KR20220134094A - 굴 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 및 치료, 또는 근기능 개선용 조성물 - Google Patents
굴 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 및 치료, 또는 근기능 개선용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 굴 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 근기능 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 굴 가수분해물은 근위축에 따른 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소를 완화시키고, 근육 단백질의 분해에 관여하는 인자의 발현 증가를 완화시키고, 근육 단백질의 합성에 관여하는 인자의 발현을 증가시키며, 근육 세포 내 에너지 분포에 중요한 역할을 하는 미토콘드리아 생합성에 관여하는 인자의 발현을 증가시킴으로써, 근육 질환을 예방, 개선 또는 치료하는데 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 굴 가수분해물 (oyster hydrolysate)을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 및 치료, 또는 근기능 개선용 조성물에 관한 것이다.
노화는 신체 구성 성분에 주된 영향을 주는데, 정상적인 노화의 경우라 하더라도 점진적인 체지방의 증가를 나타내며, 남성의 경우 65세경, 여성의 경우는 이보다 늦게 최고치에 이르게 된다. 또한, 노화는 체지방량 또는 근육량의 감소를 유발하며, 이러한 노화에 따른 체지방의 증가와 근육량의 감소는 체중과 체질량지수 (body mass index)의 변화가 없는 노인에서도 발생한다.
근육량의 점진적인 감소는 대략 40대 이후부터 발생하여 70대까지 10년에 8%의 감소가 일어난다고 추정하고 있으며, 그 이후로는 더욱 급격한 감소가 발생하여 10년마다 15%까지 발생할 수 있다고 알려져있다. 하체 근력 또한 70대까지 10년 마다 10 내지 15%의 저하가 발생하며, 70대 이후로는 10년 마다 25 내지 40%로 매우 빠른 속도로 감소하게 된다.
이러한 노화와 관련된 근육량의 소실은 신경계 및 호르몬의 변화, 영양 부족, 신체 활동량 저하 및 저강도 만성 염증 등에 의하여 발생하는 것으로 알려져 있다. 연령이 증가함에 따라 근력도 감소하게 되는데, 근육량과는 독립적으로 저하되는 것으로 보여진다. 이 외에도 근섬유의 수와 크기 감소, 근육 단백질의 합성 저하와 미토콘드리아 기능의 감소를 특징으로 하는 근육의 질도 연령이 증가함에 따라 감소하는 것으로 나타난다.
근감소증(sarcopenia)은 근육량 및 근력이 감소하는 퇴행성질환으로, 정상적인 노화 과정에서 나타나는 근육 소실과 달리, 비정상적으로 급격히 근육량이 감소하는 질환을 말한다. 근감소증은 여성보다 남성에서 호발하고, 50세 이상부터 나타나며, 80세 이상 인구의 절반에서 나타난다. 노화성 근감소증은 노인들의 신체적 수행력의 제한으로 인하여 낙상, 골절, 쇠약, 대사질환, 사망 등의 위험성을 증가시키는 것으로 보고되고 있다. 이러한 근 감소증은 신체의 노화가 진행됨에 따라 점진적으로 증가하는 추세이지만, 아직까지 노화성 근감소증에 대한 명확한 원인이나 뚜렷한 치료 방법이 밝혀지지 않았다.
근육은 크게 골격근(skeletal muscle), 심장근(cardiac muscle), 평활근(visceral muscle)으로 구분되고, 골격근은 인체에서 가장 많은 양으로 존재하는 조직으로, 체중의 40-45%를 차지한다. 골격근은 건(tendon)을 통해 뼈(bone)에 붙어서 뼈의 움직임 또는 힘을 만들어 내는 역할을 한다. 하나의 근육은 수많은 근섬유로 구성되어 있으며, 다시 근섬유는 액틴과 미오신으로 구성된 수많은 근원섬유로 만들어진다. 액틴과 미오신이 서로 겹쳐서 움직이면 근육의 길이가 짧아지거나 길어지면서 전체적인 근육의 수축과 이완을 유발하게 된다. 근원섬유 크기의 증가는 근섬유 두께의 증가를 의미하고, 그 결과 근육의 증가가 일어나게 된다.
또한, 근육은 에너지 항상성 유지 및 열생성 등의 대사 기능에 중요한 역할을 하고, 근육의 크기(size)는 근육 내에서 일어나는 동화작용(anabolism)이나 이화작용(catabolism)을 유도하는 세포 내 신호전달 과정(signalling pathways)에 의해 조절된다.
근육의 성장 및 재생에 관여하는 신호전달체계로는 IGF-1(insulin like growth factor 1)/AKT에 의해 매개되어 단백질 합성을 조절하는 신호전달이 있다. 근육세포막에 존재하는 IGF-1R(IGF-1 receptor)가 활성화되면 IRS1 및 PI3K 인산화를 통해 AKT 인산화가 증가되고 후자는 근육 단백질의 합성에 관여하는 대표적인 인자인 mTOR(mammalian target of rapamycin) 인산화를 활성화시킨다.
mTOR는 단백질의 번역(translation) 개시를 조절하는 중요한 인자로서, 인산화된 형태(phosphorylated mTOR, p-mTOR)가 활성화된 형태이고, 근육을 지속적으로 고정(immobilization)시켰을 때 발현은 크게 변하지 않지만 활성화가 증가하면 근육의 감소를 완화시키는 것으로 알려져 있다.
mTOR의 활성화는 S6 ribosomal protein S6 kinase beta-1(S6K1)의 인산화를 증가시켜 mRNA 번역(translation)을 증가시키는 동시에 eukaryotic translation initiation factor 4 G(eIF4G)의 활성을 증가시키고, mRNA 번역을 개시하는 eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1(4E-BP1) 단백질을 인산화시켜 활성화시킨다. eIF4G와 4E-BP1은 eIF4F 복합체를 형성하는데 관여하는데, eIF4G는 eIF4A 그리고 eIF4E와 결합하여 eIF4F 복합체를 형성하는 한편, 4E-BP1은 인산화되면 eIF4E와의 결합능이 저해되어 유리상태의 eIF4E를 증가시키게 된다. 후자는 다른 translation initiation factor들(eIF4G 및 eIF4A)과 결합하여 eIF4F 복합체를 형성하고, 이렇게 형성된 eIF4F 복합체는 리보솜 구조를 안정화시킴으로서 번역개시(translation initiation)를 촉진하여 궁극적으로 근육 단백질의 합성을 유도하여 근육량을 증가시키게 된다.
또한, 근육 단백질의 분해에 관여하는 대표적인 인자로는 근육 특이적 E3 유비퀴틴 리가아제(muscle specific E3 ubiquitin ligase) 인자인 MuRF-1(Muscle RING-finger protein-1)이 있다. MuRF-1은 활동량이 감소했을 때 발현이 크게 증가되는데(Foletta VC et el., Pflugers Archiv-European Journal of Physiology, 461(3), 325-335, 2011), 이로 인해 프로테오좀-의존적 단백질 분해(proteosome-dependent proteolysis)가 촉진되어 근육량이 줄어들게 된다. 따라서 mTOR의 활성 촉진과 MuRF-1 발현 억제는 근육 단백질의 양을 증가시켜 근육량을 증가시키게 된다.
미토콘드리아는 에너지 공급원으로서 아데노신 트라이포스페이트(adenosine triphosphate: ATP) 합성 및 조절에 관여하는 진핵세포의 생존에 필수적인 세포 소기관이다. 미토콘드리아는 생체 내 다양한 대사 경로, 예를 들어, 세포 신호처리, 세포 분화, 세포 사멸뿐만 아니라 세포 주기 및 세포 성장의 제어와 연관이 있다.
