KR20220133283A - 항종양 조성물 - Google Patents

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KR20220133283A
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샤오펀 쉬
홍징 유
시 량
닝윤 순
빈 웬
위엔 가오
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Abstract

본 발명은, (A) 아커만시아; 및 (B) PD-1 억제제, PD-L1 억제제 및 CTLA-4 억제제와 같은 면역 관문 억제제를 포함하는 항종양 조성물을 제공한다. 또한, 종양 치료용 약물의 제조에서의 아커만시아의 용도를 제공한다.

Description

항종양 조성물
본 출원은 항종양 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 아커만시아 조성물과 면역 관문 억제제의 결합 사용에 관한 것이다.
의학 분야에서 암을 치료하는 것은 하나의 큰 어려운 문제이다. 전통적인 화학 요법 및 방사선 요법과 같은 치료 방법은 환자에게 더 큰 부작용과 고통을 가져올 수 있다. 최근 몇 년 동안, 암 면역 요법은 혈액 종양 및 일부 고형 종양에서 놀라운 치료 효과를 보여주고 있고, 환자에게 주는 부작용이 적어 인류에게 암 치료에 대한 큰 희망을 가져다주었다.
정상적인 상황에서 종양 세포의 표면에는 인체 면역 T 세포에 의해 식별될 수 있는 항원이 존재하며, 인체 면역체계는 종양 세포를 식별하고 살상할 수 있지만, 종양 세포는 생존 및 성장하기 위해 다양한 방법으로 면역체계에 의한 식별과 살상을 피한다. 종양 면역 요법은 종양 세포를 식별하고 파괴하여 신체가 다양한 종양을 제어하고 제거할 수 있는 정상적인 항종양 면역 반응을 회복하도록 하는 트릭이다. 종양 면역 요법은 주로 (1) 치료성 항체, (2) 암 백신, (3) CAR-T 요법과 같은 세포 요법, (4) 면역 조절제 및 (5) 면역 관문 억제제의 5가지 유형을 포함한다.
인체 면역체계의 활성은 면역 관문인 공동자극 분자에 의해 조절된다. 항원 식별이 발생하면 다른 분자가 면역 세포 및 표적 세포 표면 분자와 상호작용하여 상호작용의 균형을 결정한다. 신호가 아주 큰 정도로 양성이면 면역 세포가 활성화되어 표적 세포가 제시하는 항원을 공격한다. 반대로 신호가 음성이면 면역 세포가 비활성화되는데, 이러한 비활성화는 때때로 영구적인 것으로 항원을 정상적/자체 항원으로 식별한다. 이미 비교적 잘 연구된 암 관련 면역 관문으로는 CTLA-4, PD-1 및 PD-L1이 포함된다. 면역 관문 억제제는 해당 면역 관문을 대상으로 연구 개발된 단일클론 항체 약물로서, 그 주요 기능은 면역 관문을 발현하는 종양세포와 면역세포 간의 작용을 차단하여 면역세포에 대한 종양세포의 억제 작용을 차단하는 것이다. 현재 널리 사용되는 면역 관문 억제제로는 표적 프로그램성 사망 단백질 1 (PD-1)과 그 리간드(PD-L1)의 단일클론 항체가 포함된다. PD-1 항체는 말기 흑색종, 비소세포폐암 및 신장 세포암을 차단하는 데 매우 효과적이며 종양 치료에서 획기적인 돌파를 이루었다. 그러나, 면역 관문 억제제는 종양의 발병 메커니즘이 복잡하고, 환자 개체의 차이가 크고, 환경적 요인의 영향으로 인해 현재 약 25%의 환자에서만 효과를 나타내고 있다.
장내 미생물도 암 면역 요법의 효과에 영향을 주는 중요한 요인이라는 연구가 갈수록 많아지고 있다. 2015년
Figure pct00001
등은 마우스에 대해 항생제로 치료하거나 무균 마우스 체내에 접종한 종양이 CTLA-4 억제제에 반응하지 않았지만, 박테로이데스 프라길리스(Bacteroides fragilis)를 먹였을 때 CTLA-4 억제제의 항종양 효과가 회복되는 것을 발견하였다. 2017년 Routy B 등의 연구에 따르면 항-PD-1 억제제와 일부 특정 장내 세균군을 결합 사용하면 종양 환자가 이에 대한 반응이 현저히 높아지고, 환자의 평균 무진행 생존 기간(PFS)을 현저히 높이는 것으로 나타났다. 종합적으로 장내 미생물은 면역 관문 억제제의 치료 효과를 높이는 데 커다란 응용 잠재력이 있다. 따라서, 본 분야에서는 특히 특정된 종양에 대해 더 우수한 치료 효과를 갖는 새로운 항종양 조성물을 개발할 필요가 있다.
본 출원의 발명자는, 아커만시아 조성물과 면역 관문 억제제를 결합 사용하면 결장암, 폐암, 유방암, 흑색종, 신장암 및 요로상피암 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 종양을 효과적으로 억제할 수 있음을 발견하였다.
본 출원의 일 측면에서,
(A) 아커만시아; 및
(B) 면역 관문 억제제를 포함하는 항종양 조성물을 제공한다.
본 출원의 일 예에서, 상기 아커만시아는 아커만시아 균주 Akkermansiamuciniphila SSYD-3이며, 이의 수탁번호는 CGMCC No.14764이다.
본 출원의 일 예에서, 상기 아커만시아는 다른 박테리아(예를 들어, 비피도 박테리움, 락토바실러스, 클로스트리듐, 엔테로코커스 패시움, 대변 프레보텔라 및 루멘 박테리아)와 함께 조합된다.
