KR20220136841A - 신규한 스핑고모나스 파우치모빌리스 균주 및 이의 용도 - Google Patents
신규한 스핑고모나스 파우치모빌리스 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 신규한 스핑고모나스 파우치모빌리스 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 스핑고모나스 파우치모빌리스 균주를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주는 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 발현을 억제하고, 피부 주름 개선, 피부 탄력 강화, 피부 장벽 강화 및 보습 효과를 나타내는 콜라겐, 필라그린 및 클라우딘-1 등의 발현을 촉진할 수 있다. 따라서, 상기 균주는 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 탄력 강화, 피부 장벽 강화, 및/또는 피부 보습 효과 등을 나타내는 화장료 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 신규 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주는 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 발현을 억제하고, 피부 주름 개선, 피부 탄력 강화, 피부 장벽 강화 및 보습 효과를 나타내는 콜라겐, 필라그린 및 클라우딘-1 등의 발현을 촉진할 수 있다. 따라서, 상기 균주는 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 탄력 강화, 피부 장벽 강화, 및/또는 피부 보습 효과 등을 나타내는 화장료 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 신규한 스핑고모나스 파우치모빌리스 균주에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 스핑고모나스 파우치모빌리스 균주를 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다.
피부 주름, 피부 탄력 저하, 피부 장벽 약화, 보습 기능 약화 등의 특징을 나타내는 피부 노화는 크게 내적요인 및 외적요인에 의해 나타난다. 내적요인에 의한 노화는 특별한 환경적인 요인 없이 나이가 들면서 나타나는 자연스러운 현상인 반면에, 외적요인에 의한 노화는 자외선, 흡연, 스트레스, 화학물질, 공해 등을 포함하는 환경적인 요인에 의한 노화로서, 특히 자외선에 의한 노화가 주된 원인이다.
이와 같은 피부 노화 과정에서 피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등이 산화되며, 피부 세포 및 조직이 파괴된다. 특히, 콜라겐, 필라그린(filaggrin), 클라우딘-1(claudin-1) 등과 같은 피부 결합조직을 구성하는 단백질이 손상되는 경우, 과다 염증반응이 야기되고 피부의 탄력이 저하되는 문제가 발생한다.
상술한 피부 구성 단백질 중 하나인 콜라겐은 피부의 섬유아세포에서 생성되는 주요 기질 단백질로서, 피부의 기계적 견고성, 결합조직의 저항력과 조직의 결합력, 세포접착의 지탱, 상처 치유 시 세포분할 및 분화를 유도하는 등의 피부 장벽을 견고히 하는데 주요 역할을 수행한다. 콜라겐은 연령 증가, 자외선 조사에 의한 광노화 등에 의해 감소하는데, 상술한 요인에 의해 콜라겐 분해 효소인 기질 금속 단백질 분해 효소(Matrix metalloproteinase-1, MMP-1)의 발현이 증가되어 콜라겐 분해에 따른 피부 노화가 더욱 촉진될 수 있다. 즉, 생체 내에서는 콜라겐과 같은 세포 외 기질의 합성과 분해가 적절하게 조절되지만, 노화가 진행되면 콜라겐 합성이 감소하고 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 발현이 촉진되어 피부의 탄력이 저하되고 주름이 생기게 된다. 따라서, 피부 노화 및 주름을 방지하기 위해서는 세포 내에서 MMP-1의 발현 및 활성을 억제함으로써 콜라겐 분해를 억제하고, 콜라겐 생성을 촉진시킬 필요가 있다.
또한, 최근 연구 결과는 필라그린(filaggrin) 유전자의 변형, 클라우딘-1(claudin-1) 유전자의 발현 이상 등이 아토피 피부염의 발병 및 진행과 밀접한 관련이 있으며, 피부 장벽의 기능과 보습에 악영향을 미친다고 보고한바 있다(Acta Derm Venereol. 2018 Jan 12, 98(1):19-25.; An Bras Dermatol. Jul-Aug 2016, 91(4):472-8. 등). 구체적으로, 필라그린은 자연적인 보습 인자로 간주되는데, 표피 외층에서 수분이 감소하는 경우 필라그린 단백질이 가수분해되어 흡습성의 아미노산으로 분해되며, 이를 통해 피부 상부 각질층의 수분이 유지된다. 또한, 클라우딘-1은 피부 장벽 강화 및 수분 유지에 있어서 주된 역할을 수행하는 밀착연접(tight junction)을 구성하는 단백질이며, 클라우딘-1에 의한 밀착연접을 통해 경피 수분 손실(transepidermal water loss, TEWL)이 억제되고, 피부 장벽이 강화된다.
