KR20220156841A - 심장 조직 모델 - Google Patents

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KR20220156841A
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mesoderm
wnt
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KR1020227032606A
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사샤 멘잔
스테판 야넬
파블로 호프바우어
노라 파파이
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아이엠비에이 - 인스티튜트 퓌어 몰레쿨라레 바이오테크놀로지 게엠베하
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Abstract

본 발명은 적어도 60%의 심장 세포의 심장 조직 모델(여기서, 심장 세포는 내부 공동(inner cavity)을 둘러싸고, 심장 세포는 심근세포, 심내막 세포 및 심외막 세포로부터 선택된다); 이러한 조직 모델의 생성 방법 및 이의 용도를 제공한다.

Description

심장 조직 모델
본 발명은 심장 조직 모델(heart tissue model) 생성의 분야에 관한 것이다.
심장은 발달 중의 인간 배아에서 형성되는 최초의 기능적 기관이다. 배아의 생존은 심장 전구세포가 4개의 챔버로 구성된 심장으로 자가 조직화되고, 그 이후의 성숙에 의존한다. 생물학에서 자가-조직화는 세포가 조직화된 조직/기관-유사 구조로 분화할 때에 세포가 자가-조립화하는 능력이다. 적절한 조건하에서 세포가 자가-조직화하는 능력은 조직과 기관이 기능하는 데 중요하다. 누락된 자가-조직화 및 생리학적 모델은 인간의 심장의 발달 및 재생, 선천적 결함 및 심혈관 질환의 병인, 및 약물의 실제 생리학적 및 독성학적 효과를 이해하는 진보를 방해함으로써 막대한 영향을 미친다.
오르가노이드(organoid)라고 불리는 줄기 세포-유래 자가-조직화 조직-유사 구조는 기관의 발달, 생리학 및 질환의 중요한 측면을 재현함으로써 현재 생의학 연구에 혁명을 가져오고 있다. 오르가노이드는 소장 및 대장, 위, 간, 폐, 뇌, 표피, 신장, 망막, 식도, 방광 및 태반에서 생리학적 조직 구조 형성의 측면을 모방하는 줄기 세포로부터 파생되었다. 그러나, 이 분야에서는 극복해야 할 주요 과제가 있다: i) 오르가노이드의 복잡성, 구조 및 형상은 다수의 경우 제어가 곤란하고; ii) 개별 오르가노이드의 재현성은 생체내 개발의 견고성과는 여전히 거리가 멀다.
WO 2019/174879 A1은 전장 내배엽 세포(foregut endoderm cell) 등의 대량의 비-심장 세포를 포함하는 다층 응집체로 성장하는 인공 심장 조직 오르가노이드를 기재한다. 이 모델에서는, 자연 심장에서 발견되는 4개의 거대 챔버로 발전하는 거대 공동(cavity)을 재현하지 않는 몇몇 작은 내부 내배엽 공동만이 발달한다. 또한, 척추동물의 심장관에서 발견되는 심근세포(cardiomyocyte)와 심내피(심장 내피) 사이에는 분리 및 공간 형성(심장 젤리)이 없다. 따라서, 이러한 오르가노이드는 본질적으로 완전히 심장 세포로 구성된 발달 중의 심장의 생체내 상황의 이러한 중요한 측면을 재현하지 않는다. 비심장 세포가 축적되고 심장 챔버로 발전할 적어도 하나의 거대 공동을 갖는 생체내-유사 구조의 형성을 방지하기 때문에, 이 조직 모델의 장기적 발달 및 성숙은 가능하지 않을 것이다.
문헌[참조: Mendjan et al., Cell Stem Cell (2014) Vol. 15, p. 310-325]은 2D 배양에서 초기 중배엽 분화에 대한 연구를 개시한다. 내부 공동(inner cavity)을 갖는 심장 오르가노이드는 수득되지 않았다.
문헌[참조: Halloin et al., Stem Cell Reports(2019) Vol. 13, p. 366-379]는 계통 순도가 높은 심실-유사 심근세포의 심장 현탁 배양물을 개시하고 있다. 내부 공동은 기재되어 있지 않다.
문헌[참조: Ma et al., Nature Communications(2015) Vol. 6, p. 7413]은 세포 성장을 제한하기 위해 PEG-패턴화된 폴리스티렌 미세구조를 사용하여 심장 마이크로챔버로 형성된 조직을 설명한다. 따라서, 이러한 마이크로 챔버는 인공 세포 성장 간섭의 인공물이고, 생체내에서 발생하는 초기 심장 발달에서 자가-조직화에 의한 자연 공동 형성을 반복하지 않는다. 예를 들면, 심근세포와 심내막 사이의 공간(심장 젤리)과 마찬가지로 별도의 심내막 층이 없다.
생체내와 같은 자가-조직화와 유사하고, 초기 심장 발달, 특히 심실의 발달을 재현하는 오르가노이드 등의 조직 모델을 제공할 필요성이 남아 있다. 본 발명은 이러한 조직 모델 및 이를 생성하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 조직 모델의 혈관계의 임의의 추가 세포와 관계없이, 적어도 60% 심장 세포의 심장 조직 모델, 또는 적어도 50% 심장 세포를 포함하는 심장 조직 모델에 관한 것이고; 여기서 심장 세포는 내부 공동을 둘러싸고, 심장 세포는 심근세포, 심내막 세포(endocardial cell)(또는 심장 내피 세포라고도 함) 및 심외막 세포(epicardial cell)로부터 선택된다.
본 발명은 추가로 심장 조직 모델을 생성하는 방법을 제공하고, 이는 a) 바람직하게는 2D 배양에서 다능성 줄기 세포를 제공하는 단계; b1) 바람직하게는 2D 배양에서 다능성 줄기 세포를 제공하는 단계(여기서, WNT 활성화제 및/또는 GSK3-베타 억제제 및/또는 임의의 PI3 키나제 억제제, 및/또는 FGF2, 액티빈 A, BMP4 또는 이들의 조합 중의 어느 하나는 유도 개시로부터 40시간 이내에 다능성 줄기 세포의 적어도 90%의 양으로 다능성 줄기 세포를 분화시켜 다능성을 종료(exit)시키기에 충분한 양으로 존재하고, 이에 의해 중배엽 세포의 응집체를 생성한다), 또는 b2) WNT 활성화제 및/또는 GSK3-베타 억제제의 존재하에 및 추가로 PI3 키나제 억제제 및/또는 FGF2, 액티빈 A, BMP4 또는 이들의 조합 중의 어느 하나의 존재하에 저부착 배양(low attachment culture)의 3D 배양에서 중배엽 분화를 유도하는 단계(여기서, 세포는 배양 용기에 결합하는 대신에 응집하고, 이에 의해 중배엽 세포의 응집체를 생성한다); c) 단계 b)의 중배엽 세포를 저부착 배양의 3D 배양에서 심장 중배엽 세포로 분화시키는 단계(여기서, 상기 세포는 심장 중배엽 형성 및 내부 공동의 형성을 위해 적어도 3일 동안 심장 분화 인자(바람직하게는 BMP4, FGF2, 인슐린) 및 WNT 활성화제의 부재 및/또는 WNT 길항제의 존재하에 배양 용기 대신에 서로 결합하여 세포의 응집체를 형성한다)를 포함한다. 인덱스 "b1"과 "b2"를 함께 "b"라고 한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 방법으로 수득할 수 있는 심장 조직 모델을 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 조직 모델을 사용하는 스크리닝(screening) 및 시험 방법, 또는 시험 또는 스크리닝된 화합물 또는 과발현 또는 과소발현된 유전자의 효과를 관찰하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트(kit)를 제공한다. 키트는 i) WNT 활성화제 및/또는 GSK3-베타 억제제, ii) PI3 키나제 억제제, iii) 저부착 세포 배양 용기를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 적어도 10개의 구획(compartment)을 포함하는 용기 플레이트(vessel plate)를 제공하고, 각 구획에는 본 발명에 따른 조직 모델이 존재한다. 조직 모델은 실질적으로 동일한 발달 단계에 있을 수 있다.
본 발명의 모든 실시양태는 이하의 상세한 설명에서 함께 설명되고, 모든 바람직한 실시양태는 모든 실시양태, 태양, 방법, 심장 조직 모델, 오르가노이드, 용도 및 키트와 유사하게 관련된다. 예를 들면, 키트 또는 이들의 구성요소는 본 발명의 방법에 사용될 수 있거나, 본 발명의 방법에 적합할 수 있다. 기재된 방법에 사용된 임의의 구성요소는 키트의 일부일 수 있다. 본 발명의 조직 모델 또는 오르가노이드는 본 발명의 방법의 결과이거나, 본 발명의 방법 및 용도에 사용될 수 있다. 본 발명의 방법의 바람직한 및 상세한 설명은 본 발명의 수득된 또는 사용된 오르가노이드 또는 조직 모델의 적합성에 대해 유사하게 읽힌다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 실시양태를 서로 조합시킬 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 동물 및 인간의 초기 좌심장, 예를 들면, 심실 및 심방 발달을 연상시키는 하나의 거대 내부 공동을 발달시킬 수 있는 자가-조직화 심장 조직 또는 오르가노이드 모델을 제공한다. 이러한 조직은, 예를 들면, 도 1 및 2 및 14에 제시되어 있다. 조직 모델을 생성하는 본 발명의 방법은 자연 성장 및 신호전달 인자를 사용한다. 이 발달에는 외인성 매트릭스 스캐폴드를 필요로 하지 않는다.
따라서, 본 발명은 조직 모델의 혈관계의 임의의 추가 세포와 관계없이 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 80%의 심장 세포의 심장 조직 모델을 제공하고, 여기서 심장 세포는 내부 공동을 둘러싸고, 심장 세포는 심근세포, 심내막 세포(또는 심장 내피 세포라고도 함) 및 심외막 세포로부터 선택된다(도 6 및 11G). "로부터 선택된"은 선택된 종이 선택가능한 종으로서 그룹화된 구성원 중 어느 하나로부터 수득되는 것을 의미한다. 심장 조직 모델은 특히 본 발명 방법의 방법 단계 c)를 종료하는 경우, 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 80%의 심장 세포를 가질 수 있다. 조직 모델에 침윤하는 추가 세포, 특히 혈관계의 세포를 추가하는 것이 가능하고, 따라서 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 80%의 심장 세포의 수치를 고려하면, 계산되지 않는 경우가 있다. 본 발명의 특징은, 이의 침윤 세포와 관계없이, 박동 심장 모델 등의 심장 세포의 기능이 손상되거나 소실되는 정도까지 침윤 세포가 심장 세포로 치환될 수 있는 한, 동일하게 유지된다. 바람직한 실시양태에서, 심장 조직 모델은 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%의 심장 세포를 포함하고, 심장 세포는 심근세포, 심내막 세포 및 심외막 세포로부터 선택된다(절대 세포 수, 또한 임의의 추가 침윤 세포도 계수함).
본 명세서에 사용된 바와 같이, "포함하는"이라는 용어는, 달리 지정되지 않는 한, 임의의 추가 성분의 존재를 허용한다. 세포와 같은 성분을 수치 범위에 의해 정의되는 양으로 포함하는 것으로 특정되는 본 발명의 조직 등의 조성물은 이의 범위 외의 양으로 해당 성분이 존재하는 것을 제외하는 단서에 적용된다.
특히, 본 발명의 조직 모델은 심장 계통의 세포를 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 특히 바람직하게는 적어도 80%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 90% 포함하는 것과 같이 주로 심장 계통의 세포를 함유한다. 조직 모델은 또한 주요 3개 심장 계통 모두의 전구체인 측판 중배엽(HAND1+) 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, 조직 모델은 적어도 0.5%의 측판 중배엽 세포 및/또는 최대 30%의 측판 중배엽 세포, 예를 들면, 1% 내지 20%의 측판 중배엽 세포를 포함할 수 있다. 특히, 조직 모델은 전장 내배엽 세포를 함유하지 않거나, 전장 내배엽 세포를 최대 5%, 예컨대, 최대 3%, 최대 1% 또는 최대 0.1% 함유한다. 바람직하게는, 본 발명의 심장 조직 모델은 전장 내배엽 유래(예를 들면, SOX17+ 및/또는 EOMES+ 발현) 세포를 최대 3% 포함하거나 전혀 포함하지 않고/않거나, 조혈 세포를 최대 3% 포함하거나 전혀 포함하지 않고, 바람직하게는 조혈 세포를 최대 1% 포함하고/하거나, 외배엽 유래 세포(SOX2+)를 최대 3% 포함하거나 전혀 포함하지 않는다(예: 도 2, 3).
본 발명의 심장 조직 모델의 또 다른 현저한 특징은 이들이 초기 개발에서 자연스럽게 성장한 심장처럼 리드미컬한 박동 활동을 갖는다.
심장 세포는 심근세포, 심내막 세포 및 심외막 세포 등의 몇몇 심장 세포 유형으로부터 선택될 수 있다. 이들 세포 유형의 내용은 본 명세서에 개시된 바와 같은 상이한 치료 옵션에 기초하여 상이할 수 있다. 대부분의 옵션에 따르면, 심장 조직 모델은 최소 40%의 심근세포를 포함한다. 특히 바람직한 실시양태에서, 심장 조직 모델은 심근세포를 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 또는 특히 바람직하게는 적어도 80% 포함한다. 특별한 실시양태에서, 그 수는 심지어 적어도 90%의 심근세포에 도달할 수 있다(예를 들면, 도 4, 6, 10).
본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서, 심장 조직 모델은 적어도 2%, 바람직하게는 적어도 5%, 더욱 더 바람직하게는 적어도 8%의 심내막 세포를 포함한다. 심내막 세포는 생체내에서 심내막을 형성하는 심장 내피 세포이다. 이들은 본질적으로 심장 계통의 내피 세포이다. 심내막 세포는 본 발명의 조직 모델의 내측(내부 공동을 향함), 또는 일부 경우에는 외측 구획/라이닝(lining)을 형성한다. 이러한 세포는 발현 마커 NPR3, NFATC1, HOX1, HOX2, HOX3, HOX4, HOX5에 의해 동정될 수 있다. 여기서 중요한 점은 이러한 내피 세포(EC)가 생체내 심내막(심장의 실제 EC)과 가장 유사하다는 것이다(예: 도 4). 이들은 비심장 기원의 대조군 EC와 비교하여 더 높은 수준의 NPR3 및 NFATC1을 발현한다. 여기에서 모든 세포 비교는 관련된 특징적 마커 또는 특징 마커의 발현을 발현하는 세포를 유지하기 위한 세포 배양의 표준적 조건하에 수행되고, 특히 이에 따라 마커 또는 마커 발현이 세포 고유의 특성으로 결정될 수 있고; 이러한 조건은 통상 대기압하 및 세포의 생리적 온도에서 유지에 필요한 모든 영양소로 이루어진 배지를 포함한다. 본 발명의 조직 모델의 EC는 또한 심장에 전형적인 정확한 HOX 유전자(HOX1-5)를 발현한다(예: 도 4). 이들 세포의 또 다른 특징은 기계감수성 유전자(SOX18, KLF2, CDH5, FOS, TEK, FOXO1)의 활성화를 나타낸다는 것이다(예: 도 4, 도 19). 이는 EC가 심근세포와 혼합되어 있는 기타 비자가-조직화 오르가노이드의 EC와의 차이로 간주된다. 기계감수성 유전자의 발현은 보다 기능적 EC의 중요한 생물학적 특징이다. 따라서, 본 발명의 심내막 세포는 이전의 2D 및 3D 모델에서 EC보다 더 기능적이다.
본 발명에 따르면, 심내막 세포의 양은 조직 모델의 성장 중에 제어될 수 있다. 조직 모델은 적어도 2%, 바람직하게는 적어도 4%, 또는 적어도 8%, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%의 심내막 세포 등의 상이한 양의 심내막 세포를 가질 수 있다. 심내막 세포의 형성을 제어하는 1개의 옵션은 조직 모델 생성 중에 VEGF(혈관 내피 성장 인자)를 사용하는 것이다. VEGF가 사용되지 않은 경우, 통상, 특히 내층으로서, 10% 미만 등의 소량의 심내막 세포가 형성된다. 이러한 자가 발달 EC는 내피 마커 CD31 및 CDH5를 발현한다(예: 도 8, 도 19).
본 발명의 조직 모델은 바람직하게는 중공 형태이고, 바람직하게는 내부 공동을 둘러싸고, 바람직하게는 또한 내부 공동에 면하는 심내막 세포의 연속 층을 갖는다(예를 들면, 도 2, 8, 11G). 연속 층은 바람직하게는 홀을 갖지 않고 내부 공동의 중심으로부터 볼 때 모든 방향으로 내부 공동을 완전 포위하고 있다.
본 발명의 조직 모델은 구조화된 조성을 갖고, 특정 유형의 세포는 통상 특정 구획에서 발견된다. 이러한 구획은 통상 층이다. 바람직하게는, 본 발명의 심장 조직 모델은 상이한 조직 층에 심근세포 및 심내막 세포를 포함한다. 심내막 세포는 별개의 조직 층, 바람직하게는 내층 및/또는 외층에 존재할 수 있다(예: 도 4, 7, 8).
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 내피 세포의 구획, 바람직하게는 층과, 심근세포의 구회, 바람직하게는 층과의 사이에, 이 발달 단계에서 생체내에서 관찰되는 바와 같이 (심장관 심장 젤리) 공간이 있다(예: 도 7).
추가의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 심장 조직 모델은 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 또는 적어도 95%의 심근세포를 포함한다(예: 도 4, 6).
심근세포는 심장 근육 세포이고, 주로 조직 모델의 박동 활동을 담당한다. 이들은 본 발명의 조직 모델의 주요 구성요소이고, 내부 공동을 둘러싸는 조직 모델에서 층을 형성한다. 초기 발달 조직에서, 이들은 내부 공동을 직접 향할 수 있지만, 후기 및 보다 발달된 조직에서 내층은 심내막 세포에 의해 형성된다(예: 도 2, 8).
본 발명의 조직 모델은 본질적으로 중공 형태이고, 바람직하게는 내부 공동을 둘러싸고 있는 심근세포의 연속 층을 갖는다. 연속 층은 바람직하게는 홀을 갖지 않고, 내부 공동의 중심으로부터 볼 때 모든 방향으로 내부 공동을 완전 포위한다.
본 발명의 조직 모델의 한 가지 중요한 태양은 이것이 고순도의 심장 세포로 발달한다는 것이다. 외배엽, 내배엽 세포 및 조혈 내피 세포 등의 비심장 세포는 존재해서는 안 되고(예: 도 2, 3), 또는 중배엽 세포로부터 심장 세포로 분화할 때까지 본 발명의 개발 후에 조직 모델에 첨가되는 경우와 같이 매우 소량으로 존재해서는 안 된다. 따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조직 모델은 내배엽 세포를 포함하지 않거나, 최대 5%, 바람직하게는 최대 2% 또는 최대 1%의 내배엽 세포를 포함한다. 또한, 또는 이와 조합하여, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 조직 모델은 조혈 내피 세포를 포함하지 않거나, 또는 최대 5%, 바람직하게는 최대 2% 또는 최대 1%의 조혈 내피 세포를 포함한다.
이후에 조직 모델에 첨가되는 것이 바람직한 한 가지 세포 유형은 심외막 세포이다. 이들 세포는 본 발명의 조직 모델을 둘러싸는 층을 형성할 수 있다. 심외막 세포는 바람직하게는 세포 마커 WT1 및 TCF21을 발현한다(예: 도 10). 본 발명의 조직 모델은 적어도 0.5%, 바람직하게는 적어도 5% 또는 적어도 10%의 심외막 세포, 예를 들면, 0.5% 내지 30% 심외막 세포를 가질 수 있다(예: 도 11).
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 심장 조직 모델은 심외막 유래 평활근 세포(심장 평활근 세포로도 지칭됨) 및/또는 심외막 유래 심장 섬유아세포("심내막 유래 섬유아세포"로도 지칭됨 또는 간단히 "심장 섬유아세포"로도 지칭됨)를 포함한다. 이러한 유형의 평활근 세포(SMC) 및 섬유아세포는 심장 외막으로부터 발생하고, 심장 이외의 계통의 것은 아니다. 이러한 세포 유형의 심장 계통은 오르가노이드 내의 분포에 특정 패턴을 유발하고, 평활근 세포 마커 SM22 및/또는 칼포닌 및 심장 섬유아세포 마커 DDR2 및/또는 비멘틴 등의 상이한 발현 마커 패턴을 유발한다. 이러한 세포(심장 계통의 SMC 및 섬유아세포 모두)는 심근세포 조직 또는 층으로 이동한다(예: 도 10, 11).
특정 실시양태에서, 심장 조직 모델은 최대 3%, 바람직하게는 최대 1%의 비-심외막 평활근 세포를 포함하거나 전혀 포함하지 않고/않거나, 최대 3%, 바람직하게는 최대 1%의 비-심외막 섬유아세포, 즉 심장 계통이 아니고 심외막으로부터 발생하지 않는 SMC 및 섬유아세포를 포함하거나 전혀 포함하지 않는다. 비-심장 세포는 심장 모델의 자연적 거동에 대한 조사를 방해할 수 있기 때문에, 심장 조사가 방해받지 않도록, 존재하지 않거나 소량으로 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 조직 모델은 인공적이고, 발생의 자연 원리를 사용하여 배양에서 성장하지만, 임의의 생체내 심장 발달에서의 생체내 성장한 심장은 아니다. 배양 프로세스로 인해, 통상 크기는 제한된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 심장 조직 모델은 0.5mm 내지 1mm 등, 0.3mm 내지 15mm의 최대 치수(dimension)의 크기를 갖는다. 조직 모델은 통상 본질적으로 구형을 형성하는 중공의 형상이지만, 불규칙성이 있는 경우가 있다. 따라서, 참조를 위해, 해당 형상의 최대 치수를 사용하여 크기를 결정한다(예: 도 1, 2).
이 크기는 통상, 1개의 공동을 발달시키는 단계 a) 내지 c) 후에 본 발명의 방법에 의해 수득되는 오르가노이드에 적용된다. 본 발명의 심장 조직 모델을 융합하는 것이 가능하고, 이에 의해 보다 큰 하나 이상의 내부 공동을 갖는 구조를 생성할 수 있다. 이어서, 바람직한 크기는 이의 융합 조직 모델의 하나의 챔버, 즉 주변 조직을 갖는 1개의 내부 공동에 적용되고, 또 다른 내부 공동을 둘러싸는 조직 층으로 확장되지 않는다.
내부 공동은 매우 크고(이전의 심장 조직 모델과 비교하여), 조직 모델 용적의 대부분을 점유한다(단일 공동 오르가노이드 및 융합 오르가노이드 모두). 바람직하게는, 최대 치수에서의 내부 공동의 크기는 최대 치수에서의 심장 조직 모델 크기의 적어도 60%이다. 상기와 같이, 하나 이상의 내부 공동을 갖는 융합된 오르가노이드의 경우, 이는 1개의 공동에만 적용된다(및 주변 조직이고, 또 다른 내부 공동을 둘러싸는 조직 층으로 확장되지 않음)(예: 도 1, 2).
바람직하게는, 조직 모델은 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포 또는 비인간 영장류 세포, 또는 설치류, 마우스, 햄스터, 돼지, 고양이, 개, 말, 소 세포의 것이다.
본 발명은 추가로, a) 다능성 줄기 세포를 제공하는 단계, b) 저부착 배양에서의 3D 배양에서, WNT 활성화제 및/또는 GSK3-베타 억제제의 존재하에 및 추가로 PI3 키나제 억제제의 존재하에 중배엽 분화를 유도하는 단계(여기서, 배양 용기 대신에 세포들이 서로 결합하여 세포의 응집체를 형성하고, 이에 의해 중배엽 세포의 응집체를 생성한다), c) 단계 b)의 중배엽 세포를, 심장 중배엽 형성 및 내부 공동의 형성을 위해, 심장 분화 인자의 존재 및 WNT 활성제의 부재 및/또는 WNT 길항제의 존재하에 저부착 배양에서 3D 배양에서 적어도 3일 동안, 바람직하게는 3 내지 7일 동안 심장 세포로 분화시키는 단계를 포함하는, 심장 조직 모델을 생성하는 방법을 제공한다(예: 도 1).
단계 b)는 b) WNT 활성화제 및/또는 GSK3-베타 억제제의 존재하에 중배엽 분화 유도 등의 유사한 효과로 변화시킬 수 있고, 여기서 WNT 활성화제 및/또는 GSK3-베타 억제제 및/또는 선택적 PI3 키나제 억제제는 유도 개시로부터 40시간 이내에 다능성 줄기 세포의 적어도 90%의 양으로 다능성 줄기 세포를 분화시켜 다능성을 종료시키기에 충분한 양으로 존재하고, 이에 의해 중배엽 세포의 응집체를 생성하고, 세포는 액티빈 A, 골 형태형성 단백질, 섬유아세포 성장 인자 및/또는 알부민으로 처리된다. 이 경우, PI3 키나제 억제제는 필요하지 않지만, 여전히 바람직하다.
특히 바람직한 실시양태에서, 단계 b)에서 WNT 활성화제 및/또는 GSK3-베타 억제제에 의한 치료는 단계 c)에서 골 형태형성 단백질, 특히 BMP4에 의한 치료와 조합된다. 바람직하게는, 골 형태형성 단백질, 특히 BMP4는 단계 b)에서 세포의 치료에 이미 사용될 수 있다. 골 형태형성 단백질의 사용은 강력한 공동 형성 및, 그 결과, 박동 심장 모델의 생성에 특히 유리하다.
생체내 배아 발생 동안, 심장은 발생 중의 인간 배아에서 형성되는 첫 번째 기능적 기관이다. 배아의 생존은 심장 전구세포의 4개의 챔버 심장으로의 자가 조직화 및 그 이후의 성숙에 의존한다. 생물학에서 자가-조직화는 세포가 조직화된 조직/기관-유사 구조로 분화할 때에 세포가 자가-조립하는 능력이다. 적절한 조건하에서 자가-조직화하는 세포의 이러한 능력은 조직과 기관이 기능하는 데 중요하다. 본 발명의 방법은, 본 발명의 오르가노이드로의 자가-조직화를 가능하게 하는 조건을 제공하고, 여기에는 임의의 인공 스캐폴드에 의해 보조되지 않은, 거대 중앙 공동의 자가-조직화된 형성을 포함한다. 중합체 스캐폴드 등의 스캐폴드가 필요하지 않고 본 발명의 최종 조직 모델에도 존재하지 않는다는 것은 본 발명의 현저한 특징이다. 본 발명에 따라 회피할 수 있는 이러한 스캐폴드는, 예를 들면, 문헌[참조: Ma et al. (상기 배경 섹션)]에 기재된 것들이고, 예를 들면, 조직 모델의 최대 치수의 적어도 75%에 확장하는 등의 조직 모델의 대부분에 도달하는 중합체가 포함된다. 또한, 바람직하게는, 회피되는 것은, 예를 들면, 분자량이 1 Mio Da 이상인 중합체의 고분자 중합체 스캐폴드이다.
본 발명의 방법에 따르면, 자가-조직화는 성장 인자 신호전달에 의해 구동되고, 중합체 스캐폴드(Ma et al., 상기) 또는 마트리겔(Matrigel) 등의 외인성 세포외 매트릭스(WO 2019/174879 A1)를 필요로 하지 않지만, 마트리겔은 중합체 스캐폴드와 같이 방해가 되지 않기 때문에 여전히 사용될 수 있다. 세포외 매트릭스의 첨가는 오르가노이드 형성의 변동성을 증가시키기 때문에 회피하는 것이 여전히 바람직하다.
본 발명의 방법은 중배엽 및 심장 세포로 분화되는 다능성 세포(pluripotent cell)를 사용하는 것에 기초한다. 처음에, 다능성 세포는 일반적 2D 배양으로 배양할 수 있지만, 적어도 단계 c) 이후부터는 배양은 저부착 배양 용기에서 가능한 것과 같이 3D 배양이어야 한다. 단계 b)는 2D일 수 있거나, 바람직하게는 또한 3D일 수 있다(단계 c)).
단계 a)에서 제공된 세포는 다능성이다. 이들은 인간의 전능성 세포가 아니다.
다능성 세포는 바람직하게는 포유동물, 바람직하게는 인간 세포 또는 비인간 영장류 세포, 또는 설치류, 마우스, 햄스터, 돼지, 고양이, 개, 말, 소 세포로부터 유래한다.
다능성 세포는 세포주 또는 세포 배양물로부터 유래될 수 있다. 이들은 다능성 줄기 세포일 수 있거나, 유도 다능성 세포, 즉 야마나카(Yamanaka) 인자 처리에 의한 처리 등에 의해 다시 다능성으로 전환된 분화 세포로부터 유래할 수 있다. 유도 다능성 세포의 사용에 의해, 심장 발달에 영향을 미칠 수 있는 유전적 이상이 있을 수도 있고 없을 수도 있는 특정 개인의 심장 발달의 조사가 가능해진다. 이러한 실시양태에서, 세포는 심장 질환, 특히 유전적 심장 질환을 앓고 있는 환자로부터 유래하는 유도 다능성 세포일 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 다능성 줄기 세포는 본 발명의 방법의 추가 단계를 위해 제공되기 전에 배지에서 성장시킨다. 이는 본 발명의 방법에서 추가 분화를 위해 세포를 프라이밍 및 활성화할 수 있다. 다능성 세포는 바람직하게는 계대배양(passaging)되고/되거나, 알부민 및/또는 섬유아세포 성장 인자를 포함하는 배지 중에서 배양, 성장 또는 유지시킬 수 있다. 이들 성분 모두는 바람직하게는 본 발명의 원하는 개발을 위해 세포를 예외적으로 프라이밍하는 것으로 입증되었다. 알부민은, 예를 들면, 혈청 알부민, 예를 들면, 소 혈청 알부민(BSA)일 수 있다. 섬유아세포 성장 인자는 바람직하게는 FGF2, 특히 인간 FGF2이다.
