KR20220119332A

KR20220119332A - 체세포로부터 췌장 베타 세포를 직접 분화시키는 방법 및 분화 조성물

Info

Publication number: KR20220119332A
Application number: KR1020220101041A
Authority: KR
Inventors: 김경규; 황혜연; 맨달 팔루미
Original assignee: 성균관대학교산학협력단; 주식회사 타스컴
Priority date: 2019-04-30
Filing date: 2022-08-12
Publication date: 2022-08-29
Also published as: KR20200126927A; KR102596837B1; KR102433644B1

Abstract

본 발명은 체세포로부터 췌장 베타 세포를 직접 분화시키는 방법 및 분화 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 췌장 베타 세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 체세포의 췌장 베타 세포로의 직접분화 유도용 조성물 및 그를 이용한 췌장 베타 세포의 직접분화 방법 등에 관한 것이다.

Description

체세포로부터 췌장 베타 세포를 직접 분화시키는 방법 및 분화 조성물{Process and compositions for the direct differentiation of somatic cell into pancreatic beta cells}

당뇨에서 글루코스 독성은 β-세포의 세포사멸(apoptosis)을 야기하고, 췌장을 포함한 다양한 장기 시스템에 영향을 미친다. 그러나 기본적인 메커니즘은 완전하게 알려져 있지는 않다. β-세포의 장애 및 손상된 인슐린 생산은 당뇨의 전형적인 특징이나, 당뇨병의 급속한 확산에도 불구하고 β-세포의 세포사멸을 야기하는 글루코스 독성의 정확한 분자적 메커니즘은 여전히 알려지지 않았다.

특히, 제1형 당뇨병 및 췌장암과 같은 질환은 베타세포의 손상 또는 손실에 의하여 기능이상이 유발되므로, 췌장 베타 세포의 이식 방법만이 유일한 치료법이다.

최근 줄기세포 연구가 발전함에 따라, 중간 분화를 거치지 않고 다양한 계통으로 체세포를 직접분화(재분화 또는 리프로그래밍)시키는 과정에서 시간 및 효과 문제를 줄였을 뿐만 아니라 자가 이식을 위한 새로운 길이 열렸다. 다만, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)에서 유래된 췌장 베타 세포는 타인의 세포를 사용하므로 면역 거부 반응이 있을 수 있고 줄기세포의 암 유발가능성 때문에 안정성 문제가 있을 수 있다.

이에, 본인의 체세포를 췌장 베타 세포로 전환시키는 직접 분화법이 각광을 받고 있다. 체세포를 췌장 베타 세포로 전환하는 방법은 베타 세포의 마커 유전자를 강제로 발현시키는 방법 및 저분자 물질을 이용하는 방법이 있으나, 외부 유전자를 도입하는 방법은 유전체에 영향을 주어 암발생 가능성이 있고, 저분자 물질을 이용하는 경우 췌장 베타 세포로 전환 효율이 낮아지는 단점이 있었다.

또한, 기존에는 췌장 베타 세포로 변환하는데 소요되는 기간이 27일 이상으로, 췌장 베타 세포를 생산하는 기간이 길다는 단점이 있고, 이를 단축할 필요가 있었다(Cell Stem Cell. 2014 Feb 6; 14(2):228-36. doi:10.1016/j.stem.2014.01.006.)).

이러한 문제를 극복하기 위하여 본 발명자들은 환자 본인의 췌장 베타 세포에서 방출되는 엑소좀을 분리하여 엑소좀을 단독 혹은 저분자 화합물과 함께 체세포에 처리함으로써 체세포를 췌장 베타 세포로 단시간에 효과적으로 전환하는 기술을 개발하였다.

공개특허 제10-2015-0117532호

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 체세포를 바로 췌장 베타 세포로 변화시키는 방법을 찾고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 췌장 베타 세포 유래 엑소좀 단독; 또는 히스톤 메틸전달효소 저해제(Histone methyltransferase inhibitor), 보충제, 및 췌장 베타 세포 유래 엑소좀을 포함한 조성물이 체세포의 췌장 베타 세포로의 전환을 유도하기 위해 처리될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 췌장 베타 세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 체세포의 췌장 베타 세포로의 직접분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 히스톤 메틸전달효소 저해제(Histone methyltransferase inhibitor), 보충제, 및 췌장 베타 세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 체세포의 췌장 베타 세포로의 직접분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 레티노산 아고니스트(retinoic acid agonist); ALK-5 키나아제 억제제(ALK-5 kinase inhibitor); 헷지호그 억제제(hedgehog inhibitor); MAPK 억제제(MAPK inhibitor); 및 보충제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 췌장 베타 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, (1) 히스톤 메틸전달효소 저해제(Histone methyltransferase inhibitor), 보충제, 및 췌장 베타 세포 유래 엑소좀을 포함하는 배지에서 체세포를 배양하여 이를 췌장 베타 세포로 유도하는 단계; (2) 레티노산 아고니스트, ALK-5 키나아제 억제제(ALK-5 kinase inhibitor), 헷지호그 억제제, 및 보충제를 포함하는 췌장 베타 세포 성숙화 유도용 조성물 존재 하에 성숙 배양하는 단계; (2') ALK-5 키나아제 억제제(ALK-5 kinase inhibitor), 헷지호그 억제제, 및 보충제를 포함하는 췌장 베타 세포 성숙화 유도용 조성물 존재 하에 성숙 배양하는 단계; 및 (3) MAPK 억제제(MAPK inhibitor) 및 보충제를 포함하는 췌장 베타 세포 성숙화 유도용 조성물 존재 하에 성숙 배양하는 단계를 포함한 체세포로부터 췌장 베타 세포로의 직접분화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 직접분화 유도된 췌장 베타 세포를 약학적으로 허용되는 약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 혼합하는 단계를 포함하는, 당뇨병 또는 췌장암 치료용 세포치료제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 췌장 베타 세포 유래 엑소좀 또는 상기 엑소좀 유래 miRNA를 유효성분으로 포함하는, 체세포의 췌장 베타 세포로의 직접분화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명의 췌장 베타 세포를 유도함에 있어서, 출발 체세포(모세포)의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 임의의 체세포를 이용할 수 있다. 예를 들어, 태아기 (embryonic period)의 체세포 이외에 성숙한(matured) 체세포를 이용해도 된다. 유도 췌장 베타 세포를 질병의 치료에 이용하는 경우에는 환자로부터 분리된 체세포를 이용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 질병에 관여하는 체세포나 질병치료에 관여하는 체세포 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 상기 체세포는 섬유아세포 또는 외분비 세포이며, 본 발명에서 섬유아세포 또는 외분비 세포는 인간과 마우스, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 섬유아세포 또는 외분비 세포를 포함한다. 본 발명에서 용어 "체세포"는 섬유아세포(fibroblast) 또는 외분비 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서, 엑소좀(exosome)은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 20nm 내지 300nm 의 크기를 가진 입자일 수 있으며, 바람직하게는 100 내지 220nm 의 크기일 수 있으며, 보다 바람직하게는 180 내지 220nm의 크기일 수 있다. 엑소좀은 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 실시예에서, 상기 엑소좀은 CD63, CD9, CD81, Alix, 및 Tsg101 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 발현하거나;

Calnexin, Grp78 및 GM130 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 발현하지 않는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 히스톤 메틸전달효소 저해제(Histone methyltransferase inhibitor); 보충제; 및 췌장 베타 세포 유래 엑소좀 또는 상기 엑소좀 유래 miRNA;를 유효성분으로 포함하는, 체세포의 췌장 베타 세포로의 직접분화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 히스톤 메틸전달효소 저해제는 BIX01294 (2-(Hexahydro-4-methyl-1H-1,4-diazepin-1-yl)-6,7-dimethoxy-N-[1-(phenylmethyl)-4-piperidinyl]-4-quinazolinamine), 5-AZA-2'-데옥시사이티딘 (5-aza-2'-deoxycytidine:DAC), 제불라린(Zebularine), 3'-데아자네플라노신 A 하이드로클로리드(3'-Deazaneplanocin A hydrochloride), 로메구아트리브 (Lomeguatrib), 카에토신(Chaetocin, 2,2',3S,3'S,5aR,5'aR,6,6'-octahydro-3,3'-bis(hydroxymethyl)-2,2'-dimethyl-[10bR,10'bR(11aS,11'aS)-bi-3,11a-epidithio-11aH-pyrazino[1',2':1,5]pyrrolo[2,3-b]indole]-1,1',4,4'-tetrone), 및 데시타빈(Decitabine, 5-aza-2'-deoxycytidine)일 수 있다.

본 발명의 일구현예로, 상기 직접분화 유도용 조성물에 포함된 보충제는 2-포스포-L-아스코르브산, B27, 라미닌(laminin), 니코틴아마이드(nicotinamide), 및 N2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 2-포스포-L-아스코르브산일 수 있다.

본 발명의 일구현예로, 출발 체세포(모세포)의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 임의의 체세포를 이용할 수 있다. 예를 들어, 태아기(embryonic period)의 체세포 이외에 성숙한(matured) 체세포를 이용해도 된다. 유도 췌장 베타 세포를 질병의 치료에 이용하는 경우에는 환자로부터 분리된 체세포를 이용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 질병에 관여하는 체세포나 질병치료에 관여하는 체세포 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 상기 체세포는 섬유아세포 또는 외분비세포이며, 본 발명에서 섬유아세포 또는 외분비 세포는 인간과 마우스, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 섬유아세포 또는 외분비 세포를 포함한다.

또한, 본 발명은 레티노산 아고니스트(retinoic acid agonist); ALK-5 키나아제 억제제(ALK-5 kinase inhibitor); 헷지호그 억제제(hedgehog inhibitor); MAPK 억제제(MAPK inhibitor); 및 보충제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 췌장 베타 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, "레티노산 아고니스트(retinoic acid agonist)"는, 바람직하게는 레티노산 수용체 아고니스트(RAR agonist)일 수 있으며, TTNPB (4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]benzoic acid, Arotinoid acid), 피탄산(phytanic acid), 및 레티노산(retinoic acid, RA)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. RAR 수용체는 RAR 반응 요소(RARE) 라고 알려진 DNA 서열 요소에 레티노이드 X 수용체(RXR 이라고 알려짐) 와의 이종이량체의 형태로 결합함으로써 전사를 활성화시킨다. 종래 공지 기술은 RAR 유형 수용체 리간드인 다수의 화합물을 포함하고 있다. 종래 기술 문서 중에, 언급할 수 있는 예로는, 삼방향족 화합물을 기재하고 있는 특허 US 6150413, 스틸벤 화합물을 기재하고 있는 특허 US 6214878, 또는 이환식 또는 삼환식 분자 군을 기재하고 있는 특허 US 6218128이 포함된다.

