KR20220161212A - 세포 배양용 지지체 - Google Patents
세포 배양용 지지체 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20220161212A KR20220161212A KR1020220065408A KR20220065408A KR20220161212A KR 20220161212 A KR20220161212 A KR 20220161212A KR 1020220065408 A KR1020220065408 A KR 1020220065408A KR 20220065408 A KR20220065408 A KR 20220065408A KR 20220161212 A KR20220161212 A KR 20220161212A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- cell culture
- seaweed
- stem cells
- cells
- muscle stem
- Prior art date
Links
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 65
- 241001474374 Blennius Species 0.000 claims abstract description 54
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 claims abstract description 30
- 210000000663 muscle cell Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 54
- 210000001665 muscle stem cell Anatomy 0.000 claims description 45
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 28
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 26
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N Ozone Chemical compound [O-][O+]=O CBENFWSGALASAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 13
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 11
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 8
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 5
- 241001261506 Undaria pinnatifida Species 0.000 claims description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 5
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 claims description 5
- 241000512259 Ascophyllum nodosum Species 0.000 claims description 3
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000195955 Equisetum hyemale Species 0.000 claims description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 claims 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 claims 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 abstract description 11
- 230000007774 longterm Effects 0.000 abstract description 7
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 abstract description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 69
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 9
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 9
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 8
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 8
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 7
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 7
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 7
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 5
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 4
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000010872 live dead assay kit Methods 0.000 description 4
- 102400000888 Cholecystokinin-8 Human genes 0.000 description 3
- 101800005151 Cholecystokinin-8 Proteins 0.000 description 3
- AEMOLEFTQBMNLQ-BZINKQHNSA-N D-Guluronic Acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-BZINKQHNSA-N 0.000 description 3
- AEMOLEFTQBMNLQ-VANFPWTGSA-N D-mannopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-VANFPWTGSA-N 0.000 description 3
- IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N Galacturonsaeure Natural products O=CC(O)C(O)C(O)C(O)C(O)=O IAJILQKETJEXLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 3
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 3
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 3
- AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactopyranuronic acid Natural products OC1OC(C(O)=O)C(O)C(O)C1O AEMOLEFTQBMNLQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 3
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 3
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 2
- 238000005033 Fourier transform infrared spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L disodium L-glutamate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C(=O)[C@@H](N)CCC([O-])=O PXEDJBXQKAGXNJ-QTNFYWBSSA-L 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 108010082495 Dietary Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000002449 bone cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 108700005457 microfibrillar Proteins 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003387 muscular Effects 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000002834 transmittance Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0658—Skeletal muscle cells, e.g. myocytes, myotubes, myoblasts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L13/00—Meat products; Meat meal; Preparation or treatment thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/17—Amino acids, peptides or proteins
- A23L33/18—Peptides; Protein hydrolysates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M21/00—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses
- C12M21/08—Bioreactors or fermenters specially adapted for specific uses for producing artificial tissue or for ex-vivo cultivation of tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/14—Scaffolds; Matrices
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
- C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Botany (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
본 발명의 세포 배양 지지체는 해조류 유래 성분으로 이루어져 식용이 가능하고, 세포 배양에 적합한 공극 크기 및 강도를 가지며, 수분 함유 능력이 현저히 우수하여 고밀도로 근육세포를 접종해도 장기 배양 및 효율적인 세포 증식이 가능하므로 배양육 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 세포를 높은 밀도로 접종할 수 있고, 세포의 초기 부착 효율이 높아 세포의 장기 배양이 가능하며, 세포 증식 효율이 우수한 세포 배양용 지지체에 관한 것이다.
동물 윤리와 환경 오염에 대한 관심이 높아지면서 배양육에 대한 관심이 커지고 있다. 배양육이란 동물의 세포를 배양하여 만든 고기 유사식품으로 식물성 단백질을 사용하여 제조한 고기 유사식품은 대체육이라고 한다.
배양육 제조에는 세포, 배양액, 배양기 및 세포 배양 지지체가 중요하다. 세포는 배양육의 시작이 되며, 배양액은 세포가 자랄 수 있도록 양분을 제공해 주는 액체이다. 배양액과 관련하여 현재의 관건은 소 혈청의 의존도를 줄이고 배양액 제조 단가를 낮추는 데 있다. 배양기는 세포가 배양액을 먹으며 자라는 공간으로 효과적으로 산소를 공급하고 노폐물을 제거하기 위해 어느 정도의 교반을 필요로 하면서도 세포의 손상을 최소화하기 위한 세밀한 설계가 필요하다. 세포 배양 지지체는 배양육을 구성하는 세포가 부착하여 자랄 수 있는 공간을 제공하며, 세포가 근육으로 분화하는 과정을 촉진해야 하며, 배양기 내 충격으로부터 세포를 보호하는 동시에, 영양분과 노폐물의 이동이 쉽게 이루어지는 구조여야 한다. 그러나 상기 조건을 만족하는 세포 배양 지지체는 아직까지 연구가 많이 부족한 상황이다.
1. BRIC View 동향리포트, 배양육 연구동향: Beyond the BEYOND MEAT®
배양육에 대한 관심이 높아지고 있는 현 상황에서 본 발명자들은 배양육 생산에 효과적인 세포 배양 지지체를 개발하기 위해 노력하였다. 그 결과, 식용이 가능한 해조류로부터 살균, 탈세포화, 층분리, 젤 성분 회수, 급속 냉각 및 동결건조의 과정을 거쳐 세포 배양 지지체를 제조하였다. 상기 세포 배양 지지체는 40 내지 200 ㎛ 크기의 공극, 8 내지 17 kPa의 강도를 가지고, 수분 함량이 현저히 우수하며, 내부에 균사체 구조를 가지므로 근육줄기세포 배양 및 근육세포분화에 적합한 것을 확인하였다. 또한, 상기 세포 배양 지지체를 비드 형태로 제조하면 근육줄기세포의 배양 및 증식에 효과적인 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 해조류 유래 성분으로 이루어진 세포 배양용 지지체 및 세포 배양용 비드를 제공하는 것이다.
