JP2024512978A - 免疫細胞組成物を生成するための方法 - Google Patents

Abstract

【要約】本願は、腫瘍浸潤リンパ球を含む免疫細胞組成物を生成するための方法、及び、それによって生成される免疫細胞組成物の使用に関する。

Description

本願は、免疫細胞組成物を生成するための方法に関する。特に、本願は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む免疫細胞組成物を生成するための方法に関する。

がん免疫療法は、がんを治療する方法のうちの１つであり、この方法は、がんを治療するために人体の免疫系を活性化する。がん免疫療法において使用されている免疫治療の一種として、免疫細胞治療が存在し、これは、体内の免疫細胞が採取されて、遺伝子工学技術を用いて強化又は改変された後に体内に戻される細胞治療法である。

そのような細胞治療法のうちの１つは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を用いた方法であり、ここで、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）とは、がん細胞の周囲に集まるリンパ球を指す。ＴＩＬを用いた治療は、患者の腫瘍に浸潤する自然発生Ｔ細胞を採取し、次にそのＴ細胞を活性化及び増殖（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）させる処理を含む。上記処理を通して活性化され多数に増殖した多数の活性化されたＴ細胞は、患者に注入して戻され、その結果として腫瘍の破壊をもたらす。

換言すれば、腫瘍浸潤リンパ球を用いたがん治療には、ＴＩＬを培養及び増殖させる処理が不可欠である。しかしながら、この処理において、腫瘍組織からのＴＩＬの単離、培養及び増殖は複雑であり、より高い収率でＴＩＬを増殖させることは困難である。したがって、ＴＩＬ培養及び増殖のためのより効率的な処理が必要であり、本願は、高い収率で免疫細胞組成物を生成するための方法に関する。

本願は、従来の低収率の生成方法と比較して、免疫細胞組成物を高い収率で効率的に生成するための方法を提供することを対象とする。

１つの実施形態において、本願は、免疫細胞を効率的に培養及び増殖させるための方法を提供する。

１つの特定の実施形態において、本願は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を効率的に培養及び増殖させるための方法を提供する。

本願の１つの態様は、免疫細胞組成物を生成するための方法を提供する。

本願の別の態様は、ＴＩＬを含む免疫細胞組成物を提供する。

本願のまた別の態様は、ＴＩＬを含む免疫細胞組成物の使用を提供する。

本願による免疫細胞組成物を生成するための方法は、従来の免疫細胞組成物を生成するための方法のそれよりも高効率を有する。具体的には、免疫細胞組成物を生成するための従来の方法と比較して、本願の方法においては低濃度のＩＬ－２が使用され、免疫細胞を高い収率で入手することができる。

図１～図４は、免疫細胞組成物を生成する処理の例を示している。

半産物（ｓｅｍｉ－ｐｒｏｄｕｃｔ）（中間産物（ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｐｒｏｄｕｃｔ））（試料から免疫細胞集団を単離して培養することによって生成され取得された第１の免疫細胞集団）を生成する処理を示している。

冷凍保存された半産物から最終産物（第２の免疫細胞集団から増殖させた第３の免疫細胞集団を取得することによって生成された免疫細胞組成物）を生成する処理を示している。

腫瘍試料から最終産物を生成する処理を示しており、この処理は、冷凍保存段階を含む例である。

腫瘍試料から最終産物を生成する処理を示しており、この処理は、冷凍保存段階を含まない例である。

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）増殖収率を測定することによって入手された実験結果を示している。

ＴＩＬの生成においてＩＬ－２濃度を最適化するための実験結果を示している。ＴＩＬ培養においてＩＬ－２濃度を最適化するための実験結果を示している。

ＴＩＬの生成においてＩＬ－２濃度を最適化するための実験結果を示している。ＴＩＬ増殖においてＩＬ－２濃度を最適化するための実験結果を示している。

培養において使用される組成物の体積に応じたＴＩＬの細胞増殖率に関する実験結果を示している。

ＴＩＬ培養において腫瘍組織当たりの培養細胞の数を測定することによって入手された実験結果を示している。

培養及び増殖させたＴＩＬ中のＴ細胞のパーセンテージを確認した結果を示している。

腫瘍試料からのＴＩＬの単離／培養及びＴＩＬの大量培養（増殖）のための処理の代表例を示している。

冷凍保存されて解凍された半産物から増殖させたＴＩＬ（試料番号ＢＣ１６２０８）中のＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを確認した結果を示している。

図１２において同定されたＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞中のＴ細胞のタイプを確認した結果を示している。

冷凍保存されて解凍された半産物から増殖させたＴＩＬ（試料番号ＢＣ１７０５８）中のＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞パーセンテージを確認した結果を示す。

図１４において同定されたＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞中のＴ細胞のタイプを確認した結果を示している。

冷凍保存されて解凍された半産物から増殖させたＴＩＬ（試料番号ＢＣ１８０５０）中のＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを確認した結果を示している。

図１６において同定されたＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞中のＴ細胞のタイプを確認した結果を示している。

冷凍保存されて解凍された半産物から増殖させたＴＩＬ（試料番号ＢＣ１６０２８）中に存在する免疫細胞のパーセンテージを確認した結果を示している。 冷凍保存されて解凍された半産物から増殖させたＴＩＬ（試料番号ＢＣ１６０２８）中に存在する免疫細胞のパーセンテージを確認した結果を示している。

冷凍保存されて解凍された半産物から増殖させたＴＩＬ（試料番号ＢＣ１７０５８）中に存在する免疫細胞のパーセンテージを確認した結果を示している。 冷凍保存されて解凍された半産物から増殖させたＴＩＬ（試料番号ＢＣ１７０５８）中に存在する免疫細胞のパーセンテージを確認した結果を示している。

冷凍保存されて解凍された半産物から増殖させたＴＩＬ（試料番号ＢＣ１８０５０）中に存在する免疫細胞のパーセンテージを確認した結果を示している。 冷凍保存されて解凍された半産物から増殖させたＴＩＬ（試料番号ＢＣ１８０５０）中に存在する免疫細胞のパーセンテージを確認した結果を示している。

ＴＩＬ投与後の各群におけるマウスの体重の変化を確認した結果を示している。

ＴＩＬ及びＩＬ－２の同時投与後の各群におけるマウスの体重の変化を確認した結果を示している。

ＴＩＬ投与後の各群におけるマウスの腫瘍体積の変化を確認した結果を示している。 ＴＩＬ投与後の各群におけるマウスの腫瘍体積の変化を確認した結果を示している。 ＴＩＬ投与後の各群におけるマウスの腫瘍体積の変化を確認した結果を示している。 ＴＩＬ投与後の各群におけるマウスの腫瘍体積の変化を確認した結果を示している。

ＴＩＬ投与後３８日目にマウスを安楽死させ、そこから腫瘍を摘出することによって入手された各群における腫瘍サイズを確認した結果を示している。 ＴＩＬ投与後３８日目にマウスを安楽死させ、そこから腫瘍を摘出することによって入手された各群における腫瘍サイズを確認した結果を示している。

ＴＩＬ及びＩＬ－２の同時投与後の各群におけるマウスの腫瘍サイズの変化を確認した結果を示している。 ＴＩＬ及びＩＬ－２の同時投与後の各群におけるマウスの腫瘍サイズの変化を確認した結果を示している。 ＴＩＬ及びＩＬ－２の同時投与後の各群におけるマウスの腫瘍サイズの変化を確認した結果を示している。 ＴＩＬ及びＩＬ－２の同時投与後の各群におけるマウスの腫瘍サイズの変化を確認した結果を示している。

ＴＩＬ投与後３８日目にマウスを安楽死させ、そこから腫瘍を摘出することによって入手された各群における腫瘍サイズを確認した結果を示している。 ＴＩＬ投与後３８日目にマウスを安楽死させ、そこから腫瘍を摘出することによって入手された各群における腫瘍サイズを確認した結果を示している。

ＴＩＬ及びＩＬ－２の同時投与後の各群におけるマウスの体重の変化を確認した結果を示している。

ＴＩＬ及びＩＬ－２の同時投与後の各群におけるマウスの腫瘍体積の変化を確認した結果を示している。 ＴＩＬ及びＩＬ－２の同時投与後の各群におけるマウスの腫瘍体積の変化を確認した結果を示している。 ＴＩＬ及びＩＬ－２の同時投与後の各群におけるマウスの腫瘍体積の変化を確認した結果を示している。 ＴＩＬ及びＩＬ－２の同時投与後の各群におけるマウスの腫瘍体積の変化を確認した結果を示している。

ＴＩＬ及びＩＬ－２の同時投与後７０日目にマウスを安楽死させ、そこから腫瘍を摘出することによって入手された各群における腫瘍体積を確認した結果を示している。 ［発明の態様］

本願の１つの実施形態において、免疫細胞組成物を生成するための方法が提供される。

本願の１つの実施形態において、本願の一実施形態による方法によって生成される免疫細胞組成物が提供される。

本願の１つの実施形態において、被験体内のがんを治療するための免疫細胞組成物の使用が提供される。

本願の１つの実施形態において、免疫細胞組成物を用いて被験体内のがんを治療するための方法。

本願の実施形態が、下で詳細に説明される。

本願の１つの実施形態において、以下を備える免疫細胞組成物を生成するための方法が提供される。
（ａ）第１の容器内で腫瘍試料を培養する段階、
ここで、腫瘍試料は、第１の容器内の第１の組成物中で培養され、第１の組成物は、培地、血清、及び５００～１５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含み、
ここで、第１の容器は、ガス透過性容器又はガス供給システムを有する容器であり、
ここで、培養は、１３～１５日間行われ、
ここで、培養中、第１の容器に第１の添加剤組成物が１回又は２回又はそれよりも多い回数添加され、第１の添加剤組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２を含む；
（ｂ）（ａ）から入手した培養された産物から第１の免疫細胞集団を入手する段階；
（ｃ）第２の容器内に第２の組成物及び第２の免疫細胞集団を播種する段階、
ここで、第２の免疫細胞集団は、第１の免疫細胞集団に由来し、
ここで、第２の組成物は、培地、血清、１０００～３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体、及びフィーダー細胞を含み、
ここで、第２の容器は、ガス透過性容器又はガス供給システムを有する容器である；
（ｄ）前記第２の免疫細胞集団を増殖させて、第３の免疫細胞集団を生成する段階、
ここで、増殖中、第２の容器に第２の添加剤組成物が１回又は２回又はそれよりも多い回数添加され、第２の添加剤組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２を含み、
ここで、増殖は、１３～１５日間行われる；及び
（ｅ）（ｄ）において増殖させた増殖産物から第３の免疫細胞集団を入手して、免疫細胞組成物を生成する段階、
ここで、第３の免疫細胞集団は、第２の免疫細胞集団と比較して少なくとも２５００倍多い細胞を有する。

１つの実施形態において、方法は、前記腫瘍試料を調製する段階をさらに備えてよく、前記腫瘍試料を前記調製する段階は、（ａ）の前に実行されてよい。

１つの実施形態において、（ａ）において、被験体から入手した腫瘍断片から前記腫瘍試料を入手してよく、前記腫瘍試料は、おおよそ１ｍｍ^２～４ｍｍ^２の断面積を有してよい。

１つの実施形態において、（ａ）において、１２～２４の腫瘍試料が培養されてよい。

１つの実施形態において、第１の組成物の血清の濃度は、５体積％又はそれよりも低くてよい。

１つの実施形態において、第１の組成物の血清の濃度は、約３体積％又はそれよりも低くてよい。

１つの実施形態において、第１の組成物の培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地であってよい。

１つの実施形態において、第１の組成物のＩＬ－２の濃度は、約１０００ＩＵ／ｍＬであってよい。

１つの実施形態において、第１の組成物の体積は、第１の容器の最大許容可能容量の３０％又はそれよりも小さくてよい。

１つの実施形態において、第１の容器は、Ｔ７５フラスコであってよく、第１の組成物の体積は、６ｍｌであってよい。

１つの実施形態において、第１の添加剤組成物は、第１の組成物と同じ組成物質及び組成比を有してよい。

１つの実施形態において、第１の添加剤組成物のＩＬ－２濃度は、約１０００ＩＵ／ｍＬであってよく、第１の添加剤組成物の血清濃度は、約３体積％であってよく、第１の添加剤組成物の培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地であってよい。

１つの実施形態において、培養中、第１の添加剤組成物は、第１の容器に２回又はそれよりも多い回数添加されてよい。

ここで、１つの実施形態において、培養中、第１の添加剤組成物は、培養の開始日から７日目、１０日目、及び１２日目に第１の容器に添加されてよく、添加される第１の添加剤組成物の量は、各添加点において同じであってよい。

１つの実施形態において、第２の免疫細胞集団は、第１の免疫細胞集団から入手されてよい。

１つの実施形態において、第２の免疫細胞集団は、第１の免疫細胞集団を洗浄する段階を備える方法によって入手されてよい。

１つの実施形態において、第２の組成物の培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖであってよい。

１つの実施形態において、第２の組成物の血清濃度は、５体積％又はそれよりも低くてよい。

１つの実施形態において、第２の組成物の血清の濃度は、約３体積％であってよい。

１つの実施形態において、第２の組成物のＩＬ－２の濃度は、約２０００ＩＵ／ｍＬであってよい。

１つの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ３であってよい。

１つの実施形態において、第２の組成物の抗ＣＤ３抗体濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬであってよい。

１つの実施形態において、第２の組成物の抗ＣＤ３抗体濃度は、約３０ｎｇ／ｍＬであってよい。

１つの実施形態において、フィーダー細胞は、不活性化同種異系末梢血単核細胞であってよい。

１つの実施形態において、フィーダー細胞は、第２の免疫細胞集団中の細胞数に基づいて、おおよそ１：２００（第２の免疫細胞集団の細胞数：フィーダー細胞数）の比で第２の組成物に含まれてよい。

１つの実施形態において、播種する段階において、第２の容器に播種される第２の免疫細胞集団の細胞数は、１Ｅ５～１０Ｅ５であってよい。

１つの実施形態において、播種する段階において、第２の容器に播種される第２の免疫細胞集団の細胞数は、約４Ｅ５であってよい。

１つの実施形態において、第２の組成物の体積は、第２の容器の最大許容可能容量の３０％又はそれよりも小さくてよい。

１つの実施形態において、第２の容器は、ＧＲＥＸ１００Ｍであってよく、第２の組成物の体積は、約２０ｍｌであってよい。

１つの実施形態において、増殖中、免疫細胞は、第２の容器から除去されてなくてもよいし、又は、外部から添加されなくてもよい。

１つの実施形態において、第２の添加剤組成物は、抗ＣＤ３抗体及びフィーダー細胞が除外された、第２の組成物と同じ組成物質及び組成比を有する組成物であってよい。

１つの実施形態において、第２の添加剤組成物のＩＬ－２濃度は、約２０００ＩＵ／ｍＬであってよく、第２の添加剤組成物の血清濃度は、約３体積％であってよく、第２の添加剤組成物の培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖであってよい。

１つの実施形態において、増殖中、第２の添加剤組成物は、第２の容器に２回又はそれよりも多い回数添加されてよい。

ここで、１つの実施形態において、添加される第２の添加剤組成物の量は、各添加点で異なってよい。

ここで、１つの実施形態において、増殖中、第２の添加剤組成物は、増殖の開始日から４日目、６日目、８日目、及び１０日目に第２の容器に添加されてよく、添加される第２の添加剤組成物の量は、各添加点で徐々に増加されてよい。

ここで、１つの実施形態において、第２の添加剤組成物は、増殖の開始日から４日目に２０ｍｌ、増殖の開始日から６日目に６０ｍｌ、増殖の開始日から８日目に１８０ｍｌ、及び増殖の開始日から１０日目に５４０ｍｌ、第２の容器に添加されてよい。

１つの実施形態において、第３の免疫細胞集団の細胞数は、第２の免疫細胞集団の細胞数よりも少なくとも４０００倍多くてよい。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物は、第３の免疫細胞集団を含んでよい。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物は、第３の免疫細胞集団から入手された第４の免疫細胞集団を含んでよい。

１つの実施形態において、腫瘍試料は、乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、腎臓癌、卵巣癌、又は悪性黒色腫を含む皮膚癌を有する被験体の固形腫瘍に由来するものであってよい。

１つの実施形態において、腫瘍試料は、肺癌を有する被験体の悪性胸水に由来するものであってよい。

１つの実施形態において、方法は、第１の免疫細胞集団を冷凍保存する段階；及び冷凍保存された第１の免疫細胞集団を解凍する段階をさらに備えてよく、第１の免疫細胞集団を冷凍保存する段階及び冷凍保存された第１の免疫細胞集団を解凍する段階は、（ｂ）の後に行われてよい。

本願の１つの実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球を含む免疫細胞組成物が提供される。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物は、本願の一実施形態による免疫細胞組成物を生成するための方法によって生成されてよい。

本願の１つの実施形態において、腫瘍浸潤リンパ球を含む免疫細胞組成物を投与する段階を備える、被験体のがんを治療するための方法が提供される。ここで、免疫細胞組成物は、本願の一実施形態による免疫細胞組成物を生成するための方法によって生成されてよい。

１つの実施形態において、被験体は、腫瘍浸潤リンパ球がそれに由来する被験体であってよい。

本願の１つの実施形態において、被験体のがんを治療するための腫瘍浸潤リンパ球を含む免疫細胞組成物の使用が提供される。ここで、免疫細胞組成物は、本願の一実施形態による免疫細胞組成物を生成するための方法によって生成されてよい。

１つの実施形態において、被験体は、腫瘍浸潤リンパ球がそれに由来する被験体であってよい。
［本発明の開示］

以下、添付図面を参照しながら、特定の実施形態及び実施例を通して、本発明がさらに詳細に説明される。添付図面は、全てではなく一部の実施形態を含むことに留意されたい。本願に開示される本発明の内容は、様々な方法で実施されてよく、本願に記載した特定の実施形態に限定されない。本発明が属する分野の当業者であれば、本願に開示した本発明の内容に関する様々な修正及び他の実施形態を推測することができる。したがって、本願に開示された本発明の内容は、本願に記載された特定の実施形態に限定されず、その修正及び他の実施形態が特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解されるべきである。
［用語の定義］

免疫（細胞）組成物
本願において使用される「免疫細胞組成物」又は「免疫組成物」という用語は、免疫細胞集団を含む組成物を指す。本願において、免疫細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を包含する。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、腫瘍まで移動して、腫瘍の周囲で生きる免疫細胞を指す。ＴＩＬは、がん細胞を認識し、これらを殺すことができる。ＴＩＬは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及びナチュラルキラー細胞を含む様々な免疫細胞を含んでよい。Ｔ細胞は、ＴＩＬの大部分を占めることが知られている。

半産物（Ｓｅｍｉ－ｐｒｏｄｕｃｔ（ｈａｌｆ－ｐｒｏｄｕｃｔ））
本願において開示される免疫細胞組成物を生成するための方法は、半産物を生成する段階を備えてよい。ここで、半産物とは、試料から免疫細胞集団を単離して培養することを通して生成され入手される第１の免疫細胞集団を指す。免疫細胞治療技術の分野で使用されている従来の用語によれば、半産物とは、プレ急速増殖プロトコル（ｐｒｅ－Ｒａｐｉｄ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）（プレＲＥＰ（ｐｒｅ－ＲＥＰ））によって製造された免疫細胞集団を指す。すなわち、免疫細胞治療技術の分野における従来の用語によれば、半産物とは、プレＲＥＰ産物と称される場合がある。

最終産物
本願において開示される免疫細胞組成物を生成するための方法は、最終産物（ｆｉｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔ（ｆｉｎｉｓｈｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ））を生成する段階を含んでよい。ここで、最終産物とは、第２の免疫細胞集団から増殖された第３の免疫細胞集団を入手することによって生成された免疫細胞組成物又は免疫組成物を指す。免疫細胞治療技術の分野で使用される従来の用語によれば、最終産物とは、急速増殖プロトコル（Ｒａｐｉｄ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ）（ＲＥＰ）によって製造された免疫細胞集団を指す。すなわち、免疫細胞治療技術の分野で使用される従来の用語によれば、最終産物は、ＲＥＰ産物と称される場合がある。それは、薬剤産物と称される場合もある。

被験体
本願において用いられる場合、被験体とは、腫瘍を有する個体を指し、ヒトを含む。腫瘍は、固形腫瘍及び液性腫瘍であってよい。固形腫瘍は、肺腫瘍、乳房腫瘍、膀胱腫瘍、卵巣腫瘍等における腫瘍を含み、液性腫瘍は、例えば、白血病、骨髄腫、リンパ腫等の血液学的腫瘍を含むが、本願はこれに限定されない。

容器
本願において用いられる場合、容器は、腫瘍組織又は腫瘍試料を培養するか、又は免疫細胞集団を増殖させるのに使用される容器を指す。本願において、容器は、培地、血清、血漿、ＩＬ－２、ＯＫＴ３、及び／又はフィーダー細胞を含む組成物とともに、腫瘍組織又は免疫細胞集団を培養又は増殖させるのに使用される。容器は、ガスが通過するガス透過性容器又はガスを提供するガス供給システムを有する容器であってよい。すなわち、容器は、ガスが容器を通過することができるように製造された容器、又は、ガスを通過させように製造されていないがガスの通り抜けを可能にする別個のガス供給システムを有する容器であってよい。容器は、例えば、２４ウェルプレート、Ｔ２５、Ｔ７５、又はＴ１２５フラスコ、ＧＲＥＸ１０、ＧＲＥＸ１０Ｍ、ＧＲＥＸ１０Ｍ－ＣＳ、ＧＲＥＸ１００、ＧＲＥＸ１００Ｍ、ＧＲＥＸ１００Ｍ－ＣＳ、ＧＲＥＸ５００、ＧＲＥＸ５００Ｍ、又はＧＲＥＸ５００Ｍ－ＣＳフラスコ等のフラスコ、又は培養バッグであってよいが、本願はこれに限定されない。

培地
本願において用いられる場合、培地とは、細胞及び／又は組織を培養するための栄養源を指す。培地は、培養されることになる物体のタイプによって変わり得る。培地は、ＡｌｙＳ５０５Ｎ、ＡＩＭ－Ｖ培地、又はＲＰＭＩ培地であってよいが、本願はこれに限定されない。本願の１つの実施形態によれば、培地には、組織及び／又は免疫細胞を培養及び／又は増殖させるために使用されることになる血清、血漿、ＩＬ－２、ＯＫＴ３及び／又はフィーダー細胞が補足される。

血清
本願において用いられる場合、「血清（"ｓｅｒｕｍ" ｏｒ "ｂｌｏｏｄ ｓｅｒｕｍ"）」という用語は、基本培養培地に添加される添加剤を指し、血清は、高分子量タンパク質、低分子量栄養素、及び細胞成長に必要な成分を含有し得る。血清は、市販のヒトＡＢ血清等のヒト血清であるが、本願はこれに限定されない。ここで、培地中の血清の濃度は、おおよそ１０ｖｏｌ％又はそれよりも低く、おおよそ９ｖｏｌ％又はそれよりも低く、おおよそ８ｖｏｌ％又はそれよりも低く、おおよそ７ｖｏｌ％又はそれよりも低く、おおよそ６ｖｏｌ％又はそれよりも低く、おおよそ５ｖｏｌ％又はそれよりも低く、おおよそ４ｖｏｌ％又はそれよりも低く、又は、３ｖｏｌ％又はそれよりも低くてよい。

血漿
本願において用いられる場合、「血漿」（"ｐｌａｓｍａ" ｏｒ "ｂｌｏｏｄ ｐｌａｓｍａ"）という用語は、基本培養培地に添加される添加剤を指し、血漿は、フィブリノゲン不含有血清を示す。血漿は、細胞成長に必要な成分を含有する。本願において使用される血漿は、患者の血液から単離された血漿を含むが、本願はこれに限定されない。本願において、血清の代わりに、培地に含まれている血漿が使用されてよい。ここで、培地中の血漿の濃度は、おおよそ１０ｖｏｌ％又はそれよりも低く、おおよそ９ｖｏｌ％又はそれよりも低く、おおよそ８ｖｏｌ％又はそれよりも低く、おおよそ７ｖｏｌ％又はそれよりも低く、おおよそ６ｖｏｌ％又はそれよりも低く、おおよそ５ｖｏｌ％又はそれよりも低く、おおよそ４ｖｏｌ％又はそれよりも低く、又は、３ｖｏｌ％又はそれよりも低くてよい。
ＩＬ－２

本願において使用される「ＩＬ－２」という用語は、Ｔ細胞増殖を促進する因子を指すインターロイキン－２の略語である。ＩＬ－２は、ヒトリコンビナントＩＬ－２等の様々なタイプのＩＬ－２を含む。本願において、ＩＬ－２は、第１の組成物に含まれてよく、ＩＬ－２の濃度は、おおよそ１０，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ９，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ８，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ７，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ６，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ５，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ４，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ３，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬ、又は、おおよそ５００ＩＵ／ｍＬであってよい。さらに、本願において、ＩＬ－２は、ＯＫＴ３及びフィーダー細胞とともに第２の組成物に含まれてよく、ここで、ＩＬ－２の濃度は、おおよそ１０，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ９，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ８，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ７，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ６，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ５，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ４，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ３，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬ、又はおおよそ、５００ＩＵ／ｍＬであってよい。

免疫細胞集団
本願において用いられる場合、「免疫細胞集団」という用語は、本質的に複数の免疫細胞からなる群又は集団を指し、免疫細胞はＴＩＬを含む。ここで、第１の免疫細胞集団は、最初に被験体の腫瘍組織を培養することによって入手される免疫細胞集団を意味し、第２の免疫細胞集団は、第１の免疫細胞集団に由来し、必要に応じて第１の免疫細胞集団を分割することによって使用される、免疫細胞集団を意味し、第３の免疫細胞集団は、第２の免疫細胞集団を増殖させることによって入手される免疫細胞集団を意味する。

冷凍保存
本願において用いられる場合、「冷凍保存」という用語は、免疫細胞の損傷を抑制し、長期にわたって免疫細胞集団を保存するための、超低温での免疫細胞集団の保管を指す。例えば、本願において、冷凍保存は、液体窒素タンク内で細胞又は免疫細胞集団を保管する処理を表すために使用され得る。１つの実施形態において、冷凍保存期間は、最大でも、おおよそ１年、おおよそ２年、おおよそ３年、おおよそ４年、おおよそ５年、おおよそ６年、おおよそ７年、おおよそ８年、おおよそ９年、おおよそ１０年、おおよそ１１年、おおよそ１２年、おおよそ１３年、おおよそ１４年、おおよそ１５年、おおよそ１６年、おおよそ１７年、おおよそ１８年、おおよそ１９年、又はおおよそ２０年であってよい。免疫細胞集団を冷凍保存するために、冷凍保存のための培地が使用される。冷凍保存のための培地は、おおよそ１０％ＤＭＳＯを含んでよく、培地は、Ｃｒｙｏｓｔｏｒ ＣＳ１０培地を含むが、本願はこれに限定されない。冷凍保存は、免疫細胞組成物を生成するための方法の各段階の間に選択的に含まれてよい。

播種
本願において用いられる場合、「播種」という用語は、容器に細胞を分注することを指し、播種は、本願において、第２の免疫細胞集団を第２の容器に分注することを含む。例えば、第２の免疫細胞集団の播種は、第２の組成物中におおよそ２Ｅ４細胞／ｍＬを懸濁させ、容器のタイプによって異なる量でこれを分注することによって実行されてよい。１つの例において、２０ｍＬの細胞懸濁液がＧＲＥＸ１００Ｍに分注されてよく、第２の免疫細胞集団が、おおよそ４Ｅ５の細胞の細胞数で播種されてよい。

抗ＣＤ３抗体
本願において用いられる場合、「抗ＣＤ３抗体」という用語は、Ｔ細胞表面上の膜タンパク質、すなわち、ＣＤ３受容体を標的とする抗体を指す。抗ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ３を含み、ヒト、ヒト化及びネズミ抗体を含む、全てのタイプのモノクローナル及びポリクローナル抗ＣＤ３抗体も含む。本願において使用されるＯＫＴ３は、ヒト、ヒト化、キメラ又はネズミ抗体、バイオシミラー、及びそれらの変異体等の、全てのモノクローナル抗体を含む。他の抗ＣＤ３抗体の例として、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビジリズマブを含む。

フィーダー細胞
本願において用いられる場合、「フィーダー細胞」という用語は、免疫細胞を活性化及び増殖させるために、免疫細胞を培養又は増殖させるための組成物に含まれている細胞を指す。例えば、本願において、フィーダー細胞は、第２の組成物の免疫細胞を活性化及び増殖させるために第２の組成物に含まれてよい。フィーダー細胞は末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌ）（ＰＢＭＣ）を含み、これは円形細胞核を有する末梢血細胞を指す。本願において使用されるＰＢＭＣは、照射同種異系末梢血単核細胞を含む。

増殖
本願において用いられる場合、「増殖」という用語は、細胞集団又は免疫細胞集団が所定の期間を経て所定の倍数だけ又はそれよりも多く増加することを意味する。

おおよそ
本願において用いられる場合、「おおよそ」又は「約」という用語は、統計学的に有意な範囲にあることを意味する。別段の言及が無い限り、本願において使用される「おおよそ」又は「約」という用語は、所与の値の２０％又は１０％以内の範囲の値を有することを意味する。

含む／備える
本願において使用される「含む」という用語は、任意選択で追加される物質又は段階を除外しないことを意味する。
［免疫細胞治療］
概要

がんは、肺癌、乳癌、及び結腸直腸癌を含む、制御不可能な細胞周期に起因して細胞分裂が続く疾患のグループである。近年、がんを治療する方法の１つとして、がん免疫療法が研究されており、がん免疫療法とは、人体の免疫系を活性化させることによってがんを治療する方法を指す。がん免疫療法のために使用されるがん免疫治療として、免疫細胞治療は、身体から免疫細胞を採取して、これらを強化するか又はこれらを遺伝子改変して体内に戻す細胞治療法である。

