KR20220069032A - 면역학적 바이오마커를 이용한 노인의 건강 상태 확인 - Google Patents

Abstract

MAPK13, CD96, FKBP3, PPM1A, PHLDA1, GLRX3, FEN1 및 AURKA를 포함하는 항원에 대한 자가항체인 바이오마커의 존재에 대해 개체로부터 추출한 샘플을 테스트하여 노인 개체의 건강 상태를 결정하는 방법으로서, 상기 항원은 UBE2I, AAK1, YARS, ASPSCR1, CASP10, FHOD2, TCL1A 및 MAP4 중 하나 이상을 더 포함할 수 있고, 상기 PHLDA1 및 CD96은 건강한것에 해당하고, 상기 AURKA, FEN1, CASP10 및 AAK1은 중간 정도의 건강에 해당하고, 상기 UBE2I, YARS, ASPSCR1, FHOD2, TCL1A, MAP4, MAPK13, FKBP3, PPM1A 및 GLRX3은 건강하지 않은 것에 해당하는 것인 방법.

Description

면역학적 바이오마커를 이용한 노인의 건강 상태 확인

본 발명은 노인의 건강 상태 및/또는 노화 경과를 결정하기 위한 면역학적 바이오마커, 특히 자가항체의 검출에 관한 것이다.

단백질체학 연구 분야의 기술 발전에도 불구하고 임상에 진입한 바이오마커는 극소수에 불과하며, 바이오마커의 90%가 단백질 바이오마커이다 [1]. 본원에 기술된 자가항체 바이오마커는 항원에 대한 자가항체이며, 자가항체는 하나 이상의 개체 자신의 단백질('자기' 항원)에 대해 지시되는 개체에 의해 생성되는 항체이다. 바이오마커[2]가 임상에 적용되지 못하는 주요 원인은 다음과 같다:

1) 낮은 민감도와 특이도

2) 낮은 예후/예측값

3) 임상적 의사결정에 중요하지 않음

4) 원래 주장의 검증 실패(거짓 발견)

노인을 돌보는 관리는 현재 건강 상태에 대한 동반 질환 이력(과거 및 현재)의 영향보다 연령에 덜 의존한다 [3]. 이러한 동반 질환은 감염, 암 또는 만성 염증성 질환을 치료하기 위해 수년 동안 도전을 받아온 면역계에 특정 스트레스를 부과한다 [4].

따라서, 본 발명의 목적은 노인의 건강 상태를 평가하기 위한 개선된 자가항체 바이오마커 패널을 제공하는 것이다.

[발명의 요약]

본 발명의 일 측면에서, 개체로부터 추출된 샘플로부터 상기 개체의 건강을 결정하는 방법으로서,

(i) 건강에 특이적인 바이오마커의 존재에 대해 상기 샘플을 테스트하는 단계;

(ii) 상기 바이오마커의 검출에 기초하여, 개체가 건강한지, 중간 정도의 건강인지, 또는 건강하지 않은지를 결정하는 단계를 포함하고.

상기 바이오마커는 AURKA, FEN1, GLRX3, PHLDA1, PPM1A, FKBP3, CD96 및 MAPK13을 포함하는 항원에 대한 자가항체인 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.

일 구체예에서, 상기 개체는 노인, 전형적으로 60세 이상이다.

유리하게는 상기 자가항체 바이오마커는 혈장-항체 수준의 분포를 측정함으로써 노인 개체의 건강 상태(건강, 중간 정도, 및 건강하지 않음)의 특성화(또는 진단)에 사용될 수 있다. 또한 이러한 자가항체 바이오마커의 하위 집합, 특히 건강 및 중간 정도와 관련된 것들은 비전염성 질병에 대한 보호 역할을 할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 샘플은 자가항체 바이오마커에 상응하는 항원 패널을 사용하여 테스트한다. 전형적으로, 상기 항원은 비오틴화된 단백질이다. 유리하게는 바이오틴화는 항원이 올바른 형태로 폴딩되어 자가항체 바이오마커에 의한 검출의 정확성을 보장하도록 한다.

일 구체예에서, 상기 항원은 UBE2I, AAK1, YARS, ASPSCR1, CASP10, FHOD2, TCL1A 및 MAP4를 포함하는 군으로부터의 하나 이상을 포함할 수 있다.

모든 항원이 자가항체 반응을 생성하는 것은 아니고 테스트되는 1500개 이상의 항원으로 구성된 주어진 코호트에서 어떤 항원이 그렇게 할 것인지 선험적으로 예측하는 것은 불가능하며, 위에서 설명한 16개 항원에 대한 자가항체만이 건강 및 노화 상태를 식별하는 바이오마커로 적합하다.

일 구체예에서, 비오틴화된 단백질 각각은 단백질과 인프레임(in-frame)으로 융합되는 비오틴 카복실 운반체 단백질(Biotin Carboxyl Carrier Protein; BCCP) 폴딩 마커로부터 형성된다.

추가 구체예에서, 상기 비오틴화된 단백질은 스트렙타비딘-코팅된 기질에 결합된다.

유리하게는 전장 단백질은 융합 파트너가 올바르게 폴딩될 때 in vivo에서 그 자체가 비오틴화되는 BCCP 폴딩 마커에 대한 융합으로서 발현된다. 이에 비해 잘못 폴딩된 융합 파트너는 BCCP를 '아포(apo)'(즉, 비오틴화되지 않은) 형태로 유지하여 스트렙타비딘 기질에 부착할 수 없도록 한다. 따라서, 올바르게 폴딩된 융합 단백질만이 BCCP 태그에 부착된 비오틴 모이어티를 통해 스트렙타비딘 기질에 부착된다.

일 구체예에서, 상기 기질은 유리 슬라이드, 바이오칩, 스트립, 슬라이드, 비드, 미세역가 플레이트 웰, 표면 플라즈몬 공명 지지체, 미세유체 장치, 박막 중합체 기저 층, 하이드로겔-형성 중합체 기저 층, 또는 항체-항원 결합 검출에 적합한 임의의 다른 장치 또는 기술을 포함한다.

일 구체예에서, 상기 기질을 샘플의 자가항체 바이오마커가 항원에 결합할 수 있도록 사람으로부터 추출된 샘플에 노출시킨다.

전형적으로, 상기 샘플은 엑소좀, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 양수, 뇌척수액, 모유, 정액 또는 담즙 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 포함한다.

일 구체예에서, 상기 샘플에 대한 노출 후, 상기 기질을 형광-태그된 2차 항체에 노출시켜 패널 상의 항원에 결합된 상기 샘플의 임의의 자가항체의 양이 결정되도록 한다. 전형적으로, 상기 이차 항체는 항-인간 IgG이지만, 항-IgM, 항-IgG1, 항-IgG2, 항-IgG3, 항-IgG4 또는 항-IgA와 같은 다른 이차 항체가 사용될 수 있음이 이해될 것이다.

일 구체예에서, 상기 개체의 건강은 상기 항원에 특이적으로 결합하는 상기 샘플의 자가항체의 상대적 또는 절대적 양에 상응한다.

일 구체예에서, 상기 방법은 in vitro에서 수행된다.

일 구체예에서, 상기 방법은 하나 이상의 바이오마커의 상향조절/하향조절을 검출하는 것을 포함한다.

본 발명의 다른 측면에서, 노인 개체로부터 추출된 샘플로부터 상기 개체의 건강을 결정하기 위한 키트를 제조하는 방법으로서,

패널의 각 항원에 대해, 비오틴 카복실 운반체 단백질 폴딩 마커 인프레임을 상기 항원을 코딩하는 유전자와 클로닝하고, 그 결과 생성된 비오틴화된 항원을 발현하는 단계;

상기 비오틴화된 항원을 하나 이상의 스트렙타비딘-코팅된 기질 상의 주소지정 가능한 위치에 결합하여 항원 어레이를 형성하는 단계;

상기 패널 상의 항원에 결합하는 상기 샘플의 자가항체의 양이 결정될 수 있도록 상기 기질을 상기 샘플에 노출시키고 반응을 측정하는 단계를 포함하고,

상기 항원은 AURKA, FENI, GLRX3, PHLDAI, PPMIA, FKBP3, CD96 및 MAPK13를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법이 제공된다.

일 구체예에서, 상기 항원은 UBE2I, AAK1, YARS, ASPSCR1, CASP10, FHOD2, TCL1A 및 MAP4를 포함하는 군으로부터의 하나 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 노인 개체로부터 추출된 샘플에 본원에 기재된 바와 같은 항원 패널을 포함하는 조성물을 노출시키고, 상기 항원에 결합하는 상기 샘플의 자가항체의 수준을 결정함으로써 노인 개체의 건강을 결정하는 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 측면에서, in vitro에서 노인 개체로부터 추출된 샘플에 본원에 기재된 바와 같은 항원 패널을 포함하는 조성물을 노출시키고, 상기 항원에 결합하는 상기 샘플의 자가항체의 수준을 결정함으로써 노인 개체의 건강을 결정하는 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 측면에서, 노인 개체의 건강을 결정하기 위한 항원 패널을 포함하는 조성물로서, 상기 항원은 AURKA, FEN1, GLRX3, PHLDA1, PPM1A, FKBP3, CD96 및 MAPK13을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물이 제공된다.

일 구체예에서, 상기 항원은 UBE2I, AAK1, YARS, ASPSCR1, CASP10, FHOD2, TCL1A 및 MAP4를 포함하는 군으로부터의 하나 이상을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 상기 항원은 비오틴화된 단백질이다.

일 구체예에서, 환자로부터의 샘플 내의 항원에 in vitro에서 결합하는 하나 이상의 자가항체 바이오마커의 양이 상기 환자의 건강 상태를 결정하기 위해 측정될 수 있다.

본 발명의 또 다른 측면에서, 노인 환자의 건강 상태를 결정하기 위한 자가항체 바이오마커 패널을 포함하는 조성물로서,

상기 하나 이상의 자가항체 바이오마커의 수준은 상기 환자로부터의 샘플에서 측정되고;

상기 하나 이상의 자가항체 바이오마커는 AURKA, FEN1, GLRX3, PHLDA1, PPM1A, FKBP3, CD96 및 MAPK13 중 하나 이상의 항원에 대해 특이적인 자가항체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물이 제공된다.

본 발명의 가능한 배열을 예시하는 첨부 도면과 관련하여 본 발명을 추가로 설명하는 것이 편리할 것이다. 본 발명의 다른 배열이 가능하고, 따라서 첨부 도면의 특수성이 본 발명의 이전 설명의 일반성을 대체하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
도 1은 E. coli 비오틴 카복실 운반체 단백질 도메인의 구조를 도시한다.
도 2는 벡터로 사용된 pPRO9 플라스미드를 도시한다.
도 3은 (a) 차트; (b) 연결된 경로로 세포주기 및 세포 사멸과 관련된 단백질을 도시한다.
도 4는 클러스터링 분석: (a) tSNE 클러스터링 분석에 의해 16개 항원에 의해 노인에서 정의된 클러스터를 나타낸 것 [5]; (b) 각 표적 단백질에 대한 항체의 발현 밀도; (c) 각 건강 상태 그룹에 특이적인 자가항체;를 도시한다.
도 5는 코호트 선택을 도시한다: (a) 연구에서 노인 개체를 선택하고 분류하는데 사용되는 워크플로를 설명하는 개략도; (b) 연령 및 성별에 따른 노인 및 젊은 개체의 분포; Dunn의 보정과 함께 Kruskal-Wallis 테스트로 수행된 통계 분석; (c) 노인 개체의 분류에 사용되는 임상 변수의 범위; (d) 6개의 결정적인 임상 매개변수에 대한 연구에서 선택된 노인의 특성.

실험 재료 및 방법

유전자 합성 및 복제. pPRO9 플라스미드(하기 도 2 참조)는 표준 기술에 의해 구성되었으며 c-myc 태그와 BCCP 단백질 도메인으로 구성되며 앞에 다중- 클로닝 사이트가 있다. 합성 유전자 삽입물은 합성 올리고뉴클레오티드 및/또는 PCR 산물로부터 조립되었다. 단편은 SpeI 및 NcoI 클로닝 사이트를 사용하여 pPRO9에 클로닝되었다. 형질전환된 박테리아로부터 플라스미드 DNA를 정제하고 UV 분광법으로 농도를 측정하였다. 최종 구성은 시퀀싱에 의해 확인되었다. 사용된 제한 사이트 내 서열 일치는 100%였다. 5㎍의 플라스미드 제제를 동결건조하여 보관하였다.

재조합 배큘로바이러스(baculovirus)는 관심 단백질의 코딩 서열을 운반하는 전달 벡터와 함께 강력한 바이러스 다면체 프로모터를 운반하는 bacmid를 모 Spodoptera frugiperda 세포주 IPLB-Sf-21-AE에서 유래한 클론 분리체인 Sf9 세포주로 공동-형질감염시켜 생성된다. 바이러스 시스템에 의해 시작된 상동 재조합은 배양 인큐베이션의 며칠 이내에 형질감염된 세포가 바이러스 세포변성 효과(cytopathic effect; CPE)의 징후를 나타내도록 한다. 관찰된 가장 흔한 CPE는 바이러스 자손 증식의 결과인 평균 세포 크기의 현저한 확대였다. 그런 다음 P0으로 알려진 이러한 배큘로바이러스를 배양 배지로 방출하고, 바이러스 증폭을 수행하여 더 높은 역가의 P1 바이러스를 생성하였다.

