KR20220046586A

KR20220046586A - 선택적 에스트로겐 수용체 분해제

Info

Publication number: KR20220046586A
Application number: KR1020227005904A
Authority: KR
Inventors: 란잔 쿠마르 팔; 비스와짓 사만타; 자야라즈 딜립바이 아라디; 산딥 판카즈쿠르마 파닥; 카우쉭 단지바이 프라자파티; 바베시 모한바이 팬챌; 트리나다 라오 치투리
Original assignee: 썬 파마 어드밴스트 리서치 컴패니 리미티드
Priority date: 2019-07-22
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2022-04-14
Also published as: US11014915B2; CA3148592A1; BR112022001285A2; CL2022000156A1; CN114302879A; IL290036A; AU2020317099A1; WO2021014386A1; ZA202201157B; JP2022541938A; EP4003525A1; US20210024504A1; US20210261534A1; PE20221588A1; MX2022001013A

Abstract

선택적 에스트로겐 수용체 분해제(SERD)인, 화합물 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-[(E)-3-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]프로프-1-에닐]페닐]-4-메틸-2H-크로멘-7-올, 및 이의 S 거울상 이성질체인, (2S)-3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-[(E)-3-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]프로프-1-에닐]페닐]-4-메틸-2H-크로멘-7-올, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염. 또한, 이들의 제조를 위한 프로세스가 제공된다. 또한, ER-양성 유방암과 같은 에스트로겐 수용체의 조절과 관련된 질환의 치료를 위한 이들 화합물의 용도가 제공된다.

Description

선택적 에스트로겐 수용체 분해제

본 출원은 2019년 7월 22일에 출원된 인도 특허 가출원 제201921029554호에 대한 우선권을 주장하며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

본 발명은 선택적 에스트로겐 수용체 분해제(SERD)인, 화합물 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-[(E)-3-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]프로프-1-에닐]페닐]-4-메틸-2H-크로멘-7-올, 및 이의 S 거울상 이성질체인, (2S)-3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-[(E)-3-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]프로프-1-에닐]페닐]-4-메틸-2H-크로멘-7-올, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염에 관한 것이다. 본 발명은 이들의 제조를 위한 프로세스를 추가로 제공한다. 본 개시는 또한 ER-양성 유방암과 같은 에스트로겐 수용체(ER)의 조절과 관련된 질환의 치료를 위한 이들 화합물 및 관련 방법의 용도에 관한 것이다.

내인성 에스트로겐, 17β-에스트라디올(E2)은 에스트로겐 수용체(ER)와의 상호작용을 통해 생식계, 골 발달 및 전환, 및 심혈관계뿐만 아니라 중추신경계에서 매우 다양한 생물학적 활성을 나타낸다. ER은 2개의 이소형, ER-α 및 ER-β를 갖는 것으로 밝혀졌다. 에스트로겐과 유방암 성장 및 발달 간의 연관성은 잘 확립되어 있다.

에스트로겐 수용체 양성 유방암에서 내인성 에스트로겐의 작용을 억제하는 다수의 요법이 실시되고 있다. 여기에는. 유방 내 ER의 선택적 조직 특이적 길항제로 작용하는 타목시펜과 같은 선택적 ER 조절제(SERM); ER 전환을 촉진하는 풀베스트란트와 같은 선택적 ER 분해제(SERD); 및 에스트로겐 생합성을 억제하는 엑세메스탄(스테로이드성), 아나스트로졸 및 레트로졸(비스테로이드성)과 같은 아로마타아제 억제제(AI)가 포함되며, 주로 ER 양성 유방암을 가진 폐경 후 여성에게 사용된다. 유감스럽게도, 유방암을 가진 많은 여성들은 초기에 타목시펜 또는 AI 요법에 잘 반응하지만, 치료 기간 동안 저항이 발생한다. 유방암의 내성 형태에는 에스트로겐 수용체 하류의 성장 촉진 신호 전달 경로가 여전히 중요한 역할을 한다는 증거가 있다. 최근, AI 치료 후, ER-α의 리간드 결합 도메인에서의 돌연변이로 인해 내성이 발생하여, 리간드가 없는 경우에도 구조적으로 활성이 되어 내성이 유발된다는 임상 증거가 증가하고 있다.

Fanning은 가장 흔한 ER-α 점돌연변이가 Y537S 및 D538G인 반면, 몇몇 다른 것들은 상당히 감소된 빈도로 식별되었음을 보고하였다. 중요하게는, 유방암 세포 기반 연구는 Y537S 및 D538G 돌연변이가 ER-α의 호르몬 비의존성 활성화를 부여하고, 임상적으로 처방된 SERM 및 SERD의 억제 효능 및 효율을 감소시켰음을 보여주었다(Fanning 등, eLife 2016; 5:e12792).

현재, 풀베스트란트는 동종 최초의 SERD로 간주된다. 안타깝게도, 풀베스트란트의 상당한 약학적 부담, 즉 다량의 근육내 주사의 필요성, 낮은 용해도, 경구 생체이용률 부족은 그의 광범위한 사용을 제한한다. 따라서, 특히 ER 분해 특성을 갖는, 경구 생체 이용 가능한 ER 길항제의 개발은 현재 이용 가능한 ER 활성을 표적으로 하는 요법에 대한 내성이 발생한 환자에게 유익할 것이다. 최근 여러 새로운 SERD가 개발되었으며, 이는 현재 임상 시험의 여러 단계를 진행 중이다(예를 들어, SAR-439859(II상), LSZ-102(I상), AZD-9496(II상), GDC-810(현재 중단됨), GDC-927(현재 중단됨), 및 기타). 많은 비스테로이드성 ER 길항제가 선행 기술에 보고되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제US5395842호 및 제US6060503호는 항에스트로겐 화합물 및 조성물을 개시한다.

미국 특허 제5,389,646호, 제5,407,947호; 유럽 특허 제0 470 310B1호 및 WIPO 공개 WO 제99/02512A1호는 에스트로겐 수용체를 통해 조절된 병태의 치료 또는 예방에 유용한 벤조피란 화합물을 개시한다.

미국 특허 출원 공개 제2004/0034017호(Schering Aktiengesellschaft에 양도됨)는 4-플루오로알킬-2H-벤조피란 유도체를 항에스트로겐으로서 개시한다.

WIPO 공개 WO 제2011/156518A2호 및 WO 제2013/090829A1호(둘 모두 Aragon Pharmaceuticals Inc.에 양도됨)는 에스트로겐 수용체 조절제로서 2H-크로멘 유도체의 큰 속을 개시한다.

WO 제2013/090836A1호(Aragon Pharmaceuticals, Inc.에 양도됨)는 측쇄에 에스트로겐 수용체 조절제/ER 분해제로서 플루오르화 아제티딘 또는 피롤리딘 고리를 갖는 2H-크로멘 유도체를 개시한다.

WO 제2014/205136A1호 및 WO 제2014/205138A1호(둘 모두 Seragon Pharmaceuticals, Inc.에 양도됨)는 측쇄에 에스트로겐 수용체 조절제/ER 분해제로서 플루오로메틸아제티딘기를 갖는 4-메틸-2H-크로멘 유도체 및 이의 입체 이성질체를 개시한다.

