KR20220136919A - 면역세포 조성물을 생산하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 종양침윤림프구를 포함하는 면역세포 조성물을 생산하는 방법, 및 이를 통해 생산된 면역세포 조성물의 용도에 관한 것이다.
Description
본 출원은 면역세포 조성물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)을 포함하는 면역세포 조성물을 생산하는 방법에 관한 것이다.
암을 치료하는 방법 중 하나로 면역항암요법이 존재하며, 이 방법은 인체의 면역체계를 활성화시켜 암을 치료하는 방법이다. 면역항암요법에 사용되는 면역항암제로 면역세포치료제가 존재하는데, 면역세포치료제는 체내의 면역세포를 채집하여 강화시키거나 유전공학적으로 변형시켜 다시 넣어주는 세포치료 방식이다.
이러한 세포치료 방식 중의 하나로 종양 침윤 림프구를 이용하는 방법이 있는데, 이 때, 종양 침윤 림프구(Tumor infiltrating lymphocytes, TIL)는 암세포 주위에 모여 있는 림프구를 지칭한다. TIL을 이용한 치료는 환자의 종양에 침투한 자연 발생 T세포를 채취한 뒤 T세포를 활성화하고 증폭시키는 과정을 거친다. 이 과정을 거쳐 증폭된 많은 수의 활성화된 T 세포는 환자에게 재주입 되어 종양을 파괴한다.
즉, 종양 침윤 림프구를 이용한 암 치료에는 TIL을 배양 및 증폭시키는 과정이 필수적이다. 그러나 종양 조직에서 TIL을 분리, 배양, 증폭시키는 과정이 까다롭고, 보다 높은 수율로 TIL을 증폭시키는데 어려움이 존재한다. 따라서 TIL의 배양 및 증폭을 위한 보다 효율적인 공정이 필요하며, 본 출원은 높은 수율로 면역세포 조성물을 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.
본 출원에서는 기존의 낮은 수율을 가지는 생산 방법과 비교하여 효율적으로 높은 수율의 면역세포 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
일 실시양태로, 본 출원에서는 효율적으로 면역세포를 배양, 증폭시키기 위한 방법을 제공한다.
구체적인 일 실시양태로, 본 출원에서는 효율적으로 종양 침윤 림프구를 배양, 증폭시키기 위한 방법을 제공한다.
본 출원의 일 실시양태로, 면역세포 조성물을 생산하는 방법이 제공된다.
본 출원의 일 실시양태로, 종양침윤림프구를 포함하는 면역세포 조성물이 제공된다.
본 출원의 일 실시양태로, 종양침윤림프구를 포함하는 면역세포 조성물의 용도가 제공된다.
본 출원에서 제공하는 면역세포 조성물을 생산하는 방법은 종래의 면역세포 조성물 생산 방법과 비교해 높은 효율성을 가진다. 구체적으로, 종래의 면역세포 조성물 생산 방법과 비교해 낮은 농도의 IL-2가 이용되며, 높은 수율로 면역세포가 수득될 수 있다.
도 1 내지 4는 면역세포 조성물 생산을 위한 프로세스의 예시를 나타낸다.
도 1은 반제품(샘플로부터 면역세포 집단을 분리 및 배양하는 단계를 거쳐 생산 및 수득된 제1 면역세포 집단)을 생산하는 프로세스를 나타낸다.
도 2는 동결 보존된 반제품으로부터 완제품(제2 면역세포 집단으로부터 증폭된 제3 면역세포 집단을 수득하여 생산된 면역세포 조성물)을 생산하는 프로세스를 나타낸다.
도 3은 종양 샘플로부터 완제품을 생산하는 프로세스를 나타내며, 이때 프로세스는 동결 보존 단계를 포함하는 예시이다.
도 4는 종양 샘플로부터 완제품을 생산하는 프로세스를 나타내며, 이때 프로세스는 동결 보존 단계를 포함하지 않는 예시이다.
도 5는 TIL의 증폭 수율을 측정한 실험 결과이다.
도 6내지 7은 TIL의 생산 과정에서 IL-2 농도의 최적화를 위한 실험 결과이다.
도 6은 TIL의 배양 단계에서 IL-2 농도의 최적화를 위한 실험 결과를 나타낸다.
도 7은 TIL의 증폭 단계에서 IL-2 농도의 최적화를 위한 실험결과를 나타낸다.
도 8은 배양에 사용되는 조성물의 부피에 따른 TIL의 세포 증식율의 실험결과를 나타낸다.
도 9는 TIL의 배양 단계에서, 종양 조각당 배양되는 세포의 수를 측정한 실험결과를 나타낸다.
도 10은 배양 및 증폭된 TIL에서 T 세포 비율을 확인한 결과이다.
도 11은 종양 샘플로부터 TIL을 분리 배양 및 대량 배양(증폭)하는 프로세스의 대표적인 한 예시를 나타낸다.
도 12는 동결보존 및 해동된 반제품으로부터 증폭된 TIL(샘플번호 BC16208)에서 CD8+ T cell 및 CD4+ T cell의 비율을 확인한 결과이다.
도 13은 도12에서 확인된 상기 CD4+ T cell 및 CD8+ T cell에서 T cell의 타입을 확인한 결과이다.
도 14는 동결보존 및 해동된 반제품으로부터 증폭된 TIL(샘플번호 BC17058)에서 CD8+ T cell 및 CD4+ T cell의 비율을 확인한 결과이다.
도 15는 도14에서 확인된 상기 CD4+ T cell 및 CD8+ T cell에서 T cell의 타입을 확인한 결과이다.
도 16은 동결보존 및 해동된 반제품으로부터 증폭된 TIL(샘플번호 BC18050)에서 CD8+ T cell 및 CD4+ T cell의 비율을 확인한 결과이다.
도 17은 도 16에서 확인된 상기 CD4+ T cell 및 CD8+ T cell에서 T cell의 타입을 확인한 결과이다.
도 18 및 19는 동결보존 및 해동된 반제품으로부터 증폭된 TIL(샘플번호 BC16028)에 존재하는 면역세포들의 비율을 확인한 결과이다.
도 20 및 21은 동결보존 및 해동된 반제품으로부터 증폭된 TIL(샘플번호 BC17058)에 존재하는 면역세포들의 비율을 확인한 결과이다.
도 22 및 23은 동결보존 및 해동된 반제품으로부터 증폭된 TIL(샘플번호 BC18050)에 존재하는 면역세포들의 비율을 확인한 결과이다.
도 24은 TIL 투여 후 각 그룹에서 마우스의 몸무게 변화를 확인한 결과이다.
도 25는 TIL 및 IL-2의 병용 투여 후 각 그룹에서 마우스의 몸무게 변화를 확인한 결과이다.
도 26, 27, 28, 및 29는 TIL 투여 후 각 그룹에서 마우스의 종양의 크기 변화를 확인한 결과이다.
도 30 및 31은 TIL 투여 후 38일째 마우스를 안락사시키고, 종양을 적출하여 각 그룹에서의 종양의 크기를 확인한 결과이다.
도 32, 33, 34, 및 35는 TIL 및 IL-2의 병용 투여 후 각 그룹에서 마우스의 종양의 크기 변화를 확인한 결과이다.
도 36 및 37은 TIL 투여 후 38일째 마우스를 안락사시키고, 종양을 적출하여 각 그룹에서의 종양의 크기를 확인한 결과이다.
도 38은 TIL 및 IL-2의 병용 투여 후 각 그룹에서 마우스의 몸무게 변화를 확인한 결과이다.
도 39, 40, 41, 및 42는 TIL 및 IL-2의 병용 투여 후 각 그룹에서 마우스의 종양의 크기 변화를 확인한 결과이다.
도 43은 TIL 및 IL-2의 병용 투여 후 70일째 마우스를 안락사시키고, 종양을 적출하여 각 그룹에서의 종양의 크기를 확인한 결과이다.
도 1은 반제품(샘플로부터 면역세포 집단을 분리 및 배양하는 단계를 거쳐 생산 및 수득된 제1 면역세포 집단)을 생산하는 프로세스를 나타낸다.
도 2는 동결 보존된 반제품으로부터 완제품(제2 면역세포 집단으로부터 증폭된 제3 면역세포 집단을 수득하여 생산된 면역세포 조성물)을 생산하는 프로세스를 나타낸다.
도 3은 종양 샘플로부터 완제품을 생산하는 프로세스를 나타내며, 이때 프로세스는 동결 보존 단계를 포함하는 예시이다.
도 4는 종양 샘플로부터 완제품을 생산하는 프로세스를 나타내며, 이때 프로세스는 동결 보존 단계를 포함하지 않는 예시이다.
도 5는 TIL의 증폭 수율을 측정한 실험 결과이다.
도 6내지 7은 TIL의 생산 과정에서 IL-2 농도의 최적화를 위한 실험 결과이다.
도 6은 TIL의 배양 단계에서 IL-2 농도의 최적화를 위한 실험 결과를 나타낸다.
도 7은 TIL의 증폭 단계에서 IL-2 농도의 최적화를 위한 실험결과를 나타낸다.
도 8은 배양에 사용되는 조성물의 부피에 따른 TIL의 세포 증식율의 실험결과를 나타낸다.
도 9는 TIL의 배양 단계에서, 종양 조각당 배양되는 세포의 수를 측정한 실험결과를 나타낸다.
도 10은 배양 및 증폭된 TIL에서 T 세포 비율을 확인한 결과이다.
도 11은 종양 샘플로부터 TIL을 분리 배양 및 대량 배양(증폭)하는 프로세스의 대표적인 한 예시를 나타낸다.
도 12는 동결보존 및 해동된 반제품으로부터 증폭된 TIL(샘플번호 BC16208)에서 CD8+ T cell 및 CD4+ T cell의 비율을 확인한 결과이다.
도 13은 도12에서 확인된 상기 CD4+ T cell 및 CD8+ T cell에서 T cell의 타입을 확인한 결과이다.
도 14는 동결보존 및 해동된 반제품으로부터 증폭된 TIL(샘플번호 BC17058)에서 CD8+ T cell 및 CD4+ T cell의 비율을 확인한 결과이다.
도 15는 도14에서 확인된 상기 CD4+ T cell 및 CD8+ T cell에서 T cell의 타입을 확인한 결과이다.
도 16은 동결보존 및 해동된 반제품으로부터 증폭된 TIL(샘플번호 BC18050)에서 CD8+ T cell 및 CD4+ T cell의 비율을 확인한 결과이다.
도 17은 도 16에서 확인된 상기 CD4+ T cell 및 CD8+ T cell에서 T cell의 타입을 확인한 결과이다.
도 18 및 19는 동결보존 및 해동된 반제품으로부터 증폭된 TIL(샘플번호 BC16028)에 존재하는 면역세포들의 비율을 확인한 결과이다.
도 20 및 21은 동결보존 및 해동된 반제품으로부터 증폭된 TIL(샘플번호 BC17058)에 존재하는 면역세포들의 비율을 확인한 결과이다.
도 22 및 23은 동결보존 및 해동된 반제품으로부터 증폭된 TIL(샘플번호 BC18050)에 존재하는 면역세포들의 비율을 확인한 결과이다.
도 24은 TIL 투여 후 각 그룹에서 마우스의 몸무게 변화를 확인한 결과이다.
도 25는 TIL 및 IL-2의 병용 투여 후 각 그룹에서 마우스의 몸무게 변화를 확인한 결과이다.
도 26, 27, 28, 및 29는 TIL 투여 후 각 그룹에서 마우스의 종양의 크기 변화를 확인한 결과이다.
도 30 및 31은 TIL 투여 후 38일째 마우스를 안락사시키고, 종양을 적출하여 각 그룹에서의 종양의 크기를 확인한 결과이다.
도 32, 33, 34, 및 35는 TIL 및 IL-2의 병용 투여 후 각 그룹에서 마우스의 종양의 크기 변화를 확인한 결과이다.
도 36 및 37은 TIL 투여 후 38일째 마우스를 안락사시키고, 종양을 적출하여 각 그룹에서의 종양의 크기를 확인한 결과이다.
도 38은 TIL 및 IL-2의 병용 투여 후 각 그룹에서 마우스의 몸무게 변화를 확인한 결과이다.
도 39, 40, 41, 및 42는 TIL 및 IL-2의 병용 투여 후 각 그룹에서 마우스의 종양의 크기 변화를 확인한 결과이다.
도 43은 TIL 및 IL-2의 병용 투여 후 70일째 마우스를 안락사시키고, 종양을 적출하여 각 그룹에서의 종양의 크기를 확인한 결과이다.
본 출원의 일 실시양태로, 면역세포 조성물을 생산하는 방법이 제공된다.
본 출원의 일 실시양태로, 본 출원의 일 실시양태에 따른 방법에 의해 생산된 면역세포 조성물이 제공된다.
본 출원의 일 실시양태로, 대상의 암을 치료하기 위한 면역세포 조성물의 용도가 제공된다.
본 출원의 일 실시양태로, 면역세포 조성물을 이용하여 대상의 암을 치료하는 방법이 제공된다. 하기에서 구체적으로 개시한다.
본 출원의 일 실시양태로, 다음을 포함하는 면역세포 조성물을 생산하는 방법이 제공된다:
(a) 제1 컨테이너에서 종양 샘플을 배양함,
이때 상기 종양 샘플은 상기 제1 컨테이너에서 제1 조성물 내에서 배양되고, 여기서 제1 조성물은 배지, 세럼, 및 500 내지 1500 IU/ml 의 IL-2를 포함하고,
이때 상기 제1 컨테이너는 가스 투과성 컨테이너이거나, 가스 공급 시스템을 포함하는 컨테이너이고,
이때 상기 배양은 13일 내지 15일 동안 수행되고,
이때 상기 배양 동안 제1 첨가 조성물이 1회 또는 2회 이상 상기 제1 컨테이너로 첨가되며, 상기 제1 첨가 조성물은 배지, 세럼, 및 IL-2를 포함하고;
(b) 상기 (a)에서 수득한 배양물로부터 제1 면역세포 집단을 수득함;
(c) 제2 컨테이너에 제2 조성물 및 제2 면역세포 집단을 파종함,
이때 상기 제2 면역세포 집단은 제1 면역세포 집단으로부터 유래되고,
이때 상기 제2 조성물은 배지, 세럼, 1000 내지 3000 IU/ml의 IL-2, 항-CD3 항체, 및 피더 세포를 포함하고,
이때 상기 제2 컨테이너는 가스 투과성 컨테이너이거나, 가스 공급 시스템을 포함하는 컨테이너임;
(d) 제3 면역세포 집단을 생산하기 위해 상기 제2 면역세포 집단을 증폭함,
이때 상기 증폭 동안, 제2 첨가 조성물이 1회 또는 2회 이상 상기 제2 컨테이너로 첨가되고, 상기 제2 첨가 조성물은 배지, 세럼, 및 IL-2를 포함하고,
상기 증폭은 13일 내지 15일 동안 수행됨; 및
(e) 상기 (d)에서 증폭된 증폭물로부터 제3 면역세포 집단을 수득하고 면역세포 조성물을 생산함,
이때 상기 제3 면역세포 집단은 상기 제2 면역세포 집단과 비교하여 적어도 2500배 이상의 수의 세포를 가짐.
일 실시양태에서, 상기 방법은 종양 샘플을 준비함을 더 포함하고, 이때 상기 종양 샘플을 준비함은 (a) 이전에 수행될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 (a)에서, 상기 종양 샘플은 대상으로부터 수득 된 종양 조각으로부터 수득되고, 이때 상기 종양 샘플은 약 1mm2 내지 4mm2 면적의 단면을 가질 수 있다.
일 실시양태에서, (a)에서 12개 내지 24개의 상기 종양 샘플이 배양될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제1 조성물의 상기 세럼의 농도는 5 부피% 이하일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제1 조성물의 상기 세럼의 농도는 약 3 부피%일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제1 조성물의 상기 배지는 CTS-AIM-V 배지일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제1 조성물의 상기 IL-2의 농도는 약 1000IU/ml일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제1 조성물의 부피는 상기 제1 컨테이너의 최대 허용 가능한 용량의 30% 이하일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제1 컨테이너가 T75 플라스크인 경우, 상기 제1 조성물의 부피는 6ml일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제1 첨가 조성물은 상기 제1 조성물과 동일한 조성물질 및 조성비를 갖는 조성물일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제1 첨가 조성물의 IL-2의 농도는 약 1000IU/ml 이고, 상기 제1 첨가 조성물의 세럼의 농도는 약 3 부피% 이고, 상기 제1 첨가 조성물의 배지는 CTS-AIM-V 배지일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 배양 동안, 상기 제1 첨가 조성물은 2회 이상 상기 제1 컨테이너로 첨가될 수 있다.
이때, 일 실시양태에서, 상기 배양 동안, 상기 제1 첨가 조성물은 배양 시작일로부터 7, 10, 12일째에 상기 제1 컨테이너로 첨가되고, 이때 첨가되는 상기 제1 첨가 조성물의 양은 보충 시점마다 동일할 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제2 면역세포 집단은 상기 제1 면역세포 집단으로부터 수득될 수 있다.
이때, 일 실시양태에서, 상기 제2 면역세포 집단은 제1 면역세포 집단을 세척함을 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제2 조성물의 배지는 CTS-AIM-V 일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제2 조성물의 상기 세럼의 농도는 5 부피% 이하일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제2 조성물의 상기 세럼의 농도는 약 3 부피%일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제2 조성물의 상기 IL-2의 농도는 약 2000IU/ml 일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 항-CD3 항체는 OKT3 일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제2 조성물의 상기 항-CD3 항체의 농도는 10ng/ml 내지 100ng/ml 일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제2 조성물의 상기 항-CD3 항체의 농도는 약 30ng/ml 일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 피더세포는 불활성화된 동종이형 말초혈액단핵세포일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 피더세포는 세포 수가 상기 제2 면역세포집단의 세포 수를 기준으로 약 1:200 (제2 면역세포 집단의 세포 수: 피더세포) 이 되도록 상기 제2 조성물에 포함될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 파종함에서, 상기 제2 컨테이너에 파종되는 상기 제2 면역세포 집단의 세포 수는 1E5 내지 10E5일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 파종함에서, 상기 제2 컨테이너에 파종되는 상기 제2 면역세포 집단의 세포 수는 약 4E5 일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제2 조성물의 부피는 상기 제2 컨테이너의 최대 허용가능한 용량의 30% 이하일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제2 컨테이너가 GREX100M 인 경우, 상기 제2 조성물의 부피는 약 20ml일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 증폭 동안, 면역세포는 상기 제2 컨테이너로부터 제거되거나 외부로부터 추가되지 않을 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제2 첨가 조성물은 상기 제2 조성물에서 상기 항-CD3 항체 및 상기 피더세포를 제외한 것과 같은 조성물질 및 조성비를 갖는 조성물일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제2 첨가 조성물의 IL-2의 농도는 약 2000IU/mL 이고, 상기 제2 첨가 조성물의 세럼의 농도는 약 3 부피% 이고, 상기 제2 첨가 조성물의 배지는 CTS-AIM-V일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 증폭 동안, 상기 제2 첨가 조성물은 2회 이상 제2 컨테이너에 첨가될 수 있다.
이때, 일 실시양태에서, 첨가되는 상기 제2 첨가 조성물의 양은 보충 시점마다 서로 다른 양일 수 있다.
이때, 일 실시양태에서, 상기 증폭 동안, 상기 제2 첨가 조성물은 증폭 시작일로부터 4, 6, 8, 및 10일째 상기 제2 컨테이너에 첨가되고, 이때 첨가되는 상기 제2 첨가 조성물의 양은 보충 시점마다 점점 증가될 수 있다.
이때, 일 실시양태에서, 상기 제2 첨가 조성물은 증폭 시작일로부터 4일째 20ml, 6일째 60ml, 8일째 180ml, 및 10일째 540ml 로 상기 제2 컨테이너에 첨가될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제3 면역세포 집단은 상기 제2 면역세포 집단과 비교하여 적어도 4000배 이상의 수의 세포를 가질 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 면역세포 조성물은 상기 제3 면역세포 집단을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 면역세포 조성물은 상기 제3 면역세포 집단으로부터 수득된 제4 면역세포 집단을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 종양 샘플은 유방암, 대장암, 폐암, 위암, 신장암, 난소암, 또는 흑색종을 포함하는 피부암을 가지는 대상의 고형 종양으로부터 유래된 것일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 종양 샘플은 폐암을 가지는 대상의 악성 흉수로부터 유래된 것일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 방법은 상기 제1 면역세포 집단을 동결보존함; 및 상기 동결보존된 제1 면역세포 집단을 해동함을 더 포함하고, 이때, 상기 제1 면역세포 집단을 동결보존함; 및 상기 동결 보존된 제1 면역세포 집단을 해동함은 (b) 이후에 수행될 수 있다.
본 출원의 일 실시양태로, 종양침윤림프구를 포함하는 면역세포 조성물이 제공된다.
일 실시양태에서, 상기 면역세포 조성물은 본 출원의 일 실시양태에 따른 면역세포 조성물을 생산하는 방법에 의해 생산된 것일 수 있다.
본 출원의 일 실시양태로, 본 출원의 일 실시양태에 따른 면역세포 조성물을 생산하는 방법에 의해 생산된, 종양침윤림프구를 포함하는 면역세포 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 대상의 종양을 치료하는 방법이 제공된다.
일 실시양태에서, 상기 대상은 상기 종양침윤림프구가 유래된 대상일 수 있다.
본 출원의 일 실시양태로, 본 출원의 일 실시양태에 따른 면역세포 조성물을 생산하는 방법에 의해 생산된, 종양침윤림프구를 포함하는 면역세포 조성물의, 대상의 암을 치료하기 위한 용도가 제공된다.
일 실시양태에서, 상기 대상은 상기 종양침윤림프구가 유래된 대상일 수 있다.
이하, 첨부된 도면을 참조하여, 발명의 내용을 특정한 실시 양태와 예시들을 통해 더욱 상세하게 설명한다. 상기 첨부된 도면은 발명의 일부 실시 양태를 포함하지만, 모든 실시 양태를 포함하고 있지는 않다는 점에 유의해야 한다. 본 출원에 의해 개시되는 발명의 내용은 다양하게 구현될 수 있으며, 여기에 설명되는 특정한 실시 양태로 제한되지 않는다. 본 출원에 개시된 발명이 속한 기술분야에 있어 통상의 기술자라면, 본 출원에 개시된 발명의 내용에 대한 많은 변형 및 다른 실시 양태들을 떠올릴 수 있을 것이다. 따라서, 본 출원에서 개시된 발명의 내용은 여기에 기재된 특정 실시 양태로 제한되지 않으며, 이에 대한 변형 및 다른 실시 양태들도 청구범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
[용어의 정의]
면역(세포) 조성물(immune (cell) composition)
본 출원에서 사용되는 면역세포 조성물(immune cell composition) 또는 면역 조성물(immune composition) 은 면역세포 집단을 포함하는 조성물을 의미한다. 상기 면역세포는 본 출원에서 종양 침윤 림프구를 포함하는 용어로 사용된다. 상기 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte, TIL)는 종양으로 이동하여 종양 주변에 서식하는 면역세포를 의미한다. 상기 종양 침윤 림프구는 암세포를 인식하고 죽일 수 있다. 상기 종양 침윤 림프구는 T 세포, B 세포, 자연살해세포 등 다양한 면역세포들을 포함할 수 있다. 종양 침윤 림프구에서는 T 세포가 대부분의 비율을 차지하는 것으로 알려져 있다.
반제품(half-product)
본 출원에서 개시하는 면역세포 조성물을 생산하는 방법은 반제품을 생산하는 과정을 포함할 수 있다. 이 때, 상기 반제품은 샘플로부터 면역세포 집단을 분리 및 배양하는 단계를 거쳐 생산 및 수득된 제1 면역세포 집단을 의미한다. 면역세포치료제 기술 분야의 통상적 용어에 의하면 반제품이란 pre-REP(pre-Rapid Expansion Protocol)에 의하여 제조되는 면역세포 집단을 의미한다. 즉, 면역세포치료제 기술 분야에서 사용되는 통상적인 용어에 의하면, 반제품은 pre-REP 프로덕트(pre-REP product)로 지칭될 수 있다.
완제품(complete product)
본 출원에서 개시하는 면역세포 조성물을 생산하는 방법은 완제품을 생산하는 과정을 포함할 수 있다. 이 때, 상기 완제품은 제2 면역세포 집단으로부터 증폭된 제3 면역세포 집단을 수득하여 생산된 면역세포 조성물 또는 면역 조성물을 의미한다. 면역세포치료제 기술 분야의 통상적 용어에 의하면 완제품이란 REP(Rapid expansion Protocol)에 의하여 제조되는 면역세포 집단을 의미한다. 즉, 면역세포치료제 기술 분야에서 사용되는 통상적인 용어에 의하면, 완제품은 REP 프로덕트 (REP product)로 지칭될 수 있다. 또는, 의약 프로덕트(drug product)로 지칭될 수 있다.
대상(subject)
본 출원에서 사용되는 대상은 종양을 가지는 개체를 의미하며, 인간을 포함한다. 상기 종양은 고형 종양 및 액상 종양을 포함한다. 상기 고형 종양은 폐, 유방, 방광, 난소 등의 종양을 포함하고, 상기 액상 종양은 백혈병, 골수종, 림프종 등의 혈액학적 종양 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
컨테이너(container)
본 출원에서 사용되는 컨테이너는 종양 조직 또는 종양 샘플을 배양하거나, 면역세포 집단을 증폭하는데 이용되는 용기를 의미한다. 본 출원에서 컨테이너는 배지, 세럼, 플라즈마, IL-2, OKT3 및/또는 피더 세포를 포함하는 조성물과 함께 종양 조직 또는 면역세포 집단을 배양 또는 증폭하는데 사용된다. 상기 컨테이너는 가스가 투과되는 가스투과성 컨테이너이거나, 또는 가스 공급 시스템을 포함하여 가스가 공급되는 컨테이너일 수 있다. 즉 상기 컨테이너는 컨테이너 그 자체로 가스가 투과되도록 제작되어 가스가 투과되는 컨테이너일 수 있고, 또는 컨테이너 그 자체가 가스가 투과되도록 제작되지 않았지만, 별도의 가스 공급 시스템을 포함하여 가스가 투과되도록 제작된 컨테이너일 수 있다. 컨테이너는 예를 들어, 24웰 플레이트, T25, T75, T125 플라스크, GREX 10, GREX 10M, GREX 10M-CS GREX 100, GREX 100M, GREX 100M-CS, GREX 500, GREX 500M, GREX 500M-CS 플라스크 등의 플라스크 또는 배양백 (culture bag)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
배지
본 출원에서 사용되는 배지는 세포 및/또는 조직을 배양하기 위한 영양원을 의미한다. 상기 배지는 배양할 대상의 종류에 따라 각기 다른 종류가 사용될 수 있다. 상기 배지는 AlyS505N, AIM-V 배지, RPMI 배지 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 일 실시예에서는 세럼, 플라즈마, IL-2, OKT3 및/또는 피더 세포를 상기 배지에 보충하여 조직 및/또는 면역세포의 배양 및/또는 증폭에 사용한다.
세럼(serum)
본 출원에서 '세럼' 또는 '혈청'은 기본 배양 배지에 첨가되는 첨가제를 의미하며, 상기 세럼은 고분자 단백질, 저분자 영양분 등을 함유하고 있으며, 세포의 성장에 필요한 성분들을 함유하고 있다. 상기 세럼은 상업적으로 판매되는 인간 AB 세럼을 포함하는 인간 세럼을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이 때, 배지 내 세럼의 농도는 약 10 부피% 이하, 약 9부피% 이하, 약 8 부피% 이하, 약 7 부피% 이하, 약 6 부피% 이하, 약 5 부피% 이하, 약 4부피% 이하 또는 3부피% 이하로 첨가될 수 있다.
플라즈마(plasma)
본 출원에서 '플라즈마' 또는 '혈장'은 기본 배양 배지에 첨가되는 첨가제를 의미하며, 상기 플라즈마는 세럼에서 피브리노겐이 제외된 것을 의미한다. 상기 플라즈마는 세포의 성장에 필요한 성분들을 함유하고 있다. 본 출원에서 사용되는 플라즈마는 환자의 혈액에서 분리한 플라즈마를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 출원에서, 플라즈마는 세럼 대신에 배지에 포함되어 사용될 수 있다. 이 때, 배지 내 플라즈마의 농도는 약 10 부피% 이하, 약 9부피% 이하, 약 8 부피% 이하, 약 7 부피% 이하, 약 6 부피% 이하, 약 5 부피% 이하, 약 4부피% 이하 또는 3부피% 이하로 첨가될 수 있다.
IL-2
본 출원에서 사용되는 용어IL-2는 인터루킨(Interleukin)-2의 약어로 T 세포 증식을 촉진하는 인자를 의미한다. 상기 IL-2는 인간 재조합 IL-2 형태를 포함한 다양한 형태의 IL-2를 포함한다. 본 출원에서는 제1 조성물에 IL-2가 포함될 수 있고, 이 때 IL-2의 농도는 약 10000IU/mL, 약 9000IU/mL, 약 8000IU/mL, 약 7000IU/mL, 약 6000IU/mL, 약 5000IU/mL, 약 4000IU/mL, 약 3000IU/mL, 약 2000IU/mL, 약 1000IU/mL 또는 약 500IU/mL 일 수 있다. 또한, 본 출원에서는 제2 조성물에 OKT3, 피더세포와 함께 IL-2가 포함될 수 있고, 이 때, IL-2의 농도는 약 10000IU/mL, 약 9000IU/mL, 약 8000IU/mL, 약 7000IU/mL, 약 6000IU/mL, 약 5000IU/mL, 약 4000IU/mL, 약 3000IU/mL, 약 2000IU/mL, 약 1000IU/mL 또는 약 500IU/mL 일 수 있다.
면역세포 집단(immune cell population)
본 출원에서 사용되는 면역세포 집단은 다수의 면역세포로 이루어진 군(group or population)를 의미하고, 상기 면역세포는 종양 침윤 림프구를 포함한다. 이때, 제1 면역세포 집단은 한 대상의 종양 조직을 최초 배양하여 얻은 면역세포 집단을 의미하고, 제2 면역세포 집단은 제1 면역세포 집단에서 유래한, 필요에 따라 제1 면역세포 집단을 분할하여 이용하는 면역세포 집단을 의미하며, 제3 면역세포 집단은 제2 면역세포 집단을 증폭하여 얻은 면역세포 집단을 의미한다.
