KR20220157998A - 항체 약물 접합체를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

항체 약물 접합체를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

약학적 조성물은 완충액 내에 항체 약물 접합체를 포함한다. 항체 약물 접합체는 일반 화학식(Pc-L-Y-D)에 의해 표시되는 구조를 가진다. 약학적 조성물은 당 및 계면활성제를 추가로 포함한다.
Figure pct00118

Description

항체 약물 접합체를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 용도
본 출원은 2020년 3월 25일에 출원한 중국 특허 출원(출원 번호 제CN202010219601.7호) 및 2021년 3월 17일에 출원한 중국 특허 출원(출원 번호 제CN202110287012.7호)에 대해 우선권을 청구한다.
본 개시는 약학적 제제의 분야에 속하는 것으로, 특히, 항체 약물 접합체를 포함하는 약학적 조성물 및 이의 항암 약제로서의 용도에 관한 것이다.
본원의 설명은 단지 본 개시와 관련된 배경기술 정보를 제공할 뿐이며, 반드시 선행 기술을 구성하는 것은 아니다.
항체 약물 접합체(ADC)는 단일클론 항체 또는 항체 단편을 안정한 화학적 링커(linker) 화합물을 통해 생물학적 활성 세포 독소에 연결함으로써, 정상 세포 및 종양 세포의 표면 항원에 대한 항체의 결합 특이성 및 세포 독소의 높은 효율을 충분히 이용하고, 또한 전자의 치료 효과가 좋지 않은 단점 및 후자의 심각한 독성 부작용이 있는 단점 등을 피할 수 있다. 이는 과거의 통상적인 화학치료 약물에 비해 항체 약물 접합체가 종양 세포에 보다 정확하게 결합할 수 있고 정상 세포에 대한 영향을 감소시킬 수 있음을 의미한다(Mullard A, (2013) Nature Reviews Drug Discovery, 12:329-332; DiJoseph JF, Armellino DC, (2004) Blood, 103:1807-1814).
최초의 항체 약물 접합체인 마일로탁(Mylotarg)®(와이어스 제약(Wyeth Pharmaceutical Co., Ltd.)의 젬투주맙 오조가미신(gemtuzumab ozogamicin))은 급성 골수성 백혈병 치료제로서 2000년 미국 FDA 승인을 받았다(Drugs of the Future (2000) 25(7):686; US4970198; US5079233; US5585089; US5606040; US5693762; US5739116; US5767285; US5773001).
애드세트리스(Adcetris)®(시애틀 제네틱스(Seattle Genetics)의 브렌툭시맙 베도틴(brentuximab vedotin))는 호지킨 림프종 및 재발성 역형성 큰세포 림프종의 치료를 위해 2011년 8월 미국 FDA에서 설계한 신속 심사에 의해 승인되었다(Nat. Biotechnol (2003) 21(7):778-784; WO2004010957; WO2005001038; US7090843A; US7659241; WO2008025020). 애드세트리스®는 약물이 림프종 세포 상의 표적 CD30에 직접 작용한 후 엔도시토시스(endocytosis)를 수행하여 종양 세포의 세포자멸사(apoptosis)를 유도할 수 있는 신규 ADC 표적 약물이다.
마일로탁® 및 애드세트리스®는 모두 고형 종양에 비해 조직 구조가 비교적 단순한 혈액 종양에 대한 표적 치료제이다. 카드실라(Kadcyla)®(아도-트라스투주맙 엠탄신(ado-trastuzumab emtansine), T-DM1)는 진행성 또는 전이성 유방암을 갖고 트라스투주맙(trastuzumab)(상표명: 허셉틴(Herceptin)) 및 파클리탁셀(paclitaxel, WO2005037992; US8088387)에 약물 내성이 있는 HER2 양성 환자의 치료를 위해 2013년 2월 미국 FDA의 승인을 받았다. 카드실라®는 고형 종양의 치료제로서 미국 FDA가 승인한 최초의 ADC 약물이다.
항체 약물 접합체에 대해 세포독성을 갖는 여러 부류의 소분자가 있으며, 그 중 하나는 토포이소머라제 I을 억제함으로써 항종양 효과를 갖는 캄프토테신(camptothecin) 유도체이다. WO2014057687; Clinical Cancer Research (2016) 22(20):5097-5108; 및 Cancer Sci (2016) 107:1039-1046에서는, 캄프토테신 유도체 엑사테칸(exatecan)(화학명: (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-히드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]이미다조[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온)이 항체 약물 접합체(ADC)에 적용되었다고 보고되었다. 더 나은 치료 효과를 가진 ADC 약물의 추가 개발이 여전히 필요하다.
하지만, ADC는 항체보다 더 복잡한 헤테로 구조를 갖고 있다. 따라서, 치료 목적을 위한 ADC 제제에는 더 큰 도전이 제기된다.
발명의 요약
본 개시는 항체 약물 접합체 및 완충제를 포함하는 약학적 조성물을 제공하고, 여기서 항체 약물 접합체는 하기의 일반 화학식(Pc-L-Y-D)의 구조를 가지며:
Figure pct00001
;
여기서:
Y는 -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-, -O-CR1R2-(CRaRb)m-, -O-CR1R2-, -NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)- 및 -S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
Ra 및 Rb는 동일하거나 상이하고 수소, 중수소, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 중수소화 알킬, 알콕시, 히드록시, 아미노, 시아노, 니트로, 히드록시알킬, 시클로알킬 및 헤테로시클릴로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나;
또는, Ra 및 Rb는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클릴을 형성하고;
R1은 할로겐, 할로알킬, 중수소화 알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 알콕시알킬, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R2는 수소, 할로겐, 할로알킬, 중수소화 알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 알콕시알킬, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
또는, R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클릴을 형성하거나;
또는, Ra 및 Rb는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클릴을 형성하고;
m은 0 내지 4의 정수이고;
n은 1 내지 10의 정수 또는 소수이고;
L은 링커 단위이고;
Pc는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
조성물은 약 4.5 내지 약 6.0의 pH, 바람직하게는 약 4.8 내지 약 5.3의 pH, 및 더 바람직하게는 약 5.0 내지 약 5.1의 pH이다.
대안적인 구현예에서, 약학적 조성물 중 완충제는 약 4.5 내지 약 6.0의 pH이고; 비제한적인 예는 약 4.5, 약 4.6, 약 4.7, 약 4.8, 약 4.9, 약 5.0, 약 5.1, 약 5.2, 약 5.3, 약 5.4, 약 5.5, 약 5.6, 약 5.7, 약 5.8, 약 5.9 및 약 6.0을 포함하고; 약 4.8 내지 약 5.3이 바람직하며, 약 5.0 내지 약 5.1이 더 바람직하다. 일부 구현예들에서, 약학적 조성물은 4.5 내지 5.2의 pH, 바람직하게는 4.8 내지 5.2의 pH, 및 더 바람직하게는 5.0 내지 5.1의 pH이다. 일부 구현예들에서, 약학적 조성물은 5.0의 pH이다.
대안적인 구현예에서, 약학적 조성물은 폴리소르베이트, 폴리소르베이트 20, 폴리소르베이트 80, 폴록사머, 트리톤(Triton), 나트륨 도데실 술포네이트, 나트륨 라우릴 술포네이트, 나트륨 옥틸 글리코시드, 라우릴-술포베타인, 미리스틸-술포베타인, 리놀레일-술포베타인, 스테아릴-술포베타인, 라우릴-사르코신, 미리스틸-사르코신, 리놀레일-사르코신, 스테아릴-사르코신, 리놀레일-베타인, 미리스틸-베타인, 세틸-베타인, 라우라미도 프로필-베타인, 코카라미드 프로필-베타인, 리놀레인아미드 프로필-베타인, 미리스틸아미드 프로필-베타인, 팔미트아미드 프로필-베타인, 이소스테아르아미드 프로필-베타인, 미리스틸아미드 프로필-디메틸아민, 팔미트아미드 프로필-디메틸아민, 이소스테아르아미드 프로필-디메틸아민, 나트륨 메틸 코코일, 나트륨 메틸 올레일 타우레이트, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌과 프로필렌 글리콜의 공중합체 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있는 계면활성제를 더 포함한다. 계면활성제는 바람직하게는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20, 더 바람직하게는 폴리소르베이트 80이다.
대안적인 구현예에서, 약학적 조성물 중 계면활성제는 약 0.01 mg/mL 내지 약 1.0 mg/mL의 농도이다. 대안적 구현예에서, 약학적 조성물 중 계면활성제는 약 0.05 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL, 바람직하게는 약 0.1 mg/mL 내지 약 0.3 mg/mL, 약 0.2 mg/mL 내지 약 0.6 mg, 약 0.2 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL, 또는 약 0.2 mg/mL 내지 약 0.3 mg/mL, 및 더 바람직하게는 약 0.2 mg/mL의 농도이고; 비제한적인 예는 0.1 mg/mL, 0.15 mg/mL, 0.2 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.3 mg/mL, 0.35 mg/mL, 0.4 mg/mL, 0.45 mg/mL, 0.5 mg/mL 및 0.6 mg/mL를 포함한다.
대안적인 구현예에서, 전술한 약학적 조성물은 당류를 추가로 포함한다. 본 개시의 "당류"는 단당류, 이당류, 삼당류, 다당류, 당알코올, 환원당, 비환원당 등을 포함하는 일반 조성 (CH2O)n 및 이의 유도체를 포함한다. 당류는 포도당, 자당, 트레할로스, 유당, 과당, 말토스, 덱스트란, 글리세린, 에리트리톨, 글리세롤, 아라비톨, 실리톨, 소르비톨, 만니톨, 멜리비오스, 멜레지토스, 라피노스, 만노트리오스, 스타키오스, 말토오스, 락툴로오스, 말툴로오스, 글루시톨, 말티톨, 락티톨, 이소-말툴로오스 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 당류는 바람직하게는 비환원성 이당류, 더 바람직하게는 트레할로오스 또는 수크로오스, 및 가장 바람직하게는 수크로오스이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 약학적 조성물 중 당류는 약 60 mg/mL 내지 약 90 mg/mL의 농도이고; 비제한적인 예는 60 mg/mL, 65 mg/mL, 70 mg/mL, 75 mg/mL, 80 mg/mL, 85 mg/mL 및 90 mg/mL를 포함하고; 80 mg/mL가 바람직하다. 일부 구현예들에서, 당류는 70 mg/mL 내지 90 mg/mL의 농도이다.
대안적 구현예에서, 약학적 조성물 중 항체 약물 접합체는 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 농도이고; 비제한적인 예는 1 mg/mL, 10 mg/mL, 11 mg/mL, 12 mg/mL, 13 mg/mL, 14 mg/mL, 15 mg/mL, 16 mg/mL, 17 mg/mL, 18 mg/mL, 19 mg/mL, 20 mg/mL, 21 mg/mL, 22 mg/mL, 23 mg/mL, 24 mg/mL, 25 mg/mL, 26 mg/mL, 27 mg/mL, 28 mg/mL, 29 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL, 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL 및 100 mg/mL를 포함하고; 약 10 mg/mL 내지 약 30 mg/mL가 바람직하며, 약 20 mg/mL 내지 약 22 mg/mL가 더 바람직하다. 구체적으로, 비제한적인 예는 20.1 mg/mL, 20.2 mg/mL, 20.3 mg/mL, 20.4 mg/mL, 20.5 mg/mL, 20.6 mg/mL, 20.7 mg/mL, 20.8 mg/mL, 20.81 mg/mL, 20.82 mg/mL, 20.83 mg/mL, 20.84 mg/mL, 20.85 mg/mL, 20.86 mg/mL, 20.87 mg/mL, 20.88 mg/mL, 20.89 mg/mL, 20.9 mg/mL, 20.9 mg/mL, 20.91 mg/mL, 20.92 mg/mL, 20.93 mg/mL, 20.94 mg/mL, 20.95 mg/mL, 20.96 mg/mL, 20.97 mg/mL, 20.98 mg/mL, 20.99 mg/mL 및 21 mg/mL를 포함한다. 대안적 구현예에서, 약학적 조성물 중 항체 약물 접합체는 네이키드(naked) 항체(즉, ADC의 항체 부분)를 기준으로 약 10 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 바람직하게는 약 20 mg/mL의 농도이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 약학적 조성물 중 완충제는 히스티딘 염 완충제, 숙시네이트 완충제 및 시트레이트 완충제, 바람직하게는 숙시네이트 완충제, 및 더 바람직하게는 숙신산-숙신산나트륨 완충제로 이루어진 군으로부터 선택된다.
대안적 구현예에서, 약학적 조성물 중 완충제는 약 5 mM 내지 약 50 mM의 농도이고; 비제한적인 예는 1 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 11 mM, 12 mM, 13 mM, 14 mM, 15 mM, 16 mM, 17 mM, 18 mM, 19 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM 및 50 mM을 포함하고; 약 5 mM 내지 약 20 mM이 바람직하며, 약 10 mM이 가장 바람직하다.
대안적인 구현예에서, 약물 로딩(loading)(n)은 3 내지 8, 4 내지 8, 5 내지 7, 더 바람직하게는 5.3 내지 6.1의 범위일 수 있고, 이 중 5.7의 세포독성 약물은 각각의 항체 또는 이의 항원 결합 단편(Pc)에 결합한다. n은 소수 또는 정수이다.
대안적인 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함하고:
(a) 약 10 mg/mL 내지 약 30 mg/mL의 항체 약물 접합체, (b) 약 0.05 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL의 폴리소르베이트, (c) 약 60 mg/mL 내지 약 90 mg/mL의 당류, 및 (d) 약 5 mM 내지 약 20 mM의 완충제; 여기서 약학적 조성물은 약 4.8 내지 약 5.3의 pH이다.
대안적인 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함하고:
(a) 약 10 mg/mL 내지 약 30 mg/mL의 항체 약물 접합체, (b) 약 0.05 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL의 폴리소르베이트, (c) 약 60 mg/mL 내지 약 90 mg/mL의 당류, 및 (d) 약 5 mM 내지 약 20 mM의 완충제; 여기서 약학적 조성물은 4.8 내지 5.2의 pH이다.
대안적인 구현예에서, 약학적 조성물은 하기를 포함하고:
(a) 약 20 mg/mL 내지 약 22 mg/mL의 항체 약물 접합체, (b) 약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80, (c) 80 mg/mL의 자당, 및 (d) 약 10 mM의 숙시네이트 완충제; 여기서 약학적 조성물은 약 5.0 내지 약 5.1의 pH이다. 일부 구현예들에서, 약학적 조성물은 5.0 내지 5.1의 pH이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서,
-Y-는 -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-이고;
Ra 및 Rb는 동일하거나 상이하고 수소, 중수소, 할로겐 및 알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
R1은 C3-7 시클로알킬알킬 또는 C3-7 시클로알킬이고;
R2는 수소, 할로알킬 및 C3-7 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 수소이거나;
또는, R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 C3-7 시클로알킬을 형성하고;
m은 0 또는 1이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서,
-Y-는 -O-(CH2)m-CR1R2-C(O)-이고;
R1은 C3-7 시클로알킬알킬 또는 C3-7 시클로알킬이고;
R2는 수소, 할로알킬 및 C3-7 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
또는, R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 C3-7 시클로알킬을 형성하고;
m은 0 또는 1이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서,
-Y-는 -O-(CH2)m-CR1R2-C(O)-이고;
R1은 C3-7 시클로알킬알킬 또는 C3-7 시클로알킬이고;
R2는 수소이거나;
또는, R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 C3-7 시클로알킬을 형성하고;
m은 0 또는 1이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서,
-Y-는 -O-(CH2)m-CR1R2-C(O)-이고;
R1은 C3-7 시클로알킬알킬 또는 C3-7 시클로알킬이고;
R2는 수소이거나;
또는, R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 C3-7 시클로알킬을 형성하고;
m은 0이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서,
-Y-는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00002
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서,
Y의 O 말단은 링커 단위 L에 연결된다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서,
-Y-는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00003
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체는 하기의 일반 화학식(Pc-L-D1)의 구조를 가지고:
Figure pct00004
여기서:
R1은 시클로알킬알킬 또는 시클로알킬, 바람직하게는 C3-7 시클로알킬알킬 또는 C3-7 시클로알킬이고;
R2는 수소, 할로알킬 및 C3-7 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 수소이거나;
또는, R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 C3-7 시클로알킬을 형성하고;
m은 0 또는 1이고;
n은 1 내지 10의 정수 또는 소수일 수 있고;
Pc는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며; L은 링커 단위이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서, n은 2 내지 8의 정수 또는 소수, 바람직하게는 3 내지 8의 정수 또는 소수일 수 있다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서, 링커 단위 -L-은 -L1-L2-L3-L4-이고, 여기서:
L1은 -(숙신이미딜-3-일-N)-W-C(O)-, -CH2-C(O)-NR3-W-C(O)- 및 -C(O)-W-C(O)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 W는 C1-8 알킬, C1-8 알킬-시클로알킬 및 1 내지 8개 원자의 선형 헤테로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되며, 헤테로알킬은 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하고, 여기서 C1-8 알킬, 시클로알킬 및 선형 헤테로알킬은 각각 독립적으로 할로겐, 히드록시, 시아노, 아미노, 알킬, 클로로알킬, 중수소화 알킬, 알콕시 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 추가로 치환되고;
L2는 -NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-, -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-, -S(CH2)p1C(O)- 및 화학 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 p1은 1 내지 20의 정수이고; L2는 바람직하게는 화학 결합이고;
L3은 2 내지 7개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 잔기이고, 여기서 아미노산은 할로겐, 히드록시, 시아노, 아미노, 알킬, 클로로알킬, 중수소화 알킬, 알콕시 및 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 추가로 치환되고;
L4는 -NR5(CR6R7)t-, -C(O)NR5, -C(O)NR5(CH2)t- 및 화학 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 t는 1 내지 6의 정수이고; L4는 바람직하게는 -NR5(CR6R7)t-이고;
R3, R4 및 R5는 동일하거나 상이하고 수소, 알킬, 할로알킬, 중수소화 알킬 및 히드록시알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고;
R6 및 R7은 동일하거나 상이하고 수소, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 중수소화 알킬 및 히드록시알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서, 링커 단위 L1은
-(숙신이미딘-3-일-N)-(CH2)s1-C(O)-,
-(숙신이미딘-3-일-N)-CH2-시클로헥실-C(O)-,
-(숙신이미딘-3-일-N)-(CH2CH2O)s2-CH2CH2-C(O)-,
-CH2-C(O)-NR3-(CH2)s3-C(O)- 및 -C(O)-(CH2)s4C(O)-로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 s1은 2 내지 8의 정수이고, s2는 1 내지 3의 정수이고, s3은 1 내지 8의 정수이며, s4는 1 내지 8의 정수이고; s1은 바람직하게는 5이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서, 링커 단위 L2는 -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)- 또는 화학 결합이며, p1은 6 내지 12의 정수이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서, L4는 -NR5(CR6R7)t-이고, R5는 수소 또는 알킬이고, R6 및 R7은 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 알킬이며, t는 1 또는 2, 바람직하게는 2이고; L4는 바람직하게는 -NR5CR6R7-, 더 바람직하게는 -NHCH2-이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서, 링커 단위 -L-은 -L1-L2-L3-L4-이고, 여기서:
L1은
Figure pct00005
이고, s1은 2 내지 8의 정수이고;
L2는 화학 결합이고;
L3은 테트라펩티드 잔기이고;
L4는 -NR5(CR6R7)t-이고, R5는 수소 또는 알킬이고, R6 및 R7은 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 알킬이며, t는 1 또는 2이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서, 링커 단위 -L-은 -L1-L2-L3-L4-이고, 여기서:
L1은 -(숙신이미딘-3-일-N)-CH2-시클로헥실-C(O)-이고;
L2는 -NR4(CH2CH2O)9CH2C(O)-이고;
L3은 테트라펩티드 잔기이고;
L4는 -NR5(CR6R7)t-이고, R5는 수소 또는 알킬이고, R6 및 R7은 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 알킬이며, t는 1 또는 2이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서, L3의 펩티드 잔기는 페닐알라닌(E), 글리신(G), 발린(V), 리신(K), 시트룰린, 세린(S), 글루탐산(E) 및 아스파르트산(N)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개 이상의 아미노산으로부터 형성된 아미노산 잔기, 바람직하게는 페닐알라닌 및 글리신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개, 2개 이상의 아미노산으로부터 형성된 아미노산 잔기, 더 바람직하게는 테트라펩티드 잔기, 및 가장 바람직하게는 GGFG(글리신-글리신-페닐알라닌-글리신)의 테트라펩티드 잔기이다.
대안적 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서, 링커 단위 -L-은 -L1-L2-L3-L4-이고, 여기서 L1 말단은 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 연결되며, L4 말단은 Y에 연결된다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서, -L-Y-는 하기와 같고:
Figure pct00006
L1은 -(숙신이미딘-3-일-N)-(CH2)s1-C(O)- 또는 -(숙신이미딘-3-일-N)-CH2-시클로헥실-C(O)-이고;
L2는 -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)- 또는 화학 결합이며, p1은 6 내지 12의 정수이고; R4는 수소, 알킬, 할로알킬, 중수소화 알킬 및 히드록시알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L3은 GGFG의 테트라펩티드 잔기이고;
R1은 시클로알킬알킬 또는 시클로알킬, 바람직하게는 C3-7 시클로알킬알킬 또는 C3-7 시클로알킬이고;
R2는 수소, 할로알킬 및 C3-7 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 수소이거나;
또는, R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 C3-7 시클로알킬을 형성하고;
R5는 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R6 및 R7은 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 알킬이고;
s1은 2 내지 8의 정수, 바람직하게는 5이고;
m은 0 내지 4의 정수이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서, -L-Y-는 하기와 같고:
Figure pct00007
바람직하게는:
Figure pct00008
L2는 -NR4(CH2CH2O)9CH2C(O)-이고; R4는 수소, 알킬, 할로알킬, 중수소화 알킬 및 히드록시알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L3은 GGFG의 테트라펩티드 잔기이고;
R1은 시클로알킬알킬 또는 시클로알킬, 바람직하게는 C3-7 시클로알킬알킬 또는 C3-7 시클로알킬이고;
R2는 수소, 할로알킬 및 C3-7 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 수소이거나;
또는, R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 C3-7 시클로알킬을 형성하고;
R5는 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R6 및 R7은 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 알킬이고;
m은 0 내지 4의 정수이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서, -L-Y-는 하기와 같고:
Figure pct00009
L2는 화학 결합이고;
L3은 GGFG의 테트라펩티드 잔기이고;
R1은 시클로알킬알킬 또는 시클로알킬, 바람직하게는 C3-7 시클로알킬알킬 또는 C3-7 시클로알킬이고;
R2는 수소, 할로알킬 및 C3-7 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 수소이거나;
또는, R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 C3-7 시클로알킬을 형성하고;
R5는 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R6 및 R7은 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 알킬이고;
s1은 2 내지 8의 정수, 바람직하게는 5이고;
m은 0 내지 4의 정수이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서, -L-Y-는 하기와 같고:
Figure pct00010
여기서:
L1은 -(숙신이미딘-3-일-N)-(CH2)s1-C(O)- 또는 -(숙신이미딘-3-일-N)-CH2-시클로헥실-C(O)-이고;
L2는 -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)- 또는 화학 결합이며, p1은 1 내지 20의 정수이고; R4는 수소, 알킬, 할로알킬, 중수소화 알킬 및 히드록시알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L3은 GGFG의 테트라펩티드 잔기이고;
R1은 시클로알킬알킬 또는 시클로알킬, 바람직하게는 C3-7 시클로알킬알킬 또는 C3-7 시클로알킬이고;
R2는 수소, 할로알킬 및 C3-7 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 수소이거나;
또는, R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 C3-7 시클로알킬을 형성하고;
R5, R6 및 R7은 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 알킬이고;
s1은 2 내지 8의 정수이고;
m은 0 내지 4의 정수이다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서, -L-Y-는 하기와 같고:
Figure pct00011
여기서:
L2는 화학 결합이고;
L3은 GGFG의 테트라펩티드 잔기이고;
R1은 시클로알킬알킬 또는 시클로알킬, 바람직하게는 C3-7 시클로알킬알킬 또는 C3-7 시클로알킬이고;
R2는 수소, 할로알킬 및 C3-7 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 수소이거나;
또는, R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 C3-7 시클로알킬을 형성하고;
R5는 수소 및 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, R6 및 R7은 동일하거나 상이하고 각각 독립적으로 수소 또는 알킬이고;
s1은 2 내지 8의 정수이고;
m은 0 내지 4의 정수이다.
대안적인 구현예에서, 항체 약물 접합체는 하기의 일반 화학식(Pc-La-Y-D)의 구조를 가지고:
Figure pct00012
;
여기서,
W는 C1-8 알킬, C1-8 알킬-C3-7 시클로알킬, 및 1 내지 8개의 원자를 갖는 선형 헤테로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고, 헤테로알킬은 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 내지 3개의 헤테로원자를 포함하고, 여기서 C1-8 알킬, C3-7 시클로알킬 및 선형 헤테로알킬은 각각 독립적으로 할로겐, 히드록시, 시아노, 아미노, C1-6 알킬, C1-6 클로로알킬, 중수소화 C1-6 알킬, C1-6 알콕시, 및 C3-7 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 추가로 치환되고;
L2는 -NR4(CH2CH2O)p1CH2CH2C(O)-, -NR4(CH2CH2O)p1CH2C(O)-, -S(CH2)p1C(O)- 및 화학 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 p1은 1 내지 20의 정수이고; R4는 수소, 알킬, 할로알킬, 중수소화 알킬, 및 히드록시알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
L3은 2 내지 7개의 아미노산 잔기로 이루어진 펩티드 잔기이고, 여기서 아미노산 잔기는 페닐알라닌(F), 글리신(G), 발린(V), 리신(K), 시트룰린, 세린(S), 글루탐산(Q) 및 아스파르트산(D)의 아미노산으로부터 형성된 아미노산 잔기로 이루어진 군으로부터 선택되며, 할로겐, 히드록시, 시아노, 아미노, C1-6 알킬, C1-6 클로로알킬, 중수소화 C1-6 알킬, C1-6 알콕시 및 C3-7 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 선택적으로 추가로 치환되고;
R1은 C1-6 할로알킬 또는 C3-7 시클로알킬이고;
R2는 수소, C1-6 할로알킬 및 C3-7 시클로알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
또는, R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 C3-7 시클로알킬을 형성하고;
R5는 수소, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, 중수소화 C1-6 알킬 및 히드록시 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R6 및 R7은 동일하거나 상이하고 각각 수소, 할로겐, C1-6 알킬, C1-6 할로알킬, 중수소화 C1-6 알킬 및 히드록시 C1-6 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고;
m은 0 또는 1이고;
n은 3 내지 8의 정수 또는 소수이고;
Pc는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
대안적인 구현예에서, 항체 약물 접합체는 하기의 일반 화학식(Pc-Lb-Y-D)의 구조를 가지고:
Figure pct00013
;
여기서:
s1은 2 내지 8의 정수이고;
Pc, R1, R2, R5, R6, R7, m 및 n은 하기의 일반 화학식(Pc-La-Y-D)에서 정의된 바와 같다.
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체에서, -L-Y-는 하기를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00014
Figure pct00015
대안적인 구현예에서, 전술한 항체 약물 접합체는 하기의 구조를 가지고:
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
여기서, Pc 및 n은 일반 화학식(Pc-La-Y-D)에서 정의된 바와 같다. 대안적인 구현예에서, 항체 약물 접합체는 하기의 구조를 가지고:
Figure pct00020
;
여기서:
n은 3 내지 8의 정수 또는 소수이고;
Pc는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다.
대안적인 구현예에서, Pc는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고, 항체는 키메라 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 유래 항체로 이루어진 군으로부터 선택되고, 바람직하게는 단일클론 항체이다.
대안적인 구현예에서, Pc는 항 HER2(ErbB2) 항체, 항 EGFR 항체, 항 B7-H3 항체, 항 c-Met 항체, 항 HER3(ErbB3) 항체, 항 HER4(ErbB4) 항체, 항 CD20 항체, 항 CD22 항체, 항 CD30 항체, 항 CD33 항체, 항 CD44 항체, 항 CD56 항체, 항 CD70 항체, 항 CD73 항체, 항 CD105 항체, 항 CEA 항체, 항 A33 항체, 항 크립토(Cripto) 항체, 항 EphA2 항체, 항 G250 항체, 항 MUC1 항체, 항 루이스(Lewis) Y 항체, 항 VEGFR 항체, 항 GPNMB 항체, 항 인테그린(integrin) 항체, 항 PSMA 항체, 항 테나신(tenascin)-C 항체, 항 SLC44A4 항체 및 항 메조텔린(mesothelin) 항체, 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
대안적인 구현예에서, 항체 약물 접합체에서 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 트라스투주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 에노블리투주맙(enoblituzumab), 에미베투주맙(emibetuzumab), 이노투주맙(inotuzumab), 피나투주맙(pinatuzumab), 브렌툭시맙(brentuximab), 젬투주맙(gemtuzumab), 비바투주맙(bivatuzumab), 로보투주맙(lorvotuzumab), cBR96 및 글레마투마맙(glematumamab), 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
대안적인 구현예에서, 항체 약물 접합체는 하기의 구조를 가진다:
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
여기서, n은 0이 아닌 정수 또는 0 내지 10 사이의 소수, 바람직하게는 1 내지 10 사이의 정수 또는 소수, 더 바람직하게는 2 내지 8의 정수 또는 소수, 및 가장 바람직하게는 3 내지 8 사이의 정수 또는 소수이다.
대안적인 구현예에서, 약학적 조성물 내 항체 약물 접합체는 하기의 구조를 가지고:
Figure pct00025
여기서, n은 3 내지 8의 정수 또는 소수이다.
본 개시는 하기를 포함하는 약학 조성물을 제공하고: (a) 약 10 mg/mL 내지 약 30 mg/mL의 항체 약물 접합체, (b) 약 0.05 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL의 폴리소르베이트, (c) 약 60 mg/mL 내지 약 90 mg/mL의 당류, 및 (d) 약 5 mM 내지 약 20 mM의 완충제; 여기서 조성물은 4.8 내지 5.2의 pH이고;
여기서, 항체 약물 접합체는 하기의 구조를 가지고:
Figure pct00026
여기서, n은 3 내지 8의 정수 또는 소수이다.
본 개시는 하기를 포함하는 약학 조성물을 제공하고: (a) 약 20 mg/mL 내지 약 22 mg/mL의 항체 약물 접합체, (b) 약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80, (c) 약 80 mg/mL의 자당, 및 (d) 약 10 mM의 숙시네이트 완충제; 여기서 약학적 조성물은 5.0 내지 5.1의 pH이고;
여기서, 항체 약물 접합체는 하기의 구조를 가지고:
Figure pct00027
여기서, n은 3 내지 8의 정수 또는 소수이다.
본 개시는 또한 항체 약물 접합체를 포함하는 동결건조된 제제를 제공하며, 여기서 제제는 재구성되어 전술한 약학적 조성물을 형성할 수 있다.
