KR20220150194A - 들깻잎 유래 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

들깻잎 유래 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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이원종
김도경
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인천대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 들깻잎 유래 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 들깻잎 유래 나노베지클은 들깨속 식물인 들깨(Perilla frutescens) 잎에서 유래된 천연 화합물로 동물 유래 물질에 비해 생체 적합성이 우수하고, 안정적이고, 세포 투과율이 높은 이점이 있으며, 인간의 정상 세포에 독성이 없어 부작용을 최소화하면서 유방암 또는 자궁경부암의 특정 암 세포에 대해서만 선택적으로 공격하여 암세포 증식을 억제할 수 있어, 암의 치료, 개선 또는 예방에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

들깻잎 유래 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, improving or treating cancer comprising perilla frutescens-derived nanovesicle as an active ingredient}
본 발명은 들깻잎 유래 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
암은 1940년대 최초로 치료제가 개발된 이후 현재까지 정복되지 않은 질병이다. 일부 암에 한해서 완치에 가까운 치료가 가능하지만 전이 및 재발 여부에 따른 치료가 불가능해 많은 사망자를 발생시키고 있다. 지금까지도 사용되는 화학 항암제는 주로 DNA에 직접 작용하여 DNA의 복제, 전사, 번역과정을 차단하거나 대사경로에 핵산 전구체의 합성을 방해하고 세포 분열을 저해함으로써 항암활성, 즉 암세포에 대한 세포 독성을 가진다. 그러나, 이러한 항암제는 암세포뿐만 아니라 정상세포에서도 동일하게 작용하기 때문에 고통, 구토, 피부염증, 탈모 등 여러 부작용들을 동반하게 된다.
이를 해결하기 위해 합성 나노베지클을 이용하거나, 동물 세포 유래 엑소좀을 활용해 그 내부에 약물을 탑재하여 암세포 선택적인 약물 전달을 시도하였으나, 여기에 사용되는 합성 나노베지클 및 인간 세포 유래 세포밖 소포체는 안전성 이슈를 가지고 있으며, 대량 생산을 위한 비용 및 설비가 많이 요구된다는 한계를 가지고 있다.
식물 유래 나노베지클(또는 세포밖 소포체)은 천연물질로 세포독성, 면역원성 같은 부작용이 적으며, 체액에서 안정성을 가질 뿐 아니라 체액 내 높은 체류 시간을 가지고 있다. 특히 식물 유래 나노베지클에는 항암, 항산화, 항염증과 같은 천연 화합물이 존재하며, 식물 추출물과 다르게 지용성 화합물이 나노베지클에 포함되어 있어 체액에 더욱 안정적으로 존재할 수 있다. 특히, 인간 세포 유래 세포밖 소포체를 대체하여 범용성을 갖고 있는 식물을 이용한다면 경제적인 대량 생산이 가능할 것이라 예상된다.
이들 식물 유래 나노베지클의 생산에 있어, 초고속 원심분리 방법을 활용할 수 있으나, 이의 방법은 나노베지클의 생산 수율이 낮고 불순물이 존재하여 원하는 수준의 생물학적 활성을 얻는 것이 어려우며, 체내 안전성에도 문제가 발생할 수 있다. 또한, 불순물을 거의 포함하지 않으면서 식용 식물에 있는 순수 세포밖 소포체만을 이용하여 특정 암세포의 증식에 대하여 억제 활성을 가짐으로써 암을 개선, 예방 또는 치료용 조성물로 적용한 사례는 아직 개발이 미흡한 실정이다. 이에 암의 개선, 예방 또는 치료 활성을 있는 식품 유래 나노베지클의 탐색 및 이의 분리, 정제 방법의 개발이 필요한 실정이다.
한국공개특허 제2011-0082480호
본 발명의 목적은 들깻잎에서 유래된 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 들깻잎에서 유래된 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 들깻잎에서 유래된 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 들깻잎에서 유래된 나노베지클의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 들깻잎에서 유래된 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 들깻잎에서 유래된 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 들깻잎에서 유래된 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 들깻잎에서 유래된 나노베지클을 제조하는 방법으로서, 들깻잎 착즙액을 제조하는 단계; 상기 들깻잎 착즙액에 대하여 한외여과를 수행하여 여과액을 수득하는 단계; 및 상기 여과액에 대해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 나노베지클을 회수하는 단계;를 포함하는 나노베지클의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 들깻잎 유래 나노베지클은 들깨속 식물인 들깨(Perilla frutescens) 잎에서 유래된 천연 화합물로 동물 유래 물질에 비해 생체 적합성이 우수하고, 안정적이고, 세포 투과율이 높은 이점이 있다.