따라서, 피부의 주름을 예방하거나 개선시키고, 피부 장벽과 피부 보습 기능을 강화시키기 위해서는 신체의 대사 과정 및 자외선 조사에 의해 매개되는 콜라겐의 분해를 억제함과 동시에, 콜라겐, 필라그린 또는 클라우딘-1 등의 관련 유전자 및/또는 단백질의 발현을 촉진시킬 필요가 있다. 현재 피부 주름개선, 피부 보습 등에 효과적이라고 알려져 있는 물질로는 아데노신(adenosine), 레티노산(retinoic acid, RA) 등이 있으나, 아데노신은 임상에서의 효능이 미미하고, 레티노산은 가임 여성에게 사용할 수 없고 홍반 등의 부작용이 있는바, 상술한 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는 화장료 조성물에 대한 필요성은 여전히 당업계에 크게 존재한다.
이에, 본 발명자들은 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는 균주에 대해 다양한 연구를 진행하였다. 그 결과, 신규 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03을 발견하고 이를 기탁하였으며, 이는 우수한 피부 주름 개선, 피부 탄력 강화, 피부 장벽 강화 및 피부 보습 효과 등을 나타낸다는 것을 실험적으로 입증함에 따라 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 신규한 스핑고모나스 파우치모빌리스(Sphingomonas paucimobilis) GENSC03 균주를 제공한다.
용어, "스핑고모나스 파우치모빌리스(Sphingomonas paucimobilis) GENSC03"은 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주를 의미한다. 본 명세서에서는 '스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03', '스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주', 'GENSC03', 'GENSC03 균주'와 혼용되어 사용될 수 있으며, 상기 균주는 균주 그 자체, 균주의 배양물, 균주의 파쇄물, 균주의 추출물, 균주를 파쇄하여 얻은 세포질 분획물(cytoplasmic fraction)을 포함하는 것으로 해석된다.
상기 용어, '배양물'은 영양분을 공급한 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 균주 자체, 균주의 추출물, 균주의 대사물, 또는 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미하며, 균주 배양 후 균주를 제거한 배양액도 포함한다. 또한, 상기 전체 배지 또는 배양액의 농축물, 및 상기 농축물의 건조물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 배양물은 미생물 배양에 사용되는 배지 중에서 통상의 기술자가 목적에 따라 용이하게 선택한 배지를 사용할 수 있으며, 예를 들면 스핑고모나스 파우치모빌리스 배양에 사용되는 배지, 예컨대 TSA (Tryptic soy agar) 또는 TSB (Tryptic soy broth) 배지를 사용할 수 있으나, 스핑고모나스 파우치모빌리스를 배양할 수 있는 한, 이에 제한되지 않는다.
상기 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03는 본 출원인이 한국생명공학연구원에 2021년 3월 11일에 수탁번호 KCTC 14495BP로 기탁하였으며, 서열번호 1로 표시되는 16S rRNA 유전자의 염기서열을 갖는다.
또한, 상기 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03은 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)의 발현 또는 활성을 감소시키는 것일 수 있다. 또한, 제1형 콜라겐(collagen type 1), 필라그린(filaggrin) 및 클라우딘-1(claudin-1)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 발현 또는 활성을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 MMP-1의 발현 또는 활성이 감소되거나; 제1형 콜라겐, 필라그린 또는 클라우딘-1의 발현 또는 활성이 증가되는 경우 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 탄력 유지 또는 강화, 피부 장벽 유지 또는 강화, 및/또는 피부 보습 효과가 나타나므로, 상기 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03은 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 탄력 강화, 피부 장벽 강화 또는 피부 보습 용도로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 스핑고모나스 파우치모빌리스(Sphingomonas paucimobilis) GENSC03 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주를 파쇄하여 얻은 세포질 분획물로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
이때, 상기 "스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03"에 대한 설명은 전술한 바와 같다.
