KR20220151285A - 두충 발효 포접체 추출물을 이용한 근 기능 증진 조성물 - Google Patents

두충 발효 포접체 추출물을 이용한 근 기능 증진 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 두충(Eucommia ulmoides)의 발효 포접체 추출물을 이용한 근 기능 증진 조성물을 개시한다. 상기 발효 포접체 추출물은 두충(Eucommia ulmoides), 아쉬아간다(Ashwagandha) 및 야생 참마(Dioscorea)를 이용한 고상의 건조물에 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중에서 선택된 1종 이상의 발효균주를 접종하여 수득된 발효물을 포접시킨 형태로 얻어진 것으로, 이를 알코올로 추출하여 근 기능 증진 효과를 제공한다.

Description

두충 발효 포접체 추출물을 이용한 근 기능 증진 조성물 {MUSCLE FUNCTION COMPOSITION USING BACTERIA FERMENTATION-INCLUSION EXTRACT OF EUCOMMIA ULMOIDES}
본 발명은 두충의 발효 포접체 추출물을 이용한 근 지구력 증가, 근력 강화, 근육 감소증 예방 또는 개선, 체력 향상, 항피로, 또는 운동능력 향상능을 발현할 수 있는 조성물에 관한 것이다.
두충(Eucommia ulmoides)은 두충나무과(Family Eucommiaceae) 두충속(genus Eucommia)에 속하는 두충(E. ulmoides Oliv.)의 줄기껍질로서 주피를 제거한 것이다. 두충은 '신농본초경' 중편에 수록된 본초로, 약물로 사용된 역사가 가장 오래된 본초 중 하나로써,'본초강목'에서는 두충이 신, 골 및 건을 강화한다고 기록되어 있으며, 현대의 중국약전에는 두충의 줄기와 수피를 고혈압, 요통 및 좌골신경통에 사용한다고 나와있다. 한국 및 일본에서는 두충의 잎을 약용 및 음료로 사용했는데, 최근에는 두충의 수꽃(웅꽃)을 차로 마시고 있다. 두충의 주요 활성성분은 lignans와 iridoids이며, 이외에도 Phenolics, Steroid, terpenoids, Flavonoids 등의 성분이 두충에 함유되어 있다. 즉, 다양한 미네랄 및 활성단백질을 가진 식물로 특히 지방을 분해하는 콜라겐 성분이 다량 함유되어 있어 관절염, 부종해소, 혈액순환 촉진식품으로 널리 이용되고 있다.
아쉬와간다(식물학적 용어; Withania somnifera and Physalis flexuosa ; 다른 속명:winter cherry, Ashgandh, Achuvagandi, Amillira-gadday, Amlulang-kalang, Amukkira-kilzhangu, Amukran-kizhangu, Asagandha, Asana, Asgandh, Asundha, Asvagandghi, Fatarfoda, Hirimaddina-gadday, Hirre-gadday, Penneroo-gadda, Pevette,Sogade-beru, Indian ginseng)는 인도, 파키스탄, 쓰리랑카가 원산지인 직립한 가지가 나온 관목이다. 아쉬와간다는 이완, 골수, 여성의 건강(안정된 태아와 호르몬의 생산 같은)을 촉진하고, 최음제로 기억력과 집중력 같은 정신 건강을 강화하고, 호흡곤란과 이뇨제와 마찬가지로 피로, 스트레스, 기침, 불임, 조직 염증, 암, 전염성 질병, 불안 질환, 공황 발작, 류머티즘, 관절염, 통증, 조울증, 알코올성 망상증, 정신분열증, 열, 불면증, 불임, 노화, 피부 염증과 질환, 알코올 중독, 알츠하이머 질병, 빈혈, 부스럼, 회복, 병으로 인한 쇠약, HIV 서포트, AIDS, 면역 체계 문제, 요통, 다발성 경화증, 근육 에너지 손실, 중풍, 피부 고통, 부풀어 오른 분비 기관, 궤양을 치료하는데 유용하다.
야생 참마(Dioscorea)는 마과의 참마(Dioscorea japonica Thunb)의 뿌리로, 참마는 원산지가 한국으로 기후가 아주 추운 산간지대를 제외하고는 전국 산지에 분포를 하고 있으며, 덩굴성의 다년생 초본 식물이다. 잎은 대생하지만 간혹 호생하는 것도 있으며, 엽병이 길고, 길이 5 - 10cm, 폭 2 - 2.5cm로서 긴 타원형 또는 좁은 삼각형이며, 끝이 뾰족하다. 꽃은 자웅이주로서 6 - 7월에 피며, 줄기는 물체에 감기고 많은 가지가 갈라지고, 뿌리는 긴 원주형의 모양을 하고 있다. 한방에서는 예로부터 참마를 동상, 다뇨, 요실금, 피부 습진 등의 치료에 사용하여 왔으며, 최근에는 당뇨병의 치료에도 활용되고 있고, 자양, 강장, 보신 등으로 이용되어온 약재이다. 참마에 함유된 유효 성분으로는 다이오스게인(diosgenin), 비타민 C, 폴리페롤 산화효소(polyphenoloxidase), 당단백질(glycoprotein), 사포닌(saponin) 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 그러나, 야생 참마의 근 기능 증진 성능과 관련하여 문헌 어디에도 개시되거나 공개된 바가 없다.