본 출원의 일 예에서, 상기 아커만시아는 면역 관문 억제제와 혼합하여 단일 제제로 제조되거나 물리적으로 분리되어 별도로 사용된다.
본 출원의 일 예에서, 상기 아커만시아는 경구로 투여된다.
본 출원의 일 예에서, 상기 항종양 조성물은 항생제를 추가로 포함한다.
본 출원의 일 예에서, 상기 종양은 결장암, 폐암, 유방암, 흑색종, 신장암 또는 요로상피암으로부터 선택된다.
본 출원의 다른 측면에서, 종양 치료용 약물 제조에서의 아커만시아의 용도를 제공한다.
본 출원의 일 예에서, 상기 아커만시아는 면역 관문 억제제와 결합 사용된다.
본 출원의 일 예에서, 상기 용도는 종양에 대한 면역 관문 억제제의 억제 효과를 개선하기 위한 것이고, 상기 종양은 결장암, 폐암, 유방암, 흑색종, 신장암 또는 요로상피암 등으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
도 1은 항상제의 처리에 의해 파괴된 장내 세균군이 MC38 종양 보유 마우스에 대한 항-m PD-1의 치료 효과에 주는 영향을 도시한다.
도 2는 항-mPD-1을 단독 주사할 경우 및 아커만시아 SSYD-3과 결합 사용할 경우, MC38 종양에 대한 치료 효과를 도시한다.
도 3은 항-mPD-1을 단독 주사할 경우 및 아커만시아 SSYD-3과 결합 사용할 경우, MC38 종양 보유 마우스 체내에서 종양이 침윤한 CD8 T세포의 수를 도시한다.
도 4는 항-m PD-1을 단독 주사할 경우 및 아커만시아 SSYD-3과 결합 사용할 경우, MC38 종양 보유 마우스 체내에서 CD3 세포 평균 수를 도시한다.
도 5는 항-m PD-1을 단독 주사할 경우 및 아커만시아 SSYD-3과 결합 사용할 경우, MC38 종양 보유 마우스 체내에서 Treg 세포의 평균 수를 도시한다.
도 6은 항-m PD-1을 단독 주사할 경우 및 아커만시아 SSYD-3과 결합 사용할 경우, 4T1 종양에 대한 치료 효과를 도시한다.
도 7은 항-m PD-1을 단독 주사할 경우 및 아커만시아 SSYD-3과 결합 사용할 경우, LLC1 종양에 대한 치료 효과를 도시한다.
본 발명에서, 달리 명시되지 않는 한, 백분율(%) 또는 부는 모두 조성물에 대한 중량 백분율 또는 중량부를 의미한다.
본 발명에서, 달리 명시되지 않는 한, 관련된 각 성분 또는 이의 바람직한 성분은 서로 조합되어 새로운 기술 방안을 형성할 수 있다.
본 발명에서, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 언급된 모든 실시형태 및 바람직한 실시형태는 서로 조합되어 새로운 기술 방안을 형성할 수 있다.
본 발명에서, 달리 명시되지 않는 한, 본 명세서에 언급된 모든 기술적 특징 및 바람직한 특징은 서로 조합되어 새로운 기술 방안을 형성할 수 있다.
본 발명에서, 상반된 설명이 없다면, 조성물 내의 각 성분의 총 함량은 100%이다.
본 발명에서, 상반된 설명이 없다면, 조성물 내의 각 성분의 총 부수는 100 중량부일 수 있다.
본 발명에서, 달리 언급되지 않는 한, 수치 범위 "a 내지 b"는 a와 b 사이 실수의 임의의 조합을 축약하여 나타내며, 여기서 a와 b는 모두 실수이다. 예를 들어, 수치 범위 "0 내지 5"는 "0 내지 5" 사이의 모든 실수가 본 명세서에 나열되었음을 의미하고, "0 내지 5"는 이러한 수치의 조합을 축약하여 나타낸 것 뿐이다.
본 발명에서, 달리 언급되지 않는 한, 정수 수치 범위 "a 내지 b"는 a와 b 사이의 정수의 임의의 조합을 축약하여 나타내며, 여기서 a와 b는 모두 정수이다. 예를 들어, 정수 수치 범위 "1 내지 N"은 1, 2......N을 의미하고, 여기서 N는 정수이다.
본 발명에서, 달리 언급되지 않는 한, "이들의 조합"은 두 가지, 세 가지, 네 가지 및 최대 가능한 다성분 혼합물과 같은 상기 각 요소의 다성분 혼합물을 의미한다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에서 용어 "하나"는 "적어도 하나"를 의미한다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 언급된 백분율(중량 백분수를 포함)은 상기 조성물의 총 중량을 기준으로 한다.
본 명세서에 개시된 "범위"는 하한 및 상한의 형태이고, 각각 하나 이상의 하한과 하나 이상의 상한일 수 있다. 주어진 범위는 하나의 하한과 하나의 상한을 선택하여 정의된다. 선택된 하한 및 상한은 특정 범위의 경계를 정의한다. 이러한 방식으로 정의될 수 있는 모든 범위는 포괄적이고 조합 가능하다. 즉, 임의의 하한이 임의의 상한과 조합되어 하나의 범위를 형성할 수 있다. 예를 들어, 특정 매개변수에 대해 나열된 60 내지 120 및 80 내지 110의 범위는 60 내지 110 및 80 내지 120의 범위도 고려되는 것으로 이해되어야 한다. 또한 최소 범위 값 1 및 2가 나열되고 최대 범위 값 3, 4 및 5가 나열되면 다음의 범위 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5 , 2 내지 3, 2 내지 4 및 2 내지 5 모두가 예측된다.
