KR20220097323A

KR20220097323A - 케스토스를 이용한 장내 미생물의 생육 증진용도

Info

Publication number: KR20220097323A
Application number: KR1020210192422A
Authority: KR
Inventors: 사순옥; 박지원; 기민지; 남충우; 한정숙; 김원용; 김종화; 김기영
Original assignee: 주식회사 삼양사
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2021-12-30
Publication date: 2022-07-07
Also published as: JP2024501693A; WO2022146077A1; KR20220097322A; KR20220097324A

Abstract

본 발명은 케스토스를 유효성분으로 포함하는 조성물, 그리고, 상기 조성물의 장내 단쇄 지방산 (short chain fatty acid, SCFA)의 생산 및/또는 함량 증진제, 단쇄 지방산의 생산균 증진 용도, 염증성 질환 예를 들면 아토피 피부염 또는 장내 염증의 예방, 치료 또는 개선 용도, 및 장내 마이크로바이옴 조절 용도에 관한 것으로서, 상기 조성물은 식품, 의약 또는 건강기능성 식품 조성물일 수 있다.

Description

케스토스를 이용한 장내 미생물의 생육 증진용도{Growth promotion of gut microbiome using kestose}

본 발명은 케스토스를 유효성분으로 포함하는 조성물, 그리고, 상기 조성물의 장내 단쇄 지방산 (short chain fatty acid, SCFA)의 생산 및/또는 함량 증진제, 단쇄 지방산의 생산균 증진 용도, 염증성 질환 예를 들면 피부 염증 또는 장내 염증의 예방, 치료 또는 개선 용도, 및 장내 마이크로바이옴 조절 용도에 관한 것이다.

최근 프로바이오틱스가 장내 유익균을 증식하고 유해균을 억제하는 효능으로 아토피 증상 완화, 면역력 강화 등에 효과가 좋다는 연구결과들에 따라 건강보조식품으로 주목을 받고 있다.

그러나, 프로바이오틱스는 일부 장막 손상, 면역저하 환자 등에서는 부작용이 우려돼 복용시 주의가 필요하다는 보고가 되고 있다.

최근에는 프로바이오틱스 (probiotics) 라는 용어 이외에 프로바이오틱스의 먹이가 되는 영양분을 의미하는 것으로 장내 프로바이오틱스를 활성화함으로써 이의 기능을 극대화시킬 수 있는 프리바이오틱스(prebiotics)에 관한 연구가 활발하게 이루어지고 있다.

프리바이오틱스 대부분은 올리고당이나 다당체의 형태를 띠는데 대표적인 것은 과거에는 inulin, lactulose, lactitol 등이 비피더스균 등의 유익균의 먹이로 주로 활용되었고, 최근에는 더욱 다양하게 AX (arabinoxylan) 등이 활용되고 있다.

본 발명의 일 예는 케스토스를 유효성분으로 포함하는 장내 마이크로바이옴 조절 용도에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 장내 유익 미생물의 생육 증진/촉진 및/또는 장해 유해 미생물의 생육 억제/감소 용도에 관한 것이다.

본 발명의 추가 일 예는 케스토스를 유효성분으로 포함하는 조성물의 장내 미생물, 예를 들면 락토바실러스 속 미생물 및 Alistipes 속 미생물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 미생물의 생육 증진/촉진 용도에 관한 것이다.

본 발명의 추가 일 예는 케스토스를 유효성분으로 포함하는 조성물의 장내 미생물, 예를 들면 Prevotella 속 미생물의 생육 억제/감소 용도에 관한 것이다.

본 발명의 추가 일 예는 케스토스를 유효성분으로 포함하는 장내 단쇄 지방산, 예를 들면 프로피온산을 생산하는 장내 미생물의 생육 증진/촉진 용도에 관한 것이다.

본 발명의 추가 일 예는 케스토스를 유효성분으로 포함하는, 장내 단쇄 지방산, 예를 들면 프로피온산의 생산 및/또는 함량 증진용 조성물에 관한 것이다. 상기 장내 단쇄 지방산, 예를 들면 프로피온산의 생산 및/또는 함량 증가는 장내 미생물에 의해 달성되는 것일 수 있다.

본 발명의 추가 일 예는 케스토스를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예를 들면 피부 염증(염증성 피부질환) 및/또는 장내 염증 (염증성 장질환)의 예방, 치료 또는 개선 용도에 관한 것이다.

본 발명의 일 예는 케스토스를 유효성분으로 포함하는 장내 마이크로바이옴 조절 용도에 관한 것으로서, 더욱 자세하게는 장내 유익 미생물의 생육 증진, 장내유해 미생물의 생육 억제, 및/또는 장내 단쇄 지방산, 예를 들면 프로피온산을 생산하는 장내 미생물의 생육 증진 용도에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 일 예는 케스토스를 유효성분으로 포함하는 장내 단쇄 지방산(short chain fatty acid, SCFA), 예를 들면 프로피온산의 생산 및/또는 함량 증진용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 추가 일 예는 케스토스를 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예를 들면 피부 염증 및/또는 장내 염증의 예방, 치료 또는 개선 용도에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명은 케스토스를 유효성분으로 포함하는 장내 마이크로바이옴 조절 용도로서 장내 미생물 불균형을 개선하는 조성물, 용도 또는 방법에 관한 것으로서, 자세하게는 장내 유해 미생물의 생육 억제, 장내 유익 미생물의 생육 증진 및 프로피온산 생산균의 생육 증진으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 장내 마이크로바이옴 조절 용도로 사용하기 위한 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 일예는 케스토스 또는 케스토스를 포함하는 조성물을, 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 장내 마이크로바이옴의 조절 방법 또는 장내 미생물 불균형을 개선하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 의하면, 유효성분인 1-케스토스를 의약품 또는 음식품으로 대상,예를 들면 인간을 포함한 포유동물에 경구로 제공하여, 섭취자의 장내 미생물 군집을 조절하여 장내 미생물 불균형을 개선할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 장내 미생물 불균형의 개선용 조성물 및 장내 유익 미생물의 증식제를 포유동물이 경구 섭취함으로써, 장내에서 장내 유해 미생물의 생육 억제, 장내 유익 미생물의 생육 증진 및 프로피온산 생산균의 생육 증진으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 장내 마이크로바이옴을 조절할 수 있다.

본 발명의 일 예는 케스토스를 유효성분으로 포함하는 조성물의 장내 유익 미생물, 예를 들면 Alistipes 속 미생물 및 락토바실러스 속 미생물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 미생물의 생육 증진 용도 또는 함량 증가 용도에 관한 것이다.

본 발명의 일 예는 케스토스를 유효성분으로 포함하는 조성물의 유해 미생물, 예를 들면 Prevotella 속 미생물의 생육 억제 용도 또는 함량 감소 용도에 관한 것이다.

본 발명의 일 예는 케스토스를 유효성분으로 포함하는 조성물의 프로피온산 생산균의 생육 증진 용도에 관한 것이다. 상기 조성물은 장내 프로피온산의 함량을 증가시킬 수 있다.

본 발명의 일 예는 상기 조성물이 약학적 조성물 또는 식품 조성물일 수 있다. 상기 조성물이 프리바이오틱스 조성물일 수 있으며, 추가로 프로바이오틱스를 포함하여 신바이오틱스(synbiotics)로 사용할 수 있다. 프로바이오틱스(probiotics)란, 체내에서 건강에 좋은 영향을 미치는 미생물을 의미할 수 있다. 프리바이오틱스(prebiotics)란, 유익균을 포함하는 미생물에 의해 이용되어 미생물의 생육이나 활성을 촉진시킴으로써 장내 마이크로바이옴의 불균형을 해소하고 숙주의 건강에 좋은 효과를 나타내게 하는 성분을 의미할 수 있다. 상기 프로바이오틱스 균주 또는 프로바이오틱 미생물(probiotic microorganism)은 살아있는 세포이거나, 비-생존성 세포의 형태일 수 있다.

상기 프로바이오틱 미생물로서 본 발명에 적용 가능한 미생물은, Bifidobacterium 속 미생물, Streptococcus 속 미생물, Saccharomyces 속 미생물, bacillus 속 미생물, Alistipe 속 미생물, 및 Lactobacillus 속 미생물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 프로바이오틱스를 포함할 수 있다.

본 발명에서의 유효성분은 장내 마이크로바이옴의 개선이 필요한 대상에 대해 장내의 Lactobacillus 속 미생물 및 Alistipes 속 미생물로 이루어지는 군에서 1종 이상의 미생물의 증식을 촉진해서 장 내에서 유익한 작용을 하는 세균을 증식시키고, 그 결과, 장내 마이크로바이옴의 개선효과를 가져올 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 케스토스를 포함하며, Lactobacillus 속 미생물과 Alistipes 속 미생물이 증가하고 Prevotella 속 미생물이 감소하며, 이는 SCFA 생산량을 증가시킬 수 있다. 따라서 본 발명에 의하면, 부작용이나 안전성을 거의 걱정하지 않고, 간편하고 효과적으로 대상의 체내 Lactobacillus 속 미생물 및/또는 Alistipe속 미생물을 증가시킬 수 있다. 또한 본 발명에 의하면, 케스토스는, 대상의 체내 Lactobacillus 속 미생물 및/또는 Alistipe 속 미생물을 증가시킴으로써, 장내 환경을 개선시키는 장점이 있다. 또한 케스토스는, 인간이나 동물의 체내의 Prevotella 속 미생물을 감소시킴으로써, 장내 환경을 개선시켜 장내 미생물 균형을 달성할 수 있다.

Alistipe속 미생물은 그람 음성, 막대 모양, 혐기성 및 비-포자 형성 미생물로 분류되며, Alistipes finegoldii, Alistipes putredinis, Alistipes onderdonkii, Alistipes shahii, Alistipes indistinctus, Alistipes senegalensis, Alistipes timonensis, Alistipes obesi, Alistipes ihumii, Alistipes inops, Alistipes megaguti 및 Alistipes provencensis 를 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

Lactobacillus 속 미생물은, L.mucosae, L. salivarius, L.acidophilus, L. plantarum, L.pentosus), L.arizonensis, L. rhamnosus, L.brevis, L.caseii, L.paracasei, L.bulgaricus, L.delbruckii, L.arabinosus, L.caucasicus, L.leishmanni, L.musicus, L.themophilus, L.fermentum 및 L.helveticus 등을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 명세서에서 용어, "미생물총", "마이크로플로라" 및 "마이크로바이옴"은 통상 신체 기관 또는 일부, 특히 대상, 예를 들면 동물 또는 인간의 위장 기관에 서식하는 살아있는 미생물 군집을 의미한다.

