KR20220040982A - 마이크로 rna를 이용하여 체세포로부터 췌장 베타세포를 직접 분화시키는 방법 및 분화 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 체세포를 마이크로 RNA 및 저분자성 물질을 이용하여 췌장 베타세포로의 직접분화(Reprogramming)하는 방법에 관한 것으로, 본 발명자들은 다양한 분화 유도 물질 등 저분자성 물질과 마이크로 RNA를 병용처리하여 직접분화를 시도한 결과, 췌장 베타세포에서 PDX1의 발현량이 현저히 증가하였으며, 이러한 방법으로 유사 췌장 베타세포를 유도하였을 때 매우 높은 수율로 직접분화됨을 확인하였다. 또한, 본 발명은 자가 세포를 이용하므로 면역거부반응이 생기지 않으면서 암 발생 가능성도 낮다는 장점이 있어 더욱 안전한 세포치료제 개발에 유용하게 사용될 것으로 기대된다. 또한, 본 발명에 의해 생산된 췌장 베타세포는 당뇨병 또는 췌장암을 예방, 치료 및 개선하기 위한 세포 조성물로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

마이크로 RNA를 이용하여 체세포로부터 췌장 베타세포를 직접 분화시키는 방법 및 분화 조성물{Process and compositions for the direct differentiation of somatic cell into pancreatic beta cells using microRNA}

본 발명은 체세포로부터 췌장 베타세포를 직접 분화시키는 방법 및 분화 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 마이크로 RNA(miRNA) miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 체세포의 췌장 베타세포로의 직접분화 유도용 조성물 및 그를 이용한 췌장 베타세포의 직접분화 방법 등에 관한 것이다.

당뇨에서 글루코스 독성은 β-세포의 세포사멸(apoptosis)을 야기하고, 췌장을 포함한 다양한 장기 시스템에 영향을 미친다. 그러나 기본적인 메커니즘은 완전하게 알려져 있지는 않다. β-세포의 장애 및 손상된 인슐린 생산은 당뇨의 전형적인 특징이나, 당뇨병의 급속한 확산에도 불구하고 β-세포의 세포사멸을 야기하는 글루코스 독성의 정확한 분자적 메커니즘은 여전히 알려지지 않았다.

특히, 제1형 당뇨병 및 췌장암과 같은 질환은 베타세포의 손상 또는 손실에 의하여 기능이상이 유발되므로, 췌장 베타세포의 이식 방법만이 유일한 치료법이다.

최근 줄기세포 연구가 발전함에 따라, 중간 분화를 거치지 않고 다양한 계통으로 체세포를 직접분화(재분화 또는 리프로그래밍)시키는 과정에서 시간 및 효과 문제를 줄였을 뿐만 아니라 자가 이식을 위한 새로운 길이 열렸다. 다만, 유도만능줄기세포(induced pluripotent stem cell, iPSC)에서 유래된 췌장 베타세포는 타인의 세포를 사용하므로 면역 거부 반응이 있을 수 있고 줄기세포의 암 유발가능성 때문에 안정성 문제가 있을 수 있다.

이에, 본인의 체세포를 췌장 베타세포로 전환시키는 직접 분화법이 각광을 받고 있다. 체세포를 췌장 베타세포로 전환하는 방법은 베타세포의 마커 유전자를 강제로 발현시키는 방법 및 저분자 물질을 이용하는 방법이 있으나, 외부 유전자를 도입하는 방법은 유전체에 영향을 주어 암발생 가능성이 있고, 저분자 물질을 이용하는 경우 췌장 베타세포로 전환 효율이 낮아지는 단점이 있었다.

또한, 기존에는 췌장 베타세포로 변환하는데 소요되는 기간이 27일 이상으로, 췌장 베타세포를 생산하는 기간이 길다는 단점이 있고, 이를 단축할 필요가 있었다(Cell Stem Cell. 2014 Feb 6; 14(2):228-36. doi:10.1016/j.stem.2014.01.006.)).

이러한 문제를 극복하기 위하여 본 발명자들은 마이크로 RNA를 단독 혹은 저분자 물질과 함께 체세포에 처리함으로써 체세포를 췌장 베타세포로 단시간에 효과적으로 전환하는 기술을 개발하였다.

공개특허 제10-2015-0117532호

본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 체세포를 바로 췌장 베타세포로 변화시키는 방법을 찾고자 예의 노력한 결과, 본 발명의 마이크로 RNA 단독; 또는 히스톤 메틸전달효소 저해제 (histone methyltransferase inhibitor), 레티노산 아고니스트(retinoic acid agonist), ALK-5 키나아제 억제제(ALK-5 kinase inhibitor), 헷지호그 억제제(hedgehog inhibitor), MAPK 억제제(MAPK inhibitor), 칼슘 채널 아고니스트, GLP 수용체 아고니스트, 보충제; 및 마이크로 RNA를 포함한 조성물이 체세포의 췌장 베타세포로의 전환을 유도하기 위해 처리될 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함하는 체세포의 췌장 베타세포로의 직접분화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 MAPK 억제제(MAPK inhibitor), 칼슘 채널 아고니스트, GLP 수용체 아고니스트, 보충제; 및 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA;를 포함하는 조성물의 존재 하에 체세포를 배양하는 단계;를 포함하는 체세포로부터 췌장 베타세포로의 직접분화 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 직접분화 유도된 췌장 베타세포를 약학적으로 허용되는 약제학적으로 허용되는 담체 및 부형제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 혼합하는 단계를 포함하는, 당뇨병 또는 췌장암 치료용 세포치료제를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 유효성분으로 포함하는 조성물을 생체 내에 전달하여 생체 내에서 체세포의 베타세포로의 직접분화를 유도하는 단계를 포함하는, 당뇨병 또는 췌장암 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로 RNA 또는 저분자 물질을 유효성분으로 포함하는, 체세포의 췌장 베타세포로의 직접분화 유도용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함하는 체세포의 췌장 베타세포로의 직접분화 유도용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 체세포는 섬유아세포 (fibroblast), 췌관세포 및 외분비 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 조성물은 miR-19b를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 조성물은 히스톤 메틸전달효소 저해제 (histone methyltransferase inhibitor), 레티노산 아고니스트(retinoic acid agonist), ALK-5 키나아제 억제제(ALK-5 kinase inhibitor), 헷지호그 억제제(hedgehog inhibitor), MAPK 억제제(MAPK inhibitor), 칼슘 채널 아고니스트, GLP 수용체 아고니스트, 및 보충제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 저분자 물질을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 히스톤 메틸전달효소 저해제는 BIX01294 (2-(Hexahydro-4-methyl-1H-1,4-diazepin-1-yl)-6,7-dimethoxy-N-[1-(phenylmethyl)-4-piperidinyl]-4-quinazolinamine), 5-AZA-2'-데옥시사이티딘 (5-aza-2'-deoxycytidine:DAC), 제불라린 (Zebularine), 3'-데아자네플라노신 A 하이드로클로리드 (3'-Deazaneplanocin A hydrochloride), 로메구아트리브 (Lomeguatrib), 카에토신 (Chaetocin, 2,2',3S,3'S,5aR,5'aR,6,6'-octahydro-3,3'-bis(hydroxymethyl)-2,2'-dimethyl-[10bR,10'bR(11aS,11'aS)-bi-3,11a-epidithio-11aH-pyrazino[1',2':1,5]pyrrolo[2,3-b]indole]-1,1',4,4'-tetrone), 및 데시타빈 (Decitabine, 5-aza-2'-deoxycytidine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 보충제는 2-포스포-L-아스코르브산, B27, 라미닌, 니코틴아마이드, 및 N2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 레티노산 아고니스트는 TTNPB, 피탄산, 및 레티노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 헷지호그 억제제는 사이클로파민(cyclopamine), 미페프리스톤(mifepristone), GDC-0449(Vismodegib), XL139(BMS-833923), IPI926, IPI609(IPI269609), LDE225, 제르빈, GANT61, 퍼모파민, SAG, SANT-2, 토마티딘, SANT74, SANT75, 제룸본 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 MAPK 억제제는 1-Pyridinyl-2-phenylazole, SB 203580, SKF 86002, SKF 86096, SKF 104351, 1-Aryl-2-pyridinyl/pyrimidinyl heterocycles, SB 242235, RO-32001195, SX-011, 및 BIRB-796로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 ALK-5 키나아제 억제제는 RepSox (1,5-Naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB525334 (6-(2-tert-butyl-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-5-yl)quinoxaline); GW788388 (4-(4-(3)-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl)-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide); SD-208 (2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-yl)pteridin-4-amine); Galunisertib (LY2157299, 4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide); EW-7197 (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine); LY2109761 (7-(2-morpholinoethoxy)-4-(2-(pyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline); SB505124 (2-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-tert-butyl-1H-imidazol-5-yl)-6-methylpyridine); LY364947 (Quinoline, 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431542 (4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide); K02288 (3)-[(6-Amino-5-(3),4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol]; 및 LDN-212854 (Quinoline, 5-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl])로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 칼슘 채널 아고니스트는 Bay K-8644, FPL 64179, 및 CGP28392로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 GLP 수용체 아고니스트는 엑센딘-4, 둘라글루티드(Dulaglutide), 엑세나티드(Exenatide), 세마글루티드(Semaglutide), 리라글루티드(Liraglutide), 릭시세나타이드(Lixisenatide), 및 알비글루티드(Albiglutide)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 MAPK 억제제(MAPK inhibitor), 칼슘 채널 아고니스트, GLP 수용체 아고니스트, 보충제; 및 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA;를 포함하는 조성물의 존재 하에 체세포를 배양하는 단계;를 포함하는 체세포로부터 췌장 베타세포로의 직접분화 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 (1) 체세포를 췌장 내배엽 세포 (pancreatic endoderm cell)로 유도하는 단계; (2) 췌장 내배엽 세포를 췌장 전구 세포로 유도하는 단계; 및 (3) 췌장 전구 세포를 췌장 베타세포로 유도하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 방법은 (3) 췌장 전구 세포를 췌장 베타세포로 유도하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 방법의 체세포가 섬유아세포인 경우 세 가지 단계를 통해 분화가 필요하지만, 상기 체세포가 췌장 전구 세포의 성질을 갖는 췌관세포 및 외분비세포인 경우, 상기 조성물의 존재 하에서 체세포로부터 췌장 베타세포로 직접분화할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 상기 직접분화 방법은 하기 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 :

