JP2023503427A - 超活性樹状細胞は養子細胞移植に基づく持続性抗腫瘍免疫を可能にする - Google Patents

超活性樹状細胞は養子細胞移植に基づく持続性抗腫瘍免疫を可能にする Download PDF

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Abstract

本出願は、がん免疫療法、例えばＴ細胞性抗腫瘍療法の刺激に関連する。

Description

優先権主張
本出願は、２０１９年１１月１８日に出願した米国仮出願第６２／９３７，０７５号の利益を主張する。前記の全内容は、参照により本明細書に組み込まれている。
連邦政府資金による研究または開発
本発明は、米国国立衛生研究所によるグラント番号ＡＩ１１６５５０のもと、政府援助を受けてなされたものである。政府は、本発明に対して特定の権利を有する。
技術分野
本出願は、がん免疫療法、例えば、Ｔ細胞性抗腫瘍療法の刺激に関する。
背景技術
感染およびがんに対する防御免疫の理解にとって中心となるのは、身体の組織を巡回する遊走性食細胞である樹状細胞（ＤＣ）である（Ｄ．Ａｌｖａｒｅｚ、Ｅ．Ｈ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２９巻、３号、３２５～４２ページ、２００８年９月）。ＤＣは、宿主にとっての脅威である環境、最も一般的には、感染または組織損傷の証拠をサーベイする。この監視は、脅威評価受容体（典型的には、微生物産物、または組織傷害を示唆するホストコード分子を認識するパターン認識受容体（ＰＲＲ）として公知）のスーパーファミリーの作用により達成される（Ｓ．Ｗ．Ｂｒｕｂａｋｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３３巻、２５７～９０ページ、２０１５年；Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＲ．Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２０巻、１９７～２１６ページ、２００２年１月）。ＰＲＲに対する微生物リガンドは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と分類され、一方、宿主由来ＰＲＲリガンドは、ダメージ関連分子パターン（ＤＡＭＰ）である（Ｐ．Ｍａｔｚｉｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９６巻、５５６６号、３０１～５ページ、２００２年４月）。
ＰＡＭＰを検出すると、ＰＲＲは、ＰＲＲを発現するＤＣの生理を根本的に変えるシグナル伝達経路を解放する（Ａ．ＩｗａｓａｋｉおよびＲ．Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１６巻、４号、３４３～５３ページ、２０１５年４月；Ｏ．Ｊｏｆｆｒｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、２２７巻、１号、２３４～２４７ページ、２００９年１月）。例えば、ＰＲＲの活性化前は、ＤＣは、典型的に非炎症性細胞と見なされる。細胞外ＰＡＭＰに遭遇すると、ＰＲＲは、サイトカイン、ケモカインおよびインターフェロンを含む多数の炎症性メディエーターの迅速かつロバストなアップレギュレーションを刺激する。それらの遺伝子の発現と同時に起きるのが、流入領域リンパ節（ｄＬＮ）へのＤＣの遊走ならびにＴ細胞活性化にとって重要な因子、例えばＭＨＣおよび共刺激分子のアップレギュレーションである。したがって、ＰＲＲシグナル伝達過程は、ＤＣ活性を、非刺激（ナイーブ）状態から「活性化」状態へとシフトさせる（Ｋ．Ｉｎａｂａら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９１巻、６号、９２７～３６ページ、２０００年３月；Ｉ．ＭｅｌｌｍａｎおよびＲ．Ｍ．Ｓｔｅｉｎｍａｎ、Ｃｅｌｌ、１０６巻、３号、２５５～８ページ、２００１年８月）。
概要
がん免疫療法に対する目下の取組みを多様化する必要性が存在する。したがって、本出願は、治療用樹状細胞の集団を生成する方法、対象において免疫応答を誘導する方法、がんを処置するための方法、Ｉ型Ｔヘルパー（ＴＨ１）および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の応答を、ＴＨ２免疫の非存在下において誘導する樹状細胞（ＤＣ）を超活性化する方法を対象とする。超活性化刺激は、ＰＤ－１阻害に対して感受性または耐性である腫瘍に対して防御するＴ細胞応答を促進する。この防御応答は、ＤＣ中のインフラマソームに依存し、腫瘍溶解物を免疫原として使用して引き起こせる。
特定の実施形態では、対象において免疫原に対する保護免疫応答を誘導する方法は、樹状細胞を得る工程、樹状細胞を有効量の非標準的インフラマソーム活性化脂質と共にｅｘ ｖｉｖｏで培養する工程、および、対象に生きた樹状細胞を防御免疫応答を増強する有効量で投与し、それによって防御免疫応答を誘導する工程を含む。いくつかの実施形態では、治療上有効量の非標準的インフラマソーム活性化脂質は、樹状細胞を超活性化する。
特定の実施形態では、樹状細胞は、場合により、ｅｘ ｖｉｖｏで免疫原と共に培養される。特定の実施形態では、樹状細胞は、場合により、サイトカインと共にｅｘ ｖｉｖｏで培養される。
特定の実施形態では、非標準的インフラマソーム活性化脂質は、１－パルミトイル－２－アラキドニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルコリン（ＰＡＰＣ）、酸化１－パルミトイル－２－アラキドニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルコリン（ｏｘＰＡＰＣ）、ｏｘＰＡＰＣ種、それらの成分、またはそれらの組合せを含む。
特定の実施形態では、本方法は、化学療法剤を投与する工程をさらに含む。
特定の実施形態では、本明細書に開示される処置アプローチを、以下の治療のいずれかと組み合わせることもできる：放射線、化学療法、外科的処置、治療用抗体、免疫調節剤、プロテアソーム阻害剤、汎脱アセチル化酵素（ＤＡＣ）阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、チェックポイント阻害剤、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法およびＮＫ細胞療法を含む養子細胞療法、ならびにワクチン。
好ましくは、本明細書に記載される方法が、対象におけるがん、例えば腫瘍の増殖もしくは進行、またはウイルス感染を阻害する。例えば、本明細書に記載される方法は、腫瘍の増殖を、少なくとも１％、例えば、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％阻害する。別の場合、本明細書に記載される方法が、腫瘍のサイズを、直径で少なくとも１ｍｍ、例えば、直径で少なくとも２ｍｍ、直径で少なくとも３ｍｍ、直径で少なくとも４ｍｍ、直径で少なくとも５ｍｍ、直径で少なくとも６ｍｍ、直径で少なくとも７ｍｍ、直径で少なくとも８ｍｍ、直径で少なくとも９ｍｍ、直径で少なくとも１０ｍｍ、直径で少なくとも１１ｍｍ、直径で少なくとも１２ｍｍ、直径で少なくとも１３ｍｍ、直径で少なくとも１４ｍｍ、直径で少なくとも１５ｍｍ、直径で少なくとも２０ｍｍ、直径で少なくとも２５ｍｍ、直径で少なくとも３０ｍｍ、直径で少なくとも４０ｍｍ、直径で少なくとも５０ｍｍ、またはそれ以上小さくする。いくつかの場合、対象が、腫瘍の大部分を切除された。
異なる定義がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が帰属する技術分野の当業者の１人が一般的に理解するのと同じ意味を有する。方法および材料を、本発明での使用向けに本明細書に記載する。当該技術分野では公知である、他の適切な方法および材料も使用可能である。材料、方法および実施例は一例にすぎず、限定的であるとは意図されない。本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリーおよび他の参考文献は、参照によってその全体を本明細書に組み入れる。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書が照合することになる。
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な記載、図面から、および特許請求の範囲から明らかになる。
超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示す一連のグラフである。図１Ａ～１Ｆ：ＷＴ ＢＭＤＣを、未処理のままとした（なし）、またはＬＰＳのみ、もしくはアラムのみ、もしくはｏｘＰＡＰＣのみもしくはＰＧＰＣのみで２４ｈ処理した、あるいはＢＭＤＣを、ＬＰＳで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。図１Ａ：サイトカイン、ＩＬ－１βおよびＴＮＦαの放出を、ＥＬＩＳＡによりモニタリングした。４匹のマウスの平均およびＳＤを示し、各パネルは、独立した２回の実験を代表する。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。 超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示す一連のグラフである。図１Ａ～１Ｆ：ＷＴ ＢＭＤＣを、未処理のままとした（なし）、またはＬＰＳのみ、もしくはアラムのみ、もしくはｏｘＰＡＰＣのみもしくはＰＧＰＣのみで２４ｈ処理した、あるいはＢＭＤＣを、ＬＰＳで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。図１Ｂ：細胞上清へのＬＤＨ放出により、細胞死亡率を測定した。４匹のマウスの平均およびＳＤを示し、各パネルは、独立した２回の実験を代表する。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。 超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示す一連のグラフである。図１Ａ～１Ｆ：ＷＴ ＢＭＤＣを、未処理のままとした（なし）、またはＬＰＳのみ、もしくはアラムのみ、もしくはｏｘＰＡＰＣのみもしくはＰＧＰＣのみで２４ｈ処理した、あるいはＢＭＤＣを、ＬＰＳで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。図１Ｃ：図１Ａのように表示の刺激で処理したＢＭＤＣを、ｌｉｖｅ－ｄｅａｄバイオレットキットを用いてＣＤ１１ｃおよびＣＤ４０で染色した。表面ＣＤ４０の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（ＣＤ１１ｃ＋生細胞のうち）を、フローサイトメトリーで測定する。４匹のマウスの平均およびＳＤを示し、各パネルは、独立した２回の実験を代表する。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。 超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示す一連のグラフである。図１Ａ～１Ｆ：ＷＴ ＢＭＤＣを、未処理のままとした（なし）、またはＬＰＳのみ、もしくはアラムのみ、もしくはｏｘＰＡＰＣのみもしくはＰＧＰＣのみで２４ｈ処理した、あるいはＢＭＤＣを、ＬＰＳで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。図１Ｄ：表示の刺激で前処理したＢＭＤＣを、ＣＤ４０コートプレート上に移し、２４ｈ培養した。ＩＬ－１２ｐ７０サイトカインの放出を、ＥＬＩＳＡにより測定した。４匹のマウスの平均およびＳＤを示し、各パネルは、独立した２回の実験を代表する。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。 超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示す一連のグラフである。図１Ａ～１Ｆ：ＷＴ ＢＭＤＣを、未処理のままとした（なし）、またはＬＰＳのみ、もしくはアラムのみ、もしくはｏｘＰＡＰＣのみもしくはＰＧＰＣのみで２４ｈ処理した、あるいはＢＭＤＣを、ＬＰＳで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。図１Ｅ：図１Ａのように表示の刺激で前処理したＢＭＤＣを、ＯＶＡタンパク質と共に２ｈ、またはＦＩＴＣ標識ＯＶＡと共に４５分間インキュベートした。ＯＶＡ－ＦＩＴＣの取込み（左パネル）を、フローサイトメトリーで評価した。データは、３７℃におけるＯＶＡ関連ＣＤ１１ｃ＋ＢＭＤＣの百分率として表し、４℃におけるＯＶＡ関連ＣＤ１１ｃ＋ＢＭＤＣに対して正規化した。ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）に結合したＨ－２Ｋｂに対するＰＥ結合型抗体を使用して、ＭＨＣ－Ｉ上でのＯＶＡペプチド提示（右パネル）をモニタリングした。データは、ＣＤ１１ｃ＋生細胞のうちのＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）関連ＤＣの頻度として表す。３つのレプリケートからの平均およびＳＤを示し、データは、少なくとも３回の独立した実験を代表する。４匹のマウスの平均およびＳＤを示し、各パネルは、独立した２回の実験を代表する。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。 超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示す一連のグラフである。図１Ａ～１Ｆ：ＷＴ ＢＭＤＣを、未処理のままとした（なし）、またはＬＰＳのみ、もしくはアラムのみ、もしくはｏｘＰＡＰＣのみもしくはＰＧＰＣのみで２４ｈ処理した、あるいはＢＭＤＣを、ＬＰＳで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。図１Ｆ：図１Ａのように表示の刺激で処理したＢＭＤＣに、ＯＶＡタンパク質またはＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬを１ｈロードし（またはロードせず）、次いで、脾臓のＯＴ－ＩＩナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞またはＯＴ－ＩナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞と共に４日間インキュベートした。図１Ｆ：４日目に上清を捕集し、サイトカインＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＴＮＦαおよびＩＬ－１３の放出をＥＬＩＳＡにより測定した。４匹のマウスの平均およびＳＤを示し、各パネルは、独立した２回の実験を代表する。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。 超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示す一連のグラフである。図１Ｇ：ＢＭＤＣを、未処理のままとした（なし）もしくはＬＰＣで２４ｈ処理した、またはＢＭＤＣを、ＬＰＳで３ｈプライミングしてから、ＰＧＰＣもしくはアラムで２１ｈ処理した。処理したＢＭＤＣを、図１Ｆのように、脾臓のＯＴ－Ｉ Ｔ細胞またはＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞と共に培養した。共培養から４日後、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、ブレフェルジンＡおよびモネンシンの存在下においてＰＭＡ＋イオノマイシンで５ｈ刺激した。ＣＤ４＋Ｔ細胞のうち、ＴＨ１細胞の頻度をＴＮＦα＋ＩＦＮγ＋として、ＴＨ２細胞の頻度をＧａｔａ３＋ＩＬ－４＋ＩＬ－１０＋として、細胞内染色により測定した。データは、ＴＨ１細胞／ＴＨ２細胞の比率として表す（左パネル）。ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのＩＦＮγ＋の頻度を、右パネルに表す。３つのレプリケートからの平均およびＳＤを示し、各パネルは、少なくとも２回の独立した実験を代表する。４匹のマウスの平均およびＳＤを示し、各パネルは、独立した２回の実験を代表する。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。 超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示す一連のグラフである。図１Ｈ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右わき腹に、ｅｎｄｏｆｉｔ－ＯＶＡタンパク質を単独またはＬＰＳと共に、表示のように不完全フロイトアジュバント（ＩＦＡ）またはアラムのいずれか中で乳化させて皮下注射した。その代わりに、ｅｎｄｏｆｉｔ－ＯＶＡタンパク質およびＬＰＳ＋ＯｘＰＡＰＣまたはＰＧＰＣを、いずれもＩＦＡ中で乳化させてマウスに注射した。免疫化から４０日後、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を、皮膚流入領域リンパ節（ｄＬＮ）から単離した。次いで、Ｔ細胞を、ＯＶＡまたはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをロードした（またはロードしていない）ナイーブＢＭＤＣと共に５日間培養した。ＩＦＮγ、ＩＬ－１０およびＩＬ－１３の分泌をＥＬＩＳＡにより測定した。４匹のマウスの平均およびＳＤを示し、各パネルは、独立した２回の実験を代表する。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００５。 Ｃ５７ＢＬ／６ ＷＴマウスの左上背部に、５×１０５個のＢ１６ＯＶＡ生細胞を皮下接種した。腫瘍チャレンジから７日目、１４日目および２１日目に、マウスの右わき腹に、５×１０６個の未処理ＷＴ ＢＭＤＣ（ＤＣナイーブ）、またはＬＰＳで２３ｈ処理し、次いでＢ１６ＯＶＡ ＷＴＬで１ｈパルスした活性ＷＴ ＢＭＤＣ（ＤＣＬＰＳ）、またはＷＴ、またはＮＬＲＰ３－／－、またはＬＰＳで３ｈプライミングし、ＰＧＰＣで２０ｈ処理して、次いでＢ１６ＯＶＡ ＷＴＬで１ｈパルスしたｃａｓｐ１／１１－／－ ＢＭＤＣ（ＤＣＬＰＳ＋ＰＧＰＣ）を皮下注射した。生存を毎日モニタリングした（群当たりｎ＝５のマウス）。 超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示す一連のグラフである。図３Ａ、図３Ｂ：ＧＭＣＳＦを用いて生成したＢＭＤＣを、未処理のままとした（なし）、またはＭＰＬＡのみ、アラムのみ、もしくはＯｘＰＡＰＣのみ、もしくはＰＧＰＣのみで２４ｈ処理した、またはＢＭＤＣを、ＭＰＬＡで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。図５Ａ：サイトカインＩＬ－１βおよびＴＮＦαの放出を、ＥＬＩＳＡによりモニタリングした。３つのレプリケートの平均およびＳＤが示され、全てのパネルは少なくとも３回の独立した実験を代表する。＊Ｐ＜０．０５。 超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示す一連のグラフである。図３Ａ、図３Ｂ：ＧＭＣＳＦを用いて生成したＢＭＤＣを、未処理のままとした（なし）、またはＭＰＬＡのみ、アラムのみ、もしくはＯｘＰＡＰＣのみ、もしくはＰＧＰＣのみで２４ｈ処理した、またはＢＭＤＣを、ＭＰＬＡで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。図３Ｂ：細胞上清へのＬＤＨ放出により、細胞死亡率を測定した。３つのレプリケートの平均およびＳＤが示され、全てのパネルは少なくとも３回の独立した実験を代表する。＊Ｐ＜０．０５。 超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示す一連のグラフである。図３Ｃ、図３Ｄ：脾臓ＣＤ１１ｃ＋をソートし、未処理のままとした（なし）、またはＬＰＳのみ、もしくはアラムのみ、もしくはＰＧＰＣのみで処理した、またはＤＣを、ＬＰＳで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。図３Ｃ：サイトカインＩＬ－１βおよびＴＮＦαの放出を、ＥＬＩＳＡによりモニタリングした。３つのレプリケートの平均およびＳＤが示され、全てのパネルは少なくとも３回の独立した実験を代表する。＊Ｐ＜０．０５。 超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示す一連のグラフである。図３Ｃ、図３Ｄ：脾臓ＣＤ１１ｃ＋をソートし、未処理のままとした（なし）、またはＬＰＳのみ、もしくはアラムのみ、もしくはＰＧＰＣのみで処理した、またはＤＣを、ＬＰＳで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。図３Ｄ：細胞上清へのＬＤＨ放出により、細胞死亡率を測定した。３つのレプリケートの平均およびＳＤが示され、全てのパネルは少なくとも３回の独立した実験を代表する。＊Ｐ＜０．０５。 超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示す一連のグラフである。図３Ｅ～図３Ｆ：ＧＭＣＳＦを用いて生成した、Ａのように表示の刺激で処理したＢＭＤＣを、ｌｉｖｅ－ｄｅａｄバイオレットキットを用いて抗ＣＤ１１ｃ抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ６９抗体、および抗Ｈ２ｋｂ抗体で染色した。図３Ｅ：ＣＤ１１ｃ＋生細胞のうちで、表面のＣＤ８０（左パネル）、ＣＤ６９（中央パネル）およびＨ２ｋｂ（右パネル）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、フローサイトメトリーで測定した。３つのレプリケートの平均およびＳＤが示され、全てのパネルは少なくとも３回の独立した実験を代表する。＊Ｐ＜０．０５。 超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示すグラフおよび一連のプロットである。図４Ａ～図４Ｃ：ＷＴ ＢＭＤＣを、未処理のままとした（なし）、またはＬＰＳのみ、もしくはアラムのみ、もしくはＯｘＰＡＰＣのみ、もしくはＰＧＰＣのみで２４ｈ処理した、またはＢＭＤＣを、ＬＰＳで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。図４Ａ：ＢＭＤＣを、固定可能なＦＩＴＣ標識ＯＶＡと共に、３７℃または４℃において４５分間インキュベートした。次いで、ＢＭＤＣを、ｌｉｖｅ－ｄｅａｄバイオレットキットで染色した。フローサイトメトリーにより、４℃でのＯＶＡ関連ＢＭＤＣと比べた３７℃でのＯＶＡ－ＦＩＴＣ関連ＢＭＤＣの頻度を特定するためのゲーティング戦略。４匹のマウスの平均およびＳＤを示し、各パネルは、独立した２回の実験を代表する。＊＊＊Ｐ＜０．００５。 超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示すグラフおよび一連のプロットである。図４Ａ～図４Ｃ：ＷＴ ＢＭＤＣを、未処理のままとした（なし）、またはＬＰＳのみ、もしくはアラムのみ、もしくはＯｘＰＡＰＣのみ、もしくはＰＧＰＣのみで２４ｈ処理した、またはＢＭＤＣを、ＬＰＳで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。図４Ｂ：ＢＭＤＣを、ｅｎｄｏｆｉｔ－ＯＶＡタンパク質と共に２時間インキュベートした。ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬに結合したＨ－２Ｋｂに対するＰＥ結合型抗体を使用してフローサイトメトリーにより測定した、生存ＢＭＤＣの表面上のＨ２ｋｂに結合したＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）ペプチドの頻度を特定するためのゲーティング戦略。各パネルは、３つの実験のうちの１つの実験の３つのレプリケートを代表する。４匹のマウスの平均およびＳＤを示し、各パネルは、独立した２回の実験を代表する。＊＊＊Ｐ＜０．００５。 超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示すグラフおよび一連のプロットである。図４Ａ～図４Ｃ：ＷＴ ＢＭＤＣを、未処理のままとした（なし）、またはＬＰＳのみ、もしくはアラムのみ、もしくはＯｘＰＡＰＣのみ、もしくはＰＧＰＣのみで２４ｈ処理した、またはＢＭＤＣを、ＬＰＳで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。図４Ｃ：Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右わき腹に、ｅｎｄｏｆｉｔ－ＯＶＡタンパク質を単独で、またはＬＰＳと共に、表示のように不完全フロイトアジュバント（ＩＦＡ）またはアラムのいずれかの中で乳化させて皮下注射した。その代わりに、ｅｎｄｏｆｉｔ－ＯＶＡタンパク質およびＬＰＳ＋ＯｘＰＡＰＣまたはＰＧＰＣを、いずれもＩＦＡ中で乳化させてマウスに注射した。免疫化から４０日後、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、皮膚流入領域リンパ節（ｄＬＮ）から単離した。次いで、Ｔ細胞を、ＯＶＡをロードした（またはしていない）ナイーブＢＭＤＣと共に５日間培養した。ＩＬ－４分泌を、ＥＬＩＳＡにより測定した。４匹のマウスの平均およびＳＤを示し、各パネルは、独立した２回の実験を代表する。＊＊＊Ｐ＜０．００５。 超活性ＤＣが、優れた抗原提示細胞であり、かつＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１優位の免疫応答を促進することを示す一連のプロットである。ＢＭＤＣを、未処理のままとした（なし）、またはＬＰＣで２４ｈ処理した、またはＢＭＤＣをＬＰＳで３ｈプライミングしてから、ＰＧＰＣもしくはアラムで２１ｈ処理した。処理したＢＭＤＣを、次いで脾臓ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞と共に、１：５（ＢＭＤＣ：Ｔ細胞）の比率で共培養した。共培養から４日後、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、ブレフェルジンＡおよびモネンシンの存在下においてＰＭＡ＋イオノマイシンで５ｈ刺激した。細胞内染色により測定した、ＣＤ４＋Ｔ生細胞のうちのＩＬ－４＋ＩＬ－１０＋であるＴＨ２細胞の頻度を特定するためのゲーティング戦略。各パネルは、３つの実験のうちの１つの実験の３つのレプリケートを代表する。 ｃＤＣ１細胞およびｃＤＣ２細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで超活性化状態を達成することを示す、一連のグラフおよび免疫染色である。（図６Ａ～６Ｂ）脾臓ＤＣ（左側パネル）またはＦＬＴ３生成ＤＣ（右側パネル）を、ｃＤＣ１（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ２４＋）またはｃＤＣ２（ＣＤ１１ｃ＋Ｓｉｒｐａ＋）としてソートした。ＤＣを未処理のままとするか（なし）、またはＬＰＳのみ、もしくはアラムのみ、もしくはＯｘＰＡＰＣもしくはＰＧＰＣのみで２４ｈ処理するか、あるいはＤＣをＬＰＳで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。（図６Ａ）細胞死は、上清へのＬＤＨ放出により測定した。 ｃＤＣ１細胞およびｃＤＣ２細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで超活性化状態を達成することを示す、一連のグラフおよび免疫染色である。（図６Ａ～６Ｂ）脾臓ＤＣ（左側パネル）またはＦＬＴ３生成ＤＣ（右側パネル）を、ｃＤＣ１（ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ２４＋）またはｃＤＣ２（ＣＤ１１ｃ＋Ｓｉｒｐａ＋）としてソートした。ＤＣを未処理のままとするか（なし）、またはＬＰＳのみ、もしくはアラムのみ、もしくはＯｘＰＡＰＣもしくはＰＧＰＣのみで２４ｈ処理するか、あるいはＤＣをＬＰＳで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。（図６Ｂ）ＩＬ－１βおよびＴＮＦαサイトカイン放出は、ＥＬＩＳＡによりモニタリングした。３回の独立した実験の平均およびＳＤを示す。 ｃＤＣ１細胞およびｃＤＣ２細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで超活性化状態を達成することを示す、一連のグラフおよび免疫染色である。（図６Ｃ）表示の刺激で処理したＦＬＴ３－ＤＣを、ファロイジン－ＦＩＴＣおよびＤＡＰＩで染色した。画像は、Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡に４０倍油浸レンズを用いて得た。 ｃＤＣ１細胞およびｃＤＣ２細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏで超活性化状態を達成することを示す、一連のグラフおよび免疫染色である。（図６Ｄ）表示の刺激で処理したＦＬＴ３－ＤＣを、Ｌｉｖｅ－ｄｅａｄバイオレットキット、ＣＣＲ７ ＰＥ、およびＣＤ１１ｃ－ＡＰＣで染色した。ＣＣＲ７（ＣＤ１１ｃ＋生細胞でゲート）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、フローサイトメトリーにより測定した。 超活性化ｃＤＣ１が、超活性化ベースの免疫療法により誘導される腫瘍拒絶を制御することを示す、略図およびプロットである。ＷＴマウスの背部に、３×１０５個のＢ１６ＯＶＡ生細胞を皮下接種した。腫瘍チャレンジから７日目、１４日目および２１日目に、マウスを未処理のままとするか、または未処理ＷＴ ｃＤＣ１、もしくはＬＰＳで２３ｈ処理したＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１活性）、もしくはＬＰＳで３ｈプライミングし、次いでＰＧＰＣで２０ｈ処理したＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１超活性）の１×１０６個を右わき腹に皮下注射した。すべてのＤＣは、その注射前に腫瘍溶解物で１ｈパルスした。生存を毎日モニタリングした（群当たりｎ＝５のマウス）。 超活性ｃＤＣ１が腫瘍拒絶を制御し、抗腫瘍特異的Ｔ細胞の腫瘍浸潤を増強することを示す、一連のグラフ、プロットおよび略図である。図８Ａ～８Ｂ：Ｂａｔｆ３－／－マウスの背部に、３×１０５個のＢ１６ＯＶＡ生細胞を皮下接種した。腫瘍チャレンジから７日目、１４日目および２１日目に、マウスの右わき腹に、未処理ＷＴ ｃＤＣ１、またはＬＰＳで２３ｈ処理し、次いでＢ１６ＯＶＡ腫瘍溶解物で１ｈパルスしたＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１活性）、もしくはＬＰＳで３ｈプライミングし、次いでＰＧＰＣで２０ｈ処理して、次いで腫瘍溶解物で１ｈパルス処理したＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１超活性）の１×１０６個を皮下注射した。（図８Ｃ）生存を毎日モニタリングした（群当たりｎ＝５のマウス）。 超活性ｃＤＣ１が腫瘍拒絶を制御し、抗腫瘍特異的Ｔ細胞の腫瘍浸潤を増強することを示す、一連のグラフ、プロットおよび略図である。図８Ａ～８Ｂ：Ｂａｔｆ３－／－マウスの背部に、３×１０５個のＢ１６ＯＶＡ生細胞を皮下接種した。腫瘍チャレンジから７日目、１４日目および２１日目に、マウスの右わき腹に、未処理ＷＴ ｃＤＣ１、またはＬＰＳで２３ｈ処理し、次いでＢ１６ＯＶＡ腫瘍溶解物で１ｈパルスしたＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１活性）、もしくはＬＰＳで３ｈプライミングし、次いでＰＧＰＣで２０ｈ処理して、次いで腫瘍溶解物で１ｈパルス処理したＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１超活性）の１×１０６個を皮下注射した。（図８Ｂ）皮膚流入領域リンパ節（ｄＬＮ）、腫瘍、および脾臓組織を、腫瘍接種から１５日後に免疫化マウスから切除した。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率を、それぞれＳＩＩＮＦＥＫＬおよびＡＡＨＡＥＩＮＥＡテトラマー染色を使用して測定した（群当たりｎ＝５のマウス）。 超活性ｃＤＣ１が腫瘍拒絶を制御し、抗腫瘍特異的Ｔ細胞の腫瘍浸潤を増強することを示す、一連のグラフ、プロットおよび略図である。図８Ａ～８Ｂ：Ｂａｔｆ３－／－マウスの背部に、３×１０５個のＢ１６ＯＶＡ生細胞を皮下接種した。腫瘍チャレンジから７日目、１４日目および２１日目に、マウスの右わき腹に、未処理ＷＴ ｃＤＣ１、またはＬＰＳで２３ｈ処理し、次いでＢ１６ＯＶＡ腫瘍溶解物で１ｈパルスしたＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１活性）、もしくはＬＰＳで３ｈプライミングし、次いでＰＧＰＣで２０ｈ処理して、次いで腫瘍溶解物で１ｈパルス処理したＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１超活性）の１×１０６個を皮下注射した。