상기 미생물의 생육 증진 또는 억제는, 장내 미생물의 함량, 장내 미생물의 대사 산물의 함량, 및/또는 장내 미생물의 상대 풍부도(%, relative abundance(%))로 표시될 수 있다. 본 명세서에서 박테리아 종의 "상대적 풍부도"는 인간의 위장관 미생물총에서 특정 박테리아 종이 해당 박테리아를 제외한 다른 박테리아 종들에 대한 상대적인 풍부도를 의미한다.

본 발명에 따른 조성물의 장내 미생물의 조절은, 장내 Lactobacillus 속 및/또는 Alistipe 속 미생물의 상대 풍부도(%, relative abundance(%))의 증가, 장내 Prevotella 속 미생물의 상대 풍부도(%, relative abundance(%))의 감소를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 분변 내 또는 장내 Lactobacillus 속 미생물, 또는 분변 내 또는 장내 Alistipe 속 미생물의 상대 풍부도(%, relative abundance(%)) 증가분이 5%이상, 또는 7%이상, 예를 들면 5% 내지 100%일 수 있으며, 이는 상기 유효성분을 대상에 섭취 전 수준 100%를 기준으로 105% 이상 또는 107% 이상, 예를 들면 105% 내지 200%일 수 있다.

자세하게는, 발명에 따른 조성물은 분변 내 또는 장내 Lactobacillus 속 미생물의 상대 풍부도(%, relative abundance(%)) 증가분이 50 내지 70%, 50 내지 65%, 또는 50 내지 60%, 및/또는 분변 내 또는 장내 Alistipe 속 미생물의 상대 풍부도(%, relative abundance(%)) 증가분이 5 내지 25%, 5 내지 20%, 또는 5 내지 15%로 달성하는, 케스토스를 유효성분으로 포함하는 조성물일 수 있다. 상기 분변 내 또는 장내 Lactobacillus 속 미생물의 상대 풍부도(%, relative abundance(%))는 상기 유효성분을 대상에 섭취 전 수준 100%를 기준으로 150 내지 170%이며, 상기 분변 내 또는 장내 Alistipe 속 미생물의 상대 풍부도(%, relative abundance(%))는 상기 유효성분을 대상에 섭취 전 수준 100%를 기준으로 105 내지 125%일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 분변이 Prevotella 속 미생물의 상대 풍부도(%, relative abundance(%))의 감소분이 0.5% 내지 2.5%, 0.5 내지 2%, 또는 0.5 내지 1.5%로 감소시키는 케스토스를 유효성분으로 하는 조성물일 수 있다. 상기 분변 내 또는 장내 Prevotella 속 미생물의 상대 풍부도(%, relative abundance(%))는 상기 유효성분을 대상에 섭취 전 수준 100%를 기준으로 97.5 내지 99.5%일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일예는 케스토스를 유효성분으로 함유하는 장내 단쇄 지방산, 예를 들면 프로피온산의 함량을 증가시키는 조성물, 또는 케스토스를 유효성분으로 함유하는 장내 프로피온산 생산균 증식용 또는 증가용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 케스토스를 함유하는 조성물을, 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 단계를 포함하는, 장내 피로피온산의 함량을 증가시키는 방법, 또는 장내 피로피온산 생산균을 증식하는 방법에 관한 것이다.

상기 조성물은 식품 조성물, 건강기능성 식품, 또는 약학 조성물일 수 있다.

상기 분변 내 또는 장내의 프로피온산의 함량 증가는, 장내 프로피온산 생산 미생물의 증식에 의한 것일 수 있다. 상기 미생물의 증식은 장내 미생물의 함량 증가, 프로피온산의 함량 증가, 및/또는 상대적 풍부도 (%, relative abundance(%))의 증가로 표시될 수 있다.

상기 장내 프로피온산 생산 미생물은 본 기술분야에서 알려진 미생물을 포함할 수 있으며, 예를 들면 장내의 Lactobacillus spp. 및 Alistipes spp.으로 이루어지는 군에서 1종 이상의 미생물을 포함할 수 있다.

구체적으로, 본 발명에 따른 실험군 (Advanced Fos: 분말 및 시럽-중농도/고농도) 투여 그룹에서 모두 short-chain fatty acids producing bacteria인 Lactobacillus spp. 와 Alistipes spp. 가 유의적으로 증가되고, Advanced Fos(분말 및 시럽-중농도 및 고농도) 투여 실험군에서 Prevotella spp. 가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다 (시험예 4 참조). Prevotella spp. 는 자가면역질환, 인슐린 저항성, 당뇨, 및 장내 염증 유발과 연관성이 있으며, short-chain fatty acids 생성을 감소시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명의 일 예는 분변 내의 프로피온 산 함량이 100±30mg/L, 150±30mg/L, 200±30mg/L, 250±30mg/L 또는 300±30mg/L 이상인 것을 특징으로 하는 케스토스 함유 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 예는 분변 내의 프로피온산 함량이 섭취 전 수준을 기준으로 100 내지 700%, 100 내지 500%, 100 내지 300%, 130 내지 500%, 130 내지 700%, 150 내지 500%, 150 내지 700%, 150 내지 300% 또는, 130 내지 300% 증가한 것을 특징으로 하는 케스토스 함유 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 예는, 분변 또는 장 내의 부틸산: 프로피온 산의 중량비가 4:1 내지 1:3, 3:1 내지 1:3, 3:1 내지 1:2, 2:1 내지 1:2, 더욱 바람직하게는 1:1 내지 1:2인 것을 특징으로 하는 케스토스 함유 조성물을 제공한다. 해당 비율로 분변 또는 장내 부틸 산 대비 프로피온 산의 비율을 증가시키는 것을 통해 장관내 pH를 산성 환경으로 유지하고, 면역세포를 진정시켜서 염증개선의 효과 극대화를 유도할 수 있다.

본 발명의 추가 일 예는 케스토스를 함유하는 장 질환 및/또는 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기 질환은 면역과민 반응에 의한 질환, 예를 들면 면역과민 반응에 의한 염증성 피부 질환 및/또는 염증성 장 질환일 수 있다. 상기 조성물은 식품 조성물, 건강기능성 식품, 또는 약학 조성물일 수 있다.

본 명세서에 개시된 조성물은 장내 유익균의 증식 또는 생장을 촉진하고 장내 유해균의 증식 또는 생장을 억제하여 장내균총을 개선함으로써 배변 기능, 장 기능을 향상시켜 줄 뿐만 아니라 프리바이오틱스로 작용하여 프로바이오틱스와 병용 시 프로바이오틱스의 효능을 증강시켜 주는 시너지 효과가 있다. 예시적인 일 구현예에서, 상기 조성물은 예를 들면 변비, 설사, 또는 장 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물일 수 있다.

또한, 장내 미생물 불균형 (dysbiosis)은 염증성 질환, 예를 들면 염증성 장 질환 (inflammatory bowel disease, IBD)과 염증성 피부질환과 높은 관련성이 있음은 알려져 있다. 이에, 본 발명에 따른 케스토스를 포함하는 조성물은 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.

염증성 장질환의 발병 메커니즘에 대해서는 유전적 요인이나 환경적 요인 등 여러 가능성이 논의되어 왔지만, 최근 들어 장관 면역(소화관 점막 면역)의 이상이 원인일 가능성이 커져가고 있다. 최근의 연구에서는 어떤 종의 상재균에 대한 비정상적인 면역응답이 만성 염증반응이 되어 나타나고 있을 가능성도 시사되고 있다. 장관 면역의 이상에 의한 장관에서의 염증이나 알레르기의 발증 메커니즘은 환자의 T세포의 기능 및 분화와 병변부나 혈청 중의 사이토카인의 생산 패턴의 해석에 의해 뒷받침되고 있다. 더욱이, 최근에 개발된 각종 염증성 장질환 동물모델(Gastroenterology, Vol.109, p.1344-1367, 1995)의 해석에서도 이 점막 면역의 이상이 장관에 만성 염증을 일으키는 것이 명백해졌다.

본 명세서에서 용어 "대상", "개체", "숙주", 및 "환자"는 본원에서 상호 교환하여 사용될 수 있으며, 인간, 실험실 동물, 가축, 및 가정 애완 동물을 포함한 임의의 동물 대상, 바람직하게는 인간을 지칭한다. 대상은 다양한 미생물을 호스팅할 수 있다. 대상은 질환에 대한 높은 위험이 있는 것으로 진단되거나 또는 의심될 수 있으며, 질환에 기여하는 마이크로바이옴 상태 (즉, 미생물 불균형)를 가질 수 있다.

본 발명에 따른 염증성 질환은, 바람직하게는 면역과민 반응에 의한 염증성 피부 질환 또는 염증성 장 질환일 수 있으며, 상기 염증성 피부 질환은 아토피 피부염, 접촉 피부염, 알레르기성 접촉피부염 등이 있으며, 상기 염증성 장질환은 크론병 (Crohn's disease, CD)과 궤양성 대장염 (ulcerative colitis, UC)을 포함하며, UC는 주로 결장을 표적으로 하는 만성 염증성 질환으로 알려져 있다.

상기 염증성 질환은 면역과민 반응에 의한 염증성 피부 질환 또는 염증성 장 질환일 수 있으며, 실험군(Advanced Fos: 분말 및 시럽-중농도 및 고농도)은 면역반응에서 손상된 면역체계를 복구하는데 기여하고 과도한 면역세포의 활성을 억제하여 아토피 증상을 개선한 것으로 보였다 (시험예 8 참조).