상기 기재한 바와 같이 배양육 생산을 위해서는 세포 배양 지지체가 필요하며 배양육 생산을 위한 세포 배양 지지체는 세포 배양에 적합한 물성을 가지면서 근육세포의 근육조직으로의 분화를 효율적으로 유도해야 한다. 또한, 일반적인 세포 배양 지지체와 달리 초기에 근육줄기세포를 높은 밀도로 시딩하기 때문에 세포 부착 효율 또한 우수해야 하며, 식용 가능한 성분으로 이루어진 것이 바람직하다.
본 발명자들은 상기 조건을 만족할 수 있는 세포 배양 지지체를 연구한 결과, 해조류의 피질부를 제거하고 수질부를 동결건조시킨 세포 배양 지지체 (이하, ACe-gel 지지체로 기재함), 수질부를 젤화시킨 세포 배양 비드 (이하, ACe-gel 비드로 기재함)를 개발하였다.
구체적으로 상기 ACe-gel 지지체는 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다:
a) 해조류를 1~3% (w/v)의 염화나트륨(NaCl) 용액에 침지하여 오존 처리하는 단계;
b) 상기 오존 처리된 해조류를 예정된 크기로 절단하는 단계;
c) 상기 전달된 해조류를 음이온성 세정제가 포함된 용액에 침지하는 단계;
d) 상기 해조류가 침지된 용액을 천천히 흔들어 피질부를 분리하는 단계;
e) 상기 피질부와 분리된 수질부를 PBS로 세척하는 단계; 및
f) 상기 분리된 수질부를 동결 건조하여 세포 배양용 지지체를 형성하는 단계.
또한, ACe-gel 비드는 다음과 같은 방법에 의해 제조될 수 있다:
a) 해조류를 1~3% (w/v)의 염화나트륨(NaCl) 용액에 침지하여 오존 처리하는 단계;
b) 상기 오존 처리된 해조류를 예정된 크기로 절단하는 단계;
c) 상기 전달된 해조류를 음이온성 세정제가 포함된 용액에 침지하는 단계;
d) 상기 해조류가 침지된 용액을 천천히 흔들어 피질부를 분리하는 단계;
e) 상기 피질부와 분리된 수질부를 PBS로 세척하는 단계; 및
f) 상기 분리된 수질부를 젤화시켜 세포 증식용 비드를 형성하는 단계.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 ACe-gel 지지체 및 ACe-gel 비드 제조 방법에서 해조류는 미역, 다시마, 파래, 톳, 말 및 풀가사리로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 미역일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 제조 방법들에서 a) 해조류를 염화나트륨 용액에 침지하여 오존 처리하는 단계는 미역 개체의 조직을 적절히 팽윤시키는 과정이며, 오존 처리는 미역 개체 표면에 존재하는 미생물을 살균하는 과정이다. 오존은 30초 내지 2분, 바람직하게는 1분 내지 2분 동안 처리될 수 있다. 오존 처리 과정에서는 오존이 균일하게 투여될 수 있도록 일정 강도 이상의 수압을 가할 수 있다.
오존 처리 이후 미역을 일정한 크기로 절단하여 음이온성 세정제가 포함된 용액에 침지한다. 상기 음이온성 세정제가 포함된 용액은 음이온성 세정제의 농도가 0.05 내지 1.5% (w/v)일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 0.5% (w/v) 농도일 수 있다. 사용될 수 있는 음이온성 세정제에는 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate), Triton X-100, PEG(polyethylene glycol) 등이 있다.
상기 d) 상기 해조류가 침지된 용액을 천천히 흔들어 피질부를 분리하는 단계는 해조류의 피질부 (cortex layer)와 수질부(medullar layer)를 분리하는 과정으로 이를 통해 미역 개체에 치밀하게 배열된 피질부와 느슨한 셀룰로오스 구조의 수질부가 서로 분리된다.
본 발명에서, 상기 수질부는 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, L-글루탐산나트륨, 미세섬유상셀룰로오스와 같은 첨가제와 혼합될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, ACe-gel 지지체는 해조류의 수질부를 동결건조시켜 제조되는 반면, ACe-gel 비드는 해조류의 수질부를 젤화시켜 제조된다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 젤화는 상기 세척된 수질부를 10 내지 500 mM의 염화칼슘 (CaCl2) 수용액에 침지하는 단계; 및 상기 염화칼슘 수용액에 침지하는 단계에서 예정된 시간 이후 PBS로 세척하는 단계를 포함한다. 상기 염화칼슘 수용액은 바람직하게는 50 내지 200 mM 농도일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 ACe-gel 지지체는 해조류의 수질부를 바로 동결건조시킴으로써 알긴산과 균사의 복합체로 구성된 다공성 구조를 가지게 되며, 이로 인해 지지체 내 세포의 이동, 부착, 성장이 원활할 뿐 아니라 영양성분과 산소가 깊은 곳까지 잘 전달될 수 있는 특징을 갖게 된다. 또한, 지지체에 세포를 접종할 때 배지에 젤화 물질을 첨가하여 젤화시킬 수 있으므로 세포 배양 조건에 맞추어 지지체를 젤화시킬 수 있는 장점이 있다. 또한, ACe-gel 비드는 3차원 구조를 가지므로 근육줄기세포 접종 시에 효과적으로 세포를 증식시킬 수 있다.
