KR20220155145A - miRNA를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents

miRNA를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신경퇴행성 질환의 예후를 예측하기 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 miRNA-214 및/또는 miRNA-34c를 포함하는 신경퇴행성 질환 예후 예측용 마커 조성물, 상기 miRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 신경퇴행성 질환 예후 예측용 조성물 및 예측용 키트, 상기 마커를 이용하여 신경퇴행성 질환의 예후를 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 상기 miRNA-214 및/또는 miRNA-34c는 미세아교세포의 포식능 조절인자인 NKCAP1를 조절할 수 있고, 이를 통해 신경퇴행성 질환의 예후를 예측할 수 있다는 사실을 규명함으로써, 신경퇴행성 질환의 예후를 예측하기 위한 바이오마커로 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

miRNA를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 바이오마커 및 이의 용도{Biomarkers for predicting the prognosis of neurodegenerative diseases comprising miRNA and uses thereof}
본 발명은 미세아교세포의 포식인자인 NCKAP1 유전자의 발현을 조절할 수 있는 miRNA-214 및 miRNA-34c를 포함하는 신경퇴행성 질환 예후예측용 마커 조성물, 신경퇴행성 질환 예후예측용 키트 및 정보제공방법에 관한 것이다.
신경계 퇴행성질환(Neurodegenerative Disease)은 신경구조와 기능 상실에 의해 운동조절능력, 인지기능, 지각 기능, 감각기능 및 자율신경의 기능 이상을 유발하는 질환으로, 전 세계적으로 인구 고령화가 빠르게 진행되면서 루게릭병(근위축성 축삭경화증, Amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD) 및 파킨슨병(Parkinson's disease, PD) 등의 신경계 퇴행성질환 환자가 빠르게 증가하고 있다. 이러한 신경계 퇴행성질환은 일단 손상되거나 사멸되고 나면 복구와 재생이 어려운 신경세포의 특성 때문에 중대한 후유증을 남기면서 정상 상태로 회복되지 못하고 계속 악화되면서 진행하는 경우가 많다. 따라서 이를 해결하고자 지난 수십 동안 국내외에서 연구가 활발히 진행되어 왔으나, 정확한 발병 원인조차 제대로 파악하지 못하고 있는 실정이다. 이러한 특성 때문에 대부분의 신경계 퇴행성질환들은 현재 치료기술로는 완치가 불가능하며, 주로 진행속도를 조절하여 증상을 완화시키기 위한 신경염증 및 전달 과정을 표적으로 하는데 초점을 맞추고 있다. 따라서, 신경계 퇴행성질환의 신규 치료 표적 및 치료제 개발이 시급한 실정이며, 상기 질환을 보다 조기에 진단하고 예후를 예측할 수 있는 마커의 발굴 또한 중요한 과제이다.
과거에는 신경계 퇴행성질환의 병리소견상 관찰되는 신경교세포(neuroglial cell)의 증식, 면역-염증에 관련된 세포 및 면역매개 물질의 침윤 등은 신경세포의 파괴에 따른 비특이적인 이차적 현상으로만 받아들여져 왔다. 그러나, 분자생물학의 발전으로 면역-염증 기전(immune-inflammatory mechanism)에 중요한 역할을 하는 세포들의 표피지표에 대한 동정이 가능해졌고, 면역-염증매개 물질들의 정체 및 기능들이 규명됨에 따라 면역-염증 기전이 신경계 손상에 대한 비특이적인 이차적 반응만이 아니고 신경계 퇴행성 질환의 진행경과 중 초기부터 관여할 수도 있으며, 병리현상의 완급을 조절하고 신경세포의 생존 및 사멸에 관여할 수 있다는 증거들이 제시되고 있다.
한편, 미세아교세포(Microglia)는 신경계 퇴행성질환의 신경염증에 영향을 주는 주요세포로서 시냅스 리모델링, 다양한 신경성장인자의 분비, 뇌에 축적되는 다양한 찌꺼기(debris)를 제거하여 뇌의 신경세포 보존(neuronal integrity)과 사멸에 관여함으로써 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 하고 있다. 최근 논문에 따르면 정상적인 환경에서는 이러한 미세아교세포의 기능이 잘 조절되지만, 신경계 퇴행성질환에서는 다양한 비접힘 또는 응집 단백질에 의해 미세아교세포가 활성화되며(예로, 알츠하이머병을 유발하는 amyloid-β, α-synuclein, 루게릭병 을 유발하는 SOD1, 측두엽 치매를 유발하는 TDP-43 등), 더불어 수적 변화와 기능 이상이 염증반응의 자극제로 작용하여 신경염증을 유발하여 신경계 퇴행성질환의 발생 및 질병 진행 정도에 영향을 준다고 밝혀지면서 신경계 퇴행성질환에서 미세아교세포의 손실 또는 기능 이상 현상이 강조되고 있다. 따라서 기존의 치료방법 이외에 미세아교세포의 기능 조절을 통한 신경계퇴행성 질환 치료에 관심이 집중되고 있다.