본 발명의 화장료 조성물은 상기 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03을 유효성분으로 포함한다. 또한, 전술한 바와 같이, 상기 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03은 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주 그 자체, 균주의 배양물, 균주의 발효물, 균주의 파쇄물, 균주의 추출물, 균주를 파쇄하여 얻은 세포질 분획물을 포함하는 것으로 해석되므로, 본 발명의 화장료 조성물은 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 추출물 또는 상기 균주를 파쇄하여 얻은 세포질 분획물을 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 피부 주름 예방 또는 개선, 또는 피부 보습 용도일 수 있다. 또한, 상기 피부 주름 예방 또는 개선 효과에 의해 피부 탄력 및/또는 장벽을 유지하거나 강화하는 효과를 나타낼 수 있다.
상기 화장료 조성물 중 상기 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03의 함량은 사용 목적, 사용 기간, 제형의 종류, 투여 경로, 사용자의 피부 상태 등 다양한 요인을 고려하여 적합하게 결정될 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물의 사용자에는 성별, 연령 등에 제한이 없다. 구체적으로, 피부 주름 예방 또는 개선, 또는 피부 보습 효과를 얻고자 하는 사람이라면 누구나 사용할 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 상기 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 이외에 추가 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 추가 성분은 피부 주름 예방 또는 개선, 또는 피부 보습 효과를 상쇄시키거나 감소시키지 않는다면 제한이 없고, 예를 들어, 화장품 기능을 부가하거나 증대시키기 위하여 전형적으로 사용되는 통상의 성분이 포함될 수 있다. 구체적으로, 안정화제, 유화제, 점증제, 보습제, 액정 막강화제, pH 조절제, 항균제, 수용성 고분자, 피막제, 금속 이온 봉쇄제, 아미노산, 유기 아민, 고분자 에멀션, pH 조정제, 피부 영양제, 산화 방지제, 방부제, 향료 등에서 선택되는 하나 이상의 수성 첨가제; 및 유지류, 왁스류, 탄화 수소유, 고급 지방산유, 고급 알콜, 합성 에스테르유 및 실리콘유 등에서 선택되는 하나 이상의 유성 첨가제 등일 수 있다. 또한, 용제, 계면활성제, 현탁화제-비계면활성제, 보습제, 불투명화제, 기포방지제, 벌킹제, 피부유연화제, 피부컨디셔닝제, 킬레이트제, 보존제, 살균보존제 등의 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 화장료 조성물은 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형 등의 형태로 제조될 수 있다. 구체적으로, 패치류, 연고류, 피부접착용 겔류, 크림류, 팩류, 화장수류, 에센스류, 스프레이류, 마스크류, 파운데이션류, 메이크업베이스류, 세정제류, 수(W)형, 유(O)형, 실리콘(S)형, 수중유(O/W)형, 유중수(W/O)형, 실리콘중수(W/S)형, 수중실리콘(S/W)형, 고체상, 액상 등의 다양한 제형으로 제조될 수 있으며, 통상적으로 사용되는 제조방법이 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 신규 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주는 콜라겐 분해 효소인 MMP-1의 발현을 억제하고, 피부 주름 개선, 피부 탄력 강화, 피부 장벽 강화 및 보습 효과를 나타내는 콜라겐, 필라그린 및 클라우딘-1 등의 발현을 촉진할 수 있다.
따라서, 상기 균주는 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 탄력 강화, 피부 장벽 강화, 및/또는 피부 보습 효과 등을 나타내는 화장료 조성물로서 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 혈액한천배지에서 배양한 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03의 배양 결과를 보여주는 이미지이다.
도 2는 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주의 배양물이 처리된 인간 진피 섬유아세포의 생존율을 보여주는 그래프이다. 'TSB'는 TSB (Tryptic Soy Broth) 액체 배지가 처리된 대조군, 'GENSC03'는 GENSC03 균주의 배양물이 처리된 실험군을 의미한다.
도 3은 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주의 배양물이 처리된 인간 진피 섬유아세포의 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 발현 정도를 보여주는 그래프이다. 'TSB'는 TSB 액체 배지가 처리된 대조군, 'RA'는 레티노산(retinoic acid, 1 μM)이 처리된 양성 대조군, 'GENSC03'는 GENSC03 균주의 배양물이 처리된 실험군을 의미한다.
도 4는 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주의 배양물이 처리된 인간 진피 섬유아세포의 제1형 콜라겐(collagen type 1) 발현 정도를 보여주는 그래프이다. 'TSB'는 TSB 액체 배지가 처리된 대조군, 'RA'는 레티노산(1 μM)이 처리된 양성 대조군, 'GENSC03'는 GENSC03 균주의 배양물이 처리된 실험군을 의미한다.