또한, 본 발명의 들깻잎 유래 나노베지클은 인간의 정상 세포에는 독성이 없어 부작용을 최소화하면서 유방암 또는 자궁경부암의 특정 암 세포에 대해서만 선택적으로 공격하여 암세포 증식을 억제할 수 있어 암의 치료, 개선 또는 예방에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되지 않는다. 본 발명의 효과는 이하의 설명에서 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
도 1은 들깻잎 착즙액으로부터 들깻잎 유래 나노베지클을 제외한 불순물 제거와 들깻잎 유래 나노베지클의 분리 및 농축과정을 보여주는 사진이다.
도 2는 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 들깻잎 유래 나노베지클의 분리 및 정제 과정과 정제된 33개의 분획물을 나타낸 사진이다.
도 3은 들깻잎 유래 나노베지클의 농도 및 크기 분포도를 나타낸 결과이다.
도 4는 들깻잎 유래 나노베지클을 인간 암세포에 처리한 후 항증식 효과를 분석한 결과이다.
도 5는 들깻잎 유래 나노베지클을 인간 정상세포에 처리한 후 세포독성을 분석한 결과이다.
도 6은 들깻잎 유래 나노베지클을 처리한 후 삼중음성 유방암세포의 이동 및 침윤에 대한 억제 효과를 분석한 결과이다 (CTRL: 대조군; 및 Parax: 들깻잎 유래 나노베지클 처리군).
도 7은 들깻잎 유래 나노베지클을 처리한 후 비소세포성 폐암세포의 이동에 대한 효과를 분석한 결과이다 (CTRL: 대조군; 및 Parax: 들깻잎 유래 나노베지클 처리군).
도 8은 들깻잎 유래 나노베지클을 각 인간 유래 세포주에 처리한 후 세포 내 투과 정도를 비교한 결과이다.
도 9는 들깻잎, 검은콩, 당근 또는 양배추 유래 나노베지클을 처리한 후 항증식 효과를 비교한 결과이다 (Parax: 들깻잎 유래 나노베지클 처리군; Blex: 검은콩 유래 나노베지클 처리군; Carex: 당근 유래 나노베지클; 및 Cabex: 양배추 유래 나노베지클).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 들깻잎 유래 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 암의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
본 명세서에서 "유효성분으로 포함하는"이란 본 발명의 들깻잎 유래 나노베지클의 효능이나 활성을 달성하는 데 충분한 양을 포함하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "예방"이란 본 발명에 따른 조성물을 개체에 투여하여 을 암세포의 증식을 억제하거나 지연시키거나 완화하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 "치료"란 본 발명에 따른 조성물을 암 의심 개체에 투여하여 암 질환의 증상이 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미할 수 있다.
기존에는 식용 식물을 이용하여 초고속 원심분리 방법에 의해 식물 유래 엑소좀 유사 나노베지클을 수득하고 이를 이용하여 인간 세포에서의 항암 및 항증식 효과가 연구되었다. 그러나, 초고속 원심분리 방법에 의해 수득된 들깻잎 유래 엑소좀 유사 나노베지클은 수율이 낮고 불순물이 존재하여 엑소좀 유사 나노베지클 자체가 가진 효능을 검증하는데 한계가 있으며, 그 효과에서도 기대하는 수준의 효과를 제대로 발현하지 못하는 단점이 있었다.
이에 본 발명에서는 초고속 원심분리 방법이 아닌 크기 배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography, SEC)를 이용하여 범용성이 매우 높은 식용 식물인 들깻잎으로부터 고순도 및 고품질의 나노베지클을 분리 정제하고, 이렇게 분리한 들깻잎 유래 나노베지클의 항암 및 항증식 효과를 규명하였다. 즉, 본 발명의 들깻잎 유래 나노베지클은 불순물을 함유한 엑소좀 유사 나노베지클이 아닌 순수 들깻잎 유래 나노베지클만이 가진 효능 확인이 가능하였다.
이러한 본 발명의 들깻잎 유래 나노베지클은 들깨속 식물인 들깨(Perilla frutescens) 잎에서 유래된 천연 화합물로 동물 유래 물질에 비해 생체 적합성이 우수하고, 안정적이고, 세포 투과율이 높아 항암제로서의 큰 이점이 있다. 또한, 상기 들깻잎 유래 나노베지클은 인간의 정상 세포에는 독성이 없어 부작용을 최소화하면서 유방암 또는 자궁경부암의 특정 암 세포에 대해서만 선택적으로 공격하여 암세포 증식을 억제할 수 있어 암의 치료, 개선 또는 예방에 유용하게 이용될 수 있다.
