KR20220102441A - 바이설파이트 및 pna 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법 및 검출 키트 - Google Patents

바이설파이트 및 pna 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법 및 검출 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 메틸화가 일어날 수 있는 표적 유전자에 바이설파이트를 처리하고, 처리된 유전자를 PNA 프로브 존재하에서 증폭 반응을 수행하여, 융해곡선의 분석으로부터 유전자의 메틸화 여부를 검출하는 방법 및 검출을 위한 키트를 제공하며, 이는 간편하고, 우수한 민감도 및 정확도로 미량의 메틸화를 검출할 수 있어 암을 포함한 다양한 질병 진단 분야에서 유용하게 활용될 수 있다.

Description

바이설파이트 및 PNA 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법 및 검출 키트{Method and kits for detecting methylation of gene using bisulfite and PNA probe}
본 발명은 바이설파이트 및 PNA 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법 및 검출 키트에 관한 것이다.
포유류 세포의 게놈 DNA에는 A, C, G, T 외에 5번째 염기가 존재하며, 이는 시토신 고리의 5번째 탄소에 메틸기가 붙은 5-메틸시토신(5-mC)이다. 5-mC는 항상 CG 다이뉴클레오타이드의 C에만 오며(5'-mCG-3'), 이러한 CG를 흔히 CpG라고 표시한다. CpG의 C는 대부분이 메틸화되어 있다.
이러한 CpG는 포유류 세포에서 유전자외 변화가 가장 흔히 나타나는 부위로서, CpG의 메틸화는 알루(alu)나 전이인자(transposon)와 같이 게놈내에 반복되는 염기서열이 발현되지 못하도록 억제한다. 이러한 CpG의 5-mC에서는 자연히 탈아미노화되어 염기가 T로 바뀌며, 이에 따라 포유류 게놈내 CpG는 정상적으로 나타나야 할 빈도(1/4 x 1/4 = 6.25%)보다 훨씬 낮은 1%의 빈도만을 나타낸다.
CpG 중에 예외적으로 밀집되어 나타나는 것들이 있는데, 이를 CpG 섬이라고 한다. CpG 섬은 길이가 0.2~3 kb이고, C 및 G 염기의 분포율이 50%를 넘으며, CpG의 분포율이 3.75%이상으로 높게 집중되어 나타나는 부위를 가리킨다.
CpG 섬은 전체 인체 유전체에 약 45,000개가 나타나며, 특히 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 부위에 집중되어 나타난다. 실제로 인체 유전자 중 약 절반을 차지하는 하우스키핑 유전자(housekeeping genes)의 프로모터에는 CpG 섬이 나타난다(Cross, S. & Bird, A.P., Curr. Opin. Gene Develop., 5:309, 1995).
한편, 정상인의 체세포에서는 이들 하우스키핑 유전자 프로모터 부위의 CpG 섬이 메틸화되어 있지 않으나, 발생 중에는 발현되지 않도록 각인된(imprinted) 유전자 및 비활성화된 X 염색체 상의 유전자들은 메틸화되어 있다. 주로 발암과정에서 프로모터 CpG 섬에 메틸화가 나타나며, 그 해당 유전자의 발현에 장애가 나타나게 된다. 특히, 세포주기 또는 세포고사(apoptosis)를 조절하고, DNA를 복구하며 세포의 부착 및 세포간 상호협조 작용에 관여하고, 침윤과 전이를 억제하는 종양억제 유전자들의 프로모터 CpG 섬에 메틸화가 발생하는 경우, 이는 코딩서열의 돌연변이와 동일하게 이들 유전자의 발현과 기능을 차단하며, 그 결과 암의 발생과 진행이 촉진된다. 그 외에도 노화에 따라 CpG 섬에 부분적으로 메틸화가 나타나기도 한다.
이렇듯 종양억제 유전자의 프로모터 CpG 섬의 메틸화 현상은 암 발생의 가장 초기에 일어나는 대표적인 현상이기 때문에 암의 중요한 지표가 되며, 암의 조기진단을 포함한 진단, 발암의 예측, 암의 예후 예측, 치료 후 추적조사, 항암 요법에 대한 반응 예측 등 다양한 분야에 이용될 수 있다.