도 5는 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주의 배양물이 처리된 인간 각질 형성세포(HaCaT)의 필라그린(Filaggrin) mRNA 발현 정도를 보여주는 그래프이다. 필라그린의 mRNA 발현양은 β-액틴(β-actin)의 mRNA 발현양에 대해 표준화한 값으로 나타내었다. 'TSB'는 TSB 액체 배지가 처리된 대조군, 'RA'는 레티노산(1 μM)이 처리된 양성 대조군, '24H', '36H'은 GENSC03 균주의 배양물(5%)이 각각 24시간, 36시간 처리된 실험군을 의미한다.
도 6은 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주의 배양물이 처리된 인간 각질 형성세포(HaCaT)의 클라우딘-1(Claudin-1) mRNA 발현 정도를 보여주는 그래프이다. 클라우딘-1의 mRNA 발현양은 β-액틴(β-actin)의 mRNA 발현양에 대해 표준화한 값으로 나타내었다. 'TSB'는 TSB 액체 배지가 처리된 대조군, 'RA'는 레티노산(1 μM)이 처리된 양성 대조군, '24H', '36H'은 GENSC03 균주의 배양물(5%)이 각각 24시간, 36시간 처리된 실험군을 의미한다.
도 2는 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주의 배양물이 처리된 인간 진피 섬유아세포의 생존율을 보여주는 그래프이다. 'TSB'는 TSB (Tryptic Soy Broth) 액체 배지가 처리된 대조군, 'GENSC03'는 GENSC03 균주의 배양물이 처리된 실험군을 의미한다.
도 3은 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주의 배양물이 처리된 인간 진피 섬유아세포의 MMP-1(matrix metalloproteinase-1) 발현 정도를 보여주는 그래프이다. 'TSB'는 TSB 액체 배지가 처리된 대조군, 'RA'는 레티노산(retinoic acid, 1 μM)이 처리된 양성 대조군, 'GENSC03'는 GENSC03 균주의 배양물이 처리된 실험군을 의미한다.
도 4는 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주의 배양물이 처리된 인간 진피 섬유아세포의 제1형 콜라겐(collagen type 1) 발현 정도를 보여주는 그래프이다. 'TSB'는 TSB 액체 배지가 처리된 대조군, 'RA'는 레티노산(1 μM)이 처리된 양성 대조군, 'GENSC03'는 GENSC03 균주의 배양물이 처리된 실험군을 의미한다.
도 5는 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주의 배양물이 처리된 인간 각질 형성세포(HaCaT)의 필라그린(Filaggrin) mRNA 발현 정도를 보여주는 그래프이다. 필라그린의 mRNA 발현양은 β-액틴(β-actin)의 mRNA 발현양에 대해 표준화한 값으로 나타내었다. 'TSB'는 TSB 액체 배지가 처리된 대조군, 'RA'는 레티노산(1 μM)이 처리된 양성 대조군, '24H', '36H'은 GENSC03 균주의 배양물(5%)이 각각 24시간, 36시간 처리된 실험군을 의미한다.
도 6은 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주의 배양물이 처리된 인간 각질 형성세포(HaCaT)의 클라우딘-1(Claudin-1) mRNA 발현 정도를 보여주는 그래프이다. 클라우딘-1의 mRNA 발현양은 β-액틴(β-actin)의 mRNA 발현양에 대해 표준화한 값으로 나타내었다. 'TSB'는 TSB 액체 배지가 처리된 대조군, 'RA'는 레티노산(1 μM)이 처리된 양성 대조군, '24H', '36H'은 GENSC03 균주의 배양물(5%)이 각각 24시간, 36시간 처리된 실험군을 의미한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1. 스핑고 모나스 파우치 모빌리스(
Sphingomonas paucimobilis
) GENSC03의 분리 및 동정
피부 주름 예방 또는 개선, 피부 탄력 강화, 피부 장벽 강화 및/또는 피부 보습 효과를 나타내는 균주를 선별하기 위하여, 아토피, 건선, 여드름 등의 피부질환을 앓은 적이 없거나 최근 6개월 이내에 이와 관련된 치료를 받은 이력이 없는 성인의 피부에서 유래된 균을 분리하였다.