WO 제2016/097073A1호(F. Hoffmann-La Roche AG/ Genentech, Inc.에 양도됨)는 측쇄에 에스트로겐 수용체 조절제/ER 분해제로서 플루오로메틸아제티딘기 또는 플루오로메틸피롤리딘기를 갖는 2H-크로멘 유도체를 개시한다.

WO 제2016/189011A1호(F. Hoffmann-La Roche AG/ Genentech, Inc.에 양도됨)는 측쇄에 에스트로겐 수용체 조절제/ER 분해제로서 플루오로메틸아제티딘 또는 피롤리딘기를 갖는 2H-크로멘 유도체를 개시한다.

WO 제2013/090921A1호 및 WO 제20142/03132A1호(둘 모두 Olema Pharmaceuticals, Inc.에 양도됨)은 측쇄에 항에스트로겐으로서 메틸피롤리딘을 갖는 벤조피란 유도체를 개시한다.

WO 제2016/174551A1호(Pfizer Inc.에 양도됨)는 측쇄에 항에스트로겐으로서 N-알킬화 아제티딘을 갖는 2H-크로멘 유도체를 개시한다.

본 발명은 화학식 I로 표시되는 화합물, 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-[(E)-3-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]프로프-1-에닐]페닐]-4-메틸-2H-크로멘-7-올:

또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

본 발명은 또한 화학식 Ia로 표시되는 화합물, (2S)-3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-[(E)-3-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]프로프-1-에닐]페닐]-4-메틸-2H-크로멘-7-올:

또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

본 발명의 화합물은 선택적 에스트로겐 수용체 분해제이며, ER의 조절과 관련된 질환의 치료에 사용될 수 있다.

용어

본원에 사용되는 "약학적으로 허용 가능한 염"은 유기산 또는 무기산으로 형성된 하나 이상의 유형의 산 부가염을 포함한다. 본원에 개시된 화합물의 적절한 약학적으로 허용 가능한 염은, 염산, 히드로브롬산, 인산과 같은 무기산의 염, 및 예를 들어, 아세트산, 벤젠술폰산, 메탄술폰산, 벤조산, 구연산, 글리콜산, 락트산, 푸마르산, 숙신산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 말산, 타르타르산, 또는 글루탐산 또는 아스파르트산과 같은 아미노산과 같은 유기산의 염일 수 있는 산 부가염을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에 사용되는 용어 "유효량"은 대상체에게 1회 또는 다회 투여량 투여(들) 시, 주어진 질환 또는 상태의 임상적 증상 및 이러한 치료가 없을 때 예상되는 것 이상의 이의 합병증을 치유, 완화, 경감 또는 부분적으로 해결하는 데 충분한 화합물의 양을 지칭한다. 따라서, 결과는 질환의 징후, 증상 또는 원인의 감소 및/또는 완화, 또는 생물학적 시스템의 임의의 다른 원하는 변화일 수 있다. "치료적 유효량"은 대상체의 연령, 체중, 전반적인 상태, 치료 중인 병태, 치료 중인 병태의 중증도, 및 처방 의사의 판단에 따라 대상체마다 달라질 수 있는 것으로 이해된다.

본원에 사용되는 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 완전히 또는 부분적으로 치유, 완화, 경감, 개선, 제거, 발병 지연, 진행 억제, 중증도 감소, 및/또는 발병 감소시키는 것을 지칭한다.

본원에 개시된 방법 또는 화합물 또는 치료를 필요로 하는 인간은 본원에 기술된 특정 질환, 장애 및/또는 병태를 앓고 있거나, 의학적 진단에 의한 바와 같이, 이러한 특정 질환, 장애 및/또는 병태가 발생할 인지된 위험이 있는 사람이다.

도 1. MCF7-Y537S 마우스 이종이식편에서 화학식 I의 화합물 및 화학식 Ia의 화합물의 생체 내 효능.

본 출원인은 이전에, 측쇄 내에 ER 길항제/분해제로서 헤테로시클릭 고리를 갖는 2H-크로멘 유도체에 대한 WIPO 공개 WO 제2017/072792A1호로서 공개된 특허 출원을 출원하였다. 본 발명자들은, 특히 ER 분해 특성을 갖는 보다 양호한 경구 생체 이용 가능 ER 길항제를 추가로 개발하기 위한 과정에서, 놀랍게도, 구조 내의 7-히드록시 크로멘 모이어티 및 아제티딘 고리 측쇄를 갖는 화학식 I의 화합물이 에스트로겐 수용체의 상당한 분해를 나타낸다는 것을 발견하였다. 화학식 I의 화합물의 S-입체 이성질체가 R-이성질체보다 상당히 더 강력하다는 것을 추가로 발견하였다. 또한, 놀랍게도 화학식 I의 화합물의 S-이성질체가 R-이성질체에 비해 훨씬 더 효과적인 약동학적 특성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 제1 양태에서, 본 발명은 화학식 I로 표시되는 화합물, 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-[(E)-3-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]프로프-1-에닐]페닐]-4-메틸-2H-크로멘-7-올:

또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

본 발명자가 화학식 I의 화합물을 그의 거울상 이성질체 내로 키랄 분해를 수행했을 때, 'S' 거울상 이성질체는 놀랍게도 MCF-7 성장 억제 분석/ER-α 분해 검정뿐만 아니라 그의 약동학적 프로파일 모두에서의 시험관 내 효능의 측면에서 'R' 거울상 이성질체보다 상당히 우월한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 제2 양태에서, 본 발명은 화학식 Ia로 표시되는 화합물, (2S)-3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-[(E)-3-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]프로프-1-에닐]페닐]-4-메틸-2H-크로멘-7-올:

및/또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

따라서, 본 발명의 일 양태는 조성물에 존재하는 화학식 I의 거울상 이성질체의 총량의 적어도 75%가 S 거울상 이성질체인 조성물이다. 특정 구현예에서, 존재하는 화학식 I의 거울상 이성질체의 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 및 100%가 S 거울상 이성질체일 수 있다. 다른 구현예에서, 조성물은 화학식 I의 R 거울상 이성질체를 함유하지 않는다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 화학식 Ia의 화합물 또는, 화학식 Ib의 화합물이 실질적으로 없는, 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다.

용어 "실질적으로 화학식 Ib의 화합물이 없음"은 화학식 Ia의 화합물에 대해 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.9% 미만, 0.8% 미만, 0.7% 미만, 0.6% 미만, 0.5% 미만, 0.4% 미만, 0.3% 미만, 0.2% 미만, 0.1% 미만, 0.09% 미만, 0.05% 미만 또는 0.01% 미만 w/w인 화학식 Ib의 화합물의 함량을 지칭하거나, 화학식 Ib의 화합물이 존재하지 않는다는 것을 지칭한다.

