JP6928337B2

JP6928337B2 - Ｎｏ産生抑制剤

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Publication number: JP6928337B2
Application number: JP2017030374A
Authority: JP
Inventors: 直子岩間; 真珠子小堀; 和茂本多
Original assignee: National Agriculture and Food Research Organization; Hirosaki University NUC
Current assignee: National Agriculture and Food Research Organization; Hirosaki University NUC
Priority date: 2017-02-21
Filing date: 2017-02-21
Publication date: 2021-09-01
Anticipated expiration: 2037-02-21
Also published as: JP2018135294A

Description

本発明は、一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制剤に関し、詳しくはＮＯの過剰産生に起因する疾患の予防または治療用医薬品等の有効成分として有用なＮＯ産生抑制剤に関する。

ＮＯは、構成型一酸化窒素合成酵素 (ｃＮＯＳ) によってアルギニンと酸素とから合成され、細胞内の可溶型グアニル酸シクラーゼを活性化してサイクリックＧＭＰ (ｃＧＭＰ) の合成を促進し、血管内皮由来のＮＯによる血小板凝集抑制作用、血管拡張作用、抗動脈硬化作用、中枢神経系における記憶や学習機能、末梢神経系におけるＮＯ作動性神経を介する平滑筋拡張作用等、種々の生理機能に関与することが知られている。
一方、炎症性サイトカインや細菌毒素の刺激により誘導される誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）は多量のＮＯを産生し、活性酸素と反応することにより周囲の細胞に対して毒性を発揮し、病原微生物や癌細胞を排除する感染防御機能、免疫機能に関与することが知られている。

しかし、ｉＮＯＳ由来のＮＯは決して非自己の細胞に対してのみ毒性を発揮するのではなく、たとえば、細菌毒素により血管平滑筋で誘導されたｉＮＯＳ由来の多量のＮＯは、強力な血管拡張と過剰な透過性の亢進を生じ、エンドトキシンショックを誘発する。また、グリア細胞などで誘導されたｉＮＯＳ由来のＮＯにより中枢神経細胞の変性や脱落が生じることや、Ｉ型糖尿病などの自己免疫疾患でみられる細胞障害にもｉＮＯＳの関与が指摘されており、生体内でＮＯが過剰に産生されて滞留することが、若年性糖尿病、関節炎等の炎症性疾患やがんの引き金になることが知られている。
また、皮膚において、ＮＯは寄生虫に対する防御、創傷治癒、炎症、疼痛増強等に関与しており、乾癬、アトピー性皮膚炎、扁平苔癬、水疱症、膠原病等の炎症性皮膚病変においてｉＮＯＳが表皮ケラチノサイトに発現され、ＮＯが産生されることが知られている。特に慢性の掻痒性皮膚疾患であるアトピー性皮膚炎や乾癬等に罹患した患者の皮膚で、ＮＯ産生が増加すること、および、ケラチノサイト由来のＮＯが、アトピー性皮膚炎等の掻痒性皮膚疾患において、痒みの増強因子として作用することが報告されている。

それゆえ、ｉＮＯＳ選択的な阻害薬の開発が望まれているが、臨床応用が可能なものは未だに得られていない。
また、ｉＮＯＳにより産生されるＮＯの産生を抑制するＮＯ産生抑制剤の探索が進められており、サクラ抽出物（特許文献１）、イソフムロン（特許文献２）、スフィンゴ糖脂質（特許文献３）、シソ抽出物、オウゴン抽出物（特許文献４）等が報告されている。
しかしながら、ＮＯ産生抑制剤には、ｉＮＯＳによる過剰な産生に対して抑制作用を示す一方で、種々の生理機能に関与するＮＯや、感染防御機能、免疫機能等に関与するＮＯに対して過度の抑制作用を示すことなく、生体に対する安全性の高いものであることが要求される。