이에 본 발명자들은 두충과 야생 참마에 대한 연구를 하던 중, 근력, 지구력 등을 비롯한 근 기능 증진 성능을 발현할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국 공개특허 제2015-0127910호
본 발명의 목적은 두충(Eucommia ulmoides)의 발효 포접체 추출물을 이용한 근 지구력 증가, 근력 강화, 근육 감소증 예방 또는 개선, 체력 향상, 항피로, 또는 운동능력 향상능을 동시에 발현하는 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 상기 목적 및 기타 목적들은 하기 설명된 본 발명에 의하여 모두 달성될 수 있다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
두충(Eucommia ulmoides), 아쉬아간다(Ashwagandha) 및 야생 참마(Dioscorea)를 이용한 고상의 건조물에 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중에서 선택된 1종 이상의 발효균주를 접종하여 얻어진 발효물 포접체의 분말이나 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 기능 증진 조성물을 제공한다.
상기 포접체는 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린, 디메틸-β-시클로덱스트린, 트리메틸-β-시클로덱스트린, 2-히드록시메틸-β-시클로덱스트린, 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 3-히드록시프로필-β-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린 술페이트, β-시클로덱스트린 술포네이트 및 β-시클로덱스트린 술포부틸 에테르 중에서 선택된 1종 이상의 수용액으로 포접한 것일 수 있다.
상기 분말 또는 추출물은 포접체의 상등액을 알코올 추출시켜 수득될 수 있다.
상기 포접체의 상등액은 염화제일철, 염화제이철, 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화코발트 및 염화니켈 중에서 선택된 1종 이상의 응집제를 사용하여 응집시킨 포접 응집체의 상등액일 수 있다.
상기 발효균주는 Enterococcus faecium(KCTC 13225) 또는 Lactobacillus plantarum(KCTC 13093)일 수 있다.
상기 근 기능 증진은 근 지구력 증가, 근력 강화, 근육 감소증 예방 또는 개선, 체력 향상, 항피로, 또는 운동능력 향상일 수 있다.
본 발명에 따르면, 근육 강화, 근육 질량 증가, 힘 증가로 인해 근력과 지구력이 개선되고, 근육 감소증 예방 또는 치료가 가능하며, 항피로, 운동 능력 향상능을 동시에 발현하는 두충의 발효 포접체 추출물의 분말이나 추출물을 유효성분으로 하는 근 기능 증진 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 수득된 샘플과 비교예 1 내지 2에서 수득된 샘플 3종에 대해 섭취량에 따른 체중변화를 확인한 그래프이다.
도 2는 실시예 1에서 수득된 샘플과 비교예 1 내지 2에서 수득된 샘플 3종에 대해 지구력 측정결과를 대비한 그래프이다.
도 3은 실시예 1에서 수득된 샘플과 비교예 1 내지 2에서 수득된 샘플 3종에 대해 유전자 발현 정도를 정량화한 그래프이다.
도 4는 실시예 1에서 수득된 샘플과 비교예 1 내지 2에서 수득된 샘플 3종에 대해 혈중 락테이트(Lactate), 카타라아제(Catalase), GPx(Glutathione peroxidase) 활성 농도를 대비한 그래프이다.
도 5는 실시예 1에서 수득된 샘플과 비교예 1 내지 2에서 수득된 샘플 3종에 대해 혈중 크레아틴과 암모니아 농도를 대비한 그래프이다.
이하 본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니되며, 발명자는 발명을 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 점을 감안하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야 한다.
본 발명은 아래의 실시예 및 실험예에서 확인되는 바와 같이, 두충(Eucommia ulmoides), 아쉬아간다(Ashwagandha) 및 야생 참마(Dioscorea)를 이용한 고상의 건조물에 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중에서 선택된 1종 이상의 발효균주를 접종하여 얻어진 발효물 포접체를 제조할 경우 그 분말이나 그 추출물이 근육 강화, 근육 질량 증가, 힘 증가로 인해 근력과 지구력이 개선되고, 근육 감소증 예방 또는 치료가 가능하며, 항피로, 운동 능력 향상능을 동시에 발현하는 것을 확인함으로써 완성된 것이다.
두충 미발효물의 추출물이나 두충액상 발효물의 추출물은 근 기능 증진효과를 충분히 나타내지 않았다.
본 발명의 섭취량에 따른 체중변화, 지구력 측정결과, 유전자 발현 정도(ATP), 혈중 락테이트(Lactate), 카타라아제(Catalase), GPx(Glutathione peroxidase) 활성 농도, 혈중 크레아틴 그리고 암모니아 농도를 이용한 근 기능 증진을 구현하는 조성물은 이러한 실험 결과에 기초하여 제공되는 것으로, 본 발명의 근 기능 증진 조성물은 두충(Eucommia ulmoides)에 아쉬아간다(Ashwagandha)와 야생 참마(Dioscorea)의 1:0.5~1.5:0.5~1.5의 중량비로 혼합한 다음 수득한 고상물(solid phase product)에 발효균주로서 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중에서 선택된 1종 이상의 유산균을 접종하여 얻어진 발효물 포접체의 분말이나 그 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.