구체적으로 들깻잎에서 유래된 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 나노베지클은 평균 직경이 50 내지 200 nm, 바람직하게는 50 내지 180 nm, 더욱 바람직하게는 50 내지 150 nm, 가장 바람직하게는 80 내지 150 nm일 수 있다. 상기 나노베지클은 단백질, 지질, 핵산, 화합물 등 모세포로부터 유래한 유효 성분을 포함하고 있으며, 생체 내에서 이러한 물질들을 세포 또는 조직으로 전달하는 운송체 역할을 할 수 있다.
상기 나노베지클은 들깻잎의 조직 또는 세포를 포함하는 들깻잎 착즙액에 대해 크기 배제 크로마토그래피로 분리된 것일 수 있다. 상기 크기 배제 크로마토그래피는 기존의 초고속 원심분리법에 비해 분리 및 정제 시 불순물의 함량을 크게 낮추고 고유의 약리학적 및 약물 전달적 활성을 그대로 유지하는 고순도 및 고품질의 들깻잎 유래 나노베지클을 수득할 수 있다. 이때, 상기 들깻잎 착즙액은 들깻잎으로부터 채취, 분리하거나, 또는 이로부터 유래한 관심 성분의 유효량을 함유하고 있는 가공되지 않거나 또는 전처리된 것일 수 있다.
상기 나노베지클은 유방암 세포인 MDA-MB-231 또는 MCF-7과 자궁경부암 세포인 HeLa에 대하여 세포증식을 억제하는 활성을 가질 수 있다.
상기 암은 유방암 또는 자궁경부암일 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 들깻잎 유래 나노베지클을 포함하는 유효성분이 암세포의 세포증식 억제하거나, 이를 제거하거나 또는 경감시키는 역할을 한다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물은 그 자체로 이들 질환 치료의 조성물이 될 수도 있고, 혹은 다른 약리성분과 함께 투여되어 상기 질환에 대한 치료 보조제로 적용될 수도 있다. 이에, 본 명세서에서 용어 "치료" 또는 "치료제"는 "치료 보조" 또는 "치료 보조제"의 의미를 포함한다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.
상기 약학 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 암 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
상기 약학 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복제, 캡슐제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 및 주사 액제로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다.
액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있으며, 바람직하게는 경구 투여이다.
본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학 조성물의 1일 투여량은 0.001 내지 10 g/㎏, 바람직하게는 10 내지 500 mg/kg, 더욱 바람직하게는 100 내지 300 mg/kg을 1일 1 내지 4회 투여할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때, 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
한편, 본 발명의 나노베지클의 1일 투여량은, 10 내지 1,000 mg/kg일 수 있으며, 바람직하게는 20 내지 600 mg/kg일 수 있고, 더욱 바람직하게는 50 내지 400 mg/kg일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 100 내지 300 mg/kg일 수 있고, 가장 바람직하게는 200 내지 300 mg/kg일 수 있다. 본 발명의 나노베지클의 투여량의 상기 하한치 미만인 경우에는 유방암 및 자궁경부암 세포에 대하여 세포증식 억제 활성이 원하는 정도로 나타나지 않을 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 투여량이 증가하는 만큼 암세포 증식 억제 효과가 증가하지 않을 수 있다. 나노베지클은 천연물로서 과량 투여하여도 인체에 부작용이 없으므로 본 발명의 조성물 내에 포함되는 나노베지클의 양적 상한은 당업자가 적절한 범위 내에서 선택하여 실시할 수 있다.
한편, 본 발명은 들깻잎에서 유래된 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명에서의 용어, "나노베지클" 및 "암"은 상기에서 기재한 바와 같다.
본 발명의 용어 "개선"이란, 본 발명의 나노베지클을 포함하는 조성물의 투여로 치료되는 상태와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 것을 의미한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다.
상기 식품의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함한다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 비제한적인 예로는, 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 또는 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
상기 건강기능식품이란, 상기 나노베지클을 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 및 바로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있고, 또는 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하여 일반 식품 형태로 제조한 것으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.
상기 건강기능식품은, 일상적으로 섭취하는 것이 가능하기 때문에 매우 유용하다. 이와 같은 건강기능식품에 있어서의 나노베지클의 첨가량은, 대상인 건강기능식품의 종류에 따라 달라 일률적으로 규정할 수 없지만, 식품 본래의 맛을 손상시키지 않는 범위에서 첨가하면 되며, 대상 식품에 대하여 통상 0.01 내지 50 중량%, 바람직하기로는 0.1 내지 20 중량%의 범위이다. 또한, 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 또는 바(bar) 형태의 건강기능식품의 경우에는 통상 0.1 내지 100 중량%, 바람직하기로는 0.5 내지 80 중량%의 범위에서 첨가하면 된다.