본 명세서에서, 달리 언급되지 않는 한, 각 성분의 비율 또는 중량은 모두 건조 중량을 의미한다.
본 명세서에서, 달리 언급되지 않는 한, "변화되지 않은"은 ±10% 이내, 바람직하게는 ±5% 이내, 보다 바람직하게는 ±2% 이내, 최종적으로 ±1% 이내의 변화를 의미한다.
본 명세서에서, 아커만시아 균주는 아커만시아 균주에서 유래된 활성화 성분을 포함하거나 서열 검정 결과가 아커만시아의 서열과 97% 이상의 유사성을 갖는 균주이다.
아커만시아 균주
본 출원에 따른 아커만시아 균주는 상업적 경로 또는 종래 기술을 통해 얻을 수 있다. 예를 들어, 출원번호가 CN201380070847.0이고 공개번호가 CN 104918626 A인 중국 발명 특허 출원에는 "대사 장애 치료를 위한 아커만시아 균주의 용도"가 개시되었고, 상기 특허 출원에는 아커만시아 균주 ATCC BAA835가 개시되었다.
본 출원의 바람직한 일 예에서, 상기 아커만시아 균주는 Akkermansiamuciniphila SSYD-3으로 명명되고, 이의 수탁번호는 CGMCC No.14764이다.
본 발명의 Akkermansiamuciniphila SSYD-3 (약칭: W03 균주)은 2017년 9월 29일 중국 미생물균종 수탁관리 위원회의 일반 미생물 센터(CGMCC)에 수탁되었으며, 수탁 주소는 베이징시 조양구 Beichen West Road 1호원 3호이고, 우편번호는 100101이며, 수탁번호는 CGMCC No.14764이고, 배양물 명칭은 Akkermansiamuciniphila SSYD-3이며, 분류 명칭은 Akkermansiamuciniphila이다.
상기 아커만시아 균주는 드링크제, 정제, 캡슐, 경구 붕해형 정제, 동결건조 분말 등과 같은 다양한 적합한 제형으로 제조될 수 있다. 본 출원의 바람직한 일 예에서, 상기 제형은 캡슐이다. 본 출원의 다른 바람직한 예에서, 상기 제형은 정제이다. 상기 제형은 동결건조 박테리아 제제이고, 여기서 생균 수는 1010CFU/g인 것이 바람직하다. 여기서, 상기 유효량이란 아커만시아를 주요 약물 활성성분으로 조제된 고체 생균 제제에 포함된 총 생균 수가 106 내지 1014 CFU/g임을 의미한다. 여기서, 상기 유효량이란 아커만시아를 주요한 약물 활성성분으로 제조된 액체 생균 제제에 포함된 총 생균 수가 106 내지 1014 CFU/mL임을 의미한다.
본 출원의 바람직한 일 예에서, 상기 아커만시아 균주는 또한 다른 균주(비피도 박테리움, 락토바실러스, 클로스트리듐, 엔테로코커스 패시움, 대변 프레보텔라 및 루멘박테리아 등을 포함하나 이에 제한되지 않음)와 함께 사용할 수 있다.
면역 관문 억제제
본 출원에 사용되는 면역 관문 억제제는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제 및 CTLA-4 억제제 등 시판되는 임의의 제품일 수 있다. 바람직한 일 예에서, 상기 면역 관문 억제제에는 키트루다(Keytruda), 티센트리크(Tecentriq), 니볼루맙 주사제(Nivolumab Injection), 바벤시오(Avelumab) 및 투오이(토리팔리맙 주사제)가 포함될 수 있다.
항종양 조성물
본 출원에서, 상기 아커만시아 균주는 면역 관문 억제제와 혼합하여 단일 제제로 제조되어 함께 사용될 수 있고, 물리적으로 분리하여 별도로 사용할 수도 있다. 본 출원의 일 예에서, 상기 아커만시아 균주는 면역 관문 억제제와 물리적으로 분리되어 별도로 사용된다. 본 출원의 다른 예에서, 상기 아커만시아 균주는 면역 관문 억제제를 투여하기 전에 환자에게 투여될 수 있다. 일반적으로, 상기 아커만시아 균주는 임의의 적합한 방식(경구 투여, 주사 등을 포함하지만 이에 제한되지 않음)으로 환자에게 투여될 수 있다. 상기 면역 관문 억제제는 임의의 적합한 방식(경구 투여, 주사 등을 포함하나 이에 제한되지 않음)으로 환자에게 투여될 수 있다. 상기 아커만시아 균주 또는 면역 관문 억제제의 사용 방법은 당업계에서 일상적이며, 명세서의 설명에 종래 기술을 조합하여 당업자에 의해 직접적으로 결정될 수 있다.