본 발명에서, 상기 ACe-gel 지지체 및 ACe-gel 비드는 제조 후에 멸균 단계를 추가적으로 거칠 수 있다. 멸균 단계는 과산화수소(H2O2)를 이용한 증기멸균, UV 살균 또는 감마 멸균을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 예에 따른 ACe-gel 지지체는 근육줄기세포 배양 및 배양육 생산에 효과적인 지지체이다. 구체적으로 ACe-gel 지지체는 해조류 유래 성분으로 이루어져 배양육 생산 후 지지체를 분리할 필요가 없고, 세포 배양에 적합한 40 내지 200 ㎛ 크기의 공극을 갖는다 (도 2).
또한, ACe-gel 지지체는 균사망 구조를 가져 근육줄기세포의 부착 및 정렬이 용이하며, 초기에 높은 농도로 세포를 접종해도 부착 효율이 우수하므로 장기간 안정적인 세포 배양이 가능하다 (도 8 내지 10 및 12). 수분 함유 능력 또한 우수하며(도 4), 근육세포 배양에 적합한 강도를 가진다 (도 3).
한편, 본 발명의 ACe-gel 지지체 및 비드는 해조류의 천연 추출을 통해 제조되기 때문에 기존의 알긴산(algiante) 기반 지지체처럼 분리 및 정제 과정을 거치지 않아 해조류의 산지에 따라 지지체의 물성에 차이가 발생할 수 있다. 그러나 ACe-gel에 존재하는 주요 구성성분인 알긴산의 함량과 지지체의 강도를 결정하는 M/G 비율 (mannuronic/guluronic acid ratio)을 측정하여 산지별 편차를 줄일 수 있다 (도 5).
따라서, 본 발명의 다른 양상은 ACe-gel 지지체를 사용하여 근육줄기세포를 근육세포로 분화시키는 방법, ACe-gel 지지체 및 비드를 사용하여 근육줄기세포로부터 배양육을 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로 ACe-gel 지지체를 사용하여 근육줄기세포를 근육세포로 분화시키는 방법은 하기 단계를 포함한다:
1) 세포 배양용 지지체에 근육줄기세포를 접종하는 단계; 및
2) 근육줄기세포를 배양하는 단계.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 근육줄기세포는 0.5x105 내지 5x107 세포/㎖ 농도로 세포 배양용 지지체에 접종될 수 있으며, 바람직하게는 1x106 내지 3x107 세포/㎖ 농도로 접종될 수 있다. 상기 배양하는 단계는 1일 내지 30일 동안 진행될 수 있다.
한편, ACe-gel 지지체 및 비드를 사용하여 근육줄기세포로부터 배양육을 제조하는 방법은 다음 단계를 포함한다:
1) 상기 세포 배양용 비드에 근육줄기세포를 접종하여 증식시키는 단계;
2) 증식시킨 근육줄기세포를 회수하는 단계;
3) 상기 세포 배양용 지지체에 회수한 근육줄기세포를 접종하는 단계; 및
4) 근육줄기세포를 근육세포로 분화시키는 단계.
배양육을 만들 때에는 매우 많은 양의 세포가 필요하므로 일반적으로 하나의 세포 배양 지지체만 사용해서는 충분한 양의 세포를 얻을 수 없다. 따라서, 본 발명자들은 ACe-gel 비드에 근육줄기세포를 접종하여 충분히 증식시키고, 이후 증식된 근육줄기세포를 ACe-gel 지지체에 접종하여 근육세포로 분화시키는 방법을 고안하였다.
본 발명에서, 상기 배양육 제조 방법은 단계 1) 및 2)를 1회 이상 반복할 수 있으며, 바람직하게는 2회 이상, 더욱 바람직하게는 3회 반복할 수 있다.
본 발명에서, 상기 근육줄기세포는 0.1x105 내지 1x106 세포/㎖ 농도로 세포 배양용 비드에 접종될 수 있으며, 바람직하게는 0.5x105 내지 0.x106 세포/㎖ 농도로 접종될 수 있다.
본 발명에서, 상기 2) 증식시킨 근육줄기세포를 회수하는 단계는 당업계에 알려진 통상적인 방법을 사용할 수 있다. 구체적으로 트립신-EDTA, 아큐테이스 (accutase)와 같은 효소를 이용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 근육줄기세포는 0.5x105 내지 5x107 세포/㎖ 농도로 세포 배양용 지지체에 접종될 수 있으며, 바람직하게는 1x106 내지 3x107 세포/㎖ 농도로 접종될 수 있다. 상기 배양하는 단계는 1일 내지 30일 동안 진행될 수 있다.
본 발명에서, 상기 4) 근육줄기세포를 근육세포로 분화시키는 단계는 배지에 인슐린과 같은 분화 유도 물질을 첨가하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, ACe-gel 비드 및 ACe-gel 지지체 각각에 근육줄기세포를 접종하여 배양한 결과 죽은 세포가 거의 없고 대부분의 근육줄기세포가 잘 부착하여 증식하는 것을 확인하였다 (도 6 및 도 7). 따라서, ACe-gel 비드 및 ACe-gel 지지체는 근육줄기세포의 증식, 근육세포로의 분화 및 배양육 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 세포 배양 지지체는 해조류 유래 성분으로 이루어져 식용이 가능하고, 세포 배양에 적합한 공극 크기 및 강도를 가지며, 수분 함유 능력이 현저히 우수하여 고밀도로 근육줄기세포를 접종해도 장기 배양 및 효율적인 세포 증식이 가능하므로 배양육 제조에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 예에 따른 세포 배양 지지체 (ACe-gel 지지체) 및 세포 배양 비드 (ACe-gel 비드)의 제조 과정을 개략적으로 나타낸다.
도 2는 ACe-gel 지지체의 공극 크기 분포를 확인한 결과이다.
도 3은 ACe-gel 지지체의 강도(stiffness)를 확인한 결과이다.
도 4는 ACe-gel 지지체의 수분 함유량을 확인한 결과이다.