상기 건강기능식품은 유효성분으로서 나노베지클 뿐만 아니라, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함한다. 상술한 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 향미제로서 천연 향미제 [타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)] 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다.
예컨대, 본 발명의 건강기능식품이 드링크제와 음료류로 제조되는 경우에는 본 발명의 나노베지클 이외에 구연산, 액상과당, 설탕, 포도당, 초산, 사과산, 과즙, 및 각종 식물 추출액 등을 추가로 포함시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 들깻잎에서 유래된 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에서의 용어, "나노베지클" 및 "암"은 상기에서 기재한 바와 같다.
본 발명의 들깻잎에서 유래된 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 아토피용 비누, 클렌징 폼, 클렌징 크림, 클렌징 워터, 목욕제, 스킨 소프너, 스킨 토너, 로션, 크림, 에센스, 아스트린젠트, 유액, 젤, 립스틱, 분무제, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 바디클렌져, 팩, 마사지제, 페이스파우더, 콤팩트, 파운데이션, 투웨이케이크 및 메이크업베이스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 보조제로 부형제를 포함할 수 있다. 상기 부형제로는 이에 한정되지는 않으나 예를 들어, 피부연화제, 피부 침투 증강제, 착색제, 방향제, 유화제, 농화제 및 용매를 포함할 수 있다. 또한, 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제 및 보습제 등을 추가로 포함할 수 있으며, 물성개선을 목적으로 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화장료 조성물로 세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 본 발명의 바이아릴아미드 유도체를 첨가하여 용이하게 제조할 수 있다. 크림을 제조하는 경우에는 일반적인 수중유적형(O/W)의 크림베이스에 본 발명의 바이아릴아미드 유도체를 첨가하여 제조할 수 있다. 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등과 물성개선을 목적으로 한 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 추가로 첨가할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 들깻잎에서 유래된 나노베지클(nanovesicle)을 제조하는 방법으로서, 들깻잎 착즙액을 제조하는 단계; 상기 들깻잎 착즙액에 대하여 한외여과를 수행하여 여과액을 수득하는 단계; 및 상기 여과액에 대해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 나노베지클을 회수하는 단계;를 포함하는 나노베지클의 제조방법을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "들깻잎 착즙액" 은 들깻잎에 열이나 효소를 가하지 않고 기계적, 물리적인 힘을 가하여 들깻잎 내부에 포함된 유용성분을 외부로 유출시켜 얻어진 액상의 유체를 의미한다.
상기 들깻잎 착즙액을 제조하는 단계는 들깻잎을 준비한 후, 들깻잎을 가압하여 착즙액을 제조할 수 있다. 상기 들깻잎은 가압하기 전에 세척하는 과정을 추가로 진행할 수 있다.
상기 들깻잎의 세척은 흐르는 물을 이용하여 상기 준비된 식물을 세척하는 것일 수 있으나, 예를 들어 PBS 또는 탄산수소나트륨이 용해된 정제수를 이용하여 수행될 수도 있다. 상기 탄산수소나트륨은 식품첨가물로 널리 사용되는 것으로 독성이 없기 때문에 들깻잎의 세척과정에 사용할 수 있다.
상기 들깻잎에 함유되어 있는 영양성분이 용이하게 착즙되도록, 상기 세척단계와 착즙단계 사이에 상기 들깻잎을 평균 직경이 1 내지 30 mm로 분쇄되는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
이후, 상기 들깻잎 착즙액을 여과하여 고형물을 제거하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 고형물은 1 ㎜ 이상의 평균 직경을 갖는 것일 수 있다.
또한, 상기 고형물이 제거된 들깻잎 착즙액의 여과물을 원심 분리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 원심분리 단계는 7,000 내지 9,000 x g로 1차 원심분리한 후 이의 상층액을 19,000 내지 21,000 x g로 2차 원심 분리함으로써 수행될 수 있다.
상기 한외여과를 수행하여 여과액을 수득하는 단계에서 "한외여과"는 비균질 혼합용액을 구성하는 각각의 물질을 압력 또는 농도구배에 의해 반투과성 막을 따라 분리시키는 막-기반분리공정을 의미한다. 한외여과 막은 일정한 컷오프 값을 갖는 기공 크기를 갖는다. 본 발명에서 이용하는 한외여과는 5 내지 300 kDa의 컷오프(cut-off) 값을 가지며, 가장 바람직하게는 100 내지 300 kDa의 컷오프(cut-off) 값을 가진다.
