KR20220116450A - 지속가능한 입양 세포 전달-기반 항종양 면역을 가능하게 하는 과다활성 수지상 세포 - Google Patents

지속가능한 입양 세포 전달-기반 항종양 면역을 가능하게 하는 과다활성 수지상 세포 Download PDF

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KR20220116450A
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조나단 씨. 케이건
데이니아 지바키
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칠드런'즈 메디컬 센터 코포레이션
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Abstract

본 출원은 암 면역요법, 예를 들어 T 세포 자극 매개 항종양 요법에 관한 것이다.

Description

지속가능한 입양 세포 전달-기반 항종양 면역을 가능하게 하는 과다활성 수지상 세포
우선권 주장
본 출원은 2019년 11월 18일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/937,075의 이익을 주장한다. 전술한 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
연방 지원 연구 또는 개발
본 발명은 국립 보건원에서 수여한 보조금 번호 AI116550 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.
기술 분야
본 출원은 암 면역요법, 예를 들어 T 세포 자극 매개 항종양 요법에 관한 것이다.
감염 및 암에 대한 보호 면역에 대한 이해의 중심은 신체 조직을 순찰하는 이동성 식세포인 수지상 세포 (DC)이다 (D. Alvarez, E. H. et al., Immunity, vol. 29, no. 3, pp. 325-42, Sep. 2008). DC는 숙주에 대한 위협 환경, 가장 일반적으로 감염 또는 조직 손상의 증거를 조사한다. 이러한 감시는 조직 손상을 나타내는 미생물 생성물 또는 숙주-코딩된 분자를 인식하는 위협 평가 수용체 (고전적으로 패턴 인식 수용체 (PRR)로 공지됨)의 슈퍼패밀리의 작용을 통해 달성된다 (S. W. Brubaker, et al. Annu. Rev. Immunol., vol. 33, pp. 257-90, 2015; C. A. Janeway and R. Medzhitov, Annu. Rev. Immunol., vol. 20, pp. 197-216, Jan. 2002). PRR에 대한 미생물 리간드는 병원체 연관 분자 패턴 (PAMP)으로 분류된 반면, 숙주-유래 PRR 리간드는 손상 연관 분자 패턴 (DAMP)이다 (P. Matzinger, Science, vol. 296, no. 5566, pp. 301-5, Apr. 2002).
PAMP의 검출시, PRR은 이들 수용체를 발현하는 DC의 생리학을 근본적으로 변경하는 신호전달 경로를 촉발한다 (A. Iwasaki and R. Medzhitov, Nat. Immunol., vol. 16, no. 4, pp. 343-53, Apr. 2015; O. Joffre, et al. Immunol. Rev., vol. 227, no. 1, pp. 234-247, Jan. 2009). 예를 들어, PRR 활성화 전에, DC는 전형적으로 비염증성 세포로 간주된다. 세포외 PAMP를 접하면, PRR은 시토카인, 케모카인 및 인터페론을 포함하는 수많은 염증성 매개체의 급속하고 강력한 상향조절을 자극한다. 이들 유전자의 발현과 동시에 DC가 배수 림프절 (dLN)로 이동하고 T 세포 활성화에 중요한 인자, 예컨대 MHC 및 공동-자극 분자의 상향조절이 발생한다. 그러므로, PRR 신호전달의 프로세스는 비자극성 (나이브) 상태에서 "활성화된" 상태로의 DC 활성의 이동을 유발한다 (K. Inaba, et al. J. Exp. Med., vol. 191, no. 6, pp. 927-36, Mar. 2000 I. Mellman and R. M. Steinman, Cell, vol. 106, no. 3, pp. 255-8, Aug. 2001).
암 면역요법에 대한 현재 접근법을 다양화할 필요가 있다. 따라서, 본 출원은 치료적 수지상 세포 집단을 생성하는 방법, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법, 암을 치료하는 방법, TH2 면역의 부재 하에 T 헬퍼 유형 I (TH1) 및 세포독성 T 림프구 (CTL) 반응을 유도하는 수지상 세포 (DC)를 과다활성화시키는 방법에 관한 것이다. 과다활성화 자극제는 PD-1 억제에 대해 민감성이거나 저항성인 종양에 대해 보호하는 T 세포 반응을 구동한다. 이들 보호 반응은 DC의 인플라마좀에 의존하며, 종양 용해물을 면역원으로 사용하여 생성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 대상체에서 면역원에 대한 보호 면역 반응을 유도하는 방법은 수지상 세포를 수득하는 단계, 수지상 세포를 유효량의 비-정규 인플라마좀-활성화 지질과 함께 생체외에서 배양하는 단계, 및 보호 면역 반응을 증진시키는 유효량으로 생 수지상 세포를 대상체에게 투여하여, 이에 의해 보호 면역 반응을 유도하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량의 비-정규 인플라마좀-활성화 지질은 수지상 세포를 과다활성화시킨다.
특정 실시양태에서, 수지상 세포는 임의로 생체외에서 면역원과 함께 배양된다. 특정 실시양태에서, 수지상 세포는 임의로 생체외에서 시토카인과 함께 배양된다.
특정 실시양태에서, 비-정규 인플라마좀-활성화 지질은 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (PAPC), 산화된 1-팔미토일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC), oxPAPC의 종, 이들의 성분 또는 이들의 조합을 포함한다.
특정 실시양태에서, 방법은 화학요법제를 투여하는 것을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 치료 접근법은 또한 하기 요법 중 임의의 것과 조합될 수 있다: 방사선, 화학요법, 수술, 치료 항체, 면역조정제, 프로테아좀 억제제, 범-데아세틸라제 (DAC) 억제제, 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제, 체크포인트 억제제, 입양 세포 요법은 CAR T 및 NK 세포 요법 및 백신을 포함한다.
바람직하게는, 본원에 기재된 방법은 암, 예를 들어 종양의 성장 또는 진행, 또는 대상체에서 바이러스 감염을 억제한다. 예를 들어, 본원에 기재된 방법은 종양의 성장을 적어도 1%, 예를 들어 적어도 2%, 적어도 3%, 적어도 4%, 적어도 5%, 적어도 6%, 적어도 7%, 적어도 8%, 적어도 9%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 100%만큼 억제한다. 다른 경우에, 본원에 기재된 방법은 종양의 크기를 직경 적어도 1 mm, 예를 들어 직경 적어도 2 mm, 직경 적어도 3 mm, 직경 적어도 4 mm, 직경 적어도 5 mm, 직경 적어도 6 mm, 직경 적어도 7 mm, 직경 적어도 8 mm, 직경 적어도 9 mm, 직경 적어도 10 mm, 직경 적어도 11 mm, 직경 적어도 12 mm, 직경 적어도 13 mm, 직경 적어도 14 mm, 직경 적어도 15 mm, 직경 적어도 20 mm, 직경 적어도 25 mm, 직경 적어도 30 mm, 직경 적어도 40 mm, 직경 적어도 50 mm만큼 또는 그 이상 감소시킨다. 일부 경우에, 대상체는 종양의 대부분이 절제되었다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 발명에서 사용하기 위한 방법 및 재료는 본원에 기재되어 있으며; 관련 기술분야에 공지된 다른 적합한 방법 및 재료가 또한 사용될 수 있다. 재료, 방법 및 예는 예시일 뿐이며 제한하려는 것이 아니다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 서열, 데이터베이스 엔트리 및 기타 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 충돌하는 경우, 정의를 포함한 본 명세서가 우선할 것이다.
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도 1a-1h는 과다활성 DC가 우수한 항원-제시 세포이고 TH2 면역의 증거 없이 TH1-편향 면역 반응을 구동한다는 것을 입증하는 일련의 그래프이다. 도 1a-1f: WT BMDC를 미처리 상태로 두거나 (없음), LPS 단독, 또는 알룸 단독, 또는 oxPAPC 또는 PGPC 단독으로 24시간 동안 처리하거나, 또는 BMDC를 LPS로 3시간 동안 프라이밍한 후, 표시된 자극제로 21시간 동안 처리하였다. 도 1a: IL-1β 및 TNFα 시토카인 방출을 ELISA에 의해 모니터링하였다. 도 1b: 세포 사멸 백분율을 세포 상청액에서 LDH 방출에 의해 측정하였다. 도 1c: 도 1a에서와 같이 표시된 자극제로 처리된 BMDC를 라이브-데드 바이올렛 키트, CD11c 및 CD40으로 염색하였다. 표면 CD40 (CD11c+ 생 세포 중)의 평균 형광 강도 (MFI)를 유동 세포계측법에 의해 측정한다. 도 1d: 표시된 자극제로 전처리된 BMDC를 CD40-코팅 플레이트로 옮기고 24시간 동안 배양하였다. IL-12p70 시토카인 방출을 ELISA에 의해 측정하였다. 도 1e: 도 1a에서와 같이 표시된 자극제로 전처리된 BMDC를 OVA 단백질과 함께 2시간 동안 또는 FITC 표지된-OVA와 함께 45분 동안 인큐베이션하였다. OVA-FITC 흡수 (왼쪽 패널)를 유동 세포계측법에 의해 평가하였다. 데이터는 37℃에서 OVA-연관 CD11c+ BMDC의 백분율로 표시되고, 4℃에서 OVA-연관 CD11c+ BMDC로 정규화된다. MHC-I 상의 OVA 펩티드 제시 (오른쪽 패널)를 OVA 펩티드 SIINFEKL (서열식별번호: 1)에 결합된 H-2Kb에 대한 PE-접합 항체를 사용하여 모니터링하였다. 데이터는 CD11c+ 생 세포 중 SIINFEKL (서열식별번호: 1)-연관 DC의 빈도로 표시된다. 3개 복제로부터의 평균 및 SD가 표시되고, 데이터는 적어도 3개의 독립적인 실험을 대표한다. 도 1f: 도 1a에서와 같이 표시된 자극제로 처리된 BMDC를 OVA 단백질 또는 OVA 펩티드 SIINFEKL로 1시간 동안 로딩한 후 (또는 로딩하지 않음), 비장 OT-II 나이브 CD4+ T 세포 또는 OT-I 나이브 CD8+ T 세포와 함께 4일 동안 인큐베이션하였다. 도 1f: 상청액을 4일차에 수집하고 IFNγ, IL-2, IL-10, TNFα 및 IL-13 시토카인 방출을 ELISA에 의해 측정하였다. 도 1g: BMDC를 미처리 상태로 두거나 (없음), LPS로 24시간 동안 처리하거나, 또는 BMDC를 LPS로 3시간 동안 프라이밍한 후, PGPC 또는 알룸으로 21시간 동안 처리하였다. 그 후, 처리된 BMDC를 도 1f에서와 같이 비장 OT-I 또는 OT-II T 세포와 함께 배양하였다. 공동-배양 후 4일에, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 브레펠딘-A 및 모넨신의 존재 하에 PMA + 이오노마이신으로 5시간 동안 자극하였다. CD4+ T 세포 중 TNFα+ IFNγ+로서의 TH1 세포, 및 Gata3+ IL-4+ IL-10+로서의 TH2 세포의 빈도를 세포내 염색에 의해 측정하였다. 데이터는 TH1/TH2 세포의 비율로 표시된다 (왼쪽 패널). CD8+ T 세포 중 IFNγ+의 빈도는 오른쪽 패널에 표시된다. 3개 복제로부터의 평균 및 SD가 표시되고, 각 패널은 적어도 2개의 독립적인 실험을 대표한다. 도 1h: C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 엔도핏-OVA 단백질 단독 또는 LPS (표시된 바와 같이 불완전 프로인트 아주반트 (IFA) 또는 알룸에 유화됨)를 피하로 주사하였다. 대안적으로, 마우스에 엔도핏-OVA 단백질 및 LPS + OxPAPC 또는 PGPC (IFA에 모두 유화됨)를 주사하였다. 면역화 후 40일에, CD4+ 및 CD8+ T 세포를 피부 배수 림프절 (dLN)로부터 단리하였다. 그 후, T 세포를 OVA 또는 SIINFEKL 펩티드로 로딩된 (또는 로딩하지 않은) 나이브 BMDC와 함께 5일 동안 배양하였다. IFNγ, IL-10 및 IL-13 분비를 ELISA에 의해 측정하였다. 4마리의 마우스의 평균 및 SD가 표시되고, 각 패널은 2개의 독립적인 실험을 대표한다. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P< 0.005.
도 2: C57BL/6 WT 마우스를 5x105개 생 B16OVA 세포로 왼쪽 상부 등에 s.c. 접종하였다. 종양 시험감염 후 7, 14 및 21일에, 마우스의 오른쪽 옆구리에 5x106개 미처리된 WT BMDC (DC 나이브), 또는 23시간 동안 LPS로 처리된 후 1시간 동안 B16OVA WTL로 펄스화된 활성 WT BMDC (DCLPS), 또는 3시간 동안 LPS로 프라이밍되고, 20시간 동안 PGPC로 처리된 후 1시간 동안 B16OVA WTL로 펄스화된 WT, 또는 NLRP3-/-, 또는 casp1/11-/- BMDC (DCLPS+PGPC)로 s.c. 주사하였다. 생존을 매일 모니터링하였다 (n=그룹당 5마리의 마우스).
도 3a-3e는 과다활성 DC가 우수한 항원-제시 세포이고 TH2 면역의 증거 없이 TH1-편향 면역 반응을 구동한다는 것을 입증하는 일련의 그래프이다. 도 3a, 3b: GMCSF로 생성된 BMDC를 미처리 상태로 두거나 (없음), MPLA 단독, 알룸 단독, 또는 OxPAPC 또는 PGPC 단독으로 처리하거나, BMDC를 MPLA로 3시간 동안 프라이밍한 후, 표시된 자극제로 21시간 동안 처리하였다. 도 5a: IL-1β 및 TNFα 시토카인 방출을 ELISA에 의해 모니터링하였다. 도 3b: 세포 사멸 백분율을 세포 상청액에서 LDH 방출에 의해 측정하였다. 도 3c, 3d: 비장 CD11c+를 분류하고, 미처리 상태로 두거나 (없음), LPS 단독, 또는 알룸 단독, 또는 PGPC 단독으로 처리하거나, DC를 LPS로 3시간 동안 프라이밍한 후, 표시된 자극제로 21시간 동안 처리하였다. 도 3c: IL-1β 및 TNFα 시토카인 방출을 ELISA에 의해 모니터링하였다. 도 3d: 세포 사멸 백분율을 세포 상청액에서 LDH 방출에 의해 측정하였다. 도 3e-3f: a에서와 같이 표시된 자극제로 처리된 GMCSF로 생성된 BMDC를 라이브-데드 바이올렛 키트, 항-CD11c, 항-CD80, 항 CD69, 및 항-H2kb 항체로 염색하였다. 도 3e: CD11c+ 생 세포 중 표면 CD80 (왼쪽 패널) 및 CD69 (중간 패널) 및 H2Kb (오른쪽 패널)의 평균 형광 강도 (MFI)를 유동 세포계측법에 의해 측정하였다. 3개 복제의 평균 및 SD가 표시되고, 모든 패널은 적어도 3개의 독립적인 실험을 대표한다. *P < 0.05.
도 4a-4c는 과다활성 DC가 우수한 항원-제시 세포이고 TH2 면역의 증거 없이 TH1-편향 면역 반응을 구동한다는 것을 입증하는 그래프 및 일련의 플롯이다. 도 4a-4c: WT BMDC를 미처리 상태로 두거나 (없음), LPS 단독, 또는 알룸 단독, 또는 OxPAPC 또는 PGPC 단독으로 24시간 동안 처리하거나, BMDC를 LPS로 3시간 동안 프라이밍한 후, 표시된 자극제로 21시간 동안 처리하였다. 도 4a: BMDC를 37℃에서 또는 4℃에서 45분 동안 고정가능한 FITC 표지된-OVA와 함께 인큐베이션하였다. 그 후, BMDC를 라이브-데드 바이올렛 키트로 염색하였다. 유동 세포계측법에 의해 4℃에서 OVA-연관 BMDC와 비교하여 37℃에서 OVA-FITC 연관 BMDC의 빈도를 결정하기 위한 게이팅 전략. 도 4b: BMDC를 엔도핏-OVA 단백질과 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. OVA 펩티드 SIINFEKL에 결합된 H-2Kb에 대한 PE-접합 항체를 사용하여 유동 세포계측법에 의해 측정된 바와 같이 생 BMDC의 표면 상의 H2kb에 결합된 SIINFEKL (서열식별번호: 1) 펩티드의 빈도를 결정하기 위한 게이팅 전략. 각 패널은 3개의 실험 중 하나의 3개 복제를 대표한다. 도 4c: C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 엔도핏-OVA 단백질 단독 또는 LPS (표시된 바와 같이 불완전 프로인트 아주반트 (IFA) 또는 알룸에 유화됨)를 피하로 주사하였다. 대안적으로, 마우스에 엔도핏-OVA 단백질 및 LPS + OxPAPC 또는 PGPC (IFA에 모두 유화됨)를 주사하였다. 면역화 후 40일에, CD4+ T 세포를 피부 배수 림프절 (dLN)로부터 단리하였다. 그 후, T 세포를 OVA로 로딩된 (또는 로딩하지 않은) 나이브 BMDC와 함께 5일 동안 배양하였다. IL-4 분비를 ELISA에 의해 측정하였다. 4마리의 마우스의 평균 및 SD가 표시되고, 각 패널은 2개의 독립적인 실험을 대표한다. ***P < 0.005.
도 5는 과다활성 DC가 우수한 항원-제시 세포이고 TH2 면역의 증거 없이 TH1-편향 면역 반응을 구동한다는 것을 입증하는 일련의 플롯이다. BMDC를 미처리 상태로 두거나 (없음), LPS로 24시간 동안 처리하거나, 또는 BMDC를 LPS로 3시간 동안 프라이밍한 후, PGPC 또는 알룸으로 21시간 동안 처리하였다. 그 후 처리된 BMDC를 비장 OT-II T 세포와 함께 1:5 (BMDC: T 세포)의 비율로 배양하였다. 공동-배양 후 4일에, CD4+ T 세포를 브레펠딘-A 및 모넨신의 존재 하에 PMA + 이오노마이신으로 5시간 동안 자극하였다. 세포내 염색에 의해 측정된 바와 같이 생 CD4+ T 세포 중 IL-4+ IL-10+로서의 TH2 세포의 빈도를 결정하기 위한 게이팅 전략. 각 패널은 3개의 실험 중 하나의 3개 복제를 대표한다.
도 6a-6d는 cDC1 및 cDC2 세포가 시험관내에서 과다활성화 상태를 달성함을 입증하는 일련의 그래프 및 면역염색이다. (도 6a-6b) 비장 DC (왼쪽 패널) 또는 FLT3 생성 DC (오른쪽 패널)를 cDC1 (CD11c+CD24+) 또는 cDC2 (CD11c+Sirpa+)로서 분류하였다. DC를 미처리 상태로 두거나 (없음), LPS 단독, 또는 알룸 단독, 또는 OxPAPC 또는 PGPC 단독으로 24시간 동안 처리하거나, DC를 LPS로 3시간 동안 프라이밍한 후, 표시된 자극제로 21시간 동안 처리하였다. (도 6a) 세포 사멸을 상청액에서 LDH 방출에 의해 측정하였다. (도 6b) IL-1ß 및 TNFα 시토카인 방출을 ELISA에 의해 모니터링하였다. 3개의 독립적인 실험의 평균 및 SD가 표시된다. (도 6c) 표시된 자극제로 처리된 FLT3-DC를 팔로이딘-FITC 및 DAPI로 염색하였다. 자이스(Zeiss) 공초점 현미경에서 40X 오일 침지 렌즈로 이미지를 수득하였다. (도 6d) 표시된 자극제로 처리된 FLT3-DC를 라이브-데드 바이올렛 키트, CCR7 PE, 및 CD11c-APC로 염색하였다. CCR7 (CD11c+ 생 세포에 게이팅됨)의 평균 형광 강도 (MFI)를 유동 세포계측법에 의해 측정하였다.
도 7은 과다활성화-기반 면역요법에 의해 유도된 종양 거부를 과다활성 cDC1이 제어함을 입증하는 개략도 및 플롯이다. WT 마우스를 3×105개 생 B16OVA 세포로 등에 피하로 (s.c.) 접종하였다. 종양 시험감염 후 7, 14 및 21일에, 마우스를 미처리 상태로 두거나, 1×106개의 미처리된 WT cDC1 또는 23시간 동안 LPS로 처리된 WT cDC1 (cDC1활성), 또는 LPS로 3시간 동안 프라이밍된 후, 20시간 동안 PGPC로 처리된 WT cDC1 (cDC1과다활성)을 오른쪽 옆구리에 s.c. 주사하였다. 모든 DC를 주사 전 1시간 동안 종양 용해물로 펄스화하였다. 생존을 매일 모니터링하였다 (n=5마리의 마우스/그룹).
도 8a-8c는 과다활성 cDC1이 종양 거부를 제어하고 항종양 특이적 T 세포의 종양 침윤을 증진시킴을 입증하는 일련의 그래프, 플롯 및 개략도이다. 도 8a-8b: Batf3-/- 마우스를 3×105개 생 B16OVA 세포로 등에 s.c. 접종하였다. 종양 시험감염 후 7, 14 및 21일에, 마우스의 오른쪽 옆구리에 1×106개의 미처리된 WT cDC1 또는 23시간 동안 LPS로 처리된 후 1시간 동안 B16OVA 종양 용해물로 펄스화된 WT cDC1 (cDC1활성), 또는 LPS로 3시간 동안 프라이밍된 후 20시간 동안 PGPC로 처리된 후 1시간 동안 종양 용해물로 펄스화된 WT cDC1 (cDC1과다활성)을 s.c. 주사하였다. (도 8c) 생존을 매일 모니터링하였다 (n=5마리의 마우스/그룹). (도 8b) 피부 배수 림프절 (dLN), 종양 및 비장 조직을 종양 접종 후 15일에 면역화된 마우스로부터 절개하였다. 항원 특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 백분율을 각각 SIINFEKL 및 AAHAEINEA 사량체 염색을 사용하여 측정하였다 (n=5마리의 마우스/그룹). (도 8c) 처리된 마우스의 종양 및 dLN에서 SIINFEKL+ CD8+ T 세포의 대표적인 플롯.
도 9a 및 9b는 과다활성 cDC1이 인플라마좀-의존적 방식으로 종양 거부를 제어함을 입증하는 일련의 개략도 및 플롯이다. (도 9a) Casp1/11-/- 마우스, (도 9b) NLRP3-/- 마우스를 3.105개 생 B16OVA 세포로 등에 s.c. 접종하였다. 종양 시험감염 후 7, 14 및 21일에, 마우스의 오른쪽 옆구리에 1.106개의 미처리된 WT cDC1 (cDC1나이브) 또는 23시간 동안 LPS로 처리된 후 B16OVA 종양 용해물로 1시간 동안 펄스화된 WT cDC1 (cDC1활성), 또는 LPS로 3시간 동안 프라이밍된 후 20시간 동안 PGPC로 처리된 WT 또는 Casp1/11-/- cDC1 (cDC1과다활성)을 s.c. 주사하였다. 모든 DC를 주사 전 1시간 동안 종양 용해물로 펄스화하였다. (도 9a) Casp1/11-/- 마우스 및 (도 9b) NLRP3 마우스에서 생존을 매일 모니터링하였다 (n=5마리의 마우스/그룹).
도 10a 및 10b는 합성된 지질의 질량 분광법을 보여준다. 비-산화된 PAPC (도 10a), oxPAPC (도 10b), PEIPC-풍부화 oxPAPC (도 10c) 및 비오틴-표지된 oxPAPC (도 10d)의 질량 분광법 분석.
도 11a-b. 산화된 인지질은 과다이동성 표현형을 표시하는 과다활성 cDC1 및 cDC2 세포를 유도한다. (a) FLT3L을 사용하여 생성된 야생형 또는 NLRP3-/- 또는 Casp1/11-/- BMDC를 미처리 상태로 두거나 (없음), LPS 단독, 또는 알룸 단독, 또는 PGPC 단독으로 24시간 동안 처리하거나, BMDC를 LPS로 3시간 동안 프라이밍한 후, 표시된 자극제로 21시간 동안 처리하였다. IL-1β 및 TNFα 방출을 ELISA에 의해 모니터링하였다. 세포 사멸 백분율을 세포 상청액에서 LDH 방출에 의해 측정하였다. 3개 복제로부터의 평균 및 SD가 표시되고, 데이터는 적어도 3개의 독립적인 실험을 대표한다. (b) FLT3L을 사용하여 생성된 야생형 BMDC를 cDC1 또는 cDC2 세포로서 분류한 후, a에서와 같이 표시된 자극제로 처리하였다. IL-1β 및 TNFα 방출을 ELISA에 의해 모니터링하였다. 세포 사멸 백분율을 세포 상청액에서 LDH 방출에 의해 측정하였다. 2개의 상이한 실험실에서 수행된 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균 및 SD.
도 12a-b. 과다활성 DC는 강한 CTL 반응 및 CCR7 발현 및 인플라마좀 활성화에 의존적인 오래 지속되는 항종양 면역을 유도한다. (a-b) FLT3L을 사용하여 생성된 야생형 BMDC를 미처리 상태로 두거나 (DC나이브), 18시간 동안 LPS 단독으로 처리하거나 (DC활성), BMDC를 LPS로 3시간 동안 프라이밍한 후, 15시간 동안 PGPC (DC과다활성) 또는 알룸 (DC파이롭토시스)으로 처리하였다. 대안적으로, NLRP3-/- 또는 CCR7-/- 마우스로부터의 BMDC를 3시간 동안 LPS로 프라이밍한 후, 15시간 동안 PGPC로 처리하였다. 1.10e6 BMDC를 OVA 단백질과 함께 1시간 동안 인큐베이션한 후, 야생형 마우스에 피하로 주사하였다. OVA 단백질로 로딩되지 않은 BMDC의 주사는 대조군으로서 사용되었다. BMDC 주사 후 7일에, 피부 배수 림프절을 절개하고 라이브-데드 바이올렛 키트, OVA 펩티드 사량체 항체, 항-CD45, 항-CD3, 항-CD8a, 항-CD4로 염색하였다. (a) SIINFEKL+ CD8+ T 세포 (상부 패널), 및 AAHAEINEA+ CD4+ 생 T 세포의 백분율을 유동 세포계측법에 의해 측정하였다. (b) SIINFEKL+ CD8+ T 세포 (상부 패널) 및 AAHAEINEA+ CD4+ 생 T 세포의 절대 수를 카운터브라이트(CounterBright) 비드를 사용하여 유동 세포계측법에 의해 측정하였다.