본 개시는 또한 전술한 약학적 조성물을 동결건조하는 단계를 포함하는, 항체 약물 접합체를 포함하는 동결건조된 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
대안적인 구현예에서, 항체 약물 접합체를 포함하는 동결건조된 제제를 제조하는 방법에서 동결건조는 예비동결, 1차 건조 및 2차 건조의 단계를 포함한다. 동결건조는 제제를 동결한 다음, 1차 건조에 적합한 온도에서 물을 승화시킴으로써 실시한다. 이러한 조건에서, 생성물은 제제의 공융점 또는 붕괴 온도보다 낮은 온도에 있다. 일반적으로, 1차 건조의 온도는 약 -30℃ 내지 25℃의 범위에 있다(생성물은 1차 건조 중에 동결된 상태로 유지된다고 가정함). 제제, 샘플을 함유하는 용기(예: 유리 바이알)의 크기 및 유형, 및 액체의 부피는 건조에 필요한 시간을 결정하고, 이는 몇 시간 내지 며칠(예: 40~60시간)의 범위일 수 있다. 2차 건조는 주로 용기의 유형 및 크기, 및 사용된 단백질의 유형에 따라 약 0~40℃에서 실시할 수 있다. 2차 건조에 필요한 시간은 제품의 바람직한 잔여 수분 함량에 따라 결정되며, 일반적으로 적어도 약 5시간이 소요된다. 일반적으로, 저압에서 동결건조된 제제의 수분 함량은 약 5% 미만, 바람직하게는 약 3% 미만이다. 압력은 1차 건조 단계에 적용되는 압력과 동일할 수 있으며; 바람직하게는, 2차 건조의 압력은 1차 건조의 압력보다 낮다. 동결건조 조건은 제제 및 바이알 크기에 따라 가변될 수 있다.
본 개시의 대안적인 구현예에서, 약학적 조성물의 모액 5 mL가 동결건조되고, 동결건조 프로그램은 하기와 같다: 예비 동결의 경우, 온도는 -5℃ 또는 -45℃이고; 1차 건조의 경우, 온도는 -20℃이고, 진공 정도는 10 Pa이다; 2차 건조의 경우, 온도는 25℃이고, 진공 정도는 1 Pa이다.
일부 구현예에서, 동결건조된 제제는 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 18개월, 또는 적어도 24개월 동안 2~8℃에서 안정하다. 일부 구현예에서, 동결건조된 제제는 40℃에서 적어도 7일, 적어도 14일, 또는 적어도 28일 동안 안정하다.
본 개시는 또한 전술한 항 HER2 항체 약물 접합체를 포함하는 약학적 조성물을 동결건조함으로써 수득한 항체 약물 접합체를 포함하는 동결건조 제제를 제공한다.
본 개시는 또한 전술한 동결건조된 제제를 재구성함으로써 수득된 항체 약물 접합체를 포함하는 재구성된 용액을 제공한다.
본 개시는 또한 전술한 재구성된 용액의 제조하는 방법으로서, 주사용수, 생리식염수 또는 포도당 용액으로 제한없이 이루어진 군으로부터 선택되는 용액으로 전술한 동결건조 제제를 재구성하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
대안적인 구현예에서, 재구성된 용액은 하기의 성분을 포함하고:
(a) 약 10 mg/mL 내지 약 30 mg/mL의 항체 약물 접합체, (b) 약 0.05 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL의 폴리소르베이트, (c) 약 60 mg/mL 내지 약 90 mg/mL의 당류, 및 (d) 약 5 mM 내지 약 20 mM의 완충제; 여기서 재구성된 용액은 4.8 내지 5.2의 pH이다.
대안적인 구현예에서, 재구성된 용액은 하기의 성분을 포함하고:
(a) 약 20 mg/mL 내지 22 mg/mL의 항체 약물 접합체, (b) 약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80, (c) 약 80 mg/mL의 자당, 및 (d) 약 10 mM의 숙시네이트 완충제; 여기서 재구성된 용액은 5.0 내지 5.1의 pH이다.
본 개시는 또한 전술한 약학적 조성물, 동결건조 제제 또는 재구성된 용액을 함유하는 용기를 포함하는 제조 물품을 제공한다. 일부 구현예에서, 용기는 중성 붕규산 유리로 만들어진 관형 주사 바이알이다.
본 개시는 또한 종양을 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하는데 있어서 전술한 약학적 조성물 또는 동결건조 제제 또는 재구성된 용액 또는 제조 물품의 용도를 제공한다.
본 개시는 또한 전술한 약학적 조성물 또는 동결건조 제제 또는 재구성된 용액 또는 제조 물품을 제공하는 단계를 포함하는 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시는 또한 바람직하게는 종양 질환을 치료 또는 예방하기 위한 약제로서 전술한 약학적 조성물, 또는 동결건조 제제, 또는 재구성된 용액, 또는 제조 물품을 제공한다.
대안적인 구현예에서, 질병 또는 종양은 HER2, HER3, B7H3 또는 EGFR 발현과 관련된 암이다.
대안적인 구현예에서, 암은 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 전립선암, 신장암, 요로암, 방광암, 간암, 위암, 자궁내막암, 침샘암, 식도암, 흑색종, 신경교종, 신경모세포종, 육종, 폐암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 백혈병, 골암, 피부암, 갑상선암, 췌장암 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
당업자에게 일반적으로 공지된 바와 같이, 본 개시에 기재된 다양한 구현예의 특징 중 하나, 일부 또는 전부는 본 개시의 다른 구현예를 형성하기 위해 추가로 조합될 수 있다. 본 개시의 전술한 구현예 및 조합에 의해 수득되는 다른 구현예는 하기의 상세한 설명을 통하여 추가로 예시된다.
본 발명은 생산 및 투여에 유리하고 물성이 안정한 약학적 조성물을 제공한다. 특히, 본 개시에 기재된 약학적 조성물은 항체 약물 접합체 및 완충제를 포함한다.
용어
본 개시의 이해를 돕기 위해, 일부 기술 용어 및 과학 용어를 구체적으로 하기에 정의하였다. 본원에서 달리 구체적으로 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 다른 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가진다.
출원 PCT/CN2019/107873(WO2020/063676)은 그 전체가 본원에 원용된다.
“항체 약물 접합체(ADC)”는 항체 또는 항체 단편을 생물학적 활성을 갖는 세포독소 또는 세포 사멸 활성을 갖는 소분자 약물에 안정한 화학적 링커 화합물을 통해 연결함으로써 형성되며, 이러한 경우에 종양 세포 특이적이거나 고도로 발현되는 항원에 대한 항체의 결합 특이성 및 세포독소의 높은 효율을 충분히 이용하고, 정상 세포에 대한 독성 부작용을 방지한다. 항체 약물 접합체는 종양 세포에 정확하게 결합할 수 있으며, 과거의 통상적인 화학요법 약물에 비해 정상 세포에 대한 영향이 감소하였다.
"완충제"는 이의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의한 pH 변화에 저항하는 완충제를 의미한다. pH를 적절한 범위로 조절하는 완충제의 예는 아세테이트, 숙시네이트, 글루코네이트, 히스티딘염, 옥살레이트, 락테이트, 포스페이트, 시트레이트, 타르트레이트, 푸마레이트, 글리실글리신 및 기타 유기산 완충제를 포함한다.
"히스티딘염 완충제"는 히스티딘 이온을 포함하는 완충제이다. 히스티딘염 완충제의 예는 히스티딘-염산 완충제, 히스티딘-아세트산 완충제, 히스티딘-인산 완충제, 히스티딘-황산 완충제 등을 포함하고, 히스티딘-아세트산 완충제가 바람직하다. 히스티딘-아세트산 완충제는 히스티딘 및 아세트산으로부터 제조되고, 히스티딘 염산염 완충제는 히스티딘 및 염산으로부터 제조된다.
"시트레이트 완충제"는 시트레이트 이온을 포함하는 완충제이다. 시트레이트 완충제의 예는 시트르산-시트르산나트륨, 시트르산-시트르산칼륨, 시트르산-시트르산칼슘, 시트르산-시트르산마그네슘 등을 포함한다. 바람직한 시트레이트 완충제는 시트르산-시트르산나트륨이다.
“숙시네이트 완충제"는 숙시네이트 이온을 포함하는 완충제이다. 숙시네이트 완충제의 예는 숙신산-숙신산나트륨, 숙신산-숙신산칼륨, 숙신산-숙신산칼슘 등을 포함한다. 바람직한 숙시네이트 완충제는 숙신산-숙신산나트륨이다. 예시적으로, 숙신산-숙신산나트륨은 숙신산 및 수산화나트륨, 또는 숙신산 및 숙신산나트륨으로부터 제조할 수 있다.
"인산염 완충제"는 인산 이온을 포함하는 완충제이다. 인산염 완충제의 예는 인산수소이나트륨-인산이수소나트륨, 인산수소이나트륨-인산이수소칼륨, 인산수소이나트륨-구연산 등을 포함한다. 바람직한 인산염 완충제는 인산수소이나트륨-인산이수소나트륨이다.
"아세테이트 완충제"는 아세테이트 이온을 포함하는 완충제이다. 아세테이트 완충제의 예는 아세트산-아세트산나트륨, 아세트산 히스티딘염, 아세트산-아세트산칼륨, 아세트산-아세트산칼슘, 아세트산-아세트산마그네슘 등을 포함한다. 바람직한 아세테이트 완충제는 아세트산-아세트산나트륨이다.
"약학적 조성물"은 본원에 기재된 항체 약물 접합체 또는 이의 생리학적/약학적으로 허용가능한 염 또는 전구약물 중 하나 이상 및 기타 화학 성분을 함유하는 혼합물을 지칭하며, 다른 성분은, 예를 들어, 생리학적/약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제이다. 약학적 조성물의 목적은 항체의 활성 성분의 안정성을 유지하고 유기체에 대한 투여를 촉진하여 활성 성분의 흡수를 촉진함으로써 생물학적 활성을 발휘하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, "약학적 조성물" 및 "제제"는 상호 배타적이지 않다.
본원에 기재된 약학 조성물은 용액 형태이며, 달리 명시되지 않는 한, 용매는 물이다.
"동결건조 제제"는 액체 또는 용액 형태의 약학적 조성물 또는 제제를 진공 동결건조하여 수득한 제제 또는 약학적 조성물을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "약" 및 "대략"은 수치 값이 당업자가 결정한 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내에 있음을 의미하며, 해당 수치 값은 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지에 부분적으로 의존한다(즉, 측정 시스템의 한계). 예를 들어, "약"은 당업계의 관행에 따라 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 또는, "약" 또는 "실질적으로 포함하는"은 20% 이하의 범위를 의미할 수 있다. 또한, 특히 생물학적 시스템 또는 공정의 경우, 이 용어는 최대 10배 또는 최대 5배의 수치 값을 의미할 수 있다. 본 출원 및 청구범위에서 특정 값이 제공되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, "약" 또는 "실질적으로 포함하는"의 의미는 해당 특정 값에 대해 허용 가능한 오차 범위 내에 있는 것으로 가정해야 한다.
본 개시의 약학적 조성물은 하기에 대한 안정한 효과를 달성할 수 있다: 항체 약물 접합체가 저장 후 이의 물리적 및/또는 화학적 안정성 및/또는 생물학적 활성을 실질적으로 보유하는 약학적 조성물; 바람직하게는, 약학적 조성물은 저장 후 이의 물리적 및 화학적 안정성뿐만 아니라 이의 생물학적 활성을 실질적으로 유지한다. 저장 기간은 일반적으로 약학적 조성물의 미리 결정된 저장 수명을 기준으로 선택한다. 단백질 안정성을 측정하기 위한 현재 입수 가능한 다양한 분석 기술이 있으며, 선택한 온도에서 선택된 일정 기간 동안 저장한 후의 안정성을 측정할 수 있다.
안정한 제제는 하기와 같이: 냉장 온도(2~8℃)에서 적어도 3개월, 바람직하게는 6개월, 더 바람직하게는 1년, 및 더욱 더 바람직하게는 최대 2년까지 저장되는 조건하에서 유의한 변화가 관찰되지 않는 제제이다. 또한, 안정한 액상 제제는 1개월, 3개월 및 6개월을 포함하는 기간 동안 25℃를 포함하는 온도에서 보관 후 바람직한 특성을 나타내는 액상 제제를 포함한다. 안정성에 대한 전형적인 예는 하기와 같이: 전형적으로, 항체 단량체의 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하가 SEC-HPLC로 측정할 때 응집되거나 분해된다. 제제는 육안 분석에 의해 담황색, 거의 무색의 투명한 액체, 또는 무색, 또는 투명 내지 약간 유백색이다. 제제의 농도, pH 및 삼투압은 ±10% 이하의 변화를 가진다. 전형적으로, 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 감소가 관찰된다. 전형적으로, 약 10% 이하, 바람직하게는 약 5% 이하의 응집이 형성된다.
항체 약물 접합체는, 색상 및/또는 투명도를 육안으로 검사하거나 또는 UV 광산란, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 동적 광산란(DLS)으로 측정했을 때 응집, 침전 및/또는 변성의 유의한 증가가 없는 경우, 약학적 조성물 내에서 “이의 물리적 안정성을 유지”한다. 단백질 입체형태의 변화는 형광 분광법(단백질 3차 구조를 결정함) 및 FTIR 분광법(단백질 2차 구조를 결정함)으로 평가할 수 있다.
항체 약물 접합체는, 유의한 화학적 변화를 나타내지 않는 경우, 약학적 제제에서 "이의 화학적 안정성을 유지"한다. 화학적 안정성은 단백질의 화학적으로 변형된 형태를 감지하고 정량화하여 평가할 수 있다. 단백질의 화학 구조를 종종 변화시키는 분해 과정은 가수분해 또는 클리핑(크기 배제 크로마토그래피 및 CE-SDS와 같은 방법으로 평가함), 산화(질량 분석 또는 MALDI/TOF/MS와 함께 펩티드 매핑과 같은 방법으로 평가함), 탈아미드화(이온 교환 크로마토그래피, 모세관 등전점, 펩티드 맵핑, 및 이소아스파르트산 측정과 같은 방법으로 평가함), 및 이성질화(이소아스파르트산 함량 측정, 펩티드 맵핑 등으로 평가함)를 포함한다.
항체 약물 접합체는, 주어진 시간에 항체 약물 접합체의 생물학적 활성이 약학적 제제가 제조될 당시에 나타낸 생물학적 활성의 미리 결정된 범위 내에 있는 경우, 약학적 제제 내에서 "이의 생물학적 활성을 유지"한다.
본 개시에 사용된 아미노산에 대한 세 문자 및 한 문자 부호는 J. Biol. Chem., 243, p3558 (1968)에 기재된 바와 같다.
본원에 기재된 "항체"는 면역글로불린을 말하며, 원형 항체는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄 사이를 사슬간 이황화 결합으로 연결함으로써 형성된 테트라펩티드 사슬 구조이다. 면역글로불린의 중쇄 불변 영역은 아미노산 조성 및 배열, 따라서 이의 항원성이 상이하다. 이에 따라, 면역 글로불린은 5개의 부류, 달리 면역글로불린의 동형이라고도 하는, 즉, IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로 분류할 수 있으며, 이들의 해당 중쇄는 각각 μ 쇄, δ 쇄, γ 쇄, α 쇄 및 ε 쇄이다. 동일한 부류의 Ig는 힌지 영역의 아미노산 조성 및 중쇄의 이황화 결합의 수 및 위치의 차이에 따라 상이한 하위 부류로 분류할 수 있다; 예를 들어, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 분류할 수 있다. 경쇄는 불변 영역의 차이에 따라 κ 또는 λ 사슬로 분류한다. Ig의 5가지 부류의 각각은 κ 사슬 또는 λ 사슬을 갖는다. 본 개시에 기재된 항체는 바람직하게는 표적 세포 상의 세포 표면 항원에 대한 특이적 항체이고, 항체의 비제한적인 예는: 항 HER2(ErbB2) 항체, 항 EGFR 항체, 항 B7-H3 항체, 항 c-Met 항체, 항 HER3(ErbB3) 항체, 항 HER4(ErbB4) 항체, 항 CD20 항체, 항 CD22 항체, 항 CD30 항체, 항 CD33 항체, 항 CD44 항체, 항 CD56 항체, 항 CD70 항체, 항 CD73 항체, 항 CD105 항체, 항 CEA 항체, 항 A33 항체, 항 크립토 항체, 항 EphA2 항체, 항 G250 항체, 항 MUC1 항체, 항 루이스 Y 항체, 항 VEGFR 항체, 항 GPNMB 항체, 항 인테그린 항체, 항 PSMA 항체, 항 테나신-C 항체, 항 SLC44A4 항체, 및 항 메조텔린 항체, 바람직하게는 트라스투주맙(상표명: 헤르셉틴(Herceptin)), 퍼투주맙(2C4로도 공지됨, 퍼제타(Perjeta)), 니모투주맙(상표명: 타이신성(Taixinsheng)), 에노블리투주맙, 에미베투주맙, 이노투주맙, 피나투주맙, 브렌툭시맙, 젬투주맙, 비바투주맙, 로보투주맙, cBR96 및 글레마투마맙 중 하나 이상이다.
항체의 중쇄 및 경쇄에서, N 말단 근처의 약 110개 아미노산의 서열은 상당히 가변적이므로 가변 영역(Fv 영역)이라고 하며; C 말단 근처의 나머지 아미노산 서열은 상대적으로 안정하므로 불변 영역이라고 한다. 가변 영역은 상대적으로 보존적인 서열을 갖는 3개의 초가변 영역(HVR) 및 4개의 프레임워크 영역(FR)을 포함한다. 3개의 초가변 영역은 항체의 특이성을 결정하므로, 또한 상보성 결정 영역(CDR)으로도 공지되어 있다. 각 경쇄 가변 영역(LCVR) 또는 중쇄 가변 영역(HCVR)은 아미노 말단에서 카르복시 말단까지 하기의 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4. 경쇄의 3개의 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭하고, 중쇄의 3개의 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭한다. 본 개시에 기재된 항체 또는 항원 결합 단편의 LCVR 및 HCVR 영역의 CDR 아미노산 잔기는 수 및 위치의 측면에서 공지된 카바트(Kabat) 넘버링 방식(LCDR 1~3, HCDR 1~3)에 대응한다.
본 개시에서, 본 개시의 항체 경쇄는 인간 또는 뮤린 κ 쇄 및 λ 쇄 또는 이의 변이체를 포함하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시에서, 본 개시의 항체 중쇄는 인간 또는 뮤린 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 또는 이의 변이체를 포함하는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시의 항체는 뮤린 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체, 및 바람직하게는 인간화 항체를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "뮤린 항체"는 당해 분야의 지식 및 기술에 따라 마우스로부터 제조된 항체를 지칭한다. 제조 중에, 시험 대상체에게 특정 항원을 주입한 후, 원하는 서열 또는 기능적 특징을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마를 분리시킨다.
"키메라 항체"라는 용어는 뮤린 항체의 가변 영역과 인간 항체의 불변 영역을 융합시켜 수득한 항체로서, 뮤린 항체에 의해 유도되는 면역반응을 감소시킬 수 있는 항체를 의미한다. 키메라 항체는 우선 뮤린 특이적 단일클론 항체를 분비하는 하이브리도마를 확립하는 단계, 마우스 하이브리도마 세포로부터 가변 영역 유전자를 클로닝한 다음, 필요에 따라 인간 항체의 불변 영역 유전자를 클로닝하는 단계, 마우스 가변 영역 유전자 및 인간 불변 영역 유전자를 키메라 유전자 내에 연결하는 단계, 키메라 유전자를 인간 벡터 내에 삽입하는 단계, 및 마지막으로 키메라 항체 분자를 진핵 산업 시스템 또는 원핵 산업 시스템에서 발현시키는 단계에 의해 확립된다.
CDR 이식 항체로도 공지된 용어 "인간화 항체"는 뮤린 CDR 서열을 인간 항체 가변 영역 프레임워크(framework), 즉 상이한 유형의 인간 종 항체 프레임워크 서열 내에 이식함으로써 생성된 항체를 지칭한다. 이러한 항체는 많은 양의 마우스 단백질 성분을 보유하기 때문에 키메라 항체에 의해 유도된 강한 불균질 반응을 극복할 수 있다. 이러한 프레임워크 서열은 생식계열 항체 유전자 서열을 포함하는 공공의 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참조로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자에 대한 생식세포 DNA 서열은 "VBase" 인간 종 서열 데이터베이스에서뿐만 아니라, Kabat, E. A. et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition에서도 찾을 수 있다. 면역원성의 감소에 의해 유발되는 활성의 감소를 피하기 위해, 인간 항체 가변 영역의 FR 서열은 활성을 유지하기 위해 최소의 역 돌연변이 또는 복귀 돌연변이를 겪을 수 있다. 본 개시의 인간화 항체는 또한 파지 발현에 의해 CDR 친화도 성숙을 추가로 겪게 되는 인간화 항체를 포함한다.
용어 "네이키드(naked) 항체"는 이종 모듈(예컨대, 세포독성 모듈) 또는 방사성 표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다.
본원에 기재된 "항체의 항원 결합 단편"은 항원 결합 활성을 갖는 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편, 또는 항원에 결합하는 Fv 단편인 scFv 단편을 의미할 수 있다. Fv 단편은 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하지만, 불변 영역은 포함하지 않고, 전체 항원 결합 부위 중 가장 작은 항체 단편을 갖는다. 일반적으로, Fv 항체는 또한 VH 및 VL 도메인 사이에 폴리펩티드 링커를 포함하고, 항원 결합에 필요한 구조를 형성할 수 있다. 2개의 항체 가변 영역은 또한 단일 사슬 항체 또는 단일 사슬 fv(sFv)로도 공지된 상이한 링커를 사용하여 단일 폴리펩티드 사슬 내로 연결될 수 있다.
본원에 개시된 용어 "항원 결합 부위"는 본 개시의 항체 또는 항원 결합 단편에 의해 인식되는 항원 상의 연속적 또는 불연속적인 3차원 공간 부위를 의미한다.
"ADCC", 즉, 본원에 기재된 항체 의존성 세포 매개 세포독성은 Fc 수용체 발현 세포가 항체의 Fc 분절을 인식함으로써 항체 코팅된 표적 세포를 직접적으로 사멸시키는 것을 의미한다. 항체의 ADCC 효과기(effector) 기능은 IgG의 Fc 분절의 변형에 의해 감소되거나 제거될 수 있다. 변형은 항체의 중쇄 불변 영역에서의 돌연변이, 예컨대, IgG1의 N297A, L234A 및 L235A; IgG2/4 키메라, 및 IgG4의 F234A/L235A로 이루어진 군으로부터 선택되는 돌연변이를 지칭한다.
본원에 기재된 돌연변이체 서열의 "돌연변이"는 "역 돌연변이", "보존적 변형" 또는 "보존적 대체 또는 치환"을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. “보존적 변형" 또는 "보존적 대체 또는 치환"은 단백질의 생물학적 활성을 바꾸지 않으면서 흔하게 변화를 주기 위해 단백질의 아미노산을 유사한 특성(예컨대, 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 또는 골격 사슬 형태 및 강성)을 갖는 다른 아미노산으로 대체하는 것을 지칭한다. 당업자는 일반적으로 말해서 폴리펩티드의 비필수 영역에서 단일 아미노산 대체가 생물학적 활성을 실질적으로 변화시키지 않는다는 것을 알고 있다(예컨대, Watson 외 (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p224, (4판)을 참조). 또한, 유사한 구조 또는 기능을 가진 아미노산의 교체는 생물학적 활성을 방해할 가능성이 없다.
본원에 기재된 "돌연변이체 서열"은 대체, 삽입 또는 결실과 같은 돌연변이 변형이 본 개시의 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열에 적절하게 이루어질 때 본 개시의 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열에 대해 상이한 정도의 백분율 서열 일치도를 갖는 뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열을 지칭한다. 본원에 기재된 서열 일치도는 적어도 85%, 90% 또는 95%, 바람직하게는 적어도 95%일 수 있다. 비제한적 예는 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 및 100%를 포함한다. 서열의 비교 및 두 서열 간의 백분율 일치도의 결정은 국립 생명공학연구 센터(National Center for Biotechnology Institute)의 웹사이트에서 입수 가능한 BLASTN/BLASTP 알고리즘의 기본 설정치를 이용하여 실시할 수 있다.
"링커 단위" 또는 "링커 단편"이라는 용어는 한쪽 말단에서는 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 연결되고 다른 쪽 말단에서는 약물에 연결되고, 또한 다른 링커에 연결된 후 항체 또는 약물에 연결될 수 있는 화학 구조 단편 또는 결합을 말한다. 본 개시의 바람직한 구현예에서, 이들은 L 및 L1 내지 L4로 표시되며, 여기서 L1 말단은 항체에 연결되고, L4 말단은 구조 단위 Y에 연결된 다음, 화합물 또는 독소에 연결된다.
링커는 스트레처(stretcher) 단위, 스페이서 단위 및 아미노산 단위를 포함하고, US2005-0238649A1에 기재된 것과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 링커는 세포에서 약물의 방출을 선호하는 "절단 가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산 불안정한 링커(예컨대, 히드라존), 프로테아제 민감성(예컨대, 펩티다제 민감성) 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 이황화물 함유 링커를 사용할 수 있다(Chari et al., Cancer Research 52: 127-131(1992); U.S. Patent No. 5,208,020).
본 개시의 조작된 항체 또는 항원 결합 단편은 통상적인 방법을 사용하여 제조 및 정제할 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 부호화하는 cDNA 서열은 클로닝되어 GS 발현 벡터로 재조합할 수 있다. 재조합 면역글로불린 발현 벡터는 CHO 세포에 안정적으로 형질감염될 수 있다. 보다 권장되는 선행 기술로서, 포유동물 발현 시스템은 특히 Fc 영역의 고도로 보존된 N 말단 부위에서 항체의 글리코실화를 유발할 수 있다. 양성 클론은 생물반응기의 무혈청 배지에서 확장되어 항체를 생성한다. 분비된 항체를 갖는 배양물은 통상적인 기술을 사용하여 정제할 수 있다. 예를 들어, 정제는 조정된 완충제를 함유하는 A 또는 G 세파로오스(Sepharose) FF 컬럼에서 실시한다. 비특이적으로 결합된 분획을 세척한다. 결합된 항체는 pH 구배법을 사용하여 용출하고, 항체 단편은 SDS-PAGE를 사용하여 검출하고 수집한다. 항체는 통상적인 방법을 사용하여 여과 및 농축할 수 있다. 가용성 혼합물 및 중합체는 또한 분자체 및 이온 교환과 같은 기존 방법을 사용하여 제거할 수 있다. 결과로서 생성된 생성물은, 예컨대 -70℃에서 즉시 동결되거나 동결건조되어야 한다.
용어 "알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 기, 바람직하게는 1 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 알킬, 더 바람직하게는 1 내지 10개의 탄소 원자를 함유하는 알킬, 및 가장 바람직하게는 1~6개의 탄소 원자를 함유하는 알킬인 포화 지방족 탄화수소기를 지칭한다. 알킬의 비제한적인 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, sec-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 2,2-디메틸프로필, 1-에틸프로필, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, n-헥실, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2-에틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2,3-디메틸부틸, n-헵틸, 2-메틸헥실, 3-메틸헥실, 4-메틸헥실, 5-메틸헥실, 2,3-디메틸펜틸, 2,4-디메틸펜틸, 2,2-디메틸펜틸, 3,3-디메틸펜틸, 2-에틸펜틸, 3-에틸펜틸, n-옥틸, 2,3-디메틸헥실, 2,4-디메틸헥실, 2,5-디메틸헥실, 2,2-디메틸헥실, 3,3-디메틸헥실, 4,4-디메틸헥실, 2-에틸헥실, 3-에틸헥실, 4-에틸헥실, 2-메틸-2-에틸펜틸, 2-메틸-3-에틸펜틸, n-노닐, 2-메틸-2-에틸헥실, 2-메틸-3-에틸헥실, 2,2-디에틸펜틸, n-데실, 3,3-디에틸헥실, 2,2-디에틸헥실, 이의 다양한 분지형 이성질체 등을 포함한다. 더 바람직한 것은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 저급 알킬이며, 비제한적인 예는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, tert-부틸, sec-부틸, n-펜틸, 1,1-디메틸프로필, 1,2-디메틸프로필, 2,2-디메틸프로필, 1-에틸프로필, 2-메틸부틸, 3-메틸부틸, n-헥실, 1-에틸-2-메틸프로필, 1,1,2-트리메틸프로필, 1,1-디메틸부틸, 1,2-디메틸부틸, 2,2-디메틸부틸, 1,3-디메틸부틸, 2-에틸부틸, 2-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 4-메틸펜틸, 2,3-디메틸부틸 등을 포함한다. 알킬은 치환 또는 비치환될 수 있다. 치환되는 경우, 치환기는 임의의 이용 가능한 연결 부위에서 치환될 수 있으며, 여기서 치환기는 바람직하게는 하기의 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 메르캅토, 히드록시, 니트로, 시아노, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알콕시, 헤테로시클로알콕시, 시클로알킬티오, 헤테로시클로알킬티오 및 옥소로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 기 중 하나 이상이다.
용어 "헤테로알킬"은 N, O 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 헤테로원자를 함유하는 알킬을 지칭하며, 여기서 알킬은 위에서 정의된 바와 같다.
용어 "알킬렌"은 동일한 탄소 원자 또는 2개의 상이한 탄소 원자로부터 2개의 수소 원자를 제거함으로써 모 알칸으로부터 유도된 잔기를 갖는 포화 선형 또는 분지형 지방족 탄화수소 기를 지칭한다. 1 내지 20개의 탄소 원자를 함유하는 선형 또는 분지형 기, 바람직하게는 1 내지 12개의 탄소 원자를 함유하는 알킬렌, 더 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자를 함유하는 알킬렌이다. 알킬렌의 비제한적인 예는 메틸렌(-CH2-), 1,1-에틸리덴(-CH(CH3)-), 1,2-에틸리덴(-CH2CH2)-, 1,1-프로필리덴(-CH(CH2CH3)-), 1,2-프로필리덴(-CH2CH(CH3)-), 1,3-프로필리덴(-CH2CH2CH2-), 1,4-부틸리덴(-CH2CH2CH2CH2-), 1,5-부틸리덴(-CH2CH2CH2CH2CH2-) 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 알킬렌은 치환되거나 치환되지 않을 수 있다. 치환되는 경우, 치환기는 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 메르캅토, 히드록시, 니트로, 시아노, 시클로알킬, 헤테로시클릴, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알콕시, 헤테로시클로알콕시, 시클로알킬티오, 헤테로시클로알킬티오 및 옥소로 이루어진 군으로부터 바람직하게는 독립적으로 선택적으로 선택된 하나 이상의 치환기로 임의의 이용 가능한 연결 부위에서 치환될 수 있다.
용어 "알콕시"는 -O-(알킬) 및 -O-(비치환된 시클로알킬)을 나타내며, 여기서 알킬 또는 시클로알킬은 위에서 정의된 바와 같다. 알콕시의 비제한적인 예는: 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 시클로프로필옥시, 시클로부톡시, 시클로펜틸옥시 및 시클로헥실옥시를 포함한다. 알콕시는 선택적으로 치환 또는 비치환될 수 있고,
치환되는 경우, 치환기는 바람직하게는 하기의 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 메르캅토, 히드록시, 니트로, 시아노, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알콕시, 헤테로시클로알콕시, 시클로알킬티오 및 헤테로시클로알킬티오로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 기 중 하나 이상이다.