도 5는 산지가 상이한 해조류의 M/G 비율 (mannuronic/guluronic acid ratio)을 확인한 결과이다.
도 6은 ACe-gel 지지체에서 근육줄기세포를 배양한 후 라이브/데드 어세이로 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 7은 ACe-gel 비드에서 근육줄기세포를 배양한 후 라이브/데드 어세이로 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 8에서 A는 ACe-gel 지지체의 균사망 구조를 확인한 것이고, B 및 C는 균사망 구조를 따라 근육세포가 부착, 정렬된 것을 확인한 결과이다.
도 9는 ACe-gel 지지체에 근육세포를 시딩하여 1, 4, 6, 14, 21일 후 세포 증식 효율을 확인한 결과이다.
도 10에서 A는 ACe-gel 지지체에 근육세포를 시딩한 후 3차원 배양하여 근육세포의 정렬을 확인한 결과이고, B는 근육세포 분화 시에 발현되는 유전자들의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 11은 ACe-gel 지지체로 만든 배양육 시제품의 사진이다.
도 12는 ACe-gel 지지체와 Algimatrix (Thermo Fisher)에 근육세포를 고밀도로 시딩한 후 세포 부착 효율 및 장기 배양 능력을 확인한 결과이다.
도 2는 ACe-gel 지지체의 공극 크기 분포를 확인한 결과이다.
도 3은 ACe-gel 지지체의 강도(stiffness)를 확인한 결과이다.
도 4는 ACe-gel 지지체의 수분 함유량을 확인한 결과이다.
도 5는 산지가 상이한 해조류의 M/G 비율 (mannuronic/guluronic acid ratio)을 확인한 결과이다.
도 6은 ACe-gel 지지체에서 근육줄기세포를 배양한 후 라이브/데드 어세이로 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 7은 ACe-gel 비드에서 근육줄기세포를 배양한 후 라이브/데드 어세이로 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 8에서 A는 ACe-gel 지지체의 균사망 구조를 확인한 것이고, B 및 C는 균사망 구조를 따라 근육세포가 부착, 정렬된 것을 확인한 결과이다.
도 9는 ACe-gel 지지체에 근육세포를 시딩하여 1, 4, 6, 14, 21일 후 세포 증식 효율을 확인한 결과이다.
도 10에서 A는 ACe-gel 지지체에 근육세포를 시딩한 후 3차원 배양하여 근육세포의 정렬을 확인한 결과이고, B는 근육세포 분화 시에 발현되는 유전자들의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 11은 ACe-gel 지지체로 만든 배양육 시제품의 사진이다.
도 12는 ACe-gel 지지체와 Algimatrix (Thermo Fisher)에 근육세포를 고밀도로 시딩한 후 세포 부착 효율 및 장기 배양 능력을 확인한 결과이다.
이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예: 세포 배양 지지체 (Ace-gel) 제조
냉장 보관된 완도산 염장 미역을 흐르는 물에 1분 동안 세척하고, 색에 이상이 있거나 손상된 부위는 제거하였다. 미역의 물기를 제거하고 무게를 측정한 후 1% NaCl 용액(10 ㎖/g)에 미역을 5분 동안 침지하였다. 1% NaCl 용액에 침지된 상태로 오존 살균기(ozone sterilization)로 1분 동안 미역을 살균 처리하였다. 이때 오존이 균일하게 투여될 수 있도록 일정 강도 이상의 수압을 가하였다. 미역줄기 부위의 굵은 심지를 제거한 후 미역 잎을 3*3 ㎝ 크기로 절단하고, 탈세포화를 위해 절단한 미역 잎을 0.2% SDS 용액 (10 ㎖/g)에 침지하여 140 rpm으로 10분 동안 교반(shaking)하였다. 메쉬에 걸러 0.2% SDS 용액을 제거하고 미역을 트레이에 옮긴 후 증류수(20 ㎖/g)를 트레이에 붓고, 5분 동안 10 rpm으로 2회 흔들어(rocking) 남은 SDS를 수세하였다. 메쉬에 걸러 증류수를 제거하고 미역을 비커로 옮긴 후 다시 증류수 (1 ㎖/g)를 비커에 부어 180 rpm으로 30분 동안 교반하였다. 교반 속도는 미역 전체에 자극을 가할 수 있도록 조절하였다. 교반 후 원심분리 (5000 rpm, 15분)하여 상층액(수질부)만 취하고, 하층 혼합물(피질부)은 폐기하였다. 상층액은 콜라겐, 젤라틴, 폴리-L-라이신, 폴리-D-라이신, L-글루탐산나트륨, 미세섬유상셀룰로오스와 같은 식용 가능한 첨가물과 혼합될 수 있다. 회수한 상층액을 24웰-플레이트 또는 사각 몰드 (28*10*5 ㎜)에 각각 500 ㎕/웰 또는 1,600 ㎕씩 분주하였다. 초저온 냉동고 (deep freezer)에 플레이트 또는 사각 몰드를 넣어 상층액을 급속 냉각시키고, 이후 동결건조기 (lyophilizer)로 동결건조시켰다. 동결건조 후 다공성 스캐폴드 표면에 생긴 요철을 포셉으로 제거하였다. 또한, 회수한 상층액을 23G 니들이 있는 10 ㎖ 주사기에 넣고, 100 mM CaCl2 가교 용액 50 ㎖이 담긴 비커에 주사기 바늘 끝을 가교 용액으로부터 20 ㎝ 띄어서 상층액을 떨어 뜨렸다. 이후 30분 간 가교시켜 비드 형태의 지지체를 제조하였다.
이하에서는 본 제조예의 방법에 따라 제조한 세포 배양 지지체 및 세포 배양 비드를 각각 "ACe-gel 지지체" 및 "ACe-gel 비드"로 기재한다.