현재는 메틸화-특이적 PCR이 바이설파이트 전환된 DNA에서 메틸화된 DNA를 검출하기 위하여 일반적으로 사용되는 방법이다. MethyLight PCR은 메틸화 특이적 프라이머 이외에도 메틸화된 CpG 부위의 탐색을 위해 5'-3' 가수분해 프로브를 사용하여, 정량화할 수 있는 실시간 PCR 법이다. 이러한 방법은 모든 표적 CpG 부위가 메틸화되어진 것을 필요로 하는 올리고뉴클레오티드를 기반으로 한다는 점에서, CpG 영역 내 부분 메틸화가 존재하는 경우에는 진단 결과의 정확성이 감소하는 문제가 있다. 예를 들어, 소정의 메틸화된 DNA를 검출하기 위한 프로브와의 혼성화를 위해서는 모든 CpG 부위가 메틸화되어 있는 것을 요구하므로, 1 이상의 CpG 부위가 메틸화되어 있지 않은 경우에 프로브는 결합할 수 없어서, 왜곡된 결과를 나타내거나 진단 감도를 상당히 감소시킨다.
따라서 DNA 메틸화에 대한 신뢰도 높은 평가 수단으로서, CpG 영역의 부분 메틸화에 대하여 진단 감도를 향상시킬 수 있는 기술개발이 요구된다.
본 발명은 상술한 CpG 영역의 부분 메틸화에 대하여 진단 감도가 현저히 향상된 유전자의 메틸화 검출방법으로서, 단순하지만 높은 정확도로 미량의 메틸화를 검출하는 방법 및 검출키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 메틸화가 일어날 수 있는 표적 유전자에 시토신 잔기를 개질시키는 시약을 처리하여 비메틸화 시토신을 우라실로 전환시키는 단계; 상기 표적 유전자에 특이적인 PNA 프로브를 처리하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 상기 PCR에 의한 융해 곡선을 분석하여 ΔTm(melting temperature)을 산출하는 단계;를 포함하는, PNA 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법을 제공한다.
상기 ΔTm = Tm (표적 유전자) - Tm (표적 유전자와 동일한 염기서열로 이루어진 메틸화 되지 않은 유전자) 이고, 상기 ΔCt = Ct (표적 유전자) - Ct (표적 유전자와 동일한 염기서열로 이루어진 메틸화 되지 않은 유전자)이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 시약은 바이설파이트, 하이드로겐 설파이트, 다이설파이트 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 PCR은 CG 서열을 포함하지 않는 유니버셜 프라이머를 사용하여 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 프로브는 리포터, 소광자, 인터컬레이팅 형광 물질 또는 이들의 조합으로 표지된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자의 염기서열은 메틸화된 염기서열, 하이드록시 메틸화된 염기서열, 포르밀 메틸화된 염기서열, 카르복실 메틸화된 염기서열 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 검출 방법은 표준 PCR, 실시간 PCR(Real Time PCR), 디지털 PCR, 등온 PCR(Isothermal PCR), 메틸화 특이적 PCR(Methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이적 PCR(Real Time Methylation specific PCR), 질량 PCR, DNA 칩, DNA FISH (Fluorescence in situ hybridization)에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 표적 유전자의 메틸화 검출 한계가 1 % 미만일 수 있다.
또한, 본 발명은 메틸화가 일어날 수 있는 표적 유전자의 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 PNA 프로브, 표적 유전자에 시토신 잔기를 개질시키는 시약, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 유니버셜 프라이머 및 바이설파이트 또는 이의 염을 포함하는 유전자의 메틸화 검출용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유니버셜 프라이머는 CG 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 유전자 메틸화 검출방법은 바이설파이트를 처리한 후, PNA 프로브를 이용한 PCR 융해 곡선 분석을 통해 간편하게 유전자 메틸화 여부를 검출할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 유전자 메틸화 검출방법의 검출 한계는 1% 미만을 나타내어, 부분 메틸화 유전자에 대하여 진단 감도가 현저히 향상된 우수한 메틸화 검출용 키트를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 PNA 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법에 관한 순서도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 유전자의 메틸화 검출 방법의 원리를 간략히 나타낸 모식도이다.