따라서, 일 구현예에서, 본 발명은 화학식 Ia의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 여기에서 화학식 Ib의 화합물의 함량은 화학식 Ia의 화합물에 대해 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만, 0.05% 미만, 0.01% 미만 w/w이거나 존재하지 않는다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 화학식 Ia의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 화합물을 제공하며, 여기에서 화학식 Ia의 화합물 대 화학식 Ib의 화합물의 거울상 이성질체 비율은 75:25 초과, 80:20 초과, 85:15 초과, 90:10 초과, 95:5 초과, 96:4 초과, 97:3 초과, 98:2 초과, 99:1 초과 또는 100:0이다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 화학식 Ia의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공하며, 여기에서 화학식 Ia의 화합물 대 화학식 Ib의 화합물의 거울상 이성질체 비율은 80:20 초과이다. 또 다른 구현예에서, 화학식 Ia의 화합물의 거울상 이성질체 비율은 85:15 초과이다. 또 다른 구현예에서, 화학식 Ia의 화합물의 거울상 이성질체 비율은 90:10 초과이다. 또 다른 구현예에서, 화학식 Ia의 화합물의 거울상 이성질체 비율은 95:5 초과이다. 또 다른 구현예에서, 화학식 Ia의 화합물의 거울상 이성질체 비율은 96:4 초과이다. 또 다른 구현예에서, 화학식 Ia의 화합물의 거울상 이성질체 비율은 97:3 초과이다. 또 다른 구현예에서, 화학식 Ia의 화합물의 거울상 이성질체 비율은 98:2 초과이다. 또 다른 구현예에서, 화학식 Ia의 화합물의 거울상 이성질체 비율은 99:1 초과이다. 또 다른 구현예에서, 화학식 Ia의 화합물의 거울상 이성질체 비율은 100:0이다. 즉, 화학식 Ib의 화합물(R 거울상 이성질체)은 존재하지 않는다.

본 발명은 또한 화학식 I 또는 화학식 Ia의 화합물의 전구약물 또는 중수소화 유도체를 포함한다.

본원에 기술된 바와 같은 본 발명의 화합물은 ER-길항제로서, 특히 ER 분해 특성을 가지며, 따라서, 특히 유방암, 난소암, 뇌암 및 자궁내막암으로부터 선택되지만 이에 한정되지 않는 암과 같은, ER 의존성 또는 ER 매개 질환 치료에 의약으로서 유용한 것으로 여겨진다.

유방암 발생 및 진행에서의 ER-α의 중심 역할을 감안할 경우, 본 발명의 화합물은 단독으로, 또는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 다른 제제와 조합하여 유방암 치료에 유용할 수 있다: 아로마타아제 효소 억제제(예를 들어, 아나스트로졸, 레트로졸, 등), SERM(예를 들어, 타목시펜, 랄록시펜, 등), 항에스트로겐(예를 들어, 풀베스트란트 등), 황체형성 호르몬 방출 호르몬(LH-RH) 작용제(예를 들어, 루프롤리드 등), CDK4/6 억제제(예를 들어, 팔보시클립 등) 또는 안트라실린, 플라틴, 질소 머스타드 알킬화제 등을 포함하는 다른 화학요법제.

따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 ER 의존성 또는 ER 매개 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 인간에서 이를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효량을 이를 필요로 하는 인간에게 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 ER 의존성 또는 ER 매개 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 인간에서 이를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 화학식 Ia의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효량을 이를 필요로 하는 인간에게 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 유방암, 자궁내막암, 뇌암 및 난소암으로부터 선택된 암의 치료를 필요로 하는 인간에서 이를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 화학식 I의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효량을 이를 필요로 하는 인간에게 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 유방암, 자궁내막암, 뇌암 및 난소암으로부터 선택된 암의 치료를 필요로 하는 인간에서 이를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 화학식 Ia의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효량을 이를 필요로 하는 인간에게 투여하는 단계를 포함한다.

또 다른 구현예에서, 본 발명은 유방암을 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 화학식 I의 화합물 또는 화학식 Ia의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다.

약학적 조성물

본원에 개시된 화합물은 부형제 및 대상체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 하는 다른 화합물을 포함하는, 적절한 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 조성물로 제형화될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 부형제를 사용하여 종래의 방식으로 제형화될 수 있다. 약학적으로 허용 가능한 부형제는, 희석제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 활택제, 중합체, 코팅제, 용매, 공용매, 보존제, 습윤제, 증점제, 소포제, 감미제, 향미제, 항산화제, 착색제, 가용화제, 가소제, 분산제 등과 같은 항목을 포함할 수 있다. 본 발명의 화합물은 알약, 정제, 코팅된 정제, 캡슐, 분말, 과립, 펠릿, 패치, 임플란트, 필름, 액체, 반고체, 겔, 에어로졸, 유화액, 엘릭서 등의 형태로 제형화될 수 있다. 이러한 약학적 조성물 및 이를 제조하기 위한 프로세스는, 예를 들어, Remington: The Science and Practice of Pharmacy(D. B. Troy, Editor, 제21판, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)에 기술되어 있으며, 그 내용은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 특정 구현예에서, 본원에 기술된 화합물 및 조성물은 경구, 비경구, 근육내, 경피 또는 정맥내 투여될 수 있다.

따라서, 일 구현예에서, 본 발명은, 화학식 I의 화합물 또는 화학식 Ia의 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함하는 약학적 조성물을 제공한다.

본원에 기술된 바와 같은 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 화합물의 적절한 투여량은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 치료 투여량은 일반적으로 동물 연구에서 유래된 예비 증거를 기반으로 인간을 대상으로 한 투여량 범위 연구를 통해 식별된다. 투여량은 원하지 않는 부작용을 야기하지 않고 원하는 치료 혜택을 제공하기에 충분해야 한다. 투여 방법, 투여 형태, 및 적절한 약학적 부형제 또한 당업자에 의해 이해되고 조정될 수 있다.

다음의 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 예시한다. 본원의 실시예는 단지 예시적인 것이며, 본 개시의 범주 또는 본원에 첨부된 청구범위를 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다.

제조 프로세스

화학식 I의 화합물, 화학식 Ia의 화합물, 및 이들과 밀접하게 관련된 유사체를 아래에 기술된 바와 같이 제조하였다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 용매 및 시약을 상업적 공급원으로부터 수득한 바와 같이 사용하였다. 중수소화된 DMSO에서 500 MHz로 작동하는 Bruker^® 분광기로 ¹H-NMR 스펙트럼을 기록하였다.

화학식 I의 화합물 또는 화학식 Ia의 화합물은, 예를 들어 화학식 I 또는 화학식 Ia의 화합물을 적절한 용매에 용해시키고 이를 적절한 산으로 처리하는 단계를 포함하는, 당업계에 공지된 방법에 의해 이의 염으로 변환될 수 있다.

실시예 1: 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-{4-[( E )-3-(3-플루오로메틸 아제티딘-1-일)프로페닐}-4-메틸-2 H -크로멘-7-올(화학식 I의 화합물)의 제조

단계 I: 2-(3,5-디플루오로페닐)-1-(2,4-디히드록시페닐)에타논의 제조

염화옥살릴(5.98 mL, 0.070 mol)를 실온에서 디클로로메탄(100 mL) 중 3,5-디플루오로페닐아세트산(10 g, 0.058 mol) 및 N,N-디메틸포름아미드(0.5 mL)의 교반된 용액에 적가하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 30 내지 35℃의 감압 하에서 농축시킨 다음 디클로로메탄(20 mL)에 용해시켰다. 생성된 용액을 0 내지 5℃에서 디클로로메탄(80 mL) 중 레소르시놀(9.58 g, 0.087 mol) 및 염화알루미늄(11.60 g, 0.087 mol)의 교반된 용액에 첨가하고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 반응물을 0 내지 5℃에서 2N 염산 용액(120 mL)으로 서서히 ??칭시키고 동일한 온도에서 1시간 동안 교반하였다. 고형분을 여과하고, 물과 n-헥산으로 연속 세척하였다. 생성된 고형분을 진공 하에서 건조시켜 2-(3,5-디플루오로페닐)-1-(2,4-디히드록시페닐)에타논을 수득하였다.