도 1에 ACe-gel 지지체 및 ACe-gel 비드의 제조 과정을 도시하였다.
실시예 1: ACe-gel의 특성 확인
1-1. 공극 크기
세포가 지지체 내로 이동하여 부착 및 증식하기 위해서는 지지체의 공극 크기가 매우 중요하며, 일반적으로 40-200 ㎛ 사이의 공극 분포가 적합하다고 알려져 있다. 이에 ACe-gel 지지체의 윗면을 주사 전자 현미경으로 촬영하고, image J macro tool로 100개 이상의 공극의 크기를 분석하였다.
분석 결과, 표준편차를 감안한 오차를 제외하고 대부분의 공극이 세포 배양에 적합한 40 내지 200 ㎛ 크기인 것을 확인하였다 (도 2).
1-2. 물성(강도)
세포 배양 지지체의 물성(강도)은 배양육의 식감에 큰 영향을 미칠 뿐 아니라 세포에 미치는 영향도 매우 크다. 예를 들어 신경 세포 및 지방 세포는 상대적으로 부드러운 미세 조직 탄성을 요하며, 근육, 연골, 뼈 세포 등은 상대적으로 높은 미세 조직 탄성을 요구한다. 따라서, ACe-gel 지지체의 인장 특성을 분석하여 근육세포 배양에 적합한 물성을 갖는지 확인하였다.
구체적으로 가로x세로x높이가 각각 9x24x4 ㎜인 ACe-gel 지지체를 다음과 같은 조건에서 테스트하였다: N=10+a; gauge length-10 ㎜; pretest speed-0.5 ㎜/s; test speed: 0.5 ㎜/s; date rate-50 points/s; trigger load-0.10 g; load cell-10 ㎏.
테스트 결과, 본 발명의 ACe-gel 지지체가 근육(위성)세포 배양에 적합한 8 내지 17 kPa의 강도를 갖는 것을 확인하였다 (도 3).
1-3. 수분 함유량
세포 배양 지지체는 수분을 머금고 보유할 수 있는 능력이 중요하다. 통상적으로 정해진 기준은 없으나 참고문헌(J. Mater. Chem. B, 2015, 3, 8401-8409)에 따라 수분 함량이 91.2% 이상이면 "수분 함량 높음(high water contents)", 99.7% 이상이면 "수분 함량 현저히 높음 (extremely high water contents)"으로 판단하였다. ACe-gel 지지체를 일정한 시간 동안 PBS 또는 증류수(D.W.)에 담그고 늘어난 전체 중량을 하기 수학식 1에 따라 측정하였다.
[수학식 1]
측정 결과, 용매와 무관하게 ACe-gel 지지체의 수분 함량이 현저히 높은 것을 확인하였다 (도 4). 이러한 결과는 공인시험분석기관 의뢰 결과에서도 확인할 수 있었으며, ACe-gel 지지체의 수분 함유 능력이 우수하고, GMP 등급 제품과 비교해서도 높은 안전성을 갖는 것을 알 수 있었다 (표 1에서 Moisture 항목).
1-4. M/G 비율 분석
ACe-gel 지지체는 해조류의 천연 추출을 통해 제조되기 때문에 기존의 알긴산(algiante) 기반 지지체 (KR10-2151203)처럼 분리 및 정제 과정을 거치지 않는다. 이에 해조류의 산지별 편차를 제어하기 위해 ACe-gel에 존재하는 주요 구성성분인 알긴산의 함량과 지지체의 강도를 결정하는 M/G 비율 (mannuronic/guluronic acid ratio)을 측정하였다. M/G 중 G-block만이 알긴산의 이온 가교에 관여하므로 일반적으로 G의 함량이 높을수록 지지체의 물성이 단단해진다고 볼 수 있다.
산지별 해조류에서 알긴산을 추출한 후 건조하여 분말 형태로 분쇄하고 FT-IR (Fourier-transform infrared spectroscopy)의 atr 모드로 투과도를 분석하였다. 이후 1080 피크(peak) 및 1030 피크 면적 비율을 통해 M/G 비율을 계산하였다.
H-NMR은 다음 과정으로 알긴산 분말을 D2O에 용해시킨 후 90℃ 부근에서 측정하고, 5.4 (a1), 4.55(A2) 및 4.43(A3) 픽 비를 통해 M/G 비율을 계산하였다:
1) alginate 0.5 g, moisten with 5 ml ethanol (96%) dissolved in 50ml HCL
2) pH was adjusted to 5.0 by NaOH hydrolysed at 100C reflux 10min.
3) Cooling to room T, adjust to pH3.0 by HCl and 100C reflux 20min
4) Cooling to room T, neutralized (ph7) by NaOH and precipitated in ethanol (96%)
5) Drying over night at 70℃
6) D20에 1% (w/v)로 용해
7) 용액 whatman 13mm syringe filter (pore size 0.22 um) into NMR tube
8) During acquisition, sample temperature 90℃
분석 결과, 해조류의 산지에 따라 M/G 비율에 차이가 있고, 이 비율을 측정하여 산지별 해조류의 특성을 구분할 수 있음을 확인하였다 (도 5).
