KR20220071078A - 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 돼지 전염병 설사 바이러스 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 돼지 전염병 설사 바이러스의 예방, 치료 또는 개선용 약학적 조성물, 식품조성물, 사료조성물 및 건강기능식품에 관한 것이다.

Description

라이소자임을 유효성분으로 포함하는 돼지 전염병 설사 바이러스 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for the treatment of porcine epidemic diarrhea virus comprising lysozyme}
본 발명은 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 돼지 전염성 설사 바이러스(porcine epidemic diarrhea virus; PEDV) 치료용 약학적 조성물, 식품조성물 및 사료조성물에 관한 것이다.
돼지 전염병 설사 바이러스는 코로나바이러스과(Coronaviridae family) 알파코로나바이러스(Alphacoronavirus)속의 일원으로 모든 연령의 돼지에서 장증상을 동반한다. 젖을 먹는 새끼 돼지가 돼지 전염병 설사 바이러스에 감염되는 경우, 50~95%에 이르는 높은 사망률을 나타내므로, 통제되지 않은 바이러스의 발병은 농가에 막대한 경제적 손실을 초래한다.
돼지 전염병 설사 바이러스에 대해 상업적으로 이용가능한 백신은 개발되었으나, 돼지 전염병 설사 바이러스를 치료할 수 있는 효과적인 치료제의 개발은 미흡한 실정이다.
라이소자임은 펩티도글리칸에서 N-아세틸뮤라민산(N-acetylmuramic acid) 및 N-아세틸-D-글루코사민(D--acetyl-D-glucosamine) 사이의 1,4-베타-결합의 가수분해를 촉매하는 효소이다. 라이소자임은 주로 타액, 눈물, 모유 및 점액과 같은 선천적 면역체계의 일부인 분비물 내에 존재한다. 라이소자임은 박테리아, 특히 바실러스속 및 스텝토코쿠스 속 박테리아와 같은 그람 양성 바이러스 및 헤르페스 바이러스, 우두 바이러스 등 소수의 바이러스에 대해 항균 활성이 보고되었다(a) The Journal of Pediatrics.　1992;121　(2) 262-70; b)Nature. 1959;183, 548). 그러나 아직까지 라이소자임의 돼지 전염병 설사 바이러스의 억제 효과에 대해서는 보고된 바 없다.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 돼지 전염병 설사 바이러스의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 돼지 전염병 설사 바이러스의 예방 또는 개선용 식품조성물, 사료 조성물 및 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 돼지 전염병 설사 바이러스의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 의하면, 상기 라이소자임은 돼지 전염병 설사 바이러스에 의한 세포 사멸 또는 세포 변형을 억제시키는 것을 통해 돼지 전염병 설사 바이러스의 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 라이소자임은 돼지 전염병 설사 바이러스의 직접적 사멸 또는 바이러스 증식을 억제시키는 것을 통해 돼지 전염병 설사 바이러스의 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에 의하면, 본 발명의 라이소자임으로 예방 또는 치료 가능한 돼지 전염병 설사 바이러스는 스파이크 유전자의 유전형에 따라 G1a, G1b, G2a 및 G2b 그룹에서 선택되는 어느 하나 이상, 또는 상기 G1a, G1b, G2a 및 G2b 그룹에 속하는 돼지 전염병 설사 바이러스와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가지는 것일 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명에 의하면, 상기 라이소자임은 펩티도글리칸에서 N-아세틸뮤라민산(N-acetylmuramic acid) 및 N-아세틸-D-글루코사민(D--acetyl-D-glucosamine) 사이의 1,4-베타-결합의 가수분해를 촉매하는 효소이다.
본 발명에서 라이소자임은 포유 동물의 라이소자임일 수 있으며, 포유동물의 라이소자임의 유전자 정보를 확인하여, 번역된 아미노산 서열을 바탕으로 합성된 라이소자임일 수 있으며, 예컨대 인간을 비롯한 영작류 유래의 라이소자임일 수 있고, 펩타이드 합성기 등을 통하여 시험관 내에서 합성된 것일 수 있으며, 상업적으로 구매한 것일 수 있다.