본 기재에서 유효성분은 달리 특정하지 않는 한, 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
본 기재에서 상기 발효균주는 104 내지 107 CFG/g, 구체적인 예로 105 내지 106 CFG/g로 첨가한다.
배양 온도는 30 내지 37℃의 통상적인 미생물 배양조건, 그리고 pH는 5 내지 7로 호기적 또는 통상 혐기(anaerobic) 적인 조건으로 배양한다.
본 기재에서 포접체(Inclusion)는 달리 특정하지 않는 한, α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린, 디메틸-β-시클로덱스트린, 트리메틸-β-시클로덱스트린, 2-히드록시메틸-β-시클로덱스트린, 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 3-히드록시프로필-β-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린 술페이트, β-시클로덱스트린 술포네이트 및 β-시클로덱스트린 술포부틸 에테르 중에서 선택된 1종 이상을 수용액으로 포접한 형태를 의미하며, 바람직하게는 원료 특유의 쓴 맛을 제거하고, 용해도와 안정성을 높이며 액상 제형화시 투명성을 높여 제품의 전반적인 품질을 향상시킬 수 있는 β-시클로덱스트린을 사용하는 것이 바람직하다.
상기 포접 전 발효물을 극성 양성자성 용매로 희석한 다음 50 내지 85℃에서 24시간 이하로 교반 등 임의의 방법을 제공할 수 있다.
상기 극성 양성자성 용매는 예를 들어, 물 또는 탄소수 1 내지 3의 알코올을 사용할 수 있고, 용매의 간편한 처리를 고려하여 물을 사용하는 것이 바람직하나, 후술하는 알코올 추출을 고려하여 알코올을 사용하여도 무방하다.
상기 극성 양성자성 용매를 사용한 희석량은 발효 원료 중량 기준으로 30배 이하, 구체적인 예로 1 내지 30배, 또는 10 내지 30배일 수 있다. 이 경우에 발효물을 충분히 희석시킬 수 있고, 이후 투입되는 포접체와 충분한 포접을 일으킬 수 있다.
상기 포접체는 응집제를 투입하여 포접체를 견고하게 한 다음 여과하는 것이 바람직하다.
이때 사용하는 응집제는 일례로 염화제일철, 염화제이철, 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화코발트 및 염화니켈 중에서 선택된 1종 이상의 응집제를 사용할 수 있다. 일례로, 상기 응집제는 0.5%(w/v) 응집제를 전술한 포접용액 전체 부피의 1 내지 5%(v/v) 범위 내로 사용하여 응집시킬 수 있다. 이 경우 발효시간을 늘리지 않으면서 유효성분 증진 효과를 제공할 수 있다.
상기 응집제를 적용한 다음 임의의 공지 방법에 따라 여과 및 원심분리하여 상등액을 추출하며, 이렇게 수득된 상등액으로부터 추출물을 추출할 수 있다.
이때 전술한 상등액(즉, 발효물의 상등액)의 추출물은 달리 특정하지 않는 한, 추출 대상인 발효물 상등액 자체를 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 부탄올 등), 메틸렌클로라이드, 아세톤, 헥산, 에테르, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 디메틸포름아마이드, 디메틸설폭사이드, 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 침출하여 얻어진 추출물, 이산화탄소, 펜탄 등 초임계 추출 용매를 사용하여 얻어진 추출물 또는 그 추출물을 분획하여 얻어진 분획물을 의미하며, 추출 방법은 활성물질의 극성, 추출 정도, 보존 정도를 고려하여 냉침, 환류, 가온, 초음파 방사, 초임계 추출 등 임의의 방법을 적용할 수 있다.
본 기재에서는 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올로 고온 하에 추출하는 것이 최적의 유효성분 추출조건을 제공하기에 적절하다. 이때 고온은 일례로 85℃ 이하, 구체적인 예로 50 내지 80℃일 수 있고, 추출 시간은 이에 한정하는 것은 아니나, 12시간 이하, 구체적인 예로 1 내지 6시간 동안 반복하여 추출할 수 있다. 상기 반복 추출 횟수는 5회 이하, 구체적인 예로 2 내지 3회일 수 있다.
상기 저급 알코올은 이에 특정하는 것은 아니나 60~90% 농도로 사용하는 것이 반응 효율을 고려할 때 바람직하다.
또한, 환류 추출을 진행하여 수증기는 반응기 내로 되돌리고 나머지 가스들은 배출하는 것이 추출효율을 극대화할 수 있어 바람직하다.
분획된 추출물의 경우 추출물을 특정 용매에 현탁시킨 후 극성이 다른 용매와 혼합, 정치시켜 얻은 분획물, 조추출물을 실리카겔 등이 충진된 칼럼에 흡착시킨 후 소수성 용매, 친수성 용매 또는 이들의 혼합 용매를 이동상으로 하여 얻은 분획물을 포함하는 의미이다.
상기 추출물의 의미에는 동결건조, 진공건조, 열풍건조, 분무건조 등의 방식으로 추출 용매가 제거된 농축된 액상의 추출물 또는 고상의 추출물이 포함된다. 바람직하게는 추출용매로서 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올(메탄올, 에탄올, 부탄올 등) 또는 이들의 혼합 용매를 사용하여 얻어진 추출물의 의미한다.