(1) 히스톤 메틸전달효소 저해제(Histone methyltransferase inhibitor); activin A, 보충제; 및 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA;를 포함하는 조성물의 존재 하에 체세포를 췌장 내배엽 세포(pancreatic endoderm cell)로 유도하는 단계;

(2) 레티노산 아고니스트, ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor), 헷지호그 억제제, 보충제; 및 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA;를 포함하는 조성물의 존재 하에 췌장 내배엽 세포를 췌장 전구 세포(pancreatic progenitor cell)로 유도하는 단계; 및

(3) MAPK 억제제(MAPK inhibitor), 칼슘 채널 아고니스트, GLP 수용체 아고니스트, 보충제; 및 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA;를 포함하는 조성물의 존재 하에 체세포를 배양하는 단계.

또한, 본 발명은 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 당뇨병은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 임신성 당뇨병으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 직접분화 방법에 의해 직접분화 유도된 췌장 베타세포를 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 혼합하는 단계를 포함하는, 당뇨병 또는 췌장암 치료용 세포치료제를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 직접분화 방법에 의해 직접분화 유도된 췌장 베타세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 췌장암 치료용 세포 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함하는 조성물을 생체 내에 전달하여 생체 내에서 체세포의 베타세포로의 직접분화를 유도하는 단계를 포함하는, 당뇨병 또는 췌장암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 당뇨병 또는 췌장암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 당뇨병 또는 췌장암 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 당뇨병 또는 췌장암 치료 약제를 제조하기 위한 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함하는 조성물의 체세포의 췌장 베타세포로의 직접분화 유도 용도를 제공한다.

본 발명은 체세포를 마이크로 RNA 및 저분자성 물질을 이용하여 췌장 베타세포로의 직접분화(Reprogramming)하는 방법에 관한 것으로, 본 발명자들은 다양한 분화 유도 물질 등 저분자성 물질과 마이크로 RNA를 병용처리하여 직접분화를 시도한 결과, 췌장 베타세포에서 PDX1의 발현량이 현저히 증가하였으며, 이러한 방법으로 유사 췌장 베타세포를 유도하였을 때 매우 높은 수율로 직접분화 됨을 확인하였다. 또한, 본 발명은 전환된 췌장베타세포를 당뇨병이나 췌장암 환자에게 이식하는 경우 자가 세포를 이용하므로 면역거부반응이 생기지 않으면서 암 발생 가능성도 낮다는 장점이 있어 더욱 안전한 세포치료제 개발에 유용하게 사용될 것으로 기대된다. 또한, 본 발명에 의해 생산된 췌장 베타세포는 당뇨병 또는 췌장암을 예방, 치료 및 개선하기 위한 세포 조성물로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1a는 저분자 물질을 이용하여 체세포를 베타세포로 전환하는 방법에 관한 그림이며, 도 1b는 저분자 물질을 이용한 전환조건에 마이크로 RNA를 추가로 넣은 방법을 나타내며, 도 1c는 저분자 물질을 이용하여 전환된 베타세포에서 베타세포 마커인 Pdx1 및 Ins-2가 과발현되는 것을 나타낸 도이다.
도 2는 섬유아세포를 β 세포 유사 세포로 분화하는 단계에서 주요 베타세포 마커의 발현을 나타낸 것이다. * P <0.05, ** P <0.01 및 *** P <0.001. 통계적 유의성은 양방향, 대응 스튜던트 t-검정에 의해 결정되었다. 표시된 데이터는 세 번의 독립적인 실험에서 얻은 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 2a는 다양한 종류의 miRNA를 처리한 후 1단계 세포에서 Pdx1 유전자 발현을 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 2b는 1 단계 세포에서 상이한 miR-127 및 miR-709 농도의 조합에 따른 Pdx1 발현 유도 효과를 나타낸 것이다.
도 2c는 조합-3을 사용하여 miR-127 및 miR-709 형질감염한 후, 1 단계 세포에서 Ngn3 전사체 수준을 나타낸 것이다.
도 2d는 miR-127 및 miR-709 (조합-3)로 형질감염된 2단계 세포의 췌장 유전자 발현 프로파일을 qRT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2e는 miR-127 및 miR-709 (조합-3)로 형질감염된 3단계 세포에서 췌장 β세포 마커를 qRT-PCR로 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 miRNA 모방체 및 본 발명 miRNA(miR-127, miR-709, 및 miR-19b) 조합의 형질감염에 따른 마우스 배아 섬유아세포(MEF)의 증식 능력을 확인한 것이다.
도 3a는 섬유아세포에서 형질감염 효율을 최적화하기 위해 5 'FAM 표지된 대조군 모방체를 형질감염한 결과를 나타낸 것이다. 1단계 배지에서 48시간 동안 형질감염 후 명시야 현미경 이미지(좌측) 및 형광 현미경 이미지(우측)을 나타낸 것이다. 스케일 바 = 100 μm.
도 3b는 qRT-PCR 분석을 사용하여 1단계 배지에서 miR-127, miR-709 및 miR-19b의 다양한 농도 조합에 따른 Pdx1 발현 유도 효과를 나타낸 것이다. * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. 통계적 유의성은 양방향, 대응 스튜던트 t-검정에 의해 결정되었다. 표시된 데이터는 세 번의 독립적인 실험에서 얻은 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 3c는 분화 1 단계 (48 시간 후)에서 각기 다른 조합의 처리에 따른 MEF의 형태학적 변화를 명시야 현미경 이미지로 나타낸 것이다. 스케일 바 = 100 μm.
도 4는 miRNA 모방체 및 본 발명 miRNA(miR-127, 및 miR-709) 조합의 형질감염에 따른 외분비 세포의 일종인 선방 (acinar) 세포 266-6의 췌장 베타세포 관련 마커 발현을 확인한 것이다.
도 4a는 3 단계 배지에서 266-6 세포의 형질 감염 최적화 결과로서, 3단계 배지에서 48시간 동안 형질감염 후 명시야 현미경 이미지(좌측) 및 형광 현미경 이미지(우측)을 나타낸 것이다.
도 4b는 266-6 세포를 miR-127 + miR-709(조합-3)로 형질감염시키고 Pdx1, Ngn3, Insulin-1, Insulin-2, 및 Elastase의 전사 수준을 나타낸 것이다. 조합-3은 선방세포 마커인, Elastase의 발현을 감소시켰다. * P <0.05 및 ** P <0.01. 통계적 유의성은 양방향, 대응 스튜던트 t-검정에 의해 결정되었다. 표시된 데이터는 세 번의 독립적인 실험에서 얻은 평균 ± SEM을 나타낸다.
도 5는 miR-127과 3 단계 저분자물질 조합에 따른 사람의 췌관 세포 Capan-1 세포에서 췌장 베타세포 유전자 발현을 나타낸 것이다. 3단계에서 사용된 저분자 물질인 SB203580 (MAP kinase inhibitor), Nicotinamide (보조제), Exendin-4 (GLP receptor agonist), Bay K-8644 (calcium channel agonist)을 서로 다른 조합으로 miR-127과 처리하여 베타세포 마커 Pax-6 및 MafA의 발현량을 측정한 결과이다.

본 발명자들은 마이크로 RNA 또는 저분자만을 사용하였을 때와 비교하여, 마이크로 RNA와 저분자를 병용 사용한 경우, 마이크로 RNA 단독 혹은 저분자 단독처리 혹은 처리하지 않은 대조군에 비해 췌장 베타세포로의 직접분화가 현저히 잘 됨을 확인하였는 바, 본 발명은 특정 마이크로 RNA를 유효성분으로 포함하는, 체세포의 췌장 베타세포로의 직접분화 유도용 조성물을 제공하며, 보다 구체적으로는miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함하는 체세포의 췌장 베타세포로의 직접분화 유도용 조성물에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서, “마이크로 RNA(miRNA, microRNA)는 mRNA 번역의 억제 또는 mRNA 분해를 촉진함으로써, 유전자 발현의 음성 조절인자로서의 역할을 하는 ~22 뉴클레오티드 길이의 작은 비-암호화 RNA(small noncoding RNA)이다.

본 발명에서, “miR-127”는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함하거나 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, “miR-709”는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함하거나 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, “miR-19b”는 서열번호 5로 표시되는 염기서열을 포함하거나 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, miR-127 및 miR-709는 0.1 내지 10 : 1, 1 내지 3 : 1, 1 : 1 내지 3, 또는 1 : 1의 몰농도(M) 비율로 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, miR-127, miR-709, 및 miR-19b는 0.1 내지 10 : 0.1 내지 10 : 1의 몰농도(M) 비율, 1 내지 3 : 1 내지 3 : 1 내지 3의 몰농도(M) 비율, 또는 1 : 1 : 1의 몰농도(M) 비율로 포함된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 췌장 베타세포를 유도함에 있어서, 출발 체세포(모세포)의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 임의의 체세포를 이용할 수 있다. 예를 들어, 태아기(embryonic period)의 체세포 이외에 성숙한(matured) 체세포를 이용해도 된다. 유도 췌장 베타세포를 질병의 치료에 이용하는 경우에는 환자로부터 분리된 체세포를 이용하는 것이 바람직하며, 예를 들어, 질병에 관여하는 체세포나 질병치료에 관여하는 체세포 등을 이용할 수 있다. 한편, 본 발명의 체세포는 인간 췌장 유래 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 체세포는 섬유아세포 (fibroblast), 췌관세포 또는 외분비 세포(exocrine cell) 일 수 있으며, 본 발명에서 체세포는 인간과 마우스, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 동물 유래의 모든 체세포를 포함한다.