상기 염증성 피부질환, 예를 들면 아토피 피부염은 장내 마이크로바이옴 및 Th1/Th2의 불균형에 의해 발생하는데, 대표적으로 IgE 발현에 관여하는 Th1의 IFN-r의 감소와 Th2의 IL-13의 증가로 인해 AD의 증상이 악화되는 것으로 알려져 있다. 또한, 조직학적 분석에서 호산구(Eosinophil)와 연관이 있는 IL-5, IL-13, TARC, Eotaxin은 호산구 수의 증가, 피부유입 및 탈과립화를 유도하여 염증과 조직손상을 초래한다.

구체적으로, 본 발명에서는 Advanced Fos 그룹은 Lactobacillus spp. 와 Alistipes spp.가 증가하고 Prevotella spp.가 감소하였으며, 이는 SCFA 분비량으로 증가로 검증되며, 이러한 결과는 아토피 피부염을 가진 환자에서 증가하는 Th2 발현량 감소에 영향을 미침을 확인하였다. 또한, 혈액뿐만 아니라 장과 피부의 Th1/Th2 균형을 맞추기 위해 Th1 관련 인자의 발현을 상향조절하고 Th2 관련 인자의 발현을 하향 조절함으로써 AD 증상을 개선하는 것이다.

본 발명은 케스토스를 포함하는 프락토올리고당의 제형별(powder, syrup), 농도별 실험에서, 아토피 피부염(AD)의 개선 효능을 확인하였다.

구체적으로, 아토피 피부염을 유발한 동물 모델에서, 본 발명에 따른 조성물을 투여한 경우 혈청 IgE 함량이 감소하고, IgE 생성에 관여하는 IL-13의 분비량은 감소하고, 호산구(Eosiniphil) 수의 증가와 관련이 있는 TARC의 분비량은 감소하고, 호산구(Eosiniphil)의 피부유입 및 탈과립에 관여하는 Eotaxin의 분비량은 감소하고, Th1/Th2 불균형을 야기하는 IL-4 및 IL-5의 분비량은 감소하였다. 따라서, 실험군(Advanced Fos: 분말 및 시럽-중농도/고농도)의 투여는 사이토카인의 분비를 조절하여 Th2의 면역반응을 억제하여 Th1/Th2의 균형을 회복함으로써 아토피 증상을 개선하였다.

또한, 아토피 피부염을 유발한 동물 모델에서, 본 발명에 따른 조성물을 투여한 경우, TNF-α의 분비량이 상대적으로 증가, Th1 관련 IFN-γ의 분비량이 상대적으로 증가, Th1 관련 IL-12의 분비량이 상대적으로 증가하여, 실험군(Advanced Fos: 분말 및 시럽-중농도/고농도)의 투여는 Th1 관련 사이토카인의 분비를 조절하여 Th1/Th2의 균형을 회복함으로써 아토피 증상을 개선하였다 (도 17참조).

아토피 피부염을 유발한 동물 모델에서, 본 발명에 따른 조성물을 투여한 경우 Treg 관련 Cytokine, 예를 들면 IL-1β 분비량의 감소, Th1/Th2의 불균형을 야기하는 IL-10의 분비량의 감소하여, 투여는 과도한 Treg 면역반응을 억제하여 염증 반응을 억제하고 Th1/Th2 균형을 회복시킴으로써 아토피 증상을 개선하였다.

또한, 본 발명에 따른 조성물을 아토피 피부염을 유발한 동물 모델에 투여하고 아토피 피부염의 중증도 개선 효과를 itching score 및 severity score를평가한 결과, 실험군에서 피부염이 완화된 것을 확인하였다(도 15 참조).

본 발명에 따른 케스토스는 케스토스 단독 또는 이를 포함하는 당 조성물로 사용될 수 있으며, 액상 또는 분말 형태로 사용될 수 있으며, 상기 분말은 비결정 또는 결정일 수 있다. 상기 케스토스는 시판 제품을 구입하여 사용할 수 있거나 소정의 원료를 이용하여 제조한 것을 사용할 수도 있다.

본 발명에 사용 가능한 케스토스는 액상 또는 분말 형태를 모두 사용할 수 있으며, 다양한 함량으로 본 발명에 따른 조성물에 포함될 수 있다.

상기 케스토스는 단독 성분으로 사용하거나, 다른 당류를 함께 포함하는 혼합 조성물로 사용될 수 있다.

상기 케스토스를 함유하는 조성물에서, 액상 또는 분말 형태의 케스토스는 당류 총고형분을 기준으로 50 (w/w)% 이상, 60(w/w) % 이상, 70(w/w) % 이상, 80(w/w) % 이상, 또는 85(w/w) % 이상의 함량을 갖는 조성물, 예컨대 프락토올리고당으로 제공될 수 있다. 또한, 결정 형태의 케스토스는 총고형분을 기준으로 90% 이상, 95% 이상, 또는 98% 이상의 함량을 갖는 조성물일 수 있다.

상기 케스토스를 함유하는 조성물이 프락토올리고당(FOS)일 수 있다. 예를 들면 고함량의 1-케스토스(1-kesotse, GF2)를 포함하고, 니스토스(Nystose, GF3) 및 1-F-프락토퓨라노실니스토스(1-F-Fructosyl nystose, GF4)로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 당류를 추가로 포함할 수 있다. FOS는 β2→1 결합에 의해 수크로오스 분자에 연결된 1 내지 9개의 프럭토오스 잔기를 가진 선형 사슬로 구성되어 있다. 상기 케스토스-함유 프락토올리고당은 1-케스토스 함량이 높을수록 바람직하게, 1-케스토스가 주성분(main component)인 것이 더욱 바람직한다. 예를 들면 고함량의 1-케스토스(1-kesotse, GF2)를 당류 고형분 함량을 기준으로 50중량%이상으로 포함하는 것일 수 있다.

시중에 유통되는 FOS에는 케스토스(1-케스토스)가 총고형분을 기준으로 약 20 내지 35(w/w)% 로 소량 함유되어 있는 제품도 있으나, 본 발명에서는 유효 효과를 나타내는 활성성분인 케스토스(1-케스토스)를 당류 총고형분을 기준으로 50 %(w/w) 이상의 함량으로 함유시켜, 케스토스의 일일 섭취량(투여량)을 효과적으로 조절하는 것이 가능하고, 이를 통해 장내 미생물 군집인 마이크로바이옴 및 미생물 대사물의 조절을 통해 체내대사의 균형을 유도할 수 있다. 낮은 케스토스 함량을 갖는 당 조성물, 예컨대 프락토올리고당을 섭취하는 경우, 본 발명에 따른 유효 함량의 케스토스를 섭취하기 위해서 프락토올리고당의 섭취량이 증가하게 되고, 따라서, 소화기관(설사, 복부팽만감, 복명 등)의 불편함을 느낄 수 있어, 오히려 바람직하지 못한 효과가 발생할 수 있다. 따라서, 높은 케스토스 함량을 갖는 당 조성물, 예컨대 프락토올리고당을 섭취하여, 프락토올리고당의 과량 섭취로 인한 바람직하지 못한 문제를 낮추고, 더욱이 본 발명에 따른 유효 함량의 케스토스 섭취를 용이하게 달성하여 효능을 더욱 증대시킬 수 있다.

본 발명에 사용 가능한 케스토스 또는 케스토스를 포함하는 당 조성물은 특별히 제한이 없으며, 통상 케스토스 전환 활성을 가지는 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 설탕을 기질로 하여 제조할 수 있다. 상기 제조된 케스토스 함유 산물을 그대로 사용하거나, 추출 및 정제하는 공정을 수행하여 케스토스 함량을 증가시킨 당 조성물로 사용할 수도 있다.

상기 케스토스 전환 활성을 가지는 효소는, 설탕을 포함하는 기질로부터 케스토스를 함유하는 프락토올리고당을 전환하는 활성을 가지는 효소로, 예를 들어 아스페르길루스 니제르 (Aspergillus niger) 균주, 피키아 파리노사 (Pichia farinose) 균주, 야로이야 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 밀레로지마 파리노사 (Millerozyma farinose), 및 아스페르길루스 오리제 (Aspergillus oryzae) 균주로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상에서 유래된 효소일 수 있다.

케스토스를 함유하는 의약품이나 의약부외품, 서플리먼트의 제형은 특별하게 한정되지 않고, 투여방법에 적합한 제형을 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들면 경구투여의 경우에는, 가루약, 정제, 당의제, 캡슐제, 과립제, 드라이 시럽제, 물약(液劑), 시럽제, 드롭제, 드링크제 등의 고형 또는 액상 제형으로 할 수 있다.

상기 케스토스 조성물에서 유효성분으로 케스토스를 60 kg 성인을 기준으로 하루 총 섭취량이 2 내지 30 g, 2 내지 27 g, 2 내지 26 g, 2 내지 25 g, 2 내지 24 g, 2 내지 20 g, 2 내지 15 g, 2 내지 10 g, 또는 2 내지 8 g 일 수 있다. 이러한 섭취량은, 1일 1회에 한하지 않고 복수 회로 분할하여 섭취할 수 있다. 상기 케스토스 또는 이를 포함하는 프락토올리고당의 섭취에 따른 정장작용, 장기능 개선, 칼슘흡수의 증진기능과 “더부룩한 느낌”의 부작용 등을 고려하여 적절한 함량으로 설정할 수 있다.

또한 상기 케스토스 조성물은, 케스토스, 니스토즈, 및 프락토퓨라노실니스토즈를 합한 양으로 400 mg/ g이상, 500 mg/ g이상, 800 mg/ g이상, 또는 900 mg/ g이상 함유하는 조성물일 수 있다. 상기 케스토스 조성물은, 니스토즈, 및 프락토퓨라노실니스토즈의 합계 중량에 대한 케스토스의 함량 중량비가 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 5:1, 1:1 내지 3:1, 또는 1:1 내지 2:1 인 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 케스토스를 유효성분으로 하는 조성물을 투여 또는 섭취하는 대상 또는 개체는 사람을 포함한 동물이며, 예를 들면 사람, 마우스, 래트, 원숭이등을 포함한다.