본 출원에서, 상기 항종양 조성물은 또한 항생제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 항생제는 퀴놀론계 항생제, β-락탐계 항생제, 마크로라이드계 및 아미노글리코사이드계 항생제 등과 같은 임의의 적합한 항생제를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 바람직한 일 예에서, 상기 항생제는 β-락탐계 항생제(예를 들어, 페니실린, 암피실린, 카르베니실린, 메티실린, 벤조실린, 디클록사실린, 플루클록사실린, 세프라딘, 세포탁심, 세팔렉신, 세프트리악손, 세피롬, 세픽심, 세프디토렌 피복실, 세프디니르, 세프부텐, 세포독심 프록세틸, 이미페넴, 아즈트레오남, 세프미녹스나트륨, 비아페넴, 이미페넴 및 메로페넴 등); 마크로라이드계 항생제(예를 들어, 에리스로마이신, 로이코마이신, 록시트로마이신, 에리트로마이신 에틸숙시네이트, 아지트로마이신, 클라리스로마이신, 아세틸스피라마이신, 멜리마이신(Meleumycin), 미데이마이신(medemycin), 조사마이신 및 텔리트로마이신 등); 아미노글리코사이드계 항생제(예를 들어, 스트렙토마이신, 겐타마이신, 아르베카신 및 아미카신 등); 퀴놀론계 항생제(예를 들어, 시프로플록사신, 레보플록사신 및 노르플록사신 등); 다른 항생제 및 항균 약물(예를 들어, 테트라시클린계, 클로람페니콜계, 린코마이신, 리파펜틴과 같은 리파마이신계, 반코마이신과 같은 폴리펩티드, 설파메톡사졸과 같은 술파닐아미드계 및 메트로니다졸계 등); 항진균 약물(예를 들어, 암포테리신, 그리세오풀빈 및 질산미코나졸 등); 및 항종양 항생제(예를 들어, 미토마이신, 악티노마이신D, 블레오마이신 및 아드리아마이신 등) 등을 포함하지만 이제 제한되지 않는다.
본 출원에서, 상기 항생제는 다른 성분과 별도로 포장되어 단독으로 투여될 수 있다.
본 출원의 바람직한 일 예에서, 상기 항종양 조성물은 일정 기간(예를 들어, 1 내지 10일) 동안 아커만시아 균주를 투여한 후 일정 기간(예를 들어, 10 내지 100일) 동안 PD-1 억제제를 투여하라고 설명된 설명서를 추가로 포함한다. 아커만시아 균주의 투여량 범위는 104 내지 1013CFU/인/일이고, 면역 관문 억제제의 투여량 범위는 0.5 내지 10 mg/kg인 것이 바랍직하다.
상기 설명서에는 아커만시아 균주와 면역 관문 억제제를 투여하기 전에, 먼저 일정 기간(예를 들어, 1 내지 3일) 동안 항생제를 투여하는 방법이 추가로 설명되어 있다. 항생제의 투여량 범위는 1 내지 500 mg/kg인 것이 바람직하다.
본 출원의 항종양 조성물은 다양한 종양, 특히(이에 제한되지 않음) 결장암, 폐암, 유방암, 흑색종, 신장암 및 요로상피암 등을 효과적으로 치료할 수 있다.
본 출원의 다른 측면에서, 종양 치료용 약물의 제조에 있어서 아커만시아 균주의 용도를 제공한다.
본 출원에서, 상기 아커만시아 균주는 면역 관문 억제제와 결합되어 종양(예를 들어, 결장암, 폐암, 유방암, 흑색종, 신장암 및 요로상피암 등)의 성장을 억제할 수 있다. 발명자는 환자가 항생제를 복용할 경우, 종양 성장을 억제하는 면역 관문 억제제의 효과가 제한적이지만, 면역 관문 억제제를 투여 전 또는 동시에 아커만시아 균주를 투여하면 종양에 대한 면역 관문 억제제의 억제 효과를 효과적으로 증가시킬 수 있음을 발견하였다.
본 출원의 다른 측면에서, 종양의 치료에서 아커만시아 균주의 용도를 제공한다. 본 출원의 일 예에서, 상기 용도는 종양의 성장을 억제하는 것을 포함한다. 상기 아커만시아 균주는 면역 관문 억제제와 결합 사용하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 상기 종양은 결장암, 폐암, 유방암, 흑색종, 신장암 및 요로상피암 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 참조하여 본 출원을 상세히 설명하나, 본 출원의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.
실시예에 사용되는 원료는 다음과 같다.
마우스(20 내지 26g)는 6-8주 된 SPF 등급 웅성 C57BL/6J이고, Jiangsu Jicui Yaokang Biotechnology Co., Ltd.에서 유래된 것이며, 품질 인증서 번호가 201805120이다. 사육 조건은 23±3℃의 온도, 40 내지 70%의 습도로 조절하고, 마우스가 자유롭게 먹고 마실 수 있도록 하였다.
항PD-1 억제제는 Yikang (Beijing) Pharmaceutical Technology Co., Ltd.에서 구입하고, 농도가 7.09mg/mL이며, 2 내지 8℃의 암실에 보관한다. 적당량의 인산 완충 식염수(PBS)를 첨가하고 지정된 농도 용액으로 혼합한다.
암피실린은 Anhui Anfengtang Animal Pharmaceutical Co., Ltd.에서 구입하고, 스트렙토마이신은 Solarbio 회사에서 구입하였으며, 콜리스틴 황산염 가용성 분말(Colistin)은 Shandong Luxi Veterinary Medicine Co., Ltd.에서 구입했다.
MC38 종양 세포는 Rutin Biotechnology(Beijing) Co., Ltd.에서 구입하였다. 종양 세포는 비활성화된 10%의 소 태아 혈청, 100U/mL의 페니실린, 100μg/mL의 스트렙토마이신 및 2mM의 글루타민이 포함된 DMEM 배지에서 37℃, 5%의 CO2 부화기에서 배양하였다. 3일 정도 간격으로 세포가 완전히 성장한 후 계대 배양하고, 대수 성장기의 종양 세포를 체내 종양 접종에 사용하였다.
마우스 유방암 4T1 세포(ATCC, 제품 번호: CRL-2539), LLC1 폐암 세포(Shanghai Institutes for Biological Sciences에서 구입).
종양 부피의 측정
종양 부피: 종양 부피는 버니어 캘리퍼스를 사용하여 종양의 장경 및 단경을 주 3회 측정하고, 부피 계산식은 부피=0.5×장경×단경2이다.