도 13a-e. 과다활성 자극제는 인플라마좀 의존적 방식으로 강한 CTL 반응을 유도한다. (a) C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 OVA 단독 또는 LPS 또는 PGPC, 또는 LPS + oxPAPC 또는 PGPC (불완전 프로인트 아주반트 (IFA)에 모두 유화됨)를 피하로 주사하였다. 면역화 후 7 또는 40일에, 항-CD8 비드를 사용한 자성 풍부화에 의해 T 세포를 피부 배수 림프절 (dLN)로부터 단리하였다. (a) CD3+CD8+ 생 세포 중 CD44lowCD62Llow로서의 T 이펙터 세포 (Teff), CD44hiCD62Llow로서의 T 이펙터 기억 세포 (TEM), 및 CD44hiCD62Lhi로서의 T 중심 기억 세포 (TCM)의 백분율이 표시된다. (b) CD8+ T 세포를 면역화 후 7일에 dLN으로부터 분류한 후, PMA + 이오노마이신으로 처리하거나, 5시간 동안 1:3 (이펙터: 표적)의 비율로 B16OVA 세포 (표적 세포)와 함께 공동-배양하였다. CD8+ T 세포의 탈과립화를 유동 세포계측법을 사용하여 생 CD8+ T 세포 중 CD107a+의 백분율을 모니터링함으로써 평가하였다. 5-10마리의 마우스의 평균 및 SD가 표시된다. (c) 마우스의 오른쪽 옆구리에 OVA 단독 또는 LPS, 또는 LPS + oxPAPC 또는 PGPC (IFA에 모두 유화됨), 또는 LPS + 알룸을 s.c. 주사하였다. 대안적으로, NLRP3-/-마우스에 LPS + IFA에 유화된 PGPC와 함께 OVA를 주사하였다. 면역화 후 7일에, CD8+ T 세포를 면역화된 마우스의 피부 dLN으로부터 분류하고, OVA로 로딩된 (또는 로딩하지 않은) BMDC와 함께 7일 동안 1:10 (DC: T 세포)의 비율로 공동-배양하였다. CD8+ 생 T 세포 중 SIINFEKL+ IFNγ+의 백분율을 OVA 펩티드 사량체 염색 후 세포내 IFNγ 염색을 사용하여 측정하였다. (d-e) CD45.1 마우스에 방사선을 조사한 후, 골수 ZBTB46DTR 마우스 + WT 또는 NLRP3-/- 또는 Casp1/11-/- 또는 CCR7-/- (비율 5:1)로 재구성하였다 (모두 CD45.2 C57BL/6 배경 상에). 재구성 후 6주에, 마우스 키메라에 타목시펜을 7일 동안 격일로 주사하였다. 그 후, 키메라 마우스를 LPS + IFA에 유화된 PGPC와 함께 OVA로 오른쪽 옆구리에 s.c. 면역화하였다. 면역화 후 7일에, CD8+ T 세포를 항-CD8 비드를 사용한 자성 풍부화에 의해 피부 배수 림프절 (dLN)로부터 또는 비장으로부터 단리하였다. (d) 피부 dLN에서 Teff, TEM, TCM 및 T 나이브 세포의 백분율을 유동 세포계측법에 의해 측정하였다. (e) dLN (왼쪽 패널) 또는 비장 (오른쪽 패널)에서 CD8+ 생 T 세포 중 SIINFEKL+의 백분율을 유동 세포계측법에 의해 OVA 펩티드 사량체 염색을 사용하여 측정하였다. 총 CD8+ T 세포를 dLN으로부터 분류하고, 1:10 (DC: T 세포)의 비율로 7일 동안 OVA로 로딩된 (또는 로딩하지 않은) 미처리된 BMDC와 함께 공동-배양하였다.
도 14a-d. 과다활성화 자극제를 사용한 면역화는 뜨거운 종양 내지 차가운 종양 범위의 면역원성을 갖는 종양을 근절한다. (a) C57BL/6 마우스를 5x105개 생 MC38OVA 세포로 왼쪽 상부 등에 피하로 접종하였다. 14일 후, 마우스를 미처리 상태로 두거나 (비면역화됨), 중화 항 IL-1β 정맥내 (i.v.) 또는 항-CD4 또는 항-CD8a 복강내 주사와 함께 또는 없이 동계 MC38OVA 전체 종양 용해물 (WTL), + LPS 및 PGPC를 오른쪽 옆구리에 피하로 주사하였다. 마우스는 종양 접종 후 37일차 및 55일차에 WTL 및 LPS + PGPC로 2회 부스트 주사를 받았다. 종양이 20 mm의 직경에 도달하도록 하였다. 생존 백분율이 표시된다 (n=그룹당 10마리의 마우스). (b) C57BL/6 마우스를 3X105개 생 B16OVA 세포로 왼쪽 상부 등에 s.c. 접종하였다. 10일 후, 마우스를 미처리 상태로 두거나 (비면역화됨), 항-PD1 항체를 복강내로 주사하였다. 대안적으로, 항 IL-1β 정맥내 (i.v.) 또는 항-CD4 또는 항-CD8a 복강내와 함께 또는 없이 마우스의 오른쪽 옆구리에 동계 B16OVA WTL, + LPS 및 PGPC 중화 항체를 s.c. 주사하였다. 마우스는 종양 접종 후 17일차 및 24일차에 B16OVA WTL, + LPS 및 PGPC로 2회 부스트 주사를 받았다. 생존 백분율이 표시된다 (n=10마리의 마우스/그룹). (c) C57BL/6 마우스를 3x105개 생 B16-F10 세포로 왼쪽 상부 등에 s.c. 접종하였다. 7일 후, 마우스를 미처리 상태로 두거나 (비면역화됨), 항-PD1 항체를 복강내로 주사하였다. 대안적으로, 중화 항체 항 IL-1β 정맥내 (i.v.) 또는 항-CD4 또는 항-CD8a 복강내와 함께 또는 없이 마우스를 동계 B16-F10 WTL, + LPS 및 PGPC로 오른쪽 옆구리에 s.c. 면역화하였다. 마우스는 종양 접종 후 14일차 및 21일차에 2회 부스트 주사를 받았다. 생존 백분율이 표시된다 (n=그룹당 10마리의 마우스). (d) BALB/c WT 마우스를 3x105개 생 CT26 세포로 왼쪽 등에 s.c. 접종하였다. 7일 후, 마우스를 미처리 상태로 두거나 (비면역화됨), 항-PD1 항체를 복강내로 주사하였다. 대안적으로, 중화 항체 항 IL-1β 정맥내 (i.v.) 또는 항-CD4 또는 항-CD8a 복강내와 함께 또는 없이 마우스의 오른쪽 옆구리에 동계 CT26 WTL, + LPS 및 PGPC를 s.c. 주사하였다. 마우스는 종양 접종 후 14일차 및 21일차에 2회 부스트 주사를 받았다. 생존 백분율이 표시된다 (n=10마리의 마우스/그룹).
도 15a-f. 과다활성 cDC1은 복합체 항원 공급원을 사용하여 T 세포 매개 항종양 면역을 자극할 수 있다. (a) Zbtb46DTR 마우스에 B16OVA 세포를 s.c. 주사하였다. 4회 연속 주사를 위해 격일로 마우스에 디프테리아 독소 (DTx)를 주사하거나, 마우스에 PBS를 주사하였다. 종양 주사 후 7일에, 모든 마우스를 B16OVA WTL + LPS 및 PGPC로 면역화한 후, 2회 부스트 주사를 받았다. 마우스 생존 백분율이 표시된다 (n=그룹당 10마리의 마우스). (b) CD45.1 마우스에 방사선을 조사한 후, Zbtb46DTR 마우스로부터의 혼합된 BM + WT 또는 Nlrp3-/- 또는 Casp1/11-/- 또는 Ccr7-/- 마우스로 재구성하였다. 재구성 후 6주에, 마우스 키메라에 B61OVA 세포를 s.c. 주사한 후, 모든 마우스는 총 12회 연속 주사를 위해 일주일에 3회 DTx를 받았다. 종양 접종 후 7일에, 키메라 마우스를 B16OVA WTL 및 LPS + PGPC로 면역화하고, 2회 부스트 주사를 받았다. 마우스 생존 백분율이 표시된다 (n=그룹당 5마리의 마우스). (c-d) WT 또는 Batf3-/- 마우스에 B16OVA 세포를 s.c. 주사하였다. 종양 접종 후 7일에, 마우스를 미처리 상태로 두거나, WT 및 Batf3-/- 마우스를 B16OVA WTL 및 LPS + PGPC로 면역화한 후, 2회 부스트 주사를 받았다. (c) 마우스 생존 백분율이 표시된다 (n=그룹당 10마리의 마우스). (d) 종양 접종 후 21일에, OVA 특이적 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포의 백분율을 사량체 염색을 사용하여 평가하였다 (n=그룹당 5마리의 마우스). (e-f) Batf3-/- 마우스에 B16OVA 세포를 오른쪽 옆구리에 s.c. 주사하였다. 종양 접종 후 7일에, 마우스를 미처리 상태로 두거나 (cDC1 주사 없음), 마우스의 왼쪽 옆구리에 FLT3-유래 나이브 cDC1 또는 LPS로 처리된 활성 cDC1 또는 LPS + PGPC로 전처리된 과다활성 cDC1을 s.c. 주사하였다. 모든 cDC1을 주사 전 1시간 동안 B16OVA WTL로 로딩하였다. (e) 마우스 생존 백분율이 표시된다 (n=그룹당 5마리의 마우스). (f) 종양 접종 후 21일에, OVA 특이적 CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 사량체 염색을 사용하여 평가하였다 (n=그룹당 5마리의 마우스).
도 16a-c. 산화된 인지질은 cDC1 및 cDC2 세포에 의한 인플라마좀 의존적 IL-1β 분비를 유도하고, 과다이동성 DC 표현형을 촉진한다. (a) FLT3L을 사용하여 생성된 야생형 BMDC를 미처리 상태로 두거나 (없음), CpG 1806 단독, 또는 PGPC 단독으로 24시간 동안 처리하거나, BMDC를 CpG 1806으로 3시간 동안 프라이밍한 후, 표시된 자극제로 21시간 동안 처리하였다. IL-1β 및 TNFα 방출을 ELISA에 의해 모니터링하였다. 세포 사멸 백분율을 세포 상청액에서 LDH 방출에 의해 측정하였다. 3개 복제로부터의 평균 및 SD가 표시되고, 데이터는 적어도 3개의 독립적인 실험을 대표한다. (b) FLT3L-생성 BMDC로부터 또는 야생형 마우스의 비장으로부터 cDC1 또는 cDC2를 단리하기 위한 게이팅 전략. 분류 후 순도가 비장 cDC 또는 FLT3L DC에 대해 표시된다. (c) 비장 cDC1 또는 cDC2를 미처리 상태로 두거나 (없음), LPS 단독, 또는 알룸 단독, 또는 oxPAPC 또는 PGPC 단독으로 18시간 동안 처리하거나, BMDC를 LPS로 3시간 동안 프라이밍한 후, 표시된 자극제로 15시간 동안 처리하였다. IL-1β 및 TNFα 방출을 ELISA에 의해 모니터링하였다. 세포 사멸 백분율을 세포 상청액에서 LDH 방출에 의해 측정하였다. 2개의 상이한 실험실에서 수행된 3개의 독립적인 실험으로부터의 평균 및 SD.
도 17a-c. 과다활성 DC는 강한 CTL 반응 및 CCR7 발현 및 인플라마좀 활성화에 의존적인 오래 지속되는 항종양 면역을 유도한다. FLT3L을 사용하여 생성된 야생형 BMDC를 미처리 상태로 두거나 (DC나이브), 18시간 동안 LPS 단독으로 처리하거나 (DC활성), BMDC를 LPS로 3시간 동안 프라이밍한 후, PGPC (DC과다활성) 또는 알룸 (DC파이롭토시스)을 15시간 동안 배양 배지에 첨가하였다. 대안적으로, NLRP3-/- 또는 CCR7-/- 마우스로부터의 BMDC를 3시간 동안 LPS로 프라이밍한 후, PGPC를 15시간 동안 배양 배지에 첨가하였다. BMDC를 세척한 후, FITC 표지된-OVA와 함께 45분 동안, 또는 비형광 OVA 단백질과 함께 2시간 동안 인큐베이션하였다. (a) MHC-I 상의 OVA 펩티드 제시를 OVA 펩티드 SIINFEKL에 결합된 H-2Kb에 대한 PE-접합 항체를 사용하여 모니터링하였다. 데이터는 CD11c+ 생 세포 중 SIINFEKL-연관 DC의 빈도로 표시된다. 3개 복제로부터의 평균 및 SD가 표시되고, 데이터는 3개의 독립적인 실험을 대표한다. (b) FLT3L을 사용하여 생성된 야생형 또는 NLRP3-/- 또는 CCR7-/- BMDC를 a에서와 같이 자극하였다. BMDC를 세척한 후, 라이브-데드 바이올렛 키트, CD11c 및 CD40으로 염색하였다. 표면 CD40 (CD11c+ 생 세포 중)의 평균 형광 강도 (MFI)를 유동 세포계측법에 의해 측정하였다. (c) FLT3L을 사용하여 생성된 CCR7-/- BMDC를 미처리 상태로 두거나 (없음), LPS 단독, 또는 알룸 단독, 또는 PGPC 단독으로 24시간 동안 처리하였다. 대안적으로, BMDC를 LPS로 3시간 동안 프라이밍한 후, 표시된 자극제로 21시간 동안 처리하였다. IL-1β 및 TNFα 방출을 ELISA에 의해 모니터링하였다. 세포 사멸 백분율을 세포 상청액에서 LDH 방출에 의해 측정하였다. 3개 복제로부터의 평균 및 SD가 표시되고, 데이터는 적어도 3개의 독립적인 실험을 대표한다.
도 18a-d. 과다활성화 자극제는 기억 T 세포 생성을 증진시키고, 인플라마좀-의존적 방식으로 항원-특이적 IFNγ 이펙터 반응을 강화시킨다. C57BL/6 마우스의 오른쪽 옆구리에 OVA 단독 또는 LPS 또는 PGPC, 또는 LPS + oxPAPC 또는 PGPC (불완전 프로인트 아주반트 (IFA)에 모두 유화됨)를 피하로 주사하였다. 면역화 후 7일에, 항-CD8 비드를 사용한 자성 풍부화에 의해 T 세포를 피부 배수 림프절 (dLN)로부터 단리하였다. (a) CD44lowCD62Llow로서의 T 이펙터 세포 (Teff), CD44highCD62Llow로서의 T 이펙터 기억 세포 (TEM), 및 CD44highCD62Lhigh로서의 T 중심 기억 세포 (TCM)의 백분율을 결정하기 위한 게이팅 전략. (b) 총 CD3+ 생 세포 중 마우스당 피부 dLN의 Teff 또는 TEM 세포의 절대 수를 유동 세포계측법에 의해 평가하였다. (c) CD8+ T 세포를 면역화 후 7일에 dLN으로부터 분류한 후, 1000 ug/ml로부터 시작하여 OVA 단백질의 계단 희석액으로 로딩된 (또는 로딩하지 않은) 미처리된 BMDC와 함께 배양하였다. IFNγ 시토카인 분비를 ELISA에 의해 측정하였다. 5마리의 마우스의 평균 및 SD가 표시된다. (d) CD8+ T 세포를 면역화 후 7일에 dLN으로부터 분류한 후, PMA + 이오노마이신으로 처리하거나, 5시간 동안 1:3 (이펙터: 표적)의 비율로 B16OVA 세포 (표적 세포)와 함께 공동-배양하였다. 유동 세포계측법에 의해 생 CD8+ T 세포 중 CD107a+의 백분율을 결정하기 위한 게이팅 전략. 각 패널은 5마리의 마우스를 대표한다. *P < 0.05; **P < 0.01.
도 19a-b. 과다활성화 자극제는 기억 T 세포 생성을 증진시키고, 인플라마좀-의존적 방식으로 항원-특이적 IFNγ 이펙터 반응을 강화시킨다. (a-b) CD45.1 마우스에 방사선을 조사한 후, 골수 ZBTB46DTR 마우스 + WT 또는 NLRP3-/- 또는 Casp1/11-/- 또는 CCR7-/- (비율 5:1)로 재구성하였다 (모두 CD45.2 C57BL/6 배경 상에). 재구성 후 6주에, 마우스 키메라에 타목시펜을 7일 동안 격일로 주사하였다. 그 후, 키메라 마우스를 LPS + IFA에 유화된 PGPC와 함께 OVA로 오른쪽 옆구리에 피하로 면역화하였다. 면역화 후 7일에, CD8+ T 세포를 항-CD8 비드를 사용한 자성 풍부화에 의해 피부 배수 림프절 (dLN)로부터 또는 비장으로부터 단리하였다. (a) 피부 dLN에서 Teff, TEM, TCM 및 T 나이브 세포의 백분율을 유동 세포계측법에 의해 측정하였다. 각 패널은 5마리의 마우스를 대표한다. (b) dLN (상부 패널) 또는 비장 (하부 패널)에서 CD8+ 생 T 세포 중 SIINFEKL+의 백분율을 유동 세포계측법에 의해 OVA 펩티드 사량체 염색을 사용하여 측정하였다.
도 20a-c. (a-b) 마우스의 오른쪽 옆구리에 PBS (비면역화됨), B16OVA 세포 용해물 단독 (없음) 또는 LPS, 또는 B16OVA 용해물 + LPS 및 oxPAPC 또는 PGPC (불완전 프로인트 아주반트 (IFA)에 모두 유화됨)를 피하로 (s.c.) 주사하였다. 면역화 후 15일에, 마우스를 3x105개 생존가능한 B16OVA 세포로 왼쪽 상부 등에 s.c. 시험감염시켰다. 150일 후, 무종양 마우스를 5x105개 생존가능한 B16OVA 세포로 등에 s.c. 재시험하였다. (a) 종양 성장을 2일마다 모니터링하였다 (상부 패널). 생존 실험 (하부 패널)을 위해, 마우스가 20 mm의 직경에 도달하도록 하였다 (n=그룹당 8-15마리의 마우스). (b-c) 종양 성장의 종점에서 종양을 수확하고 해리하여 단일-세포 종양 현탁액을 수득하였다. (b) 풍부화된 CD45+ 생 세포 중 종양 침윤 CD3+CD4+ 및 CD3+CD8+ T 세포의 백분율을 유동 세포계측법에 의해 평가하였다. (c) 종양 침윤 CD3+ T 세포를 분류한 후, 항-CD3 및 항-CD28 다이나비즈의 존재 하에 24시간 동안 자극하였다. IFNγ 방출을 ELISA에 의해 측정하였다 (하부 패널) (n=그룹당 4마리의 마우스).
도 21a-d. (a-b) CD8+ T 세포 및 CD69+ CD103+ T 상주 기억 CD8+ T 세포의 절대 수를 생존자 마우스의 면역화 또는 종양 주사 부위에서 평가하고, 유동 세포계측법에 의해 측정하였다 (n=4마리의 마우스). (c-d) 순환 기억 CD8+ T 세포 (TCM)를 비장으로부터 단리하고, T 상주 기억 CD8+ 세포 (TRM)를 생존자 마우스 또는 연령-매치 비면역화된 종양-보유 마우스의 피부 서혜부 지방 조직으로부터 단리하였다. (c) 생존자 마우스로부터의 TCM 및 TRM을 B16OVA 또는 B16-F10 또는 CT26 종양 세포와 함께 1:5 (종양 세포: T 세포)의 비율로 5시간 동안 공동-배양하였다. 세포용해성 CD8+ T 세포에 의한 세포 사멸을 상청액에서 LDH 방출에 의해 측정하였다. (d) 마우스를 미처리 상태로 두거나 (Tx 없음), 5x105개 CD8+ TCM 세포로 정맥내로 (i.v.) 및/또는 생존자 마우스 또는 연령-매치 비면역화된 종양-보유 마우스로부터 단리된 5x105개 CD8+ TRM 세포로 피내로 (i.d.) 접종하였다. 7일 후, 모든 마우스를 3x105개 생존가능한 B16OVA 세포로 시험감염시켰다. 생존 백분율을 2일마다 모니터링하였다. 마우스가 20 mm의 직경에 도달하도록 하였다 (n=그룹당 5마리의 마우스).
선천 면역 시스템은 고전적으로 실무율 방식으로 작동하는 것으로 간주되었으며, DC는 적응 면역을 촉진하는 염증 반응을 일으키거나 일으키지 않도록 작동한다. 따라서, DC에 의해 발현되는 톨-유사 수용체 (TLR)는 이들 세포의 면역원성 잠재력을 결정하는데 중심적으로 중요한 것으로 여겨진다. 포유동물 면역 시스템은 미생물을 검출하고 감염을 제한하는 보호 반응을 활성화시키는 역할을 한다. 이 작업의 중심은 미생물을 감지하고 후속적으로 T-세포 활성화를 촉진하는 수지상 세포이다. 수지상 세포는 임의의 감염 위협을 게이지하고 비례하는 반응을 지시할 수 있다고 제안되었지만 (Blander, J.M. (2014). Nat Rev Immunol 14, 601-618; Vance, R.E. et al., (2009) Cell host & microbe 6, 10-21), 이들 면역-조절성 활성이 일어날 수 있는 메커니즘은 불분명하다.
PRR은 광범위한 부류의 미생물에 공통적인 분자를 직접 또는 간접적으로 검출하는 역할을 한다. 이들 분자는 고전적으로 병원체 연관 분자 패턴 (PAMP)으로 지칭되고, 그 중에서도 박테리아성 리포폴리사카라이드 (LPS), 박테리아성 플라겔린 또는 바이러스성 이중 가닥 RNA와 같은 인자를 포함한다.
면역의 조절인자로서의 PRR의 중요한 속성은 특정 미생물 생성물을 인식하는 능력이다. 이와 같이, PRR-매개 신호전달 사건은 감염의 확실한 표시를 제공해야 한다. "GO" 신호는 염증 및 T-세포 매개 면역을 촉진하는 DC에서 발현되는 PRR에 의해 활성화되는 것으로 상정되었다. 흥미롭게도, 여러 그룹은 최근 DC가 단순히 이러한 실무율 방식으로 작동할 수 없다고 제안하였다 (Blander, J.M., and Sander, L.E. (2012). Nat Rev Immunol 12, 215-225; Vance, R.E. et al., (2009) Cell host & microbe 6, 10-21). 오히려, DC는 임의의 가능한 감염이 제기되는 위협 (또는 병독성)을 게이지하고 비례하는 반응을 개시하는 능력을 가질 수 있다. 병독성을 게이지할 수 있는 가장 일반적으로 논의되는 수단은 비병원체보다 더 다양한 PRR을 활성화시키는 병독성 병원체의 능력에 기초한다. 그러나, 모든 미생물이 공통의 PRR 활성인자 세트를 갖는 것은 아니며, 모든 PRR 활성인자가 필적하는 효력을 갖는 것은 아니다. 따라서, 감염 동안 활성화된 PRR의 수는 병독성의 이상적인 게이지가 될 수 없다. 더욱이, 감염 동안 활성화된 PRR의 수를 증가시키는 것은 일반적으로 더 큰 염증 반응을 일으킬 것이며, 이는 더 큰 T-세포 반응을 간접적으로 촉진할 수 있다. DC 활성화 상태를 고조시키는 것으로 이전에 제안된 조건 (예를 들어, 자극제로서 병독성 병원체의 사용을 통해)은 또한 MΦ 활성화 상태를 고조시킬 것으로 예상된다 (Vance, R.E. et al., (2009) Cell host & microbe 6, 10-21). 그러므로, 면역 시스템 (즉, DC)이 감염 위협을 구체적으로 게이지하는 메커니즘이 실제로 존재하는지 여부는 불분명하다.
감염 위협을 평가할 수 있는 한 가지 가능한 수단은 잘 인식된 우연 검출 프로세스를 통한 것이며, 여기서 독립적 입력은 임의의 단일 입력에 의해 유도된 것과 상이한 반응을 초래한다. PRR의 맥락에서, 하나의 이러한 입력은 병독성 위협에 관계없이 감염 지표로서의 미생물 생성물이어야 한다. 병독성 위협을 게이지하기 위해, 제2 입력이 존재해야 한다. 이론에 얽매이지 않고, 세포 손상이 종종 고병원성 미생물과 연관된 특징이기 때문에, 이 추정되는 제2 입력은 조직 손상 부위에서 생성된 분자라고 생각된다. DC에 제2 자극을 제공할 수 있는 후보 분자는 위험 연관 분자 패턴 (DAMP)이라고 하는 다양한 분자 패밀리이며, 이는 알라민으로도 공지되어 있다 (Kono, H., and Rock, K.L. (2008) Nat Rev Immunol 8, 279-289; Pradeu, T., and Cooper, E.L. (2012) Front Immunol 3, 287). DAMP는 감염성 및 비감염성 조직 손상 부위에서 발견되었으며, 염증 반응을 조정하는 것으로 제안되었지만 그의 작용 메커니즘은 아직 불분명하다. 이러한 부류의 DAMP 중 하나는 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (PAPC)으로부터 유래된 산화된 인지질로 표시되며, 이는 집합적으로 oxPAPC로 공지되어 있다. 이들 지질은 감염성 및 비감염성 조직 손상 부위 둘 다에서 생성되고 (Berliner, J.A., and Watson, A.D. (2005). N Engl J Med 353, 9-11; Imai, Y. et al. (2008) Cell 133, 235-249; Shirey, K.A. et al. (2013) Nature 497, 498-502), 죽어가는 세포의 막에서 매우 높은 수준으로 발견된다 (Chang, M.K. et al., (2004) J Exp Med 200, 1359-1370). oxPAPC는 또한 죽상경화증성 조직에서 염증을 촉진하는 산화된 저밀도 지단백질 (oxLDL) 응집체의 활성 성분이며 (Leitinger, N. (2003) Curr Opin Lipidol 14, 421-430), 여기서 국소 농도는 10-100μM만큼 높을 수 있다 (Oskolkova, O.V. et al. (2010) J Immunol 185, 7706-7712). oxPAPC와 죽어가는 세포 사이의 연관성은 이들 지질이 조직 건강의 일반적인 지표 역할을 할 수 있다는 가능성을 상승시켰다. 따라서, 미생물 생성물(들)의 존재 하에, oxPAPC는 증가된 감염성 위협을 나타낼 수 있다.
활성화된 DC의 앞서 언급된 특징으로 인해, 이들 세포는 항원-특이적 T 세포 반응을 자극할 수 있는 장비를 잘 갖추고 있으며 DC 활성화를 촉진하여 보호 면역을 구동하기 위한 수많은 전략이 착수되었다. 이들 전략은 일반적으로 톨-유사 수용체 (TLR) 패밀리의 PRR을 자극하는 합성 또는 천연 미생물 생성물의 사용을 포함하며, 주목할만한 예는 증가하는 수의 백신을 아주반트하는데 사용되는 FDA-승인 TLR4 리간드인 분자 모노포스포릴 지질 A (MPLA)이다 (J. Paavonen, Lancet, vol. 374, no. 9686, pp. 301-314, Jul. 2009; M. Kundi, Expert Rev. Vaccines, vol. 6, no. 2, pp. 133-140, Apr. 2007; A. M. Didierlaurent, et al. J. Immunol., vol. 183, no. 10, pp. 6186-6197, Nov. 2009). 특히, TLR 단독은 T 세포 매개 면역을 촉진하는데 필요한 모든 분자 신호를 상향조절하지 않는다. 시토카인의 인터류킨-1 (IL-1) 패밀리의 구성원은 T 세포 분화, 장기 기억 T 세포 생성 및 이펙터 기능의 많은 측면의 중요한 조절인자이다 (S. Z. Ben-Sasson, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 106, no. 17, pp. 7119-24, Apr. 2009; S. Z. Ben-Sasson, et al. J. Exp. Med., vol. 210, no. 3, pp. 491-502, Mar. 2013; A. Jain, et al. Nat. Commun., vol. 9, no. 1, pp. 1-13, 2018). 잘 특징화된 패밀리 구성원인 IL-1β의 발현은 TLR 신호에 의해 고도로 유도되지만, 이 시토카인은 N-말단 분비 신호가 결여되어 있으므로, 통상적인 생합성 경로를 통해 세포로부터 방출되지 않는다. 오히려, IL-1β는 TLR 리간드에 의해 활성화된 DC의 시토졸에 비활성 상태로 축적된다 (C. Garlanda, et al. Immunity, vol. 39, no. 6, pp. 1003-1018, Dec. 2013). 활성화된 DC로부터의 IL-1β 방출의 결여는 TLR 신호 단독이 T 세포 반응 및 보호 면역을 최대로 자극하기에 충분하지 않을 가능성을 제기한다.