（図８Ｃ）処置されたマウスの腫瘍およびｄＬＮにおけるＳＩＩＮＦＥＫＬ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の代表的プロット。 超活性ｃＤＣ１がインフラマソーム依存性に腫瘍拒絶を制御することを示す、一連の略図およびプロットである。（図９Ａ）Ｃａｓｐ １／１１－／－マウス、（図９Ｂ）ＮＬＲＰ３－／－マウスの背部に、３．１０５個のＢ１６ＯＶＡ生細胞を皮下接種した。腫瘍チャレンジから７日目、１４日目および２１日目に、マウスの右わき腹に、未処理ＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１ナイーブ）、またはＬＰＳで２３ｈ処理し、次いでＢ１６ＯＶＡ腫瘍溶解物で１ｈパルスしたＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１活性）、またはＬＰＳで３ｈプライミングし、次いでＰＧＰＣで２０ｈ処理したＷＴもしくはＣａｓｐ １／１１－／－ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１超活性）のいずれかの１．１０６個を皮下注射した。すべてのＤＣは、その注射前に腫瘍溶解物で１ｈパルスした。生存は、（図９Ａ）Ｃａｓｐ１／１１－／－マウスおよび（図９Ｂ）ＮＬＲＰ３マウスにおいて毎日モニタリングした（群当たりｎ＝５のマウス）。 超活性ｃＤＣ１がインフラマソーム依存性に腫瘍拒絶を制御することを示す、一連の略図およびプロットである。（図９Ａ）Ｃａｓｐ １／１１－／－マウス、（図９Ｂ）ＮＬＲＰ３－／－マウスの背部に、３．１０５個のＢ１６ＯＶＡ生細胞を皮下接種した。腫瘍チャレンジから７日目、１４日目および２１日目に、マウスの右わき腹に、未処理ＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１ナイーブ）、またはＬＰＳで２３ｈ処理し、次いでＢ１６ＯＶＡ腫瘍溶解物で１ｈパルスしたＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１活性）、またはＬＰＳで３ｈプライミングし、次いでＰＧＰＣで２０ｈ処理したＷＴもしくはＣａｓｐ １／１１－／－ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１超活性）のいずれかの１．１０６個を皮下注射した。すべてのＤＣは、その注射前に腫瘍溶解物で１ｈパルスした。生存は、（図９Ａ）Ｃａｓｐ１／１１－／－マウスおよび（図９Ｂ）ＮＬＲＰ３マウスにおいて毎日モニタリングした（群当たりｎ＝５のマウス）。 合成脂質の質量分析を示す。非酸化ＰＡＰＣ（図１０Ａ）の質量分析。 合成脂質の質量分析を示す。ｏｘＰＡＰＣ（図１０Ｂ）の質量分析。 合成脂質の質量分析を示す。ＰＥＩＰＣ濃縮ｏｘＰＡＰＣ（図１０Ｃ）の質量分析。 合成脂質の質量分析を示す。ビオチン標識ｏｘＰＡＰＣ（図１０Ｄ）の質量分析。 酸化リン脂質が、超遊走性（ｈｙｐｅｒｍｉｇｒａｔｏｒｙ）表現型を示す超活性のｃＤＣ１細胞およびｃＤＣ２細胞を誘導する図である。（Ａ）ＦＬＴ３Ｌを使用して生成した、野生型またはＮＬＲＰ３－／－またはＣａｓｐ１／１１－／－のＢＭＤＣを、未処理のままとした（なし）、またはＬＰＳのみ、もしくはアラムのみ、もしくはＰＧＰＣのみで２４ｈ処理した、あるいはＢＭＤＣを、ＬＰＳで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。ＩＬ－１βおよびＴＮＦαの放出をＥＬＩＳＡによりモニタリングした。細胞上清へのＬＤＨ放出により、細胞死亡率を測定した。３つのレプリケートからの平均およびＳＤを示し、データは、少なくとも３回の独立した実験を代表する。 酸化リン脂質が、超遊走性（ｈｙｐｅｒｍｉｇｒａｔｏｒｙ）表現型を示す超活性のｃＤＣ１細胞およびｃＤＣ２細胞を誘導する図である。（Ｂ）ＦＬＴ３Ｌを使用して生成した野生型ＢＭＤＣを、ｃＤＣ１細胞またはｃＤＣ２細胞としてソートしてから、Ａのように表示の刺激で処理した。ＩＬ－１βおよびＴＮＦαの放出をＥＬＩＳＡによりモニタリングした。細胞上清へのＬＤＨ放出により、細胞死亡率を測定した。２つの異なる実験室で行われた３回の独立した実験からの平均およびＳＤ。 超活性ＤＣが、著しいＣＴＬ応答、ならびにＣＣＲ７発現およびインフラマソーム活性化に依存する永続的な抗腫瘍免疫を誘導する図である。（Ａ－Ｂ）ＦＬＴ３Ｌを使用して生成した野生型ＢＭＤＣを、未処理のままとした（ＤＣナイーブ）、またはＬＰＳのみ（ＤＣ活性）で１８ｈ処理した、またはＢＭＤＣをＬＰＳで３ｈプライミングしてから、ＰＧＰＣ（ＤＣ超活性）もしくはアラム（ＤＣパイロプトティック）で１５時間処理した。その代わりに、ＮＬＲＰ３－／－またはＣＣＲ７－／－マウス由来のＢＭＤＣを、ＬＰＳで３時間プライミングしてから、ＰＧＰＣで１５時間処理した。１．１０ｅ６個のＢＭＤＣを、ＯＶＡタンパク質と１時間インキュベートしてから、野生型マウスに皮下注射した。ＯＶＡタンパク質をロードしなかったＢＭＤＣの注射を対照群として利用した。ＢＭＤＣ注射から７日後、皮膚流入領域リンパ節を解剖し、ｌｉｖｅ－ｄｅａｄバイオレットキットにより、ＯＶＡペプチドテトラマー抗体、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８ａ、抗ＣＤ４で染色した。（Ａ）ＳＩＩＮＦＥＫＬ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率（上パネル）、およびＡＡＨＡＥＩＮＥＡ＋ＣＤ４＋Ｔ生細胞の百分率を、フローサイトメトリーにより測定した。 超活性ＤＣが、著しいＣＴＬ応答、ならびにＣＣＲ７発現およびインフラマソーム活性化に依存する永続的な抗腫瘍免疫を誘導する図である。（Ａ－Ｂ）ＦＬＴ３Ｌを使用して生成した野生型ＢＭＤＣを、未処理のままとした（ＤＣナイーブ）、またはＬＰＳのみ（ＤＣ活性）で１８ｈ処理した、またはＢＭＤＣをＬＰＳで３ｈプライミングしてから、ＰＧＰＣ（ＤＣ超活性）もしくはアラム（ＤＣパイロプトティック）で１５時間処理した。その代わりに、ＮＬＲＰ３－／－またはＣＣＲ７－／－マウス由来のＢＭＤＣを、ＬＰＳで３時間プライミングしてから、ＰＧＰＣで１５時間処理した。１．１０ｅ６個のＢＭＤＣを、ＯＶＡタンパク質と１時間インキュベートしてから、野生型マウスに皮下注射した。ＯＶＡタンパク質をロードしなかったＢＭＤＣの注射を対照群として利用した。ＢＭＤＣ注射から７日後、皮膚流入領域リンパ節を解剖し、ｌｉｖｅ－ｄｅａｄバイオレットキットにより、ＯＶＡペプチドテトラマー抗体、抗ＣＤ４５、抗ＣＤ３、抗ＣＤ８ａ、抗ＣＤ４で染色した。（Ｂ）ＳＩＩＮＦＥＫＬ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数（上パネル）およびＡＡＨＡＥＩＮＥＡ＋ＣＤ４＋Ｔ生細胞の絶対数を、ＣｏｕｎｔｅｒＢｒｉｇｈｔビーズを使用してフローサイトメトリーにより測定した。 超活性刺激が、著しいＣＴＬ応答を、インフラマソーム依存性に誘導する図である。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右わき腹に、ＯＶＡを、単独、またはＬＰＳと共に、またはＰＧＰＣと共に、またはＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣもしくはＰＧＰＣと共にのいずれかにより、いずれも不完全フロイトアジュバント（ＩＦＡ）中で乳化させて皮下注射した。免疫化から７日後または４０日後、Ｔ細胞を、皮膚流入領域リンパ節（ｄＬＮ）から、抗ＣＤ８ビーズを使用した磁気濃縮により単離した。（Ａ）ＣＤ３＋ＣＤ８＋生細胞のうちの、ＣＤ４４低ＣＤ６２Ｌ低であるエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）、ＣＤ４４高ＣＤ６２Ｌ低であるエフェクターメモリＴ細胞（ＴＥＭ）、およびＣＤ４４高ＣＤ６２Ｌ高であるセントラルメモリＴ細胞（ＴＣＭ）の百分率を表す。 超活性刺激が、著しいＣＴＬ応答を、インフラマソーム依存性に誘導する図である。（Ｂ）免疫化から７日後にｄＬＮからＣＤ８＋Ｔ細胞をソートし、次いで５ｈ、ＰＭＡ＋イオノマイシンで処理するか、またはＢ１６ＯＶＡ細胞（標的細胞）と共に１：３（エフェクター：標的）の比率で共培養した。ＣＤ８＋Ｔ生細胞のうちのＣＤ１０７ａ＋の百分率を、フローサイトメトリーを使用してモニタリングし、ＣＤ８＋Ｔ細胞の脱顆粒を評価した。５～１０匹のマウスの平均およびＳＤを示す。 超活性刺激が、著しいＣＴＬ応答を、インフラマソーム依存性に誘導する図である。（Ｃ）マウスの右わき腹に、ＯＶＡを、単独、またはＬＰＳと共に、またはＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣもしくはＰＧＰＣと共にのいずれかにより、いずれもＩＦＡ中で乳化させて、あるいはＬＰＳ＋アラムと共に皮下注射した。その代わりに、ＮＬＲＰ３－／－マウスに、ＯＶＡを、ＬＰＳ＋ＰＧＰＣと共にＩＦＡ中で乳化させて注射した。免疫化から７日後、免疫マウスの皮膚ｄＬＮからＣＤ８＋Ｔ細胞をソートし、ＯＶＡをロードした（またはロードしていない）ＢＭＤＣと共に、１：１０（ＤＣ：Ｔ細胞）の比率で７日間共培養した。ＣＤ８＋Ｔ生細胞のうちのＳＩＩＮＦＥＫＬ＋ＩＦＮγ＋の百分率を、ＯＶＡペプチドテトラマー染色に続く細胞内ＩＦＮγ染色を使用して測定した。 超活性刺激が、著しいＣＴＬ応答を、インフラマソーム依存性に誘導する図である。（Ｄ～Ｅ）ＣＤ４５．１マウスに放射線を照射してから、いずれもＣＤ４５．２ Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＺＢＴＢ４６ＤＴＲマウス＋ＷＴまたはＮＬＲＰ３－／－またはＣａｓｐ１／１１－／－またはＣＣＲ７－／－のいずれか（比率５：１）で骨髄再構築した。再構築から６週後、キメラマウスに、７日間にわたり１日おきにタモキシフェンを注射した。次いで、キメラマウスの右わき腹で、ＩＦＡ中で乳化させたＯＶＡおよびＬＰＳ＋ＰＧＰＣを用いて皮下免疫化した。免疫化から７日後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、皮膚流入領域リンパ節（ｄＬＮ）または脾臓から、抗ＣＤ８ビーズを使用した磁気濃縮により単離した。（Ｄ）皮膚ｄＬＮ中のＴｅｆｆ細胞、ＴＥＭ細胞、ＴＣＭ細胞およびＴナイーブ細胞の百分率を、フローサイトメトリーにより測定した。 超活性刺激が、著しいＣＴＬ応答を、インフラマソーム依存性に誘導する図である。（Ｄ～Ｅ）ＣＤ４５．１マウスに放射線を照射してから、いずれもＣＤ４５．２ Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＺＢＴＢ４６ＤＴＲマウス＋ＷＴまたはＮＬＲＰ３－／－またはＣａｓｐ１／１１－／－またはＣＣＲ７－／－のいずれか（比率５：１）で骨髄再構築した。再構築から６週後、キメラマウスに、７日間にわたり１日おきにタモキシフェンを注射した。次いで、キメラマウスの右わき腹で、ＩＦＡ中で乳化させたＯＶＡおよびＬＰＳ＋ＰＧＰＣを用いて皮下免疫化した。免疫化から７日後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、皮膚流入領域リンパ節（ｄＬＮ）または脾臓から、抗ＣＤ８ビーズを使用した磁気濃縮により単離した。（Ｅ）ｄＬＮ中（左パネル）または脾臓中（右パネル）のＣＤ８＋Ｔ生細胞のうちのＳＩＩＮＦＥＫＬ＋の百分率を、ＯＶＡペプチドテトラマー染色を使用してフローサイトメトリーにより測定した。ｄＬＮから総ＣＤ８＋Ｔ細胞をソートし、ＯＶＡをロードした（またはしていない）未処理ＢＭＤＣと共に、１：１０（ＤＣ：Ｔ細胞）の比率で７日間共培養した。 超活性刺激による免疫化が、高免疫原性腫瘍（ｈｏｔ ｔｕｍｏｒ）から低免疫原性腫瘍（ｉｃｙ ｔｕｍｏｒ）に及ぶ免疫原性を有する腫瘍を根絶する図である。（Ａ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左上背部に、５×１０５個のＭＣ３８ＯＶＡ生細胞を皮下接種した。１４日後、マウスを未処理のままとした（未免疫）、または右わき腹に、同系ＭＣ３８ＯＶＡの全腫瘍溶解物（ＷＴＬ）＋ＬＰＳおよびＰＧＰＣを、中和抗ＩＬ－１β抗体の静脈内（ｉ．ｖ．）注射または抗ＣＤ４抗体もしくは抗ＣＤ８ａ抗体の腹腔内注射を伴ってかまたは伴わずに、皮下注射した。マウスは、腫瘍接種から３７日目および５５日目に、ＷＴＬおよびＬＰＳ＋ＰＧＰＣによる２回のブースト注射を受けた。腫瘍を直径２０ｍｍに到達させた。生存率を示す（群当たりｎ＝１０のマウス）。 超活性刺激による免疫化が、高免疫原性腫瘍（ｈｏｔ ｔｕｍｏｒ）から低免疫原性腫瘍（ｉｃｙ ｔｕｍｏｒ）に及ぶ免疫原性を有する腫瘍を根絶する図である。（Ｂ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左上背部に、３×１０５個のＢ１６ＯＶＡ生細胞を皮下接種した。１０日後、マウスを未処理のままとした（未免疫）、または抗ＰＤ１抗体を腹腔内注射した。その代わりに、マウスの右わき腹に、同系Ｂ１６ＯＶＡのＷＴＬ＋ＬＰＳおよびＰＧＰＣを、中和抗体である抗ＩＬ－１β抗体の静脈内注射（ｉ．ｖ．）または抗ＣＤ４抗体もしくは抗ＣＤ８ａ抗体の腹腔内注射を伴ってかまたは伴わずに、皮下注射した。マウスは、腫瘍接種から１７日目および２４日目に、Ｂ１６ＯＶＡ ＷＴＬ＋ＬＰＳおよびＰＧＰＣによる２回のブースト注射を受けた。生存率を示す（群当たりｎ＝１０のマウス）。 超活性刺激による免疫化が、高免疫原性腫瘍（ｈｏｔ ｔｕｍｏｒ）から低免疫原性腫瘍（ｉｃｙ ｔｕｍｏｒ）に及ぶ免疫原性を有する腫瘍を根絶する図である。（Ｃ）Ｃ５７ＢＬ／６マウスの左上背部に３×１０５個のＢ１６－Ｆ１０生細胞を皮下接種した。７日後、マウスを未処理のままとした（未免疫）、または抗ＰＤ１抗体を腹腔内注射した。その代わりに、マウスの右わき腹に、同系Ｂ１６－Ｆ１０のＷＴＬ＋ＬＰＳおよびＰＧＰＣを、中和抗体である抗ＩＬ－１β抗体の静脈内注射（ｉ．ｖ．）または抗ＣＤ４抗体もしくは抗ＣＤ８ａ抗体の腹腔内注射を伴ってかまたは伴わずに、皮下免疫化した。マウスは、腫瘍接種から１４日目および２１日目に、２回のブースト注射を受けた。生存率を示す（群当たりｎ＝１０のマウス）。 超活性刺激による免疫化が、高免疫原性腫瘍（ｈｏｔ ｔｕｍｏｒ）から低免疫原性腫瘍（ｉｃｙ ｔｕｍｏｒ）に及ぶ免疫原性を有する腫瘍を根絶する図である。（Ｄ）ＢＡＬＢ／ｃ ＷＴマウスの左背部に、３×１０５個のＣＴ２６生細胞を皮下接種した。７日後、マウスを未処理のままとした（未免疫）、または抗ＰＤ１抗体を腹腔内注射した。その代わりに、マウスの右わき腹に、同系ＣＴ２６のＷＴＬ＋ＬＰＳおよびＰＧＰＣを、中和抗体である抗ＩＬ－１β抗体の静脈内注射（ｉ．ｖ．）または抗ＣＤ４抗体もしくは抗ＣＤ８ａ抗体の腹腔内注射を伴ってかまたは伴わずに、皮下注射した。マウスは、腫瘍接種から１４日目および２１日目に、２回のブースト注射を受けた。生存率を示す（群当たりｎ＝１０のマウス）。 超活性ｃＤＣ１が、Ｔ細胞性抗腫瘍免疫を刺激するために、複合抗原源を使用できる図である。（Ａ）Ｚｂｔｂ４６ＤＴＲマウスにＢ１６ＯＶＡ細胞を皮下注射した。マウスにジフテリア毒素（ＤＴｘ）を１日おきに４回続けて注射するか、またはマウスにＰＢＳを注射した。腫瘍注射から７日後、全マウスを、Ｂ１６ＯＶＡ ＷＴＬ＋ＬＰＳおよびＰＧＰＣで免疫化してから２回のブースト注射を行った。マウスの生存率を示す（群当たりｎ＝１０のマウス）。 超活性ｃＤＣ１が、Ｔ細胞性抗腫瘍免疫を刺激するために、複合抗原源を使用できる図である。（Ｂ）ＣＤ４５．１マウスに放射線を照射してから、Ｚｂｔｂ４６ＤＴＲマウス＋ＷＴまたはＮｌｒｐ３－／－またはＣａｓｐ１／１１－／－またはＣｃｒ７－／－のいずれかに由来する混合ＢＭで再構築した。再構築から６週後、キメラマウスにＢ１６ＯＶＡ細胞を皮下注射してから、全マウスにＤＴｘを週３回、計１２回続けて注射した。腫瘍接種から７日後、キメラマウスを、Ｂ１６ＯＶＡ ＷＴＬおよびＬＰＳ＋ＰＧＰＣで免疫化してから２回のブースト注射を行った。マウスの生存率を示す（群当たりｎ＝５のマウス）。 超活性ｃＤＣ１が、Ｔ細胞性抗腫瘍免疫を刺激するために、複合抗原源を使用できる図である。（Ｃ～Ｄ）ＷＴマウスまたはＢａｔｆ３－／－マウスに、Ｂ１６ＯＶＡ細胞を皮下注射した。腫瘍接種から７日後、マウスを未処理のままとした、またはＷＴマウスおよびＢａｔｆ３－／－マウスを、Ｂ１６ＯＶＡ ＷＴＬおよびＬＰＳ＋ＰＧＰＣで免疫化してから２回のブースト注射を行った。（Ｃ）マウスの生存率を示す（群当たりｎ＝１０のマウス）。 超活性ｃＤＣ１が、Ｔ細胞性抗腫瘍免疫を刺激するために、複合抗原源を使用できる図である。（Ｃ～Ｄ）ＷＴマウスまたはＢａｔｆ３－／－マウスに、Ｂ１６ＯＶＡ細胞を皮下注射した。腫瘍接種から７日後、マウスを未処理のままとした、またはＷＴマウスおよびＢａｔｆ３－／－マウスを、Ｂ１６ＯＶＡ ＷＴＬおよびＬＰＳ＋ＰＧＰＣで免疫化してから２回のブースト注射を行った。（Ｄ）腫瘍接種から２１日後、テトラマー染色を使用して、ＯＶＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率を評価した（群当たりｎ＝５のマウス）。 超活性ｃＤＣ１が、Ｔ細胞性抗腫瘍免疫を刺激するために、複合抗原源を使用できる図である。（Ｅ～Ｆ）Ｂａｔｆ３－／－マウスの右わき腹に、Ｂ１６ＯＶＡ細胞を皮下注射した。腫瘍接種から７日後、マウスを未処理のままとした（ｃＤＣ１注射なし）、またはマウスの左わき腹に、ＦＬＴ３由来のナイーブｃＤＣ１、もしくはＬＰＳで処理した活性ｃＤＣ１、もしくはＬＰＳ＋ＰＧＰＣで前処理した超活性ｃＤＣ１を皮下注射した。注射する１時間前、すべてのｃＤＣ１にＢ１６ＯＶＡ ＷＴＬをロードした。（Ｅ）マウスの生存率を示す（群当たりｎ＝５のマウス）。 超活性ｃＤＣ１が、Ｔ細胞性抗腫瘍免疫を刺激するために、複合抗原源を使用できる図である。（Ｅ～Ｆ）Ｂａｔｆ３－／－マウスの右わき腹に、Ｂ１６ＯＶＡ細胞を皮下注射した。腫瘍接種から７日後、マウスを未処理のままとした（ｃＤＣ１注射なし）、またはマウスの左わき腹に、ＦＬＴ３由来のナイーブｃＤＣ１、もしくはＬＰＳで処理した活性ｃＤＣ１、もしくはＬＰＳ＋ＰＧＰＣで前処理した超活性ｃＤＣ１を皮下注射した。注射する１時間前、すべてのｃＤＣ１にＢ１６ＯＶＡ ＷＴＬをロードした。（Ｆ）腫瘍接種から２１日後、テトラマー染色を使用して、ＯＶＡ特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を評価した（群当たりｎ＝５のマウス）。 酸化リン脂質が、ｃＤＣ１細胞およびｃＤＣ２細胞による、インフラマソーム依存性のＩＬ－１β分泌を誘導し、かつ超遊走性ＤＣ表現型を促進する図である。（Ａ）ＦＬＴ３Ｌを使用して生成した野生型ＢＭＤＣを、未処理のままとした（なし）、またはＣｐＧ１８０６のみもしくはＰＧＰＣのみで２４ｈ処理した、あるいはＢＭＤＣを、ＣｐＧ１８０６で３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。ＩＬ－１βおよびＴＮＦαの放出をＥＬＩＳＡによりモニタリングした。細胞上清へのＬＤＨ放出により、細胞死亡率を測定した。３つのレプリケートからの平均およびＳＤを示し、データは、少なくとも３回の独立した実験を代表する。 酸化リン脂質が、ｃＤＣ１細胞およびｃＤＣ２細胞による、インフラマソーム依存性のＩＬ－１β分泌を誘導し、かつ超遊走性ＤＣ表現型を促進する図である。（Ｂ）野生型マウスの、ＦＬＴ３Ｌ生成ＢＭＤＣ由来または脾臓由来のｃＤＣ１またはｃＤＣ２を単離するためのゲーティング戦略。ソーティング後の純度を、脾臓ｃＤＣまたはＦＬＴ３Ｌ ＤＣに関して示す。 酸化リン脂質が、ｃＤＣ１細胞およびｃＤＣ２細胞による、インフラマソーム依存性のＩＬ－１β分泌を誘導し、かつ超遊走性ＤＣ表現型を促進する図である。（Ｃ）脾臓のｃＤＣ１またはｃＤＣ２を、未処理のままとした（なし）、またはＬＰＳのみ、もしくはアラムのみ、もしくはｏｘＰＡＰＣのみ、もしくはＰＧＰＣのみで１８ｈ処理した、あるいはＢＭＤＣを、ＬＰＳで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で１５ｈ処理した。ＩＬ－１βおよびＴＮＦαの放出をＥＬＩＳＡによりモニタリングした。細胞上清へのＬＤＨ放出により、細胞死亡率を測定した。２つの異なる実験室で行われた３回の独立した実験からの平均およびＳＤ。 超活性ＤＣが、著しいＣＴＬ応答、ならびにＣＣＲ７発現およびインフラマソーム活性化に依存する永続的な抗腫瘍免疫を誘導する図である。ＦＬＴ３Ｌを使用して生成した野生型ＢＭＤＣを、未処理のままとした（ＤＣナイーブ）、またはＬＰＳのみ（ＤＣ活性）で１８ｈ処理した、またはＢＭＤＣをＬＰＳで３ｈプライミングしてから、ＰＧＰＣ（ＤＣ超活性）もしくはアラム（ＤＣパイロプトティック）を１５時間、培養培地に添加した。その代わりに、ＮＬＲＰ３－／－マウスまたはＣＣＲ７－／－マウスに由来するＢＭＤＣを、ＬＰＳで３時間プライミングしてから、ＰＧＰＣを１５時間、培養培地に添加した。ＢＭＤＣを洗浄してから、ＦＩＴＣ標識ＯＶＡを加えて４５分間、または非蛍光ＯＶＡタンパク質を加えて２ｈインキュベートした。（Ａ）ＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬに結合したＨ－２Ｋｂに対するＰＥ結合型抗体を使用して、ＭＨＣ－Ｉ上でのＯＶＡペプチド提示をモニタリングした。データは、ＣＤ１１ｃ＋生細胞のうちのＳＩＩＮＦＥＫＬ関連ＤＣの頻度として表す。３つのレプリケートからの平均およびＳＤを示し、データは、３回の独立した実験を代表する。 超活性ＤＣが、著しいＣＴＬ応答、ならびにＣＣＲ７発現およびインフラマソーム活性化に依存する永続的な抗腫瘍免疫を誘導する図である。ＦＬＴ３Ｌを使用して生成した野生型ＢＭＤＣを、未処理のままとした（ＤＣナイーブ）、またはＬＰＳのみ（ＤＣ活性）で１８ｈ処理した、またはＢＭＤＣをＬＰＳで３ｈプライミングしてから、ＰＧＰＣ（ＤＣ超活性）もしくはアラム（ＤＣパイロプトティック）を１５時間、培養培地に添加した。その代わりに、ＮＬＲＰ３－／－マウスまたはＣＣＲ７－／－マウスに由来するＢＭＤＣを、ＬＰＳで３時間プライミングしてから、ＰＧＰＣを１５時間、培養培地に添加した。ＢＭＤＣを洗浄してから、ＦＩＴＣ標識ＯＶＡを加えて４５分間、または非蛍光ＯＶＡタンパク質を加えて２ｈインキュベートした。（Ｂ）ＦＬＴ３Ｌを使用して生成した野生型またはＮＬＲＰ３－／－またはＣＣＲ７－／－のＢＭＤＣを、Ａにおけるように刺激した。ＢＭＤＣを洗浄してから、ｌｉｖｅ－ｄｅａｄバイオレットキット、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ４０を用いて染色した。表面ＣＤ４０の平均蛍光強度（ＭＦＩ）（ＣＤ１１ｃ＋生細胞のうち）を、フローサイトメトリーで測定した。 超活性ＤＣが、著しいＣＴＬ応答、ならびにＣＣＲ７発現およびインフラマソーム活性化に依存する永続的な抗腫瘍免疫を誘導する図である。ＦＬＴ３Ｌを使用して生成した野生型ＢＭＤＣを、未処理のままとした（ＤＣナイーブ）、またはＬＰＳのみ（ＤＣ活性）で１８ｈ処理した、またはＢＭＤＣをＬＰＳで３ｈプライミングしてから、ＰＧＰＣ（ＤＣ超活性）もしくはアラム（ＤＣパイロプトティック）を１５時間、培養培地に添加した。その代わりに、ＮＬＲＰ３－／－マウスまたはＣＣＲ７－／－マウスに由来するＢＭＤＣを、ＬＰＳで３時間プライミングしてから、ＰＧＰＣを１５時間、培養培地に添加した。ＢＭＤＣを洗浄してから、ＦＩＴＣ標識ＯＶＡを加えて４５分間、または非蛍光ＯＶＡタンパク質を加えて２ｈインキュベートした。（Ｃ）ＦＬＴ３Ｌを使用して生成したＣＣＲ７－／－ＢＭＤＣを、未処理のままとした（なし）、またはＬＰＳのみ、もしくはアラムのみ、もしくはＰＧＰＣのみで２４ｈ処理した。その代わりに、ＢＭＤＣを、ＬＰＳで３ｈプライミングしてから、表示の刺激で２１ｈ処理した。ＩＬ－１βおよびＴＮＦαの放出をＥＬＩＳＡによりモニタリングした。細胞上清へのＬＤＨ放出により、細胞死亡率を測定した。３つのレプリケートからの平均およびＳＤを示し、データは、少なくとも３回の独立した実験を代表する。 超活性化刺激が、インフラマソーム依存性に、メモリＴ細胞の生成を高めて抗原特異的ＩＦＮγエフェクター応答を増強する図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右わき腹に、ＯＶＡを、単独、またはＬＰＳと共に、またはＰＧＰＣと共に、またはＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣもしくはＰＧＰＣと共にのいずれかにより、いずれも不完全フロイトアジュバント（ＩＦＡ）中で乳化させて皮下注射した。免疫化から７日後、Ｔ細胞を、皮膚流入領域リンパ節（ｄＬＮ）から、抗ＣＤ８ビーズを使用した磁気濃縮により単離した。（Ａ）ＣＤ４４低ＣＤ６２Ｌ低であるエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）、ＣＤ４４高ＣＤ６２Ｌ低であるエフェクターメモリＴ細胞（ＴＥＭ）、およびＣＤ４４高ＣＤ６２Ｌ高であるセントラルメモリＴ細胞（ＴＣＭ）の百分率を特定するためのゲーティング戦略。各パネルは、５匹のマウスを代表する。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。 超活性化刺激が、インフラマソーム依存性に、メモリＴ細胞の生成を高めて抗原特異的ＩＦＮγエフェクター応答を増強する図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右わき腹に、ＯＶＡを、単独、またはＬＰＳと共に、またはＰＧＰＣと共に、またはＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣもしくはＰＧＰＣと共にのいずれかにより、いずれも不完全フロイトアジュバント（ＩＦＡ）中で乳化させて皮下注射した。免疫化から７日後、Ｔ細胞を、皮膚流入領域リンパ節（ｄＬＮ）から、抗ＣＤ８ビーズを使用した磁気濃縮により単離した。（Ｂ）マウス当たりの皮膚ｄＬＮ中の、総ＣＤ３＋生細胞のうちのＴｅｆｆ細胞またはＴＥＭ細胞の絶対数を、フローサイトメトリーにより評価した。各パネルは、５匹のマウスを代表する。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。 超活性化刺激が、インフラマソーム依存性に、メモリＴ細胞の生成を高めて抗原特異的ＩＦＮγエフェクター応答を増強する図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右わき腹に、ＯＶＡを、単独、またはＬＰＳと共に、またはＰＧＰＣと共に、またはＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣもしくはＰＧＰＣと共にのいずれかにより、いずれも不完全フロイトアジュバント（ＩＦＡ）中で乳化させて皮下注射した。免疫化から７日後、Ｔ細胞を、皮膚流入領域リンパ節（ｄＬＮ）から、抗ＣＤ８ビーズを使用した磁気濃縮により単離した。（Ｃ）免疫化から７日後にｄＬＮからＣＤ８＋Ｔ細胞をソートし、次いで１０００μｇ／ｍｌを起点とするＯＶＡタンパク質の段階希釈をロードした（またはしていない）未処理ＢＭＤＣと共に培養した。ＩＦＮγサイトカインの分泌を、ＥＬＩＳＡにより測定した。５匹のマウスの平均およびＳＤを示す。各パネルは、５匹のマウスを代表する。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。 超活性化刺激が、インフラマソーム依存性に、メモリＴ細胞の生成を高めて抗原特異的ＩＦＮγエフェクター応答を増強する図である。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右わき腹に、ＯＶＡを、単独、またはＬＰＳと共に、またはＰＧＰＣと共に、またはＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣもしくはＰＧＰＣと共にのいずれかにより、いずれも不完全フロイトアジュバント（ＩＦＡ）中で乳化させて皮下注射した。免疫化から７日後、Ｔ細胞を、皮膚流入領域リンパ節（ｄＬＮ）から、抗ＣＤ８ビーズを使用した磁気濃縮により単離した。（Ｄ）免疫化から７日後にｄＬＮからＣＤ８＋Ｔ細胞をソートし、次いで５ｈ、ＰＭＡ＋イオノマイシンで処理するか、またはＢ１６ＯＶＡ細胞（標的細胞）と共に１：３（エフェクター：標的）の比率で共培養した。フローサイトメトリーによりＣＤ８＋Ｔ生細胞のうちのＣＤ１０７ａ＋の百分率を特定するためのゲーティング戦略。各パネルは、５匹のマウスを代表する。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１。 超活性刺激が、インフラマソーム依存性に、メモリＴ細胞の生成を高めて抗原特異的ＩＦＮγエフェクター応答を増強する図である。（Ａ～Ｂ）ＣＤ４５．１マウスに放射線を照射してから、いずれもＣＤ４５．２ Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＺＢＴＢ４６ＤＴＲマウス＋ＷＴまたはＮＬＲＰ３－／－またはＣａｓｐ１／１１－／－またはＣＣＲ７－／－のいずれか（比率５：１）で骨髄再構築した。再構築から６週後、キメラマウスに、７日間にわたり１日おきにタモキシフェンを注射した。次いで、キメラマウスの右わき腹で、ＩＦＡ中で乳化させたＯＶＡおよびＬＰＳ＋ＰＧＰＣを用いて皮下免疫化した。免疫化から７日後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、皮膚流入領域リンパ節（ｄＬＮ）または脾臓から、抗ＣＤ８ビーズを使用した磁気濃縮により単離した。（Ａ）皮膚ｄＬＮ中のＴｅｆｆ細胞、ＴＥＭ細胞、ＴＣＭ細胞およびＴナイーブ細胞の百分率を、フローサイトメトリーにより測定した。各パネルは、５匹のマウスを代表する。 超活性刺激が、インフラマソーム依存性に、メモリＴ細胞の生成を高めて抗原特異的ＩＦＮγエフェクター応答を増強する図である。（Ａ～Ｂ）ＣＤ４５．１マウスに放射線を照射してから、いずれもＣＤ４５．２ Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドのＺＢＴＢ４６ＤＴＲマウス＋ＷＴまたはＮＬＲＰ３－／－またはＣａｓｐ１／１１－／－またはＣＣＲ７－／－のいずれか（比率５：１）で骨髄再構築した。再構築から６週後、キメラマウスに、７日間にわたり１日おきにタモキシフェンを注射した。次いで、キメラマウスの右わき腹で、ＩＦＡ中で乳化させたＯＶＡおよびＬＰＳ＋ＰＧＰＣを用いて皮下免疫化した。免疫化から７日後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、皮膚流入領域リンパ節（ｄＬＮ）または脾臓から、抗ＣＤ８ビーズを使用した磁気濃縮により単離した。（Ｂ）ｄＬＮ中（上パネル）または脾臓中（下パネル）のＣＤ８＋Ｔ生細胞のうちのＳＩＩＮＦＥＫＬ＋の百分率を、ＯＶＡペプチドテトラマー染色を使用してフローサイトメトリーにより測定した。 （Ａ～Ｂ）マウスの右わき腹に、ＰＢＳ（未免疫）、Ｂ１６ＯＶＡ細胞溶解物を単独で（なし）、またはＬＰＳと共に、またはＢ１６ＯＶＡ溶解物＋ＬＰＳおよびｏｘＰＡＰＣもしくはＰＧＰＣを、いずれも不完全フロイトアジュバント（ＩＦＡ）中で乳化させて皮下注射（ｓ．ｃ．）した。免疫化から１５日後、マウスの左上背部で３×１０５個のＢ１６ＯＶＡ生細胞により皮下チャレンジした。１５０日後、無腫瘍マウスの背部で５×１０５個のＢ１６ＯＶＡ生細胞により皮下再チャレンジした。（Ａ）２日おきに腫瘍増殖をモニタリングした（上パネル）。生存実験（下パネル）では、腫瘍を直径２０ｍｍに到達させた（群当たりｎ＝８～１５のマウス）。 （Ａ～Ｂ）マウスの右わき腹に、ＰＢＳ（未免疫）、Ｂ１６ＯＶＡ細胞溶解物を単独で（なし）、またはＬＰＳと共に、またはＢ１６ＯＶＡ溶解物＋ＬＰＳおよびｏｘＰＡＰＣもしくはＰＧＰＣを、いずれも不完全フロイトアジュバント（ＩＦＡ）中で乳化させて皮下注射（ｓ．ｃ．）した。免疫化から１５日後、マウスの左上背部で３×１０５個のＢ１６ＯＶＡ生細胞により皮下チャレンジした。１５０日後、無腫瘍マウスの背部で５×１０５個のＢ１６ＯＶＡ生細胞により皮下再チャレンジした。（Ｂ～Ｃ）腫瘍増殖の終了点で腫瘍を採取し、単一腫瘍細胞懸濁液を得るために解離した。（Ｂ）濃縮ＣＤ４５＋生細胞のうちの腫瘍浸潤性のＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を、フローサイトメトリーにより評価した。 （Ｂ～Ｃ）腫瘍増殖の終了点で腫瘍を採取し、単一腫瘍細胞懸濁液を得るために解離した。（Ｃ）腫瘍浸潤性ＣＤ３＋Ｔ細胞をソートしてから、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８のダイナビーズの存在下において２４ｈ刺激した。ＩＦＮγ放出を、ＥＬＩＳＡにより測定した（下パネル）（群当たりｎ＝４のマウス）。 （Ａ～Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数およびＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋Ｔ常在型メモリＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を、サバイバーマウスの免疫化部位または腫瘍注射部位において評価し、フローサイトメトリーにより測定した（ｎ＝４のマウス）。 （Ａ～Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数およびＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋Ｔ常在型メモリＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数を、サバイバーマウスの免疫化部位または腫瘍注射部位において評価し、フローサイトメトリーにより測定した（ｎ＝４のマウス）。 （Ｃ～Ｄ）サバイバーマウスまたは同齢未免疫担腫瘍マウスの脾臓から循環型メモリＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＣＭ）を単離し、皮膚鼠径部脂肪組織から常在型メモリＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＲＭ）を単離した。（Ｃ）サバイバーマウス由来のＴＣＭおよびＴＲＭを、Ｂ１６ＯＶＡ、Ｂ１６－Ｆ１０またはＣＴ２６の各腫瘍細胞と共に５ｈ、１：５（腫瘍細胞：Ｔ細胞）の比率で共培養した。細胞溶解性ＣＤ８＋Ｔ細胞による細胞死は、上清へのＬＤＨ放出により測定した。 （Ｃ～Ｄ）サバイバーマウスまたは同齢未免疫担腫瘍マウスの脾臓から循環型メモリＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＣＭ）を単離し、皮膚鼠径部脂肪組織から常在型メモリＣＤ８＋Ｔ細胞（ＴＲＭ）を単離した。（Ｄ）マウスを未処理のままとした（Ｔｘなし）、またはサバイバーマウスもしくは同齢未免疫担腫瘍マウスから単離した５×１０５個のＣＤ８＋ＴＣＭ細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）接種および／または５×１０５個のＣＤ８＋ＴＲＭ細胞を皮内（ｉ．ｄ．）接種した。７日後、全マウスを３×１０５個のＢ１６ＯＶＡ生細胞でチャレンジした。２日おきに生存率をモニタリングした。腫瘍を直径２０ｍｍに到達させた（群当たりｎ＝５のマウス）。