바람직하게는, 다능성 줄기 세포는 적어도 1.5%(w/v)(적어도 1.5g/l), 알부민, 바람직하게는 BSA, 및/또는 적어도 100ng/ml의 섬유아세포 성장 인자, 바람직하게는 FGF2를 포함하는 배지에서 성장시켰다.
바람직하게는, E8 배지 등의 세포 배양 배지가 사용된다. 이는 바람직하게는 세포 성장에 필요한 아미노산 및 탄수화물, 특히 바람직한 포도당 등의 에너지원을 포함한다. 이들은 추가로 Ca, Fe, Mg, K, Na, Zn, Cl, SO4, NO3, PO4 이온 등의 세포 성장에 필요한 염 및 이온을 포함해야 한다. 배지의 추가로 바람직한 성분은 비타민 B-12, 비오틴, 콜린, 엽산, 이노시톨, 나이아신아미드, 판토텐산, 피리독신, 리보플라빈, 티아민 등의 비타민이다.
바람직한 아미노산은 필수 아미노산, 바람직하게는 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 시스틴, 글루탐산, 글루타민, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 티로신, 발린 중 어느 하나의 아미노산을 포함한다.
2D 배양은 조직 배양 플레이트 등의 표면 상에서 세포를 성장 또는 유지하는 것을 포함할 수 있다. 이러한 표면은 비트로넥틴 등의 적절한 배양 기질로 코팅될 수 있다. 이어서, 세포를 분리하거나, 또는 단계 b)에서 사용하기 위한 응집체로 사용할 수 있다. 단계 b)를 위한 세포를 제공하기 전에 하나 이상의 계대배양 단계가 사용되는 경우, 세포는 다시 파종시킬 수 있다.
바람직한 실시양태에서, 세포는 이러한 배지, 특히 알부민 및/또는 섬유아세포 성장 인자를 포함하는 배지 중에서/이와 함께, 적어도 1일간, 바람직하게는 적어도 2일간, 예를 들면, 적어도 1 내지 30일(예: 2 내지 20일)간 배양 또는 처리되었다(물론 다능성을 유지하면서).
단계 b)에서, 바람직하게는 100 내지 100만개 세포(배양 용기에 따라 다름)의 다능성 세포가 1개의 배양 용기에서 배양하기 위해 제공된다. 배양 용기는 단계 a)의 경우와 같은 2D 배양용의 것, 예를 들면, 배양 플레이트, 또는 3D 배양용의 것일 수 있고, 예를 들면, 3D 배양이 필수인 단계 c)에 대해서는 이하에서 추가로 설명한다.
단계 b)에서, 세포는 더 이상 분열 또는 해리되지 않지만, 완전한 상태로 유지되는 응집체를 형성한다. 다능성 세포는 그 자체로 또는 초기 분화 단계에서 응집하여 응집체를 형성한다. 이를 수행하기 위한 세포의 수는 장래의 조직 모델의 형태에 영향을 미치고, 통상 보다 적은 수의 세포로부터 성장한 조직 모델은 보다 균질하고, 따라서 100 내지 10000개, 예를 들면, 200 내지 6000개의 다능성 세포를 사용하는 것이 바람직하다. 다능성은, 예를 들면, 마커 SOX2, OCT4 및/또는 NANOG를 결정함으로써 제어할 수 있다.
단계 b)에서 세포를 배양하기 위해 사용되는 배지(이는 응집체를 형성하고, 통상 배양 용기당 최종 조직 모델을 형성하기 위해 지속하는 1개의 주요 응집체)는 단계 a)에 대해 상기 기재된 것과 동일한 성분을 가질 수 있고, 예를 들면, 바람직하게는 세포 성장에 필요한 아미노산과 탄수화물, 특히 바람직하게는 글루코스 등의 에너지원을 포함한다. 단계 b)의 배지는 신호전달 인자 또는 조절인자 및 신호전달을 조절하는 임의의 서포트 인자를 추가로 포함한다.
이러한 신호전달 조절인자 중 하나는 PI3 키나제 억제제이다. PI3 키나제 억제제의 예는 LY294002이지만, 다른 것도 기능한다. PI3 키나제 억제제의 사용은 가장 깨끗하고 가장 균질한 조직 모델을 생성하므로 특히 바람직하다. 또는, 대량의 WNT 활성화제를 사용하는 것 등의 PI3 키나제 억제제를 사용하는 대안의 방법이 존재한다. PI3 키나제 억제제는 다수의 다능성 세포가 다능성 세포를 종료하고, 중배엽 계통으로 분화하는 효과가 있고, 이는 장래의 고도로 상동성인 심장 조직 모델(내배엽, 전장 또는 기타 비-심장 세포를 포함하지 않거나 거의 없음)을 결정한다. LY294002는 3 내지 15μM의 농도로 사용하는 것이 바람직하다.
단계 b)에 대한 중요한 신호전달 인자는 WNT 활성화제이다. 단계 b)를 위한 WNT 활성화제는 WNT-3a 또는 CHIR99021 등의 WNT 리간드일 수 있다. 추가로 호모 사피엔스에 대한 WNT 활성화제는 WNT1, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT3A, WNT4, WNT5A, WNT5B, WNT6, WNT7A, WNT7B, WNT8A, WNT8B, WNT9A, WNT9B, WNT10A, WNT10B, WNT11, WNT16이다. 이들은 고도로 보존되어 있고, 기타 생물에도 상동적으로 존재한다. 추가로 가능한 WNT 활성화제는 WNT4와 상승적으로 작용하는 R-스폰딘 1이다. WNT4는 세포에 내재적일 수 있거나, 세포에 외인적으로 투여될 수 있다.
본 발명의 WNT 활성화제는 세포를 중배엽 분화로 유도한다. 이는 섬유아세포 성장 인자(FGF), 골 형태형성 단백질(BMP, 바람직하게는 BMP4), 액티빈 A 및/또는 알부민, 바람직하게는 이들 4개 모두와 조합시키면, 특히 효율적으로 기능한다. 이러한 경우, 특히 높은 수준의 WNT 활성화가 사용되는 경우는 PI3 키나제 억제제를 사용할 필요가 없을 수도 있다. 실제로, 이들 인자 중, WNT 활성화와 알부민의 조합은 본 발명의 강력하고 재현가능한 조직 모델을 생성하기에 충분하다. 이와 같이, 단계 b)에 대한 대안으로서, WNT 활성화 및 알부민을 사용하여, 원하는 양의 다능성 줄기 세포가 단계 b)에 따른 배양 24 내지 40시간 이내에 다능성을 종료(및 중배엽 계통으로 분화)하는 것이 가능하다. 이는 WNT 활성화의 양이 통상보다 많은 경우에 가장 잘 기능한다. 알부민에 대한 대안(물론 조합가능)에서, FGF는 BMP 및/또는 액티빈 A와 조합하여 사용된다.
바람직하게는, WNT 활성화제가 유도 개시로부터 40시간 이내에 다능성 줄기 세포의 90% 이상의 양으로 다능성 줄기 세포를 분화시켜 다능성을 종료시키기에 충분한 양인 경우, WNT 활성화제로서의 CHIR99021의 양은 적어도 6μM, 바람직하게는 적어도 9μM, 예를 들면, 12μM의 농도로 존재한다.
PI3 키나제 억제제가 사용되는 경우 WNT 활성화는 통상 낮은 수준일 수 있고, 예를 들면, WNT 활성화제로서의 CHIR99021은 적어도 0.5μM, 바람직하게는 0.5μM 내지 12μM의 농도로 존재한다.
바람직하게는, 중배엽 분화(단계 b))는 액티빈 A 및/또는 골 형태형성 단백질, 바람직하게는 추가의 섬유아세포 성장 인자를 포함하는 배지에서 유도된다. 바람직한 또는 골 형태형성 단백질(BMP)은 BMP4, 특히 인간 BMP4이다. 바람직하게는, 중배엽 분화는 적어도 8ng/ml 골 형태형성 단백질, 바람직하게는 BMP4를 포함하는 배지에서 유도된다. 추가로, 대안적으로 또는 조합하여, 중배엽 분화는 섬유아세포 성장 인자(FGF) 및/또는 알부민, 바람직하게는 BSA를 포함하는 배지에서 유도된다. FGF에 대한 바람직한 농도는 배치 활성에 따라 적어도 10ng/ml, 바람직하게는 적어도 50ng/ml, 예컨대, 150ng/ml 이상이고; 알부민의 경우, 바람직한 농도는 0.2%(w/v) 이상, 예를 들면, 0.4%(w/v) 이상의 바람직하게는 BSA이다. 특히, 혈청 알부민 및/또는 FGF 등의 알부민은 이들 화합물이 상이한 다능성 세포주를 사용하여 중배엽(및 그 후의 심장) 운명으로의 형성 세포 응집체의 균일하고 강력한 분화를 촉진하는 데 도움이 되기 때문에 바람직한 배지 첨가제이다.
액티빈, 예를 들면, 액티빈 A는 심실 또는 심방의 운명에 대한 조직 모델을 지정하는 데 사용할 수 있다. 일반적으로, 높은 액티빈(예: 10ng/ml 이상)은 조직 모델을 심방 운명으로 면하게 조종하고, 낮은 액티빈(예: 10ng/ml 미만)은 조직 모델을 심실 운명으로 면하게 조종한다. 이러한 예시 농도는 사용된 세포의 유형에 따라 상이할 수 있다.
특정 배지에서 단계 b)의 배양은 바람직하게는 18 내지 40시간, 바람직하게는 24 내지 39시간, 특히 30 내지 38시간, 예컨대, 36시간이다. 중배엽 분화는 마커 BRA/T(예: 도 2), MIXL1, TBX6 및/또는 GSC를 발현하는 중배엽 세포를 결정함으로써 제어할 수 있다. 세포의 원하는 적어도 90% 등의 대부분의 세포는 단계 b) 말기에 이러한 마커를 발현해야 한다.
단계 b)(임의) 및 단계 c)(및 d) 및 성숙 등의 임의의 추가 단계)에는 3D 배양에서의 배양이 포함되고, 이는 응집체가 표면에 부착되지 않지만, 모든 3D 방향으로의 확장이 균일하게 가능하도록 현탁 상태에서 자유 부유를 유지하는 것을 의미한다. 이러한 배양은 응집체가 배양 용기 벽에 부착되지 않도록 저부착 배양이다. 바람직하게는, 저부착 배양은 표면에 대한 세포의 부착을 억제하는 저부착 표면을 갖는 용기에서 세포를 배양하는 것을 포함한다. 저부착 표면은 바람직하게는 친수성, 중성 전하 또는 비이온성이다. 이들은 세포 부착을 격퇴하여, 세포를 강제적으로 현탁 상태로 되게 하는 하이드로겔 층 또는 코팅을 가질 수 있다. 이러한 저부착 배양 용기는 당해 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들면, WO 2019/014635 또는 WO 2019/014636에 기재되어 있다. 바람직하게는, 배양 용기의 하부는 둥글고, 특히 오목하다. 또는, 이는 평평하거나, V-하부 형상을 가질 수 있다.
중배엽 세포를 심장 세포로 분화시키는 단계 c)는 저부착 배양에서 3D 배양에서 단계 b)의 중배엽 세포를 심장 세포로 분화시키는 것을 포함하고, 여기서 세포는 심장 중배엽 형성 및 내부 공동의 형성을 위해 심장 분화 인자의 존재 및 WNT 활성화제의 부재 및/또는 WNT 길항제의 존재하에, 적어도 2일 동안, 바람직하게는 3 내지 7일 동안, 예를 들면, 최대 5일 동안, 배양 용기 대신에 서로 결합하여 세포의 응집체를 형성한다. WNT 길항제는 바람직하게는 단계 c)의 전체 기간에 걸쳐 사용되지 않는다. 바람직하게는, WNT 길항제는 12시간 내지 72시간, 바람직하게는 24시간 내지 60시간 동안 사용된다. 단계 c)는 바람직하게는 조직 배양의 세포의 적어도 80%가 다능성 및 비-심장 중배엽 단계를 잔류시킬 때까지 수행된다. "비심장 중배엽 단계"는 세포가 아직 심장 계통으로 분화되지 않은 심장 분화 단계의 다능성 단계 및 전구체이다. 단계에 따른 이러한 처리는 바람직하게는 적어도 2, 3, 4, 5일 동안, 바람직하게는 최대 7 또는 5일 동안이다.
심장 중배엽 형성 및 심장 선조체 분화는 마커 NKX2-5, HAND1, HAND2, TBX5, MYH6, MYH7, MYL7, 트로포닌 T, 트로포닌 I 및/또는 a-액티닌을 발현하는 심장 세포를 결정함으로써 제어할 수 있다(예: 도 2, 4 , 5, 6, 7).
바람직하게는, 단계 c)는 섬유아세포 성장 인자, 골 형태형성 단백질, 또는 이들의 조합을 갖는 배지에서 배양하는 것을 포함한다. 이러한 화합물은 단계 b)로부터 수득된 중배엽 세포를 심장 세포로 추가로 분화시키고, 즉 이들은 심장 분화 인자로서 작용한다. 배지는 바람직하게는, 특히 배지가 에너지원으로서 글루코스를 함유하는 경우, 세포 성장, 증식 및 생존을 보조하는 인슐린을 추가로 포함한다.
본 발명의 모든 실시양태의 우선에 있어서, 세포는 단계 c)에서 액티빈 A, 골 형태형성 단백질(BMP, 바람직하게는 BMP4) 및/또는 섬유아세포 성장 인자(FGF, 바람직하게는 FGF2), 특히 바람직하게는 이들 화합물 모두로 처리된다. 이들 화합물 및 인자는 본 발명의 조직 모델의 강건성 및 공동 형성을 증가시킨다. 바람직하게는 및/또는 알부민은 또한 임의로 액티빈 A, BMP 및/또는 FGF와 조합하여 사용된다. 알부민은 WNT 활성화제/억제제 등의 소분자의 독성으로부터 세포를 보호하고, 따라서 단계 c)에서, 또한 대안적으로 단계 b)에서도 적극 권장된다.
WNT 길항제는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 이들은 WNT 억제제라고도 하고, WNT 경로의 활성을 억제한다. WNT 길항제는 바람직하게는 Wnt-C59, IWR-1, XAV939, IWP-2, IWP-4, DKK1 또는 이들의 조합으로부터 선택된다(예를 들면, 도 9). 특히 바람직한 WNT 길항제는 적어도 1μM, 바람직하게는 적어도 5μM의 농도 등의 IWP2 및 XAV이다. WNT 길항제는 단계 c)의 전체 기간(적어도 3일) 동안 사용할 수 없지만, 예를 들면, 그러나, 특히 단계 c)의 개시시에 또는 단계 c)의 개시로부터 12시간 이내에 개시되는 이의 치료에서 12시간 내지 48시간, 바람직하게는 18 내지 36시간 동안에만 사용될 수 있다. 바람직하게는, WNT 길항제는 적어도 3일 동안 또는 단계 c) 전체에 걸쳐 사용된다. 단계 c)에서 사용되는 배지는 단계 b)와 유사하고, 바람직하게는 세포 성장에 필요한 아미노산 및 탄수화물, 특히 바람직한 글루코스 등의 에너지원을 포함한다. 상기 기재된 바와 같이, 비타민 및/또는 염이 추가로 바람직하다.
배지는, 바람직하게는, 섬유아세포 성장 인자, 바람직하게는 FGF2를 적어도 6ng/ml의 바람직한 농도로 포함한다. 배지는 바람직하게는 골 형태형성 단백질, 바람직하게는 BMP4를 적어도 8ng/ml의 바람직한 농도로 포함한다.
c) 단계 후, 이 시점에서 공동이 있는 응집체를 형성하는 세포는 적절한 배지에서 분화시키기 위해 추가로 잔류시킨다. 이는 임의 단계 d)에서 수행된다. 따라서, 본 발명의 방법은 단계 d)를 포함하고, 이는 심장 중배엽을 갖는 응집체를, 심장 분화 인자를 갖는 심근세포 층을 갖는 조직으로 추가로 1일 이상, 예를 들면, 1 내지 3일, 바람직하게는 2일 동안 추가로 분화시키는 것을 포함한다. 배지, 배양 용기 및 분화 인자는 단계 c)와 동일할 수 있다. 이 시점에서 WNT 억제는 더 이상 사용되지 않다. 단계 d)를 위한 배지는 바람직하게는 섬유아세포 성장 인자, 바람직하게는 FGF2를 적어도 6ng/ml의 바람직한 농도로 포함한다. 배지는 바람직하게는 골 형태형성 단백질, 바람직하게는 BMP4를 적어도 8ng/ml의 바람직한 농도로 포함한다. 바람직하게는, 인슐린이 또한 사용된다. 레티노산은 이 단계에서 추가로 사용될 수 있고, 이는 완전한 분화를 위해 추가로 분화를 유도한다.
바람직하게는, 각 단계 a), b) 및/또는 c) 및/또는 d)의 배지는 매일 또는 2일마다 또는 이들 값 사이의 임의의 간격으로 교환된다.
본 발명의 방법은, 바람직하게는 적어도 심장 내피 세포의 내층이 내부 공동을 라이닝하도록 형성될 때까지, 영양소를 포함하는 배지에서 세포를 성숙시키는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 성숙 단계에서는 추가로 분화 유도는 필요하지 않다. 단계 c) 또는 d) 후, 조직 모델은 안정적이고, 유지될 수 있다. 이러한 유지 동안, 세포는 본 발명의 특징인 거대 내부 공동을 유지하면서 추가로 성숙할 수 있다. 성숙은 심장 내피 세포의 내층의 성숙을 유도할 수 있고, 예를 들면, 이는 생체내 심내막과 유사하다(예: 도 8).
심장 내피 세포의 분화는 VEGF 신호전달(혈관 내피 성장 인자) 억제제를 사용함으로써 예방할 수 있다. 본 발명의 한 가지 옵션에 따르면, 심장 내피 세포의 분화를 방지하기 위해, 단계 b) 및/또는 c), 및/또는 임의의 단계 d)에서 VEGF 억제제가 적용된다. VEGF 억제제의 예는 VEGFR 억제제인 항-수니티닙 또는 항-VEGF 항체이다(예: 도 5, 6).
한편, 심장 내피 세포의 형성을 증가시키기 위해 VEGF로 세포를 배양하는 것이 가능하다. VEGF의 예는 VEGF-A이다. 이는 상기에서 설명한 바와 같이 내피 세포 함유량이 더 큰, 예를 들면, 40% 이상의 심장 내피 세포의 조직 모델을 유도할 것이다. VEGF는 바람직하게는, 단계 b)에서, 바람직하게는 임의로 또한 단계 c)에서 적용되거나, 또는 단계 c)에서는 적용되지 않는다(예: 도 4, 7).
VEGF를 사용하면, 놀랍게도, WNT 활성화(단계 b에서)를 사용하여, 내피 세포 형성의 위치, 즉 조직 모델의 내측(내부 공동을 향함) 또는 외측을 제어할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 방법은 단계 b) 동안 심장 조직 모델의 외측에서 심장 내피 세포의 형성을 유도하기에 충분한 양, 바람직하게는 1uM 내지 10μM CHIR99021의 양으로 WNT 활성제, 바람직하게는 CHIR99021을 첨가하는 것을 포함할 수 있다. WNT 양이 적으면, 세포주에 따라 CHIR이 5μM CHIR99021로 되지 않는 것과 같이 내측 내피 세포층이 형성될 수 있다(예: 도 4, 7, 8). VEGF를 첨가하면, 내측으로부터 외측으로 면하여, 하기 배향: 공동-심근세포, 심내막-유래 섬유아세포 및 심장 내피 세포 등의 3개의 개별 층을 갖는 조직 모델을 개발하는 데 도움이 된다(도 18 F, F', F" 및 19A). 본 발명의 조직 모델은 이러한 배향을 가질 수 있다. 낮은 액티빈 A의 조건에서, 예를 들면, 5ng/ml 이하 등의 낮은 액티빈 A의 조건에서 VEGF가 없는 내측 내피 라이닝의 발달을 자극하는 것도 가능하다. 이들 수치는 사용된 세포 종류에 따라 상이할 수 있다. 조직 모델은 내측 내피 라이닝을 가질 수 있다.
본 발명의 방법은 임의로 심외막 세포를 조직 모델에 추가하는 단계를 추가로 포함할 수 있다(예: 도 11). 이 단계는 단계 c), d)의 직후에 또는 성숙 중의 언제든지 수행할 수 있다. 심외막 세포의 첨가는 조직 모델의 외측에 심외막 층이 형성되도록 한다. 추가로 성숙된 후, 이 심외막 층은 상기에서 언급한 바와 같이 심장 SMC 및/또는 섬유아세포를 생성할 수 있다. 심외막 세포는 심장 조직 모델의 배양물에 단순히 첨가될 수 있고, 모델에 부착되고, 그 위로 신장/이동하여 외층을 제공할 수 있다.
본 발명의 심장 조직은 심장의 특정 정상 또는 비정상 상태, 예를 들면, 질환, 질병 또는 손상, 게다가 이러한 상태로부터의 회복을 재현하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 심장 조직 모델은 손상 또는 치유된 손상을 포함할 수 있다. 본 발명의 방법은 조직 모델에 손상을 유발하는 것, 및 임의로 이러한 손상으로부터 회복하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 시험 화합물 등의 약제는 이러한 상태를 유발하거나, 손상 중, 회복 및/또는 치유 프로세스 중에 화합물의 효과를 시험하기 위해 시험할 수 있다.
조직 모델의 손상 또는 치유된 손상은 심장 조직 모델의 비손상 부분과 비교하여 증가된 양의 섬유아세포 및/또는 콜라겐 및 피브로넥틴을 포함할 수 있다. 예를 들면, 손상 또는 치유된 손상에서 섬유아세포의 증가된 양은 심장 조직 모델의 비손상 부분과 비교하여 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 3배, 특히 바람직하게는 3배 내지 25배, 예컨대, 3.3배 내지 21.7배이다. 손상 또는 치유된 손상에서 콜라겐 및/또는 피브로넥틴의 증가된 양은 심장 조직 모델의 비-손상 부분과 비교하여 적어도 1.1배, 바람직하게는 적어도 1.25배, 특히 바람직하게는 1.3배 내지 3배, 예컨대, 1.33배 내지 2.13배일 수 있다.
손상 또는 치유된 부상은 동결, 예를 들면, 동결-손상으로 인해 발생할 수 있다. 동결-손상은 재현가능한 손상 모델이고, 상기에서 언급한 시험 화합물 등의 표준화된 연구에 사용하는 것이 바람직하다.
심장 조직 모델의 손상 또는 치유된 손상 부분은 바람직하게는 심장 조직 모델의 용적의 1% 내지 30%, 바람직하게는 4% 내지 20%이다. 세포, 예를 들면, 섬유아세포는 건강한 조직으로부터 손상된 조직으로 이동하기 때문에, 건강한 조직이 충분히 잔류하는 것이 바람직하다. 다른 실시양태에서, 섬유아세포는 또한 인접한 조직으로부터 이동할 수 있고, 이들의 이동은 건강한 용적에 의존하지 않는다. 이와 같이, 더 큰 크기의 손상 또는 치유된 손상 부분, 예를 들면, 조직 모델 용적의 1% 내지 80%, 바람직하게는 조직 모델 용적의 10% 내지 60%도 가능하다.
손상 또는 치유된 손상은 조직 모델의 비-손상 부분 또는 콜라겐 침착물과 비교하여 증가된 콜라겐 양을 포함할 수 있다. 이러한 증가는, 예를 들면, 적어도 1.5배 또는 적어도 2배이어야 한다.
본 발명은 추가로 본 발명의 임의의 방법에 의해 수득되는 심장 조직 모델을 제공한다. 수득된 심장 조직 모델은 상술한 바와 같은 임의의 구조적 요소를 가질 수 있다.
본 발명은 본 발명의 방법을 수행하기 위한 키트를 추가로 포함한다. 이러한 키트는 i) WNT 활성화제 및/또는 GSK3-베타 억제제, ii) PI3 키나제 억제제, iii) 저부착 세포 배양 용기를 포함할 수 있다. 이들 모두, 특히 이의 바람직한 예는 상기에 기재되어 있다. 키트는 상기 기재된 바와 같이 배지에서 사용되는 임의의 추가 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이는 WNT 억제제, BMP, FGF, 인슐린, 알부민 등을 추가로 포함할 수 있다. 특히 바람직한 것은 상기 이유로부터 BMP, 또는 임의의 기타 추가의 또는 대안적 화합물과의 조합이다. 키트는 상술한 본 발명의 방법을 사용하는 방법에 사용될 수 있다.
키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 지시는 적절한 데이터 매체 상의 인쇄된 형태 또는 컴퓨터 판독가능한 형식으로 존재할 수 있다.
본 발명은 추가로 적어도 10개의 구획을 포함하는 용기 플레이트를 제공한다. 본 발명의 방법은 균질하고 재현가능한 결과를 제공하므로, 각 구획에서 본 발명에 따른 조직 모델이, 바람직하게는 실질적으로 동일한 발달 단계에 존재한다. 방법의 높은 재현성과 견고성은 유전자 스크리닝 또는 화합물 시험 등의 병행 비교 시험을 수행하는 경우에 특히 유리하다(예: 도 9, 12).
본 발명의 방법은 심장 발달 및 기능에 대한 이의 효과에 대한 후보 화합물을 스크리닝 또는 시험 테스트하는 데 사용할 수 있다(예: 도 9). 이러한 방법은 세포를 후보 화합물로 처리하면서(발달 중의 임의의 단계, 예를 들면, 단계 a), b) 및/또는 c) 및/또는 d에서) 본 발명에 따르는 심장 조직 모델을 생성하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 최종 조직 모델을 사용하여 후보 화합물을 시험할 수 있다. 이 방법은 심장 조직 모델의 발달 또는 기능성을 후보 화합물로 치료되지 않은 심장 조직 모델의 발달 또는 기능성과 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 비교를 위해, 후보 화합물을 사용한 처리를 제외하고 모든 처리 단계는 동일해야 한다. 예시적 함수는, 예를 들면, 박동 행동(예: 강도 및/또는 리듬, 예: 부정맥) 또는 후보 화합물에 의해 영향을 받을 수 있는 관심 유전자의 대사 회전 또는 유전적 발현 등의 임의의 심장 기능이다. 기능의 발달은 후보 화합물에 의해 유발될 수 있는 독성 발달 또는 기능일 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 방법 또는 조직 모델은 독성 시험 또는 스크리닝에 사용될 수 있다.
유사하게는, 후보 화합물에 대해 유전자 변경을 시험할 수 있다. 예를 들면, 본 발명은 본 발명에 따르는 심장 조직 모델을 생성하는 단계(여기서, 세포는 억제된 후보 유전자를 갖거나, 또는 후보 유전자를 과발현한다) 및 심장 조직 모델의 발달을 억제 또는 고발현된 유전자로 생성되지 않은 심장 조직 모델의 발달과 비교하는 단계를 포함하는, 심장 발달 중의 돌연변이(예: 질환-관련) 유전자, 억제 유전자 또는 과발현 유전자의 영향을 관찰하는 방법을 제공한다(예: 도 12). 돌연변이, 과발현 또는 발현의 억제는 유전자 녹아웃, siRNA 억제 또는 CRISPR/Cas 기반 불활성화에 의한 억제 등의 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법으로 수행될 수 있다. 과발현은 도입유전자의 도입 또는 유전자 발현의 상향조절을 유도하는 유전자 활성화제의 적용에 의해 수행할 수 있다. 이러한 돌연변이된 조직 또는 세포에서의 돌연변이를 사용하고, 이들 세포를 사용하여 본 발명의 심장 조직을 생성하는 방법은 또한 상기에서 논의된 바와 같이 후보 화합물의 스크리닝 또는 시험에도 사용될 수 있다. 이와 같이, 본 발명은 본 발명의 심장 조직 또는 방법을 질환 모델, 예를 들면, 특히 심장 기능을 연구하기 위한 심장 질환 모델로서 사용한다. 따라서, 후보 화합물을 스크리닝 또는 시험하는 방법은 또한 억제 또는 과발현된 유전자의 효과를 관찰하는 것과 조합될 수 있다. 조합된 방법에서, 비교는 후보 치료를 수반("약물을 사용")하거나 수반하지 않는("약물을 사용하지 않음") 조직의 변이체 또는 방법의 사이에서, 돌연변이를 수반하는 또는 돌연변이 또는 비-돌연변이 변이체 사이 둘 다에서, 약물 사용 구성의 둘 다, 또는 이들 4개 모든 상태 사이의 비교(돌연변이 + 약물 사용, 돌연변이 + 비-약물 사용, 비-돌연변이 + 약물 사용, 비-돌연변이 + 비-약물 사용)에서 이루어질 수 있다.