본 발명에 따른 케스토스를 유효성분으로 하는 조성물은, 식전, 식후 또는 식사와 동시에 섭취할 수 있으며, 특별히 섭취 조건을 한정하는 것은 아니다. 상기 케스토스를 유효성분으로 하는 조성물을, 염증성 질환의 개선, 장기능 개선 또는 장내 미생물 군집 또는 환경 변화를 달성하는 데 유효한 기간 동안 섭취할 수 있으며, 예를 들면 4주 이상, 8주 이상, 또는 15주 이상, 예컨대 4주 내지 20 주(weeks)기간 섭취하는 방법일 수 있다. 본 발명에 따른 조성물을 단 회 섭취하는 것만으로도 유효한 효과를 도출할 수 있지만, 2회 이상 섭취할 수 있다.

상기 케스토스를 유효성분으로 하는 조성물의 섭취를 위한 제제 단위는, 예를 들면 개별 섭취량의 1, 2, 3 또는 4배를 함유하거나 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유하도록 제조될 수 있다. 개별 섭취량은 바람직하기로는 유효 성분의 1일 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당하는 양으로 제제화되어 분할 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 케스토스를 포함하는 조성물은 식품 조성물 또는 약학 조성물일 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법， 투여 방식， 환자의 연령， 체중， 성， 병적 상태， 음식， 투여 시간, 투여 경로，. 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명에 따른 케스토스를 유효성분으로 하는 조성물은 식품, 식품 첨가제, 음료, 음료 첨가제, 건강 식품, 또는 기능성 식품일 수 있다. 본 발명에서 "건강기능식품' '이라 함은 건강기능식품에 관한 법률에 따라 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 (가공을 포함함)한 식품을 말하며， "기능성' '이란 인체의 정상적인 기능을 유지하거나 생리기능 활성화를 통하여 건강을 유지하고 개선하는 둥과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻는 것을 말한다. 상기 케스토스를 일반식품에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조할 수 있다. 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오고 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하였기 때문에 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

본 발명의 케스토스를 식품 첨가물로 사용할 경우에는, 상기 케스토스를 그대로 첨가하거나, 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용하거나, 그 외의 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 케스토스 또는 케스토스를 포함하는 조성물은 그대로 혹은 음식물이나 의약품의 형태로 대상, 예를 들면 인간 또는 동물에게 경구 섭취시키는 방법으로 투여될 수 있다.

케스토스(1-케스토스)는, 각종 음식물이나 식품첨가물, 동물사료의 통상의 제조과정에 첨가하여 사용할 수 있다. 1-케스토스의 감미도는 30으로, 그 미질(quality of taste))·물성·가공성은 자당에 가깝기 때문에, 각종 음식물의 제조과정에 있어서 설탕의 일부 또는 전부를 1-케스토스로 치환하는 등, 설탕과 마찬가지로 취급하여 각종 음식물, 음료, 식품 첨가물, 의약, 또는 사료에 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물의 구체적인 태양으로서는, 예를 들면 음료, 유제품, 식용으로 제공하는 과립, 페이스트, 조미료, 레토르트식품, 베이비푸드(baby food), 발효식품, 보존식, 수산가공품, 식육가공품, 곡식가공품 등의 가공식품, 식품첨가물, 건강식품, 동물사료 등을 들 수 있다.

본 발명은 부작용이나 안전성을 거의 걱정하지 않고, 간편하고 또한 효과적으로 인간이나 동물의 유익한 장내 미생물을 증가시키고, 유해한 미생물을 감소시킴으로써, 장내 마이크로바이움의 불균형을 개선시키는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 의하면, 부작용이나 안전성을 거의 걱정하지 않고, 간편하고 또한 효과적으로 인간이나 동물의 장내 단쇄지방산 중 프로피온산 또는 프로피온산 생산 균주를 증가시킴으로써 장내 환경을 개선시키는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 일 예에 따라 동물 모델을 이용하여 장내 미생물에 미치는 케스토스 영향 분석을 위한 실험 프로토콜이다.
도 2는 본 발명의 일 예에 따라 실험 동물 모델의 체중 변화를 측정한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 예에 따라 실험 동물 모델의 장내 미생물에 대한 alpha-diversity 분석을 통한 장내 미생물의 종 (species) 다양성을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 예에 따라 실험 동물 모델의 장내 미생물에 대한 beta-diversity 분석을 통한 장내 미생물의 그룹 간 차이를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 예에 따라 연구기간 8, 12주, 및 16주 차에 수집한 동물 모델의 분변 시료를 이용하여 장내 미생물 군집의 phylum profiling 결과를 나타낸다.
도 6은 본 발명의 일 예에 따라 연구기간 16주 차에 수집한 동물 모델의 분변 시료를 이용하여 장내 미생물 군집의 phylum profiling 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 예에 따라 연구기간 8, 12주, 및 16주 차에 수집한 동물 모델의 분변 시료를 이용하여 장내 미생물 군집의 heatmap 분석을 통한 top30 genus profiling 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 예에 따라 연구기간 16주 차에 수집한 동물 모델의 분변 시료를 이용하여 장내 미생물 군집의 heatmap 분석을 통한 top30 genus profiling 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 예에 따라 실험군 투여에 의한 Lactobacillus spp.의 유의적 증가를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 일 예에 따라 실험군 투여에 의한 Alistipe spp.의 유의적 증가를 나타낸다.
도 11은 본 발명의 일 예에 따라 실험군 투여에 의한 Prevetella spp.의 유의적 감소를 나타낸다.
도 12는 본 발명의 일 예에 따라 연구기간 16주 차에 수집한 동물 모델의 분변 시료를 이용하여 실험군 투여에 따른 부티르산 (Butyric acid) 함량의 변화를 측정한 결과이다.
도 13은 본 발명의 일 예에 따라 연구기간 16주 차에 수집한 동물 모델의 분변 시료를 이용하여 실험군 투여에 따른 아세트산 (Acetic acid) 함량의 변화를 측정한 결과이다.
도 14는 본 발명의 일 예에 따라 연구기간 16주 차에 수집한 동물 모델의 분변 시료를 이용하여 실험군 투여에 따른 프로피온산 (Propionic acid) 함량의 변화를 측정한 결과이다.
도 15는 본 발명의 일 예에 따라 Total score(itching 및 severity)를 통한 아토피 피부염의 중증도 개선 평가 결과이다.
도 16은 본 발명의 일 예에 따라 실험동물의 혈청 IgE 분비량의 분석 결과이다.
도 17은 본 발명의 일 예에 따라 실험동물의 혈청 TNF-α, IFN-γ, 및 IL-12의 분비량의 분석 결과이다.
도 18은 본 발명의 일 예에 따라 실험동물의 혈청 L-4, IL-5, IL-13, TARC, 및 Eotaxin의 분비량의 분석 결과이다.
도 19은 본 발명의 일 예에 따라 실험동물의 혈청 IL-1β 및 IL-10의 분비량의 분석 결과이다.
도 20은 본 발명의 일 예에 따라 Flow cytometry로 분석한 비장세포(splenocytes)의 CD86 발현량을 나타내는 도면이다.
도 21은 본 발명의 일 예에 따라 Flow cytometry로 분석한 비장세포(splenocytes)의 CD274 발현량을 나타내는 도면이다.
도 22는 본 발명의 일 예에 따라 실험동물의 피부조직 내 비만세포 수 (mast cell count)를 측정한 결과이다.
도 23은 본 발명의 일 예에 따라 실험동물의 피부조직 내 호산구 수 (eosinophil count)를 측정한 결과이다.
도 24는 본 발명의 일 예에 따라 실험동물의 장조직 내 비만세포 수 (mast cell count)를 측정한 결과이다.

본 발명을 하기 실시예를 들어 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.

제조예 1: 동물모델 구축

본 실험에서 동물모델 구축 및 식이 투여 실험의 전반적인 스케줄을 도 1에 표시하였다.

구체적으로, 아토피 피부염(Atopic dermatitis)을 갖는 동물 모델을 구축하고자, 5주령 암컷 balb/c 마우스를 그룹별로 6마리씩 분리하였고 1주일간 적응시켰다. 음성대조군(Neg)을 제외한 모든 그룹에 대하여 OVA/Al(OH)3 혼합액은 OVA와 Alum(Sigma Aldrich)를 PBS에 녹여 제조하였으며, 아토피 유도 시작일로부터 7, 21, 35, 49일에 총 4번 복강에 투여(2주에 1회, 총 4번을 투여하여 8주간 유도하였다. 또한 8주간 지속적으로 Balb/c 마우스의 등을 제모하고, 등 피부에 지속적으로 OVA/Al(OH)3를 접촉하여 AD를 유도하였다. 이에 상기 아토피 피부염이 유도된 실험동물을 이후 실험에서 실험군 동물모델로 사용하였다.

음성 대조군은 5주령 암컷 balb/c 마우스를 그룹별로 6마리씩 분리하였고 1주일간 적응시켰다. 이후 상기 (1)아토피 동물모델 구축과 유사하나, OVA/Al(OH)3 혼합액을 이용한 8주간 아토피를 유도하지 않고 이후 투여 기간 동안 실험군과 동일한 용량의 PBS를 경구투여 하였다.

양성 대조군은 5주령 암컷 balb/c 마우스를 그룹별로 6마리씩 분리하였고 1주일간 적응시켰다. 이후 상기 아토피 동물모델 구축과 유사하게 8주간 OVA/Al(OH)3를 통해 아토피를 유도하였으며 투여 기간 동안 실험군과 동일한 용량의 PBS를 경구투여 하였다.

상기 실험군, 음성 대조군 및 양성 대조군로 사용될 실험동물로부터 전체 연구 기간 동안 8, 12주, 및 16주 차에 분변 시료를 수집하여 추후 마이크로바이옴 및 SCFA 분석에 활용하였다. 또한, 실험종료 시 맹장 대변 시료를 수집하여 미생물총 프로파일링 및 대사체 분석에 활용하였다.

비교예 1 및 2: maltose 식이 실험

Maltose 식이 동물모델은 실시예 1에서 8주간 OVA/Al(OH)₃를 통해 아토피를 유도한 후 동일 식이로 진행한 실험군 동물모델이며, Maltose 식이는 투여 기간 동안 말토오스(㈜ 대상, 제품명: 말토오스D)를 마우스 1마리 기준 농도로 200ul의 PBS에 녹여 동일농도로 경구투여하여 사용하였다.