용어 "시클로알킬"은 포화되거나 부분적으로 불포화된 단환식 또는 다환식 탄화수소 치환기를 지칭한다. 시클로알킬 고리는 3 내지 20개의 탄소 원자, 바람직하게는 3 내지 12개의 탄소 원자, 더 바람직하게는 3 내지 10개의 탄소 원자, 및 가장 바람직하게는 3 내지 7개의 탄소 원자를 함유한다. 단환식 시클로알킬의 비제한적인 예는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로펜테닐, 시클로헥실, 시클로헥세닐, 시클로헥사디에닐, 시클로헵틸, 시클로헵타트리에닐, 시클로옥틸 등을 포함한다. 다환식 시이클로알킬은 스피로 시클로알킬, 융합된 시클로알킬 및 가교된 시클로알킬을 포함한다.
용어 "헤테로시클릴"은 3 내지 20개의 고리 원자를 함유하는 포화 또는 부분 불포화 단환식 또는 다환식 탄화수소 치환기를 나타내며, 여기서 하나 이상의 고리 원자는 -O-O-, -O-S- 또는 -S-S-의 고리 부분을 제외한 질소, 산소 및 S(O)m(여기서, m은 0 내지 2의 정수임)으로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자이고, 나머지 고리 원자는 탄소 원자이다. 헤테로시클로알킬은 바람직하게는 3 내지 12개의 고리 원자를 함유하고, 그 중 1 내지 4개는 헤테로원자이고; 더 바람직하게는, 시클로알킬 고리는 3 내지 10개의 고리 원자를 함유한다. 단환식 헤테로시클릴의 비제한적인 예는 피롤리디닐, 피페리디닐, 피페라지닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 호모피페라지닐 등을 포함한다. 다환식 헤테로시클릴의 비제한적인 예는 스피로 헤테로시클릴, 융합된 헤테로시클릴, 및 가교된 헤테로시클릴을 포함한다.
용어 "스피로 헤테로시클릴"은 단환식 고리가 1개의 원자를 공유하는 5 내지 20원 다환식 헤테로시클릴기(스피로 원자라 함)를 나타내며, 여기서 하나 이상의 고리 원자는 질소, 산소 및 S(O)m(여기서, m은 0 내지 2의 정수임)으로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자이고, 나머지 고리 원자는 탄소 원자이다. 이 고리는 하나 이상의 이중 결합을 함유할 수 있지만, 그 중 어느 것도 완전히 공액된 π-전자계를 가지지 않는다. 바람직하게는, 스피로 헤테로시클릴은 6 내지 14원, 및 더 바람직하게는 7 내지 10원이다. 고리 사이에 공유되는 스피로 원자의 수에 따라, 스피로 헤테로시클릴은 모노스피로 헤테로시클릴, 비스피로 헤테로시클릴 또는 폴리스피로 헤테로시클릴, 바람직하게는 모노스피로 헤테로시클릴 및 비스피로 헤테로시클릴, 및 더 바람직하게는 4원/4원, 4원/5원, 4원/6원, 5원/5원 또는 5원/6원 모노스피로 헤테로시클릴일 수 있다. 스피로 헤테로시클릴의 비제한적인 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00028
용어 "융합된 헤테로시클릴"은 각 고리가 시스템의 다른 고리와 한 쌍의 인접한 원자를 공유하는 5 내지 20원 다환식 헤테로시클릴기를 나타내며, 여기서 하나 이상의 고리는 하나 이상의 이중 결합을 함유할 수 있지만, 그 중 어느 것도 완전히 공액된 π-전자계를 가지지 않으며, 여기서 하나 이상의 고리 원자는 질소, 산소 및 S(O)m(여기서, m은 0 내지 2의 정수임)으로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자이고, 나머지 고리 원자는 탄소 원자이다. 바람직하게는, 융합된 헤테로시클릴은 6 내지 14원, 더 바람직하게는 7 내지 10원이다. 융합된 헤테로시클릴은 형성된 고리의 수에 따라 쌍환, 삼환, 사환 또는 다환식 융합된 헤테로시클릴, 바람직하게는 쌍환 또는 삼환 융합된 헤테로시클릴, 더 바람직하게는 5원/5원 또는 5원/6원 쌍환 융합된 헤테로시클릴일 수 있다. 융합된 헤테로시클릴의 비제한적인 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00029
용어 "가교된 헤테로시클릴"은 2개의 고리는 서로 직접 연결되지 않은 2개의 원자를 공유하는 5 내지 14원 다환식 헤테로시클릴기를 나타내며, 여기서 이들 고리는 하나 이상의 이중 결합을 함유할 수 있지만, 그 중 어느 것도 완전히 공액된 π-전자계를 가지지 않으며, 여기서 하나 이상의 고리 원자는 질소, 산소 및 S(O)m(여기서, m은 0 내지 2의 정수임)으로 이루어진 군으로부터 선택된 헤테로원자이고, 나머지 고리 원자는 탄소 원자이다. 바람직하게는, 가교된 헤테로시클릴은 6 내지 14원, 더 바람직하게는 7 내지 10원이다. 가교된 헤테로시클릴은 형성된 고리의 수에 따라 쌍환, 삼환, 사환 또는 다환식 가교된 헤테로시클릴, 바람직하게는 쌍환, 삼환 또는 사환식 가교된 헤테로시클릴, 더 바람직하게는 쌍환 또는 삼환식 가교된 헤테로시클릴일 수 있다. 가교된 헤테로시클릴의 비제한적인 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00030
헤테로시클릴 고리는 아릴, 헤테로아릴 또는 시클로알킬 고리에 융합될 수 있으며, 여기서 모 구조에 연결된 고리는 헤테로시클릴이다. 헤테로시클릴의 비제한적인 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00031
헤테로시클릴은 선택적으로 치환 또는 비치환될 수 있고, 치환되는 경우, 치환기는 바람직하게는 하기의 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 메르캅토, 히드록시, 니트로, 시아노, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알콕시, 헤테로시클로알콕시, 시클로알킬티오, 헤테로시클로알킬티오 및 옥소로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 기 중 하나 이상이다.
용어 "아릴"은 페닐 및 나프틸, 바람직하게는 페닐과 같은 공액된 π-전자계를 갖는 6 내지 14원, 바람직하게는 6 내지 10원, 탄소 단환식 또는 융합된 다환식(즉, 한 쌍의 인접한 탄소 원자를 공유하는 고리) 기를 지칭한다. 아릴 고리는 헤테로아릴, 헤테로시클릴 또는 시클로알킬 고리에 융합될 수 있으며, 여기서 모 구조에 연결된 고리는 아릴 고리이다. 아릴의 비제한적인 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00032
아릴은 치환 또는 비치환될 수 있고,
치환되는 경우, 치환기는 바람직하게는 하기의 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 메르캅토, 히드록시, 니트로, 시아노, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알콕시, 헤테로시클로알콕시, 시클로알킬티오 및 헤테로시클로알킬티오로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 기 중 하나 이상이다.
용어 "헤테로아릴"은 1 내지 4개의 헤테로원자 및 5 내지 14개의 고리 원자를 함유하는 헤테로방향족 시스템을 지칭하며, 여기서 헤테로원자는 산소, 황 및 질소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 헤테로아릴은 바람직하게는 5 내지 10원, 더 바람직하게는 5 또는 6원, 예컨대, 푸라닐, 티에닐, 피리디닐, 피롤릴, N-알킬피롤릴, 피리미디닐, 피라지닐, 이미다졸릴 및 테트라졸릴이다. 헤테로아릴 고리는 아릴, 헤테로시클릴 또는 시클로알킬 고리에 융합될 수 있으며, 여기서 모 구조에 연결된 고리는 헤테로아릴 고리이다. 헤테로아릴의 비제한적인 예는 하기를 포함한다:
Figure pct00033
헤테로아릴은 선택적으로 치환 또는 비치환될 수 있고,
치환되는 경우, 치환기는 바람직하게는 하기의 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 알킬티오, 알킬아미노, 할로겐, 메르캅토, 히드록시, 니트로, 시아노, 시클로알킬, 헤테로시클로알킬, 아릴, 헤테로아릴, 시클로알콕시, 헤테로시클로알콕시, 시클로알킬티오 및 헤테로시클로알킬티오로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 기 중 하나 이상이다.
"아미노 보호기"라는 용어는 쉽게 제거될 수 있는 기를 말하며, 분자 내 다른 곳에서 반응이 일어날 때 아미노기가 변하는 것을 보호하기 위한 것이다. 아미노 보호기의 비제한적인 예는 9-플루오레닐메톡시카르보닐, tert-부톡시카르보닐, 아세틸, 벤질, 알릴, p-메톡시벤질 등을 포함한다. 이들 기는 할로겐, 알콕시 및 니트로로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다. 아미노 보호기는 바람직하게는 9-플루오레닐메톡시카르보닐이다.
용어 "시클로알킬알킬"은 하나 이상의 시클로알킬기, 바람직하게는 하나의 시클로알킬기로 치환된 알킬을 지칭하고, 여기서 알킬은 위에서 정의된 바와 같고, 시클로알킬은 위에서 정의된 바와 같다.
용어 "할로알킬"은 하나 이상의 할로겐으로 치환된 알킬을 지칭하고, 여기서 알킬은 위에서 정의된 바와 같다.
용어 "중수소화 알킬"은 하나 이상의 중수소 원자로 치환된 알킬을 지칭하고, 여기서 알킬은 위에서 정의된 바와 같다.
용어 "히드록시"는 -OH 기를 지칭한다.
용어 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드를 지칭한다.
용어 "아미노"는 -NH2를 지칭한다.
용어 "니트로"는 -NO2를 지칭한다.
“선택적" 또는 "선택적으로"라는 용어는 이후에 설명되는 사건 또는 상황이 발생할 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니며, 설명이 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는 경우를 포함함을 의미한다. 예를 들어, "선택적으로 1~3개의 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는"은 특정 서열의 항체 중쇄 가변 영역이 존재할 수 있지만, 반드시 그런 것은 아님을 의미한다.
용어 "치환된"은 기 내의 1개 이상, 바람직하게는 5개 이하, 더 바람직하게는 1 내지 3개의 수소 원자가 상응하는 수의 치환기로 독립적으로 치환됨을 의미한다. 물론, 치환기는 가능한 화학적 위치에만 있고, 당업자는 과도한 노력 없이 (실험적으로 또는 이론적으로) 가능한 또는 불가능한 치환을 결정할 수 있을 것이다. 예를 들어, 자유 수소를 갖는 아미노 또는 히드록시가 불포화(예컨대, 올레핀) 결합을 갖는 탄소 원자에 결합되는 경우 불안정할 수 있다.
"약물 로딩"이라는 용어는 항체 약물 접합체 분자에서 각 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 로딩되는 세포독성 약물의 평균 수를 말하며, 또한 항체의 수에 대한 약물의 수의 비율로 나타낼 수 있다. 약물 로딩은 각 항체 또는 이의 항원 결합 단편(Pc)에 연결되는 0~12, 바람직하게는 1~10, 더 바람직하게는 3~8, 및 가장 바람직하게는 5.3~6.1개의 세포독성 약물의 범위일 수 있다. 본 개시의 구현예에서, 약물 로딩은 n으로 표시되며, DAR(약물-항체 비율) 값이라고도 지칭하며, 예시적으로, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 평균일 수 있다. 커플링 반응 시 ADC 분자당 평균 약물의 수는 UV/가시광선 분광법(UV-Vis), 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 질량 분광법, ELISA 분석 및 HPLC와 같은 통상적인 방법으로 특성화할 수 있다.
세포독성 약물의 로딩은 하기의 단계를 포함하는 하기와 같은 비제한적인 방법을 사용하여 제어할 수 있다:
(1) 단일클론 항체에 대한 연결 시약의 몰비를 조절하는 단계,
(2) 반응 시간 및 온도를 제어하는 단계, 및
(3) 상이한 시약을 선택하는 단계.
통상적인 약학 조성물의 제조에 대해서는, 중국 약전(Chinese Pharmacopoeia)을 참조한다.
본 개시의 약물에 대한 "담체"라는 용어는 약물이 인체에 들어가는 방식 및 인체 내 약물의 분포를 변경하고, 약물의 방출 속도를 제어하며, 표적 기관에 약물을 전달하는 시스템을 지칭한다. 약물 담체의 방출 및 표적 시스템은 약물 분해 및 손실을 줄이고, 부작용을 줄이며, 생체 이용률을 향상시킬 수 있다. 예를 들어, 담체로 사용할 수 있는 고분자 계면활성제는 이의 고유한 양친매성 구조로 인해 자가 조립되어 바람직한 예로서 미셀, 마이크로에멀젼, 겔, 액정 및 소포와 같은 다양한 형태의 응집체를 형성할 수 있다. 응집체는 약물 분자를 캡슐화하는 능력이 있고 막에 대한 투과성이 우수하여 우수한 약물 담체로 사용할 수 있다.
"제공하는" 및 "치료하는"은 동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체에 적용될 때 외인성 약물, 치료제, 진단제 또는 조성물을 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 기관 또는 생물학적 유체와 접촉시키는 것을 지칭한다. “제공하는" 및 "치료하는"은, 예를 들어, 치료 방법, 약동학적 방법, 진단 방법, 연구 방법 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 치료는 시약을 세포와 접촉시키는 것 및 시약을 유체와 접촉시키는 것을 포함한다. "제공하는" 및 "치료하는"은 또한, 예컨대, 세포를 시약, 진단, 결합 조성물에 의해, 또는 시험관내 및 생체외에서 다른 세포에 의해 치료하는 것을 지칭한다. "치료하는"은 인간, 동물 또는 연구 대상체에 적용될 때 치료법, 예방 또는 예방 조치, 및 연구 및 진단 적용을 지칭한다.
"치료하는" 또는 "치료"는 치료제, 예컨대, 치료제가 치료 효과를 갖는 것으로 공지된 하나 이상의 질병 증상을 가진 환자에게 내부적으로 또는 외부적으로 본 개시의 결합 조성물 중 임의의 하나를 포함한 조성물을 투여하는 것을 지칭한다. 전형적으로, 치료제는 치료 받는 대상체 또는 집단에서 질병의 하나 이상의 증상을 완화하여 이러한 증상의 퇴행을 유도하거나 또는 이러한 증상의 발달을 임의의 임상적으로 측정가능한 정도로 억제하는데 효과적인 양으로 투여된다. 임의의 특정 질병의 증상을 완화시키는 데 효과적인 치료제의 양("치료적 유효량"이라고도 함)은 환자의 질병 상태, 연령 및 체중, 및 환자에게서 원하는 치료 효과를 생성하는 약물의 능력과 같은 다양한 요인에 따라 가변될 수 있다. 질병의 증상이 완화되었는지 여부는 증상의 중증도 또는 진행을 평가하기 위해 의사 또는 기타 의료 전문가가 일반적으로 사용하는 임의의 임상 시험법을 사용하여 평가할 수 있다. 본 개시의 구현예(예를 들어, 치료 방법 또는 생성물)는 각각의 관심이 되는 질병의 증상을 완화하는 데 효과적이지 않을 수 있지만, 이들 구현예는 당업계에 공지된 임의의 통계적 시험 방법, 예컨대 스튜던트 t-검정(Student's t-test), 카이-제곱 검정(chi-square test), 만 휘트니(Mann and Whitney)에 의한 U-검정, 크러스칼-왈리스(Kruskal-Wallis) 검정(H 검정), 존키어-테르프스트라(Jonckheere-Terpstra) 검정 및 윌콕슨(Wilcoxon) 검정에 의해 결정된 바와 같은 통계적으로 유의한 수의 환자에게서 관심 질병의 증상을 감소시켜야 한다.
"유효량"은 의학적 질병의 증상 또는 병태를 개선하거나 예방하기에 충분한 양을 포함한다. 유효량은 또한 진단을 허용하거나 용이하게 하기에 충분한 양을 의미한다. 특정 환자 또는 동물 대상체에 대한 유효량은 치료할 병태, 환자의 일반적인 건강, 투여 방법 및 경로 및 투여량, 부작용의 중증도와 같은 요인에 따라 가변될 수 있다. 유효량은 심각한 부작용 또는 독성 효과를 피하기 위한 최대 용량 또는 투여 요법일 수 있다.
"교환"은 항체 단백질을 가용화하는 용매 시스템의 교환을 의미한다. 예를 들어, 항체 단백질을 포함하는 고염 또는 고장성 용매계는 물리적 조작에 의해 안정한 제제의 완충계와 교환되어, 항체 단백질이 안정한 제제 내에 존재하도록 한다. 물리적 조작은 한외여과, 투석 또는 원심분리 후 재구성을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
도 1a는 본 개시의 ADC-19에 대한 혈장 안정성 시험의 결과를 도시한다.
도 1b는 본 개시의 ADC-18에 대한 혈장 안정성 시험의 결과를 도시한다.
도 1c는 본 개시의 ADC-20에 대한 혈장 안정성 시험의 결과를 도시한다.
도 2는 JIMT-1 종양 보유 마우스에 대한 본 개시의 ADC-21 및 ADC-24의 효능에 대한 평가를 도시한다.
도 3은 인간 유방암 세포 SK-BR-3 이종이식 종양 누드 마우스에 대한 ADC의 치료 효과에 대한 평가를 도시한다.
도 4는 본 개시의 ADC-25에 대한 혈장 안정성 시험의 결과를 도시한다.
도 5는 인간 뇌 성상세포종 U87MG 누드 마우스 이종이식 종양에 대한 본 개시의 ADC의 효능을 도시한다.
도 6은 흉막 삼출 전이성 인간 인두암 세포 디트로이트(Detroit) 562 누드 마우스 이종이식 종양에 대한 본 개시의 ADC의 효능을 도시한다.
도 7는 인간 뇌 교모세포종 U87MG 누드 마우스 이종이식 종양에 대한 본 개시의 ADC의 효능을 도시한다.
도 8은 PS80이 10-4 g/mL 단위이고, ADC-32 단백질 농도(네이키드 항체 기준)가 mg/mL 단위인 식 선별검사 실험에 대한 맞춤 추세(fitted tendency) 그래프를 나타낸다.
본 개시는 실시예를 참조하여 하기에 추가로 설명되지만, 본 개시의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 특정 조건이 명시되지 않은 본 개시의 실시예에서의 실험 방법은, 예를 들어, 콜드 스프링 하버 연구소(Cold Spring Harbor Laboratory)의 Antibodies: A Laboratory Manual and Molecular Cloning: A Laboratory Manual을 참조하는 일반적으로 통상적인 조건하에서, 또는 원료나 상품의 제조업체가 권장하는 조건하에서 실시한다. 특정 출처가 표시되지 않은 시약은 시중에서 입수 가능한 통상적인 시약이다.
I. 항체 약물 접합체
화합물의 구조는 핵자기 공명(NMR) 또는 질량 분석(MS)에 의해 결정하였다. NMR 스펙트럼은 부르커(Bruker) AVANCE-400 핵자기 공명 기기를 통해 중수소화 디메틸 설폭사이드(DMSO-d6), 중수소화 클로로포름(CDCl3) 및 중수소화 메탄올(CD3OD)을 측정 용매로 사용하고 테트라메틸실란(TMS)을 내부 표준으로 사용하여 측정하였다. 화학적 이동은 10-6(ppm) 단위로 제공되었다.
MS 분석은 FINNIGAN LCQAd(ESI) 질량 분석기를 사용하여 실시하였다(제조업체: 써모(Thermo), 모델: 피니간(Finnigan) LCQ 어드밴티지(advantage) MAX).
UPLC 분석은 워터스(Waters) ACQUITY UPLC SQD 액체 크로마토그래피-질량 분석 시스템을 사용하여 실시하였다.
HPLC 분석은 애질런트(Agilent) 1200DAD 고압 액체 크로마토그래프(선파이어(Sunfire) C18 150 × 4.6 mm 크로마토그래피 컬럼) 및 워터스 2695-2996 고압 액체 크로마토그래프(지미니(Gimini) C18 150 × 4.6 mm 크로마토그래피 컬럼)를 사용하여 실시하였다.
UV-HPLC 분석은 써모(Thermo) 나노드롭(nanodrop)2000 자외선 분광 광도계를 사용하여 실시하였다.
증식 억제율 및 IC50 값은 PHERA 스타(star)FS 마이크로플레이트 판독기(BMG, 독일)를 사용하여 결정하였다.
0.15 mm 내지 0.2 mm 규격의 옌타이 황하이(Yantai Huanghai) HSGF254 또는 칭다오(Qingdao) GF254 실리카겔 플레이트를 박막 크로마토그래피(TLC) 분석에 사용하였고 0.4 mm 내지 0.5 mm는 TLC 분리 및 정제에 사용하였다.
200~300 메쉬의 옌타이 황하이 실리카겔은 일반적으로 컬럼 크로마토그래피에서 담체로 사용한다.
본 개시의 공지된 출발 물질은 당업계에 공지된 방법을 사용하거나 이에 따라 합성할 수 있고, 또는 ABCR GmbH & Co.KG, 아크로스 오가닉스(Acros Organnics), 알드리치 케미칼 컴퍼니(Aldrich Chemical Company), 액셀라 켐바이오(Accela ChemBio Inc.), 켐비 화학(Chembee Chemicals) 등에서 구입할 수 있다.
실시예에서, 반응은 달리 언급되지 않는 한 아르곤 분위기 또는 질소 분위기에서 실시하였다.
아르곤 분위기 또는 질소 분위기는 반응 플라스크가 약 1 L의 아르곤 또는 질소를 함유하는 풍선에 연결되어 있음을 의미한다.
수소 분위기는 반응 플라스크가 약 1 L의 수소를 함유하는 풍선에 연결되어 있음을 의미한다.
파르(Parr) 3916EKX 수소화기, 칭란(Qinglan) QL-500 수소화기 또는 HC2-SS 수소화기를 가압 수소화 반응에 사용하였다.
수소화 반응은 일반적으로 3 주기의 진공화 및 수소 퍼지(purge)를 포함한다.
CEM 디스커버(Discover)-S 908860 마이크로파 반응기를 마이크로파 반응에 사용하였다.
실시예에서, 반응에서의 용액은 달리 언급되지 않는 한 수용액을 의미한다.
실시예에서, 반응 온도는 달리 언급되지 않는 한 실온이다.
실온은 20℃ 내지 30℃의 범위에 이르는 최적의 반응 온도이다.
실시예에서, pH 6.5에서 PBS 완충액의 제조: 8.5 g의 KH2PO4, 8.56 g의 K2HPO4·3H2O, 5.85 g의 NaCl 및 1.5 g의 EDTA를 플라스크에 첨가하고, 부피를 2 L로 만들었다. 첨가된 물질을 모두 초음파로 용해시키고, 용액을 진탕으로 잘 혼합하여 원하는 완충액을 수득하였다.
컬럼 크로마토그래피용 용리액 시스템 및 화합물 정제에 사용되는 박층 크로마토그래피용 전개 용매 시스템은 하기를 포함한다: A: 디클로로메탄 및 이소프로판올 시스템, B: 디클로로메탄 및 메탄올 시스템, C: 석유 에테르 및 에틸 아세테이트 시스템. 용매의 부피비는 화합물의 극성에 따라 조절하거나, 또는 소량의 트리에틸아민 및 산성 또는 염기성 시약을 첨가하여 조절하였다.
본 개시의 일부 화합물은 Q-TOF LC/MS에 의해 특성화된다. Q-TOF LC/MS 분석은 애질런트(Agilent) 6530의 정밀 질량 사중극자 비행시간법 질량 분석계 및 애질런트 1290-인피니티(Infinity) 초고성능 액체 크로마토그래피(애질런트 포로쉘(Poroshell) 300SB-C8 5 μm, 2.1 × 75 mm 크로마토그래피 컬럼)를 사용하여 실시였다.
실시예 1-1
N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-1-히드록시시클로프로판-1-카르복사미드 1
Figure pct00034
엑사테칸(Exatecan) 메실레이트 1b(2.0 mg, 3.76 μmol, 특허 출원 "EP0737686A1"에 개시된 바와 같이 제조됨)에 1 mL의 N,N-디메틸포름아미드를 첨가하였다. 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 다음, 한 방울의 트리에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 투명해질 때까지 교반하였다. 반응 혼합물에 1-히드록시시클로프로필카르복실산 1a(1.4 mg, 3.7 μmol, 공지된 방법 "Tetrahedron Letters, 25(12), 1269-72; 1984"를 사용하여 제조됨) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(3.8 mg, 13.7 μmol)을 연속적으로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 0~5℃에서 2시간 동안 교반하고, 5 mL의 물로 중지시키고, 에틸 아세테이트(8 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(5 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 1을 수득하였다(1.6 mg, 82.1% 수율).
MS m/z (ESI): 520.2 [M+1].
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.90-7.84 (m, 1H), 7.80-7.68(m, 1H), 5.80-5.70 (m, 1H), 5.62-5.54 (m, 2H), 5.44-5.32 (m, 2H), 5.28-5.10 (m, 2H), 3.40-3.15 (m, 3H), 2.44 (s, 3H), 2.23 (t, 1H), 2.06-1.75 (m, 2H), 1.68-1.56 (m, 1H), 1.22-1.18 (m, 2H), 1.04-0.98 (m, 2H), 0.89 (t, 3H).
실시예 1-2
(S)-2-시클로프로필-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-2-히드록시아세트아미드 2-A
(R)-2-시클로프로필-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-2-히드록시아세트아미드 2-B
Figure pct00035
화합물 1b(4 mg, 7.53 μmol)에 2 mL의 에탄올 및 0.4 mL의 N,N-디메틸포름아미드를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 다음, 0.3 mL의 N-메틸모르폴린을 적가하였다. 반응 혼합물을 투명해질 때까지 교반하였다. 반응 혼합물에 2-시클로프로필-2-히드록시아세트산 2a(2.3 mg, 19.8 μmol, 특허 출원 "WO2013106717"에 개시된 바와 같이 제조됨), 1-히드록시벤조트리아졸(3 mg, 22.4 μmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(4.3 mg, 22.4 μmol)을 연속적으로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 0~5℃에서 1시간 동안 교반하였다. 얼음물 수조를 제거하고, 반응 혼합물을 30℃로 가열하고, 2시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 조 화합물 2를 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하고(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: 엑스브리지 분취용(XBridge Prep) C18 OBD 5 μm 19 × 250 mm; 이동상: A 물(10 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴, 구배 용출, 유속: 18 mL/분), 상응하는 분획을 수집하고 감압 하에 농축하여 표제 생성물을 수득하였다(2-A: 1.5 mg, 2-B: 1.5 mg).
MS m/z (ESI): 534.0 [M+1].
단일 구성 화합물 2-B(더 짧은 체류 시간):
UPLC 분석: 체류 시간: 1.06분; 순도: 88%(크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1 × 50 mm; 이동상: A 물(5 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.37 (d, 1H), 7.76 (d, 1H), 7.30 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 5.58-5.56 (m, 1H), 5.48 (d, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.32-5.29 (m, 2H), 3.60 (t, 1H), 3.19-3.13 (m, 1H), 2.38 (s, 3H), 2.20-2.14 (m, 1H), 1.98 (q, 2H), 1.87-1.83 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 1.34-1.28 (m, 1H), 0.86 (t, 3H), 0.50-0.39 (m, 4H).
단일 구성 화합물 2-A(더 긴 체류 시간):
UPLC 분석: 체류 시간: 1.10분; 순도: 86%(크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1 × 50 mm; 이동상: A 물(5 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.35 (d, 1H), 7.78 (d, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.52 (s, 1H), 5.58-5.53 (m, 1H), 5.42 (s, 2H), 5.37 (d, 1H), 5.32 (t, 1H), 3.62 (t, 1H), 3.20-3.15 (m, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.25-2.16 (m, 1H), 1.98 (q, 2H), 1.87-1.82 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 1.21-1.14 (m, 1H), 0.87 (t, 3H), 0.47-0.35 (m, 4H).
실시예 1-3
(S)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-3,3,3-트리플루오로-2-히드록시프로피온아미드 3-A
(R)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-3,3,3-트리플루오로-2-히드록시프로피온아미드 3-B
Figure pct00036
화합물 1b(5.0 mg, 9.41 μmol)에 2 mL의 에탄올 및 0.4 mL의 N,N-디메틸포름아미드를 첨가하고, 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 다음, 0.3 mL의 N-메틸모르폴린을 적가하였다. 반응 혼합물을 투명해질 때까지 교반하였다. 반응 혼합물에 3,3,3-트리플루오로-2-히드록시프로피온산 3a(4.1 mg, 28.4 μmol, 알파(Alfa)에 의해 공급됨), 1-히드록시벤조트리아졸(3.8 mg, 28.1 μmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(5.4 mg, 28.2 μmol)을 연속적으로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 0~5℃에서 10분 동안 교반하였다. 얼음물 수조를 제거하고, 반응 혼합물을 30℃로 가열하고, 8시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 조 화합물 3을 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하고(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: 엑스브리지 분취용(XBridge Prep) C18 OBD 5 μm 19 × 250 mm; 이동상: A 물(10 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴, 구배 용출, 유속: 18 mL/분), 상응하는 분획을 수집하고 감압 하에 농축하여 표제 생성물을 수득하였다(1.5 mg, 1.5 mg).
MS m/z (ESI): 561.9 [M+1].
단일 구성 화합물(더 짧은 체류 시간):
UPLC 분석: 체류 시간: 1.11분; 순도: 88%(크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1 × 50 mm; 이동상: A 물(5 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.94 (d, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.32 (s, 1H), 7.20 (d, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.61-5.55 (m, 1H), 5.45-5.23 (m, 3H), 5.15-5.06 (m, 1H), 4.66-4.57 (m, 1H), 3.18-3.12 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.26-2.20 (m, 1H), 2.16-2.08 (m, 1H), 2.02-1.94 (m, 1H), 1.89-1.82 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 0.87 (t, 3H).
단일 구성 화합물(더 긴 체류 시간):
UPLC 분석: 체류 시간: 1.19분; 순도: 90%(크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1 × 50 mm; 이동상: A 물(5 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.97 (d, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.16 (d, 1H), 6.53 (s, 1H), 5.63-5.55 (m, 1H), 5.45-5.20 (m, 3H), 5.16-5.07 (m, 1H), 4.66-4.57 (m, 1H), 3.18-3.12 (m, 1H), 2.40 (s, 3H), 2.22-2.14 (m, 1H), 2.04-1.95 (m, 2H), 1.89-1.82 (m, 1H), 1.50-1.40 (m, 1H), 0.87 (t, 3H).
실시예 1-4
N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-1-히드록시시클로펜탄-1-카르복사미드 4
Figure pct00037
화합물 1b(3.0 mg, 5.64 μmol)에 1 mL의 N,N-디메틸포름아미드를 첨가하였다. 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 다음, 한 방울의 트리에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 투명해질 때까지 교반하였다. 반응 혼합물에 1-히드록시-시클로펜탄카르복실산 4a(2.2 mg, 16.9 μmol, 특허 출원 "WO2013106717"에 개시된 바와 같이 제조됨) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(4.7 mg, 16.9 μmol)을 연속적으로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 0~5℃에서 1시간 동안 교반하고, 5 mL의 물로 중지시키고, 에틸 아세테이트(10 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(5 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 4를 수득하였다(2.5 mg, 80.9% 수율).