본 발명에 따라 선택될 수 있는 일부 바람직한 요소를 강조하는 이하의 실험 개요를 제공한다. 여기에서는 추가로 바람직한 요소가 괄호 내에 표시된다.
단계 a)에서 제공될 수 있는 다능성 줄기 세포를 성장시키기 위한 제1 다능성 배지는 바람직하게는 E8 배지를 기반으로 한다. 이 배지는 BSA(2.5μg/ml)를 포함하고, 인간 FGF2의 용량을 200ng/ml로 증가시킴으로써 변형시킨다. 세포는 단일 세포로서 TrypLE에 의해 또는 작은 덩어리로서 EDTA에 의해 12웰 플레이트에서 계대배양되지만, 이는 오르가노이드 생성에 영향을 미치지 않는다. 다능성 세포가 상기의 조합 없이 표준적 상업 조건에서 성장한 경우, 프로토콜은 양호하게 작동하지 않았다. 다능성 단계는 주요 세포 마커로서 SOX2, OCT4 및 NANOG의 발현을 특징으로 한다.
프로토콜의 후속 단계는 분화에서 중배엽 유도(단계 b)이다. 염기 분화 배지 CDM(Johansson & Wiles Molecular and Cellular Biology, 1995, p. 141-151)이 사용된다. 이는 주목할만한 첨가물로서 BSA를 포함한다. CDM 분화 배지에는 신호전달 리간드 FGF2(200ng/ml), 액티빈 A(50ng/ml), BMP4(10ng/ml) 및 CHIR99021(WNT 신호전달의 활성화제)이 다양한 농도로 포함되어 있다. 독특의 태양으로서, PI3-키나제 억제제 LY294002(5-10μM에서)가 사용된다. 목적은 모든 세포가 24시간 이내에 다능성을 종료하도록 보장하여 이후에 분화가 보다 균일해지도록 하는 것이다. 그러나, 액티빈, FGF2 및 BMP4의 첨가는 필수적인 것은 아니고, CDM에는 CHIR99021(약칭 "CHIR")로만 중배엽 유도를 수득할 수 있지만, 이 경우, 결과는 보다 더 변동할 수 있다. CHIR 용량은 다양한 계통에 최적화되어 있고, 1μM 내지 약 10μM까지 다양하다. 이 단계에서 발현되는 전형적 중배엽 마커는 BRA, EOMES, MIXL1, TBX6, GSC이다.
중배엽 유도의 한 가지 포인트는 분화 유도의 타이밍이다. 3개의 옵션이 시험되었고, 작동한다: 2D 12웰 플레이트로부터의 다능성 세포를 분할하고, 96웰 ULA(초저 부착) 플레이트에 파종하고, E8 다능성 배지에서 추가로 18 내지 36시간 동안 방치한 다음, 중배엽을 유도한다. 제2 가능성은 다능성 세포를 파종하고, 즉시 CDM에서 중배엽 유도를 개시하는 것이고, 제3 옵션은 2D 배양에서 중배엽 유도를 개시하고, 최초 36시간의 단계 후, 세포를 3D 배양용의 96웰 저부착 플레이트로 분할하는 것이다. 제2 및 제3 옵션은 보다 많은 수의 세포(예: >2000개 세포/응집체, 그러나 최초 옵션은 <2500개 세포에서 균일하게 기능함)로 보다 깨끗하고 균일한 분화를 제공하는 경향이 있다.
후속 단계는 심장 중배엽 분화(단계 c))이고, 이는 96-웰 ULA 플레이트에서 계속되고, 4일 동안 지속되며, 이것이 내부 공동이 나타나는 시기이다. 이는 IWR-1, XAV939 또는 IWP-2 억제제에 의한 FGF2, 인슐린, BMP4 및 WNT 억제를 포함하는 CDM 배지에서 수행된다(다른 것들도 기능한다). CDM 배지에서 공동을 유도하는 데는 외부 WNT 억제만으로 충분하다는 것이 밝혀졌다. 그러나, WNT의 하류에 있는 BMP 등의 기타 경로의 내인성 활성도 유익하다. 이 단계는 프로토콜의 7일차까지 계속 상승하는 일부 구조적 마커를 포함하여 심장-특이적 프로그램이 활성화되는 것이다. 관찰되는 구조적 마커는 다음과 같다: MYH6, 7, MYL7, 트로포닌 T, α-액티닌; 이 프로그램을 상류로 유도하는 전사 인자는 NKX2-5, HAND1, TBX5, ISL1, GATA4/6이다.
추가 분화를 수반하는 최종 성숙 단계에서는 2일 동안 FGF2 및 BMP4를 사용하고, 이는 생체내에서와 같이 심근 세포를 박동하는 최종적 분화를 강력하게 유도한다. 이 단계는 CDM + 인슐린에만 세포를 잔류시키는 것으로 충분하기 때문에 필수적인 것은 아니고, 가변적일 것이다. 이 단계의 세포는 심장 중배엽 단계에 대해 언급된 구조 및 전사 인자 마커를 계속 발현한다. 최종 단계가 CDM + 인슐린만으로 성숙하는 경우, MYL2 심실 마커의 상향조절에 의해 나타나는 바와 같이, 심근세포 오르가노이드는 약 1개월 후에 추가로 성숙하는 경향이 있다. 일반적으로, 3D 오르가노이드의 심근세포는 2D의 심근세포에 비교하여 심장 유전자 발현 수준이 더 높아진다. 이 프로토콜에서는, 심장 내피 세포(EC, CD31+, CDH5+)가 시간의 경과와 함께 나타나고, 이들은 4 내지 5일차에 이미 검출할 수 있지만, 1개월 후에는 수치가 증가하고, 안쪽의 공동의 양호한 라이닝을 형성한다. 그러나, 이 기본적 프로토콜에서 대부분의 세포는 여전히 심근세포(약 80-90%)인 반면, 심장 내피 세포는 본질적으로 잔존한다. 기타 세포 유형은 검출되지 않았다(내배엽 또는 외배엽 유도체는 검출되지 않았다).
보다 많은 심근세포(95% 이상)을 포함하는 오르가노이드를 임의의 내피 세포 없이 생성되어야 하는 경우, 수니티닙(100nM, VEGF 경로 억제제)과 같은 VEGF 억제제를 분화의 최초 10일간 또는 그 이상 사용할 수 있다(예: 도 6). 유리하게도, 양쪽 프로토콜(VEGF를 사용하지 않는 경우와 사용하는 경우)에서는 이러한 구조를 수개월간 유지할 수 있게 하고, 이는 적용 및 스크리닝 시험에 또한 매우 중요하다.
세포 비율을 제어할 수 있다. 예를 들면, VEGF(200ng/ml)를 첨가하여 내피 세포 운명을 유도함으로써 심장 중배엽 단계를 변경하는 것이 가능하다. 200ng/ml VEGF의 경우, 심근세포 대 내피 세포의 비율은 통상 약 53%의 내피 세포 및 41%의 심근세포이고, 약 5% 변동이 있다(기타 비율은 VEGF 농도를 변경함으로써 가능함)(예: 도 4). 내피 세포는 낮은 WNT 활성(1-4μM CHIR)을 사용하여 유도된 오르가노이드의 공동에 면하는 내측 라이닝 대 중배엽 유도 중의 높은 WNT 활성(5-8μM CHIR) 조건에서 심근세포 주변에 구획/라이닝을 형성한다. 따라서, 세포 비율뿐만 아니라, 내피 라이닝이 내측 또는 외측에 있는지의 여부도 제어할 수 있다. 이 제어는 상이한 적용 프로그램이 의존할 수 있기 때문에 중요한 태양이다. 더욱이, 심장관의 단계 동안 생체내에서 관찰된 바와 같이 내피 구획과 심근세포 구획 사이에 공간이 있다. 이 공간에 면하는 심근세포 상에서 피브로넥틴의 발현을 관찰할 수 있지만, 이는 생체내의 상황과 일치한다. 이는 내피 세포와 심근세포 사이에 형성되는 심장 젤리의 주요 성분이다.
여기서 중요한 포인트는, 이러한 내피 세포가 대조군 비-심장 내피 세포(예: 도 4E)와 비교하여 NPR3 및 NFATC1의 더 높은 수준을 발현하기 때문에, 이러한 내피 세포가 심내막과 가장 유사하다는 것이다(따라서, 이들은 심장의 실제 심장 내피 세포임). 이들은 또한 심장에 전형적인 정확한 HOX 유전자(HOX1-5 범위)를 발현한다.
또 다른 중요한 포인트는, 오르가노이드로부터의 내피 세포에서 기계감수성 유전자(SOX18, KLF2, CDH5, FOS, TEK, FOXO1)의 활성화가, 내피 세포를 2D로 배양한 경우와는 대조적으로 관찰된다는 것이다. 이는 보다 기능적인 진정한 심장 내피 세포의 매우 중요한 생물학적 특징이다(예: 도 4).
바람직하게, 첨가되는 제3 계통은 추가 단계가 적용되는 심외막(WT1+, TCF21+, TBX18+)이다. 다시 말하지만, CDM은 바람직하게는 3D 배양에 사용된다(예: 도 10, 11). 심외막 세포는 심장 오르가노이드에 추가되어, 수일 이내에 외측으로부터 오르가노이드를 삼키는 심외막을 생성한다(생체내에서와 같이, 이후에, 심외막 세포는 평활근 세포(SM22+, 칼포닌+) 및 심장 섬유아세포(DDR2+, 비멘틴+)로 분화하고, 이는 심근세포 조직으로 이동한다)(예: 도 11). 이는 생체내에서도 일어나는 것이다. 평활근 세포와 섬유아세포는 단순히 첨가되는 것이 아니라, 자연적으로 발달하고, 이는 이들이 적절하게 기능하기 위해 중요하다. 시스템의 자연적 발달은 최종 제품의 기능에 중요하다.
전반적으로, 몇 가지 가능한 최종 제품이 있다. 바람직한 조직 모델 또는 오르가노이드는 다음과 같다: a) 95% 이상의 심근세포의 순수한 오르가노이드, b) 90%의 심근세포 및 내부 라이닝을 갖는 10%의 내피 세포; c) 45%의 심근세포 및 55%의 내피 세포(또는 VEGF에 의해 조작될 수 있는 일부 기타 비율), d) 심근세포 및 심외막 단독, f) 3개의 주요 계통 모두를 함께(예: 도 11G), g) 마지막으로, 심외막이 심장 평활근 세포와 심장 섬유아세포로 분화하는 경우, 여기에는 5개의 세포 유형이 있고, 모두 심장 기능에 필수적이며, 모두 생체내에서와 같은 심장 세포 유형이다(예: 도 11). 심장에 속하지 않는 세포 유형은 검출할 수 없다(내배엽, 조혈 내피, 비-심장 평활근 세포 및 심외막에서 유래하지 않은 비-심장 섬유아세포 등). 바람직하게는, 조직 모델은 0.1% 내지 40%, 바람직하게는 1% 내지 35%, 특히 바람직하게는 10% 내지 30%의 심내막-유래 섬유아세포 등의 심내막 유래 섬유아세포를 포함한다. 바람직하게는, 조직 모델은 적어도 1%, 바람직하게는 적어도 5%의 심내막-유래 섬유아세포를 포함한다.
본 발명의 현저한 특징은 아키텍쳐이고, 따라서 심근세포 또는 내피 세포는 하나의 내부 공동에 면하고, 구조 주변의 심외막 세포가 이동하고, 심장 평활근 세포 및 심장 섬유아세포가 심근으로 이동한다. 이는 심장 공동/챔버가 생체내에서도 형성되는 방법이고, 이의 모든 변형을 갖는 이 특정 아키텍처는 발달 및 생리적 동작 등의 생체내 모델 및 시험의 기능 및 적용성에 매우 중요하다.
본 발명은 이하의 넘버링된 실시양태에 의해 추가로 설명된다:
1. 조직 모델의 혈관계의 선택적 추가 세포와 관계없이 적어도 60% 심장 세포의 심장 조직 모델, 또는 적어도 50% 심장 세포를 포함하는 심장 조직 모델로서, 상기 심장 세포는 내부 공동을 둘러싸고, 상기 심장 세포는 심근세포, 심내막 세포 및 심외막 세포로부터 선택되는, 심장 조직 모델.
2. 상기 1에 있어서, 적어도 30%의 심근세포를 포함하는, 심장 조직 모델.
3. 상기 2에 있어서, 적어도 2%의 심내막 세포를 추가로 포함하는, 심장 조직 모델.
4. 상기 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서, 상이한 조직 층에 심근세포 및 심내막 세포를 포함하는, 심장 조직 모델.
5. 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 별도의 조직, 바람직하게는 외층에 심외막 세포를 포함하는, 심장 조직 모델.
6. 상기 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 60%, 보다 바람직하게는 적어도 80%의 심근세포를 포함하는, 심장 조직 모델.
7. 상기 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 전장 내배엽 세포(foregut endodermal cell)를 최대 5%, 바람직하게는 최대 3% 포함하거나 전혀 포함하지 않고/않거나, 조혈 세포를 최대 3% 포함하거나 전혀 포함하지 않는, 심장 조직 모델.
8. 상기 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 심외막 평활근 세포 및/또는 심외막 심장 섬유아세포를 포함하는, 심장 조직 모델.
9. 상기 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 비-심외막-유래 평활근 세포를 최대 3% 포함하거나 전혀 포함하지 않고/않거나, 비-외막-유래 또는 심내막-유래 섬유아세포를 최대 3% 포함하거나 전혀 포함하지 않는, 심장 조직 모델.
10. 상기 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 최대 치수가 0.3mm 내지 15mm인, 심장 조직 모델.
11. 상기 1 내지 10 중 어느 하나에 있어서, 이의 최대 치수에서의 내부 공동의 크기는 이의 최대 치수에서의 심장 조직 모델의 크기의 적어도 20%인, 심장 조직 모델.
12. 상기 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 심근세포 또는 심내막 세포가 내부 공동을 직접 면하는, 심장 조직 모델.
13. 상기 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 손상 또는 치유된 손상을 포함하는, 심장 조직 모델.
14. 상기 13에 있어서, 상기 손상 또는 치유된 손상이 심장 조직 모델의 비-손상 부분과 비교하여 증가된 양의 섬유아세포, 콜라겐 및/또는 피브로넥틴을 포함하는, 심장 조직 모델.
15. 상기 14에 있어서, 상기 손상 또는 치유된 손상에서 섬유아세포의 증가된 양이 심장 조직 모델의 비-손상 부분과 비교하여 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 3배, 특히 바람직하게는 3배 내지 25배, 예컨대, 3.3배 내지 21.7배인, 심장 조직 모델.
16. 상기 14 또는 15에 있어서, 상기 손상 또는 치유된 손상에서 피브로넥틴 및/또는 콜라겐의 증가된 양이 심장 조직 모델의 비-손상 부분과 비교하여 적어도 1.1배, 바람직하게는 적어도 1.25배, 특히 바람직하게는 1.3배 내지 3배, 예컨대, 1.33배 내지 2.13배인, 심장 조직 모델. 17. 상기 13 내지 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 손상 또는 치유된 손상이 동결, 예를 들면, 동결-손상으로부터의 것인, 심장 조직 모델.
18. 상기 13 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 심장 조직 모델의 손상 또는 치유된 손상 부분이 심장 조직 모델의 용적의 1% 내지 30%, 바람직하게는 4% 내지 20%인, 심장 조직 모델.
19. 심장 조직 모델을 생성하는 방법으로서,
a) 다능성 줄기 세포를 제공하는 단계,
b) 저부착 배양의 3D 배양에서, WNT 활성화제 및/또는 GSK3-베타 억제제의 존재 및 추가로 PI3 키나제 억제제의 존재하에 중배엽 분화를 유도하는 단계로서, 배양 용기 대신에 세포를 서로 결합시켜 세포의 응집체를 형성하고, 이에 의해 중배엽 세포의 응집체를 생성하는 단계,
c) 단계 b)의 중배엽 세포를 저부착 배양에서 3D 배양에서 심장 세포로 분화시키는 단계로서, 상기 세포는 배양 용기에 결합하는 대신에 서로 결합하여, 심장 분화 인자의 존재하에 및 WNT 활성화제의 부재하에 및/또는 WNT 길항제의 존재하에, 심장 중배엽 형성 및 내부 공동의 형성을 위해 적어도 3일 동안, 바람직하게는 3 내지 7일 동안 세포의 응집체를 형성하는, 단계
를 포함하는. 방법.
상기 방법은 내피 구획 및 심근세포 구획을, 예를 들면, 생체내에서와 같이 공간에 의해 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
20. 심장 조직 모델을 생성하는 방법으로서,
a) 다능성 줄기 세포를 제공하는 단계,
b) WNT 활성화제 및/또는 GSK3-베타 억제제의 존재하에 중배엽 분화를 유도하는 단계로서, 상기 WNT 활성화제 및/또는 GSK3-베타 억제제 및/또는 임의의 PI3 키나제 억제제는 유도 개시로부터 40시간 이내에 다능성 줄기 세포의 적어도 90%의 양에서 다능성 줄기 세포를 분화시켜 다능성을 종료하기에 충분한 양으로 존재하고, 이에 의해 중배엽 세포의 응집체를 생성하고, 상기 세포는 섬유아세포 성장 인자 및/또는 알부민으로 처리되는, 단계,
c) 단계 b)의 중배엽 세포를, 심장 분화 인자의 존재하에 및 WNT 활성화제의 부재하에 및/또는 WNT 길항제의 존재하에 심장 내배엽 형성 및 내부 공동의 형성을 위해 적어도 3일, 바람직하게는 3 내지 7일 동안 저부착 배양에서 3D 배양에서 심장 세포로 분화시키는 단계
를 포함하는, 방법.
상기 방법은 내피 구획 및 심근세포 구획을, 예를 들면, 생체내에서와 같이 공간에 의해 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
21. 상기 19 또는 20에 있어서, 단계 b)의 WNT 활성화제가 WNT-3a 또는 CHIR99021 등의 WNT 리간드인, 방법.
22. 상기 20에 있어서,
상기 WNT 활성제가 유도 개시로부터 40시간 이내에 다능성 줄기 세포의 적어도 90%의 양에서 다능성 줄기 세포를 분화시켜 다능성을 종료시키기에 충분한 양으로 존재하는 경우, WNT 활성화제로서 CHIR99021의 양은 적어도 1μM, 바람직하게는 적어도 6μM 또는 12μM의 농도로 존재하고, PI3 키나제 억제제가 존재하는 경우, WNT 활성화제로서의 CHIR99021은 적어도 0.5μM, 바람직하게는 0.5μM 내지 12μM의 농도로 존재하는, 방법.
23. 상기 19항 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 다능성 줄기 세포가 유도된 다능성 줄기 세포 또는 세포주로부터의 세포이고/이거나, 단계 a)의 제공된 다능성 줄기 세포가, 바람직하게는 알부민 및/또는 섬유아세포 성장 인자를 포함하고, 보다 바람직하게는 BMP 및/또는 인슐린을 추가로 포함하는 배지에서 계대배양되어 있는, 방법.
24. 상기 19 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 단계 a)의 제공된 다능성 줄기 세포가 적어도 1.5%(w/v)의 알부민, 바람직하게는 BSA, 및/또는 적어도 100ng/ml의 섬유아세포 성장 인자, 바람직하게는 FGF2를 포함하고, 더욱 바람직하게는 BMP 및/또는 인슐린을 추가로 포함하는 배지에서 성장되는, 방법.
25. 상기 19 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 PI3 키나제 억제제가 LY294002 또는 임의의 기타 PI3 키나제 억제제인, 방법.
26. 상기 19 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 중배엽 분화가 액티빈 A 및/또는 골 형태형성 단백질, 바람직하게는 추가의 섬유아세포 성장 인자를 포함하는 배지에서 유도되는, 방법.
27. 상기 26에 있어서, 중배엽 분화가 적어도 1ng/ml의 골 형태형성 단백질, 바람직하게는 BMP4를 포함하는 배지에서 유도되는, 방법.
28. 상기 19 내지 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 중배엽 분화가 섬유아세포 성장 인자 및/또는 알부민, 바람직하게는 BSA를 포함하는 배지에서 유도되는, 방법.
29. 상기 19 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 저부착 배양이 표면에 대한 세포의 부착을 억제하는 저부착 표면을 갖는 용기에서 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
30. 상기 19 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 중배엽 세포를 심장 세포로 분화시키는 단계가 섬유아세포 성장 인자, 인슐린, 골 형태형성 단백질, 또는 이들의 조합을 갖는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
31. 상기 19 내지 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 WNT 길항제가 Wnt-C59, IWR-1, XAV939, IWP-2, IWP-4 DKK1로부터 선택되는, 방법.
32. 상기 19 내지 31 중 어느 하나에 있어서, d) 중배엽을 갖는 응집체를 추가로 1일 이상 동안 심장 분화 인자를 갖는 심근세포 층을 갖는 조직으로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
33. 상기 19 내지 32 중 어느 하나에 있어서, 바람직하게는 내부 공동을 라이닝하거나 심근세포 층을 둘러싸고 임의로 공간에 의해 분리된, 바람직하게는 적어도 심장 내피 세포의 내부 또는 외부 층이 형성될 때까지, 영양소를 포함하는 배지에서 세포의 성숙을 추가로 포함하는, 방법.
34. 상기 19 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 심장 내피 세포의 내부 층의 형성을 방지하기 위해, 단계 b) 및/또는 c), 및/또는 상기 32의 임의 단계 d)에서 VEGF 억제제를 적용하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
35. 상기 19 내지 33 중 어느 하나에 있어서, 세포를 VEGF와 함께 배양하여, 심장 내피 세포 및/또는 심장 섬유아세포의 형성을 증가시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
36. 상기 35에 있어서, WNT 활성화제, 바람직하게는 CHIR99021을, 단계 b) 동안에, 심장 조직 모델의 외측에 심장 내피 세포의 형성을 유도하기에 충분한 양, 바람직하게는 1 내지 12μM CHIR99021로 첨가하는 단계를 포함하는, 방법.
37. 상기 19 내지 36 중 어느 하나에 있어서, 심외막 세포를 조직 모델에 첨가하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
38. 상기 19 내지 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 세포가 단계 b)에서 알부민으로 처리되는, 방법.
39. 상기 19 내지 38 중 어느 하나에 있어서, 단계 a)가 2D 배양이고, 바람직하게는 단계 b)가 또한 2D 배양인, 방법.
40. 상기 19 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 조직 모델의 일부, 바람직하게는 심장 조직 모델의 용적의 1% 내지 30%, 바람직하게는 4% 내지 20%의 일부에 손상, 바람직하게는 동결 손상을 유발하는 단계를 포함하는, 방법.
41. 상기 19 내지 40 중 어느 하나의 방법을 수행하기 위한 키트로서,
i) WNT 활성화제 및/또는 GSK3-베타 억제제, ii) PI3 키나제 억제제, iii) 저부착 세포 배양 용기를 포함하는, 키트.
42. 상기 41에 있어서, WNT 억제제를 추가로 포함하는 키트.
43. 바람직하게는 1 내지 18 중 어느 하나에서와 같이 추가로 정의된 바와 같은, 상기 19 내지 40 중 어느 하나의 방법에 의해 수득할 수 있는 심장 조직 모델.
44. 적어도 10개의 구획을 포함하는 용기 플레이트로서, 각각의 구획에서 상기 1 내지 18 및 43 중 어느 하나에 따른 조직 모델이 실질적으로 동일한 발달 단계에 존재하는, 용기 플레이트.
45. 상기 19 내지 40 중 어느 하나에 있어서,
세포를 후보 화합물로 처리하는 동안 상기 19 내지 40 중 어느 하나에 따르는 심장 조직 모델을 생성하는 단계, 및 심장 조직 모델의 발달을, 후보 화합물로 처리되지 않은 심장 조직 모델의 발달 및/또는 기능성과 비교하는 단계
를 포함하는, 후보 화합물을 심장 발달 및/또는 기능성에 대한 이의 효과에 대해 스크리닝 또는 시험하기 위한 방법.
46. 억제 또는 과발현된 유전자가 심장 발달에 미치는 영향을 관찰하는 방법으로서,
상기 19 내지 40 중 어느 하나에 따르는 심장 조직 모델을 생성하는 단계(여기서, 상기 세포는 억제된 후보 유전자를 갖거나 후보 유전자를 과발현한다) 및 심장 조직 모델의 발달을, 억제 또는 과발현된 유전자로 생성되지 않은 심장 조직 모델의 발달과 비교하는 단계
를 포함하는, 방법.
47. 상기 46에 따른 심장 발달 동안 억제 또는 과발현된 유전자의 효과의 관찰과 조합하여, 상기 45에 따른 심장 발달 및/또는 기능성에 대한 후보 화합물의 효과에 대해 후보 화합물을 스크리닝 또는 시험하는 방법.
본 발명은 본 발명의 이러한 실시양태로 한정되지 않고, 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 설명된다.
도 1: 다능성 줄기 세포로부터 개시하는 기본적 심장 오르가노이드 프로토콜의 개요, 96웰 플레이트에서의 응집, 박동 심근세포 단계까지의 심장 공동의 형성. 섹션에 의한 실제 시간 경과를 하기에 나타낸다.
도 2: A: 유도 중에 8uM CHIR99021의 농도를 사용하여, hPSC(WTC MYL7-GFP)로부터 유래하는 d7.5의 심장 오르가노이드. 좌측: 오르가노이드의 크기를 나타내는 전체 마운트 명시야 이미지. 우측: 오르가노이드와 공동 크기의 관계를 나타내는 DAPI로 염색한 동결절편. B: 1000 hPSC(WTC MYH10-GFP)로부터 유래하는 중배엽 세포의 응집체는 hPSC가, 40시간의 중배엽 유도(8uM CHIR99021 사용) 후에, 원시 줄무늬 마커 T의 상향조절 및 다능성 마커 SOX2의 하향조절에 의해 다능성을 효율적으로 종료했음을 나타낸다. C: 심장 오르가노이드(심근세포-특이적 마커 MYL7의 내인성 발현의 발현을 나타내는 배양 10일 후의 WTC MYL7-GF).
도 3: A: 내배엽 마커 SOX17 및 EOMES의 부재를 나타내는 3.5일차의 오르가노이드 절편. 스케일바 200μm.
도 4: A: 심근세포(CM) 및 내피 세포(EC)를 별도의 층에 포함하는 심장 오르가노이드를 생성하는 프로토콜의 모식도 및 명시야 이미지. 화살표는 형성된 공동을 나타낸다. B: 별도의 층에서 MYL7-GFP(녹색) 및 CDH5-Tomato(적색)의 발현을 나타내는 복수의 심장 오르가노이드. C: 오르가노이드의 조성이 평균 53% EC 및 41% CM임을 나타내는 유세포 분석 결과의 정량화. D: 오르가노이드 단면도는 MYL7-GFP 및 HAND1을 발현하는 CM의 환으로 둘러싸인 내부 공동의 존재를 나타내고, 이는 또한 CD31을 발현하는 EC 층으로 둘러싸여 있다. E: HOX-유전자 발현을 나타내는 상이한 EC 및 다능성 줄기 세포의 vst-카운트(분산 안정화된 변환)의 히트맵. 분석된 EC는 다음과 같다: 2D 인간 심장 미세혈관 내피 세포(HCMEC), 전방 분화 프로토콜로 분화된 2D EC, 심장 오르가노이드로부터의 3D CDH5-Tomato 양성 EC, 2D 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC), 문헌(Patsch et al.) 프로토콜로 분화된 2D EC(실시예 3), 혈관 오르가노이드로부터의 3D EC(Wimmer et al., 실시예 3 참조). 심장 오르가노이드로부터 EC의 HOX 유전자 발현은 HCMEC와 비교하여 매우 유사한 특징을 나타낸다. F: 6μM 및 4μM CHIR99021(CHIR)의 절편은 보다 낮은(4μM) CHIR 조건에서 CD31을 발현하는 EC의 내부 환을 나타낸다. 절단된 카스파제 3 염색은 6μM CHIR 조건에서 낮은 수준의 아폽토시스를 나타냈지만, 4μM CHIR 조건에서 EC 환(CD31+) 내의 수준을 증가시켰다. VST = 분산 안정화 변환.
도 5: A: 명시야(BF), MYL7-GFP, CDH5-Tomato 및 수니티닙(100nM)으로 처리된 오르가노이드의 병합된 이미지는 "+수니티닙"으로 지정되거나, 표준 프로토콜("정상")로 구별된다. 이미지는 "+수니티닙" 조건에서 보다 균일한 MYL7-GFP 발현과, 양쪽 조건 모두에서 CDH5-Tomato 발현의 결여를 나타낸다. 각 오르가노이드 이미지는 2500×2500μm이다.
도 6: A: 분화 말기(7.5일차)에 유세포 분석 데이터에 대해 수행된 정량화 전략의 대표적 이미지. "WT CTRL"은 형광단을 발현하지 않는 오르가노이드로부터의 야생형 세포를 지정하고, "정상"은 표준 분화 프로토콜을 지정하고, "+수니티닙"은 수니티닙(100μM)으로 처리된 오르가노이드를 지정한다. B: 유세포 분석 데이터의 정량화는, 수니티닙 치료로 96%까지 높아질 수 있는 표준 프로토콜에서 약 60%의 MYL7-GFP 발현 심근세포를 나타낸다. 정량화는 또한 표준 프로토콜에서 내피 마커 CDH5-Tomato를 발현하는 세포의 약 2% 및 "+수니티닙" 조건에서 유사하게 낮은 3%를 나타낸다.