동결보존(cryopreserving)
본 출원에서 사용되는 동결보존은 면역세포의 손상을 억제하고 면역세포 집단을 장기간 보존하기 위해 초저온에서 보관하는 것을 의미한다. 예를 들어, 본 출원에서 동결 보존은 세포 또는 면역세포 집단 등을 액체 질소 탱크에서 보관함을 포함하는 과정을 의미하는 것으로 사용될 수 있다. 일 실시양태에서 상기 동결 보존 기간은 최장 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 6년, 약 7년, 약 8년, 약 9년, 약 10년, 약 11년, 약 12년, 약 13년, 약 14년, 약 15년, 약 16년, 약 17년, 약 18년, 약 19년, 또는 약 20년일 수 있다. 상기 면역세포 집단을 동결 보존하기 위하여, 동결 보존용 배지가 사용된다. 상기 동결 보존용 배지는 약 10%의 DMSO를 포함할 수 있으며, 상기 배지는 Cryostor CS10 배지를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 동결보존은 면역세포 조성물을 생산하는 방법의 각 단계 사이에 선택적으로 포함될 수 있다.
파종(seeding)
본 출원에서 사용되는 파종은 컨테이너에 세포를 분주하는 것을 의미하며, 상기 파종은 본 출원에서 제2 면역세포 집단을 제2 컨테이너에 분주하는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 제2 면역세포 집단의 파종은 약 2E4 세포/제2조성물mL로 현탁되어, 컨테이너의 종류에 따라 다른 양으로 분주 될 수 있다. 일 예시로, 상기 세포 현탁액은 GREX100M에 20mL분주되어, 제2 면역세포 집단은 약 4E5 세포수로 파종될 수 있다.
항-CD3항체
본 출원에서 사용되는 항-CD3항체는 T 세포 표면의 막 단백질인 CD3 수용체를 표적으로 하는 항체를 의미한다. 상기 항-CD3 항체는 OKT3를 포함하며, 또한, 인간, 인간화, 뮤린 항체를 포함한 모든 형태의 모노클로날(monoclonal), 폴리클로날(polyclonal) 항-CD3 항체를 포함한다. 본 출원에서 사용되는 OKT3는 인간, 인간화, 키메라, 또는 뮤린 항체를 비롯한 모노클로날 항체, 바이오시밀러 또는 이의 변이체를 모두 포함하는 것으로 사용된다. 다른 항-CD3 항체의 예로는 오테리시주맙(otelixizumab), 테플리주맙(teplizumab), 및 비실리주맙(visilizumab) 등이 있다.
피더 세포(feeder cell)
본 출원에서 사용되는 피더세포는 면역세포의 배양 또는 증폭을 위한 조성물에 포함되어, 면역세포를 활성화하고 증폭시키는 역할을 하는 세포를 의미한다. 예를 들어, 본 출원에서는 피더세포는 제2 조성물에 포함되어 제2 조성물의 면역세포를 활성화하고 증폭시키는데 사용될 수 있다. 상기 피더세포는 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 포함하고, 상기 말초 혈액 단핵세포는 둥근 핵을 가진 말초 혈액 세포를 의미한다. 본 출원에서 사용되는 말초 혈액 단핵세포는 방사선 조사된 동종이형 말초 혈액 단핵세포를 포함한다.
증폭(expanding)
본 출원에서 사용되는 증폭은 세포 집단 또는 면역세포 집단이 일정 기간 동안 일정 배수 이상으로 증가되는 것을 의미한다.
대략(approximately)
본 출원에서 사용되는 "대략" 또는 "약"은 통계적으로 유의미한 범위 내를 의미한다. 다르게 표현되지 않는 한, 본 출원에서 상기 용어 "대략" 또는 "약"은 주어진 값의 20% 또는 10% 내의 범위에 속하는 값을 가지는 것을 의미한다.
포함
본 출원에서 사용되는 포함이라는 용어는 임의적으로 추가되는 물질 또는 임의적으로 추가되는 단계를 배제하지 않는 것을 의미한다.
[면역세포 치료]
개요
암은 세포주기가 조절되지 않아 세포분열을 계속하는 질병으로, 그 종류로는 폐암, 유방암, 대장암 등이 있다. 최근, 암을 치료하는 방법 중 하나로 면역 항암 요법이 연구되고 있으며, 면역 항암 요법(Cancer immunotherapy)이란 인체의 면역체계를 활성화시켜 암을 치료하는 방법을 의미한다. 면역 항암 요법에 사용되는 면역항암제로 면역세포치료제가 존재하는데, 면역세포 치료제(immune cell therapy)는 체내의 면역세포를 채집하여 강화시키거나 유전공학적으로 변형시켜 다시 넣어주는 세포치료 방식이다.
이러한 방식을 입양세포치료(adoptive cell transfer, ACT)라 하고, 이를 분류하면 종양 침윤 림프구(Tumor infiltration lymphocytes, TIL)를 이용한 치료, 유전공학적으로 변형시킨 T세포를 이용하는 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)발현 T 세포 또는 키메릭 항원 수용체(chimeric antigen receptor, CAR)발현 T 세포를 이용한 치료가 있다. 본 출원의 일 실시예에서는 종양 침윤 림프구(Tumor infiltration lymphocytes, TIL)를 이용한 치료방법을 개시하고 있다.
종양 침윤 림프구(TIL) 및 이를 이용한 치료
종양 침윤 림프구는 암세포 주위에 모여 있는 림프구를 지칭한다. TIL을 이용한 치료는 “환자의 종양에 침투한” 자연 발생 T세포를 채취한 뒤 T세포를 활성화하고 증폭시킨 후, 증폭된 많은 수의 활성화된 T 세포를 환자에게 재주입하여 종양을 억제 또는 파괴하도록 하는 치료 방법이다.
종래의 면역세포 조성물 생산 방법
개요
면역세포 조성물을 생산하기 위한 공정 즉, 종양 침윤 림프구를 포함하는 면역세포 조성물 생산 공정은 일반적으로 아래의 단계를 거친다.
1
. 샘플 처리
일반적으로 종양 침윤 림프구를 포함하는 면역세포 조성물을 얻기 위해서, 샘플을 처리하는 단계를 처음으로 거친다. 이 때 상기 샘플은 환자로부터 얻은 종양 샘플을 의미하며, 상기 종양 샘플은 샘플 처리 단계에서 작은 조각으로 잘린다.
2. 배양
일반적으로 종양 샘플의 처리 단계 후, 수득한 작은 종양 조각(tumor fragment)은 상기 종양을 배양하기 위한 배지 안에서 배양된다. 일반적으로 상기 배양은 고농도의 IL-2를 포함하는 배지에서 이루어진다. 상기 배양 단계를 거쳐 첫번째 면역세포 집단이 수득된다.
3. 증폭
상기 배양 단계를 거친 첫번째 면역세포 집단은 증폭 단계를 거친다. 일반적으로 상기 증폭 단계는 REP(Rapid Expansion Protocol)라고 지칭될 수 있다. 상기 증폭 단계는 일반적으로 고농도의 IL-2, 항-CD3항체, 피더 세포가 포함된 배지에서 이루어진다.
4. 수득 및 제형화
상기 증폭 단계를 거친 면역세포 집단은 오염되지 않는 방식으로 수득되고, 환자에 투여하기에 적합한 용기로 옮겨져 제형화 된다.
[종래 기술의 한계점]
TIL을 이용하여 암을 치료하기 위해서는 먼저, 암 조직으로부터 TIL을 분리, 배양 및 증폭시켜야 한다. 암 조직으로부터 TIL을 분리, 배양한 후 증폭시키는 일련의 과정들은 상당히 까다롭고, 이러한 일련의 과정들은 TIL의 수율에 영향을 미칠 수 있다. 이로 인해, 기존의 방법은 각 과정들이 최적화 또는 표준화되지 않았거나 효율성이 낮음으로 인해 수율이 낮은 문제가 있다. 이를 극복하기 위해, 각 과정들을 최적화 및 표준화하여 종래의 방법보다 높은 효율성, 높은 수율을 가지는 방법을 만드는 것이 필요하다. 이에 따라, 본 출원에서 제공하는 면역세포 조성물 생산 방법은 일련의 각 과정들을 TIL 배양 및 증폭하는데 최적화 및 표준화되어 높은 수율의 TIL을 얻을 수 있도록 개발되었다.
[본 출원에서 개시하는 면역세포 조성물을 생산하는 방법 및 면역세포 조성물의 이용]
본 출원은 면역세포 조성물(면역 조성물)을 생산하는 방법을 개시한다.
일 실시양태에서, 본 출원의 면역세포 조성물을 생산하는 방법은 다음 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다:
반제품 생산; 동결 보존; 동결 보존된 제1 면역세포 집단을 해동; 및 완제품 생산.
일 실시양태에서, 면역세포 조성물을 생산하는 방법은 다음을 포함할 수 있다: 종양 샘플을 배양함; 제1 면역세포 집단을 수득함; 제2 면역세포 집단을 파종함; 제2 면역세포 집단을 증폭함; 및 면역세포 조성물을 생산함.
일 실시양태에서, 면역세포 조성물을 생산하는 방법은 다음을 포함할 수 있다: 종양 샘플을 배양함; 제1 면역세포 집단을 수득함; 제1 면역세포 집단을 동결보존함; 동결 보존된 제1 면역세포 집단을 해동함; 제2 면역세포 집단을 파종함; 제2 면역세포 집단을 증폭함; 및 면역세포 조성물을 생산함.
하기에서, 본 출원의 면역세포 조성물을 생산하는 방법에 포함될 수 있는 각 과정에 대하여 상세히 개시한다.
Ⅰ. 반제품 생산
본 출원에서 개시하는 면역세포 조성물을 생산하는 방법은 반제품을 생산하는 과정 및/또는 완제품을 생산하는 과정을 포함할 수 있다. 이 때, 상기 반제품은 종양 샘플을 배양하고, 배양된 조성물로부터 수득된 제1 면역세포 집단을 의미한다. 상기 반제품을 생산하는 과정은 아래에 기재된 내용을 포함할 수 있다. 본 단계는 면역세포치료제 기술 분야의 통상적 용어에 의하면 pre-REP(pre-Rapid Expansion Protocol)에 대응될 수 있다.
일 실시양태에서, 반제품 생산은 다음을 포함할 수 있다:
종양 샘플을 배양함; 및
제1 면역세포 집단을 수득함.
일 실시양태에서, 반제품 생산은 종양 샘플을 준비함을 더 포함할 수 있다. 이때 상기 종양 샘플을 준비함은 종양 샘플을 배양하는 과정 이전에 수행된다.
이하에서 반제품 생산에 포함되는 각 과정에 대하여 구체적으로 개시한다.
1. 종양 샘플을 준비함
개요
제1 면역세포 집단을 수득하기 위해서는 먼저 종양 샘플이 준비되어야 한다. 이때 종양 샘플은 대상의 종양 조직으로부터 유래된 것인 바, 종양 샘플은 암세포 주위에 존재하는 특성을 지닌 종양침윤림프구를 포함하고 있다.
일 실시양태에서, 종양 샘플을 준비함은 대상으로부터 수득된 종양 조직을 처리하는 과정을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 대상으로부터 수득된 종양 조직은 별도의 처리 없이 종양 샘플로 사용될 수 있다.
하기에서 종양 샘플을 준비하는 과정에 대하여 구체적으로 개시한다.
종양 조직의 수득
종양 샘플 준비에 사용되는 종양 조직은 종양을 가지는 대상으로부터 수득된 것이다. 이때 상기 종양을 가지는 대상은 종양을 가지는 인간을 포함할 수 있다. 상기 종양 조직의 수득은 본 발명의 실시자가 직접적으로 수행할 수도 있고, 또는 종양 조직을 병원으로부터 수득하여 이루어질 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 종양 조직은 고형 종양 또는 액상 종양을 가지는 인간으로부터 얻어질 수 있다. 상기 고형 종양을 가지는 인간은 예를 들어, 유방암, 대장암, 폐암, 위암, 신장암, 난소암, 또는 흑색종을 포함하는 피부암 환자 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 액상 종양을 가지는 인간은 예를 들어, 백혈병, 또는 림프종을 포함하는 혈액암 환자 등 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이때 상기 종양 조직은 종양침윤림프구(Tumor infiltrating lymphocyte)를 포함한다.
종양 조직은 다양한 경로를 통해 대상으로부터 채취된 것이다. 예를 들어, 종양 조직은 상기 대상(예를 들어, 암 환자)의 종양을 채취하여 얻어진 것일 수 있다. 다른 예로, 종양 조직은 암 환자들에게서 관찰되는 악성 흉수를 채취하여 얻어진 것일 수 있다. 구체적인 예로, 폐암 환자의 경우, 환자의 흉수를 채취하여 대상으로부터 수득된 종양 조직이 얻어질 수 있다.
상기 종양 조직은 당업계의 공지된 방법들을 통해 얻어질 수 있다. 일 실시 양태에서, 상기 종양 조직은 생검을 통해 얻어질 수 있다. 상기 생검은 종양의 일부를 절제하는 절제 생검, 주사기의 바늘로 채취하는 흡인 생검 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 상기 종양 조직은 생검 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 방법들을 통해 얻어질 수 있다. 일 실시양태로, 상기 종양 조직은 유방암 및/또는 폐암 환자의 종양 일부를 절제하는 절제 생검을 통해 얻어질 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 종양 조직은 유방암 및/또는 폐암 환자로부터 얻은 유방암 조직 및 또는 폐암 조직일 수 있다.
종양 조직의 처리
일 실시양태에서, 대상으로부터 수득된 종양 조직은 별도의 처리 과정을 거친 후 종양 샘플로 제조될 수 있거나, 또는 별도의 처리 과정 없이 종양 샘플로 사용될 수 있다.
하기에서는 종양 조직의 처리에 대하여 구체적으로 개시한다.
일 실시양태에서, 종양 조직의 처리는 세척, 지방 조직의 제거, 및/또는 작은 조각으로 만듦의 과정을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
1) 세척
상기 종양 조직의 처리는 종양 조직을 세척하는 과정을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 세척 과정은 종양 조직을 배지를 이용하여 세척하는 것을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 세척 과정은 항생제가 포함되어 있는 운반 배지로 옮겨진 종양 조직에서 항생제를 제거하는 것을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 종양 조직은 배지를 이용하여 1, 2, 3, 4, 또는 5회 이상 세척될 수 있다. 특정한 실시 양태에서, 상기 종양 샘플은 배지를 이용하여 2, 또는 3회 세척될 수 있다.
일 실시양태에서, 종양 조직은 항생제가 포함되지 않은 배지를 이용하여 세척될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 종양 조직은 항생제가 포함되지 않은 RPMI1640 배지를 이용하여 세척될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 종양 조직은 항생제가 포함되지 않은 RPMI1640 배지를 이용하여 3회 세척될 수 있다.
2) 지방 조직의 제거
상기 종양 조직의 처리는 지방 조직을 제거하는 과정을 포함할 수 있다. 이때, 지방 조직을 제거하는 과정은 상기 종양 샘플이 지방을 많이 함유하고 있는지 여부에 따라 수행되거나, 또는 생략될 수 있다. 상기 지방 조직 제거 과정은 상기 종양 조직으로부터 지방 조직을 떼어내는 것을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 지방 조직의 제거는 핀셋과 가위를 이용하여 수행될 수 있다.
3) 종양 조직을 작은 조각으로 만듦
상기 종양 조직의 처리는 종양 조직을 작은 조각으로 만드는 과정을 포함할 수 있다. 종양 조직은 커터(예를 들어 가위 또는 칼 등)를 이용하거나, 또는 소화효소를 포함하는 용액을 이용하여 작은 조각으로 만들어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시양태에서, 상기 종양 조직은 한 면의 폭(width)이 약 0.1 내지 약 10mm의 크기, 약 0.4 내지 약 5mm, 약 0.6 내지 약 4mm, 약 0.8 내지 약 3mm의 크기 또는 약 1mm 내지 약 2mm가 되도록 잘릴 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 종양 조직은 한 면의 폭이 약 1mm 내지 약 2mm가 되도록 잘릴 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 종양 조직은 단면의 면적이 약 0.01 내지 약 100mm2, 약 0.1 내지 약 50mm2, 약 0.2 내지 약 10mm2 내지, 약 0.5 내지 약 5mm2 내지, 약 0.7 내지 약 4mm2 또는 약 1 내지 약 2mm2의 크기로 잘릴 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 종양 조직은 단면의 면적이 약 1 내지 약 2mm2의 크기로 잘릴 수 있다.
다른 실시양태에서, 상기 종양 조직은 소화효소를 포함하는 소화액에 의해 작은 조각으로 되고, 이때 상기 종양 조직은 콜라게나제와 같은 효소를 포함하는 소화액에 의해 작은 조각으로 잘려질 수 있다.
2. 종양 샘플을 배양함
개요
본 단계에서, 종양 샘플을 배양한다.
일 실시양태에서, 종양 샘플을 배양하여 제1 면역세포 집단이 생산될 수 있다. 종양 샘플을 배양하여 제1 면역세포 집단을 생산하는 과정을 아래에서 구체적으로 개시한다.
종양 샘플 배양
상기 종양 샘플은 제1 컨테이너 내의 제1 조성물에서 배양된다. 종양 샘플의 배양 과정을 거쳐 제1 면역세포 집단이 생산될 수 있다.
이때, 상기 종양 샘플은 배양에 적합한 환경에서 배양된다. 일 실시양태에서, 상기 종양 샘플은 37℃, 5% CO2 환경에서 배양될 수 있다.
1) 제1 컨테이너에 담겨지는 종양 샘플 조각 수
상기 잘려진 종양 샘플 조각은 제1컨테이너의 제1 조성물에 일정한 수로 담겨 배양된다. 이 때, 제1 컨테이너에 담겨지는 종양 샘플 조각의 수는 제1 컨테이너의 세포 배양 면적이나 부피에 따라 달라질 수 있다.
일 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 또는 50 개 조각의 종양 샘플이 제1 컨테이너에 담겨 배양될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 12, 16, 20, 24, 28, 또는 32 조각의 종양 샘플이 제1 컨테이너에 담겨 배양될 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 컨테이너가 T75 플라스크인 경우 12, 16, 20, 24, 28, 또는 32 조각의 종양 샘플이 상기 제1 컨테이너에 담겨 배양될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 컨테이너가 T75 플라스크인 경우 24 조각의 종양 샘플이 상기 제1 컨테이너에 담겨 배양될 수 있다.
2) 제1 컨테이너
상기 종양 샘플은 제1 컨테이너의 제1 조성물에서 배양되는데, 이 때 제1 컨테이너는 상기 종양 샘플을 배양하는데 이용되는 용기를 의미한다. 본 출원에서 제1 컨테이너는 배지, 세럼, IL-2를 포함하는 조성물과 함께 종양 샘플을 배양하는데 사용된다.
상기 컨테이너는 가스가 투과되는 가스투과성 컨테이너이거나, 또는 가스 공급 시스템을 포함하여 가스가 공급되는 컨테이너이다. 즉 상기 컨테이너는 컨테이너 그 자체로 가스가 투과되도록 제작되어 가스가 투과되는 컨테이너일 수 있고, 또는 컨테이너 그 자체가 가스가 투과되도록 제작되지 않았지만 별도의 가스 공급 시스템을 포함하여 가스가 투과되도록 제작된 컨테이너를 의미한다.
일 실시양태에서, 제1 컨테이너는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 10000 mL 의 최대 허용 가능한 용량을 갖는 컨테이너 이거나, 또는 전술한 값들 중 선택되는 두 값의 범위로 이루어지는 최대 허용 가능한 용량을 갖는 컨테이너일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 컨테이너는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 또는 100 mL 의 최대 허용 가능한 용량을 갖는 컨테이너 이거나, 또는 전술한 값들 중 선택되는 두 값에 의해 설정되는 범위의 최대 허용 가능한 용량을 갖는 컨테이너일 수 있다.
일 실시양태에서, 컨테이너는 예를 들어, 24웰 플레이트, T25, T75, T125 플라스크, GREX 10, GREX 10M, GREX 10M-CS GREX 100, GREX 100M, GREX 100M-CS, GREX 500, GREX 500M, GREX 500M-CS 플라스크 등의 플라스크 또는 배양백 (culture bag)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시양태에서, 종양 샘플은 T75 플라스크에서 배양될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 24 조각의 종양 샘플이 T75 플라스크에서 배양될 수 있다.
3) 제1 조성물
제1 컨테이너 내에서, 상기 종양 샘플은 제1 조성물에서 배양된다. 이 때 제1 조성물은 배양 배지, 세럼, 플라즈마, 항생제, IL-2, 및 항체 중 어느 하나 이상을 포함한다.
일 실시양태에서, 제1 조성물은 배지, 세럼, 및 IL-2를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 조성물은 배지, 플라즈마, 및 IL-2를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 조성물은 배지; 세럼 및 플라즈마 중 어느 하나; 및 IL-2를 포함하고, 항체 및 항생제 중 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 제1 조성물은 배지, 세럼, 및 IL-2를 포함한다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 조성물은 배지, 세럼, IL-2 및 항생제를 포함한다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 조성물은 배지, 세럼, IL-2 및 항체를 포함한다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 조성물은 배지, 세럼, IL-2, 항생제 및 항체를 포함한다.
일반적으로 조직 또는 세포를 배양함에 있어서, 컨테이너(예를 들어, 플라스크)에서 사용되는 조성물의 부피는 컨테이너의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 24웰 플레이트의 경우 일반적으로 2mL의 조성물을 이용하고, T75 플라스크의 경우 일반적으로 20mL의 조성물을 이용한다.
그러나, 본 출원의 상기 종양 샘플을 배양하기 위해 제1 컨테이너에 초기에 첨가되는 제1 조성물의 양은 전술한 일반적으로 사용되는 양과 다를 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 종양 샘플을 배양하기 위해 사용되는 (즉, 제1 컨테이너에 첨가되는) 제1 조성물의 양은 제1컨테이너의 최대 허용가능한 용량의 약 80%, 70%, 60%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 또는 5% 이하 일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 종양 샘플을 배양하기 위해 제1 컨테이너에 첨가되는 제1 조성물의 양은 제1 컨테이너의 최대 허용가능한 용량의 약 30% 이하일 수 있다. 이 때, 상기 최대 허용 가능한 용량은 상기 제1 컨테이너에 최대로 첨가 가능한 용량을 의미한다.
일 실시양태에서, 제1 컨테이너가 24웰 플레이트인 경우 초기에 첨가되는 제1 조성물의 양은 1.5mL 이하 또는 1mL 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 컨테이너가 24웰 플레이트인 경우 초기에 첨가되는 제1 조성물의 양은 약 1mL일 수 있다.
다른 실시양태에서, 제1 컨테이너가 T75 플라스크인 경우 사용되는 제1 조성물의 양은 15mL, 12mL, 10mL, 9mL, 8mL, 7mL, 6mL, 5mL, 4mL, 또는 3mL 이하 일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 컨테이너가 T75 플라스크인 경우 사용되는 제1 조성물의 양은 약 6mL일 수 있다.
본 출원의 상기 초기 제1 조성물의 양은 종양 샘플의 배양 환경에 영향을 주어 제1 면역세포 집단의 생산을 최적화하는데 도움을 줄 수 있다. 구체적으로, 상기 초기 조성물의 양을 최대 허용 가능한 조성물의 양보다 적게 하면, 배양 과정 동안 조성물을 교체하지 않고 단순 첨가하면서 배양에 필요한 물질을 공급할 수 있고, 이는 배양되는 세포가 받는 스트레스를 줄일 수 있다. 또한, 조성물의 양 조절은 세포 사이의 상호작용에 영향을 줌으로써 배양되는 세포의 증식에 긍정적인 영향을 미칠 수 있다.
이 때, 상기 제1 조성물에 포함될 수 있는 배지, 세럼, 플라즈마, 항생제 및/또는 IL-2에 대해서는 아래에 설명한다.
i)배지
a) 기본 배지 종류
본 출원에서 사용되는 기본 배지는 세포 및/또는 조직을 배양하기 위한 최소한의 영양원을 의미한다. 상기 기본 배지로는 TIL을 포함하는 면역세포를 배양하는데 적합한 모든 배지가 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 배지는 AlyS505N, AIM-V 배지, 또는 RPMI1640 배지 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, CTS-AIM-V 배지를 사용하여 종양 샘플이 배양될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제1 조성물에 포함된 배지는 AlyS505N, AIM-V 배지, 또는 RPMI1640 배지일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 제1 조성물에 포함된 배지는 CTS-AIM-V 배지일 수 있다.
ii)첨가제
a)
세럼
일 실시양태에서, 세럼은 기본 배양 배지 (예를 들어, 전술한 AlyS505N, AIM-V 배지, 또는 RPMI1640 등)에 첨가될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 출원의 제1 조성물은 세럼을 포함할 수 있다. 상기 세럼은 고분자 단백질, 및 저분자 영양분 등을 함유하고 있으며, 세포의 성장에 필요한 성분들을 함유하고 있다. 상기 세럼은 인간 세럼을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일 실시양태에서, 상기 세럼은 인간 AB 세럼일 수 있다.
일 실시양태에서, 배지에 인간 세럼이 약 10 부피% 이하 농도로 첨가되어 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 배지에 인간 세럼이 약 9부피%이하, 약 8 부피%이하, 약 7 부피%이하, 약 6 부피%이하, 약 5 부피%이하, 약 4부피% 이하 또는 3부피% 이하 농도로 첨가되어 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, CTS-AIM-V 배지에 인간 세럼이 약 3부피% 로 첨가되어 종양 조각을 배양하는데 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 세럼이 제1 조성물에 포함되는 경우, 제1 조성물에 포함된 상기 세럼의 농도는 약 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 부피% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 조성물에 포함된 상기 세럼의 농도는 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 부피% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 조성물에 포함된 상기 세럼의 농도는 약 5, 4, 3, 2, 또는 1 부피% 이하일 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 조성물에 포함된 인간 세럼의 농도는 약 5, 4, 3, 2, 또는 1 부피%일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 조성물에 포함된 인간 세럼의 농도는 약 3 부피%일 수 있다.
b)
플라즈마
일 실시양태에서, 플라즈마는 기본 배양 배지에 첨가될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 출원의 제1 조성물은 플라즈마를 포함할 수 있다. 상기 플라즈마는 세럼에서 피브리노겐이 제외된 것을 의미한다. 상기 플라즈마는 세포의 성장에 필요한 성분들을 함유하고 있다.
본 출원에서 사용되는 플라즈마는 인간 플라즈마 또는 환자의 혈액에서 분리한 플라즈마일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시양태에서, 플라즈마는 세럼 대신 배지에 첨가되어 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 배지 내 플라즈마가 약 10 부피% 이하 농도로 첨가되어 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 배지 내 플라즈마가 약 9부피%이하, 약 8 부피%이하, 약 7 부피%이하, 약 6 부피%이하, 약 5 부피%이하, 약 4부피% 이하 또는 3부피% 이하 농도로 첨가되어 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, CTS-AIM-V 배지에 플라즈마가 약 3부피% 로 첨가되어 종양 조각을 배양하는데 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 플라즈마가 제1 조성물에 포함되는 경우, 제1 조성물에 포함된 상기 플라즈마의 농도는 약 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 부피% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 조성물에 포함된 상기 플라즈마의 농도는 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 부피% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 조성물에 포함된 상기 플라즈마의 농도는 약 5, 4, 3, 2, 또는 1 부피% 이하일 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 조성물에 포함된 플라즈마의 농도는 약 5, 4, 3, 2, 또는 1 부피%일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 조성물에 포함된 플라즈마의 농도는 약 3 부피%일 수 있다.
c)
IL-2
본 출원에서 사용되는 IL-2는 인터루킨(Interleukin)-2로 T 세포 증식을 촉진하는 인자를 의미한다. 상기 IL-2는 인간 재조합 IL-2 형태를 포함한 다양한 형태의 IL-2를 포함한다.
일 실시양태에서, 제1 조성물은 IL-2를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, IL-2의 농도는 약 10000IU/mL 이하로 배지에 첨가될 수 있다. 일 실시양태에서, IL-2의 농도는 약 9000IU/mL, 약 8000IU/mL, 약 7000IU/mL, 약 6000IU/mL, 약 5000IU/mL, 약 4000IU/mL, 약 3000IU/mL, 약 2000IU/mL, 약 1000IU/mL 또는 약 500IU/mL으로 배지에 첨가될 수 있다. 특정한 실시양태에서, CTS-AIM-V 배지에 IL-2가 약 1000IU/mL로 첨가되어 종양 조각을 배양하는데 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 조성물은 약 10000IU/mL, 약 9500IU/mL, 약 9000IU/mL, 약 8500IU/mL, 약 8000IU/mL, 약 7500IU/mL, 약 7000IU/mL, 약 6500IU/mL, 약 6000IU/mL, 약 5500IU/mL, 약 5000IU/mL, 약 4500IU/mL, 약 4000IU/mL, 약 3500IU/mL, 약 3000IU/mL, 약 2500IU/mL, 약 2000IU/mL, 약 1500IU/mL, 약 1000IU/mL, 약 900IU/mL, 약 800IU/mL, 약 700IU/mL, 약 600IU/mL, 약 500IU/mL, 약 400IU/mL, 약 300IU/mL, 약 200IU/mL, 또는 약 100IU/mL 의 농도의 IL-2를 포함하거나, 또는 전술한 값들 중 선택되는 두 값에 의해 설정되는 범위의 농도의 IL-2를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 조성물은 약 2000IU/mL, 약 1500IU/mL, 약 1000IU/mL, 약 900IU/mL, 약 800IU/mL, 약 700IU/mL, 약 600IU/mL, 또는 약 500IU/mL 의 농도의 IL-2를 포함하거나, 또는 전술한 값들 중 선택되는 두 값에 의해 설정되는 범위의 농도의 IL-2를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 조성물은 약 1000IU/ml 농도의 IL-2를 포함할 수 있다.
d)
항생제
일 실시양태에서, 제1 조성물은 항생제를 더 포함할 수 있다.
상기 항생제는 세포 배양 및/또는 증폭 시 박테리아, 진균류 등에 의한 오염을 방지하기 위해 사용될 수 있다.