마이크로 RNA(MicroRNA, miRNA)는 약 22개의 뉴클레오타이드로 구성된 작은 RNA 분자로 타겟 mRNA의 파쇄 또는 해독단계에서의 억제를 통하여 유전자 발현을 조절한다. miRNAs는 다양한 생리학적 현상 및 질환에 관여를 하며, 중추신경계에서, miRNA 생성의 주요한 조절자인 Dicer가 소실되면 신경퇴화가 유도되는데, 이는 균형있는 miRNAs 발현이 신경계에서 중요한 역할을 한다는 것을 보여준다. miRNA는 혈액 및 기타 체액에서 검출 가능하고 안정적인 수준에서 발견되며, 질병의 진단 또는 예후 목적으로 이용되고 있다. 현재까지 많은 연구에서 CSF를 포함한 다양한 생체 유체와 혈액 유래 성분 혈장 및 혈장(plasma)의 대조군과 비교할 때 ALS 환자에서 miRNA가 차별적으로 발현되는 것으로 보고되면서, ALS의 병인에 대한 이해를 넓히기는 하지만, ALS에서 miRNAs를 질병 예후 예측 및 직접적인 치료 용도로 활용하는 것은 아직까지 시도된 바가 없다.
따라서 본 발명은 신경계 퇴행성질환의 미세아교세포 포식능 조절인자인 NCKAP1 유전자의 발현을 조절하는 혈액내 miRNA를 활용한 신경퇴행성 질환의 예후를 예측할 수 있는 바이오 마커를 개발하고자 한다.
상기와 같은 배경하에, 본 발명자들은 신경퇴행성 질환의 예후를 예측할 수 있는 바이오마커를 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 본 발명의 miRNA가 미세아교세포의 포식능 조절인자인 NCKAP1 유전자의 발현을 조절하는 방법을 통해 신경퇴행성 질환의 예후를 예측할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 miRNA-214 및 miRNA-34c로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 마커 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 miRNA-214 및 miRNA-34c로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 키트를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 miRNA-214 및 miRNA-34c로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 miRNA-214 및 miRNA-34c로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 마커 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 miRNA-214는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 miRNA-34c는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 헌팅턴병, 루게릭병으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 miRNA-214 및 miRNA-34c는 NCKAP1(Nck-associated protein 1)의 발현을 억제하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 miRNA-214 및 miRNA-34c로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 microRNA의 발현수준을 측정하는 제제는 상기 microRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 miRNA-214는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 miRNA-34c는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 헌팅턴병, 루게릭병으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 miRNA-214 및 miRNA-34c로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 정보제공방법은 상기 miRNA-214 및 miRNA-34c로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현수준이 높게 나타나는 경우 신경퇴행성 질환이 빠르게 진행되고 있다고 판정하는 단계를 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 miRNA-214는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 miRNA-34c는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 miRNA-214 및 miRNA-34c의 발현수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것일 수 있다.
본 발명에서는 미세아교세포의 포식조절인자인 NCKAP1을 조절할 수 있는 miRNA인 miRNA-214 및 miRNA-34c가 미세아교세포 및 혈장에서 발현되었는지 확인함으로써 신경퇴행성 질환의 예후를 예측할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 miRNA는 신경퇴행성 질환 환자의 예후를 예측할 수 있기에, 예후 예측 및 환자 맞춤형 치료전략 수립 등에 유용하게 활용될 것으로 기대된다.
단, 본 발명의 효과는 상기 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1a는 NCKAP1 유전자에 대한 miRNA-214-3p 및 miRNA-34c-3p의 결합 부위를 나타낸 것이다.
도 1b는 miRNA-214-3p 및 miRNA-34c-3p의 유사체 및 억제제를 처리했을 때, 변화하는 NCKAP1의 단백질 수준을 나타낸 결과이다.