特開２０１２−２２９１７０号公報特開２０１３−１７７３６９号公報特開２０１６−１０８３１４号公報特開２０１６−１９０８２２号公報

そこで、本発明は、ＮＯ産生抑制作用に優れるとともに、安全性が高いＮＯ産生抑制剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、カタクリ（Erythronium japonicum Decne.）の葉部の抽出物が、低濃度で優れたＮＯ産生抑制作用を示し、かつ細胞毒性も低いことを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、次の通りである。
［１］カタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部の抽出物を含有する、一酸化窒素産生抑制剤。
［２］カタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部の抽出物が、水と低級アルコールとの混合溶媒による抽出物である、［１］に記載の一酸化窒素産生抑制剤。
［３］カタクリ（Erythronium）属に属する植物がカタクリ（Erythronium japonicum Decne.）である、［１］または [２]に記載の一酸化窒素産生抑制剤。
［４］［１］〜［３］のいずれかに記載の一酸化窒素産生抑制剤を含有する、医薬品。
［５］がんの予防または治療用医薬品である、［４］に記載の医薬品。
［６］自己免疫疾患の予防または治療用医薬品である、［４］に記載の医薬品。
［７］神経変性疾患の予防または治療用医薬品である、［４］に記載の医薬品。
［８］掻痒性皮膚疾患の予防または治療用医薬品である、［４］に記載の医薬品。
［９］皮膚外用剤である、［８］に記載の医薬品。
［１０］［１］〜［３］のいずれかに記載の一酸化窒素産生抑制剤を含有する、掻痒性皮膚疾患の予防または改善用医薬部外品。
［１１］［１］〜［３］のいずれかに記載の一酸化窒素産生抑制剤を含有する、掻痒性皮膚疾患の予防または改善用化粧品。
［１２］［１］〜［３］のいずれかに記載の一酸化窒素産生抑制剤を含有する、一酸化窒素の過剰産生により生じる疾患の予防または改善用食品。

本発明の一酸化窒素（ＮＯ）産生抑制剤は、優れたＮＯ産生抑制作用を有し、かつ安全性が高く、副作用を生じる危険性が少ない。従って、本発明のＮＯ産生抑制剤は、ＮＯの過剰産生により生じる疾患に対し、良好な予防または治療もしくは改善効果を有する。

本発明の実施例１のＮＯ産生抑制剤について、ＮＯ産生抑制作用および細胞毒性を示す図である。図中、「＊＊」はＰ＜０．０１で有意であることを示す。

本発明のＮＯ産生抑制剤は、カタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部の抽出物を含有する。

本発明で用いるカタクリ（Erythronium）属に属する植物は、ユリ科（Liliaceae）に属する多年草であり、カタクリ（Erythronium japonicum Decne.）、Erythronium americanum Ker-Gawl.、キバナカタクリ（Erythronium grandiflorum Pursh.）、Erythronium caucasicum Woronow、Erythronium oregonum Applegate、Erythronium sibiricum (Fisch. et C.A.Mey.) Krylov等が挙げられる。
特に、カタクリ（Erythronium japonicum Decne.）は、日本全国に広く分布し、その鱗茎は古くから良質なデンプン源として利用され、また、地上部は山菜として食されており、食経験の豊かな植物であるため、好ましく用いられる。本発明においては、カタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部を用いる。

カタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部は水洗し、そのまま、または細切、乾燥、粉砕等を行うことにより、スラリー状、細粒状、顆粒状または粉末状として抽出に供する。
抽出溶媒としては、水や、低級アルコール（たとえば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ブタノール等）、多価アルコール（たとえば、プロパンジオール、ブタンジオール、グリセリン等）等の極性を有する有機溶媒を用いることができる。これらは、１種を単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。
本発明の目的には、水および低級アルコールが好ましく用いられ、水と低級アルコールとの混合溶媒がより好ましく用いられる。低級アルコールとしては、メタノールおよびエタノールが好ましい。
また、水と低級アルコールとの混合割合（水：低級アルコール）は、これらの体積比にて５０：５０〜１０：９０であることが好ましく、３０：７０〜２０：８０であることがより好ましい。
抽出溶媒は、カタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部１００ｇ（乾燥重量）に対し、通常２００ｍＬ〜３，０００ｍＬ、好ましくは５００ｍＬ〜２，０００ｍＬを用いる。

抽出は、上記抽出溶媒にカタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部を浸漬し、そのまま静置し、もしくは撹拌して行うことができる。また、ビーズ式破砕装置等により、カタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部を抽出溶媒中で破砕し、またはカタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部を抽出溶媒中でホモジネートして行ってもよい。
抽出温度および時間は、カタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部の前処理の方法、抽出溶媒の種類、抽出方法等に応じて、適宜決定することができる。たとえば、低級アルコールを含む抽出溶媒に浸漬して抽出する場合、抽出は通常２０℃〜３０℃で１日間〜１４日間行い、２５℃〜３０℃で２日間〜７日間行うことが好ましい。
抽出後、定法に従い、たとえばろ過、遠心分離等により、抽出液を回収する。

本発明においては、カタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部の抽出物としては、上記溶媒による抽出液をそのまま用いてもよく、該抽出液を希釈もしくは濃縮し、または乾燥して用いてもよく、粗精製または精製して用いてもよい。前記抽出物の粗精製および精製は常法に従って行えばよく、たとえば「ダイヤイオンＨＰ」（三菱化学株式会社製）等のイオン交換樹脂、「Ｓｅｐ−ＰａｋＣ−１８」（ウォーターズ社製）等の吸着剤による吸着および溶出、クロマトグラフィー等を適宜組み合わせて実施することができる。

