KR20220053428A

KR20220053428A - 서양종꿀벌 수벌번데기 추출물을 포함하는 미백 및 주름개선용 마스크팩 조성물

Info

Publication number: KR20220053428A
Application number: KR1020200137880A
Authority: KR
Inventors: 김정은; 김호혁; 김도익; 구희연; 김현진; 이유범; 김성연; 김지수
Original assignee: 전라남도
Priority date: 2020-10-22
Filing date: 2020-10-22
Publication date: 2022-04-29
Also published as: KR102443871B1

Abstract

본 발명은 수벌번데기의 추출물을 0.8 내지 1.2 중량% 포함하는 미백 및 주름개선용 마스크팩 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 버려지는 수벌번데기를 미백 및 주름개선용 마스크팩 제조에 활용하여 경제성이 높으며, 미백 및 주름개선 효과를 동시에 나타내는 복합기능성 마스크팩 조성물을 제공할 수 있다.

Description

서양종꿀벌 수벌번데기 추출물을 포함하는 미백 및 주름개선용 마스크팩 조성물{Mask pack composition for Whitening and anti wrinkle containing extract pupae of male bees}

본 발명은 서양종꿀벌 수벌번데기 추출물을 포함하는 미백 및 주름개선용 기능성 마스크팩 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

꿀벌은 전 세계적으로 분포된 곤충으로써 우리나라에서는 동양종 꿀벌(Apis cerana)과 서양종 꿀벌(Apis mellifera)이 사육되고 있다. 국내 양봉농가의 수는 24,629 농가로써 약 238만 봉군을 사육하고 있으며 연간 매출액은 5,527 억원 정도이다. 이중에서 대부분의 생산물은 서양종꿀벌에서 생산된 벌꿀, 화분, 로열젤리 등이 차지하고 있다. 반면에 동양종 꿀벌을 사육하여 생산된 소득의 대부분이 꿀에서 얻어지는 것으로 꿀을 제외하고는 프로폴리스, 로열젤리, 화분 등과 같이 서양종꿀벌에서 생산되는 다양한 양봉산물을 생산 하거나 가공하는 것이 어렵다. 그러나 서양종 꿀벌도 5,527억의 소득 중에서도 약 60% 이상이 벌꿀 생산에 의존하고 있다는 약점을 가지고 있어서 새로운 부가가치를 창출할 수 있는 양봉 산물의 개발에 대한 양봉농가의 요구가 절실하다.

자외선에 의해 자극된 피부에서는 멜라닌이 생성되며, 이러한 멜라닌은 자외선으로부터 피부 손상을 억제하기 때문에 멜라닌은 피부에 중요한 역할을 한다고 볼 수 있다. 하지만 자외선에 의한 피부 자극이 지속될 경우, 멜라닌의 과잉 생산 또는 비정상적인 분포가 유발되며, 기미, 주근깨와 같은 피부질환을 유발할 수 있다.

미백소재로 잘 알려진 것은 하이드로퀴논, 아스코르빈산 등이 있다. 이들 미백제들은 자외선으로 생긴 기미, 주근깨, 검버섯 방지 및 치료 목적으로 미백 기능성 원료 및 의약외품으로 사용해 왔다. 하지만 이 소재들은 피부에 자극을 주어 염증 또는 트러블을 유발하는 등의 부작용이 있으며, 이를 대체할 부작용이 적은 천연추출물을 이용한 미백 소재 개발 연구가 활발히 진행되고 있다,

주름 개선에 대한 전 세계 소비자의 기대와 관심은 레티놀을 시작으로 하여 2000년대부터 천연물추출성분, 아데노신, 세포성장인자 등 그 종류와 기능이 다양해지고 있는 추세이다. 기존의 방법은 레티노이드, 아스코르브산, 토코페롤 및 히알루론산 등을 함유하는 화장료나 의약품을 제조하여 사용하는 것이다. 하지만 현재 개발되고 있는 피부 주름 개선 또는 항노화를 위한 유효성분들은 일부 화장품 원료로 사용할 수 없거나 매우 불안정하고 피부로의 전달이 용이하지 않아 특별한 안정화 시스템과 전달체계가 필요하며, 피부주름의 개선효과가 가시적이지 않다는 문제점이 있다. 상기 피부 주름 개선 유효성분인 레티노이드는 콜라겐 분해효소를 저해하고 콜라겐 합성을 증가시킴으로써 주름 형성 및 탄력 감소 등의 광노화 현상을 개선하기 위해 이용되고 있다. 그러나 자외선에 매우 민감하여 쉽게 화학적인 변화를 일으키므로 피부 자극 등의 부작용을 일으키며, 장기적으로 사용해야 효과가 나타난다는 문제점이 있다. 상기 유효성분들의 문제점을 해결하기 위하여 안정성이 입증된 천연물 유래의 유효성분에 대한 연구가 요구되고 있다.

대한민국 등록특허 제 10-1951782호

본 발명의 해결하고자 하는 과제는 수벌번데기의 40 내지 60% 에탄올 추출물을 0.8 내지 1.2 중량% 포함하는 미백 및 주름개선용 마스크팩 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기의 과제를 해결하기 위해 본 발명은 수벌번데기의 40 내지 60% 에탄올 추출물을 0.8 내지 1.2 중량% 포함하는 미백 및 주름개선용 마스크팩 조성물을 제공한다.