DC 활성화 상태는 PRR 신호전달시 DC가 달성할 수 있는 유일한 세포 운명이 아니다. 실제로, 상이한 PRR은 이들 세포의 뚜렷한 운명을 자극한다. 이러한 운명 중 하나는 파이롭토시스로 공지된 염증 형태의 세포 사멸에 대한 헌신이다. 파이롭토시스는 DC 및 다른 세포의 시토졸에서 어셈블리하는 초분자 조직화 센터 (SMOC)인 인플라마좀의 작용으로 인해 발생하는 조절된 프로세스이다 (A. Lu, et al.Cell, vol. 156, no. 6, pp. 1193-1206, Mar. 2014; J. C. Kagan, et al. Nat. Rev. Immunol., vol. 14, no. 12, pp. 821-826, Dec. 2014). 인플라마좀 어셈블리는 일반적으로 숙주 세포의 시토졸에서 PAMP 또는 DAMP의 검출시 자극되며, 이와 같이, 시토졸 PRR은 시토졸에서의 위협 평가를 인플라마좀-의존적 파이롭토시스와 연결하는 역할을 한다 (K. J. Kieser and J. C. Kagan, Nat. Rev. Immunol., vol. 17, no. 6, pp. 376-390, May 2017; M. Lamkanfi and V. M. Dixit, Cell, vol. 157, no. 5, pp. 1013-22, May 2014). 파이롭토시스의 프로세스는 세포로부터 IL-1β 및 다른 IL-1 패밀리 구성원의 방출을 유발하므로, TLR이 제공할 수 없는 신호를 T 세포에 제공한다. 이러한 활성 증가에도 불구하고, IL-1β 방출 촉진 측면에서, 파이롭토시스 세포는 사멸되고, 따라서 dLN에서 나이브 T 세포를 자극하고 분화하는데 필요한 며칠 동안의 프로세스에 참여할 수 있는 능력을 상실하였다 (T. R. Mempel, et al. Nature, vol. 427, no. 6970, pp. 154-159, Jan. 2004). 실제로, 파이롭토시스를 촉진하는 자극제, 예컨대 일반적으로 사용되는 백신 아주반트 알룸 (S. C. Eisenbarth, et al. Nature, vol. 453, no. 7198, pp. 1122-1126, Jun. 2008; M. Kool, et al. J. Immunol., vol. 181, no. 6, pp. 3755-3759, Sep. 2008)은 유형 2 면역 반응을 자극하는 이들의 능력으로 가장 높이 인식되며 (P. Marrack, et al. Nat. Rev. Immunol., vol. 9, no. 4, pp. 287-293, Apr. 2009), 이는 많은 미생물 감염 또는 암의 제거에 적합하지 않다.
입양 세포 요법 (ACT) (동종이계 및 자가유래 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT) 및 재조합 세포 (즉, CAR T) 요법 포함)은 많은 악성 장애에 대해 선택되는 치료법이다 (HSCT 및 입양 세포 요법 접근법의 검토에 대해서는 문헌 [Rager & Porter, Ther Adv Hematol (2011) 2(6) 409-428]; [Roddie & Peggs, Expert Opin. Biol. Ther. (2011) 11(4):473-487]; [Wang et al. Int. J. Cancer. (2015)136, 1751-1768]; 및 [Chang, Y.J. and X.J. Huang, Blood Rev, 2013. 27(1): 55-62]을 참조함). 이러한 입양 세포 요법은 동종이계 및 자가유래 조혈 줄기 세포 이식, 공여자 백혈구 (또는 림프구) 주입 (DLI), 종양 침윤 림프구의 입양 전달, 또는 T 세포 또는 NK 세포의 입양 전달 (재조합 세포, 즉, CAR T, CAR NK, 유전자-편집된 T 세포 또는 NK 세포 포함, 문헌 [Hu et al. Acta Pharmacologica Sinica (2018) 39: 167-176], [Irving et al. Front Immunol. (2017) 8: 267] 참조)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 방사선 및 화학요법 후 조혈을 재구성하기 위해 공여자-유래 세포의 필요성 외에도, 전달된 세포로부터의 면역학적 재구성은 잔류 종양 세포의 제거에 중요하다. 악성종양에 대한 치료 옵션으로서 ACT의 효능은 공여자 세포의 기원, 조성 및 표현형 (림프구 서브세트, 활성화 상태), 기저 질환, 이식전 컨디셔닝 요법 및 이식후 면역 지원 (즉, IL-2 요법) 및 이식편 내 공여자 세포에 의해 매개되는 이식편-대-종양 (GVT) 효과를 포함하는 수많은 인자에 의해 영향을 받는다. 추가로, 이들 인자는 전형적으로 컨디셔닝 요법 및/또는 숙주 내 공여자 세포의 과도한 면역 활성 (즉, 이식편-대-숙주 질환, 시토카인 방출 증후군 등)으로 인해 발생하는 이식-관련 사망률과 균형을 이루어야 한다.
본 출원은 수지상 세포 (DC)를 활성화시키거나 DC 파이롭토시스를 촉진하는 자극제가 유형 I 및 유형 2 T 헬퍼 (Th) 세포로 이루어진 혼합된 T 세포 반응을 유도한다는 발견에 부분적으로 기초한다. 대조적으로, DC를 과다활성화시키는 자극제는 TH2-유도 면역의 증거 없이 TH1 및 세포독성 T 림프구 (CTL) 면역 반응을 선택적으로 자극한다. 과다활성 DC에 의해 생성된 TH1-편향 면역은 복합체 항원 공급원 (예를 들어, 종양 세포 용해물)이 사용되는 경우에도 장기간 보호 항종양 면역을 매개하는 독특한 능력을 이들 세포에 부여한다. 본원에서 입증된 바와 같이, 과다활성 DC는 생체외에서 생성되고 예를 들어 입양 세포 요법을 위해 사용될 수 있다.
그러므로, 세포 공여자로부터 생 수지상 세포를 수득하는 단계, 수지상 세포를 TLR 리간드로 생체외에서 프라이밍하는 단계, 프라이밍된 수지상 세포를 비-정규 인플라마좀-활성화 지질과 함께 생체외에서 배양하는 단계, 및 수지상 세포에 면역원을 로딩하여, 이에 의해 치료적 수지상 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 치료적 수지상 세포 집단을 생성하는 방법이 본원에 제공된다.
또한, 세포 공여자로부터 생 수지상 세포를 수득하는 단계, 수지상 세포를 TLR 리간드로 생체외에서 프라이밍하는 단계, 프라이밍된 수지상 세포를 비-정규 인플라마좀-활성화 지질과 함께 생체외에서 배양하는 단계, 수지상 세포에 면역원을 로딩하여, 이에 의해 치료적 수지상 세포 집단을 생성하는 단계, 및 치료적 수지상 세포 집단을 대상체에게 투여하여, 이에 의해 대상체에서 면역 반응을 유도하는 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법이 본원에 제공된다.
또한, 세포 공여자로부터 생 수지상 세포를 수득하는 단계, 수지상 세포를 TLR 리간드로 생체외에서 프라이밍하는 단계, 프라이밍된 수지상 세포를 비-정규 인플라마좀-활성화 지질과 함께 생체외에서 배양하는 단계, 수지상 세포에 면역원을 로딩하여, 이에 의해 치료적 수지상 세포 집단을 생성하는 단계, 및 치료적 수지상 세포 집단을 대상체에게 투여하여, 이에 의해 대상체에서 암을 치료하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
수지상 세포
본원에 개시된 방법은 세포 공여자로부터 생 수지상 세포를 수득하는 단계를 포함한다. 세포 공여자로부터 수득된 수지상 세포는 미성숙 또는 성숙일 수 있다. 수지상 세포는 생체내 또는 시험관내에서 분화될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 공여자로부터 생 수지상 세포를 수득하는 것은 세포 공여자로부터 선조 세포를 수확하는 것 및 분화를 유도하기에 효과적인 조건 하에 생체외에서 선조 세포를 배양하여, 이에 의해 세포 공여자로부터 수지상 세포를 수득하는 것을 포함한다. 선조 세포의 수지상 세포로의 시험관내 분화 방법은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Ardavin et al., "Origin and Differentiation of Dendritic Cells," TRENDS in Immunol. 22(12):691-700 (2001)]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 선조 세포는 림프성 선조 세포이다. 일부 실시양태에서, 선조 세포는 골수성 선조 세포이다. 일부 실시양태에서, 선조 세포는 혈액 단핵구이다.
일부 실시양태에서, 선조 세포는 골수로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 선조 세포는 혈액으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 선조 세포는 말초 혈액 단핵 세포로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 선조 세포는 제대혈로부터 유래된다.
일부 실시양태에서, 분화를 유도하기에 효과적인 조건 하에 생체외에서 선조 세포를 배양하는 것은 하나 이상의 시토카인의 존재 하에 배양되는 선조 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 분화를 유도하기에 효과적인 조건 하에 생체외에서 선조 세포를 배양하는 것은 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 인터류킨-4 (IL-4), 종양 괴사 인자 α (TNF-α), 형질전환 성장 인자 β (TGF-β), 인터류킨 7 (IL-7), 줄기 세포 인자 (SCF), fms-유사 티로신 키나제 3 리간드 (FLT3-L), 인터류킨 1 (IL-1), 또는 이들의 조합의 존재 하에 배양되는 선조 세포를 배양하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 선조 세포는 약 1 내지 약 48시간 동안 생체외에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 선조 세포는 약 6 내지 약 48, 약 12 내지 약 48, 약 18 내지 약 48, 약 24 내지 약 48, 약 30 내지 약 48, 약 36 내지 약 48, 약 42 내지 약 48, 약 1 내지 약 42, 약 6 내지 약 42, 약 12 내지 약 42, 약 18 내지 약 42, 약 24 내지 약 42, 약 30 내지 약 42, 약 36 내지 약 42, 약 1 내지 약 36, 약 6 내지 약 36, 약 12 내지 약 36, 약 18 내지 약 36, 약 24 내지 약 36, 약 30 내지 약 36, 약 1 내지 약 30, 약 6 내지 약 30, 약 12 내지 약 30, 약 18 내지 약 30, 약 24 내지 약 30, 약 1 내지 약 24, 약 6 내지 약 24, 약 12 내지 약 24, 약 18 내지 약 24, 약 1 내지 약 18, 약 6 내지 약 18, 약 12 내지 약 18, 약 1 내지 약 12, 약 6 내지 약 12, 또는 약 1 내지 약 6시간 동안 배양된다.
일부 실시양태에서, 선조 세포는 혈액 단핵구이다. 일부 실시양태에서, 혈액 단핵구는 GM-CSF 및/또는 IL-4의 존재 하에 배양된다.
일부 실시양태에서, 세포 공여자로부터 수지상 세포를 수득하는 것은 세포 공여자로부터 생체내 분화된 수지상 세포를 수확하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 생체내 분화된 수지상 세포는 미성숙 수지상 세포이다. 일부 실시양태에서, 생체내 분화된 수지상 세포는 성숙 수지상 세포이다.
일부 실시양태에서, 생체내 분화된 수지상 세포는 세포 공여자의 비장으로부터 수확된다. 일부 실시양태에서, 생체내 분화된 수지상 세포는 세포 공여자의 림프절로부터 수확된다. 일부 실시양태에서, 생체내 분화된 수지상 세포는 세포 공여자의 흉선으로부터 수확된다. 일부 실시양태에서, 생체내 분화된 수지상 세포는 세포 공여자의 혈액으로부터 수확된다. 일부 실시양태에서, 생체내 분화된 수지상 세포는 세포 공여자의 피부로부터 수확된다.
일부 실시양태에서, 대상체로부터 수지상 세포를 수득하는 것은 선조 세포 및/또는 생체내 분화된 수지상 세포를 동결시키는 것을 포함한다.
본원에 개시된 방법은 수지상 세포를 TLR 리간드로 생체외에서 프라이밍하는 단계를 포함한다. 적합한 TLR 리간드는 본원에 기재되어 있다. 수지상 세포의 프라이밍은 TLR 리간드의 존재 하에 선조 세포, 생체외 분화된 수지상 세포, 및/또는 생체내 분화된 수지상 세포를 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 수지상 세포는 TLR 리간드로 생체외에서 약 1 내지 약 24시간 동안 프라이밍된다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포는 TLR 리간드로 생체외에서 약 3 내지 약 24, 약 6 내지 약 24, 약 9 내지 약 24, 약 12 내지 약 24, 약 15 내지 약 24, 약 18 내지 약 24, 약 21 내지 약 24, 약 1 내지 약 21, 약 3 내지 약 21, 약 6 내지 약 21, 약 9 내지 약 21, 약 12 내지 약 21, 약 15 내지 약 21, 약 18 내지 약 21, 약 1 내지 약 18, 약 3 내지 약 18, 약 6 내지 약 18, 약 9 내지 약 18, 약 12 내지 약 18, 약 15 내지 약 18, 약 1 내지 약 15, 약 3 내지 약 15, 약 6 내지 약 15, 약 9 내지 약 15, 약 12 내지 약 15, 약 1 내지 약 12, 약 3 내지 약 12, 약 6 내지 약 12, 약 9 내지 약 12, 약 1 내지 약 9, 약 3 내지 약 9, 약 6 내지 약 9, 약 1 내지 약 6, 약 3 내지 약 6, 또는 약 1 내지 약 3시간 동안 프라이밍된다.
선조 세포가 생체외에서 분화되는 실시양태에서, 수지상 세포의 프라이밍은 분화를 유도하기에 효과적인 조건 하에 생체외에서 선조 세포를 배양하기 전에 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포의 프라이밍은 분화를 유도하기에 효과적인 조건 하에 생체외에서 선조 세포를 배양한 후에 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포의 프라이밍은 분화를 유도하기에 효과적인 조건 하에 생체외에서 선조 세포를 배양하는 것과 동시에 일어날 수 있다.
본원에 개시된 방법은 프라이밍된 수지상 세포를 비-정규 인플라마좀-활성화 지질과 함께 생체외에서 배양하는 단계를 포함한다. 적합한 비-정규 인플라마좀-활성화 지질은 본원에 기재되어 있다. 프라이밍된 수지상 세포를 배양하는 것은 비-정규 인플라마좀-활성화 지질의 존재 하에 선조 세포, 생체외 분화된 수지상 세포, 및/또는 생체내 분화된 수지상 세포를 인큐베이션하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프라이밍된 수지상 세포를 비-정규 인플라마좀-활성화 지질과 함께 생체외에서 배양하는 것은 약 1 내지 약 48시간 동안 수행된다. 일부 실시양태에서, 선조 세포는 약 6 내지 약 48, 약 12 내지 약 48, 약 18 내지 약 48, 약 24 내지 약 48, 약 30 내지 약 48, 약 36 내지 약 48, 약 42 내지 약 48, 약 1 내지 약 42, 약 6 내지 약 42, 약 12 내지 약 42, 약 18 내지 약 42, 약 24 내지 약 42, 약 30 내지 약 42, 약 36 내지 약 42, 약 1 내지 약 36, 약 6 내지 약 36, 약 12 내지 약 36, 약 18 내지 약 36, 약 24 내지 약 36, 약 30 내지 약 36, 약 1 내지 약 30, 약 6 내지 약 30, 약 12 내지 약 30, 약 18 내지 약 30, 약 24 내지 약 30, 약 1 내지 약 24, 약 6 내지 약 24, 약 12 내지 약 24, 약 18 내지 약 24, 약 1 내지 약 18, 약 6 내지 약 18, 약 12 내지 약 18, 약 1 내지 약 12, 약 6 내지 약 12, 또는 약 1 내지 약 6시간 동안 배양된다.
일부 실시양태에서, 프라이밍된 수지상 세포를 비-정규 인플라마좀-활성화 지질과 함께 생체외에서 배양하는 것은 수지상 세포를 TLR 리간드로 생체외에서 프라이밍하는 것과 동시에 수행된다. 일부 실시양태에서, 프라이밍된 수지상 세포를 비-정규 인플라마좀-활성화 지질과 함께 생체외에서 배양하는 것은 수지상 세포를 TLR 리간드로 생체외에서 프라이밍한 후에 수행된다.
본원에 개시된 방법은 수지상 세포에 면역원을 로딩하는 것을 포함한다. 적합한 면역원은 본원에 개시되어 있다. 수지상 세포에 면역원을 로딩하는 것은 수지상 세포를 면역원과 함께 배양하는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 수지상 세포에 면역원을 로딩하는 것은 약 1 내지 약 24시간 동안 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포에 면역원을 로딩하는 것은 약 3 내지 약 24, 약 6 내지 약 24, 약 9 내지 약 24, 약 12 내지 약 24, 약 15 내지 약 24, 약 18 내지 약 24, 약 21 내지 약 24, 약 1 내지 약 21, 약 3 내지 약 21, 약 6 내지 약 21, 약 9 내지 약 21, 약 12 내지 약 21, 약 15 내지 약 21, 약 18 내지 약 21, 약 1 내지 약 18, 약 3 내지 약 18, 약 6 내지 약 18, 약 9 내지 약 18, 약 12 내지 약 18, 약 15 내지 약 18, 약 1 내지 약 15, 약 3 내지 약 15, 약 6 내지 약 15, 약 9 내지 약 15, 약 12 내지 약 15, 약 1 내지 약 12, 약 3 내지 약 12, 약 6 내지 약 12, 약 9 내지 약 12, 약 1 내지 약 9, 약 3 내지 약 9, 약 6 내지 약 9, 약 1 내지 약 6, 약 3 내지 약 6, 또는 약 1 내지 약 3시간 동안 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 수지상 세포에 면역원을 로딩하는 것은 수지상 세포를 비-정규 인플라마좀-활성화 지질과 함께 생체외에서 배양하는 것과 동시에 수행된다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포에 면역원을 로딩하는 것은 수지상 세포를 비-정규 인플라마좀-활성화 지질과 함께 생체외에서 배양한 후에 수행된다.
치료적 수지상 세포 집단을 생성하는 방법 및/또는 적응 면역 반응을 유도하는 방법의 일부 실시양태에서, 수지상 세포 및/또는 선조 세포는 동결된다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포 및/또는 선조 세포는 면역원을 로딩하기 전에 동결된다. 일부 실시양태에서, 수지상 세포는 면역원을 로딩한 후에 동결된다.
수지상 세포를 수득하고 예를 들어 암 면역원을 로딩하는 방법은 관련 기술분야에, 예를 들어 US20060134067A1, US9694059B2, US9962433B2, US20080254537A1, US9701942B2, US20060057129A1, US20160263206A1, US20150352200A1, US20070292448A1, US6251665B1, WO2003010292A3, US2017036325A1, US20040197903A1 및 US10731130B2에 기재되어 있다.
TLR 리간드
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "패턴 인식 수용체 리간드"는 톨-유사 수용체 (TLR) 패밀리, RIG-I 유사 수용체 (RLR) 패밀리, 뉴클레오티드 결합 류신 풍부 반복부 함유 (NLR) 패밀리, cGAS, STING 또는 AIM2-유사 수용체 (ALR)의 하나 이상의 구성원을 활성화시키는 분자 화합물을 지칭한다. 패턴 인식 수용체 리간드의 특정 예는 천연 또는 합성 박테리아성 리포폴리사카라이드 (LPS), 천연 또는 합성 박테리아성 지단백질, 천연 또는 합성 DNA 또는 RNA 서열, 천연 또는 합성 시클릭 디뉴클레오티드, 및 천연 또는 합성 탄수화물을 포함한다. 시클릭 디뉴클레오티드는 시클릭 GMP-AMP (cGAMP), 시클릭 디-AMP, 시클릭 디-GMP를 포함한다.
일부 실시양태에서, TLR 리간드는 TLR1 리간드, TLR2 리간드, TLR3 리간드, TLR4 리간드, TLR5 리간드, TLR6 리간드, TLR7 리간드, TLR8 리간드, TLR9 리간드, TLR10 리간드, TLR11 리간드, TLR12 리간드, TLR13 리간드, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, TLR 리간드는 TLR4 리간드이다. 일부 실시양태에서, TLR4 리간드는 LPS이다. 일부 실시양태에서, TLR4 리간드는 MPLA이다.
산화된 인지질
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "비-정규 인플라마좀-활성화 지질"은 세포의 카스파제 11-의존적 인플라마좀에서 염증 반응을 유도할 수 있는 지질을 지칭한다. 예시적인 "비-정규 인플라마좀-활성화 지질"은 PAPC, oxPAPC 및 oxPAPC의 종 (예를 들어, HOdiA-PC, KOdiA-PC, HOOA-PC, KOOA-PC, POVPC, PGPG), 뿐만 아니라 Rhodo LPS (LPS-RS 또는 로도박터 스파에로이데스(Rhodobacter sphaeroides)로부터의 LPS)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "oxPAPC" 또는 "산화된 PAPC"는 단편화된 또는 전체 길이 산소화된 sn-2 잔기를 함유하는 산화된 인지질의 혼합물을 생성하는 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (PAPC)의 산화에 의해 생성된 지질을 지칭한다. 잘 특징화된 산화적으로 단편화된 종은 오메가-알데히드 또는 오메가-카르복실 기를 보유하는 5개-탄소 sn-2 잔기를 함유한다. 아라키돈산 잔기의 산화는 또한 에스테르화된 이소프로스탄을 함유하는 인지질을 생성한다. oxPAPC는 oxPAPC에 존재하는 다른 산화된 생성물 중 HOdiA-PC, KOdiA-PC, HOOA-PC 및 KOOA-PC 종을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-정규 인플라마좀-활성화 지질은 산화된 1-팔미토일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC)의 종을 포함한다.
oxPAPC의 종은 관련 기술분야에 공지되고 기재되어 있다. 예를 들어 문헌 [Ni et al., "Evaluation of Air Oxidized PAPC: A Multi Laboratory Study by LC-MS/MS," Free Radical Biology and Medicine 144:156-66 (2019)]; 표 1을 참조한다.
일부 실시양태에서, 비-정규 인플라마좀-활성화 지질은 2-[[(2R)-2-[(E)-7-카르복시-5-히드록시헵트-6-에노일]옥시-3-헥사데카노일옥시프로폭시]-히드록시포스포릴]옥시에틸-트리메틸아자늄 (HOdiA-PC), [(2R)-2-[(E)-7-카르복시-5-옥소헵트-6-에노일]옥시-3-헥사데카노일옥시프로필] 2-(트리메틸아자늄일)에틸 포스페이트 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (HOOA-PC), 2-[[(2R)-2-[(E)-5,8-디옥소옥트-6-에노일]옥시-3-헥사데카노일옥시프로폭시]-히드록시포스포릴]옥시에틸-트리메틸아자늄 (KOOA-PC), [(2R)-3-헥사데카노일옥시-2-(5-옥소펜타노일옥시)프로필] 2-(트리메틸아자늄일)에틸 포스페이트 (POVPC), [(2R)-2-(4-카르복시부타노일옥시)-3-헥사데카노일옥시프로필] 2-(트리메틸아자늄일)에틸 포스페이트 (PGPC), [(2R)-3-헥사데카노일옥시-2-[4-[3-[(E)-[2-[(Z)-옥트-2-에닐]-5-옥소시클로펜트-3-엔-1-일리덴]메틸]옥시란-2-일]부타노일옥시]프로필] 2-(트리메틸아자늄일)에틸 포스페이트 (PECPC), [(2R)-3-헥사데카노일옥시-2-[4-[3-[(E)-[3-히드록시-2-[(Z)-옥트-2-에닐]-5-옥소시클로펜틸리덴]메틸]옥시란-2-일]부타노일옥시]프로필] 2-(트리메틸아자늄일)에틸 포스페이트 (PEIPC), 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 비-정규 인플라마좀-활성화 지질은 [(2R)-2-(4-카르복시부타노일옥시)-3-헥사데카노일옥시프로필] 2-(트리메틸아자늄일)에틸 포스페이트 (PGPC)를 포함한다.
일부 실시양태에서, oxPAPC 종은 표 1에 제시된 oxPAPC 종 또는 이들의 조합이다.
표 1. 상응하는 원소 조성 (중성), 정확한 질량, 부가물, m/z, ID 및 제안된 구조를 갖는, 문헌 [Ni et al.]에서 식별된 산화된 PAPC 분자 종. 명명법: "지질 명명법은 LIPID MAPS 컨소시엄 권장사항에 기초한다 [31]. 예를 들어, 약식 표기법 PC 36:4는 36개의 탄소 및 4개의 이중 결합을 함유하는 포스파티딜콜린 지질을 나타낸다. 본 발명자들의 경우에서와 같이, 지방산 정체성 및 sn-위치가 공지된 경우, 슬래시 구분기호가 사용된다 (예를 들어, PC 16:0/20:4). 산화된 지질에 대해 이용가능한 통일된 명명법이 없기 때문에, LPPtiger 도구에 의해 제공되는 약식 표기법이 사용되었다 [28]. 단쇄 산화된 지질은 각괄호로 묶인 상응하는 말단에 의해 표시되었으며 (예를 들어, "<" 및 ">"), 말단절단 부위는 탄소 원자 수에 의해 표시되었다 (예를 들어, <COOH@C9> 및 <CHO@C12). 장쇄 생성물의 경우, 본 발명자들의 권장사항은 첨가 유형이 알려지지 않은 경우 완전히 식별된 모 지질 후에 (예를 들어, PC 16:0/20:4 + 1O), 또는 공지된 관능기의 경우 괄호 안에 (예를 들어, PC 16:0/20:4[1xOH@C11])" 산소 첨가 수를 표시하는 것이다. Ni et al., "Evaluation of Air Oxidized PAPC: A Multi Laboratory Study by LC-MS/MS," Free Radical Biology and Medicine 144:156-66 (2019) at 2.7.
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면역원
"면역원" 및 "항원"은 상호교환가능하게 사용되며, 세포성 또는 체액성 면역 반응이 지향되는 임의의 화합물을 의미한다. 무생물 면역원은 예를 들어 사멸된 면역원, 서브유닛 백신, 재조합 단백질 또는 펩티드 등을 포함한다. 본원에 개시된 아주반트는 임의의 적합한 면역원과 함께 사용될 수 있다. 예시적인 관심 면역원은 바이러스, 마이코플라즈마, 기생충, 원생동물, 프리온 등을 구성하거나 이로부터 유래된 것을 포함한다. 따라서, 관심 면역원은 제한 없이, 인간 유두종 바이러스, 헤르페스 바이러스, 예컨대 헤르페스 심플렉스 또는 헤르페스 조스터, 레트로바이러스, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스 1 또는 2, 간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 리노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 아데노바이러스, 마이코플라즈마 뉴모니아에(Mycoplasma pneumoniae), 살모넬라(Salmonella) 속 박테리아, 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 엔테로코쿠스(Enterococcus), 클로스트리디움(Clostridium), 에스케리키아(Escherichia), 클렙시엘라(Klebsiella), 비브리오(Vibrio), 마이코박테리움(Mycobacterium), 아메바, 말라리아 기생충, 및/또는 트리파노소마 크루지(Trypanosoma cruzi)로부터 유래될 수 있다.
관심 면역원은 병든 표적 세포 (예를 들어, 신생물성 세포, 감염된 세포)에 의해 발현되고, 다른 조직에서는 더 적은 양으로 발현되거나 전혀 발현되지 않는다. 표적 세포의 예는 육종, 림프종, 백혈병, 암종, 흑색종, 유방 암종, 전립선 암종, 난소 암종, 자궁경부 암종, 결장 암종, 폐 암종, 교모세포종, 및 성상세포종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 신생물성 질환으로부터의 세포를 포함한다. 대안적으로, 표적 세포는 예를 들어 바이러스, 마이코플라즈마, 박테리아, 기생충, 원생동물, 프리온 등에 의해 감염될 수 있다. 따라서, 관심 면역원은 제한 없이, 인간 유두종 바이러스 (하기 참조), 헤르페스 바이러스, 예컨대 헤르페스 심플렉스 또는 헤르페스 조스터, 레트로바이러스, 예컨대 인간 면역결핍 바이러스 1 또는 2, 간염 바이러스, 인플루엔자 바이러스, 리노바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 아데노바이러스, 마이코플라즈마 뉴모니아에, 살모넬라 속 박테리아, 스타필로코쿠스, 스트렙토코쿠스, 엔테로코쿠스, 클로스트리디움, 에스케리키아, 클렙시엘라, 비브리오, 마이코박테리움, 아메바, 말라리아 기생충, 및 트리파노소마 크루지로부터 유래된 것일 수 있다.
일부 실시양태에서, 감염원에 의한 감염은 암의 발병과 연관된다. 예를 들어, 문헌 [Kuper et al., "Infections as a Major Preventable Cause of Human Cancer," Journal of International Medicine 249(S741):61-74 (2001)]을 참조한다.