도 7: A: 심근세포(CM) 및 내피 세포(EC)를 별도의 층에 포함하는 오르가노이드 절편의 대표적 이미지. 명시야 이미지(BF)는 세포 조직을 나타내고, MYL7-GFP(CM) 및 CD31(EC)에 대한 이미지는, 또 다른 공동에 의해 EC 층으로부터 또한 분리된 CM 층으로 둘러싸인 내부 공동을 나타낸다. B: 심근세포(CM) 및 내피 세포(EC)를 별도의 층에 포함하는 오르가노이드 절편의 대표적 이미지. BF 이미지는 세포 조직을 나타내고, CM 마커 TN NT2에 대한 염색은 다른 CM 마커 MYL7과의 중첩을 나타낸다. 스케일바 = 200μm.
도 8: 내피(CD31+) 세포에 의한 내부의 공동의 라이닝을 나타내는 유도 중에 4uM CHIR99021의 농도를 사용하여 hPSC(WTC MYL7-GFP)로부터 유래하는 d27의 심장 오르가노이드.
도 9: A: 상이한 Wnt 억제제(IWR-1(IWR), XAV939(XAV) 및 IWP2(IWP))를 2개의 CHIR99021 농도(5μM(CHIR5) 및 6μM(CHIR6))로 분화 중에 사용하는 경우, 심근세포(MYL7-GFP)와 내피 세포(EC, CDH5-Tomato)의 2층 구조를 나타내는, 명시야(BF), MYL7-GFP 및 CDH5-Tomato 이미지의 병합된 이미지. 또한, EC의 부재를 나타내는 "IWP -VEGF" 상태도 포함된다. 각 오르가노이드 이미지는 2000×2000μm이다.
도 10: A. 심외막 분화의 모식도. B. 심외막 분화의 상이한 단계에 대한 vst-카운트(분산 안정화 변환)의 히트맵. 다능성 마커는 중배엽 유도 후에 하향조절되는 반면, 시간 경과와 함께 심장 중배엽 특이적 마커의 발현은 상향조절된다. 심외막 구체화(specification) 및 유지 중에, 심외막 특이적 마커 발현이 관찰된다. C. qPCR에 의해 관찰된 다능성과 비교하여 심외막, 및 피브로넥틴 재플레이팅된 심외막의 심외막 마커 TCF21 및 TBX18의 발현. D. 항체 염색에 의해 관찰된 바와 같이, 분화 말기(8.5일차) 및 관련 후의 심외막 세포는 심외막 마커 WT1(빌름 종양 단백질)에 대해 매우 양성이다. 스케일바: 100μM. E. TGF-베타, 인슐린, L-아스코르브산 및 PDGF-BB의 존재하에서 재플레이팅된 심외막의 SMC(평활근 세포) 분화의 12일 후, 수득된 세포는 SMC-마커 a-SMA(알파 평활근 액틴) 및 칼포닌에 대해 매우 양성이다. 스케일바: 1mm, 병합되고 확대된 이미지는 1mm × 1mm이다. F. TGF-베타, 인슐린, L-아스코르브산 및 FGF의 존재하에서 재플레이팅된 심외막의 CF(심장 섬유아세포-유사 세포) 분화의 12일 후, 수득된 세포는 CF-마커 DDR2(디스코이딘 도메인 수용체 티로신 키나제 2) 및 비멘틴에 대해 매우 양성이다. 스케일바: 1mm, 병합되고 확대된 이미지는 1mm × 1mm이다.
도 11: A. 심장 오르가노이드 분화를 수반하는 심외막 공-배양 시스템의 모식. (dpf: 융합후 일수) B. 융합후 2일간, 심외막과 함께 공-배양된 심장 오르가노이드. 심외막은 여전히 심외막 마커 WT1(빌름 종양 단백질)을 발현하는 반면, 심장 오르가노이드는 cTNT(심장 트로포닌-T)에 대해 매우 양성이다. 스케일바: 100uM(b') 및 50uM(b"). C. 심외막 세포(TdTomato 발현으로 표시됨)는 심근세포 층(화살표로 표시됨)으로 이동하고, SM22(태글린) 및 VIM(비멘틴)으로 표시된 후속 분화를 겪는다. 표본 고정 24dpf. 스케일바: 20μM. D. 심외막 세포는 심장 오르가노이드의 외측 층을 형성하고, 또한 심장 층으로 이동한다(심외막은 TdTomato 발현에 의해 표시됨). 세포는 섬유아세포 특이적 Col1A2에 대해 양성이다. 표본 고정 8dpf. 스케일바: 50μM. E. 심외막 세포가 심장 층으로 이동한다(심외막은 TdTomato 발현에 의해 표시됨). 세포는 섬유아세포 특이적 DDR2(디스코이딘 도메인 수용체 티로신 키나제 2)에 대해 양성이다. 표본 고정 7dpf. 스케일바: 20μM. F. 심외막 세포는 심장 오르가노이드의 외측 층을 형성하고, 또한 심장 층으로 이동한다(심외막은 TdTomato 발현으로 표시됨). 세포는 섬유아세포 특이적 데코린에 대해 양성이다. 표본 고정 16dpf. 스케일바: 50μM. G: 외측 심외막 세포, 중간 심근세포 층 및 내측 심내막(심장 내피 세포) 층을 갖는 삼계통 심장 모델의 개략도.
도 12: A: 3.5일차의 오르가노이드(WTC iPS 세포)는 BMP 억제제 노긴 및 LDN193189로 처리되고, 이어서 억제제 처리에 의해 직경이 대폭 감소됨을 나타내는 직경 정량화가 수행된다. B: HAND1 녹아웃(KO) 세포와 비교한 야생형(WT) 대조군 세포의 3.5일차 오르가노이드(H9 배아 줄기 세포). 정량화는 KO 오르가노이드의 현저히 감소된 직경 크기를 나타낸다.
도 13: 심장 오르가노이드("카디오이드") 및 일부 용도의 도. 좌측: 카디오이드의 제품 및 고처리량 방법에서의 사용. 중간: 심근세포 또는 심외막 내부 라이닝을 갖고, 외측에 심외막 세포를 갖거나 갖지 않는 상이한 단계의 상이한 카디오이드. 예를 들면, 동결-손상을 통해 부상 모델로서의 사용은 손상된 부위에 침윤한 섬유아세포와 함께 하부에 설명되어 있다. 우측: 심장 챔버의 모델링
도 14. 시험관내에서 심장 챔버-유사 구조의 형성. (A) 심장 분화 프로토콜. WNT 신호전달의 활성화(CHIR99021에 의한), WNT 신호전달의 억제(IWP-2/IWR-1/XAV-939에 의한), PI3K 신호전달의 억제(LY294002에 의한). (B) 3개의 생물학적 복제(iPSC WTC 라인)에서 공동-함유, 박동 구조의 견고한 생성을 나타내는 고처리량 분화 접근법의 대표적 전체 마운트 이미지(5.5일차). (C) CM-특이적 마커 TNNT2의 공동 및 발현을 나타내는 d7.5에서의 카디오이드의 동결-절편. 스케일바: 200μm. (D) 유세포 분석을 통한 d7.5에서 카디오이드에서 TNNI1-GFP+ 세포의 정량화. (E) CM 구체화 및 CM 유지 중에 d1.5와 d5.5 사이의 심장 중배엽 마커를 포함하는 주요 심장 유전자의 전사 변화를 나타내는 히트맵. VST: 분산 안정화 변환 카운트. (F) RT-qPCR은 유도 단계에서 다양한 액티빈 및 CHIR99021 농도를 갖고, SB 43154의 존재 또는 부재와 함께 심장 중배엽 단계에서 다양한 레티노이드 산 농도를 갖는 14일차 오르가노이드의 결과이다. 스케일바는 하우스키핑 유전자, PBGD 및 최소-최대 정규화로 정규화된 다능성 줄기 세포로부터의 변화 배율을 나타낸다. (G) 최적화된 좌심실 상태(A4CH4 RA50) 대 최적화되지 않은 상태(A50CH4 RA500)를 나타내는 카디오이드(d10)의 심실(IRX4) 및 심방(NR2F2) CM에 대한 면역염색. A, 액티빈; CHIR, CHIR99021, RA, 레티노산; SB, SB 43154. 스케일바: 100μm. (H) 더 많은 심방 마커 대 더 많은 심실 마커를 발현하는, 중간 WNT(CHIR6)/높은 액티빈(A50)/RA500(N=2, n=1717) 대 낮은 WNT(CH4)/낮은 액티빈(A4)/RA50(N=2, n=5097) 상태에서 CM의 백분율의 scRNA-seq 분석. TNNT2는 모든 CM에서 발현된다. 이 도에서 사용된 세포주: WTC.
도 15. 심장 중배엽은 자가-조직화하고, 시험관내 및 생체외에서 공동을 형성한다. (A) 카디오이드 형성의 시간 경과. 상부: 분화 과정에서 크기 변화의 정량화. 하부: 크기의 증가와 경시적 공동 형성을 나타내는 동결절편의 전체 마운트 명시야 이미지 및 면역염색. 공동은 d2.5에서 최초로 관찰되고, 아폽토시스(Casp3 음성) 또는 국소 증식(KI67+) 차이에 의해 형성되지 않는다. 스케일바: 500μm(명시야 이미지), 50μm(절편). (B) 인간 심장 중배엽 조건에서 병아리 배아로부터의 심장 중배엽 외식편은 공동을 갖는 챔버-유사 CM 구조를 형성한다. 스케일바: 200μm. (C) d1.5와 d2.5 사이의 오르가노이드(주변에서 중심까지의 범위)의 상세 이미지는 F-액틴(팔로이딘), 막-결합 베타-카테닌(PY-654-β-카테닌) 및 N-카드헤린의 차등 발현에 의해 심장 중배엽 단계의 개시시에 느슨하고 조밀한 중배엽 구획의 형성을 나타낸다. (D) 심장 중배엽(N=3, n=14)의 느슨한(중앙) 층 대 조밀한(주변) 층의 65μm2 정사각형의 대표적 이미지 및 핵 수의 정량화. 이 도면에서 사용된 세포주: WTC.
도 16. WNT 및 BMP 제어 카디오이드의 자가-조직화 및 구체화. (A) 중배엽 유도 중의 CHIR99021 농도의 범위는 카디오이드 직경(3.5일차) 및 CM 구체화(7.5일차)에 극적인 효과를 나타낸다. 2500 hPSC로부터 개시하는 프로토콜. 스케일바: 2500μm. (B) 심장 중배엽 구체화 중의 3.5일차에 카디오이드 직경의 정량화. (C) BMP 표적 유전자(HAND1, IRX3, BMP4, BMP2, BMPR2)는 공동-형성 조건(8μM CHIR99201)하에서 상향조절되는 반면, 4μM CHIR99021을 사용하면, EC 유전자(PECAM1, CDH5, VEGFA)는 상향조절된다. (D) 노긴(100ng/ml) 또는 LDN193189(0.2μM)를 사용한 BMP 억제는 카디오이드 직경을 감소시킨다. 7500 hPSC로 개시하는 프로토콜. 스케일바: 1958μm. (E) BMP 억제의 존재 또는 부재하에 3.5일차에 카디오이드 직경의 정량화. (F) 세포/오르가노이드의 세포 계수는 감소된 직경이 보다 적은 수의 세포의 함수가 아닌 것을 나타낸다. (G) 노긴 및 LDN193189 처리는 공동 확장을 방해한다. 스케일바: 200μm. (H) 심장 중배엽 단계에서 Wnt 활성화는 CM-분화를 억제하지만, 공동 확장은 억제하지 않는다. 스케일바: 200μm. 모든 막대 그래프의 표시: 평균 +/- SD. 이 도면에서 사용된 세포주: H9, WTC.
도 17. HAND1은 심장 중배엽(d3.5)의 자가 조직화에 필요하다. (A) NKX2-5의 하향조절을 나타내는 HAND1 KO 카디오이드. 스케일바: 200μm. (B) WT 카디오이드는 HAND1 KO 카디오이드와 비교하여 공동(화살표)의 수 및 직경의 증가를 나타낸다. 스케일바: 2000μm. (C) HAND1 KO 카디오이드는 보다 작은 및 감소된 수의 공동을 나타낸다. 스케일바: 2000μm. (c') 및 (c"), HAND1 염색에 의한 C 및 HAND1 KO 확인의 상세. 스케일바: 200μm. (D) HAND1 KO 및 WT 카디오이드에서 직경의 함수로서 카디오이드 공동 확장의 정량화. (E) WT 및 KO 카디오이드에서 공동에 의해 덮인 카디오이드 영역의 백분율. (F) 3.5일차(심장 중배엽 단계)까지 오르가노이드 형성의 타임라인, 분석 포인트. 중배엽 유도 중의 WNT 신호전달의 증가(CHIR99021)는 HAND1 KO 오르가노이드(화살표)의 공동 결함을 구조한다. 스케일바: 2500μm. (G) 카디오이드 직경의 정량화는 WNT 활성화의 증가가 HAND1 KO 공동 결함을 구제하는 것을 나타낸다. 모든 막대 그래프의 표시: 평균 +/- SD. 이 도면의 모든 데이터는 d3.5의 카디오이드로부터 유래한다. 이 도면에서 사용된 세포주: HAND1 KO(H9), NKX2-5 KO(H9).
도 18. WNT, ACTIVIN 및 VEGF는 내피 및 심근 자가 조직화를 조정한다. (A) 중배엽 유도 중의 낮은 WNT 용량(CHIR99021, 4μM)은 높은 WNT(CHIR99021, 8μM)와 비교하여 EC-특이적 유전자(VEGFA, TAL1, LMO2, ETV2, PECAM1)의 보다 높은 발현을 초래한다. (A') VEGF를 첨가하지 않고 저용량 또는 고용량의 WNT 및 액티빈을 사용하여 수행된 분화 타임라인. (B) 중간 WNT(CHIR: 6μM)/높은 액티빈(50ng/ml) 조건(N=2, n=5097)와 비교하여, 최적화된 심실-유사 CM(저 WNT(CHIR: 4μM)/저 액티빈(4ng/ml), N=2, n=1717)에서는 VEGF 발현 CM(서열분석된 단일 세포)의 비율이 증가한다. (C) "액티빈 비함유" 조건에서 부분 EC-라이닝 출현의 예시 이미지. 스케일바: 200μm. (D) 상이한 EC 형성 및 라이닝 발생의 정량화. N=4, n=29. (E) 카테고리 1 및 2에 대한 예시 이미지. 스케일바: 200μm. (F) 첨가된 VEGF 및 중간체 WNT(CHIR: 6μM)/고 액티빈(50ng/ml) 투여량 및 WNT 억제로 수행된 분화의 타임라인. (F') 카디오이드에서 CM 및 EC의 견고한 비율을 나타내는 FACS 데이터의 정량화. 평균 +/- SD. (F") 카디오이드는 CM 및 EC 층의 분리, 및 섬유아세포-유사 세포(COL1A1+) 층의 출현을 나타낸다. 스케일바: 200μm. (G) 첨가된 VEGF 및 중간 WNT(CHIR: 6μM)/고 액티빈(50ng/ml) 투여량 및 WNT 억제의 결여로 수행된 분화의 타임라인. (G') 심장 중배엽 단계에서 WNT가 억제되지 않고 VEGF가 보충된 경우의, CM을 포함하지 않는 EC 및 섬유아세포-유사 세포만을 포함하는 카디오이드의 동결-절편. 이 도면에서 사용된 세포주: WTC.
도 19. VEGF 처리시의 카디오이드 세포의 세포 식별. (A) 문헌(Cui et al., 2019)(인간 태아 심장)에 의해 결정된 마커를 기반으로 하는 VEGF-보충 카디오이드 세포의 선별. CM: 심근세포, EC: 심장 내피 세포, EP: 심외막 세포. 심장 내피 세포(PECAM1, CDH5, NPR3), 심근세포(TNNT2, MYL7) 및 섬유아세포-유사 세포(COL1A1, COL3A1)에 대한 선택된 마커가 도시된다. (B, B', B") 카디오이드의 심장 내피 세포는 기계감수성 유전자(예: KLF2, SOX18)를 발현한다. 스케일바: 200μm. (C) 하기의 PCA: 2D 유래 EC(전부, Patsch et al., 인간 심장 미세혈관(HCMEC), 인간 제대 정맥(HUVEC)), 카디오이드로부터의 hPSC 및 3D 유래 EC(7.5일차, 중간 WNT 용량) 및 혈관 오르가노이드((Wimmer et al., 2019) Day>18)). 전방 EC: H9 라인, Patsch et al., 혈관 오르가노이드 ECs(Wimmer et al., 2019)에 의해 표시됨. (D) FACS 선별 EC에서 기계감수성 및 성숙 유전자, 심장 전사 인자, EC 전사 인자, 심내막-유사 및 일반적 EC 유전자의 차등 발현. 이 도면에서 사용된 세포주(달리 명시되지 않는 한): WTC.
도 20. 심외막은 카디오이드와 상호작용하고, 심외막 또는 심내막 유래 섬유아세포는 동결 손상에 반응한다. (A) 심외막 공-배양 및 동결손상의 모식도. (B) 100ng/ml VEGF-A의 존재하에 EC(PECAM1+) 내부 라이닝을 포함하는 카디오이드(TNNT2+)와의 공-배양 7일 후의 형광 표지된 심외막 유도체의 공초점 이미지. 스케일바: 200μm. (C-D) EC(PECAM1+)를 포함하는 카디오이드와 공-배양 7일 후의 COL1A1+(C) 및 ACTA2+(D) 심외막 유도체의 공초점 이미지. 스케일바: 50μm. (E-F) 심외막의 존재(E) 또는 부재(F)에서 카디오이드의 피브로넥틴(FN1) 및 COL1A1+ 세포를 염색한 동결손상 반응(손상 후 1시간 및 3일)의 공초점 이미지. 스케일바: 200μm(E, F) 및 50μm(e'-E의 상세). (G) 손상 후 1시간 및 3일 후의 심외막의 존재 또는 부재하에 동결손상된 카디오이드의 매슨(Masson)의 트리크롬 염색(청색: 결합 조직, 적색: 근육). 스케일바: 200μm. (H) FN1 및 COL1A1+ 세포를 표시하는 손상 3일 후의 CM+EC+섬유아세포 공-분화된 카디오이드의 공초점 이미지. 스케일바: 200μm. (I) 손상 3일 후의 공-분화된 CM+EC+섬유아세포 카디오이드의 손상된(자주색) 대 건강한(청색) 영역에서 COL1A1+ 세포의 정량화. COL1A1+ 세포의 수는 손상 면적/총 면적으로 정규화되었다. 점선은 도면에서 손상 영역을 표시한다. 심외막 도면에 사용된 세포주: H9, 실험은 WTC 세포주에서도 반복되었다. CM/EC/섬유아세포 공-분화에 사용된 세포주: WTC.
도 21: 심장 챔버-유사 구조의 생성 및 기능적 특성화. 도 1과 관련. (A) 라미닌 LN511(0.1μg/ml)을 2D 평저 웰에서 분화하기 전에 파종할 때에 세포 현탁액에 첨가함으로써 수득된 거대 공동을 포함하는 박동 챔버-유사 구조(8.5일차)의 예. 스케일바: 100μm. (B) 초저 부착 플레이트에서 CM 분화는 외인성 ECM 분자가 존재하지 않는 경우에도('ECM 없음' 컬럼), 공동을 포함하는 박동 3D 구조의 형성을 초래한다. 시점: 8.5일차. 스케일바: 500μm. (C) 카디오이드에서 몇몇 CM 특이적 마커의 발현(d7.5). 스케일바: 200μm. (C') 카디오이드 CM 내에서 육종 조직을 나타내는 (C)(TTN-GFP/ACTN2)의 상세. 스케일바: 6μm. (D) d7.5 카디오이드의 전자 현미경사진. S, 근절; ID, 삽입된 디스크; Z, Z선; D, 데스모솜. 스케일바: 1μm. (E) 다양한 hPSC-라인(hESC H7)(hiPSC 176/177/178)을 사용하여 카디오이드의 견고한 생성을 나타내는 CM-마커에 의한 면역염색. 스케일바: 200μm. (E') (E)에 표시된 카디오이드의 몇몇 기술적 복제의 전체 마운트 명시야 이미지. 스케일바: 200μm. (F) 500μm의 오르가노이드를 포획하는 광학 절편에서 DAPI와 TNNI1+ 영역 사이의 중첩 정량화. N=3, n=8. 이 도면의 모든 실험에서 사용된 세포주: WTC(달리 언급되지 않은 경우).
도 22: 심장 챔버-유사 구조의 생성 및 기능적 특성화. 도 1과 관련. (A) d7/d10/d27 카디오이드에서 심장 구조 유전자/이온 채널의 유전자 발현을 나타내는 히트맵. (B) 상이한 시점에서 카디오이드, 3D 조립 CM, 2D CM 및 hPSC 사이의 유전자 발현 특징의 비교. 사용된 세포주: H9, WTC. (C) GO 기간은 2D에서 7일차 CM과 비교하여 7일차 카디오이드에서 상향조절된다. 사용된 세포주: H9, WTC. (D) GO 기간은 카디오이드에서 7일차와 27일차의 3D 응집 CM의 사이에서 상향조절된다. 사용된 세포주: H9, WTC. (E) 챔버-유사 구조 및 2D CM은 유사한 칼슘 과도현상을 표시한다. 세포에 Fluo-4-AM을 로딩하고, 시간 경과에 따른 형광 강도를 분석함으로써 칼슘 과도현상을 분석했다. F/F0: 배경에 대한 형광 강도. ISI: 스파이크 간격. (F) 공개된 알고리즘을 사용한 박동 파라미터의 분석[참조: Huebsch et al., 2015, Tissue Engineering Part C: Methods 21, 467-479]. (G) 수록된 APD30, APD50 및 APD90을 포함하는 심실 카디오이드(d10)의 대표적 평균 활동 전위 트레이스. 오르가노이드는 7.33초의 평균 빈도(dT)로 수축했다. FluoVolt 시스템을 사용하여, 하나의 오르가노이드로부터 14개 이상의 활동 전위의 평균을 취득했다. 이 도면의 모든 실험에서 사용된 세포주: WTC(달리 언급되지 않은 경우).
도 23: 카디오이드 및 병아리 심장 중배엽 이식편의 특성화. 도 2와 관련. (A) SOX17+ 및 EOMES+ 내배엽의 부재를 나타내는 d2.5에서의 자가-조직화 심장 중배엽. 스케일바: 200μm. (B) 카디오이드의 공동 형성(d7.5)은, 수니티닙(100nM)으로 치료하면, 내피 세포(PECAM1+)의 부재하에 발생한다. 스케일바: 200μm. (C) 병아리 심장 중배엽 외식편은 심장 중배엽 배지에서 배양하면, 시험관내에서 공동을 갖는 구형 구조를 형성한다. 스케일바: 200μm. (D) 대조군 병아리 심장 중배엽 외식편 절편(도 2B에 나타낸 것과 동일한 구조)은 전장 마커 SOX2가 거의 존재하지 않음을 나타낸다. 스케일바: 200μm. 이 도면의 모든 실험에서 사용된 세포주: WTC(달리 언급되지 않은 경우).
도 24: NKX2-5 및 HAND1 KO hPSC 및 카디오이드 특성화. 도 4와 관련. (A) NKX2-5 KO 카디오이드는 공동 확장의 장애를 나타내지 않는다. 스케일바: 200μm. (B) 카디오이드 직경의 정량화는 3.5일차에 NKX2-5 KO 카디오이드의 감소가 없음을 확인한다. (C) d3.5 및 d7.5에서 WT 및 NKX2-5 KO 카디오이드에서 HAND1, NKX2-5 및 TNNT2의 면역염색. (D) d3.5에서 WT 및 HAND1 KO 오르가노이드에서 NKX2-5의 면역염색. (E) HAND1 KO 카디오이드에서 CM(NKX2-5+/TNNT2+)의 존재를 나타내는 d7.5 카디오이드의 면역염색의 클로즈업. (F) WT(N=3)와 HAND1 KO(N=3) 사이에 유의한 변화를 나타내지 않는 세포 수/카디오이드의 정량화. (G) HAND1 KO 카디오이드에서 HAND1 단백질 발현의 결여뿐만 아니라 공동 형성 결함을 나타내는 카디오이드(d3.5)의 절편(48 WT/47 HAND1 KO)의 면역염색. 스케일바: 2000μm. 이 도면의 모든 실험에서 사용된 세포주: HAND1 KO(H9), WT(H9), NKX2-5 KO(H9).
도 25. EC 자가-조직화의 범위의 추가 예. (A) VEGF 무첨가 및 저 WNT 및 액티빈 무첨가 또는 저 액티빈 조건으로 수행된 분화의 타임라인. (A') 저 WNT/저 액티빈 조건에서 카테고리 1 및 2의 예시 이미지. 스케일바: 200μm. (B) 저 WNT 및 고/액티빈 무첨가 조건에서 CM 구체화 후에 첨가된 VEGF를 사용하여 수행된 분화의 타임라인. (C) 및 (D) CM 구체화 이후에 VEGF를 첨가하면, 때때로 공동의 부분적 EC 라이닝이 발생하지만, 종종 EC가 부분적 외부 층을 형성한다. 스케일바: 200μm. (D)에서 사용된 세포주: H9. 이 도면의 모든 실험에서 사용된 세포주: WTC(달리 언급되지 않은 경우).
도 26. 내피 및 섬유아세포-유사 세포 층을 갖는 카디오이드의 특성화. (A) 중간 WNT 용량(CHIR99021, 6μM)을 사용하여, CM 및 EC 층을 분리한 카디오이드의 재현가능한 생성을 나타내는 3개의 생물학적 복제. 스케일바: 2000μm. (B) 응집된 CM 미세조직의 EC는 별도의 층이 아닌 심근세포 내에서 초보적 네트워크를 구축한다. 스케일바: 400μm. 사용된 세포주: H9. (C) EC는 카디오이드를 둘러싸는 네트워크 층을 구축한다. 최대 내외 투영. 동결-절편은 FN1이 3개 세포 유형 모두에 의해 발현되는 반면, VIM은 주로 EC 및 섬유아세포-유사 세포에 의해 발현된다는 것을 나타낸다. 스케일바: 200μm. (D) MYL7-GFP/CDH5-Tomato iPSC(WTC) 세포주를 사용하여 7.5일차에 공-분화된 카디오이드에서 심근세포(CM) 및 (EC)의 분포를 나타내는 예시 FACS 플롯. CTRL: WT WTC 세포주. (E) 각각의 주요 유전자의 발현을 나타내는, 선별된 hPSC, CM, EC 및 비-EC/비-CM(섬유아세포-유사) 세포의 Smart-Seq2 데이터의 히트맵. 섬유아세포-유사(둘 다 아님) 세포는 추정되는 EC 유래 섬유아세포-유사 세포와 관련된 유전자를 발현하고, (C)로부터의 염색을 확인한다. (F) CM 기여 없이 카디오이드 형성의 재현성을 나타내는 3개의 생물학적 복제(MYL7-, CDH5+). 스케일바: 500μm. 이 도면의 모든 실험에서 사용된 세포주: WTC(달리 언급되지 않은 경우).
도 27. 카디오이드 세포 속성의 추가 특성화. (A) FACS 정량화와 유사한 CM/EC 기여 및 CM-단독 카디오이드에서 EC 결여를 나타내는 심장 오르가노이드의 벌크 RNA-seq 데이터의 MuSiC 디콘볼루션[참조: Wang et al., 2019, Nature Communications 10, 380-389]. 참조 데이터 세트: 인간 심장의 발달 궤적에 대한 단일 세포 RNA-seq[참조: Cui et al., 2019, Cell Rep 26, 1934-1950.e1935). 사용된 세포주: H9, WTC. (B) 카디오이드의 프로테오믹 분석은 CM 및 EC의 주요 마커가 단백질 수준에서 검출되는 것을 나타낸다. (C) 카디오이드 EC, HCMEC 및 전방 EC의 HOX-유전자 발현 분석은 전방 HOX 유전자의 발현을 나타내는 반면, 다른 모든 EC는 후방 HOX 유전자의 발현도 나타낸다. VST: 분산 안정화 변환 카운트. 전방 EC: H9 계통, 문헌[참조: Wimmer et al., 2019, Nature 565, 505-510]에 표시된 바와 같이 혈관 오르가노이드 EC. (D) CM에서 상향조절된 유전자의 GO 기간은 심근 발달과 관련된 기간을 나타낸다. (E) 심장 EC에서 상향조절된 유전자의 GO 기간. (F) 섬유아세포-유사 세포(GFP-/Tomato-)에서 상향조절된 유전자의 GO 기간은 결합 조직 발달 및 ECM 조직화와 관련된 기간을 나타낸다. 이 도면의 모든 실험에서 사용된 세포주: WTC(달리 언급되지 않은 경우).