MS m/z (ESI): 548.0 [M+1].
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.73-7.62 (m, 2H), 5.75-5.62 (m, 1H), 5.46-5.32 (m, 2H), 5.26-5.10 (m, 1H), 3.30-3.10 (m, 1H), 2.43 (s, 3H), 2.28-2.20 (m, 2H), 2.08-1.84 (m, 8H), 1.69-1.58 (m, 2H), 1.04-1.00 (m, 2H), 0.89 (t, 3H).
실시예 1-5
N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-1-(히드록시메틸)시클로프로판-1-카르복사미드 5
Figure pct00038
화합물 1b(2.0 mg, 3.76 μmol)에 1 mL의 N,N-디메틸포름아미드를 첨가하였다. 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 다음, 한 방울의 트리에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 투명해질 때까지 교반하였다. 반응 혼합물에 1-(히드록시메틸)-시클로펜탄카르복실산 5a(0.87 mg, 7.5 μmol, 특허 출원 "WO201396771"에 개시된 바와 같이 제조됨) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(2 mg, 7.24 μmol)을 연속적으로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 0~5℃에서 2시간 동안 교반하고, 5 mL의 물로 중지시키고, 에틸 아세테이트(8 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(5 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 5를 수득하였다(1.0 mg, 50% 수율).
MS m/z (ESI): 533.9 [M+1].
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.07 (s, 1H), 7.23-7.18 (m, 2H), 6.71-6.64 (m, 1H), 6.55-6.51 (m, 1H), 5.36-5.27 (m, 2H), 4.67-4.61 (m, 2H), 3.53-3.48 (m, 1H), 3.30-3.22 (m, 2H), 3.18-3.13 (m, 1H), 2.71-2.61 (m, 2H), 2.35-2.28 (m, 1H), 2.04-1.91 (m, 4H), 1.53-1.40 (m, 3H), 0.91-0.75 (m, 4H).
실시예 1-6
N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-1-(히드록시메틸)시클로부탄-1-카르복사미드 6
Figure pct00039
화합물 1b(3.0 mg, 5.64 μmol)에 1 mL의 N,N-디메틸포름아미드를 첨가하였다. 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 다음, 한 방울의 트리에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 투명해질 때까지 교반하였다. 반응 혼합물에 1-(히드록시메틸)시클로부탄-1-카르복실산 6a(2.2 mg, 16.9 μmol, "Journal of the American Chemical Society, 2014, vol.136, #22, p.8138-8142”에 개시된 바와 같이 제조됨) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(4.7 mg, 16.9 μmol)을 연속적으로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 0~5℃에서 1시간 동안 교반하고, 5 mL의 물로 중지시키고, 에틸 아세테이트(10 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(5 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 6을 수득하였다(2.1 mg, 67.9% 수율).
MS m/z (ESI): 548.0 [M+1].
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 7.85-7.62 (m, 1H), 6.88 (br, 1H), 5.87-5.48 (m, 2H), 5.47-5.33 (m, 1H), 5.31-5.06 (m, 1H), 4.25-3.91 (m, 2H), 3.25 (br, 1H), 2.60-2.32 (m, 3H), 2.23 (t, 1H), 2.15-1.95 (m, 3H), 1.70-1.56 (m, 2H), 1.41-1.17 (m, 9H), 1.03 (s, 1H), 0.95-0.80 (m, 2H).
실시예 1-7
N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-1-히드록시시클로부탄-1-카르복사미드 7
Figure pct00040
화합물 1b(3.0 mg, 5.64 μmol)에 2 mL의 에탄올 및 0.4 mL의 N,N-디메틸포름아미드를 첨가하고, 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 다음, 0.3 mL의 N-메틸모르폴린을 적가하였다. 반응 혼합물을 투명해질 때까지 교반하였다. 반응 혼합물에 1-히드록시시클로부탄카르복실산 7a(2.0 mg, 17.22 μmol, 파마블록(PharmaBlock)에 의해 공급됨), 1-히드록시벤조트리아졸(2.3 mg, 17.0 μmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(3.2 mg, 16.7 μmol)을 연속적으로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 0~5℃에서 10분 동안 교반하였다. 얼음물 수조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축시켰다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 7을 수득하였다(2.5 mg, 83.1% 수율).
MS m/z (ESI): 534.0 [M+1].
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.28 (d, 1H), 7.75 (d, 1H), 7.29 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 6.12 (s, 1H), 5.59-5.51 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.20-5.01 (m, 2H), 3.27-3.17 (m, 1H), 3.15-3.05 (m, 1H), 2.71-2.63 (m, 1H), 2.37 (s, 3H), 2.12-2.05 (m, 1H), 2.03-1.94 (m, 2H), 1.92-1.78 (m, 4H), 1.50-1.42 (m, 1H), 0.90-0.83 (m, 4H).
실시예 1-8
1-(((S)-7-벤질-20-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-3,6,9,12,15-펜타옥소-2,5,8,11,14-펜타자에이코실)옥시)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로프로판-1-카르복사미드 8
Figure pct00041
단계 1
벤질 1-((2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)아세틸아미노)메톡시)시클로프로판-1-카르복실레이트 8c
벤질 1-히드록시시클로프로판-1-카복실레이트 8a(104 mg, 0.54 mmol; 특허 출원 "US2005/20645"에 개시된 바와 같이 제조됨) 및 2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)아세틸아미노)메틸 아세테이트 8b(100 mg, 0.27 mmol; 특허 출원 "CN105829346A"에 개시된 바와 같이 제조됨)를 반응 플라스크에 첨가하고, 5 mL의 테트라히드로푸란을 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 다음, 칼륨 tert-부톡시드(61 mg, 0.54 mmol)를 첨가하였다. 얼음 수조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 10분 동안 교반한 후, 얼음물 20 mL를 첨가하고 에틸 아세테이트(5 mL x 2) 및 클로로포름(5 mL x 5)으로 추출하였다. 유기상을 취합하고 농축하였다. 생성된 잔류물을 3 mL의 1,4-디옥산에 용해시키고, 0.6 mL의 물, 중탄산나트륨(27 mg, 0.32 mmol) 및 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트(70 mg, 0.27 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 20 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(8 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 용액(20 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 8c를 수득하였다(100 mg, 73.6% 수율).
MS m/z (ESI): 501.0 [M+1].
Step 2
1-((2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)아세틸아미노)메톡시)시클로프로판-1-카르복실산 8d
화합물 8c(50 mg, 0.10 mmol)를 테트라히드로푸란 및 에틸 아세테이트(V:V = 2:1)의 용매 혼합물 3 mL에 용해시키고, 탄소 상의 팔라듐(25 mg, 10% 로딩)을 첨가하였다. 시스템을 수소로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 필터 케이크를 테트라히드로푸란으로 헹구었다. 여액을 농축하여 표제 생성물 8d를 수득하였다(41 mg, 100% 수율).
MS m/z (ESI): 411.0 [M+1].
Step 3
(9H-플루오렌-9-일)메틸(2-(((1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노카르보닐)시클로프로폭시)메틸)아미노)-2-옥소에틸)카르바메이트 8e
화합물 1b(7 mg, 0.013 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, N,N-디메틸포름아미드 1 mL를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 후, 한 방울의 트리에틸아민, 0.5 mL의 N,N-디메틸포름아미드 중 화합물 8d(7 mg, 0.017 mmol)의 용액, 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(7 mg, 0.026 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조에서 35분 동안 교반하였다. 10 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(5 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 용액(10 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 8e를 수득하였다(8.5 mg, 78.0% 수율).
MS m/z (ESI): 828.0 [M+1].
단계 4
1-((2-아미노아세틸아미노)메톡시)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로프로판-1-카르복사미드 8f
화합물 8e(4 mg, 4.84 μmol)를 0.2 mL의 디클로로메탄에 용해시키고 0.1 mL의 디에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축하였다. 2 mL의 톨루엔을 첨가한 후, 감압 하에 농축하고; 절차를 두 번 반복하였다. 잔류물을 3 mL의 n-헥산으로 슬러리화하고, 상부 n-헥산 층을 제거하고; 절차를 세 번 반복하였다. 슬러리를 감압 하에 농축하여 조 표제 생성물 8f(2.9 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
MS m/z (ESI): 606.0 [M+1].
단계 5
1-(((S)-7-벤질-20-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-3,6,9,12,15-펜타옥소-2,5,8,11,14-펜타자에이코실)옥시)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로프로판-1-카르복사미드 8
조 8f(2.9 mg, 4.84 μmol)를 0.5 mL의 N,N-디메틸포름아미드에 용해시켰다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 용액을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각하였다. 0.3 mL의 N,N-디메틸포름아미드 중 (S)-2(-2-(-2-(6-(2,5-디옥소-1H-피롤-1-일)헥산아미도)아세틸아미노)아세틸아미노)-3-페닐프로피온산 8 g(2.7 mg, 5.80 μmol, 특허 출원 "EP2907824"에 개시된 바와 같이 제조됨)의 용액을 첨가한 후, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(2.7 mg, 9.67 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조에서 30분 동안 교반하였다. 그런 다음, 얼음 수조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하여, 15분 동안 교반한 후, 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하였다(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: 엑스브리지 분취용(XBridge Prep) C18 OBD 5 μm 19 × 250 mm; 이동상: A 물(10 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴, 구배 용출, 유속: 18 mL/분). 상응하는 분획을 수집하고 감압 하에 농축하여 표제 생성물 8을 수득하였다(2 mg, 39.0% 수율).
MS m/z (ESI): 1060.0 [M+1].
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 9.01 (d, 1H), 8.77 (t, 1H), 8.21 (t, 1H), 8.08-7.92 (m, 2H), 7.73 (d, 1H), 7.28 (s, 1H), 7.24-7.07 (m, 4H), 6.98 (s, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.61 (q, 1H), 5.40 (s, 2H), 5.32 (t, 1H), 5.12 (q, 2H), 4.62 (t, 1H), 4.52 (t, 1H), 4.40-4.32 (m, 1H), 3.73-3.47 (m, 8H), 3.16-3.04 (m, 2H), 2.89 (dd, 1H), 2.69-2.55 (m, 2H), 2.37-2.23 (m, 4H), 2.12-1.93 (m, 4H), 1.90-1.74 (m, 2H), 1.52-1.38 (m, 4H), 1.33-1.11 (m, 5H), 0.91-0.81 (m, 4H).
실시예 1-9
N-((2R,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사덱-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9-A
N-((2S,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사덱-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9-B
Figure pct00042
Figure pct00043
단계 1
벤질 2-시클로프로필-2-히드록시아세테이트 9a
화합물 2a(1.3 g, 11.2 mmol; 특허 출원 "WO2013/106717"에 개시된 바와 같이 사용하여 제조됨)를 50 mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 탄산칼륨(6.18 g, 44.8 mmol), 벤질 브롬화물(1.33 mL, 11.2 mmol) 및 테트라부틸암모늄 요오드화물(413 mg, 1.1 mmol)을 차례로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하고 셀라이트를 통해 여과하고, 필터 케이크를 에틸 아세테이트(10 mL)로 헹구었다. 여액을 취합하고 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 C를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 9a를 수득하였다(2 g, 86.9% 수율).
단계 2
벤질 10-시클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아자운데칸-11-오에이트 9b
화합물 9a(120.9 mg, 0.586 mmol) 및 8b(180 mg, 0.489 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 테트라히드로푸란 4 mL를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 다음, 칼륨 tert-부톡시드(109 mg, 0.98 mmol)를 첨가하였다. 얼음 수조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 40분 동안 교반한 후, 얼음물 10 mL를 첨가하고 에틸 아세테이트(20 mL x 2) 및 클로로포름(10 mL x 5)으로 추출하였다. 유기상을 취합하고 농축하였다. 생성된 잔류물을 4 mL의 디옥산에 용해시키고, 2 mL의 물, 중탄산나트륨(49.2 mg, 0.586 mmol) 및 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트(126 mg, 0.49 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 20 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(10 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 용액(20 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 C를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 9b를 수득하였다(48 mg, 19% 수율).
MS m/z (ESI): 515.0 [M+1].
단계 3
10-시클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아자운데칸-11-오익산 9c
화합물 9b(20 mg, 0.038 mmol)를 테트라히드로푸란 및 에틸 아세테이트(V:V = 2:1)의 용매 혼합물 4.5 mL에 용해시키고, 탄소 상의 팔라듐(12 mg, 10% 로딩, 건조 기반)을 첨가하였다. 시스템을 수소로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 필터 케이크를 에틸 아세테이트로 헹구었다. 여액을 농축하여 조 표제 생성물 9c(13 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
MS m/z (ESI): 424.9 [M+1].
단계 4
(9H-플루오렌-9-일)메틸(2-(((1-시클로프로필-2-
(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-2-옥소에톡시)메틸)아미노)-2-옥소에틸)카르바메이트 9d
화합물 1b(10 mg, 18.8 μmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, N,N-디메틸포름아미드 1 mL를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 후, 한 방울의 트리에틸아민, 조 9c(13 mg, 30.6 μmol), 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(16.9 mg, 61.2 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조에서 40분 동안 교반하였다. 10 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(10 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(10 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 9d를 수득하였다(19 mg, 73.6% 수율).
MS m/z (ESI): 842.1 [M+1].
단계 5
2-((2-아미노아세틸아미노)메톡시)-2-시클로프로필-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아세트아미드 9e
화합물 9d(19 mg, 22.6 μmol)를 2 mL의 디클로로메탄에 용해시키고 1 mL의 디에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축하였다. 1 mL의 톨루엔을 첨가한 후, 감압 하에 농축하고; 절차를 두 번 반복하였다. 잔류물을 3 mL의 n-헥산으로 슬러리화하고 방치하였다. 그런 다음, 상층액을 제거하고, 고체를 유지하였다. 고체 잔류물을 감압 하에 농축하고 오일 펌프로 건조하여 조 표제 생성물 9e(17 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
MS m/z (ESI): 638.0 [M+18].
단계 6
N-((2R,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사덱-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9-A
N-((2S,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사덱-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 9-B
조 9e(13.9 mg, 22.4 μmol)를 0.6 mL의 N,N-디메틸포름아미드에 용해시켰다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 용액을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각하였다. N,N-디메틸포름아미드 0.3 mL 중 8g(21.2 mg, 44.8 μmol)의 용액을 첨가한 다음, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(18.5 mg, 67.3 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조에서 10분 동안 교반하였다. 그런 다음, 얼음 수조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 1시간 동안 교반하여 화합물 9를 수득하였다. 반응 혼합물을 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하였다(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: 엑스브리지 분취용(XBridge Prep) C18 OBD 5 μm 19 × 250 mm; 이동상: A 물(10 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴, 구배 용출, 유속: 18 mL/분). 상응하는 분획을 수집하고 감압 하에 농축하여 표제 생성물을 수득하였다(9-A: 2.4 mg, 9-B: 1.7 mg).
MS m/z (ESI): 1074.4 [M+1].
단일 구성 화합물 9-A(더 짧은 체류 시간):
UPLC 분석: 체류 시간: 1.14분; 순도: 85%(크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1 × 50 mm; 이동상: A 물(5 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.60 (t, 1H), 8.51-8.49 (d, 1H), 8.32-8.24 (m, 1H), 8.13-8.02 (m, 2H), 8.02-7.96 (m, 1H), 7.82-7.75 (m, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.26-7.15 (m, 4H), 6.99 (s, 1H), 6.55-6.48 (m, 1H), 5.65-5.54 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.35-5.15 (m, 3H), 4.74-4.62 (m, 1H), 4.54-4.40 (m, 2H), 3.76-3.64 (m, 4H), 3.62-3.48 (m, 2H), 3.20-3.07 (m, 2H), 3.04-2.94 (m, 1H), 2.80-2.62 (m, 1H), 2.45-2.30 (m, 3H), 2.25-2.15 (m, 2H), 2.15-2.04 (m, 2H), 1.93-1.78 (m, 2H), 1.52-1.39 (m, 3H), 1.34-1.12 (m, 5H), 0.87 (t, 3H), 0.64-0.38 (m, 4H).
단일 구성 화합물 9-B(더 긴 체류 시간):
UPLC 분석: 체류 시간: 1.16분; 순도: 89%(크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1 × 50 mm; 이동상: A 물(5 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.68-8.60 (m, 1H), 8.58-8.50 (m, 1H), 8.32-8.24 (m, 1H), 8.13-8.02 (m, 2H), 8.02-7.94 (m, 1H), 7.82-7.75 (m, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.26-7.13 (m, 3H), 6.99 (s, 1H), 6.55-6.48 (m, 1H), 5.60-5.50 (m, 1H), 5.41 (s, 2H), 5.35-5.15 (m, 2H), 4.78-4.68 (m, 1H), 4.60-4.40 (m, 2H), 3.76-3.58 (m, 4H), 3.58-3.48 (m, 1H), 3.20-3.10 (m, 2H), 3.08-2.97 (m, 2H), 2.80-2.72 (m, 2H), 2.45-2.30 (m, 3H), 2.25-2.13 (m, 2H), 2.13-2.04 (m, 2H), 2.03-1.94 (m, 2H), 1.91-1.78 (m, 2H), 1.52-1.39 (m, 3H), 1.34-1.12 (m, 4H), 0.91-0.79 (m, 3H), 0.53-0.34 (m, 4H).
실시예 1-10
N-((2S,10S)-10-벤질-2-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노카르보닐)-1,1,1-트리플루오로-6,9,12,15-테트라옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사덱-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 10-A
N-((2R,10S)-10-벤질-2-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노카르보닐)-1,1,1-트리플루오로-6,9,12,15-테트라옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사덱-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 10-B
Figure pct00044
Figure pct00045
단계 1
벤질 3,3,3-트리플루오로-2-히드록시프로피오네이트 10a
화합물 3a(1.80 g, 12.5 mmol)를 100 mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 탄산칼륨(5.17 g, 37.5 mmol), 벤질 브롬화물(4.48 mL, 37.5 mmol) 및 테트라부틸암모늄 요오드화물(231 mg, 0.63 mmol)을 연속적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 60℃로 가열하고, 5시간 동안 교반한 후, 실온으로 냉각하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 C를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 10a를 수득하였다(980 mg, 33.5% 수율).
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.43-7.36 (m, 5H), 5.34 (s, 2H), 4.53 (s, 1H), 3.44 (s, 1H).
단계 2
벤질 1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-디옥소-10-(트리플루오로메틸)-2,9-디옥사-4,7-디아자운데칸-11-오에이트 10b
화합물 8b(63 mg, 0.17 mmol) 및 10a(80 mg, 0.34 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 테트라히드로푸란 3 mL를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 다음, 칼륨 tert-부톡시드(38 mg, 0.34 mmol)를 첨가하였다. 얼음 수조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 20분 동안 교반한 후, 얼음물 10 mL를 첨가하고 에틸 아세테이트(20 mL x 2) 및 클로로포름(10 mL x 5)으로 추출하였다. 유기상을 취합하고 농축하였다. 생성된 잔류물을 2 mL의 디옥산에 용해시키고, 0.4 mL의 물, 중탄산나트륨(19 mg, 0.23 mmol) 및 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트(49 mg, 0.19 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 20 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(10 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 용액(20 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 C를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 10b를 수득하였다(51 mg, 55.3% 수율).
MS m/z (ESI): 559.9 [M+18].
단계 3
1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-디옥소-10-(트리플루오로메틸)-2,9-디옥사-4,7-디아자운데칸-11-오익산 10c
화합물 10b(15 mg, 0.28 mmol)를 테트라히드로푸란 및 에틸 아세테이트(V:V = 2:1)의 용매 혼합물 3 mL에 용해시키고, 탄소 상의 팔라듐(15 mg, 10% 로딩)을 첨가하였다. 시스템을 수소로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 필터 케이크를 테트라히드로푸란으로 헹구었다. 여액을 농축하여 조 표제 생성물 10c를 수득하였다(13 mg).
MS m/z (ESI): 452.9 [M+1].
단계 4
(9H-플루오렌-9-일)메틸(2-((((3-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,1,1-트리플루오로-3-옥소프로프-2-일)옥시)메틸)아미노)-2-옥소에틸)카바메이트 10d
화합물 1b(10 mg, 18.8 μmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, N,N-디메틸포름아미드 1 mL를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 후, 한 방울의 트리에틸아민, 0.5 mL의 N,N-디메틸포름아미드 중 10c(13 mg, 28.7 μmol)의 용액, 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(11 mg, 39.7 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조에서 30분 동안 교반하였다. 10 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(10 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(10 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 10d를 수득하였다(16 mg, 97.8% 수율).
MS m/z (ESI): 870.0 [M+1].
단계 5
2-((2-아미노아세틸아미노)메톡시)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-3,3,3-트리플루오로프로피온아미드 10e
화합물 10d(16 mg, 18.4 μmol)를 0.6 mL의 디클로로메탄에 용해시키고 0.3 mL의 디에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축하였다. 2 mL의 톨루엔을 첨가한 후, 감압 하에 농축하고; 절차를 두 번 반복하였다. 잔류물을 3 mL의 n-헥산으로 슬러리화하고 방치하였다. 그런 다음, 상층액을 제거하고, 고체를 유지하였으며; 이러한 절차를 세 번 반복하였다. 고체 잔류물을 감압 하에 농축하고 오일 펌프로 건조하여 조 표제 생성물 10e(12 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
MS m/z (ESI): 647.9 [M+1].
단계 6
N-((2S,10S)-10-벤질-2-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노카르보닐)-1,1,1-트리플루오로-6,9,12,15-테트라옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사덱-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 10-A
N-((2R,10S)-10-벤질-2-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노카르보닐)-1,1,1-트리플루오로-6,9,12,15-테트라옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사덱-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 10-B
조 10e(12 mg, 18.5 μmol)를 1.0 mL의 N,N-디메틸포름아미드에 용해시켰다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 용액을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각하였다. N,N-디메틸포름아미드 0.3 mL 중 8g(14 mg, 29.6 μmol)의 용액을 첨가한 다음, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(15 mg, 54.2 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조에서 10분 동안 교반하였다. 그런 다음, 얼음 수조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 1시간 동안 교반하여 화합물 10을 수득하였다. 반응 혼합물을 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하였다(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: 엑스브리지 분취용(XBridge Prep) C18 OBD 5 μm 19 × 250 mm; 이동상: A 물(10 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴, 구배 용출, 유속: 18 mL/분). 상응하는 분획을 수집하고 감압 하에 농축하여 표제 생성물을 수득하였다(2.7 mg, 2.6 mg).
MS m/z (ESI): 1102.0 [M+1].
단일 구성 화합물(더 짧은 체류 시간):
UPLC 분석: 체류 시간: 1.18분; 순도: 91%(크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1 × 50 mm; 이동상: A 물(5 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.97 (d, 1H), 8.85-8.76 (m, 1H), 8.37-8.27 (m, 1H), 8.12-8.02 (m, 1H), 8.02-7.95 (m, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.31 (s, 1H), 7.26-7.10 (m, 4H), 6.99 (s, 1H), 6.66 (br, 1H), 6.52 (s, 1H), 5.65-5.54 (m, 1H), 5.41 (s, 1H), 5.37-5.25 (m, 3H), 5.23-5.13 (m, 1H), 4.81-4.68 (m, 2H), 4.51-4.41 (m, 1H), 3.78-3.45 (m, 6H), 3.21-3.13 (m, 1H), 3.02-2.93 (m, 1H), 2.77-2.63 (m, 2H), 2.45-2.29 (m, 3H), 2.24-2.05 (m, 3H), 2.04-1.93 (m, 5H), 1.90-1.75 (m, 2H), 1.52-1.38 (m, 4H), 0.90-0.78 (m, 5H).
단일 구성 화합물(더 긴 체류 시간):
UPLC 분석: 체류 시간: 1.23분; 순도: 90%(크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1 × 50 mm; 이동상: A 물(5 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 9.05 (d, 1H), 8.97-8.88 (m, 1H), 8.35-8.27 (m, 1H), 8.11-8.03 (m, 1H), 8.02-7.95 (m, 1H), 7.80 (d, 1H), 7.34 (s, 1H), 7.29-7.13 (m, 4H), 6.99 (s, 1H), 6.66 (br, 1H), 6.54 (s, 1H), 5.64-5.55 (m, 1H), 5.43 (s, 1H), 5.36-5.20 (m, 3H), 4.92-4.85 (m, 1H), 4.82-4.72 (m, 2H), 4.52-4.42 (m, 1H), 3.77-3.48 (m, 6H), 3.21-3.14 (m, 1H), 3.03-2.95 (m, 1H), 2.79-2.65 (m, 2H), 2.47-2.28 (m, 3H), 2.25-2.05 (m, 3H), 2.05-1.94 (m, 5H), 1.91-1.76 (m, 2H), 1.52-1.37 (m, 4H), 0.92-0.77 (m, 5H).
실시예 1-11
1-(((S)-7-벤질-20-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-3,6,9,12,15-펜타옥소-2,5,8,11,14-펜타자에이코실)옥시)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로부탄-1-카르복사미드 11
Figure pct00046
단계 1
벤질 1-((2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)아세틸아미노)메톡시)시클로부탄-1-카르복실레이트 11b
벤질 1-히드록시시클로부탄-카르복실레이트 11a(167 mg, 0.81 mmol, “Journal of Medicinal Chemistry, 2013, vol. 56, #13, p.5541-5552”에 개시된 바와 같이 제조됨) 및 8b(150 mg, 0.41 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 5 mL의 테트라히드로푸란을 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 다음, 칼륨 tert-부톡시드(92 mg, 0.82 mmol)를 첨가하였다. 얼음 수조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 10분 동안 교반한 후, 얼음물 20 mL를 첨가하고 에틸 아세테이트(5 mL x 2) 및 클로로포름(5 mL x 5)으로 추출하였다. 유기상을 취합하고 농축하였다. 생성된 잔류물을 3 mL의 디옥산에 용해시키고, 0.6 mL의 물, 중탄산나트륨(41 mg, 0.48 mmol) 및 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트(105 mg, 0.41 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 20 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(8 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 용액(20 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 C를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 11b를 수득하였다(37 mg, 17.6% 수율).
MS m/z (ESI): 514.6 [M+1].
단계 2
1-((2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)아세틸아미노)메톡시)시클로부탄-1-카르복실산 11c
화합물 11b(37 mg, 71.9 μmol)를 테트라히드로푸란 및 에틸 아세테이트(V:V = 2:1)의 용매 혼합물 3 mL에 용해시키고, 탄소 상의 팔라듐(15 mg, 10% 로딩)을 첨가하였다. 시스템을 수소로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 필터 케이크를 테트라히드로푸란으로 헹구었다. 여액을 농축하여 표제 생성물 11c(35 mg, 82% 수율)를 수득하고, 이를 다음 단계에서 직접 사용하였다.
단계 3
(9H-플루오렌-9-일)메틸(2-(((1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노카르보닐)시클로부톡시)메틸)아미노)-2-옥소에틸)카르바메이트 11d
화합물 1b(10 mg, 0.018 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, N,N-디메틸포름아미드 1 mL를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 후, 한 방울의 트리에틸아민, 0.5 mL의 N,N-디메틸포름아미드 중 화합물 11c(13 mg, 0.031 mmol)의 용액, 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(25 mg, 0.091 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조에서 40분 동안 교반하였다. 8 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(5 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 용액(8 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 A를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 11d를 수득하였다(19 mg, 73.9% 수율).
MS m/z (ESI): 842.3 [M+1].
단계 4
1-((2-아미노아세틸아미노)메톡시)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로부탄-1-카르복사미드 11e
화합물 11d(19 mg, 22.6 μmol)를 2 mL의 디클로로메탄에 용해시키고 1 mL의 디에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축하였다. 1 mL의 톨루엔을 첨가한 후, 감압 하에 농축하고; 절차를 두 번 반복하였다. 잔류물을 4 mL의 n-헥산으로 슬러리화하고, 상부 n-헥산 층을 제거하고; 절차를 세 번 반복하였다. 슬러리를 감압 하에 농축하여 조 표제 생성물 11e(15 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
단계 5
1-(((S)-7-벤질-20-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-3,6,9,12,15-펜타옥소-2,5,8,11,14-펜타자에이코실)옥시)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로부탄-1-카르복사미드 11
조 11e(2 mg, 3.22 μmol)를 0.5 mL의 N,N-디메틸포름아미드에 용해시켰다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 용액을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각하였다. N,N-디메틸포름아미드 0.3 mL 중 8g(1.5 mg, 3.17 μmol)의 용액을 첨가한 다음, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(2.7 mg, 9.67 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 오일 펌프로 건조될 때까지 농축하여 DMF를 제거하고, 잔류물을 DCM에 용해시킨 후 박층크로마토그래피로 직접 2회 정제하여(전개 용매의 극성: DCM/MeOH = 10/1) 표제 생성물 11을 수득하였다(1 mg, 28.8% 수율).
MS m/z (ESI): 1073.6 [M+1].
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 8.70-8.60 (m, 1H), 8.28-8.19 (m, 1H), 8.13-7.91 (m, 3H), 7.79-7.71 (d, 1H), 7.29 (s, 1H), 7.25-7.09 (m, 4H), 6.98 (s, 1H), 6.71-6.62 (m, 1H), 6.55-6.47 (m, 1H), 5.64-5.54 (m, 2H), 5.40 (s, 1H), 5.35-5.27 (t, 2H), 5.17-5.10 (m, 2H), 4.60-4.51 (m, 1H), 4.51-4.35 (m, 2H), 3.93-3.78 (m, 3H), 3.71-3.59 (m, 3H), 3.01-2.88 (m, 3H), 2.70-2.64 (m, 2H), 2.44-2.30 (m, 3H), 2.28-2.14 (m, 3H), 2.11-1.92 (m, 6H), 1.90-1.76 (m, 3H), 1.51-1.39 (m, 4H), 0.92-0.75 (m, 6H).
실시예 1-12
(S)-3-시클로프로필-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-2-히드록시프로피온아미드 12-A
(R)-3-시클로프로필-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-2-히드록시프로피온아미드 12-B
Figure pct00047
단계 1
3-시클로프로필-2-히드록시프로피온산 12b
화합물 12a(0.5 g, 3.87 mmol, 아다마스(Adamas)에 의해 공급됨)를 물 및 아세트산(V:V = 4:1)의 용매 혼합물 35 mL에 용해시키고, 용액을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시키고, 2 M 아질산나트륨 수용액(0.53 g, 7.74 mmol)을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 3시간 동안 교반하였다. 고체 염화나트륨을 반응 혼합물에 첨가하여 수상을 포화시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트(8 mL × 8)로 추출하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 농축하여 표제 생성물 12b를 수득하였다(0.45 g, 89.3% 수율).
단계 2
(S)-3-시클로프로필-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-2-히드록시프로피온아미드 12-A
(R)-3-시클로프로필-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-2-히드록시프로피온아미드 12-B
화합물 1b(45 mg, 0.085 mmol)에 1.5 mL의 에탄올 및 1.5 mL의 N,N-디메틸포름아미드를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 0.1 mL의 N-메틸모르폴린을 적가하였다. 반응 혼합물을 투명해질 때까지 교반하였다. 반응 혼합물에 화합물 12b(90 mg, 0.691 mmol), 1-히드록시벤조트리아졸(34 mg, 0.251 mmol) 및 1-(3-디메틸아미노프로필)-3-에틸카르보디이미드 염산염(49 mg, 0.256 mmol)을 차례로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고 감압 하에 농축하고, 생성된 조 화합물 12를 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하여(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: 샤프실(Sharpsil)-T C18 5 μm 21.2 × 250 mm; 이동상: A 물(10 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴, 구배 용출, 유속: 18 mL/분) 표제 화합물을 수득하였다(7 mg, 15 mg).