상기 한외여과를 수행하여 여과액을 수득하는 단계는 크기 배제 크로마토그래피 전에 수행될 수도 있으며, 크로마토그래피 완료 후에 수행될 수도 있다. 바람직하게는 상기 한외여과 단계와 상기 크기 배제 크로마토그래피 단계를 순차적으로 수행될 수 있다. 이와 같이 한외여과 후 크기 배제 크로마토그래피를 수행할 경우 한외여과를 통한 농축으로 시료의 부피가 감소한 뒤 크기 배제 크로마토그래피가 적용되어 보다 효율적인 분리공정이 이루어질 수 있다.
상기 크기 배제 크로마토그래피는 pH 6 내지 8의 인산완충액(PBS)으로 평형화된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "크기배제 크로마토그래피(Size Exclusion Chromatography, SEC)"는 비균질 혼합물을 구성하는 각각의 물질 중 정지상의 비드 포어(bead pore) 직경보다 크기가 작은 물질은 포어에 진입하여 상대적으로 느리게 용출되고, 크기가 큰 물질은 포어에 진입하지 않고 이동상을 따라 빠르게 용출됨으로써, 이로부터 유발되는 각 물질의 크기에 따른 이동속도 차이에 기반하여 물질을 분리하는 크로마토그래피를 의미한다.
상기 크기 배제 크로마토그래피로부터 얻은 각 분획물에 입도 분석을 수행하여 50 내지 200 nm, 바람직하게는 50 내지 180 nm, 더욱 바람직하게는 50 내지 150 nm, 가장 바람직하게는 80 내지 150 nm의 평균 직경을 갖는 분획물을 선택하여 회수할 수 있다.
기존에는 식용 식물 유래 나노베지클 분리 및 정제를 위해 고분자 침전법 또는 초고속 원심분리방법의 경우, 순도가 떨어지고 나노베지클 이외의 불순물이 많이 나올 수 있으며, 가혹한 원심분리 조건에 따라 파쇄되는 경우가 있었다. 이에 따라 상기 나노베지클을 회수하는 단계는 나노베지클이 아닌 다른 불순물들을 제외하여 불순물의 효과가 아닌 나노베지클의 효과만을 확인하기 위해 크기 배제 크로마토그래피를 이용한 고순도 나노베지클 분리 및 정제할 수 있다. 즉, 상기 크기 배제 크로마토그래피를 이용하여 들깻잎으로부터 천연 화합물을 추출하는 것이 아닌 들깻잎에 있는 세포밖 소포체인 나노베지클을 고순도 및 고효율로 분리 및 정제할 수 있다.
이렇게 분리 및 정제된 순수 들깻잎 유래 나노베지클은 인간 정상세포에 대패서는 독성이 없고 증식을 도우나, 유방암 및 자궁경부암과 같은 특정 암세포의 증식만 선택적으로 억제하여 선택적 항암 활성 효과를 가질 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 들깻잎 유래 나노베지클의 분리 및 정제 방법
들깻잎 80 g을 착즙기를 이용하여 들깻잎 착즙 용액을 수득하였다. 상기 들깻잎 착즙 용액은 원심 분리기(Centrifugation)에 넣고 크기가 큰 불순물들을 제거한 후 얻은 상층액을 이용하여 들깻잎 유래 나노베지클을 분리하였다. 구체적으로 Amicon Ultraㄾ-15 100kDa 원심분리기(Centrifugal filter)(Merck Millipore, Cat. No: UFC910024)에 들깻잎 착즙 용액 13 mL를 넣어준 후 5,000x g, 3 h 및 4 ℃의 조건에서 원심분리한 후, 얻어진 상층액 500 ㎕를 0.2 ㎛의 시린지 필터를 진행하여 Eppendorf 튜브 1.5 mL (SPL, Cat.No : 50015)에 옮겼다.
qEVoriginal/70 nm(Izon science, Cat.No: SP1)을 실험 클램프 스탠드에 고정한 후 컬럼(column) 내부의 저장 용액을 제거하였다. 그 다음 1X PBS (pH 7.4) 용액 10 mL을 이용하여 평형(equilibration)을 진행하였다. 다음으로 이전 단계에서 여과된 용액을 qEV original 컬럼에 주입 후 용액이 모두 크로마토그래피 비드로 내려가면 PBS 용액을 넣어주었다. 이때 크기 배제 크로마토그래피가 받는 중력의 힘을 일정하게 유지하기 위하여 PBS 용액이 일정한 부피인 2 mL을 넘지 않도록 주입하였다. Eppendorf 튜브 1.5 mL에 500 ㎕씩 담으며 하나의 분획물(fraction)로 칭하였고, 총 33개의 분획물을 얻었다.
