KR20220139883A - 마크로시클릭 킬레이트 및 그의 용도 - Google Patents

마크로시클릭 킬레이트 및 그의 용도 Download PDF

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스튜어트 제이. 마호니
마이클 비. 요한센
매튜 디. 모란
멜리사 샤세
라이언 더블유. 심스
에릭 에스. 부락
존 에프. 밸리언트
Original Assignee
퓨전 파마슈티칼즈 인크.
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Abstract

본 개시내용은 그의 금속 착물의 마크로시클릭 킬레이트화 모이어티, 이관능성 링커, 및 치료 또는 표적화 모이어티를 포함하는 마크로시클릭 킬레이트에 관한 것이다. 또한, 그의 제조 방법 및 그의 용도가 개시된다.

Description

마크로시클릭 킬레이트 및 그의 용도
관련 출원
본원은 2020년 1월 10일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/959,665를 우선권 주장하며; 그의 전체 내용은 모든 목적을 위해 본원에 참조로 포함된다.
방사성접합체 또는 방사성표지된 표적화 모이어티는 치료진단 용도에서 널리 사용된다. 이들은 전형적으로 방사성핵종을 착물화할 수 있는 킬레이트, 링커, 및 표적화 모이어티 또는 가교기를 함유한다. 방사성접합체는 일반적으로 표적 친화도를 유지하면서 생물학적 분자에 방사성표지를 부가하기 위해 이관능성 킬레이트화제를 사용함으로써 제조된다.
방사성접합체와 연관된 주요 도전과제 중 하나는 별개의 원자 특성을 갖는 지르코늄 (Zr) 및 악티늄 (Ac)과 같은 바람직한 치료진단 금속 쌍을 착물화시키는 킬레이트 구조를 확인하는 데 있다. 예를 들어, Zr 및 Ac는 상이한 크기를 가지며, 그의 이온 반경은 각각 0.59Å 및 1.12Å이고 (문헌 [Acta Crystallogr. Sect. A 1976, 32, 751-767]), 각각 4+ 및 3+의 상이한 전하를 갖는다. 추가로, 현재 공지된 방사성접합체는 종종 충분한 생체내 안정성이 결여되며, 이는 그의 의학적 용도를 제한한다. 또한, 특정 킬레이트는 방사성표지 과정을 위한 상승된 열 조건을 필요로 하는데, 이는 이관능성 킬레이트화제와 사전-접합된 표적화 모이어티 (예를 들어, 승온은 항체 표적화 모이어티의 구조적 완전성을 손상시킬 것임) 또는 가교기를 갖는 것과 상용성이 아니며, 이는 관련 분야에서 그의 용도를 제한하는 또 다른 요인을 제시한다.
치료진단 용도를 위한, 온화한 조건 하에 영상화-적합한 금속 (예를 들어, 89Zr) 및 요법-적합한 금속 (예를 들어, 225Ac) 둘 다의 안정한 착물을 형성하는 새로운 킬레이트를 개발할 필요가 있다.
본 발명은 예상외로 온화한 조건 하에 영상화 (예를 들어, 양전자 방출 단층촬영 또는 PET)를 위한 89Zr 및 요법 (예를 들어, 암 치료)을 위한 225Ac 둘 다와 안정한 착물을 형성하는 마크로시클릭 킬레이트에 관한 것이다.
본 발명의 한 측면은 하기 제시된 화학식 (I)의 구조를 갖는 특정 화합물, 또는 그의 금속 착물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 특색으로 한다:
Figure pct00001
여기서,
R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, R4는 -X-W이고, R5는 H, -L-U, 또는 -X-W이거나; 또는 R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 -L-U이고, R5는 -X-W이고;
n은 0-3의 정수이고,
여기서,
L은 임의로 치환된 C1-3 알킬렌이고;
U는 임의로 치환된 카르복실산 또는 임의로 치환된 포스폰산이고;
W는 방사성금속에 배위할 수 있는 공여 모이어티이고, 여기서 공여 모이어티는 임의로 치환된 히드록시피리디논 또는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티이고
Figure pct00002
;
m은 1-3의 정수이고;
X는 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 R은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 헤테로알킬, 또는 -L3-Z2-B이고,
여기서,
L1 및 L2는 각각 독립적으로 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌 또는 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬렌이고;
L3은 임의로 치환된 C1-C50 알킬렌, 또는 임의로 치환된 C1-C50 헤테로알킬렌, 또는 C5-C20 폴리에틸렌 글리콜이고;
Z1은 결합, C=O(NR4), C=S(NR4), OC=O(NR4), NR4C=O(O), NR4C=O(NR4), -CH2PhC=O(NR4), -CH2Ph(NR4)C=O, 또는 -CH2Ph(NH)C=S(NR4)이고, 각각의 R4는 독립적으로 H, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬, 또는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
Z2는 C=O, -NR'-(C=O)-, 또는 -NR'-(C=O)-R"이고, R'은 H 또는 C1-C6 알킬이고, R"은 C1-C20 알킬렌, C2-C20 헤테로알킬렌, 또는 아릴렌이고;
B는 치료 모이어티, 표적화 모이어티 또는 가교기이다.
일부 실시양태에서, W는 하기 제시된 구조 중 하나를 갖는 임의로 치환된 히드록시피리디논이다:
Figure pct00003
여기서, V1은 삭제되거나, 융합된 아릴 또는 헤테로아릴, 융합된 카르보사이클 또는 헤테로사이클, 알킬, 에테르, 알콜, 산, 에스테르, 아미드, 포스포네이트 또는 술포네이트이고; V2는 H, 알킬 또는 아실이다.
본 발명의 또 다른 측면은 하기 제시된 화학식 (I)의 구조를 갖는 특정 화합물, 또는 그의 금속 착물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 특색으로 한다:
Figure pct00004
여기서,
R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, R4는 -X-W이고, R5는 H, -L-U, 또는 -X-W이거나; 또는 R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 -L-U이고, R5는 -X-W이고;
n은 0-3의 정수이고, n이 0이고 R5가 H인 경우, R1, R3, 및 R4가 모두
Figure pct00005
과 동일하지는 않고,
여기서,
L은 C=O 또는 -CH(R)-이고, 여기서 R은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 헤테로알킬, 또는 -L1-Z1-L2-Z2-B이고;
U는 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 카르복실산, 또는 임의로 치환된 포스폰산이거나; 또는 -L-U는 -L1-Z1-L2-Z2-B이고;
R1-R3 중 적어도 하나는 임의로 치환된 헤테로아릴로서의 U를 갖고;
X는 C=O 또는 임의로 치환된 C1-C3 알킬렌이고;
W는 방사성금속에 배위할 수 있는 공여 모이어티이고, 여기서 공여 모이어티는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 임의로 치환된 히드록시피리디논이고
Figure pct00006
,
여기서, V1은 삭제되거나, 융합된 아릴 또는 헤테로아릴, 융합된 카르보사이클 또는 헤테로사이클, 알킬, 에테르, 알콜, 산, 에스테르, 아미드, 포스포네이트 또는 술포네이트이고; V2는 H, 알킬, 또는 아실이고,
여기서,
L1은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌, 또는 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬렌이고;
Z1은 결합, C=O(NR4), C=S(NR4), OC=O(NR4), NR4C=O(O), NR4C=O(NR4), -CH2PhC=O(NR4), -CH2Ph(NR4)C=O, 또는 -CH2Ph(NH)C=S(NR4)이고, 각각의 R4는 독립적으로 H, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬, 또는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
L2는 임의로 치환된 C1-C50 알킬렌, 또는 임의로 치환된 C1-C50 헤테로알킬렌, 또는 C5-C20 폴리에틸렌 글리콜이고;
Z2는 C=O, -NR'-(C=O)-, 또는 -NR'-(C=O)-R"이고, R'은 H 또는 C1-C6 알킬이고, R"은 C1-C20 알킬렌, C2-C20 헤테로알킬렌, 또는 아릴렌이고;
B는 치료 모이어티, 표적화 모이어티 또는 가교기이다.
본 발명의 추가 측면은 하기 제시된 화학식 (II)의 구조를 갖는 특정 화합물, 또는 그의 금속 착물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 특색으로 한다:
Figure pct00007
여기서,
R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, W는 H 또는 -L1-Z1-L2-Z2-B이고,
여기서,
L은 C=O 또는 -CH(R)-이고, 여기서 R은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 헤테로알킬, 또는 -L1-Z1-L2-Z2-B이고;
U는 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 카르복실산, 또는 임의로 치환된 포스폰산이거나; 또는 -L-U는 -L1-Z1-L2-Z2-B이고;
R1-R3 중 적어도 하나는 임의로 치환된 헤테로아릴로서의 U를 갖고;
여기서,
L1은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌, 또는 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬렌이고;
Z1은 결합, C=O(NR4), C=S(NR4), OC=O(NR4), NR4C=O(O), NR4C=O(NR4), -CH2PhC=O(NR4), -CH2Ph(NR4)C=O, 또는 -CH2Ph(NH)C=S(NR4)이고, 각각의 R4는 독립적으로 H, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬, 또는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
L2는 임의로 치환된 C1-C50 알킬렌, 또는 임의로 치환된 C1-C50 헤테로알킬렌, 또는 C5-C20 폴리에틸렌 글리콜이고;
Z2는 C=O, -NR'-(C=O)-, 또는 -NR'-(C=O)-R"이고, R'은 H 또는 C1-C6 알킬이고, R"은 C1-C20 알킬렌, C2-C20 헤테로알킬렌, 또는 아릴렌이고;
B는 치료 모이어티, 표적화 모이어티 또는 가교기이다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 화합물은 가변기 B를 치료 모이어티 또는 표적화 모이어티로서 포함한다. 치료 모이어티 또는 표적화 모이어티는 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 (IGF-1R)에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 화합물은 가변기 B를 가교기로서 포함한다. 가교기는 아미노-반응성 가교기, 메티오닌-반응성 가교기, 및 티올-반응성 가교기로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 가교기는 활성화된 에스테르, 이미데이트, 무수물, 티올, 디술피드, 말레이미드, 아지드, 알킨, 변형된 알킨, 변형된 알켄, 할로겐, 술포네이트, 할로아세틸, 아민, 히드라지드, 디아지린, 포스핀, 테트라진, 이소티오시아네이트 및 옥사지리딘으로부터 선택되는 모이어티를 포함한다. 각각의 이들 모이어티는 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되고 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 화학적 기를 지칭한다. 예를 들어, 활성화된 에스테르는 히드록시숙신이미드 에스테르, 2,3,5,6-테트라플루오로페놀 에스테르, 2,6-디클로로페놀 에스테르 또는 4-니트로페놀 에스테르일 수 있다.
일부 실시양태에서, 화합물은 가변기 B를 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 가교기로서 포함한다:
Figure pct00008
일부 실시양태에서, 상기 기재된 화합물은 Bi, Pb, Y, Mn, Cr, Fe, Co, Zn, Ni, In, Ga, Cu, Re, Sm, 란타나이드 및 악티나이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속을 함유하는 금속 착물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 화합물은 89Zr, 47Sc, 55Co, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 82Rb, 86Y, 87Y, 90Y, 97Ru, 105Rh, 109Pd, 111In, 117mSn, 149Pm, 52Mn, 149Tb, 152Tb, 153Sm, 177Lu, 186Re, 188Re, 199Au, 201Tl, 203Pb, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac, 223Ra 및 227Th로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성핵종을 함유하는 금속 착물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 기재된 화합물은 89Zr, 111In, 또는 225Ac의 방사성핵종을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 임의의 상기 화합물 및 제약상 허용되는 부형제 ("제약상 허용되는 담체"와 상호교환가능하게 사용됨)를 포함하는 제약 조성물을 특색으로 한다.
추가로, 방사선 치료 계획 및/또는 방사선 치료를 필요로 하는 대상체에게 임의의 상기 화합물 또는 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 방사선 치료 계획 및/또는 방사선 치료 방법이 본 발명에 포함된다.
면역조절 이상의 치료를 필요로 하는 대상체에게 상기 화합물 중 하나를 상기 면역조절 이상 (예를 들어, 암)을 치료하는 데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 면역조절 이상을 치료하는 방법이 또한 본 발명의 범주 내에 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 암의 검출 및/또는 치료를 필요로 하는 대상체에게 방사선 치료 계획에 효과적인 양의 임의의 상기 화합물 또는 제약 조성물의 제1 용량을 투여하고, 이어서 치료 유효량의 임의의 상기 화합물 또는 제약 조성물의 후속 용량을 투여하는 것을 포함하는, 암을 검출 및/또는 치료하는 방법을 특색으로 한다.
일부 실시양태에서, 제1 용량으로 투여되는 화합물 또는 조성물 및 제2 용량 또는 후속 용량으로 투여되는 화합물 또는 조성물은 동일하다.
일부 실시양태에서, 제1 용량으로 투여되는 화합물 또는 조성물 및 제2 용량 또는 후속 용량으로 투여되는 화합물 또는 조성물은 상이하다.
일부 실시양태에서, 암은 고형 종양 또는 혈액 (액상) 암이다.
일부 실시양태에서, 암은 유방암, 비소세포 폐암, 소세포 폐암, 췌장암, 두경부암, 전립선암, 결장직장암, 육종, 부신피질 암종, 신경내분비암, 유잉 육종, 다발성 골수종 또는 급성 골수성 백혈병이다.
본 발명의 치료에서 암은 유방암 세포, 비소세포 폐암 세포, 소세포 폐암 세포, 췌장암 세포, 두경부암 세포, 전립선암 세포, 결장직장암 세포, 갑상선암 세포, 육종 세포, 부신피질 암종 세포, 유잉 육종 세포, 다형성 교모세포종 세포, 간암 세포, 신경내분비 종양 세포, 방광암 세포, 위 및 위식도 접합부 암 세포, 흑색종 세포, 다발성 골수종 세포 및 급성 골수성 백혈병 세포로부터 선택되는 세포로부터 형성될 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 항증식제, 방사선 증감제, 또는 면역조절제 또는 면역조정제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 임의의 상기 화합물 또는 그의 조성물 및 항증식제 또는 방사선 증감제는 서로 28일 내에 (예를 들어, 14, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1일 내에) 투여된다.
일부 실시양태에서, 임의의 상기 기재된 화합물 또는 그의 조성물 및 면역조절제 또는 면역조정제는 서로 90일 내에 (예를 들어, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 또는 1일 내에) 투여된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 이관능성 킬레이트를 생물학적 분자에 접합시키는 단계, (b) 단계 (a)에 의해 생성된 접합체를 정제하는 단계, 및 (c) 1종 이상의 방사성핵종 (예를 들어, 1종 이상의 225Ac 방사성핵종)을 단계 (b)의 정제된 접합체와 35℃ 미만 (예를 들어, 20-30℃)의 온도에서 킬레이트화하여 방사성접합체 (예를 들어, 악티늄 방사성접합체)를 생성하는 단계를 포함하는, 방사성접합체 (예를 들어, 하기 기재된 방사성면역접합체)를 제조하는 방법을 특색으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 방사성핵종 중 1종 (예를 들어, 225Ac 방사성핵종)을 이관능성 킬레이트와 착물화하는 단계, (b) 임의로, 단계 (a)에 의해 생성된 방사성표지된 이관능성 킬레이트를 정제하는 단계, (c) 방사성표지된 이관능성 킬레이트를 생물학적 분자에 접합시켜 방사성접합체 (예를 들어, 악티늄 방사성접합체)를 생성하는 단계, 및 (d) 임의로, 방사성표지된 항체-접합체 생성물을 정제하는 단계를 포함하는, 방사성접합체 (예를 들어, 하기 기재된 방사성면역접합체)를 제조하는 방법을 특색으로 한다.
일부 실시양태에서, 방사성접합체는 방사성면역접합체 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 방사성면역접합체)이다.
일부 실시양태에서, 접합 단계 (c)의 반응 혼합물의 온도는 20-34℃ (예를 들어, 21℃, 22℃, 23℃, 24℃, 25℃, 26℃, 27℃, 28℃, 29℃, 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 또는 34℃)이다.
일부 실시양태에서, 접합 단계 (a)의 반응 혼합물의 pH는 5.0-10.0 (예를 들어, 5.0-6.0, 6.0-7.0, 7.0-8.0, 8.0-9.0 또는 9.0-10.0)이다.
일부 실시양태에서, 접합 단계 (a)의 반응 혼합물의 pH는 6.4 미만 (예를 들어, 6.3, 6.2, 6.1, 6.0, 5.9 또는 5.8 이하)이다.
일부 실시양태에서, 킬레이트화 단계 (c)의 반응 혼합물의 pH는 5.5 내지 7.0 (예를 들어, 5.5-6.0, 6.0-6.5, 또는 6.5-7.0)이다.
일부 실시양태에서, 킬레이트화 단계 (c)의 반응 혼합물의 pH는 5.5 미만 (예를 들어, 5.4, 5.3, 5.2, 5.1, 또는 5.0 이하) 또는 7.0 초과 (예를 들어, 7.1, 7.2, 7.3, 7.4, 7.5 이상)이다.
정의
본원에 사용된 용어 "알킬" 또는 "알킬렌"은 포화, 선형 또는 분지형 탄화수소 모이어티, 예컨대 메틸, 메틸렌, 에틸, 에틸렌, 프로필, 프로필렌, 부틸, 부틸렌, 펜틸, 펜틸렌, 헥실, 헥실렌, 헵틸, 헵틸렌, 옥틸, 옥틸렌, 노닐, 노닐렌, 데실, 데실렌, 운데실, 운데실렌, 도데실, 도데실렌, 트리데실, 트리데실렌, 테트라데실, 테트라데실렌, 펜타데실, 펜타데실렌, 헥사데실, 헥사데실렌, 헵타데실, 헵타데실렌, 옥타데실, 옥타데실렌, 노나데실, 노나데실렌, 이코실, 이코실렌, 트리아콘틸 및 트리아코틸렌을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "헤테로알킬" 또는 "헤테로알킬렌"은 N, O, P, B, S, Si, Sb, Al, Sn, As, Se 및 Ge로부터 선택되는 적어도 1개의 헤테로원자를 함유하는 지방족 모이어티 (예를 들어, 알킬 또는 알킬렌)를 지칭한다. "헤테로알킬" 또는 "헤테로알킬렌"의 예는 하기 모이어티를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00009
본원에 사용된 용어 "아릴" 또는 "아릴렌"은 본원에서 C6 모노시클릭, C10 비시클릭, C14 트리시클릭, C20 테트라시클릭, 또는 C24 펜타시클릭 방향족 고리계를 지칭한다. 아릴 또는 아릴렌 기의 예는 페닐, 페닐렌, 나프틸, 나프틸렌, 안트라세닐, 안트라세닐렌, 피레닐 및 피레닐렌을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "헤테로아릴" 또는 "헤테로아릴렌"은 본원에서 1개 이상의 헤테로원자 (예컨대, O, N, S 또는 Se)를 갖는 방향족 5-8원 모노시클릭, 8-12원 비시클릭, 11-14원 트리시클릭 및 15-20원 테트라시클릭 고리계를 지칭한다. 헤테로아릴 또는 헤테로아릴렌 기의 예는 푸릴, 푸릴렌, 플루오레닐, 플루오레닐렌, 피롤릴, 피롤릴렌, 티에닐, 티에닐렌, 옥사졸릴, 옥사졸릴렌, 이미다졸릴, 이미다졸릴렌, 벤즈이미다졸릴, 벤즈이미다졸릴렌, 티아졸릴, 티아졸릴렌, 피리딜, 피리딜렌, 피리미디닐, 피리미디닐렌, 퀴나졸리닐, 퀴나졸리닐렌, 퀴놀리닐, 퀴놀리닐렌, 이소퀴놀릴, 이소퀴놀릴렌, 인돌릴 및 인돌릴렌을 포함한다.
달리 명시되지 않는 한, 본원에 언급된 알킬, 알킬렌, 헤테로알킬, 헤테로알킬렌, 아릴, 아릴렌, 헤테로아릴 및 헤테로아릴렌은 치환 및 비치환된 모이어티 둘 다를 포함한다. 알킬, 알킬렌, 헤테로알킬, 헤테로알킬렌, 아릴, 아릴렌, 헤테로아릴 및 헤테로아릴렌 상의 가능한 치환기는 C1-C10 알킬, C2-C10 알케닐, C2-C10 알키닐, C1-C20 알콕시, C3-C20 시클로알킬, C3-C20 시클로알케닐, C3-C20 헤테로시클로알킬, C3-C20 헤테로시클로알케닐, C1-C10 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 아미노, C1-C10 알킬아미노, C2-C20 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노, C1-C10 알킬술폰아미노, 아릴술폰아미노, C1-C10 알킬이미노, 아릴이미노, C1-C10 알킬술폰이미노, 아릴술폰이미노, 히드록실, 할로, 옥소, 티오, C1-C10 알킬티오, 아릴티오, C1-C10 알킬술포닐, 아릴술포닐, 아실아미노, 아미노아실, 아미노티오아실, 아미도, 아미디노, 구아니딘, 우레이도, 티오우레이도, 시아노, 니트로, 니트로소, 아지도, 아실, 티오아실, 아실옥시, 카르복실 및 카르복실산 에스테르를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들 기 또는 모이어티 각각은 관련 기술분야에서 통상적으로 사용되고 통상의 기술자에게 공지된 치환기를 지칭한다. 추가로, 시클로알킬, 시클로알킬렌, 시클로알케닐, 시클로알케닐렌, 헤테로시클로알킬, 헤테로시클로알킬렌, 헤테로시클로알케닐, 헤테로시클로알케닐렌, 아릴 및 헤테로아릴은 또한 서로 융합될 수 있다.
예를 들어, 화학식 (I)의 특정 화합물은 각각 독립적으로 -L-U인 R1, R2, 및 R3을 갖고, 여기서 L은 C=O 또는 -CH(R)-이고, U는 임의로 치환된 헤테로아릴이고, 여기서 임의로 치환된 헤테로아릴은 하기 제시된 구조 중 하나를 갖는 임의로 치환된 히드록시피리디논이다:
Figure pct00010
여기서, V1은 삭제되거나, 융합된 아릴 또는 헤테로아릴, 융합된 카르보사이클 또는 헤테로사이클, 알킬, 에테르, 알콜, 산, 에스테르, 아미드, 포스포네이트 또는 술포네이트이고; V2는 H, 알킬 또는 아실이다.
예를 들어, 화학식 (I)의 특정 화합물은 각각 독립적으로 -L-U인 R1, R2, R3 및 R4를 갖고, 여기서 L은 C=O 또는 -CH(R)-이고, U는 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 또는 임의로 치환된 카르복실산, 또는 임의로 치환된 포스폰산이고, 여기서 R은 하기로부터 선택되는 임의로 치환된 헤테로알킬 (탄소가 옥소로 치환됨)이다:
Figure pct00011
본원에 사용된 용어 "임의로 치환된 카르복실산"은 카르복실산 또는 그의 유도체를 지칭하며, 상응하는 카르복실산으로부터 유도된 아미드를 포함할 수 있다. 예를 들어, U는 하기 제시된 바와 같은 아미드일 수 있다:
Figure pct00012
본원에 사용된 용어 "임의로 치환된 포스폰산"은 포스폰산 또는 그의 유도체를 지칭하며, 상응하는 포스폰산으로부터 유도된 포스포르아미드를 포함할 수 있다. 예를 들어, U는 하기 제시된 바와 같은 포스포르아미드일 수 있다:
Figure pct00013
본원에 사용된 용어 "임의로 치환된 C1-C6 알킬렌"은 C1-C6 알킬렌 또는 그의 유도체를 지칭하며, 옥소로 치환된 1개 이상의 탄소를 갖는 C1-C6 알킬렌 기를 포함할 수 있다. 치환된 C1-C6 알킬렌의 예는 하기 모이어티를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00014
본원에 사용된 용어 "임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬렌"은 C1-C6 헤테로알킬렌 또는 그의 유도체를 지칭하며, 옥소로 치환된 1개 이상의 탄소를 갖는 C1-C6 헤테로알킬렌 기를 포함할 수 있다. 치환된 C1-C6 헤테로알킬렌의 예는 하기 모이어티를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00015
본원에 사용된 용어 "임의로 치환된 C1-C50 헤테로알킬렌"은 C1-C50 헤테로알킬렌 또는 그의 유도체를 지칭하며, 옥소로 치환된 1개 이상의 탄소를 갖는 헤테로알킬렌 기를 포함할 수 있다. 치환된 C1-C50 헤테로알킬렌의 예는 하기 모이어티를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00016
본원에 사용된 용어 "조합하여 투여되는" 또는 "조합 투여"는 2종 이상의 작용제가 대상체에게 동시에 또는 환자에 대한 각각의 작용제의 효과의 중첩이 존재할 수 있도록 하는 간격 내에 투여되는 것을 의미한다. 일부 실시양태에서, 이들은 서로 90일 내에 (예를 들어, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2, 또는 1일 내에), 28일 내에 (예를 들어, 14, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1일 내에), 24시간 내에 (예를 들어, 12, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1시간 내에), 또는 약 60, 30, 15, 10, 5, 또는 1분 내에 투여된다. 일부 실시양태에서, 작용제의 투여는 조합 (예를 들어, 상승작용적) 효과가 달성되도록 함께 충분히 근접하게 이격된다.
본원에 사용된 "항체"는 아미노산 서열이 지정된 항원에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 및 그의 단편을 포함하는 폴리펩티드, 또는 그의 단편을 지칭한다. 본 발명에 따른 항체는 임의의 유형 (예를 들어, IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM) 또는 하위유형 (예를 들어, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4)일 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 항체의 특징적인 서열 또는 부분이 항체의 하나 이상의 영역 (예를 들어, 가변 영역, 초가변 영역, 불변 영역, 중쇄, 경쇄, 및 그의 조합)에서 발견되는 아미노산을 포함할 수 있다는 것을 알 것이다. 더욱이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 항체의 특징적인 서열 또는 부분이 1개 이상의 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있고, 동일한 폴리펩티드 쇄 또는 상이한 폴리펩티드 쇄에서 발견되는 서열 요소를 포함할 수 있다는 것을 알 것이다.
본원에 사용된 "항원-결합 단편"은 모 항체의 결합 특징을 보유하는 항체의 부분을 지칭한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 용어 "이관능성 킬레이트" 또는 "이관능성 접합체"는 킬레이트화 기 또는 그의 금속 착물, 링커 기, 및 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 화학식 (I)의 화합물을 지칭한다.
용어 "암"은 악성 신생물성 세포의 증식에 의해 유발된 임의의 암, 예컨대 종양, 신생물, 암종, 육종, 백혈병 및 림프종을 지칭한다. "고형 종양 암"은 조직의 비정상적 덩어리를 포함하는 암, 예를 들어 육종, 암종 및 림프종이다. 본원에서 상호교환가능하게 사용되는 "혈액암" 또는 "액상 암"은 체액에 존재하는 암, 예를 들어 림프종 및 백혈병이다.
본원에 사용된 용어 "킬레이트"는 2개 이상의 지점에서 중심 금속 또는 방사성금속 원자에 결합될 수 있는 유기 화합물 또는 그의 부분을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "접합체"는 킬레이트화 기 또는 그의 금속 착물, 링커 기를 함유하고, 임의로 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 함유하는 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "화합물"은 도시된 구조의 모든 입체이성질체, 기하 이성질체 및 호변이성질체를 포함하는 것으로 의도된다.
본원에 기재된 화합물은 비대칭일 수 있다 (예를 들어, 1개 이상의 입체중심을 가짐). 달리 나타내지 않는 한, 모든 입체이성질체, 예컨대 거울상이성질체 및 부분입체이성질체가 의도된다. 비대칭적으로 치환된 탄소 원자를 함유하는 본 개시내용의 화합물은 광학 활성 또는 라세미 형태로 단리될 수 있다. 광학 활성 출발 물질로부터 광학 활성 형태를 제조하는 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 예컨대 라세미 혼합물의 분할에 의해 또는 입체선택적 합성에 의해 제조된다.