본 발명에서 용어 "췌장 베타세포(pancreatic β cells)"는 "췌장 베타세포 유사 세포" 와 상호 교환되어 사용될 수 있으며, 이는 췌장의 랑게르한스섬을 구성하는 세포의 하나로, 인슐린을 생성 분비하는 세포이다. 췌장 베타세포에 문제가 있을 경우, 인슐린의 생성에 문제가 있어 당뇨병을 유발할 수 있다. 따라서 이와 같은 세포는 췌장의 인슐린 분비가 문제되어 발생하는 당뇨병의 치료에 이용될 수 있다.

본 발명에서 용어 “췌장 전구 세포”는 통상적으로 췌장 내분비 세포 및 췌장 외분비 세포로 분화가능한 내중배엽계 세포이며, 본 발명에서는 췌장 베타 세포로 분화 유도될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는 체세포에 마이크로 RNA 및 저분자 물질을 처리하여 직접분화된 췌장 베타세포가 췌장 특이성 유전자 마커인 PDX1, Ngn3, Ins-1, 및 Ins-2를 고발현하는 것을 확인하였다.

본 발명에서, 상기 조성물은 miR-19b를 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 조성물은 히스톤 메틸전달효소 저해제 (histone methyltransferase inhibitor), 레티노산 아고니스트(retinoic acid agonist), ALK-5 키나아제 억제제(ALK-5 kinase inhibitor), 헷지호그 억제제(hedgehog inhibitor), MAPK 억제제(MAPK inhibitor), 칼슘 채널 아고니스트, GLP 수용체 아고니스트, 및 보충제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 저분자 물질을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 조성물이 히스톤 메틸전달효소 저해제 (histone methyltransferase inhibitor)를 포함하는 경우, 체세포의 췌장 내배엽 세포로의 분화 유도용일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 조성물이 레티노산 아고니스트(retinoic acid agonist), ALK-5 키나아제 억제제(ALK-5 kinase inhibitor), 및 헷지호그 억제제(hedgehog inhibitor)를 포함하는 경우, 체세포 또는 췌장 내배엽 세포의 췌장 전구 세포로의 분화 유도용일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 조성물이 MAPK 억제제(MAPK inhibitor), 칼슘 채널 아고니스트, 및 GLP 수용체 아고니스트를 포함하는 경우, 췌장 베타세포의 성숙화 유도용일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "성숙(maturation)"이라 함은 췌장 베타세포로 유도된 세포가 보다 완벽한 활성을 갖는 베타세포로 전환되는 것을 의미한다.

본 발명에서 용어 "레티노산 아고니스트(retinoic acid agonist)"는, 바람직하게는 레티노산 수용체 아고니스트(RAR agonist)일 수 있으며, TTNPB (4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]benzoic acid, Arotinoid acid), 피탄산(phytanic acid), 및 레티노산(retinoic acid, RA)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. RAR 수용체는 RAR 반응 요소(RARE) 라고 알려진 DNA 서열 요소에 레티노이드 X 수용체(RXR 이라고 알려짐) 와의 이종이량체의 형태로 결합함으로써 전사를 활성화시킨다. 종래 공지 기술은 RAR 유형 수용체 리간드인 다수의 화합물을 포함하고 있다. 종래 기술 문서 중에, 언급할 수 있는 예로는, 삼방향족 화합물을 기재하고 있는 특허 US 6150413, 스틸벤 화합물을 기재하고 있는 특허 US 6214878, 또는 이환식 또는 삼환식 분자 군을 기재하고 있는 특허 US 6218128 이 포함된다. 본 발명의 배지는 레티노산 아고니스트를 0.01 nM 내지 30 nM, 0.01 nM 내지 20 nM, 0.01 nM 내지 10 nM, 0.1 nM 내지 30 nM, 0.01 nM 내지 20 nM, 0.01 nM 내지 10 nM, 0.1 nM 내지 8 nM, 0.1 nM 내지 6 nM, 0.1 nM 내지 3 nM, 0.1 nM 내지 2 nM, 0.1 nM 내지 1 nM, 0.1 nM 내지 0.8 nM, 0.1 nM 내지 0.7 nM, 0.3 nM 내지 1 nM, 0.3 nM 내지 0.7 nM, 또는 약 0.5 nM 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, "ALK-5 키나아제 억제제(ALK-5 kinase inhibitor)"는 TGF-β 타입 I 리셉터에 결합하여 TGF-β I의 정상적인 신호전달 과정을 방해하는 물질을 의미하며, TGF-β 타입 I(Transforming growth factor-β type I)은 세포증식, 분화 및 다양한 종류의 세포에 다양한 작용을 하는 다기능성 펩타이드로서, 이러한 다기능성은 지방세포형성, 근세포형성, 골세포형성, 상피세포 분화 등 여러 조직의 성장 및 분화에서 중추적인 역할을 한다. 상기 ALK-5 키나아제 억제제 (TGF-β 타입 I 리셉터 억제제)는 RepSox(1,5-Naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB525334(6-(2-tert-butyl-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-5-yl)quinoxaline); GW788388(4-(4-(3)-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl)-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide); SD-208(2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-yl)pteridin-4-amine); Galunisertib(LY2157299, 4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide); EW-7197(N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine); LY2109761(7-(2-morpholinoethoxy)-4-(2-(pyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline); SB505124(2-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-tert-butyl-1H-imidazol-5-yl)-6-methylpyridine); LY364947(Quinoline, 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431542(4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide); K02288(3)-[(6-Amino-5-(3),4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol]; 또는 LDN-212854(Quinoline, 5-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl])를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 Repsox일 수 있으나, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 배지는 ALK-5 키나아제 억제제를 0.01μM 내지 20μM 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 10μM 포함하는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 0.5μM 내지 5μM, 가장 바람직하게는 0.7μM 내지 1.5μM일 수 있다.

본 발명에서 용어 "헷지호그 억제제(hedgehog inhibitor)"는, 바람직하게는 소닉 헷지호그 억제제(sonic hedgehog inhibitor)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 사이클로파민(cyclopamine), 미페프리스톤(mifepristone), GDC-0449(Vismodegib), XL139(BMS-833923), IPI926, IPI609(IPI269609), LDE225, 제르빈, GANT61, 퍼모파민, SAG, SANT-2, 토마티딘, SANT74, SANT75, 제룸본 또는 그의 유도체일수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 배지는 헷지호그 억제제를 0.05μM 내지 20μM 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 15μM 포함하는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 0.5μM 내지 10μM, 보다 더 바람직하게는 0.5μM 내지 5μM, 가장 바람직하게는 1μM 내지 3μM일 수 있다.

본 발명에서 용어 "MAPK 억제제"는 미토겐 활성화 단백질 키나아제 [Mitogen activated protein kinases; MAPK]로, 이중 인산화에 의하여 그들의 기질을 활성화시키는 프롤린 작동성 세린/트레오닌 키나아제 패밀리 중 하나의 구성원이다. 공지된 MAPK 억제제는 알려져 있는 P38 키나아제 억제제로, 1-Pyridinyl-2-phenylazole, SB 203580, SKF 86002, SKF 86096, SKF 104351, 1-Aryl-2-pyridinyl/ pyrimidinyl heterocycles, SB 242235, RO-32001195, SX-011, 또는 BIRB-796 일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 다음 문헌 [G. J. Hanson (Expert Opinions on Therapeutic Patents, 1997, 7, 729-733) J Hynes et al . (Current Topics in Medicinal Chemistry, 2005, 5, 967-985), C. Dominguez et al(Expert Opinions on Therapeutics Patents, 2005, 15, 801-816) and L. H. Pettus & R. P. Wurtz(Current Topics in Medicinal Chemistry, 2008, 8, 1452-1467)]에서 기재되어 있다. 본 발명의 MAPK 억제제는 바람직하게는 sb203580일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 배지는 MAPK 억제제를 50μM 내지 5000μM, 0.001 내지 2500 μM, 0.01 내지 1000 μM, 0.01 내지 900 μM, 0.01 내지 800 μM, 0.01 내지 700 μM, 0.01 내지 600 μM, 0.01 내지 500 μM, 0.01 내지 400 μM, 0.01 내지 300 μM, 0.01 내지 200 μM, 0.01 내지 100 μM, 0.01 내지 90 μM, 0.01 내지 80 μM, 0.01 내지 70 μM, 0.01 내지 60 μM, 0.01 내지 50 μM, 0.01 내지 40 μM, 0.01 내지 30 μM, 0.01 내지 20 μM, 0.01 내지 10 μM, 0.01 내지 5 μM, 0.01 내지 3 μM, 0.01 내지 2 μM, 0.01 내지 1 μM, 0.5 내지 10 μM, 0.5 내지 7 μM, 0.5 내지 5 μM, 0.5 내지 3 μM, 0.5 내지 1.5 μM, 0.7 내지 1.3 μM, 또는 약 1 μM일 수 있다.