도 28. 심외막은 카디노이드와 상호작용하고, 심외막 또는 심내막-유래 섬유아세포는 동결손상에 반응한다. (A) 발달적으로 정렬된 프로토콜 개략도. (B) 다능성, 중배엽 구체화, 심장 중배엽 및 심외막 특이적 유전자의 차등적 발현, 8.5일차(분화 말기), 2D 재플레이팅 및 3D 응집 심외막의 비교. 사용된 세포주: H9. (C) 2D 재플레이팅된 심외막의 웰 전체의 WT1 면역염색. 스케일바: 1mm. c'는 C의 1×1mm 상세이다. 사용된 세포주: H9. (D) 다능성 및 공-배양 없이 7/10/27일 카디오이드에서 심외막 서브-계통 구체화와 관련된 성장 인자의 차등 발현. 사용된 세포주: WTC. (E) 시간이 일치하는 카디오이드와 공-배양된 2D 심외막 분화의 형광 표지된 3D 응집체. 화살표는 형태의 변화와 시간의 경과에 따른 확산을 나타낸다. 스케일바: 200μm. (F-G) 심외막 및 심외막의 2일 및 7일간의 공-배양의 TNNT2(CM) 및 WT1(심외막)의 공초점 이미지. 스케일바: 200μm. (H-I) 도 7C-D의 상세에 대한 카디오이드 이미지 전체, 스케일바: 200μm. (J-K) CM+EC+섬유아세포 공-분화 카디오이드의 공초점 이미지는 동결손상 3일 후의 세포 사멸(TUNEL, 절단된 카스파제 3) 및 세포 증식의 결여(MKI67)을 표시한다. 스케일바: 200μm. (L) 도 7I에 표시된 정량화를 위해 건강한 대 손상의 정규화에 사용된 영역의 예. 점선은 도면에서 손상 영역을 나타낸다. 심외막 도면에 사용된 세포주: H9, WTC에서도 동일하게 반복된 실험. CM+EC+섬유아세포 공-분화에 사용된 세포주: WTC.
도 29: 동결-손상된 카디오이드는 손상 반응의 태양을 재현한다.
도 30: TUNEL 염색에 의해 제시된 동결-손상 카디오이드의 괴사는 손상 반응의 태양을 재현한다.
도 31: 손상 부위에서 증식의 증가 없음 - 손상 부위의 외측/일부 내피 세포.
도 32: 손상 부위의 섬유아세포 수의 증가
도 33: 손상 부위에서의 FN1 축적.
도 34: 피브로넥틴 평균 강도 값의 정량화.
실시예
실시예 1: 재료 및 방법
일반적 인간 다능성 줄기 세포 배양 - 인간 다능성 줄기 세포주(H9, WiCell; WT 및 변형 WTC, Allen Institute for Cell Science)는 E8 배양 시스템을 기반으로 하는 변형된 사내 배지에서 배양했다. E8 레시피에는 0.5% BSA(Europa Biosciences)와 사내 생산 FGF2가 보충되었다. 세포는 비트로넥틴(Stem Cell Technologies)으로 코팅된 코닝(Corning) 또는 에펜도르프(Eppendorf) 조직 배양 처리 플레이트에서 성장시키고, 3 내지 4일마다 TrypLE 발현 효소(Gibco) 또는 PBS-EDTA를 사용하여 계대배양했다.
2D 및 3D 응집체에서 hPSC의 심근세포로의 분화 - hPSC를 E8 + ROCKi(Y-27632, Tocris)에서 160-175,000개 세포/24웰 플레이트에 24시간 동안 파종했다. 이어서, FGF2(30ng/ml, Cambridge University), LY294002(5μM, Tocris), 액티빈 A(50ng/ml, Cambridge University), BMP4(10ng/ml, R&D Systems), CHIR99021(H9의 경우 1-1.5μM, WTC의 경우 3-4μM, Tocris)를 포함하는 CDM 배지(Mendjan et al. Cell Stem Cell(2014) Vol. 15, p. 310-325)에서 세포를 36시간 내지 40시간 동안 유도했다. 이 단계에서 세포 생존율을 증가시키기 위해, 1㎍/ml의 인슐린(Roche)을 임의로 첨가했다. 이 배지는 FlyABCH(Ins)로 명명되었다. 36시간 내지 40시간 후, BMP4(10ng/ml), FGF2(8ng/ml), 인슐린(10μg/ml), IWP2(5μM, Tocris) 및 레티노산(0.5μM, Sigma Aldrich)를 포함하는 CDM 배지에서 매일 세포 교환하여 4일간 세포를 유도했다. 이 배지를 BFIIWPRa로 명명했다. 이후, 2일 동안 매일 배지 교환하면서 BMP4(10ng/ml), FGF2(8ng/ml), 인슐린(10μg/ml)을 함유하는 CDM 배지로 배지를 교환했다. 이 배지를 BFI라고 했다. 수득된 심근세포의 유지를 위해, 인슐린(10μg/ml)이 함유된 CDM 배지로 배지를 교환하고, 배지의 절반을 매일 교환했다. 이 배지를 CDM-I로 명명했다. 조립/응집된 심근세포의 생성을 위해, 21일차까지 유지된 심근세포는 StemDiff 심근세포 해리 키트(Stem Cell Technologies)를 사용하여 해리시키고, CDM-I 및 5% FBS(PAA) 중의 1000개 세포/웰에서 AggreWell400 플레이트(Stem Cell Technologies)에 응집체로서 파종했다. 2일 후, 형성된 응집체를 CDM-I 중의 초저 클러스터 96-웰 플레이트(Corning)로 옮기고, 58rpm, 37℃ 및 5% CO2에서 진탕기에 넣었다. 4일 후, 2일 후에 배지 교환하여, 응집체를 분석에 사용했다.
심장 오르가노이드의 생성 - hPSC는 약 70% 컨플루언시에서 수확되었다. 이어서, 5000개 세포/웰을, E8 + ROCKi(Y-27632, Tocris)를 함유하는 초저 부착 96웰 플레이트(Corning)에 파종하고, 200G에서 5분 동안 회전시켜 수집했다. 24시간 후, 형성된 응집체는 4 내지 8μM CHIR99021을 함유하는 FlyAB(Ins)로 유도되었다. 심장의 분화는 2D 배양에 대해 설명한 바와 같이 진행했다. 수득된 심장 오르가노이드의 유지를 위해, 배지를, 인슐린(10μg/ml)이 함유된 CDM 배지로 교환하고, 2일마다 교환했다.
내피 라이닝을 갖는 심장 오르가노이드 생성 - 세포를 파종하기 6시간 전에, 다능성 유지 배지를 새롭게 했다. 이어서, 2500 내지 3000 hPSC를, CHIR(5-6μM) 및 ROCKi(5μM)를 포함하는 FLyAB(Ins) 배지 중의 초저 클러스터 96웰 플레이트(Corning)에 36시간 내지 40시간 동안 파종했다. 이어서, 배지를, 매일 배지 교환하면서 4일 동안 VEGF-A(200ng/ml, Peprotech)를 첨가한 BFIIWPRa로 교환했다. 이어서, 배지를 2일 동안 BFI + VEGF-A(100ng/ml)로 교환하고, 1일 후에 배지를 교환했다. 유지를 위해, 100ng/ml의 VEGF-A를 포함하는 CDM 배지를 사용하고, 2일마다 교환했다.
심장 오르가노이드의 심외막 완전 포위 - 심외막 분화를 위해, 약 70% 컨플루언트 hPSC를, 분화 24시간 전에 E8 + ROCKi(Y-27632, Tocris)에 55,000개 세포/24웰 플레이트로 파종했다. 세포는 FGF2(30ng/ml, Cambridge University), LY294002(7.5μM, Tocris), BMP4(10ng/ml, R&D Systems) 및 CHIR99021(1.5μM, Tocris)을 포함하는 CDM 배지(Mendjan et al. 2014, 상기)로 유도했다. 36시간 내지 40시간 후, 분화 배지를, BMP4(10ng/ml), FGF2(8ng/ml), 인슐린(10μg/ml), IWR-1(1μM, Tocris) 및 레티노산(1μM, Sigma Aldrich)를 함유하는 CDM 배지로 2일 동안 교환하고, 매일 배지 교환했다. 이어서, 배지를 BMP4(10ng/ml), 인슐린(10μg/ml), 레티노산(1μM)을 포함하는 CDM 배지로 5일 동안 교환하고, 그 사이에 1회의 배지 교환을 수행했다. 수득된 심외막의 유지를 위해, 파종 초일에 ROCKi가 보충된 인슐린(10μg/ml) 및 SB431542(10μM, Tocris)를 포함하는 CDM 배지에서 소과 피브로넥틴(2μg/ml, Sigma) 코팅된 플레이트에, 분화 말기에 세포를 파종했다. 이 배지를 CDM-SBI라고 명명했다. 재플레이팅된 심외막은 1:3 비율로 3 내지 5일마다 80-90% 컨플루언시에서 정기적으로 계대배양되거나; 또는 FGF2(30ng/ml, Cambridge University), TGFb2(2ng/ml, R&D Systems), L-아스코르브산(100 μg/ml, Sigma), 인슐린(10μg/ml)을 포함하는 CDM 배지, 또는 PDGF-BB (10ng/ml, R&D Systems), L-아스코르빈산(100μg/ml, Sigma), TGFb2(2ng/ml, R&D Systems)로 보충된 인슐린(10μg/ml)을 포함하는 CDM 배지를 사용하여, 각각 분화의 최도 2일 동안, 12일 동안 심장 섬유아세포(CF) 또는 평활근(SMC) 세포로 분화시켰다.
완전 포위 검정에 사용된 응집된 심외막의 생성을 위해, TrypLE 발현 효소(Gibco)를 사용하여 8.5일차의 심외막 세포를 분리하고, CDM-SBI 및 5% FBS(PAA) 중의 1000개 세포/웰로 AggreWell400 플레이트(Stem Cell Technologies)에 응집체로서 다시 파종했다. 2일 후, 평균 8 내지 12개의 형성된 응집체/웰을, CDM-I 중의 분화된 심장 오르가노이드를 함유하는 초저 클러스터 96-웰 플레이트(Corning)로 옮기고, 58rpm, 37℃ 및 5% CO2에서 진탕기에 넣고, CDM-I 배지를 2일마다 교환하여 1주일 동안 함께 공-배양했다.
실시예 2: 시험관내에서 형성된 공동을 갖는 심장 중배엽
심장의 중앙 형태학적 특징은 심근세포(CM)로 둘러싸인 공동이고, 박동 CM이 될 가능성이 있으며, 내피(심내막) 라이닝이 있다. 생체내에서, 이 공동은 심장 중배엽의 이동과, 전장 내배엽 수축에 의해 보조되는 심내막관의 융합이라는 복잡한 프로세스를 통해 형성된다. 수득되는 심장관은 다중-챔버 심장으로 발전한다. 그러나, 심내막 및 전장 내배엽 수축이 없는 경우에도, 심장관과 심실은 생체내에서 형성될 수 있다.
심장 중배엽이 시험관내에서 허용 조건하에서 공동을 형성하기에 충분한지 여부를 시험했다. 이를 위해, hPSC를 중배엽, 심장 중배엽 및 (박동중) 심근세포 전구체로 분화시키고, 액티빈, BMP, FGF, 레티노산 및 WNT의 분화에 대한 영향을 시험하면서, 심원성 신호전달 경로의 시간적 제어에 기초하여, 부착성 96-웰 플레이트에 고처리량 분화 접근법을 적용했다(도 1). 시험관내에서 공동 형성을 매개할 수 있는 인자를 스크리닝하기 위해, 초기 심장 형성에 관여하는 선택된 세포외 매트릭스(ECM) 단백질을 배지에 보충했다. 예를 들면, 중배엽 유도 전에 라미닌 521/511의 첨가에 의해, 상이한 구체화 단계에서, 2D 층으로부터 분화 7일차까지 박동하는 3D 구상 구조로의, 신속한 용량-의존적 자가-응집이 발생했다(도 1). 놀랍게도, 이러한 구조는, 공초점 및 조직학적 절편에 공동의 존재에 의해 확인된 바와 같이, 중공이었다(도 1,2). MYL7-GFP 리포터의 분석 및 CM 마커 TROPO-T/MYL7에 대한 염색에 의해, 구조가 주로 심근세포로부터 구축되었음을 확인했다.
이어서, 외인성 ECM이 중배엽의 자가-응집에 필요한지, 또는 공동 형성에 직접 관여하는지 여부를 시험했다. 3D 비부착 96웰 플레이트에서 심장 분화를 수행했을 때, 외인성 ECM은 신속한 자가-응집, 견고한 자가-조직화 및 공동을 포함하는 박동 TROPO-T+/MYL7+ 구조로의 분화에는 필요하지 않음을 발견했다(도 2, HT 이미징, 라이브 이미징 및 섹션). 따라서, 이 고처리량 접근법에 의해, 타이밍, 세포 수 및 배지 조건을 시험관내에서 재현성이 높은 자가-조직화 심장 모델을 향해 신속하게 최적화할 수 있었다.
심장 공동 형성의 타이밍을 결정하기 위해, 라이브 이미징 및 동결절편 시간 경과 분석을 수행하고, 주요 심장 구조 마커의 발현 전에 심장 중배엽 단계에서 공동이 나타나는 것을 밝혀냈다(도 1, 2). 이어서, 이러한 공동은, 통상, 합체하여 1개의 주요 공동으로 되었다. 루멘 형성은 VEGF 신호전달의 부재하에 및 검출가능한 내피 마커 CD31 및 VE-Cad 없이 발생했기 때문에, 루멘 형성은 EC에 의해 매개되지 않았다(도 1, ICC 섹션(도 5). 중요하게는, SOX17+ 및 EOMES+ 내배엽도 분화 중에 존재하지 않았고, 이는 이러한 심장 중배엽 공동이 전장 내배엽 수축에 의해 생성되지 않았음을 나타낸다(도 3). 대조적으로, 심장 중배엽은 심장 중배엽 마커 HAND1의 강력한 발현 및 특정 구조적 마커(MYL7, TROPO-T)의 상향조절을 나타냈다. 7.5일차까지, VEGF 신호전달이 억제된 경우, 이러한 구조는 MYL7에 대해 90% 이상 양성이었다(도 6). 결론적으로, 3D에서 신호전달과 고처리량 분화의 조합에 의해, 심장 중배엽이, 심장의 주요 특징인 CM-제조 공동을 특정하고 자가-조직화할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
CM 분화를 위한 최신 기술에는 2D 또는 3D 접근법이 포함된다. 따라서, 3D 공동-함유 구조를 2D에서 차별화된 CM과 비교하려고 했다. 통상, 분화 7일차에, 구조는 2D에서 분화된 CM과 비교하여, Ca2+ 과도현상의 유사한 속도와 빈도로 빈도에서 박동을 개시했다. 구조는 비-심장 오염 세포 유형의 출현 없이 배양에서 수개월 동안 박동을 유지할 수 있었다. RNAseq 시간-경과 분석을 사용하여 분자 수준에서 비교한 결과, 심장 중배엽(HAND1+, TBX5+, NKX2-5+, TBX1-, HOXB1-)의 최초 심장 영역 하위 계통과 가장 유사한 발현 특징이 나타났고, 이는 생체내에서 심장 관을 생성시키고, 이어서 좌심방과 양쪽 심방의 일부를 생성시킨다. 전체적으로, 2D의 CM과 비교하여, 공동 형성 구조 및 3D 응집체에서 심장 유전자의 보다 높은 발현이 관찰되었다(PCA 및 히트맵). 이온 채널, 구조 단백질, 심장 전사 인자 및 근소포체 단백질을 코딩하는 유전자는 유의하게 더 높은 발현 수준을 나타냈다(). 이 효과는 전체 프로테옴 분석에서 볼 수 있는 바와 같이, 단백질 수준에서도 볼 수 있었다. 따라서, hPSC 유래 심장 중배엽은 기능적이고 재현 가능하며, 장기간 배양에서 유지될 수 있는 공동-함유 CM 구조를 견고하게 형성하기에 충분하다.
실시예 3: 내피 세포는 심장 오르가노이드의 공동을 라이닝한다
생체내에서, 심장관 조립 전에, 심장 중배엽은 루멘을 갖는 별도의 구획인 양측 심내막 관을 형성하는 심장내 전구세포와 공-발달한다. 심장 중배엽을 심내막-유사 EC와 CM 둘 다로 공-분화시킴으로써 이 구획화를 시험관내에서 재구성할 수 있는지 여부를 시험했다(도 4). 공-분화를 촉진하기 위해, 심장 중배엽 단계에서 내피 세포 동일성의 배아 유도인자인 VEGF-A를 포함시키고, CM 마커(MYL7-GFP+) 및 내피 세포(EC) 마커에 대한 이중 리포터 hPSC 라인을 사용하여 최적 조건을 스크리닝했다(도 4). 놀랍게도, CM과 EC가 VEGF의 존재하에 심장 중배엽으로부터 공동 함유 구조로 공-분화될 때, 이들은 생체내 상황을 연상시키는 이들 사이의 공간에서 CM과 EC 층으로 분리된다(도 4). 중배엽 유도 중의 WNT 신호전달 활성화의 용량에 따라, EC 층이 CM을 둘러싸거나 공동에 면하는지 여부를 제어할 수 있다(도 2, 7, 8). CM 대 EC의 비율은 41%(MYL7+)로부터 53%(CHD5+)로 매우 안정적이었다. 외인성 VEGF가 없으면, 심장 오르가노이드는 더 낮은 비율의 EC를 함유하고, 시간의 경과와 함께(10일차 내지 27일차까지), 생체내에서 발생하는 것과 같이, 심장 공동만을 면하는 내피 라이닝을 형성했다(도 8).
층 내의 EC는 구획 내에서 급속하게 확장된 CD31+ 네트워크를 형성할 가능성이 있었고, 이는 CM 층으로도 확장되었다(도 4, 7). 구획화를 위해 초기 공동 분화가 필요한지 여부를 검토하기 위해, CM 및 EC가 먼저 심장 중배엽과는 별도로 분화되고, 이어서 3D로 응집되는 대조군 3D 심장 미세조직을 개발했다. 이러한 심장 미세조직에서, EC는 네트워크만을 형성하고, 구획화하여 별도의 층을 형성하지 않았다. 결론적으로, 생체내에서와 같이, 심장 중배엽으로부터 3D로 공-분화하는 CM 및 EC만이 자가-조직화하여, 공동, 내피 라이닝 및 확장된 내피 네트워크를 포함하는 별개의 층을 형성한다. 이러한 구조는, 균질한 hPSC 모집단에서 출현하고, 최초 2개의 심장 세포 유형을 발생시키면서, 공동, 구획 및 EC 라이닝으로 자가-조직화하기 때문에, 심장 오르가노이드로 명명했다.
일반적으로, EC는 CD31 및 CDH5 등의 마커의 발현을 특징으로 하지만, 초기 심장 EC(심내막)에는 추가의 특정의 특징이 있다. 심장 오르가노이드 EC의 이러한 분자적 특징을 비교하기 위해, 선별된 CDH5+ 세포에서 SMART-seq2 분석을 수행했다(도 4). 확립된 2D hPSC EC 분화 프로토콜[참조: Patch et al. Nature Cell Biology 17, 994-1003 (2015)]을 사용하여 생성된 것과 비교하여, 3D 혈관 오르가노이드, 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 및 인간 심장 미세혈관 내피 세포(HCMEC)로부터의 EC, CHD5+ 심장 오르가노이드 유래 EC는 3D 혈관 오르가노이드로부터의 EC와 가장 유사했다[참조: Wimmer et al., Nature 565, 505-510 (2019)](도 4E). 중요하게는, 심장 오르가노이드 유래의 EC는 GATA4/5 등의 심장 전사 인자 및 심내막과 관련된 유전자(NFATC1, NPR3)를 상향조절했다. HCMEC와 일치하는 이들의 전방 HOX 유전자 발현 프로파일(도 4E)은 2D에서 심장 중배엽으로부터 유래하는 EC와 일치하지만, 기타 EC 서브타입과는 일치하지 않는다. 반면에, 심장 오르가노이드로부터 선별된 MYL7+ CM의 SMART-seq2 분석은, MYL7+에서도 CDH5+에서도도 아닌 선별된 세포가 측판 중배엽 및 ECM 유전자와 관련된 유전자를 상향조절한다는 것을 나타냈다. 따라서, 심장 오르가노이드로부터 유래하는 EC의 분자 특징은 심내막-유사 동일성과 일치한다.
유체 유동, 압력 및 기계적 신장을 감지하는 내피의 능력은 발달 및 생리학상 중요한 역할을 한다. 심장 발달의 진정한 모델에서 예측할 수 있는 바와 같이, 벌크 심장 오르가노이드의 RNAseq 분석에 의해, 3D의 심장 미세조직, 2D의 CM 및 EC와 비교하여, 주요 기계감수성 유전자(SOX18, KLF2, CHD5)의 상향조절이 밝혀졌다(도 4E). 이는 기계감수성 스트레스 유전자(KLF2, FOXO1, TEK, FOS)의 유도 및 CDH5, SOX18 및 KLF2에 대한 심장 오르가노이드의 면역형광 염색을 나타내는 심장 오르가노이드로부터 선별된 EC의 SMART-seq2 분석에 의해 확증되었다(도 4E). 전체적으로, 이러한 결과는 CM 및 EC의 공-분화, 자가-조직화 및 구획화가 심장 생리학의 필수 측면인 중요한 심장 동일성 및 기계감수성 유전자의 활성화를 달성하는 데 중요하다는 것을 시사한다.
실시예 4: 심외막은 심장 오르가노이드를 완전 포위한다
공동 형성 및 내피 층 및 내막의 확립 후, 초기 심근 챔버의 심외막 완전 포위는 제3 주요 심장의 자가-조직화 이벤트이다. 생체내에서, 심외막은 전-심외막 기관(pro-epicardial organ)이라고 불리는 작은 세포 덩어리로부터 개시하여 심근을 완전 포위한다. 완전 포위 후, CM으로부터의 신호는 심장 외막 세포를 평활근 세포(SMC)와 심장 섬유아세포(CF)로 분화하도록 유도하고, 이는 이후의 심장의 발달 및 성숙에 중요한 세포 유형이다. 초기 심장 형성의 이 중요한 기능을 모방하기 위해, 우리는, 척추동물에서 전-심장 외막 기관을 특정하는 것으로 공지된 인간의 심외막 발달 단계 및 신호전달의 추정된 타이밍에 대응하는 2D 및 3D에서 심외막 분화 프로토콜을 개발했다. 중요하게도, 이 프로토콜은 기본적 배지 조건의 측면에서 심장 오르가노이드 접근법과 호환성이 있었다(도 10, 개요). 시간-경과에 따른 RNAseq 및 유세포 분석에 의해, 마커 WT1, TCF21 및 TBX18(%)의 광범위한 발현에서 볼 수 있는 바와 같이, 효율적인 심외막 분화가 확인되었다(도 10). 생체내에서와 같이, TGF-b, FGF 및 PDGF 신호전달의 활성화에 따라, 심외막 세포는 2D에서 칼포닌, α-SMA 및 SM22를 발현하는 SMC과, DDR2 및 비멘틴을 발현하는 CF로 분화할 가능성이 있었다(도 10).
심외막 완전 포위의 프로세스를 모방하기 위해, 추가 성장 인자 없이 기본적 배지 조건에서 심외막 응집체와 함께 심장 오르가노이드를 공-배양했다(도 11). 4일 이내에 심장 오르가노이드 상에 심외막 세포의 효율적 확산이 관찰되었다(도 11). 중요한 것으로, 추가 성장 인자 없이 동일한 조건에서 이러한 구조를 추가로 배양하면, 심외막 세포가 심근 세포 구획으로 이동하고, SMC(Calponin+, SM22+) 및 CF(DDR2, Vimentin, Decorin)로 분화하는 것을 관찰했다(도 11). 심장 오르가노이드의 심외막 완전 포위 및 외부 신호전달 조작 없는 공-배양은 심외막에 의한 심장 오르가노이드의 완전 포위, CM 구획으로의 심외막의 이동 및 SMC 및 CF로의 분화를 자극하기에 충분하다고 결론지었다. 전체적으로, 우리의 고처리량 3D 분화 접근법은 인간 심장 형성의 주요 측면을 모방하는 자가-조직화, 계통-제어 심장 오르가노이드 플랫폼을 확립하기 위해 사용할 수 있다.
실시예 5: 심장 공동 형성의 메커니즘
환원주의적 분자 및 세포 시험관내 모델은 생체내 모델의 전체 복잡성을 재현할 수는 없지만, 이들은 보완적이고, 기계적 문제에 대처하는데 유용한 것으로 입증되었다. 우리의 오르가노이드 플랫폼에 의해, 반자동화 이미지 분석 파이프라인을 개발하여 높은 통계력으로 표현형을 정량화할 수 있었다. 이 플랫폼을 사용하여, 신호전달 경로가 심장 공동 형성을 제어하는 방법을 다루었고, 여기에는 몇몇 가능성: i) 중배엽 단계의 신호전달이 심장 중배엽 단계 동안 루멘 형성에 영향을 미칠 수 있는 가능성, ii) 심장 중배엽 신호전달이 결정적일 가능성, 또는 iii) 이것이 이들 둘의 조합일 가능성이 포함된다. 고처리량 심장 오르가노이드 플랫폼은 단계/계통-제어되기 때문에, 심장 공동 형성에 대한 주요 중배엽 및 심장 중배엽 신호전달 경로의 용량(예: WNT, BMP)의 효과를 체계적으로 시험했다. 놀랍게도, 중배엽 유도 중의 표준적 WNT 신호전달 활성화(예: CHIR99021)의 용량이 심장 중배엽 단계 동안 루멘 확장에 현저한 영향을 미친다는 것을 발견했다(도 4F). 이 극적인 효과는 세포 증식에 의존하지 않았다. 공동 형성과 CM 분화를 모두 촉진하는 최적의 중간 WNT 활성화 용량이 있었다. EC 라이닝을 포함하는 VEGF의 존재하에 분화된 오르가노이드와, EC를 포함하지 않는 오르가노이드 모두에서 WNT-의존성 공동 형성이 관찰되었다(도 4, 5). 최적의 WNT 활성화 수준은 hPSC 세포주에 따라 상이하고, 이는 본 명세서에 기재된 세포 배양 시스템, 예를 들면, 웰 플레이트에서 병렬 접근법을 사용하여 용이하게 결정할 수 있다.
심장 공동 형성을 제어하는 WNT의 하류 매개인자를 확인하기 위해, 우리는 RNA-seq 분석을 수행하고, 보다 높은(거대 공동) 또는 보다 낮은(작은 공동) WNT 신호전달 용량에 의해 유도된 중배엽의 유전자 발현 프로필을 비교했다. 심장 중배엽 단계가 개시될 때에 차등적으로 발현되는 유전자 중에서, BMP 신호전달(BMP4, BMP2, BMPR) 및 이의 표적의 복수 성분을 발견했다. BMP는 복수의 단계에서 심장 구체화의 공지된 유도인자이지만, 심장 공동 형성에 대한 직접적 역할은 입증되지 않았다. 따라서, 심장 중배엽 단계에서 다양한 수준의 BMP 신호전달이 심장 공동 형성을 유도하는지 여부를 시험했다. 심장 중배엽 단계의 초기 2일 동안, 이의 천연 억제제인 노긴(Noggin)을 사용하여 BMP 신호전달을 억제하면, 공동 확장이 심하게 손상되었다(도 12). 보다 높은 수준의 BMP4가 공동 확장을 유도하는 명확한 BMP 신호전달 용량 효과가 관찰되었다(도 12). 결론적으로, 우리의 데이터는 WNT-BMP 신호전달 축이 심장 오르가노이드의 공동 확장을 제어한다는 것을 나타낸다.
생체내에서, 신호전달 제어의 하류에서 발생학적 루멘 형성의 몇 가지 공지된 세포 생물학적 메커니즘이 있다. 그러나, 심장 공동 확장의 원동력은, 특히 포유류와 인간에서 덜 명확하기 때문에, 심장 오르가노이드 플랫폼을 사용하여 루멘 형성의 기본 메커니즘을 조사했다. 카스파제 3 및 Ki67 염색에서 볼 수 있는 바와 같이, 최적의 WNT 및 BMP 활성화 용량에서의 공동 확장은 것처럼 아폽토시스 또는 국소적 증식 차이에 의해 유도되지 않았다(도 2). 대신에, N-카드헤드린/액틴/MYH10/DAPI의 고밀도/국소화와 E-카드헤드린의 부재를 특징으로 하는 심장 중배엽 층의 주변에서 압축이 관찰되는 반면, 최초 관찰된 공동은 중간엽성이었다(도 2). 중요하게는, 외부 층의 압축은 고 WNT 및 BMP 촉진 공동 조건에서만 관찰되고, 공동이 없는 저 WNT 및 BMP 활성화에서는 관찰되지 않았다. 이러한 관찰은, 척추동물 배아의 심장 및 내장 중배엽의 압축된 영역에서 N-카드헤린 국소화의 패턴과 일치하는 반면, 심내막 관에 면하는 영역은 중간엽이다. 압축된 상피-유사 장벽을 서포트하기 위해, 심장 중배엽 공동 구조는 저분자량(4KDa) 덱스트란에 대해 투과성이 없었다. 상피에 걸친 루멘 확장은 통상 이온 펌프에 의해 구동되는 삼투압 구배에 의존하기 때문에, 이어서, 심장 오르가노이드에서 염화물 이온 및 나트륨/칼륨 펌핑의 관여를 시험했다. 우리는, 차동 심장 중배엽 압축의 WNT-BMP 구동 프로세스가 시험관내 공동 형성을 수반한다고 결론지었다.