본 기재에서, 결과 추출물의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 환(pills) 형태, 과립 형태, 가루 형태를 비롯한 분말 또는 기타 추출물 형태일 수 있다.
상기 고상물은 두충(Eucommia ulmoides)와, 아쉬아간다(Ashwagandha) 그리고 야생 참마(Dioscorea)을 깨끗이 세정한 다음 고상물 형태로 얻어질 수 있다. 깨끗이 세정한 후에는 자연건조(음건), 열풍건조 등 임의의 방식으로 건조됨으로써 수분의 일부가 제거된 후에(고상물의 수분 함량이 10%(w/w) 이하가 되도록 분쇄물 형태로) 유산균 발효에 사용될 수 있다.
나아가, 분쇄물 형태를 그대로 또는 단계별 증숙한 후 건조시킨 상태로 사용될 수 있으며, 단계별 증숙한 후 건조시킨 상태로 사용하는 것이 유효성분의 증대 효과를 제공할 수 있어 바람직하다.
본 발명에서, 상기 발효균주는 아래의 실시예에서 사용된 Enterococcus faecium(KCTC 13225) 또는 Lactobacillus plantarum(KCTC 13093)인 것인 근 기능 증진 조성물을 제공하기에 바람직하며, 이외에도 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 등도 대체 혹은 배합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서, 상기 발효균주는 상기 접종 전 두충(Eucommia ulmoides) 추출물로 활성화된 유산균, 구체적으로 두충 물(열수 포함) 추출물과 당릴 등의 탄소원이 포함된 배지에 유산균을 접종, 배양시켜 얻어진 것을 사용할 수도 있다. 본 발명자들은 아래의 실험예에서 제시하지는 않았지만 두충 물(열수 포함) 추출물로 활성화된 유산균을 사용할 경우 고상의 건조물(분쇄물)의 심부까지 발효가 진행될 것으로 보고 있다. 이러한 두충 물(열수 포함) 추출물로 활성화된 유산균은 두충 물 추출물과 탄소원이 포함된 배지를 제조하고 여기에 유산균을 접종하여 얻어질 수 있는데, 이때 탄소원은 당업계에 공지된 임의의 탄소원, 예를 들어 올리고당, 유당, 포도당, 과당, 설탕, 당릴, 덱스트로스, 전분, 글루코스, 프럭토즈, 만노오스, 갈락토스, 리보스, 소르보스, 리불로스, 락토스, 말토스, 수크로스, 라피노스 및 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 배지에의 첨가량인 1 내지 10%(w/v) 범위일 수 있으며, 또한 배지에는 질소원이나 미량 원소가 0.1 내지 3%(w/v) 범위로 더 포함될 수 있는데, 질소원으로는 암모니아, 암모늄염, 우레아, 아미노산, 대두박, 대두 단백질, 효모 추출물, 육즙 등을 들 수 있고, 미량원소로는 K, Mg, Na, Co, Mo, Ca, Mn, Zn, Cu, Fe, P, S 등을 들 수 있다. 또한 배양은 25 내지 40℃ 또는 35 내지 37℃에서 12시간 내지 2일 정도 수행될 수 있다.
본 발명에서, 상기 접종 후의 배양은 15 내지 45℃, 30 내지 40℃ 또는 35 내지 37℃에서 수행될 수 있다. 배양온도가 상기 범위보다 낮을 경우 발효 속도가 느려지거나 원치않는 부산물이 생겨날 수 있으며, 배양 온도가 상기 범위보다 높은 경우에도 발효 미생물의 사멸에 따라 마찬가지로 발효 속도가 느려지거나 원치않는 발효 부산물이 생겨날 수 있다. 배양 시간은 1일 내지 7일 정도, 또는 2일 내지 5일 정도 수행될 수 있다.
본 발명의 근 기능 증진 조성물은 그 유효성분 이외에 분산제와 담체를 포함하여 제조될 수 있다.
해당 분산제로는 물, 알코올(예를 들어, 메탄올, 에탄올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 글리세린 등), 케톤(예를 들어, 아세톤, 메틸에틸케톤 등), 에테르(예를 들어, 디옥산, 테트라하이드로푸란, 셀로솔브, 디에틸렌글리콜 디메틸에테르 등), 지방족 탄화수소(예를 들어, 헥산, 케로센 등), 방향족 탄화수소(예를 들어, 벤젠, 톨루엔, 크실렌, 나프탈렌, 메틸나프탈렌 등), 할로겐화 탄화수소(예를 들어, 클로로포름, 카본 테트라클로라이드 등), 산 아마이드(예를 들어, 디메틸포름아마이드), 에스터(예를 들어, 메틸아세테이트 에스터, 에틸아세테이트 에스터, 부틸아세테이트 에스터, 지방산글리세린 에스터 등), 니트릴(예를 들어 아세토니트릴 등), 계면활성제(예를 들어, 고급알코올 설페이트 에스터, 알킬설폰산, 알킬알릴설폰산, 4급암모늄염, 옥시알킬아민, 지방산에스터, 폴리알킬렌옥사이드 화합물, 무수소르비톨 화합물 등)을 들 수 있으며, 단독으로 또는 2종 이상 혼합되어 본 발명의 항균용 조성물에 포함되어 제조될 수 있다.