특히, 근육은 고에너지 수준을 필요로 하여 미토콘드리아를 상대적으로 다량 함유하고 있는 조직으로, 미토콘드리아의 기능 저하에 따라 근육에서 다소 빠르게 병증이 진행될 수 있다. 예를 들어, 미토콘드리아성 근육 질환으로 MELAS 증후군, MERRF 증후군, Kearns-Sayre 증후군, 근병증, 뇌근육병증, 근무력증, 중증 근무력증, 근위축성 측삭 경화증, 근육퇴행위축, 근위축증, 근긴장저하, 근력약화, 근경직증 등이 있다. 현재 근감소증의 치료 방법으로 미토콘드리아의 생성 증가, 근육 단백질 분해 억제제 및 항염제 등이 제시되고 있으나 뚜렷한 치료제가 없는 실정이다.
어패류는 구조적으로 다양한 생물 활성의 질소 성분이 풍부한 자원이며, 혈압조절, 항산화, 항균, 항응고, 면역 조절, 칼슘 결합 등의 생리 활성을 가진다. 이 같이 다양한 생리 활성을 보이는 것은 단백질 분해 효소에 의한 가수 분해물이 사용하는 효소의 종류에 따라 생성하는 펩티드의 크기와 아미노산 서열에 차이를 보이고, 아미노산 서열의 차이가 생리적 기능성의 차이에 기여하기 때문이다.
이러한 어패류에서 유래한 화합물의 기능적 특성과 관련하여 해조 다당류, 미네랄, 비타민, 항산화제, 효소 및 생리 활성 펩티드 등에 관하여 많은 연구가 이루어졌다. 특히 펩티드는 영양을 공급하고, 용해 및 유화 특성을 가지고 있을 뿐만 아니라 항암효능 및 면역증강 등의 광범위한 생리활성을 나타내고 있다. 이러한 생리활성을 가지는 펩티드는 동식물 및 어류 추출물로부터 얻을 수 있으며, 화학적 합성을 통해서, 혹은 단백질 효소 가수분해에 의한 단백질 가수분해물 및 미생물 발효 공정을 통해 얻을 수 있다.
어패류 단백질의 효소 가수분해물은 단백질의 기능적 특성을 수식하거나 향상시키는 장점을 지니며, 가수분해로 생성된 펩티드는 다양한 생리활성을 가진다. 천연물 유래의 기능성 펩티드는 해양생물의 단백질이 갖는 특이적인 1차 결합에 근거하여 많은 연구가 진행되고 있다. Abel은 해면동물, 연체동물 및 해조로부터 펩타이드의 기능적 특성 및 분리 기술에 관하여 연구하였고, Guadalupe 등은 해면동물과 연체동물 가수분해물의 항산화 효능과 항암효능에 관하여 연구하였다. 이외에도 Sacoglossan mollusk와 Elysia rufescens로부터 항암 효능과 항균 효능이 있는 cyclic depsipeptides인 Kahalalides를 분리하기도 하였다.
굴은 바다에서 사는 굴과의 연체동물로 옛날부터 전 세계 여러 사람들이 즐겨 먹는 맛이 좋고 영양가가 높은 수산식품이다. 굴은 고형물 함량 중 60~70%가 단백질로 이루어져 있으며, 비타민 A, B1, B2, C 및 철, 칼슘, 인, 아연, 셀레늄, 구리 등의 무기질 등의 기능성 성분을 다량 함유하고 있다.
굴 가수분해물은 굴에 단백질 가수분해 효소로 가수분해하여 얻어지는 산물로, 단백질이 풍부한 굴을 가수분해한 굴 가수분해물은 유리아미노산이 풍부하고 저분자의 펩티드가 다량 함유되어 있다.
다양한 기능성 성분을 함유하고 있음에도 불구하고, 굴이 가진 특육의 이미, 이취는 경제적인 관점에서의 상용화에 제약을 초래하고 있다. 일반적으로 불쾌한 이취는 선도 저하시에 trimethylamine oxide(TMAO)가 세균의 환원 작용에 의하여 trimethylamine(TMA)으로 분해되어 생성된 것으로, 이취는 해양생물 소재의 산업화에 제약이 되고 있다. 따라서, 해양생물의 이취 제거 효과에 관한 연구는 많이 진행되어 있다. 본 발명자들도 선행 연구에서 굴 단백질 가수분해물의 이취를 감소시킬 목적으로 굴 가수분해물에 효모와 젖산균으로 발효 과정을 추가하는 이취 제거를 위한 굴 가수분해물의 발효 공정을 개시한 바 있다 (Lee 등, 2016)
또한, 본 발명자들은 한국 공개특허 10-2017-0037546에서, 굴 가수분해물에 이스트 및 글루코오스를 첨가하여 발효시키는 단계를 포함하는 굴 가수분해물의 프로콜라겐의 생성을 증가시키고, MMP-1의 생합성을 저해시키는 효과를 확인함으로써, 굴 가수분해물의 주름 개선용 건강기능식품 또는 화장료 조성물로서의 용도를 개시하였다.
본 발명자들은 굴 가수분해물이 근 위축에 따른 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소를 완화시키고 근육 단백질의 분해에 관여하는 인자의 발현 증가를 완화시키며, 근육 단백질의 합성에 관여하는 인자의 발현을 증가시키는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 굴 가수분해물의 근육 질환의 예방 및 치료, 또는 근기능 개선용도를 제공하는 것이다.
본 발명은 굴 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명은 굴 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 근기능 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 굴 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환이 예방 또는 근기능 개선용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 굴 가수분해물은 근위축에 따른 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소를 완화시키고, 근육 단백질의 분해 인자의 발현을 감소시키고, 근육 단백질의 합성 인자 및 근육 세포 내 에너지 분포에 중요한 역할을 하는 미토콘드리아 생합성에 관여하는 인자의 발현을 증가시켜, 근육 감소 및 근 기능의 저하를 회복시킴으로써, 근육 질환 및 치료 또는 근기능을 개선하는데 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 C2C12 세포를 분화시킨 후, PNY를 농도별로 처리하였을 때 cell viability를 나타내는 그래프이다.
도 2는 C2C12 세포를 분화시킨 후, PNY를 농도별로 처리하였을 때 근섬유의 직경 변화를 나타내는 그래프이다.
도 3은 C2C12 세포를 분화시킨 후, PNY를 농도별로 처리하였을 때 근섬유의 형태 변화를 나타내는 그림이다.
도 4는 PNY를 농도별로 처리하였을 때 근육 분해인자(MurF1) 단백질 발현 정도를 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 그림이다.
도 5는 PNY를 농도별로 처리하였을 때 근육 분해인자(MurF1) 단백질의 발현 정도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 6은 PNY를 농도별로 처리하였을 때 근육 분해인자 (Atrogin1) 유전자의 발현 정도를 나타내는 그래프이다.
도 7은 PNY를 농도별로 처리하였을 때 근육 합성인자(S6K1) 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 그림이다.
도 8은 PNY를 농도별로 처리하였을 때 근육 합성인자(S6K1) 단백질의 발현 정도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 9는 PNY를 농도별로 처리하였을 때 근육 합성인자(4E-BP1) 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 그림이다.
도 10은 PNY를 농도별로 처리하였을 때 근육 합성인자(4E-BP1) 단백질의 발현 정도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 11은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 Quadriceps(대퇴사두근, 속근)의 무게 변화를 나타내는 그래프이다.
도 12는 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 Gastrocnemius(장딴지근, 속근)의 무게 변화를 나타내는 그래프이다.
도 13은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 Soleus(비장근, 지근)의 무게 변화를 나타내는 그래프이다.