단백질 발현. 웰당 6x10⁶ Sf9 세포를 함유하는 3ml 배양물을 사용하여 24웰 블록에서 발현을 수행하였다. 고역가, 저계대, 재조합 배큘로바이러스의 바이러스 스톡(>10⁷ pfu/ml)을 사용하여 sf9 곤충 세포를 감염시켰다. 그런 다음 감염된 세포를 72시간 동안 배양하여 관심 있는 재조합 단백질을 생산할 수 있도록 하였다. 세포를 PBS로 세척하고 완충액에 재현탁하고 필요에 따라 용해를 위해 -80 ℃에서 분취량으로 동결하였다. 전달 벡터 구성 및 단백질 자체의 특성에 따라 재조합 단백질 용해물은 배양된 세포 또는 배양된 배지에서 펠렛화될 수 있다. 그런 다음 양성 재조합 단백질을 SDS-PAGE 및 스트렙타비딘-HRP 항체에 대한 웨스턴 블롯을 통해 분석하였다. 총 1557개의 인간 항원이 상기 방법을 사용하여 복제되고 발현되었다.

어레이 제작. HS(하이드로겔-스트렙타비딘) 슬라이드는 Schott에서 구입하여 비오틴화된 단백질을 인쇄하는데 사용하였다. 총 9 나노리터의 조단백질 용해물이 비접촉 압전 인쇄 기술을 사용하여 HS 슬라이드에 4중으로 인쇄되었다. pH가 7.0에서 7.5 사이인 인쇄 버퍼를 사용하였다. 세척 및 블로킹을 시작하기 전에 슬라이드를 원심분리(5분 동안 200 x g)로 건조하였다. 인쇄된 어레이는 인산염 완충액에 BSA 또는 카제인(농도: 0.1 mg/ml)을 포함하는 용액으로 블로킹되었다. pH는 7.0과 7.5 사이로 조정되었고 차가운 용액이 사용되었다 (4 ℃ - 20 ℃). 슬라이드는 세척 사이에 건조되지 않았으며 빛으로부터 보호되었다. 전체적으로, 각각의 결과 '면역체 어레이'는 1557개의 항원으로 구성되었으며 각각은 4중으로 인쇄되었다.

실험적 절차. 면역체 어레이를 실행하는 각 중요한 실험 단계에는 작업자 편향을 줄이기 위해 두 번째 훈련된 사람이 프로토콜의 모든 단계를 철저히 확인하고, 정확하게 기록하고, 교차 확인해야 했다. 샘플을 선택하고 무작위로 추출하여 그에 따라 분석 랙에 할당하였다. 이러한 샘플은 실험 설정이 완료될 때까지 -20°C에 보관하였다.

1. 연구 코호트

연구 코호트를 2개의 연령 그룹으로 나누었다: 젊은 대조군 개체(YC)와 노인 개체. YC 그룹(n=60)은 18세에서 27세 사이의 중국계 남성(n=34)과 여성(n=26)으로 구성된다. 그들은 보고된 동반질환이나 적극적인 의학적 치료 없이 임상적으로 건강하다. 노인 개체의 선별은 60세 이상의 중국계 노인 개체 내에서 수행하였다. 이 초기 선택은 민족적 편향을 제거함으로써 이 연구의 분석력과 결과를 증가시킨다.

노인 개체의 건강 등급(건강, 중간 정도 및 건강하지 않음)으로 추가적으로 선택하는 것은 6가지 임상 매개변수의 조합을 기반으로 하였다 (도 5a):

- Commorb5: 안과 질환을 제외한 전체 동반질환 수를 반영하는 변수

- NADL: 노인 개체의 일상생활 활동에 영향을 미치는 총 장애 수 [7]

- Wo_sf1: 일반적인 삶의 질을 측정하는 매개변수.

- Frailty(노쇠): 노인 개체가 점차적으로 내부 및 외부 스트레스 요인에 매우 취약해지는 임상 증후군. 체력과 인지능력을 고려한 다차원 변수임 [8]

- MMSEtot: Mini-Mental State Examination의 총점. 이는 노인 개체의 인지능력을 나타냄 [9].

- GDStot: Geriatric Depression Scale의 총점. 이는 노인의 우울증을 식별하는 데 사용되는 자가 보고 평가임 [10].

노인 개체의 건강 상태 특성화는 전술한 6가지 매개변수를 고려하여 다음 그룹을 선택하게 되었다 (도 5a):

- 115명의 건강한 노인,

- 111명의 중간 정도 건강의 노인,

- 114명의 건강하지 않은 노인.

각 건강한 그룹에 더 많은 여성이 존재함에 따라 성별 차이가 관찰될 수 있으나 건강한 그룹 간에 연령의 중요한 변화는 없다 (도 5b, 도 5d). 도 5d에서, 볼드체 숫자는 특정 범주 및 점수에 대한 개체의 등급을 결정한다. 괄호 안의 숫자는 특정 특성을 가진 개체의 수에 해당함. ND: 결정되지 않음. Ave: 각 건강한 그룹에 대한 모든 노인 개체의 평균 연령 [6].

전반적으로 개체의 재분할은 건강하지 않은 노인 개체의 동반 질환의 축적, 더 높은 우울 상태 및 삶의 질 증가와 관련된 노쇠 상태 증가 및 인지 저하를 나타내는 것으로 나타났다 (도 5c, 도 5d).

2. 혈청/혈장 희석

그 다음 샘플을 +20℃로 설정된 진탕 인큐베이터에 넣어 30분 동안 해동되도록 하였다. 완전히 해동되면 각 샘플을 최고 속도로 3회 격렬하게 볼텍싱시키고 미세원심분리기를 사용하여 13,000 g에서 3 분 동안 회전시켰다. 22.5 μL의 샘플을 0.1% v/v Triton, 0.1% w/v BSA, 10% v/v PBS (20°C)를 포함하는 4.5mL의 혈청 분석 완충액(Serum Assay Buffer; SAB)에 피펫으로 넣고 3회 혼합하기 위해 볼텍싱하였다. 혈청이 상단의 지질층 아래에서 샘플링되나 침전물이 있는 경우 튜브의 바닥에 닿지 않도록 흡인하는 동안 튜브를 기울였다. 이 혈청/혈장 희석 과정은 클래스 II 생물학적 안전 캐비닛에서 수행되었다. 올바른 샘플이 올바른 튜브에 추가되었는지 확인하기 위해 배치 기록을 그에 따라 표시하였다.

3. 바이오마커 분석

어레이를 집게를 사용하여 저장 완충액에서 제거하고 200mL의 차가운 SAB(4℃)를 포함하는 슬라이드 상자 및 랙에 위치시키고 50 rpm에서 진탕기에서 5분 동안 진탕하였다. 슬라이드 세척이 완료되면, 슬라이드를 어레이 쪽이 위로 향하게 하여 이전에 희석된 개별 혈청이 있는 슬라이드 혼성화 챔버에 배치하였다. 모든 슬라이드를 바코드 스캐너를 사용하여 관련 배치 기록으로 스캔하고 20 ℃에서 2 시간 동안 50 rpm으로 냉장 진탕기에서 배양하였다.

4. 혈청 결합 후 어레이 세척

그런 다음 단백질 어레이 슬라이드를 30mL SAB로 개별 "Pap jars"에서 두 번 헹군 다음, 실온에서 50 rpm으로 진탕기에서 20 분 동안 슬라이드 염색 상자에서 200mL SAB 완충액으로 헹구었다. 모든 슬라이드는 동일한 방향으로 순차적으로 전달되었다.

5. Cy3-항 IgG와 배양

복제 면역체 어레이 상의 어레이된 항원에 대한 자가항체의 결합은 Cy3-토끼 항-인간 IgG와의 인큐베이션에 의해 검출되었다. 어레이를 20 ℃에서 50 rpm으로 2시간 동안 SAB 완충액에 1000 배로 희석된 Cy3-토끼 항-인간 IgG 용액의 혼합물을 함유하는 혼성화 용액에 침지시켰다.

6. Cy3-항 IgG와 인큐베이션 후 세척

인큐베이션 후, 슬라이드를 실온에서 50 rpm에서 5분 동안 200mL의 SAB 완충액에 3회 침지하였다. 200 mL의 순수한 물에 슬라이드를 몇 분 동안 담가 과잉 버퍼를 제거하였다. 그런 다음 슬라이드를 실온에서 240 g에서 2 분 동안 건조시켰다. 그런 다음 슬라이드를 스캔할 때까지 (바람직하게는 같은 날) 실온에서 보관하였다. 혼성화 신호는 10 μm 해상도에서 마이크로어레이 레이저 스캐너(Agilent Scanner)로 측정하였다. Agilent Feature Extraction 소프트웨어를 사용하여 각 지점을 플롯팅하여 제조사의 지침에 따라 형광 강도를 검출하였다.

지점 세분화 반자동 QC 프로세스를 실행하여 실행 가능한 결과를 생성하였다. 마이크로어레이 스캐너로부터의 출력은 raw .tiff 형식 이미지 파일이다. GenePix Pro 7 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 어레이 상의 각 지점의 추출 및 정량화를 수행하였다. 이미지 분석을 돕기 위해 어레이용 GAL(GenePix Array List) 파일이 생성되었다. GenePix Pro 7을 사용하면 데이터 추출을 위해 어레이 상의 각 스폿을 자동으로 스폿 그리딩 및 정렬할 수 있다. 데이터 추출 후, 각 지점에 대한 숫자 정보가 포함된 GenePix 결과(.GPR) 파일이 각 슬라이드에 대해 생성되었다; 단백질 ID, 단백질 이름, 전경 강도, 배경 강도 등.

생물정보학 분석.

1. 이미지 분석: 원시 데이터 추출

이미지 분석의 목적은 각 프로브된 지점 내 모든 픽셀의 중앙값 강도를 측정하여 혈청 샘플에 존재하는 자가항체의 양을 평가하는 것이다. 각 슬라이드, 즉, 각 샘플에 대해 raw .tiff 형식 이미지 파일이 생성된다. 어레이 상의 각 프로브된 지점에 대한 통계를 출력하는 GenePix Pro 7 소프트웨어(Molecular Devices)를 사용하여 어레이 상의 각 지점에 대한 자동 추출 및 정량화가 수행된다. 여기에는 로컬 배경과 함께 한 지점 내 픽셀 강도의 평균과 중앙값이 포함된다. 어레이에 대한 GAL(GenePix Array List) 파일은 이미지 분석을 돕기 위해 생성된다. 이 파일에는 모든 프로브된 지점의 정보와 어레이 상에서 해당 지점의 위치가 포함되어 있다. 데이터 추출 후, 각 지점에 대한 정보가 포함된 GenePix 결과(.GPR) 파일이 각 슬라이드에 대해 생성된다; 단백질 ID, 단백질 이름, 전경 강도, 배경 강도 등. 실험에서 생성된 데이터 시트에서, 각 지점의 전경 및 배경 강도는 모두 상대 형광 단위(relative fluorescence units; RFU)로 표시된다.

2. 데이터 처리 및 전처리

각 슬라이드에 대해, 단백질 및 대조군 프로브는 각 슬라이드에 4개의 어레이로 4중으로 표시된다. 데이터 분석을 진행하기 전에 단백질 어레이 데이터의 품질을 입증하기 위해 다음 단계를 수행하였다:

1 단계:

각 지점의 전경 신호 강도에서 배경 신호 강도를 빼서 각 지점에 대한 순 강도를 계산한다. 각 지점에 대해, 지점을 중심으로 지점 직경의 3배인 원형 영역을 사용하여 배경 신호 강도를 계산하였다.

2 단계:

RFU ≤ 0인 복제 지점을 제거한다.

3단계:

스캐너의 판독 용량을 초과할 수 있는 어레이 전체의 지점 내에서 포화 픽셀이 보여서는 안 된다(스캐너의 최대 RFU는 65536 RFU). 따라서 픽셀의 > 20 %에서 포화를 나타내는 스팟/초는 ≤ 2 복제/초에서 발생하는 경우 제거되었다. 해당 단백질 또는 프로브의 3개 이상의 복제에서 포화 지점이 발생하는 경우 이러한 단백질/프로브는 "SAT"로 표시되고 다운스트림 분석에서 제외되었다.

4단계:

복제 지점이 1개만 남아 있으면 순 강도가 0이다.

5단계:

각 슬라이드의 복제 지점 간의 변동을 결정하기 위해 변이 계수(CV%)의 백분율을 계산한다.

식 1

2개 이하의 복제/초만 남아 있고 CV% > 20%인 복제 지점 세트를 "높은 CV"로 플래그 지정한다. 이러한 복제 지점(즉, 단백질)의 평균 RFU는 다운스트림 분석에서 제외된다.

CV% > 20%이고 3개 이상의 복제 지점이 남아 있는 단백질/대조군에 대해, 이러한 높은 CV% 값을 초래하는 복제 지점을 걸러냈다. 이것은 각 복제 지점 세트에 대한 순 강도의 중앙값과 개별 순 강도 사이의 표준 편차를 계산하여 수행되었다. 표준편차가 가장 큰 부분을 제거하였다. CV% 값을 다시 계산하고 프로세스를 반복하였다.

6단계:

나머지 복제 지점에 대한 순 강도의 평균을 계산한다.

7단계:

분위수-기반 및 총 강도-기반 모듈을 모두 사용하여 데이터의 복합 정규화. 이 방법은 서로 다른 샘플이 대조군 프로브의 공통 기본 분포를 공유하면서 그 안에 플래그가 지정된 지점의 잠재적인 존재를 고려한다고 가정한다. 면역체 어레이는 슬라이드 전반에 걸쳐 양성 대조군 지점으로 Cy3-표지된 비오틴화된 BSA(Cy3-BSA) 복제를 사용한다. 따라서 주어진 연구에 대한 신호 강도의 정규화를 위한 하우스키핑 프로브로 간주된다.