상기 추출물은 16 내지 20일령 사이의 서양종꿀벌의 수벌번데기에서 추출된 것일 수 있다.

상기 조성물은 알부틴, 아데노신, 아쿠아 이지 젤, 1,3-프로판올 및 참마 피토뮤신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 알부틴 1 내지 3 중량%, 아노데신 0.01 내지 1 중량%, 아쿠아 이지겔 4 내지 6 중량%, 1,3-프로판올 4 내지 6 중량% 및 참마 피토뮤신 2 내지 4 중량%를 포함하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 워터 아르간 오일, 달팽이 앰플, 알로에 수딩겔 및 아로마 오일로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 워터 아르간 오일 2 내지 4 중량%, 달팽이 앰플 2 내지 4 중량%, 알로에 수딩겔 2 내지 4 중량% 및 아로마 오일 0.01 내지 2 중량%로 포함하는 것일 수 있다.

상기 조성물은 다마스크 로즈 워터 또는 유칼립투스 잎 워터를 더 포함하는 것일 수 있다.

또한 본 발명은, 16 내지 20일령 사이의 수벌번데기 동결분말에 40 내지 60% 에탄올 용매를 첨가하고 12시간 내지 48시간 동안 추출하여 수벌 번데기 추출물을 제조하는 단계 및 상기 수벌번데기 추출물을 전체 조성물에 대해 0.8 내지 1.2 중량%로 첨가하는 단계를 포함하는 미백 및 주름개선용 마스크팩 조성물의 제조방법을 제공한다.

상기 첨가하는 단계는 조성물 총 중량에 대해 알부틴 1 내지 3 중량%, 아노데신 0.01 내지 1 중량%, 아쿠아 이지겔 4 내지 6 중량%, 1,3-프로판올 4 내지 6 중량% 및 참마 피토뮤신 2 내지 4 중량%를 첨가하는 것일 수 있다.

본 발명에 따르면, 수벌번데기 추출물이 멜라닌 형성을 억제하고 티로시나아제 활성을 저해하여 미백효과가 우수하며, 동시에 주름방지 효과가 뛰어나, 미백 및 주름개선용 복합 기능성 마스크팩에 유용하게 활용 가능하다.

도 1은 HFD(a) 및 멜라노마(B16F10)(b)에서 수벌번데기 추출물의 세포독성을 평가하고자 MTT 분석을 수행한 결과이다.
도 2는 수벌번데기 추출물의 티로시나아제 억제활성을 분석한 결과이다.
도 3은 수벌번데기 추출물의 DOPA 산화활성 저해 효과를 분석한 결과이다.
도 4는 수벌번데기 추출물의 B16F10 세포를 이용한 멜라닌(Melanin) 생성 억제를 분석한 결과이다.
도 5는 HDF 세포에서 수벌번데기 추출물이 Collagen type-Ⅰ 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 6은 HDF 세포에서 수벌번데기 추출물이 MMP-1 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 7은 제형2의 마스크팩에 대해 6명의 피험자에서 팩 사용 전/후의 피부 상태 변화(수분도, 탄력도, 모공, 색소침착, 피지, 주름, 민감도)를 피부진단기(API-100, aram HUVIS)로 측정결과이다.

본 발명은 수벌번데기의 40 내지 60% 에탄올 추출물을 0.8 내지 1.2 중량% 포함하는 미백 및 주름개선용 마스크팩 조성물을 제공한다.

본 발명에서 “수벌번데기”는 서양종꿀벌(Apis mellifera L)의 수벌(drone)의 번데기일 수 있으며, 구체적으로 16 내지 20일령 사이의 수벌번데기일수 있으며, 더욱 구체적으로 16 내지 20일령 사이의 수벌번데기의 동결건조물일 수 있다.

본 발명에서 용어, “추출물”은 추출 처리에 의하여 얻어지는 추출액, 상기 추출액의 희석액이나 농축액, 상기 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 상기 추출액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출액 자체 및 추출액을 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물을 포함한다.

본 발명에서 추출물의 건조는 채취한 수벌번데기로부터 유용한 성분들이 파괴되지 않는 범위에서 공지의 방법으로 진행될 수 있고, 예를 들어 음지에서 자연건조의 방법으로 진행될 수 있다. 또한, 파쇄 또는 분쇄는 이후 추출과정에서 수벌번데기의 유용한 성분들이 충분하게 추출될 수 있을 정도로 파쇄 또는 분쇄하여 분말화할 수 있다. 상기 건조와 파쇄 또는 분쇄 공정은 필요에 따라서 순서를 뒤바꿔서 진행하거나 반복하여 실시할 수 있다.