詳細な説明
自然免疫系は、伝統的には全か無かの様式で作用すると見られ、ＤＣは、適応免疫を促進する炎症反応を開始するように作用するか、または作用しないかのいずれかである。したがって、ＤＣが発現するＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、ＤＣの免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）の決定において中心的に重要であると思われる。哺乳動物の免疫系は、微生物の検出、および感染を制限する防御応答の活性化を担う。この任務の中心となるのは、微生物の感知に続いてＴ細胞活性化を促進する樹状細胞である。樹状細胞は、何らかの感染の脅威を評価し、釣り合った反応を指図することができると提案されたが（Ｂｌａｎｄｅｒ、Ｊ．Ｍ．（２０１４年）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４、６０１～６１８ページ；Ｖａｎｃｅ，Ｒ．Ｅ．ら、（２００９年）Ｃｅｌｌ ｈｏｓｔ＆ｍｉｃｒｏｂｅ ６、１０～２１ページ）、その免疫調節活性を引き起こし得る機構は不明である。
ＰＲＲは、微生物の広範な種類に共通する分子を直接的または間接的に検出するように作用する。ＰＲＲは、伝統的に病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれ、中でも、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）、細菌フラジェリンまたはウイルス二重鎖ＲＮＡといった因子を含む。
免疫の制御因子としてのＰＲＲの重要な特性は、特異的な微生物産物を認識する能力である。したがって、ＰＲＲ媒介性シグナル伝達事象は、感染の決定的な示唆を与えるべきである。炎症およびＴ細胞性免疫を促進するＤＣ上で発現するＰＲＲによって、「ＧＯ」シグナルが活性化されると主張された。興味深いことに、いくつかの研究グループが最近、ＤＣは、単にその全か無かの様式で作用できるだけではないことを提案した（Ｂｌａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｍ．およびＳａｎｄｅｒ，Ｌ．Ｅ． （２０１２年）．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １２、２１５～２２５ページ；Ｖａｎｃｅ，Ｒ．Ｅ．ら、（２００９年）Ｃｅｌｌ ｈｏｓｔ&ｍｉｃｒｏｂｅ ６、１０～２１ページ）。むしろ、ＤＣは、何らかの可能な感染を引き起こす脅威（または病原性）を評価する能力を有し得、釣り合った反応を開始する。それにより病原性が評価され得る、最も一般的に考察されている手段は、非病原体よりも多様多種なＰＲＲを活性化する毒性病原体の能力に基づく。しかしながら、すべての微生物がＰＲＲ活性化因子の共通セットを有する訳ではなく、かつすべてのＰＲＲ活性化因子の力価が同等である訳ではない。したがって、感染中に活性化されるＰＲＲの数は、病原性の理想的な評価ではない。さらに、感染中に活性化されるＰＲＲの数の上昇は、概して、著しい炎症反応をもたらすことになり、それが、間接的に著しいＴ細胞応答を促進し得る。ＤＣ活性化の状態を高めると以前に提案された状況（例えば、刺激としての毒性病原体の使用による）が同じく、ＭΦ活性化の状態を高めると予想される（Ｖａｎｃｅ，Ｒ．Ｅ．ら、（２００９年）Ｃｅｌｌ ｈｏｓｔ＆ｍｉｃｒｏｂｅ ６，１０～２１ページ）。したがって、本当に免疫系（すなわちＤＣ）が感染の脅威を特異的に評価するための機構が存在するのかは不明なままである。
感染の脅威を評価できる１つの可能な手段は、独立諸入力が、任意の単一入力によって誘発される反応とは異なる反応をもたらす、よく知られた過程である一致検出により得る。ＰＲＲに関して、そのような入力の１つは、病原性の脅威にかかわりなく、感染の指標としての微生物産物であるに違いない。毒性脅威を評価するためには、第２の入力が存在する必要がある。理論に拘束されることは望まないが、この推定上の第２の入力は、組織傷害の部位において産生される分子であると考えられる。なぜなら、細胞損傷は頻繁に、病原性の高い微生物と関連する特徴であるからである。ＤＣに対する第２の刺激を与え得る候補分子は、損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）と呼ばれる分子の多様なファミリーであり、アラーミンとしても公知である（Ｋｏｎｏ，Ｈ．およびＲｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．（２００８年）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８、２７９～２８９ページ；Ｐｒａｄｅｕ，Ｔ．およびＣｏｏｐｅｒ，Ｅ．Ｌ．（２０１２年）Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３、２８７ページ）。ＤＡＭＰは、感染性および非感染性の組織傷害の部位において見出され、炎症反応を調節すると提案されたが、その作用機序は不明なままである。ＤＡＭＰのそのような一種は、１－パルミトイル－２－アラキドニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルコリン（ＰＡＰＣ）に由来する酸化リン脂質によって代表され、一括してｏｘＰＡＰＣとして知られる。それらの脂質は、感染性および非感染性の組織傷害の両方の部位において産生され（Ｂｅｒｌｉｎｅｒ，Ｊ．Ａ．およびＷａｔｓｏｎ，Ａ．Ｄ．（２００５年）Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５３、９～１１ページ；Ｉｍａｉ，Ｙ．ら（２００８年）Ｃｅｌｌ １３３、２３５～２４９ページ；Ｓｈｉｒｅｙ，Ｋ．Ａ．ら（２０１３年）Ｎａｔｕｒｅ ４９７、４９８～５０２ページ）、死につつある細胞の膜において高レベルで見出される（Ｃｈａｎｇ，Ｍ．Ｋ．ら（２００４年）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ ２００、１３５９～１３７０ページ）。ｏｘＰＡＰＣはさらに、アテローム性動脈硬化組織での炎症を促進する酸化低密度リポタンパク質（ｏｘＬＤＬ）凝集体の活性成分であり（Ｌｅｉｔｉｎｇｅｒ，Ｎ．（２００３年）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｌｉｐｉｄｏｌ １４、４２１～４３０ページ）、局所濃度は１０～１００μＭであり得る（Ｏｓｋｏｌｋｏｖａ，Ｏ．Ｖ．ら（２０１０年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １８５、７７０６～７７１２ページ）。ｏｘＰＡＰＣと死につつある細胞との間の関連は、この脂質を、組織健全性の標準指標として使用できる可能性を提起した。したがって、ｏｘＰＡＰＣは、微生物産物の存在下に感染性脅威の上昇を示し得る。
活性化ＤＣは、前記の特徴ゆえ、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する優れた能力があり、防御免疫を活発にするために、ＤＣ活性化を促進する多数の戦略が企てられた。それらの戦略は一般的に、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリーのＰＲＲを刺激する合成または天然の微生物産物の使用を含み、注目に値する例は、ますます多くのワクチンを補助するために使用されているＦＤＡ承認のＴＬＲ４リガンドであるモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）分子である（Ｊ．Ｐａａｖｏｎｅｎ、Ｌａｎｃｅｔ、３７４巻、９６８６号、３０１～３１４ページ、２００９年７月；Ｍ．Ｋｕｎｄｉ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ、６巻、２号、１３３～１４０ページ、２００７年４月；Ａ．Ｍ．Ｄｉｄｉｅｒｌａｕｒｅｎｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１８３巻、１０号、６１８６～６１９７ページ、２００９年１１月）。特に、ＴＬＲ単独では、Ｔ細胞性免疫を促進するために必要なすべての分子シグナルをアップレギュレートしない。サイトカインのインターロイキン－１（ＩＬ－１）ファミリーのメンバーが、Ｔ細胞分化の多くの側面、永続的なメモリＴ細胞生成およびエフェクター機能に関する決定的な制御因子である（Ｓ．Ｚ．Ｂｅｎ－Ｓａｓｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１０６巻、１７号、７１１９～２４ページ、２００９年４月；Ｓ．Ｚ．Ｂｅｎ－Ｓａｓｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、２１０巻、３号、４９１～５０２ページ、２０１３年３月；Ａ．Ｊａｉｎら、Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ、９巻、１号、１～１３ページ、２０１８年）。よく特徴づけられたファミリーメンバーであるＩＬ－１βの発現は、ＴＬＲシグナルによって高度に誘導されるが、このサイトカインは、Ｎ末端分泌シグナルを欠くため、細胞から従来の生合成経路によって放出されない。むしろ、ＩＬ－１βは、ＴＬＲリガンドによって活性化されたＤＣのサイトゾル中に、不活性状態で蓄積する（Ｃ．Ｇａｒｌａｎｄａら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、３９巻、６号、１００３～１０１８ページ、２０１３年１２月）。活性化ＤＣからのＩＬ－１β放出の欠如が、ＴＬＲシグナル単独ではＴ細胞応答および防御免疫を最大限に刺激するために十分でないという可能性を提起する。
ＤＣ活性化状態は、ＰＲＲシグナル伝達に際してＤＣが到達できる唯一の細胞運命ではない。実際、異なるＰＲＲが、ＤＣの異なる運命を刺激する。そのような運命の１つは、パイロトーシスとして公知の、炎症型の細胞死への運命決定である。パイロトーシスは、ＤＣおよび他の細胞のサイトゾル中でアセンブルする超分子形成中心（ＳＭＯＣ）であるインフラマソームの作用に起因する制御過程である（Ａ．Ｌｕら、Ｃｅｌｌ、１５６巻、６号、１１９３～１２０６ページ、２０１４年３月；Ｊ．Ｃ．Ｋａｇａｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４巻、１２号、８２１～８２６ページ、２０１４年１２月）。インフラマソームのアセンブリは一般的に、宿主細胞のサイトゾル中でのＰＡＭＰまたはＤＡＭＰの検出に応じて刺激され、したがって、サイトゾルＰＲＲが、サイトゾル中での脅威評価の、インフラマソーム依存性パイロトーシスへの関連付けを担う（Ｋ．Ｊ．ＫｉｅｓｅｒおよびＪ．Ｃ．Ｋａｇａｎ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７巻、６号、３７６～３９０ページ、２０１７年５月；Ｍ．ＬａｍｋａｎｆｉおよびＶ．Ｍ．Ｄｉｘｉｔ、Ｃｅｌｌ、１５７巻、５号、１０１３～２２ページ、２０１４年５月）。パイロトーシスの過程は、細胞からのＩＬ－１βおよび他のＩＬ－１ファミリーメンバーの放出をもたらすため、Ｔ細胞に対して、ＴＬＲが提供できないシグナルを与える。ＩＬ－１β放出の促進に関するこの活性上昇にもかかわらず、パイロプトティック細胞は、死亡しているため、ｄＬＮ中のナイーブＴ細胞を刺激および分化させるために必要な数日続く過程に関与する能力は失っている（Ｔ．Ｒ．Ｍｅｍｐｅｌら、Ｎａｔｕｒｅ、４２７巻、６９７０号、１５４～１５９ページ、２００４年１月）。実際、パイロトーシスを促進する刺激、例えば、一般的に使用されるワクチンアジュバントアラム（Ｓ．Ｃ．Ｅｉｓｅｎｂａｒｔｈら、Ｎａｔｕｒｅ、４５３巻、７１９８号、１１２２～１１２６ページ、２００８年６月；Ｍ．Ｋｏｏｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、１８１巻、６号、３７５５～３７５９ページ、２００８年９月）は、２型免疫応答を刺激するその能力に関して非常によく理解されており（Ｐ．Ｍａｒｒａｃｋら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９巻、４号、２８７～２９３ページ、２００９年４月）、その２型免疫応答は、多数の微生物感染またはがんの消失には適さない。
養子細胞療法（ＡＣＴ）（同種および自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）ならびに組換え細胞（すなわち、ＣＡＲ Ｔ）療法を含む）は、多くの悪性疾患に対して選択される処置である（ＨＳＣＴおよび養子細胞療法アプローチのレビューについては、Ｒａｇｅｒ ＆ Ｐｏｒｔｅｒ，Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ（２０１１年）２巻（６号）４０９～４２８ページ；Ｒｏｄｄｉｅ ＆ Ｐｅｇｇｓ、Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ． Ｂｉｏｌ． Ｔｈｅｒ． （２０１１年） １１巻（４号）：４７３～４８７ページ；Ｗａｎｇら、Ｉｎｔ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ． （２０１５年）１３６巻，１７５１～１７６８ページ；ならびにＣｈａｎｇ，Ｙ．Ｊ．およびＸ．Ｊ． Ｈｕａｎｇ，Ｂｌｏｏｄ Ｒｅｖ，２０１３年、２７巻（１号）：５５～６２ページを参照）。そのような養子細胞療法には、同種および自家造血幹細胞移植、ドナー白血球（またはリンパ球）注入（ＤＬＩ）、腫瘍浸潤リンパ球の養子移入、またはＴ細胞もしくはＮＫ細胞の養子移入（組換え細胞、すなわちＣＡＲ Ｔ、ＣＡＲ ＮＫ、遺伝子編集Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞を含む。Ｈｕら、Ａｃｔａ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ（２０１８年）３９巻：１６７～１７６ページ、Ｉｒｖｉｎｇら、Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ． （２０１７年）８巻：２６７ページを参照）が含まれるが、それらに限定されない。放射線照射および化学療法後の造血を再構成するドナー由来細胞の必要性を上回って、移植細胞からの免疫再構成は残存腫瘍細胞の除去に重要である。悪性腫瘍に対する治療選択肢としてのＡＣＴの有効性は、ドナー細胞の由来、組成および表現型（リンパ球サブセット、活性化状態）、基礎疾患、移植前の前処置レジメンおよび移植後の免疫サポート（すなわち、ＩＬ－２療法）、ならびに移植片内のドナー細胞により媒介される移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果を含む、いくつかの要因によって影響される。さらに、これらの要因は、典型的には前処置レジメンおよび／または宿主内のドナー細胞の過剰な免疫活性（すなわち、移植片対宿主病、サイトカイン放出症候群等）から生じる移植関連死亡率とのバランスをとる必要がある。
本出願は、部分的に、樹状細胞（ＤＣ）を活性化する、またはＤＣパイロトーシスを促進する刺激が、Ｉ型およびＩＩ型のＴヘルパー（Ｔｈ）細胞からなる混合Ｔ細胞応答を誘導するという発見に基づく。それに対して、ＤＣを超活性化する刺激は、ＴＨ２誘導性免疫の証拠なしに、ＴＨ１および細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の免疫応答を選択的に刺激する。超活性ＤＣにより引き起こされるＴＨ１に偏った免疫は、複合抗原源（例えば、腫瘍細胞溶解物）を使用した場合でさえも、ＴＨ１細胞に、抗腫瘍長期防御免疫を媒介する独特の能力を与える。本明細書中に示すように、超活性ＤＣは、ｅｘ ｖｉｖｏで生成することができ、例えば、養子細胞療法のために使用することができる。
したがって、細胞ドナーから生きた樹状細胞を得る工程、樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏでＴＬＲリガンドでプライミングする工程、プライミングされた樹状細胞を非標準的インフラマソーム活性化脂質と共にｅｘ ｖｉｖｏで培養する工程、および樹状細胞に免疫原をロードし、それにより治療用樹状細胞の集団を生成する工程を含む、治療用樹状細胞の集団を生成する方法が、本明細書中で提供される。
また、細胞ドナーから生きた樹状細胞を得る工程、樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏでＴＬＲリガンドでプライミングする工程、プライミングされた樹状細胞を非標準的インフラマソーム活性化脂質と共にｅｘ ｖｉｖｏで培養する工程、樹状細胞に免疫原をロードし、それにより治療用樹状細胞の集団を生成する工程、および治療用樹状細胞の集団を対象に投与し、それにより該対象における免疫応答を誘導する工程を含む、対象における免疫応答を誘導する方法も、本明細書中で提供される。
また、細胞ドナーから生きた樹状細胞を得る工程、樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏでＴＬＲリガンドでプライミングする工程、プライミングされた樹状細胞を非標準的インフラマソーム活性化脂質と共にｅｘ ｖｉｖｏで培養する工程、および樹状細胞に免疫原をロードし、それにより治療用樹状細胞の集団を生成する工程、および治療用樹状細胞の集団を対象に投与し、それにより該対象においてがんを処置する工程を含む、がんを処置する方法も、本明細書中で提供される。
樹状細胞
本明細書に開示される方法は、細胞ドナーから生きた樹状細胞を得る工程を含む。細胞ドナーから得られた樹状細胞は、未成熟または成熟であり得る。樹状細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで分化させることができる。
いくつかの実施形態では、細胞ドナーから生きた樹状細胞を得る工程は、細胞ドナーから前駆細胞を採取する工程、および分化を誘導するのに有効な条件下で該前駆細胞をｅｘ ｖｉｖｏで培養し、それにより細胞ドナーから樹状細胞を得る工程を含む。前駆細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで樹状細胞に分化させる方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ａｒｄａｖｉｎら、「Ｏｒｉｇｉｎ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ」、ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ、２２巻（１２号）：６９１～７００ページ（２００１年）を参照。
いくつかの実施形態では、前駆細胞がリンパ系前駆細胞である。いくつかの実施形態では、前駆細胞が骨髄系前駆細胞である。いくつかの実施形態では、前駆細胞が血液単球である。
いくつかの実施形態では、前駆細胞が骨髄に由来する。いくつかの実施形態では、前駆細胞が血液に由来する。いくつかの実施形態では、前駆細胞が末梢血単核細胞に由来する。いくつかの実施形態では、前駆細胞が臍帯血に由来する。
いくつかの実施形態では、分化を誘導するのに有効な条件下でｅｘ ｖｉｖｏで前駆細胞を培養する工程が、前駆細胞を１つまたは複数のサイトカインの存在下で培養する工程を含む。
いくつかの実施形態では、分化を誘導するのに有効な条件下で前駆細胞をｅｘ ｖｉｖｏで培養する工程が、前駆細胞を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）、トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）、インターロイキン７（ＩＬ－７）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ ３－Ｌ）、インターロイキン１（ＩＬ－１）、またはそれらの組合せの存在下で培養する工程を含む。
いくつかの実施形態では、前駆細胞を、約１～約４８時間、ｅｘ ｖｉｖｏで培養する。いくつかの実施形態では、前駆細胞を、約６～約４８時間、約１２～約４８時間、約１８～約４８時間、約２４～約４８時間、約３０～約４８時間、約３６～約４８時間、約４２～約４８時間、約１～約４２時間、約６～約４２時間、約１２～約４２時間、約１８～約４２時間、約２４～約４２時間、約３０～約４２時間、約３６～約４２時間、約１～約３６時間、約６～約３６時間、約１２～約３６時間、約１８～約３６時間、約２４～約３６時間、約３０～約３６時間、約１～約３０時間、約６～約３０時間、約１２～約３０時間、約１８～約３０時間、約２４～約３０時間、約１～約２４時間、約６～約２４時間、約１２～約２４時間、約１８～約２４時間、約１～約１８時間、約６～約１８時間、約１２～約１８時間、約１～約１２時間、約６～約１２時間、または約１～約６時間、培養する。
いくつかの実施形態では、前駆細胞が血液単球である。いくつかの実施形態では、血液単球を、ＧＭ－ＣＳＦおよび／またはＩＬ－４の存在下で培養する。
いくつかの実施形態では、細胞ドナーから樹状細胞を得る工程は、ｉｎ ｖｉｖｏで分化した樹状細胞を細胞ドナーから採取する工程を含む。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏで分化した樹状細胞が、未成熟樹状細胞である。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏで分化した樹状細胞が、成熟樹状細胞である。
いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏで分化した樹状細胞を、細胞ドナーの脾臓から採取する。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏで分化した樹状細胞を、細胞ドナーのリンパ節から採取する。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏで分化した樹状細胞を、細胞ドナーの胸腺から採取する。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏで分化した樹状細胞を、細胞ドナーの血液から採取する。いくつかの実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏで分化した樹状細胞を、細胞ドナーの皮膚から採取する。
いくつかの実施形態では、対象から樹状細胞を得る工程が、前駆細胞および／またはｉｎ ｖｉｖｏで分化した樹状細胞を凍結する工程を含む。
本明細書に開示される方法は、樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏでＴＬＲリガンドでプライミングする工程を含む。適切なＴＬＲリガンドは、本明細書中に記載される。樹状細胞をプライミングする工程は、前駆細胞をインキュベートする工程、樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏで分化させる工程、および／または樹状細胞をＴＬＲリガンドの存在下でｉｎ ｖｉｖｏで分化させる工程を含み得る。
いくつかの実施形態では、樹状細胞が、ｅｘ ｖｉｖｏでＴＬＲリガンドで約１～約２４ｈプライミングされる。いくつかの実施形態では、樹状細胞は、約３～約２４時間、約６～約２４時間、約９～約２４時間、約１２～約２４時間、約１５～約２４時間、約１８～約２４時間、約２１～約２４時間、約１～約２１時間、約３～約２１時間、約６～約２１時間、約９～約２１時間、約１２～約２１時間、約１５～約２１時間、約１８～約２１時間、約１～約１８時間、約３～約１８時間、約６～約１８時間、約９～約１８時間、約１２～約１８時間、約１５～約１８時間、約１～約１５時間、約３～約１５時間、約６～約１５時間、約９～約１５時間、約１２～約１５時間、約１～約１２時間、約３～約１２時間、約６～約１２時間、約９～約１２時間、約１～約９時間、約３～約９時間、約６～約９時間、約１～約６時間、約３～約６、または約１～約３時間、ｅｘ ｖｉｖｏでＴＬＲリガンドでプライミングされる。
前駆細胞をｅｘ ｖｉｖｏで分化させる実施形態では、樹状細胞のプライミングは、分化を誘導するのに有効な条件下でｅｘ ｖｉｖｏで前駆細胞を培養する前に行われ得る。いくつかの実施形態では、樹状細胞のプライミングは、分化を誘導するのに有効な条件下で前駆細胞をｅｘ ｖｉｖｏで培養した後に行われ得る。いくつかの実施形態では、樹状細胞のプライミングは、分化を誘導するのに有効な条件下でのｅｘ ｖｉｖｏでの前駆細胞の培養と同時に行われ得る。
本明細書に開示される方法は、プライミングされた樹状細胞を、非標準的インフラマソーム活性化脂質と共にｅｘ ｖｉｖｏで培養する工程を含む。適切な非標準的インフラマソーム活性化脂質は、本明細書中に記載される。プライミングされた樹状細胞を培養する工程は、前駆細胞、ｅｘ ｖｉｖｏで分化した樹状細胞、および／またはｉｎ ｖｉｖｏで分化した樹状細胞を、非標準的インフラマソーム活性化脂質の存在下でインキュベートする工程を含み得る。
いくつかの実施形態では、プライミングされた樹状細胞を、非標準的インフラマソーム活性化脂質と共にｅｘ ｖｉｖｏで培養する工程は、約１～約４８時間の間にわたって行われる。いくつかの実施形態では、前駆細胞は、約６～約４８時間、約１２～約４８時間、約１８～約４８時間、約２４～約４８時間、約３０～約４８時間、約３６～約４８時間、約４２～約４８時間、約１～約４２時間、約６～約４２時間、約１２～約４２時間、約１８～約４２時間、約２４～約４２時間、約３０～約４２時間、約３６～約４２時間、約１～約３６時間、約６～約３６時間、約１８～約３６時間、約２４～約３６時間、約３０～約３６時間、約１～約３０時間、約６～約３０時間、約１２～約３０時間、約１８～約３０時間、約２４～約３０時間、約１～約２４時間、約６～約２４時間、約１２～約２４時間、約１８～約２４時間、約１～約１８時間、約６～約１８時間、約１２～約１８時間、約１～約１２時間、約６～約１２時間、または約１～約６時間の間、培養される。
いくつかの実施形態では、プライミングされた樹状細胞を非標準的インフラマソーム活性化脂質と共にｅｘ ｖｉｖｏで培養する工程は、樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏでＴＬＲリガンドでプライミングする工程と同時に行われる。いくつかの実施形態では、プライミングされた樹状細胞を非標準的インフラマソーム活性化脂質と共にｅｘ ｖｉｖｏで培養する工程は、樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏでＴＬＲリガンドでプライミングした後に行われる。
本明細書に開示される方法は、樹状細胞に免疫原をロードする工程を含む。適切な免疫原は、本明細書に開示される。樹状細胞に免疫原をロードする工程は、樹状細胞を免疫原と共に培養する工程を含み得る。
いくつかの実施形態では、樹状細胞に免疫原をロードする工程は、約１～約２４時間にわたって行うことができる。いくつかの実施形態では、樹状細胞に免疫原をロードする工程は、約３～約２４時間、約６～約２４時間、約９～約２４時間、約１２～約２４時間、約１５～約２４時間、約１８～約２４時間、約２１～約２４時間、約１～約２１時間、約３～約２１時間、約６～約２１時間、約９～約２１時間、約１２～約２１時間、約１５～約２１時間、約１８～約２１時間、約１～約１８時間、約３～約１８時間、約６～約１８時間、約９～約１８時間、約１２～約１８時間、約１５～約１８時間、約１～約１５時間、約３～約１５時間、約６～約１５時間、約９～約１５時間、約１２～約１５時間、約１～約１２時間、約３～約１２時間、約６～約１２時間、約９～約１２時間、約１～約９時間、約３～約９時間、約６～約９時間、約１～約６時間、約３～約６時間、または約１～約３時間にわたって行い得る。
いくつかの実施形態では、樹状細胞に免疫原をロードする工程は、樹状細胞を非標準的インフラマソーム活性化脂質と共にｅｘ ｖｉｖｏで培養する工程と同時に行われる。いくつかの実施形態では、樹状細胞に免疫原をロードする工程は、樹状細胞を非標準的インフラマソーム活性化脂質と共にｅｘ ｖｉｖｏで培養した後に行われる。
治療用樹状細胞の集団を生成する方法および／または適応免疫応答を誘導する方法のいくつかの実施形態では、樹状細胞および／または前駆細胞は凍結される。いくつかの実施形態では、樹状細胞および／または前駆細胞は、免疫原をロードする前に凍結される。いくつかの実施形態では、樹状細胞は、免疫原をロードした後に凍結される。
樹状細胞を得て、例えば、がん免疫原をロードするための方法は、当該技術分野において、例えば、米国特許出願公開第２００６０１３４０６７（Ａ１）号、米国特許第９６９４０５９（Ｂ２）号、米国特許第９９６２４３３（Ｂ２）号、米国特許出願公開第２００８０２５４５３７（Ａ１）号、米国特許第９７０１９４２（Ｂ２）号、米国特許出願公開第２００６００５７１２９（Ａ１）号、米国特許出願公開第２０１６０２６３２０６（Ａ１）号、米国特許出願公開第２０１５０３５２２００（Ａ１）号、米国特許出願公開第２００７０２９２４４８（Ａ１）号、米国特許第６２５１６６５（Ｂ１）号、国際公開２００３０１０２９２（Ａ３）号、米国特許出願公開第２０１７０３６３２５（Ａ１）号、米国特許出願公開第２００４０１９７９０３（Ａ１）号、および米国特許第１０７３１１３０（Ｂ２）号に記載されている。
ＴＬＲリガンド
本明細書で使用する場合、用語「パターン認識受容体リガンド」は、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）ファミリー、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）ファミリー、ヌクレオチド結合ロイシンリッチリピート含有（ＮＬＲ）ファミリー、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧまたはＡＩＭ２様受容体（ＡＬＲ）の１つまたは複数のメンバーを活性化する分子化合物に関する。パターン認識受容体リガンドの具体例は、天然または合成の細菌リポ多糖（ＬＰＳ）、天然または合成の細菌リポタンパク質、天然または合成のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列、天然または合成の環状ジヌクレオチド、および天然または合成の炭水化物を含む。環状ジヌクレオチドは、環状ＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）、環状ジＡＭＰ、環状ジＧＭＰを含む。
いくつかの実施形態では、ＴＬＲリガンドが、ＴＬＲ１リガンド、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ５リガンド、ＴＬＲ６リガンド、ＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ８リガンド、ＴＬＲ９リガンド、ＴＬＲ１０リガンド、ＴＬＲ１１リガンド、ＴＬＲ１２リガンド、ＴＬＲ１３リガンド、およびそれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態では、ＴＬＲリガンドがＴＬＲ４リガンドである。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ４リガンドがＬＰＳである。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ４リガンドがＭＰＬＡである。
酸化リン脂質
用語「非標準的インフラマソーム活性化脂質」は、本明細書で使用する場合、細胞のカスパーゼ１１依存性インフラマソームにおいて炎症応答を誘発し得る脂質を指す。例示的な「非標準的インフラマソーム活性化脂質」は、ＰＡＰＣ、ｏｘＰＡＰＣ、およびｏｘＰＡＰＣ種（例えば、ＨＯｄｉＡ－ＰＣ、ＫＯｄｉＡ－ＰＣ、ＨＯＯＡ－ＰＣ、ＫＯＯＡ－ＰＣ、ＰＯＶＰＣ、ＰＧＰＧ）、ならびにロドＬＰＳ（ＬＰＳ－ＲＳ、またはロドバクター・スフェロイデス（Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）由来のＬＰＳ）を含む。