도 1c은 루게릭병 환자 유래 미세아교세포 및 혈장에서 본 발명 miRNA와 NCKAP1의 mRNA 발현 수준의 상관성을 분석한 것으로서, 도 1c의 A는 miRNA-214-3p와 NCKAP1의 상관성을 확인한 것이고, 도 1c의 B는 miRNA-34c-3p와 NCKAP1의 상관성을 확인한 결과이다.
도 2는 루게릭병 환자의 진행속도에 따른 환자 유래 미세아교세포(Induced microglia-like cells, iMGs)의 miRNA 발현 수준을 측정한 것으로서, 도 2의 A는 miRNA-214-3p의 발현 수준을 확인한 것이고, 도 2의 B는 miRNA-34c-3p의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 3은 루게릭병 환자의 진행속도에 따른 환자 혈장(plasma)의 miRNA 발현 수준을 측정한 것으로서, 도 3의 A는 miRNA-214-3p의 발현 수준을 확인한 것이고, 도 3의 B는 miRNA-34c-3p의 발현 수준을 확인한 결과이다.
도 4는 루게릭병 환자의 환자 유래 미세아교세포 및 혈장에서 본 발명 miRNA인 miRNA-214-3p 및 miRNA-34c-3p 발현간의 상관성이 있는지 여부를 확인한 결과이다.
도 5는 루게릭병 환자의 혈장내 본 발명 miRNA의 발현 수준과 delta-FS 값과의 비교를 통해 루게릭병 진행속도의 상관성을 확인한 것으로서, 도 5의 A는 miRNA-214-3p, 도 5의 B는 miRNA-34c-3p와의 상관성을 확인한 결과이다.
도 6은 루게릭병 환자의 혈장내 miRNA-214-3p의 발현 수준과 루게릭병 진행속도와의 상관관계를 재검증한 결과(in validation set)로서, 도 6의 A는 루게릭병 환자의 진행속도별 그룹에 따라 miRNA-214-3p의 발현 수준을 재확인한 것이고, 도 6의 B는 루게릭병 환자에서 miRNA-214-3p의 발현 수준과 루게릭병 진행속도의 상관성을 재확인하기 위해 delta-FS와 비교한 결과이다.
본 발명자들은 본 발명의 미세아교세포의 포식조절인자인 NCKAP1 유전자의 발현을 조절할 수 있는 miRNA인 miRNA-214 및 miRNA-34c의 미세아교세포 및 혈장에서 발현을 통해 퇴행성뇌질환의 예후를 예측할 수 있음을 확인하였는바, 이로써 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명은 miRNA-214 및 miRNA-34c로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 마커 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 miRNA-214 및 miRNA-34c로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 조성물 및 이를 포함하는 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에서 발굴한 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 바이오마커인 상기 miRNA-214는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 이때, 상기 서열번호 1로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 발굴한 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 바이오마커인 상기 miRNA-34c는 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 이때, 상기 서열번호 2로 표시되는 염기서열과 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "신경퇴행성 질환"은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 헌팅턴병, 뇌졸중, 뇌경색, 피크(Pick)병, 두부외상, 척수손상, 뇌동맥 경화증, 루게릭병, 다발성 경화증, 노인성 우울증 또는 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob disease)일 수 있고, 바람직하게는 파킨슨병, 치매, 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 헌팅턴병, 루게릭병일 수 있고, 보다 바람직하게는 루게릭병 또는 알츠하이머병일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어 "NCKAP1(Nck-associated protein 1)"은 기능이상이 생기는 경우 신경퇴행성 질환으로 발전할 수 있는 미세아교세포의 포식능 조절인자이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예후(prognosis)"는 병세의 진행, 경과 및 회복에 관한 예측을 의미하고, 질병의 전이 여부, 진행 속도, 무병 생존율, 생존율 등을 의미하는 것일 수 있고, 바람직하게는 질병의 진행 속도에 관한 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 miRNA-214 또는 miRNA-34c의 발현수준을 측정하는 제제는 상기 microRNA의 각각에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프라이머"란 DNA 합성의 기시점이 되는 짧은 유전자 서열로써, 진단, DNA 시퀀싱 등에 이용할 목적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머들은 통상적으로 15 내지 30 염기쌍의 길이로 합성하여 사용할 수 있으나, 사용 목적에 따라 달라질 수 있으며, 공지된 방법으로 메틸화, 캡화 등으로 변형시킬 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "프로브"란 효소 화학적인 분리정제 또는 합성과정을 거쳐 제작된 수 염기 내지 수백 염기길이의 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 핵산을 의미한다. 방사성 동위원소, 효소, 또는 형광체 등을 표지하여 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있으며, 공지된 방법으로 디자인하고 변형시켜 사용할 수 있다.