MS m/z (ESI): 547.9 [M+1].
단일 구성 화합물(더 짧은 체류 시간):
UPLC 분석: 체류 시간: 1.345분; 순도: 72%(크로마토그래피 컬럼: ZORBAX 에클리페이즈 플러스(Ecliphase Plus) C18 1.8 μm 2.1 × 50 mm; 이동상: A 물(5 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.42 (d, 1H), 7.78 (d, 1H), 7.30 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 5.60-5.50 (m, 2H), 5.42 (s, 1H), 5.19 (q, 2H), 4.02-4.00 (m, 1H), 3.21-3.11 (m, 2H), 2.39 (s, 3H), 2.21-2.07 (m, 2H), 2.05-1.95 (m, 1H), 1.92-1.68 (m, 4H), 1.53-1.41 (m, 1H),0.87 (t, 3H), 0.48-0.34 (m, 2H), 0.14-0.01 (m, 2H).
단일 구성 화합물(더 긴 체류 시간):
UPLC 분석: 체류 시간: 1.399분; 순도: 88%(크로마토그래피 컬럼: ZORBAX 에클리페이즈 플러스(Ecliphase Plus) C18 1.8 μm 2.1 × 50 mm; 이동상: A 물(5 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.36 (d, 1H), 7.77 (d, 1H), 7.31 (s, 1H), 6.51 (s, 1H), 5.58-5.51 (m, 1H), 5.48 (d, 1H), 5.42 (s, 1H),5.20 (q, 2H), 4.09-4.02 (m, 1H), 3.22-3.11 (m, 2H), 2.39 (s, 3H), 2.27-2.06 (m, 2H), 2.05-1.95 (m, 1H), 1.93-1.81 (m, 2H), 1.65-1.43 (m, 2H), 1.32-1.21 (m, 1H), 0.87 (t, 3H), 0.48-0.33 (m, 2H), 0.14-0.01 (m, 2H).
실시예 1-13 (참조 예)
N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)-2-히드록시아세트아미드
Figure pct00048
표제 화합물 13은 "특허 EP2907824A1 명세서 147페이지의 실시예 76"에 개시된 바와 같이 제조하였다.
실시예 1-14
N-((2R,10S)-10-벤질-2-(시클로프로필메틸)-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사덱-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 14-A
N-((2S,10S)-10-벤질-2-(시클로프로필메틸)-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사덱-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 14-B
Figure pct00049
단계 1
벤질 3-시클로프로필-2-히드록시프로피오네이트 14a
화합물 12b(200 mg, 1.54 mmol)를 20 mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 탄산칼륨(1.06 g, 7.68 mmol), 벤질 브롬화물(0.16 mL, 1.34 mmol) 및 테트라부틸암모늄 요오드화물(28 mg, 0.07 mmol)을 연속적으로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 48시간 동안 교반하고 셀라이트를 통해 여과하고, 필터 케이크를 에틸 아세테이트(10 mL)로 헹구었다. 여액을 취합하고 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 C를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 14a를 수득하였다(140 mg, 41.3% 수율).
단계 2
벤질 10-(시클로프로필메틸)-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아자운데칸-11-오에이트 14b
화합물 14a(94 mg, 0.427 mmol) 및 8b(130 mg, 0.353 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 테트라히드로푸란 10 mL를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 다음, 칼륨 tert-부톡시드(79 mg, 0.704 mmol)를 첨가하였다. 얼음 수조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 10분 동안 교반한 후, 얼음물 20 mL를 첨가하고 에틸 아세테이트(10 mL x 4)로 추출하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 용액(20 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과한 후, 여액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 C를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 14b를 수득하였다(50 mg, 26.8% 수율).
MS m/z (ESI): 529.2 [M+1].
단계 3
10-(시클로프로필메틸)-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아자운데칸-11-오익산 14c
화합물 14b(27 mg, 0.051 mmol)를 3 mL의 에틸 아세테이트에 용해시키고, 탄소 상의 팔라듐(7 mg, 10% 로딩, 건조 기반)을 첨가하였다. 시스템을 수소로 3회 퍼지하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고 셀라이트를 통해 여과하고, 필터 케이크를 에틸 아세테이트로 헹구었다. 여액을 농축하여 조 표제 생성물 14c(23 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
MS m/z (ESI): 439.1 [M+1].
단계 4
(9H-플루오렌-9-일)메틸(2-((((3-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1-옥소프로판-2-일)옥시)메틸)아미노)-2-옥소에틸)카르바메이트 14d
화합물 1b(22 mg, 42.38 μmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, N,N-디메틸포름아미드 3 mL를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 후, 트리에틸아민(4.3 mg, 42.49 μmol)을 적가하고 조 14c(23 mg, 51.1 μmol) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(17.6 mg, 63.6 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조에서 40분 동안 교반하였다. 15 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(8 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(15 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 14d를 수득하였다(29 mg, 79.9% 수율).
MS m/z (ESI): 856.1 [M+1].
단계 5
2-((2-아미노아세틸아미노)메톡시)-3-시클로프로필-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)프로판아미드 14e
화합물 14d(29 mg, 33.9 μmol)를 0.8 mL의 디클로로메탄에 용해시키고 0.4 mL의 디에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축하였다. 1 mL의 톨루엔을 첨가한 후, 감압 하에 농축하고; 절차를 두 번 반복하였다. 잔류물을 3 mL의 n-헥산으로 슬러리화하고 방치하였다. 그런 다음, 상층액을 제거하고; 이러한 절차를 세 번 반복하였다. 잔류물을 감압 하에 농축하고 오일 펌프로 건조하여 조 표제 생성물 14e(22 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
MS m/z (ESI): 634.1 [M+1].
단계 6
N-((2R,10S)-10-벤질-2-(시클로프로필메틸)-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사덱-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 14-A
N-((2S,10S)-10-벤질-2-(시클로프로필메틸)-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사덱-16-일)-6-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)헥산아미드 14-B
조 14e(22 mg, 33.9 μmol)를 2.5 mL의 N,N-디메틸포름아미드에 용해시켰다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 용액을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 후, 8g(24 mg, 50.8 μmol) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(14 mg, 50.6 μmol)을 연속적으로 첨가하였다. 그런 다음, 얼음 수조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 1시간 동안 교반하여 화합물 14를 수득하였다. 반응 혼합물을 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하여(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: 엑스브리지 분취용(XBridge Prep) C18 OBD 5 μm 19 × 250 mm; 이동상: A 물(10 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴, 구배 용출, 유속: 18 mL/분) 표제 화합물을 수득하였다(2 mg, 2 mg).
MS m/z (ESI): 1088.4 [M+1].
단일 구성 화합물(더 짧은 체류 시간):
UPLC 분석: 체류 시간: 1.18분; 순도: 88%(크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1 × 50 mm; 이동상: A 물(5 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴).
단일 구성 화합물(더 긴 체류 시간):
UPLC 분석: 체류 시간: 1.23분; 순도: 96%(크로마토그래피 컬럼: ACQUITY UPLC BEHC18 1.7 μm 2.1 × 50 mm; 이동상: A 물(5 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴).
실시예 1-15
1-((S)-9-벤질-22-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-5,8,11,14,17-펜타옥소-2-옥사-4,7,10,13,16-펜타아자도코실)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3,4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로프로판-1-카르복사미드 15
Figure pct00050
단계 1
벤질 1-(10-(9H-플루오렌-9-일)-5,8-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아자데실)시클로프로판-1-카르복실레이트 15b
화합물 8b(500 mg, 1.35 mmol)를 반응 플라스크에 첨가한 후, 6 mL의 테트라히드로푸란, 및 벤질 1-히드록시메틸시클로프로판-1-카복실레이트 15a(233 mg, 1.13 mmol; "특허 출원 EP2862856A1 명세서 262 페이지의 실시예 22-2"에 개시된 바와 같이 제조됨)를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 다음, 수소화나트륨(54 mg, 1.35 mmol)을 첨가하였다. 그런 다음, 얼음 수조를 제거하고, 반응 혼합물을 실온으로 가온하여, 40분 동안 교반하고, 0℃로 냉각한 후, 얼음물 20 mL를 첨가하고 에틸 아세테이트(5 mL x 2) 및 클로로포름(5 mL x 5)으로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(20 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과한 후, 여액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 15b를 수득하였다(15 mg, 2.5% 수율).
MS m/z (ESI): 515.2 [M+1].
단계 2
1-(10-(9H-플루오렌-9-일)-5,8-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아자데실)시클로프로판-1-카르복실산 15c
화합물 15b(15 mg, 0.029 mmol)를 2 mL의 에틸 아세테이트에 용해시키고, 탄소 상의 팔라듐(3 mg, 10% 로딩, 건조 기반)을 첨가하였다. 시스템을 수소로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 실온에서 4.5시간 동안 교반하고 셀라이트를 통해 여과한 후, 필터 케이크를 에틸 아세테이트로 헹구었다. 여액을 농축하여 표제 생성물 15c를 수득하였다(11 mg, 89% 수율).
MS m/z (ESI): 425.2 [M+1].
단계 3
(9H-플루오렌-9-일)메틸(2-((((1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노카르보닐)시클로프로필)메톡시)메틸)아미노)2-옥소에틸)카르바메이트 15d
화합물 1b(10 mg, 0.021 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, N,N-디메틸포름아미드 1 mL를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 후, 한 방울의 트리에틸아민, 화합물 15c(11 mg, 0.026 mmol) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(10.7 mg, 0.039 mmol)을 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 실온에서 60분 동안 교반하였다. 10 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(5 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 용액(10 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 15d를 수득하였다(19 mg, 87.0% 수율).
MS m/z (ESI): 842.2 [M+1].
단계 4
1-(((2-아미노아세틸아미노)메톡시)메틸)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로프로판-1-카르복사미드 15e
화합물 15d(19 mg, 22.56 μmol)를 2 mL의 디클로로메탄에 용해시키고 1 mL의 디에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하고, 0℃에서 감압 하에 농축하였다. 1 mL의 톨루엔을 첨가한 후, 감압 하에 농축하고; 절차를 두 번 반복하였다. 잔류물을 3 mL의 n-헥산으로 슬러리화하고, 상부 n-헥산 층을 제거하고; 절차를 세 번 반복하였다. 슬러리를 감압 하에 농축하여 조 표제 생성물 15e(13.9 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
MS m/z (ESI): 620.1 [M+1].
단계 5
1-((S)-9-벤질-22-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-5,8,11,14,17-펜타옥소-2-옥사-4,7,10,13,16-펜타아자도코실)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로프로판-1-카르복사미드 15
조 15e(13.9 mg, 22.4 μmol)를 1 mL의 N,N-디메틸포름아미드에 용해시켰다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 용액을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 후, 8g(15.8 mg, 33.4 μmol) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(9.3 mg, 33.6 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하여 60분 동안 교반한 후, 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하였다(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: 엑스브리지 분취용(XBridge Prep) C18 OBD 5 μm 19 × 250 mm; 이동상: A 물(10 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴, 구배 용출, 유속: 18 mL/분). 상응하는 분획을 수집하고 감압 하에 농축하여 표제 생성물 15를 수득하였다(2.5 mg, 10.3% 수율).
MS m/z (ESI): 1074.2 [M+1].
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.51-8.37 (m, 1H), 8.22 (t, 1H), 8.14-8.02 (m, 2H), 8.011-7.94 (m, 1H), 7.82-7.73 (m, 1H), 7.29 (s, 1H), 7.26-7.10 (m, 3H), 6.98 (s, 1H), 6.53-6.47 (m, 1H), 5.62-5.50 (m, 1H), 5.45-5.36 (m, 1H), 5.35-5.23 (m, 2H), 5.13-5.02 (m, 2H), 4.61-4.50 (m, 2H), 4.42-4.28 (m, 2H), 3.76-3.61 (m, 3H), 3.60-3.45 (m, 3H), 3.27-3.23 (m, 1H), 3.20-2.81 (m,7H), 2.75-2.61 (m, 3H), 241-2.28 (m, 3H), 2.23-2.13 (m, 2H), 2.11-2.01 (m, 1H), 2.03-1.94 (m, 1H), 1.90 (s, 1H), 1.87-1.74 (m, 2H), 1.53-1.36 (m, 3H), 1.29-1.08 (m, 4H), 0.90-0.68 (m, 4H).
실시예 1-16
1-((S)-9-벤질-22-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-5,8,11,14,17-펜타옥소-2-옥사-4,7,10,13,16-펜타아자도코실)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로부탄-1-카르복사미드 16
Figure pct00051
단계 1
1-(히드록시메틸)시클로부탄-1-카르복실산 16b
에틸 1-(히드록시메틸)시클로부탄카르복실레이트 16a(250 mg, 1.58 mmol, 알파(Alfa)에 의해 공급됨)를 메탄올(2 mL) 및 물(1 mL)에 용해시키고 수산화나트륨(126 mg, 3.15 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃로 가온하여, 3시간 동안 교반한 후, 실온으로 냉각하고, 감압 하에 농축하여 유기 용매를 제거하였다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르(10 mL)로 역추출하여 수상을 수집하였다. 6 N 염산 수용액으로 수상을 pH 3~4로 조절하고 감압 하에 농축하여 고체를 수득하였다. 3 mL의 톨루엔을 첨가한 후, 감압 하에 농축 건조시키고; 이러한 절차를 세 번 반복하였다. 잔류물을 오일 펌프로 건조하여 조 표제 생성물 16b(206 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
MS m/z (ESI, NEG):129.2 [M-1].
단계 2
벤질 1-(히드록시메틸)시클로부탄-1-카르복실레이트 16c
조 16b(206 mg, 1.58 mmol)를 아세토니트릴(15 mL)에 용해시키고 무수 탄산칼륨(1.09 g, 7.90 mmol), 테트라부틸암모늄 요오드화물(29 mg, 78.51 μmol) 및 벤질 브롬화물(216 mg, 1.26 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하고 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 C를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 16c를 수득하였다(112 mg, 32.1% 수율).
MS m/z (ESI): 221.1 [M+1].
단계 3
벤질 1-(10-(9H-플루오렌-9-일)-5,8-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아자데실)시클로부탄-1-카르복실레이트 16d
화합물 16c(77 mg, 0.35 mmol) 및 8b(100 mg, 0.27 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 테트라히드로푸란 3 mL를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 다음, 칼륨 tert-부톡시드(61 mg, 0.54 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조에서 10분 동안 교반하였다. 20 mL의 얼음물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(5 mL) 및 클로로포름(5 mL × 5)으로 추출하였다. 유기상을 취합하고 농축하였다. 생성된 잔류물을 3 mL의 1,4-디옥산에 용해시키고, 0.5 mL의 물, 중탄산나트륨(27 mg, 0.32 mmol) 및 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트(71 mg, 0.27 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 20 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(10 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 용액(20 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 C를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 16d를 수득하였다(24 mg, 16.7% 수율).
MS m/z (ESI): 551.3 [M+23].
단계 4
1-(10-(9H-플루오렌-9-일)-5,8-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아자데실)시클로부탄-1-카르복실산 16e
화합물 16d(12 mg, 22.7 μmol)를 테트라히드로푸란 및 에틸 아세테이트(V:V = 2:1)의 용매 혼합물 1.5 mL에 용해시키고, 탄소 상의 팔라듐(5 mg, 10% 로딩)을 첨가하였다. 시스템을 수소로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, 필터 케이크를 에틸 아세테이트로 헹구었다. 여액을 감압 하에 농축하여 조 표제 생성물 16e(10 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
단계 5
(9H-플루오렌-9-일)메틸(2-((((1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노카르보닐)시클로부틸)메톡시)메틸)아미노)-2-옥소에틸)카르바메이트 16f
화합물 1b(7.5 mg, 0.014 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, N,N-디메틸포름아미드 1 mL를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 후, 한 방울의 트리에틸아민, 0.5 mL의 N,N-디메틸포름아미드 중 조 16e(10 mg)의 용액, 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(6 mg, 0.026 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조에서 30분 동안 교반하였다. 10 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(10 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 용액(10 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 16f를 수득하였다(10.6 mg, 87.8% 수율).
MS m/z (ESI): 856.2 [M+1].
단계 6
1-(((2-아미노아세틸아미노)메톡시)메틸)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로부탄-1-카르복사미드 16g
화합물 16f(10.6 mg, 12.4 μmol)를 0.6 mL의 디클로로메탄에 용해시키고 0.3 mL의 디에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축하였다. 2 mL의 톨루엔을 첨가한 후, 감압 하에 농축하고; 절차를 두 번 반복하였다. 잔류물을 3 mL의 n-헥산으로 슬러리화하고, 상부 n-헥산 층을 제거하고; 절차를 세 번 반복하였다. 잔류물을 감압 하에 농축하여 조 표제 생성물 16e(8 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
MS m/z (ESI): 634.1 [M+1].
단계 7
1-((S)-9-벤질-22-(2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)-5,8,11,14,17-펜타옥소-2-옥사-4,7,10,13,16-펜타아자도코실)-N-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)시클로부탄-1-카르복사미드 16
조 16g(8 mg)를 1 mL의 N,N-디메틸포름아미드에 용해시키고, 8g(8.8 mg, 18.6 μmol) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(5.2 mg, 18.8 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하여(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: 엑스브리지 분취용(XBridge Prep) C18 OBD 5 μm 19 × 250 mm; 이동상: A 물(10 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴, 구배 용출, 유속: 18 mL/분) 표제 화합물 16을 수득하였다(1.0 mg, 7.2% 수율).
MS m/z (ESI): 1088.0 [M+1].
실시예 1-17
(1r,4r)-N-((S)-7-벤질-1-(1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노카르보닐)시클로프로폭시)-3,6,9,12,15-펜타옥소-17,20,23,26,29,32,35,38,41-노나옥사-2,5,8,11,14-펜타아자테트라트리덱-43-일)-4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)시클로헥산-1-카르복사미드 17
Figure pct00052
단계 1
tert-부틸 1-페닐-2,5,8,11,14,17,20,23,26,29-데카옥사헨트리아콘탄-31-오에이트 17b
1-페닐-2,5,8,11,14,17,20,23,26-노나옥사옥타코산-28-올 17a(0.34 g, 0.67 mmol, 바이드(Bide)에 의해 공급됨)를 10 mL의 디클로로메탄에 용해시키고, 산화은(0.24 g, 1.01 mmol), tert-부틸 브로모아세테이트(0.16 g, 0.81 mmol) 및 요오드화칼륨(0.07 g, 0.40 mmol)을 차례로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 17b를 수득하였다(0.42 g, 100% 수율).
MS m/z (ESI): 636.3 [M+18].
단계 2
Tert-부틸 29-히드록시-3,6,9,12,15,18,21,24,27-노나옥사노나코산-1-오에이트 17c
화합물 17b(417 mg, 0.67 mmol)를 15 mL의 테트라히드로푸란에 용해시키고, 탄소 상의 팔라듐(110 mg, 10% 로딩, 건조 기반)을 첨가하였다. 시스템을 수소로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 60℃로 가온하여 3시간 동안 교반하고, 셀라이트를 통해 여과한 후, 필터 케이크를 테트라히드로푸란으로 헹구었다. 여액을 농축하여 조 표제 생성물 17c(357 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
MS m/z (ESI): 546.2 [M+18].
단계 3
Tert-부틸 29-아지도-3,6,9,12,15,18,21,24,27-노나옥사노나코산-1-오에이트 17d
화합물 17c(357 mg, 0.675 mmol)를 10 mL의 톨루엔에 용해시키고, 디페닐 포스포릴 아지드(279 mg, 1.014 mmol) 및 1,8-디아자비시클로운데크-7-엔(206 mg, 1.353 mmol)을 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, 105℃로 가온하여 19시간 동안 반응시키고, 실온으로 냉각시키고 농축시켰다. 20 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(10 mL × 4)로 추출하였다. 유기상을 포화 염화나트륨 용액(20 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 조 표제 생성물 17d를 수득하였다(412 mg).
MS m/z (ESI): 571.3 [M+18].
단계 4
Tert-부틸 29-아미노-3,6,9,12,15,18,21,24,27-노나옥사노나코산-1-오에이트 17e
화합물 17d(230 mg, 0.415 mmol)를 8 mL의 테트라히드로푸란에 용해시키고, 탄소 상의 팔라듐(58 mg, 10% 로딩, 건조 기반)을 첨가하였다. 시스템을 수소로 3회 퍼지하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고 셀라이트를 통해 여과하고, 필터 케이크를 테트라히드로푸란으로 헹구었다. 여액을 농축하여 조 표제 생성물 17e(220 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
MS m/z (ESI): 528.2 [M+1].
단계 5
Tert-부틸 1-((1r,4r)-4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)시클로헥실)-1-옥소-5,8,11,14,17,20,23,26,29-노나옥사-2-아자트리운덱-31-오에이트 17f
(1r,4r)-4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)시클로헥산-1-카르복실산(98.5 mg, 0.415 mmol)을 10 mL의 디클로로메탄에 용해시키고, 2-(7-벤조트리아졸 옥사이드)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(190 mg, 0.500 mmol) 및 N,N-디이소프로필에틸아민(162 mg, 1.253 mmol)을 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 조 17e(220 mg, 0.417 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 15 mL의 물을 첨가한 후, 디클로로메탄(8 mL × 3)으로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(15 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 17f를 수득하였다(122 mg, 39.2% 수율).
MS m/z (ESI): 747.2 [M+1].
단계 6
1-((1r,4r)-4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)시클로헥실)-1-옥소-5,8,11,14,17,20,23,26,29-노나옥사-2-아자트리운덱-31-오익산 17g
화합물 17f(122 mg, 0.163 mmol)를 0.8 mL의 디클로로메탄에 용해시키고, 0.4 mL의 트리플루오로아세트산을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 15 mL의 디클로로메탄으로 희석하고, 감압 하에 농축하였고; 10 mL의 n-헥산을 첨가한 후, 감압 하에 농축하였고; 이러한 절차를 두 번 반복하였다. 그런 다음, 10 mL의 톨루엔을 첨가하고, 생성된 혼합물을 감압 하에 농축한 후, pH가 7이 될 때까지 n-헥산:디에틸에테르=5:1의 용매 혼합물 10 mL로 3회 슬러리화하여 농축한 후, 오일 펌프로 건조하여 표제 생성물 17g를 수득하였다(98 mg, 86.8% 수율).
MS m/z (ESI): 691.2 [M+1].
단계 7
2,4-디메톡시벤질 1-((2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)아세틸아미노)메톡시)시클로프로필-1-카르복실레이트 17h
화합물 8d(164 mg, 0.40 mmol)를 디클로로메탄(5 mL)에 용해시키고, 2,4-디메톡시벤질 알코올(81 mg, 0.48 mmol), 1-에틸-(3-디메틸아미노프로필)카르보닐디이민 염산염(115 mg, 0.60 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(5 mg, 0.041 mmol)을 차례로 첨가하였다. 첨가 후, 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 20 mL의 물을 첨가하고, 진탕 후 층을 형성하였다. 수상을 디클로로메탄(8 mL × 3)으로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(20 mL)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 C를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 17h를 수득하였다(124 mg, 55.4% 수율).
MS m/z (ESI): 583.1 [M+23].
단계 8
2,4-디메톡시벤질 (S)-1-((11-벤질-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6,9,12,15-펜타옥소-2-옥사-4,7,10,13,16-펜타아자헵타데칸-17-일)옥시)시클로프로필-1-카복실레이트 17j
화합물 17h(39 mg, 69.6 μmol)를 0.6 mL의 디클로로메탄에 용해시키고 0.3 mL의 디에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축하였다. 2 mL의 톨루엔을 첨가한 후, 감압 하에 농축하고; 절차를 두 번 반복하였다. 잔류물을 3 mL의 n-헥산으로 슬러리화하고, 상부 n-헥산 층을 제거하고; 절차를 세 번 반복한 후, 감압 하에 농축하였다. 생성된 조 생성물을 2 mL의 N,N-디메틸포름아미드 및 (((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)글리실-L-페닐알라닌 17i(35 mg, 69.8 μmol, "특허 출원 CN108853514A 명세서의 13 페이지에 있는 실시예 7-12”에 개시된 바와 같이 제조됨)에 용해시키고, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(23 mg, 83.1 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 10 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(10 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(10 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 17j를 수득하였다(48 mg, 83.9% 수율).
MS m/z (ESI): 822.0 [M+1].
단계 9
(S)-1-((11-벤질-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6,9,12,15-펜타옥소-2-옥사-4,7,10,13,16-펜타아자헵타데칸-17-일)옥시)시클로프로판-1-카복실산 17k
화합물 17j(48 mg, 58.4 μmol)를 디클로로메탄 중 3%(v/v) 디클로로아세트산 용액 1.4 mL에 용해시키고, 용액을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 후, 트리에틸실란(21 mg, 180.6 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조에서 감압 하에 농축하여 유기 용매의 절반을 제거하였다. 디에틸에테르 5 mL를 첨가하고, 생성된 혼합물을 실온으로 가온하고 슬러리화하여 백색 고체를 침전시킨 후, 여과하였다. 필터 케이크를 수집하고 오일 펌프로 건조하여 표제 생성물 17k(33 mg, 84.1% 수율)를 수득하였다.
단계 10
(9H-플루오렌-9-일)메틸((S)-7-벤질1-(1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노카르보닐)시클로프로폭시)-3,6,9,12-테트라옥소-2,5,8,11-테트라아자트리데칸-13-일)카바메이트 17l
화합물 1b(20 mg, 42.4 μmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 디클로로메탄 중 10%(v/v) 메탄올 용액 1 mL를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 후, 한 방울의 트리에틸아민을 첨가하였다. 혼합물을 화합물 1b가 용해될 때까지 교반하였다. 화합물 17k(33 mg, 49.1 μmol)를 디클로로메탄 중 10%(v/v) 메탄올 용액 1 mL에 용해시킨 다음, 전술한 반응 혼합물을 적가한 후, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(17.6 mg, 63.6 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 1시간 교반하였다. 10 mL의 디클로로메탄 및 5 mL의 물을 첨가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한 후, 방치하여 층을 형성하였다. 유기상을 수집하고, 수상을 디클로로메탄(10 mL × 3)으로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(10 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 17l을 수득하였다(37 mg, 80.2% 수율).
MS m/z (ESI): 1090.1 [M+1].
단계 11
(1r,4r)-N-((S)-7-벤질-1-(1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노카르보닐)시클로프로폭시)-3,6,9,12,15-펜타옥소-17,20,23,26,29,32,35,38,41-노나옥사-2,5,8,11,14-펜타아자테트라트리덱-43-일)-4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)시클로헥산-1-카르복사미드 17
화합물 17l(15.5 mg, 14.23 μmol)을 0.6 mL의 디클로로메탄에 용해시키고 0.3 mL의 디에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축하였다. 2 mL의 톨루엔을 첨가한 후, 감압 하에 농축하고; 절차를 두 번 반복하였다. 잔류물을 3 mL의 n-헥산으로 슬러리화하고, 상부 n-헥산 층을 제거하고; 절차를 세 번 반복하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축한 다음, 오일 펌프로 건조시켰다. 생성된 조 생성물을 1 mL의 N,N-디메틸포름아미드에 용해시키고, 화합물 17g(11 mg, 15.92 μmol) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(6.0 mg, 21.68 μmol)을 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하였다(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: 엑스브리지 분취용(XBridge Prep) C18 OBD 5 μm 19 × 250 mm; 이동상: A 물(10 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴, 구배 용출, 유속: 18 mL/분). 상응하는 분획을 수집하고 감압 하에 농축하여 표제 생성물 17를 수득하였다(6 mg, 27.4% 수율).
MS m/z (ESI): 1556.4 [M+18].
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.98 (d, 1H), 8.76 (s, 1H), 8.20 (br, 1H), 8.12-7.95 (m, 3H), 7.93-7.76 (m, 2H), 7.75-7.66 (m, 2H), 7.24 (s, 1H), 7.20-7.05 (m, 6H), 6.97 (s, 1H), 6.64 (br, 1H), 6.55 (d, 1H), 6.47 (s, 1H), 5.61-5.52 (m, 2H), 5.37 (s, 1H), 5.33-5.23 (m, 2H), 5.18 (s, 1H), 5.13 (s, 1H), 5.05 (s, 1H), 5.00 (s, 1H), 4.65-4.55 (m, 2H), 4.53-4.45 (m, 1H), 4.38-4.28 (m, 2H), 3.84 (s, 2H), 3.67 (d, 3H), 3.60-3.40 (m, 33H), 3.18 (d, 1H), 3.15-3.08 (m, 3H), 2.28 (s, 3H), 2.00-1.92 (m, 3H), 1.85 (s, 2H), 1.82-1.73 (m, 2H), 1.68-1.52 (m, 4H), 1.29-1.15 (m, 3H), 0.86-0.76 (m, 5H).
실시예 1-18
(1r,4r)-N-((2R,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15,18-헥사옥소-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-데카옥사-5,8,11,14,17-펜타아자-테트라헥사덱-46-일)-4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)시클로헥산-1-카르복사미드 18
Figure pct00053
Figure pct00054
단계 1
벤질 (R)-2-시클로프로필-2-히드록시아세테이트 18a
벤질 (S)-2-시클로프로필-2-히드록시아세테이트 18b
화합물 2a(7.4 g, 63.7 mmol)를 200 mL의 아세토니트릴에 용해시키고, 탄산칼륨(35 g, 253.6 mmol), 벤질 브롬화물(9.3 g, 54.4 mmol) 및 테트라부틸암모늄 요오드화물(500 mg, 1.36 mmol)을 차례로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고 셀라이트를 통해 여과하고, 필터 케이크를 에틸 아세테이트(10 mL)로 헹구었다. 여액을 취합하고 감압 하에 농축하고, 생성된 잔류물(4.1 g)을 전개 용매 시스템 C를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하고 키랄 분해에 의해 추가로 정제하여 표제 생성물 18a(1.1 g) 및 18b(1.2 g)수득하였다.
단계 2
벤질 (R)-10-시클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아자운데칸-11-오에이트 18c
화합물 8b(3.1 g, 8.41 mmol)를 테트라히드로푸란(55 mL)에 용해시키고, 화합물 18a(2.0 g, 9.70 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시키고, 칼륨 tert-부톡시드(1.89 g, 16.84 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 얼음물 수조에서 10분 동안 교반하였다. 에틸 아세테이트(30 mL) 및 물(20 mL)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 방치하여 층을 형성하였다. 수상을 클로로포름(30 mL × 5)으로 추출하고, 유기상을 취합하여 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 1,4-디옥산(32 mL) 및 물(8 mL)에 용해시키고, 탄산나트륨(1.78 g, 16.79 mmol) 및 9-플루오레닐메틸 클로로포르메이트(2.18 g, 8.42 mmol)를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 물(30 mL)을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(50 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(30 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 C를 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 18c를 수득하였다(1.3 g, 30.0% 수율).
MS m/z (ESI): 515.2 [M+1].
