KR20220042117A

KR20220042117A - 엑소좀의 생성 방법

Info

Publication number: KR20220042117A
Application number: KR1020227001652A
Authority: KR
Inventors: 마사히코 하기하라; 다카시 하라다; 쇼타로 야마다; 아키라 다카마
Original assignee: 우베 고산 가부시키가이샤
Priority date: 2019-08-09
Filing date: 2020-08-11
Publication date: 2022-04-04
Also published as: TW202122572A; US20220290082A1; EP4012014A4; CN114207113A; EP4012014A1; JPWO2021029408A1; WO2021029408A1

Abstract

본 발명은, 세포를 세포 배양 모듈에 적용하여 세포를 배양하는 공정, 및 세포에 의해 엑소좀을 생성시키는 공정을 포함하고, 여기서 상기 세포 배양 모듈이 폴리머 다공질막과 2 이상의 배지 유출 입구를 가지며, 상기 폴리머 다공질막이 수용된 케이싱을 구비하는 상기 방법을 제공한다.

Description

엑소좀의 생성 방법

본 발명은 세포를 이용하여 엑소좀을 생성하는 방법에 관한 것이다.

엑소좀은 세포가 세포 밖으로 분비하는 50∼300 nm의 막질 소포 구조의 일종으로, 엔도사이토시스에 의해 형성된 다포성(多胞性) 엔도솜의 내부에 엔도솜의 막이 함몰하여 형성되기 때문에, 표면에 세포막 유래의 표면 단백질, 내부에 세포질 유래의 핵산이나 단백질을 함유하고 있다. 최근, 다양한 세포종에 있어서, 단백질이나 핵산의 구성이 정묘하게 컨트롤된 엔도솜이 근방 또는 원격의 세포 사이에서의 정보 전달에 관여하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 1).

엑소좀은 주로 진단 마커, 약물 송달 담체 및 생물 의약으로서의 이용이 도모되고 있다. 암 세포나 질환 세포는 그 병리적 상태를 반영하는 엑소좀을 분비하기 때문에, 엑소좀의 특징을 프로파일링함으로써 질환의 진단이 가능하게 된다(비특허문헌 2). 약물을 담지시킨 엑소좀을 그 엑소좀을 수취하는 세포를 표적으로 한 약물 송달에 이용할 수도 있다. 약물을 담지하는 방법으로서, 분비된 엑소좀에 약물을 결합하거나 또는 받아들이게 하는 수법이나, 세포질 내에 약물을 함유하는 세포에 약물을 포함한 엑소좀을 분비하게 하는 수법이 있다(비특허문헌 3).

엑소좀 자체가 생리 활성 물질로서 기능할 수 있다는 것도 보고되어 있다. 배양 신경 줄기세포주로부터 단리한 엑소좀이, 인비트로로 선유아세포의 이동, 인간 제대정맥 내피세포의 분기 및 신경돌기의 신장을 유도하는 것이 개시되어 있다(특허문헌 1). 골수 수상세포의 엑소좀은 면역 조절 기능을 갖는다는 것이 보고되어 있고, 마우스 모델에 있어서 감염증, 알레르기, 자기면역 질환 등에 대한 치료 효과가 시험되어 있다(비특허문헌 4 및 5).

엑소좀이 갖는 생리 활성은, 엑소좀 유래 세포에 의해서 컨트롤된 핵산이나 단백질의 구성에 의해서 지지된다고 생각되고 있다. 특히 엑소좀이 함유하는 miRNA와 생리 활성의 관련성이 주목을 받아, 특허문헌 2에는, 심근구(cardiosphere) 또는 심근 유래 세포(CDC)로부터 단리된 엑소좀이, miR-146a, miR-210, miR-22 및 miR-24를 포함하고, 이들이 손상되거나 또는 병을 앓은 심장 조직의 치료 효과가 있다는 것이 기재되어 있다. 또한, 특허문헌 3에는, miR-34b, miR-132, miR-137, miR-193a 및 miR-203의 적어도 하나 이상의 miRNA를 포함하는 리포좀이 구강 편평상피암의 억제제로서 작용하는 것이 기재되어 있다. 더욱이, 비특허문헌 6에는 miR-26a 및 miR-26b가 위세포암의 세포 유주(遊走) 및 습윤(濕潤)을 저해하고, 비특허문헌 7에는, miR-23b, miR-27b 및 miR-24가 전립선암 세포의 세포 유주 및 습윤을 우수하게 저해하는 것이 기재되어 있다.

엑소좀을 약물 송달 담체나 생리 활성 물질로서 이용하기 위해서는 균일한 품질의 엑소좀을 충분량 생산하는 수법을 확립할 필요가 있다. 통상 엑소좀은 배양세포가 배양계 내에 분비한 엑소좀을 초원심으로 회수함으로써 취득된다. 엑소좀의 이용 방법을 제시하는 상기 문헌 등의 종래 기술에 있어서, 시험에 필요한 엑소좀을 회수하는 각각 적절한 방법이 이용되고 있지만, 모두 의약품 레벨의 엑소좀을 공업적 스케일로 생산할 수 있는 안정적이며 또한 고효율의 생산 방법의 개발을 예상한 것이 아니다.