본 발명의 추출에 있어서, 상기 추출하는 방법은 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 추출할 수 있다. 상기 추출 방법의 비제한적인 예로는, 열수 추출법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등을 들 수 있으며, 이들은 단독으로 수행되거나 2 종 이상의 방법을 병용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서“미백”은 멜라닌 등의 색소의 과다로 인하여 명도가 감소된 피부의 명도를 증가시키거나 또는 피부의 명도를 일정 수준으로 유지하는 방법, 상기 방법으로 형성된 명도가 증가된 피부 등을 포괄하여 의미하는 것으로서, 구체적으로는 피부 미백을 의미할 수 있다. "피부 미백"은 멜라닌의 생성이 저해됨에 따른 결과로서 이해되는데, 구체적으로는 멜라닌의 생성이 저해됨에 따라 멜라닌의 증가에서 비롯되는 증상, 예컨대 기미, 주근깨 개선으로서 이해될 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 수벌번데기 50% 에탄올 추출물이 농도 의존적으로 tyrosinase 저해활성 및 L-DOPA 기질(substrate)에 대한 저해활성이 증가함을 확인하였다. 즉, 수벌번데기 추출물의 in vitro 티로시나아제 저해(tyrosinase inhibition) 시험 결과 농도 의존적으로 티로시나아제를 저해시켜 미백 효과가 있음을 확인하였다.

또한, α-MSH에 의해 세포 내 멜라닌(melanin) 생성이 증가되는 것을 확인하였고 대조군에서 증가된 melanin 양은 모든 시험물질 투여군에서 감소하는 경향을 나타내 세포에서 미백 효과를 나타냄을 확인하였다.

또한, 수벌번데기 추출물은 자외선 자극에 의해 유도된 콜라겐(collagen) 생성 감소를 억제시키고 collagen 분해 효소인 MMP1의 발현을 감소시켜 자외선에 의해 유도된 주름 개선에 효과가 있음을 확인하였다.

따라서 본 발명의 마스크팩 조성물은 수벌번데기 미백 및 주름 개선 효과가 우수하다.

상기 주름은 자외선에 의해 유도되는 것 일수 있으며, 본 발명의 주름 개선은 콜라겐 생성을 촉진하고 콜라겐 분해효소(MMP1)의 발현을 감소시켜 주름 형성을 억제 또는 주름을 완화 시키는 것일 수 있다.

본 발명의 실시예에서 수벌번데기의 50% 에탄올 추출물의 미백 및 주름개선 활성을 확인하였는바, 본 발명의 추출물은 수벌번데기를 40 내지 60% 에탄올 추출물로 추출한 것일 수 있으며, 구체적으로 50% 에탄올 추출물로 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 수벌번데기 추출물 0 내지 1 중량%, 다마스크 로즈 워터 82.95 내지 83.95 중량%, 알부틴 2 중량%, 아데노신 분말 0.05 중량%, 아쿠아 이지 젤(Aqua easy gel) 5 중량%, 1,3-프로판디올 5 중량%, 참마 피토뮤신 3 중량%, 나프리(NApre, 천연한방보존제) 1중량%를 혼합하여 마스크팩 조성물을 제조하고 유기농 면 100% 마스크 시트를 이용하여 제형1의 마스크 팩을 제조하여 관능 평가를 수행하였으며, 관능평가 결과, 점도, 발림성, 팩 제거 후 느낌 및 보습력은 수벌 번데기 추출물 함량 0%에서 1%로 증가할수록 우수해지는 것을 확인하였다.

구체적으로 수벌번데기 추출물을 0.5 중량% 포함하는 마스크팩 제형과 비교하여 1 중량% 포함하는 제형이 점도, 발림성, 팩 제거 후 느낌 및 보습력 등의 관능 평가가 우수함을 확인하였다.

또한, 수벌번데기 추출물이 전체 중량의 1.2 중량%로 초과로 혼합하는 경우, 팩 제형이 색이 어두워지고, 번데기 특유의 냄새가 강해 기호도가 떨어짐을 확인하였다.

즉, 마스크팩 조성물이 전체 조성물 중량에 대해 수벌번데기 추출물을 1 중량% 포함하는 경우 점도, 발림성, 팩 제거 후 느낌 및 보습력 등의 관능평가 및 기호성이 가장 우수함을 확인하였다.

따라서 본 발명의 마스크팩 조성물은 수벌번데기 추출물을 0.8 내지 1.2 중량%로 포함하는 것을 특징으로 한다. 구체적으로 상기 조성물은 수벌번데기 추출물을 1 중량% 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 조성물에서 수벌번데기 추출물의 함량이 0.8 중량% 미만인 경우, 팩의 관능성(점도, 발림성, 팩제거 후 느낌, 및 보습력)이 기호도가 떨어지며, 유효성분이 수벌번데기의 함량이 낮아 미백 및 주름 개선 효과가 미비한 문제가 단점이 있으며, 본 발명의 조성물에서 수벌번데기 추출물 함량이 1.2 중량%를 초과하는 경우, 팩 제형이 색이 어두워지고, 번데기 특유의 냄새가 강해져 기호성이 낮아지는 단점이 있다.

본 발명의 일실시예에서 제형1의 마스크팩의 관능평가 결과, 기호성이 가장 좋았던 수벌번데기 추출물 1 중량%를 포함하는 경우, 관능성이 가장 우수함을 확인하였으며, 제형1의 마스크팩 관능평가 결과 보습력이 3.92로 보통 수준(3점대)으로 평가되ㅇ?ㅆ다. 따라서 마스크팩 조성물의 보습력을 강화하고자 수벌번데기 추출물 1 중량%, 유칼립투스 잎 워터 73.75 중량%, 알부틴 2 중량%, 아데노신 분말 0.05 중량%, 아쿠아 이지 젤(Aqua easy gel) 5 중량%, 1,3-프로판디올 5 중량%, 참마 피토뮤신 3 중량%, 나프리(NApre, 천연한방보존제) 1중량%, 워터 아르간 오일 3 중량%, 달팽이 앰플 3 중량%, 알로에 수딩겔 3 중량% 및 아로마 오일 0.2 중량%을 혼합하여 제형2의 마스크 팩을 제조하였다.