本発明のＮＯ産生抑制剤は、上記カタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部の抽出物に、必要に応じて、製剤の分野で用いられる一般的な添加剤を加えて、製剤の分野で周知の製剤化手段、たとえば第十七改正日本薬局方製剤総則［３］製剤各条に記載された方法等により調製することができ、溶液状、懸濁液状、乳液状等の液状；ゲル状、ペースト状、クリーム状等の半固形状；粉末状、顆粒状、タブレット状、カプセル状等の固形状等の形態とすることができる。

上記添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、被覆剤、基剤、溶剤、乳化剤、分散剤、懸濁化剤、安定化剤、粘稠剤、ｐＨ調整剤、抗酸化剤、防腐剤、保存剤、矯味剤、甘味剤、香料、着色剤等が挙げられる。

賦形剤としては、無水ケイ酸、ケイ酸カルシウム、ケイ酸アルミン酸マグネシウム、デンプン（トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、コムギデンプン等）、糖類（ブドウ糖、乳糖、白糖等）、糖アルコール（ソルビトール、マルチトール、マンニトール等）等が挙げられる。

結合剤としては、ゼラチン、カゼインナトリウム、デンプンおよび加工デンプン（トウモロコシデンプン、ヒドロキシプロピルスターチ、アルファー化デンプン、部分アルファー化デンプン等）、セルロースおよびその誘導体（結晶セルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース等）等が挙げられる。

崩壊剤としては、ポビドン、クロスポビドン、セルロースおよびその誘導体（結晶セルロース、メチルセルロース等）等が挙げられる。

滑沢剤としては、タルク、合成ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム等が挙げられる。

被覆剤としては、メタクリル酸共重合体（メタクリル酸・アクリル酸エチル共重合体等）、メタクリレート共重合体（アクリル酸エチル・メタクリル酸メチル共重合体、アクリル酸エチル・メタクリル酸メチル・メタクリル酸塩化トリメチルアンモニウムエチル共重合体等）等が挙げられる。

基剤としては、炭化水素（流動パラフィン等）、ポリエチレングリコール（マクロゴール４００、マクロゴール１５００等）等が挙げられる。

溶剤としては、精製水、一価アルコール（エタノール等）、多価アルコール（プロピレングリコール、グリセリン等）等が挙げられる。

乳化剤としては、非イオン性界面活性剤（ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル等）、陰イオン性界面活性剤（アルキル硫酸ナトリウム、Ｎ−アシルグルタミン酸塩等）、精製大豆レシチン等が挙げられる。

分散剤としては、アラビアゴム、アルギン酸プロピレングリコール、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール等）、陰イオン性界面活性剤（アルキル硫酸ナトリウム等）等が挙げられる。

懸濁化剤としては、アルギン酸ナトリウム、非イオン性界面活性剤（ポリオキシエチレンラウリルエーテル、グリセリン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステル等）等が挙げられる。

安定化剤としては、アジピン酸、エチレンジアミン四酢酸塩（カルシウム二ナトリウム塩、二ナトリウム塩等）、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン等が挙げられる。

粘稠剤としては、水溶性高分子（ポリアクリル酸ナトリウム、カルボキシビニルポリマー等）、多糖類（アルギン酸ナトリウム、キサンタンガム、トラガント等）等が挙げられる。

ｐＨ調整剤としては、塩酸、リン酸、酢酸、クエン酸、乳酸、水酸化ナトリウム、リン酸水素ナトリウム等が挙げられる。

抗酸化剤としては、ジブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ｄｌ−α−トコフェロール、エリソルビン酸、没食子酸プロピル等が挙げられる。

防腐剤としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、デヒドロ酢酸、デヒドロ酢酸ナトリウム、パラオキシ安息香酸エステル（パラオキシ安息香酸メチル等）等が挙げられる。
また、保存剤としては、安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビトール、パラオキシ安息香酸エステル（パラオキシ安息香酸メチル等）、プロピレングリコール等が挙げられる。

矯味剤としては、アスコルビン酸、エリスリトール、５’−グアニル酸二ナトリウム、クエン酸、Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、酒石酸、ＤＬ−リンゴ酸等が挙げられる。
また、甘味剤としては、アスパルテーム、カンゾウエキス、サッカリン等が挙げられる。

香料としては、オレンジエッセンス、ｌ−メントール、ｄ−ボルネオール、バニリン、リナロール等が挙げられる。

着色剤としては、タール色素（食用赤色２号、食用青色１号、食用黄色４号等）、無機顔料（ベンガラ、黄色三二酸化鉄、酸化チタン等）、天然色素（アナトー色素、ウコン色素、カロテノイド等）等が挙げられる。

上記した添加剤は、必要に応じて、１種または２種以上を用いることができる。

上記したカタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部の抽出物は、後述するように、優れたＮＯ産生抑制作用を示し、また、食経験のある植物由来であって、安全性が高く、有効なＮＯ産生抑制作用を示す濃度で細胞毒性を示さない。
従って、上記したカタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部の抽出物を含有する本発明のＮＯ産生抑制剤は、ＮＯの過剰産生に起因する疾患の予防または治療もしくは改善において、有効成分として、安全に使用することができる。