본 발명의 라이소자임은 인간 또는 영장류의 라이소자임의 아미노산 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 서열 상동성을 가지는 것으로, 생물학적 활성이 유지되는 서열을 본 발명의 범주에서 포함할 수 있다.
본 발명의 라이소자임은 아미노산의 일부가 결실, 삽입, 부가, 또는 치환될 수 있다.
용어, "결실"은 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기가 없는 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서의 변화로 정의된다
용어 "삽입" 또는 "부가"는 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산 잔기의 부가로 인한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에서의 변화이다.
용어 "치환"은 야생형 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드와 비교하여 각각 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산에 의해 하나 이상의 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 교체에서 비롯된다.
한편, 치환 위치에서 바람직한 아미노산 변이는 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 특성의 유사성에 기반하여 수행되는 것일 수 있다. 예를 들어, 이에 한정되는 것은 아니나, 음으로 하전된(negatively charged) 아미노산으로서는 아스파르트산 및 글루타민산을 포함하며; 양으로 하전된(positively charged) 아미노산으로서는 리신 및 아르기닌을 포함하고; 그리고 유사한 친수성값을 가지는 비하전성 극성 헤드기를 가지는 아미노산으로서는 류신, 이소류신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민; 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신;을 들 수 있다. 상기 변이는 보존적 치환을 포함할 수 있다. '보존적 치환'이란, 어느 아미노산이 유사한 특성을 가지는 다른 아미노산으로 치환되어 당업자라면 그 폴리펩타이드의 2차 구조 및 감수성질(hydropathic nature, 소수성 또는 친수성 성질)이 실질적으로 비변화되었다고 예측할 수 있는 치환이다. 일반적으로 하기 아미노산 군이 보존성 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his.
경우에 따라서는, 상기 변이체는 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation), 파네실화(farnesylation), 아세틸화(acetylation) 및 아밀화(amidation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.
또한, 본 발명에 따른 라이소자임은 세포 내 투과를 위해 세포 투과성 펩타이드 서열을 더 포함할 수도 있다. 세포 투과성 펩타이드란 일종의 신호 펩타이드로써 세포 내로 물질 전달을 목적하는 펩타이드 서열이다. 주로 7-30 개 정도의 아미노산 펩타이드 서열로 이루어지며, 세포 내로 전달될 수 있는 신호 펩타이드를 가지는 서열이라면 어떠한 서열이라도 본 발명에서 포함될 수 있다.
예컨대, 세포 투과성 펩타이드는 라이신/아르기닌 등 기본 아미노산 잔기들을 주로 포함하고 있어서 이와 융합된 단백질들을 세포막을 투과하여 세포내로 침투시키는 역할을 한다. 상기 세포 투과성 펩타이드는 HIV-1 Tat 단백질, 드로소필라 안테나페디아의 호메오도메인(페네트라틴), HSV VP22 전사조절단백질, vFGF에서 유도된 MTS 펩타이드, PTD-5, 트랜스포탄 또는 Pep-1 펩타이드에서 유래된 서열 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이와 같이, 바이러스 또는 양이온성 펩타이드로부터 동정/합성된 다양한 CPPs(예를 들어, TAT48-60, 페네트라틴(pAntp)43-58, 폴리아르기닌, Pep-1, 트랜스포탄, 등)은 생물학적 활성 물질은 약물운반체들의 이동을 매개하기 위해 세포 내재화(internalization)가 가능한 활성을 가진다.
본 발명에 있어서, 용어 "치료"는 상기 조성물의 투여에 의해 돼지 전염병 설사 바이러스로 인한 증상을 낫게 하는 행위를 모두 의미하는 것으로, 질환, 질환의 증상, 질병 또는 질환의 2차 질환, 또는 이에 대한 소인(predisposition)을 치료, 경감, 완화, 요법(remedy), 또는 향상하기 위한 목적과 함께 질환, 질환의 증상, 질병 또는 질환의 2차 질환, 또는 이에 대한 소인을 갖는 피험자(인간 또는 동물)에게 상기 조성물의 적용 또는 투여로 정의된다.