분위수 모듈(quantile module)은 Bolstad et al., 2003 [11]에 의해 설명된 알고리즘을 채택한다. 이 재구성을 통해 모든 Cy3BSA 대조군 프로브에서 이상값 또는 플래그가 지정된 지점을 감지하고 처리할 수 있다. 그런 다음 총 강도-기반 모듈을 구현하여 각 샘플에 대한 스케일링 계수를 얻었다. 이 방법은 정규화 후 양성 대조군이 모든 샘플에서 공통된 총 강도 값을 가져야 한다고 가정한다. 이 복합 방법은 샘플 전체에서 표적화된 생물학적 활성을 보존하면서 측정의 변화로부터 단백질 어레이 데이터를 정규화하는 것을 목표로 한다. 단계는 다음과 같다:

모든 샘플에서 모든 cy3BSA의 분위수-기반 정규화

(i=지점 번호 및 j=샘플 번호)

1. 모든 샘플에 대해 모든 Cy3-BSA j를 i X j 행렬 X에 로딩

2. X _sort 를 얻기 위해 X의 각 열 j에서 지점 강도를 정렬

3. < X _i >를 얻기 위해 X _sort 의 각 행 i에서 평균을 취함

강도-기반 정규화

1. 각 행 i의 평균 합계를 계산, ∑ <Xi>

2. 각 샘플 k에 대해 모든 Cy3-BSA 대조군의 합계를 계산, ∑Xk

3. 각 샘플 k에 대해

식 2

데이터 분석

1557개의 자가항체 측정에서 얻은 형광 신호는 모든 매개변수 분석에 앞서 정규성(normality)을 보장하기 위해 대수 변환되었다. 단방향 ANOVA를 i) 모든 그룹 (건강한 노인, 중간 건강 상태를 가진 노인, 건강하지 않은 노인 및 젊은 대조군) 간 및 ii) 노인 (건강, 중간 정도 및 건강하지 않음) 간의 1557 개의 자가항체 측정 각각에 대해 수행하여 나머지 그룹과 비교하여 그룹 중 하나 이상에서 유의하게 다른 자가항체를 식별하였다 (표 1). 0.05의 초기 P-값 임계값을 사용하여 유의성을 나타냈다. 16개의 항원에 대한 자가항체 바이오마커는 이러한 방식으로 확인되었다: YARS[12], UBE2I[13], TCL1A[14], PPM1A[15], PHLDA1[16], GLRX3[17], FHOD2[18], FEN1[19], CASP10[20], MAPK13[21], MAP4[22], FKBP3[23], CD96[24], AURKA[25], ASPSCR1[26] 및 AAK[27], 도 3에 나타냄. 이 16개 항원 중, AURKA, FEN1, GLRX3, PHLDA1, PPM1A, FKBP3, CD96 및 MAPK13은 두 분석(모든 그룹 간 및 노인 간)에서 < 0.02의 P-값을 갖는 것으로 나타났다.

바이오마커	P-값
	모든 그룹 간	노인 간
AURKA	0.000912	1.41E-03
FEN1	0.00772	0.00592
GLRX3	0.00289	0.00633
PHLDA1	0.00476	0.00799
PPM1A	7.61E-05	0.0108
FKBP3	0.00504	0.0114
CD96	0.00593	0.0116
MAPK13	0.0191	0.0165
MAP4	0.0376	0.0172
TCL1A	0.000814	0.0211
FHOD2	1.05E-04	0.0212
CASP10	5.91E-05	0.023
ASPSCR1	0.0317	0.0281
YARS	0.0761	0.045
AAK1	0.0126	0.0453
UBE2I	0.0036	0.0496

경로 농축 분석(pathway enrichment analysis) 결과, 16개 중 4개(PHLDA1, AURKA, FEN1 및 UBE2I)가 노화 과정에서 변화되는 세포 주기 및 DNA 복구 경로에 관여하는 것으로 나타났다.

16개의 개별 자가항체 각각이 그 자체로 건강 상태에 대한 약한 예측인자임을 감안할 때, tSNE를 사용한 차원 축소를 수행하여 16개 자가항체의 집합적 능력을 확인하여 건강 그룹을 구별하였다. 도 4a에서 볼 수 있듯이, tSNE를 사용한 차원 축소는 2개의 tSNE 차원이 3개의 건강 그룹을 구별할 수 있음을 보여준다. 16개의 자가항체의 특이성은 도 4b에 나타내었다.

각 건강 상태에 특정한 자가항체를 확인하기 위해, Welch 보정을 사용한 일련의 t-검정을 사용하여 확인된 16개의 모든 자가항체에 대해 나머지 건강 상태를 테스트하였다. 자가항체 각각에 대해, 3가지 건강 상태 중 가장 좋은 t-검정 결과를 해당 건강 상태에 대한 자가 항체 선택으로 선택하였다. 이를 통해 PHLDA1 및 CD96은 건강한 그룹에 대해 특이적이고, URKA, FEN1, CASP10 및 AAK은 중간 정도 그룹에 대해 특이적이고, 나머지는 건강하지 않은 그룹에 특이적임을 확인하였다 (도 4c). 건강 및 중간 정도 자가항체는 비전염성 질병에 대한 보호 역할을 할 수 있다. 평균 RFU는 나머지에 대해 관심 건강 상태 그룹을 구별하는 자가 항체의 중요성을 보여주는 t-검정의 P-값과 함께 각 건강 상태 그룹에 대해 표시되었다.

본 발명은 상기 및 EP1470229에 기재된 바와 같이 관심 단백질을 코딩하는 유전자와 인프레임(in-frame)으로 클로닝되는 비오틴 카복실 운반체 단백질(BCCP) 폴딩 마커를 이용한다. E. coli BCCP 도메인의 구조는 도 1에 도시되어 있으며, 여기서 잔기 77-156이 도시되어(좌표 파일 1bdo) N- 및 C- 말단 및 비오틴 리가제에 의해 in vivo에서 라이신 122에 부착되는 단일 비오틴 모이어티를 보여준다.

BCCP는 단백질 폴딩 마커뿐만 아니라 단백질 용해도 증진제로도 작용한다. BCCP는 관심 단백질의 N- 또는 C-말단에 융합될 수 있다. 전장 단백질은 BCCP 폴딩 마커에 대한 융합으로 발현되며, 이는 in vivo에서 비오틴화되지만 단백질이 올바르게 폴딩될 때만 가능하다. 반대로 잘못 폴딩된 단백질은 BCCP의 미스폴딩을 유도하여 숙주 비오틴 리가아제에 의해 비오틴화될 수 없다. 따라서, 미스폴딩된 단백질은 스트렙타비딘-코팅된 고체 지지체에 특이적으로 부착할 수 없다. 따라서, 올바르게 폴딩된 단백질만 BCCP 태그를 통해 고체 지지체에 부착된다.

지지체의 표면 화학은 신중하게 설계되었으며 단백질 지점 형태를 유지하고 어레이 전체에서 일관된 지점 크기를 보장하는 3차원 박막 중합체 기저 층(폴리에틸렌 글리콜, PEG)을 사용할 수 있다. PEG 층은 비특이적 결합을 억제하므로 다른 플랫폼을 사용하여 관찰되는 높은 배경을 줄인다. 따라서 선택된 바이오마커를 고정하는데 사용되는 고체 지지체는 비특이적 거대분자 흡착에 저항하고 비특이적 배경 결합을 최소화하여 우수한 신호-대-노이즈 비율 및 낮은 검출 한계 (즉, 개선된 감도)를 제공하도록 설계되었다. 또한, PEG 층은 고정화 후 배열된 단백질 및 단백질 복합체의 폴딩된 구조와 기능을 보존한다. 이는 인간 혈청 항체가 일반적으로 폴딩되지 않은 단백질의 노출된 소수성 표면에 비특이적으로 결합하므로, 폴딩되지 않은 단백질 어레이에 대한 혈청학적 분석에서 위양성을 유발하는 것으로 알려져 있고, 더욱이, 인간 자가항체가 일반적으로 불연속적인 에피토프에 결합하므로 폴딩되지 않은 단백질 또는 미스폴딩된 단백질 어레이에 대한 혈청학적 분석은 자가항체 결합 분석에서 위음성을 유발할 것이므로 이는 정확한 진단에 있어 중요하다.

스트렙타비딘-코팅된 표면에 결합된 비오틴화된 단백질은 무시할 수 있는 해리를 나타내므로, 이러한 상호작용은 단백질을 평면 표면에 연결하는 우수한 수단을 제공하며 단백질 어레이, SPR 및 비드-기반 분석과 같은 응용 분야에 이상적이다. 컴팩트하고, 폴딩된, 비오틴화된 80개 잔기 도메인 BCCP의 사용은 예를 들어 AviTag 및 인테인-기반 태그에 비해 두 가지 중요한 이점을 제공한다. 첫째, BCCP 도메인은 E. coli 비오틴 리가아제를 공동 발현할 필요 없이 효모, 곤충, 및 포유동물 세포에서 효율적으로 비오틴화될 수 있도록 하는 진핵생물 비오틴 리가아제에 의해 교차-인식된다. 둘째, BCCP의 N-말단과 C-말단은 비오틴화 사이트로부터 50 Å 물리적으로 분리되어 있으므로 (도 1 참조), BCCP 도메인은 재조합 단백질을 고체 지지체 표면으로부터 멀리 떨어뜨려 고정으로 인한 유해한 영향을 최소화하는 줄기로 생각할 수 있다.

가장 복잡한 단백질의 BCCP 폴딩 마커 매개 발현의 성공률은 98%를 초과한다. 따라서 이 기술을 고도로 병렬화된 파이프라인에 적용하여 기능적으로 검증된 단백질의 높은 처리량, 매우 일관된 생산을 달성할 수 있다.

BCCP를 추가하면 in vivo 비오틴화 정도를 측정하여 융합 단백질 폴딩을 모니터링할 수 있다. 이는 SDS-PAGE를 사용하는 표준 블로팅 절차 또는 in situ 콜로니 용해 및 샘플을 막으로 이동시킨 후 스트렙타비딘-홀스래디시 퍼옥시다아제와 같은 스트렙타비딘 접합체를 사용하여 비오틴화된 단백질을 검출하여 측정할 수 있다. 또한, BCCP 도메인이 in vivo에서 비오틴화된다는 사실은 단백질이 세포 용해물로부터 동시에 정제되고 스트렙타비딘 표면이 나타내는 높은 친화도 및 특이성을 통해 단일 단계에서 고정될 수 있기 때문에 단백질 어레이의 제작을 위한 다중 단백질 정제 시 특히 유용하다.

도 3은 세포 주기와 세포 사멸 과정을 특징으로 하는 노인의 단백질을 구별하는 것을 보여준다. (a) 다양한 노인 건강 상태를 구별하는 16개의 단백질-표적과 관련된 p-값. YARS 단백질에 대한 혈청/혈장 항체 판독값만 노인과 YC 개체를 구별하지 않는다 (p>0.05) (b) 5개의 단백질 판독값은 농축 경로 분석(String)에 의한 세포 주기(PHLDA1, AURKA, FEN1), DNA 복구(UBE2I, FEN1) 및 번역(YARS)에 연결된 경로와 밀접하게 연관되어 있다.