본원에 사용된 "검출제"는 항원을 함유하는 세포의 위치를 찾아냄으로써 질환을 진단하는 데 유용한 분자 또는 원자를 지칭한다. 검출제로 폴리펩티드를 표지하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 검출제의 예는 방사성동위원소 및 방사성핵종, 염료 (예컨대, 비오틴-스트렙타비딘 복합체 함유), 조영제, 발광제 (예를 들어, 플루오레세인 이소티오시아네이트 또는 FITC, 로다민, 란타나이드 인광체, 시아닌, 및 근 IR 염료), 및 자기 작용제, 예컨대 가돌리늄 킬레이트를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "방사성핵종"은 방사성 붕괴를 겪을 수 있는 원자 (예를 들어, 89Zr, 47Sc, 55Co, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 82Rb, 86Y, 87Y, 90Y, 97Ru, 105Rh, 109Pd, 111In, 117mSn, 149Pm, 52Mn, 149Tb, 152Tb, 153Sm, 177Lu, 186Re, 188Re, 199Au, 201Tl, 203Pb, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac, 223Ra 및 227Th)를 지칭한다. 용어 방사성 핵종, 방사성동위원소 또는 방사성 동위원소는 또한 방사성핵종을 기재하는 데 사용될 수 있다. 방사성핵종은 상기 기재된 바와 같이 검출제로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 방사성핵종은 알파-방출 방사성핵종일 수 있다.
본원에 사용된 용어 작용제 (예를 들어, 상기 접합체 중 임의의 것)의 "유효량"은 유익하거나 목적하는 결과, 예컨대 임상 결과를 가져오기에 충분한 양이고, 이에 따라 "유효량"은 적용되는 문맥에 따라 달라진다.
본원에 사용된 용어 "면역접합체"는 표적화 모이어티, 예컨대 항체 (또는 그의 항원-결합 단편)를 포함하는 접합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 면역접합체는 표적화 모이어티당 평균 적어도 0.10개의 접합체 (예를 들어, 표적화 모이어티당 평균 적어도 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2, 4, 5, 또는 8개의 접합체)를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "방사성접합체"는 방사성동위원소 또는 방사성핵종, 예컨대 본원에 기재된 임의의 방사성동위원소 또는 방사성핵종을 포함하는 임의의 접합체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "방사성면역접합체"는 암 세포에 결합할 수 있는 면역 물질, 예컨대 모노클로날 항체에 부착된 방사성 분자를 포함하는 임의의 방사성접합체를 지칭한다. 방사성면역접합체는 방사선을 암 세포에 직접적으로 및 특이적으로 운반함으로써, 정상 세포를 손상시키지 않으면서 암 세포를 사멸시킬 수 있다. 방사성면역접합체는 또한 신체에서 암 세포를 발견하는 것을 돕기 위해 영상화에 사용될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "방사선면역요법"은 방사성면역접합체를 사용하여 치료 효과를 생성하는 방법을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 방사선면역요법은 그를 필요로 하는 대상체에게 방사성면역접합체를 투여하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 방사성면역접합체의 투여는 대상체에서 치료 효과를 생성한다. 일부 실시양태에서, 방사선면역요법은 방사성면역접합체의 세포로의 투여를 포함할 수 있으며, 여기서 방사성면역접합체의 투여는 세포를 사멸시킨다. 여기서, 방사선면역요법은 세포의 선택적 사멸을 수반하고, 일부 실시양태에서 세포는 암을 갖는 대상체의 암 세포이다.
본원에 사용된 용어 "제약 조성물"은 제약상 허용되는 부형제와 함께 제제화된 본원에 기재된 화합물을 함유하는 조성물을 나타낸다. 일부 실시양태에서, 제약 조성물은 포유동물에서의 질환의 치료를 위한 치료 요법의 일부로서 정부 규제 기관의 승인 하에 제조 또는 판매된다. 제약 조성물은, 예를 들어 단위 투여 형태로의 경구 투여를 위해 (예를 들어, 정제, 캡슐, 캐플릿, 겔캡 또는 시럽); 국소 투여를 위해 (예를 들어, 크림, 겔, 로션 또는 연고로서); 정맥내 투여를 위해 (예를 들어, 미립자 색전이 없고 정맥내 사용에 적합한 용매계 중의 멸균 용액으로서); 또는 본원에 기재된 임의의 다른 제제로 제제화될 수 있다.
본원에 사용된 "제약상 허용되는 부형제"는 환자에서 비독성 및 비-염증성인 특성을 갖는, 본원에 기재된 화합물 이외의 임의의 성분 (예를 들어, 활성 화합물을 현탁 또는 용해시킬 수 있는 비히클)을 지칭한다. 부형제는, 예를 들어 부착방지제, 항산화제, 결합제, 코팅제, 압축 보조제, 붕해제, 염료 (착색제), 연화제, 유화제, 충전제 (희석제), 필름 형성제 또는 코팅제, 향미제, 향료, 활택제 (유동 증진제), 윤활제, 보존제, 인쇄 잉크, 방사선보호제, 흡착제, 현탁화제 또는 분산제, 감미제, 또는 수화수를 포함할 수 있다. 예시적인 부형제는 아스코르브산, 히스티딘, 인산염 완충액, 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 탄산칼슘, 인산칼슘 (이염기성), 스테아르산칼슘, 크로스카르멜로스, 가교 폴리비닐 피롤리돈, 시트르산, 크로스포비돈, 시스테인, 에틸셀룰로스, 젤라틴, 히드록시프로필 셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 락토스, 스테아르산마그네슘, 말티톨, 만니톨, 메티오닌, 메틸셀룰로스, 메틸 파라벤, 미세결정질 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리비닐 피롤리돈, 포비돈, 예비젤라틴화 전분, 프로필 파라벤, 레티닐 팔미테이트, 쉘락, 이산화규소, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 시트르산나트륨, 소듐 스타치 글리콜레이트, 소르비톨, 전분 (옥수수), 스테아르산, 스테아르산, 수크로스, 활석, 이산화티타늄, 비타민 A, 비타민 E, 비타민 C 및 크실리톨을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에서 용어 "제약상 허용되는 염"은 과도한 독성, 자극 또는 알레르기 반응 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 본원에 기재된 화합물의 염을 나타낸다. 제약상 허용되는 염은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 제약상 허용되는 염은 문헌 [Berge et al., J. Pharmaceutical Sciences 66:1-19, 1977 and in Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, (Eds. P.H. Stahl and C.G. Wermuth), Wiley-VCH, 2008]에 기재되어 있다. 염은 본원에 기재된 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 계내 제조될 수 있거나, 또는 유리 염기 기를 적합한 유기 산과 반응시킴으로써 개별적으로 제조될 수 있다.
본 발명의 화합물은 제약상 허용되는 염으로서 제조될 수 있도록 이온화가능한 기를 가질 수 있다. 이들 염은 무기 또는 유기 산을 포함하는 산 부가염일 수 있거나, 또는 염은 본 발명의 화합물의 산성 형태의 경우에 무기 또는 유기 염기로부터 제조될 수 있다. 빈번하게, 화합물은 제약상 허용되는 산 또는 염기의 부가 생성물로서 제조된 제약상 허용되는 염으로서 제조되거나 사용된다. 적합한 제약상 허용되는 산 및 염기, 예컨대 산 부가염을 형성하기 위한 염산, 황산, 브로민화수소산, 아세트산, 락트산, 시트르산 또는 타르타르산, 및 염기성 염을 형성하기 위한 수산화칼륨, 수산화나트륨, 수산화암모늄, 카페인, 다양한 아민은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 적절한 염의 제조 방법은 관련 기술분야에 널리 확립되어 있다.
대표적인 산 부가염은 특히 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스코르베이트, 아스파르테이트, 벤젠술포네이트, 벤조에이트, 비술페이트, 보레이트, 부티레이트, 캄포레이트, 캄포르술포네이트, 시트레이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 푸마레이트, 글루코헵토네이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵토네이트, 헥사노에이트, 히드로브로마이드, 히드로클로라이드, 히드로아이오다이드, 2-히드록시-에탄술포네이트, 락토비오네이트, 락테이트, 라우레이트, 라우릴 술페이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 메탄술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 니트레이트, 올레에이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 술페이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 톨루엔술포네이트, 운데카노에이트, 발레레이트 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘 및 마그네슘, 뿐만 아니라 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민 및 에틸아민을 포함하나 이에 제한되지는 않는 비독성 암모늄, 4급 암모늄 및 아민 양이온을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합에 의해 서로 부착된 적어도 2개의 아미노산의 스트링을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 적어도 3-5개의 아미노산을 포함할 수 있으며, 이들 각각은 적어도 1개의 펩티드 결합에 의해 다른 것에 부착된다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 폴리펩티드가 1개 이상의 "비-천연" 아미노산 또는 그럼에도 불구하고 폴리펩티드 쇄 내로 통합될 수 있는 다른 엔티티를 포함할 수 있다는 것을 알 것이다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 글리코실화될 수 있고, 예를 들어 폴리펩티드는 1개 이상의 공유 연결된 당 모이어티를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단일 "폴리펩티드" (예를 들어, 항체 폴리펩티드)는 2개 이상의 개별 폴리펩티드 쇄를 포함할 수 있으며, 이는 일부 경우에, 예를 들어 1개 이상의 디술피드 결합 또는 다른 수단에 의해 서로 연결될 수 있다.
"대상체"는 인간 또는 비-인간 동물 (예를 들어, 포유동물)을 의미한다.
"실질적 동일성" 또는 "실질적으로 동일한"은 각각 참조 서열과 동일한 폴리펩티드 서열을 갖거나, 또는 2개의 서열을 최적으로 정렬하는 경우에 각각 참조 서열 내의 상응하는 위치에서 동일한 아미노산 잔기를 명시된 백분율로 갖는 폴리펩티드 서열을 의미한다. 예를 들어, 참조 서열과 "실질적으로 동일한" 아미노산 서열은 참조 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는다. 폴리펩티드의 경우, 비교 서열의 길이는 일반적으로 적어도 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 50, 75, 90, 100, 150, 200, 250, 300 또는 350개의 인접 아미노산 (예를 들어, 전장 서열)일 것이다. 서열 동일성은 디폴트 설정된 서열 분석 소프트웨어 (예를 들어, 제네틱스 컴퓨터 그룹 (위스콘신주 53705 매디슨 유니버시티 애비뉴 1710 유니버시티 오브 위스콘신 바이오테크놀로지 센터)의 서열 분석 소프트웨어 패키지)를 사용하여 측정될 수 있다. 이러한 소프트웨어는 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 상동성 정도를 할당함으로써 유사한 서열을 매칭시킬 수 있다.
본원에 사용되고 관련 기술분야에서 널리 이해되는 바와 같이, 상태 (예를 들어, 본원에 기재된 상태, 예컨대 암)를 "치료하다" 또는 이러한 상태의 "치료"는 유익하거나 목적하는 결과, 예컨대 임상 결과를 수득하기 위한 접근법이다. 유익한 또는 목적하는 결과는 검출가능하든 검출가능하지 않든 1종 이상의 증상 또는 상태의 완화 또는 호전; 질환, 장애 또는 상태의 정도의 감소; 질환, 장애 또는 상태의 안정화된 (즉, 악화되지 않는) 상태; 질환, 장애 또는 상태의 확산의 방지; 질환, 장애 또는 상태의 진행의 지연 또는 둔화; 질환, 장애 또는 상태의 호전 또는 완화; 및 관해 (부분적이든 전체적이든)를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 질환, 장애 또는 상태를 "완화시키는 것"은 치료 부재 하의 정도 또는 시간 경과와 비교하여, 질환, 장애 또는 상태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상 징후가 감소되고/거나 진행의 시간 경과가 둔화 또는 연장되는 것을 의미한다.
본 개시내용의 하나 이상의 실시양태의 세부사항은 하기 설명에 제시된다. 본 개시내용의 다른 특색, 목적 및 이점은 하기 도면, 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
도 1은 화합물 89Zr-화합물 Y의 생체분포 연구를 도시한다.
방사성표지된 표적화 모이어티 (방사성접합체로도 공지됨)는, 질환 상태에서 상향조절되는 단백질 또는 수용체를 표적화하여 관심 세포를 손상시키고 사멸시키는 방사성 페이로드를 전달하도록 설계된다 (방사선면역요법). 이러한 페이로드를 전달하는 과정은 방사성 붕괴를 통해 DNA에 대한 직접 효과 (예컨대, 단일 또는 이중 가닥 DNA 파괴) 또는 간접 효과, 예컨대 방관자 또는 십자포화 효과를 유발할 수 있는 알파, 베타 또는 감마 입자 또는 오거 전자를 생성한다.
방사성면역접합체는 전형적으로 생물학적 표적화 모이어티 (예를 들어, 항체 또는 그의 항원 결합 단편), 방사성동위원소, 및 이들 둘을 연결하는 분자를 함유한다. 접합체는, 이관능성 킬레이트가 표적 친화도를 유지하면서 구조적 변경이 최소이도록 생물학적 표적화 분자에 부착되는 경우에 형성된다. 방사성표지되면, 최종 방사성면역접합체가 형성된다.
이관능성 킬레이트는 구조적으로 킬레이트, 링커 및 표적화 모이어티 (예를 들어, 항체)를 함유한다. 새로운 이관능성 킬레이트를 개발할 때, 대부분의 노력은 분자의 킬레이트화 부분에 집중된다. 이관능성 킬레이트의 몇몇 예는 표적화된 모이어티에 접합된 다양한 시클릭 및 비-시클릭 구조를 갖는 것으로 기재되었다. 예를 들어, 문헌 [Bioconjugate Chem. 2000, 11, 510-519; Bioconjugate Chem. 2012, 23, 1029-1039; Mol. Imaging Biol. 2011, 13, 215-221; and Bioconjugate Chem. 2002, 13, 110-115]을 참조한다.
생체내 89Zr PET 영상화에 통상적으로 사용되는 킬레이트는 부분적으로 그의 과거 전례 및 또한 온화하고 효율적인 방사성표지화 조건으로 인해 데스페리옥사민 ("DFO")이었다. 그러나, 안정성 문제로 인해, DFO 킬레이트를 함유하는 방사성접합체의 생체내 안정성을 개선하여 금속 탈착물화를 감소시키는 데 많은 노력을 기울였다. 예를 들어, 문헌 [Chem. Comm. 2014, 50, 11523-11525; Chem. Comm. 2016, 52, 11889-11892]을 참조한다.
본 개시내용의 실시양태는 온화한 방사성표지화 조건 하에 및 방사성면역접합체의 일부로서 높은 안정성을 갖는 방사성금속 착물, 예를 들어 89Zr 및 225Ac의 치료진단 쌍을 형성하는 특정 마크로시클릭 킬레이트의 구조적 확인에 관한 것이다. 구조적 조사는 링커 영역 내에서 마크로시클릭 킬레이트를 근위 공여 기로 변형시킴으로써 또는 히드록시피리디논의 사용을 포함한 마크로시클릭 코어의 신중한 치환에 의해 수행되었다.
상기 발명의 내용 섹션에 논의된 바와 같이, 본 개시내용의 한 특색은 하기 제시된 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물의 제1 하위세트, 또는 그의 금속 착물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 특색으로 한다:
Figure pct00017
여기서,
R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, R4는 -X-W이고, R5는 H, -L-U, 또는 -X-W이거나; 또는 R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 -L-U이고, R5는 -X-W이고;
n은 0-3의 정수이고,
여기서,
L은 임의로 치환된 C1-3 알킬렌이고;
U는 임의로 치환된 카르복실산 또는 임의로 치환된 포스폰산이고;
W는 방사성금속에 배위할 수 있는 공여 모이어티이고, 여기서 공여 모이어티는 임의로 치환된 히드록시피리디논 또는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티이고
Figure pct00018
;
m은 1-3의 정수이고;
X는 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 R은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 헤테로알킬, 또는 -L3-Z2-B이다.
가변기 X를 참조하면, L1 및 L2는 각각 독립적으로 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌 또는 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬렌이고; L3은 임의로 치환된 C1-C50 알킬렌, 또는 임의로 치환된 C1-C50 헤테로알킬렌, 또는 C5-C20 폴리에틸렌 글리콜이고; Z1은 C=O(NR4), C=S(NR4), OC=O(NR4), NR4C=O(O), NR4C=O(NR4), -CH2PhC=O(NR4), -CH2Ph(NR4)C=O, 또는 -CH2Ph(NH)C=S(NR4)이고, 각각의 R4는 독립적으로 H, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬, 또는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고; Z2는 C=O, -NR'-(C=O)-, 또는 -NR'-(C=O)-R"이고, R'은 H 또는 C1-C6 알킬이고, R"은 C1-C20 알킬렌, C2-C20 헤테로알킬렌, 또는 아릴렌이고; B는 치료 모이어티, 표적화 모이어티, 또는 가교기이다.
제1 하위세트의 일부 실시양태에서, W는 하기 제시된 구조 중 하나를 갖는 임의로 치환된 히드록시피리디논이다:
Figure pct00019
여기서, V1은 삭제되거나, 융합된 아릴 또는 헤테로아릴, 융합된 카르보사이클 또는 헤테로사이클, 알킬, 에테르, 알콜, 산, 에스테르, 아미드, 포스포네이트 또는 술포네이트이고; V2는 H, 알킬 또는 아실이다. 예를 들어, 특정 화합물은 W가
Figure pct00020
인 것을 특색으로 한다.
제1 하위세트의 일부 실시양태에서, R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, 여기서 L은 임의로 치환된 C1 알킬 (예를 들어, CH2)이고, U는 -CO2H이다.
또한, 상기 실시양태의 특정 화합물은 n이 1인 화학식 (I)의 구조를 갖는다.
제1 하위세트의 일부 실시양태에서, X는 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 L1은
Figure pct00021
이고, R은 H이다.
제1 하위세트의 일부 실시양태에서, X는 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 L1은
Figure pct00022
이고, R은 H이고; R1, R2, 및 R3은 각각 -L-U이고, 여기서 L은 CH2이고 U는 -CO2H이다.
제1 하위세트의 일부 실시양태에서, X는 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 L1은
Figure pct00023
이고, R은 H이고; W는
Figure pct00024
이다.
제1 하위세트의 일부 실시양태에서, X는 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 L1은
Figure pct00025
이고, R은 H이고; R1, R2, 및 R3은 각각 -L-U이고, 여기서 L은 CH2이고 U는 -CO2H이고; W는
Figure pct00026
이다.
제1 하위세트의 일부 실시양태에서, X는 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 L1은
Figure pct00027
이고, R은 -L3-Z2-B이다.
제1 하위세트의 일부 실시양태에서, X는 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 L1은
Figure pct00028
이고, R은 -L3-Z2-B이고, 여기서 L3은 C5-C20 폴리에틸렌 글리콜이고, Z2는 -NR'-(C=O)-R"이고, R'은 H이고 R"은 아릴렌이다.
제1 하위세트의 일부 실시양태에서, X는 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 L1은
Figure pct00029
이고, R은 -L3-Z2-B이고; R1, R2, 및 R3은 각각 -L-U이고, 여기서 L은 CH2이고 U는 -CO2H이다.
제1 하위세트의 일부 실시양태에서, X는 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 L1은
Figure pct00030
이고, R은 -L3-Z2-B이고; W는
Figure pct00031
이다.
제1 하위세트의 일부 실시양태에서, X는 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 L1은
Figure pct00032
이고, R은 -L3-Z2-B이고; W는
Figure pct00033
이고; R1, R2, 및 R3은 각각 -L-U이고, 여기서 L은 CH2이고 U는 -CO2H이고; L3은 C5-C20 폴리에틸렌 글리콜이고; Z2는 -NR'-(C=O)-R"이고, R'은 H이고, R"은 아릴렌이다.
제1 하위세트의 일부 실시양태에서, X는 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 L1은
Figure pct00034
이고, R은 -L3-Z2-B이고, 여기서 B는 치료 모이어티 또는 표적화 모이어티이다.
제1 하위세트의 일부 실시양태에서, X는 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 L1은
Figure pct00035
이고, R은 -L3-Z2-B이고, 여기서 B는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 (IGF-1R)에 특이적으로 결합한다.
제1 하위세트의 일부 실시양태에서, X는 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 L1은
Figure pct00036
이고, R은 -L3-Z2-B이고, 여기서 B는 아미노-반응성 가교기, 메티오닌-반응성 가교기 및 티올-반응성 가교기로 이루어진 군으로부터 선택되는 가교기이다. 일부 실시양태에서, 가교기는 활성화된 에스테르, 이미데이트, 무수물, 티올, 디술피드, 말레이미드, 아지드, 알킨, 변형된 알킨, 변형된 알켄, 할로겐, 술포네이트, 할로아세틸, 아민, 히드라지드, 디아지린, 포스핀, 테트라진, 이소티오시아네이트 또는 옥사지리딘을 포함하며, 여기서 활성화된 에스테르는 히드록시숙신이미드 에스테르, 2,3,5,6-테트라플루오로페놀 에스테르, 2,6-디클로로페놀 에스테르 또는 4-니트로페놀 에스테르일 수 있다.
제1 하위세트의 일부 실시양태에서, B는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 가교기이다:
Figure pct00037
본 발명의 또 다른 측면은 하기 제시된 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물의 제2 하위세트, 또는 그의 금속 착물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 특징으로 한다:
Figure pct00038
여기서,
R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, R4는 -X-W이고, R5는 H, -L-U, 또는 -X-W이거나; 또는 R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 -L-U이고, R5는 -X-W이고;
n은 0-3의 정수이고, n이 0이고 R5가 H인 경우, R1, R3, 및 R4가 모두
Figure pct00039
과 동일하지는 않고,
여기서,
L은 C=O 또는 -CH(R)-이고, 여기서 R은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 헤테로알킬, 또는 -L1-Z1-L2-Z2-B이고;
U는 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 카르복실산, 또는 임의로 치환된 포스폰산이거나; 또는 -L-U는 -L1-Z1-L2-Z2-B이고;
R1-R3 중 적어도 하나는 임의로 치환된 헤테로아릴로서의 U를 갖고;
X는 C=O 또는 임의로 치환된 C1-C3 알킬렌이고;
W는 방사성금속에 배위할 수 있는 공여 모이어티이고, 여기서 공여 모이어티는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 임의로 치환된 히드록시피리디논이고
Figure pct00040
,
여기서, V1은 삭제되거나, 융합된 아릴 또는 헤테로아릴, 융합된 카르보사이클 또는 헤테로사이클, 알킬, 에테르, 알콜, 산, 에스테르, 아미드, 포스포네이트 또는 술포네이트이고; V2는 H, 알킬 또는 아실이다.
-CH(R)-인 링커 L을 참조하면, R은 -L1-Z1-L2-Z2-B이고, 가변기 L1, Z1, L2, Z2, 및 B는 각각 하기와 같이 정의된다:
L1은 임의로 결합, 치환된 C1-C6 알킬렌, 또는 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬렌이고;
Z1은 결합, C=O(NR4), C=S(NR4), OC=O(NR4), NR4C=O(O), NR4C=O(NR4), -CH2PhC=O(NR4), -CH2Ph(NR4)C=O, 또는 -CH2Ph(NH)C=S(NR4)이고, 각각의 R4는 독립적으로 H, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬, 또는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
L2는 임의로 치환된 C1-C50 알킬렌, 또는 임의로 치환된 C1-C50 헤테로알킬렌, 또는 C5-C20 폴리에틸렌 글리콜이고;
Z2는 C=O, -NR'-(C=O)-, 또는 -NR'-(C=O)-R"이고, R'은 H 또는 C1-C6 알킬이고, R"은 C1-C20 알킬렌, C2-C20 헤테로알킬렌, 또는 아릴렌이고;
B는 치료 모이어티, 표적화 모이어티 또는 가교기이다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, W는 구조
Figure pct00041
을 갖는 임의로 치환된 히드록시피리디논이다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, X는 C1-C3 알킬렌이다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, W는 구조
Figure pct00042
을 갖는 임의로 치환된 히드록시피리디논이고, X는 CH2이다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, 화학식 (I)의 화합물은 가변기 n이 1이다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, W는 구조
Figure pct00043
을 갖는 임의로 치환된 히드록시피리디논이고, X는 CH2이고, n은 1이다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, 여기서 L은 -CH(R)-이고, R은 H이다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, 여기서 L은 -CH(R)-이고, R은 H이고, U는 임의로 치환된 헤테로아릴 (예를 들어,
Figure pct00044
) 또는 임의로 치환된 카르복실산 (예를 들어, CO2H 또는 CO(NMeOH))이다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, 여기서 L은 -CH(R)-이고, R은 H이고, U는
Figure pct00045
, CO2H, 또는 CO(NMeOH)이고, R1-R3 중 적어도 하나는
Figure pct00046
으로서의 U를 갖는다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, 여기서 L은 -CH(R)-이고, R은 H이고, R1-R3 중 적어도 하나는
Figure pct00047
으로서의 U를 갖는다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, 여기서 L은 -CH(R)-이고, R은 H이고, R1-R3은 각각
Figure pct00048
으로서의 U를 갖는다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, 여기서 L은 -CH(R)-이고, R은 H이고, R1-R3은 각각
Figure pct00049
으로서의 U를 갖고; W는
Figure pct00050
이고; X는 CH2이다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, X는 C1-C3 알킬렌이고, R1-R3은 각각
Figure pct00051
으로서의 U를 갖는다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, R1-R3은 각각
Figure pct00052
으로서의 U를 갖고, W는
Figure pct00053
이고, X는 CH2이다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, 여기서 L은 -CH(R)-이고, R은 -L1-Z1-L2-Z2-B이고 L1은
Figure pct00054
이다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, 여기서 L은 -CH(R)-이고, R은 -L1-Z1-L2-Z2-B이고, 여기서 L1은
Figure pct00055
이고, L2는 C5-C20 폴리에틸렌 글리콜이고, Z2는 -NR'-(C=O)-R"이고, R'은 H이고, R"은 아릴렌이다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, 여기서 L은 -CH(R)-이고, R은 -L1-Z1-L2-Z2-B이고, L1은
Figure pct00056
이고, R1-R3 중 적어도 하나는
Figure pct00057
으로서의 U를 갖는다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, 여기서 L은 -CH(R)-이고, R은 -L1-Z1-L2-Z2-B이고, 여기서 L1은
Figure pct00058
이고, B는 치료 모이어티 또는 표적화 모이어티이다.
전형적으로, 이러한 하위세트의 화합물에서 치료 모이어티 또는 표적화 모이어티는 항체 또는 그의 항원-결합 단편이다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 IGF-1R에 특이적으로 결합한다.
제2 하위세트의 일부 실시양태에서, R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, 여기서 L은 -CH(R)-이고, R은 -L1-Z1-L2-Z2-B이고, 여기서 L1은
Figure pct00059
이고, B는 아미노-반응성 가교기, 메티오닌-반응성 가교기, 및 티올-반응성 가교기로 이루어진 군으로부터 선택되는 가교기이다.