본 발명에서, "대상체" 및 "환자"는 인간 또는 비 인간, 예컨대 영장류, 포유류, 척추동물을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 돼지이다.
본 발명에서, "치료 이점" 또는 "치료적으로 유효한"은 이러한 상태의 의학적 치료와 관련하여 대상체의 건강을 촉진하거나 증대시키는 임의의 것을 지칭한다. 이는 이에 제한되는 것은 아니나, 질병의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도의 감소를 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 라이소자임을 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 라이소자임은 통상적인 담체, 보조제 또는 희석제와 혼합하여 통상의 제제화 방법으로 제형화하여 경구투여 또는 비경구투여에 적합한 형태로 제조될 수 있다.
상기 담체, 보조제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 제제화할 경우에는 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등을 더 포함할 수도 있으며, 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제를 더 첨가할 수도 있다.
경구투여의 경우에는 정제, 캡슐제, 용액, 시럽제, 현탁제 등의 형태로 제조될 수 있고, 비경구투여의 경우에는 정맥, 자궁내 경막, 복강, 피하, 근육, 경피 및 뇌혈관 내 주사에 대한 주사제의 형태로 제조될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양, 즉 치료되는 질환 또는 장애의 증상의 완화를 유도하는 양인 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자 등에 따라 조절될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 구강, 심장내, 골수내, 경막내, 경피, 장관, 피하, 설하 또는 국소 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 1 내지 10,000㎎/㎏/일, 바람직하게는 1 내지 200㎎/㎏/일의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명이 해결하고자 하는 다른 과제는 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 돼지 전염병 설사 바이러스의 예방 또는 개선용 식품조성물을 제공한다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능식품"이라 함은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 라이소자임을 0.01 내지 95 중량%, 바람직하게는 1 내지 80 중량%로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 라이소자임, 부형제, 결합제, 붕해제, 및 다른 첨가제와의 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축성형할 수 있다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수 있으며, 필요에 따라 적당한 제피제로 제피할 수도 있다.
캡슐 형태의 건강기능식품 중 경질캡슐제는 통상의 경질캡슐에 라이소자임, 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물 또는 그의 입상물 또는 제피한 입상물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캡슐제는 라이소자임 및 부형제 등의 첨가제와의 혼합물을 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 라이소자임, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.
과립형태의 건강기능식품은 라이소자임, 부형제, 결합제, 붕해제 등의 혼합물을 적당한 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다. 과립형태의 건강기능식품은 12호 (1680 μm), 14호 (1410 μm) 및 45호 (350 μm) 체를 써서 다음 입도시험을 할 때에 12호체를 전량 통과하고 14호체에 남는 것이 전체량의 5.0 %이하이고 또 45호체를 통과하는 것은 전체량의 15.0 %이하일 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).
상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 본 발명의 라이소자임을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 음료, 껌, 비타민 복합제, 드링크제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
상기 식품 조성물은 식품보조첨가제를 포함할 수 있으며, 식품류는 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 캡슐, 정제, 분말, 과립, 액상, 환, 편상, 페이스트상, 시럽, 겔, 음료, 젤리 또는 바인 형태로 사용할 수 있다.
라이소자임의 함량은 건강기능식품 총 중량을 기준으로 0.01 내지 15 중량%로 함유할 수 있으며, 건강음료 조성물의 경우에는 총 100 g을 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g으로 함유할 수 있다.