제형2의 마스크팩을 이용하여 6명의 피험자에서 피부 측정기로 마스크팩 전과 후의 피부 상태 변화(수분도, 탄력도, 모공, 색소침착, 피지, 주름, 민감도)를 분석하였다. 팩 사용 전과 비교하여 마스크팩 사용후 20분 뒤 수분도 및 탄력도가 모두 증가하는 것을 확인하였으며, 1 내지 3주의 측정결과 수분도 및 탄력도가 증가된 상태를 유지함을 확인하였다.

또한, 6명의 피험자를 대상으로 피부상태를 피부진단기를 통한 종합진단한 결과, 제형2의 마스크팩 사용 전과 비교하여 3주간 지속 사용시 피험자의 모공, 민감도, 주름, 피지 및 색소침착의 피부상태가 전반적으로 개선되는 것을 확인하였다.

따라서 본 발명의 마스크팩 조성물은 알부틴, 아데노신, 아쿠아 이지 젤, 1,3-프로판올 및 참마 피토뮤신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함할 수 있으며, 구체적으로 알부틴 1 내지 3 중량%, 아노데신 0.01 내지 1 중량%, 아쿠아 이지겔 4 내지 6 중량%, 1,3-프로판올 4 내지 6 중량% 및 참마 피토뮤신 2 내지 4 중량%를 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 마스크팩 조성물은 워터 아르간 오일, 달팽이 앰플, 알로에 수딩겔 및 아로마 오일로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 구체적으로 워터 아르간 오일 2 내지 4 중량%, 달팽이 앰플 2 내지 4 중량%, 알로에 수딩겔 2 내지 4 중량% 및 아로마 오일 0.01 내지 2 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명에서 조성물이 수벌번데기 추출물, 알부틴, 아데노신, 아쿠아 이지 젤, 1,3-프로판올, 참마 피토뮤신, 워터 아르간 오일, 달팽이 앰플, 알로에 수딩겔 또는 아로마 오일을 포함하는 경우, 수벌번데기 추출물, 알부틴, 아데노신, 아쿠아 이지 젤, 1,3-프로판올, 참마 피토뮤신만을 포함하는 조성물과 비교하여 보습력이 우수할 수 있다.

또한 상기 마스크팩은 다마스크 로즈 워터 또는 유칼립투스 잎 워터를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 마스크팩 조성물은 모공, 민감도, 주름, 피지 또는 색소침착의 피부상태를 개선하는 것을 특징으로 할 수 있다.

또한 본 발명은 16 내지 20일령 사이의 수벌번데기 동결분말에 40 내지 60% 에탄올 용매를 첨가하고 12시간 내지 48시간 동안 추출하여 수벌 번데기 추출물을 제조하는 단계 및 상기 수벌번데기 추출물 전체 조성물에 대해 0.8 내지 1.2 중량%로 첨가하는 단계를 포함하는 미백 및 주름개선용 마스크팩 조성물의 제조방법을 제공한다.

전술한 실시예에서 제형1 및 제형2의 마스크팩이 수벌번데기 추출물, 알부틴, 아데노신, 아쿠아 이지 젤, 1,3-프로판올 및 참마 피토뮤신을 혼합하여 제조하였는바, 상기 첨가하는 단계는 수벌번데기 추출물과 알부틴, 아데노신, 아쿠아 이지 젤, 1,3-프로판올 및 참마 피토뮤신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 첨가하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 조성물 총 중량에 대해 알부틴 1 내지 3 중량%, 아노데신 0.01 내지 1 중량%, 아쿠아 이지겔 4 내지 6 중량%, 1,3-프로판올 4 내지 6 중량% 및 참마 피토뮤신 2 내지 4 중량%를 첨가하는 것일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<재료 및 방법>

1. 시료준비

전라남도 곤충잠업연구소에서 사육중인 서양종꿀벌을 이용하여 16 내지 20일령 사이의 수벌번데기를 생산하여 동결건조하였으며 가정용 분쇄기를 이용하여 분쇄하여 수벌번데기 분말을 얻었다. 이후, 상기 수벌번데기 분말 100g에 50% 에탄올 용매 2L를 넣고 24시간 동안 실온에서 교반 추출하였다. 이후 상기 얻어진 추출물을 여과지를 이용하여 여과하였다. 다시 여과된 추출물에 50% 에탄올 용매 2L를 넣고 24시간 동안 4℃에서 반복하여 교반 추출하였다. 이후, 얻어진 추출물을 여과지를 이용하여 여과하였으며, 회전감압농축기를 이용하여 농축한 후 동결건조하여 수벌번데기 50% 에탄올 추출물을 얻었다.