종양 항원 및 감염원의 항원에 추가하여, p53, BRCA1, BRCA2, 망막모세포종 및 TSG101을 포함하나 이에 제한되지는 않는 종양 서프레서 유전자 생성물의 돌연변이체, 또는 제한 없이, RAS, W T, MYC, ERK 및 TRK와 같은 종양유전자 생성물은 또한 본 개시내용에 따라 사용되는 표적 항원을 제공할 수 있다. 표적 항원은 자기-항원, 예를 들어 암 또는 신생물성 질환과 연관된 것일 수 있다. 한 실시양태에서, 면역원은 병든 세포의 열 충격 단백질 (hsp)-펩티드 복합체, 또는 hsp-펩티드 복합체 자체로부터의 펩티드이다.
본원에서 사용된 바와 같은 "암"은 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 조절되지 않은 세포 성장 또는 복제에 의해 특징화된 질환, 병태, 형질, 유전자형 또는 표현형을 의미하며; 결장직장암, 뿐만 아니라, 예를 들어 백혈병, 예를 들어 급성 골수형성 백혈병 (AML), 만성 골수형성 백혈병 (CML), 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 및 만성 림프구성 백혈병, AIDS 관련 암, 예컨대 카포시 육종; 유방암; 골암, 예컨대 골육종, 연골육종, 유잉 육종, 섬유육종, 거대 세포 종양, 사기질종 및 척삭종; 뇌암, 예컨대 수막종, 교모세포종, 저급 성상세포종, 희소돌기아교세포종, 뇌하수체 종양, 신경초종 및 전이성 뇌암; 다양한 림프종을 포함하는 두경부암, 예컨대 외투 세포 림프종, 비호지킨 림프종, 선종, 편평 세포 암종, 후두 암종, 담낭 및 담관 암, 망막암, 예컨대 망막모세포종, 식도암, 위암, 다발성 골수종, 난소암, 자궁암, 갑상선암, 고환암, 자궁내막암, 흑색종, 폐암, 방광암, 전립선암, 폐암 (비소세포 폐 암종 포함), 췌장암, 육종, 윌름스 종양, 자궁경부암, 두경부암, 피부암, 비인두 암종, 지방육종, 상피 암종, 신장 세포 암종, 담낭 선암종, 이하선암종, 자궁내막 육종, 다제내성암; 및 증식성 질환 및 병태, 예컨대 종양 혈관신생과 연관된 신혈관화, 황반 변성 (예를 들어, 습성/건성 AMD), 각막 신혈관화, 당뇨병성 망막병증, 신생혈관 녹내장, 근시 변성 및 기타 증식성 질환 및 병태를 포함한다.
면역원, 예를 들어 암 면역원, 및 예를 들어 수지상 세포 로딩에서의 이들의 용도는 관련 기술분야에 공지되고 기재되어 있다. 예를 들어 문헌 [Michael J.P. Lawman and Patricia D. Lawman (eds.) "Cancer Vaccines, Methods and Protocols" Methods in Molecular Biol. 1136 (2014)]; [Chiang et al., "Whole Tumor Antigen Vaccines: Where Are We?" Vaccines (Basel) 3(2):344-72 (2015)]; [Thumann et al., "Antigen Loading of Dendritic Cells with Whole Tumor Cell Preparations," J. Immunol. Methods 277:1-16 (2003)]; [Kamigaki et al., "Immunotherapy of Autologous Tumor Lysate-Loaded Dendritic Cell Vaccines by a Closed-Flow Electroporation System for Solid Tumors," Anticancer Res. 33:2971-6 (2013)]; US3823126A; US3960827A; 및 US4160018A를 참조한다.
일부 실시양태에서, 면역원은 암 항원이다. 일부 실시양태에서, 암 항원은 종양 용해물, 세포자멸체, 펩티드, 종양 RNA, 종양 유래 엑소좀, 종양-DC 융합체, 또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 면역원은 전체 종양 용해물이다.
일부 실시양태에서, 전체 종양 용해물은 방사선조사, 비등 및 또는 동결-해동 용해에 의해 제조된다.
일부 실시양태에서, 면역원은 자가유래이다. 일부 실시양태에서, 면역원은 동종이계이다.
대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법의 일부 실시양태에서, 면역원은 세포 공여자로부터 유래된 종양 용해물이다.
세포 공여자 및 대상체
용어 "환자" 또는 "개체" 또는 "대상체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되고, 치료될 포유동물 대상체를 지칭하며, 인간 환자가 바람직하다. 일부 경우에, 본원에 개시된 방법은 실험 동물, 수의학적 적용, 및 마우스, 래트 및 햄스터를 비롯한 설치류, 및 영장류를 포함하나 이에 제한되지는 않는 질환에 대한 동물 모델의 개발에 사용된다.
일부 실시양태에서, 세포 공여자 및/또는 대상체는 포유동물 대상체이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "포유동물"은 인간, 실험 동물, 가축 및 농장 동물을 포함하나 이에 제한되지는 않는 것으로 의도된다.
일부 실시양태에서, 세포 공여자 및/또는 대상체는 인간 대상체이다.
대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법의 일부 실시양태에서, 세포 공여자는 대상체이다. 일부 실시양태에서 세포 공여자는 대상체가 아니다. 일부 실시양태에서, 선조 세포 및/또는 생체내 분화된 수지상 세포는 자가유래이다. 일부 실시양태에서, 선조 세포 및/또는 생체내 분화된 수지상 세포는 동종이계이다.
투여
본원에 개시된 방법에서, 치료적 수지상 세포 집단이 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 치료 유효량의 생 수지상 세포가 대상체에게 투여된다.
본원에 개시된 치료적 수지상 세포 집단의 투여량은 면역원의 성질 및 수지상 세포의 상태에 따라 달라질 수 있지만, 면역원성 반응을 유발하는데 있어서 생 수지상 세포의 효능을 증진시키기에 충분해야 한다. 치료적 또는 예방적 치료를 위해, 투여되는 생 수지상 세포의 양은 용량당 1Х103, 1Х104, 1Х105, 1Х106, 1Х107, 1Х108, 1Х109, 1x1010 또는 1Х1011개 세포 또는 그 이상의 범위일 수 있다. 본 개시내용의 수지상 세포는 일반적으로 무독성이고, 일반적으로 생명을 위협하는 부작용을 일으키지 않고 상대적으로 많은 양으로 생 세포로서 투여될 수 있다.
방법 중에는 규격품 방법이 포함된다. 일부 실시양태에서, 방법은 동결보존 전 또는 후에 대상체로부터 세포를 단리하고, 본원에 기재된 바와 같이 제조, 프로세싱, 배양하고, 이들을 동일한 환자에 재도입하는 것을 포함한다.
본원에 개시된 치료적 수지상 세포 집단의 투여는 암을 호전, 감소 또는 안정화시키는데 효과적인 세포의 농도를 초래하는 임의의 적합한 수단에 의한 것이다. 치료적 수지상 세포 집단은 비경구 (예를 들어, 피하, 정맥내, 근육내, 방광내, 종양내 또는 복강내) 투여 경로에 적합한 투여 형태로 제공될 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자가 동물 모델과 비교하여 인간에 대한 투여량을 변형시키는 것이 관련 기술분야에서 일상적임을 인식하는 바와 같이, 인간 투여량은 마우스 또는 비인간 영장류에 사용된 본원에 개시된 치료적 수지상 세포 집단의 양으로부터 외삽함으로써 초기에 결정된다. 예를 들어, 투여량은 용량당 약 1Х103, 1Х104, 1Х105, 1Х105, 1Х106, 1Х107, 1Х108, 1Х109 내지 약 1Х1011개 세포 또는 그 이상으로 달라질 수 있다.
"적합한 투여량 수준"은 약리학적 유효성과 해로운 효과 사이에 치료적으로 합리적인 균형을 제공하는 투여량 수준을 지칭한다 (예를 들어, 충분히 낮은 대식세포 자극 수준으로 본원에 개시된 투여된 수지상 세포에 의해 부여되는 충분한 면역자극 활성). 예를 들어, 이 투여량 수준은 예를 들어 특정 투여량 수준에서 면역원성 조성물 (본원에 개시된 수지상 세포를 포함함)의 투여 후에 생성된 항-면역원 항체의 대상체에서의 피크 또는 평균 혈청 수준과 관련될 수 있다.
본원에 정의된 바와 같이, 화합물 또는 작용제의 "치료 유효량" (즉, 유효 투여량)은 치료적으로 (예를 들어, 임상적으로) 바람직한 결과를 생성하기에 충분한 양을 의미한다. 조성물은 1일 1회 이상 내지 1주 1회 이상 (격일에 한 번 포함) 투여될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 질환 또는 장애의 중증도, 이전 치료, 대상체의 전반적인 건강 및/또는 연령, 및 존재하는 다른 질환을 포함하나 이에 제한되지는 않는 특정 인자가 대상체를 효과적으로 치료하는데 필요한 투여량 및 시기에 영향을 미칠 수 있음을 인식할 것이다. 더욱이, 본원에 개시된 생 수지상 세포의 치료 유효량을 사용한 대상체의 치료는 단일 치료 또는 일련의 치료를 포함할 수 있다.
본원에 개시된 치료적 수지상 세포 집단은 투여 형태, 제형으로 주사, 주입 또는 이식 (피하, 정맥내, 근육내, 종양내, 방광내, 복강내)에 의해, 또는 통상적인 무독성 제약상 허용되는 담체를 함유하는 적합한 전달 디바이스 또는 이식물을 통해 비경구적으로 투여된다. 이러한 담체의 제형 및 제제는 제약 제형의 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 제형은 상기 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy]에서 찾을 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "제약상 허용되는" 성분/담체 등은 합리적인 이익/위험 비율에 상응하는 과도한 유해 부작용 (예컨대 독성, 자극 및 알레르기 반응) 없이 인간 및/또는 동물에서 사용하기에 적합한 것이다.
치료적 수지상 세포 집단을 투여하는 것을 포함하는, 암 또는 이의 증상을 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 그러므로, 한 실시양태는 암을 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체를 치료하는 방법이다. 방법은 질환 또는 장애를 치료하도록 하는 조건 하에 질환 또는 장애 또는 이의 증상을 치료하기에 충분한 용량으로 본원에 개시된 치료적 수지상 세포 집단의 치료량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "유효량"은 치료적 또는 예방적 이익을 제공하는 양을 의미한다.
본원에서 사용된 용어로서 질환을 "치료한다"는 것은 대상체가 경험한 질환 또는 장애, 예를 들어 암의 적어도 하나의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
"치료"는 장애의 발병을 예방하거나 병리학 또는 증상을 변경할 의도로 수행되는 개입이다. 따라서, "치료"는 치료적 치료 및 예방적 또는 방지적 조치를 모두 지칭한다. "치료"는 또한 완화 처치로서 특정될 수 있다. 치료를 필요로 하는 사람들은 이미 장애를 가진 사람들 뿐만 아니라 장애를 예방해야 하는 사람들을 포함한다. 따라서, 상태, 장애 또는 병태의 "치료하는 것" 또는 "치료"는 하기를 포함할 수 있다: (1) 상태, 장애 또는 병태에 걸릴 수 있거나 걸리기 쉽지만 아직 상태, 장애 또는 병태의 임상적 또는 준임상적 증상을 경험하거나 나타내지 않는 인간 또는 다른 포유동물에서 발생하는 상태, 장애 또는 병태의 임상적 증상의 출현을 예방 또는 지연하는 것; (2) 상태, 장애 또는 병태를 억제하는 것, 즉, 질환의 발병 또는 이의 재발 (유지 치료의 경우) 또는 이의 적어도 하나의 임상적 또는 준임상적 증상을 저지, 감소 또는 지연시키는 것; 또는 (3) 질환을 경감시키는 것, 즉, 상태, 장애 또는 병태 또는 이의 임상적 또는 준임상적 증상 중 적어도 하나의 퇴행을 야기하는 것. 치료될 개체에 대한 이익은 통계적으로 유의하거나 적어도 환자 또는 의사가 인지할 수 있는 것이다.
그러므로, 암의 경우, "치료"는 하기를 포함할 수 있다: (1) 종양 크기 및/또는 수의 감소; (2) 순환 종양 세포의 수의 감소; (3) 전이 위험의 감소; (4) 암 발생 및/또는 재발 위험의 감소.
예를 들어 증상, 분자의 수준 또는 생물학적 활성 등의 "조정"은 예를 들어 검출가능하게 증가 또는 감소되는 증상 또는 활성 등을 지칭한다. 이러한 증가 또는 감소는 과다활성 DC로 치료되지 않은 대상체와 비교하여 치료된 대상체에서 관찰될 수 있으며, 여기서 치료되지 않은 대상체 (예를 들어, 아주반트 지질의 부재 하에 면역원이 투여된 대상체)는 치료된 대상체와 동일한 또는 유사한 질환 또는 감염을 갖거나 발병하는 대상체이다. 이러한 증가 또는 감소는 적어도 약 2%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300%, 400%, 500%, 1000% 또는 그 이상 또는 이들 값 중 임의의 2개 사이의 임의의 범위 이내일 수 있다. 조정은 주관적으로 또는 객관적으로, 예를 들어 대상체의 자기-평가에 의해, 임상의의 평가에 의해, 또는 예를 들어 대상체에서 본원에 개시된 투여된 수지상 세포에 의해 달성되는 면역자극의 정도 및/또는 질의 평가를 포함하여 적절한 검정 또는 측정을 수행함으로써 결정될 수 있다. 조정은 일시적, 연장된 또는 영구적일 수 있거나, 본원에 개시된 수지상 세포가 대상체에게 투여되거나 본원 또는 인용된 참고문헌에 기재된 검정 또는 다른 방법에서 사용되는 동안 또는 후에 관련 시간에, 예를 들어 하기 기재된 시간 내에, 또는 본원에 개시된 아주반트 지질의 투여 또는 사용 후 약 12시간 내지 24 또는 48시간, 내지 대상체(들)가 이러한 면역자극성 조성물/치료를 받은 후 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 21, 28일, 또는 1, 3, 6, 9개월 또는 그 이상 가변적일 수 있다.
본 개시내용은 면역 반응을 유도하는 방법을 포함한다. 일부 실시양태에서, 면역 반응은 적응 면역 반응이다.
일부 실시양태에서, 면역 반응은 치료적 면역 반응이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "치료적 면역 반응"은 표적 항원에 대한 표준 기술에 의해 측정된 바와 같은 체액성 및/또는 세포성 면역의 증가를 지칭한다. 바람직하게는, 표적 항원에 대한 유도된 면역 수준은 면역원 투여 전 수준의 적어도 4배, 및 바람직하게는 적어도 5배이다. 면역 반응은 또한 정성적으로 측정될 수 있으며, 여기서 적합한 시험관내 또는 생체내 검정에 의해, 대상체에서 신생물성 또는 감염성 질환의 진행의 저지 또는 관해는 치료적 면역 반응의 유도를 나타내는 것으로 간주된다.
본원의 방법은 대상체 (이러한 치료를 필요로 하는 것으로 식별된 대상체 포함)에게 유효량의 본원에 개시된 치료적 수지상 세포 집단을 투여하여 이러한 효과를 생성하는 것을 포함한다. 이러한 치료를 필요로 하는 대상체를 식별하는 것은 대상체 또는 의료 전문가의 판단에 달려 있을 수 있고, 주관적 (예를 들어, 의견) 또는 객관적 (예를 들어, 시험 또는 진단 방법에 의해 측정가능)일 수 있다.
본원에 개시된 치료 방법 (예방적 치료 포함)은 일반적으로 치료 유효량의 본원에 개시된 치료적 수지상 세포 집단을 포유동물, 특히 인간을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체 (예를 들어, 동물, 인간)에게 투여하는 것을 포함한다. 이러한 치료는 암 또는 이의 증상을 앓고 있거나 또는 이를 갖고 있거나 이에 걸리기 쉽거나 이에 대한 위험에 처한 대상체, 특히 인간에게 적합하게 투여될 것이다. "위험에 처한" 대상체의 결정은 대상체 또는 건강 관리 제공자의 진단 시험 또는 의견 (예를 들어, 유전자 시험, 효소 또는 단백질 마커, 마커 (본원에 정의된 바와 같음), 가족력 등)에 의한 임의의 객관적 또는 주관적 결정에 의해 이루어질 수 있다.
본 개시내용은 또한 치료 진행을 모니터링하는 방법을 제공한다. 방법은 암과 연관된 장애 또는 이의 증상을 앓고 있거나 이에 걸리기 쉬운 대상체에서 진단적 마커 (마커) (예를 들어, 본원의 화합물, 단백질 또는 이의 지표 등에 의해 조정되는 본원에 기술된 임의의 표적)의 수준 또는 진단적 측정 (예를 들어, 스크리닝, 검정)의 수준을 결정하는 단계를 포함하며, 여기서 대상체는 질환 또는 이의 증상을 치료하기에 충분한 본원의 화합물의 치료량을 투여받았다. 방법에서 결정된 마커의 수준은 건강한 정상 대조군 또는 다른 병든 환자에서 공지된 마커의 수준과 비교하여 대상체의 질환 상태를 확립할 수 있다. 일부 경우에, 대상체에서 마커의 제2 수준은 제1 수준의 결정보다 늦은 시점에 결정되고, 두 수준을 비교하여 질환의 경과 또는 요법의 효능을 모니터링한다. 특정 측면에서, 대상체에서 마커의 치료전 수준은 본원에 개시된 방법에 따라 치료를 시작하기 전에 결정되고; 그 후, 마커의 이러한 치료전 수준을 치료가 시작된 후 대상체의 마커의 수준과 비교하여 치료의 효능을 결정할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 치료적 수지상 세포 집단은 제약 조성물의 일부로서 투여된다.
일부 실시양태에서, 제약 조성물은 전신적으로 투여되며, 예를 들어 제약상 허용되는 완충액, 예컨대 생리 식염수로 제형화된다. 바람직한 투여 경로는 예를 들어 환자에서 조성물의 연속적, 지속적 또는 효과적인 수준을 제공하는 방광 내 점적주입, 피하, 정맥내, 복강내, 근육내, 종양내 또는 피내 주사를 포함한다. 인간 환자 또는 다른 동물의 치료는 생리학적으로 허용되는 담체에서 본원에서 식별된 치료제의 치료 유효량을 사용하여 수행된다. 적합한 담체 및 이들의 제형은 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences by E. W. Martin]에 기재되어 있다. 투여되는 치료제의 양은 투여 방식, 환자의 연령 및 체중, 및 암의 임상적 증상에 따라 달라진다. 일반적으로, 양은 암과 연관된 다른 질환의 치료에 사용되는 다른 작용제에 사용되는 양의 범위 내에 있을 것이지만, 특정 경우에 화합물의 증가된 특이성으로 인해 더 적은 양이 필요할 것이다. 생 수지상 세포는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의해 결정된 바와 같이 대상체의 면역 반응을 증진시키거나, 신생물 또는 감염된 세포의 증식, 생존 또는 침습성을 감소시키는 투여량으로 투여된다.
본원에 개시된 치료적 수지상 세포 집단을 포함하는 조성물은 피부로, 피하로, 정맥내로, 근육내로, 비경구적으로, 폐내로, 질내로, 직장내로, 비강으로 또는 국소로 투여될 수 있다. 조성물은 주사에 의해, 경구로, 에어로졸 또는 입자 충격에 의해 전달될 수 있다.
본원에 개시된 치료적 수지상 세포 집단의 제약 조성물은 투여 지침과 함께 키트, 컨테이너, 팩 또는 디스펜서에 포함될 수 있다.
조합 요법
본원에서 사용된 바와 같이, 대상체에 대한 요법의 투여의 맥락에서 용어 "조합하여"는 치료적 이익을 위한 하나 초과의 요법의 사용을 지칭한다. 투여의 맥락에서 용어 "조합하여"는 또한 적어도 하나의 추가 요법과 함께 사용될 때 대상체에 대한 요법의 예방적 사용을 지칭할 수 있다. 용어 "조합하여"의 사용은 요법 (예를 들어, 제1 및 제2 요법)이 대상체에게 투여되는 순서를 제한하지 않는다. 요법은 암을 가졌거나 갖고 있거나 암에 걸리기 쉬운 대상체에게 제2 요법의 투여 전에 (예를 들어, 1분, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 전에), 이와 동시에, 또는 후에 (예를 들어, 1분, 5분, 15분, 30분, 45분, 1시간, 2시간, 4시간, 6시간, 12시간, 24시간, 48시간, 72시간, 96시간, 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 8주, 또는 12주 후에) 투여될 수 있다. 요법은 요법이 함께 작용할 수 있도록 순서대로 및 시간 간격 내에서 대상체에게 투여된다. 특정 실시양태에서, 요법은 다른 방식으로 투여되는 경우보다 증가된 이익을 제공하도록 순서대로 및 시간 간격 내에서 대상체에게 투여된다. 임의의 추가 요법은 다른 추가 요법과 함께 임의의 순서로 투여될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "암 요법"은 암 치료에 유용한 요법을 지칭한다. 항암 치료제의 예는 예를 들어 수술, 화학요법제, 면역요법, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용되는 작용제, 항혈관신생제, 세포자멸제, 항튜불린제, 및 암을 치료하기 위한 다른 작용제, 예컨대 항-HER-2 항체 (예를 들어, 허셉틴™), 항-CD20 항체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 길항제 (예를 들어, 티로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제 (예를 들어, 엘로티닙 (타쎄바™)), 혈소판 유래 성장 인자 억제제 (예를 들어, 글리벡™ (이매티닙 메실레이트)), COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브), 인터페론, 시토카인, 하기 표적 ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA 또는 VEGF 수용체(들), TRAIL/Apo2 중 하나 이상에 결합하는 길항제 (예를 들어, 중화 항체), 및 기타 생물활성 및 유기 화학 작용제 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 이들의 조합이 또한 본원에 기재된 방법과 함께 사용하기 위해 고려된다.
대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법의 일부 실시양태는 항암제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항암제는 화학요법제이다. 일부 실시양태에서, 항암제는 면역 체크포인트 조정제이다.
항암제: 특정 실시양태에서, 방법은 항암제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항암제는 화학요법제 또는 성장 억제제, 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포, 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 항체-약물 접합체, 혈관신생 억제제, 및 이들의 조합이다.