본 발명에서 용어 “칼슘 채널 아고니스트(calcium channel agonist)”는 “칼슘 채널 오프너”로도 명명되며, 칼슘 채널을 통한 이온 전달을 촉진하는 물질이라면 제한되지 않는다. 본 발명의 칼슘 채널 아고니스트는 Bay K-8644, FPL 64179, 및 CGP28392로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 배지는 칼슘 채널 아고니스트를 0.05μM 내지 20μM 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 15μM 포함하는 것일 수 있고, 보다 바람직하게는 0.5μM 내지 10μM, 보다 더 바람직하게는 0.5μM 내지 5μM, 가장 바람직하게는 1μM 내지 3μM일 수 있다.

본 발명에서 용어 “GLP 수용체 아고니스트(GLP receptor agonist)”는 구체적으로 GLP-1 수용체 아고니스트일 수 있으며, GLP 작용 활성이 있는 모든 펩타이드, 이들의 단편, 전구물질, 변이체나 유도체를 망라하며, GLP 수용체를 활성화시킬 수 있는 물질을 제한없이 포함할 수 있다. 본 발명의 GLP 수용체 아고니스트는 엑센딘-4, 둘라글루티드(Dulaglutide), 엑세나티드(Exenatide), 세마글루티드(Semaglutide), 리라글루티드(Liraglutide), 릭시세나타이드(Lixisenatide), 및 알비글루티드(Albiglutide)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 배지는 GLP 수용체 아고니스트를 1 내지 500 ng/mL, 1 내지 400 ng/mL, 1 내지 300 ng/mL, 1 내지 200 ng/mL, 1 내지 100 ng/mL, 30 내지 500 ng/mL, 30 내지 400 ng/mL, 30 내지 300 ng/mL, 30 내지 200 ng/mL, 30 내지 100 ng/mL, 30 내지 90 ng/mL, 30 내지 80 ng/mL, 30 내지 70 ng/mL, 40 내지 60 ng/mL, 또는 약 50 ng/mL로 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 용어 "보충제"는, 2-포스포-L-아스코르브산, B27, 라미닌(laminin), 니코틴아마이드(nicotinamide), 및 N2로 이루어진 군에서 하나 이상 선택된 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 MAPK 억제제(MAPK inhibitor), 칼슘 채널 아고니스트, GLP 수용체 아고니스트, 보충제; 및 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA;를 포함하는 조성물의 존재 하에 체세포를 배양하는 단계;를 포함하는 체세포로부터 췌장 베타세포로의 직접분화 방법에 관한 것이다.

본 발명에서, 상기 방법은 (1) 체세포를 췌장 내배엽 세포 (pancreatic endoderm cell)로 유도하는 단계; (2) 췌장 내배엽 세포를 췌장 전구 세포로 유도하는 단계; 및 (3) 췌장 전구 세포를 췌장 베타세포로 유도하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 방법은 (3) 췌장 전구 세포를 췌장 베타세포로 유도하는 단계를 포함하거나, 상기 단계로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서, 상기 방법의 체세포가 섬유아세포인 경우 세 가지 단계를 통해 분화가 필요하지만, 상기 체세포가 췌장 전구 세포의 성질을 갖는 췌관세포 및 외분비세포인 경우, (3)의 조성물의 존재 하에서 체세포로부터 췌장 베타세포로 직접분화할 수 있다.

본 발명에서, 상기 직접분화 방법은 하기 단계를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 :

(1) 단계: 히스톤 메틸전달효소 저해제(Histone methyltransferase inhibitor); activin A, 보충제; 및 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA;를 포함하는 조성물의 존재 하에 체세포를 췌장 내배엽 세포(pancreatic endoderm cell)로 유도하는 단계;

(2) 단계: 레티노산 아고니스트, ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor), 헷지호그 억제제, 보충제; 및 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA;를 포함하는 조성물의 존재 하에 췌장 내배엽 세포를 췌장 전구 세포(pancreatic progenitor cell)로 유도하는 단계; 및

(3) 단계: MAPK 억제제(MAPK inhibitor), 칼슘 채널 아고니스트, GLP 수용체 아고니스트, 보충제; 및 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA;를 포함하는 조성물의 존재 하에 체세포를 배양하는 단계.

본 발명의 (1) 단계는, 췌장 베타세포로 분화를 유도할 수 있는 기간이라면 제한이 없이 이루어질 수 있으나, 3 내지 10일, 4 내지 9일, 4 내지 8일, 4 내지 7일, 또는 5 내지 7일 동안 수행될 수 있고, 더욱 바람직하게는 약 6일 동안 수행될 수 있다. 상기 단계의 보충제는 바람직하게는 2-포스포-L-아스코르브산일 수 있다.

상기 (2) 단계의 배양은 제한없이 이루어질 수 있으나, 0.5 내지 8일, 0.5 내지 7일, 1 내지 7일, 2 내지 6일, 3 내지 5일, 또는 약 4일 동안 수행될 수 있다. 다만, 상기 배양 기간은 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 (2) 단계의 보충제는 바람직하게는 2-포스포-L-아스코르브산일 수 있다.

본 발명의 (3) 단계는, 상기 분화가 유도된 세포가 성숙할 수 있는 기간이라면 제한이 없이 이루어질 수 있으나, 7 내지 13일, 8 내지 12일, 9 내지 11일, 또는 약 10일 동안 수행될 수 있다. 다만, 상기 배양 기간은 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 단계의 보충제는 바람직하게는 2-포스포-L-아스코르브산, 라미닌, B27, 및 니코틴아마이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으며, 보다 바람직하게는 2-포스포-L-아스코르브산, 라미닌, B27, 및 니코틴아마이드일 수 있다.

본 발명의 직접분화 방법을 사용하는 경우, 종래의 알려진 줄기세포 분화 방법 및 화학적 세포 분화 방법과 비교하여, 보다 면역 거부 반응이 생기지 않으면서도, 암 발생 가능성이 없다는 장점이 있다.

본 발명의 용어 "배지"는 당업계에 알려진 기본 배지를 제한 없이 사용할 수 있다. 기본 배지는 인위적으로 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 제조된 배지를 사용할 수도 있다. 상업적으로 제조되는 배지의 예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, DMEM 배지일 수 있다.

상기 체세포를 배양하는 배양액은 당해 분야에서 섬유아세포 배양에 통상적으로 사용되는 배지 배양액를 모두 포함한다. 배양에 사용되는 배양액은 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다.

체세포를 직접분화(Direct conversion) 방법을 이용하여 췌장 베타세포로 유도하는 대부분의 방법은 외부 유전자를 도입하는 방식으로 이루어지고 있다. 다만, 바이러스를 이용하여 유전자를 도입하는 것은 외부 유전자의 무작위적인 인테그레이션(integration)으로 인한 유전적 불안정성(genomic instability)을 야기하여, 향후 환자에 임상적용 시 암이 발생할 가능성이 있다. 이러한 이유로 인해 점차적으로 외부 유전자를 주입하지 않고 저분자성 물질(small molecule)을 이용하는 방법들이 제시되고 있는 실정이나 최근 다양한 저분자성 화합물들을 이용하여 직접분화를 유도하는 연구가 활발하게 진행되고 있음에도 불구하고 최소한 하나의 유전자는 이용되고 있으며, 유전자 도입 없이는 여전히 인간 체세포로부터 원하는 세포로 전환할 수 없는 상태이다.

그러나, 본 발명은 외부 유전자의 도입 없이 마이크로 RNA 혹은 마이크로 RNA와 저분자물질을 조합한 조성물을 처리하여 환자의 체세포로부터 췌장 베타세포를 유도하는 유전적 안정성이 확보된 방법으로써, 기존의 유전자를 이용한 세포전환 방법의 문제인 유전적 결손을 근본적으로 해결하면서, 암 발생 가능성을 낮추기 위하여 고안된 것이다.

본 발명에서는 마이크로 RNA 단독; 혹은 저분자성 물질과 마이크로 RNA의 조합을 이용하여 체세포를 췌장 베타세포로 직접분화하였다. 이에, 본 발명의 마이크로 RNA는 그 자체로서 당뇨병 또는 췌장암 치료제로 사용될 수 있을 것이며, 환자를 위한 세포치료제를 제조할 수 있어 활용 가능성이 매우 높다.

따라서, 본 발명은 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 직접분화 방법에 의해 직접분화 유도된 췌장 베타세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 췌장암 치료용 세포 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 포함하는 조성물을 생체 내에 전달하여 생체 내에서 체세포의 베타세포로의 직접분화를 유도하는 단계를 포함하는, 당뇨병 또는 췌장암 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 치료 또는 예방의 대상인 "당뇨병"은 췌장의 베타세포에서 생성되는 인슐린 호르몬 부족 또는 인슐린 저항성의 이상과 나아가 이러한 두 가지 모두의 결함으로 발생하는 고혈당을 특징으로 하는 대사장애증후군이다. 이러한 당뇨병은 인슐린 의존형 당뇨병(IDDM, Type 1)과 인슐린 저항 및 인슐린 분비 손상에 의해 발생하는 인슐린 비의존형 당뇨병(NIDDM, Type 2)으로 나눌 수 있다. 제1형과 제2형 당뇨병 모두에서 심장 질환, 장 질환, 안과 질환, 신경 질환, 뇌졸중 등과 같은 다양한 합병증이 발생하게 되는데, 이는 장시간 동안 혈당과 인슐린 수준이 상승하여 만성신경질환과 심혈관질환이 발생하게 되고 단시간의 저혈당과 고혈당 반응으로 급성 합병증을 야기시키게 되는 것이다. 당뇨병은 고혈당이 만성으로 지속되면서 당질 대사뿐만 아니라 지질 및 단백질 대사 장애도 함께 일으킨다. 그 병태는 다양하며 직접 고혈당에 기인하는 것으로 망막, 신장, 신경, 심혈관계 등에서 당뇨병성 말초신경장해, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신증, 당뇨병성 백내장, 각막증, 당뇨병성 동맥경화증 등이 있다.