반제품 생산에서 항생제의 사용 여부는 대상으로부터 수득된 종양 조직의 종양의 종류, 배양되는 종양 샘플의 상태, 배양 및/또는 증폭되는 세포의 상태 등을 적절히 고려하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 종양 샘플이 대상의 유방암으로부터 유래된 경우, 초기 첨가되는 제1 조성물에는 항생제가 포함되지 않을 수 있다. 다른 예로, 종양 샘플이 대상의 유방암으로부터 유래된 경우라도, 종양 샘플의 상태를 판단하여 종양 샘플의 상태에 따라 항생제가 포함된 제1 조성물이 사용될 수 있다. 또 다른 예로, 종양 샘플이 대상의 두경부암에서부터 유래된 경우, 항생제가 포함된 제1 조성물이 사용될 수 있다.
제1조성물이 항생제를 포함하는 경우, 상기 항생제는 세포의 배양 및/또는 증폭에 영향을 주지 않는 농도로 포함되며, 이때 세포 독성을 나타내는 항생제의 농도가 고려될 수 있다. 제1 조성물에 포함되는 항생제의 적절한 농도는 항생제의 종류에 따라 달라질 수 있다.
상기 제1 조성물에 포함될 수 있는 항생제의 예시로는, 앰피실린, 젠타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 페니실린, 스트렙토마이신 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 즉, 세포의 배양 및/또는 증폭을 위한 배지에 첨가되는 항생제로 당업계에 공지된 항생제가 모두 사용될 수 있고, 필요에 따라 당업자가 적절하게 선택하여 사용할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 조성물은 젠타마이신을 포함할 수 있다.
e) 항체
전술한 바와 같이, 본 출원의 일 실시양태에서, 제1 조성물에는 항체가 더 포함될 수 있다. 제1 조성물에 항체가 포함되는 경우, 제1 조성물에 포함된 항체는 CD137(4-1BB)를 타겟하는 항체, 및 PD-1과 PD-L1의 결합을 방해하는 항체 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 일 실시양태에서, 제1 조성물에 포함된 항체는 항-CD137 항체, 항-PD-1 항체, 및 항-PD-L1 항체 중 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
항-CD137 항체(anti-CD137 antibody)는 CD137(4-1BB)을 타겟하는 항체이다. 일 실시양태에서, 항-CD137 항체는 인간, 인간화, 및 뮤린 항체를 포함하는 모든 형태의 모노클로날 또는 폴리클로날 항-CD137 항체를 포함한다. 일 실시양태에서, 제1 조성물에 항-CD137 항체가 포함되는 경우, 항-CD137 항체는 우렐루맙(Urelumab), 유토밀루맙(utomilumab), 및 이의 변이체 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
PD-1과 PD-L1의 결합을 방해하는 항체의 예로는, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체 등이 있을 수 있다. 일 실시양태에서, 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체는 인간, 인간화, 및 뮤린 항체를 포함하는 모든 형태의 모노클로날 또는 폴리클로날 항-PD-1 항체 또는 항-PD-L1 항체를 포함한다. 일 실시양태에서, 제1 조성물에 항-PD-1 항체가 포함되는 경우, 항-PD-1 항체는 니볼루맙(Nivolumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 세미플리맙(Cemiplimab), 도스탈리맙(Dostarlimab), 및 이의 변이체 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 실시양태에서, 제1 조성물에 항-PD-L1 항체가 포함되는 경우, 항-PD-L1 항체는 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab), 듀발루맙(Durvalumab), 및 이의 변이체 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시양태에서, 제1 조성물에 항체가 포함되는 경우, 제1 조성물에 포함된 항체의 농도는 약 1 ng/mL, 약 10ng/mL, 약 100ng/mL, 약 1μg/mL, 약 2μg/mL, 약 3μg/mL, 약 4μg/mL, 약 5μg/mL, 약 10μg/mL, 약 15μg/mL, 약 20μg/mL, 약 25μg/mL, 약 30μg/mL, 약 35μg/mL, 약 40μg/mL, 약 45μg/mL, 약 50μg/mL, 약 60μg/mL, 약 70μg/mL, 약 80μg/mL, 약 90μg/mL, 또는 약 100μg/mL이거나, 또는 전술한 값 중 선택되는 두 값의 범위에 속하는 값 일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 조성물에 포함된 항체의 농도는 약 10μg/mL일 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 출원의 제1 조성물은 배지 및 첨가제를 포함한다.
일 실시양태에서, 제1 조성물은 배지, 세럼, 및 IL-2를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 조성물은 배지, 플라즈마, 및 IL-2를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 조성물은 배지, 세럼, IL-2 및 항생제를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제1 조성물은 배지, 플라즈마, IL-2, 및 항생제를 포함할 수 있다. 다만, 이에 제한되지 않는다.
특정한 실시양태에서, 상기 제1 조성물은 배지, 세럼 및 IL-2를 포함하고, 이때, 상기 배지는 CTS-AIM-V 배지이고, 세럼은 인간 AB 세럼이 약 3부피%로 제1 조성물에 포함되고, IL-2는 약 1000 IU/mL의 농도로 제1 조성물에 포함될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 제1 조성물은 배지, 세럼, IL-2 및 항생제를 포함하고, 이때, 상기 배지는 CTS-AIM-V 배지이고, 항생제는 젠타마이신이고, 세럼은 인간 AB 세럼이 약 3부피%로 제1 조성물에 포함되고, IL-2는 약 1000IU/mL의 농도로 제1 조성물에 포함될 수 있다.
4) 배양 기간
종양 샘플은 제1 컨테이너에서 일정 기간 동안 배양된다. 일 실시양태에서, 종양 샘플은 약 1일 이상 배양된다. 일 실시양태에서, 종양 샘플은 약 2일 이상, 3 일 이상, 4 일 이상, 5 일 이상, 6 일 이상, 7 일 이상, 8 일 이상, 9 일 이상, 10 일 이상, 11 일 이상, 12 일 이상, 13 일 이상, 14 일 이상, 15 일 이상, 16 일 이상, 17 일 이상, 18 일 이상, 19 일 이상, 20 일 이상, 21 일 이상, 22일 이상, 23일 이상, 또는 24일 이상 배양될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 종양 샘플은 제1 컨테이너에서 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21일 동안 배양될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 종양 샘플은 제1 컨테이너에서 약 14일 동안 배양될 수 있다.
5) 제1 첨가 조성물이 보충됨
상기 종양 샘플이 제1 컨테이너 내에서 배양되는 동안, 제1 첨가 조성물이 제1 컨테이너 내로 보충될 수 있다. 이때 제1 첨가 조성물은 배지, 세럼, 플라즈마, 항생제, 및 IL-2 중에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 제1 첨가 조성물의 조성은 관련 단락에서 상세히 개시된다.
일 실시양태에서, 제1 첨가 조성물은 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 보충될 수 있거나, 또는 전술한 횟수 이상 보충될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 첨가 조성물은 3회 보충될 수 있다.
이때, 일 실시양태에서, 제1 첨가 조성물은 배양 시작일부터 1 일째, 2 일째, 3 일째, 4일째, 5일째, 6일째, 7일째, 8일째, 9일째, 10일째, 11일째, 12일째, 13일째, 14 일째, 15 일째, 16 일째, 17 일째, 18 일째, 19 일째, 20 일째, 및 21 일째 중에서 어느 하나 이상의 일자에 보충될 수 있고, 배양 기간동안 총 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 보충될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 첨가 조성물은 7일째, 10일째, 및 12일째에 보충되어 3회 보충될 수 있다.
제1 첨가 조성물이 보충되는 과정에서, 제1 첨가 조성물은 종양 샘플이 배양되는 환경의 스트레스를 최소화하기 위한 방법으로 보충될 수 있다.
제1 첨가 조성물이 보충되는 과정에서, 보충되는 제1 첨가 조성물의 양은 컨테이너의 종류 및/또는 보충되는 시점 등에 따라 달라질 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 첨가 조성물은 보충 시점마다 동일한 양으로 보충될 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 첨가 조성물은 보충 시점마다 다른 양으로 보충될 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 첨가 조성물은 보충 시점마다 보충되는 양이 증가되어 보충될 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 첨가 조성물은 보충 시점마다 동일한 양으로 또는 다른 양으로 약 1mL, 2mL, 3mL, 4mL, 5mL, 6mL, 7mL, 8mL, 9mL, 10mL, 12mL, 14mL, 16mL, 18mL, 20mL, 24mL, 28mL, 32mL, 36mL, 40mL, 45mL, 또는 50mL 보충될 수 있거나, 또는 전술한 값 이상의 양으로 보충될 수 있다. 다만 이에 제한되지 않고, 보충되는 제1 첨가 조성물의 양은 다양한 조건(예를 들어, 컨테이너의 용량, 배양되는 세포의 상태, 및/또는 보충 시점 등)을 고려하여 적절한 값으로 결정될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 첨가 조성물은 보충시점에 3mL씩 동일한 양으로 보충될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 제1 컨테이너가 T75 플라스크인 경우, 제1 첨가 조성물은 보충시점에 3mL 씩 동일한 양으로 보충될 수 있다.
구체적인 일 실시양태에서, 제1 첨가 조성물은 배양 시작부터 7일째, 10일째, 및 12일째 제1 컨테이너로 보충되고, 이때 각 보충시점에 3ml의 제1 첨가 조성물이 보충될 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 컨테이너에 보충되는 제1 첨가 조성물은 배지, 세럼, 플라즈마, 항생제, IL-2, 및 항체 중에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 첨가 조성물은 배지, 세럼, 및 IL-2를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 첨가 조성물은 배지, 플라즈마, 및 IL-2를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 첨가 조성물은 배지; 세럼 및 플라즈마 중 어느 하나; 및 IL-2를 포함하고, 항체 및 항생제 중 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 보충되는 제1 첨가 조성물은 배지, 세럼, 및 IL-2를 포함한다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 첨가 조성물은 배지, 세럼, IL-2 및 항생제를 포함한다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 첨가 조성물은 배지, 세럼, IL-2 및 항체를 포함한다. 다른 특정한 실시양태에서, 제1 첨가 조성물은 배지, 세럼, IL-2, 항생제 및 항체를 포함한다.
제1 첨가 조성물에 포함될 수 있는 각각의 구성들에 대한 실시 양태는 제1 조성물에서 전술한 바와 같다.
a) 배지
제1 첨가 조성물에 포함될 수 있는 배지와 관련된 실시양태는 제1 조성물에서 전술한 바와 같다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 상기 제1 첨가 조성물에 포함된 배지는 AIM-V 배지일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특정한 실시양태에서, 제1 첨가 조성물에 포함된 배지는 CTS-AIM-V 배지일 수 있다.
b) 세럼
제1 첨가 조성물에 세럼이 포함되는 경우, 세럼과 관련된 실시 양태는 제1 조성물에서 전술한 바와 같다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 상기 세럼은 인간 세럼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 제1 첨가 조성물에 포함된 상기 세럼의 농도는 약 3 부피%일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
c) 플라즈마
제1 첨가 조성물에 플라즈마가 포함되는 경우, 플라즈마와 관련된 실시양태는 제1 조성물에서 전술한 바와 같다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 상기 플라즈마는 인간 플라즈마일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 제1 첨가 조성물에 포함된 상기 플라즈마의 농도는 약 3 부피%일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
d) 항생제
제1 첨가 조성물에 항생제가 포함되는 경우, 항생제와 관련된 실시양태는 제1 조성물에서 전술한 바와 같다. 전술한 바와 같이, 항생제의 사용 여부는 대상으로부터 수득된 종양의 종류, 배양되는 종양 샘플의 상태, 배양 및/또는 증폭되는 세포의 상태 등을 적절히 고려하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 제1 첨가 조성물에 포함된 항생제는 젠타마이신일 수 있다.
e) IL-2
제1 첨가 조성물에 IL-2가 포함되는 경우, IL-2와 관련된 실시양태는 제1 조성물에서 전술한 바와 같다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 제1 첨가 조성물에 포함된 IL-2의 농도는 1000IU/mL 일 수 있다.
f) 항체
제1 첨가 조성물에 항체가 포함되는 경우, 제1 첨가 조성물에 포함되는 항치와 관련된 실시양태는 제1 조성물에서 전술한 바와 같다. 예를 들어, 제1 첨가 조성물에 포함되는 항체는 항-CD137 항체, 항-PD-1 항체, 및 항-PD-L1 항체 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 컨테이너에 보충되는 제1 첨가 조성물의 조성은 보충 시점마다 다를 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 컨테이너에 보충되는 제1 첨가 조성물의 조성은 보충 시점마다 같을 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 컨테이너에 보충되는 제1 첨가 조성물의 조성은 제1 조성물과 같을 수 있다. 다른 실시양태에서, 제1 컨테이너에 보충되는 제1 첨가 조성물의 조성은 제1 조성물과 다를 수 있다.
특정한 실시양태에서, 제1 컨테이너에 보충되는 제1 첨가 조성물은 배지, 세럼, 및 IL-2를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 컨테이너에 보충되는 제1 첨가 조성물은 CTS-AIM-V 배지, 약 3 부피% 인간 세럼, 및 약 1000IU/ml의 IL-2를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 배양 동안, 면역세포는 제1 컨테이너로부터 제거되거나 외부로부터 추가되지 않는다. 이는 상기 배양 동안, 상기 제1 컨테이너 이외의 다른 컨테이너로 옮겨지거나, 외부로부터 상기 제1 컨테이너에 면역세포가 새롭게 추가되지 않는 것을 의미한다.
제1 면역세포 집단을 생산함의 구체적인 일 예시는 다음과 같이 설명될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
- 24조각의 1-4mm2 의 면적의 단면을 갖는 종양 샘플이 T75 플라스크에 담겨 배양되고 6ml의 제1 조성물이 배양 초기에 사용된다. 이때 상기 제1 조성물은 CTS-AIM-V 배지, 3 부피% 인간 세럼, 및 1000IU/ml 의 IL-2를 포함한다. 종양 샘플은 37℃, 5% CO2 환경에서, 제1 컨테이너에서 14일 동안 배양된다.
- 배양 시작일로부터 7일째, 10일째, 및 12일째에 제1 조성물과 조성이 동일한 제1 첨가 조성물이 제1 컨테이너에 추가되고, 이때 추가되는 제1 첨가 조성물은 7일째, 10일째, 및 12일째에 3ml 씩 추가된다.
3. 제1 면역세포 집단을 수득함
개요
전술한 종양 샘플을 배양함의 과정을 통해 수득된 배양물로부터 상기 제1 면역세포 집단을 수득한다.
제1 면역세포 집단 수득
면역세포 집단은 다수의 면역세포를 의미하고, 상기 면역세포는 종양 침윤 림프구를 포함한다. 이때, 제1 면역세포 집단은 종양 샘플을 배양하여 얻은 면역세포 집단을 의미한다.
상기 제1 면역세포 집단을 수득하는 방법은 조직을 이용한 세포 배양과정에서 생산된 세포를 수득하는 다양한 공지의 방법들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 일 실시양태에서, 상기 제1 면역세포 집단은 종양 샘플을 배양함의 과정을 통해 배양된 조성물로부터 종양 조직의 거름, 세포 세척, 처리, 분리, 및/또는 세포 솔팅 과정을 통해 수득될 수 있으며, 달리 제한되지 않고 당업계에 공지된 방법을 통해 수득될 수 있다.
하기에서, 상기 제1 면역세포 집단을 수득함에 포함될 수 있는 예시적인 과정들을 개시한다.
1) 종양 조직을 거름(straining)
상기 제1 면역세포 집단을 수득함 내에는 종양 조직의 조각을 거르는 과정이 포함될 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 배양된 조성물로부터 제1 면역세포 집단을 수득하기 위해 세포 스트레이너(strainer)를 이용하여 종양 조직의 조각을 거르는 과정이 수행될 수 있다. 이때 상기 세포 스트레이너의 메쉬 포어(mesh pore)의 크기는 수득하는 면역세포의 종류에 따라 달라질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 40 μm의 메쉬 포어를 갖는 세포 스트레이너를 사용하여 종양 조직의 조각이 걸러질 수 있다.
2) 세포 회수 (collection)
상기 제1 면역세포 집단을 수득함은 세포를 수득 또는 회수하는 과정을 포함할 수 있다. 배양된 조성물 또는 상기 걸러진 세포액에서 세포를 수득 또는 회수하는 방법으로 당업계의 공지된 방법이 사용될 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 제1 면역세포집단을 수득 또는 회수하기 위해 원심분리 방법이 이용될 수 있다. 일 예시로, 상기 원심분리는 약 100g, 150g, 200g, 250g, 300g, 400g, 450g, 500g, 600g, 700g, 800g, 900g, 또는 1000g, 또는 전술한 g값 이상의 조건에서 수행될 있으나, 이에 제한되지 않는다. 다른 예시로, 상기 원심분리는 또는 약 100RPM, 200RPM, 300RPM, 400RPM, 500RPM, 600RPM, 700 RPM, 800 RPM, 900 RPM, 1000 RPM, 1100 RPM, 1200 RPM, 1300 RPM, 1400 RPM, 1500 RPM, 1600 RPM, 1700 RPM, 1800 RPM, 1900 RPM, 2000 RPM, 2200 RPM, 2500 RPM, 3000 RPM, 3500 RPM, 4000 RPM, 또는 5000 RPM 또는, 전술한 RPM 값 이상의 조건으로 수행될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
3) 세포 솔팅(sorting)
상기 제1 면역세포 집단을 수득함은 상기 배양된 조성물에 포함된 세포를 솔팅함을 포함할 수 있다.
세포 솔팅은 전술한 분리된 세포 집단에서 “목적하는 세포만을 선별”하기 위해 사용되는 방법을 의미한다. 세포 솔팅에는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, FACS(fluorescence-activated cell sorting), 원심분리, 또는 세포의 용기에의 접착력에 따른 분리 등의 방법이 세포 솔팅을 위해 사용될 수 있다.
4) 세포 세척
상기 제1 면역세포 집단을 수득함은 상기 배양된 조성물에 포함된 면역세포 집단을 세척하는 과정을 포함할 수 있다. 본 단락에서 서술되는 세포를 세척하는 과정은 제1 면역세포 집단을 수득함의 단계에서 임의의 횟수로 수행될 수 있다. 예를 들어, 제1 면역세포 집단을 수득함에 포함된 각 과정의 사이사이에 세포 세척과정이 수행될 수 있다. 다른 예로, 세포 세척은 전술한 종양 조직이 걸러진, 회수된 및/또는 솔팅된 세포 집단을 대상으로 수행될 수 있다. 또 다른 예로, 세포 세척은 세포 회수 단계에서 함께 수행될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 배양된 면역세포 집단은 PBS, 또는 DPBS등을 포함하는 버퍼 용액을 이용하여 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 또는 5회 이상 세척될 수 있다. 이때, 예를 들어, 원심분리 방법이 이용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, DPBS를 이용하여 배양된 면역세포 집단을 3회 세척하여 제1 면역세포 집단을 수득할 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 면역세포 집단을 수득함은 세포 회수 과정을 포함할 수 있다. 이때 제1 면역세포 집단을 수득함은 세포 세척 과정을 더 포함할 수 있고, 상기 세포 세척 과정은 임의의 적절한 시점에 임의의 적절한 횟수로 수행될 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 면역세포 집단을 수득함은 다음을 포함할 수 있다:
종양 조직을 거름; 및 세포 회수. 이때 제1 면역세포 집단을 수득함은 세포 세척 과정을 더 포함할 수 있고, 상기 세포 세척 과정은 임의의 적절한 시점에 임의의 적절한 횟수로 수행될 수 있다.
다른 실시양태에서, 제1 면역세포 집단을 수득함은 다음을 포함할 수 있다:
종양 조직을 거름; 세포 회수; 및 세포 솔팅. 이때 제1 면역세포 집단을 수득함은 세포 세척 과정을 더 포함할 수 있고, 상기 세포 세척 과정은 임의의 적절한 시점에 임의의 적절한 횟수로 수행될 수 있다.
수득된 제1 면역세포 집단의 세포 수
상기 제1면역세포 집단을 수득함을 통해, 일정한 수 이상의 세포가 수득된다. 일 실시양태에서, 상기 제1 면역세포 집단을 생산하기 위해 배양된 종양 샘플 하나 당 약 1E4, 약 2E4, 약 3E4, 약 4E4, 약 5E4, 약 6E4, 약 7E4, 약 8E4, 약 9E4, 약 1E5, 약 2E5, 약 3E5, 약 4E5, 약 5E5, 약 6E5, 약 7E5, 약 8E5, 약 9E5, 약 1E6, 약 2E6, 약 3E6, 약 4E6, 또는 약 5E6 이상의 세포가 수득될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 제1 면역세포집단을 생산하기 위해 배양된 종양 샘플 하나 당 약 1E5, 약 2E5, 약 3E5, 약 4E5, 약 5E5, 약 6E5, 약 7E5, 약 8E5, 약 9E5, 또는 약 1E6의 세포가 수득될 수 있다. 일 예시로 상기 제1 면역세포집단을 생산하기 위해 배양된 종양 샘플이 약 1-4mm2 의 단면을 가진 종양 샘플인 경우, 종양 샘플 하나 당 약 8E5 이상의 세포가 수득될 수 있다. 제1 면역세포 집단을 생산하기 위한 배양을 통해 수득되는 세포의 수는 종양의 종류, 및 종양 샘플의 크기 등에 따라 달라질 수 있고, 전술한 실시양태에 제한되지 않는다.
Ⅱ. 동결 보존함
개요
본 출원에서 개시하는 면역세포 조성물을 생산하는 방법에 있어서, 상기 방법에 포함되는 각 과정의 중간에 각 과정의 결과물을 동결 보존하는 것이 선택적으로 포함될 수 있다.
일 예시로, 제1 면역세포 집단을 수득한 후, 상기 제1 면역세포 집단 또는 반제품을 동결 보존하는 것이 선택적으로 포함될 수 있다. 제1 면역세포 집단 또는 반제품을 동결보존하는 경우, 상기 제1 면역세포 집단 또는 반제품은 동결 보존 조성물에 포함되어 동결 보존된다. 상기 제1면역세포 집단을 동결 보존하는 것에 대해서는 아래에서 자세하게 설명한다.
동결 보존용 배지
전술한 바와 같이, 제1 면역세포집단은 동결 보존 조성물에 포함되어 동결 보존된다. 동결 보존 조성물은 동결 보존에 적합한 조성을 갖는다. 이때 동결 보존에 적합한 배지가 포함될 수 있다. 상기 동결 보존에 적합한 배지는 당업계에서 공지된 동결 보존용 배지를 모두 포함한다.
일 실시양태에서, 동결 보존 조성물은 약 0.1%, 약 0.5%, 약 1%, 약3%, 약5%, 약8%, 약10%, 약 13% 또는 약 15%, 또는 전술한 %값 이상의 농도의 DMSO를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특정한 실시양태에서, 동결 보존 조성물은 10%의 농도의 DMSO를 포함할 수 있다. 예를 들어, 10%의 DMSO가 포함된 CryoStor® CS10가 사용될 수 있다.
세포 농도 및 동결 보존되는 세포 수
제1 면역세포 집단은 특정한 농도로 동결 보존 조성물에 포함되어 동결 보존될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제1 면역세포 집단은 약 1E5 cells/ml, 약 1E6 cells/mL, 약 2E6 cells/mL, 약 3E6 cells/mL, 약 4E6 cells/mL, 약 5E6 cells/mL, 약 6E6 cells/mL, 약 7E6 cells/mL, 약 8E6 cells/mL, 약 9E6 cells/mL, 또는 약 1E7 cells/mL의 농도로 동결 보존 조성물에 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않고 동결보존에 적합한 농도로 동결 보존 조성물에 포함될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제1 면역세포 집단은 2E6 cells/ml의 농도로 동결 보존 조성물에 포함될 수 있다.
일 실시양태에서, 약 0.1ml, 약 0.2ml, 약 0.3ml, 약 0.4ml, 약 0.5ml, 약 0.7ml, 약 1ml, 약 2ml, 약 3ml, 약 4ml, 약 5ml, 약 7ml, 또는 약 10ml, 또는 전술한 ml 이상의 양의 동결 보존 조성물이 동결 보존용 용기에 담겨져 동결보존 될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 약 1ml의 양의 동결 보존 조성물이 동결 보존용 용기에 담겨져 동결보존 될 수 있다.
예를 들어, 제1 면역세포 집단은 약2E6 cells/mL의 농도로 동결 보존 조성물에 현탁 되고, 약 1ml의 동결 보존 조성물이 동결 보존 용기(cryovial)에 담겨져 동결 보존될 수 있다.
동결 보존 기간
상기 제1 면역세포 집단은 일정 기간 동안 동결 보존된 이후에 증폭되어 면역세포 조성물을 생산하는데 이용될 수 있다. 동결 보존되는 기간은 달리 제한되지 않는다. 일 실시양태에서, 제1 면역세포 집단이 동결 보존될 수 있는 기간은 최장 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 6년, 약 7년, 약 8년, 약 9년, 약 10년, 약 11년, 약 12년, 약 13년, 약 14년, 약 15년, 약 16년, 약 17년, 약 18년, 약 19년, 또는 약 20년, 또는 전술한 기간 이상일 수 있다. 예를 들어, 제1 면역세포 집단은 1시간 동안 동결 보존된 후 해동되어 면역세포 조성물을 생산하는데 사용될 수 있다. 다른 예로, 제1 면역세포 집단은 하루동안 동결 보존된 후 해동되어 면역세포 조성물을 생산하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예로, 제1 면역세포 집단은 10년 동안 동결 보존된 후 해동되어 면역세포 조성물을 생산하는데 사용될 수 있다.
동결 보존 온도
상기 제1면역세포 집단은 장기간 보존되기에 적합한 온도에서 동결 보존된다. 일 실시양태에서, 상기 제1면역세포 집단은 약 -40°C 이하, -60°C 이하, -80°C이하, 약 -100°C이하, 약 -120°C이하, 약 -140°C이하, 약 -160°C이하, 약 -180°C이하 또는 약 -190°C 이하에서 동결 보존될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 약 -190°C 이하에서 동결보존 될 수 있다. 예를 들어, 상기 제1면역세포 집단은 약 -190°C 이하의 액체질소(LN2) 또는 기체상 액체질소(LN2)에 동결 보존될 수 있다.
Ⅲ. 동결 보존된 제1 면역세포 집단을 해동함
개요
본 출원에서 개시하는 면역세포 조성물을 생산하는 방법에 있어서, 상기 방법에 포함되는 각 과정의 중간에 각 과정의 결과물이 동결 보존되는 것이 선택적으로 포함될 수 있고, 이러한 동결보존 공정을 실시하는 경우, 상기 동결 보존 단계 후에 상기 동결 보존된 각 과정의 결과물을 해동하는 공정이 함께 추가로 포함될 수 있다.
일 예시로, 동결 보존된 제1 면역세포 집단은 면역세포 조성물을 생산하기 위해 해동하여 이용될 수 있다.
해동 방법
상기 해동은 당업계에서 동결 보존된 세포를 해동하는 공지된 방법들을 통해 수행될 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 동결 보존된 제1 면역세포 집단은 항온 수조(워터 배스)를 이용하여 해동될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 동결 보존된 제1면역세포 집단은 해동 기기를 이용하여 해동될 수 있다. 이 때, 상기 해동 기기는 건식 해동(dry-thawing)방법으로 세포를 해동하는 기기일 수 있다. 상기 건식 해동(dry-thawing) 방법을 이용하는 경우 세포의 오염을 방지할 수 있다. 이 때, 상기 건식 해동(dry-thawing)방법은 물을 이용하지 않는(water-free) 방법 또는 물이 해동되는 대상과 차단된 형태로 존재하는 방법(예를 들어, 물을 담고 있는 팩의 형태)을 모두 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 동결 보존된 제1면역세포 집단은 항온 수조에서 약 37℃에서 약 2분간 해동될 수 있다. 다른 예로, 상기 동결 보존된 제1 면역세포 집단은 물을 담고 있는 팩을 포함하는 해동기기를 이용하여 약 37℃에서 약7분간 해동될 수 있다.
이처럼, 본 출원에서 개시하는 면역(세포) 조성물을 생산하는 방법은, 제1차 면역세포 집단을 포함하는 반제품을 생산한 후 바로 사용하여 완제품을 생산하거나; 또는 선택적으로 상기 반제품을 일정기간 동안 동결보존 후 이를 해동하여 완제품을 생산하는 것 모두 포함한다.
Ⅳ. 완제품 생산
본 출원에서 개시하는 면역세포 조성물을 생산하는 방법은 반제품을 생산하는 과정 및/또는 완제품을 생산하는 과정을 포함할 수 있다. 이 때, 상기 완제품은 제2 면역세포 집단으로부터 증폭된 제3 면역세포 집단을 수득하여 생산된 면역세포 조성물을 의미하며, 이때 상기 제2 면역세포 집단은 제1 면역세포 집단 또는 동결 보존 후 해동된 제1 면역세포 집단으로부터 유래된 것이다.
일 실시양태에서, 면역세포 조성물의 생산 또는 완제품 생산은 다음을 포함할 수 있다:
제2 면역세포 집단을 파종함;
제2 면역세포 집단을 증폭함; 및
면역세포 조성물을 생산함.
이하에서 완제품 생산에 포함되는 각 과정에 대하여 구체적으로 개시한다.
1. 제2 면역세포 집단을 파종함
개요
제1 면역세포 집단 또는 동결 보존 후 해동된 제1 면역세포 집단으로부터 유래된 제2 면역세포 집단을 제2 조성물로 현탁하여 제2 컨테이너에 파종한다.
상기 파종은 컨테이너에 세포를 분주하는 것을 의미하며, 상기 파종은 제2 면역세포 집단을 제2 컨테이너에 분주하는 것을 의미한다. 이 때, 컨테이너의 세포 배양 면적이나 부피 등에 따라 증폭에 적합한 세포 수로 분주 될 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 제2 면역세포 집단은 제2 조성물로 현탁되어, 제2 컨테이너에 적합한 양으로 파종된다.