본 발명의 추가 측면은 하기 제시된 화학식 (II)의 구조를 갖는 화합물의 제3 하위세트, 또는 그의 금속 착물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 특색으로 한다:
Figure pct00060
여기서,
R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, W는 H 또는 -L1-Z1-L2-Z2-B이고,
여기서,
L은 C=O 또는 -CH(R)-이고, 여기서 R은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 헤테로알킬, 또는 -L1-Z1-L2-Z2-B이고;
U는 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 카르복실산, 또는 임의로 치환된 포스폰산이거나; 또는 -L-U는 -L1-Z1-L2-Z2-B이고;
R1-R3 중 적어도 하나는 임의로 치환된 헤테로아릴로서의 U를 갖고;
여기서,
L1은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌, 또는 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬렌이고;
Z1은 결합, C=O(NR4), C=S(NR4), OC=O(NR4), NR4C=O(O), NR4C=O(NR4), -CH2PhC=O(NR4), -CH2Ph(NR4)C=O, 또는 -CH2Ph(NH)C=S(NR4)이고, 각각의 R4는 독립적으로 H, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬, 또는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
L2는 임의로 치환된 C1-C50 알킬렌, 또는 임의로 치환된 C1-C50 헤테로알킬렌, 또는 C5-C20 폴리에틸렌 글리콜이고;
Z2는 C=O, -NR'-(C=O)-, 또는 -NR'-(C=O)-R"이고, R'은 H 또는 C1-C6 알킬이고, R"은 C1-C20 알킬렌, C2-C20 헤테로알킬렌, 또는 아릴렌이고;
B는 치료 모이어티, 표적화 모이어티 또는 가교기이다.
일부 실시양태에서, 상기 화학식 (II)의 화합물은 U가 방사성금속에 배위할 수 있는 공여 모이어티이고, 여기서 공여 모이어티는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 임의로 치환된 히드록시피리디논인 것을 특색으로 한다:
Figure pct00061
여기서, V1은 삭제되거나, 융합된 아릴 또는 헤테로아릴, 융합된 카르보사이클 또는 헤테로사이클, 알킬, 에테르, 알콜, 산, 에스테르, 아미드, 포스포네이트 또는 술포네이트이고; V2는 H, 알킬 또는 아실이다.
화학식 (II)의 화합물의 제3 하위세트의 예는 하기를 포함하나 이에 제한되지는 않는다:
Figure pct00062
Figure pct00063
전형적으로, 상기 기재된 화합물의 임의의 하위세트에서의 가교기는 활성화된 에스테르, 이미데이트, 무수물, 티올, 디술피드, 말레이미드, 아지드, 알킨, 변형된 알킨, 변형된 알켄, 할로겐, 술포네이트, 할로아세틸, 아민, 히드라지드, 디아지린, 포스핀, 테트라진, 이소티오시아네이트 또는 옥사지리딘을 포함하며, 여기서 활성화된 에스테르는 히드록시숙신이미드 에스테르, 2,3,5,6-테트라플루오로페놀 에스테르, 2,6-디클로로페놀 에스테르 또는 4-니트로페놀 에스테르일 수 있다. 예시적인 가교기는 하기로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00064
본원에 기재된 실시양태를 통해, 특정 항체 (예를 들어, IGF-1R)에 부착되는 경우, 방사성면역접합체의 생체내 안정성을 증진시킴으로써 전신 방사능의 감소를 달성하여 독성을 최소화하는 이관능성 킬레이트가 확인되었다. 전체적으로 취해졌을 때, 이들 실시양태는 온-타겟 활성을 유지하면서 인간 신체에서 방사능을 감소시킴으로써 방사성면역접합체의 목적하는 특성을 달성한다.
치료 모이어티 및 표적화 모이어티
치료 또는 표적화 모이어티는 치료 이익을 부여하는 임의의 분자 또는 분자의 임의의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 모이어티는 단백질 또는 폴리펩티드, 예를 들어 항체, 그의 항원-결합 단편이다. 일부 실시양태에서, 치료 모이어티는 소분자이다. 표적화 모이어티는 주어진 표적에 결합하는 임의의 분자 또는 분자의 임의의 부분을 포함한다.
항체
항체는 전형적으로 디술피드 결합에 의해 함께 연결된 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드 및 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드 쇄를 포함한다. 각 쇄의 아미노 말단에 위치한 제1 도메인은 아미노산 서열이 가변적이어서, 각 개별 항체의 항체-결합 특이성을 제공한다. 이들은 가변 중쇄 (VH) 및 가변 경쇄 (VL) 영역으로 공지되어 있다. 각 쇄의 다른 도메인은 아미노산 서열이 비교적 불변이고, 불변 중쇄 (CH) 및 불변 경쇄 (CL) 영역으로 공지되어 있다. 경쇄는 전형적으로 1개의 가변 영역 (VL) 및 1개의 불변 영역 (CL)을 포함한다. IgG 중쇄는 가변 영역 (VH), 제1 불변 영역 (CH1), 힌지 영역, 제2 불변 영역 (CH2) 및 제3 불변 영역 (CH3)을 포함한다. IgE 및 IgM 항체에서, 중쇄는 추가의 불변 영역 (CH4)을 포함한다.
본원에 기재된 항체는, 예를 들어 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 낙타류 항체, 키메라 항체, 단일쇄 Fv (scFv), 디술피드-연결된 Fv (sdFv), 및 항-이디오타입 (항-Id) 항체, 및 상기 중 임의의 것의 항원-결합 단편을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 인간화된다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 키메라이다. 항체는 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 부류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위부류의 것일 수 있다.
본원에 사용된 용어 항체의 "항원 결합 단편"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 용어 항체의 "항원 결합 단편" 내에 포괄되는 결합 단편의 예는 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fd 단편, Fv 단편, scFv 단편, dAb 단편 (문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]), 및 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. 일부 실시양태에서, "항원 결합 단편"은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 사용하여 수득될 수 있고, 단편은 무손상 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝될 수 있다.
본원에 기재된 항체 또는 단편은 항체의 합성에 대해 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 생성될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988); Brinkman et al., 1995, J. Immunol. Methods 182:41-50]; WO 92/22324; WO 98/46645 참조). 키메라 항체는 예를 들어 문헌 [Morrison, 1985, Science 229:1202]에 기재된 방법을 이용하여 생성할 수 있고, 인간화 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 6,180,370에 기재된 방법에 의해 생성할 수 있다.
본원에 기재된 추가의 항체는 예를 들어 문헌 [Segal et al., J. Immunol. Methods 248:1-6 (2001); and Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)]에 기재된 바와 같은 이중특이적 항체 및 다가 항체, 또는 하기 기재된 임의의 분자이다.
"아비머"는, 예를 들어 시험관내 엑손 셔플링 및 파지 디스플레이를 사용하여 조작된 다량체 결합 단백질 또는 펩티드에 관한 것이다. 다중 결합 도메인이 연결되어, 단일 에피토프 이뮤노글로불린 도메인에 비해 더 큰 친화도 및 특이성을 유발한다.
"나노바디"는 단일 단량체 가변 항체 도메인으로 이루어진 항체 단편이다. 나노바디도 또한 단일-도메인 항체로 지칭될 수 있다. 항체와 같이, 나노바디는 특이적 항원에 선택적으로 결합한다. 나노바디는 중쇄 가변 도메인 또는 경쇄 도메인일 수 있다. 나노바디는 자연적으로 발생할 수 있거나 또는 생물학적 조작의 산물일 수 있다. 나노바디는 부위-지정 돌연변이유발 또는 돌연변이유발 스크리닝 (예를 들어, 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, mRNA 디스플레이, 리보솜 디스플레이)에 의해 생물학적으로 조작될 수 있다. "아피바디"는 특이적 항원에 결합하도록 조작된 폴리펩티드 또는 단백질이다. 이에 따라, 아피바디는 항체의 특정 기능을 모방하는 것으로 간주될 수 있다. 아피바디는 스타필로코쿠스 단백질 A의 이뮤노글로불린-결합 영역 내의 B-도메인의 조작된 변이체일 수 있다. 아피바디는 Fab 영역에 대해 보다 낮은 친화도를 갖는 B-도메인인 Z-도메인의 조작된 변이체일 수 있다. 아피바디는 부위-지정 돌연변이유발 또는 돌연변이유발 스크리닝 (예를 들어, 파지 디스플레이, 효모 디스플레이, 박테리아 디스플레이, mRNA 디스플레이, 리보솜 디스플레이)에 의해 생물학적으로 조작될 수 있다.
다양한 상이한 단백질 (예를 들어, 인슐린, 피브리노겐, 트랜스페린, 종양 괴사 인자-α, IL-8, gp120, CD28, 인간 혈청 알부민, IgA, IgE, IgM, HER2 및 EGFR)에 대한 특이적 결합을 나타내는 아피바디 분자가 생성되었으며, 이는 μM 내지 pM 범위의 친화도 (Kd)를 나타낸다. "디아바디"는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, 문헌 [Hudson et al., (2003)]을 참조한다. 단일쇄 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 항체 단편은 무손상 항체의 단백질분해적 소화뿐만 아니라 본원에 기재된 바와 같은 재조합 숙주 (예를 들어, 이. 콜라이 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편은 다중특이적, 예를 들어 이중특이적이다. 다중특이적 항체 (또는 그의 항원-결합 단편)는 적어도 2개의 상이한 부위에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체 (또는 그의 항원-결합 단편)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 아미노산 서열 변이체; 예를 들어, IGF-1R에 결합하는 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 아미노산 서열 변이체는 항체 또는 그의 항원-결합 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 단편의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 목적하는 특징, 예를 들어 항원 결합을 보유하는 한, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
폴리펩티드
폴리펩티드는, 예를 들어 임의의 다양한 혈액 작용제 (예를 들어, 에리트로포이에틴, 혈액-응고 인자 등 포함), 인터페론, 콜로니 자극 인자, 항체, 효소 및 호르몬을 포함한다. 특정한 폴리펩티드의 정체는 본 개시내용을 제한하는 것으로 의도되지 않으며, 임의의 관심 폴리펩티드가 본 방법에서의 폴리펩티드일 수 있다.
본원에 기재된 참조 폴리펩티드는 관심 표적에 결합하는 (예를 들어, 항원에 결합하는) 표적-결합 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드, 예컨대 항체는 막횡단 폴리펩티드 (예를 들어, 수용체) 또는 리간드 (예를 들어, 성장 인자)에 결합할 수 있다. 본원에 기재된 폴리펩티드 (예를 들어, 항체)에 대한 예시적인 분자 표적 (예를 들어, 항원)은 CD 단백질, 예컨대 CD2, CD3, CD4, CD8, CD11, CD19, CD20, CD22, CD25, CD33, CD34, CD40, CD52; ErbB 수용체 패밀리의 구성원, 예컨대 EGF 수용체 (EGFR, HER1, ErbB1), HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3) 또는 HER4 (ErbB4) 수용체; 대식세포 수용체, 예컨대 CRIg; 종양 괴사 인자, 예컨대 TNFα 또는 TRAIL/Apo-2; 세포 부착 분자, 예컨대 LFA-1, Mac1, p150,95, VLA-4, ICAM-1, VCAM 및 αvβ3 인테그린 (그의 α 또는 β 서브유닛 포함) (예를 들어, 항-CD11a, 항-CD18 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자 및 수용체, 예컨대 EGF, FGFR (예를 들어, FGFR3) 및 VEGF; IgE; 시토카인, 예컨대 IL1; 시토카인 수용체, 예컨대 IL2 수용체; 혈액형 항원; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; 단백질 C; 뉴트로필린; 에프린 및 수용체; 네트린 및 수용체; 슬릿 및 수용체; 케모카인 및 케모카인 수용체, 예컨대 CCL5, CCR4, CCR5; 아밀로이드 베타; 보체 인자, 예컨대 보체 인자 D; 지단백질, 예컨대 산화된 LDL (oxLDL); 림프독소, 예컨대 림프독소 알파 (LTa)를 포함한다. 다른 분자 표적은 트윅(Tweak), B7RP-1, 전구단백질 컨버타제 서브틸리신/켁신 유형 9 (PCSK9), 스클레로스틴, c-kit, Tie-2, c-fms, 및 항-M1을 포함한다.
변형된 폴리펩티드
본 발명의 폴리펩티드는 변형된 아미노산 서열을 가질 수 있다. 변형된 폴리펩티드는 상응하는 참조 폴리펩티드와 실질적으로 동일할 수 있다 (예를 들어, 변형된 폴리펩티드의 아미노산 서열은 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열에 대해 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 가질 수 있음). 특정 실시양태에서, 변형은 목적하는 생물학적 활성 (예를 들어, IGF-1R에 대한 결합)을 유의하게 파괴하지 않는다. 변형은 원래 폴리펩티드의 생물학적 활성을 감소시킬 수 있거나 (예를 들어, 적어도 5%, 10%, 20%, 25%, 35%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 95%만큼), 효과를 갖지 않을 수 있거나, 또는 증가시킬 수 있다 (예를 들어, 적어도 5%, 10%, 25%, 50%, 100%, 200%, 500%, 또는 1000%만큼). 변형된 폴리펩티드는 폴리펩티드의 특징, 예컨대 생체내 안정성, 생체이용률, 독성, 면역학적 활성, 면역학적 동일성 및 접합 특성을 가질 수 있거나 또는 최적화할 수 있다.
변형은 자연 과정, 예컨대 번역후 프로세싱에 의한 것들 또는 관련 기술분야에 공지된 화학적 변형 기술에 의한 것들을 포함한다. 변형은 폴리펩티드 백본, 아미노산 측쇄 및 아미노- 또는 카르복시-말단을 포함한 폴리펩티드 내의 임의의 위치에서 발생할 수 있다. 동일한 유형의 변형은 주어진 폴리펩티드 내의 여러 부위에서 동일하거나 다양한 정도로 존재할 수 있고, 폴리펩티드는 1종 초과의 유형의 변형을 함유할 수 있다. 폴리펩티드는 유비퀴틴화의 결과로서 분지화될 수 있고, 분지화가 있거나 없는 시클릭일 수 있다. 시클릭, 분지형 및 분지형 시클릭 폴리펩티드는 번역후 자연 과정으로부터 생성될 수 있거나 또는 합성적으로 제조될 수 있다. 다른 변형은 PEG화, 아세틸화, 아실화, 아세토미도메틸 (Acm) 기의 부가, ADP-리보실화, 알킬화, 아미드화, 비오티닐화, 카르바모일화, 카르복시에틸화, 에스테르화, 플라빈에 대한 공유 부착, 헴 모이어티에 대한 공유 부착, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체의 공유 부착, 약물의 공유 부착, 마커 (예를 들어, 형광 또는 방사성)의 공유 부착, 지질 또는 지질 유도체의 공유 부착, 포스파티딜이노시톨의 공유 부착, 가교, 고리화, 디술피드 결합 형성, 탈메틸화, 공유 가교의 형성, 시스틴의 형성, 피로글루타메이트의 형성, 포르밀화, 감마-카르복실화, 글리코실화, GPI 앵커 형성, 히드록실화, 아이오딘화, 메틸화, 미리스토일화, 산화, 단백질분해 프로세싱, 인산화, 프레닐화, 라세미화, 셀레노일화, 황산화, 단백질에 대한 아미노산의 전달-RNA 매개 부가, 예컨대 아르기닐화 및 유비퀴틴화를 포함한다.
변형된 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드 서열 내에 보존적 또는 비-보존적 (예를 들어, D-아미노산, 데스아미노산) 아미노산 삽입, 결실 또는 치환을 포함할 수 있다 (예를 들어, 이러한 변화가 폴리펩티드의 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 경우). 특히, 본 발명의 임의의 폴리펩티드의 아미노 또는 카르복시-말단에 대한 하나 이상의 시스테인 잔기의 부가는 예를 들어 디술피드 결합에 의한 이들 폴리펩티드의 접합을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 아미노-말단에 단일 시스테인 잔기 또는 카르복시-말단에 단일 시스테인 잔기를 포함하도록 변형될 수 있다. 아미노산 치환은 보존적 (즉, 여기서 잔기는 동일한 일반적 유형 또는 군의 또 다른 것에 의해 대체됨) 또는 비-보존적 (즉, 여기서 잔기는 또 다른 유형의 아미노산에 의해 대체됨)일 수 있다. 또한, 비-자연 발생 아미노산 대신 자연 발생 아미노산이 치환될 수 있다 (즉, 비-자연 발생 보존적 아미노산 치환 또는 비-자연 발생 비-보존적 아미노산 치환).
합성적으로 제조된 폴리펩티드는 DNA에 의해 천연적으로 코딩되지 않는 아미노산 (예를 들어, 비-자연 발생 또는 비천연 아미노산)의 치환을 포함할 수 있다. 비-자연 발생 아미노산의 예는 D-아미노산, N-보호된 아미노산, 시스테인의 황 원자에 부착된 아세틸아미노메틸 기를 갖는 아미노산, PEG화 아미노산, 화학식 NH2(CH2)nCOOH (여기서, n은 2-6임)의 오메가 아미노산, 중성 비극성 아미노산, 예컨대 사르코신, t-부틸 알라닌, t-부틸 글리신, N-메틸 이소류신 및 노르류신을 포함한다. 페닐글리신은 Trp, Tyr 또는 Phe를 치환시킬 수 있고; 시트룰린 및 메티오닌 술폭시드는 중성 비극성이고, 시스테산은 산성이고, 오르니틴은 염기성이다. 프롤린은 히드록시프롤린으로 치환되고 입체형태 부여 특성을 보유할 수 있다.
유사체는 치환 돌연변이유발에 의해 생성되고 원래 폴리펩티드의 생물학적 활성을 보유할 수 있다. "보존적 치환"으로서 확인된 치환의 예가 하기 표 1에 제시된다. 이러한 치환이 목적하지 않은 변화를 유발하는 경우, 표 1에서 "예시적인 치환"으로 명명되거나 아미노산 부류와 관련하여 본원에 추가로 기재된 바와 같은 다른 유형의 치환이 도입되고 생성물이 스크리닝된다.
표 1: 아미노산 치환
Figure pct00065
기능 또는 면역학적 동일성의 실질적인 변형은 (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 백본의 구조, 예를 들어 시트 또는 나선 입체형태, (b) 표적 부위에서의 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 것에 대한 그의 효과가 유의하게 상이한 치환을 선택함으로써 달성된다.
검출제
검출제는 폴리펩티드, 예를 들어 항체 또는 그의 항원-결합 단편에 접합되어 투여되는 분자 또는 원자이고, 항원을 함유하는 세포의 위치를 찾아냄으로써 질환을 진단하거나, 방사선 치료를 계획하거나, 또는 질환을 치료하는 데 유용하다. 유용한 검출제는 방사성동위원소, 염료 (예컨대, 비오틴-스트렙타비딘 복합체 함유), 조영제, 형광 화합물 또는 분자, 발광제, 및 자기 공명 영상화 (MRI)를 위한 증진제 (예를 들어, 상자성 이온)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 폴리펩티드 성분에 검출제를 로딩하기 위해, 이를 검출제 또는 다수의 검출제가 부착된 링커를 갖는 시약과 반응시키는 것이 필요할 수 있다.
방사성동위원소 및 방사성핵종
검출제로서의 그의 유용성에 대해 관련 기술분야에 공지된 방사성동위원소 및 방사성핵종은 89Zr, 47Sc, 55Co, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 82Rb, 86Y, 87Y, 90Y, 97Ru, 105Rh, 109Pd, 111In, 117mSn, 149Pm, 52Mn, 149Tb, 152Tb, 153Sm, 177Lu, 186Re, 188Re, 199Au, 201Tl, 203Pb, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac, 223Ra 및 227Th를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
투여 및 투여량
본 발명은 또한 치료 유효량의 본 발명의 화합물을 함유하는 제약 조성물을 특색으로 한다. 조성물은 다양한 약물 전달 시스템에 사용하기 위해 제제화될 수 있다. 1종 이상의 생리학상 허용되는 부형제 또는 담체가 또한 적절한 제제화를 위해 조성물에 포함될 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 제제가 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed., 1985]에서 발견된다. 약물 전달 방법의 간단한 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Langer (Science 1990, 249, 1527-1533)]을 참조한다.
제약 조성물은 예방적 및/또는 치유적 치료를 위한 비경구, 비강내, 국소, 경구 또는 국부 투여, 예컨대 경피 수단에 의한 투여를 위해 의도된다. 제약 조성물은 비경구로 (예를 들어, 정맥내, 근육내 또는 피하 주사에 의해), 또는 경구 섭취에 의해, 또는 혈관 또는 암 상태에 걸린 영역에서의 국소 적용 또는 관절내 주사에 의해 투여될 수 있다. 추가의 투여 경로는 혈관내, 동맥내, 종양내, 복강내, 뇌실내, 경막외내, 및 또한 비강, 안과, 공막내, 안와내, 직장, 국소 또는 에어로졸 흡입 투여를 포함한다. 지속 방출 투여는 또한 데포 주사 또는 침식성 이식물 또는 성분과 같은 수단에 의해 본 발명에 구체적으로 포함된다. 따라서, 본 발명은 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체, 예를 들어 특히 물, 완충수, 염수 또는 PBS 중에 용해 또는 현탁된 상기 언급된 작용제를 포함하는 비경구 투여용 조성물을 제공한다. 조성물은 생리학적 조건에 근접하기 위해 요구되는 제약상 허용되는 보조 물질, 예컨대 특히 pH 조정제 및 완충제, 장성 조정제, 습윤제, 또는 세제를 함유할 수 있다. 본 발명은 또한 경구 전달용 조성물을 제공하며, 이는 단위 투여 형태, 예컨대 정제 또는 캡슐의 제제를 위한 불활성 성분, 예컨대 결합제 또는 충전제를 함유할 수 있다. 또한, 본 발명은 크림, 연고, 겔, 페이스트 또는 점안제의 제제화를 위한 불활성 성분, 예컨대 용매 또는 유화제를 함유할 수 있는 국소 투여용 조성물을 제공한다.
이들 조성물은 통상적인 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있거나 또는 멸균 여과될 수 있다. 생성된 수용액은 그대로 사용하기 위해 포장되거나, 동결건조될 수 있고, 동결건조된 제제는 투여 전에 멸균 수성 담체와 조합된다. 제제의 pH는 전형적으로 3 내지 11, 보다 바람직하게는 5 내지 9 또는 6 내지 8, 가장 바람직하게는 6 내지 7, 예컨대 6 내지 6.5일 것이다. 생성된 고체 형태의 조성물은 각각 고정량의 상기 언급된 작용제 또는 작용제들을 함유하는 다중 단일 용량 단위로, 예컨대 정제 또는 캡슐의 밀봉된 패키지로 포장될 수 있다. 고체 형태의 조성물은 또한 유연한 양을 위한 용기 내에, 예컨대 국소적으로 적용가능한 크림 또는 연고용으로 설계된 압착가능한 튜브 내에 포장될 수 있다.
유효량을 함유하는 조성물은 방사선 치료 계획, 진단 또는 치유적 치료를 위해 투여될 수 있다. 방사선 치료 계획 또는 진단 목적을 위해 투여되는 경우, 접합체는 대상체에게 진단 유효 용량 및/또는 치료 유효 용량을 결정하기에 효과적인 양으로 투여된다. 치료 용도에서, 조성물은 이미 상태 (예를 들어, 암)를 앓고 있는 대상체 (예를 들어, 인간)에게 장애 및 그의 합병증의 증상을 치유하거나 또는 적어도 부분적으로 정지시키기에 충분한 양으로 투여된다. 이러한 목적을 달성하기에 적절한 양은 질환 또는 의학적 상태와 연관된 1종 이상의 증상을 실질적으로 개선시키기에 충분한 화합물의 양인 "치료 유효량"으로서 정의된다. 예를 들어, 암의 치료에서, 질환 또는 상태의 임의의 증상을 감소, 예방, 지연, 억제 또는 정지시키는 작용제 또는 화합물이 치료상 유효할 것이다. 치료 유효량의 작용제 또는 화합물은 질환 또는 상태를 치유하는 데 요구되지 않지만, 질환 또는 상태의 발병이 지연, 방해 또는 예방되거나, 또는 질환 또는 상태 증상이 개선되거나, 또는 질환 또는 상태의 기간이 변화되거나, 예를 들어 덜 중증이거나, 또는 개체에서 회복이 가속화되도록 질환 또는 상태에 대한 치료를 제공할 것이다. 본 발명의 접합체는 대상체에게 임의의 상기 접합체 또는 조성물의 제1 용량을 방사선 치료 계획에 효과적인 양으로 투여하고, 이어서 임의의 상기 접합체 또는 조성물의 제2 용량을 치료 유효량으로 투여함으로써 암의 치료에 사용될 수 있다.
이들 사용에 효과적인 양은 질환 또는 상태의 중증도 및 대상체의 체중 및 일반적 상태에 따라 달라질 수 있다. 포유동물 (예를 들어, 인간)에게 적용되는 본 발명의 방법에 사용되는 본 발명의 조성물의 치료 유효량은 포유동물의 연령, 체중 및 상태의 개별 차이를 고려하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 본 발명의 특정 접합체는 암 세포를 표적화하는 증진된 능력을 나타내고 잔류하기 때문에, 본 발명의 화합물의 투여량은 비접합 및/또는 비-방사성표지된 작용제의 치료 효과에 요구되는 등가 용량보다 더 낮을 수 있다 (예를 들어, 약 90%, 75%, 50%, 40%, 30%, 20%, 15%, 12%, 10%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5% 또는 0.1% 이하). 본 발명의 작용제는 대상체 (예를 들어, 포유동물, 예컨대 인간)에게 치료되는 대상체에서 바람직한 결과를 생성하는 양인 유효량으로 투여된다. 치료 유효량은 또한 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 실험적으로 결정될 수 있다.
유효량을 포함하는 본 발명의 조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료 의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 용량 및 투여 스케줄은 대상체에서의 질환 또는 상태의 중증도에 기초하여 결정되고 조정될 수 있으며, 이는 임상의에 의해 통상적으로 실시되는 방법 또는 본원에 기재된 것들에 따라 치료 과정 전반에 걸쳐 모니터링될 수 있다.
본 발명의 접합체는 치료 또는 요법의 통상적인 방법과 조합하여 사용될 수 있거나, 또는 치료 또는 요법의 통상적인 방법과 별개로 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물이 다른 작용제와 조합 요법으로 투여되는 경우, 이들은 개체에게 순차적으로 또는 공동으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 제약 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 제약상 허용되는 부형제, 및 관련 기술분야에 공지된 또 다른 치료제 또는 예방제와 함께 본 발명의 화합물의 조합물로 구성될 수 있다.
추가의 상술 없이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 설명에 기초하여 본 개시내용을 최대한 활용할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 하기 구체적 실시예는 단지 예시적인 것이며, 어떠한 방식으로도 나머지 개시내용을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다.
실시예
실시예 1: 물질 및 일반적 방법
악티늄-225 (225Ac)는 핵 물리학 과학의 미국 에너지 동위원소 프로그램부에 의해 공급되었다. 루테튬-177 (177Lu)은 ITG 이소토프 테크놀로지스 가르칭 게엠베하(ITG Isotope Technologies Garching GmbH)로부터 받았고, 지르코늄-89 (89Zr)는 3D 이미징(3D Imaging)으로부터 받았다.
MALDI-TOF-MS (양성 이온)를 사용하여 면역접합체의 킬레이트-대-항체 비를 결정하였다. 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분광측정법 (MALDI-TOF-MS)을 MALDI 브루커 울트라플렉스트림 분광계를 사용하여 수행하였다. 시나핀산의 포화 용액을 TA30 용매 (30:70 [v/v] 아세토니트릴:물 중 0.1% TFA) 중에서 제조하였다. 샘플을 매트릭스 용액과 1:1 비로 혼합하였다. 1 μL의 샘플 부피를 플레이트 상에 스팟팅하고, BSA의 단백질 용액을 외부 표준으로서 사용하였다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 워터스 1525 바이너리 HPLC 펌프, 워터스 2489 UV/가시광선 검출기 (280 nm에서 모니터링), 바이오스캔 플로우 카운트 방사선검출기 (FC-3300) 및 토소(TOSOH) TSK겔 G3000SWxl, 7.8 x 300 mm 칼럼으로 구성된 워터스 시스템을 사용하여 수행하였다.
SEC HPLC 용리 방법 1: 등용매 SEC 방법은 유량 = 0.5 mL/분, 및 0.2 M 인산칼륨 (pH 7), 0.25 M 염화칼륨, 10% 이소프로판올, pH = 7의 이동상을 가졌다.