본 발명의 일구현예로, 상기 ALK-5 키나아제 억제제(TGF-β 타입 I 리셉터 억제제)는 RepSox(1,5-Naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB525334(6-(2-tert-butyl-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-5-yl)quinoxaline); GW788388(4-(4-(3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl)-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide); SD-208(2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-yl)pteridin-4-amine); Galunisertib(LY2157299, 4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide); EW-7197(N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine); LY2109761(7-(2-morpholinoethoxy)-4-(2-(pyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline); SB505124(2-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-tert-butyl-1H-imidazol-5-yl)-6-methylpyridine); LY364947(Quinoline, 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431542 (4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide); K02288(3-[(6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol]; 또는 LDN-212854(Quinoline, 5-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl])를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 Repsox일 수 있다.

본 발명의 일구현예로, 상기 헷지호그 억제제는 사이클로파민(cyclopamine), 미페프리스톤(mifepristone), GDC-0449(Vismodegib), XL139(BMS-833923), IPI926, IPI609(IPI269609), LDE225, 제르빈, GANT61, 퍼모파민, SAG, SANT-2, 토마티딘, SANT74, SANT75, 제룸본 또는 그의 유도체일 수 있다.

본 발명의 일구현예로, MAPK 억제제는 1-Pyridinyl-2-phenylazole, SB 203580, SKF 86002, SKF 86096, SKF 104351, 1-Aryl-2-pyridinyl/ pyrimidinyl heterocycles, SB 242235, RO-32001195, SX-011, 또는 BIRB-796일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 다음 문헌 [G. J. Hanson (Expert Opinions on Therapeutic Patents, 1997, 7, 729-733) J Hynes et al. (Current Topics in Medicinal Chemistry, 2005, 5, 967-985), C. Dominguez et al (Expert Opinions on Therapeutics Patents, 2005, 15, 801-816) and L. H. Pettus & R. P. Wurtz (Current Topics in Medicinal Chemistry, 2008, 8, 1452-1467)]에서 기재되어 있다.

본 발명의 일구현예로, 상기 보충제는 B27, 라미닌(laminin), 니코틴아마이드(nicotinamide), 및 N2로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

또한, 본 발명은 (1) 히스톤 메틸전달효소 저해제(Histone methyltransferase inhibitor); 보충제; 및 췌장 베타 세포 유래 엑소좀 또는 상기 엑소좀 유래 miRNA;를 포함하는 배지에서 체세포를 배양하여 이를 췌장 베타 세포로 유도하는 단계;

(2) 레티노산 아고니스트, ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor), 헷지호그 억제제, 및 보충제를 포함하는 췌장 베타 세포 성숙화 유도용 조성물 존재 하에 성숙 배양하는 단계; 및

(3) MAPK 억제제(MAPK inhibitor) 및 보충제를 포함하는 췌장 베타 세포 성숙화 유도용 조성물 존재 하에 성숙 배양하는 단계를 포함한 체세포로부터 췌장 베타 세포로의 직접분화 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 상기 직접분화 방법은 단계 (2) 와 (3)의 사이에, (2') ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor), 헷지호그 억제제, 및 보충제를 포함하는 췌장 베타 세포 성숙화 유도용 조성물 존재 하에 성숙 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

단, (2) 단계에서 레티노산 아고니스트는 세포에 대한 독성을 일부 가지고 있으므로 (2) 단계 중 하루만 사용하고 이 후부터는 제거하여, ALK-5 키나아제 억제제(ALK-5 kinase inhibitor), 헷지호그 억제제 및 보충제만을(2') 단계의 조성물로 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 방법에 의해 직접분화 유도된 췌장 베타 세포를 약학적으로 허용되는 약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 혼합하는 단계를 포함하는, 당뇨병 또는 췌장암 치료용 세포치료제를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 또는 임신성 당뇨병일 수 있다.

본 발명은 체세포로부터 췌장 베타 세포를 직접분화시키는 방법 및 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 체세포를 엑소좀 및 저분자성 물질을 이용하여 췌장 베타 세포로의 직접분화(Reprogramming)하는 방법에 관한 것이다. 본 발명자들은 다양한 분화 유도 물질 등 저분자성 물질 중에서 보다 효율적으로 췌장 베타 세포를 유도할 것으로 예상되는 2종의 저분자성 물질은 선별하였으며, 그와 함께 췌장 베타 세포 유래 엑소좀을 처리하여 직접분화를 시도한 결과, 췌장 베타 세포에서 PDX1의 발현량이 현저히 증가하였으며, 이러한 방법으로 유사 췌장 베타 세포를 유도하였을 때 매우 높은 수율로 직접분화 됨을 확인하였는바, 면역거부반응이 생기지 않으면서 암 발생 가능성도 낮다는 장점을 가진, 자가세포를 이용한 더욱 안전한 세포치료제 개발에 유용하게 사용될 것으로 기대된다.

또한, 본 발명에 의해 생산된 췌장 베타 세포는 당뇨병 또는 췌장암을 예방, 치료 및 개선하기 위한 세포 조성물로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 마우스 인슐린종 세포 MIN6로부터 분리한 엑소좀을 전자현미경으로 관찰한 결과이다. 도 1A는 MIN6 유래 엑소좀 크기를 TEM으로 관찰하여 나타낸 도이고, 도 1B는 엑소좀의 마커 단백질로 알려진 CD63을 웨스턴 블롯팅으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a 내지 2d는 PKH67란 색소로 표지한 엑소좀이 MEF(mouse embryonic fibroblasts)에 흡수화되는 것을 현미경으로 관찰한 결과이다. 도 2a는 48시간 뒤 엑소좀 처리한 MEF을 나타내고, 도 2b는 96시간 뒤 엑소좀 처리한 MEF을 나타낸 도이다. MEF내로 엑소좀에 표시된 색소인 PKH67이 흡수화 되는 것으로 보아, 엑소좀이 효과적으로 MRF로 흡수화된다는 것을 확인할 수 있다. 도 2c와 2d는 각각 48시간 및 96시간 뒤에 엑소좀 대신 PBS (xxx)를 처리한 MEF를 나타낸다. 도 2a 및 2b와 다르게 MEF내에 색소가 흡수되지 않는 것을 통해, 도 2a 및 2b에서 보이는 MEF내의 색소 흡수화는 엑소좀 흡수화에 의한 결과라는 것을 확인할 수 있다(scale bar = 50μm).
도 3a 내지 3c는 MIN6 유래 엑소좀을 이용하여 베타세포로 직접분화된 MEF 세포에서의 주요 유전자 발현을 확인한 결과이다. 도 3a는 분화 두 번째 단계(단계 2)를 거친 세포에서 PDX1 발현 수준 및 Fsp1 발현 수준을 측정한 결과를 나타내며, 도 3b는 분화 세 번째 단계(단계 3)를 거친 세포에서의 PDX1 발현 수준 및 Ngn3 발현 수준을 측정한 결과를 나타내며, 도 3c는 단계 3에 분화 세 번째 단계(단계 3)를 거친 세포에서 Ins1, Ins2, 및 Fsp1의 발현수준을 측정한 결과를 나타낸다. PDX1 및 Ngn3는 췌장 분화 세포의 마커이고 Ins1 및 Ins2는 베타세포에서 발현되는 인슐린, 그리고 Fsp1은 섬유아세포 마커이다. 본 실험 결과는 엑소좀 혹은 엑소좀과 저분자화합물을 동시에 처리한 경우 단계 3단계에서 췌장 및 베타세포 마커의 발현이 현저히 증가한다는 사실을 확인해 줌으로써, 본 특허에서 발명한 분화방법 및 분화조성물에 의해 섬유아세포가 베타세포로 고효율로 전환될 수 있음을 증명한다.
도 4는 MIN6 세포로부터 유래된 엑소좀은 시간 의존적으로 MEF에 의해 효율적으로 내재화됨을 확인한 결과를 나타낸 것이다. (A)는 MEF 세포를 72 시간 동안의 대조군 실험으로서 ExoGlow 표지된 PBS (50 μg/ml 엑소좀과 동일한 부피)와 함께 배양한 것이며, (B), (C), 및 (D)는 MEF를 각각 24 시간, 48 시간 및 72 시간 동안 50 μg/ml 엑소좀과 함께 배양한 결과를 나타낸 것이다. (E)는 엑소좀 흡수 정량을 대조군 PBS 세포 형광에 대하여 평균 형광 강도를 사용하여 측정한 결과이다 (ImageJ 소프트웨어를 사용). Scale = 20 μm이며, 데이터는 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 평균 오차 (SEM)로 표현된다 * P <0.05, ** P <0.01.
도 5는 β 유사 세포로의 직접 전환을 측정하기 위한 C-펩타이드 면역 형광 염색 결과를 나타낸 것이다. (A)는 화학 물질과 엑소좀을 첨가하지 않고 기초 배지에서 성장한 MEF, (B)는 BIX01294 및 비타민 C의 존재 하에서 성장한 MEF, (C)는 50 μg/ml MIN6 유래 엑소좀의 존재 하에 배양된 MEF, (D)는 BIX01294 + 비타민 C + 50 μg/ml MIN6 유래 엑소좀의 존재 하에 배양된 MEF에서의 측정 결과이다. Scale = 20 μm.
도 6은 단리된 마우스 외분비 세포의 MIN6 엑소좀을 사용한 β 유사 세포로의 직접 분화 결과를 나타낸 것으로, (A) 및 (B)는 외분비 세포에 엑소좀 50 μg/ml 을 첨가 또는 첨가하지 않고 3 단계 배지에서 성장시킨 것을 명시야 현미경 이미지이며, (C)는 β 세포 특이적 췌장 내분비 계통 마커를 qRT-PCR로 분석한 결과이며, (D)는 글루카곤, 선방 (acinar) 및 췌관 (ductal) 세포 특이적 유전자를 qRT-PCR로 프로파일링한 결과이다. 데이터는 3 개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 평균 오차 (SEM)로 표현된다 * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 (student’s t- test). Scale = 100μm