당뇨병을 일으키고 심화시키는 중요한 병리 현상의 하나는 고혈당에 의한 췌장 β세포의 사멸이다. 본 발명자들은 체세포를 췌장 베타세포로 전환 시킴으로써 당뇨병 치료에 이용가능한 베타세포를 생산하는 방법을 제공하고 있다. 이에 따라, 본 발명에서의 당뇨병은 글루코스 독성에 의하여 유발되는 당뇨병 또는 심화 또는 진행된 당뇨병이라면 그 대상이 될 수 있으며, 보다 구체적으로는 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 임신성 당뇨병으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 “전달”은 투여를 통한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 miRNA는 약학적으로 허용가능한 염 형태로 포함될 수 있다. 본 발명에서 용어, "약학적으로 허용 가능한 염"이란 약학적으로 허용되는 무기산, 유기산, 또는 염기로부터 유도된 염을 포함한다.

적합한 산의 예로는 염산, 브롬산, 황산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 말레산, 인산, 글리콜산, 락트산, 살리실산, 숙신산, 톨루엔-p-설폰산, 타르타르산, 아세트산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 벤조산, 말론산, 글루콘산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산 등을 들 수 있다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조할 수 있다. 또한, 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.

적합한 염기로부터 유도된 염은 나트륨, 칼륨 등의 알칼리 금속, 마그네슘 등의 알칼리 토금속, 및 암모늄 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻을 수 있다. 이 때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.

본 발명의 조성물 내의 상기 miRNA의 함량은 질환의 증상, 증상의 진행 정도, 환자의 상태 등에 따라서 적절히 조절 가능하며, 예컨대, 전체 조성물 중량을 기준으로 0.00001 내지 99.9중량%, 또는 0.001 내지 50중량%일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 함량비는 용매를 제거한 건조량을 기준으로 한 값이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명에 따른 정제, 산제, 과립제, 캡슐제, 환제, 트로키제의 첨가제로 옥수수전분, 감자전분, 밀전분, 유당, 백당, 포도당, 과당, 디-만니톨, 침강탄산칼슘, 합성규산알루미늄, 인산일수소칼슘, 황산칼슘, 염화나트륨, 탄산수소나트륨, 정제 라놀린, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 알긴산나트륨, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 카올린, 요소, 콜로이드성실리카겔, 히드록시프로필스타치, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1928, HPMC 2208, HPMC 2906, HPMC 2910, 프로필렌글리콜, 카제인, 젖산칼슘, 프리모젤 등 부형제; 젤라틴, 아라비아고무, 에탄올, 한천가루, 초산프탈산셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 포도당, 정제수, 카제인나트륨, 글리세린, 스테아린산, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스나트륨, 메칠셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 덱스트린, 히드록시셀룰로오스, 히드록시프로필스타치, 히드록시메칠셀룰로오스, 정제쉘락, 전분호, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 폴리비닐알코올, 폴리비닐피롤리돈 등의 결합제가 사용될 수 있으며, 히드록시프로필메칠셀룰로오스, 옥수수전분, 한천가루, 메칠셀룰로오스, 벤토나이트, 히드록시프로필스타치, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 알긴산나트륨, 카르복시메칠셀룰로오스칼슘, 구연산칼슘, 라우릴황산나트륨, 무수규산, 1-히드록시프로필셀룰로오스, 덱스트란, 이온교환수지, 초산폴리비닐, 포름알데히드처리 카제인 및 젤라틴, 알긴산, 아밀로오스, 구아르고무(Guar gum), 중조, 폴리비닐피롤리돈, 인산칼슘, 겔화전분, 아라비아고무, 아밀로펙틴, 펙틴, 폴리인산나트륨, 에칠셀룰로오스, 백당, 규산마그네슘알루미늄, 디-소르비톨액, 경질무수규산 등 붕해제; 스테아린산칼슘, 스테아린산마그네슘, 스테아린산, 수소화식물유(Hydrogenated vegetable oil), 탈크, 석송자, 카올린, 바셀린, 스테아린산나트륨, 카카오지, 살리실산나트륨, 살리실산마그네슘, 폴리에칠렌글리콜(PEG) 4000, PEG 6000, 유동파라핀, 수소첨가대두유(Lubri wax), 스테아린산알루미늄, 스테아린산아연, 라우릴황산나트륨, 산화마그네슘, 마크로골(Macrogol), 합성규산알루미늄, 무수규산, 고급지방산, 고급알코올, 실리콘유, 파라핀유, 폴리에칠렌글리콜지방산에테르, 전분, 염화나트륨, 초산나트륨, 올레인산나트륨, dl-로이신, 경질무수규산 등의 활택제;가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 액제의 첨가제로는 물, 묽은 염산, 묽은 황산, 구연산나트륨, 모노스테아린산슈크로스류, 폴리옥시에칠렌소르비톨지방산에스텔류(트윈에스텔), 폴리옥시에칠렌모노알킬에텔류, 라놀린에텔류, 라놀린에스텔류, 초산, 염산, 암모니아수, 탄산암모늄, 수산화칼륨, 수산화나트륨, 프롤아민, 폴리비닐피롤리돈, 에칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 시럽제에는 백당의 용액, 다른 당류 혹은 감미제 등이 사용될 수 있으며, 필요에 따라 방향제, 착색제, 보존제, 안정제, 현탁화제, 유화제, 점조제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유제에는 정제수가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 유화제, 보존제, 안정제, 방향제 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 현탁제에는 아카시아, 트라가칸타, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스나트륨, 미결정셀룰로오스, 알긴산나트륨, 히드록시프로필메칠셀룰로오스(HPMC), HPMC 1828, HPMC 2906, HPMC 2910 등 현탁화제가 사용될 수 있으며, 필요에 따라 계면활성제, 보존제, 안정제, 착색제, 방향제가 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9%염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지(PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염(초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염(암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨(NaHSO₃) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨(Na₂S₂O₅), 아황산나트륨(Na₂SO₃), 질소가스(N₂), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 좌제에는 카카오지, 라놀린, 위텝솔, 폴리에틸렌글리콜, 글리세로젤라틴, 메칠셀룰로오스, 카르복시메칠셀룰로오스, 스테아린산과 올레인산의 혼합물, 수바날(Subanal), 면실유, 낙화생유, 야자유, 카카오버터+콜레스테롤, 레시틴, 라네트왁스, 모노스테아린산글리세롤, 트윈 또는 스판, 임하우젠(Imhausen), 모놀렌(모노스테아린산프로필렌글리콜), 글리세린, 아뎁스솔리두스(Adeps solidus), 부티룸 태고-G(Buytyrum Tego-G), 세베스파마 16 (Cebes Pharma 16), 헥사라이드베이스 95, 코토마(Cotomar), 히드록코테 SP, S-70-XXA, S-70-XX75(S-70-XX95), 히드록코테(Hydrokote) 25, 히드록코테 711, 이드로포스탈 (Idropostal), 마사에스트라리움(Massa estrarium, A, AS, B, C, D, E, I, T), 마사-MF, 마수폴, 마수폴-15, 네오수포스탈-엔, 파라마운드-B, 수포시로(OSI, OSIX, A, B, C, D, H, L), 좌제기제 IV 타입 (AB, B, A, BC, BBG, E, BGF, C, D, 299), 수포스탈 (N, Es), 웨코비 (W, R, S, M ,Fs), 테제스터 트리글리세라이드 기제(TG-95, MA, 57)와 같은 기제가 사용될 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다.

경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구 복용, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간(경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 흡입, 입 또는 코를 통한 분무, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.

본 발명에서 "개체"란 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 척추동물이라면 제한되지 아니하나, 구체적으로는 인간, 마우스, 래트, 기니어 피그, 토끼, 원숭이, 돼지, 말, 소, 양, 영양, 개, 고양이, 어류 및 파충류에 적용될 수 있다.

본 발명에서 “투여”란 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.

본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, “개선”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 감소시키는 모든 행위를 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화 유도된 췌장 베타세포를 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 혼합하는 단계를 포함하는, 당뇨병 또는 췌장암 치료용 세포치료제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 용어 "세포치료제 (cellular therapeutic agent)"란, 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품 (미국 FDA 규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.

본 발명의 세포치료제 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 비경구 투여, 예를 들어, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 조성물은 세포 치료에 일반적으로 사용되는 약제학적 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명에 따른 세포 치료제는 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 본 발명의 세포 치료제에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알지네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로오스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 또는 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 세포치료제는 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 조성물은 세포치료제가 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수도 있다.

본 발명의 세포치료제 조성물은 질환의 치료를 위하여 치료학적으로 유효한 양의 세포치료제를 포함할 수 있다. "치료학적으로 유효한 양 (therapeutically effective amount)"은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양을 의미하는 것으로, 이는 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양을 포함한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 세포치료제는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로 최적의 세포치료제 함량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 포함하는 것이 중요하다. 예컨대, 본 발명의 줄기세포의 1일 투여량은 1.0×10⁴ 내지 1.0×10¹¹ 세포/kg 체중, 바람직하게는 1.0×10⁵ 내지 1.0×10⁹ 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야하는 것으로 이해되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 치료방법에서 본 발명의 세포치료제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 직장, 정맥내(intravenous therapy, i.v), 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 경피, 국소, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다.