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SEQUENCE LISTING <110> Sengenics Corporation Pte Ltd Agency for Science, Technology and Research <120> IDENTIFICATION OF HEALTH STATUS IN THE ELDERLY USING IMMUNOLOGICAL BIOMARKERS <130> MJ550/6 <160> 32 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1422 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products <400> 1 atgaagaagt ttttcgactc ccggcgagag cagggcggct ctggcctggg ctccggctcc 60 agcggaggag ggggcagcac ctcgggcctg ggcagtggct acatcggaag agtcttcggc 120 atcgggcgac agcaggtcac agtggacgag gtgttggcgg aaggtggatt tgctattgta 180 tttctggtga ggacaagcaa tgggatgaaa tgtgccttga aacgcatgtt tgtcaacaat 240 gagcatgatc tccaggtgtg caagagagaa atccagataa tgagggatct ttcagggcac 300 aagaatattg tgggttacat tgattctagt atcaacaacg tgagtagcgg tgatgtatgg 360 gaagtgctca ttctgatgga cttttgtaga ggtggccagg tggtaaacct gatgaaccag 420 cgcctgcaaa caggctttac agagaatgaa gtgctccaga tattttgtga tacctgtgaa 480 gctgttgccc gcctgcatca gtgcaaaact cctattatcc 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caaggaaccc ataaagatgc tgagatcctg agtcatgtgt tccagtggct tgggttcaca 960 gtgcatatac acaataatgt gacgaaagtg gaaatggaga tggtcctgca gaagcagaag 1020 tgcaatccag cccatgccga cggggactgc ttcgtgttct gtattctgac ccatgggaga 1080 tttggagctg tctactcttc ggatgaggcc ctcattccca ttcgggagat catgtctcac 1140 ttcacagccc tgcagtgccc tagactggct gaaaaaccta aactcttttt catccaggcc 1200 tgccaaggtg aagagataca gccttccgta tccatcgaag cagatgctct gaaccctgag 1260 caggcaccca cttccctgca ggacagtatt cctgccgagg ctgacttcct acttggtctg 1320 gccactgtcc caggctatgt atcctttcgg catgtggagg aaggcagctg gtatattcag 1380 tctctgtgta atcatctgaa gaaattggtc ccaagacatg aagacatctt atccatcctc 1440 actgctgtca acgatgatgt gagtcgaaga gtggacaaac agggaacaaa gaaacagatg 1500 ccccagcctg ctttcacact aaggaaaaaa ctagtattcc ctgtgcccct ggatgcactt 1560 tcatta 1566 <210> 5 <211> 1206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 5 atggagaaaa aatggaaata ctgtgctgtc tattacatca tccagataca ttttgtcaag 60 ggagtttggg aaaaaacagt caacacagaa gaaaatgttt atgctacact tggctctgat 120 gtcaacctga cctgccaaac acagacagta ggcttcttcg tgcagatgca atggtccaag 180 gtcaccaata agatagacct gattgctgtc tatcatcccc aatacggctt ctactgtgcc 240 tatgggagac cctgtgagtc acttgtgact ttcacagaaa ctcctgagaa tgggtcaaaa 300 tggactctgc acttaaggaa tatgtcttgt tcagtcagtg gaaggtacga gtgtatgctt 360 gttctgtatc cagagggcat tcagactaaa atctacaacc ttctcattca gacacacgtt 420 acagcagatg aatggaacag caaccatacg atagaaatag agataaatca gactctggaa 480 ataccatgct ttcaaaatag ctcctcaaaa atttcatctg agttcaccta tgcatggtcg 540 gtggaggata atggaactca ggaaacactt atctcccaaa atcacctcat cagcaattcc 600 acattactta aagatagagt caagcttggt acagactaca gactccacct ctctccagtc 660 caaatcttcg atgatgggcg gaagttctct tgccacatta gagtcggtcc taacaaaatc 720 ttgaggagct ccaccacagt caaggttttt gctaaaccag aaatccctgt gattgtggaa 780 aataactcca cggatgtctt ggtagagaga agattcacct gcttactaaa gaatgtattt 840 cccaaagcaa atatcacatg gtttatagat ggaagttttc ttcatgatga aaaagaagga 900 atatatatta ctaatgaaga gagaaaaggc aaagatggat ttttggaact gaagtctgtt 960 ttaacaaggg tacatagtaa taaaccagcc caatcagaca acttgaccat ttggtgtatg 1020 gctctgtctc cagtcccagg aaataaagtg tggaacatct catcagaaaa gatcactttt 1080 ctcttaggtt ctgaaatttc ctcaacagac cctccactga gtgttacaga atctaccctt 1140 gacacccaac cttctccagc cagcagtgta tctcctgcaa gtaagaatgt tttcacactg 1200 agctat 1206 <210> 6 <211> 1140 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 6 atgggaattc aaggcctggc caaactaatt gctgatgtgg cccccagtgc catccgggag 60 aatgacatca agagctactt tggccgtaag gtggccattg atgcctctat gagcatttat 120 cagttcctga ttgctgttcg ccagggtggg gatgtgctgc agaatgagga gggtgagacc 180 accagccacc tgatgggcat gttctaccgc accattcgca tgatggagaa cggcatcaag 240 cccgtgtatg tctttgatgg caagccgcca cagctcaagt caggcgagct ggccaaacgc 300 agtgagcggc gggctgaggc agagaagcag ctgcagcagg ctcaggctgc tggggccgag 360 caggaggtgg aaaaattcac taagcggctg gtgaaggtca ctaagcagca caatgatgag 420 tgcaaacatc tgctgagcct catgggcatc ccttatcttg atgcacccag tgaggcagag 480 gccagctgtg ctgccctggt gaaggctggc aaagtctatg ctgcggctac cgaggacatg 540 gactgcctca ccttcggcag ccctgtgcta atgcgacacc tgactgccag tgaagccaaa 600 aagctgccaa tccaggaatt ccacctgagc cggattctgc aggagctggg cctgaaccag 660 gaacagtttg tggatctgtg catcctgcta ggcagtgact actgtgagag tatccggggt 720 attgggccca agcgggctgt ggacctcatc cagaagcaca agagcatcga ggagatcgtg 780 cggcgacttg accccaacaa gtaccctgtg ccagaaaatt ggctccacaa ggaggctcac 840 cagctcttct tggaacctga ggtgctggac ccagagtctg tggagctgaa gtggagcgag 900 ccaaatgaag aagagctgat caagttcatg tgtggtgaaa agcagttctc tgaggagcga 960 atccgcagtg gggtcaagag gctgagtaag agccgccaag gcagcaccca gggccgcctg 1020 gatgatttct tcaaggtgac cggctcactc tcttcagcta agcgcaagga gccagaaccc 1080 aagggatcca ctaagaagaa ggcaaagact ggggcagcag ggaagtttaa aaggggaaaa 1140 <210> 7 <211> 672 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic 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atggacttga ccaagagaga gtacaccatg catgaccata acacgctgct gaaggagttc 60 atcctcaaca atgaggggaa gctgaagaag ctgcaggatg atgccaagat cgcacaggat 120 gcctttgatg atgttgtgaa gtattttgga gaaaacccca agacaacacc accctctgtc 180 ttctttcctg tctttgtccg gtttgtgaaa gcatataagc aagcagaaga ggaaaatgag 240 ctgaggaaaa agcaggaaca agctctcatg gaaaaactcc tagagcaaga agctctgatg 300 gagcagcagg atccaaagtc tccttctcat aaatcaaaga ggcagcagca agagttaatt 360 gcagaattaa gaagacgaca agttaaagat aacagacatg tatatgaggg aaaagatggt 420 gccattgaag atattatcac agccttaaag aagaataata tcactaaatt tccaaatgtt 480 cactcgaggg taaggatttc ttctagcaca ccggtggtgg aggatacaca gagc 534 <210> 9 <211> 1005 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 9 atggcggcgg gggcggctga ggcagctgta gcggccgtgg aggaggtcgg ctcagccggg 60 cagtttgagg agctgctgcg cctcaaagcc aagtccctcc ttgtggtcca tttctgggca 120 ccatgggctc cacagtgtgc acagatgaac gaagttatgg cagagttagc taaagaactc 180 cctcaagttt catttgtgaa gttggaagct gaaggtgttc ctgaagtatc tgaaaaatat 240 gaaattagct ctgttcccac ttttctgttt ttcaagaatt ctcagaaaat cgaccgatta 300 gatggtgcac atgccccaga gttgaccaaa aaagttcagc gacatgcatc tagtggctcc 360 ttcctaccca gcgctaatga acatcttaaa gaagatctca accttcgctt gaagaaattg 420 actcatgctg ccccctgcat gctgtttatg aaaggaactc ctcaagaacc acgctgtggt 480 ttcagcaagc agatggtgga aattcttcac aaacataata ttcagtttag cagttttgat 540 atcttctcag atgaagaggt tcgacaggga ctcaaagcct attccagttg gcctacctat 600 cctcagctct atgtttctgg agagctcata ggaggacttg atataattaa ggagctagaa 660 gcatctgaag aactagatac aatttgtccc aaagctccca aattagagga aaggctcaaa 720 gtgctgacaa ataaagcttc tgtgatgctc tttatgaaag gaaacaaaca ggaagcaaaa 780 tgtggattca gcaaacaaat tctggaaata ctaaatagta ctggtgttga atatgaaaca 840 ttcgatatat tggaggatga agaagttcgg caaggattaa aagcttactc aaattggcca 900 acataccctc agctgtatgt gaaaggggag ctggtgggag gattggatat tgtgaaggaa 960 ctgaaagaaa atggtgaatt gctgcctata ctgagaggag aaaat 1005 <210> 10 <211> 2898 <212> DNA <213> 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tggcaggaag atcacacctc gattgctagt agactggtcc 780 acaggaattg caagtggaat gaattatttg cacctccata aaattattca tcgtgatctc 840 aaatcaccta atgttttagt gacccacaca gatgcggtaa aaatttcaga ttttggtaca 900 tctaaggaac tcagtgacaa aagtaccaag atgtcatttg ctggcacggt cgcatggatg 960 gcgccagagg tgatacggaa tgaacctgtc tctgaaaaag ttgatatatg gtcttttgga 1020 gtggtgcttt gggagctgct gacaggagag atcccttaca aagatgtaga ttcttcagcc 1080 attatctggg gtgttggaag caacagcctc caccttccag ttccttccac ttgccctgat 1140 ggattcaaaa tccttatgaa acagacgtgg cagagtaaac ctcgaaaccg accttctttt 1200 cggcagacac tcatgcattt agacattgcc tctgcagatg tacttgccac cccacaagaa 1260 acttacttca agtctcaggc tgaatggaga gaagaagtga aaaaacattt tgagaagatc 1320 aaaagtgaag gaacttgtat acaccggtta gatgaagaac tgattcgaag gcgcagagaa 1380 gagctcaggc atgcgctgga tattcgtgaa cactatgagc ggaagcttga gcgggcgaat 1440 aatttataca tggaattgag tgccatcatg ctgcagctag aaatgcggga gaaggagctc 1500 attaagcgtg agcaagcagt ggaaaagaag tatcctggga cctacaaacg acaccctgtt 1560 cgtcctatca tccatcccaa tgccatggag aaactcatga aaaggaaagg agtgcctcac 1620 aaatctggga tgcagaccaa acggccagac ttgttgagat cagaagggat ccccaccaca 1680 gaagtggctc ccactgcatc ccctttgtcc ggaagtccca aaatgtccac ttctagcagc 1740 aagagccgat atcgaagcaa accacgccac cgccgaggga atagcagagg cagccatagt 1800 gactttgccg caatcttgaa aaaccagcca gcccaggaaa attcacccca tcccacttac 1860 ctgcaccaag ctcaatccca atacccttct cttcatcacc ataattctct gcagcagcaa 1920 taccagcagc cccctcctgc catgtcccag agtcaccatc ccagactcaa tatgcacgga 1980 caggacatag caacctgcgc caacaacctg aggtatttcg gcccagcagc agccctgcgg 2040 agcccactca gcaaccatgc tcagagacag ctgcccggct cgagccctga cctcatctcc 2100 acagccatgg ctgcagactg ctggagaagt tctgagcctg acaagggcca agctggtccc 2160 tggggctgtt gccaggctga cgcttatgac ccctgccttc agtgcaggcc agaacagtat 2220 gggtccttag acataccctc tgctgagcca gtggggagga gccctgacct ttccaagtca 2280 ccagcacata atcctctctt ggaaaacgcc cagagttctg agaaaacgga agaaaatgaa 2340 ttcagcggct gtaggtctga gtcatccctc ggcacctctc atctcggcac ccctccagcg 2400 ctacctcgaa aaacaaggcc tctgcagaag agtggagatg actcctcaga agaggaagaa 2460 ggggaagtag atagtgaagt tgaatttcca cgaagacaga ggccccatcg ctgtatcagc 2520 agctgccagt catattcaac ctttagctct gagaatttct ctgtgtctga tggagaagag 2580 ggaaatacca gtgaccactc aaacagtcct gatgagttag ctgataaact tgaagaccgc 2640 ttggcagaga agctagacga cctgctgtcc cagacgccag agattcccat tgacatatcc 2700 tcacactcgg atgggctctc tgacaaggag tgtgccgtgc gccgtgtgaa gactcagatg 2760 tctctgggca agctgtgtgt ggaggaacgt ggctatgaga accccatgca gtttgaagaa 2820 tcggactgtg actcttcaga tggggagtgt tctgatgcca cagttaggac caataaacac 2880 tacagctctg ctacctgg 2898 <210> 11 <211> 2937 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 11 atggctgacc tcagtcttgc agatgcatta acagaaccat ctccagacat tgagggagag 60 ataaagcggg acttcattgc cacactagag gcagaggcct ttgatgatgt tgtgggagaa 120 actgttggaa aaacagacta tattcctctc ctggatgttg atgagaaaac cgggaactca 180 gagtcaaaga agaaaccgtg ctcagaaact agccagattg aagatactcc atcttctaaa 240 ccaacactcc tagccaatgg tggtcatgga gtagaaggga gcgatactac agggtctcca 300 actgaattcc ttgaagagaa aatggcctac caggaatacc caaatagcca gaactggcca 360 gaagatacca acttttgttt ccaacctgag caagtggtcg atcctatcca gactgatccc 420 tttaagatgt accatgatga tgacctggca gatttggtct ttccctccag tgcgacagct 480 gatacttcaa tatttgcagg acaaaatgat cccttgaaag acagttacgg tatgtctccc 540 tgcaacacag ctgttgtacc tcaggggtgg tctgtggaag ccttaaactc tccacactca 600 gagtcctttg tttccccaga ggctgttgca gaacctcctc agccaacggc agttccctta 660 gagctagcca aggagataga aatggcatca gaagagaggc caccagcaca agcattggaa 720 ataatgatgg gactgaagac tactgacatg gcaccatcta aagaaacaga gatggccctc 780 gccaaggaca