도 1 및 도 2에서와 같이, 크기 배제 크로마토그래피 상에서 들깻잎 유래 나노베지클과 분리 및 정제되었고, 나노베지클이 색을 띄는 이유는 나노베지클 내에 들깻잎의 특정 성분이 포함되어 있음을 확인하였다. 나노베지클 내의특정 성분은 안전하고 안정적으로 체내 전달하는 역할을 할 수 있으며, 특히 불용성 물질들을 잘 탑재할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. 들깻잎 유래 나노베지클 크기 분포도 및 농도와 순도 분석
상기 실시예 1에서 제조된 들깻잎 유래 나노베지클의 농도와 순도를 결정하기 위해 나노입자추적분석(Nanoparticle tracking analyzer, NTA)과 단백질 정량화의 BCA(Bicinchoninic acid) assay를 이용하여 분석하였다. 분리한 상기 실시예 1의 들깻잎 유래 나노베지클을 1:1000의 희석을 진행한 후, 나노입자추적분석 장치를 이용하여 나노베지클의 농도와 평균 크기를 측정하였다. 이후, 사용한 분획물의 단백질 농도를 정량화 하기 위해 BCA assay를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 들깻잎 유래 나노베지클의 나노입자는 그 크기가 100 내지 200 nm에 주로 분포하는 것을 확인하였다.
실시예 3. 인간 암세포에서 들깻잎 유래 나노베지클의 항증식 효과 분석
96-well cell culture plate에 10% FBS과 1% 페니실린과 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM을 사용하여 유방암 세포(MDA-MB-231, MCF-7), 자궁경부암 세포(HeLa), 폐암 세포(A549), 대장암 세포(SW480)를 0.5 x 104 cell/cm2으로 세포를 접종하였다. 24시간 후에 배지를 제거한 후 PBS로 세척하였다. 이때, 실험군 세포에 1 x 109 particles/mL부터 1 x 1012 particles/mL의 농도까지 농도별로 세포 배양액과 함께 배양하였다. 세포의 활성 정도는 WST-1을 통해 분석하였다. 모든 값은 평균±표준 편차(* p<0.1, ** p<0.01 및 *** p<0.001; n = 3)로 표시하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 들깻잎 유래 나노베지클은 유방암 세포(MDA-MB-231, MCF-7) 및 자궁경부암 세포(HeLa)에서 증식을 억제하는 효과를 나타내었으며, 특히, 삼중음성유방암 세포인 MDA-MB-231 세포에서는 들깻잎 유래 나노베지클를 처리한 후 48시간 후부터 대조군에 비하여 증식이 억제됨을 확인하였다. 반면, 폐암 세포(A549), 대장암 세포(SW480)에서는 항암 효과가 나타나지 않았다. 이로써, 들깻잎 유래 나노베지클은 유방암 세포 및 자궁경부암 세포에 대한 항암 효과 및 항증식 효과를 있음을 확인하였다.
실시예 4. 인간 정상세포에서 들깻잎 유래 나노베지클의 세포독성 분석
96-well cell culture plate에 10% FBS과 1% 페니실린과 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM을 사용하여 인간 배아신장세포(HEK293T), 인간 피부 각질 세포(HaCaT), 인간 섬유아세포(HDF)를 0.5 x 104 cell/cm2으로 세포를 접종하였다. 24시간 후에 배지를 제거한 후 PBS로 세척하였다. 이때, 실험군 세포에 1 x 109 particles/mL부터 1 x 1012 particles/mL의 농도까지 농도별로 세포 배양액과 함께 배양하였다. 세포의 활성 정도는 WST-1을 통해 분석하였다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 들깻잎 유래 나노베지클을 넣지 않은 대조군(CTRL)과 비교하여 고농도(1 x 1012 particles/mL)의 들깻잎 유래 나노베지클 처리를 비교하였을 때 세포 활성이 떨어지지 않는 것을 확인하였다. 이로써, 들깻잎 유래 나노베지클은 정상세포에 대해 세포 독성을 일으키지 않음을 확인하였다.