2. 시험관내 티로시나아제 억제 활성 분석

동결건조된 수벌번데기 추출물은 dimethyl sulfoxide를 부형제로 하여 5, 10 및 20 mg/㎖의 농도로 용해하여 조제하였다. L-tyrosine substrate를 사용한 tyrosinase 저해 반응은 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 6.8) 220 ㎕에 2 mM L-ty?rosine (Sigma aldrich, Lot. No BCBP3212V) 40 ㎕ 및 시험물질 용액 30 ㎕의 혼합액에 650 U/㎖ 티로시아제(tyrosinase) 10 ㎕를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 신속히 ice에서 5분간 방치하여 반응을 중지시키고 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. L?DOPA 기질(substrate)를 사용한 티로시나아제(tyrosinase) 저해 반응은 0.1 M sodium phosphate buffer (pH6.8) 200㎕에 5 mM L-DOPA 100㎕ 및 시험물질 용액 50 ㎕의 혼합액에 1,000 U/ml tyrosinase 50㎕를 첨가하여 37℃에서 20분간 반응시킨 후 신속히 ice에서 5분간 방치하여 반응을 중지시키고 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 티로시아제 억제율(Tyrosinase inhibition rate)는 다음과 화학식 1을 산출하였다.

3. 세포배양

인간섬유아세포(human dermal fibroblast, HDF) 및 마우스 멜라노마 세포(B16F10은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture CollectionATCC)를 통해 구입하였으며 10% 소태아혈청(Fetal bovine serum 및 항생제(Antibiotics (Gibco, BRL, Life technologies CO. USA)가 포함된 DMEM 배지(Gibco, BRL, Life technologies CO. USA)에 3일에 한 번씩 계대배양 하였다. 세포는 5%의 CO₂가 유지되는 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 배양하여 사용하였다.

4. 세포독성시험

동결건조 한 수벌번데기추출물은 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 부형제로 하여 20 mg/㎖의 농도로 용해하고, DMEM 배지를 첨가하여 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 및 400 ㎍/㎖의 농도로 조제하여 사용하였다. 96-well plate에 HDF 세포는 8 x 10³ cells/well, B16F10 세포는 1×10⁴ cells/well의 농도로 seeding하고 24시간 배양하였다. 시험물질을 농도 별로 처리하고 24시간 배양 후에 CCK-8 (Dojindo, Japan) 10 ㎕를 첨가하여 37℃ 인큐베이터(incubator)에서 1시간 추가 배양하였다. Microplate reader (PerkinElmer, Victor TMx3, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하여 무처치군의 세포 생존률 대비 각 농도별 세포 생존률을 구하였다.

5. Collagen I 및 MMP1 유전자 발현량 측정

동결건조한 수벌번데기추출물을 dimethyl sulfoxide를 부형제로 하여 20 mg/ml의 농도로 용해하고, DMEM 배지를 첨가하여 4, 20 및 100 ㎍/㎖의 농도로 조제하여 사용하였다. 용매대조군은 DMEM 배지에 DMSO를 0.5%의 농도로 조제하여 사용하였다. 100 mm plate에 HDF 세포를 1.5×10⁶ cells/plate의 농도로 시딩(seeding)하고 24시간 배양하였다. 배양 배지를 제거하고 PBS 1 ㎖/well을 첨가한 후 UVB 200 mJ/cm²을 조사하였다. PBS를 제거하고 시험물질이 농도 별로 포함된 배양배지를 처리하고 24시간 배양 후에 세포를 수거하였다. 세포는 easy-BLUE™ Total RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology, Korea)의 매뉴얼에 따라 total RNA를 추출하였다. 추출된 total RNA는 분광광도계(Spectrophotometer, UV-2450, SHIMADZU, Japan)를 이용하여 260 nm 및 280 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. RT-qPCR은 iTaq™ Universal SYBR® Green One-Step kit (BIO-RAD)를 사용하여 리얼 타임 PCR 기계(Chromo4, BIO-RAD, CA, U.S.A.)을 이용하여 Collagen Ⅰ 유전자 발현량을 비교하기 위하여 서열번호1의 Forward primer 5’-AGGGCCAAGACGAAGACATC-3’과 서열번호2의 Reverse primer 5’- AGATCACGTCATCGCACAACA -3’를 사용하였으며, MMP1 유전자 발현량을 비교하기 위하여 서열번호3의 Forward primer 5’-TCTGACGTTGATCCCAGAGAGCAG-3’을 사용하고 control로는 서열번호4의 Forward primer 5’-AGAGCTACGAGCTGCCTGAC-3’과 서열번호5의 Reverse primer 5’-AGCACTGTGTTGGCGTACAG-3’을 사용하여 50℃에서 10분간 polymerase activation 및 DNA denaturation: 95℃에서 1 분 , amplification (denaturation: 95℃에서 15 초, annealing and extension: 60℃에서 30 초, 40 cycle)의 조건으로 Real time PCR을 수행하였다. Real Time 결과는 β-actin의 C(t)값으로 보정하여 음성대조군 대비 유전자 발현량을 상대 정량하였다.