필요에 따라서는 상기 발효물에 전술한 분산제를 적용하고 포집체, 포집 응집체, 또는 이의 추출물을 제조하는데 사용할 수도 있다. 구체적으로 아래의 실시예에서 처럼 발효물의 포집응집 상등액에 무게 대비 10 내지 20배의 60 내지 90% 에탄올을 투입하고 70℃에서 3시간 동안 환류관을 연결하여 추출할 수 있다. 얻어진 추출액은 0.45 ㎛ 멤브레인 필터로 여과한 다음 3시간 동안 진공 및 상온에서 농축하여 추출물로 제공될 수 있다.
담체의 경우, 점토(예를 들어, 카올린, 벤토나이트, 산 점도 등), 활석(예를 들어 활석 분말, 납석 분말 등), 실리카(예를 들어 규조토, 규산 무수물, 운모 분말 등), 알루미나, 황 분말, 활성탄 등이 예시될 수 있으며, 이들 담체도 단독 또는 2종 이상 혼합물로 본 발명의 근 기능 증진 조성물에 포함되어 제조될 수 있다.
본 발명의 조성물은 근 기능 증진을 필요로 하는 용도로 다양하게 사용될 수 있다. 구체적인 효과 또는 그 용도는 근 지구력 증가, 근력 강화, 근육 감소증 예방 또는 개선, 체력 향상, 항피로, 또는 운동능력 향상으로 이해될 수 있다.
근 기능 증진 조성물의 구체적인 액제화 또는 제제화와 관련하여서는 당업계에 공지되어 있는 기술을 다양하게 적용할 수 있다.
전술한 근 기능 증진 조성물로 파악될 경우, 해당 조성물은 제품 형태에 있어서도 임의의 제품 형태를 띨 수 있는데, 구체적으로 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 크림, 로션, 파우더, 클렌징, 오일, 분말 파우더, 유탁액 파우더, 왁스 파우더, 스프레이 등의 제품 형태를 띨 수 있다.
전술한 근 기능 증진 조성물의 경우에는 그 유효성분 이외에 통상적으로 이용되는 성분들, 예를 들어 용매, 안정화제, 용해화제, 유탁화제, 희석제, 현탁제, 계면활성제, 비타민, 색소 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.
예를 들어, 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체로서 락토오스, 탈크, 실리카, 알루미늄 하이드록사이드, 칼슘 실리케이트, 폴리아마이드 파우더 등이 사용될 수 있고, 특히 스프레이의 경우에는 클로로플루오로하이드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸에테르와 같은 추진체를 추가로 포함할 수 있다.
상기 용매, 용해화제 또는 유탁화제로는 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질알콜, 벤질벤조에이트, 프로필렌글리콜, 부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스터, 폴리에틸렌글리콜, 소르비탄의 지방산 에스터 등이 이용될 수 있다.
상기 희석제 또는 현탁제로는 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제가 사용되거나 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨에스터, 폴리옥시에틸렌 소르비탄에스터와 같은 현탁제, 또는 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타하이드록사이드, 벤토나이트, 아가 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 구체적인 양태에 있어서는 약제학적 조성물로도 파악될 수 있다. 본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 파악될 경우 그 약리효과 또는 그 용도는 근육 감소증 예방 또는 치료로 이해될 수 있다.
나아가, 전술한 양태 이외에 근 기능 증진이 발현될 것이 요구되는 용도라면 제한없이 사용될 수 있다.
본 발명의 근 기능 증진 조성물, 약제학적 조성물은 해당 분야에 공지된 유효성분을 포함하는 것을 제외하고는 당업계에서 통상적으로 행해지는 해당 조성물의 제조방법에 따라 제조할 수 있다.
본 기재의 근 기능 증진 조성물을 설명함에 있어서, 명시적으로 기재하지 않은 다른 조건이나 장비 등은 당업계에서 통상적으로 실시되는 범위 내에서 적절히 선택할 수 있고, 특별히 제한되지 않음을 명시한다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정하는 것은 아니다.
[실시예]
<실시예 1> 발효CD두충 혼합추출물의 제조
두충(Eucommia ulmoides), 아쉬아간다(Ashwagandha), 야생 참마(Dioscorea)을 온라인으로 각각 구입하였고, β-시클로덱스트린을 대정화금㈜에서 구입하여 10% 수용액으로 준비하였다.
(1)두충(Eucommia ulmoides), 아쉬아간다(Ashwagandha), 야생 참마(Dioscorea)을 깨끗이 세정한 후 건조하여 0.3 내지 1.0mm 사이즈로 분쇄하였다. 분쇄한 원료를 일정한 중량(100 g : 100 g : 100 g)으로 혼합하였다.
(2)상기 건조한 원료에 유산균인 Enterococcus faecium(KCTC 13225) 또는 Lactobacillus plantarum(KCTC 13093)]]을 106 CFU/g의 농도로 혼합 접종하여 37 ℃에서 5일간 발효시켰다.
(3)상기 발효원료의 무게 대비 20 배의 물과 10%(w/v) β-시클로덱스트린 수용액을 투입하고 70 ℃에서 12시간 교반하여 포접 용액을 제조하였다.
(4)상기 포접용액에 응집제 0.5%(w/v) 염화칼슘을 포접용액 전체 부피의 1 내지 5%(v/v)만큼 첨가하여 70 ℃에서 1시간 가열하고 여과 및 원심분리하여 상등액을 얻었다.