도 14는 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 근섬유의 단면적을 나타낸 그림이다.
도 15는 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 근섬유 단면적을 정량화한 그래프이다.
도 16은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델의 악력 변화를 나타내는 그래프이다.
도 17은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 탈진시까지 걸리는 시간의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 18은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 달린 거리의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 19는 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 근육 분해인자(MurF1) 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 그림이다.
도 20은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 근육 분해인자(MurF1) 단백질의 발현 정도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 21은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 근육 분해인자 (Atrogin1) 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 그림이다.
도 22는 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 근육 분해인자 (Atrogin1) 단백질의 발현 정도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 23은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 단백질 분해에 관여하는 인자들의 전사인자 (FoxO3a)의 단백질 발현 정도를 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 그림이다.
도 24는 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 단백질 분해에 관여하는 인자들의 전사인자 (FoxO3a)의 단백질 발현 정도의 변화를 나타내는 그래프이다.
도 25는 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 근육 합성인자(S6K1) 단백질의 인산화 정도를 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 그림이다.
도 26은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 근육 합성인자(S6K1) 단백질의 인산화 정도를 나타내는 그래프이다.
도 27은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 근육 합성인자(PI3K) 단백질의 인산화 정도를 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 그림이다.
도 28은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 근육 합성인자(PI3K) 단백질의 인산화 정도를 나타내는 그래프이다.
도 29는 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 근육 합성인자(Akt) 단백질의 인산화 정도를 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 그림이다.
도 30은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 근육 합성인자(Akt) 단백질의 인산화 정도를 나타내는 그래프이다.
도 31은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 근육 합성인자 (mTOR) 단백질의 인산화 정도를 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 그림이다.
도 32는 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 근육 합성인자(mTOR) 단백질의 인산화 정도를 나타내는 그래프이다.
도 33은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 근육 합성인자 (4E-BP1) 단백질의 인산화 정도를 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 그림이다.
도 34는 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 근육 합성인자(4E-BP1) 단백질의 인산화 정도를 나타내는 그래프이다.
도 35는 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 미토콘드리아 생합성 인자 (NRF-1) 유전자의 발현을 나타내는 그래프이다.
도 36은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 미토콘드리아 생합성 인자 (NRF-2) 유전자의 발현을 나타내는 그래프이다.
도 37은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 미토콘드리아 생합성 인자 (TFAM) 유전자의 발현을 나타내는 그래프이다.
도 38은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 미토콘드리아 생합성 인자 (SIRT 1) 단백질의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 그림이다.
도 39는 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 미토콘드리아 생합성 인자 (SIRT 1) 단백질의 발현을 나타낸 그래프이다.
도 40은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 미토콘드리아 생합성 인자 (PGC1-α) 단백질의 발현을 웨스턴 블롯을 통해 나타낸 그림이다.
도 41은 PNY를 투여하였을 때 동물 모델에서 미토콘드리아 생합성 인자 (PGC1-α) 단백질의 발현을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 굴 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
굴 가수분해물은 굴에 단백질 가수분해 효소로 가수분해하여 얻어지는 산물로, 단백질이 풍부한 굴의 가수분해물은 유리아미노산이 풍부하고 저분자의 펩티드가 다량 함유되어 있다.
상기 굴 가수분해물은,
1) 5 내지 20분 열처리한 굴을 분쇄하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 굴 분쇄물에 단백질 분해효소를 처리하여 30 내지 65 ℃의 온도에서 0.5 내지 12시간 반응시키는 단계;
3) 100℃에서 10 내지 50분 동안 가열하여 효소를 불활성화시키는 단계;
4) 효모 및 효모의 탄소원을 처리하여 20 내지 30 ℃에서 10 내지 50분 동안 발효시키는 단계: 및
5) 100℃에서 10 내지 50분 동안 가열하여 효소를 불활성화시키는 단계;를 포함하는 가수분해과정을 거쳐 수득할 수 있다.
상기 단계 1)의 열처리 과정은 굴의 이취를 제거하기 위하여 끓는 물에서 5 내지 20분 동안 진행될 수 있고, 바람직하게는 10분 동안 진행될 수 있다.
상기 단계 2)의 단백질 분해효소는 프로타멕스(Protamex), 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase), BP-트립신(trypsin from bovine pancreas), 알카라제(Alcalase), 키모트립신(α-caymotrypsin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 프로타멕스(Protamex) 또는 뉴트라제(Neutrase)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 단계 2)는, 프로타멕스를 처리하고 반응시킨 후, 뉴트라제를 처리하여 반응시키는 2단 가수분해과정일 수 있다.
이때, 상기 프로타멕스는 굴 중량의 0.5 내지 3% 처리할 수 있고, 바람직하게는 1% 처리할 수 있다.
상기 프로타멕스는 30 내지 65 ℃에서 0.5 내지 12시간 동안 반응시킬 수 있으며, 바람직하게는 40℃에서 1시간 동안 반응시킬 수 있다.
상기 뉴트라제는 굴 중량의 0.5 내지 3% 처리할 수 있고, 바람직하게는 1% 처리할 수 있다.
상기 뉴트라제는 30 내지 65 ℃에서 0.5 내지 12시간 동안 반응시킬 수 있으며, 바람직하게는 50℃에서 1시간 동안 반응시킬 수 있다.
상기 단계 3)의 열처리 과정은 단백질 분해효소를 불활성화시키기 위하여 100℃에서 10 내지 50분 동안 진행될 수 있고, 바람직하게는 100℃에서 30분 동안 진행될 수 있다.
상기 열처리 후, 온도를 50 내지 70℃, 바람직하게는 60℃까지 하향조절하여 단계 4)를 진행할 수 있다.
상기 단계 4)는 굴의 이취를 제거하기 위한 발효 과정으로, 효모를 굴 중량의 0.1 내지 1%, 바람직하게는 0.5% 첨가하고, 효모의 탄소원을 굴 중량의 0.5 내지 3%, 바람직하게는 1% 첨가하여 진행될 수 있다.
상기 효모는 이스트 (Yeast) 일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 효모의 탄소원은 글루코오스 (Glucose) 일 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 발효 과정은 20 내지 30 ℃에서 10 내지 50분 동안 진행될 수 있고, 바람직하게는, 24℃에서 30분 동안 진행될 수 있다.
상기 발효 과정이 끝나면 다시 효소 불활성화시키는 단계를 진행할 수 있다.
상기 근육 질환은 근육 소모 또는 퇴화로 인한 질환을 의미하고, 근감소증(sarcopenia), 긴장감퇴증(atony), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육 퇴화, 근경직증(myotonic dystrophy) 및 근무력증(myasthenia) 으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.
상기 근육 소모는 근육량의 점진적 손실과, 골격근과 같은 수의근 또는 심장근과 같은 불수의근의 약화 및 퇴행을 특징으로 한다. 근육 소모 및 퇴화는 유전적 요인, 후천적 요인, 노화 등에 의해 발생한다.
본 발명의 조성물은 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소를 완화시킬 수 있고, 근육 단백질의 분해에 관여하는 인자 발현의 증가를 완화시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 근육 단백질의 합성에 관여하는 인자의 발현을 증가시킬 수 있으며, 미토콘드리아 생합성에 관여하는 인자의 발현을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 발명자들은 굴 가수분해물을 제조한 뒤, 마우스 근아세포(C2C12)로부터 분화 유도된 근관세포(myotube)에서 농도 400 ㎍/ml 까지 세포 독성이 없음을 확인하고 (도 1 참조), 근관세포를 이용하여 제조한 근위축 세포 모델에서 굴 가수분해물 처리군의 근세포 직경이 대조군에 비하여 길어진 것을 확인함으로써 손상된 근관세포를 회복시킬 수 있음을 확인하였다 (도 2 및 3 참조).