본 발명자들은 엑소좀 또는 저분자만을 사용하였을 때와 비교하여, 엑소좀과 저분자를 병용 사용한 경우, 엑소좀 단독 혹은 저분자 단독 처리에 비하여 췌장 베타 세포로의 직접분화가 현저히 잘 됨을 확인하였는 바,

본 발명은 췌장 베타 세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 체세포의 췌장 베타 세포로의 직접분화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 상기 "엑소좀(exosome)"은 여러 종류의 세포들로부터 분비되는 막 구조의 소낭체로, 20 nm 내지 300nm 의 크기를 가진 입자일 수 있으며, 바람직하게는 100 내지 220nm 의 크기일 수 있으며, 보다 바람직하게는 180 내지 220nm의 크기일 수 있다. 엑소좀은 다른 세포 및 조직에 결합하여 막 구성요소, 단백질, RNA를 전달하는 등 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 상기 엑소좀은 CD63, CD9, CD81, Alix, 및 Tsg101 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 발현하거나; Calnexin, Grp78 및 GM130 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 발현하지 않을 수 있다.

상기 엑소좀은 mmu-miR-486b-5p, mmu-miR-486a-5p, mmu-miR-3470b, mmu-miR-3470a, mmu-miR-466i-5p, mmu-miR-1195, mmu-miR-3473a, mmu-miR-145a-5p, mmu-miR-19b-3p, mmu-miR-150-5p, mmu-miR-127-5p, mmu-miR-709, mmu-miR-706, mmu-miR-3473b, mmu-miR-770-3p, mmu-miR-122-5p, mmu-miR-126a-5p, mmu-miR-199a-3p, mmu-miR-199b-3p, mmu-miR-669c-3p, mmu-miR-3473e, mmu-miR-467b-3p, mmu-miR-7651-5p, mmu-miR-92a-3p, mmu-miR-341-3p, mmu-miR-10b-5p, mmu-miR-470-5p, mmu-miR-3473f, mmu-miR-494-3p, 및 mmu-miR-466m-3p 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명의 엑소좀은 상기 miRNA가 췌장세포에서의 수준 대비 과발현됨으로써 체세포를 췌장 베타 세포로 직접분화시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 엑소좀 유래 miRNA는 mmu-miR-486b-5p, mmu-miR-486a-5p, mmu-miR-3470b, mmu-miR-3470a, mmu-miR-466i-5p, mmu-miR-1195, mmu-miR-3473a, mmu-miR-145a-5p, mmu-miR-19b-3p, mmu-miR-150-5p, mmu-miR-127-5p, mmu-miR-709, mmu-miR-706, mmu-miR-3473b, mmu-miR-770-3p, mmu-miR-122-5p, mmu-miR-126a-5p, mmu-miR-199a-3p, mmu-miR-199b-3p, mmu-miR-669c-3p, mmu-miR-3473e, mmu-miR-467b-3p, mmu-miR-7651-5p, mmu-miR-92a-3p, mmu-miR-341-3p, mmu-miR-10b-5p, mmu-miR-470-5p, mmu-miR-3473f, mmu-miR-494-3p, 및 mmu-miR-466m-3p 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서, 엑소좀은 다음의 단계를 포함하는 방법으로 분리정제된 것일 수 있다:

i) 췌장 베타 세포를 포함하는 배지를 원심분리하는 단계;

ii) 상등액을 여과하는 단계; 및

iii) 여과물을 원심분리하는 단계.

본 명세서에서, 엑소좀은 여과 및 원심분리를 사용하는 대신 크로마토그래피, PEG(poly-ethanol glycol), 부형제 또는 엑소좀 정제 키트 등을 이용하여 분리정제된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 부형제(excipient)는 통상, 약제에 적당한 굳기나 형상을 주거나, 주제(主劑)의 양이 적은 경우에 일정한 중량을 주어 취급하기 쉬운 크기로 할 목적으로 첨가되는 물질을 의미하나, 본 발명에서는 당업계에 알려진 "부형제(excipient)(또는 첨가제로 불리기도 함)"가 세포 잔해물, 노폐물, 단백질 및 거대 입자와 같은 불순물에 대해 엑소좀 및/또는 세포외 소포체를 효율적으로 분별할 수 있는 기능을 부여한다. 본 발명을 제한하지 않는 예시로서, 부형제는 자당(sucrose), 트레할로오스(trehalose), 유당(lactose), 락툴로오스, 말토오스, 셀로비오스, 이소말토오스, 투라노오스, 포도당(dextrose), 글루코오스, 갈락토오스, 프룩토오스, 탈로오스, 만노오스, 타가토오스, 프시코오스, 에리트로오스, 에리트룰로오스, 트레오스, 에리스리톨(erythritol), 아라비노오스, 자일로오스, 릭소오스, 리보오스, 리불로오스, 자일룰로스, 알도헵토오스, 헵툴로오스, 옥툴로오스, 겐티아노스, 움벨리페로스, 플란테오스, 이소리크노오스, 라피노오스, 리크노오스, 스타키오스, 베르바스코오스(verbascose), 만니톨(manitol), 말티톨, 락티톨, 말토트리오스, 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 자일리톨, 소르비톨(sorbitol), 전분 분해당, 전분 분해당 환원 알콜, 비이온성 계면활성제 (예를 들어, Tween-20, Triton X-100, Pluonic F-68 등), 글리신(glycine), 히스티딘(histidine), 글리세롤(glycerol) 및 콜레스테롤(cholesterol)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 인슐린종 세포주를 포함하는 배지를 실온에서 750g에서 10분간 원심분리하고, 그 상등액을 필터로 여과하고, 최종 여과물을 100,000g로 90분 동안 원심분리한 후, 그 상등액을 제거하고 PBS로 펠렛을 세척 후 초원심분리함으로써 췌장 베타 세포 유래 엑소좀을 수득하였다.

또한, 본 발명은 히스톤 메틸전달효소 저해제(Histone methyltransferase inhibitor), 보충제, 및 췌장 베타 세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 체세포의 췌장 베타 세포로의 직접분화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "히스톤 메틸전달효소 저해제(Histone methyltransferase inhibitor)"는 공여자의 메틸기를 수용자로 옮기는 것을 촉매하는 효소를 일컫는 것이다. 본원에 사용될 수 있는 히스톤 메틸전달효소 저해제는 BIX01294 (2-(Hexahydro-4-methyl-1H-1,4-diazepin-1-yl)-6,7-dimethoxy-N-[1-(phenylmethyl)-4-piperidinyl]-4-quinazolinamine), 5-AZA-2'-데옥시사이티딘 (5-aza-2'-deoxycytidine:DAC), 제불라린(Zebularine), 3'-데아자네플라노신 A 하이드로클로리드(3'-Deazaneplanocin A hydrochloride), 로메구아트리브(Lomeguatrib), 카에토신(Chaetocin, 2,2',3S,3'S,5aR,5'aR,6,6'-octahydro-3,3'-bis(hydroxymethyl)-2,2'-dimethyl-[10bR,10'bR(11aS,11'aS)-bi-3,11a-epidithio-11aH-pyrazino[1',2':1,5]pyrrolo[2,3-b]indole]-1,1',4,4'-tetrone), 및 데시타빈(Decitabine, 5-aza-2'-deoxycytidine)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 배지는 히스톤 메틸전달효소 억제제를 0.01μM 내지 20μM 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 10μM 포함하는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 0.5μM 내지 5μM, 가장 바람직하게는 0.7μM 내지 1.5μM일 수 있다.

본 발명에서 용어 "보충제"는, 2-포스포-L-아스코르브산(pVC), B27, 라미닌(laminin), 니코틴아마이드(nicotinamide), 및 N2로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 직접분화 유도용 조성물은 보충제로 2-포스포-L-아스코르브산(pVC)을 포함하는 것일 수 있다. 상기 보충제는 10μM 내지 1000μM 포함되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 150 내지 450μM 포함되는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 200μM 내지 400μM, 보다 더 바람\직하게는 250μM 내지 350μM, 가장 바람직하게는 260μM 내지 300μM일 수 있다.

본 발명에서 용어 "췌장 베타 세포 유래 엑소좀"은 췌장 베타 세포에서 분리된 것으로, CD63, CD9, CD81, Alix, 및 Tsg101 으로 이루어진 마커군에서 선택된 하나 이상을 발현 및/또는 Calnexin, Grp78 및 GM130 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 발현하지 않는 것일 수 있다. 본 발명의 췌장 베타 세포 유래 엑소좀은 고순도의 엑소좀이며, 상기 고순도라 함은 골지체 단백질(Calnexin, Grp78) 또는 소포체 단백질(GM130)이 극미량 포함되거나 전혀 포함되지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 배지는 췌장 베타 세포 유래 엑소좀을 0.1㎕ 내지 50㎕ 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 1㎕ 내지 30㎕ 포함하는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 5㎕ 내지 15㎕ , 보다 더 바람직하게는 8㎕ 내지 12㎕, 가장 바람직하게는 10㎕일 수 있다.