tggcactagc tacaaaaacc gaggtggcat tggctaaaga tatggaatca 840 cccaccaaat tagatgtgac actggccaag gacatgcagc catccatgga atcagatatg 900 gccctagtca aggacatgga actacccaca gaaaaagaag tggccctggt taaggatgtc 960 agatggccca cagaaacaga tgtatcttca gccaagaatg tggtactgcc cacagaaaca 1020 gaggtagccc cagccaagga tgtgacactg ttgaaagaaa cagagagggc atctcctata 1080 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gaggctcctc tgtgtccggg tccccctgct ggggaggagc cggccatctc tgaggcagcg 2820 cctgaagctg gcgcccccac ttcagccagt ggcctcaatg gccaccccac cctgtcaggg 2880 ggtggtgacc aaagggaggc ccagaccttg gacagccaga tccaggagac aagcatc 2937 <210> 12 <211> 777 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 12 atgctggaga gtagcggctg caaagcgctg aaggagggcg tgctggagaa gcgcagcgac 60 gggttgttgc agctctggaa gaaaaagtgt tgcatcctca ccgaggaagg gctgctgctt 120 atcccgccca agcagctgca acaccagcag cagcagcaac agcagcagca gcagcagcaa 180 caacagcccg ggcaggggcc ggccgagccg tcccaaccca gtggccccgc tgtcgccagc 240 ctcgagccgc cggtcaagct caaggaactg cacttctcca acatgaagac cgtggactgt 300 gtggagcgca agggcaagta catgtacttc actgtggtga tggcagaggg caaggagatc 360 gactttcggt gcccgcaaga ccagggctgg aacgccgaga tcacgctgca gatggtgcag 420 tacaagaatc gtcaggccat cctggcggtc aaatccacgc ggcagaagca gcagcacctg 480 gtccagcagc agcccccctc gcagccgcag ccgcagccgc agctccagcc ccaaccccag 540 cctcagcctc agccgcaacc ccagccccaa tcacaacccc agcctcagcc ccaacccaag 600 cctcagcccc agcagctcca cccgtatccg catccacatc cacatccaca ctctcatcct 660 cactcgcacc cacaccctca cccgcacccg catccgcacc aaataccgca cccacaccca 720 cagccgcact cgcagccgca cgggcaccgg cttctccgca gcacctccaa ctctgcc 777 <210> 13 <211> 1146 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 13 atgggagcat ttttagacaa gccaaagatg gaaaagcata atgcccaggg gcagggtaat 60 gggttgcgat atgggctaag cagcatgcaa ggctggcgtg ttgaaatgga ggatgcacat 120 acggctgtga tcggtttgcc aagtggactt gaatcgtggt cattctttgc tgtgtatgat 180 gggcatgctg gttctcaggt tgccaaatac tgctgtgagc atttgttaga tcacatcacc 240 aataaccagg attttaaagg gtctgcagga gcaccttctg tggaaaatgt aaagaatgga 300 atcagaacag gttttctgga gattgatgaa cacatgagag ttatgtcaga gaagaaacat 360 ggtgcagata gaagtgggtc aacagctgta ggtgtcttaa tttctcccca acatacttat 420 ttcattaact gtggagactc aagaggttta ctttgtagga acaggaaagt tcatttcttc 480 acacaagatc acaaaccaag taatccgctg gagaaagaac gaattcagaa tgcaggtggc 540 tctgtaatga ttcagcgtgt gaatggctct ctggctgtat cgagggccct tggggatttt 600 gattacaaat gtgtccatgg aaaaggtcct actgagcagc ttgtctcacc agagcctgaa 660 gtccatgata ttgaaagatc tgaagaagat gatcagttca ttatccttgc atgtgatggt 720 atctgggatg ttatgggaaa tgaagagctc tgtgattttg taagatccag acttgaagtc 780 actgatgacc ttgagaaagt ttgcaatgaa gtagtcgaca cctgtttgta taagggaagt 840 cgagacaaca tgagtgtgat tttgatctgt tttccaaatg cacccaaagt atcgccagaa 900 gcagtgaaga aggaggcaga gttggacaag tacctggaat gcagagtaga agaaatcata 960 aagaagcagg gggaaggcgt ccccgactta gtccatgtga tgcgcacatt agcgagtgag 1020 aacatcccca gcctcccacc agggggtgaa ttggcaagca agaggaatgt tattgaagcc 1080 gtttacaata gactgaatcc ttacaaaaat gacgacactg actctacatc aacagatgat 1140 atgtgg 1146 <210> 14 <211> 342 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 14 atggccgagt gcccgacact cggggaggca gtcaccgacc acccggaccg cctgtgggcc 60 tgggagaagt tcgtgtattt ggacgagaag cagcacgcct ggctgccctt aaccatcgag 120 ataaaggata ggttacagtt acgggtgctc ttgcgtcggg aagacgtcgt cctggggagg 180 cctatgaccc ccacccagat aggcccaagc ctgctgccta tcatgtggca gctctaccct 240 gatggacgat accgatcctc agactccagt ttctggcgct tagtgtacca catcaagatt 300 gacggcgtgg aggacatgct tctcgagctg ctgccagatg ac 342 <210> 15 <211> 474 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 15 atgtcgggga tcgccctcag cagactcgcc caggagagga aagcatggag gaaagaccac 60 ccatttggtt tcgtggctgt cccaacaaaa aatcccgatg gcacgatgaa cctcatgaac 120 tgggagtgcg ccattccagg aaagaaaggg actccgtggg aaggaggctt gtttaaacta 180 cggatgcttt tcaaagatga ttatccatct tcgccaccaa aatgtaaatt cgaaccacca 240 ttatttcacc cgaatgtgta cccttcgggg acagtgtgcc tgtccatctt agaggaggac 300 aaggactgga ggccagccat cacaatcaaa cagatcctat taggaataca ggaacttcta 360 aatgaaccaa atatccaaga cccagctcaa gcagaggcct acacgattta ctgccaaaac 420 agagtggagt acgagaaaag ggtccgagca caagccaaga agtttgcgcc ctca 474 <210> 16 <211> 1585 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 16 atgggggacg ctcccagccc tgaagagaaa ctgcacctta tcacccggaa cctgcaggag 60 gttctggggg aagagaagct gaaggagata ctgaaggagc gggaacttaa aatttactgg 120 ggaacggcaa ccacgggcaa accacatgtg gcttactttg tgcccatgtc aaagattgca 180 gacttcttaa aggcagggtg tgaggtaaca attctgtttg cggacctcca cgcatacctg 240 gataacatga aagccccatg ggaacttcta gaactccgag tcagttacta tgagaatgtg 300 atcaaagcaa tgctggagag cattggtgtg cccttggaga agctcaagtt catcaaaggc 360 actgattacc agctcagcaa agagtacaca ctagatgtgt acagactctc ctccgtggtc 420 acacagcacg attccaagaa ggctggagct gaggtggtaa agcaggtgga gcaccctttg 480 ctgagtggcc tcttataccc cggactgcag gctttggatg aagagtattt aaaagtagat 540 gcccaatttg gaggcattga tcagagaaag attttcacct ttgcagagaa gtacctccct 600 gcacttggct attcaaaacg ggtccatctg atgaatccta tggttccagg attaacaggc 660 agcaaaatga gctcttcaga agaggagtcc aagattgatc tccttgatcg gaaggaggat 720 gtgaagaaaa aactgaagaa ggccttctgt gagccaggaa atgtggagaa caatggggtt 780 ctgtccttca tcaagcatgt cctttttccc cttaagtccg agtttgtgat cctacgagat 840 gagaaatggg gtggaaacaa aacctacaca gcttacgtgg acctggaaaa ggactttgct 900 gctgaggttg tacatcctgg agacctgaag aattctgttg aagtcgcact gaacaagttg 960 ctggatccaa tccgggaaaa gtttaatacc cctgccctga aaaaactggc cagcgctgcc 1020 tacccagatc cctcaaagca gaagccaatg gccaaaggcc ctgccaagaa ttcagaacca 1080 gaggaggtca tcccatcccg gctggatatc cgtgtgggga aaatcatcac tgtggagaag 1140 cacccagatg cagacagcct gtatgtagag aagattgacg tgggggaagc tgaaccacgg 1200 actgtggtga gcggcctggt acagttcgtg cccaaggagg aactgcagga caggctggta 1260 gtggtgctgt gcaacctgaa accccagaag atgagaggag tcgagtccca aggcatgctt 1320 ctgtgtgctt ctatagaagg gataaaccgc caggttgaac ctctggaccc tccggcaggc 1380 tctgctcctg gtgagcacgt gtttgtgaag ggctatgaaa agggccaacc agatgaggag 1440 ctcaagccca agaagaaagt cttcgagaag ttgcaggctg acttcaaaat ttctgaggag 1500 tgcatcgcac agtggaagca aaccaacttc atgaccaagc tgggctccat ttcctgtaaa 1560 tcgctgaaag gggggaacat tagcc 1585 <210> 17 <211> 961 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 17 Met Lys Lys Phe Phe Asp Ser Arg Arg Glu Gln Gly Gly Ser Gly Leu 1 5 10 15 Gly Ser Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Gly Leu Gly Ser 20 25 30 Gly Tyr Ile Gly Arg Val Phe Gly Ile Gly Arg Gln Gln Val Thr Val 35 40 45 Asp Glu Val Leu Ala Glu Gly Gly Phe Ala Ile Val Phe Leu Val Arg 50 55 60 Thr Ser Asn Gly Met Lys Cys Ala Leu Lys Arg Met Phe Val Asn Asn 65 70 75 80 Glu His Asp Leu Gln Val Cys Lys Arg Glu Ile Gln Ile Met Arg Asp 85 90 95 Leu Ser Gly His Lys Asn Ile Val Gly Tyr Ile Asp Ser Ser Ile Asn 100 105 110 Asn Val Ser Ser Gly Asp Val Trp Glu Val Leu Ile Leu Met Asp Phe 115 120 125 Cys Arg Gly Gly Gln Val Val Asn Leu Met Asn Gln Arg Leu Gln Thr 130 135 140 Gly Phe Thr Glu Asn Glu Val Leu Gln Ile Phe Cys Asp Thr Cys Glu 145 150 155 160 Ala Val Ala Arg Leu His Gln Cys Lys Thr Pro Ile Ile His Arg Asp 165 170 175 Leu Lys Val Glu Asn Ile Leu Leu His Asp Arg Gly His Tyr Val Leu 180 185 190 Cys Asp Phe Gly Ser Ala Thr Asn Lys Phe Gln Asn Pro Gln Thr Glu 195 200 205 Gly Val Asn Ala Val Glu Asp Glu Ile Lys Lys Tyr Thr Thr Leu Ser 210 215 220 Tyr Arg Ala Pro Glu Met Val Asn Leu Tyr Ser Gly Lys Ile Ile Thr 225 230 235 240 Thr Lys Ala Asp Ile Trp Ala Leu Gly Cys Leu Leu Tyr Lys Leu Cys 245 250 255 Tyr Phe Thr Leu Pro Phe Gly Glu Ser Gln Val Ala Ile Cys Asp Gly 260 265 270 Asn Phe Thr Ile Pro Asp Asn Ser Arg Tyr Ser Gln Asp Met His Cys 275 280 285 Leu Ile Arg Tyr Met Leu Glu Pro Asp Pro Asp Lys Arg Pro Asp Ile 290 295 300 Tyr Gln Val Ser Tyr Phe Ser Phe Lys Leu Leu Lys Lys Glu Cys Pro 305 310 315 320 Ile Pro Asn Val Gln Asn Ser Pro Ile Pro Ala Lys Leu Pro Glu Pro 325 330 335 Val Lys Ala Ser Glu Ala Ala Ala Lys Lys Thr Gln Pro Lys Ala Arg 340 345 350 Leu Thr Asp Pro Ile Pro Thr Thr Glu Thr Ser Ile Ala Pro Arg Gln 355 360 365 Arg Pro Lys Ala Gly Gln Thr Gln Pro Asn Pro Gly Ile Leu Pro Ile 370 375 380 Gln Pro Ala Leu Thr Pro Arg Lys Arg Ala Thr Val Gln Pro Pro Pro 385 390 395 400 Gln Ala Ala Gly Ser Ser Asn Gln Pro Gly Leu Leu Ala Ser Val Pro 405 410 415 Gln Pro Lys Pro Gln Ala Pro Pro Ser Gln Pro Leu Pro Gln Thr Gln 420 425 430 Ala Lys Gln Pro Gln Ala Pro Pro Thr Pro Gln Gln Thr Pro Ser Thr 435 440 445 Gln Ala Gln Gly Leu Pro Ala Gln Ala Gln Ala Thr Pro Gln His Gln 450 455 460 Gln Gln Leu Phe Leu Lys Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro Pro 465 470 475 480 Ala Gln Gln Gln Pro Ala Gly Thr Phe Tyr Gln Gln Gln Gln Ala Gln 485 490 495 Thr Gln Gln Phe Gln Ala Val His Pro Ala Thr Gln Lys Pro Ala Ile 500 505 510 Ala Gln Phe Pro Val Val Ser Gln Gly Gly Ser Gln Gln Gln Leu Met 515 520 525 Gln Asn Phe Tyr Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln 530 535 540 Gln Gln Leu Ala Thr Ala Leu His Gln Gln Gln Leu Met Thr Gln Gln 545 550 555 560 Ala Ala Leu Gln Gln Lys Pro Thr Met Ala Ala Gly Gln Gln Pro Gln 565 570 575 Pro Gln Pro Ala Ala Ala Pro Gln Pro Ala Pro Ala Gln Glu Pro Ala 580 585 590 Ile Gln Ala Pro Val Arg Gln Gln Pro Lys Val Gln Thr Thr Pro Pro 595 600 605 Pro Ala Val Gln Gly Gln Lys Val Gly Ser Leu Thr Pro Pro Ser Ser 610 615 620 Pro Lys Thr Gln Arg Ala Gly His Arg Arg Ile Leu Ser Asp Val Thr 625 630 635 640 His Ser Ala Val Phe Gly Val Pro Ala Ser Lys Ser Thr Gln Leu Leu 645 650 655 Gln Ala Ala Ala Ala Glu Ala Ser Leu Asn Lys Ser Lys Ser Ala Thr 660 665 670 Thr Thr Pro Ser Gly Ser Pro Arg Thr Ser Gln Gln Asn Val Tyr Asn 675 680 685 Pro Ser Glu Gly Ser Thr Trp Asn Pro Phe Asp Asp Asp Asn Phe Ser 690 695 700 Lys Leu Thr Ala Glu Glu Leu Leu Asn Lys Asp Phe Ala Lys Leu Gly 705 710 715 720 Glu Gly Lys His Pro Glu Lys Leu Gly Gly Ser Ala Glu Ser Leu Ile 725 730 735 Pro Gly Phe Gln Ser Thr Gln Gly Asp Ala Phe Ala Thr Thr Ser Phe 740 745 750 Ser Ala Gly Thr Ala Glu Lys Arg Lys Gly Gly Gln Thr Val Asp Ser 755 760 765 Gly Leu Pro Leu Leu Ser Val Ser Asp Pro Phe Ile Pro Leu Gln Val 770 775 780 Pro Asp Ala Pro Glu Lys Leu Ile Glu Gly Leu Lys Ser Pro Asp Thr 785 790 795 800 Ser Leu Leu Leu Pro Asp Leu Leu Pro Met Thr Asp Pro Phe Gly Ser 805 810 815 Thr Ser Asp Ala Val Ile Glu Lys Ala Asp Val Ala Val Glu Ser Leu 820 825 830 Ile Pro Gly Leu Glu Pro Pro Val Pro Gln Arg Leu Pro Ser Gln Thr 835 840 845 Glu Ser Val Thr Ser Asn Arg Thr Asp Ser Leu Thr Gly Glu Asp Ser 850 855 860 Leu Leu Asp Cys Ser Leu Leu Ser Asn Pro Thr Thr Asp Leu Leu Glu 865 