この方法は、養子細胞移植（ＡＣＴ）と呼ばれ、ＴＩＬを使用する治療、及び、遺伝子工学を通して改変されたＴ細胞を使用する、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）発現Ｔ細胞又はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現Ｔ細胞を使用する治療に分類される。本願の１つの実施形態において、ＴＩＬを使用する治療法が開示される。

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及びこれを使用する治療
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）とは、がん細胞の周囲に集まるリンパ球を指す。ＴＩＬを使用した治療は、患者の腫瘍に浸潤した自然発生Ｔ細胞を収穫すること、これらのＴ細胞を活性化して増幅させること、及び、次に、腫瘍を抑制又は破壊するために、多数の活性化されたＴ細胞を患者に再導入することを伴う。

免疫細胞組成物を生成するための従来の方法
概要

免疫細胞組成物、すなわち、ＴＩＬを含む免疫細胞組成物を生成するための処理は、以下の段階を一般に含む。
１．
試料の処理
一般に、ＴＩＬを含む免疫細胞組成物を入手するために、試料を処理する段階がまず行われる。ここで、試料とは、患者から入手された腫瘍試料を意味し、腫瘍試料は、試料処理段階において小さな断片に切断される。
２．
培養
一般に、腫瘍試料を処理した後、取得された小さな腫瘍断片を、腫瘍を培養するための培地において培養する。一般に、培養は、高濃度のＩＬ－２を含有する培地において行われる。培養段階を通して、第１の免疫細胞集団が入手される。

３．
増殖
培養段階を経た第１の免疫細胞集団は、増殖段階に進む。一般に、増殖段階は、急速増殖プロトコル（ＲＥＰ）と称され得る。増殖段階は、一般に、高濃度のＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体、及びフィーダー細胞を含有する培地において行われる。

４．取得及び製剤化
増殖段階を経た免疫細胞集団は、汚染されない方式で取得され、患者に投与するのに好適な容器にそれを移すことによって製剤化される。
［従来技術の制限］

ＴＩＬを使用してがんを治療するために、まず、がん組織からＴＩＬが単離され、培養され、増殖されなければならない。がん組織からＴＩＬを単離し、培養し、次に増殖するための一連の処理は、かなり複雑であり、そのような一連の処理は、ＴＩＬの収率に影響する場合がある。したがって、従来の方法は、各処理が最適化又は標準化されていないこと又は低効率を有することから、低収率の問題を有する。これを克服するために、各処理を最適化及び標準化して、従来の方法よりも高効率かつ高収率の方法を生み出すことが必要である。したがって、本願において提供される免疫細胞組成物を生成するための方法は、ＴＩＬ培養及び増殖のための一連の処理を最適化及び標準化することによってＴＩＬの高収率を得るように開発された。
［本願において開示される免疫細胞組成物を生成するための方法及び免疫細胞組成物の使用］

本願は、免疫細胞組成物（免疫組成物）を生成するための方法を開示する。

１つの実施形態において、本願の免疫細胞組成物を生成するための方法は、以下の処理：
半産物の生成；冷凍保存；冷凍保存された第１の免疫細胞集団の解凍；及び最終産物の生成
のうちのいずれか１又は複数を備えてよい。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物を生成するための方法は、腫瘍試料を培養する段階；第１の免疫細胞集団を入手する段階；第２の免疫細胞集団を播種する段階；第２の免疫細胞集団を増殖する段階；及び、免疫細胞組成物を生成する段階を備えてよい。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物を生成するための方法は、腫瘍試料を培養する段階；第１の免疫細胞集団を入手する段階；第１の免疫細胞集団を冷凍保存する段階；冷凍保存された第１の免疫細胞集団を解凍する段階；第２の免疫細胞集団を播種する段階；第２の免疫細胞集団を増殖させる段階；及び、免疫細胞組成物を生成する段階を備えてよい。

本願の免疫細胞組成物を生成するための方法に含むことができる各処理は、下で詳細に開示される。

Ｉ．半産物の生成
本願において開示される免疫細胞組成物を生成するための方法は、半産物を生成する処理及び／又は最終産物を生成する処理を含んでよい。ここで、半産物とは、腫瘍試料を培養した後に培養された組成物から入手された第１の免疫細胞集団を指す。半産物を生成する処理は、下に記載される内容を含んでよい。この段階は、免疫細胞治療の分野における従来の用語に従ってプレ急速増殖プロトコル（プレＲＥＰ）に対応し得る。

１つの実施形態において、半産物の生成は、
腫瘍試料を培養する段階；及び
第１の免疫細胞集団を入手する段階
を含んでよい。

１つの実施形態において、半産物の生成は、腫瘍試料を調製する段階をさらに含んでよい。ここで、腫瘍試料を調製する段階は、腫瘍試料を培養する段階の前に行われる。

半産物の生成に含まれる各処理は、下で詳細に説明される。

１．腫瘍試料の調製
概観
第１の免疫細胞集団を取得するために、まず、腫瘍試料が調製されなければならない。ここで、腫瘍試料は、被験体の腫瘍組織に由来し、がん細胞の周囲に存在する特性を有する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。

１つの実施形態において、腫瘍試料の調製は、被験体から入手された腫瘍組織を処理する段階を含んでよい。別の実施形態において、被験体から入手された腫瘍組織は、さらなる処理を行わずに腫瘍試料として使用されてよい。

腫瘍試料を調製する処理は、下で詳細に説明される。

腫瘍組織の入手
腫瘍試料の調製に使用される腫瘍組織は、腫瘍を有する被験体から取得される。ここで、腫瘍を有する被験体とは、腫瘍を有するヒトを含んでよい。腫瘍組織の入手は、本発明の実施者によって直接行われてもよいし、又は、腫瘍組織の入手は、病院から腫瘍組織を入手することによって行われてもよい。

１つの実施形態において、腫瘍組織は、固形腫瘍又は液性腫瘍を有するヒトから入手されてよい。固形腫瘍を有するヒトは、例えば、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、胃癌、腎臓癌、卵巣癌、又は悪性黒色腫を含む皮膚癌を有する患者であってよいが、本願はこれに限定されない。液性腫瘍を有するヒトは、例えば、白血病又はリンパ腫を含む血液がんを有する患者であってよいが、本願はこれに限定されない。

ここで、腫瘍組織は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を含む。

腫瘍組織は、様々な経路を介して被験体から採取される。例えば、腫瘍組織は、被験体（例えば、がん患者）の腫瘍を採取することによって入手されてよい。別の例として、腫瘍組織は、がん患者において観察される悪性胸水を採取することによって入手されてよい。具体例として、肺癌患者の場合、被験体から取得された腫瘍組織は、患者の胸水を採取することによって入手されてよい。

腫瘍組織は、当該技術分野で知られている方法によって入手されてよい。１つの実施形態において、腫瘍組織は、生検によって入手されてよい。生検は、腫瘍の一部を除去するための摘出生検、及び、シリンジの針を使用した吸引生検を含むが、本願はこれに限定されない。腫瘍組織は、生検、及び、当該技術分野で知られている他の方法によって入手されてよい。１つの実施形態において、腫瘍組織は、乳癌及び／又は肺癌を有する患者の腫瘍の一部を除去するための摘出生検を介して入手してされてよい。

１つの実施形態において、腫瘍組織は、乳癌及び／又は肺癌患者から入手された乳癌組織及び／又は肺癌組織であってよい。

腫瘍組織の処理
被験体から入手された１つの実施形態において、腫瘍組織は、さらなる処理を経た後に腫瘍試料として調製されてもよいし、又は、被験体から入手された腫瘍組織は、いかなる処理も行わずに腫瘍試料として調製されてよい。

腫瘍組織の処理は、下で詳細に説明される。

１つの実施形態において、腫瘍組織の処理は、洗浄、脂質組織の除去、及び／又は小さな断片の形成を含んでよいが、本願はこれに限定されない。

１）洗浄
腫瘍組織の処理は、腫瘍組織の洗浄を含んでよい。１つの実施形態において、洗浄は、腫瘍組織を培地で洗浄することを含んでよい。１つの実施形態において、洗浄は、抗生物質を含有する輸送培地に移植された腫瘍組織から抗生物質を除去することを含んでよい。

１つの実施形態において、腫瘍組織は、培地で１回、２回、３回、４回、５回、又はそれよりも多い回数洗浄されてよい。特定の実施形態において、腫瘍試料は、培地を使用して２回又は３回洗浄されてよい。

１つの実施形態において、腫瘍組織は、抗生物質を含まない培地を使用して洗浄されてよい。特定の実施形態において、腫瘍組織は、抗生物質不含有ＲＰＭＩ１６４０培地で洗浄されてよい。特定の実施形態において、腫瘍組織は、抗生物質不含有ＲＰＭＩ１６４０培地で３回洗浄されてよい。

２）脂質組織の除去
腫瘍組織の処理は、脂質組織の除去を含んでよい。ここで、脂質組織の除去は、腫瘍試料が大量の脂肪を含有するか否かに応じて、実行されてもよいし又は省略されてもよい。脂質組織の除去は、腫瘍組織から脂質組織を分離することを含む。１つの実施形態において、脂質組織の除去は、ピンセット及びはさみを使用して実行されてよい。

３）腫瘍組織の小さな断片の形成
腫瘍組織の処理は、腫瘍組織を小さな断片に形成することを含んでよい。腫瘍組織は、カッター（例えば、はさみ又はナイフ）、又は、消化酵素を含有する溶液を使用して小さな断片に形成されてよいが、本願はこれに限定されない。

１つの実施形態において、腫瘍組織は、一辺の幅が、おおよそ０．１～１０ｍｍ、おおよそ０．４～５ｍｍ、おおよそ０．６～４ｍｍ、おおよそ０．８～３ｍｍ、又はおおよそ１～２ｍｍであるように切断されてよい。特定の実施形態において、腫瘍組織は、一辺の幅がおおよそ１～２ｍｍであるように切断されてよい。

１つの実施形態において、腫瘍組織は、断面積が、おおよそ０．０１～１００ｍｍ^２、おおよそ０．１～５０ｍｍ^２、おおよそ０．２～１０ｍｍ^２、おおよそ０．５～５ｍｍ^２、おおよそ０．７～４ｍｍ^２、又はおおよそ１～２ｍｍ^２であるように切断されてよい。特定の実施形態において、腫瘍組織は、おおよそ１から２ｍｍ^２の断面積を有するように切断されてよい。

別の実施形態において、腫瘍組織は、消化酵素を含む消化溶液によって小さな断片に形成されてよく、ここで、腫瘍組織は、コラゲナーゼ等の酵素を含む消化溶液によって小さな断片に切断されてよい。

２．腫瘍試料の培養
概観
この段階において、腫瘍試料が培養される。

１つの実施形態において、第１の免疫細胞集団は、腫瘍試料を培養することによって生成されてよい。腫瘍試料を培養することによって第１の免疫細胞集団を生成する処理が、下で詳細に説明される。

腫瘍試料の培養腫瘍試料は、第１の容器内の第１の組成物中で培養される。第１の免疫細胞集団は、腫瘍試料を培養することによって生成されてよい。

ここで、腫瘍試料は、培養に好適な環境において培養される。１つの実施形態において、腫瘍試料は、３７℃、５％ＣＯ_２環境において培養されてよい。

１）第１の容器に含有される腫瘍試料断片数
切断された所定の数の腫瘍試料断片が、第１の容器の第１の組成物中に配置され培養される。ここで、第１の容器に配置される腫瘍試料断片数は、第１の容器の細胞培養面積又は容積によって変わり得る。

１つの実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８又は５０の腫瘍試料断片が、第１の容器に配置され培養されてよい。特定の実施形態において、１２、１６、２０、２４、２８又は３２の腫瘍試料断片が、第１の容器に配置され培養されてよい。

１つの実施形態において、第１の容器がＴ７５フラスコである場合、１２、１６、２０、２４、２８、又は３２の腫瘍試料断片が、第１の容器に配置され培養されてよい。特定の実施形態において、第１の容器がＴ７５フラスコである場合、２４の腫瘍試料断片が、第１の容器に配置され培養されてよい。

２）第１の容器
腫瘍試料は、第１の容器内の第１の組成物中で培養され、ここで、第１の容器は、腫瘍試料の培養において使用される容器を意味する。本願における第１の容器は、培地、血清、及びＩＬ－２を含む組成物とともに、腫瘍試料を培養するために使用される。

容器は、ガスが通過するガス透過性容器又はガスを提供するガス供給システムを有する容器であってよい。すなわち、容器は、ガスが容器を通過することができるように製造された容器、又は、ガスを通過させように製造されていないがガスの通り抜けを可能にする別個のガス供給システムを有する容器であってよい。

１つの実施形態において、第１の容器は、おおよそ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１６００、１８００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００又は１００００ｍＬの最大許容可能容量を有する容器、又は、前述の値から選択される２つの値によって設定される範囲内の最大許容可能容量を有する容器であってよい。特定の実施形態において、第１の容器は、おおよそ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０又は１００ｍＬの最大許容可能容量を有する容器、又は、前述の値から選択される２つの値によって設定される範囲内の最大許容可能容量を有する容器であってよい。

１つの実施形態において、容器は、例えば、２４ウェルプレート、Ｔ２５、Ｔ７５、又はＴ１２５フラスコ、ＧＲＥＸ１０、ＧＲＥＸ１０Ｍ、ＧＲＥＸ１０Ｍ－ＣＳ、ＧＲＥＸ１００、ＧＲＥＸ１００Ｍ、ＧＲＥＸ１００Ｍ－ＣＳ、ＧＲＥＸ５００、ＧＲＥＸ５００Ｍ、又はＧＲＥＸ５００Ｍ－ＣＳフラスコ等のフラスコ、又は培養バッグであってよいが、本願はこれに限定されない。

１つの実施形態において、腫瘍試料は、Ｔ７５フラスコ内で培養されてよい。特定の実施形態において、２４の腫瘍試料断片が、Ｔ７５フラスコ内で培養されてよい。

３）第１の組成物
第１の容器において、腫瘍試料は、第１の組成物中で培養される。ここで、第１の組成物は、培地、血清、血漿、及び抗生物質、ＩＬ－２、及び抗体のうちのいずれか１又は複数を含む。

１つの実施形態において、第１の組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２を含んでよい。別の実施形態において、第１の組成物は、培地、血漿、及びＩＬ－２を含んでよい。

１つの実施形態において、第１の組成物は、培地；血清及び血漿のうちのいずれか１つ；及びＩＬ－２を含んでよく、抗体及び抗生物質のうちのいずれか１又は複数をさらに含んでよい。

特定の実施形態において、第１の組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２を含む。別の特定の実施形態において、第１の組成物は、培地、血清、ＩＬ－２、及び抗生物質を含む。また別の特定の実施形態において、第１の組成物は、培地、血清、ＩＬ－２、及び抗体を含む。さらに別の特定の実施形態において、第１の組成物は、培地、血清、ＩＬ－２、抗生物質、及び抗体を含む。

一般に、組織又は細胞の培養において、容器（例えば、フラスコ）内で使用される組成物の体積は、容器のタイプによって変わり得る。例えば、２４ウェルプレートでは、一般に、２ｍＬの組成物が使用され、Ｔ７５フラスコでは、一般に、２０ｍＬの組成物が使用される。

しかしながら、本願の腫瘍試料を培養するために、第１の容器に当初追加される第１の組成物の量は、一般に使用される上述の量とは異なってよい。

１つの実施形態において、腫瘍試料を培養するのに使用される（すなわち、第１の容器に添加される）第１の組成物の量は、第１の容器の最大許容可能容量のおおよそ８０％、７０％、６０％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、又は５％、又はそれよりも少なくてよい。特定の実施形態において、腫瘍試料を培養するための第１の容器に添加される第１の組成物の量は、第１の容器の最大許容可能容量のおおよそ３０％又はそれよりも少なくてよい。ここで、最大許容可能容量は、第１の容器に添加することができる最大容量を意味する。

１つの実施形態において、第１の容器が２４ウェルプレートである場合、当初添加される第１の組成物の量は、１．５ｍＬ又はそれよりも少ないか、又は１ｍＬ又はそれよりも少なくてよい。特定の実施形態において、第１の容器が２４ウェルプレートである場合、当初添加される第１の組成物の量は、おおよそ１ｍＬであってよい。

別の実施形態において、第１の容器がＴ７５フラスコである場合、使用される第１の組成物の量は、１５ｍＬ、１２ｍＬ、１０ｍＬ、９ｍＬ、８ｍＬ、７ｍＬ、６ｍＬ、５ｍＬ、４ｍＬ、又は３ｍＬ、又はそれよりも少なくてよい。特定の実施形態において、第１の容器がＴ７５フラスコである場合、使用される第１の組成物の量は、おおよそ６ｍＬであってよい。

本願の当初の第１の組成物の量は、腫瘍試料の培養環境に影響し、それにより、第１の免疫細胞集団の生成を最適化するのに役立ち得る。具体的には、当初の組成物の量が組成物の最大許容可能量のそれよりも少ない場合、培養に必要な物質は、培養中に組成物を置換することなく単に添加することによって提供され、それにより、培養細胞が受けるストレスが低減し得る。さらに、組成物の量のコントロールは、細胞間の相互作用に影響することによって、培養細胞の増殖にプラスの効果を有し得る。

第１の組成物に含まれ得る培地、血清、血漿、抗生物質及び／又はＩＬ－２が下に記載される。

ｉ）培地
ａ）基礎培地のタイプ
本願において使用される基礎培地は、細胞及び／又は組織を培養するための最低限の栄養源を指す。基礎培地としては、ＴＩＬを含む免疫細胞を培養するのに好適な任意の培地が使用されてよい。

１つの実施形態において、培地は、ＡｌｙＳ５０５Ｎ培地、ＡＩＭ－Ｖ培地、又はＲＰＭＩ１６４０培地であってよいが、本願はこれに限定されない。特定の実施形態において、腫瘍試料は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地を使用して培養されてよい。

１つの実施形態において、第１の組成物に含まれている培地は、ＡｌｙＳ５０５Ｎ培地、ＡＩＭ－Ｖ培地、又はＲＰＭＩ１６４０培地であってよい。特定の実施形態において、第１の組成物に含まれている培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地であってよい。

ｉｉ）添加剤
ａ）血清
１つの実施形態において、基本培養培地（例えば、上述のＡｌｙＳ５０５Ｎ、ＡＩＭ－Ｖ、又はＲＰＭＩ１６４０培地）に血清が添加されてよい。１つの実施形態において、本願の第１の組成物は、血清を含んでよい。血清は、高分子量タンパク質及び低分子量栄養素を含有し、細胞成長に必要な成分を含有し得る。血清は、ヒト血清を含むが、本願はこれに限定されない。１つの実施形態において、血清がヒトＡＢ血清であってよい。

１つの実施形態において、おおよそ１０ｖｏｌ％又はそれよりも少ないヒト血清が培地に追加されてよい。別の実施形態において、おおよそ９ｖｏｌ％又はそれよりも少ない、おおよそ８ｖｏｌ％又はそれよりも少ない、おおよそ７ｖｏｌ％又はそれよりも少ない、おおよそ６ｖｏｌ％又はそれよりも少ない、おおよそ５ｖｏｌ％又はそれよりも少ない、おおよそ４ｖｏｌ％又はそれよりも少ない、又は３ｖｏｌ％又はそれよりも少ないヒト血清が培地に添加されてよい。特定の実施形態において、おおよそ３ｖｏｌ％のヒト血清が、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地に添加され、腫瘍断片を培養するために使用されてよい。

１つの実施形態において、第１の組成物に血清が含まれている場合、第１の組成物に含まれている血清の濃度は、おおよそ２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｖｏｌ％又はそれよりも低くてよい。特定の実施形態において、第１の組成物に含まれている血清の濃度は、おおよそ１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｖｏｌ％又はそれよりも低くてよい。特定の実施形態において、第１の組成物に含まれている血清の濃度は、おおよそ５、４、３、２又は１ｖｏｌ％又はそれよりも低くてよい。

１つの実施形態において、第１の組成物に含まれているヒト血清の濃度は、おおよそ５、４、３、２又は１ｖｏｌ％であってよい。特定の実施形態において、第１の組成物に含まれているヒト血清の濃度は、おおよそ３ｖｏｌ％であってよい。

ｂ）血漿
１つの実施形態において、基本培養培地に血漿が添加されてよい。１つの実施形態において、本願の第１の組成物は、血漿を含んでよい。血漿とは、血清からフィブリノゲンが除外されていることを指す。血漿は、細胞成長に必要な成分を含有し得る。

本願において使用される血漿は、ヒト血漿又は患者の血液から単離された血漿であってよいが、本願はこれに限定されない。

１つの実施形態において、血清の代わりに血漿が培地に追加されて使用されてよい。

１つの実施形態において、おおよそ１０ｖｏｌ％又はそれよりも少ない血漿が培地に追加されて使用されてよい。１つの実施形態において、おおよそ９ｖｏｌ％又はそれよりも少ない、おおよそ８ｖｏｌ％又はそれよりも少ない、おおよそ７ｖｏｌ％又はそれよりも少ない、おおよそ６ｖｏｌ％又はそれよりも少ない、おおよそ５ｖｏｌ％又はそれよりも少ない、おおよそ４ｖｏｌ％又はそれよりも少ない、又は３ｖｏｌ％又はそれよりも少ない血漿が培地に添加されて使用されてよい。特定の実施形態において、おおよそ３ｖｏｌ％の血漿が、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地に添加され、腫瘍断片を培養するために使用されてよい。

１つの実施形態において、第１の組成物に血漿が含まれている場合、第１の組成物に含まれている血漿の濃度は、おおよそ２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｖｏｌ％又はそれよりも低くてよい。特定の実施形態において、第１の組成物に含まれている血漿の濃度は、おおよそ１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｖｏｌ％又はそれよりも低くてよい。特定の実施形態において、第１の組成物に含まれている血漿の濃度は、おおよそ５、４、３、２又は１ｖｏｌ％又はそれよりも低くてよい。

１つの実施形態において、第１の組成物に含まれている血漿の濃度は、おおよそ５、４、３、２又は１ｖｏｌ％であってよい。特定の実施形態において、第１の組成物に含まれている血漿の濃度は、おおよそ３ｖｏｌ％であってよい。

ｃ）ＩＬ－２
本願で使用されるＩＬ－２（インターロイキン－２）は、Ｔ細胞増殖を促進する因子を指す。ＩＬ－２は、ヒトリコンビナントＩＬ－２型を含む様々なタイプのＩＬ－２を含む。

１つの実施形態において、第１の組成物は、ＩＬ－２を含んでよい。

１つの実施形態において、培地に添加されるＩＬ－２の濃度は、おおよそ１０，０００ＩＵ／ｍＬ又はそれよりも低くてよい。１つの実施形態において、おおよそ９，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ８，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ７，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ６，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ５，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ４，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ３，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬ、又はおおよそ５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２が、培地に添加されてよい。特定の実施形態において、おおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２が、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地に添加され、腫瘍断片を培養するために使用されてよい。

１つの実施形態において、第１の組成物は、おおよそ１０，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ９，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ９，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ８，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ８，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ７，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ７，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ６，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ６，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ５，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ５，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ４，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ４，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ３，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ３，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ２，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ１，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ９００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ８００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ７００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ６００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ４００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ３００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ２００ＩＵ／ｍＬ、又はおおよそ１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、又は、前述の値から選択される２つの値によって定められる範囲内の濃度でＩＬ－２を含んでよい。特定の実施形態において、第１の組成物は、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ１，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ９００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ８００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ７００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ６００ＩＵ／ｍＬ、又はおおよそ５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、又は、前述の値から選択される２つの値によって設定される範囲内の濃度でＩＬ－２を含んでよい。特定の実施形態において、第１の組成物は、おおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含んでよい。

ｄ）抗生物質
１つの実施形態において、第１の組成物は、抗生物質をさらに含んでよい。

抗生物質は、細胞培養及び／又は増殖中の細菌又は真菌による汚染を防止するために使用されてよい。

半産物の生成において抗生物質を使用するか否かは、被験体から取得された腫瘍組織の腫瘍のタイプ、培養された腫瘍試料の条件（状態）、及び培養及び／又は増殖された細胞の条件を適切に考慮することによって決定されてよい。例えば、腫瘍試料が被験体の乳癌に由来する場合、当初添加される第１の組成物中に抗生物質が含まれなくてよい。別の例において、腫瘍試料が被験体の乳癌に由来する場合、腫瘍試料の条件に応じて、抗生物質を含む第１の組成物が使用されてよい。さらに別の例において、腫瘍試料が被験体の頭頚部癌に由来する場合、抗生物質を含む第１の組成物が使用されてよい。

第１の組成物が抗生物質を含む場合、抗生物質は、細胞培養及び／又は増殖に影響しない濃度で含まれてよく、ここで、細胞毒性を示す抗生物質の濃度が考慮されてよい。第１の組成物に含まれている抗生物質の適切な濃度は、抗生物質のタイプによって変わり得る。

第１の組成物に含まれている抗生物質の例は、アンピシリン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ペニシリン、及びストレプトマイシンを含むが、本願はこれに限定されない。すなわち、細胞培養及び／又は増殖のための培地に添加される抗生物質として、当該技術分野で知られている任意の抗生物質が使用されてよく、必要に応じて当業者によって適切に選択された後に使用されてよい。特定の実施形態において、第１の組成物は、ゲンタマイシンを含んでよい。

ｅ）抗体
上で記載されたように、本願の１つの実施形態において、第１の組成物には抗体がさらに含まれてよい。第１の組成物に抗体が含まれている場合、第１の組成物に含まれている抗体は、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）を標的とする抗体、及びＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の結合をブロックする抗体から選択されるいずれか１又は複数であってよい。１つの実施形態において、第１の組成物に含まれている抗体は、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＰＤ－１抗体、及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体から選択されるいずれか１又は複数であってよい。

抗ＣＤ１３７抗体は、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）を標的とする抗体である。１つの実施形態において、抗ＣＤ１３７抗体は、ヒト、ヒト化又はネズミ抗体等の、任意のタイプのモノクローナル又はポリクローナル抗ＣＤ１３７抗体を含む。１つの実施形態において、第１の組成物に抗ＣＤ１３７抗体が含まれている場合、抗ＣＤ１３７抗体は、ウレルマブ、ウトミルマブ、及びそれらの変異体から選択されるいずれか１又は複数であってよいが、本願はこれに限定されない。

ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の結合を阻害する抗体の一例として、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体が挙げられ得る。１つの実施形態において、抗ＰＤ－１抗体又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ヒト、ヒト化又はネズミ抗体を含む、任意のタイプのモノクローナル又はポリクローナル抗ＰＤ－１抗体又はＰＤ－Ｌ１抗体を含む。１つの実施形態において、第１の組成物に抗ＰＤ－１抗体が含まれている場合、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ、ドスタルリマブ、及びそれらの変異体から選択されるいずれか１又は複数であってよいが、本願はこれに限定されない。１つの実施形態において、第１の組成物に抗ＰＤ－Ｌ１抗体が含まれている場合、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、及びそれらの変異体から選択されるいずれか１又は複数であってよいが、本願はこれに限定されない。

１つの実施形態において、第１の組成物に抗体が含まれている場合、第１の組成物に含まれている抗体の濃度は、おおよそ１ｎｇ／ｍＬ、おおよそ１０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ１００ｎｇ／ｍＬ、おおよそ１μｇ／ｍＬ、おおよそ２μｇ／ｍＬ、おおよそ３μｇ／ｍＬ、おおよそ４μｇ／ｍＬ、おおよそ５μｇ／ｍＬ、おおよそ１０μｇ／ｍＬ、おおよそ１５μｇ／ｍＬ、おおよそ２０μｇ／ｍＬ、おおよそ２５μｇ／ｍＬ、おおよそ３０μｇ／ｍＬ、おおよそ３５μｇ／ｍＬ、おおよそ４０μｇ／ｍＬ、おおよそ４５μｇ／ｍＬ、おおよそ５０μｇ／ｍＬ、おおよそ６０μｇ／ｍＬ、おおよそ７０μｇ／ｍＬ、おおよそ８０μｇ／ｍＬ、おおよそ９０μｇ／ｍＬ、又はおおよそ１００μｇ／ｍＬ、又は、前述の値から選択される２つの値によって設定される範囲に含まれている値であってよい。特定の実施形態において、第１の組成物に含まれている抗体の濃度は、おおよそ１０μｇ／ｍＬであってよい。

上で記載されたように、本願の第１の組成物は、培地及び添加剤を含む。

１つの実施形態において、第１の組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２を含んでよい。別の実施形態において、第１の組成物は、培地、血漿、及びＩＬ－２を含んでよい。また別の実施形態において、第１の組成物は、培地、血清、ＩＬ－２、及び抗生物質を含んでよい。さらに別の実施形態において、第１の組成物は、培地、血漿、ＩＬ－２、及び抗生物質を含んでよい。しかしながら、本願はこれに限定されない。

特定の実施形態において、第１の組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２を含んでよく、培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地であってよく、血清としておおよそ３ｖｏｌ％のヒトＡＢ血清が第１の組成物に含まれてよく、おおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２が第１の組成物に含まれてよい。特定の実施形態において、第１の組成物は、培地、血清、ＩＬ－２、及び抗生物質を含んでよい。ここで、第１の組成物中、培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地であってよく、抗生物質は、ゲンタマイシンであってよく、血清は、おおよそ３ｖｏｌ％のヒトＡＢ血清であってよく、ＩＬ－２は、おおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬで含まれてよい。

