KR20220157589A - 효모 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 방법 - Google Patents

효모 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

효모 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

효모 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 방법 {Composition Comprising Extracellular Vesicles Derived from Yeast, and methods related thereto}
본 개시는 효모 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
세포외 소낭(Extracellular vesicle, EV)은 세포가 바깥으로 방출하는 생체막으로 둘러 싸인 작은 주머니 (vesicle)를 지칭하며 작게는 직경 약 20 nm부터 크게는 직경 약 5 μm를 갖는 막 구조 소낭체이다. 원핵생물 및 진핵생물은 모두 세포외 소낭을 분비한다고 알려져 있다. 세포외 소낭은 그 크기와 구성에 있어서 이질성이 있고, 엑소좀(exosome, 약 30 내지 100 nm), 엑토좀(ectosome), 마이크로소낭(microvesicle, 약 100-1,000 nm), 마이크로입자(microparticle), 외막소낭 (outer membrane vesicle) 등의 다수의 상이한 종을 포함한다. 세포외 소낭의 특성은 그 기원이 되는 세포의 특성에 영향을 받는다.
한편, 염증(Inflammation)은 세포 및 조직의 손상이나 감염에 대한 국소적인 또는 전신적인 방어 기작이다. 염증은 주로 면역계를 이루는 수많은 체액성 매개체(humoral mediator)가 직접 반응하거나 국소적 또는 전신적 작동 시스템(effector system)을 자극함으로써 일어나는 연쇄적인 생체반응에 의해 유발된다.
염증 질환은 특히, 염증성 사이토카인의 분비, 이로 인한 조직손상과 치유의 불균형에 의한 조직개형을 특징으로 한다. 현재까지 알려진 주요한 염증성 사이토카인으로는 대식세포 및 단핵구 세포에 의해 생성되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1, 인터루킨-1), IL-6 및 IL-8 등이 있다.
한국특허출원 2016-0083045는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 유래의 세포밖 소포체를 유효성분으로 포함하는 항염 조성물을 개시하고 있다. 또한, 한국특허출원 2018-0052157은 염증을 개선하기 위한 재조합 미생물로부터 유래한 세포외 소낭을 개시하고 있다.
본 발명자들은 염증성 사이토카인을 보다 효과적으로 억제할 수 있고, 재조합 단백질을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는, 효모로부터 유래된 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 조성물을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
KR10-2016-0083045 KR10-2018-0052157
본 개시의 목적은 효모 유래의 세포외 소낭(extracellular vesicles)을 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로, 상기 효모는 코마가타엘라 속(Komagataella genus) 유래의 효모이고, 상기 효모는 재조합 단백질을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는, 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 개시의 다른 목적은 효모 유래의 세포외 소낭(extracellular vesicles)을 유효성분으로 포함하는 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 위한 화장료 조성물로, 상기 효모는 코마가타엘라 속(Komagataella genus)유래의 효모이고, 상기 효모는 재조합 단백질을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는, 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 위한 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 개시의 또 다른 목적은 상기 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 유효한 양을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 개시의 또 다른 목적은 상기 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 위한 화장료 조성물을 개체의 피부에 직접 도포하거나 상기 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 개체의 피부에 접촉 또는 부착하는 것을 포함하는, 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 통한 미용방법을 제공하는 것이다.
본 개시의 일 양상은 효모 유래의 세포외 소낭(extracellular vesicles)을 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로, 상기 효모는 코마가타엘라 속(Komagataella genus) 유래의 효모이고, 상기 효모는 재조합 단백질을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는, 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 개시의 다른 양상은 효모 유래의 세포외 소낭(extracellular vesicles)을 유효성분으로 포함하는 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 위한 화장료 조성물로, 상기 효모는 코마가타엘라 속(Komagataella genus) 유래의 효모이고, 상기 효모는 재조합 단백질을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는, 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 위한 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 개시의 또 다른 양상은 상기 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 유효한 양을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증질환을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 개시의 또 다른 양상은 상기 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 위한 화장료 조성물을 개체의 피부에 직접 도포하거나 상기 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 개체의 피부에 접촉 또는 부착하는 것을 포함하는, 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 통한 미용방법에 관한 것이다.