870 875 880 Glu Phe Ala Pro Thr Ala Ile Ser Ala Pro Val His Lys Ala Ala Glu 885 890 895 Asp Ser Asn Leu Ile Ser Gly Phe Asp Val Pro Glu Gly Ser Asp Lys 900 905 910 Val Ala Glu Asp Glu Phe Asp Pro Ile Pro Val Leu Ile Thr Lys Asn 915 920 925 Pro Gln Gly Gly His Ser Arg Asn Ser Ser Gly Ser Ser Glu Ser Ser 930 935 940 Leu Pro Asn Leu Ala Arg Ser Leu Leu Leu Val Asp Gln Leu Ile Asp 945 950 955 960 Leu <210> 18 <211> 553 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 18 Met Ala Ala Pro Ala Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Ser Val Leu Ala 1 5 10 15 Pro Asn Gly Arg Arg His Thr Val Lys Val Thr Pro Ser Thr Val Leu 20 25 30 Leu Gln Val Leu Glu Asp Thr Cys Arg Arg Gln Asp Phe Asn Pro Cys 35 40 45 Glu Tyr Asp Leu Lys Phe Gln Arg Ser Val Leu Asp Leu Ser Leu Gln 50 55 60 Trp Arg Phe Ala Asn Leu Pro Asn Asn Ala Lys Leu Glu Met Val Pro 65 70 75 80 Ala Ser Arg Ser Arg Glu Gly Pro Glu Asn Met Val Arg Ile Ala Leu 85 90 95 Gln Leu Asp Asp Gly Ser Arg Leu Gln Asp Ser Phe Cys Ser Gly Gln 100 105 110 Thr Leu Trp Glu Leu Leu Ser His Phe Pro Gln Ile Arg Glu Cys Leu 115 120 125 Gln His Pro Gly Gly Ala Thr Pro Val Cys Val Tyr Thr Arg Asp Glu 130 135 140 Val Thr Gly Glu Ala Ala Leu Arg Gly Thr Thr Leu Gln Ser Leu Gly 145 150 155 160 Leu Thr Gly Gly Ser Ala Thr Ile Arg Phe Val Met Lys Cys Tyr Asp 165 170 175 Pro Val Gly Lys Thr Pro Gly Ser Leu Gly Ser Ser Ala Ser Ala Gly 180 185 190 Gln Ala Ala Ala Ser Ala Pro Leu Pro Leu Glu Ser Gly Glu Leu Ser 195 200 205 Arg Gly Asp Leu Ser Arg Pro Glu Asp Ala Asp Thr Ser Gly Pro Cys 210 215 220 Cys Glu His Thr Gln Glu Lys Gln Ser Thr Arg Ala Pro Ala Ala Ala 225 230 235 240 Pro Phe Val Pro Phe Ser Gly Gly Gly Gln Arg Leu Gly Gly Pro Pro 245 250 255 Gly Pro Thr Arg Pro Leu Thr Ser Ser Ser Ala Lys Leu Pro Lys Ser 260 265 270 Leu Ser Ser Pro Gly Gly Pro Ser Lys Pro Lys Lys Ser Lys Ser Gly 275 280 285 Gln Asp Pro Gln Gln Glu Gln Glu Gln Glu Arg Glu Arg Asp Pro Gln 290 295 300 Gln Glu Gln Glu Arg Glu Arg Pro Val Asp Arg Glu Pro Val Asp Arg 305 310 315 320 Glu Pro Val Val Cys His Pro Asp Leu Glu Glu Arg Leu Gln Ala Trp 325 330 335 Pro Ala Glu Leu Pro Asp Glu Phe Phe Glu Leu Thr Val Asp Asp Val 340 345 350 Arg Arg Arg Leu Ala Gln Leu Lys Ser Glu Arg Lys Arg Leu Glu Glu 355 360 365 Ala Pro Leu Val Thr Lys Ala Phe Arg Glu Ala Gln Ile Lys Glu Lys 370 375 380 Leu Glu Arg Tyr Pro Lys Val Ala Leu Arg Val Leu Phe Pro Asp Arg 385 390 395 400 Tyr Val Leu Gln Gly Phe Phe Arg Pro 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20 25 30 Cys Gln Asn Pro Leu Pro Val Asn Ser Gly Gln Ala Gln Arg Val Leu 35 40 45 Cys Pro Ser Asn Ser Ser Gln Arg Val Pro Leu Gln Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Val Ser Ser His Lys Pro Val Gln Asn Gln Lys Gln Lys Gln Leu Gln 65 70 75 80 Ala Thr Ser Val Pro His Pro Val Ser Arg Pro Leu Asn Asn Thr Gln 85 90 95 Lys Ser Lys Gln Pro Leu Pro Ser Ala Pro Glu Asn Asn Pro Glu Glu 100 105 110 Glu Leu Ala Ser Lys Gln Lys Asn Glu Glu Ser Lys Lys Arg Gln Trp 115 120 125 Ala Leu Glu Asp Phe Glu Ile Gly Arg Pro Leu Gly Lys Gly Lys Phe 130 135 140 Gly Asn Val Tyr Leu Ala Arg Glu Lys Gln Ser Lys Phe Ile Leu Ala 145 150 155 160 Leu Lys Val Leu Phe Lys Ala Gln Leu Glu Lys Ala Gly Val Glu His 165 170 175 Gln Leu Arg Arg Glu Val Glu Ile Gln Ser His Leu Arg His Pro Asn 180 185 190 Ile Leu Arg Leu Tyr Gly Tyr Phe His Asp Ala Thr Arg Val Tyr Leu 195 200 205 Ile Leu Glu Tyr Ala Pro Leu Gly Thr Val Tyr Arg Glu Leu Gln Lys 210 215 220 Leu Ser Lys Phe Asp Glu Gln Arg Thr Ala Thr Tyr Ile Thr Glu Leu 225 230 235 240 Ala Asn Ala Leu Ser Tyr Cys His Ser Lys Arg Val Ile His Arg Asp 245 250 255 Ile Lys Pro Glu Asn Leu Leu Leu Gly Ser Ala Gly Glu Leu Lys Ile 260 265 270 Ala Asp Phe Gly Trp Ser Val His Ala Pro Ser Ser Arg Arg Thr Thr 275 280 285 Leu Cys Gly Thr Leu Asp Tyr Leu Pro Pro Glu Met Ile Glu Gly Arg 290 295 300 Met His Asp Glu Lys Val Asp Leu Trp Ser Leu Gly Val Leu Cys Tyr 305 310 315 320 Glu Phe Leu Val Gly Lys Pro Pro Phe Glu Ala Asn Thr Tyr Gln Glu 325 330 335 Thr Tyr Lys Arg Ile Ser Arg Val Glu Phe Thr Phe Pro Asp Phe Val 340 345 350 Thr Glu Gly Ala Arg Asp Leu Ile Ser Arg Leu Leu Lys His Asn Pro 355 360 365 Ser Gln Arg Pro Met Leu Arg Glu Val Leu Glu His Pro Trp Ile Thr 370 375 380 Ala Asn Ser Ser Lys Pro Ser Asn Cys Gln Asn Lys Glu Ser Ala Ser 385 390 395 400 Lys Gln Ser <210> 20 <211> 521 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 20 Met Lys Ser Gln Gly Gln His Trp Tyr Ser Ser Ser Asp Lys Asn Cys 1 5 10 15 Lys Val Ser Phe Arg Glu Lys Leu Leu Ile Ile Asp Ser Asn Leu Gly 20 25 30 Val Gln Asp Val Glu Asn Leu Lys Phe Leu Cys Ile Gly Leu Val Pro 35 40 45 Asn Lys Lys Leu Glu Lys Ser Ser Ser Ala Ser Asp Val Phe Glu His 50 55 60 Leu Leu Ala Glu Asp Leu Leu Ser Glu Glu Asp Pro Phe Phe Leu Ala 65 70 75 80 Glu Leu Leu Tyr Ile Ile Arg Gln Lys Lys Leu Leu Gln His Leu Asn 85 90 95 Cys Thr Lys Glu Glu Val Glu Arg Leu Leu Pro Thr Arg Gln Arg Val 100 105 110 Ser Leu Phe Arg Asn Leu Leu Tyr Glu Leu Ser Glu Gly Ile Asp Ser 115 120 125 Glu Asn Leu Lys Asp Met Ile Phe Leu Leu Lys Asp Ser Leu Pro Lys 130 135 140 Thr Glu Met Thr Ser Leu Ser Phe Leu Ala Phe Leu Glu Lys Gln Gly 145 150 155 160 Lys Ile Asp Glu Asp Asn Leu Thr Cys Leu Glu Asp Leu Cys Lys Thr 165 170 175 Val Val Pro Lys Leu Leu Arg Asn Ile Glu Lys Tyr Lys Arg Glu Lys 180 185 190 Ala Ile Gln Ile Val Thr Pro Pro Val Asp Lys Glu Ala Glu Ser Tyr 195 200 205 Gln Gly Glu Glu Glu Leu Val Ser Gln Thr Asp Val Lys Thr Phe Leu 210 215 220 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Glu Ala Asp Phe Leu Leu Gly Leu Ala Thr Val Pro Gly Tyr Val Ser 435 440 445 Phe Arg His Val Glu Glu Gly Ser Trp Tyr Ile Gln Ser Leu Cys Asn 450 455 460 His Leu Lys Lys Leu Val Pro Arg Met Leu Lys Phe Leu Glu Lys Thr 465 470 475 480 Met Glu Ile Arg Gly Arg Lys Arg Thr Val Trp Gly Ala Lys Gln Ile 485 490 495 Ser Ala Thr Ser Leu Pro Thr Ala Ile Ser Ala Gln Thr Pro Arg Pro 500 505 510 Pro Met Arg Arg Trp Ser Ser Val Ser 515 520 <210> 21 <211> 585 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 21 Met Glu Lys Lys Trp Lys Tyr Cys Ala Val Tyr Tyr Ile Ile Gln Ile 1 5 10 15 His Phe Val Lys Gly Val Trp Glu Lys Thr Val Asn Thr Glu Glu Asn 20 25 30 Val Tyr Ala Thr Leu Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln 35 40 45 Thr Val Gly Phe Phe Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asn Lys 50 55 60 Ile Asp Leu Ile Ala Val Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe Tyr Cys Ala 65 70 75 80 Tyr Gly Arg Pro Cys Glu Ser Leu Val 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Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 25 Met Ala Ala Gly Ala Ala Glu Ala Ala Val Ala Ala Val Glu Glu Val 1 5 10 15 Gly Ser Ala Gly Gln Phe Glu Glu Leu Leu Arg Leu Lys Ala Lys Ser 20 25 30 Leu Leu Val Val His Phe Trp Ala Pro Trp Ala Pro Gln Cys Ala Gln 35 40 45 Met Asn Glu Val Met Ala Glu Leu Ala Lys Glu Leu Pro Gln Val Ser 50 55 60 Phe Val Lys Leu Glu Ala Glu Gly Val Pro Glu Val Ser Glu Lys Tyr 65 70 75 80 Glu Ile Ser Ser Val Pro Thr Phe Leu Phe Phe Lys Asn Ser Gln Lys 85 90 95 Ile Asp Arg Leu Asp Gly Ala His Ala Pro Glu Leu Thr Lys Lys Val 100 105 110 Gln Arg His Ala Ser Ser Gly Ser Phe Leu Pro Ser Ala Asn Glu His 115 120 125 Leu Lys Glu Asp Leu Asn Leu Arg Leu Lys Lys Leu Thr His Ala Ala 130 135 140 Pro Cys Met Leu Phe Met Lys Gly Thr Pro Gln Glu Pro Arg Cys Gly 145 150 155 160 Phe Ser Lys Gln Met Val Glu Ile Leu His Lys His Asn Ile Gln Phe 165 170 175 Ser Ser Phe Asp Ile Phe Ser Asp Glu Glu Val Arg Gln 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Thr Pro Ser Ser Lys 65 70 75 80 Pro Thr Leu Leu Ala Asn Gly Gly His Gly Val Glu Gly Ser Asp Thr 85 90 95 Thr Gly Ser Pro Thr Glu Phe Leu Glu Glu Lys Met Ala Tyr Gln Glu 100 105 110 Tyr Pro Asn Ser Gln Asn Trp Pro Glu Asp Thr Asn Phe Cys Phe Gln 115 120 125 Pro Glu Gln Val Val Asp Pro Ile Gln Thr Asp Pro Phe Lys Met Tyr 130 135 140 His Asp Asp Asp Leu Ala Asp Leu Val Phe Pro Ser Ser Ala Thr Ala 145 150 155 160 Asp Thr Ser Ile Phe Ala Gly Gln Asn Asp Pro Leu Lys Asp Ser Tyr 165 170 175 Gly Met Ser Pro Cys Asn Thr Ala Val Val Pro Gln Gly Trp Ser Val 180 185 190 Glu Ala Leu Asn Ser Pro His Ser Glu Ser Phe Val Ser Pro Glu Ala 195 200 205 Val Ala Glu Pro Pro Gln Pro Thr Ala Val Pro Leu Glu Leu Ala Lys 210 215 220 Glu Ile Glu Met Ala Ser Glu Glu Arg Pro Pro Ala Gln Ala Leu Glu 225 230 235 240 Ile Met Met Gly Leu Lys Thr Thr Asp Met Ala Pro Ser Lys Glu Thr 245 250 255 Glu Met Ala Leu Ala Lys Asp Met Ala Leu Ala Thr Lys Thr Glu Val 260 265 270 Ala Leu Ala Lys Asp Met Glu Ser Pro Thr Lys Leu Asp Val Thr Leu 275 280 285 Ala Lys Asp Met Gln Pro Ser Met Glu Ser Asp Met Ala Leu Val Lys 290 295 300 Asp Met Glu Leu Pro Thr Glu Lys Glu Val Ala Leu Val Lys Asp Val 305 310 315 320 Arg Trp Pro Thr Glu Thr Asp Val Ser Ser Ala Lys Asn Val Val Leu 325 330 335 Pro Thr Glu Thr Glu Val Ala Pro Ala Lys Asp Val Thr Leu Leu Lys 340 345 350 Glu Thr Glu Arg Ala Ser Pro Ile Lys Met Asp Leu Ala Pro Ser Lys 355 360 365 Asp Met Gly Pro Pro Lys Glu Asn Lys Lys Glu Thr Glu Arg Ala Ser 370 375 380 Pro Ile Lys Met Asp Leu Ala Pro Ser Lys Asp Met Gly Pro Pro Lys 385 390 395 400 Glu Asn Lys Ile Val Pro Ala Lys Asp Leu Val Leu Leu Ser Glu Ile 405 410 415 Glu Val Ala Gln Ala Asn Asp Ile Ile Ser Ser Thr Glu Ile Ser Ser 420 425 430 Ala Glu Lys Val Ala Leu Ser Ser Glu Thr Glu Val Ala Leu Ala Arg 435 440 445 Asp Met Thr Leu Pro Pro Glu Thr Asn Val Ile Leu Thr Lys Asp Lys 450 455 460 Ala Leu Pro Leu Glu Ala Glu Val Ala Pro Val Lys Asp Met Ala Gln 465 470 475 480 Leu Pro Glu Thr Glu Ile Ala Pro Ala Lys Asp Val Ala Pro Ser Thr 485 490 495 Val Lys Glu Val Gly Leu Leu Lys Asp Met Ser Pro Leu Ser Glu Thr 500 505 510 Glu Met Ala Leu Gly Lys Asp Val Thr Pro Pro Pro Glu Thr Glu Val 515 520 525 Val Leu Ile Lys Asn Val Cys Leu Pro Pro Glu Met Glu Val Ala Leu 530 535 540 Thr Glu Asp Gln Val Pro Ala Leu Lys Thr Glu Ala Pro Leu Ala Lys 545 550 555 560 Asp Gly Val Leu Thr Leu Ala Asn Asn Val Thr Pro Ala Lys Asp Val 565 570 575 Pro Pro Leu Ser Glu Thr Glu Ala Thr Pro Val Pro Ile Lys Asp Met 580 585 590 Glu Ile Ala Gln Thr Gln Lys Gly Ile Ser Glu Asp Ser His Leu Glu 595 600 605 Ser Leu Gln Asp Val Gly Gln Ser Ala Ala Pro Thr Phe Met Ile Ser 610 615 620 Pro Glu Thr Val Thr Gly Thr Gly Lys Lys Cys Ser Leu Pro Ala Glu 625 630 635 640 Glu Asp Ser Val Leu Glu Lys Leu Gly Glu Arg Lys Pro Cys Asn Ser 645 650 655 Gln Pro Ser Glu Leu Ser Ser Glu Thr Ser Gly Ile Ala Arg Pro Glu 660 665 670 Glu Gly Arg Pro