４）培養期間
腫瘍試料は、第１の容器内で所定の期間培養される。１つの実施形態において、腫瘍試料は、おおよそ１日又はそれよりも多い日数培養される。１つの実施形態において、腫瘍試料は、おおよそ２日又はそれよりも多い日数、３日又はそれよりも多い日数、４日又はそれよりも多い日数、５日又はそれよりも多い日数、６日又はそれよりも多い日数、７日又はそれよりも多い日数、８日又はそれよりも多い日数、９日又はそれよりも多い日数、１０日又はそれよりも多い日数、１１日又はそれよりも多い日数、１２日又はそれよりも多い日数、１３日又はそれよりも多い日数、１４日又はそれよりも多い日数、１５日又はそれよりも多い日数、１６日又はそれよりも多い日数、１７日又はそれよりも多い日数、１８日又はそれよりも多い日数、１９日又はそれよりも多い日数、２０日又はそれよりも多い日数、２１日又はそれよりも多い日数、２２日又はそれよりも多い日数、２３日又はそれよりも多い日数、又は２４日又はそれよりも多い日数培養されてよい。特定の実施形態において、腫瘍試料は、おおよそ７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２１日間、第１の容器内で培養されてよい。特定の実施形態において、腫瘍試料は、おおよそ１４日間、第１の容器内で培養されてよい。

５）第１の添加剤組成物の添加
腫瘍試料が第１の容器内で培養される間、第１の添加剤組成物が第１の容器に添加されてよい。ここで、第１の添加剤組成物は、培地、血清、血漿、抗生物質、及びＩＬ－２のうちのいずれか１又は複数を含んでよい。第１の添加剤組成物の構成は、関連する段落において詳細に開示されている。

１つの実施形態において、第１の添加剤組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０回、又はこれらの回数よりも多い回数添加されてよい。特定の実施形態において、第１の添加剤組成物は、３回添加されてよい。

ここで、１つの実施形態において、第１の添加剤組成物は、培養の開始日の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、及び２１日後から選択されるいずれか１又は複数の日に添加され、培養期間中、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０回添加されてよい。特定の実施形態において、第１の添加剤組成物は、７、１０、及び１２日目に３回添加されてよい。

第１の添加剤組成物の添加の処理において、第１の添加剤組成物は、腫瘍試料が培養される環境のストレスを最小限に抑えるための方法によって添加されてよい。

第１の添加剤組成物の添加の処理において、添加される第１の添加剤組成物の量は、容器のタイプ及び／又は添加時間によって変わり得る。

１つの実施形態において、第１の添加剤組成物は、各添加時間において同量添加されてよい。別の実施形態において、第１の添加剤組成物は、各添加時間において異なる量添加されてよい。別の実施形態において、第１の添加剤組成物は、各添加時間においてその添加量を増加させることによって添加されてよい。

１つの実施形態において、第１の添加剤組成物は、おおよそ１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、８ｍＬ、９ｍＬ、１０ｍＬ、１２ｍＬ、１４ｍＬ、１６ｍＬ、１８ｍＬ、２０ｍＬ、２４ｍＬ、２８ｍＬ、３２ｍＬ、３６ｍＬ、４０ｍＬ、４５ｍＬ、又は５０ｍＬの同量又は異なる量添加されてもよいし、又は、各添加時間において前述の値よりも多い又はそれに等しい量添加されてもよいが、本願はこれに限定されない。添加される第１の添加剤組成物の量は、様々な条件（例えば、容器の容量、培養細胞の条件、及び／又は添加時間）を考慮して適切な値として決定されてよい。特定の実施形態において、第１の添加剤組成物は、各添加時間において３ｍＬの同量添加されてよい。特定の実施形態において、第１の容器がＴ７５フラスコである場合、第１の添加剤組成物は、各添加時間において３ｍＬの同量添加されてよい。

特定の実施形態において、第１の添加剤組成物は、培養の開始から７、１０、及び１２日目に第１の容器に添加されてよく、３ｍＬの第１の添加剤組成物が各添加時間において添加されてよい。

１つの実施形態において、第１の容器に添加される第１の添加剤組成物は、培地、血清、血漿、抗生物質、ＩＬ－２、及び抗体から選択されるいずれか１又は複数を含んでよい。

１つの実施形態において、第１の添加剤組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２を含んでよい。別の実施形態において、第１の添加剤組成物は、培地、血漿、及びＩＬ－２を含んでよい。

１つの実施形態において、第１の添加剤組成物は、培地；血清及び血漿のうちのいずれか１つ；及びＩＬ－２を含んでよく、抗体及び抗生物質のうちのいずれか１又は複数をさらに含む。

特定の実施形態において、添加される第１の添加剤組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２を含む。特定の実施形態において、第１の添加剤組成物は、培地、血清、ＩＬ－２、及び抗生物質を含む。別の特定の実施形態において、第１の添加剤組成物は、培地、血清、ＩＬ－２、及び抗体を含む。特定の実施形態において、第１の添加剤組成物は、培地、血清、ＩＬ－２、抗生物質、及び抗体を含む。

第１の添加剤組成物に含まれている成分に関する実施形態は、第１の組成物の説明におけるものと同じである。

ａ）培地
第１の添加剤組成物に含むことができる培地に関する実施形態は、第１の組成物において上で記載された通りである。例えば、特定の実施形態において、第１の添加剤組成物に含まれている培地は、ＡＩＭ－Ｖ培地であってよいが、本願はこれに限定されない。特定の実施形態において、第１の添加剤組成物に含まれている培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地であってよい。

ｂ）血清
第１の添加剤組成物に血清が含まれている場合、血清に関する実施形態は、第１の組成物において上で記載した通りである。例えば、特定の実施形態において、血清は、ヒト血清であってよいが、本願はこれに限定されない。例えば、特定の実施形態において、第１の添加剤組成物に含まれている血清の濃度は、おおよそ３ｖｏｌ％であってよいが、本願はこれに限定されない。

ｃ）血漿
第１の添加剤組成物に血漿が含まれている場合、血漿に関する実施形態は、第１の組成物において上で記載した通りである。例えば、特定の実施形態において、血漿は、ヒト血漿であってよいが、本願はこれに限定されない。例えば、特定の実施形態において、第１の添加剤組成物に含まれている血漿の濃度は、おおよそ３ｖｏｌ％であってよいが、本願はこれに限定されない。

ｄ）抗生物質
第１の添加剤組成物に抗体が含まれている場合、抗生物質に関する実施形態は、第１の組成物において上で記載した通りである。上で記載されたように、抗生物質を使用するか否かは、被験体から取得された腫瘍のタイプ、培養された腫瘍試料の状態、培養及び／又は増殖された細胞の状態を適切に考慮することによって決定されてよい。例えば、特定の実施形態において、第１の添加剤組成物に含まれている抗生物質は、ゲンタマイシンであってよい。

ｅ）ＩＬ－２
第１の添加剤組成物にＩＬ－２が含まれている場合、ＩＬ－２に関する実施形態は、第１の組成物において上で記載された通りである。例えば、特定の実施形態において、第１の添加剤組成物に含まれているＩＬ－２の濃度は、１，０００ＩＵ／ｍＬであってよい。

ｆ）抗体
第１の添加剤組成物に抗体が含まれている場合、抗体に関する実施形態は、第１の添加剤組成物において上で記載した通りである。例えば、第１の添加剤組成物に含まれている抗体は、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＰＤ－１抗体、及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体から選択されるいずれか１又は複数であってよい。

１つの実施形態において、第１の容器に添加される第１の添加剤組成物の構成（組成）は、各添加時間に関して異なってよい。別の実施形態において、第１の容器に添加される第１の添加剤組成物の構成は、全ての添加時間において同じであってよい。

１つの実施形態において、第１の容器に添加される第１の添加剤組成物の構成は、第１の組成物のそれと同じであってよい。別の実施形態において、第１の容器に添加される第１の添加剤組成物の構成は、第１の組成物のそれとは異なってよい。

特定の実施形態において、第１の容器に添加される第１の添加剤組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２を含んでよい。特定の実施形態において、第１の容器に添加される第１の添加剤組成物は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地、おおよそ３ｖｏｌ％のヒト血清、及びおおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含んでよい。

１つの実施形態において、培養中、第１の容器から免疫細胞が除去されない、又は、外部から添加されない。これは、培養中、第１の容器以外の容器に免疫細胞が移植されない、又は、外部から第１の容器に免疫細胞が新たに添加されないことを意味する。

第１の免疫細胞集団の生成に関する具体例が下で記載され得るが、本願はこれに限定されない。
－ １～４ｍｍ^２の断面積を有する腫瘍試料の２４の断片がＴ７５フラスコ内で培養され、培養の開始において６ｍＬの第１の組成物が使用される。ここで、第１の組成物は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地、３ｖｏｌ％のヒト血清、及び１，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。腫瘍試料は、第１の容器内で３７℃の５％のＣＯ_２環境において１４日間培養される。
－ 培養の開始日から７、１０、及び１２日目に、第１の組成物と同じ組成物を有する第１の添加剤組成物が第１の容器に添加され、ここで、添加される第１の添加剤組成物は、７、１０、及び１２日目にそれぞれ３ｍＬ添加される。

３．第１の免疫細胞集団の取得
概観
第１の免疫細胞集団は、上述の腫瘍試料の培養を通して入手された培養産物から入手される。

第１の免疫細胞集団の取得
免疫細胞集団は、実質的に複数の免疫細胞を含む群を指し、免疫細胞はＴＩＬを含む。ここで、第１の免疫細胞集団は、腫瘍試料を培養することによって入手された免疫細胞集団を指す。

第１の免疫細胞集団を取得する方法は、組織を使用して細胞を培養する処理において生成された細胞を取得するための様々な既知の方法を含むが、本願はこれに限定されない。１つの実施形態において、第１の免疫細胞集団は、腫瘍組織の濾過、細胞の洗浄、処理、単離、及び／又は、腫瘍試料を培養する処理によって培養された組成物からの細胞の分別を通して入手されてよいが、本願はこれに限定されない。第１の免疫細胞集団は、当該技術分野で知られている方法によって取得されてよい。

ここで、第１の免疫細胞集団の入手に含むことができる例示的な処理が開示される。

１）腫瘍組織の濾過（Ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ（ｓｔｒａｉｎｉｎｇ））
第１の免疫細胞集団の取得は、腫瘍組織断片を濾過することを含んでよい。１つの実施形態において、培養された組成物から第１の免疫細胞集団を取得するために、セルストレーナーを使用して腫瘍組織断片の濾過が行われてよい。ここで、セルストレーナーのメッシュポアのサイズは、取得された免疫細胞のタイプによって変わり得る。特定の実施形態において、４０μｍのメッシュポアを有するセルストレーナーを使用して、腫瘍組織の断片が濾過されてよい。

２）細胞採取
第１の免疫細胞集団の入手は、細胞の取得又は採取を含んでよい。培養された組成物又は濾過された細胞溶液から細胞を取得又は採取するための方法として、当該技術分野で知られている方法が使用されてよい。１つの実施形態において、第１の免疫細胞集団を取得又は採取するために、遠心分離が用いられてよい。１つの例において、遠心分離は、おおよそ１００ｇ、１５０ｇ、２００ｇ、２５０ｇ、３００ｇ、４００ｇ、４５０ｇ、５００ｇ、６００ｇ、７００ｇ、８００ｇ、９００ｇ、又は１，０００ｇ、又は、前述のｇ値よりも大きいか又はそれに等しいｇ値の条件下で行されてよいが、本願は、これに限定されない。別の例において、遠心分離は、おおよそ１００ＲＰＭ、２００ＲＰＭ、３００ＲＰＭ、４００ＲＰＭ、５００ＲＰＭ、６００ＲＰＭ、７００ＲＰＭ、８００ＲＰＭ、９００ＲＰＭ、１０００ＲＰＭ、１１００ＲＰＭ、１２００ＲＰＭ、１３００ＲＰＭ、１４００ＲＰＭ、１５００ＲＰＭ、１６００ＲＰＭ、１７００ＲＰＭ、１８００ＲＰＭ、１９００ＲＰＭ、２０００ＲＰＭ、２２００ＲＰＭ、２５００ＲＰＭ、３０００ＲＰＭ、３５００ＲＰＭ、４０００ＲＰＭ、又は５０００ＲＰＭ、又は、前述のＲＰＭ値よりも大きいか又はそれに等しいＲＰＭ値の条件下で行われてよいが、本願はこれに限定されない。

３）細胞分別
第１の免疫細胞集団の入手は、培養された組成物に含まれている細胞分別を含んでよい。

細胞分別は、上述の単離された細胞集団から「所望の細胞を選別する」ために使用される方法を意味する。細胞分別のために、当該技術分野で従来使用される方法が使用されてよい。例えば、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）、遠心分離、又は容器への細胞付着による単離等の方法が、細胞分別のために使用されてよい。

４）細胞洗浄
第１の免疫細胞集団の取得は、培養された組成物に含まれている免疫細胞集団の洗浄を含んでよい。この段落において記載される細胞洗浄の処理は、第１の免疫細胞集団の入手の段階において任意の回数行われてよい。例えば、細胞洗浄は、第１の免疫細胞集団の入手に含まれている処理の間に行われてよい。別の例において、細胞洗浄は、上で記載されたように濾過され、採取され、及び／又は分別された細胞集団に対して行われてよい。さらに別の例において、細胞洗浄は、細胞採取と同時に行われてよい。

１つの実施形態において、培養された免疫細胞集団は、ＰＢＳ又はＤＰＢＳを含む緩衝液で洗浄されてよい。培養された免疫細胞集団は、洗浄１、２、３、４又は５回又はそれよりも多い回数であってよい。ここで、例えば、遠心分離が用いられてよい。特定の実施形態において、培養された免疫細胞集団は、第１の免疫細胞集団を入手するために３回ＤＰＢＳで洗浄されてよい。

１つの実施形態において、第１の免疫細胞集団の入手は、細胞採取を含んでよい。ここで、第１の免疫細胞集団の入手は、細胞洗浄をさらに含んでよく、細胞洗浄は、任意の適切な時間において任意の適切な回数行われてよい。

１つの実施形態において、第１の免疫細胞集団の入手は、腫瘍組織の濾過；及び細胞採取を含んでよい。ここで、第１の免疫細胞集団の入手は、細胞洗浄をさらに含んでよく、細胞洗浄は、任意の適切な時間において任意の適切な回数行われてよい。

別の実施形態において、第１の免疫細胞集団の入手は、腫瘍組織の濾過；細胞採取；及び細胞分別を含んでよい。ここで、第１の免疫細胞集団の取得は、細胞洗浄をさらに含んでよく、細胞洗浄は、任意の適切な時間において任意の適切な回数行われてよい。

入手された第１の免疫細胞集団中の細胞数
第１の免疫細胞集団の入手を通して、所定の数又はそれよりも多い細胞が取得される。１つの実施形態において、第１の免疫細胞集団を生成するために培養された各腫瘍試料に関して、おおよそ１Ｅ４、おおよそ２Ｅ４、おおよそ３Ｅ４、おおよそ４Ｅ４、おおよそ５Ｅ４、おおよそ６Ｅ４、おおよそ７Ｅ４、おおよそ８Ｅ４、おおよそ９Ｅ４、おおよそ１Ｅ５、おおよそ２Ｅ５、おおよそ３Ｅ５、おおよそ４Ｅ５、おおよそ５Ｅ５、おおよそ６Ｅ５、おおよそ７Ｅ５、おおよそ８Ｅ５、おおよそ９Ｅ５、おおよそ１Ｅ６、おおよそ２Ｅ６、おおよそ３Ｅ６、おおよそ４Ｅ６、又はおおよそ５Ｅ６又はそれよりも多い細胞が入手されてよい。特定の実施形態において、第１の免疫細胞集団を生成するために培養された１つの腫瘍試料に関して、おおよそ１Ｅ５、おおよそ２Ｅ５、おおよそ３Ｅ５、おおよそ４Ｅ５、おおよそ５Ｅ５、おおよそ６Ｅ５、おおよそ７Ｅ５、おおよそ８Ｅ５、おおよそ９Ｅ５、又はおおよそ１Ｅ６の細胞が取得されてよい。１つの例において、第１の免疫細胞集団を生成するために培養された腫瘍試料が、おおよそ１から４ｍｍ^２の断面積を有する腫瘍試料である場合、各腫瘍試料に関しておおよそ８Ｅ５又はそれよりも多い細胞が取得されてよい。第１の免疫細胞集団を生成するための培養を通して入手される細胞数は、腫瘍のタイプ及び腫瘍試料のサイズによって変わり得、上述の実施形態に限定されない。

ＩＩ．冷凍保存
概観
本願において開示される免疫細胞組成物を生成するための方法において、方法に含まれている各処理の間に、各処理の結果の冷凍保存が任意選択で含まれてよい。

１つの例において、第１の免疫細胞集団を入手した後、第１の免疫細胞集団又は半産物を冷凍保存することが任意選択で含まれてよい。第１の免疫細胞集団又は半産物の冷凍保存において、第１の免疫細胞集団又は半産物が冷凍保存組成物に含まれ、冷凍保存される。第１の免疫細胞集団の冷凍保存は、下で詳細に説明される。

冷凍保存のための培地
上で記載されたように、第１の免疫細胞集団が冷凍保存組成物に含まれ、冷凍保存される。冷凍保存組成物は、冷凍保存に好適な組成物を有する。ここで、冷凍保存に好適な培地が含まれてよい。冷凍保存に好適な培地は、当該技術分野で知られている、冷凍保存のための全てのタイプの培地を含む。

１つの実施形態において、冷凍保存組成物は、おおよそ０．１％、おおよそ０．５％、おおよそ１％、おおよそ３％、おおよそ５％、おおよそ８％、おおよそ１０％、おおよそ１３％、又はおおよそ１５％の濃度、又は、前述のパーセンテージ値よりも高い濃度でＤＭＳＯを含んでよいが、本願はこれに限定されない。特定の実施形態において、冷凍保存組成物は、１０％の濃度でＤＭＳＯを含んでよい。例えば、１０％ＤＭＳＯを含むＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０が使用されてよい。

冷凍保存された細胞の細胞濃度及び数
第１の免疫細胞集団は、特定の濃度で冷凍保存組成物に含まれ、冷凍保存されてよい。

１つの実施形態において、第１の免疫細胞集団は、おおよそ１Ｅ５細胞／ｍＬ、おおよそ１Ｅ６細胞／ｍＬ、おおよそ２Ｅ６細胞／ｍＬ、おおよそ３Ｅ６細胞／ｍＬ、おおよそ４Ｅ６細胞／ｍＬ、おおよそ５Ｅ６細胞／ｍＬ、おおよそ６Ｅ６細胞／ｍＬ、おおよそ７Ｅ６細胞／ｍＬ、おおよそ８Ｅ６細胞／ｍＬ、おおよそ９Ｅ６細胞／ｍＬ、又はおおよそ１Ｅ７細胞／ｍＬの濃度で冷凍保存組成物に含まれてよいが、本願は限定されない。第１の免疫細胞集団は、冷凍保存組成物中で冷凍保存に好適な濃度で含まれてよい。特定の実施形態において、第１の免疫細胞集団は、冷凍保存組成物中に２Ｅ６細胞／ｍＬの濃度で含まれてよい。

１つの実施形態において、おおよそ０．１ｍＬ、おおよそ０．２ｍＬ、おおよそ０．３ｍＬ、おおよそ０．４ｍＬ、おおよそ０．５ｍＬ、おおよそ０．７ｍＬ、おおよそ１ｍＬ、おおよそ２ｍＬ、おおよそ３ｍＬ、おおよそ４ｍＬ、おおよそ５ｍＬ、おおよそ７ｍＬ、又はおおよそ１０ｍＬ、又は、前述のｍＬ量よりも多い又はそれに等しい量の冷凍保存組成物が、クライオバイアル内に配置され、冷凍保存されてよい。特定の実施形態において、冷凍保存組成物のおおよそ１ｍＬが、クライオバイアル内に配置されて、冷凍保存されてよい。

例えば、第１の免疫細胞集団は、おおよそ２Ｅ６細胞／ｍＬの濃度で冷凍保存組成物中に懸濁されてよく、おおよそ１ｍＬの冷凍保存組成物がクライオバイアル内に配置され、冷凍保存されてよい。

冷凍保存期間
第１の免疫細胞集団は、所定の期間冷凍保存されてよく、その後、免疫細胞組成物を生成するために増殖を通して使用されてよい。冷凍保存期間は、限定されるものではない。１つの実施形態において、第１の免疫細胞集団を冷凍保存する期間は、最大でも、おおよそ１年、おおよそ２年、おおよそ３年、おおよそ４年、おおよそ５年、おおよそ６年、おおよそ７年、おおよそ８年、おおよそ９年、おおよそ１０年、おおよそ１１年、おおよそ１２年、おおよそ１３年、おおよそ１４年、おおよそ１５年、おおよそ１６年、おおよそ１７年、おおよそ１８年、おおよそ１９年、又はおおよそ２０年、又は前述の期間よりも長いか又はそれに等しい期間であってよい。例えば、第１の免疫細胞集団は、１時間冷凍保存されて、解凍された後、免疫細胞組成物を生成するために使用されてよい。別の例において、１日間冷凍保存された後、第１の免疫細胞集団が解凍されて、免疫細胞組成物を生成するために使用されてよい。さらに別の例において、１０年間冷凍保存された後、第１の免疫細胞集団が解凍されて、免疫細胞組成物を生成するために使用されてよい。

冷凍保存温度
第１の免疫細胞集団は、長期保存に好適な温度で冷凍保存される。１つの実施形態において、第１の免疫細胞集団は、おおよそ－４０℃又はそれよりも低い、－６０℃又はそれよりも低い、－８０℃又はそれよりも低い、おおよそ－１００℃又はそれよりも低い、おおよそ－１２０℃又はそれよりも低い、おおよそ－１４０℃又はそれよりも低い、おおよそ－１６０℃又はそれよりも低い、おおよそ－１８０℃又はそれよりも低い、又は、おおよそ－１９０℃又はそれよりも低い温度で冷凍保存されてよい。特定の実施形態において、第１の免疫細胞集団は、おおよそ－１９０℃又はそれよりも低い温度で冷凍保存されてよい。例えば、第１の免疫細胞集団は、液体窒素（ＬＮ_２）又はガス状液体窒素（ｇａｓｅｏｕｓ ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）（ＬＮ_２）中で、おおよそ－１９０℃又はそれよりも低い温度で冷凍保存されてよい。

ＩＩＩ．冷凍保存された第１の免疫細胞集団の解凍
概観
本願において開示される免疫細胞組成物を生成するための方法において、方法に含まれている各処理間に、各処理の結果物を冷凍保存する段階が任意選択で含まれてよく、そのような冷凍保存処理が行われる場合、冷凍保存段階の後に、各処理の冷凍保存された結果物を解凍する処理がさら含まれてよい。

１つの例において、冷凍保存された第１の免疫細胞集団は、解凍され、免疫細胞組成物を生成するために使用されてよい。

解凍方法
解凍は、当該技術分野で知られている、冷凍保存された細胞を解凍するための方法を通して行われてよい。１つの実施形態において、冷凍保存された第１の免疫細胞集団は、サーモスタット（水浴）を使用して解凍されてよい。別の実施形態において、冷凍保存された第１の免疫細胞集団は、解凍デバイスを使用して解凍されてよい。ここで、解凍デバイスは、乾燥解凍法によって細胞を解凍するためのデバイスであってよい。乾燥解凍法は、細胞の汚染を防止し得る。ここで、乾燥解凍法は、無水方法、及び、解凍された被験体からブロックされる形態で（例えば、水を含有するパックの形態で）水が存在する方法の両方を含むが、本願はこれに限定されない。例えば、サーモスタットにおいて、おおよそ３７℃でおおよそ２分間、冷凍保存された第１の免疫細胞集団が解凍されてよい。別の例において、冷凍保存された第１の免疫細胞集団は、おおよそ３７℃でおおよそ７分、水含有パックを含む解凍デバイスを用いて解凍されてよい。

上で記載されたように、本願において開示される免疫（細胞）組成物を生成するための方法は、第１の免疫細胞集団を含む半産物を生成した直後に第１の免疫細胞集団を含む半産物を使用することによって最終産物を生成する段階；又は所定の期間にわたって半産物を任意選択で冷凍保存し、それを解凍することによって最終産物を生成する段階を備える。

ＩＶ．最終産物の生成本願において開示される免疫細胞組成物を生成するための方法は、半産物を生成する段階及び／又は最終産物を生成する段階を備えてよい。ここで、最終産物とは、第２の免疫細胞集団から増殖させた第３の免疫細胞集団を取得することによって生成された免疫細胞組成物を指し、第２の免疫細胞集団は、第１の免疫細胞集団、又は冷凍保存後に解凍された第１の免疫細胞集団に由来する。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物の生成又は最終産物の生成は、
第２の免疫細胞集団を播種する段階；
第２の免疫細胞集団を増殖させる段階；及び
免疫細胞組成物を生成する段階
を含んでよい。

以下、最終産物の生成に含まれている各段階が詳細に開示される。

１．第２の免疫細胞集団の播種
概観
第１の免疫細胞集団又は冷凍保存後に解凍された第１の免疫細胞集団に由来する第２の免疫細胞集団が、第２の組成物中に懸濁され、第２の容器内に播種される。

播種とは、容器に細胞を分注することを指し、第２の容器に第２の免疫細胞集団を分注することを意味する。ここで、増殖のために適切な数の細胞が、容器の細胞培養面積又は容積に従って分散されてよい。１つの実施形態において、第２の免疫細胞集団は、第２の組成物中に懸濁され、適切な量で第２の容器に播種される。

１つの実施形態において、第２の免疫細胞集団は、第２の組成物中に懸濁されてよく、細胞は、おおよそ１Ｅ３～１Ｅ４、おおよそ１Ｅ４～１Ｅ５、おおよそ１Ｅ５～１Ｅ６、又はおおよそ１Ｅ６～１Ｅ７の細胞数で第２の容器に播種されてよい。特定の実施形態において、第２の免疫細胞集団は、第２の組成物中に懸濁されてよく、細胞は、おおよそ１Ｅ５、２Ｅ５、３Ｅ５、４Ｅ５、５Ｅ５、６Ｅ５、７Ｅ５、８Ｅ５、９Ｅ５、１Ｅ６、１．１Ｅ６、１．２Ｅ６、１．３Ｅ６、１．４Ｅ６、又は１．５Ｅ６の細胞数で、又は、前述の値から選択される２つの値によって設定される範囲内の細胞数で第２の容器に播種されてよい。特定の実施形態において、第２の免疫細胞集団は、第２の組成物中に懸濁されてよく、細胞は、４Ｅ５の細胞数で第２の容器に播種されてよい。

第２の免疫細胞集団
この段階において、第２の容器に播種される第２の免疫細胞集団は、上述の第１の免疫細胞集団又は冷凍保存後に解凍された第１の免疫細胞集団に由来する。すなわち、第２の免疫細胞集団は、上記第１の免疫細胞集団又は冷凍保存後に解凍された第１の免疫細胞集団から入手されてよい。

１つの実施形態において、上記第１の免疫細胞集団又は冷凍保存後に解凍された第１の免疫細胞集団から第２の免疫細胞集団を入手する方法は、細胞を培養する処理において細胞を取得するための様々な既知の方法を含んでよいが、本願はこれに限定されない。

例えば、上記第１の免疫細胞集団又は冷凍保存後に解凍された第１の免疫細胞集団から第２の免疫細胞集団を入手する方法は、以下の段階のうちのいずれか１又は複数を備えてよい。第２の免疫細胞集団の入手は、必要な場合に細胞生存率を確認することをさらに含んでよいが、本願はこれに限定されない。

１）細胞洗浄
第２の免疫細胞集団の取得は、細胞集団を洗浄することを含んでよい。１つの実施形態において、第２の免疫細胞集団は、上記第１の免疫細胞集団又は解凍された第１の免疫細胞集団を洗浄することによって取得されてよい。例えば、細胞洗浄のために、遠心分離が用いられてよい。１つの実施形態において、上記第１の免疫細胞集団又は解凍された第１の免疫細胞集団は、ＤＰＢＳ又はＰＢＳ等の緩衝液で洗浄されるか、又は培地で洗浄されてよい。

２）遠心分離
１つの実施形態において、第２の免疫細胞集団を取得するために、上記第１の免疫細胞集団又は解凍された第１の免疫細胞集団を遠心分離する方法が使用されてよい。１つの実施形態において、遠心分離は、洗浄された免疫細胞集団に対して行われてよい。遠心分離方法の一実施形態は、関連する段落において説明したのと同じである。

３）細胞計数、分割、又は結合
１つの実施形態において、第２の免疫細胞集団を取得するために、第１の免疫細胞集団に対して細胞計数が行われてよい。例えば、細胞洗浄を経た第１の免疫細胞集団の細胞数を計測した後、下に記載される播種のための適切な細胞数を有するように免疫細胞集団を分割することによって、第２の免疫細胞集団が取得されてよい。さらに、第２の免疫細胞集団は、異なる複数の第１の容器内で培養された免疫細胞集団を組み合わせることによって取得されてよい。

１つの実施形態において、第２の免疫細胞集団の入手は、細胞洗浄を含んでよい。

１つの実施形態において、第２の免疫細胞集団の入手は、細胞洗浄及び細胞計数を含んでよい。ここで、細胞計数を経た免疫細胞集団は、播種のために適切な細胞数を有するように分割されてよい。

第２の容器
第２の免疫細胞集団は、第２の容器に播種されてよく、第２の容器は、第２の免疫細胞集団を増殖させるために使用される容器を指す。第２の容器は、培地、血清、血漿、ＩＬ－２、抗ＣＤ－３抗体、フィーダー細胞、及び／又は抗生物質を含む第２の組成物とともに、第２の免疫細胞集団を増殖させるために使用される。第２の容器は、ガスが通過するガス透過性容器、又は、ガスを提供するようにガス供給システムを有する容器である。すなわち、容器は、ガスが容器を通過することができるように製造された容器、又は、ガスを通過させように製造されていないがガスの通り抜けを可能にする別個のガス供給システムを有する容器であってよい。