실시예 2: ACe-gel 지지체 및 비드의 세포 배양 능력 확인
2-1. 라이브/데드 어세이 (Live/Dead assay)
ACe-gel 지지체 또는 비드에 한우로부터 추출한 근육줄기세포 (bovine muscular stem cell, bMuSC)를 시딩하여 10% FBS 및 % P/S가 첨가된 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium)에서 1일 내지 15일 동안 배양하였다. 이후 라이브/데드 어세이 키트로 세포를 염색하고, 3D 공초점 현미경으로 세포를 관찰하였다.
| 세포 유형 | 일차 세포(Primary cell), 부착성 |
| 세포 기원 | bMuSC [Bovine, Hanwoo (Korean cattle), muscle, Semimembranous muscle (SM)] |
| 시딩 농도 | 5x106/㎖ (스캐폴드), 1x105/㎖ (비드) |
| 배양 배지 | 10% FBS + Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + 1% P/S |
관찰 결과, 살아 있는 세포를 보여주는 녹색 형광이 대부분이고, 죽은 세포를 보여주는 적색 형광은 거의 없으며, 근육줄기세포들이 ACe-gel 지지체의 균사를 따라 잘 부착하여 증식하는 모습을 확인할 수 있었다 (도 6). 또한, ACe-gel 비드에서 배양한 경우에도 대부분이 녹색 형광을 보여 근육줄기세포들이 잘 증식하고 있음을 알 수 있었다 (도 7).
상기 결과들을 통해 ACe-gel 지지체 및 비드가 근육세포 배양에 적합한 것을 알 수 있었다.
2-2. 근육세포 성장과 분화 검증
배양육을 생산하기 위해서는 근육세포가 근육조직으로 분화되어야 한다. 따라서 ACe-gel 지지체에 근육세포(C2C12; mouse myoblast cell line)를 시딩하여 3차원으로 배양한 후 현미경으로 분화 여부를 확인하였다.
확인 결과, 본 발명의 ACe-gel 지지체는 세포의 지지 및 결 형성 (cell alignment)에 도움을 줄 수 있는 균사망 구조 (hypha network)를 가지고 (도 8의 A), 이 균사망 구조를 따라 근육세포가 부착, 정렬된 것을 확인할 수 있었다 (도 8의 B 및 C).
3차원 배양 결과에서도 세포 증식 능력이 우수한 것을 알 수 있었다 (도 9). 도 9에서 ACe-gel ver 1.0은 별도의 첨가물 없이 제조예에 따라 만든 세포 배양 지지체이고, ACe-gel modified는 세포 증식 효율을 추가로 증가시키기 위해 식품 첨가물을 부가한 지지체이다.
또한, 한우에서 추출한 bMuSC의 3차원 배양에서도 근육세포의 분화 유도에 필요한 세포 정렬을 확인하였으며 (도 10의 A), 분화시 발현되는 유전자들의 발현 또한 증가되는 것을 알 수 있었다 (도 10의 B).
도 11에 ACe-gel 지지체에서 근육줄기세포를 배양하여 만든 배양육 시제품의 사진을 제시하였다.
비교예
ACe-gel 지지체와 연구용으로 판매 중인 Algimatrix (Thermo Fisher, 미국)에 근육세포(C2C12)를 2x106 세포/㎖ 농도로 시딩하고, 시딩 1, 4, 6, 14, 21일 후 CCK8 어세이로 세포의 초기 부착 효율 및 장기 배양 능력을 확인하였다. 상기 세포 시딩 농도는 일반적인 24웰 플레이트 세포 시딩 농도에 비해 매우 높은 농도로 세포 농도가 낮으면 증식이 일어나 근육세포를 분화시켜 배양육까지 만드는데 시간이 오래 걸리기 때문에 높은 농도로 시딩하였다. 구체적인 실험 방법은 하기 표 3에 기재하였다.
| C2C12 | |
| 계대 수 | 21 |
| 세포 카운팅 | 총 2.24x108 세포 |
| 생존율 | 97.5% |
| 배양 배지 | High-DMEM+10% FBS+1% P/S |
| 시딩 방법 | 24 웰-라운드 타입: 200 ㎕ 배지+10 ㎕ 20% CaCl2 |
| 시딩 밀도 | 2x106 세포/㎖ (고밀도) |
| CCK8 어세이 | |
| CCK8 키트 | Biomax Quantimax |
| 반응시간 | 3시간 |
| 흡광도 | Biomax (450 ㎚) |
| 로딩 부피 | 20:1 (배지:시약) 96 웰 (100 ㎕) |
| 실험군 | ACe-gel 지지체Algimatrix |
확인 결과, Algimatrix와 비교하여 ACe-gel 지지체에 접종하였을 때 근육세포의 초기 세포 부착 효율이 높고, 장기 배양 시에도 초기 접종한 세포 농도가 거의 일정하게 유지되어 세포 유지 능력이 안정적인 것을 알 수 있었다 (도 12).
근육세포를 배양하여 배양육을 만들기 위해서는 시간이 오래 걸리기 때문에 세포 배양 지지체에 세포를 높은 밀도로 시딩하며, 세포 배양 지지체는 매우 높은 밀도의 세포를 부착 및 유지시키는 능력이 우수해야 한다. 본 비교예의 결과를 통해 ACe-gel 지지체는 세포 부착 및 유지 능력이 매우 우수하므로 배양육 제조에 적합함을 알 수 있다.
Claims (16)
1) 세포 배양용 지지체에 근육줄기세포를 접종하는 단계; 및
2) 근육줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 근육줄기세포를 근육세포로 분화시키는 방법으로서,
상기 세포 배양용 지지체는
a) 해조류를 0.1~3% (w/v)의 염화나트륨(NaCl) 용액에 침지하여 오존 처리하는 단계;
b) 상기 오존 처리된 해조류를 일정한 크기로 절단하는 단계;
c) 상기 전달된 해조류를 음이온성 세정제가 포함된 용액에 침지하는 단계;
d) 상기 해조류가 침지된 용액을 천천히 흔들어 피질부를 분리하는 단계;
e) 상기 피질부와 분리된 수질부를 PBS (phosphate buffered saline)로 세척하는 단계; 및
f) 상기 분리된 수질부를 동결 건조하여 세포 배양용 지지체를 제조하는 단계;를 포함하는 단계로 만들어지는, 근육줄기세포를 근육세포로 분화시키는 방법.