도 3a는 본 발명의 실시예 1에 따른 메틸화 정도에 따른 융해 곡선의 형태를 나타낸 그래프이다.
도 3b는 본 발명의 비교예 1에 따른 메틸화 정도에 따른 융해 곡선의 형태를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1에 따른 융해 곡선의 peak 변화를 나타낸 그래프이다.
이하에서 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 따로 정의하지 않는 경우 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 내용으로 해석되어야 할 것이다. 본 명세서의 도면 및 실시예는 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 쉽게 이해하고 실시하기 위한 것으로 도면 및 실시예에서 발명의 요지를 흐릴 수 있는 내용은 생략될 수 있으며, 본 발명이 도면 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
또한 달리 정의되지 않는 한, 모든 기술적 용어 및 과학적 용어는 본 발명이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자 중 하나에 의해 일반적으로 이해되는 의미와 동일한 의미를 가진다. 본원에서 설명에 사용되는 용어는 단지 특정 실시예를 효과적으로 기술하기 위함이고 본 발명을 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
이하에서 어느 하나의 구성요소가 다른 구성요소를 “포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 당해 구성요소만으로 이루어지는 것으로 한정되어 해석되지 아니하며, 다른 구성요소들을 더 포함할 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명은 PNA 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법에 관한 것으로서, 메틸화가 일어날 수 있는 표적 유전자에 시토신 잔기를 개질시키는 시약을 처리하여 비메틸화 시토신을 우라실로 전환시키는 단계; 상기 표적 유전자에 특이적인 PNA 프로브를 처리하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 상기 PCR에 의한 융해 곡선을 분석하여 ΔTm(melting temperature)을 산출하는 단계;를 포함한다. 이때 상기 ΔTm = Tm (표적 유전자) - Tm (표적 유전자와 동일한 염기서열로 이루어진 메틸화 되지 않은 유전자) 이다.
표적 유전자는 메틸화된 염기서열을 포함하며, 이는 메틸화된 염기서열, 하이드록시 메틸화된 염기서열, 포르밀 메틸화된 염기서열, 카르복실 메틸화된 염기서열 또는 이들의 조합을 포함하는 것을 의미할 수 있다.
상기 시약은 바이설파이트를 포함하며, 구체적으로 바이설파이트, 하이드로겐 설파이트, 다이설파이트 또는 이들의 조합일 수 있다. 바이설파이트는 시토신(C)을 우라실(U)로 바꾸는 물질이지만, 메틸화된 시토신과는 반응하지 못하여, 유전자에 바이설파이트를 처리하고 PCR을 수행하면 메틸화되지 않은 시토신은 티민으로 전환된다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 시약을 처리하여 비메틸화 시토신을 우라실로 전환시킨 후, CG 서열을 포함하지 않는 유니버셜 프라이머를 이용하여 증폭하는 단계를 포함할 수 있다. CG 서열을 포함하지 않도록 유니버셜 프라이머를 디자인하여, 메틸화 또는 비메틸화 여부에 따라 증폭에 미치는 영향을 차단할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 검출 방법은 표준 PCR, 실시간 PCR(Real Time PCR), 디지털 PCR, 등온 PCR(Isothermal PCR), 메틸화 특이적 PCR(Methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이적 PCR(Real Time Methylation specific PCR), 질량 PCR, DNA 칩, DNA FISH (Fluorescence in situ hybridization)에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따라 메틸화된 유전자에 특이적인 PNA 프로브를 처리하여 PCR을 수행하는 경우 메틸화된 유전자와 더 강한 결합을 형성하여 높은 Tm에서 융해될 수 있다.