단계 II: 2-(3,5-디플루오로페닐)-1-[2-히드록시-4-(테트라 히드로피란-2-일옥시)페닐]에타논의 제조

3,4-디히드로-2H-피란(45.58 mL, 0.50 mol)을 실온에서 디클로로메탄(880 mL) 중 2-(3,5-디플루오로페닐)-1-(2,4-디히드록시페닐)에타논(44.0 g, 0.167 mol) 및 피리디늄 p-톨루엔 술포네이트(6.28 g, 0.025 mol)의 교반 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 2시간 동안 교반하고, 수성 포화 중탄산나트륨 용액으로 ??칭시켰다. 유기층을 분리하고 수성층을 디클로로메탄으로 다시 추출하였다. 합쳐진 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 감압 하에서 농축시켜 조생성물을 수득하고, 이를 실온에서 n-헥산:에틸 아세테이트(95:5)의 혼합물 중에서 교반하고 여과하여 2-(3,5-디플루오로페닐)-1-[2-히드록시-4-(테트라히드로피란-2-일옥시)-페닐]에타논을 수득하였다.

단계 III: 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-(4-요오드페닐)-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)크로만-4-온의 제조

1,8-디아자비시클로(5.4.0)운데크-7-엔(DBU, 0.055 g, 0.00036 mol)을 이소프로필 알코올(10 mL) 중 2-(3,5-디플루오로페닐)-1-[2-히드록시-4-(테트라히드로피란-2-일옥시)-페닐]에타논(0.5 g, 0.0014 mol), 4-요오드 벤즈알데히드(0.37 g, 0.0016 mol) 및 피페리딘(0.03 g, 0.00036 mol)의 교반된 슬러리에 첨가하였다. 반응 혼합물을 90 내지 95℃로 3시간 동안 가열하였다. 감압 하에서 용매를 제거하여 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-(4-요오드페닐)-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)크로만-4-온을 수득하였다.

단계 IV: 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-(4-요오드페닐)-4-메틸-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)-크로만-4-올의 제조

테트라히드로푸란(THF, 1.6 mL) 중 메틸 마그네슘 염화물(3 M)을 20 내지 25℃에서 무수 THF(12 mL) 중 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-(4-요오드페닐)-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)-크로만-4-온(0.8 g, 0.0014 mol)의 교반된 용액에 첨가하고 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 수성 포화 염화암모늄 용액으로 0 내지 5℃에서 ??칭시킨 다음, 물로 ??칭시켰다. 유기층을 분리하고 수성층을 에틸 아세테이트로 다시 추출하였다. 합쳐진 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 진공 하에서 용매를 제거하여 표제 화합물을 수득하였다.

단계 V: 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-(4-요오드페닐)-4-메틸-2 H -크로멘-7-올의 제조

메탄올(2 mL) 중 농축 황산(0.22 mL, 0.0042 mol)의 용액을 메탄올(10 mL) 중 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-(4-요오드페닐)-4-메틸-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)-크로만-4-올(0.8 g, 0.0014 mol)의 교반된 용액에 첨가하고, 65 내지 70℃에서 3시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 0 내지 5℃로 냉각시켰다. 포화 중탄산나트륨 용액을 전술한 반응 혼합물에 첨가하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에서 용매를 제거하여 조생성물을 수득하고, 이를 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 톨루엔:에틸 아세테이트(97:3))로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.

단계 VI: 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-(4-요오드페닐)-4-메틸-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)-2 H -크로멘의 제조

3,4-디히드로-2H-피란(10.34 mL, 0.113 mol)을 실온에서 디클로로메탄(200 mL) 중 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-(4-요오드페닐)-4-메틸-2H-크로멘-7-올(18 g, 0.038 mol) 및 피리디늄 p-톨루엔술포네이트(1.42 g, 0.0057 mol)의 교반된 용액에 첨가하고, 16시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 중탄산나트륨의 포화 용액으로 ??칭시켰다. 유기층을 분리하고 수성층을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에서 용매를 제거하여 조생성물을 수득하고, 이를 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 톨루엔)로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.

단계 VII: ( E )-3-{4-[3-(3,5-디플루오로페닐)-4-메틸-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)-2H-크로멘-2-일]페닐}아크릴산 에틸 에스테르의 제조

에틸 아크릴레이트(0.23 g, 0.0022 mol)를 N-메틸-2-피롤리돈(2 mL) 중 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-(4-요오드페닐)-4-메틸-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)-2H-크로멘(0.25 g, 0.00045 mol) 및 트리에틸아민(0.37 mL, 0.0027 mol)의 교반된 용액에 첨가하고, 이어서 Pd(PPh₃)₂Cl₂(0.003 g, 0.0000044 mol)를 실온에서 첨가하였다. 생성된 반응 혼합물을 95℃에서 1시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에서 용매를 제거하여 조생성물을 수득하고, 이를 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, n-헥산:에틸 아세테이트(85:15))로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.

단계 VIII: ( E )-3-{4-[3-(3,5-디플루오로페닐)-4-메틸-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)-2 H -크로멘-2-일]-페닐}프로프-2-엔-1-올의 제조

톨루엔(0.56 mL, 0.00079 mol) 중 디이소부틸알루미늄 수소화물(20%) 용액을 -30℃에서 톨루엔(5.6 mL) 중 (E)-3-{4-[3-(3,5-디플루오로페닐)-4-메틸-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)-2H-크로멘-2-일]-페닐}아크릴산 에틸 에스테르(0.14 g, 0.00026 mol)의 교반된 용액에 첨가하고, -20 내지 -25℃에서 45분 동안 교반하였다. 메탄올(0.5mL) 및 나트륨 칼륨 타르트레이트(20%) 용액(5mL)을 -20℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고 실온에서 물로 처리하였다. 유기층을 분리하고 수성층을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에서 용매를 제거하여 조생성물을 수득하고, 이를 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, n-헥산:에틸 아세테이트(60:40))로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.