실시예 1: 아커만시아 CGMCC No.14764의 동결건조 접종물
배지
분리 배지: 0.4g의 KH2PO4, 0.53g의 Na2HPO4, 0.3g의 NH4Cl, 0.3g의 NaCl, 0.1g의 MgCl2·6H2O, 0.11g의 CaCl2, 0.5mg의 레자주린, 4g의 NaHCO3, 0.25g의 Na2S·7-9H2O, 0.25%의 뮤신.
발효 배지 1: 뇌심장 엑기스 분말(Brain Heart Infusion Broth; BHI)
발효 배지 2: 5g의 트립톤, 5g의 대두 펩톤, 5g의 쇠고기 가루, 5g의 효모 분말, 4g의 포도당, 3g의 NaCl, 1.5g의 MgSO4, Na2HPO4, KH2PO4, 1L의 물, pH=7.2
분리 및 발효 배지를 121℃에서 15분 동안 오토클레이브하였다.
균주의 분리 및 검정
① 조제한 뮤신 분리 배지를 세럼 병에 담는다(액적량 10/30mL).
② 건강한 성인 대변 0.5g을 취하여 멸균된 PBS 인산 완충 식염수에 넣어 균일하게 분산시킨 후, 대변을 PBS용액에 10배 구배로 순차적으로 희석하고, 1mL의 희석액을 뮤신 분리 배지 세럼 병에 접종한다.
③ 뮤신 세럼 병을 37℃에 놓고 혐기성 환경에서 48시간 동안 배양한다.
④ 육안으로 볼 수 있는 탁도가 가장 높은 희석 구배에서 뮤신 발효액을 취하고 PBS 완충액으로 10-6내지 10-9로 희석한다.
⑤ 희석액을 뇌심장 액기스 분말 한천배지에 도포하여 24 내지 48시간 배양하고, 콜로니 크기가 1mm인 콜로니를 선택하여 정제 배양한 후 세균 16S rDNA 균종을 검증하였다.
결과: 콜로니의 형태 특성, 생리적 및 생화학적 특성을 조합하여 세균의 16S rDNA를 증폭한다. W03 세균의 16S rDNA 서열은 서열표 1에 나타낸 바와 같다. 측정한 서열을 GenBank에 업로드된 16S rDNA 유전자 서열과 상동성을 비교하였으며, 분리된 세균은 Akkermansiamuciniphila SSYD-3로 명명된 아커만시아로 검증되었으며, 수탁번호는 CGMCC No.14764이다. 기존 서열과의 비교에서 유사도는 최고로 99%이다.
아커만시아 발효
① 아커만시아는 뇌심장 엑기스 분말 한천에서 3 구역으로 선을 그어 접종하고, 37℃에서 48시간 동안 혐기성 배양한다.
② 한천 플레이트에서 아커만시아의 단일 콜로니를 선택하여 15mL의 뇌심장 엑기스 분말 액체 배지에 접종하고, 37℃에서 24시간 동안 혐기성 배양한다.
③ 15mL의 혐기성 튜브에서 10mL의 발효액을 200mL의 뇌심장 엑기스 분말 액체 배지로 옮기고, 37℃에서 24시간 혐기성 배양한다.
④ 200mL의 아커만시아 발효액을 뇌심장 엑기스 분말 액체 배지에 접종하고, 5L 발효탱크의 적재 부피는 4L이고, 혐기성 가스는 질소와 이산화탄소의 혼합 이중 가스(N2 : CO2=9:1)이며, 교반 속도는 100r/min이고, 온도는 37℃이며, 24시간 동안 혐기성 배양한다.
아커만시아 CGMCC No.14764의 동결건조 접종물
① 동결건조 보호제는 트레할로스, 자당 및 분유이다.
② 상기에서 얻은 발효액을 8000R에서 20분간 원심분리하여 균체를 수집한다.
③ 아커만시아를 원심분리하여 얻은 균체는 동결건조 보호제 및 물과 혼합하며, 동결건조 전의 용액에서 트레할로스, 자당 및 분유의 질량% 함량이 각각 5%, 5% 및 10%이다. 동결건조를 수행하여 동결건조된 세균 분말을 얻고, 세균 분말에서 수탁번호가 CGMCC No. 14764인 아커만시아 균주의 생균 수는 1010 CFU/g이다.
실시예 2
6-8 주령의 웅성 C57BL/6J 마우스 (20 내지 26g, SPF 등급) 48마리를 1주일 동안 환경에 적응시킨 후, 각 그룹에 12마리씩 체중에 따라 무작위로 4개 그룹으로 나누었다. 각 그룹에서, 제1 그룹은 무항생제 처리, 공백, i.p.이고, 제2 그룹은 무항생제 처리, 항-mPD-1, 10mg/kg, i.p.이며, 제3 그룹은 항생제 처리, 공백, i.p.이고, 제4그룹은 항생제 처리, 항-mPD-1, 10mg/kg, i.p.이다. 항생제 처리는 광범위 항생제 암피실린 (1mg/mL) + 콜리스틴 (1mg/mL) + 스트렙토마이신 (5mg/mL) 을 사용하여 5일 동안 식수 투여하였다. 모든 그룹의 마우스에는 1×107cells/mL 농도의, 인산 완충 식염수(PBS)에 재현탁된 MC38 종양 세포를, 실험 동물의 오른쪽 옆구리에 동물당 100μL씩 피하 접종하였다. 제2 그룹 및 제4 그룹의 마우스에는, 종양 세포를 접종한 후 4일째에 항-mPD-1을 주사하고, 4일 마다 1회씩 모두 4회 주사하였다. 마우스는 종양을 접종한 후 19일째에 안락사시키고, 각 그룹 마우스의 종양을 갈취하였다.