일부 실시양태에서, 항암제는 화학요법제 또는 성장 억제제이다. 예를 들어, 화학요법제 또는 성장 억제제는 알킬화제, 안트라사이클린, 항호르몬제, 아로마타제 억제제, 항안드로겐, 단백질 키나제 억제제, 지질 키나제 억제제, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 항대사물질, 토포이소머라제 억제제, 세포독성제 또는 항종양 항생제, 프로테아좀 억제제, 항미세소관제, EGFR 길항제, 레티노이드, 티로신 키나제 억제제, 히스톤 데아세틸라제 억제제, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화합물이다. 화학요법제의 예는 엘로티닙 (타쎄바™, 제넨텍(Genentech)/오에스아이 팜.(OSI Pharm.)), 보르테조밉 (벨케이드™, 밀레니엄 팜.(Millennium Pharm.)), 풀베스트란트 (파슬로덱스™, 아스트라제네카), 수텐트 (SU11248, 화이자), 레트로졸 (페마라™, 노바티스), 이매티닙 메실레이트 (글리벡™, 노바티스), PTK787/ZK 222584 (노바티스), 옥살리플라틴 (엘록사틴™, 사노피), 5-FU (5-플루오로우라실), 류코보린, 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨™, 와이어스), 라파티닙 (GSK572016, 글락소스미스클라인), 로나파닙 (SCH 66336), 소라페닙 (BAY43-9006, 바이엘 랩스.), 및 게피티니브 (이레사™, 아스트라제네카), AG1478, AG1571 (SU 5271; 수겐), 알킬화제, 예컨대 티오테파 및 사이톡산™ 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트, 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸로멜라민을 포함하는 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도즈치신, 카르즈치신 및 비즈치신 합성 유사체 포함); 크립토피신 (특히 크립토피신 1 및 크립토피신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕틴; 스폰지스타틴; 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제, 예컨대 엔디인 항생제 (예를 들어, 칼리케아마이신, 특히 칼리케아마이신 γ1 및 칼리케아마이신 오메가 1 (Angew Chem. Intl. Ed. Engl. (1994) 33:183-186); 디네마이신 A를 포함하는 디네마이신; 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트; 에스페라마이신; 뿐만 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 발색단백질 엔디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 안트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신™ 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 퀘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 튜베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물질, 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-아드레날, 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충제, 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드, 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미토산트론; 모피다몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로소산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK™ 폴리사카라이드 복합체 (JHS 내츄럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 미국 오리건주 유진); 라족산; 리족신; 시조푸란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안귀딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미톨락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 탁솔™ 파클리탁셀 (브리스톨-마이어스 스퀴브 온콜로지, 미국 뉴저지주 프린스턴), 파클리탁셀의 아브락산™ 크레모포르-비함유, 알부민-조작된 나노입자 제형 (아메리칸 파마슈티칼 파트너스(American Pharmaceutical Partners), 미국 일리노이주 샴버그), 및 탁소텔™ 독세탁셀 (롱-프랑 로리(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 엉또니); 클로람부실; 젬자™ 젬시타빈; 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미토산트론; 빈크리스틴; 나벨빈™ 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 젤로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드, 예컨대 레틴산; 카페시타빈; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 알킬화제 (일관능성 및 이관능성 알킬화제 포함), 예컨대 티오테파, 사이톡산™ 시클로포스파미드, 질소 머스타드, 예컨대 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비킨, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아, 예컨대 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 테모졸로마이드; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 및 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 안트라사이클린, 예컨대 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 이다루비신, 미토산트론, 발루비신, 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 및 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 항호르몬제, 예컨대 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조정제 (SERM) (예를 들어 타목시펜 (놀바덱스™; 타목시펜 시트레이트 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 아이오독시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 파레스톤™ (토레미펜 시트레이트) 포함); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 및 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 부신에서 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예컨대, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가스™ (메게스트롤 아세테이트), 아로마신™ (엑스메스탄; 화이자), 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르™ (보로졸), 페마라™ (레트로졸; 노바티스), 및 아리미덱스™ (아나스트로졸; 아스트라제네카); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 및 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 항안드로겐, 예컨대 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린; 부세렐린, 트립토렐린, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 디에틸스틸베스트롤, 프레마린, 플루옥시메스테론, 올 트랜스 레틴산, 펜레티니드, 뿐만 아니라 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 및 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 단백질 키나제 억제제, 지질 키나제 억제제, 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 예를 들어 PKC-알파, Ralf 및 H-Ras와 같은 비정상적인 세포 증식에 연루된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것들을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 리보자임, 예컨대 VEGF 발현 억제제 (예를 들어, 안지오자임™) 및 HER2 발현 억제제를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 세포독성제 또는 항종양 항생제, 예컨대 닥티노마이신, 악티노마이신, 블레오마이신, 플리카마이신, 미토마이신, 예컨대 미토마이신 C, 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 및 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 프로테아좀 억제제, 예컨대 보르테조밉 (벨케이드™, 밀레니엄 팜.), 에폭소마이신, 예컨대 카르필조밉 (키프롤리스™, 오닉스 팜.(Onyx Pharm.)), 마리조밉 (NPI-0052), MLN2238, CEP-18770, 오프로조밉, 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 및 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 항미세소관제, 예컨대 빈크리스틴, 빈블라스틴, 빈데신 및 비노렐빈을 포함하는 빈카 알칼로이드; 파클리탁셀 및 도세탁셀을 포함하는 탁산; 포도필로톡신; 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 및 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 "EGFR 길항제"를 포함할 수 있으며, 이는 EGFR에 결합하거나 그렇지 않으면 이와 직접 상호작용하고 이의 신호전달 활성을 예방하거나 감소시키는 화합물을 지칭하고, 대안적으로 "EGFR i"로 지칭된다. 이러한 작용제의 예는 EGFR에 결합하는 항체 및 소분자를 포함한다. EGFR에 결합하는 항체의 예는 MAb 579 (ATCC CRL HB 8506), MAb 455 (ATCC CRL HB8507), MAb 225 (ATCC CRL 8508), MAb 528 (ATCC CRL 8509) (미국 특허 번호 4,943,533 (Mendelsohn et al.) 참조) 및 이의 변이체, 예컨대 키메라화된 225 (C225 또는 세툭시맙; 얼비툭스) 및 재성형된 인간 225 (H225) (WO 96/40210, 임클론 시스템스 인크.(Imclone Systems Inc.) 참조); IMC-11F8, 완전한 인간, EGFR-표적화 항체 (임클론); 유형 II 돌연변이체 EGFR에 결합하는 항체 (미국 특허 번호 5,212,290); 미국 특허 번호 5,891,996에 기재된 바와 같은 EGFR에 결합하는 인간화 및 키메라 항체; 및 EGFR에 결합하는 인간 항체, 예컨대 ABX-EGF 또는 파니투무맙 (WO98/50433, 앱제닉스/암젠 참조); EMD 55900 (Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)); EGFR 결합에 대해 EGF 및 TGF-알파 둘 모두와 경쟁하는 EGFR에 대한 EMD7200 (마투주맙) 인간화 EGFR 항체 (EMD/머크); 인간 EGFR 항체, HuMax-EGFR (젠맵); E1.1, E2.4, E2.5, E6.2, E6.4, E2.11, E6.3 및 E7.6.3으로 공지되고 미국 특허 번호 6,235,883에 기재된 완전한 인간 항체; MDX-447 (메다렉스 인크); 및 mAb 806 또는 인간화 mAb 806 (Johns et al., J. Biol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004))을 포함한다. 항-EGFR 항체는 세포독성제와 접합되어 면역접합체를 생성할 수 있다 (예를 들어 EP659439A2, 머크 패턴트 게엠베하(Merck Patent GmbH) 참조). EGFR 길항제는 미국 특허 번호 5,616,582, 5,457,105, 5,475,001, 5,654,307, 5,679,683, 6,084,095, 6,265,410, 6,455,534, 6,521,620, 6,596,726, 6,713,484, 5,770,599, 6,140,332, 5,866,572, 6,399,602, 6,344,459, 6,602,863, 6,391,874, 6,344,455, 5,760,041, 6,002,008, 및 5,747,498, 뿐만 아니라 하기 PCT 공개: WO98/14451, WO98/50038, WO99/09016, 및 WO99/24037에 기재된 화합물과 같은 소분자를 포함한다. 특정 소분자 EGFR 길항제는 OSI-774 (CP-358774, 엘로티닙, 타쎄바™ 제넨텍/오에스아이 파마슈티칼스); PD 183805 (CI 1033, 2-프로펜아미드, N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[3-(4-모르폴리닐)프로폭시]-6-퀴나졸리닐]-, 디히드로클로라이드, 화이자 인크.); ZD1839, 게피티니브 (이레사™) 4-(3'-클로로-4'-플루오로아닐리노)-7-메톡시-6-(3-모르폴리노프로폭시)퀴나졸린, 아스트라제네카); ZM 105180 ((6-아미노-4-(3-메틸페닐-아미노)-퀴나졸린, 제네카); BIBX-1382 (N8-(3-클로로-4-플루오로-페닐)-N2-(1-메틸-피페리딘-4-일)-피리미도[5,4-- d]피리미딘-2,8-디아민, 베링거 인겔하임); PKI-166 ((R)-4-[4-[(1-페닐에틸)아미노]-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀)- ; (R)-6-(4-히드록시페닐)-4-[(1-페닐에틸)아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘); CL-387785 (N-[4-[(3-브로모페닐)아미노]-6-퀴나졸리닐]-2-부틴아미드); EKB-569 (N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-3-시아노-7-에톡시-6-퀴놀리닐]-4-(- 디메틸아미노)-2-부텐아미드) (와이어스); AG1478 (화이자); AG1571 (SU 5271; 화이자); 이중 EGFR/HER2 티로신 키나제 억제제, 예컨대 라파티닙 (타이커브™, GSK572016 또는 N-[3-클로로-4-[(3 플루오로페닐)메톡시]페닐]-6[5[[[2메틸술포닐)에틸]아미노]메틸]-2-- 푸라닐]-4-퀴나졸린아민)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 하기를 포함할 수 있다: 이전 단락에서 언급된 EGFR-표적화 약물을 포함하는 티로신 키나제 억제제; 소분자 HER2 티로신 키나제 억제제, 예컨대 타케다로부터 입수가능한 TAK165; ErbB2 수용체 티로신 키나제의 경구 선택적 억제제인 CP-724,714 (화이자 및 OSI); 이중-HER 억제제, 예컨대 EGFR에 우선적으로 결합하지만 HER2 및 EGFR-과발현 세포 둘 모두를 억제하는 EKB-569 (와이어스로부터 입수가능함); 경구 HER2 및 EGFR 티로신 키나제 억제제인 라파티닙 (GSK572016; 글락소-스미스클라인으로부터 입수가능함); PKI-166 (노바티스로부터 입수가능함); 범-HER 억제제, 예컨대 카너티닙 (CI-1033; 파마시아(Pharmacia)); Raf-1 신호전달을 억제하는 Raf-1 억제제, 예컨대 ISIS 파마슈티칼스(ISIS Pharmaceuticals)로부터 입수가능한 안티센스 작용제 ISIS-5132; 비-HER 표적화된 TK 억제제, 예컨대 이매티닙 메실레이트 (글리벡™, 글락소 스미스클라인으로부터 입수가능함); 다중-표적화 티로신 키나제 억제제, 예컨대 수니티닙 (수텐트™, 화이자로부터 입수가능함); VEGF 수용체 티로신 키나제 억제제, 예컨대 바탈라닙 (PTK787/ZK222584, 노바티스/쉐링 아게로부터 입수가능함); MAPK 세포외 조절된 키나제 I 억제제 CI-1040 (파마시아로부터 입수가능함); 퀴나졸린, 예컨대 PD 153035, 4-(3-클로로아닐리노) 퀴나졸린; 피리도피리미딘; 피리미도피리미딘; 피롤로피리미딘, 예컨대 CGP 59326, CGP 60261 및 CGP 62706; 피라졸로피리미딘, 4-(페닐아미노)-7H-피롤로[2,3-d] 피리미딘; 커큐민 (디페룰로일 메탄, 4,5-비스(4-플루오로아닐리노)프탈이미드); 니트로티오펜 모이어티를 함유하는 티르포스틴; PD-0183805 (워너-램버트); 안티센스 분자 (예를 들어, HER-코딩 핵산에 결합하는 것들); 퀴녹살린 (미국 특허 번호 5,804,396); 티르포스틴 (미국 특허 번호 5,804,396); ZD6474 (아스트라 제네카); PTK-787 (노바티스/쉐링 아게); 범-HER 억제제, 예컨대 CI-1033 (화이자); 아피니탁 (ISIS 3521; Isis/릴리); 이매티닙 메실레이트 (글리벡™); PKI 166 (노바티스); GW2016 (글락소 스미스클라인); CI-1033 (화이자); EKB-569 (와이어스); 세막시닙 (화이자); ZD6474 (아스트라제네카); PTK-787 (노바티스/쉐링 아게); INC-1C11 (임클론), 라파마이신 (시롤리무스, 라파뮨™); 또는 하기 특허 공개 중 임의의 것에 기재된 바와 같음: 미국 특허 번호 5,804,396; WO 1999/09016 (아메리칸 사이안아미드(American Cyanamid)); WO 1998/43960 (아메리칸 사이안아미드); WO 1997/38983 (워너 램버트); WO 1999/06378 (워너 램버트); WO 1999/06396 (워너 램버트); WO 1996/30347 (화이자, 인크); WO 1996/33978 (제네카); WO 1996/3397 (제네카) 및 WO 1996/33980 (제네카).
일부 실시양태에서, 화학요법제는 레티노이드, 예컨대 레틴산 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 및 유도체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 항대사물질을 포함할 수 있다. 항대사물질의 예는 엽산 유사체 및 항엽산, 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예컨대 5-플루오로우라실 (5-FU), 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 뉴클레오시드 유사체; 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 토포이소머라제 억제제를 포함할 수 있다. 토포이소머라제 억제제의 예는 토포이소머라제 1 억제제, 예컨대 루토테칸™ 및 아바렐릭스™ rmRH; 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 에토포시드 및 블레오마이신; 및 토포이소머라제 억제제 RFS 2000을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학요법제는 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제, 예컨대 보리노스타트, 로미뎁신, 벨리노스타트, 모세티노스타트, 발프로산, 파노비노스타트, 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 및 유도체를 포함할 수 있다.
화학요법제는 또한 하기를 포함할 수 있다: 히드로코르티손, 히드로코르티손 아세테이트, 코르티손 아세테이트, 틱소코르톨 피발레이트, 트리암시놀론 아세토나이드, 트리암시놀론 알콜, 모메타손, 암시노나이드, 부데소나이드, 데소나이드, 플루오시노나이드, 플루오시놀론 아세토나이드, 베타메타손, 베타메타손 인산나트륨, 덱사메타손, 덱사메타손 인산나트륨, 플루오코르톨론, 히드로코르티손-17-부티레이트, 히드로코르티손-17-발레레이트, 아클로메타손 디프로피오네이트, 베타메타손 발레레이트, 베타메타손 디프로피오네이트, 프레드니카르베이트, 클로베타손-17-부티레이트, 클로베타솔-17-프로피오네이트, 플루오코르톨론 카프로에이트, 플루오코르톨론 피발레이트 및 플루프레드니덴 아세테이트; 면역 선택적 항염증성 펩티드 (ImSAID), 예컨대 페닐알라닌-글루타민-글리신 (FEG) 및 이의 D-이성질체 형태 (feG) (이뮬란 바이오테라퓨틱스, 엘엘씨(IMULAN BioTherapeutics, LLC)); 항-류마티스 약물, 예컨대 아자티오프린, 시클로스포린 (시클로스포린 A), D-페니실라민, 금 염, 히드록시클로로퀸, 레플루노미드미노사이클린, 설파살라진, 종양 괴사 인자 알파 (TNFα) 차단제, 예컨대 에타너셉트 (엔브렐), 인플릭시맙 (레미케이드), 아달리무맙 (휴미라), 세르톨리주맙 페골 (심지아), 골리무맙 (심퍼니), 인터류킨 1 (IL-1) 차단제, 예컨대 아나킨라 (키너렛), T 세포 공동자극 차단제, 예컨대 아바타셉트 (오렌시아), 인터류킨 6 (IL-6) 차단제, 예컨대 토실리주맙 (악템라™); 인터류킨 13 (IL-13) 차단제, 예컨대 레브리키주맙; 인터페론 알파 (IFN) 차단제, 예컨대 론탈리주맙; 베타 7 인테그린 차단제, 예컨대 rhuMAb 베타7; IgE 경로 차단제, 예컨대 항-M1 프라임; 분비된 동종삼량체성 LTa3 및 막 결합된 이종삼량체 LTa1/β2 차단제, 예컨대 항-림프독소 알파 (LTa); 방사성 동위원소 (예를 들어, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 212Bi, 32P, 212Pb 및 Lu의 방사성 동위원소); 기타 연구용 작용제, 예컨대 티오플라틴, PS-341, 페닐부티레이트, ET-18-OCH3, 또는 파르네실 트랜스퍼라제 억제제 (L-739749, L-744832); 폴리페놀, 예컨대 퀘르세틴, 레스베라트롤, 피세아탄놀, 에피갈로카테킨 갈레이트, 테아플라빈, 플라바놀, 프로시아니딘, 베툴린산 및 이의 유도체; 자가포식 억제제, 예컨대 클로로퀸; 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, 마리놀™); 베타-라파콘; 라파콜; 콜히친; 베툴린산; 아세틸캄프토테신, 스코폴레틴, 및 9-아미노캄프토테신); 포도필로톡신; 테가푸르 (UFTORAL™); 벡사로텐 (타그레틴™); 비스포스포네이트, 예컨대 클로드로네이트 (예를 들어, 보네포스™ 또는 오스탁™), 에티드로네이트 (디드로칼™), NE-58095, 졸레드론산/졸레드로네이트 (조메타™), 알렌드로네이트 (포사맥스™), 파미드로네이트 (아레디아™), 틸루드로네이트 (스켈리드™), 또는 리세드로네이트 (악토넬™); 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R); 백신, 예컨대 테라토프™ 백신; 페리포신, COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브 또는 에토리콕시브), 프로테아솜 억제제 (예를 들어, PS341); CCI-779; 티피파르닙 (R11577); 오라페닙, ABT510; Bcl-2 억제제, 예컨대 오블리머센 나트륨 (제나센스™); 픽산트론; 파르네실트랜스퍼라제 억제제, 예컨대 로나파닙 (SCH 6636, 사라사르™); 및 상기 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체; 뿐만 아니라 상기 중 둘 이상의 조합, 예컨대 CHOP, 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 조합된 요법에 대한 약어; 및 FOLFOX, 5-FU 및 류코보린과 조합된 옥살리플라틴 (엘록사틴™)을 사용한 치료 요법에 대한 약어.
화학요법제는 또한 진통, 해열 및 항염증 효과를 갖는 비스테로이드성 항염증성 약물을 포함할 수 있다. NSAID는 효소 시클로옥시게나제의 비-선택적 억제제를 포함한다. NSAID의 특정 예는 아스피린, 프로피온산 유도체, 예컨대 이부프로펜, 페노프로펜, 케토프로펜, 플루르비프로펜, 옥사프로진 및 나프록센, 아세트산 유도체, 예컨대 인도메타신, 설린닥, 에토돌락, 디클로페낙, 에놀산 유도체, 예컨대 피록시캄, 멜록시캄, 테녹시캄, 드록시캄, 로녹시캄 및 이속시캄, 페남산 유도체, 예컨대 메페남산, 메클로페남산, 플루페남산, 톨페남산, 및 COX-2 억제제, 예컨대 셀레콕시브, 에토리콕시브, 루미라콕시브, 파레콕시브, 로페콕시브, 로페콕시브, 및 발데콕시브를 포함한다. NSAID는 류마티스성 관절염, 골관절염, 염증성 관절병증, 강직성 척추염, 건선성 관절염, 라이터 증후군, 급성 통풍, 월경통, 전이성 골 통증, 두통 및 편두통, 수술후 통증, 염증 및 조직 손상으로 인한 경증 내지 중등도 통증, 발열, 장폐색증, 및 신장 산통과 같은 병태의 증상 경감으로 표시될 수 있다.
면역 체크포인트 조정: 특정 실시양태에서, 면역 체크포인트 조정제는 과다활성화된 수지상 세포와 함께 공동-투여된다. 면역 체크포인트는 자기-관용을 유지하고 생리학적 면역 반응의 지속시간 및 진폭을 조정하는 역할을 하는 면역 시스템의 억제 경로를 지칭한다.
특정 암 세포는 특히 종양 항원에 대해 특이적인 T 세포와 관련하여 면역 저항성의 주요 메커니즘으로서 면역 체크포인트 경로를 이용함으로써 번성한다. 예를 들어, 특정 암 세포는 세포독성 T 세포 반응을 억제하는 역할을 하는 하나 이상의 면역 체크포인트 단백질을 과발현할 수 있다. 그러므로, 면역 체크포인트 조정제는 억제 신호를 극복하고 암 세포에 대한 면역 공격을 허용 및/또는 증대하기 위해 투여될 수 있다. 면역 체크포인트 조정제는 음성 면역 반응 조절인자 (예를 들어, CTLA4)에 의한 신호전달을 감소, 억제 또는 폐지함으로써 암 세포에 대한 면역 세포 반응을 용이하게 할 수 있거나, 면역 반응의 양성 조절인자 (예를 들어, CD28)의 신호전달을 자극 또는 증진시킬 수 있다.
면역 체크포인트 조정제로 표적화된 면역요법제는 암 세포를 표적화하는 면역 공격을 장려하기 위해 투여될 수 있다. 면역요법제는 면역 체크포인트 조정제를 표적화하는 (예를 들어, 이에 대해 특이적인) 항체 작용제이거나 또는 이를 포함할 수 있다. 면역요법제의 예는 CTLA-4, PD-1, PD-L1, GITR, OX40, LAG-3, KIR, TIM-3, CD28, CD40; 및 CD137 중 하나 이상을 표적화하는 항체 작용제를 포함한다. 항체 작용제의 특정 예는 모노클로날 항체를 포함할 수 있다. 면역 체크포인트 조정제를 표적화하는 특정 모노클로날 항체가 이용가능하다. 예를 들어, 이필리무맙은 CTLA-4를 표적화하고; 트레멜리무맙은 CTLA-4를 표적화하고; 펨브롤리주맙은 PD-1 등을 표적화한다.
프로그램화된 사멸 1 (PD-1) 단백질은 T 세포 조절인자의 연장된 CD28/CTLA-4 패밀리의 억제성 구성원이다 (Okazaki et al. (2002) Curr Opin Immunol 14: 391779-82; Bennett et al. (2003) J. Immunol. 170:711-8). CD28 패밀리의 다른 구성원은 CD28, CTLA-4, ICOS 및 BTLA를 포함한다. PD-1에 대한 2개의 세포 표면 당단백질 리간드인 프로그램 사멸 리간드 1 (PD-L1) 및 프로그램 사멸 리간드 2 (PD-L2)가 식별되었다. PD-L1 및 PD-L2는 PD-1에 결합시 T 세포 활성화 및 시토카인 분비를 하향조절하는 것으로 나타났다 (Freeman et al. (2000) J Exp Med 192:1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2:261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32:634-43; Ohigashi et al. (2005) Clin Cancer Res 11:2947-53).
PD-L1 (분화 클러스터 274 (CD274) 또는 B7 상동체 1 (B7-H1)로도 공지됨)은 40 kDa 유형 1 막횡단 단백질이다. PD-L1은 활성화된 T 세포, B 세포, 및 골수성 세포에서 발견되는 이의 수용체인 PD-1에 결합하여 활성화 또는 억제를 조정한다. PD-L1 및 PD-L2 둘 모두는 PD-1에 결합하지만 CD28 또는 CTLA-4에는 결합하지 않는 B7 상동체이다 (Blank et al. (2005) Cancer Immunol Immunother. 54:307-14). PD-L1의 T 세포 상의 이의 수용체 PD-1과의 결합은 IL-2 생산 및 T 세포 증식의 TCR-매개 활성화를 억제하는 신호를 전달한다. 메커니즘은 ZAP70 인산화의 억제 및 CD3.제타와의 이의 연관성을 포함한다. (Sheppard et al. (2004) FEBS Lett. 574:37-41). PD-1 신호전달은 전사 인자 NF-κB 및 AP-1의 활성화 및 IL-2의 생성에 필요한 TCR 신호전달로 인한 PKC-θ 활성화 루프 인산화를 약독화시킨다. PD-L1은 또한 공동자극 분자 CD80 (B7-1)에 결합하지만 CD86 (B7-2)에는 결합하지 않는다 (Butte et al. (2008) Mol Immunol. 45:3567-72).
세포 표면 상의 PD-L1의 발현은 IFN-γ 자극제를 통해 상향조절되는 것으로 나타났다. PD-L1 발현은 인간 폐, 난소 및 결장 암종 및 다양한 골수종을 비롯한 많은 암에서 발견되었으며, 종종 불량한 예후와 연관된다 (Iwai et al. (2002) PNAS 99:12293-7; Ohigashi et al. (2005) Clin Cancer Res 11:2947-53; Okazaki et al. (2007) Intern. Immun. 19:813-24; Thompson et al. (2006) Cancer Res. 66:3381-5). PD-L1은 항원-특이적 T-세포 클론의 세포자멸을 증가시킴으로써 종양 면역에서 역할을 하는 것으로 제안되었다 (Dong et al. (2002) Nat Med 8:793-800). 또한, PD-L1이 장 점막 염증에 관여할 수 있고 PD-L1의 억제가 대장염과 연관된 소모성 질환을 저해한다는 것이 제안되었다 (Kanai et al. (2003) J Immunol 171:4156-63).
예시적인 항-PD1 항체는 펨브롤리주맙 (MK-3475, 머크), 니볼루맙 (BMS-936558, 브리스톨-마이어스 스퀴브), 및 피딜리주맙 (CT-011, 큐어테크 리미티드(Curetech LTD))을 포함한다. 항-PD1 항체는 예를 들어 압캠(ABCAM)™ (AB137132), 바이오레전드(BIOLEGEND)™ (EH12.2H7, RMP1-14) 및 어피메트릭스 이바이오사이언스(Affymetrix Ebioscience) (J105, J116, MIH4)로부터 상업적으로 이용가능하다.
본 개시내용의 실행은 달리 표시되지 않는 한, 관련 기술분야의 기술 내에 있는 화학, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA, 유전학, 면역학, 세포 생물학, 세포 배양 및 트랜스제닉 생물학의 통상적인 기술을 사용한다. 예를 들어 하기를 참조한다: Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Sambrook and Russell, 2001, Molecular Cloning, 3rd Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Ausubel et al., 1992), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, including periodic updates); Glover, 1985, DNA Cloning (IRL Press, Oxford); Anand, 1992; Guthrie and Fink, 1991; Harlow and Lane, 1988, Antibodies, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.); Jakoby and Pastan, 1979; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Riott, Essential Immunology, 6th Edition, Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1988; Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986); Westerfield, M., The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio), (4th Ed., Univ. of Oregon Press, Eugene, 2000).
유전자: 본원에 개시된 모든 유전자, 유전자 명칭 및 유전자 생성물은 본원에 개시된 조성물 및 방법이 적용가능한 임의의 종으로부터의 상동체에 상응하는 것으로 의도된다. 특정 종으로부터의 유전자 또는 유전자 생성물이 개시된 경우, 본 개시내용은 단지 예시적인 것으로 의도되고, 그것이 나타나는 문맥이 명백하게 나타내지 않는 한 제한으로 해석되어서는 안됨을 이해해야 한다. 그러므로, 예를 들어 본원에 개시된 유전자 또는 유전자 생성물의 경우, 다른 종으로부터의 상동성 및/또는 오르토로거스 유전자 및 유전자 생성물을 포함하는 것으로 의도된다.
범위: 본 개시내용 전반에 걸쳐, 본 개시내용의 다양한 측면이 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 기재는 단지 편의 및 간결함을 위한 것이며 본 청구범위의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위의 기재는 모든 가능한 하위범위 뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 범위, 예컨대 1 내지 6의 기재는 하위범위, 예컨대 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 숫자, 예를 들어 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
본원에 제공된 임의의 조성물 또는 방법은 본원에 제공된 임의의 다른 조성물 및 방법 중 하나 이상과 조합될 수 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 등가인 방법 및 재료가 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 하기 기재되어 있다. 본원에 개시된 발명의 원리의 변형은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이루어질 수 있고 이러한 변형은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 의도되는 것으로 이해되고 예상되어야 한다.
실시예
본 발명은 청구범위에 기재된 본 발명의 범위를 제한하지 않는 하기 실시예에서 추가로 설명된다.
실시예 1: 과다활성 수지상 세포는 복합체 항원 혼합물에 대한 지속가능한 항종양 면역을 자극한다
보호 면역을 자극하는 이상적인 전략은 활성화된 및 파이롭토시스 DC의 이익을 조합하여, 이에 의해 활성화된 세포가 생존력을 유지하면서 IL-1β를 방출하는 능력을 갖는 것이다. 본 발명자들은 최근 이들 속성을 나타내는 DC의 새로운 활성화 상태를 식별하였다. DC가 PAMP (예를 들어, TLR 리간드) 및 죽어가는 세포로부터 방출된 산화된 인지질 집합 (DAMP)에 노출된 경우, 세포는 "과다활성화"의 장기 상태를 달성한다 (I. Zanoni, et al. Science, vol. 352, no. 6290, pp. 1232-1236, 2016; I. Zanoni, et al. Immunity, vol. 47, no. 4, p. 697-709.e3, 2017). 산화된 지질 집합은 oxPAPC (산화된 1-팔미토일-2-아라키도닐-sn-글리세로-3-포스포릴콜린)로 공지되어 있다. 과다활성 DC는 시토카인 방출 (예를 들어, TNFα)의 면에서 활성화된 DC의 활성을 나타내지만, 며칠 동안 IL-1β도 방출하는 능력을 얻었다. "과다활성" DC로서의 이들의 할당과 일치하여, 이들 세포는 모델 항원에 대한 T 세포 반응을 자극하는 이들의 능력의 면에서 이들의 활성화된 대응물보다 우수하다.
DC의 과다활성 상태의 근본적인 메커니즘이 정의되었으며, 이는 문제의 DAMP (oxPAPC)가 시토졸 PRR 카스파제-11에 결합하고 이를 자극할 수 있기 때문이다 (I. Zanoni, et al. 2016). 카스파제-11 자극제는 NLRP3의 활성화 및 파이롭토시스를 유발하지 않지만 오히려 생 세포로부터 IL-1β의 방출을 유발하는 인플라마좀의 어셈블리를 초래한다. 과다활성 세포로부터의 IL-1β 방출은 이들 시토카인의 분비를 위한 도관 역할을 하는 기공 형성 단백질 가스더민 D에 의해 매개된다 (C. L. Evavold, et al. Immunity, 2018 Jan 16;48(1):35-44.e6.; X. Liu, et al. Nature, vol. 535, no. 7610, pp. 153-158, 2016; R. A. Aglietti, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 113, no. 28, pp. 7858-63, Jul. 2016; N. Kayagaki, et al. Nature, vol. 526, no. 7575, pp. 666-671, Sep. 2015). 세포 생존력을 보장하는 방식으로 가스더민 D 기공을 제거하기 위해 원형질막이 복구되는 것으로 생각되는 반면 (S. Ruehl, et al. Science, vol. 362, no. 6417, pp. 956-960, Nov. 2018), 다른 경우에 (알룸 자극제) 막 복구 경로가 압도될 수 있으며 파이롭토시스가 뒤따른다. IL-1β가 생 세포로부터 어떻게 방출될 수 있는지에 대한 메커니즘에 대한 이러한 통찰력에도 불구하고, 적응 면역의 지시의 면에서 과다활성 세포 상태의 생리학적 이익은 제대로 정의되지 않았다.
재료 및 방법
마우스 균주 및 종양 세포주: C57BL/6J (Jax 000664), 카스파제-1/-11 dKO 마우스 (Jax 016621), NLRP3KO (Jax 021302), Casp11KO (Jax 024698), OT-I (Jax 003831) 및 OT-II (Jax 004194) 및 BALB/c (Jax 000651) 마우스를 잭슨 랩스(Jackson Labs)로부터 구입하였다. C57BL/6J의 동계 종양 모델의 경우, 2개의 흑색종 세포주를 사용하였다. 모 세포주: B16.F10 및 OVA 발현 세포주: B16.F10OVA. 동계 결장직장 모델의 경우, C57BL6 뮤린 결장 선암종 세포로부터 유래된 OVA를 발현하는 MC-38 세포주를 사용하였다. 이들 세포주는 알린 샤프(Arlene Sharpe) 실험실로부터의 기증품이었다. BALB/c 마우스의 동계 결장암 모델의 경우, CT26 세포주를 사용하였다 (제프 카프(Jeff Karp) 실험실로부터의 기증품).