Val Val Ser Gly Thr Gly Asn Asp Ile Thr Thr Pro 675 680 685 Pro Asn Lys Glu Leu Pro Pro Ser Pro Glu Lys Lys Thr Lys Pro Leu 690 695 700 Ala Thr Thr Gln Pro Ala Lys Thr Ser Thr Ser Lys Ala Lys Thr Gln 705 710 715 720 Pro Thr Ser Leu Pro Lys Gln Pro Ala Pro Thr Thr Ile Gly Gly Leu 725 730 735 Asn Lys Lys Pro Met Ser Leu Ala Ser Gly Leu Val Pro Ala Ala Pro 740 745 750 Pro Lys Arg Pro Ala Val Ala Ser Ala Arg Pro Ser Ile Leu Pro Ser 755 760 765 Lys Asp Val Lys Pro Lys Pro Ile Ala Asp Ala Lys Ala Pro Glu Lys 770 775 780 Arg Ala Ser Pro Ser Lys Pro Ala Ser Ala Pro Ala Ser Arg Ser Gly 785 790 795 800 Ser Lys Ser Thr Gln Thr Val Ala Lys Thr Thr Thr Ala Ala Ala Val 805 810 815 Ala Ser Thr Gly Pro Ser Ser Arg Ser Pro Ser Thr Leu Leu Pro Lys 820 825 830 Lys Pro Thr Ala Ile Lys Thr Glu Gly Lys Pro Ala Glu Val Lys Lys 835 840 845 Met Thr Ala Lys Ser Val Pro Ala Asp Leu Ser Arg Pro Lys Ser Thr 850 855 860 Ser Thr Ser Ser Met Lys Lys Thr Thr Thr Leu Ser Gly Thr Ala Pro 865 870 875 880 Ala Ala Gly Val Val Pro Ser Arg Val Lys Ala Thr Pro Met Pro Ser 885 890 895 Arg Pro Ser Thr Thr Pro Phe Ile Asp Lys Lys Pro Thr Ser Ala Lys 900 905 910 Pro Ser Ser Thr Thr Pro Arg Leu Ser Arg Leu Ala Thr Asn Thr Ser 915 920 925 Ala Pro Asp Leu Lys Asn Val Arg Ser Lys Val Gly Ser Thr Glu Asn 930 935 940 Ile Lys His Gln Pro Gly Gly Gly Arg Ala Lys Val Glu Lys Lys Thr 945 950 955 960 Glu Ala Ala Ala Thr Thr Arg Lys Pro Glu Ser Asn Ala Val Thr Lys 965 970 975 Thr Ala Gly Pro Ile Ala Ser Ala Gln Lys Gln Pro Ala Gly Lys Val 980 985 990 Gln Ile Val Ser Lys Lys Val Ser Tyr Ser His Ile Gln Ser Lys Cys 995 1000 1005 Gly Ser Lys Asp Asn Ile Lys His Val Pro Gly Gly Gly Asn Val 1010 1015 1020 Gln Ile Gln Asn Lys Lys Val Asp Ile Ser Lys Val Ser Ser Lys 1025 1030 1035 Cys Gly Ser Lys Ala Asn Ile Lys His Lys Pro Gly Gly Gly Asp 1040 1045 1050 Val Lys Ile Glu Ser Gln Lys Leu Asn Phe Lys Glu Lys Ala Gln 1055 1060 1065 Ala Lys Val Gly Ser Leu Asp Asn Val Gly His Leu Pro Ala Gly 1070 1075 1080 Gly Ala Val Lys Thr Glu Gly Gly Gly Ser Glu Ala Pro Leu Cys 1085 1090 1095 Pro Gly Pro Pro Ala Gly Glu Glu Pro Ala Ile Ser Glu Ala Ala 1100 1105 1110 Pro Glu Ala Gly Ala Pro Thr Ser Ala Ser Gly Leu Asn Gly His 1115 1120 1125 Pro Thr Leu Ser Gly Gly Gly Asp Gln Arg Glu Ala Gln Thr Leu 1130 1135 1140 Asp Ser Gln Ile Gln Glu Thr Ser Ile 1145 1150 <210> 28 <211> 401 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 28 Met Arg Arg Ala Pro Ala Ala Glu Arg Leu Leu Glu Leu Gly Phe Pro 1 5 10 15 Pro Arg Cys Gly Arg Gln Glu Pro Pro Phe Pro Leu Gly Val Thr Arg 20 25 30 Gly Trp Gly Arg Trp Pro Ile Gln Lys Arg Arg Glu Gly Ala Arg Pro 35 40 45 Val Pro Phe Ser Glu Arg Ser Gln Glu Asp Gly Arg Gly Pro Ala Ala 50 55 60 Arg Ser Ser Gly Thr Leu Trp Arg Ile Arg Thr Arg Leu Ser Leu Cys 65 70 75 80 Arg Asp Pro Glu Pro Pro Pro Pro Leu Cys Leu Leu Arg Val Ser Leu 85 90 95 Leu Cys Ala Leu Arg Ala Gly Gly Arg Gly Ser Arg Trp Gly Glu Asp 100 105 110 Gly Ala Arg Leu Leu Leu Leu Pro Pro Ala Arg Ala Ala Gly Asn Gly 115 120 125 Glu Ala Glu Pro Ser Gly Gly Pro Ser Tyr Ala Gly Arg Met Leu Glu 130 135 140 Ser Ser Gly Cys Lys Ala Leu Lys Glu Gly Val Leu Glu Lys Arg Ser 145 150 155 160 Asp Gly Leu Leu Gln Leu Trp Lys Lys Lys Cys Cys Ile Leu Thr Glu 165 170 175 Glu Gly Leu Leu Leu Ile Pro Pro Lys Gln Leu Gln His Gln Gln Gln 180 185 190 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Pro Gly Gln Gly 195 200 205 Pro Ala Glu Pro Ser Gln Pro Ser Gly Pro Ala Val Ala Ser Leu Glu 210 215 220 Pro Pro Val Lys Leu Lys Glu Leu His Phe Ser Asn Met Lys Thr Val 225 230 235 240 Asp Cys Val Glu Arg Lys Gly Lys Tyr Met Tyr Phe Thr Val Val Met 245 250 255 Ala Glu Gly Lys Glu Ile Asp Phe Arg Cys Pro Gln Asp Gln Gly Trp 260 265 270 Asn Ala Glu Ile Thr Leu Gln Met Val Gln Tyr Lys Asn Arg Gln Ala 275 280 285 Ile Leu Ala Val Lys Ser Thr Arg Gln Lys Gln Gln His Leu Val Gln 290 295 300 Gln Gln Pro Pro Ser Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Leu Gln Pro Gln 305 310 315 320 Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Pro Gln Ser Gln Pro Gln 325 330 335 Pro Gln Pro Gln Pro Lys Pro Gln Pro Gln Gln Leu His Pro Tyr Pro 340 345 350 His Pro His Pro His Pro His Ser His Pro His Ser His Pro His Pro 355 360 365 His Pro His Pro His Pro His Gln Ile Pro His Pro His Pro Gln Pro 370 375 380 His Ser Gln Pro His Gly His Arg Leu Leu Arg Ser Thr Ser Asn Ser 385 390 395 400 Ala <210> 29 <211> 382 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 29 Met Gly Ala Phe Leu Asp Lys Pro Lys Met Glu Lys His Asn Ala Gln 1 5 10 15 Gly Gln Gly Asn Gly Leu Arg Tyr Gly Leu Ser Ser Met Gln Gly Trp 20 25 30 Arg Val Glu Met Glu Asp Ala His Thr Ala Val Ile Gly Leu Pro Ser 35 40 45 Gly Leu Glu Ser Trp Ser Phe Phe Ala Val Tyr Asp Gly His Ala Gly 50 55 60 Ser Gln Val Ala Lys Tyr Cys Cys Glu His Leu Leu Asp His Ile Thr 65 70 75 80 Asn Asn Gln Asp Phe Lys Gly Ser Ala Gly Ala Pro Ser Val Glu Asn 85 90 95 Val Lys Asn Gly Ile Arg Thr Gly Phe Leu Glu Ile Asp Glu His Met 100 105 110 Arg Val Met Ser Glu Lys Lys His Gly Ala Asp Arg Ser Gly Ser Thr 115 120 125 Ala Val Gly Val Leu Ile Ser Pro Gln His Thr Tyr Phe Ile Asn Cys 130 135 140 Gly Asp Ser Arg Gly Leu Leu Cys Arg Asn Arg Lys Val His Phe Phe 145 150 155 160 Thr Gln Asp His Lys Pro Ser Asn Pro Leu Glu Lys Glu Arg Ile Gln 165 170 175 Asn Ala Gly Gly Ser Val Met Ile Gln Arg Val Asn Gly Ser Leu Ala 180 185 190 Val Ser Arg Ala Leu Gly Asp Phe Asp Tyr Lys Cys Val His Gly Lys 195 200 205 Gly Pro Thr Glu Gln Leu Val Ser Pro Glu Pro Glu Val His Asp Ile 210 215 220 Glu Arg Ser Glu Glu Asp Asp Gln Phe Ile Ile Leu Ala Cys Asp Gly 225 230 235 240 Ile Trp Asp Val Met Gly Asn Glu Glu Leu Cys Asp Phe Val Arg Ser 245 250 255 Arg Leu Glu Val Thr Asp Asp Leu Glu Lys Val Cys Asn Glu Val Val 260 265 270 Asp Thr Cys Leu Tyr Lys Gly Ser Arg Asp Asn Met Ser Val Ile Leu 275 280 285 Ile Cys Phe Pro Asn Ala Pro Lys Val Ser Pro Glu Ala Val Lys Lys 290 295 300 Glu Ala Glu Leu Asp Lys Tyr Leu Glu Cys Arg Val Glu Glu Ile Ile 305 310 315 320 Lys Lys Gln Gly Glu Gly Val Pro Asp Leu Val His Val Met Arg Thr 325 330 335 Leu Ala Ser Glu Asn Ile Pro Ser Leu Pro Pro Gly Gly Glu Leu Ala 340 345 350 Ser Lys Arg Asn Val Ile Glu Ala Val Tyr Asn Arg Leu Asn Pro Tyr 355 360 365 Lys Asn Asp Asp Thr Asp Ser Thr Ser Thr Asp Asp Met Trp 370 375 380 <210> 30 <211> 114 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 30 Met Ala Glu Cys Pro Thr Leu Gly Glu Ala Val Thr Asp His Pro Asp 1 5 10 15 Arg Leu Trp Ala Trp Glu Lys Phe Val Tyr Leu Asp Glu Lys Gln His 20 25 30 Ala Trp Leu Pro Leu Thr Ile Glu Ile Lys Asp Arg Leu Gln Leu Arg 35 40 45 Val Leu Leu Arg Arg Glu Asp Val Val Leu Gly Arg Pro Met Thr Pro 50 55 60 Thr Gln Ile Gly Pro Ser Leu Leu Pro Ile Met Trp Gln Leu Tyr Pro 65 70 75 80 Asp Gly Arg Tyr Arg Ser Ser Asp Ser Ser Phe Trp Arg Leu Val Tyr 85 90 95 His Ile Lys Ile Asp Gly Val Glu Asp Met Leu Leu Glu Leu Leu Pro 100 105 110 Asp Asp <210> 31 <211> 158 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 31 Met Ser Gly Ile Ala Leu Ser Arg Leu Ala Gln Glu Arg Lys Ala Trp 1 5 10 15 Arg Lys Asp His Pro Phe Gly Phe Val Ala Val Pro Thr Lys Asn Pro 20 25 30 Asp Gly Thr Met Asn Leu Met Asn Trp Glu Cys Ala Ile Pro Gly Lys 35 40 45 Lys Gly Thr Pro Trp Glu Gly Gly Leu Phe Lys Leu Arg Met Leu Phe 50 55 60 Lys Asp Asp Tyr Pro Ser Ser Pro Pro Lys Cys Lys Phe Glu Pro Pro 65 70 75 80 Leu Phe His Pro Asn Val Tyr Pro Ser Gly Thr Val Cys Leu Ser Ile 85 90 95 Leu Glu Glu Asp Lys Asp Trp Arg Pro Ala Ile Thr Ile Lys Gln Ile 100 105 110 Leu Leu Gly Ile Gln Glu Leu Leu Asn Glu Pro Asn Ile Gln Asp Pro 115 120 125 Ala Gln Ala Glu Ala Tyr Thr Ile Tyr Cys Gln Asn Arg Val Glu Tyr 130 135 140 Glu Lys Arg Val Arg Ala Gln Ala Lys Lys Phe Ala Pro Ser 145 150 155 <210> 32 <211> 528 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> A synthetic gene insert was assembled from synthetic oligonucleotides and/or PCR products. <400> 32 Met Gly Asp Ala Pro Ser Pro Glu Glu Lys Leu His Leu Ile Thr Arg 1 5 10 15 Asn Leu Gln Glu Val Leu Gly Glu Glu Lys Leu Lys Glu Ile Leu Lys 20 25 30 Glu Arg Glu Leu Lys Ile Tyr Trp Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys Pro 35 40 45 His Val Ala Tyr Phe Val Pro Met Ser Lys Ile Ala Asp Phe Leu Lys 50 55 60 Ala Gly Cys Glu Val Thr Ile Leu Phe Ala Asp Leu His Ala Tyr Leu 65 70 75 80 Asp Asn Met Lys Ala Pro Trp Glu Leu Leu Glu Leu Arg Val Ser Tyr 85 90 95 Tyr Glu Asn Val Ile Lys Ala Met Leu Glu Ser Ile Gly Val Pro Leu 100 105 110 Glu Lys Leu Lys Phe Ile Lys Gly Thr Asp Tyr Gln Leu Ser Lys Glu 115 120 125 Tyr Thr Leu Asp Val Tyr Arg Leu Ser Ser Val Val Thr Gln His Asp 130 135 140 Ser Lys Lys Ala Gly Ala Glu Val Val Lys Gln Val Glu His Pro Leu 145 150 155 160 Leu Ser Gly Leu Leu Tyr Pro Gly Leu Gln Ala Leu Asp Glu Glu Tyr 165 170 175 Leu Lys Val Asp Ala Gln Phe Gly Gly Ile Asp Gln Arg Lys Ile Phe 180 185 190 Thr Phe Ala Glu Lys Tyr Leu Pro Ala Leu Gly Tyr Ser Lys Arg Val 195 200 205 His Leu Met Asn Pro Met Val Pro Gly Leu Thr Gly Ser Lys Met Ser 210 215 220 Ser Ser Glu Glu Glu Ser Lys Ile Asp Leu Leu Asp Arg Lys Glu Asp 225 230 235 240 Val Lys Lys Lys Leu Lys Lys Ala Phe Cys Glu Pro Gly Asn Val Glu 245 250 255 Asn Asn Gly Val Leu Ser Phe Ile Lys His Val Leu Phe Pro Leu Lys 260 265 270 Ser Glu Phe Val Ile Leu Arg Asp Glu Lys Trp Gly Gly Asn Lys Thr 275 280 285 Tyr Thr Ala Tyr Val Asp Leu Glu Lys Asp Phe Ala Ala Glu Val Val 290 295 300 His Pro Gly Asp Leu Lys Asn Ser Val Glu Val Ala Leu Asn Lys Leu 305 310 315 320 Leu Asp Pro Ile Arg Glu Lys Phe Asn Thr Pro Ala Leu Lys Lys Leu 325 330 335 Ala Ser Ala Ala Tyr Pro Asp Pro Ser Lys Gln Lys Pro Met Ala Lys 340 345 350 Gly Pro Ala Lys Asn Ser Glu Pro Glu Glu Val Ile Pro Ser Arg Leu 355 360 365 Asp Ile Arg Val Gly Lys Ile Ile Thr Val Glu Lys His Pro Asp Ala 370 375 380 Asp Ser Leu Tyr Val Glu Lys Ile Asp Val Gly Glu Ala Glu Pro Arg 385 390 395 400 Thr Val Val Ser Gly Leu Val Gln Phe Val Pro Lys Glu Glu Leu Gln 405 410 415 Asp Arg Leu Val Val Val Leu Cys Asn Leu Lys Pro Gln Lys Met Arg 420 425 430 Gly Val Glu Ser Gln Gly Met Leu Leu Cys Ala Ser Ile Glu Gly Ile 435 440 445 Asn Arg Gln Val Glu Pro Leu Asp Pro Pro Ala Gly Ser Ala Pro Gly 450 455 460 Glu His Val Phe Val Lys Gly Tyr Glu Lys Gly Gln Pro Asp Glu Glu 465 470 475 480 Leu Lys Pro Lys Lys Lys Val Phe Glu Lys Leu Gln Ala Asp Phe Lys 485 490 495 Ile Ser Glu Glu Cys Ile Ala Gln Trp Lys Gln Thr Asn Phe Met Thr 500 505 510 Lys Leu Gly Ser Ile Ser Cys Lys Ser Leu Lys Gly Gly Asn Ile Ser 515 520 525