본 발명의 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.
예컨대, 본 발명의 키트는 PCR을 수행하기 위해, 분석하고자 하는 시료로부터 유래된 게놈 DNA, 본 발명의 마커 유전자에 대해 특이적인 프라이머 세트, 적당량의 DNA 중합 효소, dNTP 혼합물, PCR 완충용액 및 물을 포함하는 키트일 수 있다. 상기 PCR 완충용액은 KCl, Tris-HCl 및 MgCl2를 함유할 수 있다. 이외에 PCR 산물의 증폭 여부를 확인할 수 있는 전기영동 수행에 필요한 구성 성분들이 본 발명의 키트에 추가로 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머레이즈 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명의 miRNA가 신경퇴행성 질환 환자의 진행속도를 예측할 수 있는 지표로 활용될 수 있다는 사실을 확인하였다.
보다 구체적으로 본 발명의 일실시예에서는, 본 발명의 miRNA인 miRNA-214 또는 miRNA-34c의 발현수준을 통해 신경퇴행성 질환 환자의 질병 진행속도를 예측할 수 있다는 사실을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 본 발명 miRNA의 신경퇴행성 질환 예후예측 효과를 확인하기 위한 재검증을 수행하였는데, 이 때에도 본 발명의 miRNA인 miRNA-214 및 miRNA-34c의 발현 수준을 확인함으로써, 신경퇴행성 질환 환자의 질병 진행속도를 예측할 수 있다는 사실을 재차 검증할 수 있었다(실시예 4 참조).
따라서 상기 결과들은 본 발명 miRNA들의 신경퇴행성 질환 환자에 대한 예후예측 효과 및 이의 용도를 입증하는 것이다.
이에 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 피검체 유래의 생물학적 시료에서 miRNA-214 및 miRNA-34c로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 피검체 유래의 생물학적 시료는 조직, 세포, 전혈, 혈액, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨 등을 포함할 수 있고, 바람직하게는 세포 또는 혈장일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 방법에 따라 피검자 유래 시료에서 miRNA-214 및/또는 miRNA-34c의 발현수준이 비교군인 신경퇴행성 질환 환자의 발현 수준보다 높은 경우, 비교군인 환자군 보다 신경 퇴행성 질환이 빠르게 진행되고 있음을 판정할 수 있다.
상기 microRNA의 발현수준은 당업계에 알려진 통상적인 방법으로 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법을 통해 측정될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험준비 및 실험방법
1-1. 분석 대상 모집
① 신경퇴행성 질환의 예후를 예측할 수 있는 miRNA를 발굴해내기 위하여, 신경퇴행성 질환 중 하나인 루게릭병 환자의 혈액을 활용한 미세아교세포의 유도 방법을 활용하였으며, 이는 2015년 9월과 2017년 7월 사이에 본 실험의 대상인 5명의 건강한 지원자와 29명의 루게릭병 환자(느린 진행 환자군 14명, 빠른 진행 환자군 15명)를 대상으로 한 HY-ALS의 의료 데이터에 나타난 진행 속도의 평균값(ΔFS = 0.75)을 기준으로 하여, 기준을 초과하는 FS값을 가지는 경우 빠른 진행 환자군(Rapid-ALS), 기준 이하의 FS값을 가지는 경우 느린 진행 환자군(Slow-ALS)로 분류하였다. 1년 이상의 추적기간 동안 환자의 의료기록을 검토하여, 연령, 성별, ALS 가족력, 증상 발병, 질병 기간, ALS 기능 등급 척도(ALS functional rating scale-revised, ALSFRS-R) 점수를 얻었으며, 구체적인 정보는 하기 표 1에 나타내었다.
Characteristic Rapid-ALS Slow-ALS Controls
Number of subjects 15 14 5
Male: Female, n 9:6 8:6 3:2
Onset age, yr 55.6 (6.0) 49.9 (6.6) ―
Age at diagnosis, yr 56.2 (6.1) 52.4 (7.0)
ALSFRS-R at diagnosis 36.5 (3.8) 42.4 (3.7) ―
Age at sampling time for iMG, yr 56.7 (5.9) 54.6 (8.1) 32.0 (4.8)
ALSFRS-R at sampling time for iMG model 27.7 (7.6) 37.9 (8.3) ―
Disease duration (from onset to sampling time) a , mo 13.7 (6.2) 53.0 (54.9) ―
Delta-FS (from onset to sampling time) b , point/mo 1.6 (0.6) 0.2 (0.1) ―
Family history of amyotrophic lateral sclerosis, n (%) 0 (0%) 0 (0%) 0 (0%)
데이터는 연속 변수(continuous variables)의 경우 평균(표준편차)로 나타내었고, 범주형 변수(categorical variables)의 경우 n(%)로 나타내었다.