MC38 종양 세포는 Rutin Biotechnology Co., Ltd.에서 구입했다. 종양 세포는 비활성화된 10%의 소 태아 혈청, 100U/mL의 페니실린, 100μg/mL의 스트렙토마이신 및 2mM의 글루타민을 함유한 DMEM 배지에서 37℃, 5%의 CO2 부화기에서 배양하였다. 3일 정도 간격으로 세포가 완전히 성장한 후 계대 배양하고, 대수 성장기의 종양 세포를 체내 종양 접종에 사용하였다.
실험 결과는 도 1에 도시된 바와 같다. 결과는 항생제 처리에 의해 마우스의 장내 세균군이 파괴된 다음, 마우스의 종양 성장이 가속화되고, 종양 부피가 증가하며, 항-m PD-1의 항종양 효과가 약화됨을 나타내고, 장내 세균군이 마우스의 종양 성장 속도 및 항-m PD-1의 항종양 효과에 영향을 미치는 것으로 나타났다.
실시예 3
6-8 주령의 웅성 C57BL/6J 마우스 (20 내지 26g, SPF 등급) 48마리를 1주일 동안 환경에 적응시킨 후, 체중에 따라 무작위로 4개의 그룹으로 나누었다. 제1 그룹은 무항생제 처리, 공백, i.p.이고, 제2 그룹은 항생제 처리, 공백, i.p.이며, 제3 그룹은 항생제 처리, 항-mPD-1, 10mg/kg, i.p.이고, 제4 그룹은 항생제 처리, 아커만시아 SSYD-3, p.o., 항-mPD-1, 10mg/kg, i.p.이다. 광범위 항생제 암피실린 (1mg/mL) + 콜리스틴 (1mg/mL) + 스트렙토마이신(5mg/mL)을 사용하여 5일 동안 식수 투여하였다. 제4 그룹의 마우스에는 1.0 × 108 CFU/마리/일의 위관 영양 농도로 동결건조 아커만시아를 제공하기 시작하였다. 2주 동안 지속적으로 위관 영양을 수행한 후, 모든 그룹의 마우스에는 1×107 cells/mL 농도의, PBS에 재현탁된 MC38 종양 세포를 실험 동물의 오른쪽 옆구리에 동물당 100μL씩 피하 접종하였다. 제3 그룹 및 제4 그룹의 마우스에는, 종양 세포를 접종한 후 4일째에 항-mPD-1을 주사하고, 4일 마다 1회씩 모두 4회 주사하였다. 마우스는 종양을 접종한 후 19일째에 안락사시켰고, 마우스의 종양 무게를 측정하여 기록하였다.
MC38 종양 세포는 Rutin Biotechnology Co., Ltd.에서 구입했다. 종양 세포는 비활성화된 10%의 소 태아 혈청, 100U/mL의 페니실린, 100μg/mL의 스트렙토마이신 및 2mM의 글루타민을 함유한 DMEM 배지에서 37℃, 5%의 CO2 부화기에서 배양하였다. 3일 정도 간격으로 세포가 완전히 성장한 후 계대 배양하고, 대수 성장기의 종양 세포를 체내 종양 접종에 사용하였다.
시험 결과는 도 2에 도시된 바와 같다. 단독 항-mPD-1 치료 그룹과 비교하여, 균주와 항-mPD-1의 병용 요법 효과는 종양 성장을 현저하게 억제하고 종양 부피를 유의하게 감소시켰다. 결과는 아커만시아 SSYD-3가 항-mPD-1의 치료 효과를 효과적으로 향상시킬 수 있음을 나타내었다. P<0.05는 현저한 차이가 존재함을 나타낸다.
실시예 4
실시예 3의 마우스는 종양을 접종한 후 19일째에 안락사시켰고, 유동 세포 분석법(아이젠바이오유한공사, NovoCyte 3130)으로 종양 세포 내의 CD3, CD4, CD8, FOXP3, CD25, CXCR3, Gata3, Granzyme B, CD69, PD-1, CTLA-4 및 CD11b, MHCⅡ CD206, CD40, CSF1R, PD-L1, Gr-1을 검출하였다. 면역 인자 분석은 TNF-α, IL-17, IL-13, IL-12p70, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-1b, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP-10, MIP1b 및 MAC-1을 포함한다. 항생제 처리된 마우스에서 항-m PD-1 단독 치료 및 아커만시아 SSYD-3과 항-m PD-1의 병용 요법의 결과는 도 3에 나타낸 바와 같다. 결과는 아커만시아 SSYD-3과 항-mPD-1 주사를 병용한 후 종양이 침윤한 CD8 T 세포의 수가 현저하게 증가했으며, 이는 항-mPD-1의 항종양 효과가 아커만시아 SSYD-3에 의해 향상되었음을 나타냈다.
실시예 5
실시예 3의 마우스는 항-m PD-1 단독 치료 및 아커만시아 SSYD-3과 항-m PD-1을 병용한 후 19일째 안락사시켰고, 유동 세포 분석법(아이젠바이오유한공사, NovoCyte 3130)으로 종양 세포 내의 CD3, CD4, CD8, FOXP3, CD25, CXCR3, Gata3, Granzyme B, CD69, PD-1, CTLA-4 및 CD11b, MHCⅡ, CD206, CD40, CSF1R, PD-L1, Gr-1을 측정하였다. 면역인자 분석은 TNF-α, IL-17, IL-13, IL-12p70, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-1b, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP-10, MIP1b 및 MAC-1을 포함한다. 마우스 체내에서 면역세포의 변화 결과는 도 4에 나타낸 바와 같다. 결과는 항-m PD-1 단독 주사와 비교하여, 항-m PD-1과 아커만시아 SSYD-3의 병용 요법은 종양 조직 내의 CD3 세포 수준을 크게 증가시키고 유기체의 면역력을 향상시키는 것으로 나타났다. 도에서 모두 항생제 처리 그룹과 비교하여 P<0.05는 현저한 차이가 존재함을 나타냈고, *P<0.05, **P<0.01이다.