Claims (19)

1. 개체로부터 추출된 샘플로부터 상기 개체의 건강을 결정하는 방법으로서,
   (i) 건강에 특이적인 바이오마커의 존재에 대해 상기 샘플을 테스트하는 단계;
   (ii) 상기 바이오마커의 검출에 기초하여, 개체가 건강한지, 중간 정도의 건강인지, 또는 건강하지 않은지를 결정하는 단계를 포함하고.
   상기 바이오마커는 AURKA, FEN1, GLRX3, PHLDA1, PPM1A, FKBP3, CD96 및 MAPK13을 포함하는 항원에 대한 자가항체인 것을 특징으로 하는 방법.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 항원은 UBE2I, AAK1, YARS, ASPSCR1, CASP10, FHOD2, TCL1A 및 MAP4 중 하나 이상을 더 포함하는 것인 방법.
3. 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 항원을 사람으로부터 추출한 샘플에 노출시켜 상기 샘플의 자가항체 바이오마커가 상기 항원에 결합할 수 있도록 하는 것인 방법.
4. 청구항 3에 있어서, 상기 항원을 형광-태그된 2차 항체에 후속적으로 노출시켜 상기 항원에 결합된 상기 샘플의 임의의 자가항체의 양이 결정되도록 하는 것인 방법.
5. 청구항 4에 있어서, 상기 사람의 건강 상태가 상기 항원에 특이적으로 결합하는 상기 샘플의 자가항체의 상대적 또는 절대적 양에 해당하는 것인 방법.
6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플은 엑소좀, 혈액, 혈청, 혈장, 소변, 타액, 양수, 뇌척수액, 모유, 정액 또는 담즙 중 어느 하나 또는 이들의 조합을 포함하는 방법.
7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계들은 in vitro에서 수행되는 것인 방법.
8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 바이오마커의 상향조절/하향조절을 검출하는 것을 포함하는 것인 방법.
9. 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PHLDA1 및 CD96은 건강한것에 해당하고, 상기 AURKA, FEN1, CASP10 및 AAK1은 중간 정도의 건강에 해당하고, 상기 UBE2I, YARS, ASPSCR1, FHOD2, TCL1A, MAP4, MAPK13, FKBP3, PPM1A 및 GLRX3은 건강하지 않은 것에 해당하는 것인 방법.
10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 개체는 노인인 것인 방법.
11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원은 비오틴화된 단백질인 것인 방법.
12. 청구항 11에 있어서, 비오틴화된 단백질 각각은 단백질과 인프레임(in-frame)으로 융합된 비오틴 카복실 운반체 단백질(Biotin Carboxyl Carrier Protein) 폴딩 마커로부터 형성되는 것인 방법.
13. 청구항 11 또는 12에 있어서, 상기 비오틴화된 단백질은 스트렙타비딘-코팅된 기질에 결합되는 것인 방법.
14. 청구항 13에 있어서, 상기 기질은 히드로겔-형성 중합체 기저 층을 포함하는 것인 방법.
15. 노인 개체로부터 추출된 샘플로부터 상기 개체의 건강을 결정하기 위한 키트를 제조하는 방법으로서,
    패널의 각 항원에 대해, 비오틴 카복실 운반체 단백질 폴딩 마커 인프레임을 상기 항원을 코딩하는 유전자와 클로닝하고, 그 결과 생성된 비오틴화된 항원을 발현하는 단계;
    상기 비오틴화된 항원을 하나 이상의 스트렙타비딘-코팅된 기질 상의 주소지정 가능한 위치에 결합하여 항원 어레이를 형성하는 단계;
    상기 패널 상의 항원에 결합하는 상기 샘플의 자가항체의 양이 결정될 수 있도록 상기 기질을 상기 샘플에 노출시키고 반응을 측정하는 단계를 포함하고,
    상기 항원은 UBE2I, AAK1, YARS, ASPSCR1, CASP10, FHOD2, TCL1A, MAP4, MAPK13, CD96, FKBP3, PPM1A, PHLDA1, GLRX3, FEN1 및 AURKA를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 노인 개체의 건강을 결정하기 위한 항원 패널을 포함하는 조성물로서, 상기 항원은 MAPK13, CD96, FKBP3, PPM1A, PHLDA1, GLRX3, FEN1 및 AURKA을 포함하고, UBE2I, AAK1, YARS, ASPSCR1, CASP10, FHOD2, TCL1A, 및 MAP4 중 하나 이상을 선택적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
17. 청구항 15에 있어서, 상기 항원은 비오틴화된 단백질인 것인 조성물.
18. 청구항 16 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 환자로부터의 샘플의 상기 항원에 in vitro에서 결합하는 하나 이상의 자가항체 바이오마커의 양이 상기 환자의 건강 상태를 결정하기 위해 측정될 수 있는 것인 조성물.
19. 노인 환자의 건강 상태를 결정하기 위한 자가항체 바이오마커 패널을 포함하는 조성물로서,
    상기 하나 이상의 자가항체 바이오마커의 수준은 상기 환자로부터의 샘플에서 측정되고;
    상기 하나 이상의 자가항체 바이오마커는 MAPK13, CD96, FKBP3, PPM1A, PHLDA1, GLRX3, FEN1 및 AURKA 중 하나 이상의 항원에 대해; 그리고, UBE2I, AAK1, YARS, ASPSCR1, CASP10, FHOD2, TCL1A, 및 MAP4 중 하나 이상을 선택적으로 포함하는 항원에 대해 특이적인 자가항체로부터 선택되는 것을 특징으로 하는;
    노인 환자의 건강 상태를 결정하기 위한 자가항체 바이오마커 패널을 포함하는 조성물.
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    
    

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