a Disease duration: 질병 발병에서 채혈까지의 기간.
b진행 수준은 delta FS((진단시 48 - ALSFRS-R 점수)/(발병 후 진단까지의 기간(월)))로 정의하였고, 루게릭병 환자는 하기와 같은 기준으로 카테고리화 하였다: 느리게 진행되는 그룹(Slow, delta FS ≤ 0.75), 빠르게 진행되는 그룹(Rapid, delta FS > 1.0).
1-2. 유도 미세아교세포(Induced microglia-like cells, iMGs)의 제작
유도 미세아교세포의 제작은 기존에 공개된 Ohganani(Ohgidani M, et al. Sci Rep 2014, 4:4957.)의 방법을 통해 수행되었고, 구체적으로는 상기 실시예 1-1의 환자의 혈액을 채혈한 다음, Ficoll(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)를 활용한 밀도 구배 원심 분리를 통해 말초혈액단핵 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 분리해 내었고, 이렇게 분리한 말초혈액단핵세포는 미세아교세포의 모델링을 위해 10 %의 소태아혈청(Fetal Bovine Serum, FBS) 및 1 %의 antibiotic/antimycotic(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 포함하는 표준 배양조건(37 ℃, 5 %의 CO2)의 RPMI-1640 배지에서 500,000 cells/ml의 밀도로 하루 배양한 다음, 부착 세포(단핵구)를 1% antibiotic/antimycotic, 10 ng/ml recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF) 및 100 ng/ml recombinant human interleukin-34(IL-34)이 보충된 RPMI-1640 Glutamax(Gibco, Waltham, MA)에서 21일 동안 배양하였다.
1-3. 본 발명의 miRNA 유사체 및 억제제 제작
미세아교세포의 포식 조절능이 있어 신경퇴행성 질환의 예후를 예측할 수 있을 것으로 예상되는 miRNA인 miRNA-214(miRNA-214-3) 및 miRNA-34c-3p의 유사체(mimic)와 억제제(inhibitor)를 Bioneer Corporation(Daejeon, Korea)에서 합성하였고 negative control로 사용하기 위하여 miRNA-214-5p 또한 Bioneer Corporation에서 제조하여 사용하였다, 합성한 올리고뉴클레오티드의 구체적인 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
miRNA Primer sequence
miR-214-3p mimic 5′-UGCCUGUCUACACUUGCUGUGC-3
miR-34c-3p mimic 5′-AAUCACUAACCACACGGCAGG-3′
miRNA mimic negative control #1 Bioneer Corporation, Korea, #SMC-2003
miR-214-5p inhibitor 5′-UGCCUGUCUACACUUGCUGUGC-3′
miR-214-3p inhibitor 5′-ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU-3′
miR-34c-3p inhibitor 5′-AAUCACUAACCACACGGCCAGG-3′
miRNA inhibitor negative control #1 Bioneer Corporation, Korea, #SMC-2103
상기 올리고뉴클레오티드의 형질전환의 대상이 되는 HeLa 세포는 10 % FBS(Gibco), 중탄산 나트륨(sodium bicarbonate), 피루브산 나트륨(sodium pyruvate)(sigma) 및 항생제들이 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's 배지에서 배양하였고, 합성된 상기 miRNA 유사체, 억제제 및 음성 대조군 miRNA는 Lipofectamine® RNAiMAX(Invitrogen)를 제조사의 지침에 따라 50 nM의 miRNA 유사체, 억제제 또는 대조군을 3 x 105 cells/well의 밀도로 플레이팅된 HeLa 세포에 처리하여 형질전환 시켰다.
1-4. 면역블롯팅(Immunoblotting)
단백질 검출을 위한 면역블롯팅은 각각 동일한 양의 단백질(40 μg)을 10 % SDS-PAGE로 분리한 다음, PVDF 막(GE Healthcare)으로 옮겼으며, PVDF 막은 5 %의 탈지유로 차단시킨 다음, 1차 항체와 함께 배양하였다. 막을 0.05 % Tween-20을 함유하고 있는 Tris 완충 식염수로 세척하고, HRP(horseradish peroxidase)-접합 2차 쥐 항체 또는 토끼 항체(Amersham Pharmacia Biotech)를 처리한 다음, ECL(enhanced chemiluminescence) 검출을 수행하였다.