１つの実施形態において、第２の容器は、おおよそ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１６００、１８００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００又は１００００ｍＬの最大許容可能容量を有する容器、又は、前述の値から選択される２つの値によって設定される範囲内の最大許容可能容量を有する容器であってよい。特定の実施形態において、第２の容器は、おおおよそ５００、５５０、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１６００、１８００又は２０００ｍＬの最大許容可能容量を有する容器、又は、前述の値から選択される２つの値によって設定される範囲内の最大許容可能容量を有する容器であってよい。

１つの実施形態において、第２の容器は、例えば、２４ウェルプレート、Ｔ２５、Ｔ７５、又はＴ１２５フラスコ、ＧＲＥＸ１０、ＧＲＥＸ１０Ｍ、ＧＲＥＸ１０Ｍ－ＣＳ、ＧＲＥＸ１００、ＧＲＥＸ１００Ｍ、ＧＲＥＸ１００Ｍ－ＣＳ、ＧＲＥＸ５００、ＧＲＥＸ５００Ｍ、又はＧＲＥＸ５００Ｍ－ＣＳフラスコ等のフラスコ、又は培養バッグであってよいが、本願はこれに限定されない。特定の実施形態において、第２の容器は、ＧＲＥＸ１００Ｍであってよい。

第２の組成物
第２の免疫細胞集団は、第２の組成物中に懸濁され、第２の容器に播種され、ここで、第２の組成物は、培地、血清、血漿、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体、フィーダー細胞、及び抗生物質から選択されるいずれか１又は複数を含む。

１つの実施形態において、第２の組成物は、培地；血清；及びＩＬ－２を含んでよい。別の実施形態において、第２の組成物は、培地；血漿；及びＩＬ－２を含んでよい。１つの実施形態において、第２の組成物は、上述の物質に加えて、本願の第１の組成物に関する含量の表に記載されている抗体（例えば、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＰＤ－１抗体、及び抗ＰＤ－Ｌ１抗体から選択されるいずれか１又は複数）をさらに含んでよく、抗体の実施形態は、関連する段落において説明したのと同じである。

特定の実施形態において、第２の組成物は、培地；血清；ＩＬ－２；抗ＣＤ３抗体；及びフィーダー細胞を含む。別の特定の実施形態において、第２の組成物は、培地；血漿；ＩＬ－２；抗ＣＤ３抗体；及びフィーダー細胞を含む。また別の特定の実施形態において；第２の組成物は、培地；血清及び血漿のうちのいずれか１つ；ＩＬ－２；抗ＣＤ３抗体；抗生物質；及びフィーダー細胞を含む。

一般に、組織又は細胞の培養及び／又は増殖において、容器（例えば、フラスコ）において使用される組成物の体積は、容器のタイプによって変わり得る。例えば、一般に、ＧＲＥＸ１０に関して、４０ｍＬの組成物が使用され、ＧＲＥＸ１００に関して、４００ｍＬの組成物が使用され、ＧＲＥＸ１００Ｍに関して、１，０００ｍＬの組成物が使用される。

しかしながら、本願の第２の免疫細胞集団を増殖させるために、第２の容器に当初添加される組成物の量は、上で記載された一般に使用される量とは異なってよい。

１つの実施形態において、第２の容器に当初添加される第２の組成物の量は、第２の容器の最大許容可能容量のおおよそ８０％、７０％、６０％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、又は５％、又はそれよりも少なくてよい。特定の実施形態において、第２の容器に当初添加される第２の組成物の量は、第２の容器の最大許容可能容量のおおよそ３０％又はそれよりも少なくてよい。特定の実施形態において、第２の容器に当初添加される第２の組成物の量は、第２の容器の最大許容可能容量のおおよそ１０％又はそれよりも少なくてよい。ここで、最大許容可能容量は、第２の容器に添加することができる最大量を意味する。

１つの実施形態において、第２の容器がＧＲＥＸ１００Ｍである場合、当初添加される第２の組成物の量は、２００ｍＬ、１５０ｍＬ、１００ｍＬ、８０ｍＬ、６０ｍＬ、４０ｍＬ、２０ｍＬ、又は１０ｍＬ、又はそれよりも少なくてよい。特定の実施形態において、第２の容器がＧＲＥＸ１００Ｍである場合、当初添加される第２の組成物の量は、おおよそ２０ｍＬであってよい。

１）培地
本願において使用される培地は、細胞及び／又は組織を培養するための栄養源を意味する。培地として、ＴＩＬを含有する免疫細胞の培養に好適な全ての培地が使用されてよい。

１つの実施形態において、培地は、ＡｌｙＳ５０５Ｎ培地、ＡＩＭ－Ｖ培地、又はＲＰＭＩ培地であってよいが、本願はこれに限定されない。特定の実施形態において、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地が使用されてよい。

１つの実施形態において、第２の組成物に含まれている培地は、ＡｌｙＳ５０５Ｎ培地、ＡＩＭ－Ｖ培地、又はＲＰＭＩ培地であってよい。特定の実施形態において、第２の組成物に含まれている培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地であってよい。

血清、血漿、ＩＬ－２、抗ＣＤ－３抗体、フィーダー細胞、及び／又は抗生物質が培地に添加され、免疫細胞の増殖において使用されてよい。すなわち、第２の組成物は、培地に加えて、血清、血漿、ＩＬ－２、抗ＣＤ－３抗体、フィーダー細胞、及び／又は抗生物質をさらに含んでよい。

２）添加剤
ａ）血清
１つの実施形態において、基本培養培地（例えば、上述のＡｌｙＳ５０５Ｎ培地、ＡＩＭ－Ｖ培地、又はＲＰＭＩ１６４０培地）に血清が添加されてよい。１つの実施形態において、本願の第２の組成物は、血清を含んでよい。血清は、高分子量タンパク質及び低分子量栄養素を含有し、細胞成長に必要な成分を含有し得る。血清は、ヒト血清を含んでよいが、本願はこれに限定されない。

１つの実施形態において、おおよそ１０ｖｏｌ％又はそれよりも低い濃度で培地に添加されながら、ヒト血清が使用されてよい。別の実施形態において、ヒト血清は、おおよそ９ｖｏｌ％又はそれよりも低い、おおよそ８ｖｏｌ％又はそれよりも低い、おおよそ７ｖｏｌ％又はそれよりも低い、おおよそ６ｖｏｌ％又はそれよりも低い、おおよそ５ｖｏｌ％又はそれよりも低い、おおよそ４ｖｏｌ％又はそれよりも低い、又は３ｖｏｌ％又はそれよりも低い濃度で培地に添加されながら使用されてよい。特定の実施形態において、ヒト血清は、おおよそ３ｖｏｌ％でＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地に添加されながら使用されてよい。

１つの実施形態において、第２の組成物に血清が含まれている場合、第２の組成物に含まれている血清の濃度は、おおよそ２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｖｏｌ％、又は、前述のｖｏｌ％よりも低いか又はそれに等しい濃度であってよい。特定の実施形態において、第２の組成物に含まれている血清の濃度は、おおよそ１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｖｏｌ％、又は、前述のｖｏｌ％よりも少ないか又はそれに等しい濃度であってよい。特定の実施形態において、第２の組成物に含まれている血清の濃度は、おおよそ５、４、３、２又は１ｖｏｌ％、又は、前述のｖｏｌ％よりも少ないか又はそれに等しい濃度であってよい。

１つの実施形態において、第２の組成物に含まれているヒト血清の濃度は、おおよそ５、４、３、２又は１ｖｏｌ％であってよい。特定の実施形態において、第２の組成物に含まれているヒト血清の濃度は、おおよそ３ｖｏｌ％であってよい。

ｂ）血漿
１つの実施形態において、基礎培地に血漿が添加されてよい。１つの実施形態において、本願の第２の組成物は、血漿を含んでよい。血漿は、フィブリノゲン不含有血清を指す。血漿は、細胞成長に必要な成分を含有する。

本願において使用される血漿は、ヒト血漿又は患者の血液から単離された血漿であってよいが、本願はこれに限定されない。

１つの実施形態において、血清の代わりに血漿が培地に追加されて使用されてよい。

１つの実施形態において、血漿は、おおよそ１０ｖｏｌ％又はそれよりも低い濃度で培地に添加されながら使用されてよい。別の実施形態において、血漿は、おおよそ９ｖｏｌ％又はそれよりも低い、おおよそ８ｖｏｌ％又はそれよりも低い、おおよそ７ｖｏｌ％又はそれよりも低い、おおよそ６ｖｏｌ％又はそれよりも低い、おおよそ５ｖｏｌ％又はそれよりも低い、おおよそ４ｖｏｌ％又はそれよりも低い、又は３ｖｏｌ％又はそれよりも低い濃度で培地に添加されながら使用されてよい。特定の実施形態において、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地に血漿がおおよそ３ｖｏｌ％で添加され、使用されてよい。

１つの実施形態において、第２の組成物に血漿が含まれている場合、第２の組成物に含まれている血漿の濃度は、おおよそ２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｖｏｌ％、又は、前述のｖｏｌ％よりも低いか又はそれに等しい濃度であってよい。特定の実施形態において、第２の組成物に含まれている血漿の濃度は、おおよそ１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１ｖｏｌ％、又は、前述のｖｏｌ％よりも少ないか又はそれに等しい濃度であってよい。特定の実施形態において、第２の組成物に含まれている血漿の濃度は、おおよそ５、４、３、２又は１ｖｏｌ％、又は、前述のｖｏｌ％よりも少ないか又はそれに等しい濃度であってよい。

１つの実施形態において、第２の組成物に含まれている血漿の濃度は、おおよそ５、４、３、２又は１ｖｏｌ％であってよい。特定の実施形態において、第２の組成物に含まれている血漿の濃度は、おおよそ３ｖｏｌ％であってよい。

ｃ）ＩＬ－２
本願において使用されるＩＬ－２は、Ｔ細胞増殖を促進する因子を指す、インターロイキン－２の略語である。ＩＬ－２は、ヒトリコンビナントＩＬ－２タイプを含む様々なタイプのＩＬ－２を含む。

１つの実施形態において、第２の組成物は、ＩＬ－２を含んでよい。

１つの実施形態において、ＩＬ－２は、おおよそ１０，０００ＩＵ／ｍＬの濃度で培地に添加されてよい。１つの実施形態において、培地に添加されるＩＬ－２の濃度は、おおよそ９０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ８，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ７，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ６，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ５，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ４，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ３，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬ、又はおおよそ５００ＩＵ／ｍＬであってよい。特定の実施形態において、ＩＬ－２は、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬの濃度でＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地に添加されてよい。

１つの実施形態において、第２の組成物は、おおよそ１０，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ９，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ９，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ８，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ８，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ７，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ７，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ６，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ６，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ５，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ５，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ４，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ４，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ３，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ３，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ２，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ１，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ９００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ８００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ７００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ６００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ４００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ３００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ２００ＩＵ／ｍＬ、又はおおよそ１００ＩＵ／ｍＬの濃度、又は、前述の値から選択される２つの値によって設定される範囲内の濃度でＩＬ－２を含んでよい。特定の実施形態において、第２の組成物は、おおよそ３，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ２，５００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬ、おおよそ１，５００ＩＵ／ｍＬ、又はおおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬの濃度、又は、前述の値から選択される２つの値によって設定される範囲内の濃度で、ＩＬ－２を含んでよい。特定の実施形態において、第２の組成物は、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬの濃度でＩＬ－２を含んでよい。

ｄ）抗ＣＤ３抗体
抗ＣＤ３抗体は、Ｔ細胞表面上の膜タンパク質、すなわち、ＣＤ３受容体を標的とする抗体を指す。

１つの実施形態において、第２の組成物は、抗ＣＤ３抗体を含んでよい。１つの実施形態において、抗ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ３、オテリキシズマブ、テプリズマブ、及びビジリズマブ、又はそれらの２つ又はそれよりも多くの組み合わせから選択されたいずれか１つであってよい。特定の実施形態において、第２の組成物に含まれている抗ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ３であってよい。

１つの実施形態において、抗ＣＤ－３抗体は、おおよそ１ｎｇ／ｍＬ、おおよそ２ｎｇ／ｍＬ、おおよそ３ｎｇ／ｍＬ、おおよそ４ｎｇ／ｍＬ、おおよそ５ｎｇ／ｍＬ、おおよそ１０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ１５ｎｇ／ｍＬ、おおよそ２０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ２５ｎｇ／ｍＬ、おおよそ３０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ３５ｎｇ／ｍＬ、おおよそ４０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ４５ｎｇ／ｍＬ、おおよそ５０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ６０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ７０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ８０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ９０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ１００ｎｇ／ｍＬ、おおよそ２００ｎｇ／ｍＬ、おおよそ３００ｎｇ／ｍＬ、おおよそ４００ｎｇ／ｍＬ、おおよそ５００ｎｇ／ｍＬ、又はおおよそ１，０００ｎｇ／ｍＬの濃度、又は、前述の値から選択される２つの値によって設定される範囲内の濃度で培地に添加されながら使用されてよい。

１つの実施形態において、抗ＣＤ３抗体が第２の組成物に含まれている場合、第２の組成物に含まれている抗ＣＤ３抗体の濃度は、おおよそ１ｎｇ／ｍＬ、おおよそ２ｎｇ／ｍＬ、おおよそ３ｎｇ／ｍＬ、おおよそ４ｎｇ／ｍＬ、おおよそ５ｎｇ／ｍＬ、おおよそ１０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ１５ｎｇ／ｍＬ、おおよそ２０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ２５ｎｇ／ｍＬ、おおよそ３０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ３５ｎｇ／ｍＬ、おおよそ４０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ４５ｎｇ／ｍＬ、おおよそ５０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ６０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ７０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ８０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ９０ｎｇ／ｍＬ、おおよそ１００ｎｇ／ｍＬ、おおよそ２００ｎｇ／ｍＬ、おおよそ３００ｎｇ／ｍＬ、おおよそ４００ｎｇ／ｍＬ、おおよそ５００ｎｇ／ｍＬ、又はおおよそ１０００ｎｇ／ｍＬ、又は、前述の値から選択される２つの値によって設定される範囲内の濃度であってよい。特定の実施形態において、第２の組成物に含まれている抗ＣＤ３抗体の濃度は、おおよそ３０ｎｇ／ｍＬであってよい。

ｅ）フィーダー細胞
ｉ）フィーダー細胞パーセンテージ
本願において使用されるフィーダー細胞は、第２の組成物に含まれて、第２の免疫細胞集団を増殖させる場合にＴＩＬを活性化させ増殖させるのに役立つ細胞である。１つの実施形態において、フィーダー細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、ここで、ＰＢＭＣは、円形細胞核を有する末梢血細胞を指す。

１つの実施形態において、フィーダー細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であってよい。１つの実施形態において、フィーダー細胞は、不活性化ＰＢＭＣであってよい。１つの実施形態において、フィーダー細胞は、同種異系ＰＢＭＣであってよい。１つの実施形態において、フィーダー細胞は、不活性化同種異系ＰＢＭＣであってよい。ここで、ＰＢＭＣは、照射によって不活性化されてよく、ＰＢＭＣを不活性化する方法は、これに限定されない。例えば、ＰＢＭＣは、おおよそ６０Ｇｙの照射を通して不活性化されてよい。

フィーダー細胞は、第２の免疫細胞集団（ＴＩＬ）に対して所定の比で第２の組成物に添加されてよい。１つの実施形態において、第２の免疫細胞集団が第２の組成物中に懸濁された後、フィーダー細胞は、第２の免疫細胞集団中の細胞と以下の比（第２の免疫細胞集団に含まれている細胞：フィーダー細胞）を有するように第２の組成物に含まれてよい：おおよそ１：１０００、おおよそ１：９００、おおよそ１：８００、おおよそ１：７００、おおよそ１：６００、おおよそ１：５００、おおよそ１：４５０、おおよそ１：４００おおよそ１：３５０、おおよそ１：３００、おおよそ１：２８０、おおよそ１：２６０、おおよそ１：２４０、おおよそ１：２２０、おおよそ１：２００、おおよそ１：１８０、おおよそ１：１６０、おおよそ１：１４０、おおよそ１：１２０、おおよそ１：１００、おおよそ１：９０、おおよそ１：８０、おおよそ１：７０、おおよそ１：６０、又はおおよそ１：５０。

特定の実施形態において、フィーダー細胞は、免疫細胞集団との比（第２の免疫細胞集団に含まれている細胞：フィーダー細胞）が１：２００（±１００）であるように第２の組成物に含まれてよい。

特定の実施形態において、フィーダー細胞は、免疫細胞集団との比（第２の免疫細胞集団に含まれている細胞：フィーダー細胞）がおおよそ１：２００であるように第２の組成物に含まれてよい。

ｉｉ）ＰＢＭＣの単離
１つの実施形態において、フィーダー細胞は、ＰＢＭＣであってよい。ここで、ＰＢＭＣは、健康な人の血液から単離されたものであってよい。フィーダー細胞が不活性化同種異系ＰＢＭＣである場合、不活性化同種異系ＰＢＭＣは、健康な患者の血液から単離された末梢血細胞を不活性化（例えば、照射による不活性化）することによって調製される。

健康な人からのＰＢＭＣの単離は、既知の方法を通して実行されてよい。例えば、ＰＢＭＣを単離する方法としては、Ｆｉｃｏｌｌ溶液を使用した一般的な単離方法が挙げられ得る。

ｆ）抗生物質
１つの実施形態において、第２の組成物は、抗生物質をさらに含んでよい。

抗生物質は、細胞培養及び／又は増殖中の細菌又は真菌による汚染を防止するために使用されてよい。

最終産物の生成において抗生物質を使用するか否かは、使用される第１の免疫細胞集団又は第２の免疫細胞集団の条件、及び培養及び／又は増殖された細胞の条件を適切に考慮することによって決定されてよい。

第２の組成物が抗生物質を含む場合、抗生物質は、細胞培養及び／又は増殖に影響しない濃度で含まれてよく、ここで、細胞毒性を示す抗生物質の濃度が考慮されてよい。第２の組成物に含まれている抗生物質の濃度は、抗生物質のタイプによって変わり得る。

第２の組成物に含まれている抗生物質の例は、アンピシリン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ペニシリン、及びストレプトマイシンを含むが、本願はこれに限定されない。すなわち、細胞培養及び／又は増殖のための培地に添加される抗生物質として、当該技術分野で知られている任意の抗生物質が使用されてよい。特定の実施形態において、第２の組成物は、ゲンタマイシンを含んでよい。

上で記載されたように、本願における第２の組成物は、培地及び添加剤を含む。１つの実施形態において、第２の組成物は、培地、血清、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体、及びフィーダー細胞を含んでよい。別の実施形態において、第２の組成物は、培地、血漿、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体、及びフィーダー細胞を含んでよい。また別の実施形態において、第２の組成物は、培地、血清、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体、フィーダー細胞、及び抗生物質を含んでよい。さらに別の実施形態において、第２の組成物は、培地、血漿、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体、フィーダー細胞、及び抗生物質を含んでよい。しかしながら、本願はこれに限定されない。

特定の実施形態において、第２の組成物は、培地、血清、ＩＬ－２、ＯＫＴ３、及びフィーダー細胞を含み、培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地であり、血清は、ヒトＡＢ血清であり、第２の組成物には、おおよそ３ｖｏｌ％の濃度でヒトＡＢ血清が含まれ、第２の組成物には、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬの濃度でＩＬ－２が含まれ、第２の組成物には、おおよそ３０ｎｇ／ｍＬの濃度でＯＫＴ３が含まれ、フィーダー細胞は、不活性化同種異系ＰＢＭＣである。ここで、不活性化同種異系ＰＢＭＣは、免疫細胞集団に含まれている細胞に対して１：２００の比（第２の免疫細胞集団に含まれている細胞：フィーダー細胞）で第２の組成物に含まれてよい。

特定の実施形態において、第２の組成物は、培地、血清、ＩＬ－２、ＯＫＴ３、抗生物質、及びフィーダー細胞を含み、培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地であり、血清は、ヒトＡＢ血清であり、第２の組成物には、おおよそ３ｖｏｌ％の濃度でヒトＡＢ血清が含まれ、第２の組成物には、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬの濃度でＩＬ－２が含まれ、第２の組成物には、３０ｎｇ／ｍＬの濃度でＯＫＴ３が含まれ、フィーダー細胞は、不活性化同種異系ＰＢＭＣである。ここで、不活性化同種異系ＰＢＭＣは、免疫細胞集団に含まれている細胞に対して１：２００の比（第２の免疫細胞集団に含まれている細胞：フィーダー細胞）で第２の組成物に含まれてよい。

第２の免疫細胞集団の播種の具体例が下で記載されるが、本願はこれに限定されない。

上記第１の免疫細胞集団又は冷凍保存後に解凍された第１の免疫細胞集団から、第２の免疫細胞集団が取得される。第２の免疫細胞集団は、第２の組成物中に懸濁され、第２の容器ＧＲＥＸ１００Ｍに播種され、ここで、細胞は、容器当たりにおおよそ４Ｅ５の細胞数で播種される。ここで、第２の組成物は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地、３ｖｏｌ％のヒト血清、２，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３、及び不活性化同種異系ＰＢＭＣを含む。ここで、第２の免疫細胞集団が第２の組成物中に懸濁された後の時点に基づいて、第２の組成物には、第２の免疫細胞集団に含まれている細胞に対しておおよそ１：２００の比（第２の免疫細胞集団に含まれている細胞：不活性化同種異系ＰＢＭＣ）で不活性化同種異系ＰＢＭＣが含まれている。すなわち、第２の免疫細胞集団は、第２の組成物中に懸濁され、第２の免疫細胞集団を含む第２の組成物は、容器当たりに２０ｍＬ添加される。

２．第２の免疫細胞集団の増殖
概観
本願の免疫細胞組成物を生成するための方法は、第２の免疫細胞集団を増殖させる段階を備える。１つの実施形態において、本願の免疫細胞組成物を生成するための方法は、第２の免疫細胞集団を増殖させて、第３の免疫細胞集団を生成する段階を備える。

播種された第２の免疫細胞集団は、増殖期間中に第２の容器内の第２の組成物中で増殖され、これを通して、第３の免疫細胞集団が生成される。第３の免疫細胞集団は、第２の免疫細胞集団を増殖させることによって入手された免疫細胞集団を指す。

第２の免疫細胞集団を増殖させることは、第２の添加剤組成物を添加することを含んでよい。

以下、第２の免疫細胞集団の増殖が詳細に説明される。

第２の容器への第２の添加剤組成物の添加
第２の免疫細胞集団の増殖中、第２の添加剤組成物が第２の容器に添加されてよい。ここで、第２の添加剤組成物は、培地、血清、血漿、抗生物質、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体、及びフィーダー細胞から選択されるいずれか１又は複数を含んでよい。特定の実施形態において、第２の添加剤組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２を含んでよい。

第２の添加剤組成物の添加の処理が下で詳細に説明される。

１）添加の回数
第２の免疫細胞集団が第２の容器内の第２の組成物中で培養される間、第２の容器に第２の添加剤組成物が添加（補足）される。

１つの実施形態において、増殖中、第２の添加剤組成物は、第２の容器に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回、又は、前述の回数よりも多い回数、添加されてよい。特定の実施形態において、増殖期間中、第２の添加剤組成物は、４回添加されてよい。

増殖中、第２の添加剤組成物が２回又はそれよりも多い回数添加される場合、第２の添加剤組成物は、全ての添加時間において同量添加されてもよいし、又は、全ての添加時間において異なる量添加されてもよい。添加される第２の添加剤組成物の量は、関連する段落において詳細に説明される。

２）添加時間
ここで、１つの実施形態において、第２の添加剤組成物は、増殖の開始日から２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目、１４日目、１５日目、１６日目、１７日目、１８日目、１９日目、２０日目、及び２１日目から選択されるいずれか１又は複数の日に添加されてよく、増殖期間中に１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回添加されてよい。特定の実施形態において、第２の添加剤組成物は、４、６、８、及び１０日目に、４回添加される。

３）添加量
添加される第２の添加剤組成物の量は、容器のタイプ及び／又は添加時間によって変わり得る。
１つの実施形態において、第２の添加剤組成物は、各添加時間において同量添加されてよい。別の実施形態において、第２の添加剤組成物は、各添加時間において異なる量添加されてよい。また別の実施形態において、第２の添加剤組成物は、各添加時間においてその添加量を増加させることによって添加されてよい。

１つの実施形態において、第２の添加剤組成物は、おおよそ１ｍＬ、２ｍＬ、３ｍＬ、４ｍＬ、５ｍＬ、６ｍＬ、７ｍＬ、８ｍＬ、９ｍＬ、１０ｍＬ、１１ｍＬ、１２ｍＬ、１３ｍＬ、１４ｍＬ、１５ｍＬ、１６ｍＬ、１７ｍＬ、１８ｍＬ、１９ｍＬ２０ｍＬ、２１ｍＬ、２２ｍＬ、２３ｍＬ、２４ｍＬ、２５ｍＬ、２６ｍＬ、２７ｍＬ、２８ｍＬ、２９ｍＬ、３０ｍＬ、３２ｍＬ、３５ｍＬ、３７ｍＬ、４０ｍＬ、４５ｍＬ、５０ｍＬ、５５ｍＬ、６０ｍＬ、６５ｍＬ、７０ｍＬ、８０ｍＬ、９０ｍＬ、１００ｍＬ、１１０ｍＬ、１２０ｍＬ、１３０ｍＬ、１４０ｍＬ、１５０ｍＬ、１６０ｍＬ、１７０ｍＬ、１８０ｍＬ、１９０ｍＬ、２００ｍＬ、２５０ｍＬ、３００ｍＬ、３５０ｍＬ、４００ｍＬ、４５０ｍＬ、５００ｍＬ、５５０ｍＬ、６００ｍＬ、６５０ｍＬ、７００ｍＬ、７５０ｍＬ、８００ｍＬ、８５０ｍＬ、９００ｍＬ、９５０ｍＬ、１０００ｍＬ、１５００ｍＬ、２Ｌ、３Ｌ、４Ｌ、又は５Ｌ、又は、各添加時間において前述の値よりも多いか又はそれに等しい量等の同じ又は異なる量添加されてよい。しかしながら、本願はこれに限定されず、添加される第２の添加剤組成物の量は、様々な条件（例えば、容器の容量、培養細胞の条件、及び／又は添加時点）を考慮して適切な値として決定されてよい。特定の実施形態において、第２の添加剤組成物は、各添加時間における添加量を増加させることによって添加されてよく、２０ｍＬ、６０ｍＬ、１８０ｍＬ、及び５４０ｍＬの第２の添加剤組成物が、４、６、８、及び１０日目にそれぞれ第２の容器に添加されてよい。

４）第２の添加剤組成物の構成
第２の容器に添加される第２の添加剤組成物は、培地、血清、血漿、ＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体、及びフィーダー細胞から選択されるいずれか１又は複数を含んでよい。

１つの実施形態において、第２の添加剤組成物は、培地；血清；及びＩＬ－２を含んでよい。別の実施形態において、第２の添加剤組成物は、培地；血漿；及びＩＬ－２を含んでよい。

特定の実施形態において、第２の添加剤組成物は、培地；血清；及びＩＬ－２を含んでよい。別の特定の実施形態において、第２の添加剤組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２に加えて、抗ＣＤ３抗体及びフィーダー細胞のうちのいずれか１又は複数をさらに含んでよい。

第２の添加剤組成物に含むことができる各成分の実施形態は、第２の組成物において上で説明されている。

ａ）培地
第２の添加剤組成物に含むことができる培地に関する実施形態は、第２の組成物において上で説明されている。例えば、特定の実施形態において、第２の添加剤組成物に含まれている培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地であってよいが、本願はこれに限定されない。

ｂ）血清
第２の添加剤組成物に血清が含まれている場合、血清に関する実施形態は、第２の組成物において上で説明したのと同じである。例えば、特定の実施形態において、血清は、ヒト血清であってよいが、本願はこれに限定されない。例えば、特定の実施形態において、第２の添加剤組成物に含まれている血清の濃度は、おおよそ３ｖｏｌ％であってよいが、本願はこれに限定されない。

ｃ）血漿
第２の添加剤組成物に血漿が含まれている場合、血漿に関する実施形態は、第２の組成物において上で説明したのと同じである。例えば、特定の実施形態において、血漿はヒト血漿であってよいが、本願はこれに限定されない。例えば、特定の実施形態において、第２の添加剤組成物に含まれている血漿の濃度は、おおよそ３ｖｏｌ％であってよいが、本願はこれに限定されない。

ｄ）ＩＬ－２
第２の添加剤組成物にＩＬ－２が含まれている場合、ＩＬ－２に関する実施形態は、第２の組成物において上で説明したのと同じである。例えば、特定の実施形態において、第２の添加剤組成物に含まれているＩＬ－２の濃度は、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬであってよいが、本願はこれに限定されない。

ｅ）抗ＣＤ３抗体
第２の添加剤組成物に抗ＣＤ３抗体が含まれている場合、抗ＣＤ３抗体に関する実施形態は、第２の組成物において上で説明したのと同じである。例えば、特定の実施形態において、抗ＣＤ３抗体はＯＫＴ３であってよいが、本願はこれに限定されない。例えば、特定の実施形態において、第２の添加剤組成物に含まれている抗ＣＤ３抗体の濃度は、おおよそ３０ｎｇ／ｍＬであってよいが、本願はこれに限定されない。