구체적으로, 비교예 1-1은 Maltose-중농도 8g/day 비율 적용하고, 비교예 1-2는 Maltose-고농도는 16g/day 비율로 적용하였다.

비교예 3 및 4: 저함량 케스토스 함유 FOS 분말 식이 실험

FOS를 투여한 실험군은 8주간 OVA/Al(OH)₃를 통해 아토피를 유도한 후, 투여 기간 동안 FOS를 케스토스 함량(33%) 대비 마우스 1마리 기준으로 200ul의 PBS에 녹여 경구 투여를 위한 시료로 제조하였다.

상기 저함량 케스토스 함유 FOS 분말은 총고형분 기준 프락토올리고당 함량이 95%이며, 상기 프락토올리고당에 포함된 케스토스 함량은 33 중량%이었으며, 이에 상기 식이 분말은 총고형분 기준 31.35 중량%의 케스토스를 함유한 것이다.

각 시료를 PBS에 용해한 용해액을 2가지 투여량으로 나누어 실험을 수행하였으며, 1일 2회 투여를 하며, 성인 기준(60kg)으로 비교예 3은 8g/day 중농도 그룹 및 비교예 4는 16g/day 고농도 그룹을 각각 적용하여 8주 동안 투여하였다.

고농도 및 중농도 식이는 동일 조성의 식이를 1일 투여량에 따라 구분한 것으로서, 중농도 그룹은 8g/day 투여량, 고농도 그룹은 16g/day 투여량으로 적용하였다.

그룹	그룹 설명	제형
음성대조군	Negative	PBS
양성대조군	Positive	PBS
비교예 1	Maltose-중농도 8g/day 비율 적용	분말
비교예 2	Maltose-고농도 16g/day 비율 적용	분말
비교예 3	저함량 케스토스 FOS-중농도 8g/day 비율 적용	분말
비교예 4	저함량 케스토스 FOS-고농도 16g/day 비율 적용	분말
실시예 1	Advanced Fos-중농도 8g/day 비율 적용	분말
실시예 2	Advanced Fos-고농도 16g/day 비율 적용	분말
실시예 3	Advanced Fos-중농도 8g/day 비율 적용	시럽
실시예 4	Advanced Fos-고농도 16g/day 비율 적용	시럽

실시예 1 및 2: 고함량 케스토스 함유 FOS 분말 식이 실험

고함량 케스토스 함유 FOS 분말을 투여한 실험군은 8주간 OVA/Al(OH)3를 통해 아토피를 유도한 후 투여 기간 동안, 마우스 1마리 기준 농도로 200ul의 PBS에 고함량 케스토스 함유 FOS 분말을 용해하여 경구 투여를 위한 시료로 제조하였다.

본 실시예에 사용한 고함량 케스토스 함유 FOS 분말은 총고형분 기준 프락토올리고당 함량이 91.2%이며, 상기 프락토올리고당에 포함된 케스토스 함량은 85.5 중량%이었으며, 이에 상기 식이 분말은 총고형분 기준 77.98 중량%의 케스토스를 함유한 것이다.

각 시료를 PBS에 녹여 투여하며, 2가지 투여량으로 나누어 실험을 수행하였으며, 1일회 2회 투여를 하며, 성인 기준(60kg)으로, 실시예 1은 중농도 그룹의 8g 투여량 및 실시예 2는 고농도 그룹의 16g 투여량을 각각 8주 동안 투여하였다.

상기 비교예 3과 실질적으로 동일한 방법으로 동물모델에 식이를 급여하였으나, 다만 비교예 3의 FOS 분말을 대신하여 본 발명에서 제조한 고함량 케스토스 함유 FOS 분말을 급여하였다.

실시예 3 및 4: 고함량 케스토스 함유 FOS 시럽 식이 실험

고함량 케스토스 함유 FOS 시럽을 투여한 실험군은 8주간 OVA/Al(OH)3를 통해 아토피를 유도한 후, 투여 기간 동안 고함량 케스토스 함유 FOS 시럽을 총 고형분(89.9%) 및 케스토스 함량(85.6%), FOS 시럽의 고형분(75.3%) 대비 마우스 1마리 기준의 농도로 200ul의 PBS에 녹여 녹여 경구 투여를 위한 시료로 제조하였다.

본 실시예에 사용한 고함량 케스토스 함유 FOS 시럽은 총고형분 기준 프락토올리고당 함량이 91.2%이며, 상기 프락토올리고당에 포함된 케스토스 함량은 89.9 중량%이었으며, 이에 상기 식이 분말은 총고형분 기준 81.998 중량%의 케스토스를 함유한 것이다.

각 시료를 PBS에 녹여 투여하며, 2가지 투여량으로 나누어 실험을 수행하였으며, 1일회 2회 투여를 하며, 성인 기준(60kg)으로, 실시예 3은 8g 투여량을 갖는 중농도 그룹 및 실시예 4는 16g 고투여량을 갖는 고농도 그룹으로 8주 동안 투여하였다.

상기 비교예 3과 실질적으로 동일한 방법으로 동물모델에 식이를 급여하였으나, 다만 비교예 3의 FOS 분말을 대신하여 본 발명에서 제조한 고함량 케스토스 함유 FOS 시럽을 급여하였다.

시험예 1: 마우스 체중 증가량 및 식이 섭취량 확인

투여기간 동안 각 실험군 투여에 따른 마우스의 체중변화를 기록하였으며, 마우스 무게 측정은 매주 경구투여를 하기 전 동일한 시간대에 진행하였다.

프락토올리고당 섭취에 따른 비만 여부를 확인하기 위해 투여기간 동안 각 실험군 투여에 따른 마우스의 식이섭취량을 확인하였고, 매주 동일한 시간대에 식이섭취량을 확인하였다.

도 2는 실험군 투여에 따른 실험 동물 모델의 체중 변화에 대한 결과이며 양성대조군 및 비교예 1 및 2에 따른 Maltose 투여군에서는 아토피 유발에 의해 체중 증가량이 감소한 것을 보였다. 실시예 1 내지 4에 따른 실험군의 경우 체중 증가량이 음성 대조군과 비슷한 수치를 보이므로, 아토피에 대한 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced FOS의 개선 효과에 따라 체중 증가량을 회복한 것이다.

시험예 2: 장내 마이크로바이옴의 종 다양성 분석

(1)분변 시료의 미생물 군집 분석

비교예 1 내지 4와 실시예 1 내지 4의 시료를, 제조예 1의 실험동물에 대해, 전체 연구 기간 동안 8, 12주, 및 16주 차에 분변 시료를 수집하였다. 상기 수집된 8주 12주 16주 분변 샘플을 DNA soil kit를 사용하여 DNA를 추출하였다.

180개의 DNA는 Illumina Miseq platform을 통해 염기서열을 분석하였으며 총 13,117,845개의 16S rRNA sequence read count를 얻었고, 샘플 당 평균 85,737 reads를 읽었으며, 모든 그룹은 2500이상의 read수를 얻었다. 16S rRNA sequences는 qiime2 파이프라인을 사용하여 분석하였으며, 5'이나 3'끝쪽의 시퀀스가 없거나 불분명한 시퀀스는 제거하였다. 250bp가 안되는 트림 시퀀스 (trimmed sequences)를 제거하였고, 키메라 (chimera) 시퀀스는 qiime2 파이프라인의 키메라를 이용해서 제거하였다. 이를 통해 샘플의 각 시퀀싱 리드를 동정하여 미생물 군집 구조를 볼 수 있다.

샤넌 인덱스 (Shannon index), 심슨(Simpson index) 및 인벌스심슨(InvSimpson index)은 장내 마이크로바이옴의 종 다양성 분석 (alpha-diversity)을 위해 계산되었으며. 종 군집 다양성 (beta-diversity)분석을 위해 브레이-커티스 거리 메트릭스 (Bray-Curtis distance metrics)를 사용한 Adonis분석을 통해 군집분석하였다. R software (version 4.0.3)를 통해 그래프를 시각화하였다.

(2) 장내 마이크로바이옴의 종 다양성 및 그룹간 차이 분석

장내 마이크로바이옴의 종 다양성 및 그룹간 차이를 분석하고자, 비교예 1 내지 4와 실시예 1 내지 4의 실험동물에 대해, 연구 기간 16주 차에 얻은 분변 시료를 로우 퀄리티 시퀀스를 제거하고 평균 시퀀싱이 85,737인 것으로 확인하였다. 아토피 유도 마우스인 양성 대조군과 음성 대조군의 유사성을 검사하기 위해 장내 미생물의 종 다양성 (alpha-diversity)을 확인하였다. 알파 다양성 결과는 샤넌(Shannon), 심슨(Simpson), 인벌스심슨(InvSimpson) 다양성 지수가 그룹 간의 차이가 없음을 보였다(도 3).

하지만 미생물 베타 다양성 (Beta-diversity)에서는 각 그룹별 군집이 나눠지는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 양성대조군과 maltose 그룹이 오른쪽에 있지만, 실험그룹은 음성대조군과 유사하게 변화되는 것을 볼 수 있었다(도 4).

시험예 3: 장내 마이크로바이옴 profiling 확인

비교예 1 내지 4와 실시예 1 내지 4의 실험동물에 대해, 전체 연구 기간 동안 8, 12주, 및 16주 차에 분변 시료를 수집하였다. 상기 수집된 8주 12주 및 16주 분변 샘플을 DNA soil kit를 사용하여 DNA를 추출하였다. 상기 DNA 시료를 이용하여 8주, 12주, 16주에 대한 대조군과 실험군 투여 그룹 간의 장내 마이크로바이옴의 프로파일링(profiling) 분석을 수행하였다.

마이크로바이옴은 생물의 계통과 종속을 특정 기준에 따라 기초하여 정리하는 분류학 (Taxonomy)으로 지정할 수 있다. 그룹별 8주, 12주 및 16주차 시료에 대해 문 (Phylum) 수준에서 확인하였다. 8주, 12주, 및 16주차 시료의 문 (Phylum) 수준에서 박테로이데테스(Bacteroidetes) 및 퍼미큐티스(Firmicutes)가 전반적으로 모든 그룹에서 우세함을 확인하였다(도 5).