본 발명은 포유동물에게 치료학적으로 유효한 양의 본 발명의 상기 세포치료제 조성물을 투여하는 것을 포함하는 치료방법을 제공한다. 여기에서 사용된 용어 포유동물은 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 말하며, 바람직하게는 인간을 말한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 실험 준비 및 실험 방법

1-1. 세포배양

세포는 엑소좀이 고갈된 15 % 태아 소 혈청(FBS)(Gibco), 1 % 페니실린-스트렙토 마이신(Welgene) 및 55μM β 메르캅토 에탄올(β-ME)(Sigma)이 첨가된 DMEM(dulbecco's minimal essential medium, Welgene)에 넣고 5 % CO₂ 조건에서 37℃에서 배양되었다.

1-2. 마우스로부터의 외분비 세포 분리

외분비 조직은 [G.C. Chau, D.U. Im, T.M. Kang, J.M. Bae, W. Kim, S. Pyo, E.-Y. Moon, S.H.J.J.C.B. Um, mTOR controls ChREBP transcriptional activity and pancreatic β cell survival under diabetic stress, 216(7) (2017) 2091-2105.] 문헌을 참고하여, 8 주령 수컷 마우스 2 마리로부터 분리되었다. 먼저, 마우스 췌장에 HBSS (Hank’s Balanced Salt Solution, 웰진)에 용해된 여과된 0.8 mg/ml 콜라게네이즈 P (Roche)를 주사하였다. 췌장조직은 간헐적으로 흔들면서 37 ℃에서 15 분 동안 배양되었다. 소화된 현탁액을 여과하기 위해 400㎛ 메쉬 (Sigma)를 사용하였고, 바이오콜 (biocoll) 분리 용액 (Merck-Millipore) 상에서 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 모든 외분비 세포를 섬으로부터 분리하였다. 그리고나서, 세포를 20 ℃에서 20 분 동안 2000rpm에서 원심 분리하였다. 바이오콜 구배의 상부층은 선방 (acinar) 세포를 함유 한 반면, 펠렛은 섬 및 선방 세포를 제외한 췌관 (ductal) 세포를 포함한 다른 모든 세포를 함유한다. 선방 세포와 췌관 세포를 조심스럽게 수집하고 함께 혼합한 후 70μm 메쉬 (Falcon)를 통해 여과하였다. 이후, 세포를 1X HBSS로 3 회 세척하고 4 ℃에서 3 분 동안 1200rpm에서 원심분리하고 10 % FBS 및 1 % P/S (penicillin/streptomycin)가 보충된 RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 배지를 함유하는 10cm 조직 배양 접시 (TPP)에 접종하고 95%의 공기 및 5%의 CO₂ 하에서 배양하였다.

1-3. 형질감염

MEF(12 웰 플레이트 당 5×10⁴ 세포/웰)는 제조업체의 지침에 따라 jetMESSENGER(Polyplus-Transfection, Illkirch, France) 시약을 사용하여 형질감염하였다. 감염시키고자 하는 miRNA(200 nM)(QIAGEN, Hilden, Germany)를 mRNA 완충액에 희석하고 2 μL의 jetMESSENGER 시약을 첨가하였다. 혼합물은 실온에서 20분 동안 인큐베이션하고 MEF에 첨가한 다음, 24시간 후에 단계 특이적 배지를 첨가하였다.

266-6 세포(8×10⁴ 세포/웰)는 제조사의 프로토콜에 따라 RNAiMAX 시약(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)을 사용하여 형질감염하였다. 단계 특이적 배지에서 형질감염을 수행하였고, 형질감염된 세포를 원하는 시간 동안 인큐베이션하였다.

1-4. 면역염색

3 단계의 분화를 완료한 후, 분화된 β-유사 세포를 종래 문헌(Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 665)에 기재된 바와 같이 수확하고 면역염색하였다. 샘플은 형광 현미경(IX71S1F3, Olympus, Tokyo, Japan)을 사용하여 시각화하였다. 사용한 항체는 하기 표 1에 나타내었다.

1-5. 마이크로 RNA를 이용한 췌장 계통으로의 MEF 직접분화

도 1에 나타난 바와 같이, 마우스 배아 섬유아세포(mouse embryonic fibroblasts, MEF) 직접분화는 기존 프로토콜을 수정하여 수행하였다. 세포 직접분화를 위하여, 녹아웃 DMEM(KO-DMEM)(Gibco)을 기초배지로 사용하였다. 녹아웃 DMEM은 15% 녹아웃 혈청 대체물 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), 5% FBS (exosome depleted), 1% 글루타맥스 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), 1% 비필수 아미노산 (NEAA, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), 및 0.5 mM β-ME (Sigma Aldrich, Inc., Saint Louis, MO, USA)을 포함한다.

본 발명의 3단계 분화 프로토콜은 다음과 같다: 1단계, MEF에서 췌장 내배엽 세포로 분화; 2단계, 췌장 내배엽 세포에서 췌장 전구체 유사 세포로 분화; 3단계, 췌장 전구체 유사 세포에서 베타세포 유사 세포로 분화.

먼저, 5×10⁴ MEF 세포/웰을 10% FBS 및 1×P/S를 포함하는 DMEM의 12웰 조직 배양 플레이트에 1일 동안 분주하였다. 다음날, 1단계 분화 배지를 첨가하였다. 1단계 분화 배지는 1 μM Bix-01294 (MedchemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA), 280 μM 2-포스포-L-아스코르브산 (pVc, Sigma Aldrich, Inc., Saint Louis, MO, USA), 및 50 ng/mL 액티빈 A (R&D Systems, Minneapolis, MI, USA)를 포함한다. 배지 첨가 후 6일 동안 세포를 유지시켰다. 사용된 배지는 3일마다 교체되었다. 6일 뒤 2단계 분화 배지를 4일간 첨가하였다. 2단계 분화 배지는 저분자 물질로서 0.5 nM TTNPB (MedchemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA), 1 μM repsox (MedchemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA), 2 μM 사이클로파민 (Tocris, Bristol, UK), 및 280 μM pVc를 포함한다.

3단계 분화배지는 1 μM SB203580 (MedchemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA), 1× 인슐린-트랜스페린-셀레늄 (ITS, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), 10 mM 니코틴아마이드 (Sigma Aldrich, Inc., Saint Louis, MO, USA), 1 μg/mL 라미닌 (Sigma Aldrich, Inc., Saint Louis, MO, USA), 50 ng/mL 엑센딘-4 (MedchemExpress, Monmouth Junction, NJ, USA), 2 μM Bay K-8644 (Tocris, Bristol, UK), 1× B27 플러스 보충제(Gibco, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA), 및 pVc를 포함한다. 3단계 배지에서는 세포를 10일간 유지시켰다.

단계	단계 특징	배지 성분
1 단계	내배엽 세포로 분화	BIX01294(BIX), 포스포-L-아스코르브산(pVC), activin A 및 마이크로 RNA
2 단계	췌장 전구체 세포로 분화	TTNPB, repsox, 사이클로파민, 및 pVC, 마이크로 RNA
3 단계	베타세포 세포로 분화	SB203580, 니코틴 아미드, Extendin-A, Bay K-8644, 마이크로 RNA

마이크로 RNA

NAME	SEQUENCE	서열번호
miR-127-5p	CUGAAGCUCAGAGGGCUCUGAU	1
miR-709	GGAGGCAGAGGCAGGAGGA	2
miR-127 MI0000154 precursor	CCAGCCUGCUGAAGCUCAGAGGGCUCUGAUUCAGAAAGAUCAUCGGAUCCGUCUGAGCUUGGCUGGUCGG	3
miR-709 MI0004693 precursor	UGUCCCGUUUCUCUGCUUCUACUCAGAAGUGCUCUGAGCAUAGAACUGUCCUGUUUGAGCAGCACUGGGGAGGCAGAGGCAGGAGGAU	4
miR-19b	ugugcaaauccaugcaaaacuga	5

1-6. qRT-PCR을 이용한 유전자 발현 연구

제조사의 Trizol(Invitrogen) 방법을 이용하여 전체 세포 RNA를 추출하였다. 전체 RNA 1ug을 PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit(Takara Clontech)를 사용하여 cDNA 합성에 사용하였다. 췌장 계통 특이적 마커 분석은 Real Time PCR (Biorad)을 사용하여 iQ SYBR Green Supermix(Biorad)로 수행되었다. qRT-PCR 조건은 95 ℃에서 30 초, 60 ℃에서 15 초, 72 ℃에서 15 초의 40 주기였다. 이 연구에서 사용된 프라이머는 하기 표 4과 같다.

1-7. 통계적 분석

통계적 유의성은 양방향, 대응 스튜던트 t-검정에 의해 결정되었다. 표시된 데이터는 세 번의 독립적인 실험을 통해 수득하였으며, 평균 ± SEM로 나타내었다. p < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다. 통계 분석은 Prism v8.0(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 수행하였다.

실시예 2. 마이크로 RNA를 사용한 MEF의 β 유사 세포로의 전환

dox 유도성 MEF를 저분자화합물을 사용하는 세포와 같은 내배엽으로의 전환하고, 기능성 췌장 베타세포와 같은 세포 생성을 위한 연구는 직접분화 접근법을 위한 기초를 제공하였다. 이에, 본 발명자들은 마이크로 RNA가 전사변화 물질로 작용한다면, 후성유전 수정 인자(epigenetic modifier) BIX01294 및 pVC 등과 같은 저분자 물질의 존재 유무에 따라 1단계 배지에서 MEF 내 췌장(내분비) 특이적인 전사 변화를 유도할 것이라고 가정하였다.

도 1a에 나타난 바와 같이, 저분자 화합물 분화 프로토콜은 3 가지 단계를 포함한다 : 1단계, MEF에서 췌장 내배엽 세포(PEC)로; 2단계, PEC에서 췌장 선조 유사 세포(PPLC)로; 및 3단계, PPLC를 β-유사 세포(BLC)로 전환.

본 발명자들은 도 1a의 3단계 프로토콜에 마이크로 RNA를 첨가하는 최종 프로토콜을 확립하였다 (도 1b 참조).