本明細書で使用する用語「ｏｘＰＡＰＣ」または「酸化ＰＡＰＣ」は、断片化された酸素化ｓｎ－２残基または全長の酸素化ｓｎ－２残基のいずれか一方を含有する酸化リン脂質の混合物をもたらす、１－パルミトイル－２－アラキドニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルコリン（ＰＡＰＣ）の酸化により生成される脂質に関する。よく特徴づけられた酸化的断片化種は、オメガアルデヒドまたはオメガカルボキシル基を担持する５炭素ｓｎ－２残基を含有する。アラキドン酸残基の酸化もまた、エステル化されたイソプロスタンを含有するリン脂質を産生する。ｏｘＰＡＰＣは、ＨＯｄｉＡ－ＰＣ、ＫＯｄｉＡ－ＰＣ、ＨＯＯＡ－ＰＣおよびＫＯＯＡ－ＰＣ種を含み、特にｏｘＰＡＰＣ中に存在する他の酸化生成物を含む。
いくつかの実施形態では、非標準的インフラマソーム活性化脂質が、酸化１－パルミトイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルコリン（ｏｘＰＡＰＣ）の種を含む。
ｏｘＰＡＰＣ種は、公知であり、当該技術分野に記載される。例えば、Ｎｉら、「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｉｒ Ｏｘｉｄｉｚｅｄ ＰＡＰＣ：Ａ Ｍｕｌｔｉ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔｕｄｙ ｂｙ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ」、Ｆｒｅｅ Ｒａｄｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １４４：１５６～６６ページ（２０１９年）；表１を参照。
いくつかの実施形態では、非標準的インフラマソーム活性化脂質が、２－［［（２Ｒ）－２－［（Ｅ）－７－カルボキシ－５－ヒドロキシヘプタ－６－エノイル］オキシ－３－ヘキサデカノイルオキシプロポキシ］－ヒドロキシホスホリル］オキシエチル－トリメチルアザニウム（ＨＯｄｉＡ－ＰＣ）、［（２Ｒ）－２－［（Ｅ）－７－カルボキシ－５－オキソヘプタ－６－エノイル］オキシ－３－ヘキサデカノイルオキシプロピル］２－（トリメチルアザニウミル）エチルホスフェート（ＫＯｄｉＡ－ＰＣ）、１－パルミトイル－２－（５－ヒドロキシ－８－オキソ－オクテノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルコリン（ＨＯＯＡ－ＰＣ）、２－［［（２Ｒ）－２－［（Ｅ）－５，８－ジオキソオクタ－６－エノイル］オキシ－３－ヘキサデカノイルオキシプロポキシ］－ヒドロキシホスホリル］オキシエチル－トリメチルアザニウム（ＫＯＯＡ－ＰＣ）、［（２Ｒ）－３－ヘキサデカノイルオキシ－２－（５－オキソペンタノイルオキシ）プロピル］２－（トリメチルアザニウミル）エチルホスフェート（ＰＯＶＰＣ）、［（２Ｒ）－２－（４－カルボキシブタノイルオキシ）－３－ヘキサデカノイルオキシプロピル］２－（トリメチルアザニウミル）エチルホスフェート（ＰＧＰＣ）、［（２Ｒ）－３－ヘキサデカノイルオキシ－２－［４－［３－［（Ｅ）－［２－［（Ｚ）－オクタ－２－エニル］－５－オキソシクロペンタ－３－エン－１－イリデン］メチル］オキシラン－２－イル］ブタノイルオキシ］プロピル］２－（トリメチルアザニウミル）エチルホスフェート（ＰＥＣＰＣ）、［（２Ｒ）－３－ヘキサデカノイルオキシ－２－［４－［３－［（Ｅ）－［３－ヒドロキシ－２－［（Ｚ）－オクタ－２－エニル］－５－オキソシクロペンチリデン］メチル］オキシラン－２－イル］ブタノイルオキシ］プロピル］２－（トリメチルアザニウミル）エチルホスフェート（ＰＥＩＰＣ）、またはそれらの組合せを含む。
いくつかの実施形態では、非標準的インフラマソーム活性化脂質が、[（２Ｒ）－２－（４－カルボキシブタノイルオキシ）－３－ヘキサデカノイルオキシプロピル]－２－（トリメチルアザニウミル）エチルホスフェート（ＰＧＰＣ）を含む。
いくつかの実施形態では、ｏｘＰＡＰＣ種が、表１に記載されるｏｘＰＡＰＣ種またはその組合せである。
Figure 2023503427000001
Figure 2023503427000002
Figure 2023503427000003
Figure 2023503427000004
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Figure 2023503427000009
Figure 2023503427000010
免疫原
「免疫原」および「抗原」は、交換可能に使用され、かつ細胞性免疫応答または体液性免疫応答の対象となる任意の化合物を意味する。非生存免疫原は、例えば、殺滅免疫原、サブユニットワクチン、組換えタンパク質またはペプチド等を含む。本明細書に開示されるアジュバントは、任意の適切な免疫原と共に使用可能である。目的の例示的免疫原は、ウイルス、マイコプラズマ、寄生生物、原生動物、プリオン等から構成されるまたは由来するものを含む。したがって、目的の免疫原は、制限なしに、ヒト乳頭腫ウイルス、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルスまたは帯状疱疹ウイルス、レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス１または２、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、ＲＳウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌、アメーバ、マラリア原虫、および／またはＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉに由来し得る。
目的の免疫原は、疾患標的細胞（例えば、新生細胞、感染細胞）で発現され、他の組織では発現量がより低いか、または全く発現されない。標的細胞の例は、新生物疾患に由来する細胞を含み、肉腫、リンパ腫、白血病、癌、黒色腫、胸部の癌、前立腺の癌、卵巣癌、子宮頚癌、結腸癌、肺癌、膠芽腫、および星状細胞腫を含むがそれらに限定されない。その代わりに、標的細胞は、例えば、ウイルス、マイコプラズマ、細菌、寄生生物、原生動物、プリオン等に感染していてもよい。したがって、目的の免疫原は、制限なしに、ヒト乳頭腫ウイルス（下記を参照）、ヘルペスウイルス、例えば、単純ヘルペスウイルスまたは帯状疱疹ウイルス、レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス１または２、肝炎ウイルス、インフルエンザウイルス、ライノウイルス、ＲＳウイルス、サイトメガロウイルス、アデノウイルス、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ属、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ属、Ｖｉｂｒｉｏ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の細菌、アメーバ、マラリア原虫、およびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉに由来し得る。
いくつかの実施形態では、感染因子による感染が、がんの発生を伴う。例えば、Ｋｕｐｅｒら、「Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ ａｓ ａ Ｍａｊｏｒ Ｐｒｅｖｅｎｔａｂｌｅ Ｃａｕｓｅ ｏｆ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ」、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２４９巻（Ｓ７４１号）：６１～７４ページ（２００１年）を参照。
腫瘍抗原および感染因子の抗原に加えて、ｐ５３、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、網膜芽細胞腫、およびＴＳＧ１０１を含むがこれらに限定されない、腫瘍抑制遺伝子産物の突然変異体、または例えば、制限なしに、ＲＡＳ、ＷＴ、ＭＹＣ、ＥＲＫ、およびＴＲＫ等のがん遺伝子産物も、本開示により使用される標的抗原を提供し得る。標的抗原は、自己抗原、例えば、がんまたは新生物疾患に関連しているものであってもよい。一実施形態では、免疫原が、疾患細胞のヒートショックタンパク質（ｈｓｐ）－ペプチド複合体に由来するペプチド、またはｈｓｐ－ペプチド複合体それ自体である。
本明細書で使用する「がん」は、当該技術分野では公知のように、無制御の細胞増殖または複製を特徴とする疾患、状態、特性、遺伝子型または表現型を意味し、結直腸がん、ならびに、例えば、白血病、例えば、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）および慢性リンパ性白血病、ＡＩＤＳ関連がん、例えばカポジ肉腫；乳がん；骨がん、例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、線維肉腫、巨細胞腫、アダマンチノーマおよび脊索腫；脳がん、例えば、髄膜腫、神経膠芽腫、低悪性度星状細胞腫、乏突起細胞腫（Ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｏｃｙｔｏｍａ）、下垂体腫瘍、シュワン細胞腫および転移性脳がん；様々なリンパ腫、例えば、マントル細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫を含む頭部および頸部のがん、腺腫、扁平上皮癌、喉頭癌、胆嚢・胆管がん、網膜のがん、例えば網膜芽細胞腫、食道のがん、胃がん、多発性骨髄腫、卵巣がん、子宮がん、甲状腺がん、精巣がん、子宮内膜がん、黒色腫、肺がん、膀胱がん、前立腺がん、肺がん（非小細胞肺癌を含む）、膵臓がん、肉腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、頭頚部がん、皮膚がん、鼻咽頭癌、脂肪肉腫、上皮癌、腎細胞癌、胆嚢腺癌、耳下腺癌、子宮内膜肉腫、多剤耐性がん；および増殖性疾患および状態、例えば、腫瘍血管新生関連の血管新生、黄斑変性（例えば、滲出型／萎縮型ＡＭＤ）、角膜血管新生、糖尿病網膜症、血管新生緑内障、近視性変性および他の増殖性疾患および状態を意味する。
免疫原、例えばがん免疫原、および、例えば、樹状細胞のロードにおけるその使用は、当該技術分野において公知であり、記載されている。例えば、Ｍｉｃｈａｅｌ Ｊ．Ｐ．ＬａｗｍａｎおよびＰａｔｒｉｃｉａ Ｄ．Ｌａｗｍａｎ（編）「Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌ．１１３６（２０１４年）；Ｃｈｉａｎｇら、「Ｗｈｏｌｅ Ｔｕｍｏｒ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｗｈｅｒｅ Ａｒｅ Ｗｅ？」Ｖａｃｃｉｎｅｓ（Ｂａｓｅｌ）３（２）：３４４～７２ページ（２０１５年）；Ｔｈｕｍａｎｎら、「Ａｎｔｉｇｅｎ Ｌｏａｄｉｎｇ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｗｈｏｌｅ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２７７：１～１６ページ（２００３年）；Ｋａｍｉｇａｋｉら、「Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ Ｔｕｍｏｒ Ｌｙｓａｔｅ－Ｌｏａｄｅｄ Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ Ｃｅｌｌ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ｂｙ ａ Ｃｌｏｓｅｄ－Ｆｌｏｗ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ」、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３３：２９７１～６ページ（２０１３年）；米国特許第３８２３１２６号明細書；同第３９６０８２７号明細書；および同第４１６００１８号明細書を参照。
いくつかの実施形態では、免疫原が、がん抗原である。いくつかの実施形態では、がん抗原が、腫瘍溶解物、アポトーシス小体、ペプチド、腫瘍ＲＮＡ、腫瘍由来エクソソーム、腫瘍ＤＣ融合、またはそれらの組合せから選択される。
いくつかの実施形態では、免疫原が全腫瘍溶解物である。
いくつかの実施形態では、全腫瘍溶解物を、照射、沸騰および／または凍結融解溶解により調製する。
いくつかの実施形態では、免疫原が自家性である。いくつかの実施形態では、免疫原が同種異系である。
対象において免疫応答を誘導する方法のいくつかの実施形態では、免疫原が、細胞ドナー由来の腫瘍溶解物である。
細胞ドナーおよび対象
用語「患者」または「個体」または「対象」は、本明細書では交換可能に使用し、処置されるべき哺乳動物対象に関し、ヒト患者が好ましい。いくつかの場合では、本明細書に開示される方法は、実験動物、獣医用途において、およびマウス、ラット、ハムスターを含む齧歯動物および霊長類を含むがそれらに限定されない、疾患に関する動物モデルの開発において用いられる。
いくつかの実施形態では、細胞ドナーおよび／または対象が、哺乳動物対象である。用語「哺乳動物」は、本明細書で使用する場合、ヒト、実験動物、家庭ペット、および家畜を含むがそれらに限定されないと意図される。
いくつかの実施形態では、細胞ドナーおよび／または対象が、ヒト対象である。
対象において免疫応答を誘導する方法のいくつかの実施形態では、細胞ドナーが対象である。いくつかの実施形態では、細胞ドナーが、対象ではない。いくつかの実施形態では、前駆細胞および／またはｉｎ ｖｉｖｏで分化した樹状細胞が、自家性である。いくつかの実施形態では、前駆細胞および／またはｉｎ ｖｉｖｏで分化した樹状細胞が、同種異系である。
投与
本明細書に開示される方法では、治療用樹状細胞の集団が対象に投与される。いくつかの実施形態では、治療上有効量の生きた樹状細胞が対象に投与される。
本明細書に開示される治療用樹状細胞の集団の用量は、免疫原の性質および樹状細胞の状況に応じて様々であり得るが、免疫原性応答の誘発における生きた樹状細胞の有効性を増強するために十分であるべきである。治療的または予防的な処置では、投与する生きた樹状細胞の量は、１用量当たり細胞１×１０３個、１×１０４個、１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個、１×１０１０個または１×１０１１個またはそれ以上の範囲であり得る。本開示の樹状細胞は、概して無毒性であり、概して、生命に危険を及ぼすような副作用を引き起こすことなく比較的大量に生細胞として投与することができる。
方法の中には、汎用的な方法が含まれる。いくつかの実施形態では、本方法は、本明細書に記載されるように、対象から細胞を単離する工程、調製する工程、処理する工程、培養する工程、および凍結保存の前または後に、それを同じ患者に再導入する工程を含む。
本明細書に開示される治療用樹状細胞の集団の投与は、がんの改善、軽減または安定化において有効である細胞の濃度をもたらす任意の適切な手段による。治療用樹状細胞の集団は、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、小胞内、腫瘍内または腹腔内）投与経路に適切な剤形で用意され得る。
ヒトへの投与量は、最初のうちは、マウスまたは非ヒト霊長類で使用した、本明細書に開示される治療用樹状細胞の集団の量をもとに推定して決定する。なぜなら、当業者は、ヒトに対する用量を、動物モデルと比べて修正することが、当該技術分野における日常であることを認識するからである。例えば、用量は、投与当たり細胞約１×１０３個、１×１０４個、１×１０５個、１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個から約１×１０１１個またはそれ以上の間を変動し得る。
「適切な用量レベル」は、薬効と有害作用との間での治療上の合理的なバランスをもたらす用量レベルに関する（例えば、投与された、本明細書に開示される樹状細胞によりもたらされる十分な免疫刺激活性で、マクロファージ刺激レベルは十分に低い）。例えば、この用量レベルは、例えば、特定の用量レベルでの免疫原性組成物（本明細書に記載される樹状細胞を含む）の投与後に産生される抗免疫原抗体の、対象におけるピークまたは平均血清レベルに関し得る。
本明細書に定義される場合、化合物または薬剤の「治療上有効」量（すなわち有効用量）は、治療上（例えば臨床上）望ましい結果を生み出すために十分な量を意味する。組成物は、１日おきに１回を含め、１日当たり１回または複数回から１週当たり１回または複数回まで投与され得る。当業者は、疾患または障害の重症度、以前の処置、対象の健康全般および／もしくは年齢、ならびに現在の他疾患を含むがそれらに限定されない特定の要因が、対象を効果的に処置するために必要とされる用量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。さらに、本明細書に開示される生きた樹状細胞の治療上有効量での対象の処置は、単回処置または一連の処置を含み得る。
本明細書に開示される治療用樹状細胞の集団は、剤形、製剤の注射、注入もしくは移植（皮下、静脈内、筋肉内、腫瘍内、小胞内、腹腔内）により、または従来の非毒性、薬学的に許容可能なキャリアを含有する適切な送達デバイスもしくは植込剤を介して非経口的に投与される。そのようなキャリアの製剤および調剤は、医薬製剤分野の当業者には周知である。製剤は、前記のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙに見出され得る。
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容可能な」成分／キャリア等は、不当な有害副作用（例えば、毒性、刺激またはアレルギー応答）を伴わない、合理的な利益／リスク比に見合う、ヒトおよび／または動物での使用に適切であるものである。
治療用樹状細胞の集団を投与する工程を含む、がんまたはその症状を処置する方法が、本明細書中で提供される。したがって、一実施形態は、がんを患う、またはがんに感受性である対象を処置する方法である。本方法は、本明細書に開示される治療用樹状細胞の集団の治療量を、疾患または障害を処置する条件下、疾患または障害またはその症状を処置するために十分な用量で対象に投与する工程を含み得る。
本明細書で使用する「有効量」は、治療上または予防上の利益をもたらす量を意味する。
疾患を「処置する」ことは、本明細書でその用語を使用する場合、疾患または障害、例えばがんの、対象が経験する少なくとも１つの徴候または症状の頻度または重症度を軽減することを意味する。
「処置」は、障害の発生を予防するため、または障害の病理または症状を変化させるために行う介入である。したがって、「処置」は、治療処置および予防措置または防止措置の両方に関する。「処置」はさらに、緩和ケアと指定することもできる。処置を必要とするものは、障害をすでに有するもの、ならびに障害が防がれるべきであるものを含む。したがって、状態、障害または状況の「処置（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、（１）状態、障害もしくは状況を患い得るまたは起こしやすいが、まだ状態、障害もしくは状況の臨床症状または亜臨床症状を経験または示していないヒトまたは他の哺乳動物において発生する状態、障害もしくは状況の臨床症状の出現を防止または遅延させる工程；（２）状態、障害または状況を阻害する工程、すなわち疾患の発生またはその再発（処置を維持する場合）またはその少なくとも１つの臨床症状もしくは亜臨床症状を阻止する、軽減するまたは遅延させる工程；あるいは（３）疾患を緩和させる工程、すなわち状態、障害もしくは状況またはその臨床症状もしくは亜臨床症状の少なくとも１つの後退を引き起こす工程を含む。処置されるべき個体への利益は、統計的に有意であるか、または患者もしくは医師にとって少なくとも知覚可能である。
したがって、がんの場合、「処置」は以下を含み得る：（１）腫瘍のサイズおよび／または数を減少させること；（２）循環型腫瘍細胞の数を減少させること；（３）転移のリスクを低下させること；（４）がんの発生および／または再発のリスクを低下させること。
例えば、症状、分子のレベルまたは生物活性等の「調節」は、例えば、検出可能に上昇または低下した症状または活性等に関する。そのような上昇または低下は、超活性ＤＣで処置されなかった対象と比べて、処置された対象において認めることができ、ただし、処置されなかった対象（例えば、アジュバント脂質の非存在下において免疫原が投与された対象）は、処置された対象と同じもしくは同様の疾患もしくは感染を有するか、または処置された対象と同じもしくは同様の疾患もしくは感染を発現しやすい。そのような上昇または低下は、少なくとも約２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、１００％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％、１０００％、もしくはそれ以上、またはそれらの値のいずれか２つの間の任意の範囲内であり得る。調節は、主観的または客観的に、例えば、対象の自己評価により、臨床医の評価により、または例えば、本明細書に開示される樹状細胞の投与により達成される、対象における免疫刺激の程度および／もしくは質の評価を含む、適切なアッセイもしくは測定の実施により確かめることができる。調節は、一過性、長期的もしくは永続的であり得る、または本明細書に開示される樹状細胞を対象に投与中もしくは投与後の関連時、または本明細書に開示される樹状細胞をアッセイもしくは本明細書もしくは引用参考文献に記載される他の方法において使用中もしくは使用後の関連時、例えば、下記に記載の時間内、または本明細書に開示されるアジュバント脂質の投与もしくは使用の約１２時間から２４時間もしくは４８時間後、対象がそのような免疫刺激組成物／処置の投与を受けた約３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、２１日、２８日、もしくは１ヵ月、３ヵ月、６ヵ月、９ヵ月もしくはそれ以上の後において様々であり得る。
本開示は、免疫応答を誘導する方法を含む。いくつかの実施形態では、免疫応答が適応免疫応答である。
いくつかの実施形態では、免疫応答が、治療的免疫応答である。用語「治療的免疫応答」は、本明細書で使用する場合、標準的技法により測定される、標的抗原に対する体液性免疫および／または細胞性免疫の上昇に関する。好ましくは、標的抗原に対する免疫の誘導レベルが、免疫原の投与前のレベルの少なくとも４倍、好ましくは少なくとも５倍である。さらに、免疫応答は、定性的に測定することもできる。その場合、適切なｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイを用いて、対象での新生物疾患または感染症の進行阻止または寛解が、治療的免疫応答の誘導を示すと見なされる。
本明細書における方法は、そのような効果を生み出す、本明細書に開示される治療用樹状細胞の集団の有効量を、対象（そのような処置を必要とすると同定された対象を含む）に投与する工程を含み得る。そのような処置を必要とする対象の同定は、対象または医療専門家の判断であり得、かつ主観的（例えば見解）または客観的（例えば、検査方法または診断方法により測定可能）であり得る。
本明細書に開示される治療方法（予防処置を含む）は、概して、本明細書に開示される治療用樹状細胞の集団の治療上有効量の、それを必要とする、哺乳動物、特にヒトを含む対象（例えば、動物、ヒト）への投与を含む。そのような処置は、対象、特に、がんもしくはその症状を患う、がんもしくはその症状を有する、がんもしくはその症状に感受性である、またはがんもしくはその症状の危険性があるヒトに適切に投与されることになる。そのような「危険性がある」対象の決定は、任意の客観的または主観的な決定により、診断検査または対象もしくは医療提供者の見解（例えば、遺伝子検査、酵素またはタンパク質マーカー、マーカー（本明細書に記載される）、家族歴等）によって行われ得る。
本開示はまた、処置経過をモニタリングする方法も提供する。本方法は、診断マーカー（マーカー）（例えば、本明細書の化合物により調節される、本明細書に叙述される任意の標的、タンパク質もしくはその指標等）のレベルを特定する工程、あるいはがんに関連する障害もしくはその症状を患う、またはがんに関連する障害もしくはその症状に感受性である対象における診断測定（例えば、スクリーン、アッセイ）を含み得、ここで、対象は、障害またはその症状を処置するために十分な本明細書の化合物の治療量をされている。本方法で特定されるマーカーのレベルは、対象の病態を立証するために、健常正常対照におけるか、または他の罹患した患者における、マーカーの公知のレベルと比較できる。いくつかの場合、対象におけるマーカーの第２のレベルを、第１のレベルの特定よりも遅い時点に特定して、疾患の経過または療法の有効性をモニタリングするために２つのレベルを比較する。特定の態様では、対象におけるマーカーの処置前レベルを、本明細書に開示される処置の開始前に特定する。次いで、処置の有効性を特定するために、マーカーのこの処置前レベルを、対象における処置の開始後のマーカーのレベルと比較してもよい。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される治療用樹状細胞の集団が、医薬組成物の一部として投与される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物を、例えば、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば生理食塩水中で調合して全身投与する。好ましい投与経路は、例えば、膀胱内注入、皮下注射、静脈内注射、腹腔内注射、筋肉内注射、腫瘍内注射または皮内注射を含み、それらは、患者における、組成物の連続的、持続的または有効なレベルをもたらす。ヒト患者または他の動物の処置は、本明細書で同定された治療薬の治療上有効量を、生理学的に許容可能なキャリア中で使用して行う。適切なキャリアおよびその製剤は、例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載される。投与されるべき治療剤の量は、投与方法、患者の年齢および体重、ならびにがんの臨床症状に応じて異なる。概して、量は、がんと関連する他の疾患の処置において使用する他の薬剤に関して使用する量の範囲になるが、特定の場合、化合物の高まった特異性ゆえ、より少量が必要になる。生きた樹状細胞は、当業者には公知の方法で測定して、対象の免疫応答を高める用量、または新生細胞もしくは感染細胞の増殖、生存もしくは侵襲性を低下させる用量で投与する。
本明細書に開示される治療用樹状細胞の集団を含む組成物は、皮膚、皮下、静脈内、筋肉内、非経口、肺内、膣内、直腸内、経鼻または局所投与され得る。組成物は、注射、経口、噴霧、または粒子衝突により送達してもよい。
本明細書に開示される治療用樹状細胞の集団の医薬組成物は、投与説明書と共に、キット、コンテナ、パック、またはディスペンサーに含まれ得る。
併用療法
本明細書で使用する場合、用語「組み合わせて」は、対象に対する療法の投与に関して、治療上利益を目指す２つ以上の療法の使用に関する。投与に関する用語「組み合わせて」はさらに、少なくとも１つの追加療法と共に使用する場合、対象に対する療法の予防的使用に関し得る。用語「組み合わせて」の使用は、療法（例えば、第１および第２の療法）を対象に投与する順序を限定しない。療法は、がんを有した、がんを有する、またはがんに感受性である対象に対する第２の療法の投与前（例えば、１分、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、もしくは１２週間前）、投与と同時に、または投与後（例えば、１分、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、もしくは１２週間後）に投与され得る。該療法は、順番に、かつ該療法が共に作用し得るような期間内に対象に投与される。特定の実施形態では、該療法を、順番に、かつ他の方法で投与した場合よりも効果の上昇をもたらすような期間内に対象に投与する。任意の追加療法を、任意の順序で、他の追加療法と共に投与し得る。
本明細書で使用する場合、用語「がん療法」は、がんの処置に有用な療法に関する。抗がん治療剤の例は、例えば、外科的処置、化学療法剤、免疫療法、増殖阻害剤、細胞毒性剤、放射線療法に用いる薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、およびがんを処置する他の薬剤、例えば、抗ＨＥＲ－２抗体（例えばＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（商標））、抗ＣＤ２０抗体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）アンタゴニスト（例えばチロシンキナーゼ阻害剤）、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ阻害剤（例えばエルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）））、血小板由来成長因子阻害剤（例えばＧＬＥＥＶＥＣ（商標）（メシル酸イマチニブ））、ＣＯＸ－２阻害剤（例えばセレコキシブ）、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲβ、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡまたはＶＥＧＦの受容体の１つまたは複数に結合するアンタゴニスト（例えば中和抗体）、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２、ならびに他の生物活性剤および有機化学剤等を含むが、それらに限定されない。それらの組合せも、本明細書に記載される方法での使用に意図される。
対象において免疫応答を誘導する方法のいくつかの実施形態は、抗がん剤を対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、該抗がん剤が、化学療法剤である。いくつかの実施形態では、該抗がん剤が、免疫チェックポイント調節因子である。
抗がん剤：特定の実施形態では、本方法がさらに、抗がん剤を投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、該抗がん剤が、化学療法剤、増殖阻害剤、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞、抗体またはその抗原結合断片、抗体薬物複合体、血管新生阻害剤、およびそれらの組合せである。
いくつかの実施形態では、抗がん剤が、化学療法剤または増殖阻害剤である。例えば、化学療法剤または増殖阻害剤は、アルキル化剤、アントラサイクリン、抗ホルモン剤、アロマターゼ阻害剤、抗アンドロゲン剤、プロテインキナーゼ阻害剤、脂質キナーゼ阻害剤、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害剤、細胞毒性剤、抗腫瘍抗生物質、プロテアソーム阻害剤、微小管阻害剤、ＥＧＦＲアンタゴニスト、レチノイド、チロシンキナーゼ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、およびそれらの組合せを含み得る。