ｆ）フィーダー細胞
第２の添加剤組成物にフィーダー細胞が含まれている場合、フィーダー細胞に関する実施形態は、第２の組成物において上で説明したのと同じである。例えば、特定の実施形態において、フィーダー細胞は、不活性化同種異系ＰＢＭＣであってよいが、本願はこれに限定されない。例えば、特定の実施形態において、フィーダー細胞は、第２の容器に当初播種された第２の容器に含まれている免疫細胞又は第２の免疫細胞集団に含まれている細胞に対して、１：２００の比（免疫細胞又は第２の免疫細胞集団に含まれている細胞：フィーダー細胞）で第２の添加剤組成物に含まれてよい。

ｇ）抗生物質
第２の添加剤組成物に抗生物質が含まれている場合、抗生物質に関する実施形態は、第２の組成物において上で説明したのと同じである。

１つの実施形態において、第２の容器に添加される第２の添加剤組成物の構成は、各添加時間において変わり得る。別の実施形態において、第２の容器に添加される第２の添加剤組成物の構成は、各添加時間において同じであってよい。

１つの実施形態において、第２の容器に添加される第２の添加剤組成物の構成は、第２の組成物のそれと同じであってよい。別の実施形態において、第２の容器に添加される第２の添加剤組成物の構成は、第２の組成物のそれとは異なってよい。特定の実施形態において、第２の添加剤組成物は、抗ＣＤ３抗体及びフィーダー細胞を除いて、第２の組成物と同じ組成成分及び組成比を有する組成物であってよい。

１つの実施形態において、第２の容器に添加される第２の添加剤組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２を含んでよい。特定の実施形態において、第２の容器に添加される第２の添加剤組成物は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地、おおよそ３ｖｏｌ％のヒト血清、及びおおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含んでよい。

増殖中に新たな免疫細胞を追加するか否か
第２の容器において第２の免疫細胞集団を増殖させる間、免疫細胞が外部から第２の免疫細胞集団にさらに添加されなくてよい。

さらに、そのような増殖処理において、任意選択で容器変更が実行されてよいが、第２の免疫細胞集団の増殖中は、第２の容器から別の容器に細胞集団を移植させる必要がないことから、この処理において便宜性を提供することが有利である。

これは、本願の方法において、第２の免疫細胞集団の増殖中、第２の容器以外の容器に移植させる必要がなく、又は、外部から第２の容器に新たな免疫細胞をさらに追加する必要がないことを意味する。

増殖期間
第２の免疫細胞集団は、第２の容器において所定の期間増殖されてよい。１つの実施形態において、第２の免疫細胞集団は、おおよそ１日又はそれよりも多い日数の間増殖される。１つの実施形態において、第２の免疫細胞集団は、おおよそ２日又はそれよりも多い日数、３日又はそれよりも多い日数、４日又はそれよりも多い日数、５日又はそれよりも多い日数、６日又はそれよりも多い日数、７日又はそれよりも多い日数、８日又はそれよりも多い日数、９日又はそれよりも多い日数、１０日又はそれよりも多い日数、１１日又はそれよりも多い日数、１２日又はそれよりも多い日数、１３日又はそれよりも多い日数、１４日又はそれよりも多い日数、１５日又はそれよりも多い日数、１６日又はそれよりも多い日数、１７日又はそれよりも多い日数、１８日又はそれよりも多い日数、１９日又はそれよりも多い日数、２０日又はそれよりも多い日数、２１日又はそれよりも多い日数、２２日又はそれよりも多い日数、２３日又はそれよりも多い日数、又は２４日又はそれよりも多い日数の間増殖されてよい。特定の実施形態において、第２の免疫細胞集団は、第２の容器においておおよそ７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、又は２１日間増殖されてよい。特定の実施形態において、第２の免疫細胞集団は、第２の容器においておおよそ１４日間増殖されてよい。

増殖効率
第２の容器に播種された第２の免疫細胞集団は、第２の免疫細胞集団の増殖を通して所定の倍数又はそれよりも多く増殖されてよい。すなわち、播種された第２の免疫細胞集団は、第２の容器において所定の倍数又はそれよりも多く増殖される。

１つの実施形態において、播種された第２の免疫細胞集団は、第２の容器において増殖され、こうして、第３の免疫細胞集団が生成され得る。第２の免疫細胞集団と比較して、第３の免疫細胞集団は、ある特定の倍数よりも多いか又はそれに等しい細胞数を有する。１つの実施形態において、第３の免疫細胞集団は、第２の免疫細胞集団の少なくともおおよそ１００倍多い細胞を有する。１つの実施形態において、第３の免疫細胞集団は、第２の免疫細胞集団の少なくともおおよそ２００倍、おおよそ３００倍、おおよそ４００倍、おおよそ５００倍、おおよそ６００倍、おおよそ７００倍、おおよそ８００倍、おおよそ９００倍、おおよそ１，０００倍、おおよそ１，１００倍、おおよそ１，２００倍、おおよそ１，３００倍、おおよそ１，４００倍、おおよそ１，５００倍、おおよそ１，６００倍、おおよそ１，７００倍、おおよそ１，８００倍、おおよそ１，９００倍、おおよそ２，０００倍、おおよそ２，２００倍、おおよそ２，３００倍、おおよそ２，４００倍、おおよそ２，５００倍、おおよそ２，６００倍、おおよそ２，７００倍、おおよそ２，８００倍、おおよそ３，０００倍、おおよそ３，５００倍、おおよそ４，０００倍、おおよそ４，５００倍、おおよそ５，０００倍、おおよそ５，５００倍、おおよそ６，０００倍、おおよそ６，５００倍、おおよそ７，０００倍、おおよそ７，５００倍、おおよそ８，０００倍、おおよそ８，５００倍、おおよそ９，０００倍、おおよそ９，５００倍、おおよそ１０，０００倍、又はおおよそ２０，０００倍多い細胞を有してよい。特定の実施形態において、第３の免疫細胞集団は、第２の免疫細胞集団の少なくともおおよそ２，５００倍多い細胞を有してよい。特定の実施形態において、第３の免疫細胞集団は、第２の免疫細胞集団の少なくともおおよそ９，４００倍多い細胞を有してよい。特定の実施形態において、第３の免疫細胞集団は、第２の免疫細胞集団のおおよそ２，５００～９，４００倍多い細胞を有してよい。

第２の免疫細胞集団の増殖の具体例が以下の通りに記載され得るが、本願はこれに限定されない。
－ 第２の組成物中に懸濁された後に播種された第２の免疫細胞集団は、１４日間の増殖期間増殖される。
－ 第２の添加剤組成物は、増殖の開始日から４、６、８、及び１０日目に第２の容器に添加される。ここで、添加される第２の添加剤組成物は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地、３ｖｏｌ％のヒト血清、及び２，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む。より具体的には、第２の添加剤組成物は、増殖の開始日から４日目に２０ｍＬ、６日目に６０ｍＬ、８日目に１８０ｍＬ、及び１０日目に５４０ｍＬ、第２の容器に添加されてよい。
－ １４日間の増殖処理を通して、第２の免疫細胞集団から第３の免疫細胞集団が生成される。

３．
免疫細胞組成物（免疫組成物）の生成
概観
本願の免疫細胞組成物又は免疫組成物を生成するための方法は、上述の処理を通して取得される、有効成分としての免疫細胞を含む、免疫（細胞）組成物を調製する段階を備えてよい。

第２の免疫細胞集団の増殖が完了した後、増殖させた産物から第３の免疫細胞集団を入手することによって免疫（細胞）組成物が調製される。

１つの実施形態において、免疫（細胞）組成物は、有効成分としての第３の免疫細胞集団を含んでよい。別の実施形態において、免疫（細胞）組成物は、有効成分としての第３の免疫細胞集団に由来する第４の免疫細胞集団を含んでよい。

免疫細胞組成物又は免疫組成物は、有効成分としての「免疫細胞集団」を含む組成物を指す。ここで、免疫細胞集団はＴＩＬを含んでよく、本願の免疫細胞組成物（免疫組成物）は、有効成分としてＴＩＬを含んでよい。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物の生成は、増殖させた産物から第３の免疫細胞集団を入手することを含んでよい。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物の生成は、増殖させた産物から第３の免疫細胞集団を入手することに加えて、第３の免疫細胞集団から第４の免疫細胞集団を入手することをさらに含んでよい。

免疫細胞組成物の生成は、下で詳細に説明される。

第３の免疫細胞集団の取得
第３の免疫細胞集団は、増殖させた産物から入手される。第３の免疫細胞集団を入手する方法は、細胞を培養又は増殖させる処理において細胞を入手するための様々な既知の方法を含んでよいが、本願はこれに限定されない。例えば、第３の免疫細胞集団の入手は、下に記載される処理に加えて、細胞計数及び／又は細胞生存率の確認を含む、当該技術分野で従来実行されている処理をさらに含んでよいが、本願はこれに限定されない。

１つの実施形態において、免疫細胞集団の入手は、以下の処理、すなわち、第２の容器から増殖処理によって生成された免疫細胞集団を採取すること（細胞採取）を含んでよい。すなわち、第３の免疫細胞集団は、増殖させた産物から免疫細胞集団を採取することによって入手されてよい。

１つの実施形態において、第３の免疫細胞集団の入手は、以下の処理、すなわち、採取された免疫細胞集団を洗浄すること（細胞洗浄）をさらに含んでよい。

１つの実施形態において、第３の免疫細胞集団の入手は、第２の容器から増殖を通して生成された免疫細胞集団を採取することを含む。ここで、免疫細胞集団を採取する方法として、当該技術分野において知られている方法が使用されてよいが、本願はこれに限定されない。１つの実施形態において、第２の容器から免疫細胞集団を採取するために、遠心分離が用いられてよい。遠心分離は、例えば、２００ｇ、７分、室温、及びＡｃｃ９／Ｄｃｃ９の条件下で実行されてよいが、本願はこれに限定されない。

１つの実施形態において、第３の免疫細胞集団の取得は、第２の容器から増殖を通して生成された免疫細胞集団を採取することに加えて、採取された免疫細胞集団を洗浄することをさらに含んでよい。細胞の洗浄において、当該技術分野で知られている方法が使用されてよい。例えば、細胞を洗浄するために、遠心分離が用いられてよいが、本願は限定されない。ここで、免疫細胞集団の洗浄は、緩衝液で実行されてよい。ここで、緩衝液として、例えば、ＰＢＳ又はＤＰＢＳが使用されてよいが、本願はこれに限定されない。１つの実施形態において、採取された免疫細胞集団は、ＤＰＢＳで１、２、３、４、又は５回又はそれよりも多くの回数洗浄されてよい。特定の実施形態において、免疫細胞集団は、ＤＰＢＳで３回洗浄されてよい。

第３の免疫細胞集団１つの実施形態において、第３の免疫細胞集団は、第２の免疫細胞集団の少なくともおおよそ１００倍、おおよそ２００倍、おおよそ３００倍、おおよそ４００倍、おおよそ５００倍、おおよそ６００倍、おおよそ７００倍、おおよそ８００倍、おおよそ９００倍、おおよそ１，０００倍、おおよそ１，１００倍、おおよそ１，２００倍、おおよそ１，３００倍、おおよそ１，４００倍、おおよそ１，５００倍、おおよそ１，６００倍、おおよそ１，７００倍、おおよそ１，８００倍、おおよそ１，９００倍、おおよそ２，０００倍、おおよそ２，２００倍、おおよそ２，３００倍、おおよそ２，４００倍、おおよそ２，５００倍、おおよそ２，６００倍、おおよそ２，７００倍、おおよそ２，８００倍、おおよそ３，０００倍、おおよそ３，５００倍、おおよそ４，０００倍、おおよそ４，５００倍、おおよそ５，０００倍、おおよそ５，５００倍、おおよそ６，０００倍、おおよそ６，５００倍、おおよそ７，０００倍、おおよそ７，５００倍、おおよそ８，０００倍、おおよそ８，５００倍、おおよそ９，０００倍、おおよそ９，５００倍、おおよそ１０，０００倍、又はおおよそ２０，０００倍多い細胞を有してよい。

特定の実施形態において、第３の免疫細胞集団は、第２の免疫細胞集団の少なくともおおよそ２，５００倍多い細胞を有してよい。特定の実施形態において、第３の免疫細胞集団は、第２の免疫細胞集団の少なくともおおよそ９，４００倍多い細胞を有してよい。特定の実施形態において、第３の免疫細胞集団は、第２の免疫細胞集団のおおよそ２，５００から９，４００倍の細胞を有してよい。

１つの実施形態において、第３の免疫細胞集団は免疫細胞を含む。第３の免疫細胞集団は、腫瘍組織の近傍に存在するＴＩＬの培養及び／又は増殖によって入手され、それにより、免疫細胞はＴＩＬであってよい。ここで、第３の免疫細胞集団に含まれている細胞中、免疫細胞のパーセンテージは、おおよそ７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％、又はそれよりも高くてよい。特定の実施形態において、第３の免疫細胞集団に含まれている細胞中、ＴＩＬのパーセンテージは、おおよそ９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％又はそれよりも高くてよい。ここで、第３の免疫細胞集団に含まれている細胞は、生存細胞を指し得る。

１つの実施形態において、第３の免疫細胞集団はＴ細胞を含む。ここで、第３の免疫細胞集団はＴＩＬを含み、ＴＩＬはＴ細胞を含む。すなわち、第３の免疫細胞集団に含まれているＴ細胞は、ＴＩＬの一種であり得る。１つの実施形態において、第３の免疫細胞集団に含まれている細胞中、Ｔ細胞のパーセンテージは、おおよそ６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又はそれよりも高くてよい。特定の実施形態において、第３の免疫細胞集団に含まれている細胞中、Ｔ細胞のパーセンテージは、おおよそ８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又はそれよりも高くてよい。特定の実施形態において、第３の免疫細胞集団に含まれている細胞中、Ｔ細胞のパーセンテージは、おおよそ９９％又はそれよりも高くてよい。特定の実施形態において、第３の免疫細胞集団に含まれている細胞中、Ｔ細胞のパーセンテージは、おおよそ９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、又は９９．９％、又はそれよりも高くてよい。ここで、第３の免疫細胞集団に含まれている細胞は、生存細胞を指し得る。

１つの実施形態において、第３の免疫細胞集団に含まれている細胞中、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）のパーセンテージは、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１％、又はそれよりも低くてよい。特定の実施形態において、第３の免疫細胞集団に含まれている細胞中、ＮＫ細胞のパーセンテージは、１０％又はそれよりも低くてよい。特定の実施形態において、ＮＫ細胞のパーセンテージは、１％又はそれよりも低くてよい。特定の実施形態において、ＮＫ細胞のパーセンテージは、０．２％又はそれよりも低くてよい。ここで、第３の免疫細胞集団に含まれている細胞は、生存細胞を指し得る。

１つの実施形態において、第３の免疫細胞集団に含まれている細胞中、Ｂ細胞のパーセンテージは、５、４、３、２、又は１％又はそれよりも低くてよい。特定の実施形態において、Ｂ細胞のパーセンテージは、１％又はそれよりも低くてよい。特定の実施形態において、Ｂ細胞のパーセンテージは、０．２％又はそれよりも低くてよい。ここで、第３の免疫細胞集団に含まれている細胞は、生存細胞を指し得る。

任意選択で含むことができる処理：第３の免疫細胞集団からの第４の免疫細胞集団の取得
１つの実施形態において、免疫細胞組成物の生成は、第３の免疫細胞集団を入手することに加えて、第３の免疫細胞集団から第４の免疫細胞集団を入手することをさらに含んでよい。

ここで、第４の免疫細胞集団は、細胞洗浄、処理、単離、及び／又は細胞分別を通して第３の免疫細胞集団から入手されてよく、限定しないが当該技術分野で知られている方法を通して入手されてよい。例えば、第４の免疫細胞集団は、被験体に投与するのに好適であるように処理された処理済みの第３の免疫細胞集団であってよい。

細胞分別
第３の免疫細胞集団から第４の免疫細胞集団を入手することは、細胞を分別することを含んでよい。細胞分別は、細胞集団を含む組成物から所望の細胞のみを選別するために使用される方法を指す。細胞分別のために、当該技術分野で従来使用される方法が使用されてよい。例えば、蛍光活性化細胞分別（ＦＡＣＳ）、遠心分離、又は容器への細胞付着による単離等の方法が、細胞分別のために使用されてよい。

被験体への投与に好適な状態に処理された免疫細胞集団
第３の免疫細胞集団又は細胞洗浄を経た第３の免疫細胞集団の入手は、被験体（例えば、患者）への投与に好適な状態に処理されてよい。

１つの例において、入手された第３の免疫細胞集団又は洗浄を経た第３の免疫細胞集団；又はこれを分別することによって取得された免疫細胞集団は、医薬的に許容される物質で処理されてよい。例えば、免疫細胞集団は、希釈剤及び／又は賦形剤等の医薬的に許容される物質中に懸濁されてよく、患者への投与に好適な状態に処理されてよい。例えば、医薬的に許容される物質は、等張食塩水、リンガー溶液、リン酸緩衝液、又は当該技術分野で知られている非毒性の医薬的に許容される物質であってよい。

免疫細胞組成物又は免疫組成物
本願の方法によって調製された免疫（細胞）組成物は、有効成分として第３の免疫細胞集団又は第４の免疫細胞集団を含む。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物は、第３の免疫細胞集団又は第４の免疫細胞集団を含む組成物であり、被験体への投与に好適な状態に処理されてよい。すなわち、１つの実施形態において、免疫細胞組成物は、被験体への投与に好適な状態の組成物であってよい。

以下、本願の免疫細胞組成物の特性が詳細に説明される。

免疫細胞組成物の特性
上で記載されたように、免疫細胞組成物は、第３の免疫細胞集団から入手された第３の免疫細胞集団又は第４の免疫細胞集団を含んでよい。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物は、免疫細胞を含む。ここで、免疫細胞は、ＴＩＬであってよい。ここで、免疫細胞組成物に含まれている細胞中、免疫細胞のパーセンテージは、おおよそ６０、６５、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％、又はそれよりも高くてよい。特定の実施形態において、免疫細胞組成物に含まれている細胞中、ＴＩＬのパーセンテージは、おおよそ９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％又はそれよりも高くてよい。ここで、免疫細胞組成物に含まれている細胞は、生存細胞を指し得る。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物は、Ｔ細胞を含む。ここで、免疫細胞組成物はＴＩＬを含み、ＴＩＬはＴ細胞を含む。すなわち、免疫細胞組成物に含まれているＴ細胞は、ＴＩＬの一種であってよい。１つの実施形態において、免疫細胞組成物に含まれている細胞中、Ｔ細胞のパーセンテージは、おおよそ６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又はそれよりも高くてよい。特定の実施形態において、免疫細胞組成物に含まれている細胞中、Ｔ細胞のパーセンテージは、おおよそ８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％、又はそれよりも高くてよい。特定の実施形態において、免疫細胞組成物に含まれている細胞中、Ｔ細胞のパーセンテージは、おおよそ９９％又はそれよりも高くてよい。特定の実施形態において、免疫細胞組成物に含まれている細胞中、Ｔ細胞のパーセンテージは、おおよそ９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、又は９９．９％、又はそれよりも高くてよい。ここで、免疫細胞組成物に含まれている細胞は、生存細胞を指し得る。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物に含まれている細胞中、ＮＫ細胞のパーセンテージは、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１％、又はそれよりも低くてよい。特定の実施形態において、免疫細胞組成物に含まれている細胞中、ＮＫ細胞のパーセンテージは、１０％又はそれよりも低くてよい。特定の実施形態において、ＮＫ細胞のパーセンテージは、１％又はそれよりも低くてよい。特定の実施形態において、ＮＫ細胞のパーセンテージは、０．２％又はそれよりも低くてよい。ここで、免疫細胞組成物に含まれている細胞は、生存細胞を指し得る。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物に含まれている細胞中、Ｂ細胞のパーセンテージは、５、４、３、２、又は１％又はそれよりも低くてよい。特定の実施形態において、Ｂ細胞のパーセンテージは、１％又はそれよりも低くてよい。特定の実施形態において、Ｂ細胞のパーセンテージは、０．２％又はそれよりも低くてよい。ここで、免疫細胞組成物に含まれている細胞は、生存細胞を指し得る。

免疫（細胞）組成物にさらに含むことができる物質
下で説明される組み合わせ投与セクションにおけるように、第３の免疫細胞集団又は第３の免疫細胞集団から取得された第４の免疫細胞集団を含む免疫細胞組成物は、治療効果を増加させることができる物質と一緒に投与されてよい。

ここで、同時投与されることになる物質は、例えば、ＩＬ－２等のインターロイキン、及び／又は、免疫チェックポイント阻害剤であってよいが、本願はこれに限定されない。

１つの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－１の結合を阻止する物質、例えば、抗ＰＤ－Ｌ１剤又は抗ＰＤ－１剤であってよい。１つの実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ、ドスタルリマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、及びそれらの変異体から選択されるいずれか１又は複数であってよい。特定の実施形態において、免疫チェックポイント阻害剤は、ニボルマブであってよい。

同時投与することができる上記物質は、免疫細胞組成物にさらに含まれてよい。この場合、免疫細胞組成物中で同時投与することができる物質は、免疫細胞組成物の投与と同時に被験体に投与される。ここで、免疫細胞組成物に同時投与物質が含まれている場合、同時投与物質の濃度は、被験体への投与に好適な量を考慮して決定されてよい。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物は、ＩＬ－２及び免疫チェックポイント阻害剤から選択されるいずれか１又は複数をさらに含んでよい。特定の実施形態において、免疫細胞組成物は、ＩＬ－２をさらに含んでよい。特定の実施形態において、免疫細胞組成物は、ニボルマブをさらに含んでよい。

生成された免疫（細胞）組成物の使用
概観
生成された免疫細胞組成物は、それを必要とする被験体への投与において使用されてよい。１つの実施形態において、生成された免疫細胞組成物は、保管のために冷凍保存されてよい。冷凍保存された免疫細胞組成物は、解凍されて、それを必要とする被験体への投与のために使用されてよい。ここで、免疫細胞組成物を冷凍保存する期間は、これに限定されない。さらにここで、免疫細胞組成物を冷凍保存する方法は、免疫細胞組成物を冷凍保存するための当該技術分野で知られている方法であってよいが、それに限定されない。免疫細胞組成物の投与は、免疫細胞組成物が投与されない被験体に比較して、特定の医学的状態の症状又は疾患の進行を遅延させる効果を有し得る。１つの実施形態において、免疫細胞組成物は、容器に充填されて、被験体に投与されてよい。

１つの実施形態において、本願の免疫細胞組成物を生成するための方法によって生成された免疫細胞組成物又は免疫組成物を被験体に投与することを備える、被験体内の腫瘍を治療する方法が提供される。

１つの実施形態において、被験体の腫瘍を治療するための、本願の免疫細胞組成物を生成するための方法によって生成された免疫細胞組成物又は免疫組成物の使用が提供される。

免疫細胞組成物での容器の充填
第３の免疫細胞集団又は第３の免疫細胞集団からの第４の免疫細胞集団を含む免疫細胞組成物が、容器に充填されてよい。ここで、容器は、本願の方法によって増殖された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を被験体に注入するための注入容器であってよい。ここで、免疫細胞組成物は、被験体（例えば、患者）への投与に好適な量を考慮して容器に充填されてよい。ここで、患者の状態、及び免疫細胞組成物に含まれている免疫細胞の状態が考慮されてよい。

１つの実施形態において、免疫細胞は、免疫細胞の濃度が、おおよそ１Ｅ８／２００ｍＬ、２Ｅ８／２００ｍＬ、３Ｅ８／２００ｍＬ、４Ｅ８／２００ｍＬ、５Ｅ８／２００ｍＬ、６Ｅ８／２００ｍＬ、７Ｅ８／２００ｍＬ、８Ｅ８／２００ｍＬ、９Ｅ８／２００ｍＬ、１Ｅ９／２００ｍＬ、２Ｅ９／２００ｍＬ、３Ｅ９／２００ｍＬ、４Ｅ９／２００ｍＬ、５Ｅ９／２００ｍＬ、６Ｅ９／２００ｍＬ、７Ｅ９／２００ｍＬ、８Ｅ９／２００ｍＬ、９Ｅ９／２００ｍＬ、１Ｅ１０／２００ｍＬ、２Ｅ１０／２００ｍＬ、３Ｅ１０／２００ｍＬ、４Ｅ１０／２００ｍＬ、５Ｅ１０／２００ｍＬ、６Ｅ１０／２００ｍＬ、７Ｅ１０／２００ｍＬ、８Ｅ１０／２００ｍＬ、９Ｅ１０／２００ｍＬ、１Ｅ１１／２００ｍＬ、２Ｅ１１／２００ｍＬ、３Ｅ１１／２００ｍＬ、４Ｅ１１／２００ｍＬ、又は５Ｅ１１／２００ｍＬ、又はそれよりも高いように容器に充填されてよいが、本願はこれに限定されない。特定の実施形態において、免疫細胞は、免疫細胞の濃度がおおよそ１Ｅ９／２００ｍＬ又はそれよりも高いように容器に充填されてよい。特定の実施形態において、免疫細胞は、免疫細胞の濃度がおおよそ１Ｅ１０／２００ｍＬ又はそれよりも高いように容器に充填されてよい。特定の実施形態において、免疫細胞は、免疫細胞の濃度が１Ｅ１０／２００ｍＬ～１．３Ｅ１１／２００ｍＬであるように容器に充填されてよい。

投与する被験体
免疫細胞組成物は、それを必要とする被験体に投与されてよい。被験体は、腫瘍を有するヒトを含む。ここで、腫瘍は、固形腫瘍又は液性腫瘍を含み、固形腫瘍は、限定されるものではないが、乳癌、肺癌、胃癌、卵巣癌、腎臓癌、又は悪性黒色腫を含む皮膚癌を含む。液性腫瘍は、限定されるものではないが、白血病又はリンパ腫を含む血液がん、又は肺癌を有する患者の胸水を含む。特定の実施形態において、免疫細胞組成物は、乳癌を有するヒトに投与されてよい。特定の実施形態において、免疫細胞組成物は、肺癌を有するヒトに投与されてよい。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物を必要とする被験体は、Ｉ．半産物の生成において腫瘍組織を提供する被験体であってよい。例えば、被験体に由来する腫瘍試料（被験体から取得された腫瘍組織から入手された）を介して、この方法を用いて生成された免疫細胞組成物が、同じ被験体に投与し戻されてよい。

投与方法
免疫細胞組成物を、それを必要とする被験体に投与する方法は、当該技術分野で知られている方法のうちの１つであってよい。１つの実施形態において、免疫細胞組成物は、動脈内、静脈内、皮内、又は腹腔内投与されてよい。特定の実施形態において、免疫細胞組成物は、動脈内又は静脈内投与されてよい。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物は、追加の物質とともに投与されてよい。ここで、同時投与は、追加の物質の投与の前又は後における免疫細胞組成物の投与、又は追加の物質との同時の投与を含んでよい。追加の物質は、被験体のための治療効果を促進する物質として当該技術分野で知られている全ての物質を含む。１つの実施形態において、追加の物質は、ＩＬ－２、シクロホスファミド、及び／又はフルダラビンを含んでよい。追加の物質との同時投与が下で詳細に開示される。

用量
それを必要とする被験体に投与される免疫細胞組成物の用量は、治療に好適な有効量であってよい。ここで、用量は、被験体の腫瘍体積、体重、及び年齢を含むパラメータによって変わり得る。１つの実施形態において、おおよそ１Ｅ６、おおよそ１．５Ｅ６、おおよそ２Ｅ６、おおよそ２．５Ｅ６、おおよそ３Ｅ６、おおよそ３．５Ｅ６、おおよそ４Ｅ６、おおよそ４．５Ｅ６、おおよそ５Ｅ６、おおよそ５．５Ｅ６、おおよそ６Ｅ６、おおよそ６．５Ｅ６、おおよそ７Ｅ６、おおよそ７．５Ｅ６、おおよそ８Ｅ６、おおよそ８．５Ｅ６、おおよそ９Ｅ６、おおよそ９．５Ｅ６、おおよそ１Ｅ７、おおよそ１．５Ｅ７、おおよそ２Ｅ７、おおよそ２．５Ｅ７、おおよそ３Ｅ７、おおよそ３．５Ｅ７、おおよそ４Ｅ７、おおよそ４．５Ｅ７、おおよそ５Ｅ７、おおよそ５．５Ｅ７、おおよそ６Ｅ７、おおよそ６．５Ｅ７、おおよそ７Ｅ７、おおよそ７．５Ｅ７、おおよそ８Ｅ７、おおよそ８．５Ｅ７、おおよそ９Ｅ７、おおよそ９．５Ｅ７、おおよそ１Ｅ８、おおよそ１．５Ｅ８、おおよそ２Ｅ８、おおよそ２．５Ｅ８、おおよそ３Ｅ８、おおよそ３．５Ｅ８、おおよそ４Ｅ８、おおよそ４．５Ｅ８、おおよそ５Ｅ８、おおよそ５．５Ｅ８、おおよそ６Ｅ８、おおよそ６．５Ｅ８、おおよそ７Ｅ８、おおよそ７．５Ｅ８、おおよそ８Ｅ８、おおよそ８．５Ｅ８、おおよそ９Ｅ８、おおよそ９．５Ｅ８、おおよそ１Ｅ９、おおよそ１．５Ｅ９、おおよそ２Ｅ９、おおよそ２．５Ｅ９、おおよそ３Ｅ９、おおよそ３．５Ｅ９、おおよそ４Ｅ９、おおよそ４．５Ｅ９、おおよそ５Ｅ９、おおよそ５．５Ｅ９、おおよそ６Ｅ９、おおよそ６．５Ｅ９、おおよそ７Ｅ９、おおよそ７．５Ｅ９、おおよそ８Ｅ９、おおよそ８．５Ｅ９、おおよそ９Ｅ９、おおよそ９．５Ｅ９、おおよそ１Ｅ１０、おおよそ１．５Ｅ１０、おおよそ２Ｅ１０、おおよそ２．５Ｅ１０、おおよそ３Ｅ１０、おおよそ３．５Ｅ１０、おおよそ４Ｅ１０、おおよそ４．５Ｅ１０、おおよそ５Ｅ１０、おおよそ５．５Ｅ１０、おおよそ６Ｅ１０、おおよそ６．５Ｅ１０、おおよそ７Ｅ１０、おおよそ７．５Ｅ１０、おおよそ８Ｅ１０、おおよそ８．５Ｅ１０、おおよそ９Ｅ１０、おおよそ９．５Ｅ１０、おおよそ１Ｅ１１、おおよそ１．５Ｅ１１、おおよそ２Ｅ１１、おおよそ２．５Ｅ１１、おおよそ３Ｅ１１、おおよそ３．５Ｅ１１、おおよそ４Ｅ１１、おおよそ４．５Ｅ１１、おおよそ５Ｅ１１、おおよそ５．５Ｅ１１、おおよそ６Ｅ１１、おおよそ６．５Ｅ１１、おおよそ７Ｅ１１、おおよそ７．５Ｅ１１、おおよそ８Ｅ１１、おおよそ８．５Ｅ１１、おおよそ９Ｅ１１、おおよそ９．５Ｅ１１、又はおおよそ１Ｅ１２又はそれよりも多い免疫細胞を含む免疫細胞組成物が、それを必要とする被験体に、１回又は複数回投与されてよいが、本願はこれに限定されない。