구체적으로, PNA 프로브의 구아닌 염기는 상보적 염기에 해당하는 시토신과 결합하고, 상기 상보적 결합은 구아닌과 시토신 염기가 3개의 수소 결합을 함으로써 강한 분자 간의 인력을 형성할 수 있다. 메틸화된 시토신은 피리미딘 고리의 5번째 탄소에 메틸기가 결합된 것으로서, 메틸기는 전자 주는 기(Electron Donating group: EDG)에 해당하므로 메틸화된 시토신의 경우 상보적 염기인 구아닌과 더 강한 수소 결합이 가능하다. 그러므로 메틸화된 시토신이 존재하는 경우 PNA 프로브와의 결합력이 더 강하여 융해 온도가 더 높게 나타날 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 PCR에 의한 융해 곡선 분석은 FMCA(Fluorescence Melting Curve Analysis: 형광융해곡선 분석) 방법으로 수행되는 것일 수 있으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 형광 융해곡선 분석은 형광 물질을 사용하여 융해 곡선을 분석하는 것으로서, 본 발명의 바람직한 일 구현예를 위하여 상기 PNA 프로브는 리포터(Reporter) 및 소광자(Quencher), 인터컬레이팅 형광 물질 또는 이들의 조합으로 표지된 것일 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 상기 PNA 프로브는 C-말단에 결합된 리포터 및 N-말단에 결합된 소광자를 포함하는 PNA 프로브 또는 N-말단에 결합된 리포터 및 C-말단에 결합된 소광자를 포함하는 PNA 프로브일 수 있다.
상기 리포터는 특정 파장의 빛을 흡수, 방출하여 형광을 발하는 물질로서, 프로브에 표지하여 표적 핵산과 프로브 사이의 혼성화가 이루어졌는지 여부를 확인할 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 리포터는 구체적으로 400 nm 내지 800 nm 영역의 파장을 발광하는 형광공여체(fluorescence donor)로서, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(oregon green), 알렉사 플루오로(Aleza Fluor), FAM(6-carboxyfluorescein), Texas red, HEX(2,4,5,7-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), JOE, ROX, TET, TRITC, TEMRA, CY3 및 CY5로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 소광자는 상기 리포터의 발광 에너지를 흡수하는 형광수용체(fluoroscence acceptor)로서, 리포터 물질이 발생시킨 빛을 흡수하여 형광 세기를 감소시키는 작용을 나타낼 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 소광자는 구체적으로 TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), BHQ1, BHQ2 및 Dabcyl(4,4-Dimethylamino-azobenzene-4-carboxylic acid), 아이오와 블랙(Iowa black), FQ, IRDye QC-1로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있고, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인터컬레이팅 형광 물질은 아크리딘 호모다이머(Acridine homodimer) 및 이의 유도체, 아크리딘 오렌지(Acridine Orange) 및 이의 유도체, 7-아미노액티노마이신 D(7-aminoactinomycin D, 7-AAD) 및 이의 유도체, 액티노마이신 D(Actinomycin D) 및 이의 유도체, 에이씨엠에이(ACMA, 9-amino-6-chloro-2-methoxyacridine) 및 이의 유도체, 디에이피아이(DAPI) 및 이의 유도체, 디하이드로에티듐(Dihydroethidium) 및 이의 유도체, 에티듐 브로마이드(Ethidium bromide) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-1(EthD-1) 및 이의 유도체, 에티듐 호모다이머-2(EthD-2) 및 이의 유도체, 에티듐 모노아자이드(Ethidium monoazide) 및 이의 유도체, 헥시디움 아이오다이드(Hexidium iodide) 및 이의 유도체, 비스벤지마이드(bisbenzimide, Hoechst 33258) 및 이의 유도체, 호에크스트 33342(Hoechst 33342) 및 이의 유도체, 호에크스트 34580(Hoechst 34580) 및 이의 유도체, 하이드로옥시스티바미딘(hydroxystilbamidine) 및 이의 유도체, 엘디에스 751(LDS 751) 및 이의 유도체, 프로피디움 아이오다이드(Propidium Iodide, PI) 및 이의 유도체, 사이다이스(Cy-dyes) 유도체로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에 따른 PNA 프로브가 리포터, 소광자, 인터컬레이팅 형광 물질 또는 이들의 조합을 포함하는 경우 표적 유전자와 혼성화되어 혼성체(Hybrid)를 형성하면, 형광신호가 발생한다. 상기 혼성체의 온도를 점차적으로 변화시키면 겹 가닥을 이루고 있는 PNA 프로브 및 유전자가 적정 융해 온도에서 빠르게 융해되어, 형광 신호가 소광되고, 소광되는 순간의 온도는 Tm을 의미할 수 있다.