구체적으로, 멸균생리수를 적신 멸균된 면봉으로 세안을 하지 않은 양볼과 콧망울을 힘을 가하여 문질렀다. 이후, 피부 샘플이 묻은 상기 면봉을 PBS가 들어 있는 튜브에 넣어 밀봉한 후, 균주 분리를 위해 TSA (Tryptic soy agar)에 획선 도말하였고, 이 작업을 3~4회 반복하여 순수한 콜로니를 분리하였다.
이후, 분리된 균주의 순수 배양물으로부터 16S rRNA 유전자 염기서열을 결정하여 균주를 동정하였다. 이때 사용한 프라이머 서열 및 분리된 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열은 하기 표 1에 나타내었다.
| 종류 | 서열 | 서열번호 |
| 16S rRNA gene | CTGTCAGAACGAACGCTGGCGGCATGCCTAACACATGCAAGTCGAACGAAGGCTTCGGCCTTAGTGGCGCACGGGTGCGTAACGCGTGGGAATCTGCCCTTAGGTTCGGAATAACAGCTGGAAACGGCTGCTAATACCGGATGATATCGCGAGATCAAAGATTTATCGCCTGAGGATGAGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGAGTGATGAAGGCCCTAGGGTTGTAAAGCTCTTTTACCCGGGAAGATAATGACTGTACCGGGAGAATAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGCTTTGTAAGTCAGAGGTGAAAGCCTGGAGCTCAACTCCAGAACTGCCTTTGAGACTGCATCGCTTGAATCCAGGAGAGGTCAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAAATTCGTAGATATTCGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGACTGGACTGGTATTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGATAACTAGCTGTCCGGGCACTTGGTGCTTGGGTGGCGCAGCTAACGCATTAAGTTATCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCTGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAGCGTTTGACATGGTAGGACGACTTCCAGAGATGGATTTCTTCCCTTCGGGGACCTACACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTCGCCTTTAGTTACCATCATTTGGTTGGGTACTCTAAAGGAACCGCCGGTGATAAGCCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTACGCGCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGCAACTACAGTGGGCAGCGACCCTGCGAGGGCGAGCTAATCCCCAAAAGTTGTCTCAGTTCGGATTGTTCTCTGCAACTCGAGAGCATGAAGGCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCAGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTTGGATTCACCCGAAGGCGTTGCGCCAACCTAGCAATAGGAAGCAGGCGACCACGGTGGGTTCAGCGACTGGGGTGAAGC | 서열번호 1 |
| 정방향 프라이머 27F (PCR용) | 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3' | 서열번호 2 |
| 역방향 프라이머 1492R (PCR용) | 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3' | 서열번호 3 |
| 정방향 프라이머 785F (시퀀싱용) | 5'-GGATTAGATACCCTGGTA-3' | 서열번호 4 |
| 역방향 프라이머 907R (시퀀싱용) | 5'-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3' | 서열번호 5 |
그 결과, 분리된 상기 균주는 스핑고모나스 파우치모빌리스와 99% 상동성을 나타내는 것을 확인하였다. 이에, 상기 균주를 "스핑고모나스 파우치모빌리스 (Sphingomonas paucimobilis) GENSC03"으로 명명하고, 2021년 3월 11일자로 특허균주 기탁기관인 한국생명공학연구원에 기탁하여 수탁번호 KCTC 14495BP를 부여받았다.
실시예 2. 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03의 안전성
실시예 2-1. 균주의 안전성 확인
스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주의 인체에 대한 안전성을 확인하기 위하여, 혈액 내 존재하는 적혈구 등의 세포를 파괴하는 능력인 용혈성(hemolytic activity)을 확인하였다. 용혈성은 균주 배양 시 투명환이 생성되는 특징을 통해 확인할 수 있으며, 병원성 미생물의 경우 상당한 용혈성을 나타낸다고 알려져 있다.
구체적으로, TSA 배지에서 순수배양된 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주를 백금이로 채취하여 혈액한천배지(sheep blood agar)에 획선 도말하고 37℃에서 48시간 동안 호기적으로 배양하였다. 이후, 상기 GENSC03 균주의 균체 주위에 투명환이 생성되는지 여부를 통해 용혈성을 판단하였다.