상기 세포 모델을 사용한 기전 연구에서, 굴 가수분해물이 근육 단백질 분해 관련 인자인 MurF1 단백질 및 Atrogin1 유전자의 발현을 억제함을 확인하였다 (도 4 내지 6 참조). MurF1은 E3 ubiquitin ligase로 muscle atrophy 에서 발현이 증가하며 주로 myosin heavy chain을 분해시킨다고 알려져 있으며, Atrogin1은 muscle specific ubiquitin ligase로 muscle atrophy에서 발현이 증가하여 26S proteasomal pathway를 통해 protein degradation을 활성화시키는 유전자이다.
또한, 굴 가수분해물은 근육 단백질 합성 관련 인자인 S6k1 및 4E-BP1 단백질의 활성화를 증가시킴을 확인하였는데 (도 7 내지 10 참조), S6k1은 S6 ribosomal protein을 인산화하여 리보솜에서 단백질 합성 증가시키고, 4E-BP1은 Eukaryotic translation initiation factor 4E (elF4E)와 결합하여 40S ribosomal subunit complex assembly를 억제하며 전사를 막고 있는데, 4E-BP1이 인산화되면 elF4E가 분리되며 단백질 합성이 유도된다.
본 발명자들은 in vitro 실험에 이어, 마우스를 이용한 Immobilization-induced muscle atrophy 동물 모델에서 굴 가수분해물의 근 손상 회복 효과를 검증하였다.
먼저, 악력 (Grip strength test)을 측정한 결과, 굴 가수분해물 투여군 마우스에서 유의미한 악력 증가 효과가 나타났고 (도 16 참조), 근육 무게를 측정한 결과, 굴 가수분해물을 투여한 마우스의 속근 (대퇴사두근 및 장딴지근) 및 지근 (가자미근) 모두 근육 무게가 증가하였다 (도 11 내지 13 참조). 골격근은 속근 및 지근이라는 두 가지 형태의 근섬유를 가지고 있는데, 속근섬유는 순간적인 힘이 강하여 관절을 잇는 인대를 튼튼하게 하여 그 기능을 향상시켜주며, 인대나 근육 조직을 강화하여 탈골을 예방하지만, 쉽게 피로해지는 특징이 있으며, 지근섬유는 다른 근섬유보다 느리게 수축하여 적은 힘을 발휘하지만 피로에 대한 저항력이 크고 미토콘드리아를 많이 포함하고 있어 산소 운반에 도움을 주는 근섬유이다.
다음은 마우스의 운동 수행능력 (treadmill test)을 평가한 결과, 굴 가수분해물을 투여한 마우스의 탈진 시까지 걸린 시간이 대조군에 비하여 유의미하게 증가하였으며, 달린 거리 역시 유의미한 증가를 보였다 (도 17 및 18 참조).
또한, 마우스의 장딴지근 염색하여 근섬유 단면적을 측정한 결과, 굴 가수분해물 투여군의 근육 손실이 대조군에 비하여 감소하는 것으로 나타나 굴 가수분해물의 근섬유 보호 효과를 확인할 수 있었다 (도 14 및 15 참조).
상기 근위축 마우스 모델에서 in vivo 기전 연구를 수행하였다. 먼저 근육 단백질 분해 관련 인자인 MurF1 및 Atrogin1 단백질 발현 및 FoxO3a 활성화 정도를 확인한 결과, 굴 가수분해물 투여군에서 MurF1 및 Atrogin1 단백질의 발현이 유의미하게 감소하고 FoxO3a의 활성이 증가함을 확인할 수 있었다 (도 19 내지 24 참조). FoxO3a는 단백질 분해에 관여하는 인자들의 transcription factor이며, Akt에 의해 phosphorylation되어 cytosol로 location된 뒤 분해된다.
또한, 굴 가수분해물은 근육 단백질 합성 관련 인자인 S6k1, PI3K, AKT, mTOR 및 4E-BP1의 활성을 증가시키는 것으로 나타났다 (도 25 내지 34 참조). PI3K는 인산화되어 활성화된 후, 단백질 합성에 관여하는 인자들을 인사화시켜 골격근에서 단백질 합성을 증가시키고, AKT는 PI3K/Akt/mTOR pathway를 통해 인사화되면 단백질 합성 및 조직의 성장에 관여한다고 알려져 있으며, mTOR complex1 (mTORC1)은 영양, 에너지, 산화환원 센서로 작용하여 Akt에 의해 활성화되면, S6K1, 4EBP1같은 단백질 합성인자들을 조절한다고 알려져 있다.
또한, 미토콘드리아 생합성 관련 인자의 발현을 확인하였다. 미토콘드리아는 세포 속에 들어 있는 작은 발전소로, 근육 세포 내 에너지 분포에 중요한 역할을 한다고 알려져 있으며, 미토콘드리아의 기능 저하는 근육량 및 근 기능 저하를 유발한다고 보고되어 있다.
미토콘드리아 관련 인자 발현 정도를 확인한 결과, 굴 가수분해물 투여군에서 NRF 1/2, TFAM, SIRT1 및 PGC1-a의 발현이 증가하는 것으로 나타났다 (도 35 내지 41 참조). NRF 1/2는 미토콘드리아의 프로모터에 결합하여 미토콘드리아 복제와 전사를 활성화시켜 미토콘드리아 생성을 유도하고, TFAM은 미토콘드리아 전사 인자로, 미토콘드리아 유전자 복제와 전사에 관여하며, SIRT1은 근육 대사에 주요 조절인자로서 PGC1-a의 활성을 조절하고, PGC1-a는 미토콘드리아 생합성의 가장 key factor로 TEAM 발현을 촉진시켜 전사 및 복제를 증가시키는 인자이다.
상기한 바와 같이, 굴 가수분해물은 근육 단백질 분해 인자의 발현을 감소시키고, 근육 단백질 합성 인자의 발현을 증가시키며, 미토콘드리아 생합성 관련 인자의 발현을 증가시켜 근육 감소 및 근 기능 저하를 회복시키므로, 상기 굴 가수분해물은 근육 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 굴 가수분해물을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 허용되는 첨가물을 추가로 포함할 수 있다.
상기 첨가물은 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형 제제는 상기 유효성분 외에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 과제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로솔, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed, 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성, 환자의 골 손실 정도와 같은 요인들에 따라 다르며, 당 업자에 의하여 적절하게 선택될 수 있고, 구체적으로 0.001 mg/kg 내지 500 mg/kg이며, 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 갑셀제 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 "투여 대상"은 인간, 원성이, 소, 말, 돼지, 양, 닭, 고양이, 개, 마우스, 토끼 등을 포함하지만, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 굴 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환의 예방 또는 근기능 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "건강기능식품" 이란, 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 또는 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분 (기능성 원료)을 사용하여 제조하는 것으로, 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리 기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 식품을 의미하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품은 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 액제 등의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명은 굴 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 근육 질환이 예방 또는 근기능 개선용 사료 첨가제를 제공한다.
본 발명의 용어 "사료 첨가제"란 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 의미한다.
본 발명의 사료첨가제는 근육 질환의 예방 또는 개선 효능을 가지므로 가금류, 가축 등에게 꾸준히 섭취하게 함으로써 근육 질환을 예방할 수 있고, 이미 발생한 근육 질환을 개선시킬 수 있다.