본 발명의 췌장 베타 세포를 유도함에 있어서, 출발 체세포(모세포)의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 임의의 체세포를 이용할 수 있다. 예를 들어, 태아기(embryonic period)의 체세포 이외에 성숙한(matured) 체세포를 이용해도 된다. 유도 췌장 베타 세포를 질병의 치료에 이용하는 경우에는 환자로부터 분리된 체세포를 이용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 질병에 관여하는 체세포나 질병치료에 관여하는 체세포 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 상기 체세포는 섬유아세포 또는 외분비 세포이며, 본 발명에서 섬유아세포 또는 외분비 세포는 인간과 마우스, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 섬유아세포 또는 외분비 세포를 포함한다. 본 발명에서 용어 "체세포"는 섬유아세포 (fibroblast) 또는 외분비 세포(exocrine cell)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 용어 "췌장 베타 세포(pancreatic β cells)"는 "췌장 베타 유사세포" 와 상호 교환되어 사용될 수 있으며, 이는 췌장의 랑게르한스섬을 구성하는 세포의 하나로, 인슐린을 생성 분비하는 세포이다. 췌장 베타 세포에 문제가 있을 경우, 인슐린의 생성에 문제가 있어 당뇨병을 유발할 수 있다. 따라서 이와 같은 세포는 췌장의 인슐린 분비가 문제되어 발생하는 당뇨병의 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 체세포에 엑소좀 및 저분자 화합물을 처리하여 직접분화된 췌장 베타 세포는 췌장 특이성 유전자 마커인 PDX1, Ngn3, Ins1, 및 Ins2를 고발현하는 것을 확인하였다.

또한, 본 발명은 간세포 성장 인자 자극제; 레티노산 아고니스트(retinoic acid agonist); ALK-5 키나아제 억제제(ALK-5 kinase inhibitor); 헷지호그 억제제(hedgehog inhibitor); MAPK 억제제(MAPK inhibitor); 및 보충제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 췌장 베타 세포의 성숙화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "성숙(maturation)"이라 함은 췌장 베타 세포로 유도된 세포가 보다 완벽한 활성을 갖는 베타세포로 전환되는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어 "레티노산 아고니스트(retinoic acid agonist)"는, 바람직하게는 레티노산 수용체 아고니스트(RAR agonist)일 수 있으며, TTNPB (4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]benzoic acid, Arotinoid acid), 피탄산(phytanic acid), 및 레티노산(retinoic acid, RA)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. RAR 수용체는 RAR 반응 요소(RARE) 라고 알려진 DNA 서열 요소에 레티노이드 X 수용체(RXR 이라고 알려짐) 와의 이종이량체의 형태로 결합함으로써 전사를 활성화시킨다. 종래 공지 기술은 RAR 유형 수용체 리간드인 다수의 화합물을 포함하고 있다. 종래 기술 문서 중에, 언급할 수 있는 예로는, 삼방향족 화합물을 기재하고 있는 특허 US 6150413, 스틸벤 화합물을 기재하고 있는 특허 US 6214878, 또는 이환식 또는 삼환식 분자 군을 기재하고 있는 특허 US 6218128 이 포함된다. 본 발명의 배지는 레티노산 아고니스트를 0.05μM 내지 20μM 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 15μM 포함하는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 0.5μM 내지 10μM, 보다 더 바람직하게는 0.5μM 내지 5μM, 가장 바람직하게는 1μM 내지 3μM일 수 있다.

본 발명에 있어서, "ALK-5 키나아제 억제제(ALK-5 kinase inhibitor)"는 TGF-β 타입 I 리셉터에 결합하여 TGF-β I의 정상적인 신호전달 과정을 방해하는 물질을 의미하며, TGF-β 타입 I(Transforming growth factor-β type I)은 세포증식, 분화 및 다양한 종류의 세포에 다양한 작용을 하는 다기능성 펩타이드로서, 이러한 다기능성은 지방세포형성, 근세포형성, 골세포형성, 상피세포 분화 등 여러 조직의 성장 및 분화에서 중추적인 역할을 한다. 상기 ALK-5 키나아제 억제제 (TGF-β 타입 I 리셉터 억제제)는 RepSox(1,5-Naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB525334(6-(2-tert-butyl-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-5-yl)quinoxaline); GW788388(4-(4-(3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl)-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide); SD-208(2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-yl)pteridin-4-amine); Galunisertib(LY2157299, 4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide); EW-7197(N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine); LY2109761(7-(2-morpholinoethoxy)-4-(2-(pyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline); SB505124(2-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-tert-butyl-1H-imidazol-5-yl)-6-methylpyridine); LY364947(Quinoline, 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431542(4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide); K02288(3-[(6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol]; 또는 LDN-212854(Quinoline, 5-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl])를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 Repsox일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 배지는 ALK-5 키나아제 억제제를 0.01μM 내지 20μM 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 10μM 포함하는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 0.5μM 내지 5μM, 가장 바람직하게는 0.7μM 내지 1.5μM일 수 있다.

본 발명에서 용어 "헷지호그 억제제(hedgehog inhibitor)"는, 바람직하게는 소닉 헷지호그 억제제(sonic hedgehog inhibitor)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 사이클로파민(cyclopamine), 미페프리스톤(mifepristone), GDC-0449(Vismodegib), XL139(BMS-833923), IPI926, IPI609(IPI269609), LDE225, 제르빈, GANT61, 퍼모파민, SAG, SANT-2, 토마티딘, SANT74, SANT75, 제룸본 또는 그의 유도체일수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 배지는 헷지호그 억제제를 0.05μM 내지 20μM 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 15μM 포함하는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 0.5μM 내지 10μM, 보다 더 바람직하게는 0.5μM 내지 5μM, 가장 바람직하게는 1μM 내지 3μM일 수 있다.

본 발명에서 용어 "MAPK 억제제"는 미토겐 활성화 단백질 키나아제 [Mitogen activated protein kinases; MAPK]로, 이중 인산화에 의하여 그들의 기질을 활성화시키는 프롤린 작동성 세린/트레오닌 키나아제 패밀리 중 하나의 구성원이다. 공지된 MAPK 억제제는 알려져 있는 P38 키나아제 억제제로, 1-Pyridinyl-2-phenylazole, SB 203580, SKF 86002, SKF 86096, SKF 104351, 1-Aryl-2-pyridinyl/ pyrimidinyl heterocycles, SB 242235, RO-32001195, SX-011, 또는 BIRB-796 일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 다음 문헌 [G. J. Hanson (Expert Opinions on Therapeutic Patents, 1997, 7, 729-733) J Hynes et al . (Current Topics in Medicinal Chemistry, 2005, 5, 967-985), C. Dominguez et al(Expert Opinions on Therapeutics Patents, 2005, 15, 801-816) and L. H. Pettus & R. P. Wurtz(Current Topics in Medicinal Chemistry, 2008, 8, 1452-1467)]에서 기재되어 있다. 본 발명의 MAPK 억제제는 바람직하게는 sb203580일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 배지는 MAPK 억제제를 50μM 내지 5000μM 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 100 내지 2500μM 포함하는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 200μM 내지 1250μM, 보다 더 바람직하게는 300μM 내지 1000μM, 가장 바람직하게는 400μM 내지 700μM일 수 있다.

본 발명에서 용어 "보충제"는, 2-포스포-L-아스코르브산, B27, 라미닌(laminin), 니코틴아마이드(nicotinamide), 및 N2로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 것일 수 있다.

상기 라미닌은 0.05ug/ml 내지 20ug/ml, 0.1ug/ml 내지 10ug/ml, 0.2ug/ml 내지 9, 0.4ug/ml 내지 7ug/ml의 함량으로 포함되는 것일 수 있으나, 바람직하게는 0.7ug/ml 내지 3ug/ml의 라미닌을 포함할 수 있다. 상기 니코틴아마이드는 0.1mM 내지 100mM, 0.5mM 내지 40mM, 1mM 내지 20mM의 함량으로 포함되는 것일 수 있으나, 바람직하게는 5mM 내지 15mM 의 니코틴아마이드를 포함할 수 있다. 상기 2-포스포-L-아스코르브산는 100μM 내지 500μM 포함되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 150 내지 450μM 포함되는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 200μM 내지 400μM, 보다 더 바람직하게는 250μM 내지 350μM, 가장 바람직하게는 260μM 내지 300μM일 수 있다.

상기 B27는 0.5 ~ 5배액 농도일 수 있으며, 바람직하게는 1배액농도일 수 있다.

또한, 본 발명은 아래와 같은 3 가지 단계를 거쳐 체세포를 췌장 베타 세포로 유도한다.

(1) 히스톤 메틸전달효소 저해제(Histone methyltransferase inhibitor), 보충제, 및 췌장 베타 세포 유래 엑소좀을 포함하는 배지에서 체세포를 배양하여 이를 췌장 베타 세포로 유도하는 단계;

(3) MAPK 억제제(MAPK inhibitor) 및 보충제를 포함하는 췌장 베타 세포 성숙화 유도용 조성물 존재 하에 성숙 배양하는 단계를 포함한 체세포로부터 췌장 베타 세포로의 분화방법을 제공한다.

본 발명의 (1) 단계는, 췌장 베타 세포로 분화를 유도할 수 있는 기간이라면 제한이 없이 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 3 내지 10일 동안 수행될 수 있고, 더욱 바람직하게는 4 내지 8일 동안 수행될 수 있다. 상기 단계의 보충제는 바람직하게는 2-포스포-L-아스코르브산일 수 있다.

상기 (2) 단계의 배양은 제한없이 이루어질 수 있으나 바람직하게는 0.5일 내지 2일 동안, 더욱 바람직하게는 1일 동안 수행될 수 있다. 다만, 상기 배양 기간은 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 (2) 단계의 보충제는 바람직하게는 2-포스포-L-아스코르브산일 수 있다. 단, (2) 단계에서 레티노산 아고니스트는 세포에 대한 독성을 일부 가지고 있으므로 (2) 단계 중 하루만 사용하고 이 후부터는 제거하여, ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor), 헷지호그 억제제 및 보충제만을 (2') 단계의 조성물로 사용할 수 있다.

본 발명의 (2') 단계는, 췌장 베타 세포로 분화를 성숙할 수 있는 기간이라면 제한이 없이 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 1일 내지 5일 동안 수행될 수 있고, 더욱 바람직하게는 2일내지 4일 동안 수행될 수 있다. 상기 단계의 보충제는 바람직하게는 2-포스포-L-아스코르브산일 수 있다.