일 실시양태에서, 제2 면역세포 집단은 제2 조성물로 현탁되어 제2 컨테이너에 약 1E3 이상 1E4 이하, 약 1E4 이상 1E5 이하, 약 1E5 이상 1E6 이하 또는 약 1E6 이상 1E7 이하의 세포 수로 제2 컨테이너에 파종될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 면역세포 집단은 제2 조성물로 현탁되어 제2 컨테이너에 약 1E5, 2E5, 3E5, 4E5, 5E5, 6E5, 7E5, 8E5, 9E5, 1E6, 1.1E6, 1.2E6, 1.3E6, 1.4E6, 또는 1.5E6 세포 수, 또는 전술한 값들 중 선택되는 두 값에 의해 설정되는 범위의 세포 수로 파종될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 면역세포 집단은 제2 조성물로 현탁되어 제2 컨테이너에 4E5의 세포 수로 파종될 수 있다.
제2 면역세포 집단
본 단계에서, 제2 컨테이너에 파종되는 제2 면역세포 집단은 전술한 제1 면역세포 집단 또는 동결 보존 후 해동된 제1 면역세포 집단으로부터 유래된다. 즉, 제2 면역세포 집단은 제1 면역세포 집단 또는 동결 보존 후 해동된 제1 면역세포 집단으로부터 수득된 것일 수 있다.
일 실시양태에서, 제1 면역세포 집단 또는 동결 보존 후 해동된 제1 면역세포 집단으로부터 제2 면역세포 집단을 수득하는 방법은 세포의 배양과정에서 세포를 수득하는 다양한 공지의 방법들을 포함할 수 있고, 달리 제한되지 않는다.
예를 들어, 제1 면역세포 집단 또는 동결 보존 후 해동된 제1 면역세포 집단으로부터 제2 면역세포 집단을 수득하는 방법에는 아래의 과정 중 어느 하나 이상이 포함될 수 있다. 제2 면역세포 집단을 수득함에는 필요한 경우 세포 생존율 확인 등의 과정이 추가적으로 포함될 수 있으나, 달리 제한되지 않는다.
1) 세포 세척
제2 면역세포 집단을 수득하는 방법은 세포 집단을 세척하는 과정을 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 제1 면역세포 집단 또는 해동된 제1 면역세포 집단을 세척하여 제2 면역세포 집단을 수득할 수 있다. 예를 들어, 세포 세척에는 원심분리 방법이 이용될 수 있다. 일 실시양태에서, 제1 면역세포 집단 또는 해동된 제1 면역세포 집단은 DPBS, 또는 PBS 등과 같은 버퍼를 통해 세척되거나, 또는 배지를 통해 세척될 수 있다.
2) 원심 분리
일 실시양태에서, 제2 면역세포 집단을 수득하기 위해 제1 면역세포 집단 또는 해동된 제1 면역세포 집단을 원심분리하는 방법이 이용될 수 있다. 일 실시양태에서, 원심 분리는 세척된 면역세포 집단을 대상으로 수행될 수 있다. 원심분리 방법의 실시양태는 관련 단락에서 전술한 바와 같다.
3) 세포 계수, 분할 또는 합침
일 실시양태에서, 제2 면역세포 집단을 수득하기 위해서 제1 면역세포 집단에 대하여 세포 계수가 수행될 수 있다. 예를 들어, 세포 세척이 끝난 제1 면역세포 집단의 세포 수를 카운팅 후, 후술할 파종을 위한 적절한 세포 수를 갖도록 면역세포 집단을 분할하여 제2 면역세포 집단을 수득할 수 있다. 또는, 다른 제1 컨테이너에서 배양된 각 면역세포 집단을 합하여 제2 면역세포 집단을 수득할 수 있다.
일 실시양태에서, 제2 면역세포 집단을 수득함은 세포 세척과정을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 제2 면역세포 집단을 수득함은 세포 세척 및 세포 계수의 과정을 포함할 수 있다. 이때 세포 계수 과정을 거친 면역세포 집단은 파종되기에 적절한 세포 수를 갖도록 분할될 수 있다.
제2 컨테이너
제2 면역세포 집단은 제2컨테이너에 파종되는데, 이 때 제2컨테이너는 제2 면역세포 집단을 증폭하는데 이용되는 용기를 의미한다. 상기 제2 컨테이너는 배지, 세럼, 플라즈마, IL-2, 항CD-3항체, 피더 세포 및/또는 항생제 등을 포함하는 제2 조성물과 함께 제2 면역세포 집단을 증폭하는데 사용된다. 상기 제2 컨테이너는 가스가 투과되는 가스투과성 컨테이너이거나, 또는 가스 공급 시스템을 포함하여 가스가 공급되는 컨테이너이다. 즉 상기 컨테이너는 컨테이너 그 자체로 가스가 투과되도록 제작되어 가스가 투과되는 컨테이너일 수 있고, 또는 컨테이너 그 자체가 가스가 투과되도록 제작되지 않았지만 별도의 가스 공급 시스템을 포함하여 가스가 투과되도록 제작된 컨테이너를 의미한다.
일 실시양태에서, 제2 컨테이너는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1600, 1800, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000 또는 10000 ml 의 최대 허용 가능한 용량을 갖는 컨테이너 이거나, 또는 전술한 값들 중 선택되는 두 값에 의해 설정되는 범위의 최대 허용 가능한 용량을 갖는 컨테이너일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 컨테이너는 약 500, 550, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1600, 1800, 또는 2000 ml 의 최대 허용 가능한 용량을 갖는 컨테이너 이거나, 또는 전술한 값들 중 선택되는 두 값에 의해 설정되는 범위의 최대 허용 가능한 용량을 갖는 컨테이너일 수 있다.
일 실시양태에서, 제2 컨테이너는 예를 들어, 24웰 플레이트, T25, T75, T125 플라스크, GREX 10, GREX 10M, GREX 10M-CS GREX 100, GREX 100M, GREX 100M-CS, GREX 500, GREX 500M, GREX 500M-CS 플라스크 등의 플라스크 또는 배양백 (culture bag)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특정한 실시양태에서, 제2 컨테이너는 GREX 100M일 수 있다.
제2 조성물
제2 면역세포 집단은 제2 조성물에 현탁되어 제2 컨테이너에 파종되는데, 이 때 제2 조성물은 배지, 세럼, 플라즈마, IL-2, 항-CD3 항체, 피더 세포 및 항생제 중 어느 하나 이상을 포함한다.
일 실시양태에서, 제2 조성물은 배지; 세럼; 및 IL-2를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 제2 조성물은 배지; 플라즈마; 및 IL-2를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 제2 조성물은 상술한 물질에 더하여, 본 출원의 제1 조성물 목차에서 기술된 항체(예를 들어, 항-CD137 항체, 항-PD-1 항체, 및 항-PD-L1 항체 중 선택되는 어느 하나 이상)를 더 포함할 수 있고, 상기 항체의 실시양태는 관련 단락에서 전술한 바와 같다.
특정한 실시양태에서, 제2 조성물은 배지; 세럼; IL-2; 항-CD3 항체; 및 피더 세포를 포함한다. 다른 특정한 실시양태에서, 제2 조성물은 배지; 플라즈마; IL-2; 항-CD3 항체; 및 피더 세포를 포함한다. 다른 특정한 실시양태에서; 제2 조성물은 배지; 세럼 및 플라즈마 중 어느 하나; IL-2; 항-CD3 항체; 항생제; 및 피더 세포를 포함한다.
일반적으로 조직 또는 세포를 배양 및/또는 증폭함에 있어서, 컨테이너(예를 들어, 플라스크)에 사용되는 조성물의 부피는 컨테이너의 종류에 따라 달라질 수 있다. 예를 들어, 일반적으로 GREX10의 경우 40mL의 조성물을 이용하고, GREX100의 경우 400mL의 조성물을 이용하고, GREX100M의 경우 1000mL의 조성물을 이용한다.
그러나, 본 출원의 상기 제2 면역세포 집단을 증폭하기 위해 제2 컨테이너에 초기에 첨가되는 조성물의 양은 전술한 일반적으로 사용되는 양과 다를 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제2 컨테이너에 첨가되는 초기 제2 조성물의 양은 제2 컨테이너의 최대 허용가능한 용량의 약 80%, 70%, 60%, 50%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 또는 5% 이하 일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 제2컨테이너에 첨가되는 초기 제2 조성물의 양은 제2 컨테이너의 최대 허용가능한 용량의 약 30% 이하 일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 제2 컨테이너에 첨가되는 초기 제2 조성물의 양은 제2 컨테이너의 최대 허용가능한 용량의 약 10% 이하일 수 있다. 이때, 상기 최대 허용가능한 용량은 상기 제2 컨테이너에 최대로 첨가 가능한 용량을 의미한다.
일 실시양태에서, 제2 컨테이너가 GREX100M인 경우 초기에 첨가되는 제2 조성물의 양은 200mL, 150mL, 100mL, 80mL, 60mL, 40mL, 20mL, 또는 10mL 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 컨테이너가 GREX100M인 경우 초기에 첨가되는 제2 조성물의 양은 약 20mL일 수 있다.
1)배지
본 출원에서 사용되는 배지는 세포 및/또는 조직을 배양하기 위한 영양원을 의미한다. 상기 배지로는 TIL을 포함하는 면역세포를 배양하는데 적합한 모든 배지가 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 배지는 AlyS505N 배지, AIM-V 배지, 또는 RPMI 배지 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특정 실시양태에서, CTS-AIM-V 배지가 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제2 조성물에 포함된 배지는 AlyS505N 배지, AIM-V 배지, 또는 RPMI 배지일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 제2 조성물에 포함된 배지는 CTS-AIM-V 배지일 수 있다.
세럼, 플라즈마, IL-2, 항 CD-3 항체, 피더 세포 및/또는 항생제 등이 상기 배지에 첨가되어 면역세포의 증폭에 사용될 수 있다. 즉, 제2 조성물은 배지 외에도 세럼, 플라즈마, IL-2, 항 CD-3 항체, 피더 세포, 및/또는 항생제 등을 더 포함할 수 있다.
2)첨가제
a)
세럼(serum)
일 실시양태에서 세럼은 기본 배양 배지(예를 들어, 전술한 AlyS505N, AIM-V 배지, 또는 RPMI1640 등)에 첨가될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 출원의 제2 조성물은 세럼을 포함할 수 있다. 상기 세럼은 고분자 단백질, 및 저분자 영양분 등을 함유하고 있으며, 세포의 성장에 필요한 성분들을 함유하고 있다. 상기 세럼은 인간 세럼을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시양태에서, 일 실시양태에서, 배지 내 인간 세럼이 약 10 부피% 이하 농도로 첨가되어 사용될 수 있다. 다른 실시양태에서, 배지 내 인간 세럼이 약 9부피% 이하, 약 8 부피% 이하, 약 7 부피%이하, 약 6 부피%이하, 약 5 부피% 이하, 약 4부피% 이하 또는 3부피% 이하 농도로 첨가되어 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, CTS-AIM-V 배지에 인간 세럼이 약 3부피% 로 첨가되어 사용될 있다.
일 실시양태에서, 상기 세럼이 제2 조성물에 포함되는 경우, 제2 조성물에 포함된 상기 세럼의 농도는 약 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 부피% 이거나, 또는 전술한 부피% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 조성물에 포함된 상기 세럼의 농도는 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 부피% 이거나, 또는 전술한 부피% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 조성물에 포함된 상기 세럼의 농도는 약 5, 4, 3, 2, 또는 1 부피% 이거나, 또는 전술한 부피% 이하일 수 있다.
일 실시양태에서, 제2 조성물에 포함된 인간 세럼의 농도는 약 5, 4, 3, 2, 또는 1 부피%일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 조성물에 포함된 인간 세럼의 농도는 약 3 부피%일 수 있다.
b)
플라즈마
일 실시양태에서, 플라즈마는 기본 배지에 첨가될 수 있다. 일 실시양태에서, 본 출원의 제2 조성물은 플라즈마를 포함할 수 있다. 상기 플라즈마는 세럼에서 피브리노겐이 제외된 것을 의미한다. 상기 플라즈마는 세포의 성장에 필요한 성분들을 함유하고 있다.
본 출원에서 사용되는 플라즈마는 인간 플라즈마 또는 환자의 혈액에서 분리한 플라즈마일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시양태에서, 플라즈마는 세럼 대신 배지에 첨가되어 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 배지 내 플라즈마가 약 10 부피% 이하 농도로 첨가되어 사용된다. 다른 실시양태에서, 배지 내 플라즈마가 약 9부피%이하, 약 8 부피%이하, 약 7 부피%이하, 약 6 부피%이하, 약 5 부피%이하, 약 4부피% 이하 또는 3부피% 이하 농도로 첨가되어 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, CTS-AIM-V 배지에 플라즈마가 약 3부피% 로 첨가되어 사용된다.
일 실시양태에서, 상기 플라즈마가 제2 조성물에 포함되는 경우, 제2 조성물에 포함된 상기 플라즈마의 농도는 약 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 부피% 이거나, 또는 전술한 부피% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 조성물에 포함된 상기 플라즈마의 농도는 약 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1 부피% 이거나, 또는 전술한 부피% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 조성물에 포함된 상기 플라즈마의 농도는 약 5, 4, 3, 2, 또는 1 부피% 이거나, 또는 전술한 부피% 이하일 수 있다.
일 실시양태에서, 제2 조성물에 포함된 플라즈마의 농도는 약 5, 4, 3, 2, 또는 1 부피%일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 조성물에 포함된 플라즈마의 농도는 약 3 부피%일 수 있다.
c)
IL-2
본 출원에서 사용되는 IL-2는 인터루킨(Interleukin)-2로 T 세포 증식을 촉진하는 인자를 의미한다. 상기 IL-2는 인간 재조합 IL-2 형태를 포함한 다양한 형태의 IL-2를 포함한다.
일 실시양태에서, 제2 조성물은 IL-2를 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 일 실시양태에서, IL-2의 농도는 약 10000IU/mL 이하로 배지에 첨가될 수 있다. 일 실시양태에서, IL-2의 농도는 약 9000IU/mL, 약 8000IU/mL, 약 7000IU/mL, 약 6000IU/mL, 약 5000IU/mL, 약 4000IU/mL, 약 3000IU/mL, 약 2000IU/mL, 약 1000IU/mL 또는 약 500IU/mL으로 배지에 첨가될 수 있다. 특정한 실시양태에서, CTS-AIM-V 배지에 IL-2가 약 2000IU/mL로 첨가될 수 있다.
일 실시양태에서, 제2 조성물은 약 10000IU/mL, 약 9500IU/mL, 약 9000IU/mL, 약 8500IU/mL, 약 8000IU/mL, 약 7500IU/mL, 약 7000IU/mL, 약 6500IU/mL, 약 6000IU/mL, 약 5500IU/mL, 약 5000IU/mL, 약 4500IU/mL, 약 4000IU/mL, 약 3500IU/mL, 약 3000IU/mL, 약 2500IU/mL, 약 2000IU/mL, 약 1500IU/mL, 약 1000IU/mL, 약 900IU/mL, 약 800IU/mL, 약 700IU/mL, 약 600IU/mL, 약 500IU/mL, 약 400IU/mL, 약 300IU/mL, 약 200IU/mL, 또는 약 100IU/mL 의 농도의 IL-2를 포함하거나, 또는 전술한 값들 중 선택되는 두 값에 의해 설정되는 범위의 농도의 IL-2를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 조성물은 약 3000IU/mL, 약 2500IU/mL, 약 2000IU/mL, 약 1500IU/mL, 또는 약 1000IU/mL 의 농도의 IL-2를 포함하거나, 또는 전술한 값들 중 선택되는 두 값에 의해 설정되는 범위의 농도의 IL-2를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 조성물은 약 2000IU/ml 농도의 IL-2를 포함할 수 있다.
d)
항-CD3항체
항-CD3 항체는 T 세포 표면의 막 단백질인 CD3 수용체를 표적으로 하는 항체를 의미한다.
일 실시양태에서, 제2 조성물은 항-CD3 항체를 포함할 수 있다. 일 실시양태에서, 항-CD3 항체는 OKT3, 오테리시주맙, 테플리주맙, 및 비실리주맙 중에서 선택되는 어느 하나이거나, 둘 이상의 조합일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 조성물에 포함되는 항-CD3 항체는 OKT3일 수 있다.
일 실시양태에서, 배지에 항 CD-3 항체가 약 1ng/mL, 약 2ng/mL, 약 3ng/mL, 약 4ng/mL, 약 5ng/mL, 약 10ng/mL, 약 15ng/mL, 약 20ng/mL, 약 25ng/mL, 약 30ng/mL, 약 35ng/mL, 약 40ng/mL, 약 45ng/mL, 약 50ng/mL, 약 60ng/mL, 약 70ng/mL, 약 80ng/mL, 약 90ng/mL, 약 100ng/mL, 약 200ng/mL, 약 300ng/mL, 약 400ng/mL, 약 500ng/mL, 또는 약 1000 ng/mL 의 농도로 첨가되거나, 또는 전술한 값들 중 선택되는 두 값으로 설정되는 범위의 농도로 첨가되어 사용될 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 항-CD3 항체가 제2 조성물에 포함되는 경우, 제2 조성물에 포함된 상기 항-CD3 항체의 농도는 약 1ng/mL, 약 2ng/mL, 약 3ng/mL, 약 4ng/mL, 약 5ng/mL, 약 10ng/mL, 약 15ng/mL, 약 20ng/mL, 약 25ng/mL, 약 30ng/mL, 약 35ng/mL, 약 40ng/mL, 약 45ng/mL, 약 50ng/mL, 약 60ng/mL, 약 70ng/mL, 약 80ng/mL, 약 90ng/mL, 약 100ng/mL, 약 200ng/mL, 약 300ng/mL, 약 400ng/mL, 약 500ng/mL, 또는 약 1000 ng/mL 이거나, 또는 전술한 값들 중 선택되는 두 값으로 설정되는 범위일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 조성물에 포함되는 항-CD3 항체의 농도는 약 30ng/mL일 수 있다.
e)
피더 세포(feeder cell)
i) 피더세포 비율
본 출원에서 사용되는 피더세포는 제2 조성물에 포함되어, 제2 면역세포 집단을 증폭할 때 TIL을 활성화하고 증폭시키는 역할을 하는 세포를 의미한다. 일 실시양태에서, 피더세포는 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)를 포함하고, 이 때, 상기 말초 혈액 단핵세포는 둥근 핵을 가진 말초 혈액 세포를 의미한다.
일 실시양태에서, 피더 세포는 말초 혈액 단핵세포일 수 있다. 일 실시양태에서, 피더 세포는 불활성화된 말초 혈액 단핵세포일 수 있다. 일 실시양태에서, 피더 세포는 동종이형(allogenic) 말초혈액 단핵세포일 수 있다. 일 실시양태에서, 피더 세포는 불활성화된 동종이형 말초혈액 단핵세포일 수 있다. 이때, 상기 말초 혈액 단핵세포는 방사선을 조사하여 불활성화시킬 수 있으나, 말초 혈액 단핵세포를 불활성화 시키는 방법은 달리 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 말초 혈액 단핵세포는 약 60Gy의 방사선 조사를 통해 불활성화될 수 있다.
상기 피더 세포는 제2 조성물에 제2 면역세포 집단(TIL)에 대하여 일정한 비율로 첨가될 수 있다. 일 실시양태에서, 제2 면역세포집단이 제2 조성물에 현탁된 후를 기준으로, 상기 피더 세포는 제2 면역세포 집단의 세포와 다음의 비율(제2 면역세포 집단에 포함된 세포 : 피더 세포)을 이루도록 제2 조성물에 포함될 수 있다:
약 1:1000, 약 1:900, 약 1:800, 약 1:700, 약 1:600, 약 1:500, 약 1:450, 약 1:400, 약 1:350, 약 1:300, 약 1:280, 약 1:260, 약 1:240, 약 1:220, 약 1:200, 약 1:180, 약 1:160, 약 1:140, 약 1:120, 약 1:100, 약 1:90, 약 1:80, 약 1:70, 약 1:60, 또는 약 1:50.
특정한 실시양태에서, 피더 세포는 면역세포 집단과 비율(제2 면역세포 집단에 포함된 세포:피더 세포)이 1:200(±100)이 되도록 제2 조성물에 포함될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 피더 세포는 면역세포 집단과 비율(제2 면역세포 집단에 포함된 세포:피더 세포)이 약 1:200이 되도록 제2 조성물에 포함될 수 있다.
ii) 말초 혈액 단핵세포의 분리
일 실시양태에서, 피더 세포는 말초혈액 단핵세포일 수 있다. 이때, 상기 말초 혈액 단핵세포는 건강한 사람의 혈액으로부터 분리될 수 있다. 피더 세포가 불활성화된 동종 이형 말초혈액 단핵세포인 경우, 상기 불활성화된 동종 이형 말초혈액 단핵세포는 건강한 사람의 혈액으로부터 분리된 말초 혈액 세포를 불활성화 시켜 (예를 들어, 방사선 조사를 통한 불활성화) 제조된다.
건강한 사람으로부터 말초 혈액 단핵세포의 분리는 공지된 방법을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 말초 혈액 단핵세포를 분리하는 방법은 피콜(ficoll) 용액을 이용하여 분리하는 일반적인 방법을 포함할 수 있다.
f)
항생제
일 실시양태에서, 제2 조성물은 항생제를 더 포함할 수 있다.
상기 항생제는 세포 배양 및/또는 증폭 시 박테리아, 진균류 등에 의한 오염을 방지하기 위해 사용될 수 있다.
완제품 생산에서 항생제의 사용 여부는 사용되는 제1 면역세포 집단 또는 제2 면역세포 집단의 상태, 배양 및/또는 증폭되는 세포의 상태 등을 적절히 고려하여 결정될 수 있다.
제2 조성물이 항생제를 포함하는 경우, 상기 항생제는 세포의 배양 및/또는 증폭에 영향을 주지 않는 농도로 포함되며, 이때 세포 독성을 나타내는 항생제의 농도가 고려될 수 있다. 제2 조성물에 포함되는 항생제의 농도는 항생제의 종류에 따라 달라질 수 있다.
상기 제2 조성물에 포함될 수 있는 항생제의 예시로는, 앰피실린, 젠타마이신, 카나마이신, 네오마이신, 페니실린, 및 스트렙토마이신 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 즉, 세포의 배양 및/또는 증폭을 위한 배지에 첨가되는 항생제로 당업계에 공지된 항생제가 모두 사용될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 조성물은 젠타마이신을 포함할 수 있다.
전술한 바와 같이, 본 출원에서 제2 조성물은 배양 배지 및 첨가제를 포함한다. 일 실시양태에서, 제2 조성물은 배지, 세럼, IL-2, 항-CD3 항체, 및 피더 세포를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 제2 조성물은 배지, 플라즈마, IL-2, 항-CD3 항체, 및 피더 세포를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제2 조성물은 배지, 세럼, IL-2, 항-CD3 항체, 피더 세포, 및 항생제를 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 제2 조성물은 배지, 플라즈마, IL-2, 항-CD3 항체, 피더 세포, 및 항생제를 포함할 수 있다. 다만 이에 제한되지 않는다.
특정한 실시양태에서, 제2 조성물은 배지, 세럼, IL-2, OKT3, 및 피더 세포를 포함하고, 이때 배지는 CTS-AIM-V 배지이고, 세럼은 인간 AB 세럼이 약 3 부피%로 제2 조성물에 포함되고, IL-2는 약 2000IU/ml 의 농도로 제2 조성물에 포함되고, OKT3는 30ng/ml 의 농도로 제2 조성물에 포함되며, 피더 세포는 불활성화된 동종이형 말초 혈액 단핵세포이다. 이때 상기 불활성화된 동종이형 말초 혈액 단핵세포는 면역세포 집단에 포함된 세포와의 비율이 1:200 (면역세포 집단에 포함된 세포:피더 세포)가 되도록 제2 조성물에 포함될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 제2 조성물은 배지, 세럼, IL-2, OKT3, 항생제, 및 피더 세포를 포함하고, 이때 배지는 CTS-AIM-V 배지이고, 세럼은 인간 AB 세럼이 약 3 부피%로 제2 조성물에 포함되고, IL-2는 약 2000IU/ml 의 농도로 제2 조성물에 포함되고, OKT3는 30ng/ml 의 농도로 제2 조성물에 포함되며, 피더 세포는 불활성화된 동종이형 말초 혈액 단핵세포이다. 이때 상기 불활성화된 동종이형 말초 혈액 단핵세포는 면역세포 집단에 포함된 세포와의 비율이 1:200 (면역세포 집단에 포함된 세포:피더 세포)가 되도록 제2 조성물에 포함될 수 있다.
제2 면역세포 집단을 파종함의 구체적인 일 예시는 다음과 같이 설명될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
제1 면역세포 집단 또는 동결 보존 후 해동된 제1 면역세포 집단에서 제2 면역세포 집단을 수득한다. 제2 면역세포 집단은 제2 조성물로 현탁되어 제2 컨테이너인 GREX 100M에 파종되며, 이때 하나의 컨테이너 당 약 4E5의 세포 수를 갖도록 파종된다. 이때 제2 조성물은 CTS-AIM-V 배지, 3 부피% 인간 세럼, 2000IU/ml의 IL-2, 30ng/ml의 OKT3, 및 불활성화된 동종이형 말초 혈액 단핵세포를 포함하며, 이때 상기 불활성화된 동종이형 말초혈액 단핵세포는, 제2 면역세포 집단이 제2 조성물에 현탁된 후를 기준으로, 제2 면역세포 집단에 포함된 세포와 약 1:200(제2 면역세포 집단에 포함된 세포:불활성화된 동종이형 말초 혈액 단핵세포)의 비율을 이루도록 제2 조성물에 포함된다. 즉, 제2 면역세포 집단을 제2 조성물에 현탁시키고, 제2 면역세포집단이 포함된 제2 조성물을 하나의 컨테이너 당 20ml씩 첨가한다.
2. 제2 면역세포 집단을 증폭함
개요
본 출원의 면역세포 조성물을 생산하는 방법은 제2 면역세포 집단을 증폭함을 포함한다. 일 실시양태에서, 본 출원의 면역세포 조성물을 생산하는 방법은 제3 면역세포 집단을 생산하기 위하여 제2 면역세포 집단을 증폭함을 포함한다.
파종된 제2 면역세포 집단은 제2 컨테이너의 제2 조성물에서 증폭 기간동안 증폭되고, 이를 통해 제3 면역세포 집단이 생산된다. 상기 제3 면역세포 집단은 제2 면역세포 집단을 증폭하여 얻은 면역세포 집단을 의미한다.
제2 면역세포 집단을 증폭함은 제2 첨가 조성물이 보충됨을 포함할 수 있다.
이하에서, 제2 면역세포 집단을 증폭함에 대하여 구체적으로 개시한다.
제2 컨테이너에 제2 첨가 조성물이 보충되는 과정
상기 제2 면역세포 집단의 증폭 동안, 제2 첨가 조성물이 제2 컨테이너로 보충될 수 있다. 이때, 제2 첨가 조성물은 배지, 세럼, 플라즈마, 항생제, IL-2, 항-CD3 항체, 및 피더세포 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 첨가 조성물은 배지, 세럼, 및 IL-2를 포함할 수 있다.
제2 첨가 조성물이 보충되는 과정을 아래에서 상세하게 개시한다.
1)
보충 횟수
상기 제2 면역세포 집단이 제2 컨테이너의 제2 조성물에서 배양되는 동안, 제2 첨가 조성물이 제2 컨테이너로 추가(보충)된다.
일 실시양태에서, 증폭 동안 제2 첨가 조성물은 제2 컨테이너에 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 또는 10회 보충될 수 있거나, 전술한 횟수 이상 보충될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 증폭 기간동안 제2 첨가 조성물은 4회 보충될 수 있다.
증폭 동안, 제2 첨가 조성물이 2회 이상 첨가되는 경우, 제2 첨가 조성물은 보충 시점마다 동일한 양으로 보충될 수 있거나, 보충 시점마다 다른 양으로 보충될 수 있다. 보충되는 제2 첨가 조성물의 양은 관련 단락에서 상세히 설명된다.
2) 보충 시점
이때, 일 실시양태에서, 상기 제2 첨가 조성물은 증폭 시작일부터 2일째, 3일째, 4일째, 5일째, 6일째, 7일째, 8일째, 9일째, 10일째, 11일째, 12일째, 13일째, 14 일째, 15 일째, 16 일째, 17 일째, 18 일째, 19 일째, 20 일째, 및 21 일째 중에서 어느 하나 이상의 일자에 보충될 수 있고, 증폭 기간동안 총 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회 또는 10회 보충될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 제2 첨가 조성물은 4일째, 6일째, 8일째, 및 10일째에 보충되어 4회 보충된다.
3) 보충량
제2 첨가 조성물이 보충되는 양은 컨테이너의 종류 및/또는 보충되는 시점 등에 따라 달라질 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 제2 첨가 조성물은 보충 시점마다 동일한 양으로 보충될 수 있다. 다른 실시양태에서, 상기 제2 첨가 조성물은 보충 시점마다 다른 양으로 보충될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 제2 첨가 조성물은 보충 시점마다 보충되는 양이 증가되어 보충될 수 있다.
일 실시양태에서, 보충 시점마다 동일한 양으로 또는 다른 양으로 약 1mL, 2mL, 3mL, 4mL, 5mL, 6mL, 7mL, 8mL, 9mL, 10mL, 11mL, 12mL, 13mL, 14mL, 15mL, 16mL, 17mL, 18mL, 19mL 20mL, 21mL, 22mL, 23mL, 24mL, 25mL, 26mL, 27mLm 28mL, 29mL, 30mL, 32mL, 35mL, 37mL, 40mL, 45mL, 50mL, 55mL, 60mL, 65mL, 70mL, 80mL, 90mL, 100mL, 110mL, 120mL, 130mL, 140mL, 150mL, 160mL, 170mL, 180mL, 190mL, 200mL, 250mL, 300mL, 350mL, 400mL, 450mL, 500mL, 550mL, 600mL, 650mL, 700mL, 750mL, 800mL, 850mL, 900mL, 950mL, 1000mL, 1500mL, 2L, 3L, 4L, 또는 5L 보충될 수 있거나, 또는 전술한 값 이상의 양으로 보충될 수 있다. 다만 이에 제한되지 않고, 보충되는 제2 첨가 조성물의 양은 다양한 조건(예를 들어, 컨테이너의 용량, 배양되는 세포의 상태, 및/또는 보충 시점 등)을 고려하여 적절한 값으로 결정될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 첨가 조성물은 보충 시점마다 보충되는 양이 증가되어 보충될 수 있고, 4일째 20ml, 6일째 60ml, 8일째 180ml, 및 10일째 540ml 의 제2 첨가 조성물이 제2 컨테이너에 첨가될 수 있다.