특허문헌 4는 엑소좀을 생산하는 방법을 개시하고 있다. 이 방법은, 프로스타글란딘 E 리셉터 4(EP4) 안타고니스트를 줄기세포에 접촉시킴으로써 엑소좀 분비를 유도하는 것을 특징으로 하고 있다. 양호한 생리 활성을 갖는 엑소좀을 고효율로 생산하기 위해서 구성된 세포 배양계의 예로서, 비특허문헌 8은 간엽계 줄기세포의 3D 배양계와 탄젠셜 플로우 여과(TFF)를 조합시킨 계를 제시하고 있다.

상술한 것과 같이 엑소좀을 특징짓는 핵산이나 단백질, 각종 시그널 분자의 구성은, 엑소좀 유래의 세포에 의해서 컨트롤되기 때문에, 세포 배양에 있어서의 유도기, 대수증식기, 정지기 및 사멸기의 각 단계에서 생성되는 엑소좀의 품질은 변화된다고 생각된다. 그러나, 엑소좀의 공업적 스케일에서의 생산을 생각하는 경우, 엑소좀의 특성이 배양 시간에 따라 변화되는 것은 품질관리상 바람직하지 못하고, 한번 확립한 생산계에서 장기간에 걸쳐 균일한 품질의 엑소좀을 생성할 수 있을 것이 요구된다. 종래의 배양세포를 이용한 엑소좀 생성 기술에 있어서, 이러한 세포 배양계의 시간 경과에 따른 엑소좀의 품질 변화 문제의 충분한 대처가 이루어지지 못하여, 품질이 안정적인 엑소좀의 공급이나 공업적 스케일에서의 엑소좀 생성계의 확립을 저해하는 기술적 장벽이 되고 있다.

엑소좀에 한하지 않고, 배양세포를 이용한 물질 생산에 있어서, 원하는 물질을 고효율로 안정적으로 생산하기에 가장 알맞은 세포 배양 방법을 수립하는 것은 중요하다. 세포는 생체 내에서는 일반적으로 삼차원적인 구조를 취한 집단으로서 존재한다. 한편, 세포를 인공 환경에서 배양하는 경우는, 세포가 배양 용기 바닥면에 단층형으로 붙는 형태로 이차원적으로 배양되는 고전적인 평면 배양법이나, 액체 배양액 내에 세포를 분산시킨 상태에서 배양하는 부유 배양법이 일반적으로 이용된다. 평면 배양법에 이용되는 세포에 관해서는, 비교적 접착성이 높은 세포가 적합하지만, 알맞은 세포를 이용한 경우라도, 배양 환경의 차이에 의해 세포의 성질이 크게 변화되는 경우가 있다. 부유 배양법에 관해서도 적합한 세포와 적합하지 않은 세포가 존재한다.

의료 용도에 이용되는 생체내 단백질 등에 대한 수요가 높아짐에 따라, 세포 배양을 이용한 생체내 단백질 등의 대량 생성이 주목을 모으고 있다. 대장균 등의 부유세포에 관해서는 대형 배양조로 대량 배양하는 기술이 연구되어 왔다. 대형 배양조를 이용한 부유세포의 대량 배양에서는 다량의 배양액과 교반 장치가 필요하게 된다. 한편, 부착세포를 이용하여 물질 생성을 행하는 연구도 사용하는 세포의 연구의 진전과 더불어 많은 흥미를 모으고 있다. 부착세포의 경우, 고전적인 평면 배양법에서는 세포는 이차원적으로밖에 전개하지 않기 때문에, 많은 배양 면적이 필요하게 된다. 생체내 단백질 등의 대량 생성을 위해서 보다 입체적으로 대량의 세포를 배양하도록 세포 배양 담체와 바이오리액터의 연구도 수많이 이뤄지고 있다.

대표적인 세포 배양용 담체로서는, 세포를 부착 육성할 수 있는 소립자인 마이크로캐리어가 널리 연구 대상이 되고 있다(특허문헌 5). 다양한 종류의 마이크로캐리어가 연구·개발되고, 시판되고 있는 것도 많다. 백신이나 단백질의 제조에도 많이 이용되며, 스케일업에도 견디는 시스템으로 널리 방법론으로서 채용되고 있다. 그러나, 마이크로캐리어 배양에 있어서는, 마이크로캐리어가 충분히 교반·확산되어 응집하지 않을 필요가 있기 때문에, 세포 배양의 양적인 상한이 있다. 게다가, 예컨대 물질 생성을 행하는 경우, 캐리어 그 자체를 분리하기 위해서는 미세한 입자를 분별하는 필터 등으로 분리시킬 필요가 있는 등, 방법론적으로도 번잡한 작업이 필요하게 된다. 더욱이, 전단력으로 인해 세포의 박리가 일어나기 쉽기 때문에, 교반 조건도 매우 한정되게 되어, 대장균에서 이용하는 강한 유로에서의 배양 조건에는 전혀 적합하지 않다.