한편, PDX1의 발현이 증가한 것은 마이크로 RNA 비처리 세포와 비교하여 췌장 특이적 프로그램이 시작되었음을 나타낸다. 췌장의 형성은 완성 내배엽의 췌장 내배엽으로의 분화로부터 시작된다. 췌장 내배엽 세포는 췌장-십이지장 호메오박스(homeobox) 유전자, PDX1을 발현한다. PDX1의 부재 하에서, 췌장은 복측 원기(ventral bud) 및 배측 원기(dorsal bud)의 형성 이상으로 발달하지 못한다. 따라서, PDX1 발현이 췌장 기관형성에서 중요한 단계를 특징짓는다. 성숙한 췌장은 다른 세포형 중에서도 외분비 조직 및 내분비 조직을 포함한다. 외분비 및 내분비 조직은 췌장 내배엽의 분화로부터 생성된다. 이에 본 발명자들은 췌장 베타세포 유사 세포로의 분화를 확인하기 위하여, Pdx1의 발현을 확인하였다.

도 1c에 나타난 바와 같이, 대조군 배지(기저 배지 사용)를 사용한 것과 비교하여 도 1a의 저분자 화합물 분화 프로토콜을 사용한 경우, MEF는 Pdx1 및 인슐린-2가 2.9배 및 2.6배로 발현 유도됨을 확인하였다.

따라서, 본 발명의 저분자 화합물 분화 프로토콜을 췌장 베타세포 직접분화에 사용하기에 적합함을 확인하였다.

실시예 3. 마이크로 RNA 단독의 pdx1 분화 효능 확인

기존 연구에서, 본 발명자들은 MIN6 유래 엑소좀에 miR-486, miR-127, miR-19b, miR-494 및 miR-709 등 다양한 miRNA가 풍부할 뿐만 아니라, 췌장 계통과 관련이 있음을 확인하였다. 그에 따라, 본 발명자들은 상기 miRNA가 췌장 베타세포 마커의 발현을 개별적으로, 또는 조합하여 사용한 경우에 향상시킬 수 있는지 여부를 조사하였다.

먼저, MEF를 miRNA 모방체로 형질감염시켜 자연적으로 발생하는 miRNA를 시뮬레이션하기 전에, 5' FAM(플루오레세인 아미다이트) 표지 대조군 miRNA 모방체를 사용하여 형질감염 실험을 최적화하였다. 대조군 miRNA 모방체(mimic)는 마우스, 쥐 또는 인간 miRNA와 상동성이 없는 것으로 사용하였다. 또한, 1단계 분화시 더 높은 수준의 Pdx1을 유도하는 miRNA를 선별하기 위하여, 개별적으로 형질감염을 수행하였다.

도 2a에 나타난 바와 같이, 다양한 miRNA 중에서도 miR-127 및 miR-709가 Pdx1의 발현 유도 효과가 가장 우수함을 확인하였다. 구체적으로, miR-127은 모방체의 3.9배, miR-709는 모방체의 3.2배, miR-19b는 1.6배를 유도하는 것으로 나타났다.

이하 실시예에서는 Pdx1 발현 유도 효과가 큰 상기 3가지 miRNA를 사용하여 실험을 진행하였다.

실시예 4. 마이크로 RNA 조합의 Pdx1 분화 효능 확인

실시예 3에서 Pdx1 발현 유도 효과가 큰 miR-127 및 miR-709를 농도별로 조합하여, 췌장 유전자 마커의 발현을 증가시키는지 확인하였다.

	miR-127	miR-709
조합-1	100nM	100nM
조합-2	133nM	66nM
조합-3	66nM	133nM

도 2b에 나타난 바와 같이, miR-127+miR-709 조합-3의 형질감염 후 1단계에서 가장 높은 Pdx1의 전사 수준이 관찰되었다.

또한, 도 2c에 나타난 바와 같이, Ngn3의 발현 수준 또한 유의하게 상승조절되는 것을 확인할 수 있었다. Ngn3의 조기 활성화는 췌장 전구 세포의 풀(pool)을 고갈시키면서 글루카곤 양성 세포를 배타적으로 유도하는 것으로 알려져 있다.

또한, 도 2d에 나타난 바와 같이, miR-127+miR-709 조합-3의 형질감염 후 2단계에서도 높은 수준의 Pdx1, Ngn3, Nkx6.1, 및 NeuroD1이 관찰되었다. 특히, Pdx1 및 Ngn3는 모방체 처리군과 비교하여 각각 4.8배 및 4.1배 증가하였다.

또한, 도 2e에 나타난 바와 같이, miR-127+miR-709 조합-3의 형질감염 후 3단계 세포에서 모방체 처리군과 비교하여 Pdx1(5.4배), Ngn3(2.8배), Nkx6.1(6.2배), 인슐린-1(2.7배), 및 인슐린-2(4.3배)를 포함하는 췌장 특이성 유전자 마커의 발현이 모두 유의하게 상향조절된 것을 확인하였다.

즉, miR-127 및 miR-709의 단계적 처리가 저분자 화합물의 존재 하에서 MEF의 분화를 유도하고, 분화 효율을 향상시킴에 따라, MEF를 베타 유사 세포로 분화시킬 수 있음을 나타내는 결과이다.

또한, miR-127 및 miR-709에 더하여, miR-19b를 병용 처리하는 경우, 췌장 유전자 마커의 발현을 증가시키는지 확인하였다.

	miR-127	miR-709	miR-19b
조합-1	66nM	66nM	66nM
조합-2	160nM	20nM	20nM
조합-3	20nM	160nM	20nM
조합-4	20nM	20nM	160nM

먼저, 도 3a에 나타난 바와 같이, 용량 의존적 형질감염을 수행한 결과, miRNA는 200nM의 용량을 처리한 경우, 낮은 세포독성으로 약 80%의 형질감염 효율을 제공함을 확인하였다.

또한, 도 3b에 나타난 바와 같이, miR-127+miR-709+miR-19b 조합-1의 형질감염 후 1단계에서 가장 높은 Pdx1의 전사 수준이 관찰되었다.

또한, 도 3c에 나타난 바와 같이, miR-127+miR-709+miR-19b의 각기 다른 조합이 세포 증식을 증가시키며, 특히 miR-19b 단독으로 형질감염한 경우와 조합-3에서 세포 증식이 가장 증가됨을 확인하였다.

실시예 5. 마이크로 RNA 조합의 외분비 세포의 췌장 베타세포 유사 세포 분화 효과 확인

본 발명자들은 상기 실시예 3 및 4를 통해 본 발명의 마이크로 RNA 조합을 사용하여 섬유아세포를 췌장 베타세포 유사 세포로 분화시킬 수 있음을 확인하였다.

이에 더하여, 췌장의 외분비 및 내분비 세포가 공통 발달 경로를 공유함에 따라, 외분비세포를 이용하여 췌장 베타세포 유사 세포로 분화시킬 수 있는지 여부를 조사하였다.

먼저, 마우스 선방 세포주 266-6 세포에 대하여 miR-127+miR-709 조합-3을 사용하여 시험하였다. 먼저, 분리한 외분비 세포를 3단계 배지에서 6웰 플레이트 (BD Bioscience의 마트리겔의 1:10 희석으로 코팅됨)에 분주하였다. 3단계 배지에서 1일 후, 50 ㎍/ml 마이크로 RNA을 하나의 웰에 첨가하고 다른 웰은 마이크로 RNA을 첨가하지 않았다. 세포를 2일 동안 3단계 배지에서 마이크로 RNA와 배양한 뒤, 마이크로 RNA가 없는 신선한 배지를 각 웰에 첨가하였다. 7일 후, Qiagen RNeasy 키트를 사용하여 RNA 분리를 위한 세포를 수확하고, qRT-PCR을 이용하여 유전자 프로파일링을 수행하였다.

도 4a에 나타난 바와 같이, 266-6 세포는 5'FAM 표지 모방체 대조군으로 70-80% 형질감염 효율을 나타내었다.

또한, 형질감염된 266-6 세포를 3단계 배지에서 배양 및 성장시킴에 따라, 췌장 베타세포 마커의 발현을 확인하였다.

도 4b에 나타난 바와 같이, 외분비세포에 본 발명의 마이크로 RNA 조합을 처리한 경우에도 베타세포 마커 유전자가 증가되는 것을 확인하였다. Pdx1의 수준은 비처리 세포와 비교하여 1.5 배 이상 증가하였다. Ngn3 발현 또한, 마이크로 RNA 처리된 세포에서 1.6 배만큼 상향 조절되었다. 인슐린-1과 인슐린-2의 수치 또한 각각 1.8 배와 1.9 배 증가한 것으로 나타났다. 그러나, 엘라스타제 (선방 세포 마커)의 발현은 마이크로 RNA 처리시 오히려 감소된 것으로 나타났다.

즉, miR-127 및 miR-709를 병용함으로써 섬유아세포 및 외분비 세포와 같은 체세포를 췌장 베타세포로 직접분화시킬 수 있는 것이다.

실시예 6. 마이크로 RNA와 저분자 조합에 따른 사람의 췌관세포의 베타세포 유사 세포 분화 효과 확인

본 발명자들은 miR-127과 저분자물질의 조합을 통해 사람의 췌관세포인 Capan-1를 췌장 베타세포 유사 세포로 분화시킬 수 있음을 확인하였는 바, 이에 더하여 3단계에서 사용된 저분자 물질의 유무에 따른 췌장 베타세포 마커의 발현을 확인하였다.

도 5에 나타난 바와 같이, Nicotinamide가 결핍된 조합 C에서 Pax-6 및 MafA의 발현이 현저히 감소된 것을 확인하였다.