4) 제2 첨가 조성물의 조성
제2 컨테이너에 보충되는 제2 첨가 조성물은 배지, 세럼, 플라즈마, IL-2, 항-CD3 항체, 및 피더 세포 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 제2 첨가 조성물은 배지; 세럼; 및 IL-2를 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 제2 첨가 조성물은 배지; 플라즈마; 및 IL-2를 포함할 수 있다.
특정한 실시양태에서, 제2 첨가 조성물은 배지; 세럼; 및 IL-2를 포함할 수 있다. 다른 특정한 실시양태에서, 제2 첨가 조성물은 배지, 세럼, 및 IL-2에 더하여, 항-CD3 항체 및 피더 세포 중 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
상기 제2 첨가 조성물에 포함될 수 있는 각각의 구성에 대한 실시양태는, 제2 조성물에서 전술한 바와 같다.
a) 배지
제2 첨가 조성물에 포함될 수 있는 배지와 관련된 실시양태는 제2 조성물에서 전술한 바와 같다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 상기 제2 첨가 조성물에 포함된 배지는 CTS-AIM-V 배지일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
b) 세럼
제2 첨가 조성물에 세럼이 포함되는 경우, 세럼과 관련된 실시 양태는 제2 조성물에서 전술한 바와 같다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 상기 세럼은 인간 세럼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 제2 첨가 조성물에 포함된 상기 세럼의 농도는 약 3 부피%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
c) 플라즈마
제2 첨가 조성물에 플라즈마가 포함되는 경우, 플라즈마와 관련된 실시 양태는 제2 조성물에서 전술한 바와 같다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 상기 플라즈마는 인간 플라즈마일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 제2 첨가 조성물에 포함된 상기 플라즈마의 농도는 약 3 부피%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
d) IL-2
제2 첨가 조성물에 IL-2가 포함되는 경우, IL-2와 관련된 실시 양태는 제2 조성물에서 전술한 바와 같다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 제2 첨가 조성물에 포함된 상기 플라즈마의 농도는 약 2000IU/ml 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
e) 항-CD3 항체
제2 첨가 조성물에 항-CD3 항체가 포함되는 경우, 항-CD3 항체와 관련된 실시 양태는 제2 조성물에서 전술한 바와 같다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 항-CD3 항체는 OKT3 일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 제2 첨가 조성물에 포함된 항-CD3 항체의 농도는 약 30ng/ml일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
f) 피더 세포
제2 첨가 조성물에 피더 세포가 포함되는 경우, 피더 세포와 관련된 실시 양태는 제2 조성물에서 전술한 바와 같다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 피더 세포는 불활성화된 동종이형 말초혈액 단핵세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 특정한 실시양태에서, 피더 세포는 제2 컨테이너에 포함된 면역세포를 기준으로 또는 제2 컨테이너에 초기에 파종된 제2 면역세포 집단에 포함된 세포를 기준으로, 1:200 (면역세포 또는 제2 면역세포 집단에 포함된 세포:피더 세포)의 비율을 이루도록 제2 첨가 조성물에 포함될 수 있다.
g) 항생제
제2 첨가 조성물에 항생제가 포함되는 경우, 항생제와 관련된 실시양태는 제2 조성물에서 전술한 바와 같다.
일 실시양태에서, 제2 컨테이너에 보충되는 제2 첨가 조성물의 조성은 보충 시점마다 다를 수 있다. 다른 실시양태에서, 제2 컨테이너에 보충되는 제2 첨가 조성물의 조성은 보충 시점마다 동일할 수 있다.
일 실시양태에서, 제2 컨테이너에 보충되는 제2 첨가 조성물의 조성은 제2 조성물과 같을 수 있다. 다른 실시양태에서, 제2 컨테이너에 보충되는 제2 첨가 조성물의 조성은 제2 조성물과 다를 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 첨가 조성물은 제2 조성물에서 항-CD3 항체 및 피더세포를 제외한 것과 같은 조성물질 및 조성비를 갖는 조성물일 수 있다.
일 실시양태에서, 제2 컨테이너에 보충되는 제2 첨가 조성물은 배지, 세럼, 및 IL-2를 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 컨테이너에 보충되는 제2 첨가 조성물은 CTS-AIM-V 배지, 약 3 부피% 인간 세럼, 및 약 2000IU/ml의 IL-2를 포함할 수 있다.
증폭 과정 동안 새로운 면역세포의 추가 여부
상기 제2 면역세포 집단이 제2 컨테이너에서 증폭되는 동안, 상기 제2 면역세포 집단에 외부로부터 면역 세포가 더 추가되지 않는다.
또한, 이러한 증폭 공정에서, 컨테이너의 변경은 선택적으로 이루어질 수 있지만, 제2 면역세포 집단이 증폭되는 동안, 상기 제2 컨테이너 이외의 다른 컨테이너로 옮기지 않아도 되므로, 이는 공정상의 편의성을 제공하는 장점이 있다
이는, 본 출원의 방법에서, 상기 제2 면역세포 집단이 증폭되는 동안, 상기 제2 컨테이너 이외의 다른 컨테이너로 옮겨지거나, 외부로부터 상기 제2컨테이너에 면역세포를 새롭게 더 추가시키지 않아도 무방함을 의미한다.
증폭 기간
상기 제2 면역세포집단은 제2 컨테이너에서 일정 기간동안 증폭된다. 일 실시양태에서, 제2 면역세포집단은 약 1일 이상 증폭된다. 일 실시양태에서, 상기 제2 면역세포집단은 약 2일 이상, 3 일 이상, 4 일 이상, 5 일 이상, 6 일 이상, 7 일 이상, 8 일 이상, 9 일 이상, 10 일 이상, 11 일 이상, 12 일 이상, 13 일 이상, 14 일 이상, 15 일 이상, 16 일 이상, 17 일 이상, 18 일 이상, 19 일 이상, 20 일 이상, 21 일 이상, 22일 이상, 23일 이상, 또는 24일 이상 증폭될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 면역세포집단은 제2 컨테이너에서 약 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 또는 21일 동안 증폭될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제2 면역세포집단은 제2 컨테이너에서 약 14일동안 증폭될 수 있다.
증폭 효율
제2 컨테이너에 파종된 제2 면역세포집단은 제2 면역세포 집단을 증폭함을 통해 일정 배수 이상 증폭될 수 있다. 즉, 파종된 제2 면역세포집단은 제2 컨테이너에서 일정 배수 이상 증폭된다.
일 실시양태에서, 파종된 제2 면역세포집단이 제2 컨테이너에서 증폭되어 제3 면역세포 집단이 생산될 수 있다. 제3 면역세포 집단은 제2 면역세포 집단과 비교하여 일정 배수 이상의 세포 수를 갖는다. 일 실시양태에서, 상기 제3 면역세포집단은 제2 면역세포 집단과 비교하여 약 100배 이상의 세포수를 가진다. 일 실시양태에서, 제3 면역세포집단은 제2 면역세포집단과 비교하여 약 200배, 약300배, 약400배, 약500배, 약600배, 약700배, 약800배, 약900배, 약1000배, 약 1100배, 약1200배, 약 1300배, 약1400배, 약1500배, 약1600배, 약1700배, 약1800배, 약1900배, 약2000배, 약2200배, 약2300배, 약2400배, 약2500배, 약2600배, 약2700배, 약2800배, 약3000배, 약3500배, 약4000배, 약4500배, 약5000배, 약5500배, 약6000배, 약6500배, 약7000배, 약7500배, 약8000배, 약8500배, 약9000배, 약9500배, 약10000배, 또는 약20000배 이상의 세포 수를 가질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제3 면역세포집단은 제2 면역세포집단과 비교하여 약 2500배 이상의 세포수를 가질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제3 면역세포집단은 제2 면역세포집단과 비교하여 약 9400배 이상의 세포수를 가질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제3 면역세포집단은 제2 면역세포집단과 비교하여 약 2500배 내지 약 9400배의 세포 수를 가질 수 있다.
제2 면역세포 집단을 증폭함의 구체적인 일 예시는 다음과 같이 설명될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
- 제2 조성물에 현탁되어 파종된 제2 면역세포집단을 14일의 증폭 기간동안 증폭한다.
- 증폭 시작일로부터 4일, 6일, 8일, 및 10일째 제2 컨테이너로 제2 첨가 조성물이 보충된다. 이때 보충되는 제2 첨가 조성물은 CTS-AIM-V 배지, 3 부피% 인간 세럼, 및 2000IU/ml IL-2를 포함한다. 보다 상세하게, 제2 첨가 조성물은 증폭 시작일로부터 4일째 제2 컨테이너에 20ml 보충되고, 6일째 제2 컨테이너에 60ml 보충되고, 8일째 제2 컨테이너에 180ml 보충되고, 10일째 제2 컨테이너에 540ml 보충된다.
- 14일 동안의 증폭과정을 통해 제2 면역세포 집단으로부터 제3 면역세포 집단이 생산된다.
3. 면역세포 조성물(면역 조성물)을 생산함
개요
본 출원의 면역세포 조성물 또는 면역 조성물을 생산하는 방법은, 전술한 공정을 통해 수득한 면역세포들을 유효성분으로 포함하는 면역(세포) 조성물을 제조함을 포함할 수 있다.
제2 면역세포 집단의 증폭이 완료된 후, 증폭물로부터 제3 면역세포 집단을 수득하여 면역(세포) 조성물을 제조한다.
일 실시양태에서, 상기 면역(세포) 조성물은 제3 면역세포 집단을 유효성분으로 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 면역(세포) 조성물은 제3 면역세포 집단으로부터 유래한 제4 면역세포 집단을 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 면역세포 조성물 또는 면역 조성물은 “면역세포 집단”을 유효성분으로 포함하는 조성물을 의미한다. 이때, 상기 면역세포 집단은 종양 침윤 림프구를 포함할 수 있고, 이에 본 출원의 면역세포 조성물(면역 조성물)은 종양 침윤 림프구(TIL)를 유효성분으로 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 면역세포 조성물을 생산함은 증폭된 증폭물로부터 제3 면역세포 집단을 수득함을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 면역세포 조성물을 생산함은 증폭된 증폭물로부터 제3 면역세포 집단을 수득함에 더하여, 상기 제3 면역세포 집단으로부터 제4 면역세포 집단을 수득함을 더 포함할 수 있다.
면역세포 조성물의 생산함에 대하여 아래에서 구체적으로 개시한다.
제3 면역세포 집단의 수득
증폭된 증폭물로부터 제3 면역세포 집단을 수득한다. 제3 면역세포 집단을 수득하는 방법은 세포의 배양 또는 증폭 과정에서 세포를 수득하는 다양한 공지의 방법들을 포함할 수 있고, 달리 제한되지 않는다. 예를 들어, 제3 면역세포 집단을 수득함에는 후술하는 과정에 더하여, 세포 계수 및/또는 세포 생존율 확인 등의 당업계에서 통상적으로 수행되는 과정들이 더 포함될 수 있으나, 달리 제한되지 않는다.
일 실시양태에서, 제3 면역세포 집단을 수득함은 다음을 포함할 수 있다: 증폭과정을 통해 생산된 면역세포 집단을 제2 컨테이너로부터 회수함 (세포 회수). 즉, 증폭된 증폭물로부터 면역세포 집단을 회수하여 제3 면역세포 집단을 수득할 수 있다.
일 실시양태에서, 제3 면역세포 집단을 수득함은 다음을 더 포함할 수 있다: 회수된 면역세포 집단을 세척함 (세포 세척).
일 실시양태에서, 제3 면역세포 집단을 수득함은 증폭과정을 통해 생산된 면역세포 집단을 제2 컨테이너로부터 회수함을 포함한다. 이 때, 면역세포 집단을 회수하는 방법으로 당업계의 공지된 방법이 사용될 수 있고, 달리 제한되지 않는다. 일 실시양태에서, 상기 제2 컨테이너로부터 면역세포 집단을 회수하기 위해 원심분리 방법이 이용될 수 있다. 상기 원심분리는 예를 들어, 200g, 7분, RT, Acc9/Dcc9 조건으로 수행될 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일 실시양태에서, 제3 면역세포 집단을 수득함은 증폭과정을 통해 생산된 면역세포 집단을 제2 컨테이너로부터 회수함에 더해, 회수된 면역세포 집단을 세척함을 더 포함할 수 있다. 세포를 세척하는 과정은 당업계에 공지된 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 세포를 세척하는 과정에 원심분리 방법이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이때 면역세포 집단의 세척은 버퍼를 이용하여 수행될 수 있다. 이 때, 버퍼는 예를 들어 PBS, DPBS 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 실시양태에서, 상기 회수된 면역세포 집단은 DPBS를 이용하여 1회 이상, 2회 이상, 3회 이상, 4회 이상, 또는 5회 이상 세척될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 면역세포 집단은 DPBS를 이용하여 3회 세척될 수 있다.
제3 면역세포집단
일 실시양태에서, 상기 제3 면역세포 집단은 제2 면역세포집단과 비교하여 약 100배, 약200배, 약300배, 약400배, 약500배, 약600배, 약700배, 약800배, 약900배, 약1000배, 약 1100배, 약1200배, 약 1300배, 약1400배, 약1500배, 약1600배, 약1700배, 약1800배, 약1900배, 약2000배, 약2200배, 약2300배, 약2400배, 약2500배, 약2600배, 약2700배, 약2800배, 약3000배, 약3500배, 약4000배, 약4500배, 약5000배, 약5500배, 약6000배, 약6500배, 약7000배, 약7500배, 약8000배, 약8500배, 약9000배, 약9500배, 약10000배, 또는 약20000배 이상의 세포수를 가질 수 있다.
특정한 실시양태에서, 제3 면역세포집단은 제2 면역세포집단과 비교하여 약 2500배 이상의 세포 수를 가질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제3 면역세포집단은 제2 면역세포집단과 비교하여 약 9400배 이상의 세포 수를 가질 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제3 면역세포집단은 제2 면역세포집단과 비교하여 약 2500배 내지 약 9400배의 세포 수를 가질 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제3 면역세포 집단은 면역세포를 포함한다. 제3 면역세포 집단은 종양 조직 근처에 존재하던 종양침윤림프구를 배양 및/또는 증폭하여 수득된 것으로서, 면역세포는 종양침윤림프구일 수 있다. 이때 제3 면역세포 집단에 포함된 세포 중에서, 면역세포의 비율은 약 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9% 이상일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 제3 면역세포 집단에 포함된 세포 중에서, 종양침윤림프구의 비율은 약 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9% 이상일 수 있다. 이때, 제3 면역세포 집단에 포함된 세포는 생존한 세포를 의미하는 것일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제3 면역세포 집단은 T 세포를 포함한다. 이때, 제3 면역세포 집단은 종양침윤림프구를 포함하고, 종양침윤림프구는 T 세포를 포함한다. 즉, 상기 제3 면역세포집단에 포함된 T 세포는 종양침윤림프구의 일종일 수 있다. 일 실시양태에서, 제3 면역세포 집단에 포함된 세포 중에서 T 세포의 비율은 약 60, 65, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 제3 면역세포 집단에 포함된 세포 중, T 세포의 비율은 약 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 제3 면역세포 집단에 포함된 세포 중 T 세포의 비율은 약 99% 이상일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 제3 면역세포 집단에 포함된 세포 중 T 세포의 비율은 약 99.5%, 99.6, 99.7, 99.8, 또는 99.9% 이상일 수 있다. 이때, 제3 면역세포 집단에 포함된 세포는 생존한 세포를 의미하는 것일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제3 면역세포 집단에 포함된 세포 중 NK 세포(natural killer cell) 세포의 비율은 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 제3 면역세포 집단에 포함된 세포 중 NK 세포(natural killer cell) 세포의 비율은 10% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, NK 세포의 비율은 1% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, NK 세포의 비율은 0.2% 이하일 수 있다. 이때, 제3 면역세포 집단에 포함된 세포는 생존한 세포를 의미하는 것일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 제3 면역세포 집단에 포함된 세포 중 B 세포의 비율은 5, 4, 3, 2, 또는 1% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, B 세포의 비율은 1% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, B 세포의 비율은 0.2% 이하일 수 있다. 이때, 제3 면역세포 집단에 포함된 세포는 생존한 세포를 의미하는 것일 수 있다.
선택적으로 포함될 수 있는 과정: 제3 면역세포 집단으로부터 제4 면역세포 집단을 수득함
일 실시양태에서, 면역세포 조성물을 생산함은 제3 면역세포 집단을 수득함에 더하여, 제3 면역세포 집단으로부터 제4 면역세포 집단을 수득함을 더 포함할 수 있다.
이때, 상기 제4 면역세포 집단은 제3 면역세포 집단으로부터 세포 세척, 처리, 분리, 및/또는 세포 솔팅 과정을 통해 수득될 수 있으며, 달리 제한되지 않고 당업계에 공지된 방법을 통해 수득될 수 있다. 예를 들어, 제4 면역세포 집단은 대상에게 투여하기 적합한 상태로 처리된 제3 면역세포 집단일 수 있다.
세포 솔팅(sorting)
제3 면역세포 집단으로부터 제4 면역세포 집단을 수득함은 세포를 솔팅함을 포함할 수 있다. 세포 솔팅은 세포 집단을 포함하는 조성물에서 목적하는 세포만을 선별하기 위해 사용되는 방법을 의미한다. 세포 솔팅에는 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법이 사용될 수 있다. 예를 들어, FACS(fluorescence-activated cell sorting), 원심분리, 또는 세포의 용기에의 접착력에 따른 분리 등의 방법이 세포 솔팅을 위해 사용될 수 있다.
대상에게 투여하기 적합한 상태로 처리된 면역세포 집단
상기 수득된 제3 면역세포 집단 또는 세포의 세척 과정을 거친 제3 면역세포 집단은 대상(예를 들어, 환자)에게 투여하는데 적합한 상태로 처리될 수 있다.
일 예시로, 상기 수득된 제3 면역세포 집단 또는 세포의 세척 과정을 거친 제3 면역세포 집단; 또는 이들을 솔팅하여 수득한 세포면역 집단에 대하여 제약상 허용되는 물질로 처리할 수 있다. 예를 들어, 희석제, 및/또는 부형제 등과 같은 제약상 허용되는 물질에 현탁되어 환자에게 투여하기 적합한 상태로 처리될 수 있다. 이 때, 제약상 허용되는 물질은 등장성 식염수, 링거액, 인산염 완충액 또는 당업계에 공지된 무독성의 제약상 허용되는 물질 등을 포함할 수 있다.
면역세포 조성물 또는 면역 조성물
본 출원의 방법으로 제조된, 면역(세포) 조성물은 제3 면역세포 집단 또는 제4 면역세포 집단을 유효성분으로 포함한다.
일 실시양태에서, 면역세포 조성물은 제3 면역세포 집단 또는 제4 면역세포 집단을 포함하고, 대상에게 투여하기 적합한 상태로 처리된 조성물일 수 있다. 즉, 일 실시양태에서, 면역세포 조성물은 대상에게 투여하기 적합한 상태의 조성물일 수 있다.
이하에서는, 본 출원의 면역세포 조성물의 특징에 대하여 상세히 개시한다.
면역세포 조성물의 특징
전술한 바와 같이, 면역세포 조성물은 제3 면역세포 집단 또는 제3 면역세포 집단으로부터 수득된 제4 면역세포 집단을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 면역세포 조성물은 면역세포를 포함한다. 이때, 면역세포는 종양침윤림프구일 수 있다. 이때 면역세포 조성물에 포함된 세포 중에서, 면역세포의 비율은 약 60, 65, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9% 이상일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 면역세포 조성물에 포함된 세포 중에서, 종양침윤림프구의 비율은 약 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9% 이상일 수 있다. 이때, 면역세포 조성물에 포함된 세포는 생존한 세포를 의미하는 것일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 면역세포 조성물은 T 세포를 포함한다. 이때, 면역세포 조성물은 종양침윤림프구를 포함하고, 종양침윤림프구는 T 세포를 포함한다. 즉, 상기 면역세포 조성물에 포함된 T 세포는 종양침윤림프구의 일종일 수 있다. 일 실시양태에서, 면역세포 조성물에 포함된 세포 중에서 T 세포의 비율은 약 60, 65, 70%, 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 면역세포 조성물에 포함된 세포 중, T 세포의 비율은 약 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 면역세포 조성물에 포함된 세포 중 T 세포의 비율은 약 99% 이상일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 면역세포 조성물에 포함된 세포 중 T 세포의 비율은 약 99.5%, 99.6, 99.7, 99.8, 또는 99.9% 이상일 수 있다. 이때, 면역세포 조성물에 포함된 세포는 생존한 세포를 의미하는 것일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 면역세포 조성물에 포함된 세포 중 NK 세포(natural killer cell) 세포의 비율은 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 면역세포 조성물에 포함된 세포 중 NK 세포(natural killer cell) 세포의 비율은 10% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, NK 세포의 비율은 1% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, NK 세포의 비율은 0.2% 이하일 수 있다. 이때, 면역세포 조성물에 포함된 세포는 생존한 세포를 의미하는 것일 수 있다.
일 실시양태에서, 상기 면역세포 조성물에 포함된 세포 중 B 세포의 비율은 5, 4, 3, 2, 또는 1% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, B 세포의 비율은 1% 이하일 수 있다. 특정한 실시양태에서, B 세포의 비율은 0.2% 이하일 수 있다. 이때, 면역세포 조성물에 포함된 세포는 생존한 세포를 의미하는 것일 수 있다.
면역(세포) 조성물에 추가로 포함될 수 있는 물질
후술할 병용투여 단락에서와 같이, 제3 면역세포 집단 또는 제3 면역세포 집단으로부터 수득된 제4 면역세포 집단을 포함하는 면역세포 조성물은, 치료 효과를 증가시킬 수 있는 물질과 함께 투여될 수 있다.
이때, 함께 투여되는 물질은 예를 들어, IL-2(Interleukin-2)와 같은 인터루킨, 및/또는 면역관문억제제(immune check point inhibitor)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
일 실시양태에서, 면역관문억제제는, PD-L1 과 PD-1의 바인딩을 막는 물질일 수 있으며, 예를 들어, anti-PD-L1 제제 또는 anti-PD-1 제제일 수 있다. 일 실시양태에서, 면역관문억제제는 니볼루맙(Nivolumab), 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 세미플리맙(Cemiplimab), 도스탈리맙(Dostarlimab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab), 듀발루맙(Durvalumab), 및 이의 변이체 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 특정한 실시양태에서, 면역관문억제제는 니볼루맙(nivolumab)일 수 있다.
상술한 함께 투여될 수 있는 물질은 면역세포 조성물에 추가로 포함될 수 있다. 이 경우, 면역세포 조성물에 포함된 함께 투여될 수 있는 물질은 면역세포 조성물을 투여함과 동시에 대상에게 투여된다. 이때, 면역세포 조성물에 상술한 함께 투여될 수 있는 물질이 포함되는 경우, 상기 함께 투여될 수 있는 물질의 농도는 대상에게 투여하기 적절한 양이 고려되어 결정될 수 있다.
일 실시양태에서, 면역세포 조성물은 IL-2 및 면역관문억제제 중에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 면역세포 조성물은 IL-2를 더 포함할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 면역세포 조성물은 니볼루맙(nivolumab)을 더 포함할 수 있다.
생산된 면역(세포) 조성물의 이용
개요
생산된 면역세포 조성물은 이를 필요로 하는 대상에게 투여되는데 이용될 수 있다. 일 실시양태에서, 생산된 면역세포 조성물은 보관을 위해 동결 보존될 수 있다. 동결 보존된 면역세포 조성물은 해동되어 이를 필요로 하는 대상에게 투여되는데 이용될 수 있다. 이때, 면역세포 조성물이 동결 보존되는 기간은 달리 제한되지 않는다. 나아가, 이때, 면역세포 조성물을 동결 보존하는 방법은 달리 제한되지 않고, 면역세포 조성물의 동결 보존을 위해 당업계에 공지된 방법이 이용될 수 있다. 상기 면역세포 조성물의 투여는 투여 받지 않은 대상에 비해 특정한 의학적 상태의 증상이나, 질병의 진행을 지연시키는 효과를 가질 수 있다. 일 실시양태에서, 면역세포 조성물은 용기에 충전되어 대상에게 투여될 수 있다.
일 실시양태로, 본 출원의 면역세포 조성물을 생산하는 방법을 통해 생산된 면역세포 조성물 또는 면역 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 대상의 종양을 치료하는 방법이 제공된다.
일 실시양태로, 본 출원의 면역세포 조성물을 생산하는 방법을 통해 생산된 면역세포 조성물 또는 면역 조성물의, 대상의 종양을 치료하기 위한 용도가 제공된다.
면역세포 조성물을 용기에 충전함
제3 면역세포 집단 또는 제3 면역세포 집단으로부터 수득된 제4 면역세포 집단을 포함하는 면역세포 조성물은 용기에 충전될 수 있다. 이때 용기는 대상에게 본 출원의 방법에 따라 증폭된 종양 침윤 림프구를 주입하기 위한 주입 용기일 수 있다. 이때 면역세포 조성물은 대상(예를 들어, 환자)에게 투여하기 적합한 양을 고려하여 용기에 충전될 수 있다. 이때 환자의 상태, 면역세포 조성물에 포함된 면역세포의 상태 등이 고려될 수 있다.
일 실시양태에서, 면역세포의 농도가 약 1E8/200mL, 2E8/200mL, 3E8/200mL, 4E8/200mL, 5E8/200mL, 6E8/200mL, 7E8/200mL, 8E8/200mL, 9E8/200mL, 1E9/200mL, 2E9/200mL, 3E9/200mL, 4E9/200mL, 5E9/200mL, 6E9/200mL, 7E9/200mL, 8E9/200mL, 9E9/200mL, 1E10/200mL, 2E10/200mL, 3E10/200mL, 4E10/200mL, 5E10/200mL, 6E10/200mL, 7E10/200mL, 8E10/200mL, 9E10/200mL, 1E11/200mL, 2E11/200mL, 3E11/200mL, 4E11/200mL, 또는 5E11/200mL 이상이 되도록 하여, 면역세포를 용기에 충전할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특정한 실시양태에서, 면역세포의 농도가 약 1E9/200mL 이상이 되도록 하여 면역세포를 용기에 충전할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 면역세포의 농도가 약 1E10/200mL 이상이 되도록 하여 면역세포를 용기에 충전할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 면역세포의 농도가 1E10/200mL 내지 1.3E11/200mL가 되도록 하여 면역세포를 용기에 충전할 수 있다.
투여 대상
상기 면역세포 조성물은 이를 필요로 하는 대상에게 투여될 수 있다. 상기 대상은 종양을 가지고 있는 인간을 포함한다. 이때, 상기 종양은 고형 종양 또는 액상 종양을 포함하며, 상기 고형 종양은 유방암, 폐암, 위암, 난소암, 신장암, 흑색종을 포함하는 피부암 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 액상 종양은 백혈병, 림프종을 포함하는 혈액암, 폐암 환자의 흉수(Pleural Effusion) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 특정한 실시양태에서, 상기 면역세포 조성물은 유방암을 가지고 있는 인간에게 투여될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 면역세포 조성물은 폐암을 가지고 있는 인간에게 투여될 수 있다.
일 실시양태에서, 면역세포 조성물을 필요로 하는 대상은 I. 반제품 생산에서 종양 조직을 제공한 대상일 수 있다. 예를 들어, 대상으로부터 유래된 종양 샘플(대상으로부터 수득된 종양 조직으로부터 얻어짐)을 통해 본 방법을 이용하여 생산된 면역세포 조성물은 다시 상기 동일한 대상으로 투여될 수 있다.
투여 방법
상기 면역세포 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 방법은 당업자에게 공지된 방법 중의 하나일 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 면역세포 조성물은 동맥내, 정맥내, 피부 내 또는 복강 내 등으로 투여될 수 있다. 특정한 실시양태에서, 상기 면역세포 조성물은 동맥 내 또는 정맥 내로 투여된다.
일 실시양태에서, 상기 면역세포 조성물은 추가적인 물질과 함께 투여될 수 있다. 이때, 상기 함께 투여는 면역세포 조성물을 추가적인 물질의 투여 전, 투여 후 또는 추가적인 물질과 함께 동시에 투여하는 것을 모두 포함한다. 상기 추가적인 물질은 당업계에서 대상체의 치료 효과를 높이는 물질로 공지된 모든 물질을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 추가적인 물질은 IL-2, 시클로포스파미드, 및/또는 플루다라빈 등을 포함할 수 있다. 추가적인 물질 과의 함께 투여(병용 투여)에 대해서는 아래에서 구체적으로 개시한다.