(5)상기 상등액에 무게 대비 20 배의 70 % 에탄올을 투입하고 70 ℃에서 3시간 동안 환류관을 통해 3회 반복하여 환류 추출하였다.
(6)이후 얻어진 추출액을 0.45 μm membrane filter로 여과한 후 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 발효CD 두충 추출물(샘플 EAD-3)을 제조하였다.
<비교예 1> 발효두충 혼합추출물의 제조
(1)두충(Eucommia ulmoides), 아쉬아간다(Ashwagandha), 야생 참마(Dioscorea)을 깨끗이 세정한 후 건조하여 0.3 내지 1.0mm 사이즈로 분쇄하였다. 분쇄한 원료를 일정한 중량(100 g : 100 g : 100 g)으로 혼합하였다.
(2)상기 건조한 원료에 유산균인 Enterococcus faecium(KCTC 13225) 또는 Lactobacillus plantarum(KCTC 13093)]]을 106 CFU/g의 농도로 혼합 접종하여 37 ℃에서 5일간 발효시켰다.
(3')상기 발효원료의 무게 대비 20 배의 70 % 에탄올을 투입하고 70 ℃에서 3시간 동안 환류관을 통해 3회 반복하여 환류 추출하였다. 이후 얻어진 추출액을 0.45 μm membrane filter로 여과한 후 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 증숙발효두충 추출물(샘플 EAD-3)을 제조하였다.
(5')상기 발효원료의 무게 대비 20 배의 70 % 에탄올을 투입하고 70 ℃에서 3시간 동안 환류관을 통해 3회 반복하여 환류 추출하였다.
(6)이후 얻어진 추출액을 0.45 μm membrane filter로 여과한 후 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 발효두충 추출물(샘플 EAD-2)을 제조하였다.
<비교예 2> 비발효 두충 혼합추출물의 제조
(1')두충(Eucommia ulmoides), 아쉬아간다(Ashwagandha), 야생 참마(Dioscorea)을 깨끗이 세정한 후 건조하여 0.3 내지 1.0mm 사이즈로 분쇄하였다. 분쇄한 원료를 일정한 중량(100 g : 100 g : 100 g)으로 혼합하였다.
(5')상기 원료의 무게 대비 20 배의 70 % 에탄올을 투입하고 70 ℃에서 3시간 동안 환류관을 통해 3회 반복하여 환류 추출하였다.
(6)이후 얻어진 추출액을 0.45 μm membrane filter로 여과한 후 감압 농축기로 에탄올을 제거하여 두충 추출물(샘플 EAD-1)을 제조하였다.
<실험예>
<실험예 1> 섭취량에 따른 체중변화 시험
상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 2에서 수득한 샘플에 대한 섭취량에 따른 체중변화 실험을 수행하였다.
해당 실험은 6주령의 Sprague-Dawley계 수컷 흰 쥐를 구입하여 물과 고형사료를 충분히 공급시켜 실험실환경(온도 22±2℃, 습도 55±5% 12시간 명암주기)에 적응시켜 관리하였다. 실험군은 비발효 두충 혼합추출물(EAD-1), 발효 두충 혼합추출물(EAD-2), 발효CD 두충 혼합추출물(EAD-3)을 100 mg/kg/day 총 4주간 경구 투여하였으며, 대조군은 생리식염수를 투여하였다. 각 군 당 10마리씩 총 4군으로 분류하였다. 사료 섭취량별 체중변화 측정 결과를 하기 도 1에 나타내었다.
하기 도 1의 좌측 도면에서 보듯이, 사료섭취량은 대조군과 실시예 1, 비교예 1, 2의 실험군간 유의적인 차이가 나타나지 않았으며, 각 주차별 차이도 없었다.
또한, 도 1의 우측 도면에서 보듯이, 체중 변화는 모든 군에서 주차별로 체중이 증가하였지만, 대조군과 실시예 1, 비교예 1,2의 실험군간 유의적인 차이는 나타나지 않았다.
이러한 결과로부터, 실시예 1의 발효CD 두충 혼합추출물(EAD-3)은 비교예 1의 발효 두충 혼합추출물(EAD-2), 비교예 2의 비발효 두충 혼합추출물(EAD-1)과 마찬가지로 사료섭취량 및 체중 변화에 영향을 주지 않은 것으로 확인되었다.
<실험예 2> 지구력 측정시험
상기 실시예 1에서 수득한 샘플과 비교예 1 내지 2에서 수득한 샘플에 대한 건강기능식품 기능성 평가 가이드-'운동수행능력 향상에 도움을 줄 수 있음' 편-을 바탕으로 지구력 측정을 진행하였다.
구체적으로, 각 군은 플라스틱 수조(50W Х 40D Х 50H cm)의 35 cm 높이까지 물을 채운 후, 수중히터를 이용하여 수온을 일정하게(25±2℃) 유지하도록 한다. 적응훈련은 본실험 전까지 1주일에 1회 실시하였으며, 시험물질 투여 1시간 후에 마우스체중의 4%에 해당하는 무게추를 꼬리에 부착하고 20분 동안 강제수영을 실시하였다. 2주차에는 30분, 3주차에는 40분까지 점차적으로 수영시간을 증가시키고, 본 실험은 시험물질 투여 후에 적응훈련과 동일한 방법으로 강제수영을 실시하여, 마우스의 코가 수면 아래로 5초 이상 가라앉는 시점을 탈진 시점으로 한다. 결과를 하기 도 2에 나타내었다.