組み合わせ投与
上で記載されたように、免疫細胞組成物は、追加の物質とともに投与されてよい。ここで、同時投与される追加の物質は、免疫細胞組成物の投与の前又は後に投与されるか、又は、免疫細胞組成物と同時に投与されてよい。例えば、追加の物質は、免疫細胞組成物を投与した日に投与されてよい。別の例において、追加の物質は、免疫細胞組成物を投与した日の前の日に被験体に投与されてよい。さらに別の例において、追加の物質は、免疫細胞組成物を投与した日の後の日に被験体に投与されてよい。さらに別の例において、追加の物質は、複数回投与されてよく、ここで、追加の物質は、免疫細胞組成物を投与する日と同じ日に１回投与され、免疫細胞組成物を投与した日の後の日に複数回投与されてよい。さらに、同時投与される追加の物質は、免疫細胞組成物のそれと同じ経路を介して、又は異なる経路を介して、投与されてよい。

追加の物質は、被験体のための治療効果を促進する物質として当該技術分野で知られている全ての物質を含む。１つの実施形態において、追加の物質は、ＩＬ－２、免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ、ドスタルリマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、又はデュルバルマブ等のＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１ブロッカー）、シクロホスファミド、及び／又はフルダラビンを含んでよい。

１つの実施形態において、免疫細胞組成物は、免疫チェックポイント阻害剤及び／又はＩＬ－２とともに投与されてよい。

特定の実施形態において、免疫細胞組成物は、ＩＬ－２とともに投与されてよい。ここで、被験体に投与されるＩＬ－２の量は、治療に好適な有効量であってよい。ここで、被験体に投与されるＩＬ－２の量は、被験体の腫瘍体積、体重、及び年齢を含むパラメータによって変わり得るが、本願はこれに限定されない。

１つの実施形態において、ＩＬ－２は、それを必要とする被験体に、おおよそ１Ｅ３ＩＵ、おおよそ５Ｅ３ＩＵ、おおよそ１Ｅ４ＩＵ、おおよそ５Ｅ４ＩＵ、おおよそ１Ｅ５ＩＵ、おおよそ５Ｅ５ＩＵ、おおよそ１Ｅ６ＩＵ、おおよそ５Ｅ６ＩＵ、おおよそ１Ｅ７ＩＵ、おおよそ５Ｅ７ＩＵ、おおよそ１Ｅ８ＩＵ、おおよそ５Ｅ８ＩＵ、おおよそ１Ｅ９ＩＵ、おおよそ５Ｅ９ＩＵ、おおよそ１Ｅ１０ＩＵ、おおよそ５Ｅ１０ＩＵ、おおよそ１Ｅ１１ＩＵ、おおよそ５Ｅ１１ＩＵ、おおよそ１Ｅ１２ＩＵ、おおよそ５Ｅ１２ＩＵ、おおよそ１Ｅ１３ＩＵ、おおよそ５Ｅ１３ＩＵ、おおよそ１Ｅ１４ＩＵ、おおよそ５Ｅ１４ＩＵ、おおよそ１Ｅ１５ＩＵ、又はおおよそ５Ｅ１５ＩＵ又はそれを超える量で１回又は複数回投与されてよい。

特定の実施形態において、ＩＬ－２は、それを必要とする被験体に、１回又は複数回投与され、投与当たりに７２０，０００ＩＵ／ｋｇ又はそれよりも少ない量で投与されてよい。

特定の実施形態において、ＩＬ－２は、それを必要とする被験体に、１回又は複数回投与され、投与当たりに１８Ｅ６ＩＵ／頭又はそれよりも少ない量で投与されてよい。

例えば、ＩＬ－２が静脈内投与される場合、以下の投与方法に従った投与が１回行われるか、又は複数回繰り返して行われてよい。
－ ５日間１８Ｅ６ＩＵ／日の量で投与する
－ ２～６日間休ませる（投与の中断）
－ ５日間１８Ｅ６ＩＵ／日の量で投与する
－ ３週間休ませる（投与の中断）。

別の例において、ＩＬ－２が皮下投与される場合、以下の投与方法による投与は、１回行われるか、又は複数回繰り返されてよい。
－ ５日間１８Ｅ６ＩＵ／日の量で投与する
－ ２日間休ませる（投与の中断）
－ ３週間投与する：第１週（１週目）には、１日目及び２日目に１８Ｅ６ＩＵの量で投与し；３日目、４日目、及び５日目に９Ｅ６ＩＵの量で投与し；６日目及び７日目に薬剤は投与されない。３週間のうちの第２週（２週目）及び第３週（３週目）における投与も、第１週における投与と同じである。

特定の実施形態において、ＩＬ－２は、以下の用量で投与されてよい：１日当たり２Ｅ６ＩＵ／頭の量で１４日間投与される。

本願において開示される方法の例示的な例本明細書で開示される方法の例示的な例が下に提示される。以下の例示的な例は、本願において開示される方法の容易な理解のための例示的な方法であり、本願において開示される方法の範囲は、以下の例によって限定されない。
１．
半産物（腫瘍試料から生成され取得される第１の免疫細胞集団）を生成する例示的な例
１）腫瘍試料の調製
乳癌又は肺癌を有する患者の腫瘍組織が医療機関から入手される。腫瘍組織は、抗生物質を含まないＲＰＭＩ１６４０培地を使用して３回洗浄される。洗浄された腫瘍組織から脂質組織が除去される。脂肪組織が除去された腫瘍組織は、おおよそ１ｍｍ^２～おおよそ２ｍｍ^２の断面積を有するように切断され、それによって腫瘍試料を調製する。
２）第１の免疫細胞集団の生成
腫瘍試料の２４の断片が、おおよそ３ｖｏｌ％のヒトＡＢ血清及びおおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含むＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地とともにＴ７５フラスコ内に配置されて（第１の組成物、合計おおよそ６ｍＬ）、３７℃、５％ＣＯ_２環境において１４日間培養される。ここで、培養中、おおよそ３ｖｏｌ％のヒトＡＢ血清及びおおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含むＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地（添加される第１の添加剤組成物、合計おおよそ３ｍＬ）が、培養の開始日から７、１０、及び１２日目に、Ｔ７５フラスコに添加される。
３）第１の免疫細胞集団の入手
４０μｍのメッシュポアを有するセルストレーナーを使用して、培養された組成物から腫瘍組織の断片が濾過される。培養された免疫細胞集団を、ＤＰＢＳを使用して３回洗浄することによって、第１の免疫細胞集団が取得される。
４）第１の免疫細胞集団の冷凍保存
第１の免疫細胞集団は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０を使用しておおよそ２Ｅ６細胞／ｍＬの濃度で懸濁され、クライオバイアルに１ｍＬ添加され、続いて、おおよそ－１９０℃又はそれよりも低い温度にてガス状液体窒素（ＬＮ２）中で保管される。
２．
冷凍保存された半産物から最終産物（第３の免疫細胞集団を取得することによって生成される免疫細胞組成物）を生成する例示的な例
１）冷凍保存された第１の免疫細胞集団の解凍
冷凍保存された第１の免疫細胞集団は、おおよそ２分間おおよそ３７℃の水浴で解凍される。
２）第２の免疫細胞集団の播種
第１の免疫細胞集団から分割された第２の免疫細胞集団、及び、おおよそ３ｖｏｌ％のヒトＡＢ血清、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、おおよそ３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３、及びおおよそ１：２００（ＴＩＬ：ＰＢＭＣ）の第２の免疫細胞集団（ＴＩＬ）との比を有する照射ＰＢＭＣ（第２の組成物、合計おおよそ２０ｍＬ）を含むＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地が、ＧＲＥＸ－１００Ｍに播種される。ここで、播種は、ＧＲＥＸ－１００Ｍ内におおよそ４Ｅ５の免疫細胞を含むように実行される。
３）第２の免疫細胞集団の増殖
増殖中、おおよそ３ｖｏｌ％のヒトＡＢ血清及びおおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含むＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地（添加される第２の添加剤組成物）が、増殖の開始日から４日目に２０ｍＬ、６日目に６０ｍＬ、８日目に１８０ｍＬ、及び１０日目に５４０ｍＬ、ＧＲＥＸ－１００Ｍに添加される。ここで、増殖は１４日間行われ、この期間中、第２の免疫細胞集団は、新たな容器に移植されず、又は、外部から新たな免疫細胞が添加されない。増殖期間中、第２の免疫細胞が２，５００倍又はそれよりも多く増殖される。
４）免疫細胞組成物の生成
上述の処理を通して増殖された免疫細胞集団を含む組成物が遠心分離されて第３の免疫細胞集団を取得し、それによって免疫細胞組成物を生成する。
３．
冷凍保存を通して最終産物（第３の免疫細胞集団を取得することによって生成される免疫細胞組成物）を生成する例示的な例
１）免疫細胞組成物を生成するための試料の取得
乳癌又は肺癌を有する患者の腫瘍組織が医療機関から入手される。腫瘍組織は、抗生物質を含まないＲＰＭＩ１６４０培地を使用して３回洗浄される。洗浄された腫瘍組織から脂質組織が除去される。脂肪組織が除去された腫瘍組織は、おおよそ１ｍｍ^２～おおよそ２ｍｍ^２の断面積を有するように切断され、それによって腫瘍試料を調製する。
２）第１の免疫細胞集団の生成
腫瘍試料の２４の断片が、おおよそ３ｖｏｌ％のヒトＡＢ血清及びおおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含むＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地とともにＴ７５フラスコ内に配置されて（第１の組成物、合計おおよそ６ｍＬ）、３７℃、５％ＣＯ_２環境において１４日間培養される。ここで、培養中、おおよそ３ｖｏｌ％のヒトＡＢ血清及びおおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含むＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地（添加される第１の添加剤組成物、合計おおよそ３ｍＬ）が、培養の開始日から７、１０、及び１２日目に、Ｔ７５フラスコに添加される。
３）第１の免疫細胞集団の取得
４０μｍのメッシュポアを有するセルストレーナーを使用して、腫瘍組織の断片が培養組成物から濾過される。培養された免疫細胞集団を、ＤＰＢＳを使用して３回洗浄することによって、第１の免疫細胞集団が取得される。
４）第１の免疫細胞集団の冷凍保存
第１の免疫細胞集団は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０を使用しておおよそ２Ｅ６細胞／ｍＬの濃度で懸濁され、クライオバイアルに１ｍＬ添加され、続いて、おおよそ－１９０℃又はそれよりも低い温度にてガス状液体窒素（ＬＮ２）中で保管される。
５）冷凍保存された第１の免疫細胞集団の解凍
冷凍保存された第１の免疫細胞集団は、おおよそ２分間おおよそ３７℃の水浴で解凍される。
６）第２の免疫細胞集団の播種
第１の免疫細胞集団から分割された第２の免疫細胞集団、及び、おおよそ３ｖｏｌ％のヒトＡＢ血清、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、おおよそ３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３、及びおおよそ１：２００（ＴＩＬ：ＰＢＭＣ）の第２の免疫細胞集団（ＴＩＬ）との比を有する照射ＰＢＭＣを含むＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地（第２の組成物、合計おおよそ２０ｍＬ）が、ＧＲＥＸ－１００Ｍに播種される。ここで、播種は、ＧＲＥＸ－１００Ｍ内におおよそ４Ｅ５の免疫細胞を含むように実行される。
７）第２の免疫細胞集団の増殖
増殖中、おおよそ３ｖｏｌ％のヒトＡＢ血清及びおおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含むＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地（添加される第２の添加剤組成物）が、増殖の開始日から４日目に２０ｍＬ、６日目に６０ｍＬ、８日目に１８０ｍＬ、及び１０日目に５４０ｍＬ、ＧＲＥＸ－１００Ｍに添加される。ここで、増殖は１４日間行われ、この期間中、第２の免疫細胞集団は、新たな容器に移植されず、又は、外部から新たな免疫細胞が添加されない。増殖期間中、第２の免疫細胞が２，５００倍又はそれよりも多く増殖される。
８）免疫細胞組成物の生成
上述の処理を通して増殖された免疫細胞集団を含む組成物が遠心分離されて第３の免疫細胞集団を取得し、それによって免疫細胞組成物を生成する。
４．
冷凍保存することなく最終産物（第３の免疫細胞集団を取得することによって生成される免疫細胞組成物）を生成する例示的な例
１）免疫細胞組成物を生成するための試料の取得
乳癌又は肺癌を有する患者の腫瘍組織が医療機関から入手される。腫瘍組織は、抗生物質を含まないＲＰＭＩ１６４０培地を使用して３回洗浄される。洗浄された腫瘍組織から脂質組織が除去される。脂肪組織が除去された腫瘍組織は、おおよそ１ｍｍ^２～おおよそ２ｍｍ^２の断面積を有するように切断され、それによって腫瘍試料を調製する。
２）第１の免疫細胞集団の生成
腫瘍試料の２４の断片が、おおよそ３ｖｏｌ％のヒトＡＢ血清及びおおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含むＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地とともにＴ７５フラスコ内に配置されて（第１の組成物、合計おおよそ６ｍＬ）、３７℃、５％ＣＯ_２環境において１４日間培養される。ここで、培養中、おおよそ３ｖｏｌ％のヒトＡＢ血清及びおおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含むＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地（添加される第１の添加剤組成物、合計おおよそ３ｍＬ）が、培養の開始日から７、１０、及び１２日目に、Ｔ７５フラスコに添加される。
３）第１の免疫細胞集団の取得
４０μｍのメッシュポアを有するセルストレーナーを使用して、腫瘍組織の断片が培養組成物から濾過される。第１の免疫細胞集団は、３回培養された免疫細胞集団を、ＤＰＢＳを使用して洗浄することによって取得される。
４）第２の免疫細胞集団の播種
第１の免疫細胞集団から分割された第２の免疫細胞集団、及び、おおよそ３ｖｏｌ％のヒトＡＢ血清、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、おおよそ３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３、及びおおよそ１：２００（ＴＩＬ：ＰＢＭＣ）の第２の免疫細胞集団（ＴＩＬ）との比を有する照射ＰＢＭＣを含むＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地（第２の組成物、合計おおよそ２０ｍＬ）が、ＧＲＥＸ－１００Ｍに播種される。ここで、播種は、ＧＲＥＸ－１００Ｍ内におおよそ４Ｅ５の免疫細胞を含むように実行される。
５）第２の免疫細胞集団の増殖
増殖中、おおよそ３ｖｏｌ％のヒトＡＢ血清及びおおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含むＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地（添加される第２の添加剤組成物）が、増殖の開始日から４日目に２０ｍＬ、６日目に６０ｍＬ、８日目に１８０ｍＬ、及び１０日目に５４０ｍＬ、ＧＲＥＸ－１００Ｍに添加される。ここで、増殖は１４日間行われ、この期間中、第２の免疫細胞集団は、新たな容器に移植されず、又は、外部から新たな免疫細胞が添加されない。増殖期間中、第２の免疫細胞が２，５００倍又はそれよりも多く増殖される。
６）免疫細胞組成物の生成
上述の処理を通して増殖された免疫細胞集団を含む組成物が遠心分離されて第３の免疫細胞集団を取得し、それによって免疫細胞組成物を生成する。

本願によって提供される方法の例示的な実施形態以下、本願によって提供される方法の例示的な実施形態が開示される。以下の例示的な実施形態は、本願において開示された方法を容易に理解するために提供されており、本願において開示される本発明の範囲は、以下の例に限定されない。
ＰＲ０１．

第１の免疫細胞集団を生成するための方法は、以下を備える：
（ａ）第１の容器内で腫瘍試料を培養する段階、
ここで、腫瘍試料は、第１の容器内の第１の組成物中で培養され、第１の組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２を含み、
第１の容器は、ガス透過性容器、又はガス供給システムを有する容器であり、
培養は、７～２１日間行され、
培養中、第１の容器に第１の添加剤組成物が１回又は２回又はそれよりも多い回数添加される；及び
（ｂ）（ａ）において培養された組成物から第１の免疫細胞集団を入手する段階。
ＰＲ０２．

方法が腫瘍試料を調製する段階をさらに備える、ＰＲ０１による方法。
ＰＲ０３．

腫瘍試料は、被験体から入手された腫瘍断片から入手され、腫瘍試料は、おおよそ１ｍｍ^２～４ｍｍ^２の断面積を有する、ＰＲ０１及びＰＲ０２のいずれか１つによる方法。
ＰＲ０４

（ａ）において１２～２４の腫瘍試料が培養される、ＰＲ０１～ＰＲ０４のいずれか１つによる方法。
ＰＲ０５．

血清は、ヒト血清である、ＰＲ０１～ＰＲ０４いずれか１つによる方法。
ＰＲ０６．

第１の組成物中の血清の濃度は、５ｖｏｌ％又はそれよりも低い、ＰＲ０１～ＰＲ０４のいずれか１つによる方法。
ＰＲ０７．

第１の組成物中の血清の濃度は、おおよそ３ｖｏｌ％である、ＰＲ０１～ＰＲ０４のいずれか１つによる方法。
ＰＲ０８．

第１の組成物中の培地は、ＡＩＭ－Ｖ培地である、ＰＲ０１～ＰＲ０７のいずれか１つによる方法。
ＰＲ０９．

第１の組成物中の培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地である、ＰＲ０１～ＰＲ０７のいずれか１つによる方法。
ＰＲ１０．

第１の組成物中のＩＬ－２の濃度は、５００ＩＵ／ｍＬ～３，０００ＩＵ／ｍＬである、ＰＲ０１～ＰＲ０９のいずれか１つによる方法。
ＰＲ１１．

第１の組成物のＩＬ－２の濃度は、おおよそ１，０００ＩＵ／ｍＬである、ＰＲ０１～ＰＲ０９のいずれか１つによる方法。
ＰＲ１２．

第１の容器は、Ｔ７５フラスコである、ＰＲ０１～ＰＲ１１のいずれか１つによる方法。
ＰＲ１３．

第１の組成物の体積は第１の容器の最大許容可能容量の３０％又はそれよりも小さい、ＰＲ０１～ＰＲ１２のいずれか１つによる方法。
ＰＲ１４．

第１の容器がＴ７５フラスコである場合、第１の組成物の体積は６ｍＬである、ＰＲ０１～ＰＲ１２のいずれか１つによる方法。
ＰＲ１５．

第１の添加剤組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２を含む、ＰＲ０１～ＰＲ１４のいずれか１つによる方法。
ＰＲ１６．

第１の添加剤組成物は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地、３ｖｏｌ％の血清、及び１，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む、ＰＲ０１～ＰＲ１４のいずれか１つによる方法。
ＰＲ１７．

第１の添加剤組成物は、第１の組成物と同じ組成物質及び組成比を有する、ＰＲ０１～ＰＲ１４のいずれか１つによる方法。
ＰＲ１８．

培養中、第１の添加剤組成物は、第１の容器に２回又はそれよりも多い回数添加される、ＰＲ０１～ＰＲ１７のいずれか１つによる方法。
ＰＲ１９．

培養中、第１の添加剤組成物は、培養の開始日から７、１０、及び１２日目に第１の容器に添加され、添加される第１の添加剤組成物の量は、各添加時間において同じである、ＰＲ０１～ＰＲ１７のいずれか１つによる方法。
ＰＲ２０．

培養中、第１の添加剤組成物は、培養の開始日から７日目に３ｍＬ、１０日目に３ｍＬ、及び１２日目に３ｍＬ、第１の容器に添加されてよい、ＰＲ０１～ＰＲ１７のいずれか１つによる方法。
ＰＲ２１．

培養は、１３～１５日間行われる、ＰＲ０１～ＰＲ２０のいずれか１つによる方法。
ＰＲ２２．

培養は、１４日間行われる、ＰＲ０１～ＰＲ２１のいずれか１つによる方法。
Ｆ０１．

ＰＲ０１～ＰＲ２２のいずれか１つによって生成された第１の免疫細胞集団を冷凍保存する段階
を備える、第１の免疫細胞集団を冷凍保存する方法。
Ｔ０１．

Ｆ０１による冷凍保存された第１の免疫細胞集団を解凍する段階を備える、冷凍保存された第１の免疫細胞集団を解凍する方法。
Ｒ０１．

以下を備える、免疫細胞組成物を生成するための方法：
（ａ）第２の容器内に第２の組成物及び第２の免疫細胞集団を播種する段階、
ここで、第２の免疫細胞集団は、第１の免疫細胞集団に由来し、
第２の組成物は、培地、血清、１，０００ＩＵ／ｍＬ～３，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体、及びフィーダー細胞を含み、
第２の容器は、ガス透過性容器、又はガス供給システムを有する容器である；
（ｂ）第２の免疫細胞集団を増殖させて、第３の免疫細胞集団を生成する段階、
ここで、増殖中、第２の添加剤組成物は、第２の容器に１回又は２回又はそれよりも多い回数添加され、
増殖は、７～２１日間行われる；及び
（ｃ）（ｂ）において入手された増殖させた産物から第３の免疫細胞集団を入手する段階、及び、免疫細胞組成物を生成する段階、
ここで、第３の免疫細胞集団は、第２の免疫細胞集団の少なくとも２５００倍多い細胞を有する。
Ｒ０２．

第１の免疫細胞集団は、ＰＲ０１～ＰＲ２２のいずれか１つによって生成された免疫細胞集団、又はＴ０１によって解凍された免疫細胞集団である、Ｒ０１による方法。
Ｒ０３．

第２の組成物中の培地は、ＡＩＭ－Ｖ培地である、Ｒ０１及びＲ０２のいずれか１つによる方法。
Ｒ０４．

第２の組成物中の血清は、ヒト血清である、Ｒ０１～Ｒ０３のいずれか１つによる方法。
Ｒ０５．

第２の組成物中の血清の濃度は、５ｖｏｌ％又はそれよりも低い、Ｒ０１～Ｒ０３のいずれか１つによる方法。
Ｒ０６．

第２の組成物中の血清の濃度は、おおよそ３ｖｏｌ％である、Ｒ０１～Ｒ０３のいずれか１つによる方法。
Ｒ０７．

第２の組成物中のＩＬ－２の濃度は、おおよそ２，０００ＩＵ／ｍＬである、Ｒ０１～Ｒ０６のいずれか１つによる方法。
Ｒ０８．

抗ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ３である、Ｒ０１～Ｒ０７のいずれか１つによる方法。
Ｒ０９．

第２の組成物中の抗ＣＤ３抗体の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬである、Ｒ０１～Ｒ０８のいずれか１つによる方法。
Ｒ１０．

第２の組成物中の抗ＣＤ３抗体の濃度は、おおよそ３０ｎｇ／ｍＬである、Ｒ０１～Ｒ０８のいずれか１つによる方法。
Ｒ１１．

フィーダー細胞は、同種異系ＰＢＭＣである、Ｒ０１～Ｒ１０のいずれか１つによる方法。
Ｒ１２．

フィーダー細胞は、不活性化同種異系ＰＢＭＣである、Ｒ０１～Ｒ１０のいずれか１つによる方法。
Ｒ１３．

フィーダー細胞は、第２の免疫細胞集団の細胞数に基づいて、フィーダー細胞の数の比がおおよそ１：２００（第２の免疫細胞集団の細胞数：フィーダー細胞）であるように第２の組成物を含む、Ｒ０１～Ｒ１２のいずれか１つによる方法。
Ｒ１４．

播種中、第２の容器に播種される第２の免疫細胞集団の細胞数は、１Ｅ５～１０Ｅ５である、Ｒ０１～Ｒ１３のいずれか１つによる方法。
Ｒ１５．

播種中、第２の容器に播種される第２の免疫細胞集団の細胞数は、おおよそ４Ｅ５である、Ｒ０１～Ｒ１３のいずれか１つによる方法。
Ｒ１６．

第２の容器は、ＧＲＥＸ１００Ｍである、Ｒ０１～Ｒ１５のいずれか１つによる方法。
Ｒ１７．

第２の組成物の容積は、第２の容器の最大許容可能容量の３０％又はそれよりも小さい、Ｒ０１～Ｒ１６のいずれか１つによる方法。
Ｒ１８．

第２の容器はＧＲＥＸ１００Ｍである場合、第２の組成物の容積は、おおよそ２０ｍＬである、Ｒ０１～Ｒ１６のいずれか１つによる方法。
Ｒ１９．

増殖中、免疫細胞は、第２の容器から除去されない、又は外部から添加されない、Ｒ０１～Ｒ１８のいずれか１つによる方法。
Ｒ２０．

増殖は、１３～１５日間行われる、Ｒ０１～Ｒ１９のいずれか１つによる方法。
Ｒ２１．

増殖は、１４日間行われる、Ｒ０１～Ｒ１９のいずれか１つによる方法。
Ｒ２２．

第２の添加剤組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２を含む、Ｒ０１～Ｒ２１のいずれか１つによる方法。
Ｒ２３．

第２の添加剤組成物は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地、３ｖｏｌ％の血清、２，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含む、Ｒ０１～Ｒ２１のいずれか１つによる方法。
Ｒ２４．

第２の添加剤組成物は、抗ＣＤ３抗体及びフィーダー細胞を除いて、第２の組成物と同じ組成物質及び組成比を有する、Ｒ０１～Ｒ２１のいずれか１つによる方法。
Ｒ２５．

第２の添加剤組成物は、第２の容器に２回又はそれよりも多い回数添加される、Ｒ０１～Ｒ２４のいずれか１つによる方法。
Ｒ２６．

第２の添加剤組成物は、第２の容器に２回又はそれよりも多い回数添加され、添加される第２の添加剤組成物の量は、各添加時間において異なる、Ｒ０１～Ｒ２４のいずれか１つによる方法。
Ｒ２７．

第２の添加剤組成物は、増殖の開始日から４、６、８、及び１０日目に第２の容器に添加され、添加される第２の添加剤組成物の量は、各添加時間において異なる、Ｒ０１～Ｒ２４のいずれか１つによる方法。
Ｒ２８．

第２の添加剤組成物は、増殖の開始日から４日目に２０ｍＬ、６日目に６０ｍＬ、８日目に１８０ｍＬ、及び１０日目に５４０ｍＬ、第２の容器に添加される、Ｒ０１～Ｒ２４のいずれか１つによる方法。
Ｒ２９．

第３の免疫細胞集団は、第２の免疫細胞集団の少なくとも４０００倍多い細胞を有する、Ｒ０１～Ｒ２８のいずれか１つによる方法。
Ｒ３０．

免疫細胞組成物は、第３の免疫細胞集団を含む、Ｒ０１～Ｒ２９のいずれか１つによる方法。
Ｒ３１．

免疫細胞組成物は、第３の免疫細胞集団から入手された第４の免疫細胞集団を含む、Ｒ０１～Ｒ２９のいずれか１つによる方法。
Ｒ３２．

方法は、免疫細胞の遺伝子を操作する段階をさらに備える、Ｒ０１～Ｒ２９のいずれか１つによる方法。
Ｒ３３．

免疫細胞の遺伝子を操作する段階は、第１の容器内での腫瘍試料の培養中又はその前に行われる、Ｒ３２による方法。
Ｒ３４．

免疫細胞の遺伝子を操作する段階は、第２の容器内への第２の組成物及び第２の免疫細胞集団の播種中又はその前に行われる、Ｒ３２による方法。
Ｒ３５．

免疫細胞の遺伝子を操作する段階は、免疫細胞に導入遺伝子を導入する段階を含む、Ｒ３２による方法。
Ｒ３６．

免疫細胞の遺伝子を操作する段階は、免疫細胞にｍＲＮＡを導入する段階を含む、Ｒ３２による方法。
Ｒ３７．

免疫細胞の遺伝子を操作する段階は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムを用いて免疫細胞の遺伝子を操作する段階を含む、Ｒ３２による方法。
Ｒ３８．