투여량
상기 면역세포 조성물이 이를 필요로 하는 대상에게 투여될 때의 투여량은 치료에 적합한 유효량 일 수 있다. 이때, 상기 투여량은 대상의 종양의 크기, 체중, 연령 등의 상태에 따라 달라질 수 있다. 일 실시양태에서, 상기 면역세포 조성물은 이를 필요로 하는 대상에, 1회 또는 복수 회에 걸쳐, 약 1E6, 약 1.5E6, 약 2E6, 약 2.5E6, 약 3E6, 약 3.5E6, 약 4E6, 약 4.5E6, 약 5E6, 약 5.5E6, 약 6E6, 약 6.5E6, 약 7E6, 약 7.5E6, 약 8E6, 약 8.5E6, 약 9E6, 약 9.5E6, 약 1E7, 약 1.5E7, 약 2E7, 약 2.5E7, 약 3E7, 약 3.5E7, 약 4E7, 약 4.5E7, 약 5E7, 약 5.5E7, 약 6E7, 약 6.5E7, 약 7E7, 약 7.5E7, 약 8E7, 약 8.5E7, 약 9E7, 약 9.5E7, 약 1E8, 약 1.5E8, 약 2E8, 약 2.5E8, 약 3E8, 약 3.5E8, 약 4E8, 약 4.5E8, 약 5E8, 약 5.5E8, 약 6E8, 약 6.5E8, 약 7E8, 약 7.5E8, 약 8E8, 약 8.5E8, 약 9E8, 약 9.5E8, 약 1E9, 약 1.5E9, 약 2E9, 약 2.5E9, 약 3E9, 약 3.5E9, 약 4E9, 약 4.5E9, 약 5E9, 약 5.5E9, 약 6E9, 약 6.5E9, 약 7E9, 약 7.5E9, 약 8E9, 약 8.5E9, 약 9E9, 약 9.5E9, 약 1E10, 약 1.5E10, 약 2E10, 약 2.5E10, 약 3E10, 약 3.5E10, 약 4E10, 약 4.5E10, 약 5E10, 약 5.5E10, 약 6E10, 약 6.5E10, 약 7E10, 약 7.5E10, 약 8E10, 약 8.5E10, 약 9E10, 약 9.5E10, 약 1E11, 약 1.5E11, 약 2E11, 약 2.5E11, 약 3E11, 약 3.5E11, 약 4E11, 약 4.5E11, 약 5E11, 약 5.5E11, 약 6E11, 약 6.5E11, 약 7E11, 약 7.5E11, 약 8E11, 약 8.5E11, 약 9E11, 약 9.5E11, 또는 약 1E12개 이상의 면역세포를 포함하는 면역세포 조성물의 양으로 투여될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
병용투여
전술한 바와 같이, 면역세포 조성물은 추가적인 물질과 함께 투여될 수 있다. 이때, 함께 투여되는 추가적인 물질은 면역세포 조성물의 투여 전, 투여 후 투여될 수 있거나, 또는 면역세포 조성물과 동시에 투여될 수 있다. 예를 들어, 추가적인 물질은 면역세포 조성물이 투여되는 날짜에 같이 투여될 수 있다. 다른 예로, 추가적인 물질은 면역세포 조성물이 투여되는 날짜보다 앞선 날짜에 대상에게 투여될 수 있다. 또 다른 예로, 추가적인 물질은 면역세포 조성물이 투여되는 날짜보다 뒤의 날짜에 대상에게 투여될 수 있다. 또 다른 예로, 추가적인 물질은 복수 회 투여되고, 이때 추가적인 물질은 면역세포 조성물이 투여되는 날짜와 동일한 날에 1회 투여되고, 및 면역세포 조성물이 투여된 날짜보다 뒤의 날짜에 복수 회 투여될 수 있다. 나아가, 함께 투여되는 추가적인 물질은 면역세포 조성물의 투여 경로와 동일한 경로를 통해 투여될 수 있거나, 또는 다른 경로를 통해 투여될 수 있다.
상기 추가적인 물질은 당업계에서 대상체의 치료 효과를 높이는 물질로 공지된 모든 물질을 포함한다. 일 실시양태에서, 상기 추가적인 물질은 IL-2, 면역관문억제제(예를 들어, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 세미플리맙, 도스탈리맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 또는 듀발루맙 등과 같은 PD-1 블로커, 또는 PD-L1 블로커 등), 시클로포스파미드, 및/또는 플루다라빈 등을 포함할 수 있다.
일 실시양태에서, 면역세포 조성물은 면역관문억제제 및/또는 IL-2와 함께 투여될 수 있다.
특정한 실시양태에서, 면역세포 조성물은 IL-2와 함께 투여될 수 있다. 이때 대상에게 투여되는 IL-2의 양은 치료에 적합한 유효량일 수 있다. 이때 대상에게 투여되는 IL-2의 양은 대상의 종양의 크기, 체중, 연령 등의 상태에 따라 달라질 수 있고, 달리 제한되지 않는다.
일 실시양태에서, IL-2는 이를 필요로 하는 대상에, 1회 또는 복수 회에 걸쳐, 약 1E3 IU, 약 5E3 IU, 약 1E4 IU, 약 5E4 IU, 약 1E5 IU, 약 5E5 IU, 약 1E6 IU, 약 5E6 IU, 약 1E7 IU, 약 5E7 IU, 약 1E8 IU, 약 5E8 IU, 약 1E9 IU, 약 5E9 IU, 약 1E10 IU, 약 5E10 IU, 약 1E11 IU, 약 5E11 IU, 약 1E12 IU, 약 5E12 IU, 약 1E13 IU, 약 5E13 IU, 약 1E14 IU, 약 5E14 IU, 약 1E15 IU, 또는 약 5E15 IU 이상의 양으로 투여될 수 있다.
특정한 실시양태에서, IL-2는 이를 필요로 하는 대상에, 1회 또는 복수회에 걸쳐 투여될 수 있고, 투여 회차 마다 720,000IU/kg 이하의 양으로 투여될 수 있다.
특정한 실시양태에서, IL-2는 이를 필요로 하는 대상에, 1회 또는 복수회에 걸쳐 투여될 수 있고, 투여 회차 마다 18E6 IU/head 이하의 양으로 투여될 수 있다.
예를 들어, IL-2가 정맥 투여되는 경우, 하기의 투여 방법을 통한 투여가 1회 수행되거나 또는 복수회 반복될 수 있다:
- 하루에 18E6 IU의 양으로 5일간 투여
- 2 내지 6일간 휴약(투여 중단)
- 하루에 18E6 IU의 양으로 5일간 투여
- 3주간 휴약(투여 중단).
다른 예로, IL-2가 피하 투여되는 경우, 하기의 투여 방법을 통한 투여가 1회 수행되거나 또는 복수 회 반복될 수 있다:
- 하루에 18E6 IU의 양으로 5일간 투여
- 2일간 휴약(투여 중단)
- 3주간 투여: 1주 중 첫째 날 및 둘째날은 18E6 IU의 양으로 투여; 셋째, 넷째, 및 다섯째 날은 9E6 IU의 양으로 투여; 및 여섯, 및 일곱째 날은 휴약. 3주간 투여 중 2주 및 3주차의 투여 또한 1주차의 투여와 같음.
특정한 실시양태에서, IL-2는 다음과 같은 투여양으로 투여될 수 있다: 하루에 2E6 IU/head의 양으로 14일간 투여.
본 출원에서 개시하는 방법의 구체적인 예시
아래의 내용은 본 출원에서 개시하는 방법의 구체적인 예시들을 나타낸다. 아래의 구체적인 예시들은 본 출원에서 개시하는 방법의 용이한 이해를 위한 예시적인 방법들이며, 아래의 예시들로 본 출원에서 개시하는 방법의 범위가 제한되지 않는다.
1. 반제품(종양 샘플로부터 생산 및 수득된 제1면역세포 집단)을 생산하는 구체적인 일 실시예
1) 종양 샘플을 준비함
의료기관으로부터 유방암 또는 폐암을 가지는 환자의 종양 조직을 얻는다. 상기 종양 조직은 항생제가 포함되지 않은 RPMI1640배지를 이용하여 3회 세척된다. 세척된 종양 조직에서 지방 조직이 제거된다. 지방 조직이 제거된 종양 조직을 약 1mm2 내지 약 2mm2 의 단면을 가지도록 잘라 종양 샘플을 준비한다.
2) 제1면역세포 집단을 생산함
종양 샘플 24조각이 약 3부피%의 인간AB 세럼, 약 1000IU/mL농도의 IL-2를 포함하는 CTS-AIM-V 배지 (제1 조성물, 총 약 6mL)와 함께 T75플라스크에 담기고, 14일 동안 37℃, 5% CO2환경에서 배양된다. 이때, 배양 기간 동안, 약 3부피%의 인간AB 세럼, 약 1000IU/mL농도의 IL-2를 포함하는 CTS-AIM-V 배지(보충되는 제1 첨가 조성물, 총 약 3ml)가 배양 시작일부터 7일째, 10일째, 및 12일째에 T75 플라스크에 첨가된다.
3) 제1면역세포 집단을 수득함
40 μm의 메쉬 포어를 갖는 세포 트레이너를 이용하여 상기 배양된 조성물에서 종양 조직의 조각이 걸러진다. DPBS를 이용하여 배양된 면역세포 집단을 3회 세척하여 제1 면역세포 집단을 수득한다.
4) 제1면역세포 집단을 동결 보존함
상기 제1 면역세포 집단을 CryoStor® CS10을 사용하여 약2E6 cells/mL 농도로 현탁하여 1mL 씩 cryovial에 넣어 약 -190°C이하의 기체상 액체질소(LN2)에 저장한다.
2. 동결 보존된 반제품으로부터 완제품(제3면역세포 집단을 수득하여 생산된 면역세포 조성물)을 생산하는 구체적인 일 실시예
1) 동결된 제1 면역세포 집단을 해동함
상기 동결 보존된 제1면역세포 집단을 약 37℃ 워터 배스(water bath)에서 약 2분간 해동한다.
2) 제2 면역세포 집단을 파종함
제1면역세포 집단에서 분할된 제2면역세포 집단 및 약 3부피%의 인간AB 세럼, 약 2000IU/mL 농도의 IL-2, 약 30ng/mL 농도의 OKT3, 제2 면역세포 집단(TIL)과 비율(TIL:PBMC)이 약 1:200인 방사선 조사된 PBMC를 포함하는 CTS-AIM-V배지 (제2 조성물, 총 약 20ml)이 GREX-100M에 파종된다. 이 때, GREX-100M 에 약 4E5개의 면역세포가 포함되도록 파종된다.
3) 제2 면역세포 집단을 증폭함
증폭하는 동안, 증폭시작일부터 4일째 20mL, 6일째 60mL, 8일째 180mL, 10일째 540mL로, 약 3부피%의 인간AB 세럼, 약 2000IU/mL농도의 IL-2를 포함하는 CTS-AIM-V배지 (보충되는 제2 첨가 조성물)가 GREX-100M에 첨가된다. 이때, 상기 증폭은 14일 동안 수행되며, 이 기간 동안 상기 제2 면역세포 집단은 새로운 컨테이너로 옮겨지거나, 외부로부터 새로운 면역세포가 추가되지 않는다. 상기 증폭 기간동안 제2 면역세포는 2500배 이상 증폭된다.
4) 면역세포 조성물을 생산함
상기의 과정을 통해 증폭된 면역세포 집단을 포함하는 조성물을 원심 분리하여 제3 면역세포 집단을 수득하여 면역세포 조성물을 생산한다.
3. 동결 보존을 거쳐 완제품(제3면역세포 집단을 수득하여 생산된 면역세포 조성물)을 생산하는 구체적인 일 실시예
1) 면역세포 조성물을 생산하기 위한 샘플을 수득함
의료기관으로부터 유방암 또는 폐암을 가지는 환자의 종양 조직을 얻는다. 상기 종양 조직은 항생제가 포함되지 않은 RPMI1640배지를 이용하여 3회 세척된다. 세척된 종양 조직에서 지방 조직이 제거된다. 지방 조직이 제거된 종양 조직을 약 1mm2 내지 약 2mm2 의 단면을 가지도록 잘라 종양 샘플을 준비한다.
2) 제1면역세포 집단을 생산함
종양 샘플 24조각이 약 3부피%의 인간AB 세럼, 약 1000IU/mL농도의 IL-2를 포함하는 CTS-AIM-V 배지 (제1 조성물, 총 약 6mL)와 함께 T75플라스크에 담기고, 14일 동안 37℃, 5% CO2환경에서 배양된다. 이때, 배양 기간 동안, 약 3부피%의 인간AB 세럼, 약 1000IU/mL농도의 IL-2를 포함하는 CTS-AIM-V 배지(보충되는 제1 첨가 조성물, 총 약 3ml)가 배양 시작일부터 7일째, 10일째, 및 12일째에 T75 플라스크에 첨가된다.
3) 제1면역세포 집단을 수득함
40 μm의 메쉬 포어를 갖는 세포 트레이너를 이용하여 상기 배양된 조성물에서 종양 조직의 조각이 걸러진다. DPBS를 이용하여 배양된 면역세포 집단을 3회 세척하여 제1 면역세포 집단을 수득한다.
4) 제1면역세포 집단을 동결 보존함
상기 제1 면역세포 집단을 CryoStor® CS10을 사용하여 약2E6 cells/mL 농도로 현탁하여 1mL 씩 cryovial에 넣어 약 -190°C이하의 기체상 액체질소(LN2)에 저장한다.
5) 동결된 제1 면역세포 집단을 해동함
상기 동결 보존된 제1면역세포 집단을 약 37℃ 워터 배스(water bath)에서 약 2분간 해동한다.
6) 제2 면역세포 집단을 파종함
제1 면역세포 집단에서 분할된 제2 면역세포 집단 및 약 3부피%의 인간AB 세럼, 약 2000IU/mL 농도의 IL-2, 약 30ng/mL 농도의 OKT3, 제2 면역세포 집단(TIL)과 비율(TIL:PBMC)이 약 1:200인 방사선 조사된 PBMC를 포함하는 CTS-AIM-V배지 (제2 조성물, 총 약 20ml)이 GREX-100M에 파종된다. 이 때, GREX-100M 에 약 4E5개의 면역세포가 포함되도록 파종된다.
7) 제2 면역세포 집단을 증폭함
증폭하는 동안, 증폭시작일부터 4일째 20mL, 6일째 60mL, 8일째 180mL, 10일째 540mL로, 약 3부피%의 인간AB 세럼, 약 2000IU/mL농도의 IL-2를 포함하는 CTS-AIM-V배지 (보충되는 제2 첨가 조성물)가 GREX-100M에 첨가된다. 이때, 상기 증폭은 14일 동안 수행되며, 이 기간 동안 상기 제2 면역세포 집단은 새로운 컨테이너로 옮겨지거나, 외부로부터 새로운 면역세포가 추가되지 않는다. 상기 증폭 기간동안 제2 면역세포는 2500배 이상 증폭된다.
8) 면역세포 조성물을 생산함
상기의 과정을 통해 증폭된 면역세포 집단을 포함하는 조성물을 원심 분리하여 제3 면역세포 집단을 수득하여 면역세포 조성물을 생산한다.
4. 동결 보존 없이 완제품(제3면역세포 집단을 수득하여 생산된 면역세포 조성물)을 생산하는 구체적인 일 실시예
1) 면역세포 조성물을 생산하기 위한 샘플을 수득함
의료기관으로부터 유방암 또는 폐암을 가지는 환자의 종양 조직을 얻는다. 상기 종양 조직은 항생제가 포함되지 않은 RPMI1640배지를 이용하여 3회 세척된다. 세척된 종양 조직에서 지방 조직이 제거된다. 지방 조직이 제거된 종양 조직을 약 1mm2 내지 약 2mm2 의 단면을 가지도록 잘라 종양 샘플을 준비한다.
2)제1면역세포 집단을 생산함
종양 샘플 24조각이 약 3부피%의 인간AB 세럼, 약 1000IU/mL농도의 IL-2를 포함하는 CTS-AIM-V 배지 (제1 조성물, 총 약 6mL)와 함께 T75플라스크에 담기고, 14일 동안 37℃, 5% CO2환경에서 배양된다. 이때, 배양 기간 동안, 약 3부피%의 인간AB 세럼, 약 1000IU/mL농도의 IL-2를 포함하는 CTS-AIM-V 배지(보충되는 제1 첨가 조성물, 총 약 3ml)가 배양 시작일부터 7일째, 10일째, 및 12일째에 T75 플라스크에 첨가된다.
3)제1면역세포 집단을 수득함
40 μm의 메쉬 포어를 갖는 세포 트레이너를 이용하여 상기 배양된 조성물에서 종양 조직의 조각이 걸러진다. DPBS를 이용하여 배양된 면역세포 집단을 3회 세척하여 제1 면역세포 집단을 수득한다.
4)제2 면역세포 집단을 파종함
제1 면역세포 집단에서 분할된 제2 면역세포 집단 및 약 3부피%의 인간AB 세럼, 약 2000IU/mL 농도의 IL-2, 약 30ng/mL 농도의 OKT3, 제2 면역세포 집단(TIL)과 비율(TIL:PBMC)이 약 1:200인 방사선 조사된 PBMC를 포함하는 CTS-AIM-V배지 (제2 조성물, 총 약 20ml)이 GREX-100M에 파종된다. 이 때, GREX-100M 에 약 4E5개의 면역세포가 포함되도록 파종된다.
5)제2 면역세포 집단을 증폭함
증폭하는 동안, 증폭시작일부터 4일째 20mL, 6일째 60mL, 8일째 180mL, 10일째 540mL로, 약 3부피%의 인간AB 세럼, 약 2000IU/mL농도의 IL-2를 포함하는 CTS-AIM-V배지 (보충되는 제2 첨가 조성물)가 GREX-100M에 첨가된다. 이때, 상기 증폭은 14일 동안 수행되며, 이 기간 동안 상기 제2 면역세포 집단은 새로운 컨테이너로 옮겨지거나, 외부로부터 새로운 면역세포가 추가되지 않는다. 상기 증폭 기간동안 제2 면역세포는 2500배 이상 증폭된다.
6)면역세포 조성물을 생산함
상기의 과정을 통해 증폭된 면역세포 집단을 포함하는 조성물을 원심 분리하여 제3 면역세포 집단을 수득하여 면역세포 조성물을 생산한다.
본 출원에 의해 제공되는 방법의 예시적 실시양태
이하에서는 본 출원에 의해 제공되는 방법의 예시적 실시양태를 개시한다. 아래의 예시적 실시양태는 본 출원에서 개시하는 방법의 용이한 이해를 위한 것이며, 아래의 실시양태들로 본 출원에서 개시하는 발명의 범위가 제한되지 않는다.
PR01.
다음을 포함하는 제1 면역세포 집단을 생산하는 방법:
(a) 제1 컨테이너에서 종양 샘플을 배양함,
이때 상기 종양 샘플은 상기 제1 컨테이너에서 제1 조성물 내에서 배양되고, 여기서 상기 제1 조성물은 배지, 세럼, 및 IL-2를 포함하고,
이때 상기 제1 컨테이너는 가스 투과성 컨테이너이거나, 가스 공급 시스템을 포함하는 컨테이너이고,
이때 상기 배양은 7일 내지 21일 동안 수행되고,
이때 상기 배양 동안 제1 첨가 조성물이 1회 또는 2회 이상 상기 제1 컨테이너로 첨가됨;
(b) 상기 (a)에서 배양된 조성물로부터 제1 면역세포 집단을 수득함.
PR02.
PR01에 있어서, 종양 샘플을 준비함을 더 포함하는, 방법.
PR03.
PR01 내지 PR02 중 어느 하나에 있어서, 상기 종양 샘플은 대상으로부터 수득된 종양 조각으로부터 수득되고, 이때 상기 종양 샘플은 약 1mm2 내지 4mm2 면적의 단면을 갖는, 방법
PR04.
PR01 내지 PR04 중 어느 하나에 있어서, (a)에서 12개 내지 24개의 상기 종양 샘플이 배양되는, 방법.
PR05.
PR01 내지 PR04 중 어느 하나에 있어서, 상기 세럼은 인간 세럼인, 방법.
PR06.
PR01 내지 PR04 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 조성물의 상기 세럼의 농도는 5 부피% 이하인 방법.
PR07.
PR01 내지 PR04 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 조성물의 상기 세럼의 농도는 약 3 부피% 인 방법.
PR08.
PR01 내지 PR07 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 조성물의 상기 배지는 AIM-V 배지인 방법.
PR09.
PR01 내지 PR07 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 조성물의 상기 배지는 CTS-AIM-V 배지인 방법.
PR10.
PR01 내지 PR09 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 조성물의 상기 IL-2의 농도는 500IU/ml 내지 3000IU/ml 인 방법.
PR11.
PR01 내지 PR09 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 조성물의 상기 IL-2의 농도는 약 1000IU/ml인 방법.
PR12.
PR01 내지 PR11 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 컨테이너는 T75 플라스크인 방법.
PR13.
PR01 내지 PR12 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 조성물의 부피는 상기 제1 컨테이너의 최대 허용 가능한 용량의 30% 이하인 방법.
PR14.
PR01 내지 PR12 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 컨테이너가 T75 플라스크인 경우, 상기 제1 조성물의 부피는 6ml인, 방법.
PR15.
PR01 내지 PR14 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 첨가 조성물은 배지, 세럼, 및 IL-2를 포함하는, 방법.
PR16.
PR01 내지 PR14 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 첨가 조성물은 CTS-AIM-V 배지, 3 부피% 세럼, 및 1000IU/ml IL-2를 포함하는, 방법.
PR17.
PR01 내지 PR14 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 첨가 조성물은 제1 조성물과 동일한 조성물질 및 조성비를 갖는, 방법.
PR18.
PR01 내지 PR17 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 동안, 상기 제1 첨가 조성물은 2회 이상 상기 제1 컨테이너로 첨가되는 방법.
PR19.
PR01 내지 PR17 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 동안, 상기 제1 첨가 조성물은 배양 시작일로부터 7, 10, 및 12일째에 상기 제1 컨테이너로 첨가되고, 이때 첨가되는 상기 제1 첨가 조성물의 양은 보충 시점마다 동일한 양인, 방법.
PR20.
PR01 내지 PR17 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양 동안, 상기 제1 첨가 조성물은 배양 시작일로부터 7일째 3ml, 10일째 3ml, 및 12일째 3ml로 상기 제1 컨테이너에 첨가되는, 방법.
PR21.
PR01 내지 PR20 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양은 13일 내지 15일 동안 수행되는, 방법.
PR22.
PR01 내지 PR21 중 어느 하나에 있어서, 상기 배양은 14일동안 수행되는 방법.
F01.
PR01 내지 PR22 중 어느 하나에 의해 생산된 제1 면역세포 집단을 동결보존함을 포함하는,
제1 면역세포집단을 동결보존하는 방법.
T01.
F01에 의해 동결보존된 제1 면역세포 집단을 해동함을 포함하는, 동결보존된 제1 면역세포 집단을 해동하는 방법.
R01.
다음을 포함하는 면역세포 조성물을 생산하는 방법:
(a) 제2 컨테이너에 제2 조성물 및 제2 면역세포 집단을 파종함,
이때 상기 제2 면역세포 집단은 제1 면역세포 집단으로부터 유래되고,
이때 상기 제2 조성물은 배지, 세럼, 1000IU/ml 내지 3000IU/ml의 IL-2, 항-CD3 항체, 및 피더 세포를 포함하고,
이때 상기 제2 컨테이너는 가스 투과성 컨테이너이거나, 가스 공급 시스템을 포함하는 컨테이너임;
(b) 제3 면역세포 집단을 생산하기 위하여 상기 제2 면역세포 집단을 증폭함,
이때 상기 증폭 동안, 제2 첨가 조성물이 상기 제2 컨테이너로 1회 또는 2회 이상 첨가되고,
상기 증폭은 7일 내지 21일동안 수행됨; 및
(c) 상기 (b)에서 증폭된 증폭물로부터 제3 면역세포 집단을 수득하고 면역세포 조성물을 생산함,
이때, 상기 제3 면역세포 집단은 상기 제2 면역세포 집단과 비교하여 적어도 2500배 이상의 수의 세포를 가짐.
R02.
R01에 있어서, 상기 제1 면역세포 집단은 PR01 내지 PR22 중 어느 하나에 의해 생산된 면역세포 집단이거나, T01에 의해 해동된 면역세포집단인, 방법.
R03.
R01 내지 R02 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 조성물의 배지는 AIM-V 배지인 방법.
R04.
R01 내지 R03 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 조성물의 상기 세럼은 인간 세럼인 방법.
R05.
R01 내지 R03 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 조성물의 상기 세럼의 농도는 5 부피% 이하인, 방법.
R06.
R01 내지 R03 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 조성물의 상기 세럼의 농도는 약 3 부피%인 방법.
R07.
R01 내지 R06 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 조성물의 상기 IL-2의 농도는 약 2000IU/ml인 방법.
R08.
R01 내지 R07 중 어느 하나에 있어서, 상기 항-CD3 항체는 OKT3인 방법.
R09.
R01 내지 R08 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 조성물의 상기 항-CD3 항체의 농도는 10ng/ml 내지 100ng/ml 인, 방법.
R10.
R01 내지 R08 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 조성물의 상기 항-CD3 항체의 농도는 약 30ng/ml 인, 방법.
R11.
R01 내지 R10 중 어느 하나에 있어서, 상기 피더 세포는 동종이형 말초혈액단핵세포인 방법.
R12.
R01 내지 R10 중 어느 하나에 있어서, 상기 피더 세포는 불활성화된 동종이형 말초혈액단핵세포인 방법.
R13.
R01 내지 R12 중 어느 하나에 있어서, 상기 피더세포는 세포 수가 상기 제2 면역세포집단의 세포 수를 기준으로 약 1:200 (제2 면역세포 집단의 세포 수: 피더세포) 이 되도록 상기 제2 조성물에 포함되는, 방법.
R14.
R01 내지 R13 중 어느 하나에 있어서, 상기 파종함에서, 상기 제2 컨테이너에 파종되는 상기 제2 면역세포 집단의 세포 수는 1E5 내지 10E5인 방법.
R15.
R01 내지 R13중 어느 하나에 있어서, 상기 파종함에서, 상기 제2 컨테이너에 파종되는 상기 제2 면역세포 집단의 세포 수는 약 4E5인 방법.
R16.
R01 내지 R15 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 컨테이너는 GREX100M인 방법.
R17.
R01 내지 R16 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 조성물의 부피는 상기 제2 컨테이너의 최대 허용가능한 용량의 30% 이하인, 방법.
R18.
R01 내지 R16 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 컨테이너가 GREX100M 인 경우, 상기 제2 조성물의 부피는 약 20ml인, 방법.
R19.
R01 내지 R18 중 어느 하나에 있어서, 상기 증폭 동안, 면역세포는 상기 제2 컨테이너로부터 제거되거나 외부로부터 추가되지 않는, 방법.
R20.
R01 내지 R19 중 어느 하나에 있어서, 상기 증폭은 13일 내지 15일동안 수행되는 방법.
R21.
R01 내지 R19 중 어느 하나에 있어서, 상기 증폭은 14일동안 수행되는 방법.
R22.
R01 내지 R21 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 첨가 조성물은 배지, 세럼, 및 IL-2를 포함하는, 방법.
R23.
R01 내지 R21 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 첨가 조성물은 CTS-AIM-V 배지, 3 부피% 세럼, 및 2000IU/ml IL-2를 포함하는, 방법.
R24.
R01 내지 R21 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 첨가 조성물은 상기 제2 조성물에서 상기 항-CD3 항체 및 상기 피더세포를 제외한 것과 같은 조성물질 및 조성비를 가지는, 방법.
R25.
R01 내지 R24 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 첨가 조성물은 2회 이상 상기 제2 컨테이너에 첨가되는, 방법.
R26.
R01 내지 R24 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 첨가 조성물은 2회 이상 상기 제2 컨테이너에 첨가되고, 이때 첨가되는 상기 제2 첨가 조성물의 양은 보충 시점마다 서로 다른, 방법.
R27.
R01 내지 R24 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 첨가 조성물은 증폭 시작일로부터 4, 6, 8, 및 10일째에 상기 제2 컨테이너에 첨가되고, 이때 첨가되는 상기 제2 첨가 조성물의 양은 보충 시점마다 서로 다른, 방법.
R28.
R01 내지 R24 중 어느 하나에 있어서, 상기 제2 첨가 조성물은 증폭 시작일로부터 4일째 20ml, 6일째 60ml, 8일째 180ml, 및 10일째 540ml 로 상기 제2 컨테이너에 첨가되는, 방법.
R29.
R01 내지 R28 중 어느 하나에 있어서, 상기 제3 면역세포집단은 상기 제2 면역세포 집단과 비교하여 적어도 4000배 이상의 수의 세포를 가지는, 방법.
R30.
R01 내지 R29 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역세포 조성물은 상기 제3 면역세포 집단을 포함하는, 방법.
R31.
R01 내지 R29 중 어느 하나에 있어서, 상기 면역세포 조성물은 상기 제3 면역세포 집단으로부터 수득된 제4 면역세포 집단을 포함하는, 방법.
R32.
R01 내지 R29 중 어느 하나에 있어서, 면역세포의 유전자를 조작함을 더 포함하는, 방법.
R33.
R32에 있어서, 상기 면역세포의 유전자를 조작함은 제1 컨테이너에서 종양 샘플을 배양함에서 수행되거나, 또는 그 이전에 수행되는, 방법.
R34.
R32에 있어서, 상기 면역세포의 유전자를 조작함은 제2 컨테이너에 제2 조성물 및 제2 면역세포 집단을 파종함에서 수행되거나, 또는 그 이전에 수행되는, 방법.
R35.
R32에 있어서, 면역세포의 유전자를 조작함은 트렌스진(transgene)을 면역세포에 도입함을 포함하는, 방법.
R36.
R32에 있어서, 면역세포의 유전자를 조작함은 mRNA를 면역세포에 도입함을 포함하는, 방법.
R37.
R32에 있어서, 면역세포의 유전자를 조작함은 CRISPR-Cas 시스템을 통해 면역세포의 유전자를 조작함을 포함하는, 방법.
R38.
R32에 있어서, 면역세포의 유전자를 조작함은 트랜스포존(transposon)을 통해 면역세포의 유전자를 조작함을 포함하는, 방법.
R39.
R32에 있어서, 면역세포의 유전자를 조작함은 siRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotides)를 통해 유전자의 발현을 감소시킴을 포함하는, 방법.
C01.
R01 내지 R39에 의해 생산된, 종양침윤림프구를 포함하는 면역세포 조성물.
C02.
C01에 있어서, IL-2를 더 포함하는 면역세포 조성물.
C03.
C01 내지 C02 중 어느 하나에 있어서, 면역관문억제제(immune checkpoint inhibitor)를 더 포함하는 면역세포 조성물.
C04.
C01 내지 C02 중 어느 하나에 있어서, 니볼루맙(nivolumab)을 더 포함하는 면역세포 조성물.
U01.
R01 내지 R39에 의해 생산된, 종양침윤림프구를 포함하는 면역세포 조성물의, 대상의 종양을 치료하기 위한 용도.
U02.
U01에 있어서, 상기 대상은 종양침윤림프구가 유래된 대상인, 용도.
TM01.
R01 내지 R39에 의해 생산된, 종양침윤림프구를 포함하는 면역세포 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 대상의 종양을 치료하는 방법.
TM02.
TM01에 있어서, 상기 대상은 종양침윤림프구가 유래된 대상인, 대상의 종양을 치료하는 방법.
TM03.
TM01 내지 TM02 중 어느 하나에 있어서, IL-2를 투여함을 더 포함하는, 대상의 종양을 치료하는 방법.
