5 차단이 인간 GBM 세포주에서 CD133-양성 CSC 하위집단의 유의한 감소를 야기하기 때문에, 정상 조직 줄기 세포에서의 그의 기능과 유사하게, ABCB5가 GBM CSC의 생존에 유의하게 기여한다는 것을 나타낸다. ABCB5 차단이 증식을 감쇠시키고 아폽토시스를 촉진할 수 있다는 본 발명자들의 발견은 CSC-매개된 GBM 종양형성의 역전에서의 ABCB5 표적화의 잠재적인 역할을 강조한다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 참조로서 완전히 포함된다. 따라서 본 발명의 적어도 하나의 실시양태의 여러 측면을 기재하였지만, 다양한 변경, 변형, 및 개선이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 용이하게 발생할 것으로 인식되어야 한다. 이러한 변경, 변형, 및 개선은 본 개시내용의 일부인 것으로 의도되고, 본 발명의 사상 및 범주 내인 것으로 의도된다. 따라서, 상기 설명 및 도면은 단지 예이다.

Claims (26)

  1. 다형성 교모세포종 (GBM)을 갖는 대상체에게 ATP-결합 카세트 서브패밀리 B 구성원 5 (ABCB5)의 억제제 및 화학요법제를 투여하는 단계
    를 포함하는, GBM을 치료하는 방법으로서, 여기서 화학요법제는 GBM을 치료하기 위한 유효량의 알킬화제인 방법.
  2. 제1항에 있어서, 알킬화제가 테모졸로미드인 방법.
  3. 화학요법내성 암을 갖는 대상체를 확인하는 단계, 유효량의 ABCB5 억제제를 투여하여 대상체의 암 세포에서 화학요법 유도된 G2/M 정지를 역전시키는 단계 및 대상체에게 화학요법제를 투여하여 암 세포 사멸을 촉진하는 단계
    를 포함하는, 화학요법내성 암을 치료하는 방법.
  4. 암을 G2/M 세포 주기 정지의 세포를 갖는 암으로 확인하는 단계 및 대상체에게 유효량의 ABCB5 억제제를 투여하여 세포에서 G2/M 세포 주기 정지를 역전시키는 단계
    를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법으로서, 여기서 암은 G2/M 세포 주기 정지와 연관된 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 대상체에게 화학요법제를 투여하여 암 세포 사멸을 촉진하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  6. 제3항 또는 제5항에 있어서, 화학요법제가 알킬화제인 방법.
  7. 제6항에 있어서, 알킬화제가 테모졸로미드인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 ABCB5+ 암을 갖는 것으로 확인된 것인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, ABCB5의 억제제가 항-ABCB5 항체 또는 그의 단편인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 항-ABCB5 항체 또는 그의 단편이 단백질의 세포외 폴리펩티드의 시클릭 형태 또는 선형 형태에 대한 특이성을 갖는 것인 방법.
  11. 제9항에 있어서, 항-ABCB5 항체 또는 그의 단편이 ABCB5 PIP2 결합 부위의 형태를 변경하는 것인 방법.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 항-ABCB5 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, ABCB5의 억제제가 PIP2 길항제인 방법.
  14. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, ABCB5의 억제제가 지질 유사체인 방법.
  15. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, ABCB5의 억제제가 억제성 핵산인 방법.
  16. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, ABCB5의 억제제가 효소인 방법.
  17. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, ABCB5의 억제제가 항-수용체 티로신 키나제 (RTK) 항체인 방법.
  18. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, ABCB5의 억제제가 인슐린 수용체 (InsR)의 억제제인 방법.
  19. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, ABCB5의 억제제가 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 (IGF1R)의 억제제인 방법.
  20. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, ABCB5의 억제제가 신호 통합 어댑터 분자 (IRS-1)의 억제제인 방법.
  21. 대상체로부터 다형성 교모세포종 (GBM) 암 세포를 단리하는 단계 및 GBM 암 세포가 ABCB5를 발현하는 지 여부를 결정하는 검정을 수행하는 단계
    를 포함하는, GBM을 화학요법내성 암으로 확인하는 방법으로서, 여기서 GBM 암 세포가 ABCB5를 발현하는 경우에 GBM은 화학요법내성 암인 방법.
  22. 2개의 항원 결합 도메인을 포함하는 이중특이적 항체로서, 여기서 제1 항원 결합 도메인은 ABCB5에 특이적이고 제2 항원 결합 도메인은 RTK에 특이적인 것인 이중특이적 항체.
  23. 제22항에 있어서, 이중특이적 항체를 사용하는 항원의 점유 수준이 항원에 단일특이적인 항체를 사용하는 점유 수준과 비교하여 더 높은 것인 이중특이적 항체.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 제1 항원 결합 영역이 단일 쇄 가변 단편 (scFv)을 포함하는 것인 이중특이적 항체.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 표적 세포에 대한 이중특이적 항체의 결합이 신호전달 경로의 하향조절을 야기하는 것인 이중특이적 항체.
  26. 제22항에 있어서, 이중특이적 항체의 IC50 값이 항원에 단일특이적인 항체의 IC50 값과 비교하여 적어도 100-배 감소된 것인 이중특이적 항체.
KR1020227039356A 2020-04-15 2021-04-14 다형성 교모세포종에서의 abcb5 표적화 KR20230004590A (ko)

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