免疫細胞の遺伝子を操作する段階は、トランスポゾンによって免疫細胞の遺伝子を操作する段階を含む、Ｒ３２による方法。
Ｒ３９．

免疫細胞の遺伝子を操作する段階は、ｓｉＲＮＡ又はアンチセンスオリゴヌクレオチドによって遺伝子の発現を低下させることを含む、Ｒ３２による方法。
Ｃ０１．

Ｒ０１～Ｒ３９によって生成される、ＴＩＬを含む免疫細胞組成物。
Ｃ０２．

免疫細胞組成物は、ＩＬ－２をさらに含む、Ｃ０１による免疫細胞組成物。
Ｃ０３．

免疫細胞組成物は、免疫チェックポイント阻害剤をさらに含む、Ｃ０１及びＣ０２のいずれか１つによる免疫細胞組成物。
Ｃ０４．

免疫細胞組成物は、ニボルマブをさらに含む、Ｃ０１及びＣ０２のいずれか１つによる免疫細胞組成物。
Ｕ０１．

被験体の腫瘍を治療するための、Ｒ０１～Ｒ３９に従って生成された、ＴＩＬを含む免疫細胞組成物の使用。
Ｕ０２．

被験体は、腫瘍浸潤リンパ球がそれに由来する被験体である、Ｕ０１による使用。
ＴＭ０１．

Ｒ０１～Ｒ３９に従って生成されたＴＩＬを含む免疫細胞組成物を被験体に投与する段階を備える、被験体の腫瘍を治療する方法。
ＴＭ０２．

被験体は、ＴＩＬ由来の被験体である、ＴＭ０１による方法。
ＴＭ０３．

方法は、ＩＬ－２を投与する段階をさらに備える、ＴＭ０１及びＴＭ０２のいずれか１つによる方法。
ＴＭ０４．

方法は、免疫チェックポイント阻害剤を投与する段階をさらに備える、ＴＭ０１～ＴＭ０３のいずれか１つによる方法。
ＴＭ０５．

方法は、ニボルマブを投与する段階をさらに備える、ＴＭ０１～ＴＭ０３のいずれか１つによる方法。

本願において開示される免疫細胞組成物を生成するための方法の特性
ＩＬ－２濃度
一般に、ＴＩＬを含む免疫細胞組成物の生成において、ＴＩＬ培養のための培地に、高濃度（例えば、６，０００ＩＵ／ｍＬ）のＩＬ－２が添加される。しかしながら、本明細書において開示される方法は、培養において、より低い濃度のＩＬ－２を含む第１の組成物を使用する。本発明者らは、ＴＩＬを含む免疫細胞集団の培養のためには、より低い濃度のＩＬ－２が添加された組成物の使用で十分であることを、実験を通して証明した（実験例３を参照）。

さらに、培養のための組成物に加えて、一般に、高濃度（例えば、３，０００ＩＵ／ｍＬ）のＩＬ－２が増殖のための組成物に添加される。しかしながら、本明細書において開示される増殖のための第２の組成物は、より低い濃度のＩＬ－２を含んでよい。本願の発明者らは、ＴＩＬを含む免疫細胞集団の増殖のためには、低濃度のＩＬ－２が添加された組成物の使用が十分であることを、実験を通して証明した（実験例３を参照）。

結論として、低濃度のＩＬ－２を用いて、ＴＩＬを含む免疫細胞集団を十分に培養及び増殖させることができる有効な処理が確立される点において、上記は重要である。

培養及び／又は増殖組成物
１）初期培養のための組成物及び／又は増殖のための組成物の量
一般に、ＴＩＬを含む細胞の培養及び／又は増殖において、培養及び／又は増殖のための組成物の量は、培養及び／又は増殖がその中で起こる容器によって変わる。さらに、ここで、培養及び／又は増殖のための組成物の決定される量は、一般に、容器の最大許容可能容量によって決定される。しかしながら、本明細書において開示される方法において、培養のための組成物（例えば、第１の組成物）及び／又は増殖のための組成物（例えば、第２の組成物）の量は、細胞培養及び／又は増殖の開始において容器の最大許容可能容量よりも少ない。すなわち、培養及び／又は増殖のための組成物の量は、容器の最大許容可能容量よりも少なく設定され、したがって、細胞濃度は、培養及び／又は増殖のために最適であるように調節され、続いて、培養及び／又は増殖が開始される。組成物中の細胞の最適な濃度は、細胞間の相互作用にプラスの効果を有し得、したがって、細胞培養及び／又は増殖の効率を高める役割を果たす。実験例４及び図８を参照すると、２４ウェルプレートを用いて組成物の量を変えることによって細胞が培養された場合、１ｍＬが添加されたときに、細胞数がより高かったことを確認できる。これによれば、それは、組成物中の細胞の濃度の最適化を通して、細胞培養及び／又は増殖の効率をさらに高めることができることを意味する。

２）第１の添加剤組成物及び／又は第２の添加剤組成物の添加
一般に、ＴＩＬを含む免疫細胞組成物の生成において、ＴＩＬの培養及び増殖中、培養及び／又は増殖組成物が置換される。しかしながら、本願において開示される方法によれば、ＴＩＬを含む免疫細胞集団を培養及び増殖させる処理において、培養又は増殖のための組成物は置換されず、培養及び増殖において添加することによって添加されるだけである。これには２つの利点がある。

第１に、複雑なＴＩＬ培養又は増殖の処理中にＴＩＬに加えられる可能性があるストレスを最小限に抑えながら、ＴＩＬ培養又は増殖に必要な物質を供給することができる。さらに、培養及び／又は増殖組成物の置換において生じる可能性がある免疫細胞集団の損失を防止することも可能である。

第２に、組成物の添加を通して、組成物中で培養及び／又は増殖される細胞の濃度は、培養及び／又は増殖のために有効な最適濃度として継続的に維持されてよい。これは、細胞培養及び／又は増殖環境が、培養及び／又は増殖のために最適化された環境として継続的に維持され、これを通して、免疫細胞組成物をより高い収率で生成することができることを意味する。

結論として、培養及び／又は増殖時に組成物の量を調節することによって、組成物中の細胞の濃度が最適化され、さらに、培養及び／又は増殖中に培養及び／又は増殖組成物を添加することによって、組成物中の細胞の最適な濃度が維持される。さらに、この処理中、組成物が置換ではなく添加されるので、ＴＩＬを含む免疫細胞組成物は、より効率的にかつより高い収率で生成され得る。

増殖効率
一般に、ＴＩＬを含む免疫細胞の増殖中、ＴＩＬは、おおよそ１００から１，０００倍増殖される。しかしながら、本願において開示される方法において、増殖中、ＴＩＬは、平均でおおよそ２，５００倍又はそれよりも多く増殖される。本願において、他の一般的な処理と比較して、増殖のための組成物は、より低いＩＬ－２濃度を有し、また、おおよそ２，５００倍又はそれを超える高い増殖率を有する。これは、他の処理よりも少量の添加剤を用いてより高い増殖率を有する効率的な免疫細胞生成方法を発明者らが確立したことを示し、これは、実験例２及び図５に示されている。

冷凍保存期間
本願において開示される免疫細胞組成物を生成する方法によれば、第１の免疫細胞集団は、取得され、次に、特定の期間又はそれよりも長く保管されるように冷凍保存されてよく、冷凍保存された第１の免疫細胞集団は、必要なときに解凍した後に増殖されてよく、免疫細胞組成物を生成するために使用されてよい。ここで、一例として、第１の免疫細胞集団は、冷凍保存されて、おおよそ１、２、３、４、又は５年又はそれよりも長く保管されて、その後、免疫細胞組成物を生成するために増殖されて使用されてよい。別の例として、第１の免疫細胞集団は、短期間冷凍保存されて、解凍され、その後、免疫細胞組成物を生成するために使用されてよい。したがって、本願において開示される方法によって取得された第１の免疫細胞は、状況に応じて短期又は長期の冷凍保存後に、増殖のために使用できることが非常に重要である。例えば、半産物の生成及び最終産物の生成が異なる場所、又は異なる会社で実行される場合、第１の免疫細胞集団は、冷凍保存の後で別の場所に移送されてよい。さらに、例えば、患者のがんが再発又は転移した場合、以前に冷凍保存された第１の免疫細胞集団が、患者の治療のために解凍され、増殖され、及び使用されてよい。
［実験例］

本願において提供される本発明は、下の実験例及び実施例を参照しながらさらに詳細に記載される。これらの実施例は、本願において開示される内容を単に示すために提供されているものであり、本願において開示される内容の範囲はこれらの実施例によって限定されるものと解釈されるものではないことが当業者には明らかである。

表１．試薬情報
実験例１．ＴＩＬ生成
実験例１－１．
ＴＩＬ単離／培養処理
１．ＴＩＬ単離／培養処理
－ ０日目
病院の手術室から移動させた腫瘍組織を、ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて３回洗浄し、１００ｍｍペトリ皿に移した。殺菌された外科手術用はさみ及びピンセットを用いて、腫瘍組織中の脂質組織を除去し、殺菌された外科手術用はさみ及びピンセットを用いて、腫瘍組織を１～２ｍｍのサイズに切断した。１～２ｍｍのサイズに切断された腫瘍組織の２４の断片を、Ｔ７５フラスコ内に置き、６ｍＬの調製培養組成物を添加し、続いて、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で７日間培養した。

培養組成物の構成は、次の通りである：ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地、３ｖｏｌ％のヒト血清、及び１，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２。
－ ７日目
３ｍＬの調製培養組成物を各フラスコに添加し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で３日間培養した。
－ １０日目
３ｍＬの調製培養組成物を各フラスコに添加し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で２日間培養した。
－ １２日目
３ｍＬの調製培養組成物を各フラスコに添加し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において２日間３７℃で培養した。
－ １４日目
細胞を採取するために、５０ｍＬチューブの上部に４０μｍセルストレーナーを設置した。１０ｍＬピペットを用いて培養細胞をセルストレーナーに通すことによって腫瘍組織を濾過し、培養細胞のみを５０ｍＬコニカルチューブに採取し、次に、室温にて４５０ｇで５分間遠心分離した。沈殿した細胞に５ｍＬのＤＰＢＳを添加し、次に、これをピペッティングすることによって懸濁した。懸濁した細胞を計数し、血球計数器（Ｃ－ｃｈｉｐ）を用いて細胞生存率を求めた。４５０ｇでの５分間の遠心分離後、細胞を２Ｅ６細胞／ｍＬでＣｒｙｏ－ｓｔｏｒ ＣＳ１０に懸濁し、クライオバイアルに１ｍＬ充填し、液体窒素タンク（ＬＮ_２）又はガス状液体窒素タンク（ＬＮ_２）において保管した。

実験例１－２．ＴＩＬ増殖処理
１．
アロフィーダー（ａｌｌｏ－ｆｅｅｄｅｒ）ＰＢＭＣの単離
－ 健康なボランティアに対する白血球除去及び照射
病院の採血室における白血球除去装置を用いて、健康なボランティアからの血液バッグに対して、白血球除去を行った。白血球除去を行った血液バッグを、Ｘ線を照射することによって不活性化した。
照射血液バッグからのＰＢＭＣの単離白血球除去を受けた照射血液を１：２の比でＤＰＢＳと混合した。１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ溶液を５０ｍＬチューブに添加した後、３０ｍＬの血液混合物を、Ｆｉｃｏｌｌと混合することなくＦｉｃｏｌｌ層上に重ねて、Ａｃｃ９／Ｄｃｃ０の条件下で室温にて８００ｇで２０分間遠心分離した。分離されたＰＢＭＣ層を採取して、次に、新たな５０ｍＬチューブに移した。洗浄のために、ＰＢＭＣ層を移した５０ｍＬチューブにＤＰＢＳを添加し、次に、遠心分離を室温にて８００ｇで５分間行った。遠心分離後、上清を完全に除去し、沈殿したＰＢＭＣを、最終産物を培養するための５０ｍＬの培地に懸濁した。血球計数器セットを用いて、懸濁した細胞を計数し、細胞生存率を求めた。細胞計数の後、３．２Ｅ９のＰＢＭＣを調製した。
２．
最終産物の生成
－ ０日目（細胞播種）
液体窒素タンク（ＬＮ_２）内に保管した半産物の１１のバイアルを３７℃の水浴にて２分間解凍した。解凍された細胞をＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地で洗浄し、室温にて１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を破棄した後、結果として得られるペレットをＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ増殖組成物中に懸濁し、血球計数器セットを用いて細胞を計数し、細胞生存率を求めた。細胞計数の後、１．６Ｅ７細胞を調製した。４Ｅ５の半産物ＴＩＬ及び８Ｅ７の照射ＰＢＭＣを４０のＧＲＥＸ１００Ｍ（１Ｌ）培養容器のそれぞれの中に置き、最終産物増殖組成物を２０ｍＬ添加した。結果として得られる細胞混合物を５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で培養した。

最終産物増殖組成物の構成は、次の通りである：ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地、３％のヒト血清、２，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、及び３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３
－ ４日目
ＩＬ－２及び細分されたヒト血清をそれぞれ２，０００ＩＵ／ｍＬ及び３％までＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地に添加し、それによって添加剤組成物を必要な量で調製した。２０ｍＬの調製添加剤組成物を各ＧＲＥＸフラスコ内にさらに分注し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で培養した。
－ ６日目
ＩＬ－２及び細分されたヒト血清をそれぞれ２，０００ＩＵ／ｍＬ及び３％までＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地に添加し、それによって添加剤組成物を必要な量で調製した。６０ｍＬの調製添加剤組成物を各ＧＲＥＸフラスコ内にさらに分注し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で培養した。
－ ８日目
ＩＬ－２及び細分されたヒト血清をそれぞれ２，０００ＩＵ／ｍＬ及び３％までＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地に添加し、それによって添加剤組成物を必要な量で調製した。１８０ｍＬの調製添加剤組成物を各ＧＲＥＸフラスコ内にさらに分注し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で培養した。
－ １０日目
ＩＬ－２及び細分されたヒト血清をそれぞれ２，０００ＩＵ／ｍＬ及び３％までＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地に添加し、それによって添加剤組成物を必要な量で調製した。５４０ｍＬの調製添加剤組成物を各ＧＲＥＸフラスコ内にさらに分注し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で培養した。
－ １４日目
培養細胞を、２００ｍＬの培地を残しながら慎重に吸引し、残りの２００ｍＬの培地を穏やかに振とうし、懸濁させて、５００ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇボトル中に採取した。採取された細胞を室温にて２０００ｇで７分間遠心分離した。遠心分離後、上清を完全に除去し、沈殿した細胞を２６０ｍＬの賦形剤中に懸濁した。血球計数器セットを用いて、懸濁した細胞を計数し、細胞生存率を求めた。細胞計数の後、２００ｍＬの細胞を注入バッグに充填した。

実験例２．
ＴＩＬ増殖収率に関する実験
ＴＩＬ生成のための実験プロトコルに従って、ＴＩＬの増殖収率を測定する実験を行った（実験例１）。

ＴＩＬ生成のための実験プロトコルに従って生成されたＴＩＬを取得した後（実験例１）、血球計数器セットを用いて細胞を計数し、細胞生存率を求めた。

図５を参照すると、ＴＩＬ増殖収率実験の結果として、ＴＩＬ増殖処理中、ＴＩＬが少なくとも２，５００倍増殖し、最大でも９，４００倍増殖したことを確認した。

実験例３．
ＩＬ－２に関する最適化実験
実験例３－１．
ＴＩＬ単離／培養段階におけるＩＬ－２最適化に関する実験
１．
ＩＬ－２最適化のためのＴＩＬ単離／培養処理
－ ０日目
病院の手術室から移動させた腫瘍組織を、ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて３回洗浄し、１００ｍｍペトリ皿に移した。殺菌された外科手術用はさみ及びピンセットを用いて、腫瘍組織中の脂質組織を除去し、殺菌された外科手術用はさみ及びピンセットを用いて、腫瘍組織を１～２ｍｍのサイズに切断した。１～２ｍｍのサイズに切断された腫瘍組織の２つの断片を２４ウェルプレート内に置き、ＩＬ－２濃度に従った１ｍＬの調製培養組成物を添加し、続いて、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で７日間培養した。
－ ７日目
ＩＬ－２濃度に従った０．５ｍＬの調製培養組成物を各ウェルに添加し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で３日間培養した。
－ １０日目
ＩＬ－２濃度に従った０．５ｍＬの調製培養組成物を各ウェルに添加し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で２日間培養した。
－ １２日目
ＩＬ－２濃度に従った０．５ｍＬの調製培養組成物を各ウェルに添加し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で２日間培養した。
－ １４日目
細胞を採取するために、５０ｍＬチューブの上部に４０μｍセルストレーナーを設置した。１０ｍＬピペットを用いて培養細胞をセルストレーナーに通すことによって腫瘍組織を濾過し、培養細胞のみを５０ｍＬコニカルチューブに採取し、次に、室温にて４５０ｇで５分間遠心分離した。沈殿した細胞に１ｍＬのＤＰＢＳを添加し、次に、これをピペッティングすることによって懸濁した。血球計数器（Ｃ－ｃｈｉｐ）を用いて、懸濁した細胞を計数し、細胞生存率を求め、それによって、ＩＬ－２の各濃度について細胞増殖率を求めた。

図６を参照すると、ヒトＡＢ血清が添加された状態では、ＩＬ－２の濃度が１，０００ＩＵ／ｍＬ又はそれよりも高い場合、細胞増殖率は有意な差を示さなかった。

実験例３－２．
ＴＩＬ増殖段階におけるＩＬ－２濃度最適化に関する実験
１．アロフィーダーＰＢＭＣの単離
ＰＢＭＣ単離方法を実験例１－２と同じ方式で行った。
ＴＩＬ増殖処理
２．
ＩＬ－２最適化のためのＴＩＬ増殖処理
－ ０日目（細胞播種）液体窒素タンク（ＬＮ_２）中に保管した半産物バイアルを３７℃の水浴にて２分間解凍した。解凍された細胞をＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地で洗浄し、室温にて１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を破棄した後、結果として得られるペレットをＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ増殖組成物中に懸濁し、血球計数器セットを用いて細胞を計数し、細胞生存率を求めた。５Ｅ４半産物ＴＩＬ細胞及び１Ｅ７照射ＰＢＭＣを各Ｔ７５フラスコ培養容器内に置き、増殖組成物を３ｍＬ添加した。さらに、結果として得られる細胞混合物を５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で培養した。
－ ４日目
１０００、２０００、４０００、及び６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２のそれぞれを３ｖｏｌ％ヒト血清含有ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地内に置き、それによって、添加剤組成物を必要な量で調製した。６ｍＬの調製添加剤組成物を各Ｔ７５フラスコ内にさらに分注し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で培養した。
－ ６日目
１０００、２０００、４０００、及び６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２のそれぞれを３ｖｏｌ％ヒト血清含有ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地内に置き、それによって、添加剤組成物を必要な量で調製した。１８ｍＬの調製添加剤組成物を各Ｔ７５フラスコ内にさらに分注し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で培養した。
－ ８日目
１０００、２０００、４０００、及び６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２のそれぞれを３ｖｏｌ％ヒト血清含有ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地内に置き、それによって、添加剤組成物を必要な量で調製した。５４ｍＬの調製添加剤組成物を各Ｔ７５フラスコ内にさらに分注し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で培養した。
－ １０日目
１０００、２０００、４０００、及び６，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２のそれぞれを３ｖｏｌ％ヒト血清含有ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地内に置き、それによって、添加剤組成物を必要な量で調製した。１６２ｍＬの調製添加剤組成物を各Ｔ７５フラスコ内にさらに分注し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で培養した。
－ １４日目培養細胞を、１５０ｍＬの培地を残しながら慎重に吸引し、残りの１５０ｍＬの培地を穏やかに振とうし、懸濁させて、５０ｍＬチューブ中に採取した。採取された細胞を室温にて２０００ｇで７分間遠心分離した。遠心分離後、上清を完全に除去し、沈殿した細胞を３０ｍＬのＤＰＢＳ中に懸濁させた。血球計数器セットを用いて、懸濁した細胞を計数し、細胞生存率を求めた。

図７を参照すると、２，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を添加した組成物であってもＴＩＬを増殖させるのに十分であることが確認できる。さらに、細胞増殖収率及び細胞生存率の両方を考慮すると、２，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を添加した組成物は、ＴＩＬ増殖に最も効率的であることが確認できる。

実験例４．
培養組成物量の最適化に関する実験
１．
培養組成物量の最適化のためのＴＩＬ単離／培養処理
－ ０日目
病院の手術室から移動させた腫瘍組織を、ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて３回洗浄し、１００ｍｍペトリ皿に移した。殺菌された外科手術用はさみ及びピンセットを用いて、腫瘍組織中の脂質組織を除去し、殺菌された外科手術用はさみ及びピンセットを用いて、腫瘍組織を１～２ｍｍのサイズに切断した。１～２ｍｍのサイズに切断した腫瘍組織の２つの断片を２４ウェルプレート内に置き、１ｍＬ又は２ｍＬの調製培養組成物を添加し、続いて、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で７日間培養した。
－ ７日目
０日目に１ｍＬの組成物を添加したウェルに、０．５ｍＬの調製培養組成物を添加し、０日目に２ｍＬの組成物を添加したウェルから１ｍＬの組成物を慎重に除去し、次に、１ｍＬの組成物をこれに添加し、続いて、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で３日間培養した。
－ １０日目
０日目に１ｍＬの組成物を添加したウェルに、０．５ｍＬの調製培養組成物を添加し、０日目に２ｍＬの組成物を添加したウェルから、１ｍＬの組成物を慎重に除去し、次に、１ｍＬの組成物をこれに添加し、続いて、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で３日間培養した。
－ １２日目
０日目に１ｍＬの組成物を添加したウェルに、０．５ｍＬの調製培養組成物を添加し、０日目に２ｍＬの組成物を添加したウェルから、１ｍＬの組成物を慎重に除去し、次に、１ｍＬの組成物をこれに添加し、続いて、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃で３日間培養した。
－ １４日目
細胞を採取するために、５０ｍＬチューブの上部に４０μｍセルストレーナーを設置した。１０ｍＬピペットを用いて培養細胞をセルストレーナーに通すことによって腫瘍組織を濾過し、培養細胞のみを５０ｍＬコニカルチューブに採取し、次に、室温にて４５０ｇで５分間遠心分離した。沈殿した細胞に１ｍＬのＤＰＢＳを添加し、次に、これをピペッティングすることによって懸濁した。血球計数器（Ｃ－ｃｈｉｐ）を用いて、懸濁した細胞を計数し、細胞生存率を求め、それによって、０日目に添加した培養組成物の量に応じた細胞増殖率を求めた。

図８を参照すると、２４ウェルプレートを用いた実験の結果として、１ｍＬの組成物を使用した場合、２ｍＬの組成物を使用した場合よりも細胞増殖率が高いことが確認できた。

実験例５．
腫瘍断片当たりに取得された細胞を計数するための実験
実験例１－１と同じ方式で、肺癌（ＬＣ）腫瘍組織、頭頚部癌（ＨＮＣ）腫瘍組織、及び乳癌（ＢＣ）腫瘍組織を用いて、ＴＩＬ単離／培養処理、実験を行った。結果として、腫瘍断片当たりに平均でどれだけの細胞が入手されたかが確認された。図９を参照すると、ＬＣ腫瘍組織の場合、腫瘍断片当たりに平均でおおよそ４Ｅ５の細胞が入手された。ＨＮＣ腫瘍組織の場合、腫瘍断片当たりに平均でおおよそ６Ｅ５の細胞が入手された。ＢＣ腫瘍組織の場合、腫瘍断片当たりに平均でおおよそ６Ｅ５の細胞が入手された。

実験例６．
培養及び増殖させたＴＩＬ中のＴ細胞パーセンテージを確認するための実験
１．
Ｔ細胞パーセンテージを確認するための抗体の調製
Ｔ細胞パーセンテージを確認するための抗体として、ＣＤ３及びＣＤ４５に対する抗体を調製し、アイソタイプコントロール抗体もまた調製した。

表２．
Ｔ細胞パーセンテージを確認するための抗体についての情報
２．ＦＡＣＳ分析のための事前処理
培養及び増殖させたＴＩＬを１５ｍＬ又は５０ｍＬコニカルチューブ内に置き、ＦＡＣＳバッファ（ＤＰＢＳ中２％ＦＢＳ）で２回洗浄し、ＦＡＣＳバッファ中に懸濁した。５×１０^５の懸濁した細胞を１．７ｍＬ微量遠心チューブ内に置き、４℃で５分間１，５００ｒｐｍで遠心分離し、上清２００μＬを除いて上清を破棄した。残りの上清をボルテックスして細胞を懸濁させ、５μＬの各抗体を下のような各チューブ内に置いた。

表３．チューブに添加した抗体
抗体を添加した後、暗室において４℃で３０分間インキュベーションを行った。反応の後、細胞をＦＡＣＳバッファで３回洗浄し、４℃で５分間１，５００ｒｐｍで遠心分離し、おおよそ２００μＬを除いて上清を破棄した。残りの上清をボルテックスして細胞を懸濁させ、３００μＬのＦＡＣＳバッファを添加してＦＡＣＳ分析を行った。
３．ＦＡＣＳデータ分析
ＦＡＣＳ装置からＦＳＣ／ＳＳＣドットプロットにデータをロードした後、リンパ球領域をゲーティングした。ゲーティングされたリンパ球集団をドットプロットにロードした後、ＣＤ３－ＡＰＣ－ｃｙ７をｘ軸に設定し、ＣＤ４５－Ａｍｃｙａｎをｙ軸に設定し、４象限を設定した。４象限におけるＣＤ３陽性及びＣＤ４５陽性Ｔ細胞のパーセンテージを確認した。

図１０を参照すると、実験例１に従って生成されたＴＩＬ中のＴ細胞のパーセンテージを測定した結果として、生成されたＴＩＬの９９．７％、９９．４％、又は９８．４％がＴ細胞であることがわかる。すなわち、本願において開示された生成処理に従って生成されたＴＩＬ中には、高い比率でＴ細胞が存在することが確認された。

実験例７．
長期間冷凍保存された半産物を用いた増殖（最終産物生成）及び増殖させたＴＩＬ中のＴ細胞パーセンテージの確認
冷凍保存された半産物の増殖
１．アロフィーダーＰＢＭＣの単離
白血球除去を通して、正常なドナーから入手された血液を調製し、６０ＧｙのＸ線で照射した。１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ溶液を、気泡を伴わずに５０ｍＬコニカルチューブの底部に置いた。採取した血液を複数の５０ｍＬコニカルチューブに分割した後、血液の量を測定した。複数の５０ｍＬコニカルチューブに分割した血液を１：２（血液：ＤＰＢＳ）の比で希釈した。３０ｍＬの希釈した血液を、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ溶液を充填した５０ｍＬコニカルチューブに慎重に添加し、次に、Ａｃｃ９／Ｄｃｃ０の条件下で室温にて８００ｇで２０分間遠心分離を行った。ＰＢＭＣ層のみを採取し、新しい５０ｍＬコニカルチューブに移し、次に、Ａｃｃ９／Ｄｃｃ９の条件下で室温にて８００ｇで５分間遠心分離した。遠心分離した後、上清を完全に除去し、ＤＰＢＳを５０ｍＬまで充填し、洗浄、次に、Ａｃｃ９／Ｄｃｃ９の条件下で室温にて８００ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後、上清を完全に除去し、沈殿した細胞をＤＰＢＳ中に懸濁させた。血球計数器セットを用いて懸濁した細胞を計数し、細胞生存率を求めた。細胞計数の後、１：２００（２週間培養したＴＩＬ：ＰＢＭＣ）の比に従って必要な数の細胞を調製した。調製した細胞をＡｃｃ９／Ｄｃｃ９の条件下で室温にて８００ｇで５分間遠心分離した。遠心分離後、上清を完全に除去し、沈殿した細胞を最終産物培養完全培地中に懸濁し、最終産物の製造において使用した。
２．
最終産物の生成
－ ０日目（解凍及び細胞播種）
１年又はそれよりも長い長期にわたって液体窒素タンク（ＬＮ_２）に保管した半産物のバイアルを解凍した。ＴＩＬ半産物を、解凍したバイアルから５０ｍＬコニカルチューブに移した。ＴＩＬ半産物をＡＩＭ－Ｖ培地で洗浄した（９：１（培地：ＴＩＬ半産物）の体積比）。ＴＩＬ半産物をＡｃｃ９／Ｄｃｃ９の条件下で室温にて１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を破棄し、沈殿した細胞をＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地中に懸濁し、続いて、細胞計数及び細胞生存率の確認を行った。４Ｅ５の半産物ＴＩＬ細胞及び８Ｅ７の照射ＰＢＭＣ（アロＰＢＭＣ）をそれぞれＧＲＥＸ１００Ｍ（１Ｌ）培養容器内に置き、次に、最終産物増殖組成物を２０ｍＬの最終体積まで添加した。５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃でインキュベーションを行った。

最終産物増殖組成物の構成は、次の通りである：ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地、３ｖｏｌ％のヒト血清、２，０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、及び３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３
－ ４日目
ＩＬ－２及び細分されたヒト血清をＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地にそれぞれ２，０００ＩＵ／ｍＬ及び３％まで追加することによって、必要量の増殖組成物を調製した。２０ｍＬの調製増殖組成物を各ＧＲＥＸフラスコにさらに添加し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃でインキュベートした。
－ ６日目
ＩＬ－２及び細分されたヒト血清をＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地にそれぞれ２，０００ＩＵ／ｍＬ及び３％まで追加することによって、必要量の増殖組成物を調製した。６０ｍＬの調製増殖組成物を各ＧＲＥＸフラスコにさらに添加し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃でインキュベートした。
－ ８日目
ＩＬ－２及び細分されたヒト血清をＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地にそれぞれ２，０００ＩＵ／ｍＬ及び３％まで追加することによって、必要量の増殖組成物を調製した。１８０ｍＬの調製増殖組成物を各ＧＲＥＸフラスコにさらに添加し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃でインキュベートした。
－ １０日目
ＩＬ－２及び細分されたヒト血清をＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地にそれぞれ２，０００ＩＵ／ｍＬ及び３％まで追加することによって、必要量の増殖組成物を調製した。５４０ｍＬの調製増殖組成物を各ＧＲＥＸフラスコにさらに添加し、５％ＣＯ_２インキュベータ内において３７℃でインキュベートした。
－ １４日目培養細胞を、２００ｍＬの培地を残しながら慎重に吸引し、残りの２００ｍＬの培地を穏やかに振とうし、懸濁させて、５００ｍＬのＣｏｒｎｉｎｇボトル中に採取した。１５０ｍＬのＤＰＢＳをフラスコ内に置き、ここで、容器内の細胞を回収するために細胞収穫を行った（２回繰り返した）。採取された細胞を室温にて２，０００ｇで７分間遠心分離した。遠心分離後、上清を完全に除去し、洗浄のためにＤＰＢＳを５００ｍＬまで添加した（２，０００ｇ、７分、室温、Ａｃｃ９／Ｄｃｃ９、３回繰り返した）。遠心分離後、上清を完全に除去し、沈殿した細胞をＤＰＢＳ中に懸濁させた。血球計数器セットを用いて懸濁した細胞を計数し、細胞生存率を求めた。その後、細胞の一部を以下の確認テストのために使用し、残りをＣＳ１０内にて３×１０^７細胞／ｍＬで懸濁し、クライオジェニックバイアルに分注し、ディープフリーザを使用してクライオコンテナ内で凍結させた（－８０℃）。