SEC HPLC 용리 방법 2: 등용매 SEC 방법은 유량 = 1.0 mL/분, 및 0.022 M NaH2PO4, 0.047 M Na2HPO4, 0.60 M 염화나트륨, 0.0038 M 아지드화나트륨, pH = 7의 이동상을 가졌다.
iTLC-SG 유리 마이크로섬유 크로마토그래피 페이퍼 (애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies), SGI0001) 플레이트 상에서 수행되는 바이오스캔 AR-2000 이미징 스캐너로 방사성TLC를 수행하였다.
방사성 정제용 역상 HPLC를 워터스 1525 바이너리 HPLC 펌프, 워터스 2489 UV/가시광선 검출기 (254 및 214 nm에서 모니터링함), 바이오스캔 플로우 카운트 방사선검출기 (FC-3300) 및 아틀란티스 T3, 4.6 x 150 mm (5 μm) 칼럼, 가드 없음; 이동상 A: H2O (0.1% v/v TFA); 이동상 B: 아세토니트릴 (0.1% v/v TFA); 유량 = 1.5 mL/분; 초기 = 100% A, 3분 = 100% A, 13분 = 75% A, 15분 = 0% A로 구성된 워터스 시스템을 사용하여 수행하였다.
방사성 정제용 SEC HPLC를 워터스 1525 바이너리 HPLC 펌프, 워터스 2489 UV/가시광선 검출기 (280 nm에서 모니터링함), 바이오스캔 플로우 카운트 방사선검출기 (FC-3300) 및 토소 TSK겔 G3000SWxl, 7.8 x 300 mm 칼럼으로 구성된 워터스 시스템을 사용하여 수행하였다. 등용매 SEC 방법은 유량 = 1.0 mL/분, 및 0.022 M NaH2PO4, 0.047 M Na2HPO4, 0.60 M 염화나트륨, pH = 7의 이동상을 가졌다.
분석용 HPLC-MS를 워터스 액퀴티 바이너리 솔벤트 매니저, 워터스 액퀴티 샘플 매니저, 워터스 액퀴티 칼럼 매니저 (칼럼 온도 30℃), 워터스 액퀴티 포토다이오드 어레이 검출기 (254 nm 및 214 nm에서 모니터링함), 전기분무 이온화를 갖는 워터스 액퀴티 TQD 및 워터스 액퀴티 BEH C18, 2.1 x 50 mm (1.7 μm) 칼럼으로 구성된 워터스 액퀴티 HPLC-MS 시스템을 사용하여 수행하였다. 정제용 HPLC를 워터스 1525 바이너리 HPLC 펌프, 워터스 2489 UV/가시광 검출기 (254 nm 및 214 nm에서 모니터링함) 및 워터스 엑스브리지 정제용 C18 19 x 100 mm (5 μm) 칼럼 또는 워터스 엑스브리지 정제용 페닐 19 x 100 mm (5 μm)로 구성된 워터스 HPLC 시스템을 사용하여 수행하였다.
HPLC 용리 방법 1: 워터스 액퀴티 BEH C18 2.1 x 50 mm (1.7 μm) 칼럼; 이동상 A: H2O (0.1% v/v TFA); 이동상 B: 아세토니트릴 (0.1% v/v TFA); 유량 = 0.3 mL/분; 파장 = 214, 254 nm; 초기 = 98% A, 3분 = 98% A, 8분 = 75% A, 10분 = 0% A, 11분 = 98% A, 12분 = 98% A.
HPLC 용리 방법 2: 워터스 액퀴티 BEH C18 2.1 x 50 mm (1.7 μm) 칼럼; 이동상 A: H2O (0.1% v/v TFA); 이동상 B: 아세토니트릴 (0.1% v/v TFA); 유량 = 0.3 mL/분; 파장 = 214, 254 nm; 초기 = 90% A, 8분 = 0% A, 10분 = 0% A, 11분 = 90% A, 12분 = 90% A.
HPLC 용리 방법 3: 워터스 액퀴티 BEH C18 2.1 x 50 mm (1.7 μm) 칼럼; 이동상 A: H2O (0.1% v/v TFA); 이동상 B: 아세토니트릴 (0.1% v/v TFA); 유량 = 0.3 mL/분; 파장 = 214, 254 nm; 초기 = 95% A, 8분 = 75% A, 10분 = 0% A, 11분 = 95% A, 12분 = 95% A.
실시예 2: 4-({2-[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)포름아미도]에틸}카르바모일)-2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (화합물 A)의 합성
Figure pct00066
단계 1: tert-부틸-4-[(2-아미노에틸)카르바모일]-2-{4,7,10-트리스[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부타노에이트 (중간체 1-A)의 합성
교반 막대가 구비된 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 DOTA-GA(tBu)4 (500 mg, 0.70 mmol, 1 당량), HBTU (300 mg, 0.77 mmol, 1.1 당량), 무수 MeCN (30 mL) 및 마지막으로 피리딘 (2.94 mL, 36.3 mmol, 52 당량)을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 30분 동안 교반한 다음, 시린지에 넣고, 시린지 펌프에 의해 0.5 mL/분의 속도로 1시간에 걸쳐 에틸렌디아민 (9.3 mL, 139 mmol, 200 당량) 및 무수 MeCN (20 mL)을 함유하는 100 mL 둥근 바닥 플라스크 내로 전달하고, 실온에서 교반하였다. 반응물을 HPLC-MS에 의해 모니터링하고, 완결 시 진공 하에 농축시킨 다음, 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하여 중간체 1-A (435 mg, 64%)를 TFA 염으로서 백색/투명한 잔류물로 수득하였다.
단계 2: tert-부틸-4-[(2-{[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]포름아미도}에틸)카르바모일]-2-{4,7,10-트리스[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부타노에이트 (중간체 1-B)의 합성
tert-부틸-4-[(2-아미노에틸)카르바모일]-2-{4,7,10-트리스[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부타노에이트 (중간체 1-A) TFA 염 (125 mg, 0.13 mmol)을 함유한 교반 막대가 구비된 20 mL 섬광 바이알에 무수 MeCN (4 mL), N,N-디이소프로필에틸아민 (90 μL, 0.51 mmol) 및 최종적으로 1-(벤질옥시)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-2-카르보닐 클로라이드 (문헌 [J. Med. Chem. 2014, 57, 4849-486]) (43 mg, 0.16 mmol, 무수 MeCN 496 μL 중에 용해됨)를 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반한 다음, HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 완결 시 반응물을 진공 하에 농축시킴으로써 후처리한 다음, 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하여 중간체 1-B (133 mg, 86%)를 TFA 염으로서 연황색 잔류물로 수득하였다.
단계 3: 4-({2-[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)포름아미도]에틸}카르바모일)-2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (화합물 A)의 합성
tert-부틸-4-[(2-{[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]포름아미도}에틸)카르바모일]-2-{4,7,10-트리스[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부타노에이트 (중간체 1-B, 10 mg, 8.3 μmol) 및 교반 막대를 함유한 20 mL 섬광 바이알에 1,4-디옥산 (0.5 mL) 및 HCl (0.5 mL, 12 M, 미량 금속 분석 등급)을 첨가하였다. 생성된 용액을 캡핑하고, 오일 조에서 50℃에서 교반하고, 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 완결 시 반응물을 공기 스트림 하에 농축 건조시킴으로써 후처리한 다음, 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하고, 동결건조 후에 화합물 A (13.5 mg, 정량적)를 TFA 염으로서 백색 고체로 수득하였다. 분취물을 용리 방법 1을 사용하여 HPLC-MS 용리에 의해 분석하였다; 체류 시간: 1.74분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z 656.0 [M+H]+; C27H42N7O12 (계산치 656.3).
실시예 3: 4-({2-[1-(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)-N-{2-[2-(2-{2-[(4-이소티오시아네이토페닐)포름아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}포름아미도]에틸}카르바모일)-2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (화합물 B)의 합성
Figure pct00067
단계 1: N-(2-{2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시}에틸)-4-니트로벤즈아미드 (중간체 2-A)의 합성
4-니트로벤조산 (2.00 g, 11.7 mmol)을 함유한 교반 막대가 구비된 500 mL 둥근 바닥 플라스크에 무수 DMF (40 mL) 및 무수 MeCN (20 mL), 및 이어서 DIPEA (4.00 mL, 22.7 mmol) 및 HBTU (4.99 g, 12.9 mmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 무수 DMF (6 mL) 중 아미노-PEG4-알콜 (2.54 g, 12.9 mmol)의 용액을 0.3 mL/분의 속도로 시린지 펌프에 의해 30분에 걸쳐 적가하였다. 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하고, 완결 시 반응물을 진공 하에 농축 건조시킨 다음, 잔류 DMF를 공기 스트림 하에 제거하여 갈색 유성 잔류물을 수득하였다. 이어서, 조 잔류물을 DCM (200 mL) 중에 용해시킨 다음, NaOH (1 M, 100 mL), HCl (1 M, 100 mL) 및 마지막으로 염수 (100 mL)로 연속적으로 세척하였다. 이어서, 유기 층을 황산나트륨으로 건조시키고, 경사분리하고, 진공 하에 농축시켰다. 이어서, 조 물질을 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하고, 다음 단계로 용리시켰다: EtOAc → 3% MeOH/97% DCM (v/v) → 5% MeOH/95% DCM (v/v) → 10% MeOH/90% DCM (v/v) → MeOH). 생성물은 10% MeOH/90% DCM (v/v) → MeOH의 용리 후반부에 용리되었다. 생성물 함유 분획을 진공 하에 농축시킨 후, 중간체 2-A (1.77 g, 32%, 71% 순도)를 갈색/오렌지색 오일로서 수득하였다.
단계 2: tert-부틸 N-[2-(N-{2-[2-(2-{2-[(4-니트로페닐)포름아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}2,4-디니트로벤젠술폰아미도)에틸]카르바메이트 (중간체 2-B)의 합성
둥근 바닥 플라스크에 N-(2-{2-[2-(2-히드록시에톡시)에톡시]에톡시}에틸)-4-니트로벤즈아미드 (중간체 2-A, 1.45 g, 3.02 mmol, 71% 순도), tert-부틸 N-[2-(2,4-디니트로벤젠술폰아미도)에틸]카르바메이트 (1.53 g, 3.93 mmol), 교반 막대, 무수 THF (52 mL)를 충전한 다음, 빙조에서 0℃에서 냉각시켰다. 이어서, 반응물을 교반하면서 DIAD (0.88 mL, 4.23 mmol)를 5분에 걸쳐 수동으로 적가하였다. 최종적으로, 트리페닐포스핀 (1.12 g, 4.23 mmol)을 대략 2분에 걸쳐 첨가하고, 반응물을 빙조로부터 제거하고, 실온에서 교반하였다. 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였고, 1시간 후에 완결되었다. 반응물을 진공 하에 농축시켜 후처리하여 오렌지색 오일을 수득하였다. 이어서, 조 물질을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하고, 다음 단계로 용리시켰다: 50% EtOAc/50% 헥산 (v/v) → EtOAc → 10% MeOH/90% DCM (v/v) 및 마지막으로 MeOH. 생성물은 10% MeOH/DCM (v/v) → MeOH 용리의 주요 불순물로서 트리페닐포스핀 옥시드와 공-용리되었다. 생성물 함유 분획을 진공 하에 농축시킨 후, 중간체 2-B (2.10 g, 67%, 69% 순도)를 오렌지색 오일로서 수득하였다.
단계 3: tert-부틸 N-{1-[(4-니트로페닐)포름아미도]-3,6,9-트리옥사-12-아자테트라데칸-14-일}카르바메이트 (중간체 2-C)
tert-부틸 N-[2-(N-{2-[2-(2-{2-[(4-니트로페닐)포름아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}2,4-디니트로벤젠술폰아미도)에틸]카르바메이트 (중간체 2-B, 2.10 g, 2.03 mmol, 69% 순도)를 DCM (40 mL) 중에 용해시킨 다음, n-프로필아민 (3.40 mL, 40.6 mmol)을 실온에서 천천히 첨가하였다. 반응물을 실온에서 10분 동안 교반하고, HPLC-MS에 의해 완결된 것으로 밝혀졌다. 반응물을 진공 하에 농축시켜 후처리한 다음, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 조 샘플을 실리카 겔 상에 건조 패킹하고, 다음 단계로 용리시켰고: EtOAc → 10% MeOH/90% DCM (v/v) → MeOH 중 DCM/MeOH/7 M NH3 (각각 70:10:1 비 대 50:10:1 비), 생성물은 구배의 후반부에 용리되었다. 생성물 함유 분획을 진공 하에 농축시킨 후, 중간체 2-C (618 mg, 60%, 96% 순도)를 연오렌지색 오일로서 수득하였다.
단계 4: tert-부틸 N-(2-{1-[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]-N-{2-[2-(2-{2-[(4-니트로페닐)포름아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}포름아미도}에틸)카르바메이트 (중간체 2-D)
무수 MeCN (2 mL) 중에 용해된 1-(벤질옥시)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-2-카르복실산 클로라이드 (문헌 [J. Med. Chem. 2014, 57, 4849-4860]) (196 mg, 0.74 mmol)에 DIPEA (261 μL, 1.49 mmol)를 첨가한 다음, tert-부틸 N-{1-[(4-니트로페닐)포름아미도]-3,6,9-트리옥사-12-아자테트라데칸-14-일}카르바메이트 (중간체 2-C, 250 mg, 0.50 mmol, 무수 MeCN 중 1.0 M 용액으로서)의 용액을 실온에서 첨가하였다. 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 4시간 후 반응의 진행이 80% 전환율에서 멈추어 HBTU (192 mg, 0.50 mmol)를 첨가하고, 반응물을 실온에서 추가로 1시간 동안 교반하여 반응이 완결되도록 하였다. 반응물을 진공 하에 농축시킴으로써 후처리한 다음, 실리카 겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 10% MeOH/DCM (v/v)으로 용리시켜 정제하여 중간체 2-D (406 mg, 99%, 86% 순도)를 오렌지색 오일로서 수득하였다.
단계 5: N-{2-[2-(2-{2-[N-(2-아미노에틸)-1-[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]포름아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}-4-니트로벤즈아미드 (중간체 2-E)의 합성
tert-부틸 N-(2-{1-[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]-N-{2-[2-(2-{2-[(4-니트로페닐)포름아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}포름아미도}에틸)카르바메이트 (중간체 2-D, 200 mg, 0.24 mmol) 및 교반 막대를 함유한 20 mL 섬광 바이알에 무수 DCM을 첨가한 다음, 빙조에서 0℃에서 교반하였다. 다음에, 트리플루오로아세트산 (370 μL, 4.83 mmol)을 첨가하고, 첨가 후 반응물을 실온에서 교반하고, 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 완결 시 반응물을 공기스트림 하에 농축시켜 후처리하였다. 이어서, 조 잔류물을 Et2O (3 x 7 mL)로 연화처리하여 중간체 2-E (129 mg, 74%)를 TFA 염으로서 연오렌지색 유성 잔류물로 수득하였다.
단계 6: tert-부틸-4-[(2-{1-[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]-N-{2-[2-(2-{2-[(4-니트로페닐)포름아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}포름아미도}에틸)카르바모일]-2-{4,7,10-트리스[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부타노에이트 (중간체 2-F)의 합성
무수 MeCN (500 μL) 중 DOTAGA(tBu)4 (70 mg, 0.10 mmol)의 용액에 HBTU (38 mg, 0.10 mmol)를 첨가하고, 실온에서 5분 동안 교반한 다음, DIPEA (57.6 μL, 0.33 mmol)와 함께 무수 MeCN (500 μL) 중에 용해시킨 N-{2-[2-(2-{2-[N-(2-아미노에틸)-1-[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]포름아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}-4-니트로벤즈아미드 (중간체 2-E, 64 mg, 89 μmol)의 TFA 염을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 교반하고, 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 완결 시 반응물을 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하여 중간체 2-F (122 mg, 86%)를 TFA 염으로서 투명한 필름으로 수득하였다.
단계 7: 4-({2-[1-(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)-N-{2-[2-(2-{2-[(4-니트로페닐)포름아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}포름아미도]에틸}카르바모일)-2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (중간체 2-G)의 합성
tert-부틸-4-[(2-{1-[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]-N-{2-[2-(2-{2-[(4-니트로페닐)포름아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}포름아미도}에틸)카르바모일]-2-{4,7,10-트리스[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부타노에이트 (중간체 2-F, 97.5 mg, 56.4 μmol) 및 교반 막대를 함유한 20 mL 섬광 바이알에 AcOH (3 mL), 및 이어서 HCl (3 mL, 12 M, 미량 금속 분석 등급)을 첨가하였다. 생성된 용액을 캡핑하고, 50℃ 오일 조에서 교반하고, 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 완결 시 반응물을 공기 스트림 하에 농축시킨 다음, 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하여 중간체 2-G (29.7 mg, 43%)를 TFA 염으로서 무색 필름으로 수득하였다.
단계 8: 4-{[2-(N-{2-[2-(2-{2-[(4-아미노페닐)포름아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}-1-(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)포름아미도)에틸]카르바모일}-2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (중간체 2-H)의 합성
교반 막대가 구비된 20 mL 섬광 바이알 내의 메탄올 (3.6 mL) 중 4-({2-[1-(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)-N-{2-[2-(2-{2-[(4-니트로페닐)포름아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}포름아미도]에틸}카르바모일)-2-[4,7,10 트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (중간체 2-G, 29.7 mg, 24.1 μmol)의 용액에 Pd(10%)/C (26.0 mg, 24.4 μmol) 및 마지막으로 포름산암모늄 (155 mg, 241 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 반응물을 실온에서 교반되도록 하고, 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 완결 시 반응물을 메탄올 (3 mL)로 희석하고, 0.2 μm 시린지 필터를 통해 여과하고, 진공 하에 농축시키고, 최종적으로 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하여 중간체 2-H (12.6 mg, 44%)를 TFA 염으로서 투명한 잔류물로 수득하였다.
단계 9: 4-({2-[1-(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)-N-{2-[2-(2-{2-[(4-이소티오시아네이토페닐)포름아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}포름아미도]에틸}카르바모일)-2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (화합물 B)의 합성
교반 막대가 구비된 80% MeCN/20% H2O (v/v) 0.72 mL 중 4-{[2-(N-{2-[2-(2-{2-[(4-아미노페닐)포름아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}-1-(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)포름아미도)에틸]카르바모일}-2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (중간체 2-H, 3.4 mg, 2.9 μmol)의 용액에 NEt3 (1.12 μL, 8.0 μmol)을 첨가한 다음; 용액을 빙조에 넣고, 마지막으로 디(2-피리딜) 티오노카르보네이트 (1.2 mg, 5.0 μmol)를 첨가하였다. 이어서, 용액을 0℃에서 교반되도록 하고, 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 완결 시 반응물을 정제용 C18 HPLC 칼럼 상에서 정제에 의해 후처리하고, 동결건조 후에 화합물 B (3.4 mg, 81%)를 TFA 염으로서 백색 고체로 수득하였다. 분취물을 용리 방법 2를 사용하여 HPLC-MS 용리에 의해 분석하였다; 체류 시간: 2.59분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z 991.9 [M+H]+; C43H62N9O16S (계산치 992.4).
실시예 4: 4-[(2-{N-[2-(2-{2-[2-(3-{2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시} 프로판아미도)에톡시]에톡시}에톡시)에틸]-1-(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)포름아미도}에틸)카르바모일]-2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (화합물 C)의 합성
Figure pct00068
단계 1: tert-부틸-4-({1-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-3,6,9-트리옥사-12-아자테트라데칸-14-일}카르바모일)-2-{4,7,10-트리스[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부타노에이트 (중간체 3-A)의 합성
교반 막대가 구비된 50 mL 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸-4-[(2-아미노에틸)카르바모일]-2-{4,7,10-트리스[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부타노에이트 (중간체 1-A) TFA 염 (253 mg, 0.26 mmol), tert-부틸 N-(2-{2-[2-(2-옥소에톡시)에톡시]에톡시}에틸)카르바메이트 (101 mg, 0.31 mmol, 25 mL 무수 THF 중 ~90% 순도)를 첨가하고, 최종적으로 소듐 트리아세톡시보로히드라이드 (132 mg, 0.60 mmol)를 1 부분으로 첨가하였다. 반응물을 벌룬 아웃렛(balloon outlet)으로 실온에서 교반하고, HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 반응물을 NaHCO3 (2 mL, 포화 수용액)의 첨가에 의해 후처리한 다음, 진공 하에 농축시켜 백색 고체를 수득하였다. 이어서, 조 물질을 DCM (25 mL) 및 H2O (25 mL)의 혼합물 중에 용해시키고, 분리 깔때기로 옮기고, 유기 층을 추출하였다. 수성 층을 추가의 DCM 25 mL로 추출한 다음, 유기 층을 합하고, 염수로 세척한 다음, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공 하에 농축시켰다. 이어서, 조 물질을 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하여 tert-부틸-4-({1-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-3,6,9-트리옥사-12-아자테트라데칸-14-일}카르바모일)-2-{4,7,10-트리스[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부타노에이트 (중간체 3-A) (67 mg, 21%)를 TFA 염으로서 연황색 잔류물로 수득하였다.
단계 2: tert-부틸-4-[(2-{1-[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]-N-{2-[2-(2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}포름아미도}에틸)카르바모일]-2-{4,7,10-트리스[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부타노에이트 (중간체 3-B)의 합성
무수 MeCN (2 mL) 중 1-(벤질옥시)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-2-카르복실산 (20.9 mg, 81 μmol)의 용액에 HBTU (31.7 mg, 81 μmol)를 첨가하고, 실온에서 5분 동안 교반한 다음, DIPEA (57 μL, 324 μmol)와 함께 무수 MeCN (1 mL) 중에 용해시킨 tert-부틸-4-({1-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]-3,6,9-트리옥사-12-아자테트라데칸-14-일}카르바모일)-2-{4,7,10-트리스[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부타노에이트 (중간체 3-A, 67.3 mg, 54 μmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 50℃ 오일 조에서 교반하고, 반응을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 완결 시 반응물을 진공 하에 농축시킨 다음, 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하여 중간체 3-B (48 mg, 48%, ~80% 순도)를 TFA 염으로서 투명한 필름으로 수득하였다.
단계 3: 4-({2-[N-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에틸)-1-(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)포름아미도]에틸}카르바모일)-2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (중간체 3-C)
tert-부틸-4-[(2-{1-[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]-N-{2-[2-(2-{2-[(tert-부톡시카르보닐)아미노]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}포름아미도}에틸)카르바모일]-2-{4,7,10-트리스[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부타노에이트 (중간체 3-B, 14.1 mg, 8.13 μmol, ~85% 순도)를 함유한 바이알에 교반 막대, 무수 1,4-디옥산 (1.5 mL), HCl (1.5 mL, 12 M, 미량 금속 등급)을 충전한 다음, 바이알을 캡핑하였다. 생성된 용액을 50℃ 오일 조에서 교반하고, 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 완결 시 반응물을 공기 스트림 하에 농축시킨 다음, 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하여 중간체 3-C (6.5 mg, 76%)를 TFA 염으로서 투명한 필름으로 수득하였다.
단계 4: 4-[(2-{N-[2-(2-{2-[2-(3-{2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시} 프로판아미도)에톡시]에톡시}에톡시)에틸]-1-(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)포름아미도}에틸)카르바모일]-2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (화합물 C)의 합성
교반 막대가 구비된 20 mL 바이알에 4-({2-[N-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에틸)-1-(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)포름아미도]에틸}카르바모일)-2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (중간체 3-C, 3.5 mg, 3.3 μmol, 트레이스 셀렉트(Trace Select) 등급 H2O 중 c = 2.0 mg/mL 용액) 3.5 mg을 첨가한 다음, DIPEA (14.4 μL, 83 μmol)를 첨가하였다. 마지막으로, 아지도-PEG3-NHS (3.5 mg, 9.9 μmmol)를 H2O (100 μL의 트레이스 셀렉트 등급 H2O) 중 새로 용해된 용액으로서 첨가한 다음, 반응 용액을 실온에서 교반하였다. 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하고, 완결 시 반응물을 진공 하에 농축에 의해 후처리한 다음, 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하여 화합물 C (3.2 mg, 75%)를 TFA 염으로서 투명한 필름으로 수득하였다. 분취물을 용리 방법 2를 사용하여 HPLC-MS 용리에 의해 분석하였다; 체류 시간: 1.80분, 2.28분 및 2.52분 (각각 75:9:16 비) 관찰 [M+H]+ 및/또는 [M+Na]+; MS (양성 ESI): 실측치 m/z 1060.1 [M+H]+; C44H74N11O19 (계산치 1060.5).
실시예 5: 4-(프로필카르바모일)-2-{4,7,10-트리스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부탄산 (화합물 D)의 합성
Figure pct00069
단계 1: 메틸 1-(벤질옥시)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-2-카르복실레이트 (중간체 4-A)의 합성
20 mL 섬광 바이알에 1-(벤질옥시)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-2-카르복실산 (200 mg, 815 μmol), 및 이어서 탄산칼륨 (225 mg, 1.63 mmol) 및 5 mL 무수 아세토니트릴 및 5 mL 무수 테트라히드로푸란을 충전하였다. 아이오도메탄 (110 uL, 1.77 mmol)을 첨가하고, 바이알을 밀봉하고, 40℃에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 추가 부분의 아이오도메탄 (55 uL 885 μmol)을 첨가하고, 반응을 추가로 24시간 동안 계속하였다. 이어서, 고체를 여과에 의해 제거하고, 여과물을 감압 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 4 mL 디클로로메탄 중에 용해시키고, 잔류 고체를 2nd 여과에 의해 제거하였다. 모액을 2 x 3 mL 아세토니트릴과 공증발시켜 메틸 1-(벤질옥시)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-2-카르복실레이트 (중간체 4-A)를 투명한 황색 오일 (214 mg, HPLC에 의한 98% 순도, 99% 수율)로서 수득하였다.
단계 2: 1-(벤질옥시)-6-(히드록시메틸)-1,2-디히드로피리딘-2-온 (중간체 4-B)의 합성
25 mL 둥근 바닥 플라스크에 1-(벤질옥시)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-2-카르복실산 메틸 에스테르 (중간체 4-A, 214 mg, 829 μmol), 및 이어서 NaBH4 (385 mg, 9.95 mmol) 및 8 mL 무수 테트라히드로푸란을 충전하였다. 이어서, 플라스크에 환류 응축기 및 질소 풍선을 부착하고, 환류 하에 16시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 0-5℃로 냉각시키고, 메탄올 5 mL를 천천히 첨가하여 켄칭하였다. 혼합물을 감압 하에 농축 건조시킨 다음, 디클로로메탄 및 물의 혼합물 중에 용해시켰다. 포화 염화암모늄 용액 2 mL를 첨가하고, 상들을 분리 깔때기로 분리하였다. 수성 상을 4 x 20 mL 디클로로메탄으로 추출하고, 유기부를 합하고, Na2SO4 (s) 상에서 건조시켰다. 고체를 여과에 의해 제거하고, 3 x 20 mL 디클로로메탄으로 세척하고, 여과물을 감압 하에 농축시켜 1-(벤질옥시)-6-(히드록시메틸)-1,2-디히드로피리딘-2-온 (중간체 4-B)을 왁스상 백색 고체 (144 mg, HPLC에 의한 85% 순도, 64% 수율)로서 수득하였다.