실시예 6
실시예 3의 마우스는 항-m PD-1 단독 처리 및 아커만시아 SSYD-3과 항-m PD-1 을 병용한 후 19일째에 안락사시켰고, 유동 세포 분석법(아이젠바이오유한공사, NovoCyte 3130)으로 종양 세포 내의 CD3, CD4, CD8, FOXP3, CD25, CXCR3, Gata3, Granzyme B, CD69, PD-1, CTLA-4 및 CD11b, MHCⅡ, CD206, CD40, CSF1R, PD-L1, Gr-1을 측정하였다. 면역인자 분석은 TNF-α, IL-17, IL-13, IL-12p70, IL-10, IL-6, IL-5, IL-4, IL-2, IL-1b, IFNy, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, MIG, IP-10, MIP1b 및 MAC-1을 포함하고, 실험 결과는 도 5에 도시된 바와 같다. 항생제 처리된 마우스의 종양 조직 내에서 Treg 세포의 수는 약간 증가하였으나 현저한 차이가 없었다. 항-mPD-1 치료를 거친 항생제 처리 그룹에서 Treg 세포의 수는 현저하게 감소(P<0.01)하였다. 아커만시아 SSYD-3과 항-mPD-1의 병용 요법 또한 마우스 체내의 Treg 세포 수(P<0.001)를 현저하게 감소시켰다. 상기 결과는, 항-mPD-1의 단독 주사는 마우스 체내의 면역 억제체계를 부분적으로 해제시키고, 아커만시아 SSYD-3과 결합 사용하면 마우스 체내의 면역 억제를 더욱 해제하여 유기체의 면역 활성 및 항종양 효과를 회복시키는 것으로 나타났다. 항생제 처리 그룹과 비교하여 P<0.05는 현저한 차이가 존재함을 나타내고, **P<0.01 및 ***P<0.001이다.
실시예 7
6-8 주령의 웅성 C57BL/6J 마우스 (20 내지 26g, SPF 등급) 36마리를 1주일 동안 환경에 적응시킨 후, 체중에 따라 무작위로 3개의 그룹으로 나누었다. 제1 그룹은 항생제 처리, 공백, i.p.이고, 제2 그룹은 항생제 처리, 항-mPD-1, 10mg/kg, i.p.이며, 제3 그룹은 항생제 처리, 아커만시아 SSYD-3, p.o., 항-mPD-1, 10mg/kg, i.p.이다. 각 그룹의 마우스에는 광범위 항생제 암피실린 (1mg/mL) + 콜리스틴 (1mg/mL) + 스트렙토마이신 (5mg/mL) 을 사용하여 5일 동안 식수 투여하였다. 그 다음, 제3 그룹에는 1.0 × 108 CFU/마리/일의 위관 영양 농도로 동결건조된 아커만시아 SSYD-3 샘플을 제공하기 시작하였다. 2주 동안 지속적으로 위관 영양을 수행한 후, 모든 그룹의 마우스에는 1×107 cells/mL 농도의, PBS에 재현탁된 4T1 종양 세포를 실험 동물의 오른쪽 옆구리에 동물당 100μL씩 피하 접종하였다. 제2 그룹 및 제3 그룹의 마우스에는, 종양 세포를 접종한 후 4일째에 항-mPD-1을 주사하고, 4일 마다 1회씩 모두 4회 주사하였다. 종양을 접종한 후 19일째에 마우스의 종양 부피를 측정한 다음, 각 그룹의 마우스를 안락사시키고 종양 조직을 갈취하였다.
결과는 도 6에 도시된 바와 같다. 항-mPD-1 치료에 둔감한 4T1 유방암 모델에서, 아커만시아 SSYD-3과 항-mPD-1의 병용 요법은 4T1 유방암에 대한 항-mPD-1의 치료 효과(P<0.0001)를 현저하게 향상시켰으며, 이는 아커만시아 SSYD-3이 항-mPD-1에 대한 유기체의 반응을 향상시키고 종양 치료에서 항-mPD-1의 적용 범위를 확대할 수 있음을 나타냈다.
실시예 8
6-8 주령의 웅성 C57BL/6J 마우스 (20 내지 26g, SPF 등급) 36마리를 1주일 동안 환경에 적응시킨 후, 체중에 따라 무작위로 3개의 그룹으로 나누었다. 제1 그룹은 항상제 처리, 공백, i.p.이고, 제2 그룹은 항상제 처리, 항-mPD-1, 10mg/kg, i.p.이며, 제3 그룹은 항상제 처리, 아커만시아 SSYD-3, p.o., 항-mPD-1, 10mg/kg, i.p.이다. 각 그룹의 마우스에는 광범위 항생제 암피실린 (1mg/mL) + 콜리스틴 (1mg/mL) + 스트렙토마이신 (5mg/mL) 을 사용하여 5일 동안 식수 투여하였다. 제3 그룹의 마우스에는 1.0 × 108 CFU/마리/일의 위관 영양 농도로 동결건조된 아커만시아 SSYD-3 샘플을 제공하기 시작하였다. 2주 동안 지속적으로 위관 영양을 수행한 후, 모든 그룹에는 1×105 cells/mL 농도의, PBS에 재현탁된 LLC1 폐암 세포를 실험 동물의 오른쪽 옆구리에 동물당 100μL씩 피하 접종하였다. 제2 그룹 내지 3 그룹의 마우스에는, 종양 세포를 접종한 후 4일째에 항-mPD-1을 주사하고, 4일 마다 1회씩 모두 4회 주사하였다. 종양을 접종한 후 19일째에 마우스의 종양 부피를 측정한 다음, 각 그룹의 마우스를 안락사시켰고 종양 조직을 갈취하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, 항-mPD-1 치료에 둔감한 LLC1 폐암 모델에서, 항생제 처리된 마우스는 항-mPD-1을 아커만시아 SSYD-3과 병용하면 항-mPD-1의 단독 치료에 비해, 종양 부피를 현저하게 감소(P<0.0001)시켰다. 이는 아커만시아 SSYD-3에 의해 항-m PD-1 치료에 대한 LLC1 폐암의 반응이 효과적으로 향상되고 종양 치료에서 항-mPD-1의 적용 범위를 확대할 수 있음을 나타냈다.