본 개시에 따르면, 효모 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 방법이 제공된다.
도 1은 코마가타엘라 파피이 발효액에서 분리한 세포외 소낭을 EFTEM(Energy-filtering transmission electron microscopy)을 이용하여 관찰한 그림이다.
도 2는 코마가타엘라 파피이 발효액에서 분리한 세포외 소낭을 NaonoSight NS300을 이용하여 크기와 개수를 측정한 그래프이다.
도 3은 코마가타엘라 파피이 발효액에서 분리한 여러 농도(2×105, 1×106, 5×106, 2×107, 1.2×108, 6×108, 3×109, 1.5×1010)의 세포외 소낭 및 LPS를 마우스 대식세포에 처리한 후, TNF-α를 ELISA MAXTM Deluxe Set로 정량한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 코마가타엘라 파피이 발효액에서 분리한 여러 농도(1×107, 3×107, 1×108, 3×108, 1×109, 1×1010)의 세포외 소낭 및 LPS를 마우스 대식세포에 처리한 후, TNF-α, IL-6를 정량하고 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 코마가타엘라 파피이, 사카로마이세스 세레비지애에서 각각 분리한 여러 농도(5×108, 2.5×108, 1.25×108, 0.625×108)의 세포외 소낭 및 LPS를 마우스 대식세포에 처리한 후, IL-6를 정량하고 흡광도를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
달리　정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속한 분야에 통상적으로 사용되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 개시의 이해를 위해, 하기　정의가 적용될 것이고, 단수형으로 사용되는 용어는 복수형을 포함하며, 이의 역도 마찬가지이다.
용어 '약제학적 조성물'은 유효성분을 함유하는 제제를 의미한다. '제제'라는　용어는　유효성분 이외에 적어도 1종의 추가적인 성분이 약제학적 조성물 중에 존재한다는 것을 의미한다. 약제학적 조성물은 인간 환자와 같은 개체로의 투여에 적합한 제제이다. 약제학적 조성물은 동결건조된 형태, 예를 들면 식염수 또는 물을 사용한 동결건조된 약제학적 조성물의 재구성 후 형성되는 용액, 또는 재구성을 필요로 하지 않는 용액 형태일 수 있다. 약제학적 조성물은 액체 또는 고체일 수 있다.
용어 '투여' 또는 '투여하는 것'은 제약 조성물 또는 유효성분을 대상에게 제공하는 단계를 의미한다. 제약 조성물은 다양한 적절한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
용어 '치료 유효량'은 유의성 있는 부정적이거나 불리한 부작용을 야기하지 않으면서 질환, 장애 또는 이상을 치료하는 데에 요구되는 작용제를 포함하는 약제학적 조성물의 수준, 양 또는 농도를 의미한다.
용어, '치료하다', '치료하는 것' 또는 '치료'는 예를 들어 상처를 입거나 손상된 조직의 치유, 또는 기존의 것이거나 인지된 질환, 장애 또는 이상을 변경, 변화, 강화, 개선, 개량 및/또는 미화하는 것에 의해, 원하는 치료상의 결과를 달성하도록 하는, 질환, 장애 또는 이상의 경감 또는 감소(일부 감소, 상당한 감소, 거의 완전한 감소 및 완전한 감소 포함), 해결 또는　예방(일시적이거나 영구적인 것)을 의미한다.
용어 '예방'은 질병, 장애 또는 질환의 발병의 지연을 의미한다. 질병, 장애 또는 질환의 발병이 예정된 기간 동안 지연된 경우 예방은 완전한 것으로 간주될 수 있다.
용어, '개선'은 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미한다.