마이크로캐리어 배양과는 다른 방법으로서는, 메틸셀룰로오스나 젤란검을 이용하는 3차원 배양법으로 스페로이드 형상의 세포를 계속적으로 대량 배양하는 방법도 발견되었다. 셀룰로오스 스폰지를 이용하는 바이오리액터 등에서는 확실히 대량의 세포 배양이 가능하다. 그러나, 시스템으로서 큰 폐쇄계로 되어, 배양 환경에 간단히 접촉할 수는 없는 등, 작업상의 제한도 많다.

간편하면서 또한 자동화에 적합한 시스템으로 장기간에 걸쳐 균일한 품질의 엑소좀을 효율적으로 세포에 생성하게 할 수 있기 위해서 신규 시스템을 구축할 필요성이 높아지고 있다.

<폴리이미드 다공질막>

세포를 폴리이미드 다공질막에 적용하여 배양하는 것을 포함하는 세포의 배양 방법이 보고되어 있다(특허문헌 6).

폴리이미드란, 반복 단위에 이미드 결합을 포함하는 고분자의 총칭이다. 방향족 폴리이미드는 방향족 화합물이 직접 이미드 결합으로 연결된 고분자를 의미한다. 방향족 폴리이미드는, 방향족과 방향족이 이미드 결합을 통해 공역 구조를 갖기 때문에, 강직하고 강고한 분자 구조를 가지면서 또한 이미드 결합이 강한 분자간력을 가지므로, 매우 높은 레벨의 열적, 기계적, 화학적 성질을 갖는다.

폴리이미드 다공질막은, 본 출원 전부터 필터, 저유전율 필름, 연료전지용 전해질막 등, 특히 전지 관계를 중심으로 하는 용도를 위해서 이용되어 왔다. 특허문헌 7∼9는, 특히 기체 등의 물질 투과성이 우수하고, 공극률이 높은, 양 표면의 평활성이 우수하고, 상대적으로 강도가 높고, 높은 공극률에도 불구하고 막 두께 방향으로의 압축 응력에 대한 내력(耐力)이 우수한 마크로보이드를 다수 갖는 폴리이미드 다공질막을 기재하고 있다. 이들은 모두 아믹산을 경유하여 작성된 폴리이미드 다공질막이다.

특허문헌 1: 국제공개 제2013/150303호 특허문헌 2: 일본 특허 공개 2019-38840호 공보 특허문헌 3: 일본 특허 공개 2009-171876호 공보 특허문헌 4: 일본 특허 공개 2018-064550호 공보 특허문헌 5: 국제공개 제2003/054174호 특허문헌 6: 국제공개 제2015/012415호 특허문헌 7: 국제공개 제2010/038873호 특허문헌 8: 일본 특허 공개 2011-219585호 공보 특허문헌 9: 일본 특허 공개 2011-219586호 공보 특허문헌 10: 국제공개 제2018/021368호

비특허문헌 1: J. of Extracellular Vesicles, 2015, 4, Article: 27066 비특허문헌 2: AMA Oncology, 2016, 2, p882-889 비특허문헌 3: Trends in Biotechnology, 2017, 7, p665-676 비특허문헌 4: Transplantation 2003, 76: 1503-10 비특허문헌 5: Am. J. Transplant. 2006, 6:1541-50 비특허문헌 6: Int J Oncol. 2016 May; 48(5):1837-46 비특허문헌 7: Oncotarget. 2014; 5:7748-7759 비특허문헌 8: Molecular Therapy Vol. 26 No 12 2018 2838-2847

본 발명은, 세포를 이용하여 장기간에 걸쳐 계속적으로 균일한 품질의 엑소좀을 고수율로 생성하는 방법, 엑소좀 생성 장치, 키트 및 이들의 사용, 그리고 이들을 이용하여 생산된 엑소좀을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 폴리머 다공질막이 케이싱에 수용되어 구성된 모듈이 세포의 대량 배양 및 세포의 제거에 적합하다는 것을 알아냈다(특허문헌 10). 발명자들은, 엑소좀을 간편하면서 또한 효율적으로 세포에 생성시킬 수 있는 방법, 세포 배양 시스템 및 세포 배양 시스템에 의해 생성된 품질이 안정적인 엑소좀을 제공한다고 하는 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구에 노력을 기울인 결과, 이러한 폴리머 다공질막 및 케이싱을 갖춘 모듈을 이용하여 세포를 배양함으로써, 장기간에 걸쳐 안정적인 생성량과 품질을 갖는 엑소좀의 생성이 가능하게 되는 것을 알아내어, 본 발명에 이르렀다.

놀랍게도 본 발명의 방법을 이용함으로써 배양세포는 수개월간에 걸쳐 균일한 품질의 엑소좀을 지속적으로 생성할 수 있다. 이것은, 한번 확립된 원하는 성질을 갖는 엑소좀의 생산계를 장기간 계속해서 이용할 수 있다는 점, 그리고 균일한 품질을 갖는 엑소좀을 대량으로 조제할 수 있다는 점에서, 생리 활성 물질로서 이용하는 엑소좀을 공업적 스케일로 생성함에 있어서 매우 유리하다.

따라서, 본 발명은 폴리머 다공질막 및 케이싱을 갖춘 모듈을 이용하여 세포를 배양하는 것을 특징의 하나로 한다.