本発明のＮＯ産生抑制剤におけるカタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部の抽出物の含有量は、抽出物の調製方法（抽出溶媒の種類、抽出温度、抽出方法等）や、ＮＯ産生抑制剤の剤形等に応じて適宜決定されるが、固形分の乾燥重量にして、通常０．１重量％〜２０重量％であり、好ましくは１重量％〜１５重量％であり、より好ましくは５重量％〜１２．５重量％である。
なお、上記「固形分」とは、カタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部の抽出物より、抽出溶媒を留去して得られる固形分をいう。

本発明はまた、本発明のＮＯ産生抑制剤を含有する医薬品（以下、「本発明の医薬品」とも称する）を提供する。

本発明の医薬品は、上記した本発明のＮＯ産生抑制剤に、必要に応じて、上記した添加剤を加え、製剤の分野で周知の製剤化手段、たとえば第十七改正日本薬局方製剤総則［３］製剤各条に記載された方法等により調製することができ、錠剤、被覆錠剤、チュアブル錠、丸剤、（マイクロ）カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤、エリキシル剤、リモナーゼ剤、シロップ剤、懸濁剤、乳剤、経口ゼリー剤等の経口製剤；溶液状、懸濁液状、乳液状等の注射剤、用時溶解または懸濁して用いる固形状の注射剤、輸液剤、持続性注射剤等の注射用製剤；外用固形剤（外用散剤等）、外用液剤（リニメント剤、ローション剤等）、スプレー剤（外用エアゾール剤、ポンプスプレー剤等）、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤、貼付剤（テープ剤、パップ剤等）等の外用製剤等の剤形とすることができる。

本発明の医薬品は、ＮＯの過剰産生に起因する疾患、たとえば、がん；Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患（たとえば、潰瘍性大腸炎、クローン病等）、血管炎症候群等の自己免疫疾患；老年性認知症、ハンチントン病、パーキンソン病等の神経変性疾患；刺激性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状皮膚炎、限局性掻爬皮膚炎、口周囲皮膚炎、汗疱、扁平苔癬、水疱症（たとえば、尋常性天疱瘡、疱疹状皮膚炎等）、乾癬、乾皮症等の掻痒性皮膚疾患等の予防または治療用医薬品として、好適に用いることができる。

本発明の医薬品は、特に皮膚に適用される外用製剤、すなわち皮膚外用剤として、好適に提供することができ、刺激性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状皮膚炎、限局性掻爬皮膚炎、口周囲皮膚炎、汗疱、扁平苔癬、水疱症（たとえば、尋常性天疱瘡、疱疹状皮膚炎等）、乾癬、乾皮症等の掻痒性皮膚疾患の予防または治療用として、好適に用いることができる。

本発明の医薬品における本発明のＮＯ産生抑制剤の含有量は、本発明の医薬品の剤形や投与経路等に応じて適宜設定されるが、有効成分として含有されるカタクリ（Erythronium）属に属する植物の葉部の抽出物の固形分の乾燥重量にして、通常０．０００５重量％〜５重量％であり、好ましくは０．００１重量％〜２重量％であり、より好ましくは０．００５重量％〜１重量％である。
本発明の医薬品の投与量および投与期間は、本発明の医薬品が投与される患者の性別、年齢、体重、症状およびその重篤度、本発明の医薬品の剤形、投与経路等に応じて、適宜決定される。

また、本発明の医薬品においては、本発明の特徴を損なわない範囲で、ＮＯの過剰産生に起因する疾患の治療に用いられる薬物を併用することができる。
かかる薬物としては、たとえば炎症性腸疾患の治療薬として用いられるサリチル酸製剤（サラゾスルファピリジン、メサラジン等）、ステロイド性抗炎症剤（プレドニゾロン、ヒドロコルチゾン等）、免疫抑制剤（タクロリムス等）、掻痒性皮膚疾患の治療に用いられる非ステロイド性抗炎症薬（スプロフェン、ブフェキサマク、ベンダザック、ウフェナマート等）等が挙げられる。