용어 '화장료 조성물'은 개체의 피부에 직접 도포하거나 화장료 조성물이 도포된 매체를 개체의 피부에 접촉 또는 부착 피부의 외관 및 건강을 개선시키는 조성물을 지칭한다. 이 점에서, 용어 '피부'는 모발, 손발톱 등을 포함하여, 피부 전체 또는 피부의 임의의 부분을 포함한다.
용어 '개체'는 인간, 및 조류 및 비인간 영장류, 반려동물(companion aminal)(예를 들어, 개 및 고양이), 가축(예를 들어, 돼지, 양, 소)뿐만 아니라, 큰 고양이과 동물(big cat)과 같은 길들여지지 않은 동물(non-domesticated animal)과 같은 비인간 포유동물과 같은 비인간 개체를 모두 포함한다.
본 개시의 일 양상은 효모 유래의 세포외 소낭(extracellular vesicles)을 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로, 상기 효모는 코마가타엘라 속(Komagataella genus) 유래의 효모이고, 상기 효모는 재조합 단백질을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는, 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.
상기 효모는 코마가타엘라 속(Komagataella genus) 유래의 효모일 수 있다. 상기,'코마가타엘라 속(Komagataella genus)'은 '피키아 속(pichia genus)'과 상호 보완적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 코마가타엘라 파피이(K. phaffi)에 속한다는 것이 다중 유전자 서열 분석에 의해 입증된 바 있다. (J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2009) 36 (11) : 1435-8) 상기 코마가타엘라(Komagataella) 속 유래의 효모는 코마가타엘라 파스토리스(K. pastoris), 코마가타엘라 파피이(K. phaffii), 코마가타엘라 슈도파스토리스(pseudopastoris), 코마가타엘라 포풀리(K. poluli), 코마가타엘라 울미(K. ulmi) 및 코마가타엘라 쿠르츠마니이(K. kurtzmanii)에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 세포외 소낭은 재조합 단백질을 발현하지 않는 효모로부터 유래될 수 있다. 재조합 단백질은 성장인자, 시토킨, 항체, 효소, 저해 단백질, 또는 이들의 단편일 수 있다. 상기 재조합 단백질을 발현하지 않는 효모는 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것이 아닌 효모일 수 있다.
상기 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 조성물은 염증질환을 예방 또는 치료하는 것일 수 있다. 상기 염증질환으로는 천식, 만성폐쇄성폐질환, 비염 등의 호흡기질환, 접촉성 피부염, 아토피 피부염 등의 피부질환, 위염, 위궤양, 염증성장염 등의 소화기질환이 포함되며, 기타 감염성 비염, 알레르기성 비염, 만성 비염, 급성 부비동염 및 만성 부비동염 등과 같은 비염 및 부비동염; 급성화농성 중이염 및 만성화농성 중이염 등과 같은 중이염; 세균성 폐렴, 기관지 폐렴, 대엽성 폐렴, 레지오렐라 폐렴 및 바이러스성 폐렴 등과 같은 폐렴; 급성 또는 만성 위염; 감염성 소장결장염, 크론씨 병(Crohn's disease), 특발성 궤양성 대장염, 위막성 대장염 등과 같은 장염; 화농성 관절염, 결핵성 관절염, 퇴행성 관절염 및 류마티스 관절염 등과 같은 관절염; 및 당뇨병, 동맥경화증 등인 것일 수 있다.
상기 염증질환은 특히, 염증성 사이토카인의 분비에 의한 것일 수 있다. 현재까지 알려진 주요한 염증성 사이토카인으로는 대식세포 및 단핵구 세포에 의해 생성되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1, 인터루킨-1), IL-6 및 IL-8 등일 수 있다.