6. 멜라닌 생성량 측정시험

6 웰 플레이드(well plate)에 B16F10 세포를 5×10⁴ cells/well의 농도로 seeding하고 24시간 배양하였다. α-MSH 및 수벌번데기 추출물을 농도별(4, 20, 100 ㎍/㎖)로 처리하고 48시간 후에 배지를 제거하고 PBS로 세포를 세척하였다. 이때 양성대조군은 알부틴 100 ㎍/㎖를 처리하였다.

RIPA 버퍼(buffer)를 첨가하여 세포막을 깨뜨리고 12,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 단백질(protein)을 추출하였다. BCA 키트를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하여 단백질 정량하였다. 세포 펠렛(cell pellet)에 1N NaOH (10% DMSO)를 500 ㎕ 첨가하여 70℃에 20분간 반응시켜 세포 내 멜라닌을 용출하였다. 용출된 멜라닌은 405 nm에서 흡광도(PerkinElmer, Victor TMx3, USA)를 측정하였으며, 멜라닌 표준품(Sigma aldrich)으로 얻은 표준 검량선을 이용하여 각각의 멜라닌 양을 산출하였고 전체 단백질(total protein) 값으로 보정하였다.

7. 마스크팩의 제조 및 관능 평가

하기 표 1 또는 표 2과 같은 조성으로 미백 및 주름 개선용 기능성 마스크팩 제형을 제조하였다.

표 1은 제형1 마스크팩의 조성이다. 수벌번데기 추출물 0, 0.1. 0.5 또는 1 중량%, 다마스크 로즈 워터 82.95 내지 83.95 중량%, 알부틴 2 중량%, 아데노신 분말 0.05 중량%, 아쿠아 이지 젤(Aqua easy gel) 5 중량%, 1,3-프로판디올 5 중량%, 참마 피토뮤신 3 중량%, 나프리(NApre, 천연한방보존제) 1중량%를 혼합하고, 유기농 면 100%의 시트를 이용하여 제형 1의 마스크팩을 제조하였다.

또한, 수벌번데기 추출물을 1.2 중량%로 혼합하는 경우(표 1에서는 기재되어 있지 않음), 팩 제형이 색이 어두워지고, 번데기 특유의 냄새가 강해져 마스크팩 제형으로 기호성이 떨어져 이후 관능평가는 수행하지 않았다.

수벌번데기 추출물의 함량이 상이한 제형1의 마스크팩을 이용하여 6 명의 피험자를 대상으로 수벌번데기 추출물의 함량에 따른 마스크팩의 관능평가(점도, 발림성, 제거 용이성, 팩제거 후 느낌, 및 보습력)를 수행하였다.

표 2는 제형2 마스크팩의 조성이다. 수벌번데기 추출물 1 중량%, 유기농 유칼립투스 잎 워터 73.75 중량%, 알부틴 2 중량%, 아데노신 분말 0.05 중량%, 아쿠아 이지 젤(Aqua easy gel) 5 중량%, 1,3-프로판디올 5 중량%, 참마 피토뮤신 3 중량%, 나프리(NApre, 천연한방보존제) 1 중량%, 워터아르간 오일 3 중량%, 달팽이 램플 3 중량%, 알로에 수딩젤 3 중량%, 아로마 오일 0.2 중량%를 혼합하고, 텐셀 시트를 이용하여 제형 2의 마스크팩을 제조하였다.

또한 제형2의 마스크팩을 이용하여 6명의 피험자에서 피부 측정기(skin test meter: API-100, aram HUVIS)로 마스크팩 전과 후의 피부 상태 변화(수분도, 탄력도, 모공, 색소침착, 피지, 주름, 민감도)를 분석하였다.

<결과>

1. 세포독성시험

수벌번데기 추출물의 세포 독성을 시험하기 위하여 다이메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide)를 부형제로 하여 20 mg/㎖ 농도로 수벌번데기 추출물을 용해하고, DMEM 배지를 첨가하여 6.25, 12.5, 25, 50, 100, 200 및 400 ㎍/㎖의 농도로 조제하여 HDF 세포독성 여부 시험을 하였다. 대조군(Control) HDF 세포의 생존률이 100%일 때 용매대조군의 HDF cell 생존률은 평균 105.1%로 용매는 세포의 생존에 영향을 미치지 않았다.

수벌번데기 추출물이 100 ㎍/㎖ 이하에서는 세포독성을 나타내지 않았다. 그러나 200 ㎍/㎖에서 70.2%, 400 ㎍/㎖에서 38.5%의 HDF 세포 생존률을 나타났다(도 1a).

또한 B16F10 세포의 경우에는 무처리 대조군(control)의 세포 생존률이 100%일 때 용매대조군의 세포 생존률은 92.3%로 나타나 세포 생존에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 판단하였다(도 1b). 수벌번데기 추출물 100 ㎍/㎖ 처리군에서는 89.9%의 세포 생존률을 나타내어 용매 대조군과도 차이를 나타내지 않았다. 그러나 B16F10 cell의 경우에도 200 ㎍/㎖에서 80.2%, 400 ㎍/㎖에서 48.3%의 세포 생존률을 나타내어 실용화 가능한 농도로써 수벌번데기 추출물은 100 ㎍/㎖를 최고 농도로 설정하여 시험에 사용하였다.