단계 3: 1-(벤질옥시)-6-(브로모메틸)피리딘-2-온 (중간체 4-C)의 합성
20 mL 섬광 바이알에 1-(벤질옥시)-6-(히드록시메틸)-1,2-디히드로피리딘-2-온 (중간체 4-B, 63 mg, 272 μmol), 및 이어서 테트라브로모메탄 (135 mg, 409 μmol) 및 무수 디클로로메탄 2 mL를 충전하였다. 이어서, 혼합물을 빙수조에서 냉각시켰다. 10분 동안 냉각시킨 후, 트리페닐포스핀 (110 mg, 409 μmol)을 고체로서 10분에 걸쳐 조금씩 첨가하였다. 추가 10분 후, 반응을 TLC에 의해 체크하고, 완결된 것으로 확인하였다. 반응물을 0.5 mL 포화 아황산나트륨 (Na2SO3) 용액으로 켄칭하고, 실온에서 30분 동안 교반되도록 하였다. 이어서, 반응물을 분리 깔때기로 옮기고, 디클로로메탄으로 추출하고, 유기부를 Na2SO4 (s) 상에서 건조시켰다. 고체를 여과에 의해 제거하고, 모액을 감압 하에 잔류물로 농축시켰다. 실리카 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피 (용리액: 에틸 아세테이트 중 30% 톨루엔)에 의해 정제하여 1-(벤질옥시)-6-(브로모메틸)피리딘-2-온 (중간체 4-C)을 투명한 점성 오일로서 수득하였으며, 이는 정치 시 백색 필름으로 응고되었다 (63 mg, 75%).
단계 4: 1-tert-부틸 5-메틸-2-(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일)펜탄디오에이트 (중간체 4-D)의 합성
5-벤질 1-tert-부틸-2-(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일)펜탄디오에이트 (문헌 [Org. Process Res. Dev. 2009, 13, 535-542]) (112 mg, 250 μmol)를 함유한 20 mL 섬광 바이알에 이염기성 인산칼륨 (4.5 mg, 25 μmol, 0.1 당량) 및 메탄올 4 mL를 충전하고, 반응 바이알을 75℃로 3.5시간 동안 가열하였다. 이어서, 추가 부분의 이염기성 인산칼륨을 첨가하고 (10 mg, 57 μmol, 0.2 당량), 반응물을 75℃에서 추가로 16시간 동안 유지하였다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 감압 하에 농축 건조시켰다. 생성된 잔류물을 1:1 물:아세토니트릴 1 mL 중에 용해시키고, 0.2 μm 필터를 통해 여과한 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하였다. 1-tert-부틸 5-메틸-2-(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일)펜탄디오에이트 (중간체 4-D)를 연황색 오일 (61 mg, TFA 염으로서 41% 수율)로서 수득하였다.
단계 5: 1-tert-부틸 5-메틸 2-[4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]펜탄디오에이트 (중간체 4-E)의 합성
20 mL 섬광 바이알에 1-(벤질옥시)-6-(브로모메틸)-1,2-디히드로피리딘-2-온 (중간체 4-C, 33 mg, 165 μmol), 1-tert-부틸 5-메틸 2-(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일)펜탄디오에이트 (중간체 4-D, 20 mg, 53.7 μmol) 및 탄산칼륨 (46.8 mg, 165 μmol), 및 이어서 2 mL 무수 아세토니트릴을 충전하였다. 바이알 헤드스페이스를 질소로 퍼징한 다음, 바이알을 캡핑하고, 오일 조에서 50℃에서 4시간 20분 동안 가열하였다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 잔류물로 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 4 mL로 연화처리한 다음, 여과하여 불용성 고체를 제거하였다. 여과물을 감압 하에 농축 건조시키고, 생성된 잔류물을 1:1 아세토니트릴:물 혼합물 2 mL 중에 용해시켰다. 이 용액을 0.2 μm 필터를 통해 여과한 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 1-tert-부틸 5-메틸 2-[4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]펜탄디오에이트 (중간체 4-E)를 작은 무색 입자 (28 mg, HPLC에 의해 결정 시 68% 순도, TFA 염으로서 29% 수율)로서 수득하였다. 중간체 4-E를 추가 정제 없이 이월하였다.
단계 6: 5-(tert-부톡시)-5-옥소-4-[4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]펜탄산 (중간체 4-F)의 합성
20 mL 섬광 바이알에 1-tert-부틸 5-메틸 2-[4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]펜탄디오에이트 (중간체 4-E, 28 mg, 18.8 μmol, HPLC에 의해 결정 시 68% 순도), 및 이어서 수산화리튬 (1.5 mg, 230 μmol), 이어서 물:테트라히드로푸란:메탄올의 1:1:1 혼합물 1.5 mL를 충전하고, 용액을 주위 온도에서 교반하였다. 1.5시간 후, 추가 부분의 수산화리튬 (4 mg, 167 μmol)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 추가로 5시간 동안 유지하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에 잔류물로 농축시킨 다음, 물 중 아세토니트릴:0.1% 트리플루오로아세트산의 1:1 혼합물 2 mL 중에 용해시켰다. 이 용액을 0.2 μm 필터에 통과시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 5-(tert-부톡시)-5-옥소-4-[4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]펜탄산 (중간체 4-F)을 투명한 무색 필름 (17 mg, HPLC에 의해 결정 시 91% 순도, TFA 염으로서 67% 수율)으로서 수득하였다. 중간체 4-F를 추가 정제 없이 후속 단계로 이월하였다.
단계 7: tert-부틸 4-(프로필카르바모일)-2-[4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부타노에이트 (중간체 4-G)의 합성
5-(tert-부톡시)-5-옥소-4-[4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]펜탄산 (중간체 4-F, 17 mg, 15.5 μmol)을 함유한 20 mL 섬광 바이알에 HBTU (7.1 mg, 18.6 μmol), 및 이어서 1 mL 무수 아세토니트릴 및 1 mL 무수 테트라히드로푸란을 첨가하였다. 이어서, 디이소프로필에틸아민 (13.5 uL, 77.5 μmol)을 첨가하고, 혼합물을 주위 온도에서 25분 동안 교반하였다. 이어서, 프로필아민 (2.55 uL, 31 μmol)을 첨가하고, 혼합물을 주위 온도에서 추가로 1시간 15분 동안 유지하였다. 이어서, 반응물을 감압 하에 잔류물로 농축시키고, 2 mL 1:1 아세토니트릴:물 중에 용해시키고, 0.2 μm 필터를 통해 여과하고, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하였다. tert-부틸 4-(프로필카르바모일)-2-[4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부타노에이트 (중간체 4-G)를 투명한 필름 (14.5 mg, HPLC에 의한 94% 순도, TFA 염으로서 70% 수율)으로서 수득하였다. 중간체 4-G를 추가 정제 없이 후속 단계에서 사용하였다.
단계 8: 4-(프로필카르바모일)-2-{4,7,10-트리스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부탄산 (화합물 D)의 합성
tert-부틸 4-(프로필카르바모일)-2-[4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부타노에이트 (중간체 4-G, 14.5 mg, 13.95 μmol) 및 교반 막대를 함유한 20 mL 섬광 바이알에 무수 1,4-디옥산 (0.5 mL) 및 HCl (12 M, 0.5 mL)을 첨가하였다. 생성된 용액을 캡핑하고, 오일 조에서 50℃에서 4시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 공기 스트림 하에 얇은 잔류물로 농축시켰다. 아세토니트릴 4 mL를 첨가하고, 혼합물을 감압 하에 잔류물로 농축시켰다. 이를 각각의 반복에 대해 3 mL 아세토니트릴로 추가로 3회 반복하였다. 생성된 잔류물을 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 1 mL 중에 용해시키고, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 4-(프로필카르바모일)-2-{4,7,10-트리스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부탄산 (화합물 D)을 투명한 무색 필름 (5.0 mg, TFA 염으로서 30% 수율, HPLC에 의해 결정 시 >80% 순도)으로서 수득하였다. 분취물을 HPLC 용리 방법 3에 의해 분석하였다; 체류 시간 = 3.6분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z = 713.0 [M+H]+; C34H49N8O9 (계산치 713.4).
실시예 6: [7-(카르복시메틸)-4,10-비스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트산 (화합물 E)의 합성
Figure pct00070
단계 1: tert-부틸 2-[4,10-비스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-7-[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세테이트 (중간체 5-A)의 합성
20 mL 섬광 바이알에 1-(벤질옥시)-6-(브로모메틸)-1,2-디히드로피리딘-2-온 (중간체 4-C, 12.2 mg, 41.5 μmol) tert-부틸 2-{7-[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}아세테이트 ([문헌 [Dalton Trans. 2016, 45, 4791-4801]) (8 mg, 20 μmol) 및 탄산칼륨 (13 mg, 41.5 μmol), 및 이어서 2 mL 무수 아세토니트릴을 충전하였다. 바이알 헤드스페이스를 질소로 퍼징한 다음, 밀봉하고, 오일 조에서 50℃에서 3.5시간 동안 가열하였다. 이어서, 불용성 고체를 여과에 의해 제거하고, 모액을 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 1 mL 1:1 아세토니트릴:물 중에 용해시키고, 0.2 μm 필터를 통해 여과하였다. 잔류물을 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 tert-부틸 2-[4,10-비스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-7-[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세테이트 (중간체 5-A)를 작은 무색 입자로서 수득하였으며, 이는 혼합물로서 생성물에 속하는 것이며, 이를 추가 정제 없이 후속 단계로 이월하였다 (20.5 mg, HPLC에 의해 결정 시 68% 순도, TFA 염으로서 66% 수율).
단계 2: [7-(카르복시메틸)-4,10-비스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트산 (화합물 E)의 합성
tert-부틸 2-[4,10-비스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-7-[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세테이트 (중간체 5-A, 19.4 μmol) 및 교반 막대를 함유한 20 mL 섬광 바이알에 무수 1,4-디옥산 (1 mL) 및 HCl (12 M, 1 mL)을 첨가하였다. 생성된 용액을 캡핑하고, 오일 조에서 50℃에서 7시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 압축 공기의 스트림 하에 농축시킨 다음, 감압 하에 2 mL 물과 공증발시켜 투명한 무색 잔류물을 제공하였다. 잔류물을 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 1 mL 중에 용해시키고, 용액을 0.2 μm 필터에 통과시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 [7-(카르복시메틸)-4,10-비스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트산 (화합물 E)을 투명한 무색 필름 (7.2 mg, HPLC에 의해 결정 시 93% 순도, TFA 염으로서 46% 수율)으로서 수득하였다. 분취물을 HPLC 용리 방법 3에 의해 분석하였다; 체류 시간 = 1.2분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z = 534.8 [M+H]+; C24H35N6O8 (계산치 535.3).
실시예 7: 1-히드록시-6-({4,7,10-트리스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}메틸)피리딘-2-온 (화합물 F)의 합성
Figure pct00071
단계 1: 1-(벤질옥시)-6-{[4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]메틸}피리딘-2-온 (중간체 6-A)의 합성
20 mL 섬광 바이알에 중간체 4-C (33 mg, 107 μmol), 시클렌 (4.7 mg, 27.3 μmol) 및 탄산칼륨 (31 mg, 224 μmol), 및 이어서 무수 아세토니트릴 2 mL를 충전하였다. 바이알 헤드스페이스를 질소로 퍼징한 다음, 밀봉하고, 오일 조에서 50℃에서 14시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 실온으로 냉각시킨 다음, 감압 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 1:1 아세토니트릴:물 혼합물 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 중간체 6-A를 담황색 점성 필름 (9.3 mg, HPLC에 의해 결정 시 98% 순도, TFA 염으로서 27% 수율)으로서 수득하였다.
단계 2: 1-히드록시-6-({4,7,10-트리스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}메틸)피리딘-2-온 (화합물 F)
중간체 6-A 및 교반 막대를 함유하는 20 mL 섬광 바이알에 무수 1,4-디옥산 0.5 mL 및 12 M 염산 0.5 mL를 첨가하였다. 반응 바이알을 캡핑하고, 50℃에서 1시간 40분 동안 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고, 공기 스트림 하에 농축시켰다. 잔류물을 추가로 감압 하에 아세토니트릴 4 mL와 공증발시켰다. 생성된 농축물을 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 화합물 F를 불투명한 무색 필름 (4.0 mg, HPLC에 의해 결정 시 85% 순도, TFA 염으로서 42% 수율)으로서 수득하였다. 분취물을 HPLC 용리 방법 3에 의해 분석하였다; 체류 시간 = 3.9분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z = 665.9 [M+H]+; C32H41N8O8 (계산치 665.3).
실시예 8: [4,7-비스(카르복시메틸)-10-[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트산 (화합물 G)의 합성
Figure pct00072
단계 1: 1-(벤질옥시)-6-(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일메틸)피리딘-2-온 (중간체 7-A)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 4-C (17 mg, 58 μmol), 시클렌 (20 mg, 117 μmol) 및 탄산칼륨 (35 mg, 255 μmol), 및 이어서 무수 아세토니트릴 3 mL를 충전하였다. 바이알 헤드스페이스를 질소로 퍼징한 다음, 밀봉하고, 오일 조에서 50℃에서 18시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 실온으로 냉각시킨 다음, 감압 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 (2 x 2 mL)으로 연화처리하고, 고체를 여과에 의해 제거하고, 모액을 잔류물로 농축시켰다. 혼합물을 물:아세토니트릴 혼합물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 2:1 1.5 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 중간체 7-A를 투명한 무색 필름 (28 mg, HPLC에 의해 결정 시 >98% 순도, TFA 염으로서 79% 수율)으로서 수득하였다.
단계 2: tert-부틸 2-(4-{[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸}-7,10-비스[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일)아세테이트 (중간체 7-B)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 7-A (28 mg, 46 μmol), tert-부틸 2-브로모아세테이트 (29.5 mg, 151 μmol) 및 탄산칼륨 (39 mg, 284 μmol), 및 이어서 무수 아세토니트릴 3 mL를 충전하였다. 바이알 헤드스페이스를 질소로 퍼징한 다음, 밀봉하고, 오일 조에서 50℃에서 14.5시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 실온으로 냉각시킨 다음, 감압 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 디클로로메탄 (2 x 2 mL)으로 연화처리하고, 고체를 여과에 의해 제거하고, 모액을 잔류물로 농축시켰다. 혼합물을 2:1의 아세토니트릴:물 혼합물 2 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 중간체 7-B를 투명한 무색 필름 (23 mg, HPLC에 의해 결정 시 >98% 순도, TFA 염으로서 51% 수율)으로서 수득하였다.
단계 3: [4,7-비스(카르복시메틸)-10-[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]아세트산 (화합물 G)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 7-B (23 mg, 32 μmol), 무수 1,4-디옥산 0.5 mL, 및 이어서 12 M 염산 0.5 mL를 충전하였다. 바이알 헤드스페이스를 질소로 퍼징한 다음, 밀봉하고, 오일 조에서 50℃에서 18시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 실온으로 냉각시킨 다음, 압축 공기의 스트림 하에 농축 건조시키고, 이어서 감압 하에 4 mL 트레이스 셀렉트 등급 물과 공증발시켜 투명한 무색 잔류물을 제공하였다. 잔류물을 트레이스 셀렉트 등급 물 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 화합물 G를 투명한 무색 필름 (8.8 mg, HPLC에 의해 결정 시 >93% 순도, TFA 염으로서 37% 수율)으로서 수득하였다. 분취물을 HPLC 용리 방법 1에 의해 분석하였다; 체류 시간 = 0.74분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z = 469.8 [M+H]+; C20H32N5O8 (계산치 470.2).
실시예 9: {4,10-비스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-7-(포스포노메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}메틸포스폰산 (화합물 H)의 합성
Figure pct00073
단계 1: 1,7-디-tert-부틸 4,10-비스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,7-디카르복실레이트 (중간체 8-A)
20 mL 섬광 바이알에 1,7-디-tert-부틸 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,7-디카르복실레이트 (250 mg, 604 μmol), 중간체 4-C (332 mg, 1.13 mmol) 및 탄산칼륨 (297 mg, 2.15 mmol), 및 이어서 무수 아세토니트릴 3 mL 및 분자체 0.5 g을 충전하였다. 바이알 헤드스페이스를 질소로 퍼징한 다음, 밀봉하고, 오일 조에서 50℃에서 19시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과에 의해 제거한 다음, 모액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 혼합물을 2:8의 물:아세토니트릴 혼합물 3 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 중간체 8-A를 투명한 담황색 중질 오일 (646 mg, HPLC에 의해 결정 시 >85% 순도, TFA 염으로서 91% 수율)로서 수득하였다.
단계 2: 1-(벤질옥시)-6-[(7-{[1-(벤질옥시)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-2-일]메틸}-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일)메틸]-1,2-디히드로피리딘-2-온 (중간체 8-B)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 8-A (646 mg, 630 μmol), 및 이어서 3 mL 디클로로메탄에 이어서 1 mL 트리플루오로아세트산을 충전하였다. 반응 용기를 캡핑하고, 20-25℃에서 6.5시간 동안 교반하면서 유지하였다. 이어서, 반응물을 압축 공기의 스트림 하에 농축시킨 다음, 감압 하에 2 x 4 mL 아세토니트릴과 공증발시켜 투명한 무색 점성 잔류물을 제공하였다. 잔류물을 3:1의 물:아세토니트릴 혼합물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 5 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 중간체 8-B를 투명한 담황색 중질 오일 (362 mg, HPLC에 의해 결정 시 >98% 순도, TFA 염으로서 70% 수율)로서 수득하였다.
단계 3: 디-tert-부틸 [4,10-비스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-7-{[비스(tert-부톡시)포스포릴]메틸}-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]메틸포스포네이트 (중간체 8-C)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 8-B (50 mg, 60.5 μmol), 및 이어서 [비스(tert-부톡시)포스포릴]메틸 트리플루오로메탄술포네이트 (40 mg, 133 μmol) 및 탄산칼륨 (26 mg, 181 μmol), 이어서 무수 아세토니트릴 2 mL를 충전하였다. 바이알 헤드스페이스를 질소로 퍼징한 다음, 밀봉하고, 오일 조에서 50℃에서 18시간 동안 가열하였다. [비스(tert-부톡시)포스포릴]메틸 트리플루오로메탄술포네이트의 추가 분취물 (15 mg, 50 μmol)을 첨가하고, 반응물을 50℃에서 추가로 72시간 동안 유지하였다. 이어서, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과에 의해 제거하고, 모액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 생성된 혼합물을 아세토니트릴 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 중간체 8-C를 각각 38:36:22의 비로 모노 및 디-포스폰산 가수분해 부산물을 갖는 혼합물로서 수득하였다. 투명한 무색 필름 21 mg (21 mg, 상기 기재된 바와 같은 혼합물, TFA 염으로서 25% 수율)을 단리하였다. 모든 성분이 목적 생성물에 대해 생산성이었기 때문에, 혼합물을 추가 정제 없이 사용하였다.
단계 4: {4,10-비스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-7-(포스포노메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}메틸포스폰산 (화합물 H)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 8-C (21 mg, 대략 15.3 μmol)의 혼합물, 및 이어서 각각 1.5 mL의 1,4 디옥산 중 4 M HCl 및 아세트산 중 4 M HCl을 충전하였다. 이어서, 바이알을 밀봉하고, 오일 조에서 50℃에서 19시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 실온으로 냉각시킨 다음, 압축 공기의 스트림 하에 농축 건조시키고, 이어서 감압 하에 3 mL 트레이스 셀렉트 등급 물과 공증발시켜 투명한 무색 잔류물을 제공하였다. 잔류물을 트레이스 셀렉트 등급 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 화합물 H를 불투명한 담황색 백악질 분말 (11.6 mg, HPLC에 의해 결정 시 >98% 순도, TFA 염으로서 91% 수율)로서 수득하였다. 분취물을 HPLC 용리 방법 1에 의해 분석하였다; 체류 시간 = 0.70분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z = 607.0 [M+H]+; C22H37N6O10P2 (계산치 607.2).
실시예 10: 1-히드록시-6-({4,8,11-트리스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1-일}메틸)피리딘-2-온 (화합물 I)의 합성
Figure pct00074
단계 1: 1-(벤질옥시)-6-{[4,8,11-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1-일]메틸}피리딘-2-온 (중간체 9-A)
20 mL 섬광 바이알에 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸 (시클람, 30 mg, 135 μmol), 중간체 4-C (198 mg, 674 μmol) 및 탄산칼륨 (112 mg, 809 mmol), 및 이어서 무수 아세토니트릴 2 mL 및 분자체 0.3 g을 충전하였다. 바이알 헤드스페이스를 질소로 퍼징한 다음, 밀봉하고, 오일 조에서 50℃에서 22.5시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과에 의해 제거한 다음, 모액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 혼합물을 2:3의 물:아세토니트릴 혼합물 2 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 중간체 9-A를 투명한 무색 점성 필름 (110 mg, HPLC에 의해 결정 시 >98% 순도, TFA 염으로서 64% 수율)으로서 수득하였다.
단계 2: 1-히드록시-6-({4,8,11-트리스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸-1-일}메틸)피리딘-2-온 (화합물 I)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 9-A (20 mg, 15.6 μmol), 및 이어서 1,4-디옥산 중 4 M 염산 1 mL를 충전하였다. 반응 용기를 캡핑하고, 50℃에서 2시간 동안 교반하면서 유지하였다. 이어서, 반응물을 압축 공기의 스트림 하에 농축시킨 다음, 감압 하에 2 x 4 mL 트레이스 셀렉트 등급 물과 공증발시켜 투명한 무색 필름을 제공하였다. 잔류물을 7:3의 물:아세토니트릴 혼합물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 화합물 I를 투명한 무색 필름 (6 mg, HPLC에 의해 결정된 바와 같은 98% 순도, TFA 염으로서 42% 수율)으로서 수득하였다. 분취물을 HPLC 용리 방법 2에 의해 분석하였다; 체류 시간 = 2.3분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z = 692.9 [M+H]+; C34H45N8O8 (계산치 693.3).
실시예 11: 1-히드록시-6-({4,7,10,13,16-펜타키스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10,13,16-헥사아자시클로옥타데칸-1-일}메틸)피리딘-2-온 (화합물 J)의 합성
Figure pct00075
단계 1: 1-(벤질옥시)-6-{[4,7,10,13,16-펜타키스({[1-(벤질옥시)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10,13,16-헥사아자시클로옥타데칸-1-일]메틸}-1,2-디히드로피리딘-2-온 (중간체 10-A)
20 mL 섬광 바이알에 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸 트리술페이트 (헥사시클렌 트리술페이트, 44 mg, 71.7 μmol), 중간체 4-C (147 mg, 502 μmol) 및 탄산칼륨 (119 mg, 860 μmol), 및 이어서 무수 아세토니트릴 2 mL 및 분자체 0.4 g을 충전하였다. 바이알 헤드스페이스를 질소로 퍼징한 다음, 밀봉하고, 오일 조에서 50℃에서 19시간 동안 가열하였다. 이 시점에, 포타슘 tert-부톡시드 (24 mg, 214 μmol) 뿐만 아니라 추가의 무수 아세토니트릴 2 mL를 첨가하고, 반응물을 50℃로 추가 76시간 동안 재가열하였다. 이어서, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과에 의해 제거하고, 모액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 혼합물을 2:8의 물:아세토니트릴 혼합물 1.5 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 중간체 10-A를 농후한 황색 필름 (47 mg, HPLC에 의해 결정 시 77% 순도, TFA 염으로서 30% 수율)으로서 수득하였다.
단계 2: 1-히드록시-6-({4,7,10,13,16-펜타키스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10,13,16-헥사아자시클로옥타데칸-1-일}메틸)피리딘-2-온 (화합물 J)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 10-A (47 mg, 77% 순도 (HPLC에 의해 결정됨), 21.3 μmol), 및 이어서 1,4-디옥산 중 4 M 염산 1 mL를 충전하였다. 반응 용기를 캡핑하고, 50℃에서 2시간 동안 교반하면서 유지하였다. 이어서, 반응물을 압축 공기의 스트림 하에 농축시킨 다음, 감압 하에 2 x 4 mL 트레이스 셀렉트 등급 물과 공증발시켜 투명한 무색 필름을 제공하였다. 잔류물을 7:3의 물:아세토니트릴 혼합물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 화합물 J를 투명한 무색 필름 (12 mg, HPLC에 의해 결정 시 97% 순도, TFA 염으로서 46% 수율)으로서 수득하였다. 분취물을 HPLC 용리 방법 2에 의해 분석하였다; 체류 시간 = 2.4분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z = 997.1 [M+H]+; C48H61N12O12 (계산치 997.5).
실시예 12: N-히드록시-2-(7-{[히드록시(메틸)카르바모일]메틸}-4,10-비스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일)-N-메틸아세트아미드 (화합물 K)의 합성
Figure pct00076
단계 1: 2-(7-{[벤질옥시(메틸)카르바모일]메틸}-4,10-비스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일)-N-(벤질옥시)-N-메틸아세트아미드 (중간체 11-A)
20 mL 섬광 바이알에 N-(벤질옥시)-2-브로모-N-메틸아세트아미드 (26 mg, 107 μmol), 중간체 8-B (42 mg, 50.8 μmol) 및 탄산칼륨 (28 mg, 203 μmol), 및 이어서 무수 아세토니트릴 3 mL 및 분자체 0.5 g을 충전하였다. 바이알 헤드스페이스를 질소로 퍼징한 다음, 밀봉하고, 오일 조에서 50℃에서 16시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과에 의해 제거하고, 모액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 생성된 잔류물을 3:7의 물:아세토니트릴 혼합물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 중간체 11-A를 투명한 무색 필름 (35 mg, HPLC에 의해 결정 시 98% 순도, TFA 염으로서 57% 수율)으로서 수득하였다.
단계 2: N-히드록시-2-(7-{[히드록시(메틸)카르바모일]메틸}-4,10-비스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일)-N-메틸아세트아미드 (화합물 K)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 11-A (8.5 mg, 7.2 μmol), 및 이어서 디클로로메탄 중 1 M 삼브로민화붕소 1 mL를 충전하였다. 반응 용기를 캡핑하고, 20-25℃에서 3.5시간 동안 교반하면서 유지하였다. 이어서, 반응물을 압축 공기의 스트림 하에 농축시킨 다음, 감압 하에 2 x 4 mL 트레이스 셀렉트 등급 물, 이어서 다시 2 x 4 mL 아세토니트릴과 공증발시켜 투명한 무색 필름을 제공하였다. 필름을 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 화합물 K를 백색 백악질 필름 (1 mg, HPLC에 의해 결정 시 >95% 순도, TFA 염으로서 17% 수율)으로서 수득하였다. 분취물을 HPLC 용리 방법 2에 의해 분석하였다; 체류 시간 = 2.2분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z = 593.1 [M+H]+; C26H41N8O8 (계산치 593.3).
실시예 13: 6-({3,9-비스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-3,6,9,15-테트라아자비시클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔-6-일}메틸)-1-히드록시피리딘-2-온 (화합물 L)의 합성
Figure pct00077
단계 1: 1-(벤질옥시)-6-{[3,9-비스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-3,6,9,15-테트라아자비시클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔-6-일]메틸}피리딘-2-온 (중간체 12-A)
20 mL 섬광 바이알에 3,6,9,15-테트라아자비시클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔 (30 mg, 145 μmol), 중간체 4-C (128 mg, 436 μmol) 및 탄산칼륨 (80 mg, 582 μmol)에 이어서 무수 아세토니트릴 3 mL 및 분자체 0.4 g을 충전하였다. 바이알 헤드스페이스를 질소로 퍼징한 다음, 밀봉하고, 오일 조에서 50℃에서 24시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과에 의해 제거하고, 모액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 생성된 잔류물을 1:1 물:아세토니트릴 혼합물 2 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 중간체 12-A를 TFA 염으로서 우수한 수율로 수득하였다.