「化学療法剤」は、がんの処置において有用な化合物である。化学療法剤の例は、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍ．）、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．）、ジスルフィラム、エピガロカテキンガレート、サリノスポラミドＡ、カルフィルゾミブ、１７－ＡＡＧ（ゲルダナマイシン）、ラディシコール、乳酸脱水素酵素Ａ（ＬＤＨ－Ａ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ（商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、スニチニブ（ｓｕｎｉｔｉｎｉｂ）（ＳＵＴＥＮＴ（商標）、Ｐｆｉｚｅｒ／Ｓｕｇｅｎ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ（商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、フィナスネート（ＶＡＴＡＬＡＮＩＢ（商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標）、Ｓａｎｏｆｉ）、５－ＦＵ（５－フルオロウラシル）、ロイコボリン、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（商標）、Ｗｙｅｔｈ）、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（商標）、ＧＳＫ５７２０１６、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ロナファミブ（Ｌｏｎａｆａｍｉｂ）（ＳＣＨ６６３３６）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ（商標）、Ｂａｙｅｒ Ｌａｂｓ．）、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ＡＧ１４７８、スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチラメルアミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトセシン（トポテカンおよびイリノテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびバイゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；副腎皮質ステロイド（プレドニゾンおよびプレドニゾロンを含む）；酢酸シプロテロン；フィナステリドおよびデュタステリドを含む５α－リーダークターゼ）；ボリノスタット、ロミデプシン、パノビノスタット、バルプロ酸、モセチノスタット、ドラスタチン；アルデスロイキン、タルク、デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９およびＣＢＩ－ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンジスタチン；エンジイン抗生物質等の抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンγ１Ｉおよびカリケアマイシンω１Ｉ（Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９４年、３３：１８３～１８６ページ）；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシン；ビスホスホネート、例えばクロドロネート；エスペラマイシン；同様にネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン（ａｎｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（商標）（ドキソルビシン）（モルホリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２－ピロリノドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えばメトトレキセートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン類、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；フロリン酸のような葉酸リプレニッシャー；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホミチン（ｅｌｆｏｍｉｔｈｉｎｅ）；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダムノール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（商標）多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ－２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばＴＡＸＯＬ（パクリタキセル；Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（商標）（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ－ｆｒｅｅ）、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ、Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ、Ｉｌｌ．）、およびＴＡＸＯＴＥＲＥ（商標）（ドセタキセル、ドキセタキセル；Ｓａｎｏｆｉ－Ａｖｅｎｔｉｓ）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲ（商標）（ゲムシタビン）；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（商標）（ビノレルビン）；ノバントロン；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（商標））；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド類、例えばレチノイン酸；ならびに前記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸および誘導体を含み得る。
いくつかの実施形態では、化学療法剤が、アルキル化剤（単官能アルキル化剤および二官能アルキル化剤を含む）、例えば、チオテパ、ＣＹＴＯＸＡＮ（商標）、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、例えば、クロランブシル、クロマファジン（ｃｈｌｏｍａｐｈａｚｉｎｅ）、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチン；テモゾロミド；ならびに前記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸および誘導体を含み得る。
いくつかの実施形態では、化学療法剤が、アントラサイクリン、例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、バルルビシン、ならびに前記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸および誘導体を含み得る。
いくつかの実施形態では、化学療法剤が、抗ホルモン剤（例えば、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン受容体調節因子（ＳＥＲＭ）、例えばタモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（商標）；クエン酸タモキシフェン含む）、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、イオドキシフェン、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびＦＡＲＥＳＴＯＮ（商標）（クエン酸トレミフェン）を含む）；ならびに前記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸および誘導体を含み得る。
いくつかの実施形態では、化学療法剤が、副腎でのエストロゲン産生を制御するアロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）－イミダゾール類、アミノグルテチミド、ＭＥＧＡＳＥ（商標）（酢酸メゲストロール）、ＡＲＯＭＡＳＩＮ（商標）（エキセメスタン；Ｐｆｉｚｅｒ）、ホルメスタニー、ファドロゾール、ＲＩＶＩＳＯＲ（商標）（ボロゾール）、ＦＥＭＡＲＡ（商標）（レトロゾール；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）およびＡＲＩＭＩＤＥＸ（商標）（アナストロゾール；ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）、ならびに前記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸および誘導体を含み得る。
いくつかの実施形態では、化学療法剤が、抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；ブセレリン、トリプテレリン、メドロキシプロゲステロンアセテート、ジエチルスチルベストロール、プレマリン、フルオキシメステロン、ａｌｌ－ｔｒａｎｓ－レチノイン酸、フェンレチニド；ならびにトロキサシタビン（１，３－ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体）；ならびに前記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸および誘導体を含み得る。
いくつかの実施形態では、化学療法剤が、プロテインキナーゼ阻害剤、脂質キナーゼ阻害剤、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド、特に細胞増殖異常に関係するシグナル伝達経路の遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ－α、ＲａｌｆおよびＨ－Ｒａｓを含み得る。
いくつかの実施形態では、化学療法剤が、リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現阻害剤（例えばＡＮＧＩＯＺＹＭＥ（商標））およびＨＥＲ２発現阻害剤を含み得る。
いくつかの実施形態では、化学療法剤が、細胞毒性剤または抗腫瘍抗生物質、例えば、ダクチノマイシン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、マイトマイシン、例えばマイトマイシンＣ、ならびに前記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸および誘導体を含み得る。
いくつかの実施形態では、化学療法剤が、プロテアソーム阻害剤、例えば、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（商標）、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍ．）、エポキソミシン、例えば、カルフィルゾミブ（ＫＹＰＲＯＬＩＳ（商標）、Ｏｎｙｘ Ｐｈａｒｍ．）、マリゾミブ（ＮＰＩ－００５２）、ＭＬＮ２２３８、ＣＥＰ－１８７７０、オプロゾミブ、ならびに前記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸および誘導体を含み得る。
いくつかの実施形態では、化学療法剤が、微小管阻害剤、例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンを含むビンカアルカロイド；パクリタキセルおよびドセタキセルを含むタキサン；ポドフィロトキシン；ならびに前記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸および誘導体を含み得る。
いくつかの実施形態では、化学療法剤が、「ＥＧＦＲアンタゴニスト」を含み得、それは、ＥＧＦＲに結合するか、またはそうでなければＥＧＦＲと直接に相互作用し、そのシグナル伝達活性を妨げるか低下させ、代わりに「ＥＧＦＲｉ」とも呼ばれる化合物に関する。そのような薬剤の例は、ＥＧＦＲに結合する抗体および小分子を含む。ＥＧＦＲに結合する抗体の例は、ＭＡｂ５７９（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ ８５０６）、ＭＡｂ４５５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ＨＢ８５０７）、ＭＡｂ２２５（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０８）、ＭＡｂ５２８（ＡＴＣＣ ＣＲＬ ８５０９）（米国特許第４，９４３，５３３号明細書、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎらを参照）およびそれらのバリアント、例えば、キメラ化２２５（Ｃ２２５またはセツキシマブ；ＥＲＢＵＴＩＸ）および再構成ヒト２２５（Ｈ２２５）（国際公開第９６／４０２１０号を参照、Ｉｍｃｌｏｎｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）；ＩＭＣ－１１Ｆ８、完全ヒトＥＧＦＲに標的化された抗体（Ｉｍｃｌｏｎｅ）；ＩＩ型変異体ＥＧＦＲに結合する抗体（米国特許第５，２１２，２９０号明細書）；同第５，８９１，９９６号明細書に記載される、ＥＧＦＲに結合するヒト化抗体およびキメラ抗体；ならびにＥＧＦＲに結合するヒト抗体、例えば、ＡＢＸ－ＥＧＦまたはパニツムマブ（国際公開第９８／５０４３３号を参照、Ａｂｇｅｎｉｘ／Ａｍｇｅｎ）；ＥＭＤ５５９００（Ｓｔｒａｇｌｉｏｔｔｏら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ３２Ａ：６３６～６４０ページ（１９９６年））；ＥＭＤ７２００（マツズマブ）、ＥＧＦＲに対するヒト化ＥＧＦＲ抗体で、ＥＧＦおよびＴＧＦ－αの両方とＥＧＦＲへの結合をめぐって競合する（ＥＭＤ／Ｍｅｒｃｋ）；ヒトＥＧＦＲ抗体、ＨｕＭａｘ－ＥＧＦＲ（ＧｅｎＭａｂ）；Ｅ１．１、Ｅ２．４、Ｅ２．５、Ｅ６．２、Ｅ６．４、Ｅ２．１１、Ｅ６．３およびＥ７．６．３として知られ、米国特許第６，２３５，８８３号明細書に記載される完全ヒト抗体；ＭＤＸ－４４７（Ｍｅｄａｒｅｘ Ｉｎｃ）；ならびにｍＡｂ８０６またはヒト化ｍＡｂ８０６（Ｊｏｈｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９（２９）：３０３７５～３０３８４ページ（２００４年））を含む。抗ＥＧＦＲ抗体は、細胞毒性剤に結合されていてもよいため、免疫複合体を生成する（例えば欧州特許出願公開第６５９４３９号明細書を参照、Ｍｅｒｃｋ Ｐａｔｅｎｔ ＧｍｂＨ）。ＥＧＦＲアンタゴニストは小分子、例えば、米国特許第５，６１６，５８２号明細書、同第５，４５７，１０５号明細書、同第５，４７５，００１号明細書、同第５，６５４，３０７号明細書、同第５，６７９，６８３号明細書、同第６，０８４，０９５号明細書、同第６，２６５，４１０号明細書、同第６，４５５，５３４号明細書、同第６，５２１，６２０号明細書、同第６，５９６，７２６号明細書、同第６，７１３，４８４号明細書、同第５，７７０，５９９号明細書、同第６，１４０，３３２号明細書、同第５，８６６，５７２号明細書、同第６，３９９，６０２号明細書、同第６，３４４，４５９号明細書、同第６，６０２，８６３号明細書、同第６，３９１，８７４号明細書、同第６，３４４，４５５号明細書、同第５，７６０，０４１号明細書、同第６，００２，００８号明細書、および同第５，７４７，４９８号明細書、ならびに以下のＰＣＴ刊行物：国際公開第９８／１４４５１号、同第９８／５００３８号、同第９９／０９０１６号、および同第９９／２４０３７号に記載される化合物を含む。特定の小分子ＥＧＦＲアンタゴニストは、ＯＳＩ－７７４（ＣＰ－３５８７７４、エルロチニブ、ＴＡＲＣＥＶＡ（商標）Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／ＯＳＩ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）；ＰＤ１８３８０５（ＣＩ１０３３、２－プロペンアミド、Ｎ－［４－［（３－クロロ－４－フルオロフェニル）アミノ］－７－［３－（４－モルホリニル）プロポキシ］－６－キナゾリニル］－、ジヒドロクロリド、Ｐｆｉｚｅｒ Ｉｎｃ．）；ＺＤ１８３９、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ（商標））４－（３’－クロロ－４’－フルオロアニリノ）－７－メトキシ－６－（３－モルホリノプロポキシ）キナゾリン、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＺＭ１０５１８０（（６－アミノ－４－（３－メチルフェニル－アミノ）－キナゾリン、Ｚｅｎｅｃａ）；ＢＩＢＸ－１３８２（Ｎ８－（３－クロロ－４－フルオロ－フェニル）－Ｎ２－（１－メチル－ピぺリジン－４－イル）－ピリミド［５，４－－ｄ］ピリミジン－２，８－ジアミン、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）；ＰＫＩ－１６６（（Ｒ）－４－［４－［（１－フェニルエチル）アミノ］－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－６－イル］－フェノール）－；（Ｒ）－６－（４－ヒドロキシフェニル）－４－［（１－フェニルエチル）アミノ］－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン）；ＣＬ－３８７７８５（Ｎ－［４－［（３－ブロモフェニル）アミノ］－６－キナゾリニル］－２－ブチンアミド）；ＥＫＢ－５６９（Ｎ－［４－［（３－クロロ－４－フルオロフェニル）アミノ］－３－シアノ－７－エトキシ－６－キノリニル］－４－（－ジメチルアミノ）－２－ブテンアミド）（Ｗｙｅｔｈ）；ＡＧ１４７８（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＡＧ１５７１（ＳＵ５２７１；Ｐｆｉｚｅｒ）；ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２チロシンキナーゼ二重阻害剤、例えばラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ（商標）、ＧＳＫ５７２０１６またはＮ－［３－クロロ－４－［（３フルオロフェニル）メトキシ］フェニル］－６［５［［［２メチルスルホニル）エチル］アミノ］メチル］－２－－フラニル］－４－キナゾリンアミン）を含む。
いくつかの実施形態では、化学療法剤はチロシンキナーゼ阻害剤を含み得、これは、前記の段落で記したＥＧＦＲ標的薬物；小分子ＨＥＲ２チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、Ｔａｋｅｄａから入手可能なＴＡＫ１６５；ＣＰ－７２４，７１４、ＥｒｂＢ２受容体チロシンキナーゼの選択的経口阻害剤（ＰｆｉｚｅｒおよびＯＳＩ）；ＨＥＲ二重阻害剤、例えば、好ましくはＥＧＦＲに結合するが、ＨＥＲ２過剰発現細胞およびＥＧＦＲ過剰発現細胞の両方を阻害するＥＫＢ－５６９（Ｗｙｅｔｈから入手可能）；ラパチニブ（ＧＳＫ５７２０１６；Ｇｌａｘｏ－ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから入手可能）、経口ＨＥＲ２およびＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤；ＰＫＩ－１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓから入手可能）；汎ＨＥＲ阻害剤、例えばカネルチニブ（ＣＩ－１０３３；Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；Ｒａｆ－１阻害剤、例えば、Ｒａｆ－１シグナル伝達を阻害する、ＩＳＩＳ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから入手可能なアンチセンス剤ＩＳＩＳ－５１３２；非ＨＥＲ標的ＴＫ阻害剤、例えばメシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（商標）、Ｇｌａｘｏ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅから入手可能）；多標的チロシンキナーゼ阻害剤、例えばスニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ（商標）、Ｐｆｉｚｅｒから入手可能）；ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えばバタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４、Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧから入手可能）；ＭＡＰＫ細胞外制御キナーゼＩ阻害剤ＣＩ－１０４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）；キナゾリン、例えばＰＤ１５３０３５、４－（３－クロロアニリノ）キナゾリン；ピリドピリミジン；ピリミドピリミジン；ピロロピリミジン、例えば、ＣＧＰ５９３２６、ＣＧＰ６０２６１およびＣＧＰ６２７０６；ピラゾロピリミジン、４－（フェニルアミノ）－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン；クルクミン（ジフェルロイルメタン、４，５－ビス（４－フルオロアニリノ）フタルイミド）；ニトロチオフェン部分を含有するチルホスチン；ＰＤ－０１８３８０５（Ｗａｒｎｅｒ－Ｌａｍｂｅｒ）；アンチセンス分子（例えば、ＨＥＲコード核酸に結合するもの）；キノキサリン（米国特許第５，８０４，３９６号明細書）；チルホスチン（同第５，８０４，３９６号明細書）；ＺＤ６４７４（Ａｓｔｒａ Ｚｅｎｅｃａ）；ＰＴＫ－７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）；汎ＨＥＲ阻害剤、例えばＣＩ－１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ）；Ａｆｆｉｎｉｔａｃ（ＩＳＩＳ３５２１；Ｉｓｉｓ／Ｌｉｌｌｙ）；メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ（商標））；ＰＫＩ１６６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）；ＧＷ２０１６（Ｇｌａｘｏ ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）；ＣＩ－１０３３（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＥＫＢ－５６９（Ｗｙｅｔｈ）；セマキシニブ（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＺＤ６４７４（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＰＴＫ－７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／Ｓｃｈｅｒｉｎｇ ＡＧ）；ＩＮＣ－１Ｃ１１（Ｉｍｃｌｏｎｅ）、ラパマイシン（シロリムス、ＲＡＰＡＭＵＮＥ（商標））を含む；または以下の特許刊行物：米国特許第５，８０４，３９６号明細書；国際公開第１９９９／０９０１６号（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ）；同第１９９８／４３９６０号（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｙａｎａｍｉｄ）；同第１９９７／３８９８３号（Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ）；同第１９９９／０６３７８号（Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ）；同第１９９９／０６３９６号（Ｗａｒｎｅｒ Ｌａｍｂｅｒｔ）；同第１９９６／３０３４７号（Ｐｆｉｚｅｒ， Ｉｎｃ）；同第１９９６／３３９７８号（Ｚｅｎｅｃａ）；同第１９９６／３３９７号（Ｚｅｎｅｃａ）および同第１９９６／３３９８０号（Ｚｅｎｅｃａ）のいずれに記載される。
いくつかの実施形態では、化学療法剤が、レチノイド、例えば、レチノイン酸、ならびに前記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸および誘導体を含み得る。
いくつかの実施形態では、化学療法剤が、代謝拮抗薬を含み得る。代謝拮抗薬の例は、葉酸類似体、および葉酸代謝拮抗薬、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトトレキセート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジン類似体、例えば、５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）、アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；ヌクレオシド類似体；およびヌクレオチド類似体を含み得る。
いくつかの実施形態では、化学療法剤が、トポイソメラーゼ阻害剤を含み得る。トポイソメラーゼ阻害剤の例は、トポイソメラーゼ１阻害剤、例えば、ＬＵＲＴＯＴＥＣＡＮ（商標）およびＡＢＡＲＥＬＩＸ（商標）ｒｍＲＨ；トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、例えば、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、およびブレオマイシン；ならびにトポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００を含み得る。
いくつかの実施形態では、化学療法剤が、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、例えば、ボリノスタット、ロミデプシン、ベリノスタット、モセチノスタット、バルプロ酸、パノビノスタット、ならびに前記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸および誘導体を含み得る。
化学療法剤はさらに、ヒドロコルチゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、酢酸コルチゾン、チキソコルトールピバレート、トリアムシノロンアセトニド、トリアムシノロンアルコール、モメタゾン、アムシノニド、ブデソニド、デソニド、フルオシノニド、フルオシノロンアセトニド、ベタメタゾン、ベタメタゾンリン酸エステルナトリウム、デキサメタゾン、デキサメタゾンリン酸エステルナトリウム、フルオコルトロン、１７－酪酸ヒドロコルチゾン、１７－吉草酸ヒドロコルチゾン、ジプロピオン酸アクロメタゾン、吉草酸ベタメタゾン、ジプロピオン酸ベタメタゾン、プレドニカルベート、１７－酪酸クロベタゾン、１７－プロピオン酸クロベタゾール、カプロン酸フルオコルトロン、ピバル酸フルオコルトロン、および酢酸フルプレドニデン；免疫選択的抗炎症性ペプチド（ＩｍＳＡＩＤ）、例えば、フェニルアラニン－グルタミン－グリシン（ＦＥＧ）およびそのＤ－異性体形態（ｆｅＧ）（ＩＭＵＬＡＮ ＢｉｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ＬＬＣ）；抗リウマチ薬、例えば、アザチオプリン、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、Ｄ－ペニシラミン、金塩、ヒドロキシクロロキン、レフルノミドミノサイクリン（ｌｅｆｌｕｎｏｍｉｄｅｍｉｎｏｃｙｃｌｉｎｅ）、スルファサラジン、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）遮断薬、例えば、エタネルセプト（Ｅｎｂｒｅｌ）、インフリキシマブ（Ｒｅｍｉｃａｄｅ）、アダリムマブ（Ｈｕｍｉｒａ）、セトリズマブペゴール（Ｃｉｍｚｉａ）、ゴリムマブ（Ｓｉｍｐｏｎｉ）、インターロイキン１（ＩＬ－１）遮断薬、例えば、アナキンラ（Ｋｉｎｅｒｅｔ）、Ｔ細胞共刺激遮断薬、例えば、アバタセプト（Ｏｒｅｎｃｉａ）、インターロイキン６（ＩＬ－６）遮断薬、例えば、トシリズマブ（ＡＣＴＥＭＥＲＡ（商標））；インターロイキン１３（ＩＬ－１３）遮断薬、例えば、レブリキズマブ；インターフェロンアルファ（ＩＦＮ）遮断薬、例えば、ロンタリズマブ；ベータ７インテグリン遮断薬、例えば、ｒｈｕＭＡｂベータ７；ＩｇＥ経路遮断薬、例えば、抗Ｍ１プライム；分泌型ホモ三量体ＬＴａ３および膜結合型ヘテロ三量体ＬＴａ１／β２遮断薬、例えば、抗リンホトキシンアルファ（ＬＴａ）；放射性同位体（例えば、２１１Ａｔ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、９０Ｙ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１２Ｂｉ、３２Ｐ、２１２Ｐｂ、およびＬｕの放射性同位体）；種々の調査剤、例えばチオプラチン、ＰＳ－３４１、フェニルブチレート、ＥＴ－１８－ＯＣＨ３、またはファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｌ－７３９７４９、Ｌ－７４４８３２）；ポリフェノール、例えばケルセチン、レスベラトロール、ピセアタンノール、エピガロカテキンガレート、テアフラビン、フラバノール、プロシアニジン、ベツリン酸およびその誘導体；オートファジー阻害剤、例えばクロロキン；デルタ－９－テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ（商標））；ベータ－ラパコン；ラパコール；コルチシン；ベツリン酸；アセチルカンプトテシン、スコポレクチン、および９－アミノカンプトテシン）；ポドフィロトキシン；テガフール（ＵＦＴＯＲＡＬ（商標））；ベキサロテン（ＴＡＲＧＲＥＴＩＮ（商標））；ビスホスホネート、例えばクロドロネート（例えば、ＢＯＮＥＦＯＳ（商標）またはＯＳＴＡＣ（商標））、エチドロネート（ＤＩＤＲＯＣＡＬ（商標））、ＮＥ－５８０９５、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ＺＯＭＥＴＡ（商標））、アレンドロネート（ＦＯＳＡＭＡＸ（商標））、パミドロネート（ＡＲＥＤＩＡ（商標））、チルドロネート（ＳＫＥＬＩＤ（商標））、またはリセドロネート（ＡＣＴＯＮＥＬ（商標））；および上皮成長因子受容体（ＥＧＦ－Ｒ）；ワクチン、例えばＴＨＥＲＡＴＯＰＥ（商標）ワクチン；ペリフォシン、ＣＯＸ－２阻害剤（例えば、セレコキシブまたはエトリコキシブ）、プロテオソーム阻害剤（例えばＰＳ３４１）；ＣＣＩ－７７９；チピファルニブ（Ｒ１１５７７）；オラフェニブ、ＡＢＴ５１０；Ｂｃｌ－２阻害剤、例えばオブリメルセンナトリウム（ＧＥＮＡＳＥＮＳＥ（商標））；ピキサントロン；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばロナファルニブ（ＳＣＨ６６３６、ＳＡＲＡＳＡＲ（商標））；ならびに前記のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸および誘導体；ならびに前記のうちの２つ以上の組合せ、例えばＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、およびプレドニゾロンの併用療法の省略形）；ならびにＦＯＬＦＯＸ（オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））を５－ＦＵおよびロイコボリンと組み合わせて用いる治療レジメンの省略形）も含み得る。
化学療法剤はさらに、鎮痛効果、解熱効果、および抗炎症効果を有する非ステロイド抗炎症薬を含み得る。ＮＳＡＩＤは、酵素シクロオキシゲナーゼの非選択的阻害剤を含む。ＮＳＡＩＤの具体的な例は、アスピリン、プロピオン酸誘導体、例えば、イブプロフェン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、およびナプロキセン、酢酸誘導体、例えば、インドメタシン、スリンダク、エトドラク、ジクロフェナク、エノール酸誘導体、例えば、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、およびイソキシカム、フェナム酸誘導体、例えば、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、ならびにＣＯＸ－２阻害剤、例えば、セレコキシブ、エトリコキシブ、ルミラコキシブ、パレコキシブ、ロフェコキシブおよびバルデコキシブを含む。ＮＳＡＩＤは、リウマチ性関節炎、骨関節炎、炎症性関節症、強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、ライター症候群、急性痛風、月経困難症、転移性骨痛、頭痛および片頭痛、術後疼痛、炎症および組織損傷に起因する軽度から中程度の疼痛、発熱、腸閉塞症、ならびに腎疝痛等の状態の症状軽減に対して適応であり得る。
免疫チェックポイント調節：特定の実施形態では、免疫チェックポイント調節因子を、超活性化樹状細胞と共投与する。免疫チェックポイントは、自己免疫寛容の維持および生理学的免疫応答の期間および幅の調節を担う、免疫系の抑制性経路に関する。
特定のがん細胞は、特に、腫瘍抗原に対して特異的であるＴ細胞に関して、免疫耐性の主要機構である免疫チェックポイント経路を利用して繁殖する。例えば、特定のがん細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞応答の阻害を担う１つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質を過剰発現する。したがって、免疫チェックポイント調節因子は、抑制シグナルに打ち勝つために投与可能であり、がん細胞に対する免疫攻撃を許容および／または増強し得る。免疫チェックポイント調節因子は、負の免疫細胞応答制御因子（例えばＣＴＬＡ４）によるシグナル伝達を低下、阻害もしくは抑止することにより、がん細胞に対する免疫細胞応答を促進し得る、または免疫応答の正の制御因子（例えばＣＤ２８）のシグナル伝達を刺激もしくは増強することができる。
免疫チェックポイント調節因子を標的とする免疫療法剤は、がん細胞を標的とする免疫攻撃を促進するために投与され得る。免疫療法剤は、免疫チェックポイント調節因子を標的とする（例えば特異的である）抗体剤（ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｇｅｎｔ）であり得る、または抗体剤を含み得る。免疫療法剤の例は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＬＡＧ－３、ＫＩＲ、ＴＩＭ－３、ＣＤ２８、ＣＤ４０；およびＣＤ１３７の１つまたは複数を標的とする抗体剤を含む。抗体剤の具体例は、モノクローナル抗体を含み得る。免疫チェックポイント調節因子を標的とする特定のモノクローナル抗体が入手可能である。例えば、イピリムバブ（ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ）はＣＴＬＡ－４を標的とし、トレメリムマブはＣＴＬＡ－４を標的とし、ペムブロリズマブはＰＤ－１を標的とする、等である。