さらに本発明は、本発明のＮＯ産生抑制剤を含有する医薬部外品、特に皮膚外用医薬部外品（以下、本明細書において「本発明の医薬部外品」ともいう）または化粧品（以下、本明細書において「本発明の化粧品」ともいう）を提供する。
ここで、「医薬部外品」とは、医薬品よりは人体等に対する効果が緩和であるが、何らかの改善効果を有するものをいい、特に皮膚に外用される医薬部外品を「皮膚外用医薬部外品」という。いわゆる薬用化粧品は、皮膚外用医薬部外品に含まれる。
また、「化粧品」とは、身体を清潔にしたり、見た目を美しくしたりする目的で、皮膚等に適用されるもので、作用の緩和なものをいう。
本発明の医薬部外品または化粧品は、上記した本発明の皮膚外用剤に準じて製造することができ、化粧水、美容液、乳液、クリーム、洗顔料、パック、身体用洗浄料等の形態で提供され得る。
本発明の医薬部外品または化粧品は、刺激性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状皮膚炎、限局性掻爬皮膚炎、口周囲皮膚炎、汗疱、扁平苔癬、水疱症（たとえば、尋常性天疱瘡、疱疹状皮膚炎等）、乾癬、乾皮症等の掻痒性皮膚疾患による皮膚症状の予防または改善用として、好適に用いられる。

本発明の医薬部外品または化粧品には、本発明の特徴を損なわない範囲で、多価アルコール（グリセリン、１，３−ブタンジオール、ジプロピレングリコール等）、アミノ酸またはその塩（アラニン、セリン、プロリン、ＤＬ−ピロリドンカルボン酸ナトリウム等）、タンパク質（ホエイ、水溶性コラーゲン、加水分解エラスチン等）、核酸（デオキシリボ核酸ナトリウム等）、ムコ多糖（コンドロイチン硫酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム等）、ヘパリン類似物質、植物抽出物（アシタバ抽出物、キュウリ抽出物、シラカバ抽出物等）等の保湿剤；アズレン類（アズレン、グアイアズレン、グアイアズレンスルホン酸エチル、グアイアズレンスルホン酸ナトリウム等）、アラントインおよびその誘導体（アラントイン、アスコルビン酸アラントイン、アラントイングリチルレチン酸等）、ビタミン（（アスコルビル／トコフェリル）リン酸カリウム、パンテノール等）、植物抽出物（カミツレ抽出物、カンゾウ抽出物、キダチアロエ抽出物等）、グリチルリチン酸およびその塩（グリチルリチン酸、グリチルリチン酸アンモニウム、グリチルリチン酸二カリウム等）、グリチルレチン酸およびその誘導体（グリチルレチン酸、グリチルレチン酸グリセリル、グリチルレチン酸ピリドキシン、サクシニルグリチルレチン酸二ナトリウム等）等の抗炎症・肌荒れ防止剤等を含有させることができる。

本発明の医薬部外品または化粧品における本発明のＮＯ産生抑制剤の含有量は、上記本発明の医薬品における含有量に準じて定められる。
また、本発明の医薬部外品または化粧品の適用量および適用期間は、本発明の医薬部外品等が適用される対象者の性別、年齢、皮膚症状等に応じて適宜決定されるが、掻痒性皮膚疾患による皮膚症状を予防または改善し、皮膚を健康な状態に維持する目的には、長期間にわたり、日常的なスキンケアにおける使用を継続することが好ましい。

さらに本発明は、本発明のＮＯ産生抑制剤を含有し、ＮＯの過剰産生に起因する疾患の予防または改善用として有用な食品（以下本明細書において、「本発明の食品」ともいう）を提供する。

本発明の食品は、本発明のＮＯ産生抑制剤に、必要に応じて、食品の製造に際して一般的に用いられる食品添加物を加え、通常の食品製造技術により製造することができ、液状、懸濁液状、乳状等の液状食品；ゲル状、クリーム状、ペースト状等の半固形状食品；粉末状、顆粒状、シート状、カプセル状、タブレット状等の固形状食品等、種々の形態で提供することができる。

さらに、本発明の食品は、本発明のＮＯ産生抑制剤を各種食品原材料に加え、必要に応じて一般的に用いられる食品添加物を加えて製造することができ、清涼飲料水（果汁飲料、スポーツ飲料、コーヒー飲料、茶系飲料等）、乳製品（乳酸菌飲料、発酵乳、バター、チーズ、ヨーグルト、加工乳、脱脂乳等）、畜肉製品（ハム、ソーセージ、ハンバーグ等）、魚肉練り製品（蒲鉾、竹輪、さつま揚げ等）、卵製品（だし巻き、卵豆腐等）、菓子（クッキー、ゼリー、チューイングガム、キャンディ、スナック菓子、冷菓等）、パン、麺類、漬物、干物、佃煮、スープ、調味料等、種々の形態で提供することができる。
また、本発明の食品は、瓶詰め食品、缶詰食品、レトルトパウチ食品としても提供することができる。