시약: 이. 콜라이 LPS (혈청형 O55:B5- TLRGRADE™)를 엔조(Enzo)로부터 구입하고, 세포 배양에서 1μg/ml로 또는 생체내 사용을 위해 10μg/마우스로 사용하였다. 에스. 미네소타(S. minnesota) R595 (MPLA)로부터의 모노포스포릴 지질 A를 인비보겐(Invivogen)으로부터 구입하고, 세포 배양에서 1μg/ml로 또는 생체내 사용을 위해 20μg/마우스로 사용하였다. OxPAPC를 인비보겐으로부터 구입하고, 미리 가온된 무혈청 배지에 재현탁하고, 세포 자극을 위해 100 μg/ml로 또는 생체내 사용을 위해 65μg/마우스로 사용하였다. POVPC 및 PGPC를 카이만 케미칼(Cayman Chemical)로부터 구입하였다. 상업적으로 이용가능한 POVPC 및 PGPC의 재구성을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (C. L. Evavold et al., Immunity, 2018 Jan 16;48(1):35-44). 간단히 말해서, 온화한 질소 가스 흐름을 사용하여 에탄올 용매를 증발시킨다. 그 후, 미리 가온된 무혈청 배지를 건조된 지질에 1 mg/ml의 최종 농도로 즉시 첨가하였다. 재구성된 지질을 37℃에서 5-10분 동안 인큐베이션하고, 세포에 첨가하기 전에 20초 동안 초음파처리하였다. POVPC 또는 PGPC를 세포 자극을 위해 100 μg/ml로 또는 생체내 사용을 위해 65μg/마우스로 사용하였다. 내독소 수준 <1 EU/mg을 갖는 엔도핏 달걀 오브알부민 단백질 및 OVA 257-264 펩티드를 인비보겐으로부터 구입하였으며, 생체내 사용을 위해 200μg/마우스의 농도로 또는 시험관내 사용을 위해 500 또는 100μg/ml의 농도로 사용하였다. 불완전 프로인트 아주반트 (F5506)를 시그마로부터 구입하고, 생체내 면역화를 위해 1:4 (IFA : 항원 에멀젼)의 작업 농도로 사용하였다. 알룸으로 지칭되는 알히드로겔을 애큐릿 케미칼(Accurate Chemical)로부터 구입하고, 생체내 면역화를 위해 2mg/마우스의 작업 농도로 사용하였다. 일부 실험에서, 스쿠알렌-수중유 아주반트인 애드박스(AddaVax)를 1:2 (애드박스: 항원)의 작업 농도로 IFA 대신에 사용하였다.
세포 배양: IMDM (깁코(Gibco)), 10% B16-GM-CSF 유래 상청액, 2μM 2-머캅토에탄올, 100 U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신 (시그마-알드리치) 및 10% FBS에서 골수를 분화함으로써 BMDC를 생성하였다. 배양 후 6일에, BMDC를 PBS로 세척하고, 1x106개 세포/ml의 농도로 100μl의 최종 부피로 10% FBS를 갖는 IMDM에 재플레이팅하였다. CD11c+ DC 순도는 비디 포르테사(BD Fortessa)를 사용하여 유동 세포계측법에 의해 평가하였으며, 일상적으로 80% 초과였다. 15일 동안 B16-FLT3으로 주사된 마우스로부터의 비장 DC를 CD11c+MHC+ 생 세포로서 정제한 후, 완전 IMDM에서 1x106개 세포/ml의 농도로 100μl의 최종 부피로 플레이팅하였다. 과다활성 또는 파이롭토시스 BMDC를 유도하기 위해, DC를 3시간 동안 LPS (1μg/ml)로 프라이밍한 후, 완전 IMDM에서 21시간 동안 OxPAPC 또는 PGPC (100μg/ml) 또는 알룸 (100μg/ml)으로 자극하였다. 일부 경우에, 활성화된 BMDC를 울트라-LEAF 항-마우스 CD40 (클론 1C10; 바이오레전드)을 사용하여 플레이트-결합 효능제 항-CD40에 대해 추가 24시간 동안 재자극하였다. T 세포를 10% FBS, 100 U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신 (시그마-알드리치), 및 50 μM β-머캅토에탄올 (시그마-알드리치)로 보충된 RPMI-1640 (깁코)에서 배양하였다. 종양 세포주를 모두 10% FBS로 보충된 DMEM에서 배양하였다. OVA 발현 세포주의 경우, 퓨로마이신 (2μg/ml)을 배지에 첨가하였다.
LDH 검정 및 ELISA: 신선한 상청액을 BMDC 자극 후 원심분리에 의해 청징화한 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 피어스(Pierce) LDH 세포독성 비색 검정 키트 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies))를 사용하여 LDH 방출 검정에 대해 검정하였다. 흡광도 판독을 위한 측정을 490 nm 및 680 nm의 파장에서 테칸(Tecan) 플레이트 판독기에서 수행하였다. 분비된 시토카인을 측정하기 위해, 상청액을 수집하고, 원심분리에 의해 청징화하고, -20℃에서 저장하였다. IL-1β, TNFα, IL-10, IL-12p70, IFNγ, IL-2, IL-13, IL-4 및 IL-17에 대한 ELISA를 제조업체의 프로토콜에 따라 이바이오사이언스 레디-셋-고(Ready-SET-Go)! (현재 써모피셔) ELISA 키트를 사용하여 수행하였다.
유동 세포계측법: FcR 차단 후 7일에, BMDC를 MACS 완충액 (1% FCS 및 2 mM EDTA가 포함된 PBS)에 재현탁하고, 하기 형광 접합 항체 (바이오레전드)로 염색하였다: 항-CD11c (클론 N418), 항-I-A/I-E (클론 M5/114.15.2), 항-CD40 (클론 3/23), 항-CD80(16-10A1), 항-CD69 클론 (H1.2F3), 항-H-2Kb (클론 AF6-88.5). 종양 또는 배수 서혜부 림프절, 또는 피부 서혜부 지방 조직으로부터의 단일 세포 현탁액을 MACS 완충액 (1% FCS 및 2 mM EDTA가 포함된 PBS)에 재현탁하고, 하기 형광 접합 항체 (바이오레전드)로 염색하였다: 항-CD8α (클론 53-6.7), 항-CD4 (클론 RM4-5), 항-CD44 (클론 IM7), 항-CD62L (MEL-14), 항-CD3 (17A2), 항-CD103 (2E7), 항-CD69 클론 (H1.2F3), 항-CD45 (A20 또는 30F11). 라이브/데드(LIVE/DEAD)™ 고정가능한 바이올렛 죽은 세포 염색 키트 (몰레큘라 프로브스(Molecular probes))를 사용하여 세포의 생존력을 결정하고, 세포를 20분 동안 PBS에서 4℃에서 염색하였다. 배수 서혜부 림프절 T 세포를 실온에서 1시간 동안 OVA-펩티드 사량체로 염색하였다. PE-접합 H2K(b) SIINFEKL (OVA 257-264; 서열식별번호: 1) 및 APC 접합 I-A(b) AAHAEINEA (OVA 329-337; 서열식별번호: 2)를 사용하였다. CLIP 펩티드와 연관된 I-A(b) 및 H2K(b)를 이소타입 대조군으로 사용하였다. NIH 사량체 핵심 설비를 위해 사량체를 구입하였다. 일부 실험에서, 애큐릿 케미칼로부터 구입된 FITC 항-CD8.1 (클론 Lyt-2.1 CD8-E1)을 사량체와 함께 사용하였다. 세포의 절대 수를 결정하기 위해, 카운트브라이트(countBright) 카운팅 비드 (몰레큘라 프로브스)를 제조업체의 프로토콜에 따라 사용하였다. 적절한 이소타입 대조군을 염색 대조군으로 사용하였다. 데이터를 BD FACS ARIA 또는 비디 포르테사에서 획득하였다. 플로우조(FlowJo) 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
항원 흡수 검정: 상이한 활성화 상태 (활성, 과다활성 또는 파이롭토시스 상태) 동안 BMDC의 항원 흡수 및 세포내이입 능력을 조사하기 위해, FITC 표지된-닭 OVA (FITC-OVA)를 사용하였다 (인비트로겐(Invitrogen)-몰레큘라 프로브스). 간단히 말해서, 전처리된 BMDC를 FITC-OVA 또는 AF488-덱스트란 (0.5 mg/ml)과 함께 45분 동안 37℃ 또는 4℃ (항원의 표면 결합에 대한 대조군으로서)에서 인큐베이션하였다. 그 후, BMDC를 세척하고, 생 세포와 죽은 세포를 구별하기 위해 라이브/데드 고정가능한 바이올렛 죽은 세포 염색 키트 (몰레큘라 프로브스)로 염색하였다. 그 후, 세포를 BD 고정 용액으로 고정하고, MACS 완충액 (1% FCS 및 2 mM EDTA가 포함된 PBS)에 재현탁하였다. 생 세포의 FITC 형광을 포르테사 유동 세포계측기 (벡톤-디킨슨(Becton-Dickenson))를 사용하여 15분마다 측정하였다. 37℃에서 인큐베이션된 BMDC의 형광 값을 OVA-FITC 또는 덱스트란-AF488 연관 세포의 백분율로 보고하였으며, 데이터를 4℃에서 인큐베이션된 OVA-FITC 연관 세포의 백분율로 정규화하였다.
OVA 항원 제시 검정: MHC-I 상의 OVA 항원 제시의 효율을 측정하기 위해, 활성화 (LPS), 과다활성화 (LPS+PGPC 또는 LPS+OxPAPC) 또는 파이롭토시스 자극제 (LPS+알룸)로 처리된 (0.5×106) BMDC를 엔도핏-OVA 단백질 (0.5 mg/ml)와 함께 2시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 세포를 MACS 완충액으로 세척하고, 얼음 위에서 20 내지 30분 동안 APC 항-마우스 H-2Kb 항체 (클론 AF6-88.5, 바이오레전드), 및 OVA 펩티드 SIINFEKL에 결합된 H-2Kb에 결합하는 PE-접합 항체 (서열식별번호: 1; 클론 25-D1.16, 바이오레전드)로 염색하였다. 적절한 이소타입 대조군을 염색 대조군으로 사용하였다. 총 표면 H-2Kb의 백분율, 및 MHC-I 상의 OVA 펩티드와 연관된 세포의 백분율을 계산하였다. 포르테사 유동 세포계측기 (벡톤-디킨슨)에서 데이터를 획득하고, 플로우조 소프트웨어 (트리 스타(Tree Star))로 분석하였다.
OT-I 및 OT-II 시험관내 T-세포 자극: 비장 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 각각 항-CD8 비드 또는 항-CD4 비드로 자성 세포 분류에 의해 OT-I 및 OT-II 마우스로부터 분류하였다 (밀테니 바이오테크(Miltenyi Biotech)). 그 후, 분류된 T 세포를 LPS (활성화 자극제) 또는 LPS+PGPC (과다활성화 자극제) 또는 LPS+알룸 (파이롭토시스 자극제)으로 전처리된 20,000 또는 10,000 DC (5:1 또는 10:1 비율)의 존재 하에 웰당 100,000개 세포의 농도로 96-웰 플레이트에 시딩하고, OVA 단백질 또는 SIINFEKL (서열식별번호: 1) 펩티드로 100 μg/ml로 2시간 동안 펄스화하였다 (또는 그렇지 않음). 배양 후 5일에, 상청액을 수집하고, -20℃에서 단기간 저장을 위해 원심분리에 의해 청징화하고, ELISA에 의해 시토카인을 측정하였다.
세포내 염색: 세포내 시토카인 염색을 위해, 세포를 50 ng/ml 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA) 및 500 ng/ml 이오노마이신 (시그마-알드리치)으로 골지스탑(GolgiStop) (BD) 및 브레펠딘 A의 존재 하에 4-5시간 동안 자극하였다. 그 후, 세포를 PBS로 2회 세척하고, 라이브/데드™ 고정가능한 바이올렛 또는 그린 죽은 세포 염색 키트 (몰레큘라 프로브스)로 PBS에서 20분 동안 4℃에서 염색하였다. 세포를 MACS 완충액으로 세척하고, 적절한 표면 마커에 대해 20분 동안 4℃에서 염색하였다. 2회 세척 후, 세포를 고정하고, BD 사이토픽스/사이토펌(Cytofix/Cytoperm) 키트를 사용하여 20분 동안 4℃에서 투과화한 후, 제조업체의 프로토콜에 따라 1X perm 세척 완충액 (BD)으로 세척하였다. 세포내 시토카인 염색을 모두 바이오레전드로부터 구입한 하기 접합된 항체로 1X perm 완충액에서 20-30분 동안 4℃에서 수행하였다: 항-Ki67(클론 16A8), 항-IFN-γ (클론 XMG1.2), 항 TNFα (클론 MP6-XT22), 항-Gata3 (16E10A23), 항-IL4(11B11), 항-IL10 (클론 JES5-16E3). 데이터를 BD FACS ARIA 또는 비디 포르테사에서 획득하였다. 플로우조 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다.
CD107a 탈과립화 검정: CD8+ T 세포의 이펙터 항종양 활성을 평가하기 위해, 리소좀-연관 단백질 CD107a의 표면 노출을 유동 세포계측법에 의해 평가하였다. 간단히 말해서, 면역화된 마우스의 피부 배수 림프절로부터의 CD8+ T 세포를 항-CD8 비드 및 컬럼 (밀테니 바이오테크)을 사용한 자성 세포 풍부화에 의해 단리한 후, FACS ARIA(BD)에서 CD3+CD8+ 생 세포로서 분류하였다. 신선하게 분류된 CD8+ T 세포를 1x106개 세포/ml의 농도로 완전 RPMI에 재현탁하였다. PerCP/Cy5.5 항-마우스 CD107a (LAMP-1) 항체 (클론1D4B, 바이오레전드)를 골지스탑 (BD)의 존재 하에 이 배지에 1μg/ml의 농도로 첨가하였다. 그 후, T 세포를 96 웰 플레이트에 10,000개 MC38OVA 또는 B16OVA 종양 세포/웰에 100,000개 세포로 즉시 시딩하였다. 대안적으로, CD8+ T 세포를 단독으로 시딩하고, 50 ng/ml 포르볼 12-미리스테이트 13-아세테이트 (PMA) 및 500 ng/ml 이오노마이신 (시그마-알드리치)으로 자극하였다. 배양 후 5시간에, 세포를 MACS 완충액으로 세척하고, 라이브/데드™ 고정가능한 바이올렛 죽은 세포 염색 키트 (몰레큘라 프로브스), 및 APC 항-CD8 (클론 53-6.7, 바이오레전드)로 염색하였다. 그 후, 세포를 BD 고정 용액으로 20분 동안 4℃에서 고정하고, MACS 완충액에 재현탁하였다. CD107a+ 세포의 백분율을 포르테사 유동 세포계측기 (BD)에서 유동 세포계측법에 의해 결정하였다.
시험관내 세포독성 검정: 생존자 마우스의 비장 또는 피부 서혜부 지방 조직으로부터의 CD8+ T 세포를 항-CD8 MACS 비드 및 컬럼 (밀테니 바이오테크)을 사용하여 단리하였다. 그 후, 풍부화된 T 세포를 FACS ARIA를 사용하여 생 CD45+CD3+CD8+ 세포로서 분류하였다. 분류 후 순도는 >97%였다. 종양 세포주, 예컨대 B16OVA, B16F-10 또는 CT26 세포를 T 세포와 이들의 공동-배양 전 적어도 5시간에 완전 DMEM에서 96-웰 플레이트 (2x104개 세포/웰)에 시딩하였다. 105개 CD8+ T 세포를 12시간 동안 종양 세포에 시딩한 후, 세포독성을 제조업체의 프로토콜에 따라 피어스 LDH 세포독성 비색 검정 키트 (라이프 테크놀로지스)를 사용하여 LDH 방출 검정에 의해 평가하였다.
전체 종양 세포 용해물 제조: 면역화를 위한 전체 종양 세포 용해물 (WTL)을 제조하기 위해, 종양 세포주를 4-5일 동안 완전 DMEM에서 배양하였다. 세포가 전면성장되면, 상청액을 수집하고, 세포를 세척하고, 트립신-EDTA (깁코)를 사용하여 해리하였다. 그 후, 종양 세포주를 이들의 수집된 배양 상청액에 5x106개 세포/ml로 재현탁한 후, 동결-해동의 3 사이클에 의해 용해시켰다.
종양 침윤: 면역화된 마우스에서 종양-침윤 림프구 (TIL)의 빈도를 평가하기 위해, 크기가 1.8-2 cm에 도달했을 때 종양을 수확하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 종양 해리 키트 (밀테니 바이오테크) 및 젠틀MACS 해리기를 사용하여 종양을 해리시켰다. 소화 후, 종양을 PBS로 세척하고, 70-μm 및 30-μm 필터를 통해 통과시켰다. CD45+ 세포는 CD45 마이크로비드 (밀테니 바이오테크)를 사용하여 양성으로 선택되었고, T 세포 침윤을 유동 세포계측법에 의해 평가하였다. T 세포 활성화 및 확장을 위해 종양 침윤 T 세포를 다이나비즈 마우스 T-활성인자 CD3/CD28 (깁코)과 함께 배양하였다.
입양 세포 전달: T 세포 전달을 위해, 생존자 마우스의 비장 또는 피부 서혜부 지방 조직으로부터의 CD8+ T 세포를 항-CD8 MACS 비드 및 컬럼 (밀테니 바이오테크)을 사용하여 단리하였다. 그 후, 풍부화된 세포를 FACS ARIA를 사용하여 생 CD45+CD3+CD8+ 세포로서 분류하였다. 분류 후 순도는 >97%였다. 그 후, 분류된 T 세포를 IL-2 (50ng/ml)의 존재 하에 항-CD3 (4 μg/ml) 및 항-CD28 (4 μg/ml)로 코팅된 24-웰 플레이트 (∼2 × 106개 세포/웰)에서 24시간 동안 자극하였다. 5x105개 활성화된 순환 비장 또는 피부 서혜부 지방 상주 CD8+ T 세포를 각각 i.v. 또는 피내 (i.d.) 주사에 의해 나이브 수용자 마우스에 전달하였다. 일부 마우스는 T 세포 서브세트 둘 모두를 받았다
DC 전달을 위해, BMDC를 6일차에 수확하고, 5x106개 세포를 6-웰 플레이트에 시딩하였다. 과다활성 자극제 (LPS+PGPC) 또는 활성화 자극제 (LPS)과의 인큐베이션에 의해 DC 활성화를 유도하였다. 종양 용해물을 1 DC 대 2 종양 세포 등가물의 비율 (즉, 1:2)로 1시간 동안 DC 배양 플레이트에 첨가하였다. 로딩되지 않은 나이브 DC를 음성 대조군으로 사용하였다.
통계적 분석: 2개 초과의 그룹을 사용한 실험에 대한 통계적 유의성을 튜키 다중 비교 테스트 보정과 함께 이원 ANOVA로 테스트하였다. 프리즘 (그래프패드)으로 계산된 조정된 p-값은 별표에 의해 코딩된다: <0.05 (*); <0.0005 (***); ≤0.0001 (****).
결과
과다활성화 자극제는 DC가 T 세포 면역을 자극하는데 중요한 여러 활성을 상향조절한다.
DC 과다활성화의 거의 모든 연구는 생존력을 유지하면서 IL-1β를 방출하는 이들 세포의 능력에 초점을 맞추었다. 과다활성화 자극제에 의해 영향을 받는 DC 기능의 스펙트럼은 정의되지 않는다. 이 스펙트럼을 조사하기 위해, 골수 유래 DC (BMDC)를 LPS로 프라이밍한 후, oxPAPC 또는 PGPC라고 하는 oxPAPC의 특이적이고 순수한 지질 성분으로 처리하였다 (I. Zanoni, et al. Science, vol. 352, no. 6290, pp. 1232-1236, 2016). 생성된 과다활성 세포를 전통적으로 활성화된 BMDC (LPS로 처리됨) 또는 파이롭토시스 BMDC (LPS로 프라이밍된 후 알룸으로 처리됨)와 비교하였다. 예상대로 IL-1β의 방출을 유도하지 않은 활성화 자극제와 대조적으로, 파이롭토시스 또는 과다활성화 자극제는 세포외 배지로의 IL-1β 방출을 촉진하였다 (도 1a). 조사된 모든 자극제는 시토카인 TNFα의 분비를 촉진하였다 (도 1a). 이들 발견은 LPS-활성화 BMDC가 TNFα를 방출하지만 IL-1β를 방출하지 않는다는 것을 확립한 이전 연구에 따른 것이다 (I. Zanoni et al., 2016). IL-1β 분비는 시토졸 효소 락테이트 데히드로게나제 (LDH)의 방출에 의해 평가된 바와 같이 파이롭토시스 DC에서 세포 사멸과 동시에 발생하였다 (도 1b). 대조적으로, IL-1β 분비는 과다활성 세포에서 LDH 방출의 부재 하에 발생하였다 (도 1b). LPS가 인간 유두종 바이러스 (HPV) 및 간염 B 바이러스 (HBV)에 대한 백신에 사용되는 FDA-승인 TLR4 리간드인 MPLA로 대체되었을 때 BMDC의 유사한 거동이 관찰되었다 (도 3a, 3b). 과다활성 BMDC의 거동이 생체내에서 분화된 DC로 연장되는지를 결정하기 위해, B16-FLT3이 주사된 마우스의 비장으로부터 단리된 CD11c+ DC의 활성을 조사하였다. GMCSF-유래 BMDC의 거동과 유사하게, LPS 및 PGPC 처리는 LDH 방출에 의해 평가된 바와 같이 세포 사멸의 부재 하에 비장 CD11c+ DC로부터 TNFα 및 IL-1β의 방출을 유발하였다 (도 3c, 3d). 이들 결과는 과다활성화 자극제 PGPC가 시험관내 또는 생체내에서 분화된 생 DC로부터 IL-1β 방출을 유도하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.
T 세포 분화에 중요한 여러 신호, 예컨대 공동-자극 분자 CD80, CD69 및 CD40의 발현, 및 IL-12의 p70 서브유닛의 분비를 조사하였다. CD80 표면 발현은 모든 활성화 자극제에 반응하는 DC에서 유사하였다 (도 3e). 대조적으로, CD40 발현은 활성화 자극제에 의해 고도로 영향을 받았다. 활성화 자극제 LPS와 비교하여, 과다활성화 자극제는 CD40의 더 큰 발현을 유도하였다 (도 1c). 파이롭토시스 자극제는 LPS-알룸 처리 후 남아있는 생 세포의 20-30% 내에서도 CD40 및 CD69의 매우 약한 유도자였다 (도 1c 및 3e). CD40의 차등적 발현은 효능제 항-CD40 코팅된 플레이트에서 배양될 때 IL-12p70을 분비하는 가장 큰 능력을 갖는 과다활성 DC와 상관관계가 있었다 (도 1d).
과다활성 BMDC는 형광 오브알부민 (OVA-FITC)의 등가 내재화에 의해 평가된 바와 같이 항원 포획에서 이들의 활성화된 대응물보다 우수하지 않았지만 (도 4a, 6b), 전자의 세포 집단은 세포 표면에서 MHC-I 분자 상의 OVA-유래 SIINFEKL 펩티드의 더 큰 존재비를 나타내었다 (도 1e 및 4c). 총 표면 MHC-I 존재비는 활성화된 및 과다활성화된 세포 간에 상이하지 않았다 (도 3e). 종합하면, DC의 다른 자극제와 비교하여, 과다활성화 자극제는 T 세포 분화에 중요한 여러 활성의 증진을 나타낸다.
과다활성 DC는 TH2 면역의 증거 없이 TH1-집중 면역 반응을 자극한다.
T 세포 지시에 대한 DC 활성화 상태의 영향을 평가하기 위해, BMDC를 상기 기재된 바와 같이 처리한 후, OVA로 로딩하였다. 이들 세포를 나이브 OT-II 또는 OT-I T 세포에 노출하였다. OT-II 세포는 MHC-II 제한된 OVA 펩티드 (OVA 323-339)에 대해 특이적인 T 세포 수용체 (TCR)를 발현하는 반면, OT-I 세포는 MHC-I 제한된 OVA 펩티드 (OVA 257-264)에 대해 특이적인 TCR을 발현한다 (K. A. Hogquist, et al. Cell, vol. 76, no. 1, pp. 17-27, Jan. 1994; M. J. Barnden, et al. Immunol. Cell Biol., vol. 76, no. 1, pp. 34-40, Feb. 1998). 반응하는 T 세포의 활성을 ELISA에 의해 평가하여 TH1 반응 (IFNγ 생성) 또는 TH2 반응 (IL-10, IL-4 또는 IL-13 생성)에 대한 T 세포 분극을 결정하였다. DC 활성화 상태에 관계없이, OVA 처리된 BMDC는 OT-II T 세포로부터 IFNγ의 생성을 자극하였다. IFNγ 생성의 정도는 조사된 활성화 자극제 간에 완만하게 다양하였다 (도 1f). 유사하게, 반응하는 OT-II 세포에 의한 TNFα 생성은 모든 DC 활성화 상태를 비교할 때 필적하였다 (도 1f). 이들 결과는 시험관내에서 항원 제시 세포 (APC)의 활성화 상태에 관계없이 TH1 반응이 일반적으로 유도됨을 나타낸다. 대조적으로, TH2 반응은 DC 활성화 상태를 비교할 때 현저하게 상이하였다. BMDC 활성화 (LPS) 또는 파이롭토시스 (LPS+알룸)를 유도하는 자극제는 다량의 IL-10 및 IL-13의 방출을 촉진한 반면, 과다활성화 자극제는 이들 TH2-연관 시토카인의 최소 생성을 유발하였다 (도 1f). TH1 (IFNγ 및 TNFα) 및 TH2 (IL-4 및 IL-10) 시토카인 뿐만 아니라 TH2-계통 한정 전사 인자 GATA3에 대한 단일 세포의 세포내 염색은 상이한 DC 활성화 자극제에 의해 생성된 TH1 및 TH2 세포의 비율의 계산을 허용하였다. 이 분석은 과다활성 BMDC가 IFNγ-생산 TH1 계통을 향한 개별 T 세포의 강한 편향을 유도함을 밝혀내었다 (도 1g 및 5). 과다활성 조건 하에 TH1 대 TH2 세포의 비율은 100:1 초과였다 (도 1g). 대조적으로, 다른 모든 활성화 자극제는 혼합된 T 세포 반응을 유도하였으며, 파이롭토시스 자극제는 TH1 대 TH2 세포의 비율이 거의 1:1이 되도록 하였다 (도 1g).
CD8+ OT-I T 세포에 대해 유사한 연구가 수행되었으며, 이는 활성화 또는 파이롭토시스 자극제와 비교하여 BMDC를 과다활성화시키는 자극제에 의한 IFNγ 생성의 약간의 증진을 나타내었다 (도 1f). 반응하는 OT-I 세포에 의한 IL-2 생성은 모든 DC 활성화 상태를 비교할 때 필적하였다 (도 1f). 이들 종합적인 결과는 시험관내에서 과다활성 BMDC 상태가 고도로 TH1-편향 T 세포 반응 및 약간 증진된 CD8 T 세포 반응을 유발함을 나타낸다. 대조적으로, 활성화 또는 파이롭토시스 자극제는 혼합된 TH1 및 TH2 반응을 생성하였다.
인플라마좀-적격 DC의 과다활성화는 보호 항종양 면역을 부여하기에 충분하다. DC는 드노보 T 세포 매개 면역을 자극하는 역할을 하는 주요 세포이기 때문에, DC를 특이적으로 과다활성화시키는 조건이 항종양 면역을 부여하기에 충분한지를 결정하고자 하였다. 상이한 활성화 자극제 및 WTL로 생체외에서 자극된 BMDC의 마우스로의 입양 전달을 수행함으로써 이 가능성을 다루었다. BMDC는 이들 세포가 1) 과다활성화되는 것으로 잘 특징화되어 있고, 2) 인간의 DC-기반 면역요법에 사용되는 가장 일반적인 APC인 단핵구-유래 DC에 대한 모델로 간주되기 때문에 선택되었다 (R. L. Sabado et al., Cell Res., vol. 27, no. 1, pp. 74-95, Jan. 2017).
BMDC를 WTL과 함께 다양한 활성화 자극제로 처리한 후, B16OVA 종양-보유 마우스에 연속 3주 동안 7일마다 s.c. 주사하였다. LPS로 활성화되고 B16OVA WTL로 펄스화된 BMDC는 나이브 BMDC가 주사된 마우스와 비교하여 B16OVA-유도 치사성으로부터 약간의 보호를 제공하였으며; DC 전달을 받은 마우스의 25-30%는 종양을 거부하였고, 마지막/제3 DC 전달 절차 후 오랫동안 무종양 상태로 유지되었다 (도 2). 특히, 과다활성 BMDC는 종양-보유 마우스의 100%에서 B16OVA 종양의 완전한 거부를 유도하였다 (도 2). 과다활성 DC의 항종양 활성은 이들 세포의 인플라마좀에 의존적이었으며, 이는 NLRP3-/- 및 Casp1-/-11-/- BMDC 전달이 활성 DC에 필적하는 경미한 거부만을 유도하였기 때문이다 (도 2). 따라서, 이들 데이터는 과다활성 DC가 지속가능한 보호 항종양 면역을 유도하기에 충분하고, DC 내의 인플라마좀이 이 프로세스에 필수적임을 나타낸다.