세포는, 폴리머 다공질막이 갖는, 세포 통과가 가능한 대구경 연통 구멍을 활용하여 안정적이면서 또한 입체적으로 생육하여, 평면 배양과 비교하여 대량의 세포를 포함하는 상태가 되더라도, 그 연통 구멍이 배지와의 접촉을 확보함으로써, 안정적으로 생육을 계속할 수 있다. 더욱이, 폴리머 다공질막이 갖는 박막 특성·플렉시블 특성·형상 안정성·자유 형태성에 의해, 작은 단위 공간에 다량의 시트를 공존시키거나 다수의 막을 적층하거나 하는 것이 가능하게 되는 데다가, 폴리머 다공질막이 갖는 초내열성·내용제성 때문에, 복수의 수단으로 간편하면서 또한 신속하게 시트의 멸균이 가능하다. 더욱이, 폴리머 다공질막이 갖는 입체적 발판 구조에 의해, 평면적인 배양과 비교한 경우, 1 세포당 엑소좀 생성량이 향상될 가능성도 기대된다.

한정되는 것은 아니지만, 본 발명은 바람직하게는 이하의 양태를 포함한다.

1. 세포를 이용하여 엑소좀을 생성하는 방법으로서,

세포를 세포 배양 모듈에 적용하여 세포를 배양하는 공정, 및

세포에 의해 엑소좀을 생성시키는 공정

을 포함하고, 여기서 상기 세포 배양 모듈이

폴리머 다공질막과

2 이상의 배지 유출 입구를 가지며, 상기 폴리머 다공질막이 수용된 케이싱

을 구비하는 상기 방법.

2. 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이고, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다도 작고, 상기 마크로보이드층은 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 마크로보이드에 연통되고,

여기서, 상기 케이싱 내에

(i) 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약되고,

(ii) 상기 폴리머 다공질막이 접혀 포개어지고,

(iii) 상기 폴리머 다공질막이 롤 형상으로 감겨져 들어가고, 및/또는

(iv) 상기 폴리머 다공질막이 줄 형상으로 묶여

수용되어 있는 항목 1에 기재된 방법.

3. 상기 배지 유출 입구의 직경이 세포의 직경보다도 크며, 또한 상기 폴리머 다공질막이 유출하는 직경보다도 작은 항목 1 또는 2의 어느 하나에 기재된 방법.

4. 상기 케이싱이 메쉬형 구조를 갖는 항목 1∼3의 어느 한 항에 기재된 방법.

5. 상기 케이싱이 비가요성 소재로 이루어지는 항목 1∼4의 어느 한 항에 기재된 방법.

6. 상기 폴리머 다공질막이 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의 복수의 세공을 갖는 항목 1∼5의 어느 한 항에 기재된 방법.

7. 상기 표면층 A의 평균 구멍 직경이 0.01∼50 ㎛인 항목 2∼6의 어느 한 항에 기재된 방법.

8. 상기 표면층 B의 평균 구멍 직경이 20∼100 ㎛인 항목 2∼7의 어느 한 항에 기재된 방법.

9. 상기 폴리머 다공질막의 총 막 두께가 5∼500 ㎛인 항목 1∼8의 어느 한 항에 기재된 방법.

10. 상기 폴리머 다공질막이 폴리이미드 다공질막인 항목 1∼9의 어느 한 항에 기재된 방법.

11. 상기 폴리이미드 다공질막이 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인 항목 10에 기재된 방법.

12. 상기 폴리이미드 다공질막이, 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색한 폴리이미드 다공질막인 항목 10 또는 11의 어느 하나에 기재된 방법.

13. 상기 세포를 배양하는 공정이 정치(靜置) 배양 조건 하에서 행해지는 항목 1∼12의 어느 한 항에 기재된 방법.

14. 상기 세포를 배양하는 공정이 회전 배양 또는 교반 조건 하에서 행해지는 항목 1∼12의 어느 한 항에 기재된 방법.

15. 상기 세포를 배양하는 공정이 연속적으로 행해지는 항목 1∼14의 어느 한 항에 기재된 방법.

16. 상기 세포를 배양하는 공정이 인큐베이터 안에 설치한 세포 배양 장치 중에서 행해지고, 여기서, 상기 세포 배양 장치는, 세포를 담지하는 상기 세포 배양 모듈을 수용하는 배양 유닛으로서, 배지 공급구 및 배지 배출구를 갖춘 배양 유닛, 배지 공급 유닛으로서, 배지 수납 용기와, 배지 공급 라인과, 배지 공급 라인을 통해 배지를 송액(送液)하는 송액 펌프를 구비하고, 여기서 배지 공급 라인의 제1 단부는 배지 수납 용기 내의 배지에 접촉하고, 배지 공급 라인의 제2 단부는 배양 유닛의 배지 공급구를 통해 배양 유닛 내에 연통되어 있는 배지 공급 유닛

을 포함하는 항목 1∼15의 어느 한 항에 기재된 방법.

17. 상기 세포 배양 장치가 배지 공급 라인, 송액 펌프, 공기 공급구, 공기 배출구 및 산소 투과막을 갖지 않는 항목 16에 기재된 방법.