상기 사료 첨가제를 공급하는 경우, 가금류 및 가축 등에 대하여 단독으로 공급하거나 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
상기 사료 첨가제를 공급하는 경우, 가금류 및 가축 등에 대하여 단독으로 공급하거나 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
또한, 본 발명의 사료 첨가제는 당업계에 공지된 다양한 사료 제조방법에 따라 적절한 유효 농도 범위에서 굴 가수분해물을 첨가하여 제조 가능하다.
상기 첨가제는 근육 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 하는 개체이면 특별히 한정되지 않고, 어떠한 개체에도 적용 가능하다. 예를 들면, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 모르모트, 랫트, 마우스, 소, 양, 돼지, 염소 등과 같은 비 인간동물, 조류, 또는 어류 등 어떠한 개체에도 적용 가능하다.
본 발명은 단백질 가수분해효소로 굴 단백질을 가수분해하여 얻어진 굴 가수분해물을 함유하는 근육 질환의 예방 및 치료 또는 근기능 개선용 조성물을 제공하는 바, 이러한 제조공정과 제품의 개발을 통하여 이용률이 떨어지는 굴, 손상 굴 및 장기간의 냉동 보관으로 인하여 상품성이 없는 굴을 이용함으로써 수산자원의 효과적인 활용과 고부가가치 제품의 생산을 가능하도록 한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의하여 한정되는 것은 아니다.
재료 준비
본 실험에 사용한 참굴은 경남 통영시 연안의 양식장에서 2014년 10월부터 2015년 4월에 걸쳐 채취하여 통영시 소재 D사에서 알굴의 형태로 급속동결한 제품(Individually Quick Frozen Product)으로 2015년 12월에 구입하여 사용하였다.
굴 단백질 가수분해를 위한 효소로서 Protamex 1.5 MG (1.5 AU/g, Bacillus protease, complex)와 Neutrase 0.8L (0.8 AU/g, endoprotease, Bacillus amyloliquefaciens), 당분해효소인 AMG 300L (exo-1.4-α-D-glucosidase from Aspergillus niger)는 Biosis 사(Busan, Korea)에서 각각 구입하였다. 그리고 발효를 위해 사용한 Saf instant yeast (Saccharomyces cereviciae)는 Societe Industrielle Lesaffre 사(France)제품을 국내의 L사에서 구매하였다.
세포실험을 위한 HepG2 세포는 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. B16F10 melanoma cell (CRL6323) 은 American Type Culture Collection (ATCC; Manassas, VA, USA)에서 분양 받았으며, human dermal fibroblast (CB-HDF-001) 는 Cell Engineering For Orign Bio (Cefobio; Seoul, Korea)에서 분양받았다. 측정용 kit 시약을 제외한 시약은 모두 분석용 특급시약을 사용하였으며, 용매로서 물은 재증류 탈이온수를 사용하였다.
실시예 1. 굴 가수분해물의 발효물 (PNY)의 제조
굴 가수분해물을 제조하기 위하여, 우선 100kg의 냉동굴을 해동하고 수세한 후, 가열(blanching)하는 과정을 거쳤다. 블랜칭된 굴(37.3 kg)을 분쇄기로 분쇄하고, 상기 분쇄된 굴 8kg에 3배의 양인 24kg의 물을 넣은 후, 1% 프로타멕스(Protamex, 80g)를 넣고 40℃에서 1시간 동안 가수분해 반응시키고, 1% 뉴트라아제(Neutrase, 80g)를 넣고 50℃에서 1시간 동안 가수분해 반응시켰다.
이후, 효소 불활성화를 위해 100℃에서 30분 동안 가열하고, 60℃로 온도를 조절한 후 0.5% 이스트(Yeast, 40g) 및 이스트의 탄소급원으로 1% 글루코오스(Glucose, 80g)를 넣고 24℃에서 30분 동안 반응을 시킨 후, 다시 효소 불활성화를 위해 100℃에서 30분 동안 가열하였다. 가수분해물은 200 메쉬(mesh) 여과체로 여과하였고(brix 4.8), 여과액은 90℃에서 5시간 동안 농축시켰다(brix 28.3).
이후, 농축액을 동결건조시키고, 최종적으로 1.5 kg의 굴 가수분해물을 수득하였다. 발효 공정은 굴 가수분해물 이취의 masking이 이루어지는 최소 시간으로 설정하였다.
상기 실시예 1에서와 같이 단백질 분해효소 (Protamex 및 Neutrase)로 가수분해한 가수분해물을 이스트(Yeast)로 발효시킨 발효물을 PNY라 하였다.
상기 PNY는 3차 증류수에 녹인 후, 5분 동안 vortexing하여 충분히 섞어준 후, 10분 동안 소니케이션을 이용하여 완벽하게 녹이고, 0.45μm 필터 (sterile millex, syringe-driven filter unit)로 걸러준 후 하기 실험에 사용하였다.
실험예 1. 굴 가수분해물 (PNY)의 세포 독성 확인
굴 가수분해물의 세포 독성을 확인하기 위하여 마우스 유래 근아세포 (Myoblast)인 C2C12 세포주를 American Type Culture Collection (ATCC, USA)로부터 구입하여 실험을 수행하였다.
C2C12 세포는 10% fetal bovine serum (FBS, Hyclone)과 1% penicillin streptomycin (Caisson Labs, Inc., USA)을 보충한 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Welgene Inc., Daegu, Korea)를 이용하여 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다.
C2C12 세포를 10% 소 혈청배지(fetal bovine serum media) , 1% antibiotics를 이용하여, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 6well 플레이트에 각 Well당 6x104개로 Seeding 후 배지에 부착된 세포의 포화도 (confluent)가 80%이상되면 분화배지인 2% 말 혈청배지(horse serum media)로 바꾸어, 근아세포를 근관세포로 7일간 분화시켰다. 배지 교환은 2일에 한번 하였다.
근관세포로 분화유도 7일째 되는 날, 근과세포에 대한 독성 여부를 알아보기 위하여, PNY를 0, 25, 50, 100, 200, 400 μg/mL의 농도가 되도록 배지에 녹여 세포에 처리한 후 48시간 동안 배양하였다.
세포 생존율은 Cell Counting Kit-8(CCK-8, Dojindo, Kumamoto, Japan)을 이용하여 ELISA reader (Bio-Tek Instruments Inc., Winooski, VT) 로 540nm에서 측정하였고, 아무것도 처리하지 않은 정상군에 대비한 흡광도 비율을 %로 나타내었다. .
PNY 는 400μg/mL의 농도까지 세포 독성을 보이지 않았다 (도 1).
실험예 2. 굴 가수분해물 (TGPN 및 PNY) 처리에 따른 근세포 손상 개선 효과 확인
굴 가수분해물이 근위축에 미치는 영향을 확인하기 위하여 마우스 유래 근아세포(Myoblast)인 C2C12 세포로부터 분화 유도된 근관세포 (Myotube)에 근육 손상을 유발시키고, 굴 가수분해물 (TGPN 및 PNY)을 처리하여 근관세포 손상의 개선 정도를 확인하였다.
C2C12 세포를 10% 소 혈청배지(fetal bovine serum media) , 1% antibiotics를 이용하여, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 6well 플레이트에 각 Well당 6x104개로 Seeding 후 배지에 부착된 세포의 포화도 (confluent)가 80%이상되면 분화배지인 2% 말 혈청배지(horse serum media)로 바꾸어, 근아세포를 근관세포로 7일간 분화시켰다. 배지 교환은 2일에 한번 하였다.
근관세포로 분화유도 7일째 되는 날, dexamethasone 50μM 과 굴 가수분해물 (PNY,100, 200, 400 ㎍/ml) 을 동시에 처리하고 48 시간 동안 배양하였다. 정상군은 아무것도 처리하지 않은 무처리군으로 하였으며, 덱사메타손만 처리한 군을 대조군으로 하였다.