상기 식품보조첨가제는 당업계에 통상적인 식품첨가제, 예를 들어 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제 등을 포함한다. 또한, 상기 건강음료조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서, 상기 라이소자임 외에 첨가되는 성분에 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린; 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
상기 외, 라이소자임을 포함하는 식품 조성물, 다이어트 보조제 또는 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
또한, 본 발명은 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 돼지 전염병 설사 바이러스의 예방 또는 개선용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서 동물은 포유동물 및 조류 중에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게, 축산법 제2조 제1호 및 동법 시행규칙 제2조 각호에서 정의하고 있는, 야생습성이 순화되어 사육하기에 적합하며 농가의 소득증대에 기여할 수 있는 가축일 수 있다. 상기 가축에는 소, 말, 노새, 당나귀, 염소, 산양, 면양, 사슴, 돼지, 토끼, 가금류 등 일수 있으며, 가금류에는 닭, 칠면조, 오리, 타조, 거위, 메추리 등, 바람직하게는 닭 일수 있으나, 사육하여 축산물을 얻기에 적합한 것이라면 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 "축산물"은 축산법 제2조 3호의 정의인, 가축에서 생산된 고기, 젖, 알, 꿀과 이들의 가공품, 원피 (원모피를 포함한다), 원모, 기타 가축의 생산물로서 농림부령이 정하는 것을 의미한다. 또한 반려동물을 포함하여 개, 고양이 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
발명의 용어 "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미한다. 일 양태로, 본 발명의 인덴온 유도체 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 함유하는 사료용 조성물에는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.
농후사료에는 밀, 귀리, 옥수수 등의 곡류를 포함하는 종자열매류, 곡물을 정제하고 얻는 부산물로서 쌀겨, 밀기울, 보릿겨 등을 포함하는 겨류, 콩, 유체, 깨, 아마인, 코코야자 등을 채유하고 얻는 부산물인 깻묵류와 고구마, 감자 등에서 녹말을 뺀 나머지인 녹말찌꺼기의 주성분인 잔존녹말질류 등의 찌꺼기류, 어분, 물고기찌꺼기, 어류에서 얻은 신선한 액상물을 농축시킨 것인 피시솔루블, 육분, 혈분, 우모분, 탈지분유, 우유에서 치즈, 탈지유에서 카제인을 제조할 때의 잔액인 훼이(whey)를 건조한 건조훼이 등의 동물질사료, 효모, 클로렐라, 해조류 등이 있다.
조사료에는 야초, 목초, 풋베기 등의 생초(生草)사료, 사료용 순무, 사료용 비트, 순무의 일종인 루터베어거 등의 뿌리채소류, 생초, 풋베기작물, 곡실(穀實)등을 사일로에 채워 놓고 젖산발효시킨 저장사료인 사일리지(silage), 야초, 목초를 베어 건조시킨 건초, 종축용(種畜用) 작물의 짚, 콩과 식물의 나뭇잎 등이 있다. 특수 사료에는 굴껍테기, 암염 등의 미네랄 사료, 요소나 그 유도체인 디우레이드이소부탄 등의 요소사료, 천연사료 원료만을 배합했을 때 부족하기 쉬운 성분을 보충하거나, 사료의 저장성을 높이기 위해서 배합사료에 미량으로 첨가하는 물질인 사료첨가물 등이 있다.
본 발명에 따른 라이소자임은 돼지 전염병 설사 바이러스에 대하여 세포 생존율을 높이고, 세포 변형율을 낮추며, 돼지 전염병 설사 바이러스의 감염에 대해 개체를 보호, 예방 및 치료할 수 있으므로, 돼지 전염병 설사 바이러스의 예방, 치료 또는 개선를 위한 약학적 조성물, 식품 조성물 또는 사료 조성물로 유용하다.
도 1은 PEDV 감염 Vero 세포에서 인간 라이소자임의 투여 용량에 따른 세포 생존율을 확인한 것이다.
도 2는 PEDV 감염 Vero 세포에서 라이소자임의 용량에 대한 상대 억제용량-반응 곡선이다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.
실시예
세포 및 바이러스
아프리카 녹색 원숭이 (Vero; ATCC® CCL-81TM) 세포를 10% 소태아 혈청, 항진균성 항생제 (Gibco) 및 L-글루타민(Gibco)이 보충된 Minimal Eagle's Medium (MEM, Gibco)로 구성된 성장 배지에서 성장시켰다. 돼지 전염병 설사 바이러스 (PEDV) 감염 배지는 0.3% 소혈청 알부민, 항진균성 항생제 및 L-글루타민이 보충된 Minimal Eagle's Medium으로 구성하였다.