본 발명의 (3) 단계는, 상기 분화가 유도된 세포가 성숙할 수 있는 기간이라면 제한이 없이 이루어질 수 있으나, 바람직하게는 7 내지 13일 동안 수행될 수 있고, 더욱 바람직하게는 8 내지 12일 동안 수행될 수 있다. 다만, 상기 배양 기간은 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 단계의 보충제는 바람직하게는 2-포스포-L-아스코르브산, 라미닌, B27, 및 니코틴아마이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 2-포스포-L-아스코르브산, 라미닌, B27, 및 니코틴아마이드일 수 있다.

또한, 본 발명은 하기 단계를 거쳐 체세포를 췌장 베타 세포로 유도할 수 있다:

MAPK 억제제(MAPK inhibitor), 보충제 및 췌장 베타 세포 유래 엑소좀을 포함하는 배지에서 체세포를 배양하여 이를 췌장 베타 세포로 유도하는 단계.

본 발명의 직접분화방법을 사용하는 경우, 종래의 알려진 줄기세포 분화 방법 및 화학적 세포 분화 방법과 비교하여, 보다 면역 거부 반응이 생기지 않으면서도, 암 발생 가능성이 없다는 장점이 있다.

본 발명의 용어 "배지"는 당업계에 알려진 기본 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Isocove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, DMEM 배지일 수 있다.

상기 체세포를 배양하는 배양액은 당해 분야에서 섬유아세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지 배양액를 모두 포함한다. 배양에 사용되는 배양액은 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.

체세포를 직접분화(Direct conversion) 방법을 이용하여 췌장베타세포로 유도하는 대부분의 방법은 외부 유전자를 도입하는 방식으로 이루어지고 있다. 다만, 바이러스를 이용하여 유전자를 도입하는 것은 외부 유전자의 무작위적인 인테그레이션(integration)으로 인한 유전적 불안정성(genomic instability)을 야기하여, 향후 환자에 임상적용 시 암이 발생할 가능성이 있다. 이러한 이유로 인해 점차적으로 외부 유전자를 주입하지 않고 저분자성 물질(small molecule)을 이용하는 방법들이 제시되고 있는 실정이나 최근 다양한 저분자성 화합물들을 이용하여 직접분화를 유도하는 연구가 활발하게 진행되고 있음에도 불구하고 최소한 하나의 유전자는 이용되고 있으며, 유전자 도입 없이는 여전히 인간 체세포로부터 원하는 세포로 전환할 수 없는 상태이다.

그러나, 본 발명은 외부 유전자의 도입 없이 엑소좀 혹은 엑소좀과 저분자물질을 조합한 조성물을 처리하여 환자의 체세포로부터 췌장 베타 세포를 유도하는 유전적 안정성이 확보된 방법으로써, 기존의 유전자를 이용한 세포전환 방법의 문제인 유전적 결손을 근본적으로 해결하면서, 암 발생 가능성을 낮추기 위하여 고안된 것이다.

본 발명에서는 엑소좀 혹은 저분자성 물질과 엑소좀의 조합을 이용하여 체세포를 췌장 베타 세포로 직접분화하였다. 이에, 기존의 기술이 가진 많은 문제점들을 극복함으로써, 환자를 위한 세포치료제로 활용 가능성이 매우 높다.

따라서, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화 유도된 췌장 베타 세포를 약학적으로 허용되는 약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 혼합하는 단계를 포함하는, 당뇨병 또는 췌장암 치료용 세포치료제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 치료 또는 예방의 대상인 "당뇨병"은 췌장의 베타 세포에서 생성되는 인슐린 호르몬 부족 또는 인슐린 저항성의 이상과 나아가 이러한 두 가지 모두의 결함으로 발생하는 고혈당을 특징으로 하는 대사장애증후군이다. 이러한 당뇨병은 인슐린 의존형 당뇨병(IDDM, Type 1)과 인슐린 저항 및 인슐린 분비 손상에 의해 발생하는 인슐린 비의존형 당뇨병(NIDDM, Type 2)으로 나눌 수 있다. 제1형과 제2형 당뇨병 모두에서 심장 질환, 장 질환, 안과 질환, 신경 질환, 뇌졸중 등과 같은 다양한 합병증이 발생하게 되는데, 이는 장시간 동안 혈당과 인슐린 수준이 상승하여 만성신경질환과 심혈관질환이 발생하게 되고 단시간의 저혈당과 고혈당 반응으로 급성 합병증을 야기시키게 되는 것이다. 당뇨병은 고혈당이 만성으로 지속되면서 당질 대사뿐만 아니라 지질 및 단백질 대사 장애도 함께 일으킨다. 그 병태는 다양하며 직접 고혈당에 기인하는 것으로 망막, 신장, 신경, 심혈관계 등에서 당뇨병성 말초신경장해, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 백내장, 각막증, 당뇨병성 동맥경화증 등이 있다.

당뇨병을 일으키고 심화시키는 중요한 병리 현상의 하나는 고혈당에 의한 췌장 β세포의 사멸이다. 본 발명자들은 체세포를 췌장 베타 세포로 전환 시킴으로써 당뇨병 치료에 이용가능한 베타세포를 생산하는 방법을 제공하고 있다. 이에 따라, 본 발명에서의 당뇨병은 글루코스 독성에 의하여 유발되는 당뇨병 또는 심화 또는 진행된 당뇨병이라면 그 대상이 될 수 있으며, 보다 구체적으로는 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 임신성 당뇨병으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 용어 "세포치료제 (cellular therapeutic agent)"란, 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품 (미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

본 발명에서 용어, "치료"는 질환의 발생 또는 재발 억제, 증상의 완화, 질병의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선, 호전, 완화 또는 개선된 예후를 의미한다.

본 발명의 세포치료제 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명에 따른 세포 치료제는 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 본 발명의 세포 치료제에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 또는 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 세포치료제는 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.

본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. "치료학적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 줄기세포의 1일 투여량은 1.0×10⁴ 내지 1.0×10¹¹세포/kg 체중, 바람직하게는 1.0×10⁵ 내지 1.0×10⁹ 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 치료방법에서 본 발명의 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 직장, 정맥내(intravenous therapy, i.v), 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명은 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 본 발명의 상기 세포치료제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료방법을 제공한다. 여기에서 사용된 용어 포유동물은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 준비 및 실험 방법

1-1. 세포배양

MIN6은 부착성 마우스 β(인슐린종) 세포주(mouse insulinoma cells)이다. 이 세포들은 성균관대 학교의 엄성희 교수로부터 제공받았다. 세포는 엑소좀 고갈된 15 % 태아 소 혈청(FBS)(Gibco), 1 % 페니실린-스트렙토 마이신(Welgene) 및 55μM β 메르캅토 에탄올(β-ME)(Sigma)이 첨가된 DMEM(dulbecco's minimal essential medium)(Welgene) 에 넣고 5 % CO₂의 대기에서 37℃에서 배양되었다.

1-2. 엑소좀 분리 및 투과전자현미경(TEM)

엑소좀 분리 과정은 Thery C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. 2006 Apr에 기재된 과정을 약간 수정하여 사용하였다. 분리한 세포를 제거하기 위하여 MIN6 조건 배지를 실온(RT)에서 750g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상등액을 0.45μm 필터(corning)로 여과하고 2000g에서 4분간 20분간 원심 분리 하였다. 상등액을 0.22μm 필터(Corning)로 여과하고, 최종 여과물을 Beckman Coulter Ultracentrifuge에서 100,000 g으로 90 분 동안 원심분리하였다. 상등액을 조심스럽게 제거하고 인산염 완충 식염수(PBS)로 펠렛을 씻고 다시 90분 동안 100,000g에서 초원심 분리시켰다. 최종 펠렛을 PBS에 다시 현탁시키고 추가실험에 사용하였다. TEM 이미징을 위해, 엑소좀 현탁액은 4% 파라포름알데히드와 동일한 부피로 혼합하고, Formvar 탄소 코팅 그리드로 처리되고, PBS로 한번 세척 후 1% 글루타르알데히드 50ul 방울로 처리되었다. 상기 샘플을 수회 세척하고 대조하여 4 % 우라닐 아세테이트 및 2% 메틸 셀룰로오스의 혼합물에 혼합한 뒤 TEM(JEM ARM 200F)으로 관찰하였다.

1-3. MIN6 엑소좀의 표지

제조자의 프로토콜을 변형하여 PKH67 세포 링커 키트(Sigma)를 사용하여 PKH67을 엑소좀에 표지하였다. 120㎕ 엑소좀 현탁액을 500㎕ 희석액 C와 혼합하였다. 유사하게 다른 튜브에서 2㎕의 PKH67 염료를 500㎕ 희석액 C에 첨가하였다. 엑소좀 현탁액과 염료 용액을 적절하게 혼합하고 실온에서 5분간 배양한 후 엑소좀 고갈된 FBS를 첨가하여 염색 반응을 멈추게 하였다. 그런 다음 혼합물을 300kDa 분자량 차단(MWCO, molecular weight cut off) 필터(Vivaspin)로 옮기고 4℃에서 4000 rpm으로 원심분리하였다. 표지된 엑소좀을 PBS로 2 회 세척하였다. 대조군으로서, 120㎕의 PBS를 PKH67 염료와 홉합한 후 엑소좀 정제와 유사한 방식으로 준비하였다.

1-4. MEF에 의한 분류된 MIN6 엑소좀의 흡수화

30㎕의 표지된 엑소좀 또는 PBS를 1X10⁵ MEF(mouse embryonic fibroblast)와 함께 96시간 동안 배양하였다. 형광 현미경(Olympus)은 PKH67 표지된 흡수화된 엑소좀의 이미지화에 사용되었다. 현미경 검사를 위해, 실온에서 10분 동안 4% 파라 포름알데히드로 48시간 및 96시간 배양한 후 세포를 고정시켰다. 세포를 PBS로 2 회 세척하고 핵을 DAPI(Sigma)로 표지하였다.

1-5. MIN6 엑소좀을 이용한 췌장 계통으로의 MEF 직접분화

마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, MEF) 직접분화는 이전에 공개된 프로토콜을 수정하여 수행하였다. 녹아웃 DMEM(KO-DMEM)(Gibco)을 세포 직접분화를 위한 기초배지로 사용하였다.