논의
이 연구에서, 과다활성화 자극제로 DC를 처리시 상향조절되는 면역학적 활성이 확장되었다. 이들 자극제는 생 세포로부터 IL-1β 방출을 유도할 수 있을 뿐만 아니라, 과다활성화 자극제는 CD40 발현 및 IL-12p70 분비를 유도하는 이들의 능력에서 다른 활성화 자극제를 능가한다. 또한, 과다활성화 자극제에 노출된 세포는 MHC-펩티드 복합체의 증진된 표면 발현을 나타낸다. 이들 집합적 발견은 oxPAPC 또는 이의 순수한 성분 PGPC에 노출된 DC의 과다활성 성질을 강조하고, 적응 면역을 자극하는 증진된 능력의 증거를 제공한다. 과다활성 DC가 실제로 활성화된 또는 파이롭토시스 세포보다 T 세포 반응의 더 나은 자극인자인 것으로 밝혀졌지만, 이들의 활성의 가장 주목할만한 측면은 TH1- 및 CTL-집중 반응을 자극하는 이들의 능력일 수 있다. 실제로, DC를 과다활성화시키는 자극제는 TH1:TH2 세포의 100:1 비율을 유발하였고; DC 활성화의 다른 전략은 이러한 편향된 T 세포 반응을 유도하지 않았다.
잘 정의된 인플라마좀 자극제인 알룸은 oxPAPC 또는 PGPC와 동일한 활성을 나타내지 않는다는 점이 주목할 만하다. 실제로, 알룸이 TH2 면역을 유도한다는 것은 잘 인식되어 있다. 이들 발견은 알룸 또는 알룸+LPS 처리가 강력한 TH2 면역을 유도함에 따라 이 연구에서 확인되었다. 알룸-처리된 세포의 TH1-집중 면역의 결여에 대한 한 가지 가능한 이유는 알룸이 CD40 발현 및 IL-12p70 분비와 같은 TH1 분화에 필요한 여러 신호의 불량한 유도자라는 본원의 발견에 기초한다. 특히, 알룸+LPS에 대한 반응으로 파이롭토시스를 겪지 않은 DC를 조사한 경우에도, CD40 발현은 현저하게 낮았다. 이들 인자의 높은 수준의 발현의 결여는 파이롭토시스 자극제를 TH1 반응의 약한 유도자로 만들고 결과적으로 항종양 면역을 부여할 가능성이 있다. 이론에 얽매이지 않고, 과다활성 DC에 의해 유도된 TH1-집중 면역은 인플라마좀의 작용 뿐만 아니라 이들 세포의 여러 다른 특징의 결과라고 제안되었다. 이들 추가 특징은 증진된 항원 제시 능력, CD40 발현, IL-12p70 발현 및 증가된 생존력을 포함한다. 이들 증진된 활성 각각은 APC로서의 DC 기능에 중요하고 DC 과다활성화 조건 하에 관찰되는 강한 TH1-집중 면역 반응에 기여할 가능성이 있다.
이들 결과는 특정 화학요법제 (예를 들어, 옥살리플라틴)가 종양 세포 사멸 및 인플라마좀-의존적 항종양 T 세포 면역을 유도하는 이유를 설명하는데 도움이 될 수 있다 (F. Ghiringhelli et al., Nat. Med., vol. 15, no. 10, pp. 1170-1178, 2009). 옥살리플라틴은 활성 산소 종 (ROS) 생성의 강력한 자극인자이며, 이는 생물학적 막을 산화시키고 PGPC를 포함한 별개의 산화된 인지질 종의 복합체 혼합물을 생성할 수 있다. 따라서, 옥살리플라틴에 의해 유도된 보호 면역은 항종양 T 세포 반응을 프라이밍하는 과다활성 DC의 작용으로 인한 것일 수 있다.
과다활성 자극제는 항원의 복합체 혼합물을 사용하는 면역요법으로서 활용될 수 있다는 것이 밝혀졌다. WTL은 여러 이유로 매력적인 항원 공급원이며, 그 중 최소한은 실용적인 관점에서 볼 수 있다. WTL-기반 접근법의 유의한 이익은 네오항원 식별의 필요성을 완화한다는 것이다. WTL-기반 면역요법에 의해 제공되는 잠재적인 이익에도 불구하고, 이 분야의 이전 연구은 혼합된 결과를 가져왔다. 본원의 발견은 과다활성화 자극제가 독특하게 WTL을 아주반트하여 강력한 항종양 면역을 유도할 수 있다는 것이며, 본원에서 발견된 DC 활성화 전략이 이전에 고려되지 않았기 때문에 이전 연구의 성공 결여를 설명할 수 있다. 이 후자의 점에서, DC 과다활성화 전략이 PD-1 차단에 민감한 종양 및 PD-1 차단에 저항성이 있는 종양과 연관된 치사성으로부터 마우스를 보호할 수 있다는 점은 주목할 만하다. 과다활성화 자극제에 의해 치료가능한 종양의 전체 스펙트럼은 정의되지 않았지만, 이들 연구는 암 면역요법의 DC-중심 전략의 가치를 추가로 탐구하는 임무를 제공한다.
실시예 2: 과다활성 cDC1은 인플라마좀-의존적 방식으로 종양 거부를 제어한다.
통상적인 수지상 세포 (cDC)는 외인성 및 내인성 항원을 T 세포에 제시하고 T 세포 증식, 생존 및 이펙터 기능을 조절하는데 능숙하다. cDC는 cDC1 및 cDC2라는 2개 주요 서브세트로 나뉜다. 비장 및 림프절 (LN)의 상주 cDC1은 CD8α, CD24 및 XCR1을 발현하는 반면, cDC2는 CD4 및 Sirpα를 발현한다. cDC1은 종양-연관 항원을 교차-제시하고 Th1 면역 및 항종양 CD8+ T 세포를 프라이밍하여 종양을 효율적으로 거부하는 고전적인 DC이다. 반면에, cDC2는 Th2 면역을 활성화시키는 기생충에 대한 유형 2 면역 반응을 지배한다.
상주 cDC가 과다활성화 상태를 달성할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, WT 마우스의 비장으로부터의 cDC1 또는 cDC2를 분류하고, 미처리 상태로 두거나, LPS로 24시간 동안 처리하거나, LPS로 3시간 동안 프라이밍한 후, 과다활성화 자극제 oxPAPC 또는 PGPC, 또는 파이롭토시스 자극제 알룸으로 21시간 동안 처리하였다. 비장 cDC2와 대조적으로, 비장 cDC1은 이들의 LDH 방출에 의해 측정된 바와 같이 단리 후 빠르게 사망하였다 (도 6a 왼쪽 패널). 결과적으로, cDC1 세포는 LPS로 프라이밍되지 않았고, 활성화 자극제 (LPS), 과다활성화 자극제 (LPS+OxPAPC/PGPC) 또는 파이롭토시스 자극제 (LPS+알룸)에 대한 반응으로 TNFa 시토카인을 생성할 수 없었다 (도 6b 왼쪽 패널). 과다활성화 자극제 (LPS+PGPC)에 대한 반응으로 IL-1β 방출이 거의 관찰되지 않았다 (도 6b 왼쪽 패널). 대조적으로, 비장 cDC2 세포는 LPS로 효율적으로 프라이밍되었고 과다활성화 상태를 달성하였으며, 이는 세포 사멸을 겪지 않고 IL-1β를 생성하는 이들의 능력에 의해 식별된다 (도 6a-6b 왼쪽 패널). 상주 cDC1은 생체외 단리 및 시험관내 자극에 대해 고도로 민감하였기 때문에, 대안적으로, 시토카인 FLT3 리간드 (FLT3L)를 사용하여 골수 (BM) 선조로부터 cDC를 생성하였다. FLT3L 생성 cDC1 및 cDC2를 배양 후 9일에 분류한 후, 이전과 같이 활성화 자극제, 과다활성화 자극제 또는 파이롭토시스 자극제로 처리하였다. 비장으로부터 단리된 상주 cDC1 세포와 대조적으로, FLT3L-생성 cDC1 및 cDC2는 LPS로 효율적으로 프라이밍되었고, 이들의 생존력을 유지하면서 다량의 IL-1β 및 TNFa의 이들의 방출에 의해 측정된 바와 같이 LPS+PGPC에 의한 이들의 자극에 대한 반응으로 과다활성화 상태를 달성하였으며, LPS+oxPAPC에서는 그렇지 않았다 (도 6a-6b 오른쪽 패널). 이들 데이터는 산화된 인지질 PGPC의 순수한 형태가 cDC1 및 cDC2 서브세트를 과다활성화시킬 수 있음을 나타낸다.
과다활성 FLT3L-생성 cDC1은 더 높은 이동 잠재력을 내포하는 이들의 나이브, 활성 또는 파이롭토시스 대응물과 비교하여 더 많은 별 모양의 수상돌기를 표시하였다. 실제로, 과다활성 cDC1 및 cDC2는 T 세포 자극을 위해 이동성 DC를 림프절로 가이드하는 케모카인 수용체 CCR7을 상향조절하였다 (도 6c-6d). 요약하면, 이들 결과는 cDC1 및 cDC2 서브세트가 시험관내에서 과다활성화 상태를 달성하고 이들의 고전적으로 활성화된 대응물과 비교하여 독특한 속성을 표시함을 나타낸다.
cDC1 세포의 독특한 기능은 cDC1이 종양 항원을 흡수하고 종양 미세환경 (TME) 내에서 또는 배수 림프절로 이동 후 T 세포에 교차-제시하는 암의 맥락에서 중요하다. cDC1이 시험관내에서 과다활성이 된다는 사실은 암 면역요법을 위한 cDC 과다활성화 상태의 가치를 추가로 탐구할 권한을 제공한다. 따라서, 종양 거부의 제어에서 cDC1의 과다활성 상태의 역할을 조사하기 위해, 마우스를 B16OVA 세포로 왼쪽 등에 피하로 (s.c.) 접종하였다. 종양 시험감염 후 7, 14 및 21일에, 마우스를 미처리 상태로 두거나, 1×106개의 미처리된 WT cDC1 (cDC1 나이브), 또는 23시간 동안 LPS로 처리된 WT cDC1 (cDC1활성), 또는 LPS로 3시간 동안 프라이밍된 후 PGPC로 20시간 동안 처리된 WT cDC1 (cDC1과다활성)을 오른쪽 옆구리에 s.c. 주사하였다. 모든 cDC를 주사 전 1시간 동안 B16OVA 종양 용해물로 펄스화하였다. 놀랍게도, 과다활성 cDC1의 입양 전달은 마우스에게 종양 성장에 대한 강하고 오래 지속되는 보호를 부여한 반면, 나이브 또는 활성 cDC1 전달은 경미한 종양 거부만을 유도하였다 (도 7). 이들 데이터는 지속가능한 종양 거부에서 cDC1의 과다활성 상태의 우수한 역할에 대한 첫 번째 증거를 나타낸다.
종양 제어에서 과다활성 cDC1의 중요한 역할을 추가로 확인하기 위해, CD8+cDC1이 결여되어 있고 교차-제시에 결함이 있는 Batf3-/- 마우스를 사용하였으며, 결과적으로 Batf3-/- 마우스는 항종양 항원-특이적 CD8+ T 세포 반응이 결여되어 있다. 따라서, B16OVA 세포로 접종된 Batf3-/- 마우스는 WT 마우스와 비교하여 종양 성장을 제어하는데 실패하였다 (도 8a). 그러나, 종양-보유 Baft3-/- 마우스가 종양 시험감염 후 7, 14 및 21일차에 이들의 s.c. 주사를 통해 WT cDC1로 보충되었을 때, 나이브 또는 활성인 cDC1과 대조적으로, 과다활성 cDC1만이 종양을 완전히 근절할 수 있었다는 것을 발견하였다. 이러한 보호는 WT 과다활성 cDC1을 주사했을 때 Batf3-/- 마우스에서 복구된 종양 침윤 OVA-특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포의 더 높은 빈도와 상관관계가 있었으나, WT 활성 또는 나이브 cDC1 세포에서는 그렇지 않았다 (도 8b-8c). 전반적으로, 이들 데이터는 과다활성 cDC1이 항종양 특이적 T 세포의 종양 침윤을 증진시킴으로써 종양 거부를 제어한다는 강력한 증거를 제공한다.
문제의 산화된 인지질 (oxPAPC/PGPC)이 시토졸 병원체 인식 수용체 (PRR) 카스파제-11에 결합하여 이를 자극할 수 있기 때문에, DC의 과다활성 상태의 근본적인 메커니즘은 잘 정의되어 있다. 카스파제-1/11 자극은 NLRP3 인플라마좀의 활성화 및 어셈블리를 초래하여 가스더민-D 기공을 통해 생 세포로부터 IL-1β의 방출을 유발한다. 과다활성 cDC1의 항종양 활성에서 IL-1β의 역할을 평가하기 위해, IL-1β 분비에 결함이 있는 Casp1/11-/- 마우스 또는 NLRP3-/- 마우스를 사용하였다. Casp1/11-/- 또는 NLRP3-/- 마우스를 B16OVA 세포로 왼쪽 등에 접종하였다. 종양 시험감염 후 7, 14 및 21일에, 마우스를 미처리 상태로 두거나 (DC 주사 없음), 1.106개의 미처리된 WT cDC1 (cDC1나이브) 또는 23시간 동안 LPS로 처리된 WT cDC1 (cDC1활성), 또는 LPS로 3시간 동안 프라이밍된 후 20시간 동안 PGPC로 처리된 WT 또는 Casp1/11-/- cDC1 (cDC1과다활성)를 오른쪽 옆구리에 s.c. 주사하였다. 모든 DC는 주사 전 1시간 동안 B16OVA 종양 용해물로 펄스화되었다. 흥미롭게도, 경미한 보호만을 유도한 WT 나이브 또는 활성 cDC1과 대조적으로, WT 과다활성 cDC1의 Casp1/11-/- 및 NLRP3-/- 수용자 마우스로의 입양 전달이 종양-보유의 100%에서 종양 성장을 완전히 근절하였다는 것을 발견하였다. 이러한 보호는 인플라마좀 소기관에 의존적이었으며, 이는 과다활성화 자극제 (LPS+PGPC)에 대한 반응으로 IL-1β 분비를 유도할 수 없는 casp1/11-/- 또는 NLRP3-/-로부터의 cDC1이 종양 거부를 유도하지 못하였기 때문이다. 요약하면, 과다활성 DC의 입양 전달은 지속가능한 항종양 반응을 유도하고 과다활성화-기반 백신에 의해 관찰되는 보호를 요약하기에 충분하다.
전반적으로, 본원의 데이터는 입양 세포 전달 기반 면역요법에 사용되는 활성화 상태와 관련하여 DC 기반 면역요법의 패러다임을 이동시킬 잠재력을 가지며, 그러므로 효과적인 암 면역요법을 생성하기 위해 시험관내에서 DC를 "컨디셔닝"하려는 시도를 재활성화시킬 수 있다.
실시예 3: 산화된 인지질은 과다활성 cDC1 및 cDC2 세포를 유도한다.
세포-과다활성화 상태를 평가하는 거의 모든 연구는 시토카인 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF)로 생성된, 골수 유래 DC (BMDC)가 생존력을 유지하면서 IL-1β를 방출하는 능력에 초점을 맞추었다 [24,31,32,33,34]. 최근 보고서는 DC보다 오히려 단핵구-유래 대식세포가 인플라마좀 활성화 및 IL-1β 분비를 담당한다는 것을 입증하였다 [35]. 통상적인 DC가 과다활성화 상태를 달성할 수 있는지 여부를 조사하기 위해, DC 헤마토포이에틴 Fms-유사 티로신 키나제 3 리간드 (Flt3L)를 사용하여 생성된 BMDC를 사용하였다. 과다활성화를 평가하기 위해, FLT3-DC를 LPS로 프라이밍한 후, 산화된 인지질 oxPAPC 또는 PGPC라고 하는 oxPAPC의 순수한 지질 성분으로 처리하였다 [36]. 대안적으로, FLT3-DC를 LPS 단독과 같은 전통적인 활성화 자극제로 자극하거나, FLT3-DC를 LPS로 프라이밍한 후, 파이롭토시스 자극제, 예컨대 알룸으로 처리하였다. DC로부터 IL-1β 방출을 유도하지 않은 전통적인 활성화 자극제와 대조적으로, 파이롭토시스 DC는 세포외 배지로의 IL-1β 방출을 촉진하였다 (도 11a). IL-1β 분비는 시토졸 효소 락테이트 데히드로게나제 (LDH)의 방출에 의해 평가된 바와 같이 파이롭토시스 DC에서 세포 사멸과 동시에 발생하였다 (도 11b). 흥미롭게도, 과다활성 자극제 LPS+PGPC를 사용한 자극, 또는 LPS+oxPAPC를 사용한 더 적은 정도로의 자극은 DC로부터 IL-1β 분비를 유도하였으며, 이는 LDH 방출의 부재 하에 발생하였다 (도 11a). LPS로 프라이밍되거나 자극된 모든 DC는 시토카인 TNFα의 분비를 촉진하였다 (도 11a). 파이롭토시스 또는 과다활성 DC에서 IL-1β 분비는 두 경우 모두 인플라마좀 성분 NLRP3 및 카스파제1/11에 의존적이었다 (도 11a). 이들 발견은 이전 연구에 따른 것이며, 이는 oxPAPC가 시토졸 PRR 카스파제-11에 결합하고 자극하여, NLRP3 활성화 및 비-파이롭토시스 인플라마좀의 어셈블리를 초래하여 생 세포로부터 IL-1β의 방출을 유발하는 DC의 과다활성 상태의 근본적인 메커니즘을 정의하였다 [24]. DC가 다른 TLR 효능제, 예컨대 TLR9 효능제 CpG로 프라이밍되었을 때 DC의 유사한 거동이 관찰되었다 (도 16a). 그러므로, 이들 데이터는 FLT3 DC가 과다활성화 상태를 달성할 수 있음을 나타낸다. DC는 cDC1 및 cDC2라는 2개 주요 서브세트로 나뉜다. cDC1은 종양-연관 항원을 교차-제시하고 CD8+ T 세포를 프라이밍할 수 있는 고전적인 DC이다 [37], [38]. 반면에, cDC2는 Th2 면역을 활성화시키는 기생충에 대한 유형 2 면역 반응을 지배한다. 과다활성 DC의 거동이 cDC1 또는 cDC2로 연장되는지를 결정하기 위해, 야생형 나이브 마우스의 비장으로부터 또는 FLT3-DC로부터 cDC1 또는 cDC2를 단리하였다 (도 16b). FLT3-유래 DC의 거동과 유사하게, LPS 및 PGPC 처리 및 LPS 및 oxPAPC를 사용한 더 적은 정도로의 처리는 LDH 방출에 의해 평가된 바와 같이 세포 사멸의 부재 하에 FLT3-유래 cDC1 및 cDC2로부터 TNFα 및 IL-1β의 방출을 유발하였다 (도 11a). 이들 데이터는 PGPC가 cDC1 및 cDC2 과다활성화를 유도하는 oxPAPC의 생물활성 성분임을 나타낸다. 본 발명자들은 또한 파이롭토시스 세포 사멸과 함께 수반되는 파이롭토시스 자극제 LPS 및 알룸에 반응하여, 또한 세포 사멸의 부재 하에 과다활성화 자극제 LPS 및 PGPC에 반응하여 IL-1β를 생성한 비장 cDC2의 유사한 거동을 관찰하였다 (도 16c). 반대로, 비장 cDC1은 파이롭토시스 또는 과다활성화 자극제에 반응하여 최소량의 IL-1β를 생성하였는데, 이는 이들 세포가 분류 후 세포 사멸에 매우 민감하고 LPS에 의해 프라이밍될 수 없었기 때문이다 (도 16c). 전반적으로, 이들 결과는 과다활성화 자극제가 시험관내 또는 생체내에서 분화된 생 DC로부터 IL-1β 방출을 유도하는데 사용될 수 있음을 나타낸다. 실용적인 이유로, 이 논문에서 DC 공급원으로서 FLT3-유래 DC를 계속 사용하였다.
실시예 4: 과다활성 DC는 인플라마좀 의존적 방식으로 CTL 반응을 강화시킨다.
IL-1β는 T 세포 분화, 장기 기억 T 세포 생성 및 이펙터 기능의 중요한 조절인자이다 [12]-[14]. 본 발명자들은 dLN에서 며칠 동안 IL-1β를 생성하는 과다활성 DC가 CD8+ T 세포 자극제를 증진시킬 수 있는지 여부가 궁금하였다. 이를 시험하기 위해, OVA 단백질로 로딩된 DC를 피하로 (s.c) 입양적으로 전달한 후, dLN에서 OVA-특이적 CD8+ T 세포를 측정하고자 하였다. 먼저, OVA 단백질을 흡수하고 H2kb 분자에 OVA 펩티드 SIINFEKL을 교차-제시하는 이질적인 DC 상태의 능력을 시험하였다. 형광 오브알부민 (OVA-FITC)의 등가 내재화에 의해 입증된 바와 같이 이질적인 상태의 모든 DC가 OVA를 유사한 정도로 흡수한다는 것을 발견하였다. 그러나, LPS 또는 CpG로 프라이밍된 활성 DC 및 과다활성 DC가 모두 이들의 나이브 대응물과 비교하여 OVA 단백질 로딩시 증진된 SIINFEKL 교차-제시를 나타냈다는 것을 발견하였다. 이는 DC 성숙이 이들의 항원 제시 능력을 증진시킨다는 것을 보여주는 이전 연구에 따른 것이다. 놀랍게도, 파이롭토시스 자극제 알룸은 DC의 교차-제시 능력을 강하게 감소시켰으며, 이는 파이롭토시스 DC가 최적의 T 세포 자극에 적합하지 않음을 시사한다. 따라서, OVA-로딩된 나이브, 활성, 파이롭토시스 또는 과다활성 DC의 1.106 DC를 WT 마우스에 주사하였을 때, 과다활성 DC가 나이브, 활성 또는 파이롭토시스 DC와 비교하여 수용자 마우스의 dLN에서 가장 높은 빈도 및 절대 수의 SIINFEKL+ CD8+ T 세포를 유도하였음 (도 12a 및 도 17b)을 관찰하였다. 과다활성 DC에 의해 매개된 증진된 CD8+ T 세포 반응은 인플라마좀 활성화에 의존적이었으며, 이는 LPS+PGPC로 처리된 NLRP3-/- DC의 주사가 약한 OVA-특이적 T 세포 반응을 유도하였기 때문이다.
실시예 5: 과다활성화 자극제는 기억 T 세포 생성을 증진시키고, 인플라마좀-의존적 방식으로 항원-특이적 IFNγ 이펙터 반응을 강화시킨다.
본 발명자들은 과다활성 자극제가 과다활성 DC 주사의 효과를 요약할 수 있는 강한 아주반트를 나타낼 수 있다고 가정하였다. 이 가능성을 조사하기 위해, 마우스를 OVA 단독, 또는 OVA + 활성화 자극제 (LPS), 또는 OVA + 과다활성화 자극제 (LPS+oxPAPC 또는 PGPC)로 s.c. 면역화하였다. 면역화 후 7일 및 40일에, dLN에서의 기억 및 이펙터 T 세포 생성을 CD44lowCD62Llow로서의 T 이펙터 세포 (Teff), CD44hiCD62Llow로서의 T 이펙터 기억 세포 (TEM), 및 CD44hiCD62Lhi로서의 T 중심 기억 세포 (TCM)를 구별하는 CD44 및 CD62L 마커를 사용하여 유동 세포계측법에 의해 평가하였다 [47]. 면역화 후 7일에, 과다활성화 자극제는 CD8+ Teff 세포를 유도하는데 있어서 활성화 자극제보다 우수하였다 (도 13a 상부 패널 및 도 18a-18b). 또한, 이 초기 시점에서, 과다활성화 자극제는 가장 높은 존재비의 CD8+ TEM을 유도하였다 (도 13a 중간 패널 및 도 18a-18b). 면역화 후 40일에, 과다활성화 자극제에 노출된 마우스에서 충분한 TCM 세포가 관찰된 반면, 이들 세포는 OVA 단독 또는 LPS로 면역화된 마우스에서 덜 풍부하였다 (도 13a 하부 패널). Teff 및 TEM 세포는 면역화 후 40일에 OVA +로 면역화된 마우스와 비교하여 OVA 단독 또는 LPS로 면역화된 마우스에서 역으로 더 풍부하였다. 그러므로, 이들 데이터는 과다활성화 자극제 oxPAPC 및 PGPC가 이펙터 및 기억 T 세포 생성의 크기를 증진시킴을 나타낸다. 또한, 면역화 후 7일에 Teff 세포의 빈도의 증가는 OVA로 로딩된 나이브 BMDC의 존재 하에 생체외에서 이들의 재자극시 OVA + 과다활성화 자극제로 면역화된 마우스의 dLN으로부터 단리된 CD8+ T 세포의 증진된 IFNγ 반응과 상관관계가 있었다 (도 18c). 또한, 과다활성 자극제로 면역화된 마우스로부터 총 CD8+ T 세포를 단리하고, OVA를 발현하는 B16 종양 세포주 (B16OVA)와 함께 공동-배양하였을 때, CD8+ T 세포는 OVA 단독 또는 OVA + LPS로 면역화된 마우스로부터 단리된 CD8+ T 세포와 비교하여 증진된 탈과립화 활성을 나타내었으며 (도 13b 및 도 18d), 이는 과다활성 자극제가 CTL 기능을 증진시킴을 나타낸다.
별개의 활성화 자극제에 의한 s.c. 면역화로부터 기인된 T 세포의 항원-특이성을 평가하기 위해, 마우스에 OVA 단독 또는 활성화 자극제 (LPS), 또는 파이롭토시스 자극제 (LPS+알룸) 또는 과다활성화 자극제 (LPS+oxPAPC 또는 PGPC)을 주사하였다. 대안적으로, 마우스를 OVA 항원 없이 LPS+PGPC로 s.c. 면역화하였다. 면역화 후 7일에, CD8+ T 세포를 면역화된 마우스의 피부 dLN으로부터 단리하고, OVA-특이적 T 세포 서브세트를 풍부화하기 위해 OVA로 로딩된 (또는 로딩하지 않은) 나이브 BMDC로 7일 동안 생체외에서 재자극하였다. OVA-특이적 T 세포의 T 세포 이펙터 기능을 IFNγ에 대한 세포내 염색에 의해 평가하였다. TCR 특이성을 MHC-제한된 OVA 펩티드 사량체를 사용한 염색에 의해 평가하였다. H2kb 제한된 SIINFEKL (OVA 257-264) 펩티드 사량체를 사용하였다. 사량체+ IFNγ+ 이중 양성 세포의 빈도를 CD4+ 및 CD8+ T 세포 서브세트에 대해 측정하였다. 놀랍게도, 과다활성화 자극제와 함께 OVA는 항원-특이적 T 세포를 유도하는데 있어서 우수하였으며, 이는 oxPAPC- 또는 PGPC-기반 면역화가 OVA 항원으로 CD8+ T 세포 재자극시 가장 높은 빈도의 사량체+ IFNγ+ 반응의 생성을 초래하였기 때문이다 (도 13c). 대조적으로, 파이롭토시스 자극제 (LPS+알룸)는 항원-특이적 IFNγ 반응의 가장 약한 유도자였다 (도 13c). 이들 결과는 이전 연구에 따른 것이며, 이는 알룸이 체액성 면역 및 Th2 반응을 촉진하는데 효과적이지만 Th1 또는 CTL 반응에는 그렇지 않은 아주반트임을 나타내었다 [39,42,43].