이는 본 발명의 3단계 배지 조성에 Nicotinamide가 필수적임을 나타내는 결과이다.

종합하면, 본 발명자들은 마이크로RNA 단독; 또는 마이크로RNA와 저분자 물질을 병용 사용한 경우, 췌장 베타세포로의 직접분화가 잘 이루어짐을 명확히 확인하였는 바, 본 발명의 마이크로RNA을 유효성분으로 포함하는, 체세포의 췌장 베타세포로의 직접분화 유도용 조성물을 제공하며, 생산된 췌장 베타세포를 당뇨병 또는 췌장암 등 췌장 관련 질환의 예방, 치료 및 개선을 위해 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다. 또한 이러한 직접분화 유도용 조성물을 신체에 직접 주입하여 신체 내에서 체세포의 베타세포유도를 통해 당뇨병 또는 췌장암 등 췌장 관련 질환의 예방, 치료 및 개선을 위해 유용하게 이용할 수 있을 것이다 기대된다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

<110> Research & Business Foundation SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY <120> Process and compositions for the direct differentiation of somatic cell into pancreatic beta cells using microRNA <130> MP20-181P1 <150> KR 10-2020-0123558 <151> 2020-09-24 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-127-5p <400> 1 cugaagcuca gagggcucug au 22 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-709 <400> 2 ggaggcagag gcaggagga 19 <210> 3 <211> 70 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-127 MI0000154 precursor <400> 3 ccagccugcu gaagcucaga gggcucugau ucagaaagau caucggaucc gucugagcuu 60 ggcuggucgg 70 <210> 4 <211> 88 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-709 MI0004693 precursor <400> 4 ugucccguuu cucugcuucu acucagaagu gcucugagca uagaacuguc cuguuugagc 60 agcacugggg aggcagaggc aggaggau 88 <210> 5 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-19b <400> 5 ugugcaaauc caugcaaaac uga 23

Claims (21)

1. miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마이크로RNA를 포함하는 체세포의 췌장 베타세포로의 직접분화 유도용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 체세포는 섬유아세포 (fibroblast), 췌관세포 및 외분비 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 직접분화 유도용 조성물.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 miR-19b를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 직접분화 유도용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 히스톤 메틸전달효소 저해제 (histone methyltransferase inhibitor), 레티노산 아고니스트(retinoic acid agonist); ALK-5 키나아제 억제제(ALK-5 kinase inhibitor); 헷지호그 억제제(hedgehog inhibitor); MAPK 억제제(MAPK inhibitor); 칼슘 채널 아고니스트; GLP 수용체 아고니스트; 및 보충제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 저분자 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 직접분화 유도용 조성물.
   
5. 제4항에 있어서,
   상기 히스톤 메틸전달효소 저해제는 BIX01294 (2-(Hexahydro-4-methyl-1H-1,4-diazepin-1-yl)-6,7-dimethoxy-N-[1-(phenylmethyl)-4-piperidinyl]-4-quinazolinamine), 5-AZA-2'-데옥시사이티딘 (5-aza-2'-deoxycytidine:DAC), 제불라린 (Zebularine), 3'-데아자네플라노신 A 하이드로클로리드 (3'-Deazaneplanocin A hydrochloride), 로메구아트리브 (Lomeguatrib), 카에토신 (Chaetocin, 2,2',3S,3'S,5aR,5'aR,6,6'-octahydro-3,3'-bis(hydroxymethyl)-2,2'-dimethyl-[10bR,10'bR(11aS,11'aS)-bi-3,11a-epidithio-11aH-pyrazino[1',2':1,5]pyrrolo[2,3-b]indole]-1,1',4,4'-tetrone), 및 데시타빈 (Decitabine, 5-aza-2'-deoxycytidine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 직접분화 유도용 조성물.
   
6. 제4항에 있어서,
   상기 보충제는 2-포스포-L-아스코르브산, B27, 라미닌, 니코틴아마이드, 및 N2로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 직접분화 유도용 조성물.
   
7. 제4항에 있어서,
   상기 레티노산 아고니스트는 TTNPB, 피탄산, 및 레티노산으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 직접분화 유도용 조성물.
   
8. 제4항에 있어서,
   상기 헷지호그 억제제는 사이클로파민(cyclopamine), 미페프리스톤(mifepristone), GDC-0449(Vismodegib), XL139(BMS-833923), IPI926, IPI609(IPI269609), LDE225, 제르빈, GANT61, 퍼모파민, SAG, SANT-2, 토마티딘, SANT74, SANT75, 제룸본 및 그의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 직접분화 유도용 조성물.
   
9. 제4항에 있어서,
   상기 MAPK 억제제는 1-Pyridinyl-2-phenylazole, SB 203580, SKF 86002, SKF 86096, SKF 104351, 1-Aryl-2-pyridinyl/pyrimidinyl heterocycles, SB 242235, RO-32001195, SX-011, 및 BIRB-796로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 직접분화 유도용 조성물.
   
10. 제4항에 있어서,
    상기 ALK-5 키나아제 억제제는 RepSox (1,5-Naphthyridine, 2-[3-(6-methyl-2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB525334 (6-(2-tert-butyl-4-(6-methylpyridin-2-yl)-1H-imidazol-5-yl)quinoxaline); GW788388 (4-(4-(3)-(pyridin-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)pyridin-2-yl)-N-(tetrahydro-2H-pyran-4-yl)benzamide); SD-208 (2-(5-chloro-2-fluorophenyl)-N-(pyridin-4-yl)pteridin-4-amine); Galunisertib (LY2157299, 4-(2-(6-methylpyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline-6-carboxamide); EW-7197 (N-(2-fluorophenyl)-5-(6-methyl-2-pyridinyl)-4-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-6-yl-1H-imidazole-2-methanamine); LY2109761 (7-(2-morpholinoethoxy)-4-(2-(pyridin-2-yl)-5,6-dihydro-4H-pyrrolo[1,2-b]pyrazol-3-yl)quinoline); SB505124 (2-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-2-tert-butyl-1H-imidazol-5-yl)-6-methylpyridine); LY364947 (Quinoline, 4-[3-(2-pyridinyl)-1H-pyrazol-4-yl]); SB431542 (4-(4-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-5-(pyridin-2-yl)-1H-imidazol-2-yl)benzamide); K02288 (3)-[(6-Amino-5-(3),4,5-trimethoxyphenyl)-3-pyridinyl]phenol]; 및 LDN-212854 (Quinoline, 5-[6-[4-(1-piperazinyl)phenyl]pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl])로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 직접분화 유도용 조성물.
    
11. 제4항에 있어서,
    상기 칼슘 채널 아고니스트는 Bay K-8644, FPL 64179, 및 CGP28392로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 직접분화 유도용 조성물.
    
12. 제4항에 있어서,
    상기 GLP 수용체 아고니스트는 엑센딘-4, 둘라글루티드(Dulaglutide), 엑세나티드(Exenatide), 세마글루티드(Semaglutide), 리라글루티드(Liraglutide), 릭시세나타이드(Lixisenatide), 및 알비글루티드(Albiglutide)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 직접분화 유도용 조성물.
    
13. MAPK 억제제(MAPK inhibitor), 칼슘 채널 아고니스트, GLP 수용체 아고니스트, 보충제; 및 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA;를 포함하는 조성물의 존재 하에 체세포를 배양하는 단계;를 포함하는 체세포로부터 췌장 베타세포로의 직접분화 방법.
    
14. 제13항에 있어서,
    상기 체세포는 섬유아세포 (fibroblast), 췌관세포, 및 외분비 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 직접분화 방법.
    
15. 제13항에 있어서,
    상기 직접분화 방법은 하기 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 직접분화 방법:
    (1) 히스톤 메틸전달효소 저해제(Histone methyltransferase inhibitor); activin A, 보충제; 및 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA;를 포함하는 조성물의 존재 하에 체세포를 췌장 내배엽 세포(pancreatic endoderm cell)로 유도하는 단계;
    (2) 레티노산 아고니스트, ALK-5 키나아제 억제제 (ALK-5 kinase inhibitor), 헷지호그 억제제, 보충제; 및 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA;를 포함하는 조성물의 존재 하에 췌장 내배엽 세포를 췌장 전구 세포(pancreatic progenitor cell)로 유도하는 단계; 및
    (3) MAPK 억제제(MAPK inhibitor), 칼슘 채널 아고니스트, GLP 수용체 아고니스트, 보충제; 및 miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA;를 포함하는 조성물의 존재 하에 체세포를 배양하는 단계.
    
16. miR-127 및 miR-709로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 miRNA를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 췌장암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    
17. 제16항에 있어서,
    상기 당뇨병은 제1형 당뇨병, 제2형 당뇨병 및 임신성 당뇨병으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    
18. 제16항에 있어서,
    상기 조성물은 miR-19b를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    
19. 제16항에 있어서,
    상기 조성물은 히스톤 메틸전달효소 저해제 (histone methyltransferase inhibitor), 레티노산 아고니스트(retinoic acid agonist); ALK-5 키나아제 억제제(ALK-5 kinase inhibitor); 헷지호그 억제제(hedgehog inhibitor); MAPK 억제제(MAPK inhibitor); 칼슘 채널 아고니스트; GLP 수용체 아고니스트; 및 보충제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 저분자 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
    
20. 제13항의 방법에 의해 직접분화 유도된 췌장 베타세포를 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 혼합하는 단계를 포함하는, 당뇨병 또는 췌장암 치료용 세포치료제를 제조하는 방법.
    
21. 제13항의 방법에 의해 직접분화 유도된 췌장 베타세포를 유효성분으로 포함하는 당뇨병 또는 췌장암 치료용 세포 치료제.
    

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