단계 2: 6-({3,9-비스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-3,6,9,15-테트라아자비시클로[9.3.1]펜타데카-1(15),11,13-트리엔-6-일}메틸)-1-히드록시피리딘-2-온 (화합물 L)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 12-A, 1,4-디옥산 중 4 M HCl을 충전하였다. 반응 용기를 캡핑하고, HPLC 분석에 의해 반응이 완결된 것으로 결정될 때까지 20-25℃에서 교반하였다. 이어서, 반응물을 압축 공기의 스트림 하에 농축시키고, 감압 하에 2 x 4 mL 아세토니트릴과 공증발시켰다. 잔류물을 1:1의 물:아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 화합물 L을 TFA 염으로서 우수한 수율로 수득하였다.
실시예 14: (2R)-4-({2-[1-(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)-N-{2-[2-(2-{2-[3-(2-{2-[3-옥소-3-(2,3,5,6-테트라플루오로페녹시)프로폭시]에톡시}에톡시)프로판아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}포름아미도]에틸}카르바모일)-2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (화합물 M) 및 (2R)-4-{[2-(N-{2-[2-(2-{2-[3-(2-{2-[3-(2,6-디클로로페녹시)-3-옥소프로폭시]에톡시}에톡시)프로판아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}-1-(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)포름아미도)에틸]카르바모일}-2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (화합물 N)의 합성
Figure pct00078
단계 1: 2,3,5,6-테트라플루오로페닐 3-(2-{2-[3-옥소-3-(2,3,5,6-테트라플루오로페녹시)프로폭시]에톡시}에톡시)프로파노에이트 (중간체 13-A)의 합성
3-{2-[2-(2-카르복시에톡시)에톡시]에톡시}프로판산 (비스-PEG3-산, 51 mg, 0.20 mmol) 및 교반 막대를 함유한 20 mL 섬광 바이알에 2,3,5,6-테트라플루오로페놀의 용액 (무수 1,4-디옥산 1 mL 중 76 mg, 0.43 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 반응물을 빙조에 넣어 교반하고, ~5분 후에 더 이상 완전히 용해되지 않음을 인지하였다. 마지막으로, 무수 1,4-디옥산 (0.5 mL) 중 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC, 90 mg, 0.43 mmol)를 1 부분으로 첨가한 다음, 혼합물을 빙조로부터 제거하여 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 HPLC-MS에 의해 모니터링하고, MeCN (2 mL)으로 희석하고, 소결 필터를 통해 여과하여 후처리하였다. 이어서, 여과된 고체를 추가의 MeCN (~5 mL)으로 세척하고, 합한 여과물을 진공 하에 농축시키고, 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하여 중간체 13-A (100 mg, 90%, 96% 순도)를 투명한 오일로서 수득하였다.
단계 2: 2,6-디클로로페닐 3-(2-{2-[3-(2,6-디클로로페녹시)-3-옥소프로폭시]에톡시}에톡시)프로파노에이트 (중간체 14-A)의 합성
무수 1,4-디옥산 3 mL 중 3-{2-[2-(2-카르복시에톡시)에톡시]에톡시}프로판산 (비스-PEG3-산, 250 mg, 0.98 mmol)을 함유하는 20 mL 섬광 바이알에 교반 막대 및 2,6-디클로로페놀 (365 mg, 2.15 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 투명한 용액을 빙조에 두고, 5분 동안 교반하였다. 마지막으로, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 (DCC, 449 mg, 2.15 mmol)를 무수 1,4-디옥산 3 mL 중에 1 부분으로 첨가한 다음, 반응물을 빙조로부터 제거하여 실온에서 6.5시간 동안 밤새 교반하고, 그 시간 동안 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 무수 DMF 1 mL를 계속 첨가하고, 이는 반응 내용물을 완전히 가용화시키지 않았으며, 다음으로 HBTU (557 mg, 1.42 mmol) 및 DIPEA (0.75 mL, 4.31 mmol)를 첨가하고, 실온에서 65시간 동안 교반하였다. 반응을 HPLC-MS에 의해 모니터링한 다음, 진공 하에 농축에 의해 후처리하여 갈색 오일을 수득하였다. 잔류하는 잔류 DMF를 공기스트림 하에 농축시켜 농후한 갈색 오일을 수득하였다. 반응물을 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하여 중간체 14-A (319 mg, 60%)를 연황색 오일로서 수득하였다. 1H NMR (600 MHz, CDCl3) = δ7.33 (d, J = 8.1 Hz, 2 H), 7.11 (t, J = 8.1 Hz, 2 H), 3.90 (t, J = 9.0 Hz, 4 H), 3.68-3.62 (m, 8 H), 2.95 (t, J = 6.0 Hz, 4 H).
단계 3: (2R)-4-({2-[N-(2-{2-[2-(2-아미노에톡시)에톡시]에톡시}에틸)-1-(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)포름아미도]에틸}카르바모일)-2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (중간체 15-A)의 합성
중간체 3-B (34 mg, 16 μmol, 70% 순도)를 함유한 섬광 바이알에 교반 막대 및 디옥산 중 무수 HCl (4 M) 2 mL를 충전하였다. 반응물을 50℃ 오일 조에서 4시간 동안 교반하고, HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 이어서, 반응물을 정제용 C18 HPLC 칼럼 상에서 정제하여 중간체 15-A (19 mg, 정량적)를 TFA 염으로서 투명한 필름으로 수득하였다.
단계 4: (2R)-4-({2-[1-(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)-N-{2-[2-(2-{2-[3-(2-{2-[3-옥소-3-(2,3,5,6 테트라플루오로페녹시)프로폭시]에톡시}에톡시)프로판아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}포름아미도]에틸}카르바모일)-2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (화합물 M)의 합성
중간체 15-A (3 mg, 3 μmol)를 함유한 섬광 바이알에 H2O 트레이스 셀렉트 등급 (500 μL), DIPEA (5 μL, 28 μmol) 및 최종적으로 중간체 13-A (500 μL의 MeCN 중 5 mg, 8 μmol)를 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 10분 동안 교반한 다음, 빙조에서 냉각시키고, TFA (5 μL)를 첨가하여 켄칭하였다. 이어서, 반응물을 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하고, 동결건조 후에 화합물 M (4.2 mg, 90%, 93% 순도)을 백색 고체로서 수득하였다. 분취물을 용리 방법 2를 사용하여 HPLC-MS 용리에 의해 분석하였다; 체류 시간: 2.91분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z 1211.1 [M+H]+; C51H75F4N8O21 (계산치 1211.5).
단계 5: (2R)-4-{[2-(N-{2-[2-(2-{2-[3-(2-{2-[3-(2,6-디클로로페녹시)-3-옥소프로폭시]에톡시}에톡시)프로판아미도]에톡시}에톡시)에톡시]에틸}-1-(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)포름아미도)에틸]카르바모일}-2-[4,7,10-트리스(카르복시메틸)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부탄산 (화합물 N)의 합성
중간체 15-A (3 mg, 3 μmol)를 함유한 섬광 바이알에 H2O 트레이스 셀렉트 등급 (500 μL), DIPEA (2.5 μL, 14 μmol) 및 마지막으로 중간체 14-A (500 μL의 MeCN 중 2 mg, 4 μmol)를 첨가하였다. 반응물을 실온에서 40분 동안 교반하고, 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 이어서, 반응물을 50℃ 오일 조에서 1시간 동안 교반한 다음, 추가의 DIPEA (10 μL)를 첨가하고, 이어서 50℃에서 추가로 1시간 교반하였다. 반응물을 진공 하에 농축시키고, 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하고, 동결건조 후에 화합물 N (3.2 mg, 70%, 90% 순도)을 회백색/연황색 고체로서 수득하였다. 분취물을 용리 방법 2를 사용하여 HPLC-MS 용리에 의해 분석하였다; 체류 시간: 2.97분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z 1207.4 [M+H]+; C51H77Cl2N8O21 (계산치 1207.5).
실시예 15: (2S)-2-[7-(카르복시메틸)-4,10-비스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]-5-(2,6-디클로로페녹시)-5-옥소펜탄산 (화합물 O)의 합성
Figure pct00079
단계 1: 1,7-디벤질 4-[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,7-디카르복실레이트 (중간체 16-A)의 합성
MeCN (58 mL) 중 1,7-디벤질 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,7-디카르복실레이트 디히드로클로라이드 (6.00 g, 11.7 mmol)의 용액에 DIPEA (8.14 mL, 46.7 mmol) 및 tert-부틸 브로모아세테이트 (1.73 mL, 11.7 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 60℃ 오일 조에서 2시간 동안 교반하고, 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 반응물을 진공 하에 농축시키고, 이어서 Et2O (100 mL) 및 KH2PO4 (100 mL, 1 M)를 첨가하여 후처리하였다. 생성된 혼합물을 실온에서 ~5분 동안 교반하여 모든 내용물을 용해시키려고 하고 (일부 유성 연오렌지색 물질은 용해되지 않음), 분리 깔때기로 옮겼다. 에테르 층을 추출하고, 이는 소량의 목적하는 모노알킬화 생성물과 함께 >80% 순도의 디알킬화 부산물을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이어서, DCM (100 mL)을 사용하여 반응 용기에서 나머지 유성 잔류물을 헹구고 용해시키고, 상기로부터 수성 층으로 옮겼다. 이어서, DCM 층을 분배하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켜 연황색 유성 잔류물을 수득하였다. 조 물질을 추가로 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하고, 다음 단계로 용리시켰다: 각각 1% MeOH/1% NEt3/98% DCM (v/v/v) → 2% MeOH/1% NEt3/97% DCM (v/v/v)으로 용리. 생성물 함유 분획을 진공 하에 농축시킨 후, 중간체 16-A (1.53 g, 18%, 76% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다.
단계 2: 1,7-디벤질 4-[(2S)-5-(벤질옥시)-1-(tert-부톡시)-1,5-디옥소펜탄-2-일]-10-[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,7-디카르복실레이트 (중간체 16-B)의 합성
교반 막대가 구비된 20 mL 섬광 바이알에 중간체 16-A (250 mg, 0.34 mmol), K2CO3 (95 mg, 0.69 mmol) 및 무수 아세토니트릴 (2 mL)을 로딩하였다. 최종적으로, 5-벤질 1-tert-부틸 (2R)-2-(메탄술포닐옥시)펜탄디오에이트 (191 mg, 0.51 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 80℃ 오일 조에 두어 교반하였다. 6시간 후, 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하고, 단지 ~24% 전환율인 것으로 밝혀졌으므로, 무수 DMF (1 mL)를 첨가하고, 반응물을 80℃ 오일 조에서 추가로 65시간 동안 교반하였다. 반응물을 소결 필터 상에서 여과에 의해 후처리하고, 고체를 MeCN으로 세척하였다. 합한 여과물을 진공 하에 농축시켜 담오렌지색 오일을 수득하고, 정제용 C18 HPLC 칼럼 상에서 정제하여 중간체 16-B (181 mg, 57%, 90% 순도)를 투명한 필름으로서 수득하였다.
단계 3: (4S)-5-(tert-부톡시)-4-{7-[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}-5-옥소펜탄산 (중간체 16-C)의 합성
중간체 16-B (181 mg, 0.15 mmol) 및 교반 막대를 함유한 20 mL 섬광 바이알에 MeOH (3 mL), 및 이어서 5% Pd/C (18 mg, 중간체 16-B를 기준으로 10 중량%)를 첨가하였다. 이어서, 바이알을 고무 마개로 밀봉한 다음, 플라스크를 격렬히 교반하면서 진공 하에 1분 동안 배기시킨 다음, 1분 동안 교반하면서 H2 풍선 (1 atm)으로 재충전하였다. 이러한 배기 및 이어서 충전의 주기를 총 3X 동안 반복한 다음, H2 풍선을 플라스크 상에 두고, 반응물을 실온에서 16시간 동안 계속 교반되도록 하였다. 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링한 다음, 메탄올 (~3 mL)로 희석함으로써 후처리하고, 이어서 0.2 um GHP 시린지 필터를 통해 여과하였다. 필터를 추가의 MeOH (2 x 1 mL)로 헹군 다음, 합한 여과물을 진공 하에 농축시켜 투명한 필름 (134 mg)을 수득하였다. 이어서, 조 물질을 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하여 중간체 16-C (105 mg, 98%)를 투명한 필름으로서 수득하였다.
단계 4: 1-tert-부틸 5-메틸 (2S)-2-{7-[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}펜탄디오에이트 (중간체 16-D)의 합성
-5℃ 조 (NaCl/얼음) 내의 2 mL 무수 MeOH 및 교반 막대를 함유한 20 mL 섬광 바이알에 SOCl2 (72 μL, 0.99 mmol)를 ~30초에 걸쳐 적가하였다. 마지막으로, 무수 MeOH (1 mL) 중 중간체 16-C (105 mg, 0.15 mmol)의 용액을 ~30초에 걸쳐 첨가하고, 생성된 용액을 -5℃ 조에서 ~0℃로 1시간에 걸쳐 계속 교반하였다. 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하고, 진공 하에 농축에 의해 후처리하여 중간체 16-D (81 mg, 정량적, 97% 순도)를 HCl 염으로서 백색 고체로 수득하였다.
단계 5: 1-tert-부틸 5-메틸 (2S)-2-[4,10-비스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-7-[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]펜탄디오에이트 (중간체 16-E)의 합성
중간체 16-D (40 mg, 77 μmol), 중간체 4-C (70 mg, 0.23 mmol) 및 교반 막대를 함유한 20 mL 섬광 바이알에 K2CO3 (31 mg, 0.23 mmol), 및 무수 MeCN (1 mL)을 첨가하였다. 생성된 용액을 50℃ 오일 조에서 65시간 동안 교반한 다음, 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 반응은 ~25% 디알킬화 생성물로 전환된 것으로 밝혀졌고, 이에 따라 무수 DMF (1 mL)를 첨가하도록 진행한 다음, 반응물을 오일 조에서 80℃에서 4.5시간 동안 교반하였다. 반응을 HPLC-MS에 의해 체크하고, 프릿 필터를 통한 여과에 의해 후처리하였다. 이어서, 여과된 고체를 추가의 MeCN (~5 mL)으로 세척하고, 합한 여과물을 진공 하에 농축시켜 투명한 필름을 수득하였다. 이어서, 조 물질을 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하여 중간체 16-E (30 mg, 33%, 94% 순도)를 백색 필름으로서 수득하였다.
단계 6: (4S)-4-[4,10-비스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-7-[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]-5-(tert-부톡시)-5-옥소펜탄산 (중간체 16-F)의 합성
20 mL 섬광 바이알에 중간체 16-E (30 mg, 26 μmol), 및 이어서 교반 막대, THF (0.7 mL), 메탄올 (0.7 mL) 및 새로 제조된 수산화리튬 용액 (700 μL의 H2O 중 3 mg)을 충전하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 반응물을 진공 하에 농축시킴으로써 후처리하고, 정제용 C18 HPLC 칼럼 상에서 정제하여 중간체 16-F (7.7 mg, 28%)를 TFA 염으로서 투명한 필름으로 수득하였다.
단계 7: 1-tert-부틸 2,6-디클로로페닐 (2S)-2-[4,10-비스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-7-[2-(tert-부톡시)-2-옥소에틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]펜탄디오에이트 (중간체 16-G)의 합성
중간체 16-F (3.8 mg, 3.4 μmol) 및 교반 막대를 함유한 20 mL 섬광 바이알에 무수 MeCN (500 μL), HBTU (2.0 mg, 5.0 μmol; 2.0 mg/250 μL 무수 MeCN에 첨가) 및 NEt3 (4.7 μL, 34 μmol)을 첨가하였다. 생성된 용액을 실온에서 10분 동안 교반한 다음, MeCN (100 μL) 중 2,6-디클로로페놀 (4 mg, 17 μmol)의 용액을 첨가하고, 생성된 용액을 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하고, 진공 하에 농축시켜 후처리하였다. 반응물을 정제용 C18 HPLC 칼럼 상에서 정제하여 중간체 16-G (4.8 mg, 정량적)를 TFA 염으로서 투명한 필름으로 수득하였다.
단계 8: (2S)-2-[7-(카르복시메틸)-4,10-비스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]-5-(2,6-디클로로페녹시)-5-옥소펜탄산 (화합물 O)의 합성
중간체 16-G (2.4 mg, 1.9 μmol)를 함유한 1 드램 바이알에 교반 막대 및 디옥산 중 무수 HCl (4 M) 500 μL를 첨가하였다. 반응물을 50℃ 오일 조에서 2시간 동안 교반하고, 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 분취물을 용리 방법 2를 사용하여 HPLC-MS 용리에 의해 분석하였다; 체류 시간: 2.41분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z 750.9 [M+H]+ 및 m/z 773.5 [M+Na]+; 각각 C33H41Cl2N6O10 (계산치 751.2) 및 C33H40Cl2N6O10Na (계산치 773.2). 이어서, 반응물을 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하여 화합물 O (1.0 mg, 46%, 85% 순도)를 백색 고체로서 수득한 후, 진공 하에 농축시켰다. 분취물을 용리 방법 2를 사용하여 HPLC-MS 용리에 의해 분석하였다; 체류 시간: 2.39분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z 774.6 [M+Na]+ 및 m/z 803.6 [M-2H+Fe]+; 각각 C33H40Cl2N6O10Na (계산치 773.2) 및 C33H38Cl2FeN6O10 (계산치 804.1).
실시예 16: 2,6-디클로로페닐 3-[2-(2-{2-[(2-{[4-({1,4,7,10-테트라키스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일}메틸)페닐]카르바모일}에틸)카르바모일]에톡시}에톡시)에톡시]프로파노에이트 (화합물 P) 및 2,6-디클로로페닐 1-[(2-{[4-({1,4,7,10-테트라키스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일}메틸)페닐]카르바모일}에틸)카르바모일]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-오에이트 (화합물 Q)의 합성
Figure pct00080
단계 1: 비스(2,6-디클로로페닐) 4,7,10,13,16,19,22,25,28,31,34,37-도데카옥사테트라콘탄디오에이트 (중간체 17-A)의 합성
비스-PEG12-산 (250 mg, 0.38 mmol) 및 교반 막대를 함유한 20 mL 섬광 바이알에 2,6-디클로로페놀의 용액 (무수 1,4-디옥산 3 mL 중 192 mg, 1.14 mmol)을 첨가하였다. 이어서, 투명한 용액을 실온에서 교반하고, DIPEA (397 μL, 2.27 mmol)를 첨가하였다. 이어서, 용액을 5분 동안 교반하고, 최종적으로 HBTU (435 mg, 1.11 mmol)를 1 부분으로 첨가한 다음, 혼합물을 실온에서 3.5시간 동안 교반하고, HPLC-MS에 의해 완결된 것으로 밝혀졌다. 반응물을 진공 하에 농축시킴으로써 후처리하여 투명한 잔류물을 수득하고, 정제용 페닐 HPLC 칼럼 상에서 정제하여 중간체 17-A (234 mg, 65%)를 무색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00081
단계 2: 1-(벤질옥시)-6-{[4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-6-[(4-니트로페닐)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]메틸}피리딘-2-온 (중간체 18-A)의 합성
중간체 4-C (112 mg, 0.382 mmol), 2-[(4-니트로페닐)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸 (25 mg, 0.076 mmol) 및 교반 막대를 함유한 20 mL 섬광 바이알에 K2CO3 (63 mg, 0.459 mmol) 및 무수 MeCN (3 mL)을 첨가하였다. 생성된 용액을 75℃ 오일 조에서 65시간 동안 교반하였다. 반응물을 HPLC-MS에 의해 모니터링하고, 소결 필터를 통한 여과에 의해 후처리하였다. 여과된 고체를 MeCN으로 세척한 다음, 여과물을 진공 하에 농축시키고, 정제용 C18 HPLC 칼럼 상에서 정제하여 중간체 18-A (120 mg, 정량적)를 TFA 염으로서 연황색 필름으로 수득하였다.
단계 3: 6-({6-[(4-아미노페닐)메틸]-4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}메틸)-1-(벤질옥시)피리딘-2-온 (중간체 18-B)의 합성
물 (150 μL) 중 잘 진탕된 Ra-Ni 2800 슬러리를 HPLC 등급 물 4 mL를 함유한 20 mL 섬광 바이알로 옮겼다. 혼합물을 와류시키고, 침강되도록 한 다음, 물을 경사분리하고 (상단에 얇은 층이 남음), 이어서 추가의 4 mL 물을 사용하여 이 세척 과정을 반복하였다. 경사분리 시, 2 x 4 mL MeOH 세척에 이어서 경사분리 순서를 수행하였다. 마지막으로, 1:1 THF/MeOH 1 mL를 교반 막대와 함께 첨가하였다. 이어서, 중간체 18-A (20 mg, 0.014 mmol)를 0.5 mL (THF/MeOH, 1:1) 중의 용액으로서 첨가한 다음, 현탁액을 3 X (~30초 동안 진공에 이어서 ~30초 동안 H2 분위기/풍선 압력) 순환시키고, 풍선을 반응물 상에 두고, 이를 실온에서 2.5시간 동안 교반되도록 하였다. 반응을 HPLC-MS에 의해 모니터링하고, 0.2 μm 시린지 필터를 통해 여과함으로써 후처리하였다. 반응 바이알을 추가의 2 mL MeOH로 세척하고, 또한 시린지 필터를 통해 여과하였다. 이어서, 합한 여과물을 진공 하에 농축시켜 중간체 18-B (19.4 mg, 94%)를 연황색 필름으로서 수득하였다.
단계 4: tert-부틸 N-{2-[(4-{[1,4,7,10-테트라키스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일]메틸}페닐)카르바모일]에틸}카르바메이트 (중간체 18-C)의 합성
중간체 18-B (131 mg, 0.077 mmol)를 함유한 20 mL 섬광 바이알에 무수 DMF (5 mL) 및 교반 막대를 첨가하였다. 다음에, DIPEA (161 μL, 0.93 mmol)를 1 부분으로 첨가하고, 이어서 DMAP (9.5 mg, 0.077 mmol)를 첨가하였다. 용기를 N2로 퍼징한 다음, 반응물을 실온에서 5분 동안 교반하였다. 무수 DMF (0.5 mL) 중 Boc-베타-Ala-OSu (135 mg, 0.463 mmol)의 새로 용해된 용액을 N2 분위기 하에 첨가한 다음, 반응물을 50℃ 오일 조에서 교반하였다. 45분 후, 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하고, 주로 출발 물질을 ~10% 생성물 형성과 함께 관찰하여 DMAP (20 mg, 0.164 mmol) 및 추가의 Boc-베타-Ala-OSu (135 mg, 0.463 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 50℃에서 추가로 18시간 동안 교반하였다. 반응물을 진공 하에 농축시킴으로써 후처리하고, 정제용 C18 HPLC 칼럼 상에서 정제하여 중간체 18-C (45 mg, 29%, 76% 순도)를 TFA 염으로서 투명한 필름으로 수득하였다.
단계 5: 3-아미노-N-(4-{[1,4,7,10-테트라키스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일]메틸}페닐)프로펜아미드 (중간체 18-D)의 합성
중간체 18-C (14.5 mg, 0.0090 mmol)를 함유한 20 mL 바이알에 교반 막대 및 무수 DCM (1 mL)을 첨가하고, 빙조에서 냉각시킨 다음, 트리플루오로아세트산 (2 mL)을 첨가하고, 반응물을 실온에서 30분 동안 교반하고, 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 반응물을 흄 후드에서 질소 스트림 하에 농축시킴으로써 후처리한 다음, 진공 하에 추가로 건조시켜 중간체 18-D (22 mg, 정량적)를 TFA 염으로서 투명한 필름으로 수득하였다. 이 물질을 추가 정제 없이 후속 단계에서 사용하였다.
단계 6: 3-아미노-N-[4-({1,4,7,10-테트라키스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일}메틸)페닐]프로펜아미드 (중간체 18-E)의 합성
중간체 18-D (10 mg, 0.0067 mmol)를 함유한 20 mL 섬광 바이알에 교반 막대 및 디옥산 중 HCl (4 M) 2 mL를 첨가하였다. 반응물을 50℃ 오일 조에서 1.5시간 동안 교반하고, 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 이어서, 반응물을 질소 스트림 하에 농축시킴으로써 후처리한 다음, 진공 하에 추가로 건조시켜 중간체 18-E (10 mg, 정량적)를 연황색 고체로서 수득하였다. 이 물질을 추가 정제 없이 후속 단계에서 사용하였다.
단계 7: 2,6-디클로로페닐 3-[2-(2-{2-[(2-{[4-({1,4,7,10-테트라키스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일}메틸)페닐]카르바모일}에틸)카르바모일]에톡시}에톡시)에톡시]프로파노에이트 (화합물 P)의 합성
ACN/H2O 트레이스 셀렉트 등급 (1:1 v/v, 800 μL, ~8 mg, 0.0053 mmol) 중 중간체 18-E를 함유한 20 mL 바이알에 교반 막대, 및 이어서 DIPEA (46 μL, 0.26 mmol), 및 이어서 마지막으로 MeCN (400 μL) 중 중간체 14-A (15 mg, 0.027 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 반응물을 빙조에서 냉각시킨 다음, TFA 50 μL를 ~30초에 걸쳐 첨가하고, 이어서 진공 하에 농축 건조시켜 후처리하였다. 이어서, 조 물질을 정제용 C18 HPLC 칼럼 상에서 정제하고, 동결건조 후에 화합물 P (0.7 mg, 7%, ≥81% 순도)를 TFA 염으로서 백색 고체로 수득하였다. 분취물을 용리 방법 2를 사용하여 HPLC-MS 용리에 의해 분석하였다; 체류 시간: 3.07분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z 1217.37 [M+H]+; C58H71Cl2N10O15 (계산치 1217.45).
단계 8: 2,6-디클로로페닐 1-[(2-{[4-({1,4,7,10-테트라키스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일}메틸)페닐]카르바모일}에틸)카르바모일]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-오에이트 (화합물 Q)의 합성
ACN/H2O 트레이스 셀렉트 등급 (1:1 v/v, 900 μL/~1 mg) 중 중간체 18-E (~9.0 mg, 0.0080 mmol)를 함유한 20 mL 섬광 바이알에 교반 막대, 및 이어서 DIPEA (70 μL, 0.040 mmol), 및 이어서 마지막으로 MeCN (374 μL) 중 중간체 17-A (37 mg, 0.040 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온에서 40분 동안 교반한 다음, HPLC-MS에 의해 모니터링하였다. 반응물을 빙조에서 냉각시킨 다음, TFA 90 μL를 첨가하고, 이어서 진공 하에 농축 건조시켜 후처리하였다. 이어서, 조 물질을 정제용 C18 HPLC 칼럼 상에서 정제하여 동결건조 후에 화합물 Q (1.2 mg, 6%, ≥68% 순도)를 TFA 염으로서 백색 고체로 수득하였다. 분취물을 용리 방법 2를 사용하여 HPLC-MS 용리에 의해 분석하였다; 체류 시간: 3.43분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z 1635.79 [M+Na]+; C76H106Cl2N10NaO24 (계산치 1635.67).
실시예 17: 1-히드록시-6-({4,7,10-트리스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-6-[(4-이소티오시아네이토페닐)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}메틸)피리딘-2-온 (화합물 R)의 합성
Figure pct00082
단계 1: 6-({6-[(4-아미노페닐)메틸]-4,7,10-트리스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}메틸)-1-히드록시피리딘-2-온 (중간체 19-A)의 합성
무수 MeOH (1.89 mL) 중 중간체 18-A의 용액에 Pd(10%)/C (39 mg, 37 μmol), 및 이어서 포름산암모늄 (71 mg, 1131 μmol)을 첨가하고, 현탁액을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링한 다음, MeOH (~4 mL)로 희석하고, 0.2 μm 시린지 필터 (GHP 막)를 통해 여과하여 후처리하였다. 반응 용기를 MeOH (1 mL)로 헹군 다음, 또한 시린지 필터에 통과시켰다. 합한 여과물을 진공 하에 농축시킨 다음, 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하여 중간체 19-A (12.7 mg, 29%, 93% 순도)를 백색 고체로서 수득하였다.