본 발명에 따르면 메틸화 되지 않은 유전자 및 PNA 프로브와 표적 유전자 및 PNA 프로브 사이의 ΔTm을 측정함으로써 유전자의 메틸화 여부를 확인할 수 있다.
상기 ΔTm은 표적 유전자의 메틸화 정도에 따라 달리 측정될 수 있으나, 본 발명의 비한정적인 일 예에 있어서, ΔTm은 8 ℃ 이상, 바람직하게는 10 ℃ 이상, 보다 바람직하게는 15 ℃ 이상일 수 있다. 상술한 범위의 ΔTm값이 산출되는 경우 표적 유전자가 메틸화 된 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구현예에 따르면 PNA 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법의 표적 유전자 메틸화 검출 한계는 1 % 미만일 수 있다. 이하 실시예를 통해 보다 상세히 기재하겠지만, 75 %, 50 %, 25 %, 10 %, 5 %, 1 % 메틸화된 유전자 및 비메틸화된 유전자를 혼합하여 검출 민감도를 테스트한 결과, 본 발명에 따른 방법을 통하여 융해 곡선 분석 시, 1% 메틸화된 유전자에 대하여도 메틸화 여부가 검출 가능한 것으로 나타났다.
또한 본 발명은 PNA 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출용 키트를 제공한다. 본 발명에 따른 유전자의 메틸화 검출용 키트는 메틸화가 일어날 수 있는 표적 유전자의 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 PNA 프로브, 표적 유전자에 시토신 잔기를 개질시키는 시약, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 유니버셜 프라이머 및 바이설파이트 또는 이의 염을 포함할 수 있다. 상기 유니버셜 프라이머는 CG 서열을 포함하지 않도록 디자인되어, 메틸화 여부에 관계없이 동일한 증폭이 이루어질 수 있도록 융해곡선에 미치는 영향을 최소화한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 유전자의 메틸화 검출용 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 구체적으로 내열성 DNA 중합효소, dNTPs, 버퍼 등으로서, 본 발명과 동일한 기술분야에서 널리 공지된 증폭 반응을 수행하기 위한 시약이라면 이에 제한받지 않고 사용할 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 자세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 하나의 예시에 해당하는 것으로서 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. PNA 형광 프로브를 이용한 PCR에서의 융해곡선 분석
Septin-9 유전자의 프로모터가 95 % 이상 메틸화된 것으로 측정된 Hela genomic DNA(gDNA)를 상기 유전자가 0 % 메틸화된 것으로 측정된 대조 샘플인 Jurkat gDNA와 1 %, 5 %, 10 %, 25 %, 50 %, 75 % 로 혼합하였고, 혼합하지 않은 Hela gDNA 및 Jurkat gDNA를 각각 200 ng씩 EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kits (Qiagen, 미국)를 이용하여 바이설파이드 처리를 실시하였다. 이후 바이설파이트 처리한 gDNA 3 ㎕를 형광 표지(5'-FAM, 3'-Dabcyl)한 하기 표 1의 서열번호 3의 염기서열을 가지는 PNA 프로브 0.1 μM, 서열번호 1의 염기서열을 가지는 forward primer 1 μM, 서열번호 2의 염기서열을 가지는 reverse primer 0.1 μM, 및 10 ㎕ PCR 증폭용액과 혼합한 후, 총 부피가 20㎕ 되도록 증류수를 첨가하여 메틸화 분석 PCR(CFX-96 Real-time)을 실시하였다.
PCR 증폭 조건은 다음과 같다. 95 ℃에서 5분 처리 후, 95 ℃에서 30초, 58 ℃에서 30초, 72 ℃에서 30초로 총 40회 수행하였으며, 단일 가닥 표적 핵산을 생성하기 위해 비대칭 PCR(asymmetric PCR)을 이용하였다. PCR 증폭이 끝난 후 95 ℃에서 5분 동안 반응 후, 30 ℃까지 낮춘 뒤에, 20 ℃부터 100 ℃까지 1 ℃씩 상승시키며, 형광을 측정하는 융해곡선 분석을 수행하였다.