2) 근육줄기세포를 배양하는 단계를 포함하는 근육줄기세포를 근육세포로 분화시키는 방법으로서,
상기 세포 배양용 지지체는
a) 해조류를 0.1~3% (w/v)의 염화나트륨(NaCl) 용액에 침지하여 오존 처리하는 단계;
b) 상기 오존 처리된 해조류를 일정한 크기로 절단하는 단계;
c) 상기 전달된 해조류를 음이온성 세정제가 포함된 용액에 침지하는 단계;
d) 상기 해조류가 침지된 용액을 천천히 흔들어 피질부를 분리하는 단계;
e) 상기 피질부와 분리된 수질부를 PBS (phosphate buffered saline)로 세척하는 단계; 및
f) 상기 분리된 수질부를 동결 건조하여 세포 배양용 지지체를 제조하는 단계;를 포함하는 단계로 만들어지는, 근육줄기세포를 근육세포로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 근육줄기세포는 0.5x105 내지 5x107 세포/㎖ 농도로 세포 배양용 지지체에 접종되는 것인, 근육줄기세포를 근육세포로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 근육줄기세포는 세포 배양용 지지체에서 1일 내지 30일 동안 배양되는 것인, 근육줄기세포를 근육세포로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 해조류는 미역, 다시마, 파래, 톳, 말 및 풀가사리로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 근육줄기세포를 근육세포로 분화시키는 방법.
제1항에 있어서, 상기 음이온성 세정제가 포함된 용액은 음이온성 세정제의 농도가 0.05 내지 1.5% (w/v)인 것인, 근육줄기세포를 근육세포로 분화시키는 방법.
하기 단계를 포함하는 세포 배양용 지지체의 제조 방법:
a) 해조류를 1~3% (w/v)의 염화나트륨(NaCl) 용액에 침지하여 오존 처리하는 단계;
b) 상기 오존 처리된 해조류를 예정된 크기로 절단하는 단계;
c) 상기 전달된 해조류를 음이온성 세정제가 포함된 용액에 침지하는 단계;
d) 상기 해조류가 침지된 용액을 천천히 흔들어 피질부를 분리하는 단계;
e) 상기 피질부와 분리된 수질부를 PBS로 세척하는 단계; 및
f) 상기 분리된 수질부를 동결 건조하여 세포 배양용 지지체를 형성하는 단계.
a) 해조류를 1~3% (w/v)의 염화나트륨(NaCl) 용액에 침지하여 오존 처리하는 단계;
b) 상기 오존 처리된 해조류를 예정된 크기로 절단하는 단계;
c) 상기 전달된 해조류를 음이온성 세정제가 포함된 용액에 침지하는 단계;
d) 상기 해조류가 침지된 용액을 천천히 흔들어 피질부를 분리하는 단계;
e) 상기 피질부와 분리된 수질부를 PBS로 세척하는 단계; 및
f) 상기 분리된 수질부를 동결 건조하여 세포 배양용 지지체를 형성하는 단계.
하기 단계를 포함하는 세포 배양용 비드의 제조 방법:
a) 해조류를 1~3% (w/v)의 염화나트륨(NaCl) 용액에 침지하여 오존 처리하는 단계;
b) 상기 오존 처리된 해조류를 예정된 크기로 절단하는 단계;
c) 상기 전달된 해조류를 음이온성 세정제가 포함된 용액에 침지하는 단계;
d) 상기 해조류가 침지된 용액을 천천히 흔들어 피질부를 분리하는 단계;
e) 상기 피질부와 분리된 수질부를 PBS로 세척하는 단계; 및
f) 상기 분리된 수질부를 젤화시켜 세포 증식용 비드를 형성하는 단계.
a) 해조류를 1~3% (w/v)의 염화나트륨(NaCl) 용액에 침지하여 오존 처리하는 단계;
b) 상기 오존 처리된 해조류를 예정된 크기로 절단하는 단계;
c) 상기 전달된 해조류를 음이온성 세정제가 포함된 용액에 침지하는 단계;
d) 상기 해조류가 침지된 용액을 천천히 흔들어 피질부를 분리하는 단계;
e) 상기 피질부와 분리된 수질부를 PBS로 세척하는 단계; 및
f) 상기 분리된 수질부를 젤화시켜 세포 증식용 비드를 형성하는 단계.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 해조류는 미역, 다시마, 파래, 톳, 말 및 풀가사리로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것인, 제조 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 음이온성 세정제가 포함된 용액은 음이온성 세정제의 농도가 0.05 내지 1.5% (w/v)인 것인, 제조 방법.
제7항에 있어서, 상기 분리된 수질부를 젤화하는 단계는
상기 세척된 수질부를 10 내지 500 mM의 염화칼슘 (CaCl2) 수용액에 침지하는 단계; 및
상기 염화칼슘 수용액에 침지하는 단계에서 예정된 시간 이후 PBS로 세척하는 단계를 포함하는, 세포 배양용 비드의 제조 방법.
상기 세척된 수질부를 10 내지 500 mM의 염화칼슘 (CaCl2) 수용액에 침지하는 단계; 및
상기 염화칼슘 수용액에 침지하는 단계에서 예정된 시간 이후 PBS로 세척하는 단계를 포함하는, 세포 배양용 비드의 제조 방법.
제6항에 따른 방법으로 제조된 세포 배양용 지지체.
제7항에 따른 방법으로 제조된 세포 배양용 비드.
1) 제7항에 따른 방법으로 제조된 세포 배양용 비드에 근육줄기세포를 접종하여 증식시키는 단계;
2) 증식시킨 근육줄기세포를 회수하는 단계;
3) 제6항에 따른 방법으로 제조된 세포 배양용 지지체에 회수한 근육줄기세포를 접종하는 단계; 및
4) 근육줄기세포를 근육세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 근육줄기세포로부터 배양육을 제조하는 방법.