단계 IX: 1-(( E )-3-{4-[3-(3,5-디플루오로페닐)-4-메틸-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)-2 H -크로멘-2-일]-페닐}알릴)-3-플루오로메틸아제티딘

요오드(1.02 g, 0.0041 mol)를 0 내지 5℃에서 디클로로메탄(10 mL) 중 트리페닐 포스핀(1.07 g, 0.0041 mol) 및 이미다졸(0.31 g, 0.0045 mol)의 교반된 용액에 나누어 첨가하였다. 반응 혼합물을 0 내지 5℃에서 30분 동안 교반하였다. 디클로로메탄(10 mL) 중 (E)-3-{4-[3-(3,5-디플루오로페닐)-4-메틸-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)-2H-크로멘-2-일]페닐}프로프-2-엔-1-올(1.0 g, 0.0020 mol)의 용액을 0 내지 5℃에서 이 반응 혼합물에 첨가하고 20분 동안 교반하였다. 이를 차가운 중탄산나트륨 용액에 서서히 붓고 디클로로메탄으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 메타중아황산나트륨 수용액 및 염수 용액으로 연속적으로 세척하였다. 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 진공 하에서 용매를 제거하여 조생성물을 수득하였다. n-헥산:에틸 아세테이트(9:1)(20 mL)의 혼합물을 전술한 조생성물에 첨가하고 실온에서 30분 동안 교반하였다. 마지막으로, 이를 여과하고 35 내지 38℃에서 여과물을 감압 하에서 농축시켜 조생성물을 수득하고, 이를 n-헥산:에틸 아세테이트(9:1)(10 mL)의 혼합물에서 30분 동안 다시 교반하였다. 이를 다시 여과하고 여과물을 35 내지 38℃에서 감압 하에서 농축시켜 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-((E)-3-요오드프로페닐)페닐]-4-메틸-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)-2H-크로멘을 수득하였다.

트리에틸아민(0.56 mL, 0.004 mol)을 아세토니트릴(10 mL) 중 3-플루오로메틸 아제티딘 염산염(0.38 g, 0.003 mol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 아세토니트릴(10 mL) 중 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-((E)-3-요오드프로페닐)페닐]-4-메틸-7-(테트라히드로-피란-2-일옥시)-2H-크로멘(1.2 g, 0.002 mol)의 용액을 실온에서 반응 혼합물에 첨가하고, 45분 동안 계속 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고, 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기층을 분리하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에서 용매를 제거하여 조생성물을 수득하고, 이를 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 디클로로메탄:메탄올(97:3))로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.

단계 X: 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-{4-[( E )-3-(3-플루오로메틸 아제티딘-1-일)프로페닐]페닐}-4-메틸-2 H -크로멘-7-올(화학식 I)의 제조

메탄올(70 mL) 중 황산(0.75 mL, 0.014 mol)의 용액을 0 내지 5℃에서 메탄올(20 mL) 중 1-((E)-3-{4-[3-(3,5-디플루오로페닐)-4-메틸-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)-2H-크로멘-2-일]-페닐}알릴)-3-플루오로메틸 아제티딘(7.6 g, 0.014 mol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반하였다. 중탄산나트륨 및 물의 포화 용액을 0 내지 5℃에서 첨가하고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜 잔류물을 수득하고, 이를 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 디클로로메탄:메탄올(90:10))로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.

실시예 2: (2 S )-3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-[( E )-3-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]프로프-1-에닐]페닐]-4-메틸-2 H -크로멘-7-올(화학식 Ia의 화합물) 및 (2 R )-3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-[( E )-3-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]프로프-1-에닐]페닐-4-메틸 -2H -크로멘-7-올(화학식 Ib의 화합물)의 제조

실시예 1의 라세미 혼합물로부터의 거울상 이성질체를 키랄 HPLC(컬럼: Chiralcel^® OD-H(250 x 30 mm, 5 μ); 이동상- n-헥산:에탄올:디에틸 아민 900:100:1)로 분리하고, 여기에서 R 거울상 이성질체(화학식 Ib의 화합물)를 먼저 용리한 다음, 원하는 S 거울상 이성질체(화학식 Ia의 화합물)를 용리하였다. 또한, 화학식 Ia의 화합물의 특이적 광학 회전(SOR)은 다음의 시험 조건을 사용하여 결정하였다:

농도: 아세톤 중 1% w/v;

온도: 25℃;

광원: 나트륨 램프(D 라인);

화학식 Ia의 화합물의 SOR:

= +224.40°.

화학식 Ia의 화합물의 키랄 순도는 다음의 분석 조건에 따라 HPLC로 결정하였다:

컬럼: CHIRALCEL^® OD-3(250 x 4.6) mm 3μm

이동상: n-헥산/에탄올/디에틸아민(90/10/0.1, v/v/v)

유속: 1.0 mL/분; 컬럼 온도: 25℃; 검출기: UV: 230 nm;

샘플 농도: 0.5 mg/mL

희석제: 이동상.

화학식 Ia의 화합물의 키랄 순도= 99.69: 0.31 (S:R); 화학식 Ib의 화합물에 대한 상대적 유지 시간(RRT) = 약 1.1

실시예 3: 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-[( E )-3-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]프로프-1-에닐]페닐]-4-메틸-2 H -크로멘-6-올(화합물 2)의 제조

라세미 화합물 2는 실시예 1(단계 III 내지 단계 X)과 유사한 프로세스에 따라 제조되었으며, 여기에서 단계 III의 2-(3,5-디플루오로페닐)-1-[2-히드록시-4-(테트라히드로피란-2-일옥시)-페닐]에타논 대신 2-(3,5-디플루오로페닐)-1-(2-히드록시-5-테트라히드로피란-2-일옥시-페닐)에타논이 사용되었다.

실시예 4: 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-{4-[( E )-3-(4-플루오로메틸피페리딘-1-일)프로페닐]페닐}-4-메틸-2 H -크로멘-7-올(화합물 3)의 제조

단계 I: 1-(( E )-3-{4-[3-(3,5-디플루오로페닐)-4-메틸-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)-2 H -크로멘-2-일]-페닐}알릴)-4-플루오로메틸피페리딘

디클로로메탄(1 mL) 중 메탄술포닐 염화물(0.11 mL, 1.4 mmol)의 용액을 0 내지 5℃에서 디클로로메탄(5 mL) 중 (E)-3-{4-[3-(3,5-디플루오로페닐)-4-메틸-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)-2H-크로멘-2-일]페닐}프로프-2-엔-1-올(0.57 g, 1.17 mmol) 및 트리에틸아민(0.24 mL, 1.75 mmol)의 교반된 용액에 적가하였다. 반응 혼합물을 0 내지 5℃에서 30분 동안 추가로 교반하였다. 반응 혼합물에 물을 첨가하고 유기층을 분리하였다. 수성층을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고 다음 단계에 사용하였다. 이 용액을 0 내지 5℃에서 아세토니트릴(6 mL) 중 트리에틸아민(0.65 mL, 4.7 mmol) 및 4-플루오로메틸피페리딘 염산염(0.54 g, 3.5 mmol)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1.5시간 동안 교반하였다. 물을 첨가하고, 혼합물을 디클로로메탄으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜 조생성물을 수득하고, 이를 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 메탄올:디클로로메탄(5:95))로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.

단계 II: 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-{4-[( E )-3-(4-플루오로메틸피페리딘-1-일)프로페닐]페닐}-4-메틸-2 H -크로멘-7-올(화합물 3)

황산(0.07 mL) 및 메탄올(5 mL)의 혼합물 중 1-((E)-3-{4-[3-(3,5-디플루오로페닐)-4-메틸-7-(테트라히드로피란-2-일옥시)-2H-크로멘-2-일]-페닐}알릴)-4-플루오로메틸피페리딘(0.7 g, 1.18 mmol)의 용액을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 중탄산나트륨 포화 용액으로 알칼리화시키고, 디클로로메탄으로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압 하에서 농축시켜 조생성물을 수득하고, 이를 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 메탄올:디클로로메탄(8:92))로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.