단계 3
(R)-10-시클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아자운데칸-11-오익산 18d
화합물 18c(1.29 g, 2.51 mmol)를 에틸 아세테이트(15 mL)에 용해시키고, 탄소 상의 팔라듐(260 mg, 10% 로딩, 건조 기반)을 첨가하였다. 시스템을 수소로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하고 셀라이트를 통해 여과한 후, 필터 케이크를 에틸 아세테이트(20 mL) 및 메탄올(20 mL)로 헹구었다. 여액을 농축하여 조 표제 생성물 18d(980 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
MS m/z (ESI): 425.1 [M+1].
단계 4
2,4-디메톡시벤질(R)-10-시클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아자운데칸-11-에스테르 18e
조 18d(980 mg, 2.31 mmol)를 디클로로메탄(15 mL)에 용해시키고, 2,4-디메톡시벤질 알코올(777 mg, 4.62 mmol), 1-에틸-(3-디메틸아미노프로필)카르보닐디이민 염산염(664 mg, 3.46 mmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(28 mg, 0.23 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축하여 유기 용매를 제거하였다. 20 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(50 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(30 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 C를 사용하는 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 18e를 수득하였다(810 mg, 61.1% 수율).
MS m/z (ESI): 575.0 [M+1].
단계 5
2,4-디메톡시벤질(R)-2-((2-아미노아세틸아미노)메톡시)-2-시클로프로필아세테이트 18f
화합물 18e(33 mg, 57.4 μmol)를 0.6 mL의 디클로로메탄에 용해시키고 0.3 mL의 디에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축하였다. 2 mL의 톨루엔을 첨가한 후, 감압 하에 농축하고; 절차를 두 번 반복하였다. 잔류물을 3 mL의 n-헥산으로 슬러리화하고, 상부 n-헥산 층을 제거하고; 절차를 세 번 반복하였다. 슬러리를 감압 하에 농축하여 조 표제 생성물 18f(21 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
단계 6
2,4-디메톡시벤질(11S,19R)-11-벤질-19-시클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6,9,12,15-펜타옥소-2,18-디옥사-4,7,10,13,16-펜타아자이코산-20-오에이트 18g
조 18f(21 mg, 57.4 μmol)를 3 mL의 N,N-디메틸포름아미드에 용해시키고, 화합물 17i(29 mg, 57.8 μmol) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(19 mg, 68.7 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 10 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(10 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(10 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 18g를 수득하였다(37 mg, 77.1% 수율).
MS m/z (ESI): 853.0 [M+18].
단계 7
(11S,19R)-11-벤질-19-시클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6,9,12,15-펜타옥소-2,18-디옥사-4,7,10,13,16-펜타아자이코산-20-오익산 18g
화합물 18g(37 mg, 44.3 μmol)를 디클로로메탄 중 3%(v/v) 디클로로아세트산 용액 1.4 mL에 용해시키고, 용액을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 후, 트리에틸실란(15.4 mg, 132.4 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조에서 감압 하에 농축하여 유기 용매의 절반을 제거하고, 5 mL의 디에틸 에테르를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온으로 가온하고 슬러리화하여 백색 고체를 침전시킨 후, 여과하였다. 필터 케이크를 수집하고 오일 펌프로 건조하여 표제 생성물 18h(24 mg, 79.1% 수율)를 수득하였다.
MS m/z (ESI): 708.2 [M+23].
단계 8
(9H-플루오렌-9-일)메틸((2R,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사덱-16-일)카바메이트 18i
화합물 1b(30 mg, 63.6 μmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 디클로로메탄 중 10%(v/v) 메탄올 용액 1 mL를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 후, 한 방울의 트리에틸아민을 첨가하였다. 혼합물을 화합물 1b가 용해될 때까지 교반하였다. 화합물 18h(65 mg, 94.8 μmol)를 디클로로메탄 중 10%(v/v) 메탄올 용액 1 mL에 용해시킨 다음, 전술한 반응 혼합물을 적가한 후, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(27 mg, 97.6 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 1시간 교반하였다. 10 mL의 디클로로메탄 및 5 mL의 물을 첨가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한 후, 방치하여 층을 형성하였다. 유기상을 수집하고, 수상을 디클로로메탄(10 mL × 3)으로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(10 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 18i를 수득하였다(25 mg, 35.6% 수율).
MS m/z (ESI): 1104.4 [M+1].
단계 9
(S)-2-(2-(2-아미노아세틸아미노)아세틸아미노)-N-(2-((((R)-1-시클로프로필-2-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-2-옥소에톡시)메틸)아미노)-2-옥소에톡시)-3-페닐프로판아미드 18j
화합물 18i(12 mg, 10.9 μmol)를 0.6 mL의 디클로로메탄에 용해시키고 0.3 mL의 디에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축하였다. 2 mL의 톨루엔을 첨가한 후, 감압 하에 농축하고; 절차를 두 번 반복하였다. 잔류물을 3 mL의 n-헥산으로 슬러리화하고, 상부 n-헥산 층을 제거하고; 절차를 세 번 반복하였다. 슬러리를 감압 하에 농축하여 조 표제 생성물 18j(10 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
MS m/z (ESI): 881.0 [M+1].
단계 10
(1r,4r)-N-((2R,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15,18-헥사옥소-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-데카옥사-5,8,11,14,17-펜타아자-테트라헥사덱-46-일)-4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)시클로헥산-1-카르복사미드 18
조 18j(10 mg)를 1 mL의 N,N-디메틸포름아미드에 용해시키고, 화합물 17g(8.5 mg, 12.3 μmol) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(4.6 mg, 16.6 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하고 여과하였다. 여액을 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하였다(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: 엑스브리지 분취용(XBridge Prep) C18 OBD 5 μm 19 × 250 mm; 이동상: A 물(10 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴, 구배 용출, 유속: 18 mL/분). 상응하는 분획을 수집하고 감압 하에 농축하여 표제 생성물 18를 수득하였다(9.5 mg, 56.2% 수율).
MS m/z (ESI): 1570.2 [M+18].
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.77 (d, 1H), 8.59-8.55 (m, 1H), 8.42 (d, 1H), 8.37-8.28 (m, 1H), 8.25-8.06 (m, 2H), 7.96-7.86 (m, 1H), 7.86-7.70 (m, 2H), 7.32-7.28 (m, 1H), 7.25-7.14 (m, 3H), 6.67 (m, 1H), 5.96 (s, 1H), 5.80-5.72 (m, 1H), 5.62-5.52 (m, 2H), 5.43-5.30 (m, 3H), 5.28-5.17 (m, 2H), 5.12-5.08 (m, 1H), 4.72-4.35 (m, 8H), 3.95-3.70 (m, 13H), 3.35-3.22 (m, 14H), 2.42-2.32 (m, 3H), 2.05-1.98 (m, 4H), 1.88-1.82 (m, 12H), 1.47-1.39 (m, 3H), 1.32-1.18 (m, 11H), 0.90-0.80 (m, 4H), 0.52-0.37 (m, 3H), 0.32-0.18 (m, 2H).
실시예 1-19
(1r,4r)-N-((2S,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15,18-헥사옥소-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-데카옥사-5,8,11,14,17-펜타아자-테트라헥사덱-46-일)-4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)시클로헥산-1-카르복사미드 19
Figure pct00055
Figure pct00056
단계 1
벤질 (S)-10-시클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아자운데칸-11-오에이트 19a
화합물 18b(252 mg, 1.22 mmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 디클로로메탄 4mL를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 다음, 리튬 tert-부톡시드(98 mg, 1.22 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음물 수조에서 15분 동안 교반하여 투명하게 되었고, 8b(300 mg, 814.3 μmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음물 수조에서 2.5시간 동안 교반하였다. 액체 분리를 위해 물(10 mL)을 첨가하였다. 수상을 디클로로메탄(8 mL × 2)으로 추출하고, 유기상을 취합하고 물(10 mL × 1) 및 포화 식염수(10 mL × 2)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 C를 사용하는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 19a를 수득하였다(282 mg, 67.2% 수율).
단계 2
(S)-10-시클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아자운데칸-11-오익산 19b
화합물 19a(280 mg, 0.554 mmol)를 8 mL의 에틸 아세테이트에 용해시키고, 탄소 상의 팔라듐(84 mg, 10% 로딩, 건조 기반)을 첨가하였다. 시스템을 수소로 3회 퍼지하고, 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고 셀라이트를 통해 여과한 후, 필터 케이크를 에틸 아세테이트로 헹구었다. 여액을 농축하여 조 표제 생성물 19b(230 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
단계 3
2,4-디메톡시벤질(S)-10-시클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6-디옥소-2,9-디옥사-4,7-디아자운데칸-11-오에이트 19c
조 19b(230 mg, 541.8 μmol)를 7 mL의 디클로로메탄에 용해시키고, 2,4-디메톡시벤질 알코올(136.7 mg, 812.7 μmol), 1-에틸-(3-디메틸아미노프로필)카르보닐디이민 염산염(155 mg, 808.5 μmol) 및 4-디메틸아미노피리딘(6.6 mg, 53.5 μmol)을 차례로 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하고, 10 mL의 디클로로메탄으로 희석하고, 물(10 mL × 1) 및 포화 식염수(10 mL × 2)로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하고, 농축하여 조 생성물을 수득하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 19c를 수득하였다(159 mg, 51.0% 수율).
단계 4
2,4-디메톡시벤질(S)-2-((2-아미노아세틸아미노)메톡시)-2-시클로프로필아세테이트 19d
화합물 19c(60 mg, 104.4 μmol)를 1 mL의 디클로로메탄에 용해시키고 0.5 mL의 디에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축하였다. 2 mL의 톨루엔을 첨가한 후, 감압 하에 농축하고; 절차를 두 번 반복하였다. 잔류물을 3 mL의 n-헥산으로 슬러리화하고, 상부 n-헥산 층을 제거하고; 절차를 세 번 반복하였다. 슬러리를 감압 하에 농축하여 조 표제 생성물 19d(21 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
단계 5
2,4-디메톡시벤질(11S,19S)-11-벤질-19-시클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6,9,12,15-펜타옥소-2,18-디옥사-4,7,10,13,16-펜타자에이코사-20-오에이트 19e
조 19d(36 mg, 102.2 μmol)를 4 mL의 N,N-디메틸포름아미드에 용해시키고, 화합물 17i(52 mg, 103.6 μmol) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(34.6 mg, 125.0 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 10 mL의 물을 첨가한 후, 에틸 아세테이트(10 mL × 3)로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(10 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 19e를 수득하였다(70 mg, 80.2% 수율).
단계 6
(11S,19S)-11-벤질-19-시클로프로필-1-(9H-플루오렌-9-일)-3,6,9,12,15-펜타옥소-2,18-디옥사-4,7,10,13,16-펜타자에이코사-20-오익산 19f
화합물 19e(70 mg, 83.7 μmol)를 디클로로메탄 중 3%(v/v) 디클로로아세트산 용액 2.5 mL에 용해시키고, 용액을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 후, 트리에틸실란(29 mg, 249.4 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 얼음 수조에서 감압 하에 농축하여 유기 용매의 절반을 제거하고, 5 mL의 디에틸 에테르를 첨가하였다. 생성된 혼합물을 실온으로 가온하고 슬러리화하여 백색 고체를 침전시킨 후, 여과하였다. 필터 케이크를 수집하고 오일 펌프로 건조하여 표제 생성물 19f(57 mg, 99.2% 수율)를 수득하였다.
단계 7
(9H-플루오렌-9-일)메틸((2S,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15-펜타옥소-3-옥사-5,8,11,14-테트라아자헥사덱-16-일)카바메이트 19g
화합물 1b(30 mg, 63.6 μmol)를 반응 플라스크에 첨가하고, 디클로로메탄 중 10%(v/v) 메탄올 용액 1 mL를 첨가하였다. 시스템을 아르곤으로 3회 퍼지하고, 혼합물을 얼음물 수조에서 0~5℃로 냉각시킨 후, 한 방울의 트리에틸아민을 첨가하였다. 혼합물을 화합물 1b가 용해될 때까지 교반하였다. 화합물 19f(57 mg, 83.1 μmol)를 디클로로메탄 중 10%(v/v) 메탄올 용액 1 mL에 용해시킨 다음, 전술한 반응 혼합물을 적가한 후, 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(26 mg, 93.9 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 1시간 교반하였다. 10 mL의 디클로로메탄 및 5 mL의 물을 첨가하고, 생성된 혼합물을 5분 동안 교반한 후, 방치하여 층을 형성하였다. 유기상을 수집하고, 수상을 디클로로메탄(10 mL × 3)으로 추출하였다. 유기상을 취합하고, 포화 염화나트륨 용액(10 mL × 2)으로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조하고, 여과하였다. 여액을 감압 하에 농축하였다. 생성된 잔류물을 전개 용매 시스템 B를 사용하는 박층 크로마토그래피로 정제하여 표제 생성물 19g를 수득하였다(56 mg, 79.8% 수율).
MS m/z (ESI): 1103.1 [M+1].
단계 8
(S)-2-(2-(2-아미노아세틸아미노)아세틸아미노)-N-(2-((((S)-1-시클로프로필-2-((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-2-옥소에톡시)메틸)아미노)-2-옥소에틸)-3-페닐프로판아미드 19h
화합물 19g(4.6 mg, 4.16 μmol)을 1.5 mL의 디클로로메탄에 용해시키고 0.75 mL의 디에틸아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.6시간 동안 교반하고, 감압 하에 농축하였다. 2 mL의 톨루엔을 첨가한 후, 감압 하에 농축하고; 절차를 두 번 반복하였다. 잔류물을 3 mL의 n-헥산으로 슬러리화하고, 상부 n-헥산 층을 제거하고; 절차를 세 번 반복하였다. 슬러리를 감압 하에 농축하여 조 표제 생성물 19h(4.0 mg)를 수득하고, 이를 정제 없이 다음 단계에서 직접 사용하였다.
단계 9
(1r,4r)-N-((2S,10S)-10-벤질-2-시클로프로필-1-(((1S,9S)-9-에틸-5-플루오로-9-히드록시-4-메틸-10,13-디옥소-2,3,9,10,13,15-헥사히드로-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-1-일)아미노)-1,6,9,12,15,18-헥사옥소-3,20,23,26,29,32,35,38,41,44-데카옥사-5,8,11,14,17-펜타아자-테트라헥사덱-46-일)-4-((2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일)메틸)시클로헥산-1-카르복사미드 19
조 19h(4.0 mg)를 1 mL의 N,N-디메틸포름아미드에 용해시키고, 화합물 17g(2.9 mg, 4.2 μmol) 및 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 염화물(1.5 mg, 5.4 μmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 40분 동안 교반하고 여과하였다. 여액을 고성능 액체 크로마토그래피로 정제하였다(분리 조건: 크로마토그래피 컬럼: 엑스브리지 분취용(XBridge Prep) C18 OBD 5 μm 19 × 250 mm; 이동상: A 물(10 mmol의 NH4OAc), B 아세토니트릴, 구배 용출, 유속: 18 mL/분). 상응하는 분획을 수집하고 감압 하에 농축하여 표제 생성물 19를 수득하였다(2.1 mg, 32.4% 수율).
1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6): δ 8.71-8.62 (m, 1H), 8.59-8.51 (m, 1H), 8.34-8.26 (m, 1H), 8.14-8.02 (m, 2H), 7.95-7.86 (m, 1H), 7.83-7.69 (m, 2H), 7.35-7.31 (m, 1H), 7.29-7.11 (m, 3H), 7.01 (s, 1H), 6.72-6.50 (m, 3H), 5.59-5.50 (m, 2H), 5.42 (s, 2H), 5.38-5.18 (m, 3H), 4.79-4.69 (m, 2H), 4.61-4.42 (m, 3H), 3.91 (s, 2H), 3.79-3.65 (m, 4H), 3.63-3.44 (m, 13H), 3.41-3.30 (m, 2H), 3.26-3.09 (m, 5H), 3.08-2.84 (m, 4H), 2.81-2.64 (m, 3H), 2.42-2.28 (m, 3H), 2.24-2.12 (m, 2H), 2.05-1.93 (m, 4H), 1.89-1.77 (m, 2H), 1.72-1.56 (m, 3H), 1.53-1.38 (m, 3H), 1.34-1.10 (m, 11H), 0.94-0.78 (m, 5H), 0.52-0.35 (m, 3H).
실시예 1-20(참조 예)
Figure pct00057
표제 화합물 20은 "특허 CN104755494A 명세서 163페이지의 실시예 58"에 개시된 바와 같이 제조하였다.
하기의 항체들은 통상적인 항체 제조 방법을 사용하여 제조할 수 있으며, 예를 들어 벡터 구축, HEK293 세포(라이프 테크놀로지스(Life Technologies) Cat. No. 11625019)와 같은 진핵 세포의 형질 감염, 및 발현 정제화에 의해 수득할 수 있다.
하기는 트라스투주맙의 서열이다:
경쇄
Figure pct00058
서열번호 1
중쇄
Figure pct00059
서열번호 2
하기는 퍼투주맙의 서열이다:
경쇄
Figure pct00060
　서열번호 3
중쇄
Figure pct00061
서열번호 4
하기는 B7H3 항체 1F9DS의 서열이다:
경쇄
Figure pct00062
서열번호 5
중쇄
Figure pct00063
서열번호 6
실시예 1-21. ADC-1
Figure pct00064
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 2.5 mL, 9.96 mg/mL, 0.168 mmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(10 mM, 0.082 mL, 0.82 mmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시키고 5.0 mg/mL로 희석하고, 다음 단계에 사용하기 위해 2.0 mL의 용액을 수집하였다.
화합물 10 - 더 짧은 체류 시간의 화합물(2.1 mg, 2.02 mmol)을 0.10 mL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 용액 2.0 mL에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(5.0 mg/mL, 1.1 mL) 중 FADC-1 일반식의 예시적 생성물 ADC-1을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-HPLC: n = 5.09로 계산한 평균.
실시예 1-22. ADC-2
Figure pct00065
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 2.5 mL, 9.96 mg/mL, 0.168 mmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(10 mM, 0.082 mL, 0.82 mmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시키고 5.0 mg/mL로 희석하고, 다음 단계에 사용하기 위해 2.0 mL의 용액을 수집하였다.
화합물 10 - 더 긴 체류 시간의 화합물(2.1 mg, 2.02 mmol)을 0.10 mL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 용액 2.0 mL에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(4.95 mg/mL, 1.1 mL) 중 FADC-1 일반식의 예시적 생성물 ADC-2을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-HPLC: n = 7.39로 계산한 평균.
실시예 1-23. ADC-3
Figure pct00066
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 2.5 mL, 9.96 mg/mL, 0.168 mmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(10 mM, 0.082 mL, 0.82 mmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시키고 5.0 mg/mL로 희석하고, 다음 단계에 사용하기 위해 2.0 mL의 용액을 수집하였다.
화합물 8(2.1 mg, 2.02 mmol)을 0.10 mL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 용액 2.0 mL에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(5.24 mg/mL, 1.1 mL) 중 FADC-3 일반식의 예시적 생성물 ADC-3을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-HPLC: n = 7.36로 계산한 평균.
실시예 1-24. ADC-4
Figure pct00067
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 3.74 mL, 13.38 mg/mL, 0.338 mmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(10 mM, 0.173 mL, 1.73 mmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시키고 6.7 mg/mL로 희석하고, 다음 단계에 사용하기 위해 1.3 mL의 용액을 수집하였다.
화합물 9 - 더 짧은 체류 시간의 화합물 9-A(1.0 mg, 0.93 mmol)을 0.10 mL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 용액 1.3 mL에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(1.72 mg/mL, 2.36 mL) 중 FADC-4A 일반식의 예시적 생성물 ADC-4을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-HPLC: n = 7.39로 계산한 평균.
실시예 1-25. ADC-5
Figure pct00068
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 3.0 mL, 6.70 mg/mL, 0.136 mmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(10 mM, 0.067 mL, 0.67 mmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시키고, 다음 단계에 사용하기 위해 0.614 mL의 용액을 수집하였다.
화합물 9 - 더 짧은 체류 시간의 화합물 9-A(0.5 mg, 0.42 mmol)을 0.031 mL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 용액 0.614 mL에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(3.08 mg/mL, 0.82 mL) 중 FADC-4A 일반식의 예시적 생성물 ADC-5을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-HPLC: n = 3.16로 계산한 평균.
실시예 1-26. ADC-6
Figure pct00069
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 3.74 mL, 13.38 mg/mL, 0.338 mmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(10 mM, 0.173 mL, 1.73 mmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시키고 6.7 mg/mL로 희석하고, 다음 단계에 사용하기 위해 0.75 mL의 용액을 수집하였다.
화합물 9 - 더 긴 체류 시간의 화합물 9-B(0.68 mg, 0.63 mmol)을 0.10 mL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 용액 0.75 mL에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(1.78 mg/mL, 1.78 mL) 중 FADC-4B 일반식의 예시적 생성물 ADC-6을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-HPLC: n = 3.94로 계산한 평균.
실시예 1-27. ADC-7
Figure pct00070
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 5.0 mL, 10 mg/mL, 0.338 mmol) 중 항체 퍼투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(10 mM, 0.173 mL, 1.73 mmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시키고 5.0 mg/mL로 희석하고, 다음 단계에 사용하기 위해 1.0 mL의 용액을 수집하였다.
화합물 8(0.65 mg, 0.6 mmol)을 0.1 mL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 용액 1.0 mL에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(1.42 mg/mL, 2.15 mL) 중 FADC-7 일반식의 예시적 생성물 ADC-7을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-HPLC: n = 6.91로 계산한 평균.
실시예 1-28. ADC-8
Figure pct00071
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 5.0 mL, 10 mg/mL, 0.338 mmol) 중 항체 퍼투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(10 mM, 0.173 mL, 1.73 mmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시키고 5.0 mg/mL로 희석하고, 다음 단계에 사용하기 위해 1.6 mL의 용액을 수집하였다.
화합물 10 - 더 짧은 체류 시간의 화합물(1.04 mg, 1.0 mmol)을 0.1 mL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 용액 1.6 mL에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(2.14 mg/mL, 2.31 mL) 중 FADC-8 일반식의 예시적 생성물 ADC-8을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-HPLC: n = 6.58로 계산한 평균.
실시예 1-29. ADC-9
Figure pct00072
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 5.0 mL, 10 mg/mL, 0.338 mmol) 중 항체 퍼투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(10 mM, 0.173 mL, 1.73 mmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각시키고 5.0 mg/mL로 희석하고, 다음 단계에 사용하기 위해 0.8 mL의 용액을 수집하였다.
화합물 9 - 더 짧은 체류 시간의 화합물 9-A(0.55 mg, 0.5 mmol)을 0.1 mL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 용액 0.8 mL에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(2.27 mg/mL, 1.11 mL) 중 FADC-9A 일반식의 예시적 생성물 ADC-9을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-HPLC: n = 3.16으로 계산한 평균.
실시예 1-30. ADC-10
Figure pct00073
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 0.574 mL, 38.78 nmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 19.76 μL, 197.6 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 14 - 더 짧은 체류 시간의 화합물(0.64 mg, 588 nmol)을 40 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(5.48 mg/mL, 1.03 mL) 중 FADC-10 일반식의 예시적 생성물 ADC-10을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 6.25로 계산한 평균.
실시예 1-31. ADC-11
Figure pct00074
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 0.646 mL, 43.64 nmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 22.24 μL, 222.4 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 14 - 더 긴 체류 시간의 화합물(0.72 mg, 662 nmol)을 40 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(2.13 mg/mL, 1.87 mL) 중 FADC-10 일반식의 예시적 생성물 ADC-11을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 7.03으로 계산한 평균.
실시예 1-32. ADC-12
Figure pct00075
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 0.726 mL, 49.05 nmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 25.0 μL, 250.0 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 15(0.81 mg, 754 nmol)을 40 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(3.34 mg/mL, 1.45 mL) 중 FADC-12 일반식의 예시적 생성물 ADC-12을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 6.93로 계산한 평균.
실시예 1-33. ADC-13
Figure pct00076
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 0.287 mL, 19.39 nmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 9.88 μL, 98.8 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 16(0.32 mg, 294 nmol)을 20 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(2.37 mg/mL, 0.88 mL) 중 FADC-13 일반식의 예시적 생성물 ADC-13을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 6.53으로 계산한 평균.
실시예 1-34. ADC-14
Figure pct00077
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 0.592 mL, 40.0 nmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 20.38 μL, 203.8 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 17(0.92 mg, 598 nmol)을 40 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(0.30 mg/mL, 12.0 mL) 중 FADC-14 일반식의 예시적 생성물 ADC-14을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 7.61로 계산한 평균.
실시예 1-35. ADC-15
Figure pct00078
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 0.592 mL, 40.0 nmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 20.38 μL, 203.8 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 18(0.93 mg, 599 nmol)을 40 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(0.32 mg/mL, 11.8 mL) 중 FADC-15 일반식의 예시적 생성물 ADC-15을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 7.89로 계산한 평균.
실시예 1-36. ADC-16
Figure pct00079
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 0.53 mL, 35.8 nmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 18.25 μL, 182.5 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 19(0.83 mg, 534 nmol)을 35 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(0.32 mg/mL, 12.0 mL) 중 FADC-16 일반식의 예시적 생성물 ADC-16을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 7.43로 계산한 평균.
실시예 1-37. ADC-17
Figure pct00080
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 2.0 mL, 135.12 nmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 43.2 μL, 432 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 9 - 더 짧은 체류 시간의 화합물 9-A(2.22 mg, 2067 nmol)을 175 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(1.32 mg/mL, 12.0 mL) 중 FADC-4A 일반식의 예시적 생성물 ADC-17을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 5.42로 계산한 평균.
실시예 1-38. ADC-18(참조 예)
Figure pct00081
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 1.5 mL, 101.3 nmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 51.7 μL, 517 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 20(2.0 mg, 1934 nmol)을 100 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(0.79 mg/mL, 13.0 mL) 중 FADC-18 일반식의 예시적 생성물 ADC-18을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 7.23으로 계산한 평균.
실시예 1-39. ADC-19
Figure pct00082
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 1.36 mL, 91.9 nmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 46.9 μL, 469 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 9 - 더 짧은 체류 시간의 화합물 9-A(2.0 mg, 1862 nmol)을 100 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(0.73 mg/mL, 13.0 mL) 중 FADC-4A 일반식의 예시적 생성물 ADC-19을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 6.26으로 계산한 평균.
실시예 1-40. ADC-20
Figure pct00083
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 1.5 mL, 101.3 nmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 51.7 μL, 517 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 10 - 더 긴 체류 시간의 화합물(2.0 mg, 1815 nmol)을 100 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(0.73 mg/mL, 13.0 mL) 중 FADC-1 일반식의 예시적 생성물 ADC-20을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 7.43으로 계산한 평균.
실시예 1-41. ADC-21(참조 예)
Figure pct00084
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 1.86 mL, 125.4 nmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 63.9 μL, 639 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 20(2.07 mg, 2001 nmol)을 150 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(2.91 mg/mL, 4.44 mL) 중 FADC-18 일반식의 예시적 생성물 ADC-21을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 7.23으로 계산한 평균.
실시예 1-42. ADC-22
Figure pct00085
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 1.88 mL, 127.2 nmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 64.9 μL, 649 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 9 - 더 짧은 체류 시간의 화합물 9-A(2.1 mg, 1955 nmol)을 150 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(3.56 mg/mL, 3.98 mL) 중 FADC-4A 일반식의 예시적 생성물 ADC-22을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 6.79로 계산한 평균.
실시예 1-43. ADC-23(참조 예)
Figure pct00086
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 345 mL, 23.31 μmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 11.89 mL, 118.9 μmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3.5시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 20(362 mg, 350 μmol)을 7.12 mL의 MeCN 및 3.56 mL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 2%(v/v) MeCN 및 1%(v/v) DMSO 함유 수성 PBS 완충액(pH 6.5에서 0.05 M 수성 PBS 완충액) 및 수성 숙신산 완충액(pH 5.3의 0.01 M 수성 숙신산 완충액)을 이용한 한외여과막을 통한 탈염으로 정제하였다. 그런 다음, 자당을 60 mg/mL로, 트윈(tween) 20을 0.2 mg/mL로 첨가하였다. 혼합물을 병에 담아 동결건조하여 FADC-18 일반식의 예시적인 생성물 ADC-23의 동결건조된 분말 샘플을 수득한 다음, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 7.05로 계산한 평균.
실시예 1-44. ADC-24
Figure pct00087
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 332 mL, 22.43 μmol) 중 항체 트라스투주맙에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 11.44 mL, 114.4 μmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3.5시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 9 - 더 짧은 체류 시간의 화합물 9-A(241 mg, 224 μmol)를 13.76 mL의 MeCN 및 6.88 mL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 4%(v/v) MeCN 및 2%(v/v) DMSO 함유 수성 PBS 완충액(pH 6.5에서 0.05 M 수성 PBS 완충액) 및 수성 숙신산 완충액(pH 5.3의 0.01 M 수성 숙신산 완충액)을 이용한 한외여과막을 통한 탈염으로 정제하였다. 그런 다음, 자당을 60 mg/mL로, 트윈(tween) 20을 0.2 mg/mL로 첨가하였다. 혼합물을 병에 담아 동결건조하여 FADC-4A 일반식의 예시적인 생성물 ADC-24의 동결건조된 분말 샘플을 수득한 다음, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 7.07로 계산한 평균.
실시예 1-45. ADC-25
Figure pct00088
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 2.14 mL, 144.60 nmol) 중 항체 B7H3 항체 1F9DS에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 73.7 μL, 740 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 9 - 더 짧은 체류 시간의 화합물 9-A(3.0 mg, 2793 nmol)을 150 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(1.28 mg/mL, 13.0 mL) 중 FADC-25 일반식의 예시적 생성물 ADC-25를 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 6.87로 계산한 평균.
실시예 1-46. ADC-26(참조 예)
Figure pct00089
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 0.89 mL, 60.14 nmol) 중 항체 B7H3 항체 1F9DS에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 30.1 μL, 300 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 20(1.0 mg, 967 nmol)을 100 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(1.61 mg/mL, 4.0 mL) 중 FADC-26 일반식의 예시적 생성물 ADC-26을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 6.15로 계산한 평균.
실시예 1-47. ADC-27
Figure pct00090
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 0.89 mL, 60.14 nmol) 중 항체 B7H3 항체 1F9DS에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 30.1 μL, 300 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 9 - 더 짧은 체류 시간의 화합물 9-A(1.02 mg, 950 nmol)을 100 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(1.94 mg/mL, 3.5 mL) 중 FADC-25 일반식의 예시적 생성물 ADC-27을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 6.11로 계산한 평균.
실시예 1-48. ADC-28(참조 예)
Figure pct00091
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 2.36 mL, 159.47 nmol) 중 항체 B7H3 항체 1F9DS에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 81.3 μL, 810 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 20(3.0 mg, 2901 nmol)을 150 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(1.29 mg/mL, 13.0 mL) 중 FADC-26 일반식의 예시적 생성물 ADC-28을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 7.46으로 계산한 평균.
실시예 1-49. ADC-29
Figure pct00092
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 0.80 mL, 50.06 nmol) 중 항체 B7H3 항체 1F9DS에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 28.6 μL, 290 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 9 - 더 짧은 체류 시간의 화합물 9-A(1.29 mg, 1201 nmol)을 100 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(2.63 mg/mL, 2.4 mL) 중 FADC-25 일반식의 예시적 생성물 ADC-29을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 7.24로 계산한 평균.