실시예 6: 심장 결함의 모델링
전사 인자(TF)의 돌연변이는 심장관 및 챔버 발달에 영향을 미치고, 심각한 인간 선천적 결함을 유발하는 심장 공동 결함의 가장 잘 공지된 근본적 원인이다. 예를 들면, BMP의 하류에서 NKX2-5 및 HAND1가 파괴되면, 인간에서 가장 심각한 심장 기형을 포함하여 척추동물에서 심각한 심장 공동 결함이 유발된다. 그러나, 이러한 인자는 심장발생 전체 및 복수의 세포 유형에 존재하기 때문에, 기본 메커니즘을 식별하는 것은 곤란하다. WNT-BMP 축의 하류에서 이러한 TF 중 하나 이상이 심장 오르가노이드의 공동 형성에 중요하다고 가정했다. 따라서, HAND1 및 NKX2-5 유전자로의 헤테로접합체 및 호모접합체의 결실을 갖는 hPSC 계통을 생성했다. 놀랍게도, NKX2-5 돌연변이주에서는 심장 중배엽 단계에서 검출가능한 공동 형성 결함이 없었다. 대조적으로, HAND1 호모접합성 KO 계통은 심장 중배엽 및 CM 단계에서 심장 공동 형성에 명백한 결함을 나타냈다(도 12B). 이러한 KO 오르가노이드의 N-카드헤드린 국소화도 영향을 받았다. 중요하게는, 중배엽 유도 중의 WNT 신호전달의 증가된 용량의 증가는 이 효과를 부분적으로 구제할 수 있고, 공동 확장에서의 역할을 확인할 수 있다. 이 관찰과 일치하여, HAND1 발현 수준은 공동 형성을 촉진하는 WNT 신호전 용량 조건에서 보다 높았다. 종합하면, 우리의 고처리량 및 계통 제어 심장 오르가노이드 플랫폼을 사용하여, 심장 형성 및 유전적 결함의 메커니즘을 정량적으로 해독할 수 있다.
실시예 7: 확장된 재료 및 방법
일반적 인간 다능성 줄기 세포 배양 - 인간 다능성 줄기 세포주(WT H9, WiCell 및 구성적으로 형광 H9 클론[참조: Wimmer et al., 2019, Nature 29, 40] WT 및 변형된 WTC, Allen Institute for Cell Science)는 E8 배양 시스템에 기반한 변형된 사내 배지에서 배양했다[참조: Chen et al., 2011, Nature Methods 8, 424-429]. 원래 E8 레시피에는 0.5% BSA(Europa Biosciences, # EQBAH70), 사내 생산 FGF2 및 1.8ng/ml TGFβ1(R&D RD-240-B-010)이 보충되었다. 세포는 비트로넥틴 XF(Stem Cell Technologies #7180)로 코팅된 코닝(Corning) 또는 에펜도르프(Eppendorf) 조직 배양 처리 플레이트에서 성장시키고, TrypLE 발현 효소(Gibco, #12605010) 또는 PBS-EDTA(Biological Industries, 01-862-1B)를 사용하여 약 70% 컨플루언시에서 2 내지 4일마다 계대배양했다. 세포는 정기적으로 마이코플라스마에 대해 시험되었다.
2D 및 3D 응집체에서 심근세포로의 hPSC 분화 - hPSC는 E8 + ROCKi(Y-27632, Tocris #1254)에서 160-175,000개 세포/24웰 플레이트에 24시간 동안 파종했다. 이어서, 세포를, FGF2(30ng/ml, Cambridge University), LY294002(5μM, Tocris, #1130), 액티빈 A(50ng/ml, Cambridge University), BMP4(10ng/ml, R&D Systems RD-314-BP-050) 및 CHIR99021(R&D Systems RD-4423/50)을 포함하는 CDM 배지(Mendjan et al., 2014, Cell Stem Cell 15, 310-325)로 36시간 내지 40시간 동안 유도했다. 이 단계에서 세포 생존율을 증가시키기 위해, 임의로 1μg/ml의 인슐린(Roche, #11376497001)을 첨가했다. 이 배지는 FlyABCH(Ins)로 명명되었다. 36시간 내지 40시간 후, BMP4(10ng/ml), FGF2(8ng/ml), 인슐린(10μg/ml), IWP2(5μM, Tocris, #3533)(이는 임의로 IWR-1(1μM, Tocris, #3532/10) 또는 XAV-939(5μM, SelleckChem, # S1180)로 또한 수행할 수 있다) 및 레티노산(0.5μM, Sigma Aldrich, #R2625)를 포함하는 CDM 배지로 4일 동안 매일 배지를 교환하여 세포를 유도했다. 이 배지는 BFIIWPRa로 명명했다. 이어서, 배지를, BMP4(10ng/ml), FGF2(8ng/ml), 인슐린(10μg/ml)을 포함하는 CDM 배지로 2일 동안 교환하고, 매일 배지를 교환했다. 이 배지를 BFI로 명명했다. 수득된 심근세포를 유지하기 위해, 배지를 인슐린(10μg/ml)을 포함하는 CDM 배지로 교환하고, 배지의 절반을 매일 교환했다. 이 배지를 CDM-I라 명명했다. 조립/응집 심근세포의 생성을 위해, 21일차까지 유지된 심근세포를, STEMdiff 심근세포 해리 키트(Stem Cell Technologies, #05025)를 사용하여 해리하고, CDM-1 및 5% FBS(PAA, #A15-108) 중의 1000개 세포/웰로 AggreWell400 플레이트(Stem Cell Technol ogies, # 34425)에서 응집체로서 재파종했다. 2일 후, 형성된 응집체를 CDM-I 중의 초저 부착 96-웰 플레이트(Corning, #7007)로 옮기고, 58rpm, 37℃ 및 5% CO2에서 진탕기에 넣었다. 4일 후, 2일 후에 배지 교환으로, 응집체를 분석에 사용했다.
사용된 ECM 분자 - 비트로넥틴(10μg/ml), 라미닌-511 E8 단편(Takara Bio, #T303, 0.05 - 2μg/ml) 및 라미닌-521(Biolaminin, # LN521-02, 0.1 - 5μg/ml)의 어느 하나를 사용하여 웰을 사전 코팅하거나, 파종 전에 세포 현탁액에 첨가했다. 상기한 바와 같이, 추가의 심근세포 분화를 수행했다.
카디오이드의 생성 - hPSC는 약 70%의 컨플루언시에서 수확되었다. 카디오이드는 KO 및 BMP 억제 실험을 위해 7500개 세포/웰 및 나머지 실험에 대해 5000개 세포/웰을 파종하여 생성되었다. 세포를, E8 + ROCKi를 함유하는 초저 부착 96웰 플레이트(Corning)에 200㎕의 용적으로 파종하고, 200g에서 5분 동안 원심분리에 의해 수집했다. 24시간 후, 형성된 응집체는 WNT 활성화제 CHIR99021을 함유하는 FLyAB(Ins)로 유도되었다(세포주-의존적 농도는 하기 참조). 심장의 분화는 2D 배양에 대해 설명한 바와 같이 수행했다. 수득된 카디오이드의 유지를 위해, 배지를 CDM-I로 교환하고, 2일마다 교환했다. 내피 세포의 분화를 중지하기 위해, 100nM 수니티닙 말레이트(Biovision, #1611)를 심장 중배엽 단계(BFIIWPRa)로부터 첨가했다. BMP 억제 실험을 위해, 100ng/ml 노긴(Noggin)(R&D System, # RD-6057-NG-025) 또는 0.2μM LDN-193189(Stemgent, # 04-0074)를 사용했다.
카디오이드의 최적화된 생성(심실/내부 EC 라이닝)을 위해, hPSC는 2D에서 F, Ly, B, 저 액티빈(4ng/ml), Ins 및 CHIR99021(세포주-특이적 농도에 대해서는 하기 참조)을 사용하여 유도했다. 이어서, 15k 세포를 200μl의 용적으로 초저 부착 96웰 플레이트(Corning)에 파종하고, 상기의 CM-분화 프로토콜을 따랐다.
정의된 층에 CM, EC 및 섬유아세포-유사 세포를 포함하는 카디오이드의 생성 - 세포를 파종하기 6시간 전에 다능성 유지 배지를 새롭게 했다. 이어서, 2500 hPSC를, CHIR99021(세포주-특이적 CHIR99021 농도는 하기 참조) 및 ROCKi(5μM)를 포함하는 FLyAB(Ins) 배지의 초저 부착 96웰 플레이트(Corning)에 36시간 내지 40시간 동안 직접 파종했다. 이어서, 배지를 매일 교환하면서 4일 동안 VEGF-A(200ng/ml, Peprotech, #AF-100-20)를 첨가하여 BFIIWPRa로 배지를 교환했다. 이어서, 배지를 BFI + VEGF-A(100ng/ml)로 2일 동안 교환하고, 1일 후에 배지를 교환했다. 유지를 위해, 100ng/ml의 VEGF-A를 포함하는 CDM 배지를 사용하고, 2일마다 교환했다. EC 및 섬유아세포-유사 세포만을 포함하는 카디오이드를 생성하기 위해, 중배엽 유도 중의 IWP2 첨가 및 저 WNT(CHIR99021: 4μM)/저 액티빈(4ng/ml)의 부재를 제외하고, 상기의 프로토콜을 따랐다. Smart-Seq2 분석을 위해, 심근세포와 내피 세포를 포함하는 7.5일차 카디오이드를, STEMdiff 심근세포 해리 키트(STEMCELL Technologies, #05025)를 사용하여 해리하고, GFP+ CM 및 Tomato+ EC와 GFP-/Tomato- 세포를 자가 제조 용해 완충액으로 FACS-선별했다.
카디오이드의 동결-손상 - 카디오이드를 일시적으로 배지가 없는 10cm 접시에 옮기고, 층류 후드 내에 위치한 EVOS 현미경(Thermo Fisher)으로 관찰했다. 이어서, 동결 조직/배지의 파면이 명확하게 카디오이드 내에 나타날 때까지, 액체 N2-냉각된 강철 막대로 이들 접촉시켰다. 이어서, 카디오이드를 추가 배양을 위해 웰을 포함하는 유지 배지로 다시 옮겼다.
세포주-의존적 CHIR99021 농도 - 최적의 분화를 위해, 상이한 hPSC 계통이 상이한 농도의 CHIR99021(Wnt 활성화)에서 반응한다는 사실을 알아냈다. 이는, 이전 보고서(Strano et al., 2020, Cell Reports 31, 107732)와 일치하고, 다양한 hPSC 계통에 대해 최적의 "고"(거대 공동) 및 "저"(작은 공동) CHIR99021 농도를 경험적으로 결정했음을 의미한다. 2D 분화에서, H9 세포는 1-2μM의 CHIR99021로 유도된 반면, WTC 계통은 3-4μM의 CHIR99021로 유도되었다. 3D 카디오이드 분화에서, "카디오이드의 생성" 섹션에 설명된 프로토콜에 따라, "고" 및 "저" CHIR99021 농도가 WTC 세포에 대해 8μM 및 4μM인 CM-단독 카디오이드가 생성되었다. H9 세포에는 1.5-3μM CHIR99021을 사용했다. "정의된 층에 CM, EC 및 섬유아세포-유사 세포를 포함하는 카디오이드의 생성" 섹션에 따른 CM/EC/섬유아세포-유사 세포 공-분화에서, 4μM의 CHIR99021이 "저" 농도로서 사용되었고, 5-6μM가 CM/EC 분화 및 공동 확장("중간")에 최적이었고, 9μM은 CHIR99021의 "고" 농도로 사용되었다.
카디오이드와의 심외막 공-배양 - hPSC는 분화 24시간 전에 E8 + ROCKi(5-10μM)에서 55,000개 세포/24웰 플레이트에 파종했다. 세포는 FGF2(30ng/ml, Cambridge University), LY294002(7.5μM), BMP4(10ng/ml) 및 CHIR99021(1.5μM)을 포함하는 CDM[참조: Mendjan et al., 2014, Cell Stem Cell 15, 310-325] 배지로 유도되었다[참조: Iyer et al., 2015, Development 142, 1528-1541]. 36시간 내지 40시간 후, 분화 배지를, 매일 배지 교환하여 BMP4(10ng/ml), FGF2(8ng/ml), 인슐린(10μg/ml), IWR-1(1μM) 및 레티노산(1μM)를 포함하는 CDM 배지로 2일 동안 교환했다. 이어서, 배지를 BMP4(10ng/ml), 인슐린(10μg/ml), 레티노산(1μM)를 포함하는 CDM 배지로 5일 동안 교환하고, 그 사이에 배지를 1회 교환했다[참조: Guadix et al., 2017, Stem Cell Reports 9, 1754-1764). 수득된 심외막의 유지를 위해, 분화 말기에, 파종 초일에 ROCKi가 보충된, 인슐린(10μg/ml) 및 SB431542(10μM, Tocris, #1614)를 함유하는 CDM 배지에서 소과 피브로넥틴(2μg/ml, Sigma, # F1141) 코팅된 플레이트에 세포를 파종했다. 재플레이팅된 심외막은 1:3 비율로 3 내지 5일마다 80 내지 90% 컨플루언시에서 정기적으로 계대배양되었다.
완전 포위 검정에 사용된 응집된 심외막의 생성을 위해, TrypLE 발현 효소를 사용하여 8.5일차의 심외막 세포를 분리하고, CDM-SBI 및 5% FBS에서 1000개 세포/웰로 AggreWell400 플레이트에 응집체로서 재파종했다. 2일 후, 평균하여 8 내지12개의 형성된 응집체/웰을, CDM-I 중의 분화된 카디오이드를 함유하는 초저 부착 96웰 플레이트(Corning)로 옮기고, 58rpm, 37℃ 및 5% CO2에서 진탕기에 넣고, 2일마다 새롭게 한 CDM-I 배지와 함께 공-배양했다. 대조군(심외막 단독) 응집체는 초저 부착 96웰 플레이트(Corning)의 CDM-SBI 배지에 유지되었다.
2D 전방 내피 세포 분화 - 다능성 줄기 세포를, 10μM ROCK 억제제가 보충된 E8 배지에서 비트로넥틴으로 코팅된 100,000개 세포/24웰로 파종했다. 다음 날, 세포를 FLyABCH(Ins), 1-3μM(H9의 경우), 3-6μm(WTC의 경우) CHIR99021로 유도하고, 36 내지 40시간 동안 배양했다. 후속 2일 동안, 배지를 BFIIWPRa로 교환했다. 이어서, 200ng/ml VEGF 및 2μM 포르스콜린(Sigma-Aldrich, #F3917)을 포함하는 CDM을 포함하는 분화 배지를 2일 동안 제공하고, 이어서 CDM + 100ng/ml VEGF에서 1일 동안 배양했다. EC는 100ng/ml VEGF가 보충된 CDM에서 유지되었다.
인간 심장 미세혈관 내피 세포의 배양 - 인간 심장 미세혈관 내피 세포(HCMEC)는 PromoCell(PC-C-12285 HCMEC-c)로부터 입수하고, 내피 세포 성장 배지 MV(PromoCell, #PC-C- 22020)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 배양했다. Smart-Seq2 분석을 위해, HCMEC를 TrypLE 발현 효소로 해리하고, 자가 제조된 용해 완충액으로 FACS-선별했다.
병아리 심장 중배엽 외식편 배양 - 발달 중의 닭(갈루스 갈루스(gallus gallus)) 배아의 심장발생 영역으로부터의 외식편을 햄버거 및 해밀턴 단계 7-8에서 분리하고, 심장 중배엽(BFIIWPRa) 배지에서 37℃에서 24시간 동안 배양했다. 이어서, 하기에 기재된 바와 같이, 추가 분석을 위해, 외식편을 포매하고, 동결절편을 생성하고, 면역염색했다.
동결절편화 - 동결절편화는 {Bagley:2017ga}를 기반으로 수행되었다. 간단히 말해서, 4% PFA로 고정된 조직을, PBS 중의 30% 수크로즈로 4℃에서 밤새 동결 보호하고, 다음날 O.C.T 동결포매 배지(Scigen, #4586K1)를 사용하여 포매했다. 포매된 조직은 액체 질소에 침전된 금속 표면을 사용하여 동결시키고, 조직은 레이카(Leica) 저온 유지장치에서 절편화될 때까지 -80℃ 냉동고에 보관시켰다. 절편을 울트라 플러스(Ultra Plus) 슬라이드에 수집하고, 면역염색할 때까지 -20℃ 또는 -80℃에서 보관했다. O.C.T.는, 면역염색 프로토콜을 계속하기 전에, PBS로 세척하여 제거했다.
면역염색 - 4% PFA(Sigma-Aldrich, #16005)로 고정한 후, 표본을 1×PBS로 2회 세척하고, 3D 작제물을 PBS/Tween20(0.1%, Sigma-Aldrich, #P1379)에서 각각 최소 15분 동안 추가로 1회 세척했다. 조직을, 4% 염소(Bio-Rad Laboratories, #C07SA) 또는 당나귀 혈청(Bio-Rad Laboratories, #C06SB) 및 0.2% 트리톤 X-100(Sigma- Aldrich, #T8787)와 함께 PBS(Gibco, #14190094)로 이루어진 차단 용액에서 최소 15분 동안 인큐베이팅했다. 이어서, 1차 항체를 실온에서 1 내지 3시간 동안 또는 2D 샘플의 경우 4℃에서 밤새, 3D 샘플의 경우 진탕기에서 4℃에서 2일 동안 상기 차단 완충액에 적용했다. PBS/Tween20으로 2회 세척한 후, 3D 조직을 2차 항체 용액과 함께 진탕기에서 4℃에서 추가로 2일간 인큐베이팅하고, 2D 샘플을 실온에서 최대 2시간 동안 인큐베이팅했다. 이러한 세척 단계 및 추가 PBS 세척 후, 조직은 PBS 중 4℃에서 분석 또는 보관될 상태로 되고, 슬라이드는 형광 장착 배지(Dako Agilent Pathology Solutions, #S3023)를 사용하여 마운트했다. 3D 조직은 이미징 전에 FocusClear(CellExplorer Labs, #FC-101)로 제거했다.
트리크롬 염색 - 매이슨 트리크롬(Masson Trichrome) 염색(Bio Optica, #04-010802)은 제조업체의 권장사항에 따라 20μM 동결절편에서 수행되었다.
전자 현미경 - 0.1mol/L 나트륨 카코딜레이트 완충액, pH 7.2 중의 2% 글루타르알데히드(EM 등급; Agar Scientific, Essex, UK) 및 2% 파라포름알데히드(EM 등급; Electron Microscopy Services, Hatfield, US)의 혼합물을 사용하여 샘플을 4℃에서 밤새 고정했다. 이어서, 오르가노이드를 동일한 완충액으로 세정하고, 40분 동안 아이스 상의 완충액에서 1% 사산화 오스뮴(Electron Microscopy Services, Hatfield, US)에 후-고정했다. 3회의 헤정 단계 후, 샘플을 아이스 상의 일련의 아세톤에서 탈수하고, Agar 100 수지(Agar Scientific, Essex, UK)에 포매했다. 70nm 절편을 100메쉬 Cu/Pd 그리드(Agar Scientific, Essex, UK)로 선택하고, 이전에 포름바르(formvar) 서포트 필름으로 코팅하고, 2% 우라닐 아세테이트(Merck) 및 레이놀드 납 시트레이트로 후-염색했다.
덱스트란 및 플루오-4 통합 검정 - TAMRA(Sigma Aldrich, T1037)와 접합된 4.4kDa 덱스트란을 64시간 내지 90시간 사이에 카디오이드 배양물에 첨가했다. 카디오이드는 공동이 형성되기 시작하면서 라이브 이미지화했다. 칼슘 과도현상을 이미지화하고 분석하기 위해, 3D 카디오이드 및 2D CM에 플루오-4 AM(Thermo Fisher Scientific, #F14217)을 로딩했다. 15분 인큐베이팅 후, 카디오이드를 티로이드 염 용액(Sigma Aldrich, #T2397)에서 추가로 15분간 인큐베이팅했다. 그 후, 카디오이드를 라이브 이미지화하고, 비디오를 FIJI 소프트웨어(Schindelin et al., 2012, Nature Methods 9, 676-682)로 분석하여, 관심 영역 및 배경(F0)의 신호 강도(F)를 취득했다.
수축 특성 측정 - 2D CM 및 3D 카디오이드는 라이브 이미지화하고, 비디오를 게시된 알고리즘(Huebsch et al., 2015, Tissue Engineering Part C: Methods 21, 467-479)으로 분석하여 수축 속도와 박동률을 결정했다.
광학 활동 전위 - 카디오이드는 37℃, 5% CO2에서 CDM 배지에서 인큐베이팅했다. 실험 전에, 오르가노이드에 전압 감수성 염료(VSD) FluoVolt(x0.5, 실온에서 30분 동안)를 일시적으로 로딩했다. 그 후, VSD를 함유하는 배지를 신선한 무혈청 배지(DMEM, Sigma-Aldrich)로 교환했다. 다중 웰 플레이트는, 환경적으로 제어되는 단계 인큐베이터(37℃, 5% CO2, 수분 포화 공기 분위기, Okolab Inc, Burlingame, CA, USA)에 배치시켰다. FluoVolt 형광 신호는 오르가노이드의 0.2 × 0.2mm 영역으로부터 기록되었다. 여기 파장은 발광 다이오드(LED)를 사용하여 470 ± 10nm이었고, 방출된 광은 광전자 증배관(PMT, Cairn Research Ltd. Kent, UK)으로 수집했다. 형광 신호는 10kHz에서 디지털화시켰다. 이어서, 120초 기록은 pClamp 소프트웨어 패키지 v.10.0(Molecular Devices, Inc., Sunnyvale, CA, USA)을 사용하여 오프라인으로 분석했다. APD는 30%, 50% 및 90% 재분극에서 측정되었다.
이미지 취득 및 분석 - 고정된 전체 마운트 및 절편은 포인트 스캐닝(1x 배율에서 아포크로마트(Apochromat) 20x 대물 렌즈를 갖는 수직형 짜이쯔(Zeiss) LSM800 Axio Imager) 및 회전 디스크 공초점 현미경(Yokogawa W1 회전 디스크가 장착된, IX3 시리즈(IX83) 도립 현미경을 기반으로 하는 올림푸스(Olympus) 회전 디스크 시스템 반전) 또는 광시야 현미경(Zeiss Axio Imager 2, Axio Vert A1, Panoramic FLASH 250 II 시스템)으로 이미지화되었다. 짜이쯔 셀디스커버러(Zeiss Celldiscoverer) 7 또는 상기에서 언급한 회전 디스크 현미경을 사용하여, 라이브 이미징 실험을 수행했다. 고처리량 이미징 및 분석을 위해, 셀리고 이미징 사이토미터(Celigo Imaging Cytometer) 현미경(Nexcelom Biosciences, LLC)으로 이미지를 촬영하고, FIJI 소프트웨어용으로 작성된 커스텀-작성 스크립트로 분석했다. 투과 전자 현미경용의 절편은 80kV에서 작동되는 aFEI 모르가그니(Morgagni) 268D TEM(FEI, Eindhoven, The Netherlands)으로 검사했다. 이미지는 1,100만 화소 모라다(Morada) CCD 카메라(Olympus-SIS)를 사용하여 취득했다.
통계 - 데이터는 평균 +/- SD로 표시된다. 유의차를 계산하기 위해, 다고스티노 앤드 피어슨(D'Agostino & Pearson) 및 프리즘(Prism) 8 소프트웨어(GraphPad Software Inc.)의 샤피로-윌크(Shapiro-Wilk) 검정을 사용하여, 정규성과 대수 정규성에 대해 데이터를 분석했다. 정규 분포의 경우, 파라메트릭 검정(양측 t-검정, 일방향 ANOVA)을 수행하여 유의차를 확인했다. 정규 분포가 아닌 경우, 프리즘(Prism) 8 소프트웨어를 사용하여 논-파라메트릭 검정(양측 만-휘트니(Mann-Whitney), 크루스칼-왈리스(Kruskal-Wallis))를 수행했다. 프리즘(Prism) 8 소프트웨어를 사용하여, 통계적 가설 검정(파라메트릭의 터키(Tukey) 검정 및 논-파라메트릭의 둔(Dunn) 검정)를 사용한 다중 비교에 대한 수정을 수행했다. 유의차에 대한 p-값은 다음과 같이 시각화되었다: *: p<0.05, **: p<0.01, ***: p<0.001, ****: p<0.0001.
유세포 분석 - CM 해리 키트(Stem Cell Technologies, #05025)를 사용하여 세포를 해리했다. 130g에서 3분 동안 원심분리한 후, 세포를 0.5mM EDTA(Biological Industries, #01-862-1B) 및 10% FBS(PAA Laboratories, #A15-108)가 보충된 300㎕ PBS에 재현탁시켰다. FACS LSR 포르테싸(Fortessa) II(BD)로 세포를 취득하고, 플로우조(FlowJo) V10(FlowJo, LLC) 소프트웨어로 분석했다. FACS 선별은 소니(Sony) SH800 세포 선별기(Sony Biotechnology)를 사용하여 수행했다.
RNA 단리 및 RNA-seq/Smart-Seq2/단일 세포(sc)RNA-seq 준비 - RNA는 RNeasy 미니 키트(Qiagen, #74104)로 단리했다. QuantSeq 3' mRNA-Seq 라이브러리 준비 키트 FWD(Lexogen GmbH, #015)를 사용하여, 제조업체의 지시에 따라 벌크 RNA-seq 라이브러리의 생성을 수행했다. 라이브러리 준비 후, 샘플은 단편 분석기(Advanced Analytical Technologies, Inc)를 사용하여 적절한 크기 분포를 확인하고, 서열분석을 위해 비엔나 바이오센터 코어 시설(Vienna Biocenter Core Facility; VBCF)의 차세대 서열분석(Next-Generation-Sequencing; NGS) 시설에 제출했다. Smart-Seq2 분석을 위해, 400개의 세포를 용해 완충액으로 선별하고, 추가 처리가 있을 때까지 -80℃에서 보관했다. 샘플은 자가 제조의 Smart-Seq2 키트를 사용하여 VBCF NGS 시설에 의해 제조 및 서열분석한 QC/라이브러리였다. scRNA-seq의 경우, 분화 7.5일차에 카디오이드(2개의 생물학적 복제물, 각각 3개의 카디오이드)를 해리하고, 세포를 VBCF NGS 시설에 제출하여, 10x 게노믹 크로미움(Genomics Chromium) 플랫폼(10x Genomics, CA, USA)을 사용하여 라이브러리를 제조했다.
생물정보 분석 - 트리밍(Trimming)은 트림-갈로레(trim-galore) v0.5.0을 사용한 Smart-Seq2 실험과, BBDuk v38.06(ref=polyA.fa.gz,truseq.fa.gz k=13 ktrim=r useshortkmers=t mink=5 qtrim=r trimq=10 minlength=20)을 사용한 QuantSeq 3' mRNA-Seq 실험에 대해 수행되었다. iGenomes UCSC hg38 참조(인간 rDNA, 인간 미토콘드리아 염색체, phiX174 게놈, 어댑터)에 포함된 풍부한 서열에 대한 판독 맵핑은 bowtie2 v2.3.4.1 정렬을 사용하여 삭제되었다. 나머지 판독은 iGenomes UCSC hg38 번들(support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.html)에 제공된 게놈 및 UCSC 유전자 주석을 사용하여 분석했다. 판독은 star v2.6.0c를 사용하여 hg38 게놈에 정렬시키고, 유전자의 판독은 QuantSeq 실험(-s 1)에 대한 가닥-특이적 판독을 사용하여 피쳐카운트(featureCounts)(subread v1.6.2)로 카운트했다. DESeq2 v1.18.1을 사용하여, 생 카운트에 대한 차등 유전자 발현 분석 및 분산 안정화된 변환 카운트 데이터에 대한 주성분 분석을 수행했다. R v3.4.1의 클러스터프로파일러(clusterprofiler) v3.6.0을 사용하여, 차등적으로 발현된 유전자의 기능적 주석 농축 분석을 수행했다.
벌크 조직 세포 유형의 디콘볼루션은 MuSiC v0.1.1을 사용하여 수행되었다[참조: Wang et al., 2019, Nature Communications 10, 1-9]. 세포 유형-특이적 마커 유전자와, 인간 발달 중의 심장에 대해 세포 유형-특이적 단일 세포 발현 참조를 사용했다[참조: Cui et al., 2019, CellReports 26, 1934-1950.e5]. 공개된 데이터와 일치시키기 위해, hg19 UCSC iGenomes 참조를 사용하여, 벌크 카디오이드 RNA-seq 샘플을 전술한 파이프라인으로 처리했다. 벌크 카디오이드 RNA-seq 샘플에서 발달 중의 심장으로부터의 세포 유형 비율이 추정되었고, MuSiC 추정 비율이 히트맵에서 시각화되었다.