또한, 16주 시료의 문 (Phylum)수준에서 양성 대조군과 비교했을 때, 실시예 2의 Advanced Fos 분말 고농도 투여 그룹과 실시예 4의 Advanced Fos 시럽 중농도 및 고농도 투여 그룹에서 퍼미큐티스(Firmicutes)가 증가했으며, 박테로이데테스(Bacteroidetes)가 감소하였다.

더 자세하게는, 양성 대조군 (1.83% ± 0.05)과 비교하였을 때, Firmicutes: Bacteroidetes의 상대적 풍부도 비율 (relative abundance ratio)이 실시예 2의 고함량 케스토스 함유 FOS 분말 고농도 투여 그룹(2.72% ± 0.15, p = 0.0048)과 실시예 3의 고함량 케스토스 함유 FOS 시럽 중농도 투여 그룹 및 실시예 4에 따른 고함량 케스토스 함유 FOS 시럽 고농도 투여 그룹(중농도; 2.42% ± 0.15, p = 0.0245, 고농도; 3.34% ± 0.15, p < 0.0001)에서 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다.

양성 대조군과 비교예 1 및 2의 maltose 그룹(비교예 1의 중농도; 2.11% ± 0.07, p = 0.2184, 비교예 2의 고농도; 1.58% ± 0.10, p = 0.26)에서는 유의적 차이가 없었다(도 6).

요약하면, Phylum 수준에서는 Bacteroidetes와 Firmicutes가 우점하는 것을 확인하였으며, 16주차에서는 양성대조군, 비교예 1 및 2의 Maltose 그룹과 달리, 실시예 1 내지 실시예 4의 실험군 투여 그룹에서는 Firmicutes가 Bacteroidetes 보다 상대적으로 증가되는 것을 확인하였다. 실시예 1의 고함량 케스토스 함유 Fos 분말 중농도 그룹은 Bacteroidetes의 비율이 감소되지 않는 것으로 확인되었으나, genus profiling을 통해 Alistipes 등의 유의적 증가와 연관된 것을 확인하였다.

Top30을 통한 속(genus) 수준에서 heatmap분석을 통해 그룹별 16주차 시료의 장내 미생물을 확인하였다. Genus 수준에서는 Lactobacillus, Alistipes, Prevotella, Muribaculum, Bacteroides 등이 장내 우점종인 것을 확인하였다. 더욱 자세히는, 락토바실러스(Lactobacillus), 뮤리바큘럼(Muribaculum), 알리스티페스 (Alistipes), 박테로이데스(Bacteroides) 및 프리보텔라(Prevotella) 4개의 속(Genus)이 우세하였다. Lactobacillus는 정상 대조군과 실시예 4의 Advanced Fos 시럽 고농도 투여 그룹 (63.70% ± 2.31, p = 0.0022)에서 높은 점유율을 확인하였다. 반면, 실시예 2의 Advanced Fos 분말 중농도 투여 그룹은 Alistipes에서 실시예 3의 Advanced Fos 시럽 중농도 및 실시예 4의 Advanced Fos 시럽 고농도 투여 그룹보다 크게 증가되는 것을 시각적으로 확인하였다(도 7, 및 도 8).

시험예 4: SCFA 생산 박테리아 분석

(1)시험군 투여에 의한 SCFA-producing bacteria의 증가

비교예 1 내지 4와 실시예 1 내지 4의 실험동물에 대해, 연구 기간 16주 차에 얻은 분변 시료에서 양성 대조군과 maltose 그룹과 비교하였을 때, 실시예 1 내지 실시예 4에 따른 실험군 (Advanced Fos: 분말 및 시럽-중농도/고농도) 투여 그룹에서 모두 short-chain fatty acids producing bacteria인 Lactobacillus spp. 와 Alistipes spp. 가 유의적으로 증가되는 것을 확인하였다.

(2) Lactobacillus spp.

Lactobacillus spp. 는 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos 분말 고농도와 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos 시럽 중농도/고농도 투여 그룹에서 유의적으로 크게 증가되는 것을 확인하였다. Lactobacillus spp. 는 8주, 12주, 16주에 걸쳐 서서히 증가하는 양상을 보이는 것을 확인하였다.

특히, 16주에서는 양성대조군(39.61% ± 4.61) 비교했을 때, 실시예 2에Advanced 따른 Fos 분말 고농도(63.70% ± 2.31, p = 0.0022)와 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos 시럽 중농도/고농도 투여 그룹(중농도; 58.91% ± 3.28, p = 0.0043, 고농도; 66.31% ± 4.35, p = 0.0022)은 유의하게 증가되는 것을 확인하였다. 양성대조군과 비교예 1 및 2에 따른 maltose 그룹(중농도; 40.71% ± 5.48, p = 0.8571, 고농도; 35.85% ± 0.61, p = 0.0905)에서는 유의적 차이가 없었다. Lactobacillus spp. (family Lactobacillaceae, phylum Firmicutes)는 short-chain fatty acid 생성 bacteria로써, 장에 유익한 균주로 알려져 있다.

(3) Alistipes spp

Alistipes spp. 는 8주와 12주에서 크게 차이가 없다가 16주차에 유의적으로 증가된 것을 확인하였다. 실시예 1에 따른 Advanced Fos 분말 중농도 그룹은 Alistipes spp.에서 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos 시럽 중농도/고농도 투여 그룹보다 크게 증가되는 것을 확인하였다. 특히, 16주에서는 양성대조군(3.47% ± 0.99) 비교했을 때, 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos 분말 중농도/고농도 (중농도; 14.73% ± 1.43, p = 0.0043, 고농도; 14.38% ± 1.97, p = 0.0043)와 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos 시럽 중농도/고농도 투여 그룹(중농도; 8.74% ± 0.40, p = 0.0095, 고농도; 6.59% ± 0.25, p = 0.0152)은 유의하게 증가되는 것을 확인하였다. 양성 대조군과 비교예 1 및 2에 따른 maltose 그룹(비교예 1의 중농도; 4.22% ± 1.51, p = 0.4429, 비교예 2의 고농도; 1.76% ± 0.43, p = 0.6095)에서는 유의적 차이가 없었다. Alistipes spp. (family Rikenellaceae, phylum Bacteroidetes)는 short-chain fatty acid 생성 bacteria로서, 장에 유익한 균주로 알려져 있다.

(4) Prevotella spp.

양성 대조군과 비교예 1 및 2의 maltose 그룹과 비교하였을 때, 실시예 1 내지 실시예 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽-중농도 및 고농도) 투여 실험군에서 Prevotella spp. 가 유의적으로 감소하는 것을 확인하였다. 특히, 16주에서는 양성대조군(5.37% ± 1.40) 비교했을 때, 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos 분말 중농도/고농도 (실시예 1의 중농도; 1.56% ± 0.37, p = 0.0043, 실시예 2의 고농도; 0.90% ± 0.35, p = 0.0043)와 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos 시럽 중농도/고농도 투여 그룹(실시예 3의 중농도; 1.58% ± 0.36, p = 0.0087, 실시예 4의 고농도; 1.69% ± 0.33, p = 0.0043)은 유의하게 감소되는 것을 확인하였다. 양성대조군과 maltose 그룹(중농도; 2.80% ± 0.16, p = 0.1077, 고농도; 4.31% ± 0.47, p = 0.8571)에서는 유의적 차이가 없었다. Prevotella spp. 는 자가면역질환, 인슐린 저항성, 당뇨, 장내 염증 유발과 연관성이 있으며, short-chain fatty acids 생성을 감소시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

시험예 5: 장내 대사산물(SCFA) 분석

(1)분변 내 부티르산(Butyrate) 함량 측정

대변 샘플(100mg)을 5ug/ml의 caproic acid(Sigma-Aldrich)이 함유된 NaOH에 균질화 하고 20분간 원심분리(12,000g, 4℃)하였다. 상층액을 Tube(Corning, USA)에 옮기고 HPLC 분석 전까지 -80℃에서 보관하였다. SCFA는 Aminex 87H column (300×10mm; Bio-Rad, USA)를 활용하여 분석되었으며 butyric acid은 RI-detector(ERC, RefractoMax 520, Japan)을 사용하여 검출하였다.

비교예 3 및 4에 따른 저함량 케스토스 함유 Fos(분말)과 실시예 1 및 2에 따른 고함량 케스토스 함유 Advanced Fos(분말), 실시예 3 및 4에 따른 고함량 케스토스 함유 Advanced Fos 시럽을 투여한 실험군에서 16주에 분변 내 butyrate 함량이 높게 측정되었으며, 음성대조군(Neg)과 비슷한 수치를 보였다.

도 12는 실험군 투여에 따른 마우스 분변 샘플 내 Butyric acid 함량을 비교한 그래프이며 그 결과, 16주차에서 양성 대조군과 비교예 1 및 2의 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 butyric acid의 함량은 각각 32.2±4.9mg/L, 45.5±3.9mg/L, 29.5±3.5mg/L인 반면, 실시예 1 내지 4에 따른 실험군(Advanced Fos: 분말 및 시럽-중농도/고농도)은 각각 172.8±5.8mg/L, 232.6±43.2mg/L, 188.1±27.4mg/L, 또는 221.9±23.9mg/L로 유의적인 증가를 보였다. Butyric acid는 내재면역 및 장 건강 유지에 중요하며 염증 억제에 관여하므로, 실시예 1 내지 4에 따른 실험군(Advanced Fos: 분말 및 시럽-중농도/고농도)의 섭취는 면역반응과 장 건강을 정상 수준까지 회복함으로써 아토피 질환을 개선하였다.

(2)분변 내 아세트산 (Acetate) 함량 측정

상기 시험예 5-(1)과 동일한 방법으로 대변 샘플에서 acetic acid의 함량을 측정하였다.