4x10⁴ MEFs는 1μM BIX01294(BIX)(히스톤 메틸전달효소 억제제) 및 280μM 2- 포스포-L-아스코르브산(pVC)(보충제)의 존재 또는 부재 하에 10㎕ MIN6 엑소좀과 함께 6일 동안 항온 배양하였다.

그 다음, 상기 배지를 2 μM TTNPB(레티노산 아고니스트)(MedchemExpress), 1μM repsox(TGF β 억제제)(MedchemExpress), 2μM 사이클로파민(cyclopamine)(sonic hedgehog 억제제)(Tocris) 및 280μM pVC(Sigma)를 함유하는 배지로 1일 동안 교환하였다. 레티노산 아고니스트는 세포에 대한 독성을 일부 가지고 있으므로 하루만 사용하고 이 후부터는 제거하여, ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor), 헷지호그 억제제 및 보충제만을 사용하였다.

이어서 3일 동안 1μM의 repsox, 2μM의 사이클로파민 및 280μM의 pVc를 함유하는 배지에 첨가 하였다.

이어서 세포를 500nM SB203580(MAPK inhibitor)(Tocris), 1ug/ml 라미닌 (Sigma), 10mM 니코틴 아미드(Sigma), 1X B27(Gibco) 보충제 및 pVC와 함께 10일동안 배양하였다.

단계	단계 특징	배지 성분
단계 1	분화 유도	BIX01294(BIX), 포스포-L-아스코르브산(pVC), 및 MIN6 유래 엑소좀
단계 2	성숙	TTNPB, repsox, 사이클로파민, 및 pVC
단계 2'	성숙	repsox, 사이클로파민, 및 pVC
단계 3	성숙	SB203580, 라미닌, 니코틴 아미드, 및 B27

1-6. qRT-PCR을 이용한 유전자 발현 연구

제조사의 Trizol(Invitrogen) 방법을 이용하여 전체 세포 RNA를 추출하였다. 전체 RNA 1ug을 PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit(Takara Clontech)를 사용하여 cDNA 합성에 사용하였다. 췌장 계통 특이적 마커 분석은 Real Time PCR (Biorad)을 사용하여 iQ SYBR Green Supermix(Biorad)로 수행되었다. qRT-PCR 조건은 95 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 15 초, 72 ℃에서 15 초의 40 주기였다. 이 연구에서 사용된 프라이머는 하기 표 2과 같다.

Primer Name	Forward Primer (5'-3')	Reverse Primer (5'-3')
Mouse Actin	GCAAGTGCTTCTAGGCGGAC (서열번호 1)	AAGAAAGGGTGTAAAACGCAGC (서열번호 2)
Mouse PDX1	ACCCGTACTGCCTACACCCG (서열번호 3)	GGGCCGGGAGATGTATTTGT (서열번호 4)
Mouse Insulin-1	GCTGGTAGAGGGAGCAGATG (서열번호 5)	CAGAGACCATCAGCAAGCAG (서열번호 6)
Mouse Insulin-2	GAAGTGGAGGACCCACAAGT (서열번호 7)	AGTGCCAAGGTCTGAAGGTC (서열번호 8)
Mouse Ngn3	TCTCAAGCATCTCGCCTCTTC (서열번호 9)	ACAGCAAGGGTACCGATGAGA (서열번호 10)
Mouse Fsp1	TGAGCAACTTGGACAGCAACA (서열번호 11)	TTCCGGGGTTCCTTATCTGGG (서열번호 12)

1-7. 웨스턴 블롯팅(Western blotting)

RIPA(Radioimmunoprecipiation assay) 버퍼를 사용하여 엑소좀 샘플을 용해시키고 BCA 키트 (Thermo Scientific)를 사용하여 단백질 정량을 수행하였다. 40μg 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 분석하고 폴리비닐리덴플루오라이드(PVDF) 막으로 옮기고 항체로 탐침했다. 환원 조건은 모든 단백질의 용해를 위해 사용되었다. CD63, Alix 및 Calnexin 항체는 Abcam에서 구입하였다.

1-8. 마우스로부터의 외분비 세포 분리

외분비 조직은 [G.C. Chau, D.U. Im, T.M. Kang, J.M. Bae, W. Kim, S. Pyo, E.-Y. Moon, S.H.J.J.C.B. Um, mTOR controls ChREBP transcriptional activity and pancreatic β cell survival under diabetic stress, 216(7) (2017) 2091-2105.] 문헌을 참고하여, 8 주령 수컷 마우스 2 마리로부터 분리되었다. 먼저, 마우스 췌장에 HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution, 웰진)에 용해된 여과된 0.8 mg/ml 콜라게네이즈 P (Roche)를 주사하였다. 췌장조직은 간헐적으로 흔들면서 37 ℃에서 15 분 동안 배양되었다. 소화된 현탁액을 여과하기 위해 400㎛ 메쉬 (Sigma)를 사용하였고, 바이오콜 (biocoll) 분리 용액 (Merck-Millipore) 상에서 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 모든 외분비 세포를 섬으로부터 분리하였다. 그리고나서, 세포를 20 ℃에서 20 분 동안 2000rpm에서 원심 분리하였다. 바이오콜 구배의 상부층은 선방 (acinar) 세포를 함유 한 반면, 펠렛은 섬 및 선방 세포를 제외한 췌관 (ductal) 세포를 포함한 다른 모든 세포를 함유한다. 선방 세포와 췌관 세포를 조심스럽게 수집하고 함께 혼합한 후 70μm 메쉬 (Falcon)를 통해 여과하였다. 이후, 세포를 1X HBSS로 3 회 세척하고 4 ℃에서 3 분 동안 1200rpm에서 원심분리하고 10 % FBS 및 1 % P/S (penicillin/streptomycin)가 보충된 RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 배지를 함유하는 10cm 조직 배양 접시 (TPP)에 접종하고 95%의 공기 및 5%의 CO₂ 하에서 배양하였다.

실시예 2. 마우스 인슐린 종 세포, MIN6의 엑소좀 분비

MIN6 세포는 엑소좀 고갈된 FBS를 함유하는 DMEM에서 성장시켰다. 조건 배지를 수집하고 전술한 바와 같이 각각의 원심 분리를 실시하였다. 사용된 배양 조건은 10% 미만의 세포 사멸을 가져왔다. 엑소좀을 포함하는 것으로 간주되는 100,000g 펠렛을 PBS에 재현탁하고 엑소좀 크기를 결정하기 위해 투과전자현미경(TEM)을 사용하여 분석하였다.

도 1a는 대다수의 엑소좀이 약 200nm의 크기를 가짐을 보여주었다.

tetraspanins(CD63, CD9, CD81), Alix, TSG101의 존재가 엑소좀과 관련이 있고, 골지체의 calnexin, Grp78 또는 GM130과 같은 소포체 단백질의 부재는 엑소좀 제제의 오염이 거의 없거나 거의 없음을 나타내는 것으로 알려져 있다.

따라서, 도 1b에 나타난 바와 같이, Calnexin의 부족과 CD63, CD9 및 Alix의 존재는 웨스턴 블롯팅에 의해 확인된 순수한 엑소좀 생성을 나타냈다.

실시예 3. PKH67 표지된 67 MIN6 엑소좀의 MEF에 의한 흡수

MEFs를 β 세포와 같은 세포로 직접분화하기 위해서는 MEF가 엑소좀을 흡수해야한다. MEF에 의한 엑소좀의 흡수(uptake) 여부를 조사하기 위해, 녹색 형광 염료인 PKH67을 MIN6 유도된 엑소좀에 표지하고, 표지된 엑소좀을 MEF에 첨가하고 37℃에서 최대 96시간 동안 배양하였다. 48시간 및 96시간 배양된 세포를 고정시키고 형광 현미경으로 관찰하였다(도 2a, 2b). 대조군으로 PBS에 PKH67을 섞고 엑소좀을 분리하는 방법처럼 300kDa 분자량 차단(MWCO, molecular weight cut off) 필터(Vivaspin)로 거른 후, 필터를 통과하지 않은 부분을 대조군으로 MEF에 첨가한 후 엑소좀을 넣었을 때와 같은 방법으로 세포를 관찰하였다(도 2c, 2d).

실시예 4. MIN6 유래된 엑소좀을 사용하여 MEF를 β 유사 세포로 전환

dox 유도성 MEF를 저분자화합물을 사용하는 세포와 같은 내배엽으로의 전환 및 기능성 췌장 베타 세포와 같은 세포 생성을 위한 연구는 직접분화 접근법을 위한 기초를 제공하였다.

엑소좀이 전사변화 물질로 작용한다면, 후성유전 수정 인자(epigenetic modifier) BIX01294 및 pVC의 존재 유무에 따라 단계 1 배지에서 MIN6 엑소좀을 첨가하면 MEF에서 췌장(내분비) 특이적인 전사 변화를 유도할 것이라고 가정하였다.

TTNPB(retinoic acid agonist), repsox(TGF-β 억제제), cyclopamine(sonic hedgehog inhibitor) 및 pVC와 같은 저분자 화합물을 첨가하면 PDX1과 같은 췌장 전구 마커의 발현이 증가하였다. Fsp1과 같은 섬유 아세포 특이적 유전자(fibroblast specific genes)는 하향조절 되어야 한다.

유전자 발현의 변화를 qRT-PCR을 사용하여 정량화 하였다.

도 3a에 나타난 바와 같이, MIN6 엑소좀으로 처리한 세포에서 PDX1의 발현이 증가한 것은 엑소좀 비처리 세포와 비교하여 췌장 특이적 프로그램이 시작되었음을 나타낸다. 췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화로부터 생긴다. 췌장 내배엽의 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자, PDX1을 발현한다. PDX1의 부재 하에서는, 췌장은 복측 원기(ventral bud) 및 배측원기(dorsal bud)의 형성 이상으로는 발달하지 못한다. 따라서, PDX1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 특징짓는다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생긴다.

도 3a에 나타난 바와 같이, MIN6 엑소좀 + BIX + pVC 처리된 세포에서 엑소좀 비처리군과 비교하여 8배 가량 PDX1의 발현 수준이 높았으며, 이는 엑소좀 비처리 또는 엑소좀의 단독처리와 비교하여, 엑소좀과 저분자 화합물의 병용 처리가 내분비 직접분화를 상향조절 하는데 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. Fsp1의 하향 조절은 섬유 아세포 특이적 프로그램이 억제되었음을 나타냈다.