하기 도 2에서 보듯이, 대조군이 침수까지 걸린 최대수영시간은 153±12초로 확인되었다.
비교예 1의 발효 두충 혼합추출물(EAD-2)과 비교예 2의 비발효 두충 혼합추출물(EAD-1)의 최대수영시간은 각각 171±3초와 162±13초로서, 대조군대비 최대수영시간이 증가한 것으로 확인되었다.
특히 실시예 1의 발효CD 두충 혼합추출물(EAD-3)의 최대수영시간은 188±9초로서 탈진시까지 걸리는 최대 수영시간이 가장 많이 증가한 것으로 확인되었다.
<실험예 3> ATP 측정 시험
앞서 실험예 2에서 지구력 증가에 대한 원인을 확인하기 위해, 지구력측정을 마친 실험군과 대조군의 뒷다리 근육에서 미토콘드리아 생합성 관련 유전자(PGC-1α, NRF1, TFAM)의 발현양을 확인하였다.
GC-1α는 미토콘드라이 생합성에 관여하는 주요 단백질로 알려져 있으며, PGC-1α의 활성화에 의해 TFAM의 발현이 증가하여 미토콘드리아 DNA의 전사 및 복제를 증가시킨다. 또한 NRF1의 발현은 ATP 대사 관련 세포신호전달 체계를 조절하여 운동수행 능력 향상을 유도한다. 따라서, PGC-1α, TFAM, NRF1의 발현이 증가한다면 운동수행능력이 증진됨을 규명할 수 있다. 본 연구에서는 PGC-1α, TFAM, NRF1의 발현을 RT-PCR을 통하여 확인하였다.
구체적으로는, 지구력측정 후, 시험에 참여한 마우스를 희생하여 뒷다리 근육 조직을 적출한다. 분화가 종료된 L6 근관세포에 Trizol 용액 1 mL를 넣은 뒤, 근육조직과 근관세포에 chloroform 200 μL를 10,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 RNA를 추출한다. 추출된 RNA는 Nanodrop 1000을 이용하여 정량 후 cDNA를 합성하시킨다. 합성된 cDNA와 표적 유전자 프라이머, 염기서열을 PCR-premix에 넣어 94℃에서 5분간 전처리를 한 뒤, denaturation을 위하여 94℃에서 30초, annealing을 위하여 50℃에서 1분, extension을 위하여 72 ℃에서 1분, 총 2분을 1 cycle로 하여 25-30 cycle의 조건으로 PCR을 실시하였다. G:BOX EF imaging system을 이용하여 유전자 발현정도를 확인 및 정량하였다. 결과를 하기 도 3에 나타내었다.
하기 도 3에서 보듯이, 대조군(100%) 대비 실시예 1과 비교예 1,2의 실험군이 PGC-1α, NRF1, TFAM 발현을 조절하여 미토콘드리아 생합성을 증가 및 ATP로 인하여 운동수행능력이 증진됨을 확인하였다.
실험군 중 비교예 1,2의 발효 두충 혼합추출물(EAD-2) 및 비발효 두충 혼합추출물(EAD-1)의 경우 대조군보다 지구력측정이 높았으며, PGC-1α, NRF1, TFAM 유전자발현도 대조군보다 큰 것으로 확인되었다.
실시예 1에 따른 발효CD 두충 혼합추출물(EAD-3)의 PGC-1α, NRF1, TFAM 발현이 가장 컸으며, 이는 지구력측정의 경향성이 있음을 보였다.
<실험예 4> 혈중 락테이트, 카탈라아제, GPx 활성 농도 측정시험
실시예 1, 비교예 1,2의 실험군(EAD-1, EAD-2, EAD-3)과 대조군의 지구력평가로 인한 피로를 확인하기 위하여 지구력측정을 마친 실험군과 대조군의 혈중 Lactate, Catalase, GPx 활성을 평가하였다. Lactate는 젖산은 포도당 분해 과정을 통해 생성되며 근육에 손상을 주지 않지만, 운동으로 인해 과다 축적 될 경우 포도당 분해과정을 방해하여 탈진에 이르게 함으로 대조군과 시험물질의 젖산발생량을 비교함으로 항피로를 확인할 수 있다.
구체적인 예로, 지구력측정 후, 시험에 참여한 마우스의 혈액을 취하여 4,000 rpm에서 10분간 원심 분리하였다. 이후 Lactate Pro를 이용하여 락테이트 함량을 측정하였다. 카탈라아제와 GPx는 지구력측정 후, 시험에 참여한 마우스를 희생하여 근육을 적출한다. 이후 cold assay buffer를 넣고 균질기로 처리한 뒤, 상층액을 취하여 카탈라아제 분석키트와 GPx 분석키를 이용하여 각 활성을 측정하고, 결과를 하기 도 4에 나타내었다.