2. 시험관내 티로시나아제 저해 효과

티로시나아제(Tyrosinase)는 멜라닌 생성 경로에서 중요하게 작용하는 효소이기 때문에 이 효소의 활성을 저해할 수 있는 것을 피부미백 제품의 소재로 활용할 수 있다.

수벌번데기추출물의 tyrosinase 활성 억제 여부를 확인하기 위해 용매대조군의 tyrosinase 저해활성을 0%의 값으로 하였고 5, 10 및 20 mg/㎖의 농도로 조제 된 수벌번데기 추출물을 처리하였다. 그 결과 수벌번데기 추출물의 농도에 따라 L-Tyrosine 기질(substrate)에 대한 tyrosinase 저해활성은 각각 40.7, 62.5 및 83.8%를 나타내었고, L-DOPA substrate에 대한 저해활성은 각각 53.4, 57.7 및 61.9%를 나타내었으며, 각각의 결과는 통계학적으로 유의하게 증가되었다(도 2, 도 3). 따라서 수벌번데기 추출물의 시험관내(in vitro)에서 티로시나아제 억제(tyrosinase inhibition) 시험 결과 농도 의존적으로 미백 효과가 있음을 확인하였다.

3. 멜라닌(Melanin) 생성 억제 효과

수벌번데기 추출물의 melanin 생성 억제 시험을 위하여 B16F10 cell에 α-MSH를 처리하여 세포에서 melanin 생성을 증가시키고, 수벌번데기 추출물을 농도별로 처리하여 세포 내 생성되는 melanin의 양을 측정한 결과, 용매대조군의 melanin 생성량을 1로 나타내었을 때 α-MSH만 처리한 대조군의 세포내 melanin 생성량은 2.67로 용매대조군에 비하여 통계적으로 유의하게 증가되어, α-MSH에 의해 세포 내 melanin 생성이 증가되는 것을 확인하였고 대조군에서 증가된 melanin 양은 모든 시험물질 투여군에서 감소하는 경향을 나타내었으며, 100 ㎍/㎖ 처리군에서 통계적으로 유의하게 감소되었다(도 4).

따라서 수벌번데기는 피부 속 melanin 색소 생성을 억제하여 미백효과를 가지고 있음을 알 수 있었다.

4. 주름 개선 및 억제 효과

수벌번데기의 주름 개선 및 억제 효과를 평가하고자, 콜라겐(Collagen) type Ⅰ, MMP1 발현량 변화를 측정하였다.

수벌번데기 추출물을 처리한 HDF 세포에 의해 생성된 collagen type Ⅰ 및 MMP1의 발현량을 RT-qPCR로 측정하고 용매대조군을 기준으로 상대 정량한 결과, 용매대조군의 콜라겐(collagen) type Ⅰ의 발현량을 1로 설정하였을 때 UVB만 처리한 대조군의 collagen type Ⅰ의 발현량은 평균 0.6으로 용매대조군과 비교시 통계적으로 유의하게 감소하여, UVB 조사에 의한 collagen type Ⅰ의 발현량이 감소된 것을 확인하였다. 대조군에서 감소된 collagen type Ⅰ의 발현량은 수벌번데기 추출물 처리군에서 농도 의존적으로 증가하는 경향을 나타내었으며, 20 및 40 ㎍/㎖ 처리군에서 통계학적인 유의성(p<0.05 및 p<0.01)을 나타내었다(도 5).

그리고 용매대조군의 MMP1의 발현량을 1로 설정하였을 때 UVB만 처리한 대조군의 MMP1의 발현량은 평균 2.31로 용매대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 증가하여, UVB 조사에 의하여 MMP1의 발현량이 증가된 것을 확인하였으며 대조군에서 감소된 MMP1의 발현량은 수벌번데기 추출물 처리군에서 농도 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었고, 20 및 40 ㎍/㎖ 처리군에서 통계학적인 유의성(p<0.05 및 p<0.01)을 나타내었다(도 6).

결론적으로 수벌번데기추출물은 콜라겐(collagen) 생성을 증가시키고 콜라겐(collagen) 분해 효소인 MMP1의 발현을 억제함으로써 주름 개선에 효과가 있는 것으로 판단된다.

6. 마스크 팩의 관능평가

수벌번데기 추출물 함량이 제형1의 마스크팩을 이용하여 6명의 피험자에서 관능평가를 수행하였다.

관능평가 결과, 점도, 발림성, 팩 제거 후 느낌 및 보습력은 수벌 번데기 추출물 함량 0%에서 1%로 증가할수록 우수해지는 것을 확인하였다. 반면, 제거 용이성은 수벌번데기 함량에 따른 차이가 나타나지 않음을 확인하였다(표 3).

따라서 제형1의 마스크팩의 관능평가 결과 기호성이 가장 좋았던 수벌번데기 추출물 1%로 함량을 확정하였으며, 관능평가 결과 보습력이 3.92로 보통 수준(3점대)으로 평가되었다. 따라서 마스크팩의 보습력을 강화하기 위해 표 2의 제형 2의 마스크팩을 제조하였다.

제조된 제형2의 마스크팩에 대해 6명의 피험자에서 팩 사용 전/후의 피부 상태 변화(수분도, 탄력도, 모공, 색소침착, 피지, 주름, 민감도)를 피부진단기(API-100, aram HUVIS)로 측정하였다. 표 4 및 도 7는 피험자에서 제형2의 마스크팩 전/후의 수분도 및 탄력도를 피부 측정기(skin test meter: API-100, aram HUVIS)를 이용하여 측정한 결과이다.