18. 상기 세포가 다능성 줄기세포, 조직 줄기세포, 체세포, 생식세포, 육종세포, 주화세포 및 형질전환세포로 이루어지는 군에서 선택되는 항목 1∼17의 어느 한 항에 기재된 방법.

19. 상기 세포가 인간 간엽계 줄기세포, 골아세포, 연골세포, 심근세포로 이루어지는 군에서 선택되는 항목 1∼18의 어느 한 항에 기재된 방법.

20. 상기 엑소좀을 생성하는 공정이 상기 세포를 배양하는 공정의 적어도 일부와 중복되는 항목 1∼19의 어느 한 항에 기재된 방법.

21. 상기 엑소좀을 생성하는 공정이 1개월, 2개월, 3개월 혹은 6개월 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 계속되는 항목 1∼20의 어느 한 항에 기재된 방법.

22. 상기 세포 배양 모듈을 포함하는 항목 1∼21의 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 엑소좀 생성 장치.

23. 상기 세포 배양 모듈을 포함하는 항목 1∼21의 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트.

24. 상기 세포 배양 모듈의, 항목 1∼21의 어느 한 항에 기재된 방법을 위한 용도.

25. 상기 세포 배양 모듈을 포함하는 항목 1∼21의 어느 한 항에 기재된 방법에 의해서 취득한 엑소좀.

케이싱에 수용되며 모듈화된 폴리머 다공질막을 이용함으로써, 현탁된 세포를 효율적으로 흡착하여, 종래의 부유 배양 용기 등을 이용하여 세포를 장기적으로 안정적으로 배양하는 것이 가능하게 된다. 세포를 적절한 조건 하에서 장기간 안정적으로 연속적으로 대량 배양할 수 있음으로써, 안정적이면서 또한 효율적인 엑소좀 생산계를 구축할 수 있다.