하기 도 4에서 보듯이, 실시예1, 비교예 1,2의 실험군은 대조군(8.9 nmol/L) 대비 락테이트가 감소하였으며, 구체적으로 비교예 2의 EAD-1(7.3 nmol/L), 비교예 1의 EAD-2(7.9 nmol/L), 실시예 1의 EAD-3(5.4 nmol/L)로 각각 분석되었다.
산화적 스트레스 또한 운동에 영향을 주며, 피로도에 영향을 준다. 대표적인 산화방지 효소인 카탈라아제와 GPx의 함량을 대조군과 시험물질에서 비교한 결과, 카탈라아제는 대조군(23.7 U/mg) 대비 비교예 2의 EAD-1(31.4 U/mg), 비교예 1의 EAD-2(33.9 U/mg), 실시예 1의 EAD-3(42.1 U/mg)로 각각 분석되었다. GPx는 대조군(4.8 U/mg) 대비 비교예 2의 EAD-1(5.2 U/mg), 비교예 1의 EAD-2(5.6 U/mg), 실시예 1의 EAD-3(6.8 U/mg)로 각각 분석되었다.
따라서 발효CD 두충 혼합추출물(EAD-3)은 대조군 대비 항피로 지표인 젖산발생량이 낮으며, 산화방지효소인 Catalase와 GPx의 비율이 높은 것으로 분석되었으며, 지구력측정 및 ATP 측정 실험결과와 경향성이 있음을 확인하였다.
<실험예 5> 혈중 크레아틴, 암모니아 농도 측정시험
실험군(EAD-1, EAD-2, EAD-3)과 대조군의 지구력평가로 인한 피로를 확인하기 위하여 지구력측정을 마친 실험군과 대조군의 혈중피로 물질인 암모니아와 근 손상 지표물질인 크레아틴의 농도를 분석하였다.
구체적으로, 혈중 피로 요소에 관련된 영향을 확인하기 위하여 지구력측정 후, 시험에 참여한 마우스의 혈액을 취하여 4,000 rpm에서 10분간 원심분리하였다. 이후 크레아틴과 암모니아 함량를 각각 측정하였다. 각각 크레아틴 분석키트와 암모니아 분석키트를 이용하여 함량을 측정하였다. 결과를 도 5에 나타내었다.
하기 도 5에서 보듯이, 실험군의 크레아틴 혈중농도는 대조군(0.62 nmol/μL) 대비 비교예 2의 EAD-1(0.53 nmol/μL), 비교예 1의 EAD-2(0.55 nmol/μL), 실시예 1의 EAD-3(0.44 nmol/μL)로 분석되었으며, 암모니아의 혈중농도는 대조군(137 μg/dL) 대비 비교예 2의 EAD-1(120 μg/dL), 비교예 1의 EAD-2(115 μg/dL), 실시예 1의 EAD-3(109 μg/dL)로 분석되어 피로 및 근손상 지표성분의 감소를 확인하였다.
특히, 실시예 1의 발효CD 두충 혼합추출물(EAD-3)은 대조군 대비 항피로 물질인 암모니아와 근손상 지표물질인 크레아틴의 농도가 대조군 대비 낮았으며, 이는 대조군 대비 힘증가가 있음을 확인하였다.
결론적으로, 두충(Eucommia ulmoides), 아쉬아간다(Ashwagandha) 및 야생 참마(Dioscorea)를 이용한 고상의 건조물에 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중에서 선택된 1종 이상의 발효균주를 접종하여 얻어진 발효물 포접체의 분말이나 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 경우, 수득된 조성물은 근 지구력 증가, 근력 강화, 근육 감소증 예방 또는 개선, 체력 향상, 항피로, 또는 운동능력 향상능을 동시에 발현하여 개선된 근 기능 증진효과를 필요로 하는 적용처에 적합함을 확인할 수 있었다.

Claims (6)

  1. 두충(Eucommia ulmoides), 아쉬아간다(Ashwagandha) 및 야생 참마(Dioscorea)를 이용한 고상의 건조물에 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 락토바실러스 플란타륨(Lactobacillus plantarum), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 및 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) 중에서 선택된 1종 이상의 발효균주를 접종하여 얻어진 발효물 포접체의 분말이나 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 근 기능 증진 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 포접체는 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린, 디메틸-β-시클로덱스트린, 트리메틸-β-시클로덱스트린, 2-히드록시메틸-β-시클로덱스트린, 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 3-히드록시프로필-β-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린 술페이트, β-시클로덱스트린 술포네이트 및 β-시클로덱스트린 술포부틸 에테르 중에서 선택된 1종 이상의 수용액으로 포접한 것인 근 기능 증진 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 분말 또는 추출물은 포접체의 상등액을 알코올 추출시켜 수득된 것인 근 기능 증진 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 포접체의 상등액은 염화제일철, 염화제이철, 염화마그네슘, 염화칼슘, 염화코발트 및 염화니켈 중에서 선택된 1종 이상의 응집제를 사용하여 응집시킨 포접 응집체의 상등액인 것인 근 기능 증진 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 발효균주는 Enterococcus faecium(KCTC 13225) 또는 Lactobacillus plantarum(KCTC 13093)인 것인 근 기능 증진 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 근 기능 증진은 근 지구력 증가, 근력 강화, 근육 감소증 예방 또는 개선, 체력 향상, 항피로, 또는 운동능력 향상인 것인 근 기능 증진 조성물.
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