시약
인간 라이소자임은 시그마-알드리치에서 구입하였다. 인간 라이소자임은 감염 배지에서 50 mg/mL로 재구성하였다. 모든 인간 라이소자임은 분취액으로 -80℃에서 저장하였고, 사용 당일 감염 배지에서 작업 농도로 희석하였다.
시험예 1. 라이소자임의 효과 및 세포독성 평가
라이소자임 처리에 따른 항바이러스 효과 분석을 실시하였다. 먼저, 성장 배지 중의 Vero 세포 (1.5×104 세포/웰)의 하룻방 96-웰 플레이트 배양물을 준비하였고, 처리하기 전에 세포를 인산염 완충 식염수(phosphate-buffered saline solution, PBS)로 2회 세척하였다. 세포를 인간 라이소자임으로 처리하고, 100 μL/웰의 부피까지 감염 배지에서 0.001의 감염 다중도 (MOI)에서 동시에 PEDV로 감염시켰다. 37℃ 5% CO2에서 66시간 까지 배양한 후, EZ-CYTOX (DoGenBio, Co., Ltd., South Korea)를 배양액에 첨가하였다 (10 μL/웰). 3~4시간 후, 450 nm에서 흡광도를 확인하였다.
세포 생존율(%)은 세포 대조군(비감염, 성장배지)과 비교하여 용량당 계산하였다. 바이러스 대조군(인간 라이소자임 첨가하지 않음)도 감염 배지로만 처리하였다. 데이터를 정규화하고, GraphPad Prism ver.5.00 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)의 억제제 대 반응 (4개-변수) 비선형 회귀 곡선 맞춤 함수를 사용하여 인간 라이소자임에 대한 상대적인 절반-최대 유효 농도(EC50)를 결정하였다. 모든 실험은 3회 실시하였다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 라이소자임은 용량 의존적으로 Vero 세포에서 돼지 전염병 설사 바이러스(PEDV) 감염을 억제하여 세포 생존률을 향상시켰다. 뿐만 아니라, 라이소자임의 투여는 용량 의존적으로 PEDV 감염 Vero 세포의 세포 변성을 감소시키는 것을 확인하였다. 라이소자임의 투여는 용량의존적으로 세포 생존율을 증가시켰으며, 특히, 4 mg/ml 농도의 라이소자임 처리는 세포 생존율을 약 82%까지 끌어올리는 것으로 확인되었다.
도 2는 PEDV 감염 Vero 세포에서 라이소자임의 용량에 대한 상대 억제용량-반응 곡선으로 PEDV 감염된 Vero 세포를 다양한 용량의 라이소자임으로 처리하고, 데이터를 최대 및 최소 반응을 기준으로 정규화하고 상대 EC50를 계산하였으며, 2.125 mg/ml로 계산되었다.
이러한 결과는 라이소자임이 PEDV 감염을 용량의존적으로 효과적으로 억제할 수 있음을 보여준다.

Claims (8)

  1. 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 돼지 전염병 설사 바이러스의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 라이소자임은 돼지 전염병 설사 바이러스에 의한 세포 사멸 또는 세포 변형을 억제시키는 것인, 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 라이소자임은 돼지 전염병 설사 바이러스의 증식을 억제하는, 약학적 조성물.
  4. 라이소자임을 포함하는 돼지 전염병 설사 바이러스의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 라이소자임은 돼지 전염병 설사 바이러스에 의한 세포 사멸 또는 세포 변형을 억제시키는 것인, 식품 조성물.
  6. 라이소자임을 포함하는 돼지 전염병 설사 바이러스의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  7. 라이소자임을 포함하는 돼지 전염병 설사 바이러스의 예방 또는 개선용 사료 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 라이소자임은 돼지 전염병 설사 바이러스에 의한 세포 사멸 또는 세포 변형을 억제시키는 것인, 사료 조성물.
KR1020200182199A 2020-11-23 2020-12-23 라이소자임을 유효성분으로 포함하는 돼지 전염병 설사 바이러스 치료용 약학적 조성물 KR102601933B1 (ko)

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BMC Veterinary Research. (2019) 15, 318* *
NATURE. February 21, 1959 voL.1, s3, p548 *

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