상기 염증질환을 예방 또는 치료하기 위한 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다. 일 구체예의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 개시의 일 구체예의 약제학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 과립제, 엘릭시르제(elixirs), 에어로졸 등의 경구투여용 제제, 외용제, 좌제, 또는 멸균 주사용액의 형태의 비경구투여용 제제로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 개시의 일 구체예의 약제학적 조성물의 경구투여용 고형제제는 적어도 1종의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 상기 경구투여용 고형제제는 상기 부형제 이외에 실리카, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제(활택제)를 포함할 수 있다. 본 개시의 일 구체예의 약제학적 조성물의 경구투여용 액상제제는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 개시의 일 구체예의 약제학적 조성물의 비경구 투여용 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 또는 좌제일 수 있다. 본 개시의 일 구체예의 약제학적 조성물의 비경구 투여용 제제는 주사제로도 제조될 수 있다. 본 개시의 일 구체예의 주사제는 수성 주사제, 비수성 주사제, 수성 현탁 주사제, 비수성 현탁 주사제, 또는 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형 주사제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 개시의 일 구체예의 주사제는 그 종류에 따라 주사용 증류수, 식물유(예를 들어, 낙화생유, 참기름, 동백기름 등), 모노글리세리드, 디글리세리드, 프로필렌글리콜, 캄퍼, 벤조산에스트라디올, 차살리실산비스무트, 아르세노벤졸나트륨, 또는 황산스트렙토마이신 중 적어도 1종을 포함할 수 있고, 선택적으로 안정제나 방부제를 포함할 수 있다.
본 개시의 일 구체예의 약제학적 조성물의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약제학적 조성물은 약 0.1 내지 99 중량%으로 포함될 수 있다.
본 개시의 다른 양상은 상기 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 유효한 양을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 개시의 일 구체예의 약제학적 조성물의 투여하는 단계는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약제학적 조성물의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 일 구체예의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여로는 경피 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 직장 내 투여일 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당 업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다. 또한, 본 개시의 일 구체예의 약제학적 조성물은 활성 물질이 표적 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약제학적 조성물의 유효량은 질환 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 개시의 일 구체예의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약제학적 조성물을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
본 개시의 또 다른 양상은 효모 유래의 세포외 소낭(extracellular vesicles)을 유효성분으로 포함하는 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 위한 화장료 조성물로, 상기 효모는 코마가타엘라 속(Komagataella genus) 유래의 효모이고, 상기 효모는 재조합 단백질을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는, 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 위한 화장료 조성물을 제공한다.
상기 효모는 코마가타엘라(Komagataella) 속 유래의 효모일 수 있다. 상기, 용어 코마가타엘라 속(Komagataella genus)'은 '피키아 속(pichia genus)'과 상호 보완적으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)는 코마가타엘라 파피이(K. phaffi)에 속한다는 것이 다중 유전자 서열 분석에 의해 입증된 바 있다. (J. Ind. Microbiol. Biotechnol. (2009) 36 (11) : 1435-8) 상기 코마가타엘라(Komagataella) 속 유래의 효모는 코마가타엘라 파스토리스(K. pastoris), 코마가타엘라 파피이(K. phaffii), 코마가타엘라 슈도파스토리스(pseudopastoris), 코마가타엘라 포풀리(K. poluli), 코마가타엘라 울미(K. ulmi) 및 코마가타엘라 쿠르츠마니이(K. kurtzmanii)에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 세포외 소낭은 재조합 단백질을 발현하지 않는 효모로부터 유래될 수 있다. 재조합 단백질은 성장인자, 시토킨, 항체, 효소, 저해 단백질, 또는 이들의 단편일 수 있다. 상기 재조합 단백질을 발현하지 않는 효모는 표적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것이 아닌 효모일 수 있다.
상기 세포외 소낭을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 염증성 사이토카인의 분비를 억제하여, 피부를 진정 또는 피부 트러블을 완화할 수 있다. 또한, 본 개시의 조성물을 사람의 피부에 직접 적용한 경우 피부 트러블, 홍조 증상 및 홍반 등을 개선시킬 수 있다. 따라서, 본 개시의 조성물은 피부진정 또는 피부 트러블 완화용 화장료 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다. 현재까지 알려진 주요한 염증성 사이토카인으로는 대식세포 및 단핵구 세포에 의해 생성되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1, 인터루킨-1), IL-6 및 IL-8 등일 수 있다.