그 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, 혈액한천배지에서 배양된 GENSC03 균주는 균체 주위에 투명환이 생성되지 않음에 따라, 용혈성이 없음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 상기 GENSC03 균주는 인체에 무해하고 안전성이 우수하므로 인체에 적용되는 화장료, 의약, 식품 등에 활용 시 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 2-2. 균주 배양물의 세포 독성 확인
상기 실시예 2-1을 통해 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주는 인체에 독성을 나타내지 않음을 확인한바, 상기 균주의 배양물 또한 독성을 나타내지 않는지 확인하였다.
구체적으로, GENSC03 균주의 배양물은 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주를 TSA 고체 플레이트에서 30℃에서 24시간 동안 호기적으로 배양하였다. 이후, 상기 고체 플레이트에 나타난 단일 콜로니를 25 mL의 TSB (Tryptic Soy Broth) 액체 배지에 계대배양하여 30℃, 200 rpm에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 상기 배양물 1%를 새로운 TSB 액체 배지에 접종하여 24시간 동안 같은 조건(30℃, 200 rpm)에서 배양하였고, 상층액을 원심분리한 후 0.22 ㎛ 포어 사이즈 필터로 여과하였다.
이후, 상기 배양물의 세포 독성은 다음과 같은 방법으로 확인하였다. 먼저, 96-웰 세포 배양 플레이트에 인간 진피 섬유아세포를 각각 3×104 세포/웰의 수로 24시간 동안 부착시킨 다음, 상기 배양물을 농도별(1, 5, 10 v/v%)로 첨가하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후, 배양된 세포 배지를 제거하고 PBS로 세척 후 FBS 미포함 DMEM 배지 100 ㎕를 첨가하고 추가로 EZ-Cytox 시약 10 ㎕를 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 흡광도(O.D)는 SpectraMax M2로 570nm에서 측정하였다. 이후, 측정한 흡광도를 "O.D sample/O.D control × 100"의 공식으로 환산하여 세포의 생존율을 계산하였고, 이로부터 상기 배양물의 세포 독성을 확인하였다.
그 결과, 도 2에서 볼 수 있듯이, GENSC03 균주의 배양물은 10%의 높은 농도에서도 인간 진피 섬유아세포의 생존율에 영향을 미치지 않음을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 상기 GENSC03 균주의 배양물은 인체 세포에 대해 독성이 없고, 인체에 무해하고, 안전성이 우수하므로, 인체에 적용되는 화장료, 의약, 식품 등에 활용 시 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 3. 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주 배양물의 피부 개선 효과
실시예 3-1. MMP-1 발현 억제 효과 확인
상기 실시예 2를 통해 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주 및 이의 배양물은 인체 적용 시 안전함을 확인한바, 화장료 조성물로서의 활용을 위하여 피부 개선 효과를 확인하였다. 먼저, 피부 주름 예방 및 개선, 피부 탄력 강화, 피부 장벽 강화 효과를 확인하기 위하여, 콜라겐을 분해하는 효소인 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)의 발현 억제 효과를 확인하였다.
구체적으로, 인간 피부 섬유아세포를 12-웰 플레이트에 2×104 세포/웰의 수로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후, PBS로 2회 세척한 후 PBS을 넣은 채로 UVB 조사기를 이용하여 144 mJ/㎝2 만큼의 UVB를 조사하였다. 이후, FBS를 미첨가한 DMEM 배지에 상기 실시예 2-2의 방법으로 제조한 GENSC03 균주의 배양물을 각 농도별(0.1, 1, 5, 10 v/v%)로 첨가하여 배양하였고, 대조군으로는 GENSC03 균주의 배양물을 첨가하지 않은 FBS 미첨가 DMEM 배지에서 72시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후, 각 웰의 상층액을 수득하여 MMP-1 분석 ELISA 키트를 이용하여 발현된 MMP-1의 양(pg/㎖)을 측정하였다. 이때, 각 대조군 및 실험군은 아래와 같이 설정하였다.