48시간 배양 후, well을 무작위로 선택하고 광학현미경(CKX41, Olympus)을 이용하여 x400배율로 촬영 한 후, image J software(USA)를 이용하여 근관세포의 직경을 측정하였다. 각 well로부터 최소 10개의 근관세포의 직경을 분석하였고, 실험은 6번 반복하였다.
그 결과, 정상군에 비하여 대조군의 근관세포 직경은 27% 감소하였고, PNY 처리군은 대조군에 비하여 농도 (100, 200, 400 ㎍/ml)에 따라 각각 36%, 44%, 50% 증가하였다 (도 2 및 도 3).
실험예 3. 굴 가수분해물 (PNY) 처리에 따른 근육 단백질의 분해 또는 합성 단백질 발현의 변화 확인
3-1. 근육 단백질의 분해에 관여하는 MuRF-1 단백질 발현 증가의 완화 확인
굴 가수분해물이 근육 단백질 분해에 관여하는 MuRF-1 단백질의 발현 증가를 완화시키는지 확인하기 위하여 웨스턴블롯을 수행하였다.
구체적으로, 실험예 2의 세포로부터 cOmpleteTM 프로테아제 인히비터 칵테일 타블렛(cOmpleteTM protease inhibitor cocktail tablets, Roche Diagnostics, 미국) 4개, 수크로오스(sucrose) 17115 g, 1 M의 트리스 버퍼(tris buffer, Trizma base, pH 74) 2 mL, 05 M의 EDTA(pH 80) 02 mL, 및 증류수(distilled water, DW)를 포함하는 용해 완충액(lysis buffer)을 이용해 제조사 프로토콜에 따라 단백질을 추출하였다.
PierceTM BCA 단백질 분석 키트(PierceTM BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, 미국)를 이용해 제조사 프로토콜에 따라 단백질 농도를 확인해 일정 농도로 조정한 뒤, 동일한 농도의 단백질을 75%의 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔(Sodium Dodecyl Sulfate(SDS)-polyacrylamide gel)에서 전기영동하여 일렉트로블롯팅 (electroblotting)을 통해 폴리비닐이딘 플루오라이드(Polyvinylidene fluoride, PVDF) 막으로 이동(transfer)시켰다. 상기 막을 5%의 탈지유(skim milk)를 이용해 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)한 후, 4℃에서 MuRF-1 단백질의 1차 항체와 밤새 인큐베이션하였고, 다음날 2차 항체와 2시간 동안 인큐베이션한 후, LAS3000 발광 이미지 분석기(LAS3000 luminescent image analyzer, 후지 필름사, 일본)로 현상하였다.
그 결과, MuRF-1 단백질의 발현은 정상군 대비 대조군에서 2.9배 증가하였고, PNY 처리군은 대조군에 비하여 농도 (100, 200, 400 ㎍/ml)에 따라 21%, 24%, 42% 감소하였다 (도 4 및 도 5).
3-2. 근육 단백질의 분해에 관여하는 atrogin-1 유전자 발현 증가의 완화 확인
굴 가수분해물이 근육 단백질 분해에 관여하는 atrogin-1 유전자 발현 증가를 완화시키는지를 qRT-PCR(quantitative real-time PCR)을 이용하여 확인하였다.
구체적으로, 실험예 2의 세포로부터 RNA RED(인트론, 한국)를 이용해 제조사 프로토콜에 따라 mRNA를 추출하고, cDNA 합성 키트(TaKaRa, 일본)를 이용해 제조사 프로토콜에 따라 cDNA를 합성한 뒤, 하기 표 1의 프라이머와 ABI Step One Plus TM Real-Time PCR System(Applied Biosystems, 미국)을 이용해 통상의 공지된 방법에 따라 qRT-PCR을 수행하였다.
프라이머 이름 | 프라이머 서열 | 서열번호 | |
Atrogin-1 forward | AGAAAGAAAGACATTCAGAACA | 1 | |
Atrogin-1 reverse | GCTCCTTCGTACTTCCTT | 2 | |
GAPDH forward | TGCTGCATACGAGCATCCAT | 3 | |
GAPDH reverse | TGTCCTCAAAGTGAACCGCA | 4 |
그 결과, atrogin-1 유전자 발현은 정상군 대비 대조군에서 3.2배 증가하였고, PNY 처리군은 대조군에 비하여 농도 (100, 200, 400 ㎍/ml)에 따라 39%, 50%, 62% 감소하였다 (도 6).
3-3.
근육 단백질의 합성에 관여하는 S6K1 및 4E-BP1 단백질 발현의 증가 확인
굴 가수분해물이 근육 단백질 합성에 관여하는 S6K1 및 4E-BP1 단백질의 발현을 증가시키는지 확인하기 위하여 웨스턴블롯을 수행하였다.
구체적으로, 실험예 2의 세포로부터 단백질을 추출하고, 이를 분석하였으며, 구체적인 실험 방법은 실험예 3-1과 동일하게 수행하였다. 아울러, S6K1 및 4E-BP1은 인산화되어 활성화됨으로써 근육 합성에 관여하기 때문에, p-S6K1와 t-S6K1의 비율 및 p-4E-BP1와 t-4E-BP1의 비율을 측정하였다.
그 결과, p-S6K1와 t-S6K1의 비율은 정상군 대비 대조군에서 50% 감소하였고, PNY 처리군은 대조군에 비하여 농도 (100, 200, 400 ㎍/ml)에 따라 24%, 28%, 43% 증가하는 것으로 나타났다 (도 7 및 도 8).
또한, p-4E-BP1와 t-4E-BP1의 비율은 정상군 대비 대조군에서 21% 감소하였고, PNY 처리군은 대조군에 비하여 농도 (100, 200, 400 ㎍/ml)에 따라 30%, 29%, 33% 증가하는 것으로 나타났다 (도 9 및 도 10).
In vitro 실험 결과를 하기 표 2에 정리하였다.
In vitro | PNY | |||
100 | 200 | 400 | ||
Myotube diameter | +35% | +44% | +50% | |
합성 | p-S6K1/t- S6K1 | +24% | +28% | +43% |
p-4E-BP1/t-4E-BP1 | +30% | +29% | +33% | |
분해 | MuRF1 | -21% | -24% | -42% |
Atrogin1(mRNA) | -39% | -50% | -62% |
상기 결과와 같이, 굴 가수분해물 (PNY)은 근관세포의 지름을 증가시키고, 근육 단백질 합성에 관여하는 단백질의 인산화를 증가시켰으며, 근육 단백질 분해에 관여하는 인자의 발현을 감소시킴으로써, 근 위축을 완화시킨다.
실험예 4. 굴 가수분해물 (PNY) 투여에 따른 근육 무게 및 근섬유 단면적의 변화 확인
굴 가수분해물이 근위축에 따른 근육 무게 및 근섬유 단면적의 감소를 개선시키는지 확인하기 위하여 Immobilization-induced muscle atrophy 동물 모델을 제작하였다.
5주령의 수컷 C57BL/6 마우스를 일주일동안 동물실 환경에 적응시킨 뒤, 실험조건에 따라 7개의 군으로 나누었다. 구체적으로, 무처치 대조군 (정상군, N), 근위축 유도군 (대조군, IM), 근위축 유도 및 PNY 200mg/kg 투여군 (PNY 200), PNY 400mg/kg 투여군 (PNY 400) 및 근위축 유도 및 굴단백 400mg/kg 을 투여한 양성 대조군 (굴단백, CG, 400)으로 구분하였다.