실시예 5: 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-[( E )-3-[(3 R )-3-(플루오로메틸)피롤리딘-1-일]프로프-1-에닐]페닐]-4-메틸-2 H -크로멘-7-올(화합물 4)의 제조

실시예 4의 단계 I의 4-플루오로메틸피페리딘 염산염 대신 (3R)-3-(플루오로메틸)피롤리딘 염산염을 사용하여, 실시예 4와 유사한 프로세스에 따라 화합물 4를 제조하였다.

실시예 6: 3-(3,5-디플루오로페닐)-4-메틸-2-[4-[( E )-3-[(3 R )-3-메틸피롤리딘-1-일]프로프-1-에닐]페닐]-2 H -크로멘-7-올(화합물 5)의 제조

실시예 4의 단계 I의 4-플루오로메틸피페리딘 염산염 대신 (3R)-3-메틸피롤리딘 염산염을 사용하여, 실시예 4와 유사한 프로세스에 따라 화합물 5를 제조하였다.

실시예 7: 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-{4-[( Z )-3-(3-플루오로메틸아제티딘-1-일)프로페닐]페닐}-4-메틸-2 H -크로멘-7-올(화합물 6)의 제조

단계 I: 3-[4-[3-(3,5-디플루오로페닐)-4-메틸-7-테트라히드로피란-2-일옥시-2 H -크로멘-2-일]페닐]프로프-2-인-1-올

비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 이염화물(0.125 g, 0.18 mmol)을 테트라히드로푸란:트리에틸아민(1:1, 64 mL)의 혼합물 중 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-(4-요오드페닐)-4-메틸-7-테트라히드로피란-2-일옥시-2H-크로멘(2.0 g, 3.6 mmol), 프로파르길 알코올(0.60 g, 10.7 mmol) 및 요오드화 구리(I)(0.054 g, 0.29 mmol)의 교반된 용액에 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반을 계속하였다. 반응 혼합물을 감압 하에서 농축시켜 미정제 잔류물을 수득하고, 이를 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 톨루엔-에틸 아세테이트(4:1))로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.

단계 II: 1-[3-[4-[3-(3,5-디플루오로페닐)-4-메틸-7-테트라히드로피란-2-일옥시-2H-크로멘-2-일]페닐]프로프-2-이닐]-3-(플루오로메틸)아제티딘

단계 II 화합물은 실시예 4, 단계 I과 유사한 프로세스를 따라 제조하였다.

단계 III: 1-[( Z )-3-[4-[3-(3,5-디플루오로페닐)-4-메틸-7-테트라히드로피란-2-일옥시-2 H -크로멘-2-일]페닐]알릴]-3-(플루오로메틸)아제티딘

Lindlar 촉매(0.125 g, 25% w/w)를 에탄올(10 mL) 중 1-[3-[4-[3-(3,5-디플루오로페닐)-4-메틸-7-테트라히드로피란-2-일옥시-2H-크로멘-2-일]페닐]프로프-2-이닐]-3-(플루오로메틸)아제티딘(0.50 g, 0.89 mmol) 및 퀴놀린(0.05 g, 10% w/w)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 수소 가스로 채워진 풍선을 사용하는 수소 분위기 하 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고 에탄올로 세척하였다. 여과물을 감압 하에서 농축시켜 조생성물을 수득하고, 이를 컬럼 크로마토그래피(실리카 겔, 디클로로메탄:메탄올(97:3))로 정제하여 표제 화합물을 수득하였다.

단계 IV: 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-{4-[( Z )-3-(3-플루오로메틸아제티딘-1-일)프로페닐]페닐}-4-메틸-2 H -크로멘-7-올(화합물 6)

실시예 4(단계 II)와 유사한 프로세스를 사용하여 THP 보호를 제거하여 라세미 화합물 6을 수득하였다.

실시예 8: 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-[3-[3-(플루오로메틸) 아제티딘-1-일]프로프-1-이닐]페닐]-4-메틸-2 H -크로멘-7-올(화합물 7)의 제조

실시예 4, 단계 II와 유사한 프로세스를 사용하여 실시예 7 (단계 II) 화합물의 THP 보호를 제거함으로써 라세미 화합물 7을 제조하였다.

화학식 I, 화학식 Ia, 및 관련 유사체의 화합물의 ¹H NMR 데이터가 아래에 제공된다:

본 개시의 화합물의 생물학적 활성을 다음의 검정을 통해 결정하였다:

선택적 에스트로겐 수용체 분해(SERD) 검정:

시험 화합물에 대한 SERD 활성을 ER 야생형을 보유하는 MCF-7 세포, 및 돌연변이체 ER(WT/D538G 및 WT/Y537S)을 보유하는 MCF-7 세포에서 평가하였다. 간략하게, 세포를 5% 목탄 제거 소 태아 혈청이 보충된 페놀 레드 유리 RPMI1640 배지에 플레이팅하였다. 시딩 밀도는 48-웰 플레이트에서, MCF-7 WT 및 MCF-7 D538G에 대해 40000 세포/웰 및 MCF-7 Y537S에 대해 50000 세포/웰이었다. 밤새 인큐베이션한 후, 세포를 다양한 농도의 시험 화합물(최종 농도: 1000 nM 내지 0.01 nM, 0.1% DMSO)로 4일 동안 처리하였다. 1 mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 5 mM NaF, 6 M 우레아, 및 1X 프로테아제 억제제 칵테일이 보충된 PBS를 사용하여 세포를 용해시켰다. ER 알파 단백질에 대해 웨스턴 블롯을 사용하여 용해물을 분석하였다. 웨스턴 블롯의 경우, 세포 용해물(12.5 내지 40 μg 총 단백질)을 10% SDS PAGE 상에서 분해하고 PVDF 막 상으로 옮겼다. 0.1% PBS-T 중 5% 탈지유 분말을 사용하여 실온에서 1시간 동안 블롯을 차단한 다음, 토끼 항-인간β-액틴 항체 및 토끼 항-인간 ERα 항체와 함께 실온에서 2시간 동안 공동 배양하였다. 이어서, 블롯을 항-토끼 IgG-HRP 접합체로 실온에서 1시간 동안 이차 항체로서 프로브하였다. 블롯은 West Pico Super Signal ChemiElluminescence 기질을 사용하여 개발하였고, 밴드는 Image Lab 소프트웨어(BioRad 버전 6.0.0)를 사용하여 밀도측정 분석을 위해 처리하였다. ERα 밴드 강도를 각각의 시료에 대한 하우스키핑 단백질로 정규화하였다. 잔여 % ER은 비히클 대조군(100%로서)에 대해 정규화하여 계산하였다.