- 대조군: TSB 액체 배지 처리
- 양성 대조군: 레티노산(retinoic acid, 1 μM) 처리
- 실험군: GENSC03 균주의 배양물 처리
그 결과, 도 3에서 볼 수 있듯이, UVB를 조사하는 경우 MMP-1은 약 4000 pg/㎖의 높은 수준으로 발현되지만, GENSC03 균주의 배양물을 처리하는 경우에는 UVB를 조사하여도 약 500 내지 2500 pg/㎖의 낮은 수준으로 발현되며, 약 1.6 내지 8배 이상 유의적으로 억제됨을 확인하였다. 상기 배양물의 MMP-1 발현 억제 효과는 농도 의존적으로 나타나며, 특히 10 v/v%의 배양물을 처리하는 경우에는 MMP-1 발현 또는 생성 억제 효과가 우수하다고 알려진 레티노산과 유사한 정도의 효능을 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 상기 GENSC03 균주 또는 이의 배양물은 콜라겐을 분해하는 효소인 MMP-1의 발현을 억제할 수 있으므로, 피부 주름 예방 또는 개선 효과가 우수하며, 따라서 피부 탄력 강화, 피부 장벽 강화 등에도 우수한 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실시예 3-2. 제1형 콜라겐(collagen type 1) 발현 촉진 효과 확인
피부 주름 예방 및 개선, 피부 탄력 강화, 피부 장벽 강화 효과를 확인하기 위한 다른 실험으로, 제1형 콜라겐(collagen type 1)의 발현 촉진 효과를 확인하였다.
구체적으로, 인간 피부 섬유아세포를 12-웰 플레이트에 2×104 세포/웰의 수로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후, FBS를 미첨가한 DMEM 배지에 상기 실시예 2-2의 방법으로 제조한 GENSC03 균주의 배양물을 각 농도별(0.1, 1, 5, 10 v/v%)로 첨가하여 배양하였고, 대조군으로는 GENSC03 균주의 배양물을 첨가하지 않은 FBS 미첨가 DMEM 배지에서 72시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 웰의 상층액을 수득하여 제1형 콜라겐 분석 ELISA 키트를 이용하여 발현된 제1형 콜라겐의 양(pg/㎖)을 측정하였다. 이때, 각 대조군 및 실험군은 아래와 같이 설정하였다.
- 대조군: TSB 액체 배지 처리
- 양성 대조군: 레티노산(1 μM) 처리
- 실험군: GENSC03 균주의 배양물 처리
그 결과, 도 4에서 볼 수 있듯이, 아무것도 처리하지 않는 경우 제1형 콜라겐이 약 2000 pg/㎖의 수준으로 발현되지만, GENSC03 균주의 배양물을 처리하는 경우에는 약 2500 pg/㎖의 높은 수준으로 발현되며, 약 1.25배 이상 유의적으로 증가함을 확인하였다. 상기 배양물의 제1형 콜라겐 발현 촉진 효과는 농도 의존적으로 나타나며, 특히 10 v/v%의 배양물을 처리하는 경우에는 제1형 콜라겐 발현 또는 생성 촉진 효과가 우수하다고 알려진 레티노산(RA, 1 μM)과 유사한 정도의 효능을 나타냄을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 상기 GENSC03 균주 또는 이의 배양물은 콜라겐의 발현 및 생성을 촉진할 수 있으므로, 피부 주름 예방 또는 개선 효과가 우수하며, 따라서 피부 탄력 강화, 피부 장벽 강화 등에도 우수한 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
실시예 3-3. 필라그린(filaggrin) 및 클라우딘-1(claudin-1)의 발현 증가 효과 확인
피부 주름 예방 및 개선, 피부 탄력 강화, 피부 장벽 강화 효과와 더불어, 피부 보습 등의 효과를 확인하기 위한 실험으로, 필라그린 및 클라우딘-1의 발현 증가 효과를 확인하였다.
구체적으로, 인간 각질 형성세포(HaCaT)를 6-웰 플레이트에 5×105 세포/웰의 수로 분주하여 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 완료 후, FBS를 미첨가한 DMEM 배지에 상기 실시예 2-2의 방법으로 제조한 GENSC03 균주의 배양물(5 v/v%)을 첨가하여 배양하였고, 대조군으로는 GENSC03 균주의 배양물을 첨가하지 않은 FBS 미첨가 DMEM 배지에서 24시간 또는 36시간 동안 배양하였다. 배양 후, 상기 세포에서 발현된 필라그린 및 클라우딘-1 mRNA의 양을 측정하였고, 이를 β-액틴(β-actin)의 mRNA 발현양에 대해 표준화하였다. 이때, 각 대조군 및 실험군은 아래와 같이 설정하였다.