2) 증식시킨 근육줄기세포를 회수하는 단계;
3) 제6항에 따른 방법으로 제조된 세포 배양용 지지체에 회수한 근육줄기세포를 접종하는 단계; 및
4) 근육줄기세포를 근육세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 근육줄기세포로부터 배양육을 제조하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 방법은 단계 1) 및 2)를 1회 이상 반복하는 것인, 근육줄기세포로부터 배양육을 제조하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 근육줄기세포는 0.1x105 내지 1x106 세포/㎖ 농도로 세포 배양용 비드에 접종되는 것인, 근육줄기세포로부터 배양육을 제조하는 방법.
제13항에 있어서, 상기 근육줄기세포는 0.5x105 내지 5x107 세포/㎖ 농도로 세포 배양용 지지체에 접종되는 것인, 근육줄기세포로부터 배양육을 제조하는 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR20210068884 | 2021-05-28 | ||
| KR1020210068884 | 2021-05-28 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20220161212A true KR20220161212A (ko) | 2022-12-06 |
Family
ID=84228876
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020220065408A KR20220161212A (ko) | 2021-05-28 | 2022-05-27 | 세포 배양용 지지체 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP4349955A1 (ko) |
| KR (1) | KR20220161212A (ko) |
| WO (1) | WO2022250497A1 (ko) |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101240133B1 (ko) * | 2011-01-27 | 2013-03-11 | 서울대학교산학협력단 | 히알루론산과 알지네이트를 포함하는 상호관입고분자망목 구조의 세포전달용 지지체의 제조방법 |
| JP6957486B2 (ja) * | 2016-02-12 | 2021-11-02 | ユニバーシティ・オブ・オタワ | 植物及び真菌由来の脱細胞化された細胞壁構造並びに足場材料としてのその使用 |
| KR101721514B1 (ko) * | 2016-08-02 | 2017-03-30 | 부산대학교 산학협력단 | 아가로스, 탈세포화된 세포외기질 및 콜라겐을 포함하는 3차원 세포 배양용 세포 지지체 |
| KR20180054439A (ko) * | 2016-11-15 | 2018-05-24 | 광주과학기술원 | 세포 3d 배양 방법 |
| KR102151203B1 (ko) | 2019-12-19 | 2020-09-02 | 주식회사 씨위드 | 세포 배양용 지지체 및 그 제조 방법 |
-
2022
- 2022-05-27 WO PCT/KR2022/007575 patent/WO2022250497A1/ko active Application Filing
- 2022-05-27 KR KR1020220065408A patent/KR20220161212A/ko unknown
- 2022-05-27 EP EP22811688.5A patent/EP4349955A1/en active Pending
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 1. BRIC View 동향리포트, 배양육 연구동향: Beyond the BEYOND MEAT® |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP4349955A1 (en) | 2024-04-10 |
| WO2022250497A1 (ko) | 2022-12-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ianovici et al. | 3D-printable plant protein-enriched scaffolds for cultivated meat development | |
| Yin et al. | Induction of mesenchymal stem cell chondrogenic differentiation and functional cartilage microtissue formation for in vivo cartilage regeneration by cartilage extracellular matrix-derived particles | |
| CN101478934B (zh) | 生物工程化的椎间盘及其制备方法 | |
| Fang et al. | Biomimetic gelatin methacrylamide hydrogel scaffolds for bone tissue engineering | |
| DE69935786T2 (de) | Geführte entwicklung und unterstützung von hydrogelzellzusammensetzungen | |
| Annamalai et al. | Collagen Type II enhances chondrogenic differentiation in agarose-based modular microtissues | |
| CN104307045B (zh) | 一种天然组织来源的脱细胞骨膜材料的制备方法 | |
| CN101890184B (zh) | 一种软骨源性胶原海绵支架及其制备方法 | |
| AU2020274717A1 (en) | Composite biomaterials | |
| Lin et al. | Mechanical property and biocompatibility of silk fibroin–collagen type II composite membrane | |
| CN103223194A (zh) | 一种用于软骨损伤修复的软骨移植物及其制备方法 | |
| CN104056304B (zh) | 负载生长因子壳聚糖微球的dbm支架修复关节软骨材料 | |
| CN101716382B (zh) | 一种质粒dna/纤维蛋白凝胶/聚合物三元复合支架的制备方法 | |
| Hu et al. | Dynamic process enhancement on chitosan/gelatin/nano-hydroxyapatite-bone derived multilayer scaffold for osteochondral tissue repair | |
| EP2644695B1 (en) | Cultured cartilage tissue material | |
| US20220340867A1 (en) | Method for fabrication of extracellular matrix-induced self-assembly and fabrication of artificial tissue using same | |
| KR20220161212A (ko) | 세포 배양용 지지체 | |
| CN107854730A (zh) | 交联cga的海藻酸钠‑明胶共混膜关节补片的制备方法及其应用 | |
| KR20230034115A (ko) | 식물성 단백질을 포함하는 다공성 세포 지지체 및 이를 이용하여 제조된 배양육 | |
| KR20220030199A (ko) | 식물성 단백질을 포함하는 다공성 세포 지지체 및 이를 이용하여 제조된 배양육 | |
| KR20210103984A (ko) | 심장 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 심장 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법 | |
| David et al. | Pea Protein‐Rich Scaffolds Support 3D Bovine Skeletal Muscle Formation for Cultivated Meat Application | |
| US20230257695A1 (en) | Methods for creating edible scaffolding using chilean seaweed (cochayuyo) | |
| CN109481673A (zh) | 促进脑损伤神经修复的组合物及其应用与评价方法 | |
| CN117752863A (zh) | 一种脱细胞基质/脱蛋白骨粉复合生物墨水及其制备方法和应用 |