도 3b 및 도 3c에 나타난 바와 같이, 니코틴아마이드, 라미닌, B27과 같은 췌장 세포 유도제(보충제)를 추가하여 단계 3 배지에 추가하면 Ngn3, 인슐린(Ins1 및 Ins2)와 같은 췌장 특이성 유전자 마커의 발현에서 볼 수 있듯이, 췌장 세포로의 직접분화가 개선되었음을 확인하였다. Ngn3의 조기 활성화는 췌장 전구 세포의 푸울(pool)을 고갈시키면서 글루카곤+ 세포를 거의 배타적으로 유도하는 것으로 알려져 있다.

상기 유전자 발현 확인 실험 결과로부터 엑소좀이 섬유아세포 계통을 억제하고 표적 세포에서 췌장 계통을 유도함을 확인할 수 있었다.

실시예 5. ExoGlow로 표지된 MIN6 엑소좀의 MEF로의 내재화

β 유사 세포로 MEF를 직접분화 하기 위해서는 엑소좀이 MEF에 의해 내재화되어야한다. 이를 확인하기 위해 System Bioscience에서 구입한 멤브레인 라벨링 키트를 사용하였다. 형광 염료는 온전한 엑소좀 막을 표지하는 데 특이적이며 손상된 막을 갖는 입자 또는 파편에는 결합하지 않는다. MIN6 엑소좀 (in PBS)의 현탁액을 ExoGlow 염료 (적색 형광 염료)로 표지한 후, 표지된 엑소좀을 37 ℃에서 72 시간까지 MEF와 함께 배양하였다.

엑소좀을 라벨링하는 방법은 구체적으로 다음과 같다. MIN6 유래 엑소좀은 제조사의 지시에 따라 SBI (System Biosciences) ExoGlow EV 멤브레인 라벨링 키트를 사용하여 라벨링되었다. 12㎕의 반응 완충제를 2㎕의 표지 염료 (적색)에 첨가하고 적절히 혼합하였다. 50 ㎍/ml의 엑소좀 (in PBS)을 미리 제조된 반응 혼합물에 첨가하고 실온에서 30 분 동안 배양하였다. 유리 염료 분자를 제거하기 위해, 35 μL의 ExoQuick-TC를 엑소좀 혼합물에 첨가하고 4 ℃에서 30 분 동안 유지하여 엑소좀을 침전시켰다. 유리 염료 분자를 함유하는 상청액을 버리고 엑소좀 펠렛을 PBS에 재현 탁시켰다.

도 4에 나타난 바와 같이, 대조군 세포와 비교하여, 시간에 따라 엑소좀이 MEF 내로 혼입됨을 명백히 확인하였다 (도 4의 (B), (C), (D)). 대조군 실험으로서, ExoGlow 염료로 표지된 동일한 부피의 PBS를 MEF에 첨가하였다. 대조군인 PBS는 임의의 막질 소포를 함유하지 않았기 때문에, 염료 분자가 PBS를 염색하지 않았고, 따라서 PBS와 함께 배양된 MEF는 염색되지 않았다.

또한, 도 4의 (E)에 나타난 바와 같이, 48 시간까지 MEF는 엑소좀을 최대로 내재화하였으며, 이후에는 흡수 과정이 시간에 따라 포화됨을 반영하여 감소하는 것으로 나타났다. 따라서, 상기 결과에 기초하여, 직접분화를 위해, 6일이 걸리는 분화의 1 단계 동안 3 일마다 엑소좀을 교체하여 효율을 높일 수 있을 것으로 예상하였다.

실시예 6. 직접분화된 β 유사 세포의 C-펩타이드 면역 형광 염색

프로 인슐린은 인슐린과 C-펩타이드로 분해되므로, 췌장 베타 세포에서 인슐린과 C-펩타이드가 공동 분비된다. C-펩타이드는 내인성 인슐린에 대해 등몰량으로 생산되며, 외인성 인슐린의 부산물이 아니므로, 인슐린 합성 및 분비의 척도로 널리 사용되어왔다. 이에, 다른 배지 조건에서 성장한 MEFs에 C-펩타이드 면역 염색을 수행하였다.

C-펩타이드 면역 형광 염색 과정은 구체적으로 다음과 같다: 4x10⁴ MEFs는 DMEM의 12웰 플레이트에 분주하였다. 1일 후, 1μM BIX01294(BIX)(히스톤 메틸전달효소 억제제) 및 280μM 2- 포스포-L-아스코르브산(pVC)(보충제)의 존재 또는 부재 하에 50 ug/ml MIN6 엑소좀과 함께 6일 동안 항온 배양하였다.

그 다음, 상기 배지를 2 μM TTNPB(레티노산 아고니스트)(MedchemExpress), 1μM repsox(TGF β 억제제)(MedchemExpress), 2μM 사이클로파민(cyclopamine)(sonic hedgehog 억제제)(Tocris) 및 280μM pVC(Sigma)를 함유하는 배지로 4일 동안 교환하였다.

이어서 세포를 500nM SB203580(MAPK inhibitor)(Tocris), 1ug/ml 라미닌 (Sigma), 10mM 니코틴 아미드(Sigma), 1X B27(Gibco) 보충제 및 pVC와 함께 10일동안 배양하였다. 녹아웃 DMEM (KO-DMEM)을 세포 리프로그래밍을 위한 기초배지 (대조군)으로 사용하였다.

분화 기간이 끝난 후, 세포를 1X 인산염 완충 식염수 (PBS) (Welgene)로 3 회 세척하고, 실온 (RT)에서 10 분 동안 4 % 파라포름알데히드 (Sigma)로 고정시켰다. 이어서, 세포를 1X PBS로 3 회 세척하고 투명화 (0.25 % Triton X-100, USB Corporation)한 다음, 블로킹 (1 % BSA (Amresco), 22.52 mg/mL 글리신 (Affymetrix) 및 0.1 % Tween 20 (Affymetrix)을 4 ℃에서 밤새 PBS에서 배양하였다. 이 후, 4 ℃에서 밤새 C- 펩티드 일차 항체 (Cell Signalling)와 함께 배양한 후, 이차 항체 (Thermo-Fischer)를 상온에서 2 시간 동안 사용한 후 1X PBS로 세 번 세척하였다. 핵 염색은 형광 현미경 (IX71S1F3, Olympus) 하에서 1μg/mL DAPI (Sigma)를 사용하여 관찰하였다.

그 결과, 도 5의 (B) 및 (C)에 나타난 바와 같이, C-펩타이드 염색은 BIX01294 + pVC 처리된 세포 및 50 μg/ml MIN6 유래 엑소좀으로 처리된 세포에서 관찰할 수 있었으나, 도 5의 (A)에 나타난 바와 같이, 저분자 또는 엑소좀이 미첨가된 배지에서 성장한 세포에서는 C-펩타이드 양성 세포가 관찰되지 않았다.

또한, 도 5의 (D)에 나타난 바와 같이, C-펩타이드 염색의 강도는 BIX01294 + pVC + 50 μg/ml 엑소좀 처리시 가장 높은 것으로 나타났다.

따라서, BIX01294 및 pVC와 같은 저분자와 50 μg/ml 엑소좀의 첨가가 MEF의 β 유사 세포로의 분화 효율을 증가시킨다는 것을 확인하였다.

실시예 8. MIN6 엑소좀을 이용한 마우스 외분비 세포 (exocrine cells)의 β 유사 세포로의 직접 분화

췌장의 외분비 및 내분비 세포가 공통 발달 경로를 공유함에 따라, MIN6 엑소 좀이 마우스 외분비 세포를 β 유사 세포로 직접 분화시킬 것으로 예측하였다. 이에, 성체 마우스의 췌장으로부터 마우스 외분비 세포를 분리하고, 외분비 세포에 MIN6 인슐린종 유래 엑소좀으로 처리시 β 유사 세포로 직접 분화될 수 있는지 확인하였다.

MIN6 엑소좀을 이용한 외분비 세포의 β 유사 세포 분화 과정은 다음과 같다 : 분리한 외분비 세포를 단계 (3) 배지에서 6 웰 플레이트 (BD Bioscience의 마트리겔의 1:10 희석으로 코팅됨)에 분주하였다. 단계 (3) 배지에서 1 일 후, 50 ㎍/ml 엑소좀을 하나의 웰에 첨가하고 다른 웰은 엑소좀을 첨가하지 않았다. 세포를 2 일 동안 단계 (3) 배지에서 엑소좀과 배양한 다음 엑소좀이 없는 신선한 배지 3 배지를 각 웰에 첨가하였다. 7 일 후, Qiagen RNeasy 키트를 사용하여 RNA 분리를 위해 세포를 수확하고 qRT-PCR을 이용하여 유전자 프로파일링을 수행하였다.

외분비 세포의 β 유사 세포로의 분화 분석을 위한 프라이머 서열은 표 3에 나타내었다.

그 결과, 도 6의 (A) 및 (B)에 나타난 바와 같이, 외분비 세포는 부착되어 있고 다른 것들은 현탁 상태였다. 이는 엑소좀 처리된 세포 및 비처리된 세포 모두에서 발생하였다.

도 6의 (C)에 나타난 바와 같이, 엑소좀 처리된 외분비 세포에서 Pdx1의 수준은 비처리 세포와 비교하여 1.5 배 증가하였다. Ngn3 발현 또한, 엑소좀 처리된 세포에서 1.6 배만큼 상향 조절되었다. 인슐린 1과 2의 수치 또한 각각 1.8 배와 1.9 배 증가한 것으로 나타났다.

그러나, 도 6의 (D)에 나타난 바와 같이, 글루카곤 (α 세포 마커), 엘라스타제 (선방 세포 마커) 및 onecut1 (췌관 세포 마커)의 발현은 엑소좀 처리 및 비처리 외분비 세포에서 유사한 수준을 나타내었다.