- 대조군: TSB 액체 배지 처리
- 양성 대조군: 레티노산(1 μM) 처리
- 실험군: GENSC03 균주의 배양물 처리
그 결과, 도 5에서 볼 수 있듯이, 아무것도 처리하지 않는 경우 필라그린은 약 0.75의 낮은 수준으로 발현되지만, GENSC03 균주의 배양물을 처리하는 경우 약 1.25의 높은 수준으로 발현되며, 약 1.5배 이상 유의적으로 증가함을 확인하였다.
또한, 도 6에서 볼 수 있듯이, 아무것도 처리하지 않은 경우 클라우딘-1은 약 1.0의 낮은 수준으로 발현되지만, GENSC03 균주의 배양물을 처리하는 경우 약 1.25 내지 1.5의 높은 수준으로 발현되며, 약 1.25 내지 1.5배 이상 유의적으로 증가함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 상기 GENSC03 균주 또는 이의 배양물은 피부 보습 유지 및 피부 장벽 강화에 주된 역할을 수행하는 필라그린 및 클라우딘-1의 생성을 촉진할 수 있으므로, 피부 보습 및 피부 장벽 강화 효과가 우수하며, 따라서 피부 탄력 강화 등에도 우수한 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
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<223> 16s rRNA gene of Sphingomonas paucimobilis GENSC03
<400> 1
ctgtcagaac gaacgctggc ggcatgccta acacatgcaa gtcgaacgaa ggcttcggcc 60
ttagtggcgc acgggtgcgt aacgcgtggg aatctgccct taggttcgga ataacagctg 120
gaaacggctg ctaataccgg atgatatcgc gagatcaaag atttatcgcc tgaggatgag 180
cccgcgttgg attaggtagt tggtggggta aaggcctacc aagccgacga tccatagctg 240
gtctgagagg atgatcagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 300
agcagtgggg aatattggac aatgggcgaa agcctgatcc agcaatgccg cgtgagtgat 360
gaaggcccta gggttgtaaa gctcttttac ccgggaagat aatgactgta ccgggagaat 420
aagccccggc taactccgtg ccagcagccg cggtaatacg gagggggcta gcgttgttcg 480
gaattactgg gcgtaaagcg cacgtaggcg gctttgtaag tcagaggtga aagcctggag 540
ctcaactcca gaactgcctt tgagactgca tcgcttgaat ccaggagagg tcagtggaat 600
tccgagtgta gaggtgaaat tcgtagatat tcggaagaac accagtggcg aaggcggctg 660
actggactgg tattgacgct gaggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc 720
tggtagtcca cgccgtaaac gatgataact agctgtccgg gcacttggtg cttgggtggc 780
gcagctaacg cattaagtta tccgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaagg 840
aattgacggg ggcctgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgcaga 900
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acctacacac aggtgctgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1020
cccgcaacga gcgcaaccct cgcctttagt taccatcatt tggttgggta ctctaaagga 1080
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ctaatcccca aaagttgtct cagttcggat tgttctctgc aactcgagag catgaaggcg 1260
gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccagg ccttgtacac 1320
accgcccgtc acaccatggg agttggattc acccgaaggc gttgcgccaa cctagcaata 1380
ggaagcaggc gaccacggtg ggttcagcga ctggggtgaa gc 1422
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 27F
<400> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1492R
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 907R
<400> 5
ccgtcaattc mtttragttt 20
Claims (7)
- 수탁번호 KCTC 14495BP로 기탁된 스핑고모나스 파우치모빌리스(Sphingomonas paucimobilis) GENSC03 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열은 서열번호 1로 표시되는 것인, 균주. - 제1항에 있어서,
상기 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주는 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)의 발현 또는 활성을 감소시키는 것인, 균주. - 제1항에 있어서,
상기 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주는 제1형 콜라겐(collagen type 1), 필라그린(filaggrin) 및 클라우딘-1(claudin-1)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 발현 또는 활성을 증가시키는 것인, 균주. - 수탁번호 KCTC 14495BP로 기탁된 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 균주의 발효물, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 추출물 및 상기 균주를 파쇄하여 얻은 세포질 분획물로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 포함하는 화장료 조성물.
- 제5항에 있어서,
상기 스핑고모나스 파우치모빌리스 GENSC03 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열은 서열번호 1로 표시되는 것인, 화장료 조성물. - 제5항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 피부 주름 예방 또는 개선, 피부 탄력 강화, 피부 장벽 강화 또는 피부 보습 용도인 것인, 화장료 조성물.
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