上記食品添加物としては、製造用剤（かんすい、結着剤等）、増粘安定剤（キサンタンガム、カルボキシメチルセルロースナトリウム等）、ゲル化剤（ゼラチン、寒天、カラギーナン等）、ガムベース（酢酸ビニル樹脂、ジェルトン、チクル等）、乳化剤（グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、サポニン、レシチン等）、保存料（安息香酸、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、ε−ポリリシン等）、酸化防止剤（アスコルビン酸、エリソルビン酸、カテキン等）、光沢剤（セラック、パラフィンワックス、ミツロウ等）、防かび剤（チアベンタゾール、フルジオキソニル等）、膨張剤（炭酸水素ナトリウム、グルコノδ−ラクトン、ミョウバン等）、甘味料（アスパルテーム、アセスルファムカリウム、カンゾウ抽出物等）、苦味料（カフェイン、ナリンジン、ニガヨモギ抽出物等）、酸味料（クエン酸、酒石酸、乳酸等）、調味料（Ｌ−グルタミン酸ナトリウム、５’−イノシン酸二ナトリウム等）、着色料（アナトー色素、ウコン色素、クチナシ色素等）、香料（アセト酢酸エチル、アニスアルデヒド等の合成香料、オレンジ、ラベンダー等の天然香料）等が挙げられる。
本発明において、上記食品添加物は、１種または２種以上を用いることができる。

さらに、本発明のＮＯ産生抑制剤を、一般的に食事やデザートに供される各種食品に添加して、本発明の食品とすることができる。
たとえば、本発明のＮＯ産生抑制剤は、茶系飲料、果汁飲料、スポーツ飲料等の清涼飲料水；牛乳、ヨーグルト等の乳製品；ゼリー、アイスクリーム等の菓子等に添加することができる。

本発明の食品は、本発明のＮＯ産生抑制剤を含有し、ＮＯの過剰産生に起因する疾患の予防または改善用として有用である。
ＮＯの過剰産生に起因する疾患としては、たとえば、がん；Ｉ型糖尿病、炎症性腸疾患（たとえば、潰瘍性大腸炎、クローン病等）、血管炎症候群等の自己免疫疾患；老年性認知症、ハンチントン病、パーキンソン病等の神経変性疾患；刺激性接触皮膚炎、アトピー性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、貨幣状皮膚炎、限局性掻爬皮膚炎、口周囲皮膚炎、汗疱、扁平苔癬、水疱症（たとえば、尋常性天疱瘡、疱疹状皮膚炎等）、乾癬、乾皮症等の掻痒性皮膚疾患等が挙げられる。

従って、本発明の食品は、ＮＯの過剰産生に起因する疾患の予防または改善用の特定保健用食品、栄養機能食品、機能性表示食品等の保健機能食品、病者用食品等の特別用途食品、健康補助食品、ダイエタリーサプリメント等としても提供され得る。

本発明の食品における本発明のＮＯ産生抑制剤の含有量は、上記本発明の医薬品における含有量に準じて定められる。
また、本発明の食品の摂取量および摂取期間は、本発明の食品を摂取させる対象者の性別、年齢、症状等に応じて適宜決定されるが、上記したＮＯの過剰産生に起因する疾患の発症のリスクの高い者において、その発症を予防する目的には、長期間にわたり継続して、日常的に摂取させることが好ましい。

なお、本発明の食品が、特に上記した保健機能食品、特別用途食品、健康補助食品等として提供される場合、本発明の食品は、１回あたりの摂取量単位で包装されまたは充填された形態とすることが好ましい。「１回あたりの摂取量単位で包装されまたは充填された形態」とは、１回あたりの摂取量ごとに袋体に包装され、またはボトルもしくは瓶に充填されているような形態をいう。１回あたりの摂取量単位で包装されまたは充填された本発明の食品には、本発明のＮＯ産生抑制剤の１回あたりの摂取量が含有される。

以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に限定されるものではない。

［実施例１、比較例１、２］ＮＯ産生抑制剤
カタクリ（Erythronium japonicum Decne.）の葉部を水洗し、９４時間凍結乾燥した後、粒径５００μｍ以下に粉砕して、葉部凍結乾燥粉末とした。
上記凍結乾燥粉末１５０ｍｇに、８０容量％メタノール水溶液を１．５ｍＬ添加し、ビーズ式破砕装置（「Precellys 24」、Bertin Technologies製、エムエス株式会社）で５，０００ｒｐｍ、９０秒×６回抽出処理した。次いで１２，０００×ｇにて１０分間遠心分離し、上清を０．４５μｍのフィルター（「PVDF syringe Driven Filter Unit、φ4mm」、メルクミリポア社製）でろ過してろ液を回収した。ろ液を減圧濃縮して溶媒を除去し、濃縮乾固した抽出物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）５００μＬに溶解し、実施例１のＮＯ産生抑制剤とした。
また、カタクリ（Erythronium japonicum Decne.）の茎部および果実をそれぞれ水洗し、９４時間凍結乾燥した後、粒径５００μｍ以下に粉砕して、茎部凍結乾燥粉末および果実凍結乾燥粉末とし、それぞれ上記と同様に抽出処理して、比較例１、２のＮＯ産生抑制剤とした。
実施例１および比較例１、２の各ＮＯ産生抑制剤におけるカタクリ（Erythronium japonicum Decne.）の各部の抽出物の含有量は、それぞれ出発原料とした凍結乾燥粉末量に換算して１５０ｍｇ／ＤＭＳＯ５００μＬ（すなわち３００ｍｇ／ｍＬ）となるように調整した。
なお、実施例１及び比較例１、２の各ＮＯ産生抑制剤中におけるカタクリ（Erythronium japonicum Decne.）の各部の抽出物の含有量としては、固形分の乾燥重量にして、それぞれ１０４．２０ｍｇ／ｍＬ、１０５．４４ｍｇ／ｍＬ、１１０．８４ｍｇ／ｍＬであった。