プログラム死１（ＰＤ－１）タンパク質は、Ｔ細胞制御因子の拡張ＣＤ２８／ＣＴＬＡ－４ファミリーの抑制性メンバーである（Ｏｋａｚａｋｉら（２００２年）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４：３９１７７９～８２ページ；Ｂｅｎｎｅｔｔら（２００３年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：７１１～８ページ）。ＣＤ２８ファミリーの他のメンバーは、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡを含む。ＰＤ－１に対する２つの細胞表面糖タンパク質リガンドが同定されており、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）およびプログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）である。ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２は、ＰＤ－１に結合して、Ｔ細胞の活性化およびサイトカイン分泌をダウンレギュレートすることが示された（Ｆｒｅｅｍａｎら（２０００年）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７～３４ページ；Ｌａｔｃｈｍａｎら（２００１年）Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１～８ページ；Ｃａｒｔｅｒら（２００２年）Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４～４３ページ；Ｏｈｉｇａｓｈｉら（２００５年）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１：２９４７～５３ページ）。
ＰＤ－Ｌ１（分化抗原群２７４（ＣＤ２７４）またはＢ７ホモログ１（Ｂ７－Ｈ１）としても知られる）は、４０ｋＤａの１型膜貫通型タンパク質である。ＰＤ－Ｌ１は、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞、および骨髄細胞上に見出されるその受容体ＰＤ－１に結合して、活性化または阻害を調節する。ＰＤ－Ｌ１もＰＤ－Ｌ２も、ＰＤ－１に結合するがＣＤ２８またはＣＴＬＡ－４には結合しないＢ７ホモログである（Ｂｌａｎｋら（２００５年）Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４：３０７～１４ページ）。Ｔ細胞上の受容体ＰＤ－１とのＰＤ－Ｌ１の結合は、ＩＬ－２産生のＴＣＲ媒介性活性化およびＴ細胞増殖を阻害するシグナルを送達する。その機構は、ＺＡＰ７０リン酸化の阻害およびその、ＣＤ３ゼータとの会合を含む（Ｓｈｅｐｐａｒｄら（２００４年）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．５７４：３７～４１ページ）。ＰＤ－１シグナル伝達は、ＴＣＲシグナル伝達に起因する、転写因子ＮＦ－κＢおよびＡＰ－１の活性化ならびにＩＬ－２の産生に必要なＰＫＣ－θ活性化ループリン酸化を弱める。ＰＤ－Ｌ１はさらに、共刺激分子ＣＤ８０（Ｂ７－１）に結合するが、ＣＤ８６（Ｂ７－２）には結合しない（Ｂｕｔｔｅら（２００８年）Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．４５：３５６７～７２ページ）。
細胞表面上でのＰＤ－Ｌ１の発現は、ＩＦＮ－γの刺激を介してアップレギュレートされることが示された。ＰＤ－Ｌ１発現は、ヒトの肺癌、卵巣癌、結腸癌および様々な骨髄腫を含む多くのがんで見出され、頻繁に予後不良を伴う（Ｉｗａｉら（２００２年）ＰＮＡＳ ９９：１２２９３～７ページ；Ｏｈｉｇａｓｈｉら（２００５年）Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １１：２９４７～５３ページ；Ｏｋａｚａｋｉら（２００７年）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｉｍｍｕｎ．１９：８１３～２４ページ；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（２００６年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：３３８１～５ページ）。ＰＤ－Ｌ１は、抗原特異的Ｔ細胞クローンのアポトーシスの上昇により、腫瘍免疫において重要であると提案された（Ｄｏｎｇら（２００２年）Ｎａｔ Ｍｅｄ ８：７９３～８００ページ）。ＰＤ－Ｌ１は、腸粘膜炎症に関与している可能性があり、かつＰＤ－Ｌ１の阻害は、大腸炎関連の消耗症を抑制することが提案された（Ｋａｎａｉら（２００３年）Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７１：４１５６～６３ページ）。
例示的な抗ＰＤ１抗体は、ペムブロリズマブ（ＭＫ－３４７５、Ｍｅｒｃｋ）、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）、ピジリズマブ（ＣＴ－０１１、Ｃｕｒｅｔｅｃｈ ＬＴＤ．）を含む。抗ＰＤ１抗体は、例えば、ＡＢＣＡＭ（商標）（ＡＢ１３７１３２）、ＢＩＯＬＥＧＥＮＤ（商標）（ＥＨ１２．２Ｈ７、ＲＭＰ１－１４）およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｊ１０５、Ｊ１１６、ＭＩＨ４）から市販入手可能である。
本開示の実践は、異なる指定がない限り、当該技術分野の技術範囲内にある、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養、およびトランスジェニック生物学の従来の技法を使用する。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第２版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２００１年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３版（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、定期的更新を含む）；Ｇｌｏｖｅｒ、１９８５年、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ）；Ａｎａｎｄ、１９９２年；ＧｕｔｈｒｉｅおよびＦｉｎｋ、１９９１年；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、１９８８年、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）；ＪａｋｏｂｙおよびＰａｓｔａｎ、１９７９年；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、１９８４年）；Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８７年）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ Ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、１９８６年）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４年）；ｔｈｅ 専門書、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ Ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７年、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４巻および１５５巻（Ｗｕ等編）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｃｅｌｌ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｙｅｒおよびＷａｌｋｅｒ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、１９８７年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｉ～ＩＶ巻（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編、１９８６年）；Ｒｉｏｔｔ、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第６版、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、１９８８年；Ｈｏｇａｎ等、Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ Ｅｍｂｒｙｏ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．、１９８６年）；Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．、Ｔｈｅ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ ｂｏｏｋ．Ａ ｇｕｉｄｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｕｓｅ ｏｆ ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ）、（第４版、Ｕｎｉｖ．ｏｆ Ｏｒｅｇｏｎ Ｐｒｅｓｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、２０００年）を参照。
遺伝子：本明細書に開示されるすべての遺伝子、遺伝子名および遺伝子産物は、本明細書に開示される組成物および方法が適用可能である任意の種に由来するホモログに相当すると意図される。ある特定種に由来する遺伝子または遺伝子産物を開示する場合、その開示は、それが現れる文脈が明記しない限り、例示的にすぎず、制限とは解釈されないものとする。したがって、例えば、本明細書に開示される遺伝子または遺伝子産物に関して、他の種からの相同および／またはオーソロガスな遺伝子および遺伝子産物を含むと意図される。
範囲：本開示を通して、開示の様々な態様が、範囲形式で提示され得る。範囲形式の記載は、単に便宜上および簡潔さのためであると理解されるものであり、本発明の範囲に対する不動の限定として解釈されるべきではない。したがって、範囲の記載は、明確に開示されるすべての可能な部分範囲ならびにその範囲内の個々の数値を有すると見なされる。例えば、範囲の記載、例えば１～６は、明確に記載される部分範囲、例えば、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６等、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３および６を有すると見なされる。それは、範囲の幅にかかわらず当てはまる。
本明細書中で提供される任意の組成物または方法は、本明細書中で提供される他の組成物および方法のいずれかの１つまたは複数と組合せ可能である。
異なる定義がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が帰属する技術分野の当業者の１人が一般的に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるのと類似または同等の方法および材料が、本発明の実践または試験において使用できるが、適切な方法および材料を以下に記載する。本明細書に開示される本発明の原理の変形形態が、当業者により行われ得ると理解かつ予想され、そのような変更は、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これらは特許請求の範囲に記載された本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１：超活性樹状細胞は、複合抗原混合物に対する持続性抗腫瘍免疫を刺激する
防御免疫を刺激する理想的な戦略は、活性化ＤＣおよびパイロプトティックＤＣの利益を組み合わせることとなり、活性化細胞が生存力を維持しつつ、ＩＬ－１β放出能を有することになる。本発明者らは最近、それらの特性を示す新規ＤＣ活性化状態を同定した。ＤＣは、ＰＡＭＰ（例えばＴＬＲリガンド）、および死につつある細胞から放出される酸化リン脂質の一群（ＤＡＭＰ）に曝されると、「超活性化」の永続的な状態を達成する（Ｉ．Ｚａｎｏｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３５２巻、６２９０号、１２３２～１２３６ページ、２０１６年；Ｉ．Ｚａｎｏｎｉら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、４７巻、４号、６９７～７０９ページｅ３、２０１７年）。酸化脂質の該一群は、ｏｘＰＡＰＣ（酸化１－パルミトイル－２－アラキドニル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルコリン）として知られる。超活性ＤＣは、サイトカイン放出（例えばＴＮＦα）に関して活性化ＤＣの活性を示すが、さらにＩＬ－１βを数日間にわたって放出する能力を獲得した。「超活性」ＤＣとの指定と一致して、超活性ＤＣは、モデル抗原に対してＴ細胞応答を刺激する能力の点で、その活性化相対物よりも優れている。
当該のＤＡＭＰ（ｏｘＰＡＰＣ）が、サイトゾルＰＲＲカスパーゼ－１１に結合して刺激できることから、ＤＣの超活性状態の基盤となる機構が定義された（Ｉ．Ｚａｎｏｎｉら、２０１６年）。カスパーゼ－１１の刺激は、ＮＬＲＰ３の活性化およびインフラマソームのアセンブリを引き起こし、それは、パイロトーシスをもたらすのではなく、むしろ生細胞からのＩＬ－１βの放出をもたらす。超活性細胞からのＩＬ－１β放出は、それらのサイトカインを分泌するための導管として利用される細孔形成タンパク質ガスデルミンＤによって媒介される（Ｃ．Ｌ．Ｅｖａｖｏｌｄら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０１８年１月１６日；４８（１）：３５～４４ページｅ６．；Ｘ．Ｌｉｕら、Ｎａｔｕｒｅ、５３５巻、７６１０号、１５３～１５８ページ、２０１６年；Ｒ．Ａ．Ａｇｌｉｅｔｔｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１１３巻、２８号、７８５８～６３ページ、２０１６年７月；Ｎ．Ｋａｙａｇａｋｉら、Ｎａｔｕｒｅ、５２６巻、７５７５号、６６６～６７１ページ、２０１５年９月）。ガスデルミンＤ細孔を除去するために、細胞生存性を確保する様式で細胞膜が修復されると考えられるが（Ｓ．Ｒｕｅｈｌら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３６２巻、６４１７号、９５６～９６０ページ、２０１８年１１月）、他の例では（アラム刺激）、膜修復経路が圧倒され、パイロトーシスが続いて起こる。ＩＬ－１βが生細胞からいかに放出され得るかについてのこの洞察にもかかわらず、適応免疫の命令に関する超活性細胞状態の生理学的利益は、十分に定義されていない。
材料および方法
マウス系統および腫瘍細胞株：Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｊａｘ０００６６４）、カスパーゼ－１／－１１ ｄＫＯマウス（Ｊａｘ０１６６２１）、ＮＬＲＰ３ＫＯ（Ｊａｘ０２１３０２）、Ｃａｓｐ１１ＫＯ（Ｊａｘ０２４６９８）、ＯＴ－Ｉ（Ｊａｘ００３８３１）およびＯＴ－ＩＩ（Ｊａｘ００４１９４）およびＢＡＬＢ／ｃ（Ｊａｘ０００６５１）マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓから購入した。Ｃ５７ＢＬ／６Ｊでの同系腫瘍モデルには、２つの黒色腫細胞株を使用した。親細胞株：Ｂ１６．Ｆ１０、およびＯＶＡ発現細胞株：Ｂ１６．Ｆ１０ＯＶＡ。同系結腸直腸モデルには、Ｃ５７ＢＬ６マウス結腸腺癌細胞由来のＯＶＡ発現ＭＣ－３８細胞株を使用した。これらの細胞株は、Ａｒｌｅｎｅ Ｓｈａｒｐｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから贈与された。ＢＡＬＢ／ｃマウスでの同系結腸がんモデルには、ＣＴ２６細胞株を使用した（Ｊｅｆｆ Ｋａｒｐ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからの贈与）。
試薬：Ｅ．ｃｏｌｉ ＬＰＳ（血清型Ｏ５５：Ｂ５－ＴＬＲＧＲＡＤＥ（商標））をＥｎｚｏから購入し、細胞培養には１μｇ／ｍｌまたはｉｎ ｖｉｖｏ使用には１０μｇ／マウスで使用した。Ｓ．ｍｉｎｎｅｓｏｔａ Ｒ５９５由来のモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）をＩｎｖｉｖｏｇｅｎから購入し、細胞培養には１μｇ／ｍｌまたはｉｎ ｖｉｖｏ使用には２０μｇ／マウスで使用した。ＯｘＰＡＰＣをＩｎｖｉｖｏｇｅｎから購入し、予熱した無血清培地中に再懸濁し、細胞刺激には１００μｇ／ｍｌまたはｉｎ ｖｉｖｏ使用には６５μｇ／マウスで使用した。ＰＯＶＰＣおよびＰＧＰＣを、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した。市販入手可能なＰＯＶＰＣおよびＰＧＰＣの再構築は、以前に記載されたように行った（Ｃ．Ｌ．Ｅｖａｖｏｌｄら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、２０１８年１月１６日；４８（１）：３５～４４ページ）。簡単に言うと、窒素ガス緩流を使用して、エタノール溶媒を蒸発させる。次いで、予熱した無血清培地を直ちに乾燥脂質に添加して、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度にした。再構築脂質を３７℃で５～１０分間インキュベートして、細胞に添加する前に２０ｓ、超音波処理した。ＰＯＶＰＣまたはＰＧＰＣを、細胞刺激には１００μｇ／ｍｌまたはｉｎ ｖｉｖｏ使用には６５μｇ／マウスで使用した。エンドトキシンレベル＜１ＥＵ／ｍｇであるＥｎｄｏＦｉｔ鶏卵オボアルブミンタンパク質、およびＯＶＡ２５７～２６４ペプチドを、ｉｎ ｖｉｖｏ使用には２００μｇ／マウスの濃度またはｉｎ ｖｉｔｒｏ使用には５００μｇもしくは１００μｇ／ｍｌの濃度でＩｎｖｉｖｏｇｅｎから購入した。不完全フロイトアジュバント（Ｆ５５０６）は、Ｓｉｇｍａから購入し、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化には、１：４（ＩＦＡ：抗原エマルジョン）の作用濃度で使用した。アラムと呼ばれるアルハイドロゲルは、Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入し、ｉｎ ｖｉｖｏ免疫化には、２ｍｇ／マウスの作用濃度で使用した。いくつかの実験では、ＩＦＡの代わりに、スクアレン－水中油型アジュバントであるＡｄｄａｖａｘを、１：２（ＡｄｄＶａｘ：抗原）の作用濃度で使用した。
細胞培養：ＢＭＤＣは、ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ Ｂ１６－ＧＭ－ＣＳＦ由来上清、２μＭ ２－メルカプトエタノール、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０％ＦＢＳ中での骨髄の分化により生成した。培養から６日後、ＢＭＤＣをＰＢＳで洗浄し、１０％ＦＢＳを含むＩＭＤＭに、１×１０６細胞／ｍｌの濃度におき１００μｌの最終体積で再プレーティングした。ＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａを使用したフローサイトメトリーにより、ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ純度を評価し、通常は８０％超であった。１５日間にわたりＢ１６－ＦＬＴ３を注射したマウスからの脾臓ＤＣを、ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ＋生細胞として精製し、次いで完全ＩＭＤＭ中、１×１０６細胞／ｍｌの濃度におき１００μｌの最終体積でプレーティングした。超活性ＢＭＤＣまたはパイロプトティックＢＭＤＣを誘導するために、ＤＣを、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）で３時間プライミングしてから、完全ＩＭＤＭ中においてＯｘＰＡＰＣもしくはＰＧＰＣ（１００μｇ／ｍｌ）またはアラム（１００μｇ／ｍｌ）で２１ｈ刺激した。いくつかの場合、活性化ＢＭＤＣを、さらなる２４ｈ、Ｕｌｔｒａ－ＬＥＡＦ抗マウスＣＤ４０（クローン１Ｃ１０；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を使用したプレート結合型アゴニスト抗ＣＤ４０上で再刺激した。Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）および５０μＭ β－メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を補充したＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。腫瘍細胞株はすべて、１０％ＦＢＳ補充ＤＭＥＭ中で培養した。ＯＶＡ発現細胞株の場合、培地にピューロマイシン（２μｇ／ｍｌ）を添加した。
ＬＤＨアッセイおよびＥＬＩＳＡ：ＢＭＤＣ刺激後、遠心分離により新鮮上清を浄化し、次いで、Ｐｉｅｒｃｅ ＬＤＨ細胞毒性比色アッセイキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し製造業者のプロトコルに従って、ＬＤＨ放出アッセイを行った。吸光度の測定は、Ｔｅｃａｎプレートリーダーを用いて、４９０ｎｍおよび６８０ｎｍの波長で行った。分泌されたサイトカインを測定するために、上清を捕集し、遠心分離により浄化し、－２０℃で保管した。ＩＬ－１β、ＴＮＦα、ＩＬ－１０、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－１３、ＩＬ－４およびＩＬ－１７に対するＥＬＩＳＡは、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅａｄｙ－ＳＥＴ－Ｇｏ！（現在はＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）ＥＬＩＳＡキットを、製造業者のプロトコルに従って使用して実施した。
フローサイトメトリー：ＦｃＲ阻害後、７日目のＢＭＤＣを、ＭＡＣＳバッファー（１％ＦＣＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）中に再懸濁し、以下の蛍光標識抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）：抗ＣＤ１１ｃ（クローンＮ４１８）、抗Ｉ－Ａ／Ｉ－Ｅ（クローンＭ５／１１４．１５．２）、抗ＣＤ４０（クローン３／２３）、抗ＣＤ８０（１６－１０Ａ１）、抗ＣＤ６９クローン（Ｈ１．２Ｆ３）、抗Ｈ－２Ｋｂ（クローンＡＦ６－８８．５）で染色した。腫瘍または流入領域鼠経リンパ節または皮膚鼠経部脂肪組織からの単一細胞懸濁液を、ＭＡＣＳバッファー（１％ＦＣＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）中に再懸濁し、以下の蛍光標識抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）：抗ＣＤ８α（クローン５３－６．７）、抗ＣＤ４（クローンＲＭ４－５）、抗ＣＤ４４（クローンＩＭ７）、抗ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ－１４）、抗ＣＤ３（１７Ａ２）、抗ＣＤ１０３（２Ｅ７）、抗ＣＤ６９クローン（Ｈ１．２Ｆ３）、抗ＣＤ４５（Ａ２０または３０Ｆ１１）で染色した。細胞の生存率を特定するために、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）固定可能バイオレット死細胞染色キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、細胞を、ＰＢＳ中、４℃で２０分間染色した。流入領域鼠経リンパ節Ｔ細胞は、ＯＶＡペプチドテトラマーを用いて室温で１ｈ、染色した。ＰＥ結合型Ｈ２Ｋ（ｂ）ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７～２６４；配列番号１）およびＡＰＣ結合型Ｉ－Ａ（ｂ）ＡＡＨＡＥＩＮＥＡ（ＯＶＡ３２９～３３７；配列番号２）を使用した。ＣＬＩＰペプチドに関連するＩ－Ａ（ｂ）およびＨ２Ｋ（ｂ）を、アイソタイプ対照として使用した。テトラマーは、ＮＩＨテトラマーコアファシリティから購入した。いくつかの実験では、ａｃｃｕｒａｔｅ ｃｈｅｍｉｃａｌから購入したＦＩＴＣ抗ＣＤ８．１（クローンＬｙｔ－２．１ ＣＤ８－Ｅ１）を、テトラマーと共に使用した。細胞の絶対数を特定するために、ＣＯＵＮＴＢＲＩＧＨＴカウントビーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）を使用し製造業者のプロトコルに従った。適切なアイソタイプ対照を、染色対照として使用した。データは、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡＲＩＡまたはＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて獲得した。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。
抗原取込みアッセイ：異なる活性状態（活性状態、超活性状態、またはパイロプトティック状態）中のＢＭＤＣの抗原取込みおよびエンドサイトーシス能を調べるために、ＦＩＴＣ標識ニワトリＯＶＡ（ＦＩＴＣ－ＯＶＡ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ－Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を使用した。簡単に言うと、前処理したＢＭＤＣを、ＦＩＴＣ－ＯＶＡまたはＡＦ４８８－デキストラン（０．５ｍｇ／ｍｌ）のいずれかと、３７℃または４℃（抗原の表面結合に関する対照として）において４５分間インキュベートした。次いでＢＭＤＣを洗浄し、生細胞を死細胞と区別するために、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ固定可能バイオレット死細胞染色キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。次いで細胞をＢＤ固定液で固定し、ＭＡＣＳバッファー（１％ＦＣＳおよび２ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）中に再懸濁した。Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を使用して、生細胞のＦＩＴＣ蛍光を１５分おきに測定した。３７℃でインキュベートしたＢＭＤＣの蛍光値を、ＯＶＡ－ＦＩＴＣまたはＤｅｘｔｒａｎ－ＡＦ４８８関連細胞の百分率として報告し、データを、４℃でインキュベートしたＯＶＡ－ＦＩＴＣ関連細胞の百分率に対して正規化した。
ＯＶＡ抗原提示アッセイ：ＭＨＣ－Ｉ上でのＯＶＡ抗原提示の効率を測定するために、活性化（ＬＰＳ）、超活性化（ＬＰＳ＋ＰＧＰＣもしくはＬＰＳ＋ＯｘＰＡＰＣ）またはパイロプトティック刺激（ＬＰＳ＋アラム）で処理した（０．５×１０６個の）ＢＭＤＣを、Ｅｎｄｏｆｉｔ－ＯＶＡタンパク質（０．５ｍｇ／ｍｌ）と共に、３７℃で２時間インキュベートした。次いで細胞をＭＡＣＳバッファーで洗浄してから、氷上で２０～３０分、ＡＰＣ抗マウスＨ－２Ｋｂ抗体（クローンＡＦ６－８８．５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、およびＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬに結合したＨ－２Ｋｂに結合するＰＥ結合型抗体（配列番号１；クローン２５－Ｄ１．１６、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。適切なアイソタイプ対照を、染色対照として使用した。総表面Ｈ－２Ｋｂの百分率、およびＭＨＣ－Ｉ上のＯＶＡペプチド関連細胞の百分率を計算した。データは、Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を用いて獲得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）で解析した。
ＯＴ－ＩおよびＯＴ－ＩＩのｉｎ ｖｉｔｒｏ Ｔ細胞刺激：脾臓のＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞をそれぞれ、抗ＣＤ８ビーズまたは抗ＣＤ４ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた磁気セルソーティングにより、ＯＴ－ＩマウスおよびＯＴ－ＩＩマウスからソーティングした。ソーティングしたＴ細胞を、次いで９６ウェルプレート上に、ウェル当たり１００，０００細胞の濃度で、ＬＰＳ（活性化刺激）またはＬＰＳ＋ＰＧＰＣ（超活性化刺激）またはＬＰＳ＋アラム（パイロプトティック刺激）のいずれかで前処理した上にＯＶＡタンパク質またはＳＩＩＮＦＥＫＬ（配列番号１）ペプチドにより、１００μｇ／ｍｌにおいて２時間パルスした（またはしなかった）２０，０００個または１０，０００個のＤＣの存在下（５：１または１０：１の比率）播種した。培養から５日後、－２０℃での短期保管およびＥＬＩＳＡによるサイトカイン測定のために、上清を捕集し、遠心分離により浄化した。
細胞内染色：細胞内サイトカイン染色には、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ）およびブレフェルジンＡの存在下において細胞を４～５ｈ、５０ｎｇ／ｍｌのホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）および５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した。次いで細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中で、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）固定可能バイオレットまたはグリーン死細胞染色キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）により、４℃で２０分染色した。細胞をＭＡＣＳバッファーで洗浄し、適切な表面マーカーに対して、４℃で２０分染色した。２回洗浄後に細胞を、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキットを使用して、製造業者のプロトコルどおりに、４℃で２０分、固定および透過処理してから、１Ｘ透過洗浄バッファー（ＢＤ）で洗浄した。細胞内サイトカイン染色は、１Ｘ透過バッファー中、４℃で２０～３０分、いずれもＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した以下の結合型抗体：抗Ｋｉ６７（クローン１６Ａ８）、抗ＩＦＮ－γ（クローンＸＭＧ１．２）、抗ＴＮＦα（クローンＭＰ６－ＸＴ２２）、抗Ｇａｔａ３（１６Ｅ１０Ａ２３）、抗ＩＬ４（１１Ｂ１１）、抗ＩＬ１０（クローンＪＥＳ５－１６Ｅ３）を用いて行った。データは、ＢＤ ＦＡＣＳ ＡＲＩＡまたはＢＤ Ｆｏｒｔｅｓｓａを用いて獲得した。データは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して解析した。
ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイ：ＣＤ８＋Ｔ細胞のエフェクター抗腫瘍活性を評価するために、フローサイトメトリーにより、リソソーム関連タンパク質ＣＤ１０７ａの表面露出を評価した。簡単に言うと、抗ＣＤ８ビーズおよびカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた磁気細胞濃縮により、免疫マウスの皮膚流入領域リンパ節からＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、次いでＦＡＣＳ ＡＲＩＡ（ＢＤ）を用いてＣＤ３＋ＣＤ８＋生細胞としてソーティングした。ソーティングしたばかりのＣＤ８＋Ｔ細胞を、完全ＲＰＭＩ中に１×１０６細胞／ｍｌの濃度で再懸濁した。その培地に、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（ＢＤ）の存在下、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗マウスＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ－１）抗体（クローン１Ｄ４Ｂ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を１μｇ／ｍｌの濃度で添加した。次いで直ちにＴ細胞を、１００，０００細胞として、９６ウェルプレート中の１０，０００個のＭＣ３８ＯＶＡ腫瘍細胞またはＢ１６ＯＶＡ腫瘍細胞／ウェル上に播種した。その代わりに、ＣＤ８＋Ｔ細胞を単独で播種し、５０ｎｇ／ｍｌのホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）および５００ｎｇ／ｍｌのイオノマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で刺激した。培養から５時間後、細胞をＭＡＣＳバッファーで洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（商標）固定可能バイオレット死細胞染色キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｂｅｓ）およびＡＰＣ抗ＣＤ８（クローン５３－６．７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で染色した。次いで細胞を、ＢＤ固定液を用いて４℃で２０分固定し、ＭＡＣＳバッファー中に再懸濁した。Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ）を用いたフローサイトメトリーにより、ＣＤ１０７ａ＋細胞の百分率を特定した。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性アッセイ：サバイバーマウスの脾臓または皮膚鼠経部脂肪組織に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ８ ＭＡＣＳビーズおよびカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。次いで、ＦＡＣＳ ＡＲＩＡを使用して、濃縮Ｔ細胞を、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋生細胞としてソーティングした。ソーティング後の純度は＞９７％であった。腫瘍細胞株、例えば、Ｂ１６ＯＶＡ、Ｂ１６Ｆ－１０またはＣＴ２６細胞を、Ｔ細胞と共培養する少なくとも５時間前に、９６ウェルプレート（２×１０４細胞／ウェル）上の完全ＤＭＥＭ中に播種した。１０５個のＣＤ８＋Ｔ細胞を腫瘍細胞上に播種して１２ｈしてから、Ｐｉｅｒｃｅ ＬＤＨ細胞毒性比色アッセイキット（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し製造業者のプロトコルに従い、ＬＤＨ放出アッセイにより、細胞毒性を評価した。
全腫瘍細胞溶解物の調製：免疫化用の全腫瘍細胞溶解物（ＷＴＬ）を調製するために、腫瘍細胞株を完全ＤＭＥＭ中で４～５日培養した。細胞がコンフルエント状態になったら上清を捕集し、細胞を洗浄し、トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して解離した。次いで、腫瘍細胞株を、その捕集培養上清中に５×１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、３サイクルの凍結融解により溶解した。
腫瘍浸潤：免疫マウスにおける腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の頻度を評価するために、腫瘍のサイズが１．８～２ｃｍに達したら採取した。腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ）およびｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳディソシエータを使用し製造業者のプロトコルに従い、腫瘍を解離した。消化後、腫瘍をＰＢＳで洗浄し、７０μｍのフィルターおよび３０μｍのフィルターを通過させた。ＣＤ４５マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＣＤ４５＋細胞を陽性選択し、フローサイトメトリーにより、Ｔ細胞浸潤を評価した。Ｔ細胞を活性化および増殖させるために、ダイナビーズマウスＴアクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ）を用いて、腫瘍浸潤Ｔ細胞を培養した。
養子細胞移植：Ｔ細胞移植には、サバイバーマウスの脾臓または皮膚鼠経部脂肪組織に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ８ ＭＡＣＳビーズおよびカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離した。次いで、ＦＡＣＳ ＡＲＩＡを使用して、濃縮細胞を、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ８＋生細胞としてソーティングした。ソーティング後の純度は＞９７％であった。ソーティングしたＴ細胞を次いで、抗ＣＤ３（４μｇ／ｍｌ）および抗ＣＤ２８（４μｇ／ｍｌ）でコーティングした２４ウェルプレート（～２×１０６細胞／ウェル）上で、ＩＬ－２（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下、２４ｈ刺激した。５×１０５個の活性化された循環型脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞または皮膚鼠径部脂肪性常在型ＣＤ８＋Ｔ細胞をそれぞれ、ｉ．ｖ．注射または皮内（ｉ．ｄ．）注射により、ナイーブ受容マウスに移植した。いくつかのマウスは、両方のＴ細胞サブセットを受けた。
ＤＣ移植には、ＢＭＤＣを６日目に採取し、５×１０６個の細胞を６ウェルプレートに播種した。ＤＣ活性化は、超活性刺激（ＬＰＳ＋ＰＧＰＣ）または活性化刺激（ＬＰＳ）とのインキュベーションにより誘導した。腫瘍溶解物を、ＤＣ １個に対して腫瘍細胞２個当量（すなわち、１：２）の比で、ＤＣ培養プレートに１ｈ添加した。非ロードナイーブＤＣを陰性対照として使用した。
統計解析：３つ以上の群を有する実験に関する統計的有意性は、テューキーの多重比較検定補正を用いる二元配置分散分析で検定した。Ｐｒｉｓｍ（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いて計算した調整済みｐ値は、アスタリスク：＜０．０５（＊）；＜０．０００５（＊＊＊）；≦０．０００１（＊＊＊＊）により表現する。
結果
Ｔ細胞免疫を刺激するためにＤＣにとって重要ないくつかの活性を超活性化刺激がアップレギュレートする
ＤＣ超活性化に関する実質的にすべての研究は、生存力を維持しつつＩＬ－１βを放出するＤＣの能力に注目していた。超活性化刺激によって影響されるＤＣ機能の範囲は定義されていない。この範囲を調べるために、骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）をＬＰＳでプライミングし、続いてｏｘＰＡＰＣ、またはＰＧＰＣというｏｘＰＡＰＣの特異的かつ純粋な脂質成分で処理した（Ｉ．Ｚａｎｏｎｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３５２巻、６２９０号、１２３２～１２３６ページ、２０１６年）。得られる超活性化細胞を、従来のように活性化されたＢＭＤＣ（ＬＰＳで処理）またはパイロプトティックＢＭＤＣ（ＬＰＳでプライミングしてからアラムで処理）と比較した。予想どおりＩＬ－１βの放出を誘導しなかった活性化刺激と対照的に、パイロプトティック刺激または超活性化刺激は、細胞外培地へのＩＬ－１βの放出を促進した（図１Ａ）。調べた刺激はすべて、サイトカインＴＮＦαの分泌を促進した（図１Ａ）。この発見は、ＬＰＳ活性化ＢＭＤＣは、ＴＮＦαを放出するがＩＬ－１βは放出しないということを確立した先行研究（Ｉ．Ｚａｎｏｎｉら、２０１６年）と一致する。ＩＬ－１β分泌は、サイトゾル酵素乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出により評価される（図１Ｂ）、パイロプトティックＤＣにおける細胞死と同時に起きた。それに対して、ＩＬ－１β分泌は、超活性化細胞におけるＬＤＨ放出の非存在下において起きた（図１Ｂ）。ＬＰＳを、ヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）および肝炎Ｂウイルス（ＨＢＶ）に対するワクチン中で使用されるＦＤＡ承認のＴＬＲ４リガンドであるＭＰＬＡで代替した場合、ＢＭＤＣの類似の挙動が認められた（図３Ａ、図３Ｂ）。超活性ＢＭＤＣの挙動が、ｉｎ ｖｉｖｏで分化したＤＣにまで及ぶかを確かめるために、Ｂ１６－ＦＬＴ３を注射したマウスの脾臓から単離したＣＤ１１ｃ＋ＤＣの活性を調べた。ＧＭＣＳＦ由来ＢＭＤＣの挙動と同様に、ＬＰＳおよびＰＧＰＣでの処理は、ＬＤＨ放出により評価される細胞死の非存在下において脾臓ＣＤ１１ｃ＋ＤＣからのＴＮＦαおよびＩＬ－１βの放出をもたらした（図３Ｃ、図３Ｄ）。これらの結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで分化した生存ＤＣからのＩＬ－１β放出を誘導するために、超活性化刺激ＰＧＰＣを使用できることを示す。
Ｔ細胞分化にとって重要ないくつかのシグナル、例えば、共刺激分子ＣＤ８０、ＣＤ６９およびＣＤ４０の発現、ならびにＩＬ－１２のｐ７０サブユニットの分泌を調べた。ＣＤ８０の表面発現は、すべての活性化刺激に対して応答するＤＣにおいて類似した（図５Ｅ）。それに対して、ＣＤ４０発現は、活性化刺激により著しく影響された。活性化刺激ＬＰＳと比べて、超活性化刺激は、ＣＤ４０の発現を著しく誘導した（図１Ｃ）。パイロプトティック刺激は、ＣＤ４０およびＣＤ６９の非常に弱いインデューサーであり、ＬＰＳ－アラム処理後、生細胞の２０～３０％の範囲内でさえあった（図１Ｃおよび図３Ｅ）。アゴニスト抗ＣＤ４０コートプレート上で培養した場合、ＣＤ４０の差次的発現は、最大のＩＬ－１２ｐ７０分泌能を有する超活性ＤＣと相関した（図１Ｄ）。
超活性ＢＭＤＣは、蛍光オボアルブミン（ＯＶＡ－ＦＩＴＣ）の同等の内在化により評価されたように（図４Ａ、図４Ｂ）、抗原捕捉においてその活性化相対物よりも優れてはいなかったものの、前者の細胞集団は、細胞表面のＭＨＣ－Ｉ分子上に、非常に多量のＯＶＡ由来ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを示した（図１Ｅおよび図４Ｃ）。表面ＭＨＣ－Ｉ総量は、活性化細胞と超活性化細胞との間で異ならなかった（図３Ｅ）。まとめると、ＤＣの他の刺激と比べて、超活性化刺激は、Ｔ細胞分化に重要ないくつかの活性の増強を示す。
超活性ＤＣは、ＴＨ２免疫の証拠なしに、ＴＨ１集中的免疫応答を刺激する
ＤＣ活性化状態が及ぼすＴ細胞命令への影響を評価するために、ＢＭＤＣを前記のように処理し、次いでＯＶＡをロードした。それらの細胞を、ナイーブＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞またはナイーブＯＴ－Ｉ Ｔ細胞に曝した。ＯＴ－ＩＩ細胞は、ＭＨＣ－ＩＩ制限ＯＶＡペプチド（ＯＶＡ３２３～３３９）に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するのに対して、ＯＴ－Ｉ細胞は、ＭＨＣ－Ｉ制限ＯＶＡペプチド（ＯＶＡ２５７～２６４）に特異的なＴＣＲを発現する（Ｋ．Ａ．Ｈｏｇｑｕｉｓｔら、Ｃｅｌｌ、７６巻、１号、１７～２７ページ、１９９４年１月；Ｍ．Ｊ．Ｂａｒｎｄｅｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、７６巻、１号、３４～４０ページ、１９９８年２月）。ＴＨ１応答（ＩＦＮγ産生）またはＴＨ２応答（ＩＬ－１０、ＩＬ－４またはＩＬ－１３の産生）へのＴ細胞極性化を特定するために、応答するＴ細胞の活性を、ＥＬＩＳＡにより評価した。ＤＣ活性化状態にかかわりなく、ＯＶＡ処理したＢＭＤＣは、ＯＴ－ＩＩ Ｔ細胞からのＩＦＮγの産生を刺激した。ＩＦＮγ産生の程度は、調べた活性化刺激間で若干異なった（図１Ｆ）。同じく、すべてのＤＣ活性化状態を比べた場合、ＯＴ－ＩＩ細胞の応答によるＴＮＦα産生は同等であった（図１Ｆ）。これらの結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＴＨ１応答が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化状態にかかわりなく一般的に誘導されることを示す。それに対して、ＴＨ２応答は、ＤＣ活性化状態を比べた場合、著しく異なった。ＢＭＤＣの活性化を誘導する刺激（ＬＰＳ）またはパイロトーシスを誘導する刺激（ＬＰＳ＋アラム）は、多量のＩＬ－１０およびＩＬ－１３の放出を促進したのに対して、超活性化刺激は、ＴＨ２関連サイトカインの最低限の産生をもたらした（図１Ｆ）。ＴＨ１サイトカイン（ＩＦＮγおよびＴＮＦα）ならびにＴＨ２サイトカイン（ＩＬ－４およびＩＬ－１０）ならびにＴＨ２系統定義転写因子ＧＡＴＡ３に関する、単一細胞の細胞内染色は、異なるＤＣ活性化刺激により生成させたＴＨ１細胞とＴＨ２細胞との比率の計算を可能にした。この解析は、超活性ＢＭＤＣが、個々のＴ細胞の、ＩＦＮγ産生ＴＨ１系統への著しい偏りを誘導することを明らかにした（図１Ｇおよび図５）。超活性条件下でのＴＨ１細胞のＴＨ２細胞に対する比は、１００：１超であった（図１Ｇ）。それに対して、他の活性化刺激はすべて、混合Ｔ細胞応答を誘導し、パイロプトティック刺激は、ＴＨ１細胞とＴＨ２細胞とのほぼ１：１の比をもたらした（図１Ｇ）。
ＣＤ８＋ＯＴ－Ｉ Ｔ細胞を用いて類似の試験を行い、活性化刺激またはパイロプトティック刺激と比べた場合のＢＭＤＣを超活性化する刺激による、ＩＦＮγ産生のわずかな増強が明らかになった（図１Ｆ）。すべてのＤＣ活性化状態を比べた場合、ＯＴ－Ｉ細胞の応答によるＩＬ－２産生は同等であった（図１Ｆ）。これらの結果を合わせると、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの超活性ＢＭＤＣ状態が、著しくＴＨ１に偏ったＴ細胞応答およびわずかに高まったＣＤ８ Ｔ細胞応答もたらすことが示される。それに対して、活性化刺激またはパイロプトティック刺激はＴＨ１およびＴＨ２の混合応答をもたらした。
防御的な抗腫瘍免疫を与えるには、ＤＣのインフラマソーム成分の超活性化で十分である。ＤＣが、ｄｅ ｎｏｖｏ Ｔ細胞性免疫の促進を担う主細胞であるため、ＤＣを特異的に活性化する条件が抗腫瘍免疫を与えるために十分であるかどうかを確かめることに努めた。この可能性に対して、異なる活性化刺激およびＷＴＬでｅｘ ｖｉｖｏ刺激したＢＭＤＣをマウスに養子移植することで取り組んだ。ＢＭＤＣが選ばれた理由は、１）超活性化状態になることがよく特徴づけられている、および２）ヒトでのＤＣベース免疫療法において使用される最も一般的なＡＰＣである単球由来ＤＣのモデルと見なされているためである（Ｒ．Ｌ．Ｓａｂａｄｏら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．、２７巻、１号、７４～９５ページ、２０１７年１月）。
ＢＭＤＣを、ＷＴＬと共に様々な活性化刺激で処理してから、７日おきに３週間続けて、Ｂ１６ＯＶＡ担腫瘍マウスへとｓ．ｃ．注射した。ＬＰＳで活性化しＢ１６ＯＶＡ ＷＴＬでパルスしたＢＭＤＣは、ナイーブＢＭＤＣを注射したマウスと比べて、Ｂ１６ＯＶＡ誘導致死性からのわずかな防御を与え、ＤＣ移植を受けたマウスの２５～３０％が、腫瘍を拒絶し、かつ最後／第３のＤＣ移植法後の長い間、無腫瘍のままであった（図２）。特に、超活性ＢＭＤＣは、担腫瘍マウスの１００％において、Ｂ１６ＯＶＡ腫瘍の完全な拒絶を誘導した（図２）。超活性ＤＣの抗腫瘍活性は、該細胞中のインフラマソームに依存した。なぜなら、ＮＬＲＰ３－／－およびＣａｓｐ１－／－１１－／－のＢＭＤＣの移植は、活性ＤＣに匹敵する、軽微な拒絶のみを誘導したからである（図２）。したがって、これらのデータは、超活性ＤＣが、持続性の防御的な抗腫瘍免疫を誘導するために十分であること、およびＤＣ内のインフラマソームがその過程に必須であることを示す。
考察
この試験では、ＤＣを超活性化刺激で処理するとアップレギュレートされる免疫学的活性の範囲が拡大された。超活性化刺激は、生細胞からＩＬ－１β放出を誘発できるのみならず、ＣＤ４０発現およびＩＬ－１２ｐ７０分泌を誘導する能力の点で他の活性化刺激に勝る。さらに、超活性化刺激に曝された細胞は、ＭＨＣペプチド複合体の表面発現の上昇を示す。これらの発見を合わせると、ｏｘＰＡＰＣまたはその純粋成分であるＰＧＰＣに曝されたＤＣの超活性性質が明白になり、かつ適応免疫を促進する能力の高まりの証拠が提供される。超活性ＤＣは実際、活性化細胞またはパイロプトティック細胞よりも優れたＴ細胞応答の刺激因子であるが、その活性の最も注目に値する側面は、ＴＨ１集中的およびＣＴＬ集中的な応答を刺激するその能力であり得る。実際、ＤＣを超活性化する刺激は、ＴＨ１細胞：ＴＨ２細胞の比１００：１をもたらし、そのように偏ったＴ細胞応答を誘導したＤＣ活性化の戦略は他にない。
明確なインフラマソーム刺激であるアラムは、ｏｘＰＡＰＣまたはＰＧＰＣと同じ活性を示さないということが特筆に値する。実際、アラムはＴＨ２免疫を誘導することがよく知られている。この知見は、本研究において、アラム処理またはアラム＋ＬＰＳ処理がロバストなＴＨ２免疫を誘導することから検証された。アラム処理細胞のＴＨ１集中的免疫の欠如に関して可能な理由は、アラムが、ＴＨ１分化に欠かせないいくつかのシグナル、例えば、ＣＤ４０発現およびＩＬ－１２ｐ７０分泌の弱いインデューサーであるという本明細書の発見に基づく。特に、アラム＋ＬＰＳに応じてパイロトーシスを経なかったＤＣを調べた場合でさえも、ＣＤ４０発現は際立って低かった。おそらく、この因子の高レベル発現の欠如のため、パイロプトティック刺激は、ＴＨ１応答、したがって、抗腫瘍免疫の弱いインデューサーである。理論に拘束されることは望まないが、超活性ＤＣによって誘導されるＴＨ１集中的免疫は、インフラマソームの作用、ならびに超活性ＤＣの他のいくつかの特徴に起因することが提案された。それらのさらなる特徴は、抗原提示能の上昇、ＣＤ４０発現、ＩＬ－１２ｐ７０発現および生存率の上昇を含む。おそらく、それらの活性の上昇の各々が、ＡＰＣとしてのＤＣ機能にとって重要であり、ＤＣ超活性化の条件下に認められた著しいＴＨ１集中的免疫応答に寄与すると思われる。
これらの結果は、特定の化学療法剤（例えばオキサリプラチン）が細胞死およびインフラマソーム依存性抗腫瘍Ｔ細胞免疫を誘導する理由を説明し得る（Ｆ．Ｇｈｉｒｉｎｇｈｅｌｌｉら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、１５巻、１０号、１１７０～１１７８ページ、２００９年）。オキサリプラチンは、活性酸素種（ＲＯＳ）産生のロバストな刺激因子であり、これは細胞膜を酸化し、ＰＧＰＣを含む異なる酸化リン脂質種の複合混合物を創生し得る。したがって、オキサリプラチンによって誘導される防御免疫は、抗腫瘍Ｔ細胞応答をプライムする超活性ＤＣの作用に起因することが可能である。
超活性刺激は、抗原の複合混合物を使用する免疫療法として利用され得ることが見出された。ＷＴＬは、いくつかの理由から興味をそそる抗原源であり、特に重要なのは実践的な観点からである。ＷＴＬベースのアプローチの重要な有用性は、新抗原同定の必要性を軽減することである。ＷＴＬベースの免疫療法により提供された潜在的な有用性にかかわらず、この分野での先行研究は、入り混じった結果をもたらした。超活性化刺激が、強力な抗腫瘍免疫を誘発するためにＷＴＬを独特な形で補助できるという本明細書の発見が、先行研究での成功の欠如を説明し得る。なぜなら、本明細書で発見されたＤＣ活性化の戦略が、以前には考慮されていなかったからである。後者の点について、ＤＣ超活性化戦略が、ＰＤ－１阻害感受性である腫瘍およびＰＤ－１阻害耐性である腫瘍と関連する致死性からマウスを防御し得ることが特筆に値する。超活性化刺激による処理の影響を受けやすい腫瘍の全範囲は定義されていないが、本研究により、がん免疫療法のＤＣ中心戦略の重要性をさらに調査することが必要となる。
実施例２：超活性ｃＤＣ１はインフラマソーム依存性に腫瘍拒絶を制御する
従来の樹状細胞（ｃＤＣ）は、外因性および内因性抗原をＴ細胞に提示して、Ｔ細胞の増殖、生存、およびエフェクター機能を調節するのに長けている。ｃＤＣは、ｃＤＣ１およびｃＤＣ２という２つの主要サブセットに分けられる。脾臓およびリンパ節（ＬＮ）における常在型ｃＤＣ１はＣＤ８α、ＣＤ２４、およびＸＣＲ１を発現し、一方、ｃＤＣ２はＣＤ４およびＳｉｒｐαを発現する。ｃＤＣ１は、腫瘍関連抗原を交差提示し、ＴＨ１免疫および抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞を刺激して腫瘍を効率的に拒絶する古典的ＤＣである。一方、ｃＤＣ２は、それらがＴｈ２免疫を活性化する寄生虫に対する２型免疫応答を司る。
常在型ｃＤＣが超活性化状態を達成できるか調べるために、ＷＴマウスの脾臓由来のｃＤＣ１またはｃＤＣ２をソートして、未処理のままとするか、またはＬＰＳで２４ｈ処理するか、もしくはＬＰＳで３ｈプライミングして、次いで超活性化刺激ｏｘＰＡＰＣもしくはＰＧＰＣで、もしくはピロトーシス刺激アラムで２１ｈ処理した。脾臓ｃＤＣ２とは対照的に、脾臓ｃＤＣ１は、ＬＤＨ放出による測定で、単離後速やかに殺滅された（図６Ａ左側パネル）。結果として、ｃＤＣ１細胞はＬＰＳでプライミングされず、活性化刺激（ＬＰＳ）、超活性化刺激（ＬＰＳ＋ＯｘＰＡＰＣ／ＰＧＰＣ）またはパイロプトティック刺激（ＬＰＳ＋アラム）に応じてＴＮＦａサイトカインを産生することができなかった（図６Ｂ左側パネル）。超活性化刺激（ＬＰＳ＋ＰＧＰＣ）に応じたＩＬ－１β放出は、わずかしか観察されなかった（図６Ｂ左側パネル）。対照的に、脾臓ｃＤＣ２細胞はＬＰＳで効率的にプライミングされ、細胞死を経ることなくＩＬ－１βを産生する能力によって同定される超活性化状態を達成した（図６Ａ～図６Ｂ左側パネル）。常在型ｃＤＣ１はｅｘ ｖｉｖｏ単離およびｉｎ ｖｉｔｒｏ刺激に対して高感受性であることから、本発明者らはサイトカインＦＬＴ３リガンド（ＦＬＴ３ Ｌ）を使用して骨髄（ＢＭ）前駆細胞から代替的にｃＤＣを生成した。ＦＬＴ３Ｌ生成ｃＤＣ１およびｃＤＣ２を培養後９日目にソートし、次いで活性化刺激、超活性化刺激またはパイロプトティック刺激で従来通り処理した。脾臓から単離された常在型ｃＤＣ１細胞とは対照的に、ＦＬＴ３Ｌにより生成されたｃＤＣ１およびｃＤＣ２は、その生存性を維持しながら大量のＩＬ－１βおよびＴＮＦａの放出が測定されたことから（図６Ａ～６Ｂ右側パネル）、ＬＰＳで効率的にプライミングされ、ＬＰＳ＋ＰＧＰＣによる刺激に応じて超活性化状態を達成したが、ＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣによる刺激に応じては超活性化状態を達成しなかった。これらのデータは、酸化リン脂質の純粋な形態であるＰＧＰＣがｃＤＣ１およびｃＤＣ２サブセットを超活性化できることを示す。
超活性ＦＬＴ３Ｌ生成ｃＤＣ１は、そのナイーブ、活性またはパイロプトティック相対物と比較してより多くの星状樹状突起を示し、これはより高い移動能を意味する。実際に、超活性ｃＤＣ１およびｃＤＣ２は、Ｔ細胞刺激のために遊走性ＤＣをリンパ節に誘導するケモカイン受容体ＣＣＲ７をアップレギュレートした（図６Ｃ～６Ｄ）。以上をまとめると、これらの結果は、ｃＤＣ１およびｃＤＣ２サブセットがｉｎ ｖｉｔｒｏで超活性化状態を達成し、古典的に活性化された相対物と比較してユニークな特性を呈することを示す。
ｃＤＣ１細胞のユニークな機能は、ｃＤＣ１が腫瘍抗原を取り込み、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内で、または流入領域リンパ節への移動後に、それらをＴ細胞に交差提示する、がんの状況において非常に重要である。ｃＤＣ１がｉｎ ｖｉｔｒｏで超活性化するという事実は、がん免疫療法のためのｃＤＣ超活性化状態の価値をさらに探求することの必要性をもたらす。このため、腫瘍拒絶の制御におけるｃＤＣ１の超活性状態の役割を調べるために、マウスの左背部にＢ１６ＯＶＡ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）接種した。腫瘍チャレンジから７日目、１４日目および２１日目に、マウスを未処理のままとするか、または未処理ＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１ナイーブ）、もしくはＬＰＳで２３ｈ処理したＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１活性）、もしくはＬＰＳで３ｈプライミングし、次いでＰＧＰＣで２０ｈ処理したＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１超活性）の１×１０６個を右わき腹に皮下注射した。すべてのｃＤＣは、その注入の前にＢ１６ＯＶＡ腫瘍溶解物で１ｈパルスした。驚いたことに、超活性ｃＤＣ１の養子移入は、腫瘍増殖に対する強力かつ長期間持続する防御をマウスに与えたが、ナイーブまたは活性ｃＤＣ１の移入は、わずかな腫瘍拒絶を誘導したのみだった（図７）。これらのデータは、持続性腫瘍拒絶におけるｃＤＣ１の超活性状態の優れた役割を示す最初の証拠である。
腫瘍制御における超活性ｃＤＣ１の重要な役割をさらに確認するために、本発明者らは、ＣＤ８＋ｃＤＣ１を欠損し、交差提示に欠陥があるＢａｔｆ３－／－マウスを使用したが、その結果、Ｂａｔｆ３－／－マウスは抗腫瘍抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を欠損する。このため、Ｂ１６ＯＶＡ細胞を接種したＢａｔｆ３－／－マウスは、ＷＴマウスと比較して、腫瘍増殖を制御することができなかった（図８Ａ）。しかし、腫瘍担持Ｂａｆｔ３－／－マウスに、腫瘍チャレンジから７日目、１４日目および２１日目にＷＴ ｃＤＣ１を皮下注射により補充した場合には、本発明者らは、ナイーブまたは活性化ｃＤＣ１とは対照的に、超活性ｃＤＣ１のみが腫瘍を完全に根絶し得ることを見出した。この防御は、ＷＴ超活性ｃＤＣ１を注射した場合にＢａｔｆ３－／－マウスでは回復するがＷＴ活性またはナイーブｃＤＣ１細胞を注射したＢａｔｆ３－／－マウスでは回復しない、腫瘍浸潤性ＯＶＡ特異的ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度の高さと相関した（図８Ｂ～８Ｃ）。以上を総合すると、これらのデータは、超活性ｃＤＣ１が抗腫瘍特異的Ｔ細胞の腫瘍浸潤を増強することによって腫瘍拒絶を制御するという強力な証拠を提供する。
ＤＣの超活性状態の基礎となる機構は、問題の酸化リン脂質（ｏｘＰＡＰＣ/ＰＧＰＣ）が細胞質病原体認識受容体（ＰＲＲ）カスパーゼ１１に結合してそれを刺激し得ることから、詳細に明らかになっている。カスパーゼ－１／１１刺激は、ＮＬＲＰ３インフラマソームの活性化および集合をもたらし、ガスデルミン－Ｄ孔を介した生細胞からのＩＬ－１βの放出を導く。超活性ｃＤＣ１の抗腫瘍活性におけるＩＬ－１βの役割を評価するために、ＩＬ－１β分泌に欠陥のあるＣａｓｐ１／１１－／－マウスまたはＮＬＲＰ３－／－マウスを使用した。Ｃａｓｐ１／１１－／－またはＮＬＲＰ３－／－マウスの左背部に、Ｂ１６ＯＶＡ細胞を接種した。腫瘍チャレンジから７日目、１４日目および２１日目に、マウスを未処理のままとするか（ＤＣ注射なし）、または未処理ＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１ナイーブ）もしくはＬＰＳで２３ｈ処理したＷＴ ｃＤＣ１（ｃＤＣ１活性）、もしくはＬＰＳで３ｈプライミングし、次いでＰＧＰＣで２０ｈ処理したＷＴもしくはＣａｓｐ１／１１－／－ｃＤＣ１（ｃＤＣ１超活性）のいずれかの１．１０６個を、右わき腹に皮下注射した。すべてのＤＣは、その注射の前にＢ１６ＯＶＡ腫瘍溶解物で１ｈパルスした。興味深いことに、本発明者らは、わずかな防御しか誘導しなかったＷＴナイーブまたは活性ｃＤＣ１とは対照的に、ＷＴ超活性ｃＤＣ１のＣａｓｐ１／１１－／－およびＮＬＲＰ３－／－受容マウスへの養子移入は、腫瘍担持体の１００％において腫瘍増殖を完全に阻止することを見出した。超活性化刺激（ＬＰＳ＋ＰＧＰＣ）に応じてＩＬ－１β分泌を誘導することができないカスパーゼ１／１１－／－またはＮＬＲＰ３－／－由来のｃＤＣ１は、腫瘍拒絶を誘導できなかったことから、この防御はインフラマソーム機構に依存した。以上をまとめると、超活性ＤＣの養子移入は、持続性抗腫瘍応答を誘導して、超活性化ベースのワクチンによって観察される防御を再現するのに十分である。
以上を総合すると、本明細書のデータは、養子細胞移植ベースの免疫療法において使用される活性化状態に関して、ＤＣベースの免疫療法におけるパラダイムを転換する可能性を有し、したがって、効果的ながん免疫療法を生み出すために、ＤＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで「前処置」する試みを再び活発にする可能性がある。
実施例３：酸化リン脂質は、超活性のｃＤＣ１細胞およびｃＤＣ２細胞を誘導する
細胞超活性化の状態を評価する実質的にすべての研究は、サイトカインである顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）により生成した、生存力を維持しつつＩＬ－１βを放出する骨髄由来ＤＣ（ＢＭＤＣ）の能力に注目していた［２４、３１、３２、３３、３４］。最近の研究は、ＤＣよりむしろ単球由来マクロファージがインフラマソーム活性化およびＩＬ－１β分泌を担うことを示した［３５］。従来のＤＣが、超活性化状態を達成できるか調べるために、ＤＣヘマトポエチンであるＦｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）を使用して生成したＢＭＤＣを使用した。超活性化を評価するために、ＦＬＴ３－ＤＣをＬＰＳでプライミングし、続いて酸化リン脂質ｏｘＰＡＰＣ、またはＰＧＰＣというｏｘＰＡＰＣの純粋な脂質成分で処理した［３６］。その代わりに、ＦＬＴ３－ＤＣを、従来の活性化刺激、例えばＬＰＳのみで刺激した、またはＦＬＴ３－ＤＣをＬＰＳでプライミングしてからパイロプトティック刺激、例えばアラムで処理した。ＤＣからのＩＬ－１β放出を誘導しなかった活性化刺激と対照的に、パイロプトティックＤＣは、細胞外培地へのＩＬ－１βの放出を促進した（図１４Ａ）。ＩＬ－１β分泌は、サイトゾル酵素乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）の放出により評価される（図１４Ｂ）、パイロプトティックＤＣにおける細胞死と同時に起きた。興味深いことに、超活性刺激ＬＰＳ＋ＰＧＰＣ、またはそれより少ない程度でＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣでの刺激が、ＬＤＨ放出の非存在下において起きたＤＣからのＩＬ－１β分泌を誘導した（図１４Ａ）。ＬＰＳでプライミングまたは刺激したすべてのＤＣは、サイトカインＴＮＦαの分泌を促進した（図１４Ａ）。パイロプトティックＤＣまたは超活性ＤＣ中でのＩＬ－１β分泌は、両方の場合とも、インフラマソーム成分であるＮＬＲＰ３およびカスパーゼ１／１１に依存した（図１４Ａ）。これらの発見は、ｏｘＰＡＰＣが、サイトゾルＰＲＲカスパーゼ－１１に結合して刺激し、生細胞からのＩＬ－１βの放出につながる、ＮＬＲＰ３活性化および非パイロプトティックインフラマソームのアセンブリをもたらす、ＤＣの超活性状態の基盤となる機構を定義した先行研究と一致する［２４］。ＤＣを、他のＴＬＲアゴニスト、例えばＴＬＲ９アゴニストＣｐＧでプライミングした場合、ＤＣの同様の挙動が認められた（図１９Ａ）。したがって、これらのデータは、ＦＬＴ３ ＤＣが、超活性化の状態を達成できることを示す。ＤＣは、ｃＤＣ１およびｃＤＣ２という２つの主要サブセットに区分される。ｃＤＣ１は、腫瘍関連抗原を交差提示し、ＣＤ８＋Ｔ細胞をプライムできる典型的なＤＣである［３７］、［３８］。他方、ｃＤＣ２は、寄生生物に対する２型免疫応答を制御し、Ｔｈ２免疫を活性化する。超活性ＤＣの挙動がｃＤＣ１またはｃＤＣ２にまで及ぶかを確かめるために、野生型ナイーブマウスのＦＬＴ３－ＤＣ由来または脾臓由来のｃＤＣ１もしくはｃＤＣ２を単離した（図１９Ｂ）。ＦＬＴ３由来ＤＣの挙動と同様に、ＬＰＳおよびＰＧＰＣ、ならびにそれより少ない程度でＬＰＳおよびｏｘＰＡＰＣでの処理は、ＬＤＨ放出により評価される細胞死の非存在下において、ＦＬＴ３由来のｃＤＣ１ｓおよびｃＤＣ２からのＴＮＦαおよびＩＬ－１βの放出をもたらした（図１４Ａ）。これらのデータは、ＰＧＰＣが、ｃＤＣ１およびｃＤＣ２の超活性化を誘導するｏｘＰＡＰＣの生理活性成分であることを示す。さらに、脾臓ｃＤＣ２の同様な挙動が認められ、パイロプトティック刺激ＬＰＳおよびアラムに応じて、パイロプトティック細胞死と同時にＩＬ－１βを産生したものの、超活性化刺激ＬＰＳおよびＰＧＰＣに応じて、細胞死の非存在下においてＩＬ－１βを産生した（図１６Ｃ）。対照的に、脾臓ｃＤＣ１は、パイロプトティック刺激または超活性化刺激に応じて最低限の量のＩＬ－１βを産生した。なぜなら、脾臓ｃＤＣ１は、ソーティング後、細胞死に対して非常に感受性であり、ＬＰＳでプライミングされ得なかったからである（図１６Ｃ）。全体的にこれらの結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで分化した生存ＤＣからＩＬ－１β放出を誘導するために、超活性化刺激を使用できることを示す。実用的な理由から、本書では、ＤＣ源として、ＦＬＴ３由来ＤＣの使用を続けた。
実施例４：超活性ＤＣは、ＣＴＬ応答をインフラソーム依存性に増強する