본 개시의 화장료 조성물은 상기 효모 유래 세포외 소낭을 유효성분으로 함유하며, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료 등과 같은 통상적인 보조제, 및 담체를 포함할 수 있으며 이에 한정되지 않는다.
본 개시의 일 구체예의 화장료 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 개시의 또 다른 양상은 상기 상기 피부진정 또는 피부완화를 위한 화장료 조성물을 개체의 피부에 직접 도포하거나 상기 화장료 조성물이 도포되거나 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트를 개체의 피부에 접촉 또는 부착하는 것을 포함하는, 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 통한 미용방법을 제공한다.
본 개시의 일 구체예의 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 통한 미용방법은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태로 상기 화장료 조성물을 피부에 직접 도포하거나 개체의 피부에 침적된 패취, 마스크팩 또는 마스크시트 등의 형태로 접촉 또는 부착하는 방법일 수 있다.
이하 본 개시를 구체적인 실시예를 들어 보다 상세히 설명하나, 이는 본 개시의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 개시의 범위를 어떤 식으로든지 제한하고자 하지 않는다.
실시예 1: 코마가타엘라 파피이(Komagataella phaffii)에서 세포외 소낭을 분리
(1) 코마가타엘라 파피이 발효액에서 세포외 소낭 준비
코마가타엘라 파피이(PPS-9010, ATUM사)를 YNB(yeast nitrogen base) 액체 배지에서 30℃, 16시간 동안 배양한 후, 이것을 다시 YNB 액체배지에 2% 양(volume)으로 접종한 후 24시간 동안 진탕 배양하였다. 5000×g로 15분 동안 원심분리하여 효모세포를 제거한 상등액을 얻어낸 후, 이것을 MWCO(Molecular weight cut off) 100 kD 초미세여과막을 이용 초여과하여 20배 농축하였다. 이 농축액을 150,000×g로 3시간 동안 초원심 분리하여 가라앉은 펠릿(pellet)을 얻어낸 후, 이 펠릿을 PBS(Phosphate-buffered saline) 버퍼로 재부유(resuspension)하여 세포외 소낭을 준비하였다.
(2) 코마가타엘라 파피이 발효액에서 세포외 소낭 분석
EFTEM(Energy-filtering transmission electron microscopy, Zeiss사)를 이용하여 준비한 세포외 소낭을 관찰하고(도 1), NaonoSight NS300(Malvern사)를 이용하여 얻어진 세포외 소낭의 사이즈와 개수를 측정하였다(도 2). TEM 및 Nanosight 분석 결과, 코마가타엘라 파피이 발효액에서 세포외 소낭의 직경은 평균 172nm이고, 대부분 100~200 nm 범위 안에 속하는 것으로 관찰되었다.
실험예 1: 코마가타엘라 파피이 유래 세포외 소낭의 생체외 세포독성 실험 결과
(1) 코마가타엘라 파피이 발효액에서 세포외 소낭 준비
코마가타엘라 파피이(PPS-9010, ATUM사)를 YNB(yeast nitrogen base) 액체 배지에서 30℃, 16시간 동안 배양한 후, 이것을 다시 YNB 액체배지에 2% 양(volume)으로 접종한 후 24시간 동안 진탕 배양하였다. 5000xg로 15분 동안 원심분리하여 효모세포를 제거한 상등액을 얻어낸 후, 이것을 MWCO(Molecular weight cut off) 100 kD 초미세여과막을 이용 초여과하여 20배 농축하였다. 이 농축액을 150,000xg로 3시간 동안 초원심 분리하여 가라앉은 펠릿(pellet)을 얻어낸 후, 이 펠릿을 PBS(Phosphate-buffered saline) 버퍼로 재부유(resuspension)하여 세포외 소낭을 준비하였다.