근위축은 'Disease models & mechanisms, 8(9), 1059-1069, 2015'에 따라 15 mL 마이크로퓨즈 튜브(microfuge tube), 클립 및 벨크로 테이프로 제작한 고정 기구를 마우스 한쪽 뒷다리에 적용하는 다리고정(immobilization)을 이용해 유도하였다. 오른쪽 다리를 고정시켜 근위축을 유도하고 1주일 후부터 다리를 계속 고정한 채 2주 동안 시료를 1일 1회 경구투여하였다. 실험 종료후 장딴지근, 대퇴근, 가자미근을 채취하여 -80℃에 보관하며 실험에 사용하였다.
4-1. 근육 무게 감소 완화 효과 확인
마우스에서 채취한 근육의 무게를 측정한 결과,
대퇴사두근의 경우, 정상군에 비하여 대조군은 21.6% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 18% 및 29% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 7% 증가하는 것으로 나타났다 (도 11).
장딴지근의 경우, 정상군에 비하여 대조군은 24.6% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 7% 및 9% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 6% 증가하는 것으로 나타났다 (도 12).
가자미근의 경우는, 정상군에 비하여 대조군은 42% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 19% 및 21% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 10% 증가하는 것으로 나타났다 (도 13).
4-2. 근섬유 단면적 감소 완화 효과 확인
마우스의 장딴지근 조직을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정한 뒤, 헤마톡실린 및 에오신(hematoxylin and eosin, H&E)으로 염색하였고, 광학현미경으로 조직을 관찰하고, 이미지 J 소프트웨어(image J softwar)를 이용해 근섬유 단면적을 정량화하였다.
그 결과, 근섬유 단면적은 정상군에 비하여 대조군은 50% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 26% 및 34% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 23% 증가하는 것으로 나타났다 (도 14 및 도 15).
실험예 5. 굴 가수분해물 (PNY) 투여에 따른 악력 및 운동수행능력 변화 확인
5-1 악력테스트 (Grip strength test)
굴 가수분해물의 근육 최대힘의 변화를 측정하기 위하여 악력테스트를 실시하였다.
구체적으로, 마우스의 꼬리를 잡고 마우스가 악력 시험장치를 잡게한 후 꼬리를 뒤로 잡아당길 때 나타나는 앞발과 뒷발의 최대 악력을 측정하였다. 악력은 3회 반복 측정한 후 평균값을 사용하였다.
마우스의 악력은 정상군에 비하여 대조군은 29% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 18% 및 29% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 7% 증가하는 것으로 나타났다 (도 16).
5-2 운동수행능력 평가 (treadmill test)
굴 가수분해물의 지구성 운동수행 능력의 변화를 측정하기 위하여, 트레드밀 운동을 시켰다.
구체적으로, actual test전에 적응시키기 위해 16m/min으로 10분간 진행을 시켰으며, 본 실험에서는 12m/min으로 시작하여 최종 30m/min까지 매 3분마다 3m/min씩 속도를 증가시켰다. 더 이상 트레이드밀 속도를 따라가지 못하는 것이 10초 이상될 때 탈진상태로 간주하였다. 본 실험방법은 식약처 운동수행능력향상 기능성평가 가이드라인을 준수하였다.
먼저, 마우스의 탈진 시까지 걸린 시간은, 정상군에 비하여 대조군은 44% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 29% 및 53% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 31% 증가하는 것으로 나타났다 (도 17).
또한, 마우스의 달린 거리는, 정상군에 비하여 대조군은 58% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 37% 및 85% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 47% 증가하는 것으로 나타났다 (도 18).
실험예 6. 굴 가수분해물 (PNY) 투여에 따른 근육 단백질의 분해 또는 합성 단백질 발현의 변화 확인
6-1 근육 단백질의 분해에 관여하는 MuRF-1, atrogin-1 및 FoxO3a 발현 증가의 완화 확인
굴 가수분해물이 근육 단백질 분해에 관여하는 인자의 발현 및 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.
구체적으로, 마우스의 장딴지근 조직으로부터 cOmpleteTM 프로테아제 인히비터 칵테일 타블렛(cOmpleteTM protease inhibitor cocktail tablets, Roche Diagnostics, 미국) 4개, 수크로오스(sucrose) 17115 g, 1 M의 트리스 버퍼(tris buffer, Trizma base, pH 74) 2 mL, 05 M의 EDTA(pH 80) 02 mL, 및 증류수(distilled water, DW)를 포함하는 용해 완충액(lysis buffer)을 이용해 제조사 프로토콜에 따라 단백질을 추출하였다.
PierceTM BCA 단백질 분석 키트(PierceTM BCA Protein Assay Kit, Thermo Fisher Scientific, 미국)를 이용해 제조사 프로토콜에 따라 단백질 농도를 확인해 일정 농도로 조정한 뒤, 동일한 농도의 단백질을 75%의 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔(Sodium Dodecyl Sulfate(SDS)-polyacrylamide gel)에서 전기영동하여 일렉트로블롯팅 (electroblotting)을 통해 폴리비닐이딘 플루오라이드(Polyvinylidene fluoride, PVDF) 막으로 이동(transfer)시켰다. 상기 막을 5%의 탈지유(skim milk)를 이용해 상온에서 1시간 동안 블로킹(blocking)한 후, 4℃에서 MuRF-1, Atrogin1 및 FoxO3a 단백질의 1차 항체와 밤새 인큐베이션하였고, 다음날 2차 항체와 2시간 동안 인큐베이션한 후, LAS3000 발광 이미지 분석기(LAS3000 luminescent image analyzer, 후지 필름사, 일본)로 현상하였다.
MuRF-1의 경우, 정상군에 비하여 대조군에서 발현이 37% 증가하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 25% 및 30% 감소하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 14% 감소하는 것으로 나타났다 (도 19 및 도 20).
Atrogin1의 경우, 정상군에 비하여 대조군에서 발현이 31% 증가하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 24% 및 32% 감소하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 24% 감소하는 것으로 나타났다 (도 21 및 도 22).
p-FoxO3a 와 t-FoxO3a의 비율은, 정상군에 비하여 대조군에서 27% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 41% 및 55% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 37% 증가하는 것으로 나타났다 (도 23 및 도 24).
6-2 근육 단백질의 합성에 관여하는 S6k1, PI3K, AKT, mTOR 및 4E-BP1
단백질 인산화 증가 확인
굴 가수분해물이 근육 단백질 합성에 관여하는 S6K1, PI3K, AKT, mTOR 및 4E-BP1의 인산화를 증가시키는지 확인하기 위하여 웨스턴블롯을 수행하였다.
구체적인 실험 방법은 실험예 6-1과 동일하게 수행하였다. 아울러, S6K1, PI3K, AKT, mTOR 및 4E-BP1은 인산화되어 활성화됨으로써 근육 합성에 관여하기 때문에, 인산화 단백질/ 총 단백질의 비율을 측정하였다.
S6K1의 경우, 정상군에 비하여 대조군에서 19% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 30% 및 34% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 25% 증가하는 것으로 나타났다 (도 25 및 도 26).
PI3K의 경우, 정상군에 비하여 대조군에서 20% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 33% 및 36% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 33% 증가하는 것으로 나타났다 (도 27 및 도 28).
AKT의 경우, 정상군에 비하여 대조군에서 23% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 31% 및 63% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 58% 증가하는 것으로 나타났다 (도 29 및 도 30).
mTOR의 경우, 정상군에 비하여 대조군에서 23% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 24% 및 29% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 22% 증가하는 것으로 나타났다 (도 31 및 도 32).
4E-BP1의 경우, 정상군에 비하여 대조군에서 29% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 46% 및 51% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 34% 증가하는 것으로 나타났다 (도 33 및 도 34).