TM04.
TM01 내지 TM03 중 어느 하나에 있어서, 면역관문억제제를 투여함을 더 포함하는, 대상의 종양을 치료하는 방법.
TM05.
TM01 내지 TM03 중 어느 하나에 있어서, 니볼루맙을 투여함을 더 포함하는, 대상의 종양을 치료하는 방법.
본 출원에서 개시하는 면역세포 조성물을 생산하는 방법의 특징
IL-2의 농도
일반적으로 TIL을 포함하는 면역세포 조성물을 생산함에 있어서, TIL을 배양하기 위해 배지에 고농도의 IL-2를 첨가(예, 6000IU/mL)한다. 그러나 본 출원에서 개시하는 방법은 배양 단계에서 보다 저농도의 IL-2를 포함하는 제1 조성물이 사용된다. 본 발명자들은 보다 저농도의 IL-2를 첨가한 조성물을 이용하여도 TIL을 포함하는 면역세포 집단을 배양하는데 충분하다는 것을 실험을 통하여 증명하였다 (실험예 3 참고).
또한, 배양을 위한 조성물 이외에도 증폭을 위한 조성물도 일반적으로 고농도의 IL-2(예, 3000IU/mL)를 첨가한다. 그러나 본 출원에서 개시하는 증폭을 위한 제2 조성물은 보다 저농도의 IL-2를 포함할 수 있다. 본 출원의 발명자들은 저농도의 IL-2를 첨가한 조성물을 이용하여도 TIL을 포함하는 면역세포 집단을 증폭하는데 충분하다는 것을 실험을 통하여 증명하였다 (실험예 3 참고).
결론적으로, 이는 적은 농도의 IL-2 로도 TIL을 포함하는 면역세포 집단을 충분히 배양 및 증폭할 수 있는 효율적인 공정을 확립한 것으로 그 의의가 있다.
배양 및/또는 증폭 조성물
1)
초기 배양을 위한 조성물 및/또는 증폭을 위한 조성물의 양
일반적으로 TIL을 포함하는 세포를 배양 및/또는 증폭함에 있어서, 배양 및/또는 증폭되는 컨테이너에 따라 배양을 위한 조성물 및/또는 증폭을 위한 조성물의 양이 달라진다. 또한, 이 때, 결정되는 배양을 위한 조성물 및/또는 증폭을 위한 조성물의 양은 일반적으로 컨테이너가 허용가능한 최대 용량에 따라 결정된다. 그러나, 본 출원에서 개시하는 방법에서는 세포의 배양 및/또는 증폭 시작 시점에 상기 배양을 위한 조성물(예를 들어, 제1 조성물) 및/또는 증폭을 위한 조성물(예를 들어, 제2 조성물)의 양을 컨테이너가 허용하는 최대 용량보다 적은 양이 되도록 한다. 즉, 배양을 위한 조성물 및/또는 증폭을 위한 조성물의 양을 컨테이너가 허용하는 최대 용량보다 적은 양으로 하여, 세포가 배양 및/또는 증폭되기에 최적화된 농도를 맞춰준 후 배양 및/또는 증폭을 시작하는 것이다. 이렇게 최적화된 조성물 내 세포의 농도는 세포 사이의 상호작용에 긍정적인 영향을 줌으로써 세포의 배양 및/또는 증폭의 효율을 높이는 역할을 할 수 있다. 실험예 4, 도 8을 참고하면, 24웰 플레이트를 이용하여 조성물의 양을 달리하여 세포를 배양하였을 때, 1mL을 넣은 경우에 세포의 수가 더 많은 것을 확인할 수 있다. 이에 따르면, 조성물 내 세포의 농도 최적화를 통해 세포의 배양 및/또는 증식의 효율을 더 높일 수 있다는 것을 의미한다.
2)
제1 첨가 조성물 및/또는 제2 첨가 조성물의 보충
일반적으로 TIL을 포함하는 면역세포 조성물을 생산함에 있어서, TIL을 배양 및 증폭하는 동안 배양 및 또는 증폭 조성물을 교체하는 과정을 거친다. 그러나, 본 출원에서 개시하는 방법에서는 TIL을 포함하는 면역세포 집단을 배양 및 증폭하는 과정에서 배양과정 및 증폭과정에서 배양 또는 증폭을 위해 사용되는 조성물이 교체되지 않고, 단순히 첨가의 방법으로 보충된다. 이는 두 가지의 장점을 가진다.
첫번째로, 까다로운 TIL의 배양 또는 증폭 과정에서 TIL에 미칠 수 있는 스트레스를 최소화하면서, TIL의 배양 또는 증폭에 필요한 물질을 공급할 수 있고 더 나아가 배양 및/또는 증폭 조성물의 교체 과정에서 발생할 수 있는 면역세포 집단의 손실을 방지할 수 있다.
두번째로, 조성물의 첨가를 통해서 조성물 내에서 배양 및/또는 증식되는 세포의 농도를 배양 및/또는 증식에 효율적인 최적의 농도로 지속적으로 유지할 수 있다. 이는 세포의 배양 및/또는 증식 환경이 배양 및/또는 증식에 최적화된 환경으로 지속적으로 유지됨을 뜻하며, 이를 통해 보다 높은 수율로 면역세포 조성물을 생산할 수 있게 된다.
결론적으로, 배양 및/또는 증폭 시점의 조성물의 양 조절로 조성물 내 세포의 농도를 최적화하고, 더 나아가 배양 및/또는 증폭 동안 배양 및/또는 증폭 조성물의 보충을 통해, 조성물 내 세포의 최적화된 농도를 유지한다. 또한, 이 과정에서 조성물이 교체되는 것이 아닌 보충되기 때문에 보다 효율적으로, 보다 높은 수율로 TIL을 포함하는 면역세포 조성물을 생산할 수 있다.
증폭 효율
일반적으로, TIL을 포함하는 면역세포를 증폭하는 과정 동안, TIL은 약 100배 내지1000배로 증폭된다. 그러나, 본 출원에서 개시하는 방법에서는 증폭 과정 동안에 TIL이 평균적으로 약2500배 이상 증폭된다. 본 출원에서는 증폭을 위한 조성물이 다른 일반적인 공정과 비교하여 낮은 IL-2 농도를 가지면서도, 약 2500배 이상의 높은 증폭율을 가진다. 이는 본 발명자들이 다른 공정 대비 적은 첨가제로 높은 증폭율을 가지는 효율적인 면역세포 생산 방법을 확립하였다는 것을 의미하며, 실험예 2, 도 5에 나타내었다.
동결 보존 기간
본 출원에서 개시하는 면역세포 조성물 생산 방법은 제1 면역세포 집단을 수득한 후 동결 보존되어 일정한 기간 이상 보관될 수 있고, 상기 동결 보존된 제1 면역세포 집단은 추후, 필요한 시기에 맞추어 해동 후 증폭되어 면역세포 조성물을 생산하는데 사용될 수 있다. 이 때, 일 예시로 상기 제1 면역세포 집단은 동결 보존되어 약 1년 이상, 약 2년이상, 3년이상, 4년 이상 또는 5년 이상 보관된 후 증폭되어 면역세포 조성물을 생산하는데 이용될 수 있다. 다른 예로, 제1 면역세포 집단은 동결 보존되어 단기간 보관된 후 해동되어 면역세포 조성물을 생산하는데 이용될 수 있다. 이에 따라, 본 출원에서 개시하는 방법에 따라 수득된 제1 면역세포는 상황에 따라 단기간 또는 장기간 동결 보존된 후 증폭에 사용될 수 있다는 점에서 큰 의미를 가진다. 예를 들어, 반제품 생산과 완제품 생산이 다른 장소에서 수행되거나 서로 다른 회사에서 수행될 때, 제1 면역세포 집단을 동결 보존하여 다른 장소로 옮길 수 있다. 또한, 예를 들어, 환자의 암이 다시 재발하였거나 전이하였을 경우 예전에 동결 보존한 제1 면역세포집단을 다시 해동하고 증폭 후 환자의 치료에 사용할 수 있다.
[실험예]
이하, 실험예 및 실시예를 통해 본 출원에서 제공되는 발명에 대해 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 출원에 의해 개시되는 내용을 예시하기 위한 것으로, 본 출원에 의해 개시되는 내용의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
표1. 시약 정보
실험예 1 TIL 생산
실험예 1-1. TIL 분리 배양 공정
1.
TIL 분리 배양 공정
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0일
병원 수술실로부터 운반된 종양 조직을 RPMI1640 배지를 이용하여 3회 세척하고 100mm 페트리디쉬로 옮겼다. 멸균 수술용 가위와 핀셋을 이용하여 종양 조직 내 지방조직을 제거하고 멸균 수술용 가위와 핀셋을 이용하여 종양 조직을 1~2mm 크기로 잘랐다. 1~2mm 크기로 자른 종양 조직을 T75 플라스크에 플라스크당 24조각을 넣고, 상기 제조된 배양 조성물을 6mL 첨가하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 7일 동안 배양하였다.
배양 조성물의 조성은 다음과 같다: CTS-AIM-V 배지, 3 부피% 인간 세럼, 및 1000IU/ml IL2.
-
7일
상기 제조된 배양 조성물을 각 플라스크당 3mL씩 첨가하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 3일 동안 배양하였다.
-
10일
상기 제조된 배양 조성물을 각 플라스크당 3mL씩 첨가하고, 37℃ 5% CO2 배양기에서 2일 동안 배양하였다.
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12일
상기 제조된 배양 조성물을 각 플라스크당 3mL씩 첨가하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 2일 동안 배양하였다.
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14일
세포를 수집하기 위해서 40μm 세포 스트레이너를 50mL 튜브 상단에 설치하였다. 배양이 끝난 세포를 10mL 파이펫을 이용하여 세포 스트레이너를 통과시켜 종양 조직은 거르고 배양된 세포만을 50mL 코니칼 튜브에 모은 후, 상온에서, 450g, 5분간 원심분리 하였다. 침전된 세포에 DPBS 5mL을 첨가하여 파이펫팅으로 현탁시켰다. 현탁한 세포는 C-chip(hemocytometer)로 세포 계수 및 세포 생존율을 확인하였다. 450g에서 5분간 원심분리 한 후, Cryo-stor CS10으로 2E6 세포/mL의 농도로 세포를 현탁시킨 후 cryovial에 1mL씩 충전하고 액체질소탱크(LN2) 또는 기체상 액체질소탱크(LN2)에 보관하였다.
실험예 1-2 TIL 증폭 공정
1.
알로-피더(Allo-feeder) PBMC분리
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건강한 지원자로부터 백혈구성분채집술(Leukapheresis) 및 방사선조사
병원 채혈실에서 백혈구성분채집술 장비를 이용하여 건강한 지원자로부터 혈액 백(bag)에 백혈구성분채집술을 진행하였다. 백혈구 성분채집술이 진행된 혈액 백은 x-ray 방사선으로 방사선 조사하여 불활성화 시켰다.
-
방사선 조사된 혈액 백으로부터 말초혈액단핵구(PBMC) 분리
백혈구 채집술을 진행하여 방사선 조사된 혈액은 DPBS와 1:2 비율이 되도록 혼합하였다. 피콜(Ficoll)용액을 50mL 튜브에 15mL 넣고 상기에서 혼합한 혈액을 피콜과 혼합되지 않게 피콜 층 위에 30mL 중첩하고 상온에서 800g, 20분 동안 Acc9/Dcc0 조건으로 원심분리 하였다. 분리된 말초혈액단핵구 층을 채취하여 새로운 50mL 튜브로 옮겨주었다. 말초혈액단핵구 층이 옮겨진 50mL 튜브에 DPBS를 첨가하여 세척하고 상온에서 800g, 5분 동안 원심분리하였다. 원심 분리 후, 상층액을 모두 제거하고 침전된 말초혈액단핵구를 완제품 배양 배지 50mL로 현탁하였다. 현탁된 세포를 hemocytometer 세트로 세포 계수 및 생존율을 확인하였다. 세포 계수 후 3.2E9 말초혈액단핵구를 준비하였다.
2.
완제품 생산
-
0일(세포 접종)
액체질소탱크(LN2)에 보관중인 반제품 11 바이알을 워터배스(water bath)에서 37℃로 2분간 해동시켰다. 해동시킨 세포는 CTS-AIM-V 배지를 넣어 세척한 후 상온에서 1500rpm, 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버린 뒤, CTS-AIM-V 증폭 조성물에 현탁하고 세포를 hemocytometer 세트를 이용하여 세포 계수 및 생존율을 확인하였다. 세포 계수 후 1.6E7 세포를 준비하였다. 40개의 각 GREX100M(1L) 배양 용기 각각에 4E5 세포의 반제품 TIL 세포와 8E7 세포의 방사선 조사된 말초혈액단핵구를 넣어주고 완제품 증폭 조성물을 20mL까지 첨가하였다. 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
완제품 증폭 조성물의 조성은 다음과 같다: CTS-AIM-V 배지, 3% 인간 세럼, 2000IU/ml IL-2, 및 30ng/ml OKT3
- 4일
CTS-AIM-V 배지에 2,000IU/mL의 IL-2와 소분된 인간 세럼을 3%가 되도록 넣어주어 필요한 양만큼 첨가 조성물을 조제하였다. 각 GREX 플라스크에 조제한 첨가 조성물을 20mL을 추가로 분주하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- 6일
CTS-AIM-V 배지에 2,000IU/mL의 IL-2와 소분된 인간 세럼을 3%가 되도록 넣어주어 필요한 양만큼 첨가 조성물을 조제하였다. 각 GREX 플라스크에 조제한 첨가조성물 60mL을 추가로 분주하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- 8일
CTS-AIM-V 배지에 2,000IU/mL의 IL-2와 소분된 인간 세럼을 3%가 되도록 넣어주어 필요한 양만큼 첨가 조성물을 조제하였다. 각 GREX 플라스크에 조제한 첨가조성물 180mL을 추가로 분주하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- 10일
CTS-AIM-V 배지에 2,000IU/mL의 IL-2와 소분된 인간 세럼을 3%가 되도록 넣어주어 필요한 양만큼 첨가 조성물을 조제하였다. 각 GREX 플라스크에 조제한 첨가조성물 540mL을 추가로 분주하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
- 14일
배양이 끝난 세포는 배지 200mL을 남기고 조심스럽게 흡입(suction)하고 남은 배지 200mL를 조심스럽게 흔들어 현탁 후, 500mL 코닝 병에 모아주었다. 수집된 세포는 상온에서 2000g, 7분 동안 원심 분리하였다. 원심 분리 후, 상층액을 모두 제거하고 침전된 세포는 260mL의 부형제로 현탁하였다. 현탁된 세포는 hemocytometer 세트로 세포 계수 및 생존율을 확인하였다. 세포 계수가 끝나면 200mL을 수액 백(Infusion bag)에 충전하였다.
실험예 2 TIL 증폭 수율 실험
TIL의 증폭 수율을 측정하기 위한 실험은 상기 실험예1 TIL 생산의 실험 프로토콜에 따라 수행되었다.
상기 실험예1 TIL의 생산 실험 프로토콜에 따라 생산된 TIL을 수득 후 hemocytometer 세트를 이용하여 세포 계수 및 생존율을 확인하였다.
도 5를 참고하면, TIL 증폭 수율 실험 결과 TIL 증폭 공정 동안, 최소 2500배 이상으로 TIL이 증폭되는 것을 확인하였고, 최대 9400배로 TIL이 증폭되는 것을 확인하였다.
실험예 3 IL-2 최적화 실험
실험예 3-1 TIL 분리 배양 단계에서 IL-2 최적화 실험
1.
IL-2 최적화를 위한 TIL 분리 배양 공정
-
0일
병원 수술실로부터 운반된 종양 조직을 RPMI 1640 배지를 이용하여 3회 세척하고 100mm 페트리디쉬로 옮겼다. 멸균 수술용 가위와 핀셋을 이용하여 종양 조직 내 지방조직을 제거하였고 멸균 수술용 가위와 핀셋을 이용하여 종양 조직을 1~2mm 크기로 잘랐다. 1~2mm 크기로 자른 종양 조직을 24well 플레이트에 well당 2조각을 넣고, 상기 제조된 IL-2 농도별 배양 조성물을 1mL첨가하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 7일 동안 배양하였다.
-
7일
상기 제조된 IL-2 농도별 배양 조성물을 각 well에 0.5mL씩 첨가하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 3일 동안 배양하였다.
-
10일
상기 제조된 IL-2 농도별 배양 조성물을 각 플라스크당 0.5mL씩 첨가하고, 37℃ 5% CO2 배양기에서 2일 동안 배양하였다.
-
12일
상기 제조된 IL-2 농도별 배양 조성물을 각 플라스크당 0.5mL씩 첨가하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 2일 동안 배양하였다.
-
14일
세포를 수집하기 위해서 40μm 세포 스트레이너를 50mL 튜브 상단에 설치하였다. 배양이 끝난 세포를 10mL 파이펫을 이용하여 세포 스트레이너를 통과시켜 종양 조직은 거르고 배양된 세포만을 50mL코니칼 튜브에 모은 후 상온, 450g에서 5분간 원심분리 하였다. 침전된 세포에 DPBS 1mL을 첨가하여 파이펫팅으로 현탁시켰다. 현탁한 세포는 C-chip(hemocytometer)로 세포 계수 및 세포 생존율을 확인하여 IL-2 농도별 세포의 증식율을 확인하였다.
도 6을 참고하면, 인간 AB 세럼을 첨가한 조건에서, IL-2의 농도가 1000IU/mL이상에서 세포의 증식율은 큰 차이를 보이지 않았다.
실험예 3-2 TIL 증폭 단계에서 IL-2 농도 최적화 실험
1.
알로-피더 PBMC 분리
상기 PBMC 분리 방법은 상기 실험예 1-2의 1. 알로-피더 PBMC 분리 방법과 동일하게 수행되었다.
2.
IL-2 최적화를 위한 TIL 증폭 공정
-
0일(세포 접종)
액체질소탱크(LN2)에 보관중인 반제품 바이알을 워터배스에서 37℃로 2분간 해동시켰다. 해동시킨 세포는 CTS-AIM-V 배지를 넣어 세척한 후 상온에서 1500rpm, 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버린 뒤, CTS-AIM-V 증폭 조성물에 현탁하고 세포를 hemocytometer 세트를 이용하여 세포 계수 및 생존율을 확인하였다. 각 T75 플라스크 배양 용기에 5E4세포의 반제품 TIL 세포와 1E7세포의 방사선 조사된 말초혈액단핵구를 넣어주고 증폭 조성물을 3mL까지 첨가하였다. 그리고 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
-
4일
3% 인간 세럼이 포함된 CTS-AIM-V 배지에 각각 1000, 2000 4000, 6000IU/mL의 IL-2를 넣어주어 필요한 양만큼 첨가 조성물 조제하였다. 각 T75 플라스크에 조제한 첨가 조성물 6mL을 추가로 분주하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
-
6일
3% 인간 세럼이 포함된 CTS-AIM-V 배지에 각각 1000, 2000 4000, 6000IU/mL의 IL-2를 넣어주어 필요한 양만큼 첨가 조성물을 조제하였다. 각 T75 플라스크에 조제한 완제품 첨가 조성물 18mL을 추가로 분주하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
-
8일
3% 인간 세럼이 포함된 CTS-AIM-V 배지에 각각 1000, 2000 4000, 6000IU/mL의 IL-2를 넣어주어 필요한 양만큼 첨가 조성물을 조제하였다. 각 T75 플라스크에 조제한 첨가조성물 54mL을 추가로 분주하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
-
10일
3% 인간 세럼이 포함된 CTS-AIM-V 배지에 각각 1000, 2000 4000, 6000IU/mL의 IL-2를 넣어주어 필요한 양만큼 첨가 조성물을 조제하였다. 각 T75 플라스크에 조제한 첨가 조성물 162mL을 추가로 분주하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
-
14일
배양이 끝난 세포는 배지 150mL을 남기고 조심스럽게 흡입(suction)하고 남은 배지 150mL를 조심스럽게 흔들어 현탁 후, 50mL 튜브에 모아주었다. 수집된 세포는 상온에서 2000g, 7분 동안 원심 분리하였다 원심 분리 후, 상층액을 모두 제거하고 침전된 세포는 30mL의 DPBS로 현탁하였다. 현탁된 세포는 hemocytometer 세트로 세포 계수 및 생존율을 확인하였다.
도 7을 참고하면, 2000IU/mL농도의 IL-2를 첨가한 조성물을 이용하여도 TIL을 증폭하는데 충분하다는 것을 확인할 수 있다. 또한, 세포 증폭 수율, 생존율을 종합적으로 고려하면 2000IU/mL농도의 IL-2를 첨가한 조성물을 이용하여 TIL을 증폭하는 것이 가장 효율적임을 확인할 수 있다.
실험예 4 배양 조성물 양 최적화 실험
1.
배양 조성물의 양을 최적화 하기 위한 TIL 분리 배양 공정
-
0일
병원 수술실로부터 운반된 종양 조직을 RPMI1640 배지를 이용하여 3회 세척하고 100mm 페트리디쉬로 옮겼다. 멸균 수술용 가위와 핀셋을 이용하여 종양 조직 내 지방조직을 제거하고 멸균 수술용 가위와 핀셋을 이용하여 종양 조직을 1~2mm 크기로 잘랐다. 1~2mm 크기로 자른 종양 조직을 24well 플레이트에 well당 2조각을 넣고, 상기 제조된 배양 조성물을 1mL과 2mL을 첨가하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 7일 동안 배양하였다.
-
7일
상기 제조된 배양 조성물을 0일차 1mL을 넣어준 well에는 0.5mL씩 첨가하고 2mL을 넣어준 well에는 1mL을 조심스럽게 제거하고 1mL을 첨가하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 3일 동안 배양하였다.
-
10일
상기 제조된 배양 조성물을 0일차 1mL을 넣어준 well에는 0.5mL씩 첨가하고 2mL을 넣어준 well에는 1mL을 조심스럽게 제거하고 1mL을 첨가하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 3일 동안 배양하였다.
-
12일
상기 제조된 배양 조성물을 0일차 1mL을 넣어준 well에는 0.5mL씩 첨가하고 2mL을 넣어준 well에는 1mL을 조심스럽게 제거하고 1mL을 첨가하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 3일 동안 배양하였다.
-
14일
세포를 수집하기 위해서 40μm 세포 스트레이너를 50mL 튜브 상단에 설치하였다. 배양이 끝난 세포를 10mL 파이펫을 이용하여 세포 스트레이너를 통과시켜 종양 조직은 거르고 배양된 세포만을 50mL 코니칼 튜브에 모은 후, 상온, 450g에서 5분 동안 원심분리 하였다. 침전된 세포에 DPBS 1mL을 첨가하여 파이펫팅으로 현탁시켰다. 현탁한 세포는 C-chip(hemocytometer)로 세포 계수 및 세포 생존율을 확인하여 0일차에 넣어준 배양 조성물의 양에 따른 세포의 증식율을 확인하였다.
도8에 따르면, 24웰 플레이트를 이용한 실험 결과, 1mL의 조성물을 이용하였을 때 2mL의 조성물을 이용하였을 때 보다 세포의 증식율이 더 높은 것을 확인할 수 있다.
실험예 5 종양 조각 당 수득되는 세포의 수 확인 실험
실험예 1-1. TIL 분리 배양 공정에 따른 방법과 동일한 방법으로 폐암(LC) 종양 조직, 두경부암(HNC) 종양 조직, 유방암(BC) 종양 조직을 이용하여 실험하였다. 그 결과 종양 조각당 평균 어느 정도 수의 세포가 얻어지는지 확인하였다. 도 9에 따르면, 폐암 종양 조직의 경우, 종양 조각당 평균 약 4E5 수의 세포가 얻어졌다. 두경부암 종양 조직의 경우, 종양 조각당 평균 약 6E5 수의 세포가 얻어졌다. 유방암 종양 조직의 경우, 종양 조각당 평균 약 6E5 수의 세포가 얻어졌다.
실험예 6 배양 및 증폭된 TIL에서 T 세포의 비율 확인 실험
1.
T 세포의 비율 확인을 위한 항체 준비
T 세포의 비율을 확인하기 위한 항체로는 CD3, CD45에 대한 항체를 준비하며, 아이소타입 대조군(isotype control) 항체도 같이 준비하였다.
표 2. T 세포 비율 확인을 위한 항체의 정보
2.
FACS 분석을 위한 전처리
배양 및 증폭된 TIL을 15mL 또는 50mL 코니컬 튜브(conical tube)에 넣고 FACS 버퍼 (2% FBS in DPBS)로 두번 세척하고 FACS 버퍼로 현탁시켰다. 현탁된 세포는 1.7mL 미세원심분리기 튜브(microcentrifuge tube)에 5 x 105 세포씩 넣어주고 4℃, 1500rpm에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액 200uL만 남기고 모두 버렸다. 남은 상층액으로 볼텍스(vortex)하여 세포를 현탁시키고 아래와 같이 각 튜브에 각각의 항체를 5uL씩 넣어주었다.
표 3. 튜브에 첨가된 항체
항체를 넣어준 후 4℃, 암소 조건에서 30분동안 반응시켰다. 반응 후 FACS 버퍼로 3번 세척한 후 4℃, 1500rpm에서 5분간 원심분리하고 상층액을 200uL 정도 남기고 버렸다. 남은 상층액으로 볼텍스(vortex)하여 세포를 현탁시키고 FACS 버퍼 300uL를 넣어 FACS 분석을 측정하였다.
3.
FACS 데이터 분석
FACS 장비에서 FSC/SSC 점 도표(dot plot)로 데이터를 불러온 후, 림프구(lymphocyte)영역을 게이팅(gating)하였다. 게이팅한 림프구(lymphocyte) 집단을 점 도표(dot plot)로 불러온 후 x축에는 CD3-APC-cy7을 y축에는 CD45-Amcyan으로 설정하고 사분면(quadrant)을 설정하였다. 사분면(quandrant)에서 CD3양성, CD45양성인 T 세포의 비율을 확인하였다.
도 10에 따르면, 실험예 1에 따라 생산된 TIL에서 T 세포의 비율을 측정한 결과 생산된 TIL의 99.7%, 99.4% 또는 98.4%가 T 세포임을 확인할 수 있었다. 즉, 본 출원에서 개시하는 생산 공정에 따라 생산된 TIL에는 높은 비율로 T세포가 존재함을 확인하였다.
실험예 7 장기간 동결 보존한 반제품을 이용한 증폭 (완제품 생산) 및 증폭된 TIL에서의 T 세포 비율 등의 확인
동결 보존한 반제품의 증폭
1.
알로-피더 PBMC 분리
백혈구 채집술을 통해 정상인 공여자의 혈액을 준비하고 60Gy X-ray로 방사선 조사를 실시하였다. Ficoll 용액을 50ml conical tube 아래부분에 bubble이 생기지 않도록 15ml 넣어주었다. 채혈한 혈액을 50ml conical tube에 나눠서 담은 후, 혈액양을 측정하였다. 50ml conical tube에 나눠 담긴 혈액을 1:2(Blood:DPBS) 비율로 희석하였다. 희석한 혈액 30mL을 Ficoll 15mL이 채워진 50mL conical tube 에 조심스럽게 넣어주고 800g, 20min, RT, Acc9/Dcc0 조건으로 원심분리하였다. PBMC 층만 취하여 새로운 50mL conical tube 로 옮겨주고 800g, 5min, RT, Acc9/Dcc9 조건으로 원심분리하였다. 원심 분리 후, 상층액을 모두 제거하고 DPBS 를 50mL 까지 채운 후 세척하여 800g, 5min, RT, Acc9/Dcc9 조건으로 원심분리하였다. 원심 분리 후, 상층액을 모두 제거하고 침전된 세포는 DPBS 로 현탁하였다. 현탁된 세포는 hemocytometer set 로 세포 계수 및 생존율을 확인하였다. 세포 계수 후, 1:200 (2 주 배양 TIL: PBMC) 비율로 필요한 세포 수만큼만 준비하였다. 준비된 세포를 800g, 5min, RT, Acc9/Dcc9 조건으로 원심분리하였다. 원심 분리 후, 상층액을 모두 제거하고 침전된 세포는 완제품 배양 완성 배지로 현탁하여 완제품 제조 시 사용하였다.
2.
완제품 생산
-
0일(해동 및 세포 접종)
액체질소탱크(LN2)에 장기간 1년 이상 동안 보관중인 반제품 바이알을 해동하였다. 해동시킨 바이알에서 TIL 반제품을 50ml conical tube로 옮겼다. AIM-V 배지와 TIL 반제품의 부피를 9:1로 하여 세척하였다. 1,500rpm, 5min, RT, Acc9/Dcc9 조건으로 원심분리하고, 상층액을 버린 후, CTS-AIM-V 배지로 현탁하여 세포 계수 및 세포 생존율을 확인하였다. 각 GREX100M(1L) 배양 용기 각각에 4E5 세포의 반제품 TIL 세포와 8E7 세포의 방사선 조사된 말초혈액단핵구(Allo-PBMC)를 넣어주고 완제품 증폭 조성물을 최종 부피 20ml가 되도록 첨가하였다. 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
완제품 증폭 조성물의 조성은 다음과 같다: CTS-AIM-V 배지, 3% 인간 세럼, 2000IU/ml IL-2, 및 30ng/ml OKT3
-
4일
CTS-AIM-V 배지에 2,000IU/mL의 IL-2와 소분된 인간 세럼을 3%가 되도록 넣어주어 필요한 양만큼 증폭 조성물을 조제하였다. 각 GREX 플라스크에 조제한 증폭 조성물 20mL을 추가로 첨가하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
-
6일
CTS-AIM-V 배지에 2,000IU/mL의 IL-2와 소분된 인간 세럼을 3%가 되도록 넣어주어 필요한 양만큼 증폭 조성물을 조제하였다. 각 GREX 플라스크에 조제한 증폭 조성물 60mL을 추가로 첨가하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
-
8일
CTS-AIM-V 배지에 2,000IU/mL의 IL-2와 소분된 인간 세럼을 3%가 되도록 넣어주어 필요한 양만큼 증폭 조성물을 조제하였다. 각 GREX 플라스크에 조제한 증폭 조성물 180mL을 추가로 첨가하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
-
10일
CTS-AIM-V 배지에 2,000IU/mL의 IL-2와 소분된 인간 세럼을 3%가 되도록 넣어주어 필요한 양만큼 증폭 조성물을 조제하였다. 각 GREX 플라스크에 조제한 증폭 조성물 540mL을 추가로 첨가하고 37℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
-
14일
배양이 끝난 세포는 배지 200mL을 남기고 조심스럽게 흡입(suction)하고 남은 배지 200mL를 조심스럽게 흔들어 현탁 후, 500mL 코닝 병에 모아주었다. 세포 수확이 끝난 flask에 150ml의 DPBS를 넣고 용기 내 세포를 회수하였다(2회 반복). 수집된 세포를 상온에서 2000g, 7분 동안 원심 분리하였다. 원심 분리 후, 상층액을 모두 제거하고 DPBS를 500ml까지 채운 후 세척하였다(2000g, 7min, RT, Acc9/Dcc9, 3회 반복). 원심분리 후, 상층액을 모두 제거하고 침전된 세포를 DPBS로 현탁하였다. 현탁된 세포를 hemocytometer set를 이용하여 세포 계수 및 세포 생존율을 확인하였다. 이후, 일부는 아래의 확인 시험에 이용하고, 나머지는 CS10을 이용하여 3 x 107 cells/mL 이 되도록 현탁하고 cryogenic vial 에 분주하여 cryo container 를 이용하여 deep-Freezer(-80℃)에 freezing 하였다.