(2) 마우스 대식세포(RAW 264.7 cell) 기반 생체 외 세포 독성 실험
마우스 대식세포 (RAW 264.7 cell, 1×106 cells/well)을 96웰 플레이트에 분주하고 CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 내에 1ug/ml의 지질다당류(LPS, lipopolysaccharide) 및 여러 농도의 코마가타엘라 파피이 세포외 소낭을 세포에 처리하고 24시간 배양하였다. 배양 후, 각 세포 배양액을 수확하여 마우스 종양괴사인자 알파(TNF-α)의 단백질 정량을 제조사 프로토콜에 따라 수행하여 세포독성을 평가하였다. 단백질 정량은 ELISA MAXTM Deluxe Set(Biolegend사)를 사용하여 수행하였다. 분석 결과 도 3에서와 같이 코마가타엘라 파피이에 의한 세포 독성이 없음을 확인하였다.
실험예 2: 코마가타엘라 파피이 유래 세포외 소낭의 생체외 항염 효능 결과
(1) 코마가타엘라 파피이 발효액에서 세포외 소낭 준비
코마가타엘라 파피이(PPS-9010, ATUM사)를 YNB(yeast nitrogen base) 액체 배지에서 30℃, 16시간 동안 배양한 후, 이것을 다시 YNB 액체배지에 2% 양(volume)으로 접종한 후 24시간 동안 진탕 배양하였다. 5000xg로 15분 동안 원심분리하여 효모세포를 제거한 상등액을 얻어낸 후, 이것을 MWCO(Molecular weight cut off) 100 kD 초미세여과막을 이용 초여과하여 20배 농축하였다. 이 농축액을 150,000xg로 3시간 동안 초원심 분리하여 가라앉은 펠릿(pellet)을 얻어낸 후, 이 펠릿을 PBS(Phosphate-buffered saline) 버퍼로 재부유(resuspension)하여 세포외 소낭을 준비하였다.
(2) 마우스 대식세포(RAW 264.7 cell) 기반 생체 외 항염 효능 평가
마우스 대식세포 RAW 264.7 세포 (1.5×105 cells/well)을 48웰 플레이트에 분주하고 CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 내에 1ug/ml의 지질다당류(LPS, lipopolysaccharide) 및 여러 농도의 코마가타엘라 파피이 세포외 소낭을 세포에 처리하고 24시간 배양하였다. 배양 후, 각 세포 배양액을 수확하여 마우스 TNF-α, IL-6(interleukin-6)의 단백질 정량을 Biolegend사의 ELISA MAXTM Deluxe Set을 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 수행하였다. CCK-8(Cell Counting Kit-8, Dojindo사) 용액을 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM에 희석하여 500ul/well로 분주하고 30분 뒤 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 분석 결과 도 4에서와 같이 코마가타엘라 파피이 유래 세포외 소낭은 마우스 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 염증성 시토킨(Cytokine)인 TNF-α, IL-6을 억제하는 능력이 있음을 확인하였다.
비교예 1: 효모 2종 (코마가타엘라 파피이, 사카로마이세스 세레비지애) 유래 세포외 소낭의 생체외 마우스 염증성 사이토카인 mIL-6 억제능 결과 비교
(1) 효모 발효액에서 효모 2종의 세포외 소낭 준비
코마가타엘라 파피이(PPS-9010, ATUM사), 사카로마이세스 세레비지애(ATCC 204508)를 각각 YPD(2% ploypeptone, 2% glucose, 1% yeast extract) 액체 배지에서 30℃ 16시간 동안 배양한 후, 이것을 다시 YPD 액체배지에 2% 양(volume)으로 접종한 후 24시간 동안 진탕 배양하였다. 5000×g로 15분 동안 원심분리하여 효모세포를 제거한 상등액을 얻어낸 후, 이것을 MWCO(Molecular weight cut off) 100 kD 초미세여과막을 이용 초여과하여 20배 농축하였다. 이 농축액을 150,000×g로 3시간 동안 초원심 분리하여 가라앉은 펠릿(pellet)을 얻어낸 후, 이 펠릿을 PBS(Phosphate-buffered saline) 버퍼로 재부유(resuspension)하여 세포외 소낭을 준비하고, NaonoSight NS300(Malvern사)을 이용하여 얻어진 세포외 소낭의 사이즈와 개수를 측정하였다.