실시예 1-50. ADC-30(참조 예)
Figure pct00093
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 0.86 mL, 58.4 nmol) 중 항체 B7H3 항체 1F9DS에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 29.1 μL, 290 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 20(1.0 mg, 967 nmol)을 100 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(1.61 mg/mL, 4.0 mL) 중 FADC-26 일반식의 예시적 생성물 ADC-30을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 6.15로 계산한 평균.
실시예 1-51. ADC-31
Figure pct00094
수성 PBS 완충액(pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 10.0 mg/mL, 0.89 mL, 60.14 nmol) 중 항체 B7H3 항체 1F9DS에 제조된 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)(10 mM, 30.1 μL, 300 nmol) 수용액을 37℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 37℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃로 냉각하였다.
화합물 8(1.0 mg, 943 nmol)을 100 μL의 DMSO에 용해시키고, 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조 진탕기에서 25℃에서 3시간 동안 진탕한 후 반응을 종결시켰다. 반응 혼합물을 세파덱스(Sephadex) G25 겔 컬럼(용출 상: pH 6.5의 0.05 M 수성 PBS 완충액, 0.001 M EDTA 함유)을 통해 탈염 및 정제하여 PBS 완충액(1.47 mg/mL, 4.5 mL) 중 FADC-31 일반식의 예시적 생성물 ADC-31을 수득하고, 이를 4℃에서 보관하였다.
UV-Vis: n = 6.33으로 계산한 평균.
실시예 1-52. ADC-32
Figure pct00095
25℃에서, 20 mM 히스티딘-염산 및 2.5 mM EDTA(pH 5.6)를 함유하는 완충액에 5.0 g의 트라스투주맙 모액(34.44 μmol; 트라스투주맙을 20 mM 히스티딘-염산 완충액으로 최종 농도 15 mg/mL로 희석함) 및 34.64 mg의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염(환원제 TCEP, 시그마, 120.84 μmol)을 일정한 온도의 수조에서 3시간 동안 교반하여 중간체 I의 용액을 수득하였다.
화합물 9 - 더 짧은 체류 시간의 화합물 9-A(406.2 mg, 378.17 μmol)를 9.98 mL의 DMSO에 용해시켜 DMSO 중 화합물 9-A의 용액을 수득하였다. DMSO 23.42 mL를 전술한 중간체 I의 용액에 미리 첨가한 다음, 전술한 DMSO 중 화합물 9-A의 용액을 DMSO를 미리 첨가한 중간체 I의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조에서 25℃에서 1시간 동안 교반하고, 시스테인으로 퀀칭(quench)한 후, 여과하였다. 25℃에서, 반응 혼합물에 대하여, 20 mM 히스티딘-염산 및 2.5 mM EDTA(pH = 6.0)의 10%(v/v) DMSO 함유 수성 완충액 및 10 mM 히스티딘-염산(pH = 5.5)의 수성 완충액을 차례로 이용한 한외여과막(30 kd)을 통해 10배 및 16배 부피의 동일 부피 한외여과로 완충액 교환을 실시하여, 소분자 및 잔류 용매를 제거하고, FADC-4A 일반식의 예시적인 생성물 ADC-32를 수득하였다.
HIC: n = 6.0으로 계산한 평균.
실시예 1-53. ADC-33
Figure pct00096
37℃에서, 20 mM 히스티딘-염산 및 2.5 mM EDTA(pH 6.0)를 함유하는 완충액에 8.0 g의 트라스투주맙 모액(55.11 μmol; 트라스투주맙을 20 mM 히스티딘 완충액으로 최종 농도 15 mg/mL로 희석함) 및 123.95 mg의 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 염산염(환원제 TCEP, 시그마, 432.41 μmol)을 일정한 온도의 수조에서 5시간 동안 교반하여 중간체 I의 용액을 수득하였다.
화합물 9 - 더 짧은 체류 시간의 화합물 9-A(754.7 mg, 702.63 μmol)를 15.99 mL의 DMSO에 용해시켜 DMSO 중 화합물 9-A의 용액을 수득하였다. DMSO 37.34 mL를 전술한 중간체 I의 용액에 미리 첨가한 다음, 전술한 DMSO 중 화합물 9-A의 용액을 DMSO를 미리 첨가한 중간체 I의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수조에서 37℃에서 1시간 동안 교반한 후 반응을 종결시키고, 반응 혼합물을 여과하였다. 25℃에서, 반응 혼합물에 대하여, 20 mM 히스티딘-염산 및 2.5 mM EDTA(pH = 6.0)의 10%(v/v) DMSO 함유 수성 완충액 및 10 mM 히스티딘-염산(pH = 6.0)의 수성 완충액을 차례로 이용한 한외여과막(30 kd)을 통해 8배 및 16배 부피의 동일 부피 한외여과로 완충액 교환을 실시하여, 소분자 및 잔류 용매를 제거하고, FADC-4A 일반식의 예시적인 생성물 ADC-33를 수득하였다.
HIC: n = 7.15로 계산한 평균.
ADC 모액의 약물 로딩 분석
실험의 목적 및 원리
ADC는 항체 가교 약물이다. 질병을 치료하는 기제는 항체의 표적화 능력에 따라 독소 분자를 세포 내로 운반하여 세포를 사멸시키는 것이다. 약물 로딩은 약물 효능에 결정적인 역할을 한다. ADC 모액의 약물 로딩은 자외선-가시광선 분광광도법(UV-Vis) 또는 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)에 의해 결정되었다.
1. 자외선-가시광선 분광광도법
숙신산나트륨 완충액이 들어있는 큐벳을 기준 세포 및 샘플 세포에 넣고, 용매 블랭크(blank)의 흡광도를 차감하였다. 그런 다음, 테스트 용액이 들어 있는 큐벳을 샘플 세포에 넣고 280 nm 및 370 nm에서 흡광도를 측정하였다.
계산: ADC 모액의 로딩은 자외선 분광광도법(기기: 써모(Thermo) 나노드롭(nanodrop)2000 자외선 분광 광도계)에 의해 특정 파장에서 ADC 모액의 총 흡광도 값이 해당 파장에서 세포독성 약물 및 단일클론 항체의 흡광도 값의 합이라는 원리에 기반하여 결정하였다.
(1) A280 nm = εmab-280bCmab + ε약물-280bC약물
ε약물-280: 280 nm에서 약물의 평균 몰 흡광 계수는 5100이었다;
C약물: 약물의 농도;
εmab-280: 280 nm에서 트라스투주맙 모액 또는 퍼투주맙 모액의 평균 몰 흡광 계수는 214,600이었다;
Cmab: 트라스투주맙 또는 퍼투주맙의 단일클론 항체 모액의 농도;
b: 광학적 경로 길이는 1 cm이었다.
유사하게, 370 nm에서 샘플의 총 흡광도 값에 대한 방정식은 하기와 같을 수 있다:
(2) A370 nm = εmab-370bCmab + ε약물-370bC약물
ε약물-370: 370 nm에서 약물의 평균 몰 흡광 계수는 19,000이었다;
C약물: 약물의 농도;
εmab-370: 370 nm에서 트라스투주맙 또는 퍼투주맙의 단일클론 항체 모액의 흡광 계수는 0이었다;
Cmab: 트라스투주맙의 단일클론 항체 모액의 농도;
b: 광학적 경로 길이는 1 cm이었다.
약물 로딩은 방정식 (1) 및 방정식 (2) 둘 모두 뿐만 아니라 두 파장 및 이들의 농도에서 단일클론 항체 및 약물의 흡광 계수를 사용하여 계산하였다.
약물 로딩 n = C약물/Cmab.
2. 소수성 상호작용 크로마토그래피
2.1 HPLC 분석은 하기의 측정 조건 하에서 실시하였다:
HPLC 시스템: 애질런트 고성능 액체 크로마토그래프 HPLC 시스템
검출기: DAD 검출기(측정 파장: 280 nm)
크로마토그래피 컬럼: TSKgel 부틸-NPR(4.6 mm × 100 mm, 2.5 μm)
컬럼 온도: 30℃
유속: 0.5 mL/분
샘플 챔버 온도: 4℃
이동상 A: 1.5 M 황산암모늄((NH4)2SO4) 및 20 mM 제2인산나트륨(Na2HPO4)을 함유하는 pH 7.00 수용액.
이동상 B: 75% 20 mM 제2인산나트륨(Na2HPO4) 및 25% 이소프로판올을 함유하는 pH 7.00 혼합 용액.
구배 프로그램: 0.0% B 내지 0.0% B(0분 내지 3.0분), 0.0% B 내지 100.0% B(3.0분 내지 30.0분), 100.0% B 내지
100.0% B(30.0분 내지 33.0분), 0.0% B 내지 0.0% B(33.1분 내지 40.0분),
샘플 주입량: 50 μg
2.2 데이터 분석
현재 데이터를 기준으로 보면, 컬럼의 특성으로 인해 염 농도의 차이를 기준으로, 항체 약물 접합체를 결합된 약물의 수에 따라 오름차순으로 용출하였다. 따라서, 각 피크의 면적을 측정하여 접합된 약물의 수 분포를 구하였다. 용출 순서에 따라, 피크는 D0(약물 링커가 결합되지 않은 항체), D2, D4, D6 및 D8이었다. 약물 로딩 DAR(n)은 하기와 같이 계산하였다:
표 1. 소수성 상호작용 크로마토그래피에 의한 약물 로딩 계산
Figure pct00097
약물 로딩 n = Σ(가중 피크 면적)/100
생물학적 평가
시험예 1-1: 본원에 개시된 화합물에 의한 종양 세포의 시험관내 증식 억제에 대한 시험
I. 목적
본 실험은 U87MG 세포(세포 은행(Cell Bank), 중국과학원(Chinese Academy of Sciences), Cat # TCHu138) 및 SK-BR-3 종양 세포(인간 유방암 세포, ATCC, Cat # HTB-30)의 시험관내 증식에 대한 본 개시의 약학적 조성물의 억제 활성을 결정하고자 한다. 세포를 상이한 농도의 화합물로 시험관내 처리하였다. 배양 6일 후 CTG(셀타이터 글로(CellTiter-Glo)®발광 세포 생존력 분석(Luminescent Cell Viability Assay), 프로메가(Promega), Cat # G7573) 시약을 사용하여 세포 증식을 결정하였고, IC50 값에 따라 화합물의 시험관내 활성을 평가하였다.
II. 방법
U87MG 세포의 시험관내 증식 억제를 시험하는 방법은 종양 세포의 시험관내 증식에 대한 본 개시의 화합물의 억제 활성을 검정하는 방법에 대한 예시로서 하기에 기재하였다. 이 방법은 다른 종양 세포의 시험관내 증식에 대한 억제 활성에 대한 시험에도 적용 가능하지만 이에 제한되지는 않는다.
1. 세포 배양: U87MG 및 SK-BR-3 세포를 각각 10% FBS 함유 EMEM 배지(GE, Cat # SH30024.01) 및 10% FBS 함유 맥코이(McCoy's) 5A 배지(깁코(Gibco), Cat # 16600-108)에서 배양하였다.
2. 세포 증식: 대수기에서 성장하는 U87MG 및 SK-BR-3 세포를 수집하고, PBS(인산염 완충 식염수, 상하이 바살미디어 테크놀로지스(Shanghai BasalMedia Technologies Co., Ltd.))로 1회 세척한 다음, 2~3 mL의 트립신(0.25% 트립신-EDTA(1×), 깁코(Gibico), 라이프 테크놀로지스(Life Technologies))으로 2~3분 동안 분해하였다(digest); 완전히 분해된 후, 세포를 10~15 mL의 세포 배양 배지로 용출하였다; 용출액을 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다; 그런 다음, 세포를 10~20 mL의 세포 배양 배지에 재현탁하여 단일 세포 현탁액을 형성하였다.
3. 세포 분주: U87MG 및 SK-BR-3 단일 세포 현탁액을 각각 잘 혼합하고, 이의 세포 밀도를 세포 배양 배지를 사용하여 각각 2.75 x 103 세포/mL 및 8.25 x 103 세포/mL로 조정하였다; 밀도 조정된 세포 현탁액을 각각 잘 혼합하고 180 μL/웰로 96-웰 세포 배양 플레이트에 첨가하였다. 96-웰 플레이트의 각 주변 웰에는 200 μL의 배지만 첨가하였다. 플레이트를 배양기에서(37℃, 5% CO2) 24시간 동안 배양하였다.
4. 화합물 제조: 화합물을 DMSO(디메틸 설폭사이드, 상하이 티탄 사이언티픽(Shanghai Titan Scientific Co., Ltd.))에 용해시켜 초기 농도 10 mM의 모액을 제조하였다.
소분자 화합물은 초기 농도가 500 nM이었다. 약물 제제는 하기와 같이 실시하였다.
96-웰 U 모양 바닥 플레이트의 제1 컬럼에 100 μM(30 μL) 농도의 상이한 시험 샘플을 첨가하고, 제2 컬럼에서부터 제11 컬럼에 이르기까지 각 웰에 20 μL의 DMSO를 첨가하였다. 제1 컬럼(10 μL)의 샘플을 제2 컬럼의 DMSO 20 μL에 첨가하고, 혼합물을 잘 혼합하였다. 혼합물(10 μL)을 제3 컬럼에서부터 제10 컬럼에 이르기까지 첨가하였다. 플레이트의 약물(웰당 5 μL)을 EMEM 배지(95 μL)로 옮기고, 혼합물을 추후 사용을 위해 잘 혼합하였다.
ADC는 하기와 같이 초기 농도 10 nM 또는 500 nM에서 제조하였다.
96-웰 플레이트의 제1 컬럼에 100 μM 또는 5 μM(100 μL) 농도의 상이한 시험 샘플을 첨가하고, 제2 컬럼에서부터 제11 컬럼에 이르기까지 각 웰에 100 μL의 PBS를 첨가하였다. 제1 컬럼(50 μL)의 샘플을 제2 컬럼의 PBS 100 μL에 첨가하고, 혼합물을 잘 혼합하였다. 혼합물(50 μL)을 제3 컬럼에서부터 제10 컬럼에 이르기까지 3배 희석하여 첨가하였다.
5. 샘플 첨가: 상이한 농도(20 μL)로 제조된 시험 샘플을 각 샘플에 대해 설정된 2개의 이중 웰과 함께 배양 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 배양기에서(37℃, 5% CO2) 6일 동안 배양하였다.
6. 발색: 96-웰 세포 배양 플레이트를 취하고, 각 웰에 90 μL의 CTG 용액을 첨가한 후, 실온에서 10분 동안 배양하였다.
7. 플레이트 판독: 96-웰 세포 배양 플레이트를 꺼내서 화학발광에 대해 마이크로플레이트 판독기(BMG 랩테크(labtech), PHERAstar FS)에서 시험하였다.
III. 데이터 분석
마이크로소프트 엑셀(Microsoft Excel) 및 그래프패드 프리즘(Graphpad Prism) 5를 사용하여 데이터를 처리하고 분석하였다. 실험 결과를 하기의 표 2에 나타내었다.
표 2. SK-BR-3 세포 및 U87 세포의 시험관내 증식 억제에 있어서 본 개시의 소분자 단편의 IC50 값
Figure pct00098
결론: 본 개시의 소분자 단편은 SK-BR-3 세포 및 U87 세포의 증식에 대해 유의적인 억제 활성을 가지며, 키랄 중심은 화합물의 억제 활성에 일정한 영향을 미친다.
시험예 1-2: 본 개시의 항체 약물 접합체에 의한 HER 2 표적화된 종양 세포의 시험관내 증식 억제에 대한 시험
본 실험은 SK-BR-3(인간 유방암 세포, ATCC, Cat # HTB-30) 및 MDA-MB-468(인간 유방암 세포, ATCC, Cat # HTB-132)의 시험관내 증식에 대한 본 개시의 HER2를 표적하는 항체 약물 접합체의 억제 활성을 검출하고자 하였다. 세포를 상이한 농도의 화합물로 시험관내 처리하였다. 배양 6일 후 CTG 시약을 사용하여 세포 증식을 결정하였고, IC50 값에 따라 화합물의 시험관내 활성을 평가하였다.
시험예 1의 시험방법을 따랐다. SK-BR-3 및 MDA-MB-468 세포가 시험에 사용되었으며, 세포 배양 배지는 10% FBS 함유 맥코이 5A 배지(깁코, Cat # 16600-108), 10% FBS 함유 EMEM 배지(GE, Cat # SH 30024.01) 및 10% FBS 함유 L-15 배지(써모피셔(ThermoFisher), Cat # 11415-114)이었다. 3가지 세포 균주의 세포 밀도를 세포 배양 배지를 이용하여 각각 8.33 × 103 세포/mL, 8.33 × 103 세포/mL 및 1.39 × 104 세포/mL로 조절하고, 밀도 조절된 세포 현탁액을 잘 혼합한 후, 96-웰 세포 배양 플레이트에 180 μL/웰로 첨가하였다. 관련 화합물을 시험하고, 시험 결과는 하기의 표 3에 나타내었다.
표 3. HER2 표적을 갖는 종양 세포의 시험관내 증식 억제에 있어서 본 개시의 항체 약물 접합체의 IC50 값
Figure pct00099
결론: 본 발명의 HER2 표적화 항체 약물 접합체는 HER2 양성 SK-BR-3 세포의 증식에 대해 유의한 억제 활성을 나타내는 반면, HER2 음성 MDA-MB-468 세포의 증식에 대해서는 약한 억제 활성을 나타내면서, 양호한 선택성을 보였다.
시험예 1-3: Her2-ADC에 대한 혈장 안정성 시험
샘플 ADC-19, ADC-18 및 ADC-20, 인간 혈장, 원숭이 혈장(상하이 메디실론(Shanghai Medicilon Inc.)) 및 PBS 중 1% BSA(시그마(Sigma)) 용액(산곤 바이오텍(Sangon Biotech, 상하이))은 각각 멸균을 위해 0.22 μm 필터를 통해 여과하였다. ADC-19, ADC-18 및 ADC-20을 각각 멸균 혈장 또는 PBS 중 1% BSA 용액에 200 μg/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 생성된 혼합물을 37℃의 세포 배양기에서 배양하였다. 배양일을 0일로 정의하였다. 7일, 14일 및 21일에 샘플을 취하여 유리 독소에 대해 시험하였다.
25 μL의 샘플을 96-웰 플레이트로 취하고; 50 μL의 내부 표준 작업 용액(아세토니트릴 중 100 ng/mL 캄프토테신 용액) 및 150 μL의 아세토니트릴을 첨가하고; 혼합물을 5분 동안 강한 진동으로 혼합하고(vortex) 10분 동안 원심분리(4000 rpm)한 후, 생성된 샘플 5 μL를 LC/MS/MS(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 미국 소재) 분석에 사용하였다.
결과는 하기와 같이 제시되었다: ADC-19는 유리 독소의 방출율이 최고 2.1% 이하로서 인간 및 원숭이 혈장 모두에서뿐만 아니라 PBS 중 1% BSA 용액에서 상당히 안정적이었고, 14일째에 안정된 경향을 보였다. 도 1a를 참조.
ADC-18은 유리 독소의 방출율이 각각 최고 14.5% 및 8.10%로서 인간 및 원숭이 혈장에서 안정적이지 않았다. 이는 PBS 중 1% BSA 용액에서 비교적 안정적이었다. 도 1b를 참조.
ADC-20은 유리 독소의 방출율이 각각 최고 21.7%, 29.7% 및 21.7%로서 인간 혈장, 원숭이 혈장 및 PBS 중 1% BSA의 용액에서 안정적이지 않았다. 이는 PBS 중 1% BSA의 용액에서 상태가 저하되었다. 도 1c를 참조.
시험예 1-4: JIMT-1 종양 보유 마우스에 대한 약물 효능 평가
I. 목적
시험동물로 nu/nu 누드마우스를 사용하여, Her2-ADC 항체 T-DM1, ADC-21, ADC-24를 복강내 주사한 다음, 트라스투주맙(헤르셉틴(Herceptin)) 내성의 인간 유방암 세포주 JIMT-1 이종이식 종양 누드 마우스에서 이의 효능을 평가하였다.
II. 시험 약물 및 재료
1. 시험 약물
T-DM1(참조 문헌 US20050169933에 의해 제조됨)
ADC-21: 3 mg/kg
ADC-21: 10 mg/kg
ADC-24: 3 mg/kg
ADC-24: 10 mg/kg
대조군(대조): PBS
2. 제조 방법: 모두 PBS에 희석하여 제조함.
3. 시험 동물
nu/nu 누드 마우스, 베이징 바이탈 리버(Beijing Vital River)에서 구입함.
III. 방법
마우스 오른쪽 옆구리에 JIMT-1 세포(난징 코비오어(Nanjing Cobioer))(5 × 106 세포/마우스, 50% 인공 기저막을 포함)를 피하 접종하였다. 8일 후, 종양은 203.09±11.94 mm3의 크기로 성장하였고, 동물을 8 마리(d1)의 6개 군으로 무작위화하였다.
약물은 총 2회 복강내 주사로 투여하였다. 종양 부피 및 체중을 일주일에 2회 측정하고 결과를 기록하였다.
엑셀(Excel) 2003 통계 소프트웨어를 사용하였다. 평균 값은 avg로 계산하였고; SD 값은 STDEV로 계산하였고; SEM 값은 STDEV/SQRT로 계산하였으며; 군간 차이 P 값은 TTEST로 계산하였다.
종양 용적(V)은 다음과 같이 계산하였다. V = 1/2 × L긴 × L짧은 2
상대 부피(RTV) = VT/V0
종양 억제율(%) = (CRTV-TRTV)/CRTV (%)
여기서, V0 및 VT는 각각 실험의 시작과 끝에서의 종양 부피이다. CRTV 및 TRTV는 각각 실험 종료 시 대조군(비히클(vehicle), PBS) 및 실험군의 상대적인 종양 부피이다.
IV. 결과
실험 결과를 도 2에 나타내었다. 2회의 복강내 주사 후 실험을 종료하고 34일 동안 관찰을 실시하였다. T-DM1(10 mg/kg)은 종양에 대한 억제 효과가 없었다; 3 mg/kg의 ADC-21은 46.22%의 종양 억제율을 보였고(P < 0.01); 10 mg/kg의 ADC-21은 56.77%의 종양 억제율을 보였으며(P < 0.001); 3 mg/kg의 ADC-24는 62.77%의 종양 억제율을 보였고(P < 0.001); 10 mg/kg의 ADC-24는 76.32%의 종양 억제율을 보였다(P < 0.001). 동일한 투여량의 조건 하에서, ADC-24의 종양 억제 효과는 ADC-21 보다 유의하게 우수하였다.
시험예 1-5: SK-BR-3 종양 보유 마우스에 대한 약물 효능 평가
I. 목적
시험동물로 nu/nu 누드마우스를 사용하여, Her2-ADC 항체 ADC-21 및 ADC-22를 복강내 주사한 다음, 인간 유방암 세포 SK-BR-3 이종이식 종양 누드 마우스에서 이의 효능을 평가하였다.
II. 시험 약물 및 재료
1. 시험 약물
ADC-21: 1 mg/kg
ADC-21: 6 mg/kg
ADC-22: 1 mg/kg
ADC-22: 6 mg/kg
대조군(대조): PBS.
2. 제조 방법: 모두 PBS에 희석하여 제조함.
3. 시험 동물
nu/nu 누드 마우스, 베이징 바이탈 리버(Beijing Vital River)에서 구입함.
III. 방법
마우스 오른쪽 옆구리에 SK-BR-3 세포(ATCC)(5 × 106 세포/마우스, 50% 인공 기저막을 포함)를 피하 접종하였다. 20일 후, 종양은 153.34±11.73 mm3의 크기로 성장하였고, 동물을 8 마리(d0)의 5개 군으로 무작위화하였다.
약물은 총 1회 복강내 주사로 투여하였다. 종양 부피 및 체중을 일주일에 2회 측정하고 결과를 기록하였다.
엑셀(Excel) 2003 통계 소프트웨어를 사용하였다. 평균 값은 avg로 계산하였고; SD 값은 STDEV로 계산하였고; SEM 값은 STDEV/SQRT로 계산하였으며; 군간 차이 P 값은 TTEST로 계산하였다.
종양 용적(V)은 다음과 같이 계산하였다. V = 1/2 × L긴 × L짧은 2
상대 부피(RTV) = VT/V0
종양 억제율(%) = (CRTV-TRTV)/CRTV (%)
여기서, V0 및 VT는 각각 실험의 시작과 끝에서의 종양 부피이다. CRTV 및 TRTV는 각각 실험 종료 시 대조군 및 실험군의 상대적인 종양 부피이다.
IV. 결과
실험 결과를 도 3에 나타내었다. 1회의 복강내 주사 후 실험을 종료하고 28일 동안 관찰을 실시하였다. 1 mg/kg의 ADC-21은 15.01%의 종양 억제율을 보였고; 6 mg/kg의 ADC-21은 77.4%의 종양 억제율을 나타내었으며, 대조군과 비교하여 유의한 차이를 보였다(P < 0.001). 1 mg/kg의 ADC-22는 19.82%의 종양 억제율을 보였고; 6 mg/kg의 ADC-22는 98.38%의 종양 억제율을 나타내었다(P < 0.001). 6 mg/kg의 동일한 투여량 조건 하에서, ADC-22의 종양 억제 효과는 ADC-21 보다 유의하게 우수하였다.
시험예 1-6: 혈장 안정성
샘플 ADC-25를 인간 혈장, 원숭이 혈장 및 PBS 중 1% BSA 용액 각각에 최종 농도 100 μg/mL로 잘 혼합한 다음, 혼합물을 여과로 멸균하고 37℃ 수조에서 배양하였다. 배양일을 0일로 정의하였다. 7일, 14일 및 21일에 샘플을 취하여 유리 독소에 대해 시험하였다.
상이한 시점의 샘플을 꺼내, 방치하여 실온으로 식힌 다음, 와류에 의해 잘 혼합하였다. 25 μL의 각 샘플을 96-웰 플레이트에 첨가한 다음, 50 μL의 내부 표준 작업 용액(아세토니트릴 중 100 ng/mL 캄프토테신 용액) 및 150 μL의 아세토니트릴을 첨가하였다. 생성된 혼합물을 5분 동안 와류(vortex)시키고 4000 rpm에서 10분 동안 원심분리하였다. 5 μL의 상청액을 LC/MS/MS 분석을 위해 수집하였다.
결과는 하기와 같이 제시되었다: ADC-25는 유리 독소의 방출율이 최고 2% 이하로서 인간 및 원숭이 혈장 모두에서뿐만 아니라 PBS 중 1% BSA 용액에서 상당히 안정적이었고, 14일째에 안정된 경향을 보였다. 도 4를 참조.
시험예 1-7: 인간 뇌 성상세포종 U87MG 누드 마우스 이종이식 종양에 대한 ADC의 효능 평가
I. 목적
BALB/cA 누드 마우스를 시험 동물로 사용하였고, 인간 뇌 성상세포종 U87MG 누드 마우스 이종이식 종양에 대한 본 개시의 ACD 화합물의 효능을 본 실험에서 평가하였다.
II. 시험 약물 및 재료
1. 시험 약물
ADC-27(3 mg/kg)
ADC-26(3 mg/kg)
대조군(대조): pH 7.4의 PBS 완충액.
2. 제조 방법: pH 7.4의 PBS 완충액.
3. 시험 동물
BALB/cA 누드 마우스: 상하이 지에지에 실험 동물 회사(Shanghai Jiesijie Laboratory Animal Co., Ltd.)에서 구입함.
III. 방법
6 내지 7주령의 실험 암컷 BALB/cA 누드 마우스에 인간 뇌 성상세포종 U87MG 세포(인간 뇌 성상세포종, 세포 은행, 중국 과학원, 카탈로그 # TCHu138)를 피하 접종하였다. 세포 접종 10일째에, 동물을 군당 8마리씩 무작위로 분류하고(D0), 총 3회를 주 1회씩 복강내 주사로 투여하고, 종양 부피 및 체중을 매주 2~3회 측정한 후, 데이터를 기록하였다. 종양 부피(V)는 하기와 같이 계산하였다:
V = 1/2 × a × b2
여기서, a 및 b는 각각 길이와 너비를 나타낸다.
상대 부피(RTV) = VT/V0
종양 억제율(%) = (CRTV-TRTV)/CRTV (%)
여기서, V0 및 VT는 각각 실험의 시작과 끝에서의 종양 부피이다. CRTV 및 TRTV는 각각 실험 종료 시 대조군(대조) 및 실험군의 상대적인 종양 부피이다.
IV. 결과
복강내 주사(i.p.) 투여는 총 3회를 주 1회씩 제공하였고; 22일 동안 관찰한 결과, 3 mg/kg의 ADC-27은 종양 억제율이 63.3%(P<0.0001), 3 mg/kg의 ADC-26은 억제율이 49.1%였다. ADC-27은 ADC-26보다 더 강력한 항종양 효능을 보였다.
각 군의 모든 동물의 체중은 투여 과정에서 정상이었고, ADC는 명백한 독성이나 부작용이 없었다. 결과는 표 4 및 도 5에 나타내었다. 검출된 항체는 종양 보유 누드 마우스에서 U87MG 이종이식 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있었고, 용량 의존성을 나타내었다.
표 4. 인간 뇌 성상세포종 U87MG 누드 마우스 이종이식 종양(D22)에 투여한 항체의 효능
Figure pct00100
***은 P < 0.001을 나타냄
시험예 1-8: 흉막 삼출 전이성 인간 인두암 세포 디트로이트 562 누드 마우스 이종이식 종양에 대한 ADC의 효능 평가
I. 목적
BALB/cA 누드 마우스를 시험 동물로 사용하였고, 흉막 삼출 전이성 인간 인두암 세포 디트로이트(Detroit) 562 누드 마우스 이종이식 종양에 대한 본 개시의 ACD 화합물의 효능을 본 실험에서 평가하였다.
II. 시험 약물 및 재료
1. 시험 약물
ADC-29(3 mg/kg)
ADC-28(3 mg/kg)
음성 대조군 ADC(3 mg/kg): 비 B7H3 표적화 항체를 화합물 20에 커플링함으로써 형성된 항체 약물 접합체.
2. 제조 방법: 모두 PBS에 희석하여 제조함.
3. 시험 동물
BALB/cA 누드 마우스: 창저우 카벤스 실험동물 회사(Changzhou Cavens Laboratory Animal Co., Ltd.)에서 구입함.
III. 방법
6 내지 7주령의 실험실 암컷 BALB/cA 누드 마우스에 흉막 삼출 전이성 인간 인두암 세포 디트로이트 562 세포(ATCC, Cat # ATCC®CCL-138™)를 피하 접종하였다. 세포 접종 10일째에, 동물을 군당 8마리씩 무작위로 분류하고(D0), 총 3회를 주 1회씩 복강내 주사로 투여하고, 종양 부피 및 체중을 매주 2~3회 측정한 후, 데이터를 기록하였다. 종양 부피(V)는 하기와 같이 계산하였다:
V = 1/2 × a × b2
여기서, a 및 b는 각각 길이와 너비를 나타낸다.