［試験例１］ＮＯ産生抑制作用の評価
下記の通り、マクロファージ様細胞を用いて、リポ多糖（ＬＰＳ）と実施例１のＮＯ産生抑制剤の共存下で培養し、ＬＰＳ刺激によって誘導されるＮＯの産生に対する抑制作用を評価した。
（１）ＲＡＷ２６４．７マウスマクロファージ細胞の１０（ｖ／ｖ）％の牛胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地による細胞懸濁液１×１０^６ｃｅｌｌｓ／ｍＬを、９６ウェルマイクロプレートに各ウェルあたり１００μＬずつ播種し（１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）、ＣＯ_２インキュベーター（５％ＣＯ_２濃度）にて、３７℃で２時間培養した。
（２）ＬＰＳ（２００ｎｇ／ｍＬ）ならびに、実施例１および比較例１、２のＮＯ産生抑制剤（カタクリ（Erythronium japonicum Decne.）の各部の抽出物の固形分の乾燥重量にして１０４．２μｇ／ｍＬ、２０８μｇ／ｍＬおよび４０８μｇ／ｍＬの３段階の各濃度）を添加した２倍濃度の上記培地各１００μＬをそれぞれ添加し（ＬＰＳの終濃度＝１００ｎｇ／ｍＬ、実施例１および比較例１、２の各ＮＯ産生抑制剤の終濃度（カタクリ（Erythronium japonicum Decne.）の各部の抽出物の固形分の乾燥重量にして）＝５２．１μｇ／ｍＬ、１０４μｇ／ｍＬおよび２０８μｇ／ｍＬ）、ＣＯ_２インキュベーター（５％ＣＯ_２濃度）にて、３７℃で２４時間培養した。なお、対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）およびＬＰＳ処理群として、ＬＰＳおよびＮＯ産生抑制剤を添加しない２倍濃度の上記培地、および２００ｎｇ／ｍＬのＬＰＳのみを添加した２倍濃度の上記培地のそれぞれを添加して、同様に培養した。各試験区とも、ｎ＝３とした。
（３）各ウェルから培養上清および培養細胞をサンプリングし、Ｇｒｉｅｓｓ法により培養上清中に産生されたＮＯ量を測定し、ＷＳＴ−８（2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium）法により培養細胞の細胞生存率を測定した。測定結果については、ＬＰＳ処理群との有意差について、ボンフェローニの多重検定を行った。
（４）培養上清中に産生されたＮＯ量および培養細胞の細胞生存率についての測定結果は、対照、ＬＰＳ処理群および実施例１のＮＯ産生抑制剤処理群について、それぞれ平均値±標準偏差にて、図１に示した。
なお、比較例１、２のＮＯ産生抑制剤については、５２．１μｇ／ｍＬの低濃度で細胞生存率の低下が認められた（データは示さず）。

図１に示されるように、ＬＰＳによるＮＯの産生は、５２．１μｇ／ｍＬの実施例１のＮＯ産生抑制剤によりほぼ消失した（Ｐ＜０．０１で有意）。また、実施例１のＮＯ産生抑制剤は、１０４μｇ／ｍＬの濃度まで細胞生存率の低下は見られず、ＬＰＳにより誘導されるＮＯの産生をほぼ完全に抑制する濃度において、細胞毒性を示さないことが認められた。
従って、本発明のＮＯ産生抑制剤は、低濃度にて、細胞毒性を示すことなく優れたＮＯ産生抑制作用を示し、安全性が高いものであることが示唆された。

［実施例２］ＮＯ産生抑制剤
上記実施例１と同様にカタクリ（Erythronium japonicum Decne.）の葉部の抽出物（濃縮乾固物）を調製し、エタノール５００μＬに溶解して、実施例２のＮＯ産生抑制剤とした。実施例２のＮＯ産生抑制剤におけるカタクリ（Erythronium japonicum Decne.）の葉部の抽出物の含有量は、実施例１のＮＯ産生抑制剤と同様に、固形分の乾燥重量にして１０４．２ｍｇ／Ｌであった。