상기 결과는, 인슐린종 유래 엑소좀이 인슐린 1 및 2의 발현을 증진시키는 반면, 외분비 세포에서 글루카곤 (α 세포 유형) 발현이 발견되지 않았기 때문에, β 세포 메시지를 특이적으로 포함하며, 이로부터 본 발명의 엑소좀을 이용하여 β 세포를 특이적으로 직접 분화시킬 수 있을 것으로 기대된다.

실시예 9. β 유사 세포의 miRNA 발현 확인

엑소좀 RNA 및 세포 RNA는 제조사의 지시에 따라 혈청/혈장 miRNeasy 미니 키트 (QIAGEN)를 사용하여 단리하였다. 단리된 RNA는 제조사에서 제공한 지침에 따라 Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies)로 분석하였다. 라이브러리 제작을 위해 RNA integrity number (RIN) 값이> 7 인 RNA를 사용하였다.

제조사의 지시에 따라 Illumina용 SMARTer smRNA-Seq 키트 (Takara Bio)를 사용하여 250ng의 총 RNA를 작은 RNA 라이브러리 제작에 적용하였다. 먼저, 올리고 (dT) 프라이머에 대한 프라이밍 서열을 제공하기 위해 입력 (input) RNA를 먼저 폴리아 데닐화시켰다. 상보적 DNA (cDNA) 합성은 3' smRNA dT 프라이머를 이용하여 수행하였는데, 이는 각각의 첫 번째 가닥 cDNA 분자의 5' 말단에 어댑터 서열을 포함한다. MMLV-유래 PrimeScript 역전사 효소 (RT)가 각 RNA 주형의 5' 말단에 도달하면 SMART smRNA에 의해 결합된 비템플릿 뉴클레오티드를 추가하였다. PrimeScript RT는 각 첫번째 가닥 cDNA 분자의 3' 말단에 두번째 어댑터 서열을 추가하기 위한 템플릿으로 SMART smRNA Oligo를 사용하였다. 전장 Illumina 어댑터는 PCR 증폭동안 추가되었다. cDNA 단편은 제조업자의 지시에 따라 HiSeq 2500 시스템 (Illumuina)을 사용하는 Illumina 플랫폼에서 합성 방법 순서에 따른 리드 길이에 따라 시퀀싱하였다.

시퀀싱 후, 로우 시퀀스 리드를 품질에 따라 필터링하였다. 어댑터 시퀀스도 로우 시퀀스 리드에서 트리밍하였다. 처리된 리드로 트리밍된 리드와 비어댑터 리드 모두 긴 타겟 (>= 50bp)의 분석을 위해 사용하였다. 처리된 리드는 고유의 클러스터를 형성하기 위해 수집되었다. 이 클러스터는 시퀀스 ID 및 리드 길이가 100 % 동일한 리드가 포함되어있다. 클러스터에 임시 클러스터 ID와 보유한 리드 수를 제공하였다. 본 연구에서 다량의 rRNA의 영향을 제거하기 위해, 리드를 rRNA 서열에 정렬시키고 이들을 제거하였다. rRNA가 제거된 리드는 레퍼런스 게놈, miRBase v21 및 비-코딩 RNA 데이터베이스, RNAcentral 10.0에 순차적으로 정렬되어, 알려진 miRNA 및 tRNA, snRNA, snoRNA 등과 같은 다른 유형의 RNA를 분류하였다.

신규 miRNA 예측은 miRDeep2로 수행하였다. 각각의 smRNA에 대한 리드 카운트는 맵핑된 smRNA로부터 추출되어 각 smRNA의 존재비를 계산하였다. 미분 표현된 smRNA는 edgeR, 계층적 글러스터링을 사용한 Fold Change, exactTest와 같은 통계적 방법을 이용하여 각 smRNA의 조건을 비교함으로써 결정되었다.

그 중 췌장의 기능 혹은 췌장 분화와 관련된 기능이 알려져 있는 miRNA중에서 MIN6 miRNA에 비해 25배 이상 과발현되는 엑소좀 miRNA를 선택하였다 (표 4).

Min6 유래 엑소좀에서 과발현되는 miRNA

Mature_ID	Exosome/Cell.fc
mmu-miR-486b-5p	616.499206
mmu-miR-486a-5p	616.349384
mmu-miR-3470b	547.665913
mmu-miR-3470a	355.374470
mmu-miR-466i-5p	333.000653
mmu-miR-1195	259.496784
mmu-miR-3473a	256.265604
mmu-miR-145a-5p	198.195520
mmu-miR-19b-3p	178.961694
mmu-miR-150-5p	168.679944
mmu-miR-127-5p	104.129920
mmu-miR-709	97.283987
mmu-miR-706	92.986520
mmu-miR-3473b	92.866008
mmu-miR-770-3p	84.832541
mmu-miR-122-5p	80.326061
mmu-miR-126a-5p	67.819520
mmu-miR-199a-3p	60.663636
mmu-miR-199b-3p	60.654103
mmu-miR-669c-3p	59.973546
mmu-miR-3473e	54.761252
mmu-miR-467b-3p	51.993403
mmu-miR-7651-5p	49.183475
mmu-miR-92a-3p	46.780288
mmu-miR-341-3p	42.271474
mmu-miR-10b-5p	40.133529
mmu-miR-470-5p	38.575463
mmu-miR-3473f	37.385475
mmu-miR-494-3p	33.379355
mmu-miR-466m-3p	28.729906

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY TASCOM Co., Ltd <120> Process and compositions for the direct differentiation of somatic cell into pancreatic beta cells <130> MP19-085P1D1 <150> KR 10-2019-0050541 <151> 2019-04-30 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Actin Forward Primer <400> 1 gcaagtgctt ctaggcggac 20 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Actin Reverse Primer <400> 2 aagaaagggt gtaaaacgca gc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse PDX1 Forward Primer <400> 3 acccgtactg cctacacccg 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse PDX1 Reverse Primer <400> 4 gggccgggag atgtatttgt 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Insulin-1 Forward Primer <400> 5 gctggtagag ggagcagatg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Insulin-1 Reverse Primer <400> 6 cagagaccat cagcaagcag 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Insulin-2 Forward Primer <400> 7 gaagtggagg acccacaagt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Insulin-2 Reverse Primer <400> 8 agtgccaagg tctgaaggtc 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Ngn3 Forward Primer <400> 9 tctcaagcat ctcgcctctt c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Ngn3 Reverse Primer <400> 10 acagcaaggg taccgatgag a 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Fsp1 Forward Primer <400> 11 tgagcaactt ggacagcaac a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse Fsp1 Reverse Primer <400> 12 ttccggggtt ccttatctgg g 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> m_Glucagon Forward Primer <400> 13 gcccttcaag acacagagga 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> m_Glucagon Reverse Primer <400> 14 cctcatgcgc ttctgtctg 19 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> m_Onecut1 Forward Primer <400> 15 aagttccctc accatcatca c 21 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> m_Onecut1 Reverse Primer <400> 16 agtgtgaaac taccgctcac 20 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> m_Elastase Forward Primer <400> 17 aatgacggca ccgagcagta tgt 23 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> m_Elastase Reverse Primer <400> 18 ccatctccac cagcgcacac 20

Claims

레티노산 아고니스트(retinoic acid agonist); ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor); 헷지호그 억제제(hedgehog inhibitor); MAPK 억제제(MAPK inhibitor) 및 보충제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 췌장 베타 세포의 성숙화 유도용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 레티노산 아고니스트는 TTNPB, 피탄산, 및 레티노산으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 췌장 베타 세포의 성숙화 유도용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 헷지호그 억제제는 사이클로파민 또는 미페프리스톤(mifepristone)인 것을 특징으로 하는, 췌장 베타 세포의 성숙화 유도용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 MAPK 억제제는 sb203580인 것을 특징으로 하는, 췌장 베타 세포의 성숙화 유도용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 보충제는 2-포스포-L-아스코르브산, B27, 라미닌, 니코틴아마이드, 및 N2로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 것을 특징으로 하는, 췌장 베타 세포의 성숙화 유도용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 ALK-5 키나아제 억제제는 RepSox (1,5-Naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB525334 (6-(2-tert-butyl-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-5-yl)quinoxaline); GW788388 (4-(4-(3-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl)-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide); SD-208 (2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-yl)pteridin-4-amine); Galunisertib (LY2157299, 4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide); EW-7197 (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine); LY2109761 (7-(2-morpholinoethoxy)-4-(2-(pyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline); SB505124 (2-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-tert-butyl-1H-imidazol-5-yl)-6-methylpyridine); LY364947 (Quinoline, 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431542 (4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide); K02288 (3-[(6-Amino-5-(3,4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol]; 및 LDN-212854 (Quinoline, 5-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl])로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 췌장 베타 세포의 성숙화 유도용 조성물.
췌장 베타 세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 체세포의 췌장 베타 세포로의 직접분화 유도용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 체세포는 섬유아세포 (fibroblast) 또는 외분비 세포인 것을 특징으로 하는, 직접분화 유도용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 엑소좀은 mmu-miR-486b-5p, mmu-miR-486a-5p, mmu-miR-3470b, mmu-miR-3470a, mmu-miR-466i-5p, mmu-miR-1195, mmu-miR-3473a, mmu-miR-145a-5p, mmu-miR-19b-3p, mmu-miR-150-5p, mmu-miR-127-5p, mmu-miR-709, mmu-miR-706, mmu-miR-3473b, mmu-miR-770-3p, mmu-miR-122-5p, mmu-miR-126a-5p, mmu-miR-199a-3p, mmu-miR-199b-3p, mmu-miR-669c-3p, mmu-miR-3473e, mmu-miR-467b-3p, mmu-miR-7651-5p, mmu-miR-92a-3p, mmu-miR-341-3p, mmu-miR-10b-5p, mmu-miR-470-5p, mmu-miR-3473f, mmu-miR-494-3p, 및 mmu-miR-466m-3p 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함하는 것을 특징으로 하는, 직접분화 유도용 조성물.
제7항에 있어서,
상기 엑소좀은 CD63, CD9, CD81, Alix, 및 Tsg101 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 발현하거나;
Calnexin, Grp78 및 GM130 으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는, 직접분화 유도용 조성물.