冷凍保存された半産物の解凍時における細胞生存率の確認
方法
冷凍保存された半産物を解凍し、解凍後に細胞生存率を確認した。異なる期間にわたって液体窒素中で保管した３つの異なるケース（ＢＣ１６２０８、ＢＣ１７０５８、及びＢＣ１８０５０）からのＴＩＬ半産物のそれぞれ１つのバイアルを解凍した。解凍後、細胞生存率を確認した。

結果
解凍後に細胞生存率を確認した結果として、ＢＣ１６２０８のケースでは、解凍後の細胞生存率は、９１．２５％であり、ＢＣ１７０５８のケースでは、９５．８８％であり、ＢＣ１８０５０のケースでは、６９．３７％であった。

表４．
半産物解凍時における細胞生存率の確認
最終産物における収率の確認
方法
解凍した３つのケース（ＢＣ１６２０８、ＢＣ１７０５８、ＢＣ１８０５０）からのＴＩＬ半産物を使用して、最終産物を調製し、最終的に収穫された細胞の数、細胞生存率、及び細胞増殖率を測定した。

結果
ＢＣ１６２０８のケースでは、１．３１ｘ１０^９の細胞が、ＢＣ１７０５８のケースでは、１．７１ｘ１０^９の細胞が、ＢＣ１８０５０のケースでは、１．４２ｘ１０^９の細胞が、それぞれ、おおよそ３，２７０、４，２７５、及び３，５４０倍増殖したことが確認された。上記ケースの全てが９０％又はそれよりも高い高細胞生存率を示すことが確認された。

表５．
最終産物を調製するための半産物細胞播種の条件
表６．
最終産物の生成における生成収率
最終産物における細胞パーセンテージの確認
ＦＡＣＳによる分析法
最終産物における細胞パーセンテージをＦＡＣＳ分析によって確認した。ＦＡＣＳ分析のために使用する細胞をＦＡＣＳバッファ（ＤＰＢＳ中２％ＦＢＳ）に懸濁し、遠心分離した（１，５００ｒｐｍ、４℃、５分）（２回繰り返した）。遠心分離後、細胞をＦＡＣＳバッファ中に懸濁した。懸濁した細胞の１～５×１０^５細胞を各１．７ｍＬマイクロチューブに分注した。表面マーカー染色のために、各チューブを２μＬの抗体で処理した。暗室において４℃で３０分間インキュベーションを行い、インキュベーションの後、８００μＬのＦＡＣＳバッファを添加し、次に、遠心分離（１，５００ｒｐｍ、４℃、５分）を行った。上清を破棄した後、ボルテックスすることによって細胞を懸濁し、８００μＬのＦＡＣＳバッファをこれに添加し、次に、遠心分離（１，５００ｒｐｍ、４℃、５分）を行った（３回繰り返した）。２００μＬのＦＡＣＳバッファを使用して懸濁した後、細胞を５ｍＬのＦＡＣＳチューブに移し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＴＭ ＩＩフローサイトメーターを使用して分析を行った。

結果
生成された最終産物のＦＡＣＳ分析によって、Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３及びＣＤ４５の発現が確認された。生存細胞のみ対して分析を実行するために、細胞を最初にＳＳＣ－Ａ及びＦＳＣ－Ａでゲーティングした（図１２、図１４、及び図１６の左上のグラフ）。ここで、ゲーティングされた生存細胞を、図１２、図１４、及び図１６の左上のグラフにリンパ球として表示した。実験の結果として、ＣＤ３及びＣＤ４５の両方を発現するＴリンパ球（ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋）のパーセンテージは、ＢＣ１６２０８のケースでは９９．５％、ＢＣ１７０５８のケースでは９９．４％、ＢＣ１８０５０のケースでは９９．１％であった。さらに、ＢＣ１６２０８のケースでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージは８３．６％であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは１３．２％であり、ＢＣ１７０５８のケースでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージは９３．２％であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは４．７１％であり、ＢＣ１８０５０のケースでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージは７８．４％であり、ＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージは、１４．０％であることが確認された（図１２、図１４、及び図１６を参照）。参照として、下の表において、ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋リンパ球の中の各タイプのＴ細胞のパーセンテージは、ＣＤ３＋／ＣＤ４５＋リンパ球を１００％としたＦＡＣＳ結果に基づいて変換されたパーセンテージである。分析結果を下で表７に要約した。

表７
ケースごとの細胞パーセンテージの確認
さらに、上で確認されたＣＤ４＋Ｔ細胞中のメモリータイプＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７発現を通して確認した。結果として、ＢＣ１６２０８、ＢＣ１７０５８、又はＢＣ１８０５０の各ケースにおいて、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）のパーセンテージが８１．３５％、８３％、８４％、又は７３．１１％であることが確認された（図１３、図１５、及び図１７を参照）。Ｔｓｃｍは、幹細胞メモリーＴ細胞を示し、Ｔｃｍは、セントラルメモリーＴ細胞を示し、Ｔｅｍは、エフェクターメモリーＴ細胞を示し、Ｔｅｆｆは、エフェクターＴ細胞を示す。分析結果を下で表８に要約した。

表８．
ケースごとのＣＤ４＋Ｔ細胞のタイプの確認
さらに、上で確認されたＣＤ８＋Ｔ細胞中のメモリータイプＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＤ４５ＲＡ及びＣＣＲ７発現を通して確認した。結果として、ＢＣ１６２０８、ＢＣ１７０５８、又はＢＣ１８０５０の各ケースにおいて、エフェクターメモリーＴ細胞（Ｔｅｍ）のパーセンテージが１１．４０％、２．２０％、又は１０．９０％であることが確認された。分析結果を下で表９に要約した。

表９
ケースごとのＣＤ８＋Ｔ細胞のタイプの確認
最終産物の純度の確認
ＦＡＣＳによる分析法ＦＡＣＳ分析において使用されることになる細胞をＦＡＣＳバッファ（ＤＰＢＳ中２％ＦＢＳ）に懸濁し、遠心分離した（１，５００ｒｐｍ、４℃、５分）（２回繰り返した）。遠心分離後、細胞をＦＡＣＳバッファ中に懸濁した。懸濁した細胞の１～５×１０^５細胞を１．７ｍＬマイクロチューブに分注した。表面マーカー染色のために、各チューブを２μＬの抗体で処理した。暗室にて４℃で３０分インキュベーションを行った。インキュベーションの後、８００μＬのＦＡＣＳバッファを添加し、次に、遠心分離を行った（１，５００ｒｐｍ、４℃、５分）。上清を破棄した後、ボルテックスすることによって細胞を懸濁し、８００μＬのＦＡＣＳバッファをこれに添加し、次に、遠心分離（１，５００ｒｐｍ、４℃、５分）を行った（３回繰り返した）。２００μＬのＦＡＣＳバッファを使用して懸濁した後、細胞を５ｍＬのＦＡＣＳチューブに移し、ＢＤ ＦＡＣＳ ＣａｎｔｏＴＭ ＩＩフローサイトメーターを使用して分析を行った。

結果最終産物の純度を確認するために、Ｂ細胞マーカーであるＣＤ１９及び非Ｔ細胞中のＮＫ細胞マーカーであるＣＤ５６の発現をＦＡＣＳ分析によって確認した。生存細胞のみに対する分析を実行するために、細胞をまずＳＳＣ－Ａ及びＦＳＣ－Ａでゲーティングした（図１８、図２０、及び図２２の左のグラフ）。ここで、ゲーティングされた生存細胞を、図１８、図２０、及び図２２の左のグラフにリンパ球として表示した。ＢＣ１６２０８、ＢＣ１７０５８、及びＢＣ１８０５０のケースにおいて、ＣＤ１９発現率がそれぞれ０．０３％、０．０１％、及び０．０１％であることが確認された。さらに、ＢＣ１６２０８、ＢＣ１７０５８、及びＢＣ１８０５０のケースにおいて、ＣＤ５６発現率がそれぞれ０．０２％、０．００％、及び０．０３％であることが確認された（図１８～図２３を参照）。分析結果を下で表１０に要約した。

表１０．
最終産物の純度の確認
実験例８．
ＴＩＬを含む免疫細胞組成物１の効果の確認 － 乳癌患者由来ＴＩＬの腫瘍阻害効能の確認
乳癌患者の腫瘍組織から培養されたＴＩＬのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍阻害効能を、同じ患者に由来する患者由来異種移植片（ＰＤＸ）において確認した。

実験例８－１．
ＴＩＬの腫瘍阻害効能の確認、及び、ＴＩＬ及びＩＬ－２の同時投与の腫瘍阻害効能の確認
方法
１．
患者由来異種移植片（ＰＤＸ）の調製
ＰＤＸを以下の方法によって調製した。

順化した５週齢のＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ、Ｋｏａｔｅｃｈ）を拘束した。２０ｍｇ／ｍＬのトリブロモエタノール（１ｘアベルチン）を２５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内投与して麻酔した。麻酔されたマウスの耳にイヤーパンチを使用してイヤータグを取り付けることによって、被験体を識別した。脱毛器を使用して手術部位から体毛を除去した。腹部皮下組織において、おおよそ１．５ｃｍ切開した。真っ直ぐな鉗子（アイリスフォーセップ（ｉｒｉｓ ｆｏｒｃｅｐｓ））を使用して、皮下組織及び腹膜間の鈍的分離を行った。１～２ｍｍ^２のサイズを有する患者由来の腫瘍組織をこの動物の右側の４つ目の乳腺脂肪パッドに移植した。移植が完了した後、オートクリップを使用して、切開した皮下組織を縫合し、ポビドンを用いて消毒した。この動物をケージに入れ、体温を維持するために落葉落枝で覆った。ケージネームタグに動物情報を記録し、個別換気ケージ（ＩＶＣ）ラックに動物を閉じ込めた後、動物が麻酔から覚醒したことを確認した。
２．ＴＩＬの調製
増殖後に液体窒素中で冷凍保存された凍結したＴＩＬ（すなわち、実験例１又は実験例７の方法に従って生成された冷凍保存された最終産物、ＢＣ２００８２－ＴＩＬ試料）を３７℃の水浴で解凍した。冷凍保存液中に存在するＤＭＳＯを除去するために、温ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地及び解凍した最終産物の体積を９：１の比で混合した。室温にて１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行った。上清を破棄した後、沈殿した細胞をＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地中に懸濁し、計数した。室温にて１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を除去し、細胞ペレットをＤＰＢＳ中に懸濁し、下の表に示すように、マウスへの投与に好適なＴＩＬ数を滴定した。ＴＩＬの用量は、下の表に列挙されている。Ｇ１はコントロールである。Ｇ２は、１×１０^７のＴＩＬを投与した群であり、低用量ＴＩＬ投与群と称される。Ｇ３は、５×１０^７のＴＩＬを投与した群であり、高用量ＴＩＬ投与群と称される。Ｇ４は、ＩＬ－２投与群であり、０日目から５日目まで毎日ＩＬ－２の１．５×１０^５ＩＵを投与した。Ｇ４は、ＩＬ－２投与コントロールと称される。Ｇ５は、ＴＩＬ及びＩＬ－２を同時投与した群であり、これは、ＴＩＬ投与後０日目から５日目まで毎日１×１０^７のＴＩＬを投与するとともに１．５×１０^５ＩＵのＩＬ－２を投与することによって調製された。Ｇ５は、低用量ＴＩＬ＋ＩＬ－２同時投与群と称される。Ｇ６は、ＴＩＬ＋ＩＬ－２同時投与群であり、これは、ＴＩＬ投与後０日目から５日目まで毎日５×１０^７のＴＩＬを投与するとともに１．５ｘ１０^５ＩＵのＩＬ－２を投与することによって調製された。Ｇ６は、高用量ＴＩＬ＋ＩＬ－２同時投与群と称される。

表１１．
ＴＩＬ及び／又はＩＬ－２の用量に関する情報
３．ＴＩＬ注入及びマウス観察
おおよそ１３～６３ｍｍ^３の腫瘍体積を有するマウスを群化した。拘束具を用いてマウスを拘束し、次に、尾を温水に入れることによって血管を弛緩させた。３０Ｇインスリンシリンジを使用して、ＴＩＬ及びＩＬ－２を１分／頭で静脈内投与した。ＴＩＬを０日目に１回投与した。同時投与群において、ＴＩＬ投与後０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、及び５日目に、ＩＬ－２を１．５×１０^５ＩＵ／頭で投与した。すなわち、各投与時間において、ＩＬ－２を１．５×１０^５ＩＵ／頭で投与した。投与後、腫瘍体積を週２回測定し、体重を週１回測定した。腫瘍体積を、それが２，０００ｍｍ^３に達するまで観察し、それが２，０００ｍｍ^３を超えたとき、ＣＯ_２を用いてマウスを安楽死させた。マウスの安楽死後、腫瘍を除去し、腫瘍のサイズを測定した。

結果
１．マウスの体重の変化
ＴＩＬ投与によるマウスの体重の変化の確認
Ｇ１、Ｇ２（低用量ＴＩＬ投与群）、及びＧ３（高用量ＴＩＬ投与群）において、マウスにＴＩＬを投与した後の体重の変化を観察した。結果を図２４に示す。観察の結果として、細胞投与による体重の変化はなかったことが確認された。

ＴＩＬ及びＩＬ－２の同時投与による体重の変化の確認
さらに、Ｇ４（ＩＬ－２投与コントロール）、Ｇ５（低用量ＴＩＬ＋ＩＬ－２同時投与群）、及びＧ６（高用量ＴＩＬ＋ＩＬ－２同時投与群）において、マウスにＴＩＬを投与した後の体重の変化を観察した。結果を図２５に示す。観察の結果として、細胞投与による体重の変化はなかったことが確認された。
２．腫瘍体積の変化の測定
ＴＩＬ投与による腫瘍体積の変化の確認
Ｇ１、Ｇ２（低用量ＴＩＬ投与群）、及びＧ３（高用量ＴＩＬ投与群）において、マウスにＴＩＬを投与した後の腫瘍体積の変化が観察された。結果を図２６及び図２７に示す。図２８及び図２９は、ＴＩＬ投与後２８日目にマウスの腫瘍移植部位を撮影した画像である。さらに、ＴＩＬ投与後３８日目にマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、腫瘍体積を測定した。結果を図３０に示し、摘出された腫瘍の画像を図３１に示す。測定の結果として、Ｇ２（低用量ＴＩＬ投与群）及びＧ３（高用量ＴＩＬ投与群）において腫瘍成長が抑制され、腫瘍体積がコントロールのそれよりも小さいことが確認された。

ＴＩＬ＋ＩＬ－２同時投与による腫瘍体積の変化の確認
Ｇ４（ＩＬ－２投与コントロール）、Ｇ５（低用量ＴＩＬ＋ＩＬ－２同時投与群）、及びＧ６（高用量ＴＩＬ＋ＩＬ－２同時投与群）において、マウスにＴＩＬを投与した後、腫瘍体積の変化が観察された。結果を図３２及び図３３に示す。図３４及び図３５は、ＴＩＬ投与後２８日目のマウスの腫瘍移植部位の画像である。さらに、ＴＩＬ投与後３８日目に、マウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、腫瘍体積を測定した。結果を図３６に示し、摘出された腫瘍の画像を図３７に示す。測定の結果として、Ｇ５（（低用量ＴＩＬ＋ＩＬ－２同時投与群）及びＧ６（（高用量ＴＩＬ＋ＩＬ－２同時投与群）において腫瘍成長が抑制され、腫瘍体積がコントロールのそれよりも小さいことが確認された。

実験例９．
ＴＩＬを含む免疫細胞組成物の効能の確認 － 肺癌患者由来ＴＩＬの腫瘍阻害効能の確認
肺癌患者の腫瘍組織から培養されたＴＩＬのｉｎ ｖｉｖｏ腫瘍阻害効能を、同じ患者に由来する患者由来異種移植片（ＰＤＸ）において確認した。

方法
１．ＰＤＸ調製
ＰＤＸを以下の方法によって調製した。

順化した５週齢のＮＯＤ－ＳＣＩＤマウス（ＮＯＤ．ＣＢ１７－Ｐｒｋｄｃ^ｓｃｉｄ、Ｋｏａｔｅｃｈ）を拘束した。２０ｍｇ／ｍＬのトリブロモエタノール（１ｘアベルチン）を２５０ｍｇ／ｋｇでマウスに腹腔内投与して麻酔した。麻酔されたマウスの耳にイヤーパンチを使用してイヤータグを取り付けることによって、被験体を識別した。脱毛器を使用して手術部位から体毛を除去した。大腿筋の上方の皮下組織をおおよそ１ｃｍ切開した。真っ直ぐな鉗子（アイリスフォーセップ）を使用して、皮下組織及び筋膜間の鈍的分離を行った。１～２ｍｍ^２のサイズを有する患者由来の腫瘍組織をこの動物の右側の同じ位置において脇腹の皮下に移植した。移植が完了した後、オートクリップを使用して、切開した皮下組織を縫合し、ポビドンで消毒した。この動物をケージに入れ、体温を維持するために落葉落枝で覆った。ケージネームタグに動物情報を記録し、個別換気ケージ（ＩＶＣ）ラックに動物を閉じ込めた後、動物が麻酔から覚醒したことを確認した。
２．ＴＩＬの調製
増殖後に液体窒素中で冷凍保存された凍結したＴＩＬ（すなわち、実験例１又は実験例７の方法に従って生成された冷凍保存された最終産物、ＬＣ２０００１－ＴＩＬ試料）を３７℃の水浴で解凍した。冷凍保存液中に存在するＤＭＳＯを除去するために、温ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地及び最終産物の体積を９：１の比で混合した。室温にて１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離を行い、上清を除去した後、沈殿した細胞をＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地中に懸濁し、計数した。室温にて１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を除去し、細胞ペレットをＤＰＢＳ中に懸濁し、ＴＩＬの数を２００μＬ当たり５×１０^７細胞に調節した。ＴＩＬの用量を下の表に示す。コントロールは、ＩＬ－２のみを投与した群であり、ここで、１．５×１０^５ＩＵのＩＬ－２を０日目から５日目まで毎日投与した。コントロールをＩＬ－２と称する。細胞投与群は、ＴＩＬ及びＩＬ－２を同時投与した群であり、ここで、５×１０^７のＴＩＬを投与し、ＴＩＬ投与後０日目から５日目まで毎日１．５×１０^５ＩＵのＩＬ－２を投与した。細胞投与群は、ＴＩＬ＋ＩＬ－２と称される。

表１２．
ＴＩＬ及び／又はＩＬ－２の用量に関する情報
３．ＴＩＬ及びＩＬ－２の同時投与
おおよそ１３～６３ｍｍ^３の腫瘍体積を有するマウスを群化した。拘束具を用いてマウスを拘束し、次に、尾を温水に入れることによって血管を弛緩させた。３０Ｇインスリンシリンジを使用して、ＴＩＬ及びＩＬ－２を１分／頭で静脈内投与した。ＴＩＬを０日目に１回投与した。同時投与群において、ＴＩＬ投与後０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、及び５日目に、ＩＬ－２を１．５×１０^５ＩＵ／頭で投与した。すなわち、各投与時間において、ＩＬ－２を１．５×１０^５ＩＵ／頭で投与した。投与後、腫瘍体積を週に２回測定し、体重を週に１回測定した。腫瘍体積を、それが２，０００ｍｍ^３に達するまで観察し、それが２，０００ｍｍ^３を超えたとき、ＣＯ_２を用いてマウスを安楽死させた。マウスの安楽死の後、腫瘍を除去し、腫瘍のサイズを測定した。

結果
１．マウスの体重の変化
コントロール（ＩＬ－２）及び細胞投与群（ＴＩＬ＋ＩＬ－２）の静脈内投与後、体重の変化を観察した。結果を図３８に示す。観察の結果として、細胞投与による体重の変化はなかったことが確認された。
２．腫瘍体積の変化の測定腫瘍体積は、ＩＬ－２のみを投与されたコントロール及びＴＩＬ及びＩＬ－２を同時投与された細胞投与群の静脈内投与の１週間後に２回測定された。結果を図３９～図４１に示す。図４２は、ＴＩＬ投与後６４日目におけるマウスの腫瘍移植部位の画像である。さらに、ＴＩＬ投与後７０日目にマウスを安楽死させ、腫瘍を摘出し、腫瘍体積を測定した。結果を図４３に示す。測定の結果として、細胞投与群では、腫瘍成長が抑制され、腫瘍体積がコントロールのそれよりも小さかったことが確認できる。

Claims (43)

1. 免疫細胞組成物を生成するための方法であって、
   （ａ）腫瘍試料を第１の容器において培養する段階、
   ここで、前記腫瘍試料は、前記第１の容器内の第１の組成物中で培養され、前記第１の組成物は、培地、血清、及び５００～１５００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を含み、
   ここで、前記第１の容器は、ガス透過性容器又はガス供給システムを有する容器であり、
   ここで、前記培養は、１３～１５日間行われ、
   ここで、前記培養中、前記第１の容器に第１の添加剤組成物が１回又は２回又はそれよりも多い回数添加され、前記第１の添加剤組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２を含む；
   （ｂ）（ａ）から入手された前記培養された産物から第１の免疫細胞集団を入手する段階；
   （ｃ）第２の容器内に第２の組成物及び第２の免疫細胞集団を播種する段階、
   ここで、前記第２の免疫細胞集団は、前記第１の免疫細胞集団に由来し、
   ここで、前記第２の組成物は、培地、血清、１０００～３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２、抗ＣＤ３抗体、及びフィーダー細胞を含み、
   ここで、前記第２の容器は、ガス透過性容器又はガス供給システムを有する容器である；
   （ｄ）前記第２の免疫細胞集団を増殖させて第３の免疫細胞集団を生成する段階、
   ここで、前記増殖中、前記第２の容器に第２の添加剤組成物が１回又は２回又はそれよりも多い回数添加され、前記第２の添加剤組成物は、培地、血清、及びＩＬ－２を含み、
   ここで、前記増殖は、１３～１５日間行われる；及び
   （ｅ）（ｄ）から入手された前記増殖させた産物から前記第３の免疫細胞集団を入手するとともに前記免疫細胞組成物を生成する段階、
   ここで、前記第３の免疫細胞集団は、前記第２の免疫細胞集団と比較して、少なくとも２５００倍多い細胞を有する
   を備える方法。
2. 前記方法は、前記腫瘍試料を調製する段階をさらに備え、
   前記腫瘍試料を前記調製する段階は、（ａ）の前に行われる
   請求項１に記載の方法。
3. （ａ）において、前記腫瘍試料は、被験体から入手された腫瘍断片から入手され、
   前記腫瘍試料は、おおよそ１ｍｍ^２～４ｍｍ^２の断面積を有する
   請求項１または２に記載の方法。
4. （ａ）において、１２～２４の前記腫瘍試料が培養される
   請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記第１の組成物の血清の濃度は、５ｖｏｌ％又はそれよりも低い
   請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記第１の組成物の血清の濃度は、約３ｖｏｌ％である
   請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記第１の組成物の前記培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地である
   請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記第１の組成物のＩＬ－２の濃度は、約１０００ＩＵ／ｍＬである
   請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記第１の組成物の体積は、前記第１の容器の最大許容可能容量の３０％又はそれよりも小さい
   請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記第１の容器はＴ７５フラスコであり、前記第１の組成物の体積は６ｍｌである
    請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記第１の添加剤組成物は、前記第１の組成物と同じ組成物質及び比を有する組成物である
    請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記第１の添加剤組成物の前記ＩＬ－２の濃度は、１０００ＩＵ／ｍＬであり、
    前記第１の添加剤組成物の前記血清の濃度は、３ｖｏｌ％であり、
    前記第１の添加剤組成物の前記培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖ培地である
    請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記培養中、前記第１の添加剤組成物は、前記第１の容器に２回又はそれよりも多い回数添加される
    請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記培養中、前記第１の添加剤組成物は、前記培養の開始日から７日目、１０日目、及び１２日目に前記第１の容器に添加され、
    各添加点において添加される前記第１の添加剤組成物の量は同じである
    請求項１３に記載の方法。
15. 前記第２の免疫細胞集団は、前記第１の免疫細胞集団から入手される
    請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記第２の免疫細胞集団は、前記第１の免疫細胞集団を洗浄する段階を含む方法によって入手される
    請求項１５に記載の方法。
17. 前記第２の組成物の前記培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記第２の組成物の前記血清の濃度は、５ｖｏｌ％又はそれよりも低い
    請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記第２の組成物の前記血清の濃度は、３ｖｏｌ％又はそれよりも低い
    請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記第２の組成物の前記ＩＬ－２の濃度は、約２０００ＩＵ／ｍＬである
    請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記抗ＣＤ３抗体は、ＯＫＴ３である
    請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 前記第２の組成物の前記抗ＣＤ３抗体の濃度は、１０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬである
    請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記第２の組成物の前記抗ＣＤ３抗体の濃度は、約３０ｎｇ／ｍＬである
    請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記フィーダー細胞は、不活性化同種異系末梢血単核細胞である
    請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 前記フィーダー細胞は、前記第２の免疫細胞集団中の細胞数に基づいて、おおよそ１：２００（前記第２の免疫細胞集団の細胞数：フィーダー細胞数）の比で、前記第２の組成物に含まれている
    請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記播種する段階において、前記第２の容器に播種される前記第２の免疫細胞集団の細胞数は、１Ｅ５～１０Ｅ５である
    請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記播種する段階において、前記第２の容器に播種される前記第２の免疫細胞集団の細胞数は、約４Ｅ５である
    請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
28. 前記第２の組成物の体積は、前記第２の容器の最大許容可能容量の３０％又はそれよりも小さい
    請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 前記第２の容器は、ＧＲＥＸ１００Ｍであり、前記第２の組成物の体積は、約２０ｍｌである
    請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
30. 前記増殖中、免疫細胞は、前記第２の容器から除去されない、又は、外部から添加されない
    請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 前記第２の添加剤組成物は、前記抗ＣＤ３抗体及び前記フィーダー細胞を除外して、前記第２の組成物と同じ組成物質及び比を有する
    請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記第２の添加剤組成物の前記ＩＬ－２の濃度は、約２０００ＩＵ／ｍＬであり、
    前記第２の添加剤組成物の前記血清の濃度は、約３体積％であり、
    前記第２の添加剤組成物の前記培地は、ＣＴＳ－ＡＩＭ－Ｖである
    請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記増殖中、前記第２の添加剤組成物は、前記第２の容器に２回又はそれよりも多い回数添加される
    請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
34. 添加される前記第２の添加剤組成物の量は、各添加点において変わる
    請求項３３に記載の方法。
35. 前記増殖中、前記第２の添加剤組成物は、前記増殖の開始日から４日目、６日目、８日目、及び１０日目に前記第２の容器に添加され、添加される前記第２の添加剤組成物の量は、各添加点において徐々に増加される
    請求項３３に記載の方法。
36. 前記第２の添加剤組成物は、前記増殖の開始日から４日目に２０ｍｌ、前記増殖の開始日から６日目に６０ｍｌ、前記増殖の開始日から８日目に１８０ｍｌ、及び前記増殖の開始日から１０日目に５４０ｍｌ、前記第２の容器に添加される
    請求項３３に記載の方法。
37. 前記第３の免疫細胞集団は、前記第２の免疫細胞集団の少なくとも４０００倍又はそれよりも多い細胞を有する
    請求項１から３６のいずれか一項に記載の方法。
38. 前記免疫細胞組成物は、前記第３の免疫細胞集団を含む
    請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
39. 前記免疫細胞組成物は、前記第３の免疫細胞集団から入手された第４の免疫細胞集団を含む
    請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
40. 前記腫瘍試料は、乳癌、大腸癌、肺癌、胃癌、腎臓癌、卵巣癌、又は悪性黒色腫を含む皮膚癌を有する被験体の固形腫瘍に由来する
    請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
41. 前記腫瘍試料は、肺癌を有する被験体の悪性胸水に由来する
    請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
42. 前記方法は、
    前記第１の免疫細胞集団を冷凍保存する段階；及び
    前記冷凍保存された第１の免疫細胞集団を解凍する段階
    をさらに備え、
    ここで、前記第１の免疫細胞集団を冷凍保存する段階及び前記冷凍保存された第１の免疫細胞集団を前記解凍する段階は、（ａ）から入手された前記培養された産物から第１の免疫細胞集団を入手する段階（ｂ）の後に行われる
    請求項１から４１のいずれか一項に記載の方法。
43. 腫瘍浸潤リンパ球を含む免疫細胞組成物。