1-5. 혈장 miRNA 분석
혈장의 miRNA 분석하기 위해 625 μl의 혈장 샘플을 제조업자의 지침(Ambion, Austin, TX)에 따라 mirVana miRNA 분리 키트를 사용하여 small RNA가 풍부한 분획을 추출하였고, 내생 대조군(endogenous controls)과 hsa-miR-214-3p(4427975, ID002306) 및 hsa-miR-34c-3p(4427975, ID 241009_mat)는 Life Technologies사의 제품을 활용하여 준비하였다.
1-6. 실시간 중합효소연쇄반응(quantitative real time polymerase chain reaction)
Trizol 시약(Invitrogen)을 사용하여 total RNA를 추출한 다음, NanoDrop 2000 분광 광도계(Thermo Scientific, ND-2000)을 사용하여 확인하였다. cDNA는 coDryTM cDNA 키트(Clontech, CA, USA)를 사용하여 합성하였고, cDNA는 95 ℃에서 10분 동안 Applied Biosystems Step One PlusTM 시스템(Life Technologies)에서 프라이머와 함께 Power SYBR Green PCR Master Mix를 사용하여 증폭시킨 다음, 95 ℃에서 15 초, 60 ℃에서 1 분을 1 사이클로 하여 40 사이클을 반복하였다. 상기 증폭의 특이성을 관찰하기 위해 용융 곡선(melting curve) 분석을 수행하였으며, 상대적 수량(relative quantity, RQ) 수준은 GAPDH를 내부 표준 대조군으로 사용하여 2-△△Ct 방법으로 계산하였다. 상기 실험의 결과는 3번의 독립적인 실험을 기반으로 도출되었으며, 프라이머는 NCKAP1(Qiagen, PPH15666A) 및 GAPDH(Qiagen, PPH00150F)를 사용하였다.
1-7. 통계 분석
데이터는 평균 ± 표준편차로 표시되었으며, 그룹간의 통계적 유의성은 t-test 및 일원 분산 분석을 수행하였고, Prism 9(GraphPad Software, San Diego, CA)를 활용하여 Tukey 사후 분석을 수행하였다. 데이터의 유의성은 * p <0.05, ** p <0.01 및 *** p <0.001로 나타내었으며, 사후 분석에서 피어슨 상관 계수(Pearson Correalation Coefficient, PCC)를 활용하여 p-value를 얻었다.
실시예 2. 신경퇴행성 질환 예후 예측용 miRNA의 발굴
2-1. 본 발명 miRNA들의 NCKAP1 조절능 확인
미세아교세포의 포식능을 조절을 통해 신경퇴행성 질환의 예후를 예측할 수 있을 것으로 예상되는 본 발명의 miRNA인 miRNA-214-3p 및 miRNA-34c-3p는 도 1a에 나타낸 바와 같이, 미세아교세포의 포식능을 조절하는 역할을 담당하고 있는 NCKAP1에 결합하여 조절할 수 있는 seed site를 가지고 있는 것을 확인하였다. 상기 본 발명의 miRNA들의 유사체(miR-214-3p 및 miR-34c-3p) 및 miRNA 억제제(miRNA-214-5p inhibitor, miRNA-214-3p inhibitor 및 miRNA-34c-3p inhibitor)를 유도 미세아교세포에 형질전환 시킨 다음, NCKAP1의 단백질 발현 수준을 관찰한 결과, 본 발명의 miRNA 유사체는 NCKAP1의 발현 수준을 억제하나, 본 발명의 miRNA 억제제는 NCKAP1의 발현을 증진시킬 수 있다는 사실을 확인하였다.
또한, 상기 결과를 구체적으로 확인하기 위하여, 미세아교세포에서의 포식능 조절인자인 NCKAP1의 mRNA 발현양과 루게릭병 환자 유래 미세아교세포 및 혈장에서 측정한 본 발명의 miRNA 발현의 상관성을 분석한 결과, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 miRNA들은 루게릭병 환자 유래 미세아교세포 뿐만 아니라, 혈장에서도 음의 상관관계를 보여줌을 확인할 수 있었고, 이를 통해 본 발명자들은 본 발명 miRNA들의 루게릭병 진행속도 예측 효과는 미세아교세포의 포식능 조절인자인 NCKAP1의 조절을 통해 이루어진다는 사실을 확인할 수 있었다.