[도 1] 도 1은 세포 배양 모듈의 일 실시양태를 도시한다. 케이싱 내에 폴리머 다공질막이 수용되어 있다.
[도 2] 도 2는 세포 배양 모듈의 일 실시양태를 도시한다. 케이싱 내에 폴리머 다공질막이 수용되어 있다.
[도 3] 도 3은 세포 배양 모듈의 일 실시양태를 도시한다. (A) 메쉬형 케이싱 내에 폴리머 다공질막이 수용되어 있다. (B) 메쉬형 네트와 골조를 포함하는 케이싱의 일 실시양태를 도시한다.
[도 4] 도 4는 스피너 플라스크 내에서 세포 배양 모듈을 적용할 때에 병용하는 디바이스의 실시양태를 도시한다. (A) 회전형 디바이스. 세포 배양 모듈을 적용한 상기 디바이스를 스피너 플라스크 내에 설치하고, 상기 회전형 디바이스 자체를 회전시켜 사용한다. (B) 고정형 디바이스. 세포 배양 모듈을 적용한 상기 디바이스를 스피너 플라스크의 바닥부에 설치한다. 디바이스 중앙의 공간에서 스피너 플라스크의 스터러를 회전시켜 사용한다.
[도 5] 도 5는 가요성 백형 배양 용기에 세포 배양 모듈을 적용하여 배양한 일 실시양태를 도시한다. 배양 시작(좌측)으로부터 1시간에 배양액의 페놀 레드가 황색으로 변화되었다(우측).
[도 6] 도 6은 진탕 배양 시의 메쉬 모듈 사용의 일 실시양태를 도시한다.
[도 7] 도 7은 폴리이미드 다공질막을 이용한 세포 배양의 모델 도면을 도시한다.
[도 8] 도 8은 건열멸균형 사이펀식 세포 배양 장치(내열 사이펀형 리액터)를 도시하는 도면이다.
[도 9] 도 9는 사이펀식 세포 배양 장치를 도시하는 도면이다.
[도 10] 도 10은 통형 기상 배양 장치를 도시한다. (A)는 세포 배양 장치의 구성을 도시하는 도면이다. (B)는 (A)에서의 세포 배양 디바이스를 배치하는 세포 배양부를 도시하는 도면이다.
[도 11] 도 11은 통형 기상 배양 장치를 도시한다. 기본적인 구성은 도 10과 공통이지만, 각 단의 배지 배출구가 30도씩 반시계 방향으로 틀어져 있어, 배지가 배출되기 쉬운 구조로 되어 있다.
[도 12] 도 12는 미스트 및 샤워형 배양 장치를 도시한다.
[도 13] 도 13은 기상 노출형 회전 배양 장치를 도시한다. (A)는 기상 노출형 회전 배양 장치의 구성을 도시한다. (B)는 기상 노출형 회전 배양 장치의 사용양태를 도시하는 도면이다.
[도 14] 도 14는 기상 노출형 회전 배양 장치의 세포 배양부를 도시한다. (A)는 상기 세포 배양부의 모식도, (B)는 상기 배양부의 사용 양태를 도시하는 도면이다. (A) 정치 배양 2일 후, (B) 진탕 배양 2일 후(메쉬 없음).
[도 15] 도 15는 일 실시형태에 있어서의 본 발명의 세포 배양 모듈을 적용한 WAVE형 바이오 리액터를 도시하는 도면이다. (A) 세포 배양 모듈이 봉입된 백, (B) WAVE25를 이용한 세포 배양 모듈에의 세포 흡착 공정을 도시하고 있다.
[도 16] 도 16은 본 발명의 일 실시형태에 있어서의 세포 배양 장치를 도시하는 도면이다. (A) 세포 배양 모듈, (B) 세포 배양부, (C) 일 실시형태에 있어서의 세포 배양 장치를 도시한다.
[도 17] 도 17은 일 실시형태에 있어서의 세포 배양 장치를 도시하는 도면이다.
[도 18] 도 18은 디쉬를 이용한 세포 배양에 있어서의 엑소좀 생성 시험의 결과를 도시하며, (A)는 배양일수 6일째 및 13일째에 회수한 세포 배양액 중에 포함되는 1일당 생성된 엑소좀수의 측정 결과, (B)는 배양일수 13일째의 입경 분포 측정 결과를 도시한다.
[도 19] 도 19는 150 mL 둥근형 스토리지 보틀에서 모듈을 이용한 세포 배양에 있어서의 엑소좀 생성 시험의 결과를 도시하며, (A)는 배양일수 27일까지의 세포 배양액 중에 포함되는 1일당 생성된 엑소좀수의 측정 결과, (B)는 배양일수 27일째의 입경 분포 측정의 결과를 도시한다.
[도 20] 도 20은 150 mL 둥근형 스토리지 보틀에서 모듈을 이용한 세포 배양에 있어서의 엑소좀 생성 시험의 결과를 도시하며, (A)는 배양일수 27일까지의 세포 배양액 중에 포함되는 1일당 생성된 생성된 엑소좀수의 측정 결과, (B)는 배양일수 27일째의 입경 분포 측정의 결과를 도시한다.
[도 21] 도 21은 오버플로우 리액터에서 모듈을 이용한 세포 배양계(5% 산소)를 도시하며, (A)는 글루코오스 소비량 및 젖산 생성량의 경시 변화, (B)는 세포 배양의 양태를 도시한다.
[도 22] 도 22는 오버플로우 리액터로 모듈을 이용한 세포 배양(5% 산소)에 있어서의 엑소좀 생성 시험의 결과를 도시하며, (A)는 배양일수 85일까지의 세포 배양액 중에 포함되는 1일당 생성된 엑소좀수의 측정 결과, (B)는 배양일수 85일째의 입경 분포 측정의 결과를 도시한다.
[도 23] 도 23은 오버플로우 리액터에서 모듈을 이용한 세포 배양계(통상 산소)를 도시하며, (A)는 글루코오스 소비량 및 젖산 생성량의 경시 변화, (B)는 세포 배양의 양태를 도시한다.
[도 24] 도 24는 오버플로우 리액터에서 모듈을 이용한 세포 배양(통상 산소)에 있어서의 엑소좀 생성 시험의 결과를 도시하며, (A)는 배양일수 85일까지의 세포 배양액 중에 포함되는 1일당 생성된 엑소좀수의 측정 결과, (B)는 배양일수 85일째의 입경 분포 측정의 결과를 도시한다.
[도 25] 도 25의 (A)는 WAVE 리액터에서 모듈을 이용한 세포 배양계에 있어서의 글루코오스 소비량 및 젖산 생성량의 경시 변화를 도시한다. 도 25의 (B) 및 (C)는 WAVE 리액터에서 모듈을 이용한 세포 배양에 있어서의 엑소좀 생성 시험의 결과를 도시하며, (B)는 배양일수 39일까지의 세포 배양액 중에 포함되는 1일당 생성된 엑소좀수의 측정 결과, (C)는 배양일수 39일째의 입경 분포 측정의 결과를 도시한다.
[도 26] 도 26은 비교예 1 및 실시예 1∼4의 배양일수 13일째의 1 세포의 엑소좀 생성력의 비교를 도시한다.
[도 27] 도 27은 비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 1(Bottle(5% 산소)_Day27)의 1 세포당 엑소좀 생성량의 비교를 도시한다.
[도 28] 도 28은 비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 1(Bottle(5% 산소)_Day27)의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도시한다.
[도 29] 도 29는 hsa-miR-146a, hsa-miR-210, hsa-miR-22 및 hsa-miR-24의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도시한다.
[도 30] 도 30은 hsa-miR-34b, hsa-miR-132, hsa-miR-203, hsa-miR-137 및 hsa-miR-193의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 31] 도 31은 hsa-miR-26a/b, hsa-miR-23b, hsa-miR-27b 및 hsa-miR-24-1의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 32] 도 32는 비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 1(Bottle(5% 산소)_Day27)의 1 세포당 엑소좀 생성량의 비교를 도시한다.
[도 33] 도 33은 비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 1(Bottle(5% 산소)_Day27)의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도시한다.
[도 34] 도 34는 hsa-miR-146a, hsa-miR-210, hsa-miR-22 및 hsa-miR-24의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 35] 도 35는 hsa-miR-34b, hsa-miR-132, hsa-miR-203, hsa-miR-137 및 hsa-miR-193의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 36] 도 36은 hsa-miR-26a/b, hsa-miR-23b, hsa-miR-27b 및 hsa-miR-24-1의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 37] 도 37은 비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 2(Bottle(통상 산소)_Day27)의 1 세포당 엑소좀 생성량의 비교를 도시한다.
[도 38] 도 38은 비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 2(Bottle(통상 산소)_Day27)의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도시한다.