실시예 5. 삼중음성 유방암세포에서 들깻잎 유래 나노베지클의 이동 및 침윤 저해 효과
들깻잎 유래 나노베지클이 암세포 이동 및 침윤에 대한 저해 효과가 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 24-well transwell insert (8 μm pore, costar 3422)에 1.5x105 cells/well의 농도로 MDA-MB-231를 접종하였고, 실험군에는 2x1011 particles/ml의 농도로 들깻잎 유래 나노베지클(Parex)을 처리하였다. 37℃, 5% CO2에서 48시간 배양하였다. Transwell을 통과하여 이동된 세포를 측정하기 위해 PBS wash 후, 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 고정하였다. 이후, 크리스탈 바이올렛의 투과를 높이기 위해 메탄올을 15분간 세포에 처리하였다. 0.1% 크리스탈 바이올렛 (crystal violet, Sigma-Aldrich)에 30분간 염색 후 PBS 세척하여 현미경으로 세포수를 측정하였다. 또한, MDA-MB-231 세포의 침윤 정도를 확인하기 위해 24-well transwell insert에 200 μg/mL의 농도로 matrigel을 처리하였다. 침윤된 세포 염색 및 측정 과정은 암 세포 이동 측정 실험과 동일하게 진행하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 들깻잎 유래 나노베지클을 처리한 세포에서는 대조군(CTRL)에 비해 삼중음성 유방암세포의 이동 및 침윤이 감소하였음을 확인하였다. 이로써, 들깻잎 유래 나노베지클은 삼중음성 유방암세포의 전이를 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 6. 비소세포 폐암 세포에서 들깻잎 유래 나노베지클의 이동에 대한 분석
*앞서 삼중음성 유방암세포와 동일한 방법으로, 들깻잎 유래 나노베지클이 비소세포성 폐암세포의 이동에 대한 저해 효능이 있는지 확인하는 실험을 수행하였다. 24-well transwell insert에 2.0 x 105 cells/well의 농도로 A549 세포를 접종하였고, 실험군에는 2x1011 particles/ml의 농도로 들깻잎 유래 나노베지클(Parex)을 처리하였다. 37℃, 5% CO2에서 48시간 배양하였다. Transwell을 통과한 이동된 세포를 측정하기 위해 PBS wash 후, 4% 파라포름알데하이드를 이용하여 고정하였다. 그런 다음, 크리스탈 바이올렛의 투과를 높이기 위해 메탄올을 15분간 세포에 처리하였다. 0.1% 크리스탈 바이올렛에 30분간 염색 후 PBS 세척하여 현미경으로 세포수를 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 들깻잎 유래 나노베지클을 처리한 세포에서는 비소세포성 폐암세포의 이동이 감소하지 않음을 확인하였다. 이로써, 들0깻잎 유래 나노베지클은 비소세포성 폐암세포의 이동을 억제하는 효과가 없음을 확인하였다.
실시예 7. 인간 암세포주 및 인간 정상세포주에서 들깻잎 유래 나노베지클의 세포 내 투과 비교
앞서 세포에 따른 항암, 항증식 효과가 들깻잎 유래 나노베지클의 세포 내 투과 정도에 따른 효과인지 확인하기 위하여 인간 암세포주 및 정상 세포에서 세포 내 투과 정도를 비교하였다. 들깻잎 유래 나노베지클을 염색하는 DiI 염색약 0.5% (v/v)와 들깻잎 유래 나노베지클 2x1011 particles/mL를 22℃, 15분간 반응시킨 후, 한외 여과 (ultrafiltration)을 통해 DiI로 염색된 깻잎 유래 나노베지클만 분리하여 실험에 사용하였다.
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 들깻잎 유래 나노베지클(Parex)은 앞서 항증식 및 전이 억제 효과가 있었던 세포에 특이적으로 전달되는 것은 아님을 확인하였다. 이로써, 들깻잎 유래 나노베지클은 특이적인 항암 효능이 세포 내 투과 정도에 따른 효과가 아님을 확인하였다.
실시예 8. 삼중음성 유방암세포에서 식물 유래 나노베지클의 항증식 효과
들깻잎 유래 나노베지클의 특이적인 항암 효능이 다른 일반적인 식물 유래 나노베지클에도 나타나는지 확인하기 위해, 검은콩, 당근, 양배추로부터 분리한 나노베지클을 삼중 음성유방암 세포에 처리하여 증식 억제 효과를 평가하였다. 96-well cell culture plate에 10% FBS과 1% 페니실린, 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM을 사용하여 삼중음성유방암세포를 0.5x104 cells/cm2으로 세포를 접종하였다. 24시간 후에 배지를 제거한 후 PBS로 세척하였다. 이때, 1x1011 particles/mL의 들깻잎(Parex), 당근(Carex), 검은콩(Blex), 양배추(Cabex) 유래 나노베지클을 실험군 세포에 배양액과 함께 배양하였다. 세포의 증식 정도는 WST-1을 통해 분석하였다.