이전 연구는 생물활성이 인플라마좀에 의해 자연적으로 제어되는 시토카인인 재조합 IL-1β와의 공동-면역화에 의해 항원-특이적 T 세포 반응이 증진될 수 있음을 나타내었다 [47,13]. 그러나, 과다활성 및 파이롭토시스 자극제 둘 모두가 IL-1β 분비를 유도한다는 사실에도 불구하고, 파이롭토시스 자극제가 아닌 과다활성 자극제가 어떻게 더 높은 항원-특이적 T 세포를 유도하는가? 인플라마좀-매개 사건이 과다활성화 자극제로 생성된 T 세포 반응을 제어하는지를 결정하기 위해, WT 및 NLRP3-/- 마우스에서 T 세포 활성의 병렬식 비교를 수행하였다. 특히, NLRP3이 CD8+ T 세포에 의한 항원-특이적 반응의 과다활성화-유도 증진에 필요하다는 것을 발견하였다 (도 13c). 그러므로 이들 데이터는 과다활성화 자극제 또는 파이롭토시스 자극제 각각을 사용한 면역화 후 비-파이롭토시스 대 파이롭토시스 인플라마좀 활성화가 현저한 차등적 적응 면역 T 세포 제어를 유도한다는 것을 나타낸다.
DC 주사 전략을 사용한 본 발명자들의 이전 결과는 파이롭토시스 자극제로 자극된 DC가 인접한 dLN으로 이동하고 T 세포 활성화를 자극하는 능력을 잃는 반면, 과다활성 자극제에 노출된 DC는 dLN으로 과다이동하고 CTL 반응을 강화시킨다는 것을 나타낸다 (도 12a-12b). 그러나, 내인성 DC가 과다활성 자극제로 면역화한 후 생체내에서 과다활성화를 달성할 수 있는지 여부는 알 수 없다. 이를 평가하기 위해, Zbtb46DTR 및 WT 마우스 또는 Zbtb46DTR 및 NLRP3-/- 마우스 또는 Zbtb46DTR 및 Casp1/11-/- 마우스를 사용하여 마우스 키메라를 생성하였다. 이를 위해, 4주령 CD45.1 방사선조사된 마우스를 이전에 기재된 바와 같은 CD45.2 배경 상에 80%의 Zbtb46DTR 및 20%의 WT 마우스 또는 20%의 NLRP3-/- 또는 20%의 Casp1/11-/- 마우스의 혼합된 골수로 재구성하였다 [51]. 재구성 후 6주에, 모든 마우스에서 BM 재구성의 효능을 cD45.1 대 CD45.2 마커를 사용하여 유동 세포계측법에 의해 평가하였다. 키메라 마우스를 디프테리아 독소 (DT)로 격일로 처리하여 Zbtb46+ 통상적인 DC를 고갈시켜, 과다활성이 될 수 있거나 없는 WT 또는 인플라마좀 결핍 (NLRP3-/- 또는 Casp1/11-/-) DC를 보유하는 마우스를 각각 발생시켰다. CD8+ T 세포 반응에 대한 내인성 DC-과다활성화의 효과를 시험하기 위해, 모든 키메라 마우스를 OVA + LPS+PGPC로 s.c. 면역화한 후 3회 연속 DT 주사를 받았다. 면역화 후 7일에, dLN으로부터의 CD8+ T 세포 반응을 평가하였다. 흥미롭게도, Teff CD8+ T 세포의 존재비가 과다활성이 될 수 있는 WT DC를 보유하는 키메라 마우스와 비교하여 과다활성이 될 수 없는 DC를 보유하는 키메라 마우스에서, 예컨대 NLRP3-/- 및 Casp1/11-/- 키메라 마우스에서 강하게 감소되었다는 것을 발견하였다 (도 13d, 도 19a). 또한, dLN 또는 비장에서 SIINFEKL+ CD8+ T 세포의 빈도가 과다활성이 될 수 없는 DC를 보유하는 NLRP3-/- 및 Casp1/11-/- 키메라 마우스에서 감소된 반면, WT DC를 보유하는 키메라에서 높은 SIINFEKL+ CD8+ 세포가 관찰되었음을 발견하였다 (도 13e, 도 19b). 그러므로, 이들 데이터는 하기를 명백하게 나타낸다: 1) 내인성 DC가 생체내에서 과다활성화 상태를 달성하고 과다활성화 자극제를 사용한 면역화 후 CTL 반응을 강화시킬 수 있고, 2) 내인성 DC 내의 인플라마좀 활성화가 과다활성화-매개 보호 CTL 반응에 중요하다.
실시예 6: 림프 조직으로의 과다활성 DC 진입은 과다활성화-매개 CTL 반응에 필수적이다.
본 발명자들은 이전에 과다활성 자극제로 자극된 DC가 dLN으로 과다이동하고 CTL 반응을 강화시키다는 것을 보여주었다 (도 12a-12b). 과다활성화-매개 CTL 반응이 dLN으로의 내인성 과다활성 DC의 진입을 필요로 하는지를 평가하기 위해, Zbtb46DTR 및 WT 또는 Zbtb46DTR 및 CCR7-/- BM을 사용하여 상기 기재된 바와 같이 마우스 키메라를 생성하였다 (도 13d). 전반적으로, 과다활성 DC의 dLN으로의 내인성 수송은 과다활성화-매개 CTL 기능에 필수적이다.
실시예 7: 과다활성 자극제는 예방적 T 세포 매개 항종양 면역을 자극하기 위해 복합체 항원 공급원을 사용할 수 있다.
항종양 면역을 자극하기 위한 현재의 노력은 상주 T 세포 집단을 활성화하는 전략 (예를 들어, PD-1 차단) 또는 종양-특이적 항원 (TSA)에 대한 드노보 T 세포 반응의 생성을 자극하는 맞춤형 암 백신 전략을 포함한다 [46]. 이 후자의 노력은 종양 세포 용해물을 네오항원으로도 공지된 TSA의 공급원으로서 사용할 수 없다는 점에서 방해를 받았다. 결과적으로, T 세포 매개 항종양 면역을 유도하기 위해 순수한 형태로 사용될 수 있는 네오항원의 식별을 개선시키기 위한 노력이 진행중이다. 이들 노력이 성공을 거두었지만 [50,49,51], 네오항원 식별을 위한 경로는 돌연변이된, 뿐만 아니라 비정상적으로 발현된 TSA 발견을 위한 파이프라인을 필요로 하며 [54], 이는 힘들고 자연적인 사건 과정을 대표하지 않는다. 이전에 논의된 바와 같이, WTL은 항원의 매력적인 대안적인 공급원을 나타내며, 이는 이들 용해물이 맞춤형 항종양 면역 반응의 개시에 필요한 다수의 항원을 제공하기 때문이다. 그러나, 암 백신에 사용되는 가장 효과적인 아주반트의 유형 (상이한 유형의 항원과 연관되는 아주반트의 유형 포함)이 무엇인지와 같은 근본적인 질문은 여전히 답이 없다.
과다활성화 자극제가 WTL에 대한 아주반트일 수 있다는 가능성을 다루기 위해, 마우스를 오른쪽 옆구리에 WTL 단독, 또는 활성화 자극제 LPS 또는 과다활성화 자극제 LPS+oxPAPC 또는 LPS+PGPC와 혼합된 WTL로 면역화하였다. WTL의 공급원은 B16OVA 세포였다. 면역화 후 15일에, 마우스를 모 B16OVA 세포로 왼쪽 상부 등에 s.c 시험감염시켰다. 비면역화된 마우스 또는 WTL 단독으로 면역화된 마우스는 어떠한 보호도 나타내지 않았고, 모든 마우스는 종양 접종 후 24일차까지 큰 종양을 보유하고 사망하였다 (도 20a). 유사하게, WTL+LPS 면역화는 최소 보호를 제공하였다. WTL+LPS로 면역화된 마우스 8마리 중 2마리는 무종양이었지만, B16OVA 재시험감염 후 빠르게 재발하였으며 (도 20a), 이는 단지 DC를 활성화시키는 자극제에 의해 부여된 보호 면역이 없음을 나타낸다. 대조적으로, LPS 및 oxPAPC의 존재 하에 WTL 면역화는 종양 성장의 유의한 지연을 유도하였으며, 모 B16OVA 종양 세포를 사용한 후속 치사 재시험감염에 대한 강한 보호를 초래하였으며; 면역화된 마우스의 50%가 완전히 보호되었다 (도 20a). oxPAPC에 의해 유도된 보호 반응이 T 세포 반응과 상관관계가 있는지 결정하기 위해, 각 활성화 자극제를 받은 마우스로부터 종양을 수확하였다. LPS+oxPAPC로 면역화된 마우스로부터의 종양은 LPS 면역화와 비교하여 상당한 존재비의 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 함유하였다 (도 S7B). 더욱이, 이들 종양으로부터의 동등한 양의 T 세포를 비교하였을 때, oxPAPC-기반 면역화는 항-CD3 및 항-CD28 자극시 가장 높은 양의 IFNγ를 분비한 종양내 T 세포를 초래하였다 (도 20c). 그러므로, 과다활성화 자극제 (LPS+oxPAPC)에 의해 유도된 종양 성장의 우수한 제한은 종양으로의 염증성 T 세포 침윤과 일치하였다.
특히, oxPAPC의 보호 표현형은 순수한 oxPAPC 성분 PGPC에 의해 유도된 것으로 대체되었다. LPS+PGPC의 존재 하에 WTL 면역화는 종양 시험감염 후 150일 동안 마우스의 100%가 무종양이 되도록 하였다. 이들 마우스는 B16OVA 세포를 사용한 치사 재시험감염을 완전히 거부하였고, 초기 종양 시험감염 후 300일에 무종양 상태로 유지되었다 (도 20a). 이들 마우스는 결코 재발하지 않았기 때문에, 본 발명자들은 종양 세포 성장이 WTL + LPS+PGPC로 면역화된 마우스에서 종양 주사 부위에서 어떻게 제어 하에 유지되는가? 궁금하였다.
기억 T 세포 서브세트 중에서, T 상주 기억 세포 (TRM)는 말초 조직에서의 이들의 상주성 특징에 기여하는 C-유형 렉틴 CD69와 함께 CD103 인테그린의 발현에 의해 정의된다 [55]. CD8+ TRM 세포는 최근 많은 관심을 받았으며, 다양한 인간 암 조직의 종양 부위에 이들 세포가 축적되고 보다 유리한 임상 결과와 상관관계가 있기 때문이다 [54,55,56]. 실험적 피부 흑색종 모델에서, 피부의 CD8+ TRM 세포는 흑색종 진행에 대한 지속가능한 보호를 촉진하였다 [58].
종양 주사 부위에서 TRM 세포의 존재, 뿐만 아니라 과다활성화 자극제 LPS+PGPC로 이전에 면역화된 생존자 마우스에서 면역화 피부 생검을 조사하였다. 흥미롭게도, 종양 접종 후 200일에, CD8+ CD69+ CD103+ TRM 세포는 종양 주사 부위에서 고도로 풍부화되었지만, 모든 생존자 마우스에서 면역화 부위에서는 부족하였다 (도 21a-21b). 이들 데이터는 높은 수준의 TRM과 장기간 종양 제어의 상관관계를 보여주는 임상 및 실험 보고서에 따른 것이며, 여기서 TRM은 잠재적으로 장기간 동안 유지되어 종양 주사 부위를 조사한다 [56,57]. 그러므로, WTL 및 과다활성화 자극제를 사용한 면역화는 종양 세포를 억제하는 TRM을 생성할 가능성이 있다.
이들 T 세포의 기능적 특이성을 조사하기 위해, 세포독성 림프구 (CTL) 활성을 생체외에서 모니터링하였다. 순환 기억 CD8+ T 세포 및 TRM 세포를 이전에 과다활성화 자극제를 받은 생존자 마우스의 비장 또는 피부 지방 조직으로부터 단리하였다. 이들 세포를 B16OVA 세포, 또는 OVA를 발현하지 않는 B16 세포 또는 비관련 암 세포주 CT26과 함께 배양하였다. LDH 방출에 의해 평가된 바와 같은 CTL 활성은 CD8+ T 세포가 B16OVA 또는 B16 세포와 혼합된 경우에만 관찰되었다 (도 21c). CT26 세포의 사멸은 관찰되지 않았으며 (도 21c), 이는 과다활성화-유도 T 세포 반응의 기능적 및 항원-특이적 성질을 나타낸다.
과다활성화 자극제에 의해 유도된 항원-특이적 T 세포 반응에 기초하여, T 세포가 종양 진행에 대해 보호하기에 충분한지 여부를 결정하였다. CD8+ T 세포를 생존자 마우스로부터 나이브 마우스로 전달하고, 후속적으로 초기 면역원으로서 사용된 모 종양 세포주로 시험감염시켰다. CD8+ TRM 또는 순환 CD8+ T 세포를 생존자 마우스로부터 나이브 수용자로 전달하는 것은 후속 종양 시험감염으로부터 상당한 보호를 부여하였으며, TRM 서브세트는 우성 보호 역할을 수행한다 (도 21d). 종양 접종 1주 전에 두 T 세포 서브세트 모두를 생존자 마우스로부터 나이브 마우스로 전달하는 것은 후속 종양 시험감염으로부터 수용자 마우스의 100% 보호를 제공하였다 (도 21d). 이들 집합적 데이터는 PGPC-기반 과다활성화 자극제가 강한 순환 및 상주 항종양 CD8+ T 세포 반응을 유도함으로써 B16 흑색종 모델에서 최적의 보호를 부여한다는 것을 나타낸다.
실시예 8: 과다활성 자극제는 확립된 항-PD1 저항성 종양에 대해 보호한다.
과다활성화 자극제가 암 면역요법으로서 활용될 수 있는지를 결정하기 위해, 임의의 추가 처리 전에 성장하는 종양을 보유한 마우스에서 항종양 반응을 조사하였다. 이들 연구를 위해, 배양된 종양 세포를 항원 공급원으로서 사용하는 대신, 비면역화된 마우스로부터의 동계 종양을 사용하여 생체외 WTL을 생성하였으며, 여기서 10 mm 수확된 종양을 해리시킨 후 CD45+ 세포를 고갈시켰다. 마우스를 종양 세포로 왼쪽 상부 등에 피하로 (s.c.) 접종하였다. 종양이 3-4mm의 크기에 도달하였을 때, 종양-보유 마우스를 미처리 상태로 두거나 (비면역화됨), 생체외 WTL 및 LPS+PGPC로 이루어진 치료제 주사를 오른쪽 옆구리에 받았다. 치료제 주사의 2개 후속 s.c. 부스트를 수행하였다 (도 14a). 흥미롭게도, 과다활성화-기반 치료제 주사는 광범위한 종양, 예컨대 B16OVA 및 B16F10 흑색종 모델, MC38OVA 및 CT26 결장암 종양 모델에서 종양 근절을 유도하였다 (도 14b-14d). 이들 모델 모두에서, 면역요법 요법을 받은 마우스의 높은 백분율은 종양 접종 후 오랫동안 무종양 상태로 유지되었다 (도 14b-14d). 면역요법의 효능은 시험된 모든 종양 모델에서 IL-1β에 의존적이었으며, 이는 IL-1β의 중화가 과다활성화 자극제 + 생체외 WTL에 의해 부여된 보호를 폐지하였기 때문이다 (도 14b-14d). 또한, CD8+ T 세포는 면역원성 종양 모델, 예컨대 B16OVA 또는 MC38OVA 종양에 대한 보호에 중요한 반면, CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘 모두는 덜 면역원성인 종양, 예컨대 CT26 및 B16F-10에 대한 보호에 필요하였다 (도 14b-14d) [63]. 과다활성화-기반 면역요법이 PD-1 차단에 기초한 요법과 효능 면에서 비교하는 방법을 결정하기 위해, 병렬식 평가를 수행하였다. 과다활성화-기반 면역요법은 면역원성 B16OVA 모델에서 항-PD-1 요법만큼 효율적이었지만, 항-PD-1 치료에 둔감한 종양 모델, 예컨대 CT26 및 B16F-10에서 더 효율적이었다 (도 14b-14d).
실시예 9: 내인성 과다활성 DC는 T 세포 매개된 지속가능한 항종양 면역을 자극한다.
과다활성 DC의 종양-보유 마우스로의 입양 전달은 강한 항종양 면역을 유도한다 (도 12a-12b). 내인성 DC가 과다활성화-매개 항종양 반응을 개시할 수 있는지 여부를 시험하기 위해, DT 주사에 의해 통상적인 DC가 고갈되는 Zbtb46DTR 마우스를 사용하였다. Zbtb46DTR 또는 WT 마우스에 B16OVA 세포를 s.c. 주사하였다. 그 후, 이들의 면역화 전에 Zbtb46DTR 마우스에서 상주 DC를 완전히 고갈시키기 위해 DT를 격일로 주사하였다. 종양이 4mm의 크기에 도달하였을 때, Zbtb46DTR 또는 WT 마우스를 B16OVA WTL + 과다활성화 자극제 LPS+PGPC로 면역화하였다. 마우스의 90%에서 종양을 거부한 WT 마우스와 대조적으로, Zbtb46DTR 마우스 (DC가 결여됨)는 종양을 거부할 수 없었다는 것을 발견하였다. 이들 데이터는 DC가 과다활성화-매개 보호의 개시제임을 확인시켜준다 (도 15a).
실시예 10: 과다활성 cDC1은 복합체 항원 공급원을 사용하여 T 세포 매개 항종양 면역을 자극할 수 있다.
cDC1 및 cDC2 둘 모두가 과다활성화 상태를 달성할 수 있다는 것을 시험관내에서 입증하였는데, 이는 이들 세포가 이들의 생존력을 유지하면서 LPS+PGPC에 반응하여 IL-1β를 생성하기 때문이다. 이들 데이터는 생체내에서 과다활성화-매개 항종양 반응을 개시하는 특정 DC 서브세트를 추가로 정의할 권한을 제공한다. 종양 거부에서 cDC1 서브세트의 중요성을 감안할 때, 본 발명자들은 cDC1이 과다활성화-매개 항종양 보호를 유도하는데 중심 역할을 한다고 가정하였다. 이 아이디어를 시험하기 위해, Batf3-/- 마우스 (cDC1이 결여되어 있으나 cDC2 세포를 보유함)를 사용하였다 [65]. 이를 위해, Batf3-/- 또는 WT 종양-보유 마우스 (3-4mm의 B16OVA 종양을 보유함)를 LPS+PGPC 및 WTL로 면역화하였다. 이들 마우스는 7일마다 2개 s.c 부스트 주사를 받았다. 비면역화된 Batf3-/- 마우스가 비면역화된 WT 마우스보다 더 중증인 종양 성장을 나타내었고, 모든 마우스가 종양 접종 후 18일 만에 종양에 굴복한다는 것을 관찰하였다. 이 데이터는 고도로 면역원성인 종양의 거부가 cDC1 세포가 결여된 Batf3-/- 마우스에서 강하게 손상된다는 것을 보여주는 이전 연구를 확증한다 [65]. 흥미롭게도, Batf3-/- 마우스의 면역화는 비면역화된 Batf3-/- 마우스와 비교하여 이들의 생존을 몇 일만큼 개선시켰다는 사실에도 불구하고, 모든 Batf3-/- 마우스는 종양 접종 후 25일까지 종양 성장에 굴복하였다. 대조적으로, WT 마우스는 종양-보유 마우스의 100%에서 종양을 거부하였다 (도 15c). 그러므로, cDC1은 과다활성화-매개 항종양 면역에서 중요한 역할을 한다. 또한, 면역화된 WT 마우스는 TME 및 피부 dLN에서 높은 빈도의 항원-특이적 CD8+ 및 CD4+ T 세포를 유도한 반면, 면역화된 Batf3-/-는 약간 감소된 항원 CD4+ T 세포를 유도하였지만, TME에서 항원-특이적 CD8+ T 세포는 현저하게 없었다 (도 15d).
수명이 긴 항종양 보호를 유도하는데 있어서 과다활성 cDC1의 역할을 추가로 확인하기 위해, Batf3-/-에서 항종양 보호를 복구하는 과다활성 cDC1의 능력을 평가하고자 하였다. 나이브, 활성, 또는 과다활성 cDC1 세포를 Batf3-/- 마우스에 입양적으로 전달하였다. 이를 위해, FLT3-유래 cDC1을 이전에 기재된 바와 같이 B220-MHC-II+CD11c+CD24+ 세포로서 C57BL/6J 마우스로부터 분류하였다. cDC1을 시험관내에서 상기 기재된 바와 같이 처리하고, B16OVA WTL로 로딩한 후, 1.10e6 세포를 종양-보유 Batf3-/- 마우스에 s.c. 주사하였다. 주사되지 않은 마우스와 비교하여 약간의 개선된 마우스 생존만을 제공한 나이브 또는 활성 cDC1와 대조적으로, 과다활성 cDC1은 종양-보유 마우스의 100%에서 종양 거부를 유도하였으며, 이는 종양 접종 후 60일 이상 동안 무종양 상태로 유지되었음을 관찰하였다 (도 15e). 참고로, 과다활성 cDC1 주사는 종양 및 피부 dLN에서 SIINFEKL 사량체 염색에 의해 측정된 바와 같이 Batf3-/-에서 CD8+ T 세포 반응을 복구하였다 (도 15f). 대조적으로, 나이브 또는 활성 cDC1 주사는 항원-특이적 CD8+ T 세포를 복구하는데 실패하였다. cDC1 매개된 종양 거부는 인플라마좀 활성화에 의존적이었으며, 이는 LPS+PGPC로 처리된 NLRP3-/- cDC1의 주사가 어떠한 항종양 보호도 제공하지 않았고, CD8+ T 세포 반응을 복구하는 과다활성 cCD1의 능력을 폐지하였기 때문이다 (도 15f).
생 세포로부터 IL-1을 생성하는 이들의 능력에 더하여, 과다활성 DC는 인접한 dLN으로 고도로 이동하여 CD8+ T 세포 반응을 강화시킨다 (도 12a-12b).
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
기타 실시양태
본 발명은 그의 상세한 설명과 함께 설명되었지만, 전술한 설명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 범위를 제한하지 않고 예시하기 위한 것으로 이해되어야 한다. 다른 측면, 장점 및 변형은 하기 청구범위의 범위 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Children's Medical Center Corporation <120> Hyperactive Dendritic Cells Enable Durable Adoptive Cell Transfer-Based Anti-Tumor Immunity <130> 37314-0098WO1 <140> PCT/US2020/061132 <141> 2020-11-18 <150> US 62/937,075 <151> 2019-11-18 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ovalbumin peptide <400> 1 Ser Ile Ile Asn Phe Glu Lys Leu 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Ovalbumin peptide <400> 2 Ala Ala His Ala Glu Ile Asn Glu Ala 1 5

Claims (21)

  1. 하기 단계를 포함하는, 치료적 수지상 세포 집단을 생성하는 방법:
    세포 공여자로부터 생 수지상 세포를 수득하는 단계;
    수지상 세포를 TLR 리간드로 생체외에서 프라이밍하는 단계;
    프라이밍된 수지상 세포를 비-정규 인플라마좀-활성화 지질과 함께 생체외에서 배양하는 단계; 및
    수지상 세포에 면역원을 로딩하여, 이에 의해 치료적 수지상 세포 집단을 생성하는 단계.
  2. 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법:
    세포 공여자로부터 생 수지상 세포를 수득하는 단계;
    수지상 세포를 TLR 리간드로 생체외에서 프라이밍하는 단계;
    프라이밍된 수지상 세포를 비-정규 인플라마좀-활성화 지질과 함께 생체외에서 배양하는 단계;
    수지상 세포에 면역원을 로딩하여, 이에 의해 치료적 수지상 세포 집단을 생성하는 단계; 및
    생 수지상 세포를 대상체에게 투여하여, 이에 의해 대상체에서 면역 반응을 유도하는 단계.
  3. 하기 단계를 포함하는, 대상체에서 암을 치료하는 방법:
    세포 공여자로부터 생 수지상 세포를 수득하는 단계;
    수지상 세포를 TLR 리간드로 생체외에서 프라이밍하는 단계;
    프라이밍된 수지상 세포를 비-정규 인플라마좀-활성화 지질과 함께 생체외에서 배양하는 단계;
    수지상 세포에 면역원을 로딩하여, 이에 의해 치료적 수지상 세포 집단을 생성하는 단계; 및
    생 수지상 세포를 대상체에게 투여하여, 이에 의해 대상체에서 암을 치료하는 단계.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 공여자 및/또는 대상체가 포유동물 대상체인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 세포 공여자 및/또는 대상체가 인간 대상체인 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 공여자로부터 수지상 세포를 수득하는 것이 하기를 포함하는 것인 방법:
    세포 공여자로부터 선조 세포를 수확하는 것; 및
    분화를 유도하기에 효과적인 조건 하에 생체외에서 선조 세포를 배양하여, 이에 의해 세포 공여자로부터 수지상 세포를 수득하는 것.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체로부터 수지상 세포를 수득하는 것이 세포 공여자로부터 생체내 분화된 수지상 세포를 수확하는 것을 포함하는 것인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원이 암의 발병과 연관된 감염원으로부터의 면역원인 방법.
  9. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원이 암 항원인 방법.
  10. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 면역원이 전체 종양 용해물인 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 면역원이 자가유래인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이밍 및 상기 배양이 동시에 일어나는 것인 방법.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프라이밍이 상기 배양 전에 일어나는 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, TLR 리간드가 TLR1 리간드, TLR2 리간드, TLR3 리간드, TLR4 리간드, TLR5 리간드, TLR6 리간드, TLR7 리간드, TLR8 리간드, TLR9 리간드, TLR10 리간드, TLR11 리간드, TLR12 리간드, TLR13 리간드, 및 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, TLR 리간드가 TLR4 리간드인 방법.
  16. 제15항에 있어서, TLR4 리간드가 모노포스포릴 지질 A (MPLA), 리포폴리사카라이드 (LPS), 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 비-정규 인플라마좀-활성화 지질이 산화된 1-팔미토일-2-아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (oxPAPC)의 종을 포함하는 것인 방법.
  18. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 비-정규 인플라마좀-활성화 지질이 2-[[(2R)-2-[(E)-7-카르복시-5-히드록시헵트-6-에노일]옥시-3-헥사데카노일옥시프로폭시]-히드록시포스포릴]옥시에틸-트리메틸아자늄 (HOdiA-PC), [(2R)-2-[(E)-7-카르복시-5-옥소헵트-6-에노일]옥시-3-헥사데카노일옥시프로필] 2-(트리메틸아자늄일)에틸 포스페이트 (KOdiA-PC), 1-팔미토일-2-(5-히드록시-8-옥소-옥테노일)-sn-글리세로-3-포스포릴콜린 (HOOA-PC), 2-[[(2R)-2-[(E)-5,8-디옥소옥트-6-에노일]옥시-3-헥사데카노일옥시프로폭시]-히드록시포스포릴]옥시에틸-트리메틸아자늄 (KOOA-PC), [(2R)-3-헥사데카노일옥시-2-(5-옥소펜타노일옥시)프로필] 2-(트리메틸아자늄일)에틸 포스페이트 (POVPC), [(2R)-2-(4-카르복시부타노일옥시)-3-헥사데카노일옥시프로필] 2-(트리메틸아자늄일)에틸 포스페이트 (PGPC), [(2R)-3-헥사데카노일옥시-2-[4-[3-[(E)-[2-[(Z)-옥트-2-에닐]-5-옥소시클로펜트-3-엔-1-일리덴]메틸]옥시란-2-일]부타노일옥시]프로필] 2-(트리메틸아자늄일)에틸 포스페이트 (PECPC), [(2R)-3-헥사데카노일옥시-2-[4-[3-[(E)-[3-히드록시-2-[(Z)-옥트-2-에닐]-5-옥소시클로펜틸리덴]메틸]옥시란-2-일]부타노일옥시]프로필] 2-(트리메틸아자늄일)에틸 포스페이트 (PEIPC), 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 비-정규 인플라마좀-활성화 지질이 [(2R)-2-(4-카르복시부타노일옥시)-3-헥사데카노일옥시프로필] 2-(트리메틸아자늄일)에틸 포스페이트 (PGPC)를 포함하는 것인 방법.
  20. 제2항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 항암제를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 항암제가 화학요법제인 방법.
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