Sequence Listing <110> Shanghai ShangYaoXinyi Pharmaceutical Co Ltd <120> ANTI-TUMOR COMPOSITION <130> 199446 <160> 1 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1414 <212> DNA <213> Akkermansia muciniphila <400> 1 cccagtgggc ggcgtcaaga catgcaagtc gacgagagaa ttgctagctt gctaataatt 60 cctctagtgg cgcacgggtg agtaacacgt gagtaacctg cccccgagag cgggatagcc 120 ctgggaaact gggattaata ccgcatagta tcgaaagatt aaagcagcaa tgcgcttggg 180 gatgggctcg cggcctatta gttagttggt gaggtaacgg ctcaccaagg cgatgacggg 240 tagccggtct gagaggatgt ccggccacac tggaactgag acacggtcca gacacctacg 300 ggtggcagca gtcgagaatc attcacaatg ggggaaaccc tgatggtgcg acgccgcgtg 360 ggggaatgaa ggtcttcgga ttgtaaaccc ctgtcatgtg ggagcaaatt aaaaagatag 420 taccacaaga ggaagagacg gctaactctg tgccagcagc cgcggtaata cagaggtctc 480 aagcgttgtt cggaatcact gggcgtaaag cgtgcgtagg ctgtttcgta agtcgtgtgt 540 gaaaggcgcg ggctcaaccc gcggacggca catgatactg cgagactaga gtaatggagg 600 gggaaccgga attctcggtg tagcagtgaa atgcgtagat atcgagagga acactcgtgg 660 cgaaggcggg ttcctggaca ttaactgacg ctgaggcacg aaggccaggg gagcgaaagg 720 gattagatac ccctgtagtc ctggcagtaa acggtgcacg cttggtgtgc ggggaatcga 780 ccccctgcgt gccggagcta acgcgttaag cgtgccgcct ggggagtacg gtcgcaagat 840 taaaactcaa agaaattgac ggggacccgc acaagcggtg gagtatgtgg cttaattcga 900 tgcaacgcga agaaccttac ctgggcttga catgtaatga acaacatgtg aaagcatgcg 960 actcttcgga ggcgttacac aggtgctgca tggccgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt 1020 ttggttaagt ccagcaacga gcgcaacccc tgttgccagt taccagcacg tgaaggtggg 1080 gactctggcg agactgccca gatcaactgg gaggaaggtg gggacgacgt caggtcagta 1140 tggcccttat gcccagggct gcacacgtac tacaatgccc agtacagagg gggccgaagc 1200 cgcgaggcgg aggaaatcct aaaaactggg cccagttcgg actgtaggct gcaacccgcc 1260 tacacgaagc cggaatcgct agtaatggcg catcagctac ggcgccgtga atacgttccc 1320 gggtcttgta cacaccgccc gtcacatcat ggaagccggt cgcacccgaa gtatctgaag 1380 ccaaccgcaa ggaggcaggt ctaagtagac tggt 1414

Claims (10)

  1. 항종양 조성물로서,
    (A) 아커만시아; 및
    (B) 면역 관문 억제제를 포함하는, 항종양 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 아커만시아는 아커만시아 균주 Akkermansiamuciniphila SSYD-3이며, 이의 수탁번호가 CGMCC No.14764인 것을 특징으로 하는, 항종양 조성물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 아커만시아는 다른 박테리아(예를 들어, 비피도 박테리움, 락토바실러스, 클로스트리듐, 엔테로코커스 패시움, 대변 프레보텔라, 루멘 박테리아)와 함께 조합되는 것을 특징으로 하는, 항종양 조성물.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 아커만시아는 면역 관문 억제제와 혼합하여 단일 제제로 제조되거나 물리적으로 분리되어 별도로 사용되는 것을 특징으로 하는, 항종양 조성물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 아커만시아는 경구로 투여되는 것을 특징으로 하는, 항종양 조성물.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 항종양 조성물은 항생제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 항종양 조성물.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 종양은 결장암, 폐암, 위암, 간암, 두경부암, 자궁경부암, 유방암, 림프종, 유방암, 흑색종, 신장암 또는 요로상피암으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 항종양 조성물.
  8. 종양 치료용 약물 제조에서의 아커만시아의 용도.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 아커만시아는 면역 관문 억제제 제제와 결합 사용되는 것을 특징으로 하는, 용도.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    상기 용도는 종양에 대한 면역 관문 억제제의 억제 효과를 향상시키기 위한 것이고, 바람직하게는 상기 종양은 결장암, 폐암, 위암, 간암, 두경부암, 자궁경부암, 유방암, 림프종, 유방암, 흑색종, 신장암 또는 요로상피암 등으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 용도.
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