ＩＬ－１βは、Ｔ細胞分化、永続的なメモリＴ細胞生成およびエフェクター機能に関する決定的な制御因子である［１２］～［１４］。ＩＬ－１βをｄＬＮ中で数日間にわたって産生する超活性ＤＣが、ＣＤ８＋Ｔ細胞刺激を増強できるかどうかに関心がもたれた。これを試験するために、ＯＶＡタンパク質を含むＤＣを皮下（ｓ．ｃ．）養子移植してからｄＬＮ中のＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定することに努めた。まず、異なるＤＣ状態の、ＯＶＡタンパク質を取り込む能力およびＨ２ｋｂ分子上にＯＶＡペプチドＳＩＩＮＦＥＫＬを交差提示する能力を試験した。蛍光オボアルブミン（ＯＶＡ－ＦＩＴＣ）の同等の内在化により示されたように、本発明者らは、すべてのＤＣが、異なる状態において、ＯＶＡを同程度で取り込むことを見出した。しかしながら、本発明者らは、ＬＰＳまたはＣｐＧでプライミングした活性ＤＣおよび超活性ＤＣがいずれも、ＯＶＡタンパク質をロードした際に、ナイーブ相対物と比べて高まったＳＩＩＮＦＥＫＬ交差提示を示すことを見出した。これは、ＤＣの成熟が抗原提示能を上昇させることを示す先行研究と一致する。驚くべきことに、パイロプトティック刺激アラムは、ＤＣの交差提示能を著しく低下させ、パイロプトティックＤＣは、最適なＴ細胞刺激には不向きであることを示唆する。したがって、ＯＶＡをロードしたナイーブ、活性、パイロプトティックまたは超活性ＤＣの１．１０ｅ６個のＤＣをＷＴマウスに注射した場合、受容マウスのｄＬＮ中において、超活性ＤＣが、ナイーブ、活性、パイロプトティックＤＣと比べて最高の頻度と絶対数のＳＩＩＮＦＥＫＬ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導することが認められた（図１２Ａおよび図１７Ｂ）。超活性ＤＣにより媒介されるＣＤ８＋Ｔ細胞応答の上昇は、インフラマソーム活性化に依存した。なぜなら、ＬＰＳ＋ＰＧＰＣで処理したＮＬＲＰ３－／－ＤＣの注射は、微弱なＯＶＡ特異的Ｔ細胞応答を誘導したからである。
実施例５：超活性化刺激は、インフラソーム依存性に、メモリＴ細胞の生成を高めて抗原特異的ＩＦＮγエフェクター応答を増強する
超活性刺激は、超活性ＤＣ注射の効果を総括し得る強力なアジュバントであり得ると仮定した。この可能性を調べるために、マウスを、ＯＶＡ単独、またはＯＶＡ＋活性化刺激（ＬＰＳ）、またはＯＶＡ＋超活性化刺激（ＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣもしくはＰＧＰＣ）によりｓ．ｃ．免疫化した。免疫化から７日後および４０日後、ＣＤ４４低ＣＤ６２Ｌ低であるエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）とＣＤ４４高ＣＤ６２Ｌ低であるエフェクターメモリＴ細胞（ＴＥＭ）とＣＤ４４高ＣＤ６２Ｌ高であるセントラルメモリＴ細胞（ＴＣＭ）とを区別する、ＣＤ４４マーカーおよびＣＤ６２Ｌマーカーを使用したフローサイトメトリーにより、ｄＬＮ中でのメモリＴ細胞生成およびエフェクターＴ細胞生成を評価した［４７］。免疫化から７日後、超活性化刺激は、ＣＤ８＋Ｔｅｆｆ細胞の誘導において、活性化刺激よりも優れていた（図１３Ａ上パネルおよび図１８Ａ～図１８Ｂ）。さらに、この早い時点では、超活性化刺激が、最高の量のＣＤ８＋ＴＥＭを誘導した（図１３Ａ中央パネルおよび図１８Ａ～図１８Ｂ）。免疫化から４０日後、超活性化刺激に曝されたマウスでは十分な量のＴＣＭ細胞が認められたのに対して、ＯＶＡのみまたはＬＰＳと共に免疫化されたマウスではあまり多くなかった（図１３Ａ下パネル）。逆に、Ｔｅｆｆ細胞およびＴＥＭ細胞は、ＯＶＡ＋で免疫化されたマウスと比べて、ＯＶＡのみまたはＬＰＳと共に免疫化されたマウスでは免疫化から４０日後、量が多かった。したがって、これらのデータは、超活性化刺激ｏｘＰＡＰＣおよびＰＧＰＣが、エフェクターＴ細胞およびメモリＴ細胞の生成の規模を高めることを示す。さらに、免疫化から７日後のＴｅｆｆ細胞の頻度の上昇は、ＯＶＡ＋超活性化刺激で免疫化したマウスのｄＬＮから単離した、ＯＶＡをロードしたナイーブＢＭＤＣの存在下においてｅｘ ｖｉｖｏで再刺激した際のＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ応答の増強と相関した（図１８Ｃ）。さらに、総ＣＤ８＋Ｔ細胞を、超活性化刺激により免疫化したマウスから単離し、ＯＶＡ発現Ｂ１６腫瘍細胞株（Ｂ１６ＯＶＡ）と共培養した場合、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＯＶＡのみまたはＯＶＡ＋ＬＰＳで免疫化したマウスから単離したＣＤ８＋Ｔ細胞と比べて高まった脱顆粒活性を示し（図１３Ｂおよび図１８Ｄ）、超活性化刺激がＣＴＬ機能を高めることを示す。
異なる活性化刺激によるｓ．ｃ．免疫化に起因する、Ｔ細胞の抗原特異性を評価するために、マウスに、ＯＶＡを、単独で、または活性化刺激（ＬＰＳ）と共に、またはパイロプトティック刺激（ＬＰＳ＋アラム）と共に、または超活性化刺激（ＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣもしくはＰＧＰＣ）と共に注射した。その代わりに、マウスを、ＬＰＳ＋ＰＧＰＣで、ＯＶＡ抗原を伴わずにｓ．ｃ．免疫化した。免疫化から７日後、免疫化マウスの皮膚ｄＬＮからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、ＯＶＡ特異的Ｔ細胞サブセットを濃縮するために、ＯＶＡをロードした（またはしていない）ナイーブＢＭＤＣにより、ｅｘ ｖｉｖｏで７日にわたり再刺激した。ＯＶＡ特異的Ｔ細胞のＴ細胞エフェクター機能を、ＩＦＮγに対する細胞内染色により評価した。ＴＣＲ特異性を、ＭＨＣ制限ＯＶＡペプチドテトラマーでの染色により評価した。Ｈ２ｋｂ制限ＳＩＩＮＦＥＫＬ（ＯＶＡ２５７～２６４）ペプチドテトラマーを使用した。テトラマー＋ＩＦＮγ＋二重陽性細胞の頻度を、ＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットおよびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットに対して測定した。際立つことに、超活性化刺激を伴うＯＶＡは、抗原特異的Ｔ細胞の誘導において優れていた。なぜならｏｘＰＡＰＣベースまたはＰＧＰＣベースの免疫化は、ＯＶＡ抗原によるＣＤ８＋Ｔ細胞再刺激に際し、最高頻度のテトラマー＋ＩＦＮγ＋応答の誘発をもたらしたからである（図１３Ｃ）。それに対して、パイロプトティック刺激（ＬＰＳ＋アラム）は、抗原特異的ＩＦＮγ応答の最も微弱なインデューサーであった（図１３Ｃ）。これらの結果は、アラムが、体液性免疫およびＴｈ２応答の促進に有効であるものの、Ｔｈ１応答またはＣＴＬ応答には有効でないアジュバントであることを示した先行研究と一致する［３９、４２、４３］。
先行研究は、本来その生理活性がインフラマソームにより制御されるサイトカインである組換えＩＬ－１βを用いた共免疫化により、抗原特異的Ｔ細胞応答が高まり得ることを示した［４７、１３］。しかしながら、超活性刺激およびパイロプトティック刺激の両方がＩＬ－１βの分泌を誘導するにもかかわらず、いかにして超活性刺激は高い抗原特異的Ｔ細胞を誘導し、パイロプトティック刺激はそうしないのであろうか？インフラマソーム媒介事象が、超活性化刺激により引き起こされるＴ細胞応答を制御するかを確かめるために、ＷＴマウスおよびＮＬＲＰ３－／－マウスにおけるＴ細胞活性の対照比較を行った。特に本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔ細胞による抗原特異的応答の超活性化誘導性上昇には、ＮＬＲＰ３が必要とされることを見出した（図１３Ｃ）。したがって、これらのデータは、超活性化刺激またはパイロプトティック刺激のそれぞれによる免疫化に続く、非パイロプトティックに対するパイロプトティックなインフラマソーム活性化は、際立って差異的な適応免疫Ｔ細胞制御を誘導することを示す。
ＤＣ注射戦略を使用した本発明者らの先行する結果は、パイロプトティック刺激で刺激されたＤＣが、隣接するｄＬＮへと遊走してＴ細胞活性化を刺激する能力を失うのに対して、超活性刺激に曝されたＤＣはｄＬＮへと超遊走してＣＴＬ応答を増強することを示す（図１２Ａ～図１２Ｂ）。しかしながら、内在性ＤＣが、超活性刺激での免疫化に続いてｉｎ ｖｉｖｏ超活性化を達成するかは知られていない。それを評価するために、Ｚｂｔｂ４６ＤＴＲマウスおよびＷＴマウス、またはＺｂｔｂ４６ＤＴＲマウスおよびＮＬＲＰ３－／－マウス、またはＺｂｔｂ４６ＤＴＲマウスおよびＣａｓｐ１／１１－／－マウスを使用してキメラマウスを生成した。その目的に向けて、以前に記載されたように［５１］、４週齢のＣＤ４５．１放射線照射マウスを、Ｚｂｔｂ４６ＤＴＲマウスの８０％およびＷＴマウスの２０％またはＮＬＲＰ３－／－マウスの２０％またはＣａｓｐ１／１１－／－マウスの２０％の混合骨髄を用いて、ＣＤ４５．２バックグラウンドで再構築した。再構築から６週後、すべてのマウスにおいて、ｃＤ４５．１マーカー対ＣＤ４５．２マーカーを使用したフローサイトメトリーにより、ＢＭ再構築の有効性を評価した。Ｚｂｔｂ４６＋の従来のＤＣを除去するために、キメラマウスを１日おきにジフテリア毒素（ＤＴ）で処理し、それぞれ、超活性になり得るＷＴ ＤＣ、または超活性になり得ないインフラマソーム欠損（ＮＬＲＰ３－／－もしくはＣａｓｐ１／１１－／－）ＤＣをもたらした。内在性ＤＣ超活性化がＣＤ８＋Ｔ細胞応答に及ぼす効果を試験するために、すべてのキメラマウスに３回続けてＤＴ注射してから、ＯＶＡ＋ＬＰＳ＋ＰＧＰＣでｓ．ｃ．免疫化した。免疫化から７日後、ｄＬＮ由来のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を評価した。興味深いことに、超活性になり得るＷＴ ＤＣを含有するキメラマウスと比べて、超活性になり得ないＤＣを含有するキメラマウス、例えば、ＮＬＲＰ３－／－キメラマウスおよびＣａｓｐ１／１１－／－キメラマウスでは、Ｔｅｆｆ ＣＤ８＋Ｔ細胞の量が著しく低下したことを本発明者らは見出した（図１３Ｄ、図１９Ａ）。さらに、本発明者らは、ｄＬＮまたは脾臓中でのＳＩＩＮＦＥＫＬ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度が、超活性になり得ないＤＣを含有するＮＬＲＰ３－／－キメラマウスおよびＣａｓｐ１／１１－／－キメラマウスでは低下したのに対して、ＷＴ ＤＣを含有するキメラマウスでは多量のＳＩＩＮＦＥＫＬ＋ＣＤ８＋細胞が認められたことを発見した（図１３Ｅ、図１９Ｂ）。したがって、これらのデータは、１）内在性ＤＣがｉｎ ｖｉｖｏ超活性化の状態に達し、かつ超活性化刺激での免疫化に続いてＣＴＬ応答を増強できること、および２）内在性ＤＣ内のインフラマソーム活性化が、超活性化介在性の防御ＣＴＬ応答には重要であることを明らかに示す。
実施例６：リンパ組織への超活性ＤＣの侵入は、超活性化介在性ＣＴＬ応答に必須である
本発明者らは先に、超活性刺激で刺激されたＤＣがｄＬＮへと超遊走してＣＴＬ応答を増強することを示した（図１２Ａ～図１２Ｂ）。超活性化介在性ＣＴＬ応答が、ｄＬＮへの内在性超活性ＤＣの侵入を必要とするかを評価するために、Ｚｂｔｂ４６ＤＴＲおよびＷＴ、またはＺｂｔｂ４６ＤＴＲおよびＣＣＲ７－／－ＢＭを使用して、前記のようにキメラマウスを生成した（図１３Ｄ）。概して、ｄＬＮへの超活性ＤＣの内在性輸送が、超活性化介在性のＣＴＬ機能に必須である。
実施例７：超活性ｃＤＣ１は、予防的なＴ細胞性抗腫瘍免疫を刺激するために、複合抗原源を使用できる
抗腫瘍免疫を刺激する現在の取組みは、常在型Ｔ細胞集団を活気づける戦略（例えばＰＤ－１阻害）、または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）に対するｄｅ ｎｏｖｏ Ｔ細胞応答の誘発を刺激する個別化がんワクチン戦略を含む［４６］。後者の取組みは、新抗原としても知られる、ＴＳＡ源である腫瘍細胞溶解物を使用できないことにより妨げられた。したがって、Ｔ細胞性抗腫瘍免疫を誘発するために純粋な形で使用できる新抗原の同定を進歩させる取組みが進行中である。これらの取組みは成功をもたらしたものの、新抗原同定への道は、変異ＴＳＡ、ならびに異常に発現したＴＳＡを発見するルートを必要とし［５４］、それは困難であり、かつ事象の自然経過を代表しない。前記で考察したように、ＷＴＬは、興味をそそる抗原代替源である。なぜなら、この溶解物は、個別化抗腫瘍免疫応答に必要とされる多数の抗原を提供するからである。しかしながら、基本的な問い、例えば、がんワクチンにおいて使用できる最も有効な種類のアジュバント（異なる種類の抗原に関連する種類のアジュバントを含む）は何であるかは依然として未回答のままである。
超活性化刺激はＷＴＬに対するアジュバントであり得るという可能性に取り組むために、マウスの右わき腹を、ＷＴＬのみ、または活性化刺激ＬＰＳと混合したＷＴＬ、または超活性化刺激ＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣもしくはＬＰＳ＋ＰＧＰＣと混合したＷＴＬで免疫化した。ＷＴＬ源は、Ｂ１６ＯＶＡ細胞であった。免疫化から１５日後、マウスの左上背部で、Ｂ１６ＯＶＡ親細胞を用いて皮下チャレンジした。未免疫マウスまたはＷＴＬのみで免疫化したマウスは、いかなる防御も示さず、かつすべてのマウスは、腫瘍接種から２４日までには大きな腫瘍を含有し死亡した（図２０Ａ）。同じく、ＷＴＬ＋ＬＰＳ免疫化は、最低限の防御を示した。ＷＴＬ＋ＬＰＳで免疫化した８匹のマウスのうちの２匹は無腫瘍であったものの、Ｂ１６ＯＶＡ再チャレンジ後すぐに再発し（図２０Ａ）、単にＤＣを活性化するだけの刺激では防御免疫を与えられなかったことを示す。それに対して、ＬＰＳおよびｏｘＰＡＰＣの存在下でのＷＴＬ免疫化は、腫瘍増殖の著しい遅延を誘導し、続く、Ｂ１６ＯＶＡ親腫瘍細胞での致死的再チャレンジに対する著しい防御をもたらし、免疫マウスの５０％は、完全に防御された（図２０Ａ）。ｏｘＰＡＰＣにより誘導される防御応答が、Ｔ細胞応答と相関したかを確かめるために、各活性化刺激を受けたマウスから腫瘍を採取した。ＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣで免疫化されたマウス由来の腫瘍は、ＬＰＳ免疫化と比べて実質的に多量のＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含有した（図Ｓ７Ｂ）。さらに、それらの腫瘍に由来する同数のＴ細胞を比較すると、ｏｘＰＡＰＣベースの免疫化は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８刺激に際して、最大量のＩＦＮγを分泌する腫瘍内Ｔ細胞をもたらした（図２０Ｃ）。したがって、超活性化刺激（ＬＰＳ＋ｏｘＰＡＰＣ）によって誘導される、腫瘍増殖の優勢な制限は、腫瘍への炎症Ｔ細胞の浸潤と一致した。
特に、純ｏｘＰＡＰＣ成分であるＰＧＰＣが誘発する防御表現型が、ｏｘＰＡＰＣの防御表現型に勝った。ＬＰＳ＋ＰＧＰＣの存在下でのＷＴＬ免疫化は、マウスの１００％を、腫瘍チャレンジから１５０日間、無腫瘍にさせた。これらのマウスは、Ｂ１６ＯＶＡ細胞での致死的再チャレンジを完全に拒絶し、初回腫瘍チャレンジから３００日、無腫瘍のままであった（図２０Ａ）。これらのマウスは一度も再発しなかったため、ＷＴＬ＋ＬＰＳ＋ＰＧＰＣで免疫化されたマウスでの腫瘍注射部位では、腫瘍細胞増殖がいかに制御され続けたのかに関心がもたれた。
メモリＴ細胞サブセットのうち、常在型メモリＴ細胞（ＴＲＭ）は、Ｃ型レクチンＣＤ６９に加えてＣＤ１０３インテグリンの発現により定義され、それは、末梢組織における常在特性に寄与する［５５］。ＣＤ８＋ＴＲＭ細胞は、最近大いに注目されている。なぜなら、この細胞は、様々なヒトがん組織中の腫瘍部位に蓄積し、より好ましい臨床転帰と相関するからである［５４、５５、５６］。実験的皮膚黒色腫モデルでは、皮膚のＣＤ８＋ＴＲＭ細胞が、黒色腫の進行に対する持続性防御を促進した［５８］。
腫瘍注射部位でのＴＲＭ細胞の存在、ならびに前もって超活性化刺激ＬＰＳ＋ＰＧＰＣで免疫化したサバイバーマウスの免疫化皮膚生検を調べた。興味深いことに、腫瘍接種から２００日後、ＣＤ８＋ＣＤ６９＋ＣＤ１０３＋ＴＲＭ細胞が腫瘍注射部位で高度に濃縮されたが、全サバイバーマウスの免疫化部位には少なかった（図２１Ａ～図２１Ｂ）。これらのデータは、高レベルのＴＲＭを、腫瘍注射部位をサーベイするためにＴＲＭが潜在的に長期間維持される長期腫瘍制御と関連付ける臨床報告および実験報告と一致する［５６、５７］。したがって、ＷＴＬおよび超活性化刺激での免疫化は、腫瘍細胞を食い止めるＴＲＭを生成すると思われる。
それらのＴ細胞の機能的特異性を調べるために、ｅｘ ｖｉｖｏでの細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）活性をモニタリングした。循環型メモリＣＤ８＋Ｔ細胞およびＴＲＭ細胞を、前もって超活性化刺激を受けたサバイバーマウスの脾臓または皮膚脂肪組織から単離した。それらの細胞を、Ｂ１６ＯＶＡ細胞、またはＯＶＡ非発現Ｂ１６細胞、または無関連がん細胞株ＣＴ２６と共に培養した。ＬＤＨ放出により評価したＣＴＬ活性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞をＢ１６ＯＶＡ細胞またはＢ１６細胞と混合した場合に限り認められた（図２１Ｃ）。ＣＴ２６細胞の殺滅は認められず（図２１Ｃ）、したがって、超活性化誘導性Ｔ細胞応答の機能的および抗原特異的性質を示す。
超活性化刺激により誘導された抗原特異的Ｔ細胞応答に基づき、Ｔ細胞が、腫瘍進行に対する防御に十分であるかを確かめた。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、サバイバーマウスからナイーブマウスへと移植し、続いて、初回免疫原として使用した親腫瘍細胞株でチャレンジした。サバイバーマウスからナイーブ受容マウスへの、ＣＤ８＋ＴＲＭ細胞または循環型ＣＤ８＋Ｔ細胞の移植は、続く腫瘍チャレンジからの重大な防御を与え、ＴＲＭサブセットが、防御上の支配的な役割を果たす（図２１Ｄ）。腫瘍接種の１週間前に行ったサバイバーマウスからナイーブマウスへの、Ｔ細胞の両サブセットの移植は、受容マウスを続く腫瘍チャレンジから１００％防御した（図２１Ｄ）。これらのデータを合わせると、ＰＧＰＣベースの超活性化刺激が、循環型および常在型の抗腫瘍ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の著しい誘導により、Ｂ１６黒色腫モデルにおいて最適な防御を与えることが示される。
実施例８：超活性刺激は、抗ＰＤ１耐性の定着腫瘍に対する防御をもたらす
超活性化刺激が、がん免疫療法として利用され得るかを確かめるために、任意の追加処置前に増殖中である腫瘍を含有したマウスでの抗腫瘍応答を調べた。この試験のために、抗原源として培養腫瘍細胞を使用するよりむしろ、未免疫マウス由来の同系腫瘍を使用して、採取した１０ｍｍの腫瘍を解離してからＣＤ４５＋細胞を除去したｅｘ ｖｉｖｏ ＷＴＬを生成した。マウスの左上背部に腫瘍細胞を皮下（ｓ．ｃ．）接種した。腫瘍が３～４ｍｍのサイズに達したら、担腫瘍マウスを未処理のままとした（未免疫）、または右わき腹に、ｅｘ ｖｉｖｏ ＷＴＬおよびＬＰＳ＋ＰＧＰＣからなる治療用注射をした。続く２回の治療用注射のｓ．ｃ．ブーストを行った（図１４Ａ）。興味深いことに、超活性化ベースの治療用注射は、広範な腫瘍、例えば、Ｂ１６ＯＶＡおよびＢ１６Ｆ１０の黒色腫モデル、ならびにＭＣ３８ＯＶＡおよびＣＴ２６の結腸がん腫瘍モデルにおいて腫瘍根絶を誘導した（図１４Ｂ～図１４Ｄ）。これらのモデルのすべてにおいて、免疫療法レジメンを受けたマウスの高い割合が、腫瘍接種後の長い間、無腫瘍のままであった（図１４Ｂ～図１４Ｄ）。免疫療法の有効性は、試験したすべての腫瘍モデルにおいてＩＬ－１βに依存した。なぜなら、ＩＬ－１βの中和は、超活性化刺激＋ｅｘ ｖｉｖｏ ＷＴＬによって与えられる防御を無効にしたからである（図１４Ｂ～図１４Ｄ）。さらに、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、免疫原性腫瘍モデル、例えば、Ｂ１６ＯＶＡ腫瘍またはＭＣ３８ＯＶＡ腫瘍に対する防御にとって重要であった一方、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方が、あまり免疫原性でない腫瘍、例えば、ＣＴ２６腫瘍およびＢ１６Ｆ－１０に対する防御に必要であった（図１４Ｂ～図１４Ｄ）［６３］。超活性化ベースの免疫療法の有効性がＰＤ－１阻害に基づく療法と比較してどの程度であるのかを確かめるために、対照評価を行った。超活性化ベースの免疫療法は、免疫原性Ｂ１６ＯＶＡモデルにおいて抗ＰＤ－１療法と同様に効率良かったが、抗ＰＤ－１処理に非感受性である腫瘍モデル、例えば、ＣＴ２６およびＢ１６Ｆ－１０においてはさらに効率良かった（図１４Ｂ～図１４Ｄ）。
実施例９：内在性超活性ＤＣは、Ｔ細胞性の持続性抗腫瘍免疫を刺激する
担腫瘍マウスへの超活性ＤＣの養子移植は、著しい抗腫瘍免疫を誘導する（図１２Ａ～図１２Ｂ）。内在性ＤＣが、超活性化介在性の抗腫瘍応答を開始できるかどうかを試験するために、従来のＤＣがＤＴ注射により除去されているＺｂｔｂ４６ＤＴＲを使用した。Ｚｂｔｂ４６ＤＴＲマウスまたはＷＴマウスに、Ｂ１６ＯＶＡ細胞をｓ．ｃ．注射した。次いで、Ｚｂｔｂ４６ＤＴＲマウス中の常在型ＤＣを、免疫化前に完全に除去するために、ＤＴを１日おきに注射した。腫瘍が４ｍｍのサイズに達したら、Ｚｂｔｂ４６ＤＴＲマウスまたはＷＴマウスを、Ｂ１６ＯＶＡ ＷＴＬ＋超活性化刺激ＬＰＳ＋ＰＧＰＣで免疫化した。マウスの９０％において腫瘍を拒絶したＷＴマウスと対照的に、Ｚｂｔｂ４６ＤＴＲマウス（ＤＣを欠く）は、腫瘍を拒絶できなかった。これらのデータは、ＤＣが、超活性化介在性防御の開始因子であることを確証する（図１５Ａ）。
実施例１０：超活性ｃＤＣ１は、Ｔ細胞性抗腫瘍免疫を刺激するために、複合抗原源を使用できる
本発明者らは、ｃＤＣ１およびｃＤＣ２は両方とも、ＬＰＳ＋ＰＧＰＣに応じて、生存力を維持しつつＩＬ－１βを産生することから、超活性化の状態に達し得ることをｉｎ ｖｉｔｒｏで示した。これらのデータにより、超活性化介在性の抗腫瘍応答をｉｎ ｖｉｖｏで開始する特異的ＤＣサブセットをさらに定義することが必要となる。腫瘍拒絶におけるｃＤＣ１サブセットの重要性からすると、ｃＤＣ１が、超活性化介在性の抗腫瘍防御の誘導において中心的な役割を果たすと本発明者らは仮定した。この着想を試験するために、Ｂａｔｆ３－／－マウス（ｃＤＣ１を欠くものの、ｃＤＣ２細胞は含有する）を使用した［６５］。その目的に向けて、Ｂａｔｆ３－／－またはＷＴの担腫瘍マウス（３～４ｍｍのＢ１６ＯＶＡを含有）を、ＬＰＳ＋ＰＧＰＣおよびＷＴＬで免疫化した。これらのマウスは、７日おきに２回のｓ．ｃ．ブースト注射を受けた。未免疫Ｂａｔｆ３－／－マウスは、未免疫ＷＴマウスよりも重度の腫瘍増殖を示し、すべてのマウスは、腫瘍接種から１８日経過直後、腫瘍のため死亡した。このデータは、高度に免疫原性の腫瘍の拒絶は、ｃＤＣ１細胞を欠くＢａｔｆ３－／－マウスにおいて著しく損なわれていることを示す先行研究［６５］を裏付ける。興味深いことに、Ｂａｔｆ３－／－マウスの免疫化は、未免疫Ｂａｔｆ３－／－マウスと比べてその生存を数日間改善したものの、すべてのＢａｔｆ３－／－マウスは、腫瘍接種から２５日までには腫瘍増殖のため死亡した。それに対して、ＷＴマウスは、担腫瘍マウスの１００％において腫瘍を拒絶した（図１５Ｃ）。したがって、ｃＤＣ１は、超活性化介在性の抗腫瘍免疫において決定的な役割を果たす。さらに、免疫化ＷＴマウスは、高頻度の抗原特異的なＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＴＭＥおよび皮膚ｄＬＮ中で誘導した一方で、免疫化Ｂａｔｆ３－／－は、ＴＭＥ中で、わずかに低下した抗原ＣＤ４＋Ｔ細胞を誘導したものの、際立つことには、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を誘導しなかった（図１５Ｄ）。
永続的な抗腫瘍防御の誘導における超活性ｃＤＣ１の役割をさらに確証するために、Ｂａｔｆ３－／－中での抗腫瘍防御を復元する超活性ｃＤＣ１の能力の評価に努めた。ナイーブ、活性または超活性ｃＤＣ１細胞を、Ｂａｔｆ３－／－マウスへと養子移植した。その目的に向けて、ＦＬＴ３由来ｃＤＣ１を、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスから、Ｂ２２０－ＭＨＣ－ＩＩ＋ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ２４＋細胞として、以前に記載されたようにソーティングした。ｃＤＣ１を、前記のようにｉｎ ｖｉｔｒｏで処理し、Ｂ１６ＯＶＡ ＷＴＬをロードしてから、１．１０ｅ６個の細胞を、担腫瘍Ｂａｔｆ３－／－マウスへとｓ．ｃ．注射した。未注射マウスと比べて、マウス生存率のわずかな改善しか与えなかったナイーブｃＤＣ１または活性ｃＤＣ１と対照的に、超活性ｃＤＣ１は、担腫瘍マウスの１００％において腫瘍拒絶を誘導し、それらのマウスは、腫瘍接種から６０日超、無腫瘍のままであった（図１５Ｅ）。超活性ｃＤＣ１注射が、腫瘍および皮膚ｄＬＮ中でのＳＩＩＮＦＥＫＬテトラマー染色により測定して、Ｂａｔｆ３－／－でのＣＤ８＋Ｔ応答を復元したことは注目に値する（図１５Ｆ）。それに対して、ナイーブｃＤＣ１または活性ｃＤＣ１の注射は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を復元できなかった。ｃＤＣ１媒介性腫瘍拒絶は、インフラマソーム活性化に依存した。なぜなら、ＬＰＳ＋ＰＧＰＣで処理されたＮＬＲＰ３－／－ ｃＤＣ１の注射は、いかなる抗腫瘍防御も与えず、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を復元する超活性ｃＤＣ１の能力を無効にしたからである（図１５Ｆ）。
生細胞からＩＬ－１を産生する能力に加えて、超活性ＤＣは、隣接するｄＬＮへと高度に遊走し、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強した（図１２Ａ～図１２Ｂ）。
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別の実施形態
本発明は、その詳細な記載と関連して記載されたものの、前記の記載は、添付クレームの範囲により定義される本発明の範囲の例証を意図し、限定する意図はないことを理解されたい。他の態様、利点、および改変が、以下のクレームの範囲内である。

Claims (21)

  1. 治療用樹状細胞の集団を生成する方法であって、
    細胞ドナーから生きた樹状細胞を得る工程；
    前記樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏでＴＬＲリガンドでプライミングする工程；
    プライミングされた前記樹状細胞を、非標準的インフラマソーム活性化脂質と共にｅｘ ｖｉｖｏで培養する工程；および
    前記樹状細胞に免疫原をロードし、それにより治療用樹状細胞の集団を生成する工程
    を含む方法。
  2. 対象において免疫応答を誘導する方法であって、
    細胞ドナーから生きた樹状細胞を得る工程；
    前記樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏでＴＬＲリガンドでプライミングする工程；
    プライミングされた前記樹状細胞を非標準的インフラマソーム活性化脂質と共にｅｘ ｖｉｖｏで培養する工程；
    前記樹状細胞に免疫原をロードし、それにより治療用樹状細胞の集団を生成する工程；および
    前記生きた樹状細胞を前記対象に投与し、それにより対象において免疫応答を誘導する工程
    を含む方法。
  3. 対象においてがんを処置する方法であって、
    細胞ドナーから生きた樹状細胞を得る工程；
    前記樹状細胞をｅｘ ｖｉｖｏでＴＬＲリガンドでプライミングする工程；
    プライミングされた前記樹状細胞を非標準的インフラマソーム活性化脂質と共にｅｘ ｖｉｖｏで培養する工程；
    前記樹状細胞に免疫原をロードし、それにより治療用樹状細胞の集団を生成する工程；および
    前記生きた樹状細胞を前記対象に投与し、それにより対象においてがんを処置する工程
    を含む方法。
  4. 前記細胞ドナーおよび／または対象が哺乳動物対象である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記細胞ドナーおよび／または対象がヒト対象である、請求項４に記載の方法。
  6. 細胞ドナーから樹状細胞を得る工程が、
    前記細胞ドナーから前駆細胞を採取する工程；および
    分化を誘導するのに有効な条件下で前記前駆細胞をｅｘ ｖｉｖｏで培養し、それにより前記細胞ドナーから樹状細胞を得る工程
    を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 対象から樹状細胞を得る工程が、ｉｎ ｖｉｖｏで分化した樹状細胞を前記細胞ドナーから採取する工程を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  8. 前記免疫原が、がんの発生に関連する感染因子由来の免疫原である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記免疫原ががん抗原である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記免疫原が全腫瘍溶解物である、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記免疫原が自家性である、請求項９または１０に記載の方法。
  12. 前記プライミングおよび前記培養が同時に行われる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記プライミングが、前記培養の前に行われる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記ＴＬＲリガンドが、ＴＬＲ１リガンド、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ３リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ５リガンド、ＴＬＲ６リガンド、ＴＬＲ７リガンド、ＴＬＲ８リガンド、ＴＬＲ９リガンド、ＴＬＲ１０リガンド、ＴＬＲ１１リガンド、ＴＬＲ１２リガンド、ＴＬＲ１３リガンド、およびそれらの組合せから選択される、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 前記ＴＬＲリガンドがＴＬＲ４リガンドである、請求項１～１３のいずれか１項に記載の方法。
  16. 前記ＴＬＲ４リガンドが、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、またはそれらの組合せから選択される、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記非標準的インフラマソーム活性化脂質が、酸化１－パルミトイル－２－アラキドノイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルコリン（ｏｘＰＡＰＣ）の一種を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 前記非標準的インフラマソーム活性化脂質が、２－［［（２Ｒ）－２－［（Ｅ）－７－カルボキシ－５－ヒドロキシヘプタ－６－エノイル］オキシ－３－ヘキサデカノイルオキシプロポキシ］－ヒドロキシホスホリル］オキシエチル－トリメチルアザニウム（ＨＯｄｉＡ－ＰＣ）、［（２Ｒ）－２－［（Ｅ）－７－カルボキシ－５－オキソヘプタ－６－エノイル］オキシ－３－ヘキサデカノイルオキシプロピル］２－（トリメチルアザニウミル）エチルホスフェート（ＫＯｄｉＡ－ＰＣ）、１－パルミトイル－２－（５－ヒドロキシ－８－オキソ－オクテノイル）－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホリルコリン（ＨＯＯＡ－ＰＣ）、２－［［（２Ｒ）－２－［（Ｅ）－５，８－ジオキソオクタ－６－エノイル］オキシ－３－ヘキサデカノイルオキシプロポキシ］－ヒドロキシホスホリル］オキシエチル－トリメチルアザニウム（ＫＯＯＡ－ＰＣ）、［（２Ｒ）－３－ヘキサデカノイルオキシ－２－（５－オキソペンタノイルオキシ）プロピル］２－（トリメチルアザニウミル）エチルホスフェート（ＰＯＶＰＣ）、［（２Ｒ）－２－（４－カルボキシブタノイルオキシ）－３－ヘキサデカノイルオキシプロピル］２－（トリメチルアザニウミル）エチルホスフェート（ＰＧＰＣ）、［（２Ｒ）－３－ヘキサデカノイルオキシ－２－［４－［３－［（Ｅ）－［２－［（Ｚ）－オクタ－２－エニル］－５－オキソシクロペンタ－３－エン－１－イリデン］メチル］オキシラン－２－イル］ブタノイルオキシ］プロピル］２－（トリメチルアザニウミル）エチルホスフェート（ＰＥＣＰＣ）、［（２Ｒ）－３－ヘキサデカノイルオキシ－２－［４－［３－［（Ｅ）－［３－ヒドロキシ－２－［（Ｚ）－オクタ－２－エニル］－５－オキソシクロペンチリデン］メチル］オキシラン－２－イル］ブタノイルオキシ］プロピル］２－（トリメチルアザニウミル）エチルホスフェート（ＰＥＩＰＣ）、またはそれらの組合せを含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  19. 前記非標準的インフラマソーム活性化脂質が、［（２Ｒ）－２－（４－カルボキシブタノイルオキシ）－３－ヘキサデカノイルオキシプロピル］２－（トリメチルアザニウミル）エチルホスフェート（ＰＧＰＣ）を含む、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  20. 抗がん剤を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項２～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. 前記抗がん剤が化学療法剤である、請求項２０に記載の方法。
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