동결 보존된 반제품 해동 시의 세포 생존률 확인
방법
동결 보존된 반제품을 해동하고, 해동 후 세포 생존률을 확인하였다. 액체질소에서 보관기간이 서로 다른 3 케이스 (BC16208, BC17058, BC18050)의 TIL 반제품을 1 바이알씩 해동하였다. 해동 후 세포 생존률을 확인하였다.
결과
해동 후 세포 생존율을 확인한 결과, BC16208 케이스의 경우 해동 후 세포 생존율은 91.25%, BC17058 케이스의 경우 95.88% 그리고 BC18050 케이스의 경우 69.37% 였다.
표 4. 반제품 해동 시 세포 생존율의 확인
완제품에서의 수율 확인
방법
해동한 3 케이스 ((BC16208, BC17058, BC18050)의 TIL 반제품을 이용하여 완제품을 제조하고, 최종 수확한 세포의 세포 수, 세포 생존률, 및 세포 증식률을 측정하였다.
결과
BC16208 케이스의 경우 1.31x109 개, BC17058 케이스의 경우 1.71x109 개 그리고 BC18050 케이스의 경우 1.42x109 개로 각각 약 3,270 배, 4,275 배, 3,540 배 증식된 것을 확인하였다. 모든 케이스에서 90% 이상의 높은 세포 생존율을 보임을 확인하였다.
표 5. 완제품 제조를 위한 반제품 세포 파종 조건
표 6. 완제품 제조 시 생산 수율
완제품에서의 세포 비율 확인
FACS를 통한 분석방법
완제품에서의 세포 비율은 FACS 분석을 통해 확인되었다. FACS 분석에 사용될 세포를 FACS Buffer (2% FBS in DPBS) 로 현탁하여 원심분리하였다 (1,500rpm, 4℃, 5min) (2회 반복). 원심 분리 후, 세포를 FACS buffer를 이용하여 부유시켰다. 부유된 세포를 1.7mL microtubes에 1~5 x 105 cells씩 분주하였다. Surface marker staining을 위해 tube에 antibody 를 2uL 처리하였다. 4℃, 암소 조건에서 30min 동안 incubation 하고, Incubation 완료 후, FACS buffer 를 800uL 넣고 원심분리하였다 (1,500rpm, 4℃, 5min). 상층액을 버리고 vortex 로 cell 을 풀어준 후 FACS buffer 800uL 를 넣고 원심분리하였다(1,500rpm, 4℃, 5min) (3회 반복). FACS buffer 200uL 로 현탁 후, 5mL FACS tube 로 옮겨 담아 BD FACS CantoTM II flow cytometer 기기를 이용하여 분석을 진행하였다.
결과
생산된 완제품에 대해 T cell marker 인 CD3, CD45의 발현을 FACS 분석으로 확인하였다. 생존 세포만을 대상으로 분석을 진행하기 위해, 1차적으로 SSC-A 및 FSC-A로 세포를 게이팅하였다 (도 12, 14, 및 16의 좌측 상단 그래프). 이때, 게이팅된 생존 세포는 도 12, 14, 및 16의 좌측 상단 그래프에서 lymphocytes로 표시된다. 시험 결과, CD3 와 CD45 가 동시에 발현되는 T Lymphocyte (CD3+/CD45+)의 비율은, BC16208 케이스에서 99.5%, BC17058 케이스에서 99.4% 그리고 BC18050 케이스에서 99.1%로 확인되었다. 그리고 BC16208 케이스의 경우 CD4+ T cell이 83.6%, CD8+ T cell이 13.2% 으로 확인되었고, BC17058 케이스의 경우 CD4+ T cell 이 93.2%, CD8+ T cell 이 4.71% 로 확인되었고, BC18050 케이스의 경우 CD4+ T cell 이 78.4% 로, CD8+ T cell 이 14.0% 로 확인되었다(도 12, 14, 및 16 참고). 참고로, 아래의 표에서 CD3+/CD45+ Lymphocyte 중 각 T 세포의 비율은 CD3+/CD45+ Lymphocyte 의 FACS 결과값을 100% 기준으로 하여 환산한 비율이다. 분석 결과는 아래 표 7에 요약된다.
표 7. 케이스별 세포 비율 확인
또한, 위에서 확인한 CD4+ T cell에서 메모리타입 CD4+ T cell의 비율을 CD45RA, CCR7 발현을 통해 확인하였다. 그 결과, BC16208, BC17058, BC18050 케이스 각각에서 Tem (effector memory T cell)이 81.35%, 83,84% 그리고 73.11%로 확인되었다(도 13, 15, 및 17 참고). Tscm은 stem cell memory T cell을 의미하며, Tcm은 central memory T cell 을, Tem은 effector memory T cell을, Teff는 effector T cell을 의미한다. 분석 결과는 아래 표 8에 요약된다.
표 8. 케이스별 CD4+ T cell의 타입 확인
또한, 위에서 확인한 CD8+ T cell 에서의 메모리 타입 CD8+ T cell의 비율을 CD45RA, CCR7 발현을 통해 확인하였다. 그 결과, BC16208, BC17058, BC18050 케이스 각각에서 Tem이 11.40%, 2,20% 그리고 10.90%로 확인되었다. 분석 결과는 아래의 표 9에 요약된다.
표 9. 케이스별 CD8+ T cell의 타입 확인
완제품의 순도 확인
FACS를 통한 분석방법
FACS 분석에 이용할 세포를 FACS Buffer (2% FBS in DPBS)로 현탁하여 원심분리하였다(1500rpm, 4℃, 5min) (2회 반복). 원심분리 후, 세포를 FACS buffer 로 부유하였다. 부유된 세포를 1.7mL microtubes 에 1~5 x 105 cells 씩 분주하였다. Surface marker staining 을 위해 tube 에 antibody 를 2uL 처리하였다. 4℃, 암소 조건에서 30min 동안 incubation 하였다. Incubation 완료 후, FACS buffer 를 800uL 넣고 원심분리하였다 (1,500rpm, 4℃, 5min). 상층액을 버리고 vortex 로 cell 을 풀어준 후 FACS buffer 800uL 를 넣고 원심분리하였다 (1,500rpm, 4℃, 5min) (3회 반복). FACS buffer 200uL 로 현탁 후, 5mL FACS tube 로 옮겨 BD FACS CantoTM II flow cytometer 기기를 이용하여 분석을 진행하였다.
결과
완제품의 순도를 확인하기 위해 Non-T cell 중에서 B cell marker 인 CD19, NK cell marker 인 CD56 의 발현을 FACS 분석으로 확인하였다. 생존 세포만을 대상으로 분석을 진행하기 위해, 1차적으로 SSC-A 및 FSC-A로 세포를 게이팅하였다 (도 18, 20, 및 22의 좌측 그래프). 이때 게이팅된 생존 세포는 도 18, 20, 및 22의 좌측 그래프에서 lymphocytes로 표시된다. CD19 발현율은 BC16208, BC17058, BC18050 케이스에서 각각 0.03%, 0.01%, 0.01% 로 확인되었다. 또한, CD56 의 발현율은 BC16208, BC17058, BC18050 케이스에서 각각 0.02%, 0.00%, 0.03% 로 확인되었다 (도 18 내지 도 23 참고). 분석 결과는 아래 표 10에 요약된다.
표 10. 완제품의 순도 확인
실험예 8 TIL을 포함하는 면역세포 조성물의 효과 확인 1 - 유방암 환자 유래 TIL의 종양 억제 효능 확인
유방암 환자의 종양 조직으로부터 배양한 종양침윤림프구(tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)의 in vivo 종양 억제 효능을 동일 환자의 환자 유래 이종이식 동물모델(patient-derived xenograft, PDX)에서 확인하였다.
실험예 8-1 TIL의 종양 억제 효능 확인, 및 TIL과 IL-2 병용 투여의 종양 억제 효능 확인
방법
1. Patient Derived Xenograft(PDX) 제작
하기의 방법을 통해 PDX를 제작하였다.
순화기간을 마친 5 주령의 NOD-SCID 마우스 (NOD.CB17-Prkdc scid , Koatech)를 보정하였다. 20mg/mL 농도의 Tribromoethanol(1x Avertin)를 250mg/kg 농도로 마우스의 복강내에 투여하여 마취를 유도하였다. 마취가 완료된 마우스의 귀에 ear punch 를 이용하여 ear tag 을 달아 개체 식별하였다. 제모기를 이용하여 수술 부위의 털을 제모하였다. 복부 피하조직을 1.5cm 정도 절개하였다. 직선 포셉(아이리스 포셉)을 이용하여 피하조직과 복막 사이를 둔성 분리하였다. 1~2mm2 크기의 환자유래 종양 조직을 동물의 오른쪽 위치의 4 번째 mammary fat pad에 이식하였다. 이식이 완료되면 절개한 피하조직을 Auto clip 을 이용하여 봉합하고 포비돈을 이용하여 소독하였다. 케이지에 동물을 넣고 체온 유지를 위해 깔짚을 체부에 덮어주었다. 케이지 네임텍에 동물정보를 기록하고 동물을 개별환기케이지(IVC rack)에 보관한 뒤 동물이 마취에서 깨어나는 것을 확인하였다.
2. TIL의 준비
증폭 후 액체질소에 냉동 보관된 frozen TIL(즉, 실험예 1 또는 실험예 7의 방법에 따라 생산된 완제품을 냉동 보관한 것, BC20082-TIL 샘플)을 37°C water bath에서 해동시켰다. 냉동 보관액에 존재하는 DMSO를 제거하기 위해 warmed CTS-AIM-V 배지와 해동된 완제품의 부피를 9:1 로 맞춰 혼합하였다. 상온에서 1,500rpm, 5 분동안 원심 분리하였다. 상층액을 버린 후, CTS-AIM-V 배지로 현탁하여 세포를 계수하였다. 상온에서 1,500rpm으로 5 분동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포침전물(cell pellet)을 DPBS 로 현탁하여 마우스에 투여하기 적절하도록 TIL 세포 수가 하기의 표와 같이 되도록 적정하였다. TIL의 투여량은 아래의 표에 개시된다. G1은 대조군 그룹이다. G2는 1x107 cells의 TIL을 투여한 그룹으로, TIL 저용량 세포 투여군으로 지칭된다. G3는 5x107 cells의 TIL을 투여한 그룹으로 TIL 고용량 세포 투여군으로 지칭된다. G4는 IL-2를 투여한 그룹으로, 0일차에서 5일차까지 매일 1.5x105 IU의 IL-2가 투여되었다. G4는 IL-2 투여 대조군으로 지칭된다. G5는 TIL과 IL-2를 병용 투여한 그룹으로, 1x107 cells의 TIL이 투여되었으며, TIL 투여 후 0일차에서 5일차까지 매일 1.5x105 IU의 IL-2가 투여되었다. G5는 TIL 저용량 + IL-2 병용 투여군으로 지칭된다. G6는 TIL과 IL-2를 병용 투여한 그룹으로, 5x107 cells의 TIL이 투여되었으며, TIL 투여 후 0일차에서 5일차까지 매일 1.5x105 IU의 IL-2가 투여되었다. G6는 TIL 고용량 + IL-2 병용 투여군으로 지칭된다.
표 11. TIL 및/또는 IL-2의 투여량에 대한 정보
3. TIL injection 및 마우스 관찰
종양의 크기가 13-63 mm3 정도 되는 마우스들로 군 분리를 하였다. 마우스를 보정기를 이용하여 보정한 후 warming water 에 꼬리를 넣어 혈관을 이완시켜주었다. TIL 과 IL-2 는 30G Insulin syringe 를 이용하여 1 min/head 의 속도로 정맥내 투여되었다. TIL은 0일차에 한번 투여되었다. IL-2를 병용 투여한 그룹에서, IL-2는 TIL 투여 후 0일차, 1일차, 2일차, 3일차, 4일차, 및 5일차에, 각각 1.5x105 IU/head 로 투여되었다. 즉, 투여 회차마다 1.5x105 IU/head 만큼 투여되었다. 투여 후, 일주일에 2 회씩 종양 크기 및 1 회씩 몸무게를 측정하였다. 종양 크기가 최대 2,000 mm3 이 될 때까지 관찰하였고, 2,000 mm3 이 넘어가면 마우스를 CO2 를 이용하여 안락사 하였다. 마우스의 안락사 후 종양을 적출하고 적출한 종양의 크기를 측정하였다.
결과
1. 마우스의 몸무게 변화
TIL 투여에 따른 마우스의 몸무게 변화 확인
G1, G2(TIL 저용량 투여군), G3(TIL 고용량 투여군)에서 마우스의 TIL 투여 후 몸무게 변화를 관찰하였다. 결과는 도 24 에 개시된다. 관찰 결과, 세포 투여에 의한 체중 변화는 없는 것으로 확인되었다.
TIL 및 IL-2 병용 투여에 따른 몸무게 변화 확인
또한, G4(IL-2 투여 대조군), G5(TIL 저용량 + IL-2 병용 투여군), 및 G6(TIL 고용량 + IL-2 병용 투여군)에서 마우스의 TIL 투여 후 몸무게 변화를 관찰하였다. 결과는 도 25 에 개시된다. 관찰 결과, 세포 투여에 의한 체중 변화는 없는 것으로 확인되었다.
2. 종양 크기의 변화 측정
TIL 투여에 따른 종양 크기의 변화 확인
G1, G2(TIL 저용량 투여군), G3(TIL 고용량 투여군)에서 마우스의 TIL 투여 후 종양 크기 변화를 관찰하였다. 결과는 도 26 및 도 27에 개시된다. 도 28 및 29는 TIL 투여 후 28일째에 마우스의 종양이 이식된 부위를 촬영한 사진이다. 또한, TIL 투여 후 38일째에 마우스를 안락사시키고, 종양을 적출하여 종양 크기를 측정하였다. 결과는 도 30에 개시되며, 적출한 종양을 촬영한 사진은 도 31에 개시된다. 측정 결과, G2(TIL 저용량 투여군), G3(TIL 고용량 투여군)은 종양 성장이 억제되어 대조군에 비해 종양 크기가 작은 것을 확인할 수 있었다.
TIL 및 IL-2 병용 투여에 따른 종양 크기의 변화 확인
G4(IL-2 투여 대조군), G5(TIL 저용량 + IL-2 병용 투여군), 및 G6(TIL 고용량 + IL-2 병용 투여군)에서 마우스의 TIL 투여 후 종양 크기 변화를 관찰하였다. 결과는 도 32 및 도 33에 개시된다. 도 34 및 도 35는 TIL 투여 후 28일째에 마우스의 종양이 이식된 부위를 촬영한 사진이다. 또한, TIL 투여 후 38일째에 마우스를 안락사시키고, 종양을 적출하여 종양 크기를 측정하였다. 결과는 도 36에 개시되며, 적출한 종양을 촬영한 사진은 도 37에 개시된다. 측정 결과, G5(TIL 저용량 + IL-2 병용 투여군), 및 G6(TIL 고용량 + IL-2 병용 투여군)은 종양 성장이 억제되어 대조군에 비해 종양 크기가 작은 것을 확인할 수 있었다.
실험예 9 TIL을 포함하는 면역세포 조성물의 효과 확인 - 폐암 환자 유래 TIL의 종양 억제 효능 확인
폐암 환자의 종양 조직으로부터 배양한 종양침윤림프구(tumor-infiltrating lymphocyte, TIL)의 in vivo 종양 억제 효능을 동일환자 환자 유래 이종이식 동물모델(patient-derived xenograft, PDX)에서 확인하였다.
방법
1. PDX 제작
하기의 방법을 통해 PDX를 제작하였다.
순화기간을 마친 5 주령의 NOD-SCID 마우스 (NOD.CB17-Prkdc scid, Koatech)를 보정하였다. 20mg/mL 농도의 Tribromoethanol(1x Avertin)를 250mg/kg 농도로 마우스의 복강내에 투여하여 마취를 유도하였다. 마취가 완료된 마우스의 귀에 ear punch 를 이용하여 ear tag 을 달아 개체 식별하였다. 제모기를 이용하여 수술 부위의 털을 제모하였다. 대퇴근부 위쪽 피하조직을 1cm 정도 절개하였다. 직선 포셉(아이리스 포셉)을 이용하여 피하조직과 근막 사이를 둔성 분리하였다. 1~2mm2 크기의 환자유래 종양 조직을 동물의 오른쪽 동일한 위치의 옆구리 피하에 이식하였다. 이식이 완료되면 절개한 피하조직을 Auto clip 을 이용하여 봉합하고 포비돈을 이용하여 소독하였다. 케이지에 동물을 넣고 체온 유지를 위해 깔짚을 체부에 덮어주었다. 케이지 네임텍에 동물정보를 기록하고 동물을 개별환기케이지(IVC rack)에 보관한 뒤 동물이 마취에서 깨어나는 것을 확인하였다.
2. TIL의 준비
증폭 후 액체질소에 냉동 보관된 frozen TIL(즉, 실험예 1 또는 실험예 7의 방법에 따라 생산된 완제품을 냉동 보관한 것, LC20001-TIL 샘플)을 37°C water bath에서 해동하였다. 냉동 보관액에 존재하는 DMSO 를 제거하기 위해 warmed CTS-AIM-V 배지와 완제품의 부피를 9:1 로 맞춰 혼합하였다. 상온에서 1,500rpm 에서 5 분동안 원심 분리하고 상층액을 제거한 후, CTS-AIM-V 배지로 현탁하여 세포 계수하였다. 상온에서 1,500rpm 으로 5 분동안 원심분리하여 상층액을 제거하고 세포 침전물(cell pellet)을 DPBS 로 현탁하고 TIL 세포 수가 200uL 당 5 x 107 개가 되도록 맞춰주었다. TIL의 투여량은 아래의 표에 개시된다. 대조군은 IL-2만을 투여한 그룹으로, 0일차에서 5일차까지 매일 1.5x105 IU의 IL-2가 투여되었다. 대조군은 IL-2로 지칭된다. 세포 투여군은 TIL과 IL-2를 병용 투여한 그룹으로, 5x107 cells의 TIL이 투여되었으며, TIL 투여 후 0일차에서 5일차까지 매일 1.5x105 IU의 IL-2가 투여되었다. 세포 투여군은 TIL+IL-2로 지칭된다.
표 12. TIL 및/또는 IL-2의 투여량에 대한 정보
3. TIL 및 IL-2의 병용 투여
종양의 크기가 13~63 mm3 정도 되는 마우스들로 군 분리를 하였다. 마우스를 보정기를 이용하여 보정한 후 warming water 에 꼬리를 넣어 혈관을 이완시켜주었다. TIL 과 IL-2 는 30G Insulin syringe 를 이용하여 1 min/head 의 속도로 정맥내 투여되었다. TIL은 0일차에 한번 투여되었다. IL-2를 병용 투여한 그룹에서, IL-2는 TIL 투여 후 0일차, 1일차, 2일차, 3일차, 4일차, 및 5일차에, 각각 1.5x105 IU/head 로 투여되었다. 즉, 투여 회차마다 1.5x105 IU/head 만큼 투여되었다. 투여 후, 일주일에 2 회씩 종양 크기 및 1 회씩 몸무게를 측정하였다. 종양 크기가 최대 2,000 mm3 이 될 때까지 관찰하였고, 2,000 mm3 이 넘어가면 마우스를 CO2 를 이용하여 안락사 하였다. 마우스 안락사 후 종양을 적출하고 적출한 종양의 크기를 측정하였다.
결과
1. 마우스의 몸무게 변화
대조군(IL-2)와 세포 투여군(TIL+IL-2)의 정맥내 투여 후 몸무게 변화를 관찰하였다. 결과는 도 38에 개시된다. 관찰 결과, 세포 투여에 의한 체중 변화는 없는 것으로 확인되었다.
2. 종양 크기의 변화 측정
IL-2 만 투여한 대조군과 TIL 과 IL-2 를 병용투여한 세포 투여군을 정맥내 투여 후 일주일에 두번씩 종양 사이즈를 측정하였다. 결과는 도 39 내지 도 41에 개시된다. 도 42는 TIL 투여 후 64일째에 마우스의 종양이 이식된 부위를 촬영한 사진이다. 또한, TIL 투여 후 70일째에 마우스를 안락사시키고, 종양을 적출하여 종양의 크기를 측정하였다. 결과는 도 43에 개시된다. 측정 결과 세포 투여군은 종양 성장이 억제되어 대조군에 비해 종양 크기가 작은 것을 확인할 수 있었다.
Claims (48)
- 다음을 포함하는 면역세포 조성물을 생산하는 방법:
(a) 제1 컨테이너에서 종양 샘플을 배양함,
이때 상기 종양 샘플은 상기 제1 컨테이너에서 제1 조성물 내에서 배양되고, 여기서 제1 조성물은 배지, 세럼, 및 500 내지 1500 IU/ml 의 IL-2를 포함하고,
이때 상기 제1 컨테이너는 가스 투과성 컨테이너이거나, 가스 공급 시스템을 포함하는 컨테이너이고,
이때 상기 배양은 13일 내지 15일 동안 수행되고,
이때 상기 배양 동안 제1 첨가 조성물이 1회 또는 2회 이상 상기 제1 컨테이너로 첨가되며, 상기 제1 첨가 조성물은 배지, 세럼, 및 IL-2를 포함하고;
(b) 상기 (a)에서 수득한 배양물로부터 제1 면역세포 집단을 수득함;
(c) 제2 컨테이너에 제2 조성물 및 제2 면역세포 집단을 파종함,
이때 상기 제2 면역세포 집단은 제1 면역세포 집단으로부터 유래되고,
이때 상기 제2 조성물은 배지, 세럼, 1000 내지 3000 IU/ml의 IL-2, 항-CD3 항체, 및 피더 세포를 포함하고,
이때 상기 제2 컨테이너는 가스 투과성 컨테이너이거나, 가스 공급 시스템을 포함하는 컨테이너임;
(d) 제3 면역세포 집단을 생산하기 위해 상기 제2 면역세포 집단을 증폭함,
이때 상기 증폭 동안, 제2 첨가 조성물이 1회 또는 2회 이상 상기 제2 컨테이너로 첨가되고, 상기 제2 첨가 조성물은 배지, 세럼, 및 IL-2를 포함하고,
상기 증폭은 13일 내지 15일 동안 수행됨; 및
(e) 상기 (d)에서 증폭된 증폭물로부터 제3 면역세포 집단을 수득하고 면역세포 조성물을 생산함,
이때 상기 제3 면역세포 집단은 상기 제2 면역세포 집단과 비교하여 적어도 2500배 이상의 수의 세포를 가짐.
- 제1항에 있어서,
상기 방법은 종양 샘플을 준비함을 더 포함하고,
이때 상기 종양 샘플을 준비함은 (a) 이전에 수행되는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 (a)에서, 상기 종양 샘플은 대상으로부터 수득 된 종양 조각으로부터 수득되고, 이때 상기 종양 샘플은 약 1mm2 내지 4mm2 면적의 단면을 갖는, 방법
- 제1항에 있어서,
(a)에서 12개 내지 24개의 상기 종양 샘플이 배양되는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 조성물의 상기 세럼의 농도는 5 부피% 이하인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 조성물의 상기 세럼의 농도는 약 3 부피%인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 조성물의 상기 배지는 CTS-AIM-V 배지인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 조성물의 상기 IL-2의 농도는 약 1000IU/ml 인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 조성물의 부피는 상기 제1 컨테이너의 최대 허용 가능한 용량의 30% 이하인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 컨테이너가 T75 플라스크인 경우, 상기 제1 조성물의 부피는 6ml인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 첨가 조성물은 상기 제1 조성물과 동일한 조성물질 및 조성비를 갖는 조성물인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 첨가 조성물의 IL-2의 농도는 약 1000IU/ml 이고,
상기 제1 첨가 조성물의 세럼의 농도는 약 3 부피% 이고,
상기 제1 첨가 조성물의 배지는 CTS-AIM-V 배지인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 배양 동안, 상기 제1 첨가 조성물은 2회 이상 상기 제1 컨테이너로 첨가되는, 방법.
- 제13항에 있어서,
상기 배양 동안, 상기 제1 첨가 조성물은 배양 시작일로부터 7, 10, 및 12일째에 상기 제1 컨테이너로 첨가되고,
이때 첨가되는 상기 제1 첨가 조성물의 양은 보충 시점마다 동일한 양인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제2 면역세포 집단은 상기 제1 면역세포 집단으로부터 수득되는, 방법.
- 제15항에 있어서,
이때 상기 제2 면역세포 집단은 제1 면역세포 집단을 세척함을 포함하는 방법에 의해 수득되는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제2 조성물의 배지는 CTS-AIM-V 인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제2 조성물의 상기 세럼의 농도는 5 부피% 이하인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제2 조성물의 상기 세럼의 농도는 약 3 부피%인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제2 조성물의 상기 IL-2의 농도는 약 2000IU/ml 인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 항-CD3 항체는 OKT3 인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제2 조성물의 상기 항-CD3 항체의 농도는 10ng/ml 내지 100ng/ml 인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제2 조성물의 상기 항-CD3 항체의 농도는 약 30ng/ml 인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 피더세포는 불활성화된 동종이형 말초혈액단핵세포인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 피더세포는 세포 수가 상기 제2 면역세포집단의 세포 수를 기준으로 약 1:200 (제2 면역세포 집단의 세포 수: 피더세포) 이 되도록 상기 제2 조성물에 포함되는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 파종함에서, 상기 제2 컨테이너에 파종되는 상기 제2 면역세포 집단의 세포 수는 1E5 내지 10E5인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 파종함에서, 상기 제2 컨테이너에 파종되는 상기 제2 면역세포 집단의 세포 수는 약 4E5 인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제2 조성물의 부피는 상기 제2 컨테이너의 최대 허용가능한 용량의 30% 이하인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제2 컨테이너가 GREX100M 인 경우, 상기 제2 조성물의 부피는 약 20ml인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 증폭 동안, 면역세포는 상기 제2 컨테이너로부터 제거되거나 외부로부터 추가되지 않는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제2 첨가 조성물은 상기 제2 조성물에서 상기 항-CD3 항체 및 상기 피더세포를 제외한 것과 같은 조성물질 및 조성비를 갖는 조성물인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제2 첨가 조성물의 IL-2의 농도는 약 2000IU/ml 이고,
상기 제2 첨가 조성물의 세럼의 농도는 약 3 부피% 이고,
상기 제2 첨가 조성물의 배지는 CTS-AIM-V인, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 증폭 동안, 상기 제2 첨가 조성물은 2회 이상 제2 컨테이너에 첨가되는, 방법.
- 제33항에 있어서,
첨가되는 상기 제2 첨가 조성물의 양은 보충 시점마다 서로 다른 양인, 방법.
- 제33항에 있어서,
상기 증폭 동안, 상기 제2 첨가 조성물은 증폭 시작일로부터 4, 6, 8, 및 10일째 상기 제2 컨테이너에 첨가되고, 이때 첨가되는 상기 제2 첨가 조성물의 양은 보충 시점마다 점점 증가하는, 방법.
- 제33항에 있어서,
상기 제2 첨가 조성물은 증폭 시작일로부터 4일째 20ml, 6일째 60ml, 8일째 180ml, 및 10일째 540ml 로 상기 제2 컨테이너에 첨가되는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제3 면역세포 집단은 상기 제2 면역세포 집단과 비교하여 적어도 4000배 이상의 수의 세포를 가지는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 면역세포 조성물은 상기 제3 면역세포 집단을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 면역세포 조성물은 상기 제3 면역세포 집단으로부터 수득된 제4 면역세포 집단을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 종양 샘플은 유방암, 대장암, 폐암, 위암, 신장암, 난소암, 또는 흑색종을 포함하는 피부암을 가지는 대상의 고형 종양으로부터 유래되는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 종양 샘플은 폐암을 가지는 대상의 악성 흉수로부터 유래되는, 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 제1 면역세포 집단을 동결보존함; 및
상기 동결보존된 제1 면역세포 집단을 해동함을 더 포함하고,
이때, 상기 제1 면역세포 집단을 동결보존함; 및 상기 동결 보존된 제1 면역세포 집단을 해동함은 (b) 상기 (a)에서 수득한 배양물로부터 제1 면역세포 집단을 수득함 이후에 수행되는, 방법.
- 종양침윤림프구를 포함하는 면역세포 조성물.
- 제43항에 있어서,
상기 면역세포 조성물은 제1항의 방법에 따라 생산된, 면역세포 조성물.
- 제1항의 방법에 의해 생산된, 종양침윤림프구를 포함하는 면역세포 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는,
대상의 종양을 치료하는 방법.
- 제45항에 있어서,
상기 대상은 상기 종양침윤림프구가 유래된 대상인, 대상의 암을 치료하는 방법.
- 제1항의 방법에 따라 생산된, 종양침윤림프구를 포함하는 면역세포 조성물의, 대상의 암을 치료하기 위한 용도.
- 제47항에 있어서
상기 대상은 상기 종양침윤림프구가 유래된 대상인, 면역세포 조성물의 용도.
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