단일 세포 RNA-seq 판독은 구축전의 10X GRCh38 참조 refdata-gex-GRCh38-2020-A를 사용하여 셀레인저 카운트(cellranger count) v4.0.0으로 처리되었다. Seurat v3.2.2를 사용하여, 카운트 데이터를 추가로 분석했다. 검출된 유전자가 500개 이상이고, 미토콘드리아 함량이 15% 미만인 세포는 유지되었다. scDblFinder v1.4.0에서 검출한 이중선은 삭제되었다. 그 결과, 카디오이드에서 세포 유형 분석을 위해 9632개 세포에 대한 추가 분석이 이루어졌다. CM을 최적화된 심실-유사 CM과 비교하기 위해, 최적화된 저 CHIR/저 액티빈 조건으로부터의 5097 CM에 인접하여, 표준 조건(중간 CHIR/고 액티빈)으로부터의 1717 CM을 분석했다. 로그-정규화 발현 값은 디폴트 스케일 계수 10000에서 LogNormalize 방법을 사용하여 도출되었다. 복제는 파인드인터그레이션앵커(FindIntegrationAnchors) 및 인테그레이트데이터(IntegrateData) 함수를 사용하여, 15 디멘션(dimension)과 디폴트 설정을 사용하여 통합시켰다. singleR v1.4.0을 사용하여, 문헌[참조: Cui et al. 참조(상기)]을 사용하여 단일-세포에 주석을 달았다. 2디멘션 표현은 uwot v0.1.9를 사용하여 균일한 매니폴드 근사 및 투영을 사용하여 생성했다.
프로테오믹스 - 세포를 8M 요소 100mM 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설폰산 완충액(HEPES)에 용해하고, 1U 벤조나제(Merck KGaA, #1.01654)를 갖는 10mM 1,4-디티오에리트리톨로 환원시키고, 20mM 2-요오도아세트아미드로 알킬화했다. 소화는 LysC(Wako, #121-05063, 1/100(w/w) 프로테아제/기질)을 포함하는 4M 요소 100mM HEPES에서 37℃에서 3시간 동안 수행하고, 이어서 트립신 소화(Promega, #V5280, 1/100(w/w) 프로테아제/기질)를 37℃에서 밤새 수행했다. 역상 고체상 추출 카트리지(Sep-Pak C-18, Waters, #186000308)를 사용하여 펩티드를 탈염하고, 진공하에 건조하고, HEPES에서 중성 pH로 재구성하고, 제조업자의 지시에 따라 TMT10-plex(Thermo Fisher Scientific, #90110)로 표지했다. TMT 표지된 펩티드를 동일한 양으로 풀링하고, 고 pH 역상 크로마토그래피(UPLC Peptide CSH C18 컬럼, 130Å, 1.7μm, 1mm × 150mm, ACQUITY)로 분획화하여, 10개의 최종 분획을 수득했다.
샘플을 역상 크로마토그래피(75um × 250mm PepMap C18, 입자 크기 5um, Thermo Fisher Scientific)로 분리하고, 60분 이내에 0.1% 포름산 중 2% 내지 80% 아세토니트릴로의 선형 구배를 발생시키고(RSLC nano, Dionex - Thermo Fisher Scientific), 전자분무 이온화 직렬 질량 분석기(Orbitrap QExactive HFX, Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 MS/MS로 분석했다. 기기는 하기 매개변수로 작동되었다: MS1 해상도 120,000; MS1 AGC 타겟 3e6; MS1 최대 주입 시간 50ms; MS1 스캔 범위 380 내지 1650m/z; MS2 해상도 45,000; MS2 AGC 타겟 1e5; 최대 주입 시간 250; TopN 10; 분리 윈도우 0.7m/z; 고정된 최초 질량 110m/z; 정규화된 충돌 에너지 35; 최소 AGC 타겟 1e4; 펩티드 매치가 바람직함; 동위원소 제외; 동적 제외 30초.
모든 MS/MS 데이터는 프로테옴 디스커버러(Proteome Discoverer) 2.3(PD 2.3.0.484, Thermo Scientific)을 사용하여 처리 및 분석하고, 호모 사피엔스(Homo sapiens) 데이터베이스(SwissProt TaxID=9606)(v2017-10-25)에 대해 MSAmanda v2.0.0.14114를 사용하여 검색했다. 최대 누락된 절단: 2, 시스테인 상의 요오도아세트아미드 유도체 및 펩티드 N-말단 10-플렉스 탠덤 질량 태그(고정 모드); 메티오닌에 대한 산화, 라이신에 대한 10-플렉스 탠덤 질량 태그(가변 모드). 펩티드 질량 허용 오차: ±5ppm; 단편 질량 허용 오차: ±15ppm. 퍼콜레이터(Percolator)를 사용하여, 단백질 및 펩티드 수준에서 1% FDR로 필터링하고; 리포터 이온은 IMP 하이퍼플렉스(Hyperplex)[참조: Doblmann et al., 2019, Journal of Proteome Research 18, 535-541](ms.imp.ac.at/index.php-action=hyperplex)를 사용하여 정량화했다.
MYL7-GFP/CDH5-Tomato 이중 리포터 계통의 생성 - 내인적으로 태그된 WTC MYL7-GFP hPSC 계통은 알렌 인스티튜트 포 셀 사이언스(Allen Institute for Cell Science)(세포주 ID: AICS-0052)로부터 수득했다. CDH5 프로모터 서열의 gBlock(TSS에 대해 -1135 내지 -5)(Prandini et al., 2005)을 인테그레이티드 DNA 테크놀로지스, 인코포레이티드(Integrated DNA Technologies, Inc.)로부터 주문하고 바글레이 등(Bagley et al.)에 따라 벡터의 변형된 백본에 클로닝하고, TALEN 기술을 사용하여 AAVS1 유전자좌에 통합한다[참조: Hockemeyer et al., 2009, Nature Biotechnology 27, 851-857]. 변형된 백본에는 코어 닭 HS4 절연체(2xCHS4)의 인접하는 탠덤 반복이 포함되어 있다. 따라서, 하기 리포터 발현 카세트가 AAVS1 유전자좌에 삽입되었다: 2xCHS4-CDH5프로모터-dTomato-WPRE-SV40-2xCHS4. 뉴클레오펙션 및 클론 선택/검증은 문헌[참조: Bagley et al., 2017, Nature Methods 14, 743-751]에서와 같이 수행되었다.
HAND1 및 NKX2-5 녹아웃 세포주의 생성 - HAND1 및 NKX2.5는 CRISPR/Cas9를 사용하여 H9 세포에서 녹아웃되었다. 표적 부위에 대한 sgRNA는 생거 인스티튜트 게놈 편집(Sanger Institute Genome Editing; WGE) 웹사이트와 벤취링(Benchling) sgRNA 설계 도구를 사용하여 특정되었다. (HAND1_sgRNA1: GAGCATTAACAGCGCATTCG(서열번호 1); NKX2.5_sgRNA1: GACGCACACTTGGCCGGTGA(서열번호 2); NKX2.5_sgRNA2: ACTTGGCCGGTGAAGGCGCG(서열번호 3)). 장 랩(Zhang Lab) 일반 클로닝 프로토콜(Ran et al., 2013, Nature Protocols 8, 2281-2308)에 따라, sgRNA를 pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459) V2.0(Feng Zhang Lab; Addgene 플라스미드 #62988; n2t.net/addgene:62988; RRID:Addgene_62988)에 클로닝했다. 세포는, P3 1차 세포 4D-뉴클레오펙터(Nucleofector™) X 키트 S(Lonza-BioResearch, Cat #: V4XP-3032) 및 아막사(Amaxa™) 4D-뉴클레오펙터(Nucleofector™)(Lonza-BioResearch)를 사용하여 형질감염시켰다. 뉴클레오펙션 후, 10μM Y-27632(Cat #72302)가 보충된 E8에서 세포를 24시간 동안 인큐베이팅했다. 그 기간 후, 세포를 퓨로마이신(puromycin)(농도 0.2ng/μL;(Sigma-Aldrich, Cat #P8833))으로 48시간 동안 선택했다. 이 처리 후, 재-성장을 촉진하기 위해, 세포 배양 배지를 10μM Y-27632(Cat #72302))가 보충된 E8로 다시 변경했다. 세포가 콜로니를 형성하면, 이를 채취하고, 96w-플레이트(Corning, Cat #CLS3370)로 옮겼다. 성공적인 편집은 먼저 풀 수준에서 평가되었다. 이어서, 녹아웃을 확인하기 위해, 단일 콜로니의 유전자형을 별도로 2회 조사했다. 풀 및 클론 수준의 게놈 편집은 신테고(Synthego)의 온라인 도구 ICE(ice.synthego.com/#/)에 의해 평가했다.
프라이머:
HAND1_G1_전방 5'-CACCGAGCATTAACAGCGCATTCG-3'(서열번호 4)
HAND1_G1_역방 5'-AAACCGAATGCGCTGTTAATGCTCC-3'(서열번호 5)
NKX2.5_G1_전방 5'-CACCGGACGCACACTTGGCCGGTGA-3'(서열번호 6)
NKX2.5_G1_역방 5'-AAACTCACCGGCCAAGTGTGCGTCC-3'(서열번호 7)
NKX2.5_G2_전방 5'-CACCGACTTGGCCGGTGAAGGCGCG-3'(서열번호 8)
NKX2.5_G2_역방 5'-AAACCGCGCCTTCACCGGCCAAGT-3'(서열번호 9)
실시예 8: 시험관내에서 심장 챔버-유사 구조의 형성
시험관내 3D 챔버-유사 구조가 본질적으로 생성될 수 있는지 여부를 조사하기 위해, 우리는 주요 심장발생 신호전달 경로인 액티빈, BMP, FGF, 레티노산 및 WNT의 시간적 제어를 기반으로 한 차별화 접근법을 개발했다. 생체내 발달 단계를 재현함으로써, 우리는 hPSC를 중배엽, 심장 중배엽 및 박동 심근 전구세포로 2D 배양에서 90% 이상의 효율로 순차적으로 특정했다[참조: Mendjan et al., 2014, Cell Stem Cell 15, 310-325](도 14A). 2D 배양에서 고유한 3D 심장 구조 형성을 자극하기에 충분한 인자를 스크리닝하기 위해, 중배엽 발달에 관여하는 선택된 ECM 단백질을 배지에 보충했다[참조: Yap et al., 2019, Trends in Cell Biology 29, 987-1000]. 중배엽 유도 전에 라미닌 521/511을 첨가하면, 세포의 고유한 자가-조립, 및 분화 7일 후에 CM 마커 TNNT2를 발현하는 중공 박동 3D 구조의 현저한 형성을 초래했다(도 21A). 3D 비부착 고처리량 배양에서 심장 분화를 완전히 수행했을 때, 외인성 ECM은 CM 마커 ACTN2, TNNT2, TNNI1, MYL7, TTN, NPPA 및 ATP2A2에 대해 양성인 박동 공동-함유 구조로의 신속한 및 재현가능한 자가-조립에 필요하지 않음을 발견했다(도 14B, 14C, 21B, 21C). 미세구조 수준에서, 이러한 CM은 조직화된 근절을 포함하고, 삽입된 디스크를 통해 상호 연결된다(도 21C', 21D). 자가-조립화는, 이의 방대한 라이브 형광 리포터 공급원 컬렉션[참조: Roberts et al., 2019, Stem Cell Reports 12, 1145-1158], 광범위하게 사용되는 hESC 계통 H9 및 H7을 포함하는 WTC hiPSC 계통에서, 게다가 뇌 오르가노이드를 생성하기 위해 일상적으로 사용되는 3개의 WTC hiPSC 계통에서 견고했다(도 21E, 21E'). 유세포 분석(N=3, n=5) 및 3D Z-스택 이미지 분석(N=3, n=8)에 의해 측정된 CM 분화 효율은 평균 약 90%였다(도 14D, 21F). 이하, 이러한 공동-함유 심장 구조를 카디오이드(cardioid)라고 한다.
이어서, 카디오이드를 분자 수준에서 특성화하려고 했다. 카디오이드의 RNA-seq 시간 경과 분석에 의해, 심장 중배엽의 제1 심장 영역(FHF) 계통(HAND1+, TBX5+, NKX2-5+, TBX1-)과 가장 유사한 발현 특징이 밝혀졌고(도 14E), 이는 생체내에서 심장 관을 생성시킨다(좌심실의 주요 전구체이고, 보다 작은 범위에서 심방이다). 카디오이드 구체화 및 성숙 동안, 구조 및 이온 채널 유전자의 발현, 및 β-아드레날린 수용체 1 및 2의 발현이 증가했다(도 22A). 2D로 분화된 CM과 관련된 카디오이드의 발현 프로파일과 비교할 때, 이온 채널(예: HERG 채널 KCNH2), 구조 단백질(TNNI1, TTN, MYH6), 심장 전사 인자(TBX5, MEF2C) 및 근소포체 단백질(RYR2, ATP2A2)을 코딩하는 유전자가 3D 공동-형성 구조에서 보다 높은 발현 수준을 나타낸 것에 주목했고, 이는 개선된 기능을 시사한다(도 22B). GO 기간 분석은 카디오이드가 심장 형태형성 및 발생의 유전자 발현 패턴을 나타내는 것을 보여주었고, 이는 2D CM(도 22C) 및 응집된 3D CM 미세조직(도 22D)에 비해 유의하게 상향조절되었다. 양쪽 모델에서, 박동은 분화의 5일차 내지 7일차 사이에 개시되었고, 유사한 속도와 빈도(Ca2+ 과도현상, 박동 빈도)로 계속되었고(도 22E, 22F), 카디오이드는 적어도 3개월 동안 배양에서 유지될 수 있었다. 전체적으로, 재현가능하게 자가-조립되고 분자 CM 동일성을 유지하는 기능적 hPSC 유래 카디오이드를 성공적으로 생성했다.
추가로, 카디오이드의 CM 서브타입의 가능성을 탐구하는 것을 목적으로 삼았다. 카디오이드의 초기 RNA-seq 분석은 이의 FHF 기원과 일치하는 혼합 심실(IRX4+, MYL2+) 및 심방(NR2F2+, KCNJ3+) 프로파일을 나타낸다(도 22A, 22B). 중배엽 유도 및 저 RA 신호전달 용량이 후방 심장 관 및 좌심실의 구체화에 중요함을 고려하여, 중배엽 유도 중의 WNT 및 ACTIVIN 용량을 최적화하고, 심장 중배엽 단계에서 RA 용량을 감소시켰다. 이러한 최적화에 의해, 심실-특이적 마커(IRX3, IRX4, HEY2, MYL2)의 발현이 증가하고, CM의 RTqPCR, 면역세포화학 및 단일 세포 RNA-seq(scRNA-seq) 분석에 의해 볼 수 있는 바와 같이, 심방-특이적 마커 발현(NR2F2, HEY1)가 거의 존재하지 않는다(도 14F, G, H). 이러한 데이터와 일치하게, FluoVolt 염료 검정을 사용한 활동 전위 측정은 주로 심실-유사 프로파일을 나타냈다(도 22G). 결론적으로, 카디오이드는 초기 좌심실 등의 동일성을 지향할 수 있다.
실시예 9: 심장 중배엽은 시험관내 및 생체외에서 공동을 형성하기 위해 자가-조직화한다
이어서, 이 시스템을 사용하여, 카디오이드 내의 공동이 고유한 형태형성에 의해 형성되는지 여부를 질문했다. 공동 형성을 포획하는 발달의 시간 경과를 분석함으로써, 우리는 공동이 개시되고, MYL7 등의 주요 심장 구조적 마커의 발현에 앞서 심장 중배엽(HAND1+) 단계에서 견고하게 확장되었음을 발견했다(도 14E, 도 15A). 카디오이드는 복수의 공동의 증식 및 형성에 의해 신속하고 재현 가능하게 확장되었다. 대부분의 작은 공동은 최종적으로 1개의 주요 공동으로 합체되었다. 공동 확장은 절단된 CASP3 및 MKI67 염색에 의해 입증된 바와 같이, 아폽토시스에 의해서도 국소적 증식의 차이에 의해서도 유도되지 않았다(도 15A). 중요하게는, SOX17+/EOMES+ 내배엽은 분화 중에 부재하고, 이는 심장 중배엽 공동이 내배엽 유도의 결과로서 생성되지 않았음을 나타낸다(도 23A). 전장 내배엽의 형태형성이 중단되는 경우에도, 양측 심장이 여전히 형성될 수 있기 때문에, 이는 생체내 소견과 일치한다. 강력한 VEGFR 억제제인 수니티닙을 사용하여 VEGF-유도 내피 세포(EC)의 분화를 억제한 경우에도, 루멘 형성이 또한 발생했고, 이는 내피-독립적 메커니즘을 시사한다(도 23B). 심장 중배엽은, CM-제조 챔버 등의 구조로의 자가-조립화의 고유한 능력을 갖고 있다고 결론지었다.
생체내에서, 심장 중배엽은 마우스[참조: Li et al., 2004, Science 305, 1619-1622] 및 병아리[참조: DeHaan 및 DeHaan, 1959, Developmental Biology 1, 586-602]에서 심장의 기본적 형태형성을 위해 전장 내배엽을 필요로 하지 않는다. 따라서, 개발 중의 병아리 배아로부터 생체외 해부된 중배엽이 인간 심장 자가-조직화를 위해 개발한 조건에서 챔버-유사 구조를 형성할 수 있는지 여부를 질문했다. 놀랍게도, SOX2+ 전장이 존재하지 않는 경우, 병아리 중배엽 외식편은 인간 심장 중배엽과 유사한 시험관내 박동 챔버-유사 구조로 발달하고, 이는 허용 조건하에서 시험관내 심장발생 자가-형태형성의 견고한 보존을 입증한다(도 15B, 도 23C, 23D).
구체화 중의 자가-형태형성 외에도, 균일한 개시 세포 모집단의 본질적 자가-패터닝은 자가-조직화의 중요 특징이다. 이를 위해, 최초의 자가-패터닝 이벤트가 발생하는 시기를 결정하기 위해, 심장 중배엽에 대한 상세한 분석을 수행했다. 유도 단계에서 중배엽은 균일한 것처럼 보였지만, 심장 중배엽 단계가 개시될 때, F-액틴 및 막 결합 베타-카테닌의 더 높은 말초 신호가 관찰되었다. 후속 공동화는 F-액틴, N-카드헤린 및 보다 높은 핵 밀도의 축적에 의해 반영되는, 주변부에서 중배엽 밀도의 증가와 일치했다(도 15C, 15D). 공동 구조는 저분자량(4kDa) 덱스트란에 대해 불투과성이므로, 이보다 더 높은 밀도의 심장 중배엽 층이 투과성 장벽으로서 기능할 가능성이 있다. 대조적으로, 공동이 최초 출현한 발달 중의 구조의 중앙 부분은 N-카드헤린 및 베타-카테닌의 신호가 감소하고, 외관이 보다 느슨했다(도 15C). 이러한 관찰은, 심장 중배엽의 보다 조밀한 배측 영역과 심내막 관 및 전장 내배엽을 면하는 덜 조밀한 영역에서 N-카드헤린 및 베타-카테닌의 생체내 패턴과 일치한다[참조: Linask, 2003, Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews 69, 14-24]. 지금까지, 인간 카디오이드는 자가-조직화, 진행 중의 구체화, 중배엽 층으로의 고유한 자가-패터닝 및 공동을 형성하기 위한 자가-형태형성의 주요 특징을 구비하고 있다고 결론지었다.
실시예 10: WNT 및 BMP는 카디오이드 자가-조직화를 제어한다
이어서, 카디오이드를 사용하여, 카디오이드 구체화 중에 신호전달이 고유한 형태형성 및 패턴화를 제어하는 방법을 분석했다. 높은 통계력으로 표현형을 정량화하기 위해, 고처리량 카디오이드 플랫폼을 커스텀-제조 반자동 이미징/분석 FIJI 파이프라인과 조합했다. 이 설정을 사용하여, 카디오이드 자가-조직화를 제어하는 신호와 이들이 중배엽 구체화의 어떤 단계에서 작동하는지를 조사했다. 먼저, 심장 공동 자가-형태형성에 대한 핵심 중배엽 및 심장 중배엽의 신호전달 용량(예: WNT, BMP)의 영향을 체계적으로 시험했다. 놀랍게도, 우리는, 중배엽 유도 중의 더 높은 용량의 WNT 신호전달이 이전에 보고되지 않은 후기 심장 중배엽 단계 중의 공동 확장을 유도한다는 것을 발견했다(도 16A, 16B). 중간 WNT 용량은 공동 형태형성과 CM 구체화를 모두 촉진했다. 최적의 WNT 활성화 범위는 각 hPSC 계통에 대해 일관되었지만, 계통 사이에서 상이하고, 계통-특이적 신호전달 반응을 나타내는 다수의 연구와 일치한다. 중요하게도, 최고의 WNT 용량은 CM 구체화 없이 공동 형성을 촉진하여(도 16A), 형태형성에 대한 세포 운명 구체화의 신호전달 제어에서 현저한 차이를 강조한다.
심장 공동 형태형성을 제어하는 WNT의 하류 매개인자를 동정하기 위해, RNA-seq 분석을 수행하고, 보다 높은(거대 공동) 및 보다 낮은(작은 공동) WNT 신호전달 용량에 의해 유도된 중배엽의 유전자 발현 프로필을 비교했다. 후기 심장 중배엽 단계에서 차등적으로 발현된 유전자 중에서, BMP 신호전달의 공지된 심장 매개인자(BMP4, BMP2, BMPR2)와 중배엽 표적의 일부(HAND1, IRX3)를 동정했다(도 16C). BMP는 복수의 단계에서 심장 구체화를 유도하고, BMP가 패턴화 및 형태형성을 지시하여 심장 공동을 형성할 수 있는지 여부를 질문했다. 이 질문에 답하기 위해, 심장 중배엽 단계의 초기 2일 동안, 천연 억제제 노긴(Noggin) 또는 화합물 LDN193189를 사용하여 BMP 신호전달을 차단했다. BMP 억제는 공동 형태형성 장애, 심장 중배엽 밀도 증가 및 카디오이드 크기 감소를 초래하는 반면, 카디오이드당 세포 수는 안정적으로 유지되었다(도 16D, 16E, 16F, 16G). 대조적으로, 심장 중배엽 단계에서 WNT 억제는 공동 형성에는 필요하지 않았다(도 16H). 이러한 발견은 구체화의 제어 대 형태형성의 제어가 근본적으로 상이한 프로세스일 수 있고, 중배엽 WNT-BMP 신호전달 축이 자가-패터닝 및 자가-형태형성을 제어한다는 점을 강조한다(이는 둘 다 중요한 자가-조직화 프로세스이다).
실시예 11: HAND1은 카디오이드 자가-조직화에 작용한다.
신호전달 및 하류 전사 인자의 돌연변이는 심장관 및 챔버 발달에 영향을 미치고, 심각한 인간 심장 기형을 유발한다. 예를 들면, 인간의 가장 심각한 선천적 결함인 저형성 좌심장 증후군에서, BMP-조절 유전자 NKX2-5 및 HAND1 수준의 교란은 좌심실 내의 심장 공동의 대폭 감소와 관련이 있다. 돌연변이 Nkx2-5 및 Hand1 마우스의 초기 표현형은 각각 심장관 및 초기 좌심실 형태형성의 결함으로 나타나지만, 인간에서 질환 병인 및 기본 형태형성 메커니즘은 덜 명확하다. 여기에서, HAND1 또는 NKX2-5의 어느 하나에 대한 녹아웃(KO) hPSC 계통을 생성하고, 이러한 유전자가 비심장 조직의 부재하에 고유한 자가-조직화를 달성하는 데 필요한지 여부를 평가했다. NKX2-5 KO 계통에서는 심장 중배엽 단계에서 공동 형성 결함을 검출하지 못했고, 최종적으로 TNNT2+ 카디오이드를 형성했다(도 24A, 24B, 24C). NKX2-5 KO 심장 중배엽에서 HAND1 발현은 영향을 받지 않고 유지되었고, 이는 카디오이드(도 24C, 도 14E) 뿐만 아니라, 인간 및 마우스 FHF 심장 중배엽에서 HAND1 발현과 비교하여 NKX2-5의 개시의 지연과 일치한다. 그러나, HAND1 발현은 NKX2-5 KO 카디오이드에서 CM 단계에서 감소된 것으로 나타났고(도 24C), 이는 NKX2-5가 HAND1의 상류에서 작용하는 마우스 및 인간 CM에서의 소견과 일치한다.
반면에, HAND1 KO에서는 심장 중배엽에서 NKX2-5 단백질 수준의 감소가 관찰되었지만, CM에서는 관찰되지 않았다(도 17A, 도 17D, 24E). 이러한 결과는, HAND1이 심장 중배엽에서 NKX2-5의 상류에서 기능하는 반면, NKX2-5가 후기 CM에서 HAND1의 상류에서 기능하는 것을 시사하기 때문에, 단계-특이적 분석의 중요성을 강조한다. 이 가설과 일치하고 NKX2-5 눌 카디오이드와는 상이하게, HAND1 KO 카디오이드는 심장 중배엽 단계에서 심장 공동 자가-조직화 및 크기에 명백한 결함을 나타냈다. 이 표현형은 보다 작은 공동(N=3, n=130)을 형성하는, 보다 작은 크기(N=9, n=246)의 카디오이드로서 나타난다(도 17B-17E, 도 24G). KO 및 WT 둘 다가 유사한 세포 수를 나타내기 때문에, 이러한 결함은 카디오이드당 세포 수의 차이에 의해 발생하지 않았다(도 24F). 중요하게는, 심장 중배엽의 패턴화 및 형태형성에서의 이러한 결함에도 불구하고, 이후의 CM 구체화(TNNT2+)는 HAND1 KO 카디오이드에서 여전히 기능했다(도 24E). 이러한 관찰은 세포 구체화 대 조직 패턴화의 제어와, 카디오이드에서 심장 기형의 맥락에서 해부될 수 있는 기관 형태형성 사이의 결정적 차이를 추가로 강조한다.
이어서, HAND1 KO 표현형이 외인성 신호전달 인자에 의해 구제될 수 있는지를 물었다. 중배엽 유도 중의 WNT 신호전달의 용량의 증가는 HAND1 KO 표현형을 구제하여, 공동의 형태형성에서 WNT의 관여를 확인했다(도 17F, 17G). 일관되게, 인간 특이적 FHF 및 초기 심실 마커인 HAND1은 또한 공동 확장을 촉진하는 고 WNT 조건에서 상향조절되었다(도 16C). 더욱이, HAND1 단백질 수준은 BMP 억제시에 감소하여, WNT-BMP-HAND1 축이 카디오이드 공동의 자가-조직화를 유도하는 것을 확인했다(도 16G). 종합하면, 이 데이터는 자가-조직화 및 유전적 심장 결함이 당사의 고처리량 카디오이드 플랫폼에서 정량적으로 모델링될 수 있음을 나타낸다.
실시예 12: WNT, ACTIVIN 및 VEGF는 내피 및 심근의 자가-조직화를 조정한다
이어서, 카디오이드를 사용하여, 심장 챔버의 특징적 특징인 내부 라이닝을 형성하기 위해, 심근과 심내막의 패턴화 및 분리를 지시하는 신호전달 경로를 분석할 있는지 여부를 조사했다. 이러한 관계를 조사하기 위해, 중배엽 유도 중의 고 WNT 활성화 용량 대 저 WNT 활성화 용량을 사용하여 생성된 카디오이드의 RNA-seq 시간 경과를 비교했다. 우리는, 심장 중배엽 단계에서 WNT 활성화의 저하가 VEGF-A 및 기타 EC 특정 인자(ETV2, TAL1, LMO2, PECAM1)의 상향조절을 초래한다는 것을 발견했다(도 18A, 18A'). 동시에, 저 WNT/저 ACTIVIN 조건으로 유도된 심실-유사 카디오이드의 단일 세포 RNA-seq 분석에 의해, 중간 WNT/고 ACTIVIN으로 유도된 카디오이드와 비교하여, VEGF-A를 발현하는 CM의 비율이 높은 것이 판명되었다(도 18B). 따라서, 저 WNT 및 ACTIVIN 신호전달 용량은, 심장 중배엽 및 CM에서 VEGF-A를 유도하여 EC 분화를 자극함으로써, CM 및 EC 공-구체화를 조정한다고 가정했다. 실제로, 본 발명자들은, 중배엽 유도 중의 저 ACTIVIN 신호전달 용량과 조합된 저 수준의 WNT 신호전달이 이후의 카디오이드 내에서 EC의 자가-조직화를 촉진한다는 것을 발견했다(도 18C, 18D). 이러한 EC는 종종(55.2%, N=4, n=29) 카디오이드 공동의 부분적 내부 라이닝을 형성했지만(도 18C, 18D, 18E, 25A, 25A'), 카디오이드 외부에서는 형성하지 않았고, 이는 생체내 조직 구조와 유사하다. 대조적으로, 보다 높은 WNT 및 ACTIVIN 용량 조건에서, 외인성 VEGF의 부재하에 EC 자가-조직화는 관찰되지 않았다(도 18C). 결론적으로, 중배엽 유도 중의 최적의 WNT 및 ACTIVIN 신호전달 용량은 이후의 EC 자가-조직화를 제어하여 카디오이드 공동의 부분적 라이닝을 초래한다.