[도 39] 도 39는 hsa-miR-146a, hsa-miR-210, hsa-miR-22 및 hsa-miR-24의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 40] 도 40은 hsa-miR-34b, hsa-miR-132, hsa-miR-203, hsa-miR-137 및 hsa-miR-193의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 41] 도 41은 hsa-miR-26a/b, hsa-miR-23b, hsa-miR-27b 및 hsa-miR-24-1의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 42] 도 42는 비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 2(Bottle(통상 산소)_Day27)의 1 세포당 엑소좀 생성량의 비교를 도시한다.
[도 43] 도 43은 비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 2(Bottle(통상 산소)_Day27)의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도시한다.
[도 44] 도 44는 hsa-miR-146a, hsa-miR-210, hsa-miR-22 및 hsa-miR-24의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 45] 도 45는 hsa-miR-34b, hsa-miR-132, hsa-miR-203, hsa-miR-137 및 hsa-miR-193의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 46] 도 46은 hsa-miR-26a/b, hsa-miR-23b, hsa-miR-27b 및 hsa-miR-24-1의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 47] 도 47은 비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 3(Reactor(5% 산소)_Day27)의 1 세포당 엑소좀 생성량의 비교를 도시한다.
[도 48] 도 48은 비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 3(Reactor(5% 산소)_Day27)의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도시한다.
[도 49] 도 49는 hsa-miR-146a, hsa-miR-210, hsa-miR-22 및 hsa-miR-24의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 50] 도 50은 hsa-miR-34b, hsa-miR-132, hsa-miR-203, hsa-miR-137 및 hsa-miR-193의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 51] 도 51은 hsa-miR-26a/b, hsa-miR-23b, hsa-miR-27b 및 hsa-miR-24-1의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 52] 도 52는 비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 3(Reactor(5% 산소)_Day27)의 1 세포당 엑소좀 생성량의 비교를 도시한다.
[도 53] 도 53은 비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 3(Reactor(5% 산소)_Day27)의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도시한다.
[도 54] 도 54는 hsa-miR-146a, hsa-miR-210, hsa-miR-22 및 hsa-miR-24의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 55] 도 55는 hsa-miR-34b, hsa-miR-132, hsa-miR-203, hsa-miR-137 및 hsa-miR-193의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 56] 도 56은 hsa-miR-26a/b, hsa-miR-23b, hsa-miR-27b 및 hsa-miR-24-1의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 57] 도 57은 비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 4(Reactor(통상 산소)_Day27)의 1 세포당 엑소좀 생성량의 비교를 도시한다.
[도 58] 도 58은 비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 4(Reactor(통상 산소)_Day27)의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도시한다.
[도 59] 도 59는 hsa-miR-146a, hsa-miR-210, hsa-miR-22 및 hsa-miR-24의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 60] 도 60은 hsa-miR-34b, hsa-miR-132, hsa-miR-203, hsa-miR-137 및 hsa-miR-193의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 61] 도 61은 hsa-miR-26a/b, hsa-miR-23b, hsa-miR-27b 및 hsa-miR-24-1의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 62] 도 62는 비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 4(Reactor(통상 산소)_Day27)의 1 세포당 엑소좀 생성량의 비교를 도시한다.
[도 63] 도 63은 비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 4(Reactor(통상 산소)_Day27)의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도시한다.
[도 64] 도 64는 hsa-miR-146a, hsa-miR-210, hsa-miR-22 및 hsa-miR-24의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 65] 도 65는 hsa-miR-34b, hsa-miR-132, hsa-miR-203, hsa-miR-137 및 hsa-miR-193의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 66] 도 66은 hsa-miR-26a/b, hsa-miR-23b, hsa-miR-27b 및 hsa-miR-24-1의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도시한다.
[도 67] 도 67은 젖산 생성량 및 글루코오스 소비량의 경시 변화를 도시하는 그래프이다.
[도 68] 도 68은 취득 엑소좀 샘플 5종의 입도 분포를 도시하는 그래프이다.
[도 69] 도 69는 일 실시양태에 있어서의 본 발명의 방법에 의해 얻어진 엑소좀의 투과형 전자현미경 화상을 도시한다.
[도 70] 도 70은 각종 리액터에 있어서의 경시적 엑소좀 생성량을 도시하는 그래프이다.
[도 71] 도 71은 miRNA 어레이 해석의 결과(좌측: 인간형 miRNA, 전체 도면; 우측: miR-21, 22, 23, 24 선별)를 도시한다.
[도 72] 도 72는 젖산 생성량 및 글루코오스 소비의 경시 변화를 도시하는 그래프이다.
[도 73] 도 73은 miRNA 어레이 해석의 결과(좌측: 인간형 miRNA, 전체 도면; 우측: miR-21, 22, 23, 24 선별)를 도시한다.
[도 74] 도 74는 젖산 생성량 및 글루코오스 소비의 경시 변화를 도시하는 그래프이다.
[도 75] 도 75는 모듈 배양 또는 소편 다공막 배양한 인간 연골세포의 세포 밀도(좌측) 및 총 세포수의 경시적 변화를 도시하는 그래프이다.
[도 76] 도 76은 miRNA 어레이 해석의 결과(좌측: 인간형 miRNA, 전체 도면; 우측: miR-21, 22, 23, 24 선별)을 도시한다.
[도 77] 도 77은 실시예 5에서 이용한 WAVE 리액터의 사용 양태를 도시한다. 좌측: WAVE 배양 백에 사용한 액체 배출 튜브 구비 HDPE 캡. 우측: 액체 배출 튜브 구비 HDPE 캡을 부착한 WAVE 배양 백.