도 13은 실험군 투여에 따른 마우스 분변 샘플 내 Acetic acid 함량을 비교한 그래프이며 비교한 결과, 16주차에서 양성 대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 Acetic acid의 함량은 각각 296.1±40.4mg/L, 304.9±46.3mg/L, 277.1±20.8mg/L인 반면, 실시예 1 내지 4에 따른 실험군(Advanced Fos: 분말 및 시럽-중농도/고농도)은 각각 471.1±38.0mg/L, 561.2±75.4mg/L, 561.0±29.7mg/L, 653.4±103.7mg/L로 유의적인 증가를 보였다.

(3) 분변 내 프로피온산 (Propionic acid) 함량 측정

시험예 5-(1)과 동일한 방법으로 대변 샘플에서 propionic acid의 함량을 측정하였다.

도 14는 실험군 투여에 따른 마우스 분변 샘플 내 Propionic acid 함량을 비교한 그래프이며, 그 결과 16주차에서 양성대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 Propionic acid의 함량은 각각 28.1±2.7mg/L, 96.1±17.2mg/L, 42.8±6.2mg/L인 반면, 실시예 1 내지 4에 따른 실험군(Advanced Fos: 분말 및 시럽-중농도/고농도)은 각각 112.1±19.2mg/L, 158.2±35.6mg/L, 143.2±12.7mg/L, 211.5±19.6mg/L로 유의적인 증가를 보였다.

시험예 6: 아토피 피부염 중증도 개선 평가

OVA/Al(OH)3로 아토피 유도를 완료한 시기(8주)와 실험군 투여를 완료한 시기(16주)에 15분 간 마우스의 긁는 횟수를 측정하였다. 또한 피부염의 중증도는 건조, 홍반, 각질의 증상을 기준으로 0(없음), 1(경도), 2(보통), 3(심함)의 심각도 점수를 적용하여 수치화 하였으며 최종 점수는 긁는 횟수와 중증도 점수를 합산하였다.

도 15는 실험군 투여에 의한 아토피 피부염의 중증도 개선 효과를 itching score 및 severity score 등으로 수치화하여 비교한 그래프로서, 비교예 3 및 4에 따른 저함량 케스토스 함유 Fos(분말)에 비해 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 피부염이 완화된 것을 확인하였으며, 특히, 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos를 투여한 실험군에서 개선 효과가 뛰어난 것을 확인하였다.

시험예 7: 실험동물의 혈청학적 분석

실험군 투여 종료일에 희생시킨 마우스로부터 혈액을 수득함. 혈액을 4℃에서 1시간 보관하고 5,000xg에서 1시간 동안 원심분리하여 혈청을 분리하였다.

혈청 IgE 및 Cytokine(TNF-α, IFN-γ, IL-12, IL-4, IL-5, IL-13, TARC, Eotaxin, IL-1β, IL-10) 분석은 ELISA kit(R&D systems, USA)의 제조업체 지침에 따라 수행하였으며 흡광도는 microplate reader(Tecan, Mδnnedorf, Switzerland)를 사용하여 450nm에서 측정하였다.

도 16은 AD 유발 및 실험군 투여에 의한 혈청 IgE 분비량을 분석한 그래프로써 비만세포를 자극하여 AD의 증상을 악화하는 IgE의 분비량을 비교한 결과, 양성대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 IgE 분비량은 각각 16.7±1.8pg/ml, 16.4±1.1pg/ml, 13.13±1.3pg/ml의 수준을 보인 반면, 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 10.9±1.1pg/ml, 10.7±0.64pg/ml 수준을 나타냈고, 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 10.6±1.1pg/ml, 9.9±1.3pg/ml, 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos(시럽)는 중농도/고농도에서 각각 9.2±1.6pg/ml, 8.3±0.6pg/ml로 Fos(분말) 및 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 IgE의 분비량이 상대적으로 감소한 것을 확인하였다.

도 17은 AD 유발 및 실험군 투여에 의한 Th1 관련 Cytokine 분비량을 분석한 결과를 나타낸다. TNF-α의 분비량을 비교한 그래프에서 양성 대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 TNF-α 분비량은 각각 23.8±2.6pg/ml, 23.9±2.22pg/ml, 23.1±1.3pg/ml의 수준을 보인 반면, 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 29.8±1.2pg/ml, 31.7±0.9pg/ml를 나타낸다.

또한, 실시예 1 내지 2에 따른 Advanced Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 32.4±1.3pg/ml, 35.8±2.4pg/ml, 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos(시럽)는 중농도/고농도에서 각각 32.3±1.1pg/ml, 34.9±2.8pg/ml로 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말) 및 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 TNF-α의 분비량이 상대적으로 증가한 것을 확인하였다.

Th1 관련 IFN-γ의 분비량을 비교한 결과, 양성대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 IFN-γ 분비량은 각각 12.7±0.9pg/ml, 13.1±0.3pg/ml, 13.7±0.3pg/ml의 수준을 보인 반면, 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 16.4±0.6pg/ml, 17.3±0.7pg/ml, 실시예 2 내지 3에 따른 Advanced Fos(분말)는 중농도/고농도 에서 각각 21.1±1.4pg/ml, 23.3±0.9pg/ml, 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos(시럽)는 중농도/고농도 에서 각각 17.3±0.5pg/ml, 18.3±1.3pg/ml로 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말) 및 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 IFN-γ의 분비량이 상대적으로 증가한 것을 확인하였다.

Th1 관련 IL-12의 분비량을 비교한 결과, 양성대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 IL-12 분비량은 각각 103.3±5.5pg/ml, 101.5±4.6pg/ml, 106.3±9.6pg/ml의 수준을 보인 반면, 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 115.3±5.6pg/ml, 122.5±1.6pg/ml, 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 128.5±2.9pg/ml, 실시예 3 및 4에 따른 129.2±2.7pg/ml, Advanced Fos(시럽)는 중농도/고농도에서 각각 126.5±3.5pg/ml, 125.8±3.0pg/ml로 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말) 및 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 IL-12의 분비량이 상대적으로 증가한 것을 확인하였다.

따라서 실시예 1 내지 4에 따른 실험군(Advanced Fos: 분말 및 시럽-중농도/고농도)의 투여는 Th1 관련 사이토카인의 분비를 조절하여 Th1/Th2의 균형을 회복함으로써 아토피 증상을 개선하였다.

도 18은 AD 유발 및 실험군 투여에 의한 Th2 관련 Cytokine 분비량을 비교한 결과이다. 구체적으로 Th1의 세포분화를 억제하고 Th2의 세포분화를 촉진시켜 Th1/Th2 불균형을 야기하는 IL-4의 분비량을 비교한 결과, 양성대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 IL-4 분비량은 각각 46.9±1.0pg/ml, 43.5±1.6pg/ml, 42.1±2.2pg/ml의 수준을 보인 반면, 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 26.5±1.7pg/ml, 23.1±3.5pg/ml, 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 12.8±0.9pg/ml, 9.3±0.6pg/ml, 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos(시럽)는 중농도/고농도에서 각각 13.1±2.5pg/ml, 11.3±1.1pg/ml로 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말) 및 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 IL-4의 분비량이 상대적으로 감소한 것을 확인하였다.

IL-4와 동일하게 Th1/Th2 불균형을 야기하는 IL-5의 분비량을 비교한 결과, 양성대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 IL-5 분비량은 각각 136.9±6.8pg/ml, 130.9±8.3pg/ml, 136.1±14.7pg/ml의 수준을 보인 반면, Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 122.5±10.9pg/ml, 79.8±20.3pg/ml, 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 54.2±17.1pg/ml, 44.7±15.5pg/ml, 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos(시럽)는 중농도/고농도에서 각각 76.3±12.4pg/ml, 68.9±12.7pg/ml로 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말) 및 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 IL-5의 분비량이 상대적으로 감소한 것을 확인하였다.

IgE 생성에 관여하는 IL-13의 분비량을 비교한 결과, 양성대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 IL-13 분비량은 각각 324.8±31.4pg/ml, 316.6±58.4pg/ml, 316.6±32.6pg/ml의 수준을 보인 반면, 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 225.6±5.7pg/ml, 168.7±7.1pg/ml, 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 143.0±11.3pg/ml, 128.4±10.6pg/ml, 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos(시럽)는 중농도/고농도에서 각각 178.4±14.5pg/ml, 138.8±6.9pg/ml로 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말) 및 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 IL-13의 분비량이 상대적으로 감소한 것을 확인하였다.

호산구(Eosiniphil) 수의 증가와 관련이 있는 TARC의 분비량을 비교한 결과, 양성대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 TARC 분비량은 각각 27.8±1.95pg/ml, 26.6±1.1pg/ml, 22.8±1.2pg/ml의 수준을 보인 반면, 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 22.4±1.5pg/ml, 21.2±2.0pg/ml, 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 18.0±0.9pg/ml, 17.7±1.8pg/ml, 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos(시럽)는 중농도/고농도에서 각각 19.7±1.1pg/ml, 19.1±0.4pg/ml로 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말) 및 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 TARC의 분비량이 상대적으로 감소한 것을 확인하였다.

호산구(Eosiniphil)의 피부유입 및 탈과립에 관여하는 Eotaxin의 분비량을 비교한 결과, 양성대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 Eotaxin 분비량은 각각 144.7±3.7pg/ml, 141.9±3.5pg/ml, 137.0±5.8pg/ml의 수준을 보인 반면, 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 125.3±6.1pg/ml, 122.3±1.2pg/ml, 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 117.9±5.7pg/ml, 113.6±1.5pg/ml, 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos(시럽)는 중농도/고농도에서 각각 123.0±2.5pg/ml, 118.6±7.4pg/ml로 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말) 및 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 Eotaxin의 분비량이 상대적으로 감소한 것을 확인하였다.

실시예 1 내지 4에 따른 실험군(Advanced Fos: 분말 및 시럽-중농도/고농도)의 투여는 사이토카인의 분비를 조절하여 Th2의 면역반응을 억제하여 Th1/Th2의 균형을 회복함으로써 아토피 증상을 개선하였다.