(2) 마우스 대식세포(RAW 264.7 cell) 기반 생체 외 항염 효능 평가
마우스 대식세포 RAW 264.7 세포 (1.5×105 cells/well)을 48웰 플레이트에 분주하고 CO2 인큐베이터에서 24시간 배양하였다. 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 내에 10ng/ml의 지질다당류(LPS, lipopolysaccharide) 및 여러 농도의 효모 2종의 세포외 소낭을 세포에 처리하고 24시간 배양하였다. 배양 후, 각 세포 배양액을 수확하여 마우스 IL-6(interleukin-6)의 단백질 정량을 Biolegend사의 ELISA MAXTM Deluxe Set을 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 수행하였다. 배양액을 모두 제거한 플레이트를 사용하여 세포 생존 평가를 수행하였다. CCK-8(Cell Counting Kit-8, Dojindo사) 용액을 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM에 희석하여 500ul/well로 분주하고 30분 뒤 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 분석 결과 도 5에서와 같이 사카로마이세스 세레비지애 유래 세포외 소낭 대비 코마가타엘라 파피이 유래 세포외 소낭이 마우스 대식세포에서 LPS에 의해 유도된 염증성 시토킨(Cytokine) IL-6을 억제하는 능력이 현저하게 높음을 확인하였다.

Claims (8)

  1. 효모 유래의 세포외 소낭(extracellular vesicles)을 유효성분으로 포함하는 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로, 상기 효모는 코마가타엘라 속(Komagataella genus) 유래의 효모이고, 상기 효모는 재조합 단백질을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는, 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 코마가타엘라 속(Komagataella genus) 유래의 효모는 코마가타엘라 파피이(Komagataella phaffii), 코마가타엘라 파스토리스(Komagataella pastoris), 또는 코마가타엘라 슈도파스토리스(Komagataella pseudopastoris)인 것을 특징으로 하는, 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  3. 청구항 1 내지 2 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물은 염증 관련 매개체인 종양 괴사 인자-α (Tumor necrosis factor-α, TNF-α) 또는 인터루킨-6 (Interleukin-6, IL-6)의 분비를 억제 또는 저해하는 것을 특징으로 하는, 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  4. 효모 유래의 세포외 소낭(extracellular vesicles)을 유효성분으로 포함하는 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 위한 화장료 조성물로, 상기 효모는 코마가타엘라 속(Komagataella genus) 유래의 효모이고, 상기 효모는 재조합 단백질을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는, 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 위한 화장료 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 코마가타엘라 속(Komagataella genus) 유래의 효모는 코마가타엘라 파피이(Komagataella phaffii), 코마가타엘라 파스토리스(Komagataella pastoris), 또는 코마가타엘라 슈도파스토리스(Komagataella pseudopastoris)인 것을 특징으로 하는, 피부진정 또는 피부트러블 완화를 위한 화장료 조성물.
  6. 청구항 4 내지 5중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 염증 관련 매개체인 종양 괴사 인자-α (Tumor necrosis factor-α, TNF-α) 또는 인터루킨-6 (Interleukin-6, IL-6)의 분비를 억제 또는 저해하는 것을 특징으로 하는, 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 위한 화장료 조성물.
  7. 청구항 1 내지 2 중 어느 한 항에 따른 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물의 유효한 양을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증질환을 예방 또는 치료하는 방법.
  8. 청구항 4 내지 5 중 어느 한 항에 따른 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 위한 화장료 조성물을 개체의 피부에 직접 도포하거나 상기 화장료 조성물이 도포된 매개체를 개체의 피부에 접촉 또는 부착하는 것을 포함하는, 피부진정 또는 피부 트러블 완화를 통한 미용방법.
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