MCF-7 세포 성장 억제 검정:

시험 화합물의 항-증식 활성을 성장 억제 검정으로 평가하였다. 요약하자면, ER 야생형(Wt)을 보유하는 MCF-7 세포, 및 돌연변이체 ER(WT/D538G 및 WT/Y537S)을 보유하는 MCF-7 세포를 10% 목탄 제거 소 태아 혈청이 보충된 페놀 레드 유리 RPMI1640 배지 중 96-웰 플레이트에서 1000 세포/웰의 밀도로 시딩하였다. 세포를 5% CO₂ 하 37℃에서 밤새 인큐베이션한 다음, DMSO 중 다양한 농도의 시험 화합물을 첨가하였다. 웰 내 DMSO의 최종 농도는 0.5%였다. 시험 화합물로 세포를 7일 동안 인큐베이션한 후, Prestoblue^TM 시약을 사용하여 세포 생존 능력을 평가하였다. 세포 증식 억제 백분율은 비히클 대조군을 0% 증식 억제로 사용하여 세포 생존 능력을 정규화함으로써 계산하였다.

화학식 I의 화합물 및 이의 밀접하게 관련된 화합물의 1 nM 농도에서의 ER-α 분해 검정의 결과는 다음의 표 1에 나타낸 바와 같다.

위의 표로부터 명백한 바와 같이, 화학식 I의 화합물은 그의 위치 이성질체 화합물 2를 포함하는 구조적으로 밀접한 화합물에 비해 MCF-7 세포주(Wt 유형)에서 상당히 더 많은 ER-α 분해를 나타냈다. 놀랍게도, 화합물 2에서와 같이, 화학식 I의 화합물에서 히드록실기의 위치를 크로멘 모이어티 상의 제7 위치로부터 제6 위치까지 변화시키는 것은 SERD 활성의 완전한 상실을 초래한다는 것을 발견하였다. 측쇄에 6원 또는 5원 헤테로시클로알킬 고리를 갖는 화합물 3, 4 및 5는 무시할 만한 SERD 활성을 갖는 반면(ER의 80% 이상 남아 있음), 측쇄에 4원성 아제티딘 고리를 갖는 화학식 I의 화합물은 ER의 양호한 분해(ER의 약 41%만 남아 있음)를 나타냈다. 또한, 놀랍게도, 화합물 7에서와 같이, 화학식 I의 화합물의 측쇄에서의 이중 결합을 삼중 결합으로 변화시키는 것은 SERD 활성의 완전한 상실을 초래한다는 것을 발견하였다. 또한, 화학식 I의 화합물의 기하학적 이성질체(Cis-이성질체)인 화합물 6은 매우 무시할 만한 SERD 활성을 나타냈다.

따라서, 화학식 I의 화합물은 강력한 선택적 에스트로겐 수용체 분해제에 필요한 모든 최적의 구조적 속성을 갖는다. 본 발명의 발명자들은 화학식 I의 화합물을 그의 S 및 R 입체 이성질체 내로 추가로 분리하였다. 본 개시에서 S 이성질체는 화학식 Ia로 제시되고 R 이성질체는 화학식 Ib로 제시된다.

화학식 Ia의 화합물 및 화학식 Ib의 화합물을 성장 억제 검정(MCF-7 세포주)에서의 항증식 활성 및 ER-α 분해에 대해 추가로 시험하였다. 결과는 다음의 표 2에 나타낸 바와 같이 제공된다.

위의 표로부터 입증된 바와 같이, 화학식 Ia의 화합물은 MCF-7 성장 억제 검정(야생형)에서 화학식 Ib의 화합물에 비해 수 배 더 우수한 활성을 나타냈으며, 여기에서 화학식 Ia의 화합물은 화학식 Ib의 화합물보다 약 233배 더 강력하였다. 화학식 Ia의 화합물은 또한 돌연변이된 세포주(Y537S & D538G)에서 유사한 경향을 나타냈다. 화학식 Ia의 화합물은 또한 그의 R-거울상 이성질체에 비해 ER-α 분해 검정에서 더 강력한 것으로 밝혀졌으며, 여기에서 화학식 Ia의 화합물은 화학식 Ib의 화합물보다 ER-α 분해(야생형)에서 약 34배 더 강력하였다. R 거울상 이성질체는 돌연변이된 세포주(Y537S & D538G)에서 ER-α 분해를 나타내지 않았다.

약동학 연구:

약물 개발에서, 경구 투여를 위한 우수한 약물 후보물질이 되기 위해서는 화합물의 양호한 경구 생체이용률 및 약동학적(PK) 프로파일을 갖는 것이 매우 중요하다. 강력한 시험관 내 효능을 갖는 많은 화합물들이 인간 신체에서 치료 효능을 나타내는 데 실패했다. 이들 화합물의 치료적 효능의 결여는 주로 낮은 생체이용률, 짧은 반감기, 신속한 대사, 또는 짧은 작용 지속 기간을 초래하는 신속한 제거와 같은 부적절한 약동학적 특성에 기인한다. 따라서, 우수한 약물 후보물질은 우수한 효능뿐만 아니라 우수한 약동학적 프로파일도 가져야 한다. 화학식 Ia 및 Ib의 화합물의 약동학적 프로파일을 아래에 제공된 절차에 따라 결정하였다.

PK 프로파일은 암컷 SD 랫트(n = 2)에서 1회 경구 투여 후 평가하였다. 투여 전 12 내지 13시간 동안 랫트를 금식시키고, 경구 치료 후 2시간 시점에 먹이를 제공하였다. 화합물의 투여량 제형은 0.5% 카복시메틸 셀룰로오스(CMC) 중 Tween 80(현탁액의 총 부피의 0.4% v/v)에서 제조하였다. 치료는 50 mg/kg, 경구로 제공되었다. 혈장 농도를 평가하기 위해, 치료 후 0.25, 1, 4, 8, 24, 48 및 72시간 시점에 안와 뒤 신경총을 통해 랫트로부터 0.2 mL의 혈액을 채혈하고, 즉시 항응고제로 헤파린 나트륨을 함유하는 Eppendorf 튜브(100IU/mL)에서 8500 rpm으로 4℃에서 7분 동안 원심분리하였다. 혈장을 분리하여 분석 시까지 -70℃에서 보관하였다. 샘플의 분석은 아래에 주어진 방법에 따라 수행하였다:

작업 교정 표준 및 정확도 관리 표준 제조:

0.10, 0.20, 2.00, 4.00, 8.00, 12.00, 16.00, 및 20.00 μg/mL 농도를 갖는 작업 교정 표준을 제조하였다. 정확도 관리 표준은 0.30, 3.00, 10.00, 15.00 및 60.00 μg/mL 농도로 제조하였다.

작업 내부 표준(WIS) 제조:

정확히 칭량된 5 mg의 카바마제핀을 100 mL 부피 플라스크에 옮기고, 용해시키고, 희석액(물 중 0.1% 포름산:아세토니트릴 30:70 v/v)으로 표식까지 희석하였다. 위의 용액으로부터 5 μg/mL의 WIS를 제조하였다.

샘플 처리:

5 μL의 작업 표준 및 정확도 대조군을 95 μL의 블랭크 혈장에 첨가하였다. 전술한 첨가된 표준 및 정확도 대조군으로부터의 25 μL를 마이크로원심분리 튜브에 분취하였다. 또한 25 μL의 연구 샘플을 마이크로원심분리 튜브에 분취하였다. 5 μL의 WIS를 블랭크를 제외한 선형성 및 연구 샘플에 0의 표준으로 첨가하였다. 샘플을 10 내지 15초 동안 추가로 와동시켰다. 모든 제조된 샘플에 150 μL의 Milli Q 물을 첨가하고 10 내지 15초 동안 와동시켰다. 샘플을 전처리된 카트리지 상에 로딩하였다(1 mL의 메탄올에 이어서 1 mL의 Milli Q 물을 사용하여 전처리를 수행함). 카트리지를 2 x 1 mL의 Milli Q 물로 세척하였다. HPLC 바이알 중 1 mL의 용리 용액{아세토니트릴:0.1% 포름산 용액(70:30)}으로 용리를 수행하였다.