2-2. 신경퇴행성 질환 환자의 예후에 따른 본 발명 miRNA들의 발현 수준 확인
① 정상인 환자군과, 느린 루게릭병 진행속도를 가진 환자군(ASL(S)) 및 빠른 루게릭병 진행속도를 가진 환자군(ASL(R))들의 유도 미세아교세포에서 본 발명 miRNA 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 느린 진행속도를 보여주는 환자군에 비해서, 빠른 진행속도를 보여주는 환자군의 유도 미세아교세포에서 본 발명의 miRNA인 miRNA-214-3p 및 miRNA-34c-3p의 발현이 모두 증가했음을 확인할 수 있었다.
② 정상인 환자군과, 느린 루게릭병 진행속도를 가진 환자군(ASL(S)) 및 빠른 루게릭병 진행속도를 가진 환자군(ASL(R))들의 혈장에서 본 발명 miRNA 발현 수준을 qRT-PCR을 통해 확인하였다. 그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이, 느린 진행속도를 보여주는 환자군에 비해서, 빠른 진행속도를 보여주는 환자군의 혈장에서 본 발명의 miRNA인 miRNA-214-3p 및 miRNA-34c-3p의 발현이 모두 증가했음을 확인할 수 있었다.
본 발명자들은 상기와 같은 결과를 통해 본 발명의 miRNA는 신경퇴행성 질환의 예후에 따라서 그 발현 수준이 상이함을 확인한바, 본 발명의 miRNA가 신경퇴행성 질환의 예후를 예측함에 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.
2-3. 본 발명 miRNA들의 발현간의 상관성 확인
상기 2-2에서 확인한 데이터를 토대로 루게릭병 환자 유래 미세아교세포 및 혈장에서 측정한 본 발명의 miRNA의 발현간의 상관관계를 확인하였다. 그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 miRNA인 miRNA-214-3p 및 miRNA-34c-3p의 발현 수준간에는 양의 상관관계가 있다는 사실을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 본 발명 miRNA의 신경퇴행성 질환에 대한 예후예측 효과 검증
본 발명의 miRNA의 신경퇴행성 질환 예후예측 효과를 검증하기 위하여, 본 발명 miRNA의 루게릭병 환자의 혈장내 발현 수준과 질병 진행속도를 나타내는 지표인 delta-FS를 비교하여 상관성을 확인하였다. 그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이 본 발명의 miRNA인 miRNA-214-3p 및 miRNA-34c-3p는 질병 진행속도가 증가함에 따라(delta-FS 값이 증가함에 따라), 높은 상대적 발현 수준을 보여줌을 확인할 수 있었고, 이에 따라 본 발명의 miRNA들을 활용하면 신경퇴행성 질환의 진행속도를 예측할 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 본 발명 miRNA의 발현과 신경퇴행성 질환 진행속도의 상관성 재검증
4-1. 재검증을 위한 분석대상 모집
상기 실시예 2 및 3의 결과가 유효한지 여부를 확인하기 위한 재검증(validation test)을 수행하였다. 재검증은 2014년 6월부터 2016년 5월까지 ALS/MND registry database를 초기에 방문한 환자 중, ALS 기능 등급 척도가 6개월 이상 등록된 사람인 132명의 루게릭 환자 및 30명의 건강한 사람을 대상으로 이루어졌다. 환자군은 등록된 ALS 질병진행속도의 데이터를 기준으로 하여 4개의 그룹으로 나누었고(Q1, Q2, Q3 및 Q4), 구체적인 환자 데이터는 하기 표 3에 나타내었다.
Characteristic Rapid-ALS (Q1) Intermediate-ALS (Q2, Q3) Slow-ALS (Q4) Total-ALS Controls
Number of subjects 32 67 33 132 30
Male: Female, n 21:11 39:28 16:17 76:56 15:15
Onset age, yr 60.7 (8.9) 57.9 (11.0) 56.6 (10.9) 58.2 (10.5) ―
Age at bio-banking, yr 61.6 (9.0) 59.3 (10.9) 59.0 (11.1) 59.8 (10.5) 59.6 (6.4)
ALSFRS-R at bio-banking 36.3 (5.6) 38.7 (5.3) 41.2 (4.5) 38.8 (5.4) ―
Duration (from onset to bio-banking) a , mo 10.3 (8.0) 16.4 (14.0) 28.4 (33.2) 17.9 (20.6) ―
Delta-FS (from onset to bio-banking) b , point/mo 1.4 (0.8) 0.8 (0.5) 0.4 (0.2) 0.8 (0.7) ―
Age at follow up time (at least more than 6 months later after bio-banking), yr 62.2 (9.0) 60.0 (10.8) 59.6 (11.2) 60.4 (10.5) ―
ALSFRS-R at follow up time (from bio-banking to follow up) 19.1 (9.4) 31.5 (6.3) 39.4 (4.5) 30.5 (9.9) ―
Duration (from bio-banking to follow up) c , mo 6.7 (1.1) 7.9 (2.8) 7.4 (1.7) 7.5 (2.3) ―
Delta-FS (from bio-banking to follow up) d , point/mo 2.6 (1.0) 0.9 (0.3) 0.2 (0.1) 1.2 (1.0) ―
데이터는 연속 변수(continuous variables)의 경우 평균(표준편차)로 나타내었고, 범주형 변수(categorical variables)의 경우 n(%)로 나타내었다.