단계 2: 1-히드록시-6-({4,7,10-트리스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-6-[(4-이소티오시아네이토페닐)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}메틸)피리딘-2-온 (화합물 R)의 합성
H2O 트레이스 셀렉트 등급 (157 μL)/MeCN (680 μL) 중 중간체 19-A (2 mg, 2 μmol)의 용액에 NEt3 (1 μL, 6 μmol), 및 이어서 디(2-피리딜)티오노카르보네이트 (1 mg, 4 μmol)를 첨가하였다. 디(2-피리딜)티오노카르보네이트의 첨가 직후 투명한 용액이 맑은 황색으로 변하였고, 반응물을 실온에서 1시간 동안 교반되도록 하였다. 반응 진행을 HPLC-MS에 의해 모니터링한 다음, 정제용 C18 HPLC 칼럼에 의해 정제하고, 동결건조 후에 화합물 R (1.6 mg, 62%, ≥81% 순도)을 TFA 염으로서 백색 고체로 수득하였다. 분취물을 용리 방법 2를 사용하여 HPLC-MS 용리에 의해 분석하였다; 체류 시간: 2.54분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z 811.9 [M+H]+; C40H46N9O8S (계산치 812.3).
실시예 18: 4-{[2-(2-{2-[3-(2,6-디클로로페녹시)-3-옥소프로폭시]에톡시}에톡시)에틸]카르바모일}-2-{4,7,10-트리스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부탄산 (화합물 S)
Figure pct00083
단계 1: tert-부틸 4-[(2-{2-[2-(3-메톡시-3-옥소프로폭시)에톡시]에톡시}에틸)카르바모일]-2-[4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부타노에이트 (중간체 20-A)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 4-F (55 mg, 41 μmol) 및 HBTU (19 mg, 49.3 μmol), 및 이어서 무수 아세토니트릴 4 mL 및 DIPEA (71 μL, 410 μmol)를 충전하고, 혼합물을 20-25℃에서 20분 동안 교반하였다. 이어서, 아미노-PEG3-메틸 에스테르의 HCl 염 (12 mg, 45.1 μmol)을 무수 아세토니트릴 2 mL 중의 용액으로서 첨가하고, 반응물을 20-25℃에서 추가로 1.5시간 동안 유지하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에 농축 건조시켰다. 생성된 잔류물을 1:1의 물:아세토니트릴 혼합물 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 중간체 20-A를 투명한 무색 필름 (32 mg, HPLC에 의해 결정 시 94% 순도, TFA 염으로서 50% 수율)으로서 수득하였다.
단계 2: tert-부틸 4-{[2-(2-{2-[3-(2,6-디클로로페녹시)-3-옥소프로폭시]에톡시}에톡시)에틸]카르바모일}-2-[4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부타노에이트 (중간체 20-B)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 20-A (31.5 mg, 21.8 μmol), 및 이어서 물:THF:메탄올의 1:1:1 혼합물 3 mL, 및 이어서 수산화리튬 (1 mg, 41.8 μmol)을 충전하고, 혼합물을 20-25℃에서 2시간 동안 유지하였다. 추가 부분의 수산화리튬 (1 mg, 41.8 μmol)을 첨가하고, 혼합물을 20-25℃에서 2.5시간 동안 유지하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에 농축 건조시킨 다음, 1:1의 물:아세토니트릴 혼합물 1 mL 중에 용해시키고, 이어서 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 중간체 20-B를 투명한 무색 유성 필름 (25 mg, HPLC에 의해 결정 시 85% 순도, TFA 염으로서 68% 수율)으로서 수득하였다.
단계 3: tert-부틸 4-{[2-(2-{2-[3-(2,6-디클로로페녹시)-3-옥소프로폭시]에톡시}에톡시)에틸]카르바모일}-2-[4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]부타노에이트 (중간체 20-C)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 20-B (25 mg, 15 μmol), 및 이어서 HBTU (16 mg, 41.8 μmol), 무수 아세토니트릴 3 mL 및 DIPEA (15 μL, 83.6 μmol)를 충전한 다음, 최종적으로 2,6-디클로로페놀 (7 mg, 41.8 μmol)을 첨가하고, 혼합물을 20-25℃에서 20시간 동안 유지하였다. 이어서, 추가 부분의 HBTU (5 mg, 13.3 μmol) 및 2,6-디클로로페놀 (5 mg, 30.4 μmol)을 첨가하고, 혼합물을 20-25℃에서 4시간 동안 교반하였다. DIPEA (15 μL, 83.6 μmol) 및 2,6-디클로로페놀 (7 mg, 41.8 μmol) 및 HBTU (5 mg, 13.3 μmol)를 다시 첨가하고, 반응을 20-25℃에서 추가로 16시간 동안 계속하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에 농축 건조시키고, 1:1의 물:아세토니트릴 혼합물 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하였다. 중간체 20-C를 농축 후 투명한 무색 필름으로서 수득하였다 (18.7 mg, HPLC에 의해 결정 시 97% 순도, TFA 염으로서 76% 수율).
단계 4: 4-{[2-(2-{2-[3-(2,6-디클로로페녹시)-3-옥소프로폭시]에톡시}에톡시)에틸]카르바모일}-2-{4,7,10-트리스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}부탄산 (화합물 S)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 20-C (18.7 mg, 11.9 μmol), 및 이어서 1,4-디옥산 중 4 M 염산 1.5 mL를 충전하였다. 반응 용기를 캡핑하고, 20-25℃에서 24시간 동안 교반하면서 유지하였다. 이어서, 반응물을 압축 공기의 스트림 하에 농축시킨 다음, 2 x 3 mL 아세토니트릴과 공증발시켰다. 조 잔류물을 물 중 1:1 아세토니트릴:0.1% 트리플루오로아세트산 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물을 함유하는 것으로 결정된 분획을 풀링하고, -80℃에서 동결시키고, 동결건조시켜 화합물 S를 백색 불투명 무정형 고체 (7.2 mg, HPLC에 의해 결정 시 >98% 순도, TFA 염으로서 49% 수율)로서 수득하였다. 분취물을 HPLC 용리 방법 3에 의해 분석하였다; 체류 시간 = 3.2분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z = 1019.2 [M+H]+; C46H61Cl2N8O14 (계산치 1019.4).
실시예 19: 2,6-디클로로페닐 3-{2-[2-(3-옥소-3-{4,7,10-트리스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}프로폭시)에톡시]에톡시}프로파노에이트 (화합물 T)
Figure pct00084
단계 1: 1-(벤질옥시)-6-{[4,7-비스({[1-(벤질옥시)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]메틸}-1,2-디히드로피리딘-2-온 (중간체 21-A)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 4-C (237 mg, 805 μmol), 시클렌 (100 mg, 268 μmol) 및 탄산칼륨 (223 mg, 1.61 mmol), 및 이어서 무수 아세토니트릴 4 mL를 충전하였다. 바이알 헤드스페이스를 질소로 퍼징한 다음, 밀봉하고, 오일 조에서 50℃에서 2.5시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과에 의해 제거하고, 모액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 1:1 아세토니트릴:물 혼합물 2 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 중간체 21-A를 담황색 오일 (91 mg, HPLC에 의해 결정 시 90% 순도, TFA 염으로서 29% 수율)로서 수득하였다.
단계 2: 2,6-디클로로페닐 3-[2-(2-{3-옥소-3-[4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]프로폭시}에톡시)에톡시]프로파노에이트 (중간체 21-B)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 14-A (12 mg, 22.5 μmol), 및 이어서 무수 아세토니트릴 1 mL, 및 이어서 탄산칼륨 (15 mg, 102 μmol) 및 최종적으로 중간체 21-A (24 mg, 20.4 μmol)를 충전하고, 반응물을 오일 조에서 85℃에서 23시간 동안 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과에 의해 제거하고, 모액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 물 혼합물 중 1:1 아세토니트릴:0.1% 트리플루오로아세트산 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 중간체 21-B를 불투명한 필름 (7 mg, HPLC에 의해 결정 시 90% 순도, TFA 염으로서 22% 수율)으로서 수득하였다.
단계 3: 2,6-디클로로페닐 3-{2-[2-(3-옥소-3-{4,7,10-트리스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일}프로폭시)에톡시]에톡시}프로파노에이트 (화합물 T)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 21-B (7 mg, 4.9 μmol), 및 이어서 1,4-디옥산 중 4 M 염산 1 mL를 충전하였다. 반응 용기를 캡핑하고, 20-25℃에서 22시간 동안 교반하면서 유지하였다. 이어서, 반응물을 압축 공기의 스트림 하에 농축시킨 다음, 2 x 3 mL 아세토니트릴과 공증발시켰다. 조 잔류물을 1:1 아세토니트릴:트레이스 셀렉트 등급 물 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 풀링하고, -80℃에서 동결시키고, 동결건조시켜 화합물 T를 회백색 베이지색 무정형 고체 (2.3 mg, HPLC에 의해 결정 시 >98% 순도, TFA 염으로서 41% 수율)로서 수득하였다. 분취물을 HPLC 용리 방법 3에 의해 분석하였다; 체류 시간 = 3.1분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z = 918.1 [M+H]+; C42H54Cl2N7O12 (계산치 918.3).
실시예 20: 2,6-디클로로페닐 3-[2-(2-{2-[({1,4,7,10-테트라키스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일}메틸)카르바모일]에톡시}에톡시)에톡시]프로파노에이트 (화합물 U)
Figure pct00085
단계 1: 2-(1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일메틸)이소인돌-1,3-디온 (중간체 22-A)
20 mL 섬광 바이알에 (1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일)메탄아민 5xHCl (103 mg, 268.5 μmol), 및 이어서 15 mL THF를 충전하고, 현탁액을 빙조에서 0-5℃로 냉각시켰다. 이어서, 포타슘 tert-부톡시드 (150 mg, 1.34 mmol)를 첨가하고, 혼합물을 20-25℃로 천천히 가온되도록 하고, 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 50 mL 1구 둥근 바닥 플라스크로 옮기고, 감압 하에 농축 건조시킨 다음, 2 x 10 mL 이소프로판올과 공증발시켰다. 건조된 잔류물에 이소프로판올 20 mL, 및 이어서 트리에틸아민 (261 μL, 1.88 mmol)을 첨가하고, 생성된 용액을 빙조에서 0-5℃로 냉각시켰다. 이어서, 프탈산 무수물 (40 mg, 269 μmol)을 디클로로메탄 1 mL 중의 용액으로서 30분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 실온으로 가온되도록 한 다음, 이소프로판올을 함유한 딘-스타크 트랩 및 환류 응축기를 부착하고, 반응물을 질소 분위기 하에 16시간 동안 환류로 설정하였다. 반응 완결을 HPLC-MS에 의해 확인한 다음, 반응물을 감압 하에 잔류물로 농축시키고, 2 x 10 mL 아세토니트릴과 공증발시킨 다음, 추가 정제 없이 이월하였다.
단계 2: 2-{[1,4,7,10-테트라키스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일]메틸}이소인돌-1,3-디온 (중간체 22-B)
중간체 22-A (정량적 수율; 89 mg, 269 μmol)을 가정함)를 함유하는 단계 1로부터의 조 반응 혼합물을 함유한 50 mL 1구 둥근 바닥 플라스크에 중간체 4-C (332 mg, 1.13 mmol) 및 탄산칼륨 (223 mg, 1.61 mmol), 및 이어서 무수 아세토니트릴 10 mL를 충전하고, 반응물을 오일 조에서 50℃에서 22시간 동안 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 고체를 여과에 의해 제거하고, 모액을 감압 하에 농축 건조시켰다. 생성된 오렌지색-베이지색 발포체 잔류물 (360 mg)은 대략 70% 중간체 22-B를 함유하는 것으로 결정되었으며, 이를 추가 정제 없이 이월하였다.
단계 3: 6-{[3-(아미노메틸)-4,7,10-트리스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1-일]메틸}-1-(벤질옥시)피리딘-2-온 (중간체 22-C)
조 중간체 22-B (230 mg, 136 μmol, 70% 순도)로 충전된 50 mL 1구 둥근 바닥 플라스크에 이소프로판올 15 mL 및 아밀렌 (190 μL, 1.8 mmol), 및 이어서 히드라진-수화물 (190 μL, 3.9 mmol)을 첨가하고, 반응물을 오일 조에서 95℃에서 질소 분위기 하에 16시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 감압 하에 농축시키고, 2 x 3 mL 아세토니트릴과 함께 잔류물로 공증발시켰다. 조 반응 혼합물을 1:1 아세토니트릴:물 1.5 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하였다. 중간체 22-C를 투명한 무색 필름으로서 수득하였다 (44 mg, HPLC에 의해 결정 시 95% 순도, 3 단계에 걸쳐 TFA 염으로서 24% 수율).
단계 4: 2,6-디클로로페닐 3-(2-{2-[2-({[1,4,7,10-테트라키스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일]메틸}카르바모일)에톡시]에톡시}에톡시)프로파노에이트 (중간체 22-D)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 14-A (30 mg, 56 μmol), 및 이어서 3 mL 무수 디클로로메탄을 충전한 다음, 중간체 22-C (24 mg, 18.7 μmol)를 1 mL 디클로로메탄 중의 용액으로서 첨가하고, 이어서 1 mL 디클로로메탄으로 헹군 다음, DIPEA (25 μL, 143 μmol)를 첨가하고, 반응물을 20-25℃에서 27시간 동안 유지하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축 건조시킨 다음, 3 x 3 mL 아세토니트릴과 공증발시켰다. 이어서, 조 잔류물을 7:5 아세토니트릴:물 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 풀링하고, -80℃에서 동결시키고, 동결건조시켜 중간체 22-D를 백색 무정형 분말 (10 mg, HPLC에 의해 결정 시 90% 순도, TFA 염으로서 29% 수율)로서 수득하였다.
단계 5: 2,6-디클로로페닐 3-[2-(2-{2-[({1,4,7,10-테트라키스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2l}메틸)카르바모일]에톡시}에톡시)에톡시]프로파노에이트 (화합물 U)
20 mL 섬광 바이알을 중간체 22-D (10 mg, 5.4 μmol), 및 이어서 1,4-디옥산 중 4 M 염산 2 mL를 충전하였다. 반응 용기를 캡핑하고, 50℃로 2.5시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 압축 공기의 스트림 하에 농축시킨 다음, 2 x 4 mL 아세토니트릴과 공증발시켰다. 조 잔류물을 트레이스 셀렉트 등급 물 중 1:1 아세토니트릴:0.1% 트리플루오로아세트산 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 풀링하고, -80℃에서 동결시키고, 동결건조시켜 화합물 U를 미세한 백색 무정형 분말 (3 mg, HPLC에 의해 결정 시 95% 순도, TFA 염으로서 40% 수율)로서 수득하였다. 분취물을 HPLC 용리 방법 3에 의해 분석하였다; 체류 시간 = 3.0분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z = 1070.0 [M+H]+; C49H62Cl2N9O14 (계산치 1070.4).
실시예 21: 2,6-디클로로페닐 1-[({1,4,7,10-테트라키스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일}메틸)카르바모일]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-오에이트 (화합물 V)
Figure pct00086
단계 1: 2,6-디클로로페닐 1-({[1,4,7,10-테트라키스({[1-(벤질옥시)-6-옥소피리딘-2-일]메틸})-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일]메틸}카르바모일)-3,6,9,12,15,18,21,24, 27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-오에이트 (중간체 23-A)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 17-A (19 mg, 35 μmol), 및 이어서 3 mL 무수 디클로로메탄을 충전한 다음, 중간체 22-C (15 mg, 11.7 μmol)를 0.75 mL 디클로로메탄 중 용액으로서 첨가하고, 이어서 0.75 mL 디클로로메탄으로 헹군 다음, DIPEA (32 μL, 187 μmol)를 첨가하고, 반응물을 20-25℃에서 24시간 동안 유지하였다. 반응 혼합물을 감압 하에 농축 건조시키고, 7:5 아세토니트릴:물 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하여 중간체 23-A를 투명한 무색 필름 (14 mg, HPLC에 의해 결정 시 >98% 순도, TFA 염으로서 58% 수율)으로서 수득하였다.
단계 2: 2,6-디클로로페닐 1-[({1,4,7,10-테트라키스[(1-히드록시-6-옥소피리딘-2-일)메틸]-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-2-일}메틸)카르바모일]-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33,36-도데카옥사노나트리아콘탄-39-오에이트 (화합물 V)
20 mL 섬광 바이알에 중간체 23-A (14 mg, 6.8 μmol), 및 이어서 1,4-디옥산 중 4 M 염산 1.5 mL 및 아세트산 중 4 M 염산 1.5 mL를 충전하였다. 반응 용기를 캡핑하고, 50℃로 2.5시간 동안 가열하였다. 이어서, 반응물을 압축 공기의 스트림 하에 농축시킨 다음, 2 x 3 mL 아세토니트릴과 공증발시켰다. 조 잔류물을 트레이스 셀렉트 등급 물 중 1:1 아세토니트릴:0.1% 트리플루오로아세트산 1 mL 중에 용해시킨 다음, 정제용 C18 HPLC에 의해 정제하였다. 생성물 함유 분획을 풀링하고, -80℃에서 동결시키고, 동결건조시켜 화합물 V를 황색빛-백색 무정형 분말 (4 mg, HPLC에 의해 결정 시 95% 순도, TFA 염으로서 33% 수율)로서 수득하였다. 분취물을 HPLC 용리 방법 3에 의해 분석하였다; 체류 시간 = 3.4분; MS (양성 ESI): 실측치 m/z = 1466.4 [M+H]+; C67H98Cl2N9O23 (계산치 1466.6).
실시예 22: 이관능성 킬레이트 화합물 M 및 화합물 N을 사용한 항체 접합체 (화합물 W)의 합성
Figure pct00087
500 μL 에펜도르프에 항체 (인간화 mAb 항-IGF-1R; 10 nmol, 0.01% 트윈 80을 함유한 아세트산나트륨 (0.1 M) 완충 염수 용액 = SABST 중 80.5 uL) 및 Na2CO3 (5 μL, 0.1 M)을 로딩하였다. 화합물 M 또는 화합물 N (26 μL, 0.001 M HCl 중 c = 5 nmol/μL에서 130 nmol), 및 이어서 Na2CO3 (1.2 μL, 0.1 M)을 첨가하여 pH 스트립에 의해 pH를 8로 조정하였다. 반응물을 37℃ 수조에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 반응물을 G50 칼럼 (1 mL 하우징, SABST를 사용한 용리)에 의해 정제하여 미반응 킬레이트를 제거하여 화합물 W를 수득하고, 이를 SEC-HPLC 용리 방법 2에 대해 샘플링하고, 농도 결정을 위해 보정 곡선 상에 피팅하였다 (화합물 M을 사용하여 ~78% 수율 및 화합물 N을 사용하여 ~83% 수율). 1.1 및 0.44의 CAR이 각각 화합물 M 및 화합물 N과의 반응 시 MALDI-MS에 의해 결정되었다.
실시예 23: 항체 접합체 화합물 X 및 화합물 Y의 합성
Figure pct00088
1.5 mL 에펜도르프에 항체 (인간화 mAb 항-IGF-1R; 9.7 nmol, 0.01% 트윈 80을 함유한 아세트산나트륨 (0.1 M) 완충 염수 용액 = SABST 중 1.1 mL) 및 중탄산나트륨 완충제 (110 μL, 0.1 M)를 로딩하였다. 화합물 P를 첨가하였다 (58.2 μL, 0.001 M HCl 중 c = 1 nmol/μL에서 58.2 nmol). 반응물을 실온에서 100분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 반응물을 용리액으로서 SABST를 사용하여 G50 칼럼에 의해 정제하여 미반응 킬레이트를 제거하여 화합물 X를 수득하고, 이를 SEC-HPLC 용리 방법 2 및 나노-드롭에 의해 샘플링하였다 (~71% 수율). 0.80의 CAR이 MALDI-MS에 의해 결정되었다. 상기와 유사하게, 6배 과량의 화합물 Q를 실온에서 120분 동안 인간화 mAb 항-IFG-1R과 반응시켜 화합물 Y를 수득하고, 이를 SEC-HPLC 용리 방법 2 및 나노-드롭에 의해 샘플링하였다 (~78% 수율). 0.92의 CAR이 MALDI-MS에 의해 결정되었다.
실시예 24: 225Ac를 사용한 화합물 A의 방사성표지
화합물 A의 225Ac 방사성표지에 대해, 하기 일반적 조건을 사용하였다. 0.01% 트윈 80을 함유한 아세트산나트륨 (0.1 M, pH 6.5) 완충 염수 용액 중 화합물 A (100 μL, 10 nmol)의 용액에 225Ac의 용액 (5 μL, 4 μCi, 0.001 M HCl 중)을 첨가하였다. 방사성표지 반응물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 생성물로의 전환율을 방사성TLC (98.4%; iTLC 플레이트, 1:1:18 NH4OH/EtOH/H2O)에 의해 모니터링하였다.
실시예 25: 89Zr을 사용한 화합물 A의 방사성표지
화합물 A의 89Zr 방사성표지에 대해, 하기 일반적 조건을 사용하였다. 화합물 A의 용액 (10 μL, 50-100 nmol, 0.001 M HCl 중)을 (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산; HEPES;400 μL, 0.5 M) 완충제에 첨가하고, 이어서 89ZrCl4 (문헌 [Nucl. Med. Biol. 2009, 36, 729-739]) 또는 89Zr(ox)2의 용액 (2-20 μL, 0.5-1.0 mCi)을 첨가하였다. 반응물을 90℃ (1시간), 60℃ (3시간) 또는 37℃ (3시간)로 가열하고, 전환율을 방사성TLC (iTLC 플레이트, 1:1:18 NH4OH/EtOH/H2O)에 의해 결정하고, 데이터를 하기 표 2에 요약하였다. 생성된 생성물을 방사성 정제용 HPLC에 의해 단리하고, 공기 스트림 하에 농축시키고, 0.01% 트윈 80을 함유하는 아세트산나트륨 (0.1 M) 완충 염수 용액으로 제제화하였다.
표 2: 89Zr-화합물 A의 방사성합성에 대한 전환율 결과
Figure pct00089
실시예 26: 89Zr을 사용한 DOTA의 방사성표지
DOTA, S-2-(4-니트로벤질)-1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸 테트라아세트산의 용액 (마크로시클릭스, B-199; 50-100 nmol, 10 μL, 0.001 M HCl 중)을 HEPES (400 μL, 0.5 M) 완충제에 첨가하고, 이어서 89ZrCl4 또는 89Zr(ox)2의 용액 (2-20 μL, 0.5-1.0 mCi)을 첨가하고, 반응물을 90℃로 1시간 동안 가열하였다. 전환율을 방사성TLC (iTLC 플레이트, 1:1:18 NH4OH/EtOH/H2O)에 의해 결정하였다. 89ZrCl4는 50%의 전환율을 생성하였고, 89Zr(ox)2의 경우 전환율은 33%인 것으로 결정되었다. 생성된 생성물을 방사성 정제용 HPLC에 의해 단리하고, 공기 스트림 하에 농축시키고, 0.01% 트윈 80을 함유하는 아세트산나트륨 (0.1 M) 완충 염수 용액으로 제제화하였다.
실시예 27: 89Zr을 사용한 DFO의 방사성표지
DFO, 데스페리옥사민 메실레이트 염의 용액 (시그마-알드리치, D9533; 50-100 nmol,10 μL, 0.001 M HCl 중)을 HEPES (400 μL, 0.5 M) 완충제에 첨가하고, 이어서 89Zr(ox)2의 용액 (2-20 μL, 0.5-1.0 mCi)을 첨가하였다. 반응물을 90℃로 1시간 동안 가열하고, 전환율을 방사성TLC (>99%; iTLC 플레이트, 0.1 M 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA))에 의해 결정하였다. 생성된 생성물을 방사성 정제용 HPLC에 의해 단리하고, 공기 스트림 하에 농축시키고, 0.01% 트윈 80을 함유하는 아세트산나트륨 (0.1 M) 완충 염수 용액으로 제제화하였다.
실시예 28: 89Zr-화합물 A의 안정성
89Zr의 화합물 A 착물의 안정성은 25배 몰 과량의 DTPA를 HPLC 정제된 89Zr-화합물 A에 첨가하는 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 챌린지 실험을 이용하여 입증되었으며, 결과를 89Zr-DOTA 및 89Zr-DFO 유사체 둘 다와 비교하였다. 하기 표 3에 요약된 결과는 89Zr-화합물 A 및 89Zr-DOTA가 120시간에 걸쳐 DTPA 챌린지에 대해 안정하고, 89Zr-화합물 A가 유사한 조건 하에 89Zr-DFO에 비해 우수한 안정성을 나타낸다는 것을 입증한다.
표 3: 89Zr-화합물 A, 89Zr-DOTA, 및 89Zr-DFO의 DTPA 챌린지에 대한 안정성
Figure pct00090
실시예 29: 225Ac를 사용한 화합물 D, 화합물 E 및 화합물 F의 방사성표지 및 안정성
화합물 D, 화합물 E 및 화합물 F의 225Ac 방사성표지에 대해, 하기 일반적 조건을 사용하였다. 화합물의 용액 (10 μL, 100 nmol, 0.001 M HCl 중)을 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 (TRIS) 완충제 (100 μL, 0.1 M)에 첨가하였다. 여기에 225Ac의 용액 (5 μL, 4 μCi, 0.001 M HCl 중)을 첨가하고, 방사성표지 반응물을 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 생성물로의 전환율을 적절한 용매 (1:1:18 NH4OH/EtOH/H2O 또는 0.1 M EDTA) 중에 전개된 ITLC-SG 플레이트 상에서의 방사성TLC에 의해 모니터링하였다. 225Ac 착물의 안정성은 상기 기재된 생성물 용액에 25배 몰 과량의 DTPA를 첨가하는 DTPA 챌린지 실험을 이용하여 입증되었다. 안정성을 방사성TLC에 의해 모니터링하고, 방사성표지 및 안정성의 결과를 하기 표 4에 요약하였다.
표 4: 225Ac-화합물 D, 225Ac-화합물 E 및 225Ac-화합물 F에 대한 생성물로의 전환율 및 DTPA 챌린지 안정성 결과
Figure pct00091
*사용된 조건: 화합물 F (10 μL, 100 nmol, 0.001 M HCl 중)를 100 mM 아세트산나트륨 완충제 pH 6.5, 0.33% NaCl, 0.01% 트윈-80에 첨가하였다. 여기에 225Ac의 용액 (2 μL, 4 μCi, 0.001 M HCl 중)을 첨가하고, 방사성표지 반응물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 전환율 및 안정성을 ITLC-SG 플레이트 상에서 95:5 시트레이트/MeOH 중에 전개시킨 방사성TLC에 의해 모니터링하였다.
실시예 30: 89Zr을 사용한 화합물 D, 화합물 E, 및 화합물 F의 방사성표지
화합물 D, 화합물 E 및 화합물 F의 89Zr 방사성표지에 대해, 하기 일반적 조건을 사용하였다. 화합물 용액 (10 μL, 50-100 nmol, 0.001 M HCl 중)을 HEPES (400 μL, 0.5 M) 완충제에 첨가하였다. 여기에 89ZrCl4 또는 89Zr(ox)2의 용액 (2-20 μL, 0.5-1.0 mCi)을 첨가하였다. 반응물을 90℃ (1시간), 60℃ (3시간) 또는 37℃ (3시간)로 가열하고, 전환율을 방사성TLC (iTLC 플레이트, 0.1 M EDTA)에 의해 결정하고, 데이터를 하기 표 5-7에 요약하였다.