그 결과, 들깻잎 유래 나노베지클을 처리한 MDA-MB-231 세포에서만 증식을 억제하는 효과가 나타났고, 이를 제외한 검은콩, 당근, 양배추 유래 나노베지클을 처리한 MDA-MB-231 세포에서는 증식을 억제하는 효과가 나타나지 않음을 확인하였다. 이로써, 삼중음성 유방암세포에서의 항증식 효능은 들깻잎 유래 나노베지클의 고유한 특성임을 확인하였다.
본 발명의 들깻잎 유래 나노베지클은 크기 배제 크로마토그래피를 통해 분리 및 정제하였고, 들깻잎 유래 나노베지클은 몇 가지 암 세포에 선택적으로 암세포의 증식을 억제하였으며, 정상세포인 인간 배아신장세포, 피부 각질 세포, 인간 섬유아세포에서 세포 독성을 일으키지 않음을 통해 들깻잎 유래 나노베지클은 정상세포에는 영향을 주지 않으며, 특이하게도 유방암 등 몇 가지 암 세포에 선택적인 항암 효과를 나타냄을 확인하였다. 특히, 삼중음성 유방암세포에서는 다른 세포에 비하여 들깻잎 유래 나노베지클 처리 후 48 시간일 때부터 세포 증식이 효과적으로 억제되었으며, 삼중음성유방암 세포의 이동 및 침윤을 억제하는 것을 확인하였다. 이러한 특이적인 항암 효능은 일반적인 식물 유래 나노베지클의 특성이 아닌 들깻잎 유래 나노베지클의 고유한 특성임을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 들깻잎 유래 나노베지클은 동물세포 유래 세포밖 소포체에 비하여 경제적인 대량생산이 가능하다. 또한, 천연 물질로 안전성 및 생체 적합성이 좋으며, 체액 내에서 안정적으로 존재하기 때문에 식물에 존재하는 천연 생리활성 물질의 효율적인 세포전달이 가능하다. 뿐만 아니라 정상세포에는 영향을 주지 않고, 특정 암세포에 증식 억제 효과를 가지기 때문에 암 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (14)

  1. 들깻잎에서 유래된 나노베지클(nanovesicle)을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 나노베지클은 평균 직경이 50 내지 200 nm인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 나노베지클은 크기 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography)로 분리된 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 나노베지클은 유방암 세포인 MDA-MB-231 세포 또는 MCF-7 세포; 또는 자궁경부암 세포인 HeLa 세포의 세포증식을 억제하는 활성을 가지는 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 암은 유방암 또는 자궁경부암인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 약학 조성물은 과립제, 산제, 정제, 피복제, 캡슐제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 및 주사 액제로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형인 것인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 들깻잎에서 유래된 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 건강기능식품 조성물은 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 젤리 및 바로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형인 것인, 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  9. 들깻잎에서 유래된 나노베지클을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 화장료 조성물은 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 아토피용 비누, 클렌징 폼, 클렌징 크림, 클렌징 워터, 목욕제, 스킨 소프너, 스킨 토너, 로션, 크림, 에센스, 아스트린젠트, 유액, 젤, 립스틱, 분무제, 샴푸, 린스, 트리트먼트, 바디클렌져, 팩, 마사지제, 페이스파우더, 콤팩트, 파운데이션, 투웨이케이크 및 메이크업베이스로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 제형인 것인, 암의 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
  11. 제1항에 따른 들깻잎에서 유래된 나노베지클을 제조하는 방법으로서,
    들깻잎 착즙액을 제조하는 단계;
    상기 들깻잎 착즙액에 대하여 한외여과를 수행하여 여과액을 수득하는 단계; 및
    상기 여과액에 대해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 나노베지클을 회수하는 단계;를 포함하는 나노베지클의 제조방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 한외여과는 5 내지 300 kDa의 컷오프(cut-off) 값을 가지는 것인, 나노베지클의 제조방법.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 크기 배제 크로마토그래피는 pH 6 내지 8의 인산완충액(PBS)으로 평형화된 것인, 나노베지클의 제조방법.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 크기 배제 크로마토그래피로부터 얻은 각 분획물에 입도 분석을 수행하여 50 내지 200 nm의 평균 직경을 갖는 분획물을 선택하여 회수하는 것인, 나노베지클의 제조방법.
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