상기 융해곡선 분석 결과는 도 3a에 도시되었다. 비메틸화 DNA의 경우 Tm은 38 ℃, 100 % 메틸화된 DNA의 경우 54 ℃를 나타내었는데, 이는 SYBR green dye 기반의 프로브를 이용한 비교예 1과 비교하면 매우 큰 Tm 차이를 보이는 것이다. PNA 프로브를 이용한 실시예 1에 따른 결과를 통해, 1 %의 메틸화 DNA를 포함한 경우까지 메틸화 검출이 가능한 것이 관찰되었는 바, 본 발명에 따른 검출 방법이 현저히 우수한 진단 감도를 제공하는 것을 확인할 수 있었다.
비교예 1. SYBR green을 이용한 PCR에서의 융해곡선 분석
PNA 프로브 대신 SYBR green dye를 사용하는 것을 제외하면, 실시예 1과 동일한 방법으로 PCR을 실시하여 융해곡선 분석을 수행하였다. 상기 융해곡선 분석 결과는 도 3b에 도시되었다. 비메틸화 DNA의 경우 Tm은 71 ℃, 100 % 메틸화된 DNA의 경우 74 ℃를 나타내어 ΔTm은 불과 3 ℃ 차이로 확인되었다. 또한 도 3b에서 0% 및 100% 메틸화 된 경우에 한해 피크가 나타나 100% 비메틸화 또는 100% 메틸화 DNA의 검출만 가능한 것을 확인할 수 있었다.
Figure pat00001
이상을 통해 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니고, 청구범위와 발명의 설명 및 첨부한 도면의 범위 안에서 여러가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 본 발명의 범위에 속하는 것은 당연하다.

Claims (10)

  1. 메틸화가 일어날 수 있는 표적 유전자에 시토신 잔기를 개질시키는 시약을 처리하여 비메틸화 시토신을 우라실로 전환시키는 단계;
    상기 표적 유전자에 특이적인 PNA 프로브를 처리하여 PCR(Polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
    상기 PCR에 의한 융해 곡선을 분석하여 ΔTm(melting temperature)을 산출하는 단계;를 포함하는, PNA 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법.
    (상기 ΔTm = Tm (표적 유전자) - Tm (표적 유전자와 동일한 염기서열로 이루어진 메틸화 되지 않은 유전자) 이다).
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 시약은 바이설파이트, 하이드로겐 설파이트, 다이설파이트 또는 이들의 조합인, PNA 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 PCR은 CG 서열을 포함하지 않는 유니버셜 프라이머를 사용하여 수행되는 것인, PNA 프로브를 이용한 유전자의 메틸화 검출 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 PNA 프로브는 리포터, 소광자, 인터컬레이팅 형광 물질 또는 이들의 조합으로 표지된 것인, 유전자의 메틸화 검출 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 유전자의 염기서열은 메틸화된 염기서열, 하이드록시 메틸화된 염기서열, 포르밀 메틸화된 염기서열, 카르복실 메틸화된 염기서열 또는 이들의 조합을 포함하는 것인, 유전자의 메틸화 검출 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 검출 방법은 표준 PCR, 실시간 PCR(Real Time PCR), 디지털 PCR, 등온 PCR(Isothermal PCR), 메틸화 특이적 PCR(Methylation specific PCR), 실시간 메틸화 특이적 PCR(Real Time Methylation specific PCR), 질량 PCR, DNA 칩, DNA FISH (Fluorescence in situ hybridization)에서 선택되는 어느 하나 이상인, 유전자의 메틸화 검출 방법.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 표적 유전자의 메틸화 검출 한계가 1 % 미만인, 유전자의 메틸화 검출 방법.
  8. 메틸화가 일어날 수 있는 표적 유전자의 염기서열과 특이적으로 결합할 수 있는 PNA 프로브, 표적 유전자에 시토신 잔기를 개질시키는 시약, 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 유니버셜 프라이머 및 바이설파이트 또는 이의 염을 포함하는, 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 따른 유전자의 메틸화 검출용 키트.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 유니버셜 프라이머는 CG 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 하는, 유전자의 메틸화 검출용 키트.
  10. 제 8항에 있어서, 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 더 포함하는, 유전자의 메틸화 검출용 키트.
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