표 5: 89Zr-화합물 D의 방사성합성에 대한 전환율 결과
Figure pct00092
* 이용가능하지 않음
표 6: 89Zr-화합물 E의 방사성합성에 대한 전환율 결과
Figure pct00093
* 이용가능하지 않음
표 7: 89Zr-화합물 F의 방사성합성에 대한 전환율 결과
Figure pct00094
실시예 31: DTPA에 대한 89Zr-화합물 D, 89Zr-화합물 E, 및 89Zr-화합물 F의 안정성
89Zr-화합물 D, 89Zr-화합물 E, 및 89Zr-화합물 F의 안정성은 25배 몰 과량의 DTPA를 상기 기재된 생성물 용액 (실시예 30)에 첨가하는 디에틸렌트리아민펜타아세트산 (DTPA) 챌린지 실험을 이용하여 입증되었다. 모든 89Zr 방사성표지된 화합물은 DTPA 챌린지 실험에 대해 안정한 것으로 밝혀졌다. 안정성을 방사성TLC에 의해 모니터링하고, 결과를 하기 표 8에 요약하였다.
표 8: 89Zr-화합물 D, 89Zr-화합물 E, 및 89Zr-화합물 F에 대한 DTPA 챌린지 안정성 결과
Figure pct00095
실시예 32: 89Zr을 사용한 화합물 D, 화합물 E, 화합물 F, 화합물 H, 화합물 I, 화합물 J 및 화합물 K의 방사성표지 및 EDTA에 대한 착물의 안정성
89Zr(ox)2의 용액 (4 μL, ~0.1-0.2 mCi)을 Na2CO3 (2 M, 0.45X 부피의 Zr-89 용액)으로 중화시킨 다음, HEPES (100 μL, 0.5 M, pH = 7.1)로 희석하였다. 킬레이트 화합물의 용액 (2-18 μL, 20 nmol, 트레이스 셀렉트 등급 H2O 중)을 첨가하고, 반응물을 37℃ (30-60분)로 가열하고, 전환율을 방사성TLC (iTLC SG 플레이트, 0.1 M EDTA, pH = 5)에 의해 결정하였다. 89Zr 착물의 안정성은 또한 상기 기재된 생성물 용액에 50-500배 몰 과량의 EDTA를 첨가하고 실온에서 인큐베이션함으로써 EDTA 챌린지 실험을 이용하여 입증하였다. 안정성을 방사성TLC에 의해 모니터링하고, 방사성표지 및 안정성의 결과를 하기 표 9에 요약하였다.
표 9: 89Zr-화합물 D, 89Zr-화합물 E, 89Zr-화합물 F, 89Zr-화합물 H, 89Zr-화합물 I, 89Zr-화합물 J, 89Zr-화합물 K에 대한 37℃에서 HEPES 중 89Zr(ox)2를 사용한 방사성표지 및 EDTA 챌린지 안정성 결과
Figure pct00096
*500 당량 EDTA
실시예 33: 트리스 완충제 중 89Zr을 사용한 화합물 D, 화합물 E, 화합물 F 및 화합물 H의 방사성표지
트리스 완충제 중 화합물 D, 화합물 E, 화합물 F 및 화합물 H의 89Zr 방사성표지에 대해, 하기 일반적 조건을 사용하였다. 89Zr(ox)2의 용액 (4-10 μL, 0.08-0.4 mCi)을 Na2CO3 (2 M, 0.45X 부피의 Zr-89 용액)으로 중화시킨 다음, 트리스 완충제 (100-200 μL, 50 mM, pH = 7.4)로 희석하였다. 킬레이트 화합물의 용액 (4-36 μL, 20-40 nmol, 트레이스 셀렉트 등급 H2O 중)을 첨가하고, 반응물을 37℃로 가열하고 (30 내지 60분), 전환율을 방사성TLC (iTLC SG 플레이트, 0.1 M EDTA, pH = 5)에 의해 결정하였다. 데이터를 하기 표 10에 요약하였다.
표 10: 89Zr-화합물 D, 89Zr-화합물 E, 89Zr-화합물 F 및 89Zr-화합물 H에 대한 37℃에서 트리스 (0.05 M, pH = 7.4) 중 방사성표지 결과
Figure pct00097
실시예 34: 177Lu를 사용한 화합물 D, 화합물 E 및 화합물 F의 방사성표지
화합물 D, 화합물 E 및 화합물 F의 177Lu 방사성표지에 대해, 하기 일반적 조건을 사용하였다. 0.01% 트윈 80을 함유하는 아세트산나트륨 (0.1 M, pH 6.5) 완충 염수 용액 중 화합물 (100 μL, 10 nmol)의 용액에 177Lu (1.5 μL, 0.5 mCi, 0.001 M HCl 중)의 용액을 첨가하였다. 방사성표지 반응물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 생성물로의 전환율을 방사성TLC (iTLC 플레이트, 1:1:18 NH4OH/EtOH/H2O 또는 0.1 M EDTA)에 의해 모니터링하고, 결과를 하기 표 11에 요약하였다.
표 11: 177Lu-화합물 D, 177Lu-화합물 E, 및 177Lu-화합물 F의 방사성합성에 대한 전환율 결과
Figure pct00098
실시예 35: 2 단계 표지를 통한 89Zr-화합물 C-항체의 방사성합성
하기 일반적 방법을 사용하였다. DBCO-NHS의 용액 (브로드팜(BroadPharm), BP-22231; 20 μL DMSO 중 1000 nmole)을 항체 (인간화 mAb 항-IGF-1R; 10.0 nmole, 0.01% 트윈 80을 함유하는 아세트산나트륨 (0.1 M) 완충 염수 용액 중 250 μL) 및 비카르보네이트 완충제 (27 μL)를 함유하는 용액에 첨가하였다. 반응물을 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션하고, G-50 수지-패킹된 칼럼을 통해 아세트산나트륨 (0.1 M) 완충 염수 용액 (0.01% 트윈 80)으로 용리시키면서 정제하였다. 항체에 대한 DBCO의 비를 MALDI-TOF-MS에 의해 결정하였고, 0.1-5.0의 범위인 것으로 밝혀졌다. 89Zr을 사용한 화합물 C의 방사성표지는 다음과 같았다; 89Zr(ox)2의 용액 (1-2 μL, 0.5 mCi)에 탄산나트륨의 용액 (0.7 μL, 2 M)을 첨가하고, 3분 동안 인큐베이션하였다. 혼합물에 HEPES (400 μL, 0.5 M) 완충제 및 화합물 C의 용액 (20 μL, 0.001 M HCl 중 50 nmole)을 첨가하고, 반응물을 90℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 89Zr-화합물 C를 함유하는 용액을 DBCO-항체 (250 μg)에 첨가하고, 반응물을 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 생성된 89Zr-화합물 C-항체를 세파덱스 G-50 수지-패킹된 칼럼을 통해 0.01% 트윈 80을 함유하는 아세트산나트륨 (0.1 M) 완충 염수 용액으로 용리시키면서 정제하였다. 89Zr-화합물 C-항체로의 전환율을 방사성TLC (80%; iTLC 플레이트, 0.02 M 시트레이트, 25% 메탄올 함유)에 의해 모니터링하고, SEC HPLC 용리 방법 1에 의해 확인하였다.
실시예 36: 89Zr을 사용한 항체 접합체 화합물 Y의 방사성표지 및 정제용 SEC HPLC에 의한 정제
89Zr(ox)2의 용액 (15-30 μL, 0.8-1.1 mCi)을 Na2CO3 (2 M, Zr-89 용액의 0.45X 부피)으로 중화시킨 다음, HEPES (78-140 μL, 0.5 M, pH = 7.1)로 희석하였다. 0.01% 트윈 80을 함유하는 아세트산나트륨 (0.1 M) 완충 염수 용액 중 항체 접합체 화합물 Y (28-200 μL, ~70-160 μg)의 용액을 첨가하고, 반응물을 37℃로 가열하였다 (≤3시간). 반응을 방사성TLC (iTLC SG 플레이트, 0.1 M EDTA, pH = 5)에 의해 모니터링한 다음, 방사성 정제용 SEC HPLC (토소 TSK 칼럼, 7.8 x 300 mm, 유량 = 1 mL/분에서 용리액으로서 포스페이트 완충제 (pH = 7)를 사용함)에 의해 정제하고, G-25 PD-10 칼럼을 사용하여 0.01% 트윈 80을 함유하는 아세트산나트륨 (0.1 M) 완충 염수 용액으로 재제제화하였다. 방사성TLC 및 SEC HPLC 용리 방법 2 (아지드화나트륨 부재)에 의해 모니터링된 바와 같이, 결과를 표 12에 요약하고, 89Zr-화합물 Y에 대한 제제 안정성 연구를 표 13에 나타낸다.
표 12: 89Zr-화합물 Y의 방사성합성
Figure pct00099
표 13: 실온에서 89Zr-화합물 Y의 제제 안정성 연구
Figure pct00100
실시예 37: 89Zr-화합물 Y-항체의 생체-분포
IGF-1R 과다발현 Colo-205 (ATCC #CCL-222) 결장직장 선암종 종양 이종이식편을 보유하는 암컷 Balb/c nu/nu 마우스 (찰스 리버)에서 89Zr-화합물 Y에 대한 생체분포 연구를 수행하였다. 1:1 (v/v) 포스페이트 완충 염수:매트리겔 (벡톤-디킨슨) 중 현탁액으로서 제조된 2x106개 생존 세포의 피하 주사에 의해 7-8주령 마우스에 종양을 이식하였다. 종양이 대략 200 mm3의 초기 부피에 도달하였을 때 생체분포 연구를 시작하였다. 3 μg의 표적화 항체에 접합되고 100 mM 아세트산나트륨 완충제 pH 6.5, 0.33% NaCl, 0.01% 트윈-80, 3.8 mM 아스코르브산나트륨 중에 제제화된 7 μCi의 방사능을 함유한 지르코늄-89 표지된 면역접합체 200 μL를 동물에게 외측 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 주사하였다. 주사 후 선택된 시점 (24 및 96시간) 후에, 시점당 3마리의 동물을 이소플루란으로 마취시키고, 혈액을 심장 천자에 의해 수집한 다음, 동물을 절제에 의한 기관 수집을 위해 안락사시켰다. 기관 및 조직 샘플을 혈액으로 헹구고, 과량의 수분을 블롯팅하고, 사전-칭량된 카운팅 튜브 내로 수집하였다. 조직 샘플에 함유된 분당 방사선 카운트를 감마 카운터를 사용하여 측정한 다음, 보정 표준을 사용하여 붕괴 보정된 μCi의 활성으로 전환시켰다. 활성 측정 및 샘플 중량을 사용하여 조직 중량 그램당 주사된 용량의 퍼센트 (%ID/g)를 계산하였다. 도 1을 참조한다.
이러한 생체분포 연구로부터의 결과는 89Zr-화합물 Y가 Zr-89 동위원소를 IGF-1R 발현 종양에 전달할 수 있었음을 나타냈다. 종양 흡수 (평균 ± 표준 편차)는 96시간 후에 26.1 ± 10%ID/g이었다. 기관 흡수는 시험된 모든 기관에 걸쳐 평균 9%ID/g 미만으로 낮았다. 특히, Zr-89의 뼈로의 전달은 3.9 ± 2.9%ID/g이었다.
다른 실시양태
본 발명은 그의 구체적 실시양태와 관련하여 기재되었지만, 추가의 변형이 가능하며, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 원리를 따르고, 본 발명이 속하는 기술분야 내의 공지되거나 통상적인 실시 내에 있으며 상기 본원에 제시된 본질적인 특색에 적용될 수 있는 본 개시내용으로부터의 이러한 일탈을 포함하는 본 발명의 임의의 변형, 사용 또는 적합화를 포괄하는 것으로 의도된다는 것이 이해될 것이다.

Claims (61)

  1. 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물, 또는 그의 금속 착물 또는 그의 제약상 허용되는 염:
    Figure pct00101

    여기서,
    R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, R4는 -X-W이고, R5는 H, -L-U, 또는 -X-W이거나; 또는 R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 -L-U이고, R5는 -X-W이고;
    n은 0-3의 정수이고, n이 0이고 R5가 H인 경우, R1, R3, 및 R4가 모두
    Figure pct00102
    과 동일하지는 않고,
    여기서,
    L은 C=O 또는 -CH(R)-이고, 여기서 R은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 헤테로알킬, 또는 -L1-Z1-L2-Z2-B이고;
    U는 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 카르복실산, 또는 임의로 치환된 포스폰산이거나; 또는 -L-U는 -L1-Z1-L2-Z2-B이고;
    R1-R3 중 적어도 하나는 임의로 치환된 헤테로아릴로서의 U를 갖고;
    X는 C=O 또는 임의로 치환된 C1-C3 알킬렌이고;
    W는 방사성금속에 배위할 수 있는 공여 모이어티이고, 여기서 공여 모이어티는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 임의로 치환된 히드록시피리디논이고
    Figure pct00103
    ,
    여기서, V1은 삭제되거나, 융합된 아릴 또는 헤테로아릴, 융합된 카르보사이클 또는 헤테로사이클, 알킬, 에테르, 알콜, 산, 에스테르, 아미드, 포스포네이트 또는 술포네이트이고; V2는 H, 알킬, 또는 아실이고,
    여기서,
    L1은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌, 또는 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬렌이고;
    Z1은 결합, C=O(NR4), C=S(NR4), OC=O(NR4), NR4C=O(O), NR4C=O(NR4), -CH2PhC=O(NR4), -CH2Ph(NR4)C=O, 또는 -CH2Ph(NH)C=S(NR4)이고, 각각의 R4는 독립적으로 H, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬, 또는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
    L2는 임의로 치환된 C1-C50 알킬렌, 또는 임의로 치환된 C1-C50 헤테로알킬렌, 또는 C5-C20 폴리에틸렌 글리콜이고;
    Z2는 C=O, -NR'-(C=O)-, 또는 -NR'-(C=O)-R"이고, R'은 H 또는 C1-C6 알킬이고, R"은 C1-C20 알킬렌, C2-C20 헤테로알킬렌, 또는 아릴렌이고;
    B는 치료 모이어티, 표적화 모이어티 또는 가교기이다.
  2. 제1항에 있어서, W가
    Figure pct00104
    인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, X가 C1-C3 알킬렌인 화합물.
  4. 제3항에 있어서, W가
    Figure pct00105
    이고, X가 CH2인 화합물.
  5. 제1항에 있어서, n이 1인 화합물.
  6. 제5항에 있어서, W가
    Figure pct00106
    이고, X가 CH2인 화합물.
  7. 제1항에 있어서, R1, R2, 및 R3이 각각 독립적으로 -L-U이고, 여기서 L은 -CH(R)-이고, R은 H인 화합물.
  8. 제7항에 있어서, U가 임의로 치환된 헤테로아릴 또는 임의로 치환된 카르복실산인 화합물.
  9. 제8항에 있어서, U가
    Figure pct00107
    또는 CO2H이고, R1-R3 중 적어도 하나가
    Figure pct00108
    로서의 U를 갖는 것인 화합물.
  10. 제7항에 있어서, R1-R3 중 적어도 하나가
    Figure pct00109
    로서의 U를 갖는 것인 화합물.
  11. 제7항에 있어서, R1-R3이 각각
    Figure pct00110
    로서의 U를 갖는 것인 화합물.
  12. 제11항에 있어서, W가
    Figure pct00111
    이고, X가 CH2인 화합물.
  13. 제1항에 있어서, R1, R2, 및 R3이 각각 독립적으로 -L-U이고, 여기서 L은 -CH(R)-이고, R은 -L1-Z1-L2-Z2-B이고, L1은
    Figure pct00112
    인 화합물.
  14. 제13항에 있어서, L2가 C5-C20 폴리에틸렌 글리콜이고, Z2가 -NR'-(C=O)-R"이고, 여기서 R'은 H이고, R"은 아릴렌인 화합물.
  15. 제13항에 있어서, R1-R3 중 적어도 하나가
    Figure pct00113
    로서의 U를 갖는 것인 화합물.
  16. 제3항에 있어서, R1-R3이 각각
    Figure pct00114
    로서의 U를 갖는 것인 화합물.
  17. 제16항에 있어서, W가
    Figure pct00115
    이고, X가 CH2인 화합물.
  18. 제13항에 있어서, B가 치료 모이어티 또는 표적화 모이어티인 화합물.
  19. 제18항에 있어서, 치료 모이어티 또는 표적화 모이어티가 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 화합물.
  20. 제19항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 것인 화합물.
  21. 제13항에 있어서, B가 아미노-반응성 가교기, 메티오닌-반응성 가교기 및 티올-반응성 가교기로 이루어진 군으로부터 선택되는 가교기인 화합물.
  22. 제21항에 있어서, 가교기가 활성화된 에스테르, 이미데이트, 무수물, 티올, 디술피드, 말레이미드, 아지드, 알킨, 변형된 알킨, 변형된 알켄, 할로겐, 술포네이트, 할로아세틸, 아민, 히드라지드, 디아지린, 포스핀, 테트라진, 이소티오시아네이트 또는 옥사지리딘을 포함하고, 여기서 활성화된 에스테르가 히드록시숙신이미드 에스테르, 2,3,5,6-테트라플루오로페놀 에스테르, 2,6-디클로로페놀 에스테르 또는 4-니트로페놀 에스테르인 화합물.
  23. 제22항에 있어서, 가교기가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
    Figure pct00116
  24. 제1항에 있어서, Bi, Pb, Y, Mn, Cr, Fe, Co, Zn, Ni, In, Ga, Cu, Re, Sm, 란타나이드 및 악티나이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속을 함유하는 금속 착물을 포함하는 화합물.
  25. 제1항에 있어서, 89Zr, 47Sc, 55Co, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 82Rb, 86Y, 87Y, 90Y, 97Ru, 105Rh, 109Pd, 111In, 117mSn, 149Pm, 52Mn, 149Tb, 152Tb, 153Sm, 177Lu, 186Re, 188Re, 199Au, 201Tl, 203Pb, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac, 223Ra 및 227Th로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성핵종을 함유하는 금속 착물을 포함하는 화합물.
  26. 제25항에 있어서, 방사성핵종이 89Zr, 111In, 또는 225Ac인 화합물.
  27. 제1항의 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  28. 면역조절 이상의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1항의 화합물을 상기 면역조절 이상을 치료하는 데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 면역조절 이상을 치료하는 방법.
  29. 하기 화학식 (I)의 구조를 갖는 화합물, 또는 그의 금속 착물 또는 그의 제약상 허용되는 염:
    Figure pct00117

    여기서,
    R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, R4는 -X-W이고, R5는 H, -L-U, 또는 -X-W이거나; 또는 R1, R2, R3, 및 R4는 각각 독립적으로 -L-U이고, R5는 -X-W이고;
    n은 0-3의 정수이고,
    여기서,
    L은 임의로 치환된 C1-3 알킬렌이고;
    U는 임의로 치환된 카르복실산 또는 임의로 치환된 포스폰산이고;
    W는 방사성금속에 배위할 수 있는 공여 모이어티이고, 여기서 공여 모이어티는 임의로 치환된 히드록시피리디논 또는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 모이어티이고
    Figure pct00118
    ;
    m은 1-3의 정수이고;
    X는 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 R은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 헤테로알킬, 또는 -L3-Z2-B이고,
    여기서,
    L1 및 L2는 각각 독립적으로 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌, 또는 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬렌이고;
    L3은 임의로 치환된 C1-C50 알킬렌, 또는 임의로 치환된 C1-C50 헤테로알킬렌, 또는 C5-C20 폴리에틸렌 글리콜이고;
    Z1은 결합, C=O(NR4), C=S(NR4), OC=O(NR4), NR4C=O(O), NR4C=O(NR4), -CH2PhC=O(NR4), -CH2Ph(NR4)C=O, 또는 -CH2Ph(NH)C=S(NR4)이고, 각각의 R4는 독립적으로 H, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬, 또는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
    Z2는 C=O, -NR'-(C=O)-, 또는 -NR'-(C=O)-R"이고, R'은 H 또는 C1-C6 알킬이고, R"은 C1-C20 알킬렌, C2-C20 헤테로알킬렌, 또는 아릴렌이고;
    B는 치료 모이어티, 표적화 모이어티 또는 가교기이다.
  30. 제29항에 있어서, W가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 임의로 치환된 히드록시피리디논인 화합물:
    Figure pct00119

    여기서, V1은 삭제되거나, 융합된 아릴 또는 헤테로아릴, 융합된 카르보사이클 또는 헤테로사이클, 알킬, 에테르, 알콜, 산, 에스테르, 아미드, 포스포네이트 또는 술포네이트이고; V2는 H, 알킬 또는 아실이다.
  31. 제29항에 있어서, R1, R2, 및 R3이 각각 독립적으로 -L-U이고, 여기서 L은 임의로 치환된 C1 알킬렌이고, U는 -CO2H인 화합물.
  32. 제31항에 있어서, L이 CH2인 화합물.
  33. 제29항에 있어서, W가
    Figure pct00120
    인 화합물.
  34. 제33항에 있어서, W가
    Figure pct00121
    인 화합물.
  35. 제29항에 있어서, n이 1인 화합물.
  36. 제35항에 있어서, R1, R2, 및 R3이 각각 -L-U이고, 여기서 L은 CH2이고, U는 -CO2H인 화합물.
  37. 제35항에 있어서, W가
    Figure pct00122
    인 화합물.
  38. 제29항에 있어서, X가 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 L1은
    Figure pct00123
    이고, R은 H인 화합물.
  39. 제38항에 있어서, R1, R2, 및 R3이 각각 -L-U이고, 여기서 L은 CH2이고, U는 -CO2H인 화합물.
  40. 제38항에 있어서, W가
    Figure pct00124
    인 화합물.
  41. 제38항에 있어서, R1, R2, 및 R3이 각각 -L-U이고, 여기서 L은 CH2이고, U는 -CO2H이고; W가
    Figure pct00125
    인 화합물.
  42. 제29항에 있어서, X가 -L1-Z1-L2-N(R)-(C=O)-이고, 여기서 L1은
    Figure pct00126
    이고, R은 -L3-Z2-B인 화합물.
  43. 제42항에 있어서, L3이 C5-C20 폴리에틸렌 글리콜이고, Z2가 -NR'-(C=O)-R"이고, 여기서 R'은 H이고, R"은 아릴렌인 화합물.
  44. 제42항에 있어서, R1, R2, 및 R3이 각각 -L-U이고, 여기서 L은 CH2이고, U는 -CO2H인 화합물.
  45. 제42항에 있어서, W가
    Figure pct00127
    인 화합물.
  46. 제45항에 있어서, R1, R2, 및 R3이 각각 -L-U이고, 여기서 L은 CH2이고, U는 -CO2H이고; L3이 C5-C20 폴리에틸렌 글리콜이고; Z2가 -NR'-(C=O)-R"이고, 여기서 R'은 H이고 R"은 아릴렌인 화합물.
  47. 제42항에 있어서, B가 치료 모이어티 또는 표적화 모이어티인 화합물.
  48. 제47항에 있어서, 치료 모이어티 또는 표적화 모이어티가 항체 또는 그의 항원-결합 단편인 화합물.
  49. 제48항에 있어서, 항체 또는 그의 항원-결합 단편이 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체 (IGF-1R)에 특이적으로 결합하는 것인 화합물.
  50. 제42항에 있어서, B가 아미노-반응성 가교기, 메티오닌-반응성 가교기 및 티올-반응성 가교기로 이루어진 군으로부터 선택되는 가교기인 화합물.
  51. 제50항에 있어서, 가교기가 활성화된 에스테르, 이미데이트, 무수물, 티올, 디술피드, 말레이미드, 아지드, 알킨, 변형된 알킨, 변형된 알켄, 할로겐, 술포네이트, 할로아세틸, 아민, 히드라지드, 디아지린, 포스핀, 테트라진, 이소티오시아네이트 또는 옥사지리딘을 포함하고, 여기서 활성화된 에스테르가 히드록시숙신이미드 에스테르, 2,3,5,6-테트라플루오로페놀 에스테르, 2,6-디클로로페놀 에스테르 또는 4-니트로페놀 에스테르인 화합물.
  52. 제51항에 있어서, 가교기가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
    Figure pct00128
  53. 제29항에 있어서, Bi, Pb, Y, Mn, Cr, Fe, Co, Zn, Ni, In, Ga, Cu, Re, Sm, 란타나이드 및 악티나이드로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속을 함유하는 금속 착물을 포함하는 화합물.
  54. 제29항에 있어서, 89Zr, 47Sc, 55Co, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 64Cu, 67Cu, 66Ga, 67Ga, 68Ga, 82Rb, 86Y, 87Y, 90Y, 97Ru, 105Rh, 109Pd, 111In, 117mSn, 149Pm, 52Mn, 149Tb, 152Tb, 153Sm, 177Lu, 186Re, 188Re, 199Au, 201Tl, 203Pb, 212Pb, 212Bi, 213Bi, 225Ac, 223Ra 및 227Th로 이루어진 군으로부터 선택되는 방사성핵종을 함유하는 금속 착물을 포함하는 화합물.
  55. 제54항에 있어서, 방사성핵종이 89Zr, 111In, 또는 225Ac인 화합물.
  56. 제29항의 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  57. 면역조절 이상의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제29항의 화합물을 상기 면역조절 이상을 치료하는 데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 면역조절 이상을 치료하는 방법.
  58. 하기 화학식 (II)의 구조를 갖는 화합물, 또는 그의 금속 착물, 또는 그의 제약상 허용되는 염:
    Figure pct00129

    여기서,
    R1, R2, 및 R3은 각각 독립적으로 -L-U이고, W는 H 또는 -L1-Z1-L2-Z2-B이고,
    여기서,
    L은 C=O 또는 -CH(R)-이고, 여기서 R은 H, 임의로 치환된 알킬, 임의로 치환된 헤테로알킬, 또는 -L1-Z1-L2-Z2-B이고;
    U는 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 카르복실산, 또는 임의로 치환된 포스폰산이거나; 또는 -L-U는 -L1-Z1-L2-Z2-B이고;
    R1-R3 중 적어도 하나는 임의로 치환된 헤테로아릴로서의 U를 갖고;
    여기서,
    L1은 결합, 임의로 치환된 C1-C6 알킬렌, 또는 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬렌이고;
    Z1은 결합, C=O(NR4), C=S(NR4), OC=O(NR4), NR4C=O(O), NR4C=O(NR4), -CH2PhC=O(NR4), -CH2Ph(NR4)C=O, 또는 -CH2Ph(NH)C=S(NR4)이고, 각각의 R4는 독립적으로 H, 임의로 치환된 C1-C6 알킬, 임의로 치환된 C1-C6 헤테로알킬, 또는 임의로 치환된 아릴 또는 헤테로아릴이고;
    L2는 임의로 치환된 C1-C50 알킬렌, 또는 임의로 치환된 C1-C50 헤테로알킬렌, 또는 C5-C20 폴리에틸렌 글리콜이고;
    Z2는 C=O, -NR'-(C=O)-, 또는 -NR'-(C=O)-R"이고, R'은 H 또는 C1-C6 알킬이고, R"은 C1-C20 알킬렌, C2-C20 헤테로알킬렌, 또는 아릴렌이고;
    B는 치료 모이어티, 표적화 모이어티 또는 가교기이다.
  59. 제58항에 있어서, U가 방사성금속에 배위할 수 있는 공여 모이어티이고, 여기서 공여 모이어티는 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 구조를 갖는 임의로 치환된 히드록시피리디논인 화합물:
    Figure pct00130

    여기서, V1은 삭제되거나, 융합된 아릴 또는 헤테로아릴, 융합된 카르보사이클 또는 헤테로사이클, 알킬, 에테르, 알콜, 산, 에스테르, 아미드, 포스포네이트 또는 술포네이트이고; V2는 H, 알킬 또는 아실이다.
  60. 제58항의 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  61. 면역조절 이상의 치료를 필요로 하는 대상체에게 제58항의 화합물을 상기 면역조절 이상을 치료하는 데 효과적인 양으로 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상체에서 면역조절 이상을 치료하는 방법.
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