실험예 7. 굴 가수분해물 (PNY) 투여에 따른 미토콘드리아 생합성 관련 인자 발현 변화 확인
미토콘드리아 생합성 관련 인자 (NRF 1/2, TFAM, SIRT1 및 PGC1-a) 의 발현을 확인하였다.
7-1 NRF 1/2, TEAM 유전자 발현 증가 확인
굴 가수분해물이 미토콘드리아 생합성에 관여하는 NRF 1/2, TEAM 유전자 발현을 증가시키는지 확인하기 위하여 qRT-PCR(quantitative real-time PCR)을 수행하였다.
구체적으로, 마우스의 장딴지 근육으로부터 RNA RED(인트론, 한국)를 이용해 제조사 프로토콜에 따라 mRNA를 추출하고, cDNA 합성 키트(TaKaRa, 일본)를 이용해 제조사 프로토콜에 따라 cDNA를 합성한 뒤, 하기 표 3의 프라이머와 ABI Step One Plus TM Real-Time PCR System(Applied Biosystems, 미국)을 이용해 통상의 공지된 방법에 따라 qRT-PCR을 수행하였다.
프라이머 이름 | 프라이머 서열 | 서열번호 |
NRF 1 forward | GAGGGGCTACCTTCCTCTCA | 5 |
NRF 1 reverse | TTTACCCTCTGTGGTCACGC | 6 |
NRF 2 forward | TTCCTCTGCTGCCATTAGTCAGTC | 7 |
NRF 2 reverse | GCTCTTCCATTTCCGAGTCACTG | 8 |
TFAM forward | GCTTCCAGGAGGCTAAGGAT | 9 |
TFAM reverse | CCCAATCCCAATGACAACTC | 10 |
NRF 1의 경우, 정상군에 비하여 대조군에서 49% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 158% 및 219% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 64% 증가하는 것으로 나타났다 (도 35).
NRF 2의 경우, 정상군에 비하여 대조군에서 60% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 107% 및 156% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 58% 증가하는 것으로 나타났다 (도 36).
TFAM의 경우, 정상군에 비하여 대조군에서 22% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 25% 및 52% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 22% 증가하는 것으로 나타났다 (도 37).
7-2 SIRT1 및 PGC1-a 단백질 발현 증가 확인
굴 가수분해물이 미토콘드리아 생합성에 관여하는 SIRT1 및 PGC1-a 단백질 발현을 증가시키는지 확인하기 위하여 웨스턴블롯을 수행하였다.
구체적인 실험 방법은 실험예 6-1과 동일하게 수행하였다.
SIRT1의 경우, 정상군에 비하여 대조군에서 24% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 34% 및 49% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 24% 증가하는 것으로 나타났다 (도 38 및 도 39).
PGC1-a의 경우, 정상군에 비하여 대조군에서 32% 감소하였고, 대조군에 비하여 PNY 200 및 400 mg/kg 투여군은 각각 66% 및 78% 증가하였으며, 굴단백을 투여한 양성 대조군은 40% 증가하는 것으로 나타났다 (도 40 및 도 41).
In vivo 실험 결과를 하기 표 4에 정리하였다.
In vivo | PNY | CG | ||
200 | 400 | 400 | ||
악력 | +18% | +29% | + 7% | |
근육 무게 | Quadriceps (속근) | +16% | + 18% | + 10% |
Gastrocnemius(속근) | +7% | + 9% | +6% | |
Soleus (지근) | + 19% | + 21% | + 10% | |
TreadmillTest | Time | + 29% | + 53% | + 31% |
Distance | + 37% | + 85% | + 47% | |
CSA(근섬유단면적) | + 26% | + 34% | + 23% | |
protein degradation | p-FoxO3a/t-FoxO3a | + 41% | + 55% | + 37% |
MuRF1 | -25% | -30% | -14% | |
Atrogin1 | -23% | -32% | -24% | |
proteinsynthesis | p-S6K1/t-S6K1 | +30% | +34% | +25% |
p-4E-BP1/t-4E-BP1 | + 46 % | + 51 % | + 34 % | |
p-PI3K/t-PI3K | +33% | +36% | +33% | |
p-Akt/t-Akt | +31% | +63% | +58% | |
p-mTORC1 /t-mTORC1 | +24% | +29% | +22% | |
Mitochondriabiogenesis | NRF-2 | +107% | +156% | +58% |
NRF-1 | +158% | +219% | +64% | |
PGC1-a | +66% | +78% | +40% | |
TFAM | +25% | +52% | +22% | |
SirT1 | +34% | +49% | +24% |
상기 결과에서 알 수 있듯이, 굴 가수분해물 (TGPN)은 근육 단백질 합성에 관여하는 단백질의 인산화를 증가시키고, 근육 단백질 분해에 관여하는 인자의 발현을 감소시키며, 미토콘드리아 생합성에 관여하는 인자의 발현을 증가시킴으로써 근 위축을 완화시킨다.
<110> OCEANPEP Co., LTD
<120> Pharmaceutical composition for preventing or treating muscle
diseases containing oyster hydrolyzate as an active ingredient
<130> 2020P-08-011
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Atrogin-1 forward
<400> 1
agaaagaaag acattcagaa ca 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Atrogin-1 reverse
<400> 2
gctccttcgt acttcctt 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH forward
<400> 3
tgctgcatac gagcatccat 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GAPDH reverse
<400> 4
tgtcctcaaa gtgaaccgca 20
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<211> 20
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<213> Artificial Sequence
<220>
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gaggggctac cttcctctca 20
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tttaccctct gtggtcacgc 20
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<220>
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ttcctctgct gccattagtc agtc 24
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<213> Artificial Sequence
<220>
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<400> 10
cccaatccca atgacaactc 20
Claims (10)
- 굴 가수분해물을 유효성분으로 함유하는, 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서,상기 굴 가수분해물은,1) 5 내지 20분 동안 열처리한 굴을 분쇄하는 단계;2) 상기 단계 1)의 굴 분쇄물에 단백질 분해효소를 처리하여 30 내지 65 ℃의 온도에서 0.5 내지 12시간 반응시키는 단계; 3) 100℃에서 10 내지 50분 동안 가열하여 효소를 불활성화시키는 단계;4) 효모 및 효모의 탄소원을 처리하여 20 내지 30 ℃에서 10 내지 50분 동안 발효시키는 단계: 및5) 100℃에서 10 내지 50분 동안 가열하여 효소를 불활성화시키는 단계;를 포함하는 가수분해과정을 거쳐 수득되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 단백질 분해효소는 프로타멕스(Protamex), 플라보자임(Flavourzyme), 뉴트라제(Neutrase), BP-트립신(trypsin from bovine pancreas), 알카라제(Alcalase), 키모트립신(α-caymotrypsin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 단계 2)는, 프로타멕스를 처리하고 40 ℃의 온도에서 1시간 반응시키고, 이어서 뉴트라제를 처리하고 50 ℃의 온도에서 1시간 반응시키는, 2단 가수분해과정인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 근육 분해 관련 인자 (MuRF-1, Atrogin1 및 FoxO3a)의 발현 증가를 완화시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 근육 합성 관련 인자 (PI3K, AKT, mTORC1, S6K1 및 4EBP1)의 인산화를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 미토콘드리아 생합성 관련 인자 (SirT1, PGC1-α, TFAM 및 NRF-1/2)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서,상기 근육 질환은 근육감소증(sarcopenia), 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy) 및 근육 퇴화로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
- 굴 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 근육질환의 예방 또는 근기능 개선용 건강기능식품 조성물.
- 굴 가수분해물을 유효성분으로 함유하는 근육질환의 예방 또는 근기능 개선용 사료첨가제.
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