LC-MS/MS 방법:

크로마토그래피 분리는 스플리터를 사용하는 1.25 mL/분의 유속 및 20 μL의 주입 부피의 키랄 팩 ID(250*4.6 mm, 5 μ) 상에서 이루어졌다. 샘플 냉각기를 10℃로 유지시켰다. 컬럼 오븐 온도를 30℃로 설정하였다. 이동상은 다음으로 구성되었다:

이동상 A: 물 1 L 내 1.47 g 중탄산암모늄, 1 ml DEA, pH 9.2 ± 0.1

이동상 B: 메탄올,

여기에서 이동상 A를 이동상 B와 각각 30:70 v/v의 비율로 혼합하였다. 화학식 Ia의 화합물, 화학식 Ib의 화합물 및 내부 표준의 유지 시간은 각각 약 8.7, 7.6 및 4.2분이었다. 전체 크로마토그래피 실행 시간은 16분이었다.

검출은 직렬 질량 분광분석(TSQ Quantum, Discovery MAX, Thermo Electron Corporation)으로 수행하였고, 피크 면적은 LCquan 소프트웨어 버전 2.9 QF1을 사용하여 산출하였다. 화학식 Ia의 화합물 또는 화학식 Ib의 화합물에 대해 477.900 m/z → 272.982 m/z(CE 20)의 전이를 모니터링하고, 내부 표준에 대해 237.058 m/z → 194.003 m/z (CE 16)의 전이를 모니터링하는 MRM 모드로 검출기를 설정하였다.

약동학적 연구의 결과는 다음의 표 3과 같다.

위의 표로부터 명백한 바와 같이, 화학식 Ia의 화합물은 그의 R-거울상 이성질체와 비교했을 때 우월한 약동학적 프로파일을 나타냈다. 화학식 Ia의 화합물의 C_최대는 화학식 Ib의 화합물의 C_최대보다 약 2.9배 더 큰 것으로 밝혀졌다. 유사하게, 화학식 Ia의 화합물의 AUC_최종은 화학식 Ib의 화합물의 AUC_최종보다 약 4.2배 더 큰 것으로 밝혀졌다.

화학식 I의 화합물 및 화학식 Ia의 화합물의 생체 내 효능:

화학식 I의 화합물 및 화학식 Ia의 화합물의 효능을 피하 MCF7-Y537S 이종이식편을 보유하는 암컷 무흉선 누드 마우스에서 평가하였다. 화학식 I의 화합물 및 화학식 Ia의 화합물의 투여량 제형을 0.5% w/v 카복시메틸셀룰로오스(CMC) 중 Tween 80(총 현탁액 부피의 0.4% v/v)에서 제조하고, 28일 동안 1일 1회 경구 투여하였다. 디지털 버니어 캘리퍼로 종양의 2개의 수직 직경을 측정하였다. 종양 부피(V)는 다음의 식을 사용하여 계산하였다: V = (a² x b)/2, 여기에서 "a"는 종양의 폭(작은 직경)이고, "b"는 길이(큰 직경)이며, 둘 모두는 밀리미터 단위이다. 종양을 매주 2회 모니터링하고 비히클 치료군과 비교하였다. 연구의 결과는 다음의 표 4와 같다. 화학식 Ia 및 화학식 I의 화합물 둘 모두는 비히클 군과 비교했을 때 종양 성장의 유의한 감소를 나타냈다(도 1 참조). 결과는 50 mg/kg의 화학식 Ia의 화합물 및 100 mg/kg의 투여량 수준의 화학식 I의 라세미 화합물이 비히클 그룹과 비교하여 각각 56% 및 57% TGI로 유사한 종양 성장 억제(TGI)를 나타냈다는 것을 보여주었다.

요약하면, 본 개시의 화합물은 시험관 내 검정, 예를 들어, ER-α 분해 검정에서 이들의 밀접하게 관련된 화합물보다 더 양호한 효능을 나타냈다. 본 개시의 화합물은 또한 MCF7-Y537S 이종이식편에서 양호한 생체 내 효능을 나타냈다. 본 개시의 화합물, 특히 화학식 Ia의 화합물은 양호한 약동학적 프로파일을 나타냈으며, 따라서 이는 경구 투여에 적합할 수 있다. 본 개시의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은 경구 투여 형태로 제형화될 수 있고, ER 양성 유방암과 같은 ER의 조절과 관련된 질환의 치료에 사용될 수 있다.

Claims

화학식 I로 표시되는 화합물, 3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-[(E)-3-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]프로프-1-에닐]페닐]-4-메틸-2H-크로멘-7-올:

또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
화학식 Ia로 표시되는 화합물, (2S)-3-(3,5-디플루오로페닐)-2-[4-[(E)-3-[3-(플루오로메틸)아제티딘-1-일]프로프-1-에닐]페닐]-4-메틸-2H-크로멘-7-올:

또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
제1항의 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
제2항의 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는, 약학적 조성물.
인간에서 암을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 제1항 또는 제2항의 화합물의 유효량을 이를 필요로 하는 인간에게 투여하는 단계를 포함하되,
상기 암은 유방암, 자궁내막암, 뇌암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제5항에 있어서, 상기 암은 유방암인, 치료 방법.
제2항에 있어서, 하기 화학식 Ib,

의 화합물의 함량은, 상기 화학식 Ia의 화합물에 대하여 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1 미만, 0.05% 미만, 0.01% 미만 w/w이거나, 존재하지 않는, 화합물.
제2항에 있어서, 상기 화학식 Ia의 화합물의 거울상 이성질체 비율은 75:25 초과, 80:20 초과, 85:15 초과, 90:10 초과, 95:5 초과, 99:1 초과이거나 100:0인, 화합물.
제3항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 화학식 I의 S-거울상 이성질체의 양은 상기 조성물에 존재하는 화학식 I의 거울상 이성질체의 총량의 적어도 75%인, 약학적 조성물.
제9항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 화학식 I의 S-거울상 이성질체의 양은 상기 조성물에 존재하는 화학식 I의 거울상 이성질체의 총량의 적어도 99%인, 약학적 조성물.
제10항에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 화학식 I의 S-거울상 이성질체의 양은 상기 조성물에 존재하는 화학식 I의 거울상 이성질체의 총량의 100%인, 약학적 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 인간에서 유방암, 자궁내막암, 뇌암 및 난소암으로부터 선택된 암의 치료에 사용하기 위한, 화합물.
제12항에 있어서, 상기 암은 유방암인, 화합물.
인간에서 유방암, 자궁내막암, 뇌암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료를 위한 의약의 제조에 있어서의 제1항 또는 제2항의 화합물의 용도.
제14항에 있어서, 상기 암은 유방암인, 용도.