피험자 6명에게 제형2의 마스크팩 사용 전과 실험기간 중 매일 사용시 1, 2 및 3주간 피부진단기를 이용하여 얼굴 특정 지정부위(눈가)의 수분, 탄력과 모공, 민감도, 주름, 피지 및 색소침착을 종합진단 하였다.

제형2의 마스크팩을 사용하기 전 피험자 얼굴 특정부위의 수분은 평균 39.5였으나, 수벌번데기 추출물 1%를 첨가한 마스크팩 사용 3주 뒤 41.2로 개선되는 것을 확인하였다. 또한, 피부탄력은 제형2의 마스크팩을 사용하기 전 35.5에서 제형2의 마스크팩을 3주간 사용했을 때 41.0으로 개선되었다.

즉, 제형2의 마스크팩 사용후 20분 뒤 수분도 및 탄력도가 모두 증가하는 것을 확인하였으며, 1 내지 3주의 매일 사용시 수분도 및 탄력도가 증가된 상태를 유지함을 확인하였다(표 4).

6명의 피험자의 피부상태를 종합 진단한 결과, 도 7과 같이 각 피험자의 6명의 피험자에서 모공, 민감도, 주름, 피지 및 색소침착의 피부 상태가 전반적으로 개선되는 것을 확인하였다.

구체적으로 모공, 민감도, 주름, 피지 및 색소침착의 피부 상태에 대해 육안으로 평가하여 0 내지 3점의 점수를 평가하였다. 각 평가점수가 감소할수록 피부상태가 개선되는 것을 판단하였으며, 평가 결과는 개선이 필요한 상태(2점 초과 3점 이하), 관리(1점 초과 2점 이하), 유지(0점 이상 1점 이하) 상태로 분류하였다.

6명의 피험자에서 제형2의 마스크팩을 1 내지 3주의 매일 사용 후 피부 평가 결과, 사용전과 비교하여 3주 뒤에 모공, 민감도, 주름, 피지 및 색소침착의 피부상태 점수가 감소하는 경향을 나타냈다. 즉, 모공, 민감도, 주름, 피지 또는 색소침착 피부상태가 개선됨을 확인하였다.

<110> JeollaNamdo <120> Mask pack composition for Whitening and anti wrinkle containing extract pupae of male bees <130> DP20200130 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen 1 Forward primer <400> 1 agggccaaga cgaagacatc 20 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Collagen 1 Reverse primer <400> 2 agatcacgtc atcgcacaac a 21 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MMP1 forward primer <400> 3 tctgacgttg atcccagaga gcag 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control forward primer <400> 4 agagctacga gctgcctgac 20 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control reverse primer <400> 5 tctgacgttg atcccagaga gcag 24

Claims

수벌번데기의 40 내지 60% 에탄올 추출물을 0.8 내지 1.2 중량% 포함하는 미백 및 주름개선용 마스크팩 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 추출물은 16 내지 20일령 사이의 서양종꿀벌의 수벌번데기에서 추출된 것인,
마스크팩 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 알부틴, 아데노신, 아쿠아 이지 젤, 1,3-프로판올 및 참마 피토뮤신으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것인,
마스크팩 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 조성물은 알부틴 1 내지 3 중량%, 아노데신 0.01 내지 1 중량%, 아쿠아 이지겔 4 내지 6 중량%, 1,3-프로판올 4 내지 6 중량% 및 참마 피토뮤신 2 내지 4 중량%를 포함하는 것인,
마스크팩 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 조성물은 워터 아르간 오일, 달팽이 앰플, 알로에 수딩겔 및 아로마 오일로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것인,
마스크팩 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 조성물은 워터 아르간 오일 2 내지 4 중량%, 달팽이 앰플 2 내지 4 중량%, 알로에 수딩겔 2 내지 4 중량% 및 아로마 오일 0.01 내지 2 중량%로 포함하는 것인,
마스크팩 조성물.
제 1항 내지 6항 중 어느 하나의 항에 있어서,
상기 조성물은 다마스크 로즈 워터 또는 유칼립투스 잎 워터를 더 포함하는 것인,
마스크팩 조성물.
16 내지 20일령 사이의 수벌번데기 동결분말에 40 내지 60% 에탄올 용매를 첨가하고 12시간 내지 48시간 동안 추출하여 수벌 번데기 추출물을 제조하는 단계 및
상기 수벌번데기 추출물을 전체 조성물에 대해 0.8 내지 1.2 중량%로 첨가하는 단계를 포함하는,
미백 및 주름개선용 마스크팩 조성물의 제조방법.
제 8항에 있어서,
상기 첨가하는 단계는 조성물 총 중량에 대해 알부틴 1 내지 3 중량%, 아노데신 0.01 내지 1 중량%, 아쿠아 이지겔 4 내지 6 중량%, 1,3-프로판올 4 내지 6 중량% 및 참마 피토뮤신 2 내지 4 중량%를 첨가하는 것인,
미백 및 주름개선용 마스크팩 조성물의 제조방법.