a duration: 질병 발병에서 바이오뱅크에 등록할 때 까지의 시간.
b진행률은 delta FS((바이오 뱅킹에 등록했을 때 48-ALSFRS-R 점수)/(바이오 뱅킹에 등록하기 까지 경과한 시간(월)))로 정의하였다.
c duration: 바이오 뱅킹 등록 후, 후속 조치까지의 기간(바이오 뱅킹 등록 후 최소 6개월 이상 경과)
d진행 속도수준은 delta FS로 정의하였고, 루게릭병 환자는 하기와 같은 기준으로 카테고리화 하였다: 느리게 진행되는 그룹(Q4: delta FS ≤0.75), 중간 속도로 진행되는 그룹(Q2, Q3: 0.46 ≤ delta FS ≤ 1.45), 빠르게 진행되는 그룹(Q1: delta FS > 1.45).
이 연구는 세계 의학 협회의 헬싱키 선언에 따라 수행되었고, 한양 대학교 병원 윤리위원회의 승인(HYUH IRB 2013-06-012, 2017-01-043)을 받아 진행하였다.
4-2. 본 발명의 miRNA와 신경퇴행성 질환 예후예측의 상관성 재검증
상기 실시예 4-1의 재검증을 위한 새로운 환자군의 혈장내 miRNA-214-3p의 발현 수준과 신경퇴행성 질환 진행속도와의 상관성 분석을 delta-FS 값과의 비교를 통해 수행하였다. 그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 기존의 결과와 동일하게 본원발명의 miRNA-214-3p가 delta-FS 값이 증가함에 따라 양의 상관관계를 보여줌을 확인할 수 있었다.
본 발명자들은 상기와 같은 결과를 통해 본원발명의 miRNA-214-3p 및 miRNA-34c를 활용하여 신경퇴행성 질환의 예후를 예측할 수 있음을 재확인하였다.
상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Claims (16)

  1. miRNA-214(microRNA-214) 및 miRNA-34c(microRNA-34c)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 마커 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA-214는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA-34c는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 헌팅턴병, 루게릭병으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 miRNA-214 및 miRNA-34c는 NCKAP1(Nck-associated protein 1)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는, 마커 조성물.
  6. miRNA-214 및 miRNA-34c로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 microRNA의 발현수준을 측정하는 제제는 상기 microRNA에 상보적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머, 또는 프로브인 것을 특징으로 하는, 예후 예측용 조성물.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 miRNA-214는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 예후 예측용 조성물.
  9. 제6항에 있어서,
    상기 miRNA-34c는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 예후 예측용 조성물.
  10. 제6항에 있어서,
    상기 신경퇴행성 질환은 파킨슨병, 치매, 알츠하이머병, 전두측두엽 치매, 헌팅턴병, 루게릭병으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 예후 예측용 조성물.
  11. 제6항의 조성물을 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예후 예측용 키트.
  12. 피검체 유래의 생물학적 시료에서 miRNA-214 및 miRNA-34c로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현수준을 측정하는 단계를 포함하는, 신경퇴행성 질환의 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 정보제공방법은 상기 miRNA-214 및 miRNA-34c로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 발현수준이 높게 나타나는 경우 신경퇴행성 질환이 빠르게 진행되고 있다고 판정하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  14. 제12항에 있어서,
    상기 miRNA-214는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  15. 제12항에 있어서,
    상기 miRNA-34c는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
  16. 제12항에 있어서,
    상기 miRNA-214 및 miRNA-34c의 발현수준은 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing; NGS), 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray), 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방법을 통해 측정되는 것을 특징으로 하는, 정보제공방법.
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