상대 부피(RTV) = VT/V0
종양 억제율(%) = (CRTV-TRTV)/CRTV (%)
여기서, V0 및 VT는 각각 실험의 시작과 끝에서의 종양 부피이다. CRTV 및 TRTV는 각각 실험 종료 시 대조군(음성 대조군) 및 실험군의 상대적인 종양 부피이다.
IV. 결과
약물을 주 1회 복강내 주사에 의해 투여하였고, 총 3회 주사를 실시하였다. 관찰 28일째에, 시험 ADC ADC-29 3 mg/kg(3 mpk) 및 ADC-28 3 mg/kg mg/kg(3 mpk)의 종양 억제율은 72.27%(P < 0.001) 및 56.2%(P < 0.001)에 각각 도달하였다. ADC-29는 ADC-28보다 더 강력한 항종양 효능을 보였다.
각 군의 모든 동물의 체중은 투여 과정에서 정상이었고, ADC는 명백한 독성이나 부작용이 없었다. 결과는 표 5 및 도 6에 나타내었다. 검출된 항체는 종양 보유 누드 마우스에서 디트로이트 562 이종이식 종양의 성장을 효과적으로 억제할 수 있었고, 용량 의존성을 나타내었다.
표 5. 종양 보유 누드 마우스(D28)에서 디트로이트 562 이종이식 종양에 대한 투여된 항체의 효능
Figure pct00101
***은 P < 0.001을 나타냄
시험예 1-9: U87-MG 종양 보유 마우스에 대한 약물 효능 평가
I. 목적
Balb/c 누드 마우스를 시험 동물로 사용하였고, 마우스의 인간 교모세포종 세포 U87MG 이종이식 종양 모델에서 복강내 주사 후 B7H3-항체 약물 접합체의 효능을 평가하였다.
II. 시험 약물 및 재료
1. 시험 약물
ADC-30 1 mg/kg
ADC-30 3 mg/kg
ADC-31 1 mg/kg
ADC-31 3 mg/kg
대조군(대조): PBS
2. 제조 방법: 모두 PBS에 희석하여 제조함.
3. 시험 동물
BALB/cA 누드 마우스: 상하이 SLAC 실험동물 회사(Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd.)에서 구입함.
III. 방법
마우스 오른쪽 옆구리에 U87MG 세포(인간 뇌 성상세포종, 세포 은행, 중국 과학원, Cat # TCHu138)(2.5 × 106 세포/마우스)를 피하 접종하였다. 14일 후, 종양은 167.49 mm3의 크기로 성장하였고, 동물을 8 마리(d1)의 5개 군으로 무작위화하였다.
약물은 주 1회 복강내 주사로 투여하였고, 총 3회 주사를 제공하였다. 종양 부피 및 체중을 일주일에 2회 측정하고 결과를 기록하였다.
엑셀(Excel) 2003 통계 소프트웨어를 사용하였다. 평균 값은 avg로 계산하였고; SD 값은 STDEV로 계산하였고; SEM 값은 STDEV/SQRT로 계산하였으며; 군간 차이 P 값은 TTEST로 계산하였다.
종양 용적(V)은 다음과 같이 계산하였다. V = 1/2 × L긴 × L짧은 2
상대 부피(RTV) = VT/V0
종양 억제율(%) = (CRTV-TRTV)/CRTV (%)
여기서, V0 및 VT는 각각 실험의 시작과 끝에서의 종양 부피이다. CRTV 및 TRTV는 각각 실험 종료 시 대조군(비히클) 및 실험군의 상대적인 종양 부피이다.
IV. 결과
실험 결과를 도 7에 나타내었다. 약물을 주 1회 복강내 주사에 의해 투여하였고, 총 3회 주사를 실시하였다. 관찰 18일째에, 시험 ADC ADC-30 1 mg/kg, ADC-30 3 mg/kg, ADC-31 1 mg/kg 및 ADC-31 3 mg/kg의 종양 억제율은 0.31%, 45.23%(P < 0.0001), 39.22%(P < 0.01) 및 80.24%(P < 0.0001)에 각각 도달하였다. 동일한 투여량의 조건 하에서, ADC-31의 종양 억제 효과는 ADC-30 보다 유의하게 우수하였다.
II. 제제
제제 준비 및 결정에 사용된 장비 및 결과 계산 방법은 하기와 같다.
SEC 분자 배제 크로마토그래피:
이는 겔 기공의 기공 크기와 고분자 샘플 분자 코일의 크기 사이의 상대적인 관계에 의해 용질의 분리를 분석하는 방법이다.
SEC%(SEC 단량체 함량 백분율) = A 단량체/A 총계 × 100%(단량체는 샘플에서 주요 피크 단량체의 피크 면적을 나타내고, A 총계는 전체 피크 면적의 합을 나타냄).
SEC 측정용 기기: 애질런트(Agilent) 1260; 컬럼: 워터스(waters), 엑스브리지(XBrige) BEH200Å SEC(300 × 7.8 mm 3.5 μm).
CE 모세관 겔 전기영동:
이는 전기영동을 위한 지지 매질로서 모세관(capillary)에 겔을 이동시켜 일정 전압에서 샘플의 분자량에 따라 분리하는 방법이다.
감소된 CE 순도 백분율 = A 주요 피크/A 총계 × 100%(주요 피크는 경쇄 주요 피크 면적 + 중쇄 주요 피크 면적을 나타내고, A 총계는 모든 피크 면적의 합을 나타냄).
CE 측정용 기기: 베크만(Beckman) 모델 plus800
탁도 측정:
빛이 물층을 통과하는 것을 방해하는 정도는 물층이 빛을 산란 및 흡수하는 능력을 나타낸다. 부유 물질의 함량뿐만 아니라 입자 조성, 크기 및 모양, 이의 표면의 반사 성능과도 관련이 있다. 동일한 파장(근자외선 및 가시광선 파장 영역 내)에서 동일한 농도의 동일한 단백질 샘플의 흡수 값을 비교할 때, 흡수 값이 클수록, 탁도가 증가하고, 샘플 내의 단백질 분자가 더 많이 응집되는 경향이 있다. 측정 기기는 다기능 마이크로플레이트 판독기(모레큘라 디바이스(Molecular Devices) M5)이었다. 동일한 부피의 샘플을 96-웰 플레이트에 첨가하고 흡광도 값을 판독하였다.
삼투압 측정:
어는점 내림 법(freezing point method)은 삼투압을 측정하기 위해 사용하였다. 용액의 어는점 내림값과 용액의 몰농도의 비례관계에 기반한 고감도 온도 감지 소자를 이용하여 용액의 어는점을 측정한 다음, 전기량을 통해 삼투압으로 환산한다. 기기 제조사: 로저(Loser), 모델: OM815.
단백질 농도 측정:
항체 약물 접합체의 독소는 280 nm에서 빛을 흡수하기 때문에, 하기의 식을 이용하여 단백질 농도를 보정하였다:
A280 = Cd × ε280d + Cmab × ε280mab
A370 = Cd × ε370d
여기서, Cd는 독소 농도를 나타내고, Cmab은 단백질 농도를 나타내고, ε280d는 280 nm에서 독소의 흡광 계수를 나타내고, ε280mab는 280 nm에서 단백질의 흡광 계수를 나타내고, ε370d는 370 nm에서 독소의 흡광 계수를 나타내고, ε280mab = 1.49 mg-1*cm-1*mL, ε280d = 5000(280 nm에서 독소의 몰 흡광 계수)/1074.13(독소의 분자량) = 4.65 mg-1*cm-1*mL 및 ε370d = 19000(370 nm에서 독소의 몰 흡광 계수)/1074.13(독소의 분자량) = 17.69 mg-1*cm-1*mL이며; 상기 흡광 계수는 대량 소광 계수이었다.
단백질 농도 측정 기기: 자외선-가시광선 분광광도계; 모델: 나노 드롭(Nano Drop) oneC; 광로의 길이: 1 mm.
예시적으로, 네이키드 항체의 분자량은 145.181 kDa이고, 독소의 분자량은 1074 Da이고; 평균 DAR 값이 5.7인 경우, 계산된 ADC 분자량은 151.317 kDa이며, 이는 네이키드 항체의 1.042배이다. 예시적으로, ADC DAR 값이 5.7이고 네이키드 항체 단백질의 농도가 20.00 mg/mL인 경우, ADC 농도는 20.84 mg/mL가 된다.
실시예 2-1. 완충계 및 제제의 pH 값에 대한 선별검사
20 mg/mL(네이키드 항체를 기반으로 한 단백질 농도) ADC-33 제제(당류, 계면활성제 및 하기의 완충계를 제외한 다른 완충제를 함유하지 않음)는 하기의 완충계를 사용하여 제조되었다:
1) 10 mM 히스티딘-아세트산나트륨, pH 5.0
2) 10 mM 히스티딘-아세트산나트륨, pH 5.5
3) 10 mM 히스티딘-아세트산나트륨, pH 6.0
4) 10 mM 히스티딘-아세트산나트륨, pH 6.5
5) 10 mM 히스티딘-히스티딘 염산염, pH 5.5
6) 10 mM 숙신산-숙신산나트륨, pH 5.5
7) 10 mM 구연산-구연산나트륨, pH 5.5
고온 안정성 연구(40℃) 및 진탕 연구(25℃, 300 rpm)를 위해 샘플을 취하였다. 진탕한 샘플은 0.1 mg/mL 폴리소르베이트 80(Ps80)을 함유하고, 다른 샘플들은 0.4 mg/mL PS80를 함유하였다. 각 제제를 여과하고, 용기에 이를 채우고 마개를 막았다. 샘플을 전술한 강제 분해 실험에 적용하고 외관, SEC 및 탁도에 대해 조사하였다.
결과는 표 6에 나타내었다. 그 결과, 히스티딘-아세트산나트륨을 완충액으로 사용한 경우, pH 값이 pH 5.0~6.5 범위에서 증가할수록, 샘플의 외관이 점차 나빠지고, 탁도가 증가하며, SEC 단량체 비율이 감소하는 것으로 나타났다. pH 5.5에서, 10 mM 히스티딘-아세트산나트륨을 함유하는 샘플 및 10 mm 히스티딘 염산염을 함유하는 샘플은 외관 및 SEC%가 유사하였으며, 10 mM 숙신산-숙신산나트륨 또는 10 mM 구연산-구연산 나트륨을 함유하는 샘플보다 우수하였다. 놀랍게도, 10 mM 숙신산-숙신산나트륨을 함유하는 제제는 진탕 연구 후 다른 제제에 비해 탁도가 유의하게 우수하였다.
표 6. pH 및 완충계 안정성 결과
Figure pct00102
참고: 표에서, "D"는 요일을 나타낸다; 예를 들어, D12는 12일을 나타내고, D0은 실험 시작을 나타낸다; 하기에서도 동일하게 적용된다.
실시예 2-2. 계면활성제 종에 대한 선별검사
상이한 폴리소르베이트 계면활성제를 함유하고 각각 10 mM 숙신산-숙신산나트륨(pH 5.0) 완충액 및 80 mg/ml 자당을 함유하는 20 mg/mL(네이키드 항체에 기초한 단백질 농도) ADC-32 제제를 제조하였다. 각 제제를 여과하고, 용기에 이를 채우고 마개를 막았다. 샘플을 고온 안정성 연구(40℃) 및 진탕 연구(25℃, 300 rpm)에 적용하고 외관, SEC 및 감소된 CE에 대해 조사하였다.
결과는 표 7에 나타내었다. PS20(폴리소르베이트 20)-함유 제제와 PS80 함유 제제 사이의 외관, SEC 및 감소된 CE에는 상이한 조건하에서 유의한 차이가 없었으며, 이는 PS20 및 PS80이 모두 ADC-32를 효과적으로 안정화할 수 있음을 나타낸다.
표 7. 폴리소르베이트 종에 대한 선별검사의 결과
Figure pct00103
실시예 2-3. 계면활성제 농도에 대한 선별검사
0, 0.1, 0.2, 0.4 및 0.6 mg/mL PS80을 함유하는 샘플을 제조하였다. 각 샘플은 또한 10 mM 숙신산-숙신산나트륨(pH 5.0), 80 mg/mL 자당 및 20 mg/mL(네이키드 항체를 기반으로 한 단백질 농도) ADC-32를 함유하였다. 샘플을 여과하여 박테리아 및 입자를 제거하고 ADC-32 농도가 0.2 mg/mL가 되도록 0.9% NaCl로 희석하였다. 희석액을 외관 및 불용성 미립자에 대해 조사하였다.
결과는 표 8에 나타내었다. 제제의 PS80 농도가 0~0.2 mg/mL인 경우, 농도가 증가함에 따라, 희석액의 불용성 미세 입자의 증가가 더 적어지고 가시 입자가 점점 더 적어졌다. 농도가 0.2~0.6 mg/mL인 경우, 희석액 사이에 불용성 미립자의 차이가 없었고 외관이 양호하였다.
표 8. PS80 농도에 대한 선별검사의 결과
Figure pct00104
실시예 2-4. 당 종에 대한 선별검사
80 mg/mL 자당, 트레할로스 및 만니톨을 함유하는 상이한 샘플들을 준비하였다. 각 샘플은 또한 10 mM 숙신산-숙신산나트륨(pH 5.0), 0.2 mg/mL PS80 및 20 mg/mL(네이키드 항체를 기반으로 한 단백질 농도) ADC-32를 함유하였다. 샘플을 여과하여 박테리아 및 입자를 제거하였다. 각 제제를 여과하고, 용기에 이를 채우고 마개를 막았다. 샘플을 고온 안정성 연구(40℃) 및 -35℃/4℃ 동결/해동 주기 연구에 적용하고 외관, SEC 및 감소된 CE에 대해 조사하였다.
결과는 표 9에 나타내었다. 동결/해동 조건하에서, 자당은 트레할로스 및 만니톨보다 외관상 더 우수하였다. 자당 및 트레할로스는 SEC 결과에서 만니톨보다 우수하였다. 40℃에서, 자당은 감소된 CE 결과에서 트레할로스보다 약간 우수하였다.
표 9. 당류 종에 대한 선별검사의 결과
Figure pct00105
실시예 2-5. pH, 항체 약물 접합체 농도 및 폴리소르베이트에 대한 선별검사
완충제로 10 mM 숙신산-숙신산나트륨을 사용하고 안정화제로 80 mg/mL 자당을 사용하여, pH, ADC-32 단백질 농도(네이키드 항체 기준) 및 폴리소르베이트 농도에 대해 표 10에 도시된 바와 같이 식을 설계하였다. 고온 안정성 연구(40℃), 조명 연구(4℃, 4500 Lx) 및 -35℃/4℃ 동결/해동 주기 연구를 실시하였으며, 그 결과는 평가 지표로서 SEC 및 감소된 CE를 사용한 최소 제곱법을 통해 통계적으로 분석하였다.
결과는 표 11 및 도 8에 나타내었다. 본 개시의 제제는 pH 의존성이 높은 것으로 나타났다. 조명, 진탕 및 40℃ 조건하에서, pH가 증가함에 따라, SEC가 더 크게 감소하였다; 유사하게, 조명 조건하에서, pH가 증가함에 따라, 감소된 CE가 증가하고, 단량체 피크에서 더 큰 감소가 있었으며, 이는 본 개시의 제제가 개선된 안정성을 갖기 위해 낮은 pH 값이어야 함을 시사한다. 진탕 조건하에서, PS80 농도가 증가함에 따라, SEC에 대한 하향 추세가 있었다. PS80이 다른 조건하에서 SEC 및 감소된 CE에 미치는 영향에는 차이가 없었다. ADC-32 단백질 농도가 증가함에 따라, 40℃에서 SEC 단량체 피크의 감소가 더 커졌다. ADC-32 단백질 농도가 다른 조건하에서 SEC 및 감소된 CE에 미치는 영향에는 차이가 없었다.
표 10. 선별검사 실험에 대한 식의 설계
Figure pct00106
표 11. 식에 대한 선별검사의 결과
Figure pct00107
Figure pct00108
실시예 2-6. 동결건조 공정 개발
10 mM 숙신산-숙신산나트륨 pH 5.0, 80 mg/mL 자당 및 0.2 mg/mL PS80을 함유하는 20 mg/mL의(네이키드 항체를 기반으로 한 단백질 농도) ADC-33 모액을 제조하고, 여과하고, 병에 넣은 다음, 동결건조 공정 매개변수 1(표 12를 참조)에 따라 동결건조시켰다. 동결건조 샘플은 평평한 표면을 가진 백색 분말 케이크 형태이었고 1.05% 물을 함유하였다. 분말 케이크의 바닥은 중앙에서 약간 함몰되었다. 샘플을 주사용수로 재구성하고, pH 값을 측정하였다. 결과는 표 13에 나타내었다. 이온 강도(≥ 10 mM)는 완충하기에 충분히 높았다. 식에는 등삼투압 요구 사항을 충족할 수 있는 80 mg/mL의 자당이 포함되었다.
표 12. 동결건조 공정 매개변수 1
Figure pct00109
표 13. 최종 식의 pH 및 삼투압 결과
Figure pct00110
10 mM 숙신산-숙신산나트륨 pH 5.0, 80 mg/mL 자당 및 0.2 mg/mL PS80을 함유하는 20 mg/mL의(네이키드 항체를 기반으로 한 단백질 농도) ADC-33 모액을 제조하고, 여과하고, 병에 넣은 다음, 동결건조 공정 매개변수 2(표 14를 참조)에 따라 동결건조시켰다. 분말 케이크의 표면은 평평하고 주름 및 함몰을 나타내지 않았다. 0.89%의 물을 함유하였다. 동결건조 공정은 제품 품질에 대한 요구 사항을 충족할 수 있었다.
표 14. 동결건조 공정 매개변수 2
Figure pct00111
10 mM 숙신산-숙신산나트륨 pH 5.0, 80 mg/mL 자당 및 0.2 mg/mL PS80을 함유하는 20 mg/mL의(네이키드 항체를 기반으로 한 단백질 농도) ADC-32 모액을 제조하고, 여과하고, 병에 넣은 다음, 동결건조 공정 매개변수 3(표 15를 참조)에 따라 동결건조시켰다. 분말 케이크의 표면은 평평하고 함몰을 나타내지 않았다. 파우더 케이크의 하단 가장자리가 약간 줄어들었다. 1.17%의 물을 함유하였다. 동결건조 공정은 제품 품질에 대한 요구 사항을 실질적으로 충족할 수 있었다.
표 15. 동결건조 공정 매개변수 3
Figure pct00112
실시예 2-7. 장기 안정성 데이터
10 mM 숙신산-숙신산나트륨 pH 5.0, 80 mg/mL 자당 및 0.2 mg/mL PS80을 함유하는 20 mg/mL의(네이키드 항체를 기반으로 한 단백질 농도) ADC-32 모액을 제조하고, 여과하고, 병에 넣은 다음, 모액의 최종 생성물의 파일럿 배치(batch)는 동결건조 공정 매개변수 2에 따라 제조하고, 2~8℃에서 장기 보관하고, 재구성한 다음, 시험하였다. 결과는 표 16에 나타내었다. D0의 생성물과 비교하여, 2~8℃ M3 조건하의 생성물은 허용 가능한 범위 내에서 SEC, 감소된 CE 및 유리 독소 수준(SEC% ≥ 93%, 감소된 CE% ≥ 95%, 유리 독소 수준 ≤ 330 ppm)을 나타내었다. SEC는 0.5%만큼 약간 감소한 반면, 감소된 CE 및 유리 독소 수준은 모두 변하지 않았다.
표 16. 장기 안정성 데이터 결과
Figure pct00113
참고: 표에서, "M"은 월을 나타낸다; 예를 들어, M3은 3개월을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Jiangsu Hengrui Pharmaceuticals Co., Ltd. Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. <120> PHARMACEUTICAL COMPOSITION COMPRISING ANTIBODY DRUG CONJUGATE AND USE THEREOF <130> 721021CPCT <140> PCT/CN2021/082854 <141> 2021-03-25 <150> CN202010219601.7 <151> 2020-03-25 <150> CN202110287012.7 <151> 2021-03-17 <160> 6 <170> Patent-In 3.5 <210> 1 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of trastuzumab <400> 1 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 2 <211> 450 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of trastuzumab <400> 2 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr 20 25 30 Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val 115 120 125 Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala 130 135 140 Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser 145 150 155 160 Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val 165 170 175 Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro 180 185 190 Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys 195 200 205 Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp 210 215 220 Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly 225 230 235 240 Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile 245 250 255 Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu 260 265 270 Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His 275 280 285 Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg 290 295 300 Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys 305 310 315 320 Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu 325 330 335 Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr 340 345 350 Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu 355 360 365 Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp 370 375 380 Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val 385 390 395 400 Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp 405 410 415 Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His 420 425 430 Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 445 Gly Lys 450 <210> 3 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of pertuzumab <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Ile Gly 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ile Tyr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 4 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of pertuzumab <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Asp Val Asn Pro Asn Ser Gly Gly Ser Ile Tyr Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Leu Ser Val Asp Arg Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asn Leu Gly Pro Ser Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys <210> 5 <211> 215 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of B7H3 antibody 1F9DS <400> 5 Asp Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly 1 5 10 15 Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Ser Ser Gly Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 His Tyr Pro Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Met 35 40 45 Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg Ser Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala 65 70 75 80 Gln Ala Asp Asp Glu Ser Asp Tyr Tyr Cys Ala Ile His Val Asp Arg 85 90 95 Asp Ile Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 100 105 110 Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu 115 120 125 Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr 130 135 140 Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val Lys 145 150 155 160 Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr 165 170 175 Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His 180 185 190 Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys 195 200 205 Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys 210 215 <210> 6 <211> 449 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of B7H3 antibody 1F9DS <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Ser Ser 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Ala Arg Leu Tyr Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Ala Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe 115 120 125 Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu 130 135 140 Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp 145 150 155 160 Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu 165 170 175 Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser 180 185 190 Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro 195 200 205 Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys 210 215 220 Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro 225 230 235 240 Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser 245 250 255 Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp 260 265 270 Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn 275 280 285 Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val 290 295 300 Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu 305 310 315 320 Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys 325 330 335 Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr 340 345 350 Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr 355 360 365 Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu 370 375 380 Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu 385 390 395 400 Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys 405 410 415 Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu 420 425 430 Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly 435 440 445 Lys

Claims (19)

  1. 항체 약물 접합체 및 완충제를 포함하는 약학적 조성물로서,
    항체 약물 접합체는 하기의 일반 화학식(Pc-L-Y-D)의 구조를 가지며:
    Figure pct00114
    ;
    여기서:
    Y는 -O-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-, -O-CR1R2-(CRaRb)m-, -O-CR1R2-, -NH-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)- 및 -S-(CRaRb)m-CR1R2-C(O)-로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    Ra 및 Rb는 동일하거나 상이하고 수소, 중수소, 할로겐, 알킬, 할로알킬, 중수소화 알킬, 알콕시, 히드록시, 아미노, 시아노, 니트로, 히드록시알킬, 시클로알킬 및 헤테로시클릴로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되거나;
    또는, Ra 및 Rb는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클릴을 형성하고;
    R1은 할로겐, 할로알킬, 중수소화 알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 알콕시알킬, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    R2는 수소, 할로겐, 할로알킬, 중수소화 알킬, 시클로알킬, 시클로알킬알킬, 알콕시알킬, 헤테로시클릴, 아릴 및 헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되거나;
    또는, R1 및 R2는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클릴을 형성하거나;
    또는, Ra 및 Rb는 이에 연결된 탄소 원자와 함께 시클로알킬 또는 헤테로시클릴을 형성하고;
    m은 0 내지 4의 정수이고;
    n은 1 내지 10의 정수 또는 소수이고;
    L은 링커 단위이고;
    Pc는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이고;
    약학적 조성물은 4.5 내지 5.2의 pH, 바람직하게는 4.8 내지 5.2의 pH, 및 더 바람직하게는 5.0 내지 5.1의 pH인, 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    약학적 조성물은 계면활성제를 추가로 포함하고, 계면활성제는 바람직하게는 폴리소르베이트, 더 바람직하게는 폴리소르베이트 80 또는 폴리소르베이트 20, 및 가장 바람직하게는 폴리소르베이트 80인, 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    계면활성제는 약 0.01 mg/mL 내지 약 1.0 mg/mL, 바람직하게는 약 0.05 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL, 및 더 바람직하게는 약 0.2 mg/mL인, 약학적 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    조성물은 당류를 추가로 포함하고, 당류는 바람직하게는 자당, 만니톨, 소르비톨 및 트레할로스로 이루어진 군으로부터 선택되고, 더 바람직하게는 자당인, 약학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    당류는 약 60 mg/mL 내지 약 90 mg/mL, 바람직하게는 약 80 mg/mL의 농도인, 약학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 약물 접합체는 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL, 바람직하게는 약 10 mg/mL 내지 약 30 mg/mL, 및 더 바람직하게는 약 20 mg/mL 내지 약 22 mg/mL의 농도인, 약학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    완충제는 히스티딘 염 완충제, 숙시네이트 완충제 및 시트레이트 완충제, 바람직하게는 숙시네이트 완충제, 및 더 바람직하게는 숙신산-숙신산나트륨 완충제로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    완충제는 약 5 mM 내지 약 50 mM, 바람직하게는 약 5 mM 내지 약 20 mM, 및 더 바람직하게는 약 10 mM의 농도인, 약학적 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기의 성분을 포함하고:
    (a) 약 10 mg/mL 내지 약 30 mg/mL의 항체 약물 접합체, (b) 약 0.05 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL의 폴리소르베이트, (c) 약 60 mg/mL 내지 약 90 mg/mL의 당류, 및 (d) 약 5 mM 내지 약 20 mM의 완충제; 여기서 약학적 조성물은 4.8 내지 -5.2의 pH이고;
    바람직하게는 하기의 성분을 포함하고:
    (a) 약 20 mg/mL 내지 약 22 mg/mL의 항체 약물 접합체, (b) 약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80, (c) 약 80 mg/mL의 자당, 및 (d) 약 10 mM의 숙시네이트 완충제; 여기서 조성물은 5.0~5.1의 pH인, 약학적 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 약물 접합체는 하기의 구조를 가지고:
    Figure pct00115
    ;
    여기서:
    n은 3 내지 8의 정수 또는 소수이고;
    Pc는 항체 또는 이의 항원 결합 단편인, 약학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 또는 이의 항원 결합 단편은 항 HER2(ErbB2) 항체, 항 EGFR 항체, 항 B7-H3 항체, 항 c-Met 항체, 항 HER3(ErbB3) 항체, 항 HER4(ErbB4) 항체, 항 CD20 항체, 항 CD22 항체, 항 CD30 항체, 항 CD33 항체, 항 CD44 항체, 항 CD56 항체, 항 CD70 항체, 항 CD73 항체, 항 CD105 항체, 항 CEA 항체, 항 A33 항체, 항 크립토(Cripto) 항체, 항 EphA2 항체, 항 G250 항체, 항 MUC1 항체, 항 루이스(Lewis) Y 항체, 항 VEGFR 항체, 항 GPNMB 항체, 항 인테그린(integrin) 항체, 항 PSMA 항체, 항 테나신-C 항체, 항 SLC44A4 항체 및 항 메조텔린(mesothelin) 항체, 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
    바람직하게는, 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 트라스투주맙(trastuzumab), 퍼투주맙(pertuzumab), 니모투주맙(nimotuzumab), 에노블리투주맙(enoblituzumab), 에미베투주맙(emibetuzumab), 이노투주맙(inotuzumab), 피나투주맙(pinatuzumab), 브렌툭시맙(brentuximab), 젬투주맙(gemtuzumab), 비바투주맙(bivatuzumab), 로보투주맙(lorvotuzumab), cBR96 및 글레마투마맙(glematumamab), 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    항체 접합체는 하기의 구조를 가지고:
    Figure pct00116

    여기서, n은 3 내지 8의 정수 또는 소수인, 약학적 조성물.
  13. 하기의 구조를 갖는 항체 약물 접합체를 포함하는 약학적 조성물로서:
    Figure pct00117

    여기서, n은 3 내지 8의 정수 또는 소수이고;
    약학적 조성물은 하기를 포함하고:
    (a) 약 10 mg/mL 내지 약 30 mg/mL의 항체 약물 접합체, (b) 약 0.05 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL의 폴리소르베이트, (c) 약 60 mg/mL 내지 약 90 mg/mL의 당류, 및 (d) 약 5 mM 내지 약 20 mM의 완충제; 여기서 약학적 조성물은 4.8 내지 5.2의 pH이고;
    바람직하게는, 약학적 조성물은 하기를 포함하고: (a) 약 20 mg/mL 내지 약 22 mg/mL의 항체 약물 접합체, (b) 약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80, (c) 약 80 mg/mL의 자당, 및 (d) 약 10 mM의 숙시네이트 완충제; 여기서 약학적 조성물은 5.0 내지 5.1의 pH인, 약학적 조성물.
  14. 항체 약물 접합체를 포함하는 동결건조 제제로서,
    제제가 재구성되어 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 형성할 수 있는, 동결건조 제제.
  15. 항체 약물 접합체를 포함하는 동결건조 제제를 제조하는 방법으로서,
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 동결건조하는 단계를 포함하는, 방법.
  16. 항체 약물 접합체를 포함하는 동결건조 제제로서,
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 동결건조하는 단계에 의해 수득되는, 동결건조 제제.
  17. 항체 약물 접합체를 포함하는 재구성된 용액으로서,
    제14항 또는 제16항에 따른 동결건조 제제를 재구성함으로써 수득되고;
    바람직하게는, 재구성된 용액은 하기의 성분을 포함하고:
    (a) 약 10 mg/mL 내지 약 30 mg/mL의 항체 약물 접합체, (b) 약 0.05 mg/mL 내지 약 0.5 mg/mL의 폴리소르베이트, (c) 약 60 mg/mL 내지 약 90 mg/mL의 당류, 및 (d) 약 5 mM 내지 약 20 mM의 완충제; 여기서 재구성된 용액은 4.8 내지 5.2의 pH이고;
    더 바람직하게는, 재구성된 용액은 하기의 성분을 포함하고:
    (a) 약 20 mg/mL 내지 22 mg/mL의 항체 약물 접합체, (b) 약 0.2 mg/mL의 폴리소르베이트 80, (c) 약 80 mg/mL의 자당, 및 (d) 약 10 mM의 숙시네이트 완충제; 여기서 재구성된 용액은 5.0 내지 5.1의 pH인, 재구성된 용액.
  18. 제조 물품으로서,
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물을 함유하는 용기, 제14항 또는 제16항에 따른 동결건조 제제, 또는 제17항에 따른 재구성된 용액을 포함하는, 제조 물품.
  19. 질병을 치료하는 방법으로서,
    제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 약학적 조성물, 제14항 또는 제16항에 따른 동결건조 제제, 제17항에 따른 재구성된 용액, 또는 제18항에 따른 제조 물품의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하고,
    바람직하게는, 질병은 HER2, HER3, B7H3 또는 EGFR 발현과 관련된 암이고; 더 바람직하게는, 암은 유방암, 난소암, 자궁경부암, 자궁암, 전립선암, 신장암, 요로암, 방광암, 간암, 위암, 자궁내막암, 침샘암, 식도암, 흑색종, 신경교종, 신경모세포종, 육종, 폐암, 결장암, 직장암, 결장직장암, 백혈병, 골암, 피부암, 갑상선암, 췌장암 및 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
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