次に、本発明の医薬品（経口製剤）の実施例を示す。
［実施例３］錠剤
（１）乳糖５４．９０（重量％）
（２）結晶セルロース３０．００
（３）デンプン分解物１０．００
（４）グリセリン脂肪酸エステル５．００
（５）実施例２のＮＯ産生抑制剤０．１０
製法：（１）〜（５）を混合し、混練して造粒した後、打錠機にて打錠する。

続いて、本発明の皮膚外用剤の実施例を示す。
［実施例４］ローション剤
（１）実施例２のＮＯ産生抑制剤０．０５（重量％）
（２）グリセリン５
（３）ポリエチレングリコール１５００２
（４）ポリオキシエチレンオレイルエーテル（１５Ｅ．Ｏ．）２
（５）エタノール１５
（６）水酸化カリウム０．０３
（７）パラオキシ安息香酸メチル０．１
（８）精製水７５．８２
製法：（１）〜（３）および（６）を（８）に添加して溶解する。（５）に（４）および（７）を溶解して、前記溶液に加えて均一とし、ろ過する。

［実施例５］水中油型乳剤性軟膏
（１）白色ワセリン２５．０（重量％）
（２）ステアリルアルコール２５．０
（３）グリセリン１２．０
（４）ラウリル硫酸ナトリウム１．０
（５）パラオキシ安息香酸メチル０．１
（６）精製水３６．８
（７）実施例２のＮＯ産生抑制剤０．１
製法：（１）〜（４）の油相成分を混合、溶解して均一とし、７５℃に加熱する。一方、（５）を（６）に溶解して７５℃に加熱し、これに前記油相成分を添加して乳化し、冷却後４０℃にて（７）を添加、混合する。

［実施例６］水中油型クリーム剤
（１）精製水全量を１００重量％とする量
（２）１，３−ブタンジオール５（重量％）
（３）グリセリン１０
（４）キサンタンガム０．１５
（５）クエン酸ナトリウム０．１
（６）エデト酸二ナトリウム０．０１
（７）パラオキシ安息香酸メチル０．１２
（８）精製水５
（９）実施例２のＮＯ産生抑制剤０．０５
（１０）ジオクチルカルボン酸３
（１１）バチルアルコール１．８
（１２）ベヘニルアルコール１．２
（１３）マイクロクリスタリンワックス１
（１４）ミツロウ２．５
（１５）キャンデリラロウ０．８
（１６）水素添加パーム油２．５
（１７）ヘキサメチルシクロトリシロキサン２５
（１８）スクワラン３
（１９）精製ホホバ油２
（２０）マカデミアナッツ油１
（２１）ポリヒドロキシステアリン酸０．２
（２２）トリポリヒドロキシステアリン酸ジペンタエリスリチル０．３
（２３）香料０．０２
製法：（１）に（２）〜（７）を添加、溶解して７０℃〜７５℃に加熱する（水相成分）。（１０）〜（２２）を混合し、７０℃〜７５℃に加熱して均一とする（油相成分）。前記水相成分を撹拌しながら、前記油相成分を徐々に添加して乳化する。４０℃まで冷却した後、（８）に溶解した（９）、および（２３）を順次添加して混合し、均一とする。

以上詳述したように、本発明により、ＮＯ産生抑制作用に優れるとともに、安全性が高いＮＯ産生抑制剤を提供することができる。
本発明のＮＯ産生抑制剤は、ＮＯの過剰産生に起因する疾患、たとえば、がん、自己免疫疾患、神経変性疾患、掻痒性皮膚疾患等の予防または治療用医薬品、前記ＮＯの過剰産生に起因する掻痒性皮膚疾患の予防または改善用医薬部外品もしくは化粧品、前記ＮＯの過剰産生に起因する疾患の予防または改善用食品の有効成分として有用である。

Claims

カタクリ（Erythronium japonicum Decne.）の葉部の水と低級アルコールとの体積比が５０：５０〜１０：９０の混合溶媒による抽出物を含有する、一酸化窒素産生抑制剤。
請求項１に記載の一酸化窒素産生抑制剤を含有する、一酸化窒素の過剰産生により生じる疾患の予防または治療用医薬品。
がんの予防または治療用医薬品である、請求項２に記載の医薬品。
自己免疫疾患の予防または治療用医薬品である、請求項２に記載の医薬品。
神経変性疾患の予防または治療用医薬品である、請求項２に記載の医薬品。
掻痒性皮膚疾患の予防または治療用医薬品である、請求項２に記載の医薬品。
皮膚外用剤である、請求項６に記載の医薬品。
請求項１に記載の一酸化窒素産生抑制剤を含有する、掻痒性皮膚疾患の予防または改善用医薬部外品。
請求項１に記載の一酸化窒素産生抑制剤を含有する、掻痒性皮膚疾患の予防または改善用化粧品。
請求項１に記載の一酸化窒素産生抑制剤を含有する、一酸化窒素の過剰産生により生じる疾患の予防または改善用食品。