이어서, 카디오이드에서 CM 및 EC 공-구체화에 대한 외인성 VEGF의 효과를 조사했다(도 18F). CM 구체화 단계 후에 VEGF-A를 포함시키면, 카디오이드 공동을 라이닝하는 EC 층의 형성이 때때로 관찰되지만, 또한 카디오이드 표면의 일부 EC 구체화도 관찰되었다(도 25B, 25C, 25D). 심장 중배엽에서 CM 층 및 EC 층의 초기 자가-조직화를 제어할 수 있는지 여부를 추가로 해명하기 위해, 이 단계에서 VEGF-A를 포함시켰다. CM 및 EC는 VEGF-A의 존재하에 심장 중배엽으로부터 공동-함유 구조로 공-분화하기 때문에, CM 및 EC 층으로 분리되었다(도 18F, 18F', 18F"). 여기에서, 중배엽 유도 중의 최적(중간) WNT 활성화를 사용하면, 항상 CM 층을 둘러싸는 EC 층이 생성되었다(도 18F", 도 26A, 26C, 26D). 더욱이, COL1A1+ 세포의 제3 층이 EC 층에 인접하여 출현했다(도 18F"). 카디오이드와는 대조적으로, 최초에 2D로 분화된 EC 및 CM의 응집체는 혼합 네트워크를 형성했지만, 층으로 패턴화되지 않았다(도 26B). 이는 VEGF가 2개 층의 조기 분리를 자극한다는 것을 시사하고, 이는 배아 심장 중배엽 및 심장관 단계에서 볼 수 있는 중요한 측면이다. 그러나, 외인성 VEGF는 EC 라이닝의 정확한 외측 대 내측 방향을 제어하기에 충분하지 않았다. 따라서, WNT/ACTIVIN의 용량과 VEGF 신호전달의 타이밍은 구체화, 공동의 형태형성, 및 CM 및 EC 계통의 생체내-유사 패턴화를 조정한다.
카디오이드에서 계통 구체화 및 형태형성의 WNT 및 VEGF 신호전달 제어를 추가로 분석하기 위해, CM 공동 분화 없이 EC 세포 층이 형성될 수 있는지 여부를 질문했다. 심장 중배엽 단계에서 WNT 억제의 부재 및 VEGF의 존재하에, 본 발명자들은 주로 EC 및 COL1A1+ 세포를 함유하고 CM를 함유하지 않는 카디오이드-유사 구조가 재현가능하게 형성될 수 있음을 발견했다(도 18G, G', 도 26F). 이 관찰은 형태형성의 신호전달 제어가 카디오이드에서 세포 구체화의 신호전달 제어와 어떻게 분리될 수 있는지를 다시 강조한다. 종합적으로, 이러한 데이터는 카디오이드가 자가 조직화하여 최초 2개의 심장 계통을 발생시키기 위해 심근 및 심내막 공동 발달의 측면 및 단계를 분석하는 데 사용될 수 있음을 나타낸다.
실시예 13: 카디오이드에서 심내막 및 섬유아세포-유사 세포
모든 자가-조직화 오르가노이드는 관련 조직-유사 구체화, 패턴화 및 형태형성 프로세스를 공유하지만, 이들의 장기-특이적 세포 유형에 의해 구별된다. 따라서, 이어서, 카디오이드 내의 세포 불균일성을 조사했다. 중간 WNT 활성화 및 VEGF를 사용한 경우, EC에 대한 CM의 비율이 41%(MYL7+) 내지 53%(CDH5+)에서 안정적이었음을 발견했고(도 18F'), 이 모델을 사용한 정량적 분석이 용이해졌다. 이 관찰은 인간 심장 발달에 대해 벌크 RNA-seq 데이터의 디콘볼루션[참조: Wang et al., 2019, Nature Communications 10, 1-9] 및 심장 세포-유형-특이적 단일-세포 발현 참조[참조: Cui et al., 2019, CellReports 26, 1934-1950.e5]에 의해 추가로 확증되었다(도 27A). 선별된 세포의 Smart-seq2(도 26E), 및 생체내 인간 심장 데이터(Cui et al., 2019)를 기반으로 세포를 선별하기 위해 사용된 scRNA-seq 분석에 의해, 주요 CM 및 EC 마커 프로필과 GO 기간을 추가로 확인하고(도 19A, 도 27D, 27E), 나머지 세포(MYL7-/CDH5-)는 추정 EC 유래 섬유아세포-유사 세포와 관련된 유전자(예: SOX9, MSX1/2, COL1A1, COL3A1)를 발현했다(도 19A, 26E, 27F). 최종적으로, 카디오이드의 벌크 프로테옴 분석에 의해, 이들의 CM 및 EC 프로테옴 발현 특징이 확인되었다(도 27B).
모든 혈관신생 조직 및 기관에는 특정 EC 서브타입이 포함되어 있고, 따라서 심내막에는 동일성-특이적 EC 유전자 발현 특징이 있다. 카디오이드에서 EC 동일성을 결정하기 위해, 선별된 CDH5+ 카디오이드 EC에서 Smart-seq2 분석을 수행하고, 잘 확립된 2D 분화 프로토콜[참조: Patsch et al., 2015, Nature Cell Biology 17, 994-1003]을 사용하여 생성된 EC, 3D와 유사한 배지 조건을 사용하는 2D 분화 프로토콜, 혈관 오르가노이드의 EC[참조: Wimmer et al., 2019, Nature 29, 40], 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 및 인간 심장 미세혈관 내피 세포(HCMEC)와 비교했다(도 19C, 19D). 카디오이드-유래 EC는, 연령 차이에도 불구하고, 혈관 오르가노이드의 EC와 가장 유사했다는 것을 발견했다(7.5일 대 18일 초과). 중요하게도, 카디오이드로부터의 EC는 GATA4/5 등의 심장 전사 인자 및 심내막-유사 동일성(NFATC1, NPR3)과 관련된 유전자에 대한 전사 수준의 증가를 나타냈다(도 19D). 중요하게는, NFATC1은 또한 프로테오믹스 데이터(도 27B)에서 발견되었고, NPR3은 scRNA-seq 데이터(도 19A)에서 발견되었다. 이들의 전방 HOX 유전자 발현 프로파일은 성인 인간 심장 유래의 HCMEC의 것 및 2D에서 심장 중배엽으로부터 유래하는 EC의 것(전방 EC)의 것과 일치했지만, 기타 분석된 보다 후방의 EC 서브타입의 것과는 일치하지 않았다(도 27C). 따라서, 카디오이드에서 유래하는 EC의 특징은 심내막과 유사한 동일성과 일치한다.
유체 유동, 압력 및 기계적 신장을 감지하는 내피의 능력은 특히 심장에서 이의 발생 및 생리학적 역할을 위한 중요한 요건이다. 심장 발생의 선의의 모델에서 예상되는 바와 같이, 카디오이드로부터 선별된 EC의 Smart-seq2 분석에 의해, 2D의 EC와 비교하여 기계감수성 유전자(SOX18, KLF2, FOXO1, FOS)의 상향조절이 밝혀졌고(도 19B, 19B', 19B", 19D), 보다 성숙한 3D 혈관 오르가노이드 EC와 유사하다. 이러한 관찰은, scRNA-seq 데이터 세트 및 SOX18에 대한 염색으로 확인되었다. EC 성숙의 마커(VWF, TEK, TIE1)도 또한, 2D EC 분화와 비교하여 카디오이드 EC에서 상향조절되었다(도 19D). 전체적으로, 이러한 결과는 3D에서 CM 및 EC의 자가-조직화가 심내막의 동일성 및 내피 생리학의 중요한 측면을 유발하는 것을 나타낸다.
실시예 14: 발달 손상 모델로서의 삼계통 카디오이드 플랫폼
심내막 형성 후, 심외막은 초기 심근 챔버를 둘러싸고, 이에 의해 심장에 제3의 주요 심장 계통이 추가된다. 심외막은 전-심외막 기관이라고 하는 작은 세포 덩어리에서 개시하여, 심장의 외부 표면을 덮고 있다. 완전 포위한 후, CM 층(TGF-b, PDGF-b, FGF)의 신호는 심외막 세포를 평활근 세포(SMC)와 심장 섬유아세포(CF)로 분화하도록 유도한다(이들은 둘 다 손상시 심장의 추가 발달, 성숙, 재생에 관련되어 있다). 카디오이드에서 이러한 자가-조직화 프로세스를 모방하기 위해, 카디오이드와 호환성이 있고 척추동물 및 hPSC에서 전-심외막 기관을 특정하는 것으로 공지되어 있는 신호전달 서열을 기반으로 하는 심외막 분화 프로토콜을 개발했다(도 20A, 28A, 28B, 28C). 이어서, 카디오이드에 의한 이들의 신호전달 인자의 내인성 발현(도 28D)이 심외막/카디오이드 상호작용을 자극하기에 충분한지 여부를 시험하기 위해, 외인성 TGF-b, FGF 및 PDGF를 포함하지 않는 배지에서 카디오이드를 심외막 응집체와 함께 공-배양했다. 2 내지 7일 이내에, 카디오이드 상에 심외막 세포의 확산을 관찰했다(도 28E, 28F, 28G). 7일 후 및 추가 성장 인자 없이, 심외막 세포는 CM 층과 상호작용하고, CM 층으로 이동하고, 분화했다(도 20B, 20C, 20D, 28H, 28I). 생체내에서 발생하는 바와 같이, 이동하는 세포는 심외막 WT1을 하향조절하고, SMC 및 CF 마커 ACTA2(도 20D, 28I) 및 COL1A1(도 20C, 28H)을 상향조절했다. 놀랍게도, 이동하는 심외막-유래 세포 중 일부는 카디오이드 EC와 상호작용하기 시작했다(도 20B, 20D). 외부 신호의 부재하에 공-배양은 카디오이드 상의 심외막의 고유한 확산, 이의 내부 이동, 분화 및 CM 및 EC와의 상호작용을 유발한다고 결론지었다.
자가-조직화 발달 오르가노이드 모델의 가정된 이점은 이의 병태생리학적-유사 반응이다. 그러나, 현재의 심장의 시험관내 모델은 태아, 생후 초기 및 성인의 생체내 손상 모델에서 볼 수 있는 심근 재생 또는 질환 모델 및 환자에서 볼 수 있는 섬유증의 중요한 측면을 재현하지 않는다. 예를 들면, 이전 조직에서, 생체공학 심장 오르가노이드의 동결손상 후, 한정된 증식만이 있지만, 재생 및 섬유증 둘 다의 초기 단계에 전형적인 초기 세포외 매트릭스(ECM)의 축적은 없다. 카디오이드에는 3개의 주요 심장 계통이 모두 포함되어 있고, 발달 메커니즘에만 의존하고, 외부 ECM 스캐폴드를 필요로 하지 않는다는 점을 감안하면, 카디오이드는 동결손상에 대해 보다 많은 생리학적 반응을 생성할 가능성이 있다고 추론했다. 발달 손상 모델로서 카디오이드 플랫폼의 가능성을 시험하기 위해, 단일 계통(CM 단독을 포함) 및 삼중 계통(CM 포함(도 20G, 20F), EC(도 20H, 20I, 28J, 28K, 28L) 또는 심외막(도 20E, 20G) 중 어느 하나를 포함 및 관련 섬유아세포-유사 세포) 카디오이드(도 29-34)에서 동결손상을 수행했다. 손상 부위는 강력하고 압축된 DAPI 신호, TUNEL 염색에 의해 검출된 심각한 괴사(도 28J), 제한된 아폽토시스 및 명확한 CM 증식 반응이 없는 것(도 28K)을 특징으로 했다. 시간 경과 실험에서, 손상 부위에서 트리크롬 염색이 관찰되고, 국소적 ECM 축적이 나타난다(도 20G). 단일-계통 카디오이드는 손상 부위에서 COL1A1+ 발현 섬유아세포-유사 세포의 부재 및 더 낮은 피브로넥틴 축적을 나타냈다(도 20G, 20F). 대조적으로, 트리-계통 카디오이드에서, 손상 부위에 대한 COL1A1+ 섬유아세포의 유의한 지향성과 강력한 피브로넥틴 축적이 관찰되었다(도 20E, 20G). EC 또는 심외막 관련 섬유아세포-유사 세포의 이러한 급속한 동원(도 20E, 20H, 20I)은 손상 반응 중의 생체내 관찰과 일치한다. 따라서, 심장 손상시의 세포 유형-특이적 프로세스를 분석하고, 카디오이드는 재생 및 섬유성 반응의 중요한 초기 측면을 모방할 수 있다는 결론을 내릴 수 있다.
결론
결론적으로, 패턴화된 층 및 초기 인간의 좌심실의 심실을 연상시키는 3D 구조로 고유한 자가-조직화 능력을 갖는 고처리량 인간 카디오이드 플랫폼을 확립했다. 또한, 이 자원을 사용하여, 공동 형성 및 손상 반응을 포함하여, 3개 주요 심장 계통의 발달의 기본 메커니즘을 모델링할 수 있음을 나타낸다.
오르가노이드는 시험관내에서 기관형 자가-조직화를 모방하지만, 그 다양성과 복잡성은 여전히 형태형성 상의 결함의 정확한 모델화를 방해할 수 있다. 외인성 ECM을 배제하고, 고처리량 접근법을 사용하여 최적화된 범위의 파라미터로부터 최적 조건에 도달함으로써 변동성 문제를 해결했다. 3개의 주요 심장 계통의 오르가노이드 플랫폼으로의 통합을 제어하고 이의 높은 재현성에 의해, 유전적 돌연변이가 결함을 유발하는 시기 및 위치를 높은 통계적 능력으로 분석할 수 있다. 이 시스템에 통합될 수 있는 기타 주요 심장 서브-계통에는 제2 심장 필드 영역 계통 및 전도 시스템이 포함된다. 이 플랫폼을 사용함으로써, 시험관내에서 심장 중배엽은 WNT-BMP 구동 메커니즘을 통해 내피와 내배엽의 부재하에 공동을 형성하기에 충분하다는 것을 나타냈다. 전체적으로, 심장 형성의 제어된 시험관내 재구성에 대한 우리의 접근법은, 약물 발견 및 재생 의학에 적합한 보다 성숙하고 복잡한 인간 심장 모델의 생성 뿐만 아니라, 발달 메커니즘 및 심장 결함을 탐구하기 위한 광범위한 잠재력을 갖고 있다. 자가-조직화 오르가노이드 시스템의 가변성과 복잡성은 여전히 형태형성 결함의 정량적 모델링을 방해한다. 카디오이드에서, 외인성 ECM을 생략하고, 고처리량 접근법을 사용하여 최적의 신호 조건에 도달함으로써 이 문제를 해결한다. 신호전달을 통해 자가-조직화를 엄격하게 제어하고, 3개의 주요 심장 계통을 카디오이드에 단계적으로 도입함으로써 재현성을 추가로 높였다. 이 접근법에 의해, 특정 요인의 기능이 필요한 시기와 위치를 높은 통계력으로 분석할 수 있다. 심장이 아닌 조직의 간섭 없이, 1, 2 또는 3개의 심장 계통을 포함할 수 있는 시스템의 단순성은, 자가-조직화와 이의 기본 분자 및 세포 생물학적 메커니즘을 필요 최소한으로 감소시키는 것을 가능하게 한다. 따라서, 카디오이드의 복잡성은 생물학적 문제에 맞춰 조정할 수 있다. 이는 오르가노이드 모델의 중요한 이점이고, 이는 복잡한 생물학적 시스템이 다른 방법에서는 종종 분리하기 어려운 중복 메커니즘을 채용하기 때문이다.
카디오이드는, 다른 모든 자가-조직화 오르가노이드 시스템과 마찬가지로, 발생의 일부 측면을 반복하지만, 다른 측면에서는 배발생과도 상이하다. 자가-조직화는 생체내-유사 구조의 측면을 반복하기에 충분한 고유 발달 메커니즘의 서브세트만을 포함한다. 결과적으로, 카디오이드를 사용하여, 신호전달에 의해 지시된 심장 중배엽만으로도, 시험관내에서 챔버 등의 공동을 형성하기에 충분하다는 것을 나타냈다. 이 공동은 심장관의 공동과 초기 좌심실 심장 챔버와 유사할 수 있다고 제안한다. 생체내에서, 제1 공동은 전장 내배엽에 의한 이동 및 양측 심장 중배엽 및 심내막 관의 단일 심장관으로의 융합으로부터 발생한다. 그러나, 심내막 또는 전장 내배엽의 수축이 없어도, 양측 심장관과 심실이 형성될 수 있지만, 그 메커니즘은 아직 알려지지 않았다. 이는, 심장 중배엽이 생체내에서 공동과 챔버를 본질적으로 형성하는 고유한 능력을 나타내고, 이는 시험관내에서 카디오이드 및 병아리 배아 이식편에서 관찰한 자가-조직화와 일치한다. 심장 중배엽을 포함하는 서브타입인 측판 중배엽은, 공동(심막 체강(pericardial body cavity))을 형성할 수 있는 유사한 잠재력을 갖고 있다. 따라서, 공동화는 전장 결손이 있는 배아에서 발생할 수 있는 중배엽의 보다 일반적 특징일 가능성이 높다. 마지막으로, 카디오이드의 HAND1 KO 공동 표현형은 Hand1 KO 마우스의 저형성성 좌심실 챔버 표현형 및 인간의 저형성성 좌심실 증후군 챔버 공동 표현형과 일치하여 카디오이드의 모델링 가능성을 나타낸다.
카디오이드 플랫폼을 사용하여, WNT와 BMP가 챔버 등의 자가-조직화를 유도한다는 것을 입증했다. 이러한 경로는 생체내 및 시험관내에서 심장 구체화를 조절하는 것으로 공지되어 있지만, 심장 패턴화 및 형태형성을 제어하는지 및 어떤 단계에서 제어하는지는 불분명하다. 초기 중배엽 WNT가 이후의 심장 자가-조직화를 제어한다는 놀라운 발견은 생체내에서 중배엽 유도 중의 초기 심장 계통의 다양화와 일치한다. 패터닝과 형태형성은 구체화와 병행하여 발생하지만, 반드시 연결되어 있는 것은 아니다. 이 개념과 일치하여, 공동은 심장 구체화가 없는 경우에도 자가-조직화할 수 있고, HAND1 KO 카디오이드에는 자가-조직화에 결함이 있지만, CM 구체화에는 없다. 반대로, 심장 중배엽 단계에서 WNT 신호전달의 억제는 CM 구체화에 필수적이지만, 카디오이드 자가-조직화를 조절하지는 않는다. 따라서, 카디오이드는 구체화 및 형태형성의 조절을 본질적으로 분석하는 강력한 시스템이다. 동시에, 카디오이드는 이러한 프로세스 중의 하나에 대한 요인의 충분성을 결정하기에 충분히 단순하고, 따라서 보다 복잡한 시스템을 보완한다.
WNT, ACTIVIN 및 VEGF가 카디오이드에서 CM 및 EC 자가-조직화를 제어한다는 것을 발견했다. 생체내에서, 심장 EC는 먼저 심내막관을 형성하고, 이후에 ECM으로 채워진(심장 젤리) 공간에 의해 외측 CM 관으로부터 분리되고, 마지막으로 심장 챔버의 내부 라이닝을 형성한다. 신호전달이 이러한 패턴과 형태형성 프로세스를 구체화와 어떻게 조정하는지는 명확하지 않았다. 카디오이드에서, CM 및 EC 계통의 패턴화 및 형태형성은 중배엽 분화의 초기 단계에서 WNT 및 ACTIVIN의 용량, 및 심장 중배엽에서 EC 층의 구체화 및 패턴화를 모두 지시하는 VEGF에 의해 제어된다. 흥미롭게도, 동일한 범위보다 낮은 WNT 및 ACTIVIN 신호전달 용량은 심실 구체화 및 EC 라이닝 형성을 자극하고, 이는 이러한 프로세스 사이의 잠재적 조정을 시사한다. EC와 CM이 미세조직에서 응집되면, 이들은 별도의 층과 라이닝을 형성하지 않는다. 별도의 EC 층/라이닝의 생성은 생체내 챔버의 맥락에서 기계감수성의 활성화에 중요하다. 심실 기계생물학은 생리적 EC 및 CM 누화에 필요하고, 섬유주, 심근 압축 및 심외막과의 상호작용 등의 심장 발달의 후속 단계를 유도한다. 따라서, 카디오이드는 CM 및 EC 패터닝 및 누화의 기본 메커니즘을 박동 챔버의 맥락에서 연구하는 유망한 시스템이다.
발생 중, (전-)심외막은 초기 심장 챔버와 접촉하여, 이들을 완전히 둘러싸고, 동시에 분화하여 심근으로 이동한다. 카디오이드를 심외막과 공-배양함으로써, 생체내에서 이러한 프로세스를 연상시키는 심외막 확산, 이동 및 분화를 관찰했다. 심외막 및 CM 공-배양은 미세조직을 사용하기 전에 연구되었지만, 심장 챔버 등의 모델의 맥락에서는 연구되지 않았다. 심외막, EC 및 CM 계통의 유도체 사이의 누화는 심실의 기계생물학에 의존하기 때문에, 이 측면은 중요하다. 따라서, 챔버 등의 카디오이드에서 3개의 심장 계통의 자가-조직화가 생체내에서 심장의 성장, 성숙 및 병태생리학적 반응을 유도하는 발생 및 재생 누화를 재연시키기 위해 중요할 것이라고 제안한다. 생물공학 오르가노이드와 자가-조직화 카디오이드 사이의 동결손상에 대한 반응의 현저한 차이는 발달 메커니즘이 이후의 병태생리학에 영향을 미친다는 주장을 뒷받침한다.
SEQUENCE LISTING <110> IMBA - INSTITUT FUR MOLEKULARE BIOTECHNOLOGIE GMBH <120> Heart tissue model <130> r77838 <150> EP 20164637.9 <151> 2020-03-20 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 1 gagcattaac agcgcattcg 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 2 gacgcacact tggccggtga 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sgRNA <400> 3 acttggccgg tgaaggcgcg 20 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 caccgagcat taacagcgca ttcg 24 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aaaccgaatg cgctgttaat gctcc 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 caccggacgc acacttggcc ggtga 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 aaactcaccg gccaagtgtg cgtcc 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 caccgacttg gccggtgaag gcgcg 25 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 aaaccgcgcc ttcaccggcc aagt 24

Claims (15)

  1. 심장 조직 모델(heart tissue model)의 혈관계의 임의의 추가 세포와 관계없이 적어도 60% 심장 세포의 심장 조직 모델, 또는 적어도 50% 심장 세포를 포함하는 심장 조직 모델로서,
    상기 심장 세포는 내부 공동(inner cavity)을 둘러싸고, 상기 심장 세포는 심근세포(cardiomyocyte), 심내막 세포(endocardial cell) 및 심외막 세포(epicardial cell)의 그룹으로부터 선택되는, 심장 조직 모델.
  2. 제1항에 있어서, 적어도 30%의 심근세포를 포함하고, 바람직하게는 적어도 2%의 심내막 세포를 추가로 포함하는, 심장 조직 모델.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상이한 조직 층에 심근세포 및 심내막 세포를 포함하는, 심장 조직 모델.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 내배엽 세포(foregut endodermal cell)를 최대 5%, 바람직하게는 최대 3% 포함하거나 전혀 포함하지 않고/않거나, 조혈 세포를 최대 3% 포함하거나 전혀 포함하지 않는, 심장 조직 모델.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 심외막 평활근 세포 및/또는 심외막 심장 섬유아세포를 포함하고/하거나; 비-심외막-유래 평활근 세포를 최대 3% 포함하거나 전혀 포함하지 않고/않거나, 비-심외막-유래 섬유아세포를 최대 3% 포함하거나 전혀 포함하지 않는, 심장 조직 모델.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 0.3mm 내지 15mm의 이의 최대 치수(dimension)의 크기를 갖고/갖거나; 이의 최대 치수에서의 내부 공동의 크기가 이의 최대 치수에서의 심장 조직 모델 크기의 적어도 30%인, 심장 조직 모델.
  7. 심장 조직 모델을 생성하는 방법으로서,
    a) 다능성 줄기 세포를 제공하는 단계,
    b) 저부착 배양(low attachment culture)의 3D 배양에서, WNT 활성화제 및/또는 GSK3-베타 억제제의 존재하에 및 추가로 PI3 키나제 억제제의 존재하에 중배엽 분화를 유도하는 단계로서, 배양 용기 대신에 세포를 서로 결합시켜 세포의 응집체를 형성하고, 이에 의해 중배엽 세포의 응집체를 생성하는 단계, 또는
    WNT 활성화제 및/또는 GSK3-베타 억제제의 존재하에 중배엽 분화를 유도하는 단계로서, 상기 WNT 활성화제 및/또는 GSK3-베타 억제제 및/또는 임의의 PI3 키나제 억제제는 유도 개시로부터 40시간 이내에 다능성 줄기 세포의 적어도 90%의 양에서 다능성 줄기 세포를 분화시켜 다능성을 종료(exit)시키기에 충분한 양으로 존재하고, 이에 의해 중배엽 세포의 응집체를 생성하고, 상기 세포는 섬유아세포 성장 인자 및/또는 알부민으로 처리되는, 단계,
    c) 단계 b)의 중배엽 세포를 저부착 배양의 3D 배양에서 심장 세포로 분화시키는 단계로서, 상기 세포는 배양 용기에 결합하는 대신에 서로 응집하여, 심장 중배엽 형성 및 내부 공동의 형성을 위해, 심장 분화 인자의 존재하에 및 WNT 활성화제의 부재하에 및/또는 WNT 길항제의 존재하에, 적어도 3일 동안, 바람직하게는 3 내지 7일 동안 세포의 응집체를 형성하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 단계 b)에서 WNT 활성화제가 WNT-3a 또는 CHIR99021과 같은 WNT 리간드이고; 바람직하게는
    WNT 활성제가 유도 개시로부터 40시간 이내에 다능성 줄기 세포의 적어도 90%의 양으로 다능성 줄기 세포를 분화시켜 다능성을 종료시키기에 충분한 양인 경우, WNT 활성화제로서의 CHIR99021의 양은 적어도 1μM, 바람직하게는 적어도 6μM, 또는 적어도 12μM의 농도로 존재하고;
    PI3 키나제 억제제가 존재하는 경우, WNT 활성화제로서의 CHIR99021은 적어도 0.5μM, 바람직하게는 0.5μM 내지 12μM의 농도로 존재하는, 방법.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 다능성 줄기 세포가 유도된 다능성 줄기 세포 또는 세포주로부터의 세포이고/이거나, 단계 a)의 제공된 다능성 줄기 세포가, 바람직하게는 알부민 및/또는 섬유아세포 성장 인자를 포함하고 바람직하게는 추가로 BMP 및/또는 인슐린을 포함하는 배지 중에서 계대배양(passaging)되고/되거나; 단계 a)의 제공된 다능성 줄기 세포가 적어도 1.5%(w/v), 알부민, 바람직하게는 BSA, 및/또는 적어도 100ng/ml 섬유아세포 성장 인자, 바람직하게는 FGF2를 포함하고, 보다 바람직하게는 추가로 BMP 및/또는 인슐린을 포함하는 배지 중에서 성장되는, 방법.
  10. 제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 중배엽 분화가 액티빈 A 및/또는 골 형태형성 단백질, 바람직하게는 추가의 섬유아세포 성장 인자를 포함하는 배지에서 유도되고, 바람직하게는 중배엽 분화가 적어도 1ng/ml 골 형태형성 단백질, 바람직하게는 BMP4를 포함하는 배지에서 유도되는, 방법.
  11. 제7항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, d) 추가로 1일 이상 동안 심장 분화 인자에 의해 심근세포 층을 갖는 조직으로 심장 중배엽을 갖는 응집체를 추가로 분화시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  12. i) WNT 활성화제 및/또는 GSK3-베타 억제제, ii) PI3 키나제 억제제, iii) 저부착 세포 배양 용기를 포함하고, 바람직하게는 WNT 억제제를 추가로 포함하는, 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법을 실시하기 위한 키트(kit).
  13. 적어도 10개의 구획(compartment)을 포함하는 용기 플레이트(vessel plate)로서,
    각각의 구획에서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 조직 모델이 실질적으로 동일한 발달 단계에 존재하는, 용기 플레이트.
  14. 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    세포를 후보 화합물로 처리하면서, 제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 심장 조직 모델을 생성하는 단계, 및 심장 조직 모델의 발달 또는 기능성을, 후보 화합물로 처리되지 않은 심장 조직 모델의 발달과 비교하는 단계를 포함하는,
    후보 화합물을 심장 발달 또는 기능성에 대한 이의 효과에 대해 스크리닝(screening) 또는 시험하기 위한 방법.
  15. 억제 또는 과발현된 유전자가 심장 발달에 미치는 영향을 관찰하는 방법으로서,
    제7항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따르는 심장 조직 모델을 생성하는 단계로서, 상기 세포는 억제된 후보 유전자를 갖거나 후보 유전자를 과발현하는, 단계, 및
    심장 조직 모델의 발달을, 억제 또는 과발현된 유전자로 생성되지 않은 심장 조직 모델의 발달과 비교하는 단계
    를 포함하는, 방법.
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