도 19는 AD 유발 및 실험군 투여에 의한 Treg 관련 Cytokine 분비량을 비교 분석한 그래프로써 먼저 과발현으로 인해 전신 염증을 유발하는 IL-1β의 분비량을 비교한 결과, 양성대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 IL-1β 분비량은 각각 50.7±2.3pg/ml, 49.8±1.4pg/ml, 45.1±3.2pg/ml의 수준을 보인 반면, 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 34.2±4.2pg/ml, 21.1±3.0pg/ml, 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 14.0±3.8pg/ml, 11.1±2.6pg/ml, 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos(시럽)는 중농도/고농도에서 각각 7.3±2.3pg/ml, 10.3±3.6pg/ml로 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말) 및 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 IL-1β의 분비량이 상대적으로 감소한 것을 확인하였다.

Th1/Th2의 불균형을 야기하는 IL-10의 분비량의 경우, 양성대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 IL-10 분비량은 각각 173.7±20.8pg/ml, 171.8±20.7pg/ml, 170.4±18.3pg/ml의 수준을 보인 반면, 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 126.2±25.9pg/ml, 90.9±8.7pg/ml, 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 39.9±12.8pg/ml, 27.6±4.04pg/ml, 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos(시럽)는 중농도/고농도에서 각각 41.7±16.8pg/ml, 38.1±10.4pg/ml로 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말) 및 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 IL-10의 분비량이 상대적으로 감소한 것을 확인하였다.

실시예 1 내지 4에 따른 실험군(Advanced Fos: 분말 및 시럽-중농도/고농도)의 투여는 과도한 Treg 면역반응을 억제하여 염증 반응을 억제하고 Th1/Th2 균형을 회복시킴으로써 아토피 증상을 개선하고, 케스토스 함량이 높아 더욱 우수한 효과를 달성할 수 있을 뿐만 아니라, 높은 케스토스 함량을 섭취하면서도 프락토올리고당의 섭취량이 감소하게 되어 락토올리고당의 과량 섭취에 따른 소화기관(설사, 복부팽만감, 복명 등)의 불편함을 줄일 수 있어 더욱 바람직하다.

시험예 8: Flow cytometry 분석

(1)분석방법

희생시킨 마우스로부터 비장을 수득하고 50-mm Petri dish(Nunclon, Denmark)와 ACK buffer(Gibco, USA)를 활용하여 균질화 하고 적혈구를 용해시킴. 균질화된 샘플을 cell strainer(SPL, Korea)로 여과하고 2% RPMI(Hyclone, USA)로 세척함. 2,000xg, 4℃에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 2% RPMI에 재현탁함. 모든 세포를 동일하게 희석하고 항-마우스 항체인 CD86과 CD274(BD Pharmigen, USA)를 처리하여 4℃에서 20분간 반응시킴. 세포 표면의 발현량은 유세포 분석기(FACSCalibur; Becton Dickinson, USA)를 사용하여 확인하였다. 평균 형광 강도(MFI; Mean fluorescence intensity)에 대한 분석은 FACSCalibur 기기의 Cell Quest software (version 6.0)를 활용하였다.

(2)AD 유발 및 실험군 투여에 의한 CD86의 발현량 확인

도 20은 T 세포와 B 세포를 활성화에 관여하는 CD86의 발현량을 나타낸 그래프로써 비장에서 분리한 비장 세포(splenocytes)로부터 아토피 유발 시 T세포 및 B세포을 활성화시키는 Costimulatory factor인 CD86의 발현량을 확인한 결과, 양성대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 CD86 발현량은 각각 25.4±2.2%, 25.8±0.4%, 23.1±1.2%의 수준을 보인 반면, 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 21.7±1.9%, 20.9±1.1%, 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 16.1±0.4%, 14.0±0.9%, 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos(시럽)는 중농도/고농도에서 각각 16.9±1.0%, 17.7±0.8%로 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말) 및 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 CD86 발현량이 상대적으로 감소하였다.

(3)AD 유발 및 실험군 투여에 의한 CD274의 발현량 확인

도 21은 AD 유발 및 실험군 투여에 의한 CD274의 발현량을 나타낸 그래프로써 비장에서 분리한 비장 세포(splenocytes)로부터 손상된 면역조절 기능에 관여하는 negative immune regulation factor인 CD274의 발현량을 확인한 결과, 양성대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 CD274 발현량은 각각 14.1±1.5%, 14.9±0.2%, 14.8±1.6%의 수준을 보인 반면, 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 18.8±1.3%, 20.4±0.1%, 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 22.1±1.2%, 23.1±0.2%, 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos(시럽)는 중농도/고농도에서 각각 20.9±1.0%, 21.0±0.9%로 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말) 및 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 CD274 발현량이 상대적으로 증가하였다.

실시예 1 내지 4에 따른 실험군(Advanced Fos: 분말 및 시럽-중농도 및 고농도)은 면역반응에서 손상된 면역체계를 복구하는데 기여하고 과도한 면역세포의 활성을 억제하여 아토피 증상을 개선한 것으로 보였다.

시험예 9: 동물 모델의 조직 분석

(1)실험방법

희생시킨 마우스의 등 피부를 10%의 포르말린 용액으로 고정하고 파라핀에 포매시켰다. 피부 조직 절편을 4-5um의 두께로 절단하고 Toluidine blue와 Congo red 염색약을 사용하여 조직을 염색함. DM 4000B 현미경(Leika)을 사용하여 400배율에서 비만세포(mast cell) 및 호산구(eosinophil)의 수를 측정하였다.

(2) 피부조직(dorsal skin) 내 비만세포(mast cell) 측정

도 22는 피부조직(dorsal skin) 내 비만세포(mast cell)를 확인한 그래프로써 히스타민을 생성하여 염증과 가려움증을 유발하는 비만세포(mast cell) 수를 피부 조직에서 측정한 결과, 양성대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 비만세포(mast cell) 수는 각각 328±19개, 366±13개, 357±31개의 수준을 보인 반면, 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 234±1개, 226±8개, 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 214±7개, 206±11개, 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos(시럽)는 중농도/고농도에서 각각 231±9개, 221±18개로 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말) 및 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 비만세포(mast cell) 수가 상대적으로 감소하였다.

(3)피부조직(dorsal skin) 내 호산구(eosinophil) 측정.

도 23은 피부조직(dorsal skin) 내 호산구(eosinophil)를 측정한 그래프로써 과민반응에 작용하며 아토피 증상을 악화시키는 호산구(eosinophil) 수를 피부 조직에서 확인한 결과, 양성대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 호산구(eosinophil) 수는 각각 6.5±2.6개, 6±2.5개, 6.3±2.5개의 수준을 보인 반면, 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 4.3±1.7개, 4.6±1.9개, 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 4±1.6개, 2.8±1.5개, 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos(시럽)는 중농도/고농도에서 각각 3±1.2개, 2.8±1.1 개로 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말) 및 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 호산구(eosinophil) 수가 상대적으로 감소하였다.

(4)장조직(ileum) 내 비만세포(mast cell) 측정

도 24는 장조직(ileum) 내 비만세포(mast cell) 측정한 그래프로써 비만세포(mast cell) 수를 확인한 결과, 양성대조군과 maltose(중농도/고농도)를 투여한 그룹의 비만세포(mast cell) 수는 각각 48±6개, 56±12개, 59±11개의 수준을 보인 반면, 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 33±7개, 32±7개, 실시예 1 및 2에 따른 Advanced Fos(분말)는 중농도/고농도에서 각각 23±6개, 24±4개, 실시예 3 및 4에 따른 Advanced Fos(시럽)는 중농도/고농도에서 각각 25±6개, 19±8개로 비교예 3 및 4에 따른 Fos(분말) 및 실시예 1 내지 4에 따른 Advanced Fos(분말 및 시럽)를 투여한 실험군에서 비만세포(mast cell) 수가 상대적으로 감소하였다.

Claims

케스토스를 유효성분으로 함유하는 장내 미생물의 생육 증진용 조성물로서, 상기 장내 미생물은 Alistipe 속 미생물인, 장내 미생물의 생육 증진용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 장내 미생물은 Alistipe 속 미생물과 Lactobacillus 속 미생물인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 장내 미생물의 상대 풍부도(relative abundance(%))가 증가한 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 장내 미생물의 상대 풍부도는, 상기 유효성분을 대상에 섭취 전 수준 100%를 기준으로 105% 이상인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 케스토스는, 당류 고형분 함량 기준으로 50 중량%이상의 케스토스를 포함하는 프락토올리고당 조성물로 제공되는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 케스토스의 1일 투여량은 체중 60kg의 성인 1인 1일 당 2 내지 30 g의 범위로 제공되는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물.
제7항에 있어서, 상기 Bifidobacterium 속 미생물, Streptococcus 속 미생물, Saccharomyces 속 미생물, bacillus 속 미생물, Alistipe 속 미생물, Lactobacillus 속 미생물로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 프로바이오틱스 조성물을 추가로 포함하는 것인 조성물.
케스토스를 유효성분으로 함유하는, 장내 미생물 군집의 조절에 의한 염증성 질환의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로서, 상기 장내 미생물 군집의 조절은 Lactobacillus 속 미생물 및 Alistipe 속 미생물로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 미생물의 생육 증진에 의한 것인 조성물.
제9항에 있어서, 상기 염증성 질환은 면역과민 반응에 의한 염증성 피부질환 또는 염증성 장 질환인 조성물.
제9항에 있어서, 상기 염증성 장질환은 크론병 또는 궤양성 대장염인 조성물.
제9항에 있어서, 상기 염증성 피부질환은 아토피 피부염, 접촉 피부염, 알또는 알레르기성 접촉피부염인 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 케스토스는, 상기 케스토스는, 당류 고형분 함량 기준으로 50 중량%이상의 케스토스를 포함하는 프락토올리고당 조성물로 제공되는 것인 조성물.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 케스토스의 1일 투여량은 체중 60kg의 성인 1인 1일 당 2 내지 30 g의 범위로 제공되는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 프리바이오틱스(prebiotics) 조성물.
제15항에 있어서, Bifidobacterium 속 미생물, Streptococcus 속 미생물, Saccharomyces 속 미생물, 및 bacillus 속 미생물으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 프로바이오틱스 조성물을 추가로 포함하는 것인 조성물.