I. 엑소좀을 생성하는 방법

본 발명은 세포를 이용하여 엑소좀을 생성하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은, 폴리머 다공질막이 케이싱에 수용되어 구성된 모듈 내에서 세포를 배양하여, 세포에 의해 엑소좀을 생성시키는 것을 포함한다.

1. 세포

본 발명의 방법에 이용할 수 있는 세포의 종류는 엑소좀을 생성하는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. 엑소좀은 다양한 세포에 있어서 생산되는 것이 알려져 있고, 이들이 생산하는 엑소좀의 프로필도 유래하는 세포나 생성 시의 조건에 따라서 다르다. 따라서, 본 발명에 있어서, 원하는 품질 및 수율로 엑소좀을 생성할 수 있는 세포가 개개의 실시양태에 기초하여 적절하게 선택될 수 있다.

하나의 양태에 있어서, 본 발명에서 배양세포로서 다능성 줄기세포가 이용된다. 다능성 줄기세포란, 온갖 조직의 세포로 분화하는 능력(분화 다능성)을 갖는 줄기세포를 총칭하는 것을 의도한다. 한정되는 것은 아니지만, 다능성 줄기세포는 배성 줄기세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기세포(iPS 세포), 배성 생식 줄기세포(EG 세포), 생식 줄기세포(GS 세포) 등을 포함한다. 바람직하게는 ES 세포 또는 iPS 세포이다. iPS 세포는 윤리적인 문제도 없다는 등의 이유로 특히 바람직하다. 다능성 줄기세포로서는 공지된 임의의 것을 사용할 수 있지만, 예컨대 국제공개 WO2009/123349(PCT/JP2009/057041)에 기재된 다능성 줄기세포를 사용할 수 있다.

하나의 양태에 있어서, 본 발명에서 배양세포로서 조직 줄기세포가 이용된다. 조직 줄기세포란, 분화 가능한 세포 계열이 특정 조직에 한정되어 있지만, 다양한 세포종으로 분화 가능한 능력(분화 다능성)을 갖는 줄기세포를 의미한다. 예컨대 골수 중의 조혈 줄기세포는 혈구의 토대가 되고, 신경 줄기세포는 신경세포로 분화한다. 이 밖에도 간을 만드는 간 줄기세포, 피부 조직이 되는 피부 줄기세포 등 다양한 종류가 있다. 바람직하게는, 조직 줄기세포는 간엽계 줄기세포, 간 줄기세포, 췌장 줄기세포, 신경 줄기세포, 피부 줄기세포 또는 조혈 줄기세포에서 선택된다.

하나의 양태에 있어서, 본 발명에서 배양세포로서 체세포가 이용된다. 체세포란, 다세포 생물을 구성하는 세포 중 생식세포 이외의 세포를 말한다. 유성 생식에서는 차세대로는 계승되지 않는다. 바람직하게는, 체세포는 간세포, 췌세포, 근세포, 골세포, 골아세포, 파골세포, 연골세포, 지방세포, 피부세포, 선유아세포, 췌세포, 신세포, 폐세포, 또는 림프구, 적혈구, 백혈구, 단구, 마크로파지 혹은 거핵구의 혈구세포에서 선택된다.

하나의 양태에 있어서, 본 발명에서 배양세포로서 생식세포가 이용된다. 생식세포는 생식에 있어서 유전 정보를 차세대로 전하는 역할을 갖는 세포를 의미한다. 예컨대 유성 생식을 위한 배우자, 즉 난자, 난세포, 정자, 정세포, 무성 생식을 위한 포자 등을 포함한다.

세포는 육종세포, 주화세포 및 형질전환세포로 이루어지는 군에서 선택하여도 좋다. 「육종」이란, 뼈, 연골, 지방, 근육, 혈액 등의 비상피성 세포 유래의 결합 조직 세포에 발생하는 암이며, 연부육종, 악성골종양 등을 포함한다. 육종세포는 육종에 유래하는 세포이다. 「주화세포」란, 장기간에 걸쳐 체외에서 유지되어, 일정한 안정적인 성질을 가지기에 이르고, 반영구적인 계대 배양이 가능하게 된 배양세포를 의미한다. PC12 세포(래트 부신수질 유래), CHO 세포(차이니즈 햄스터 난소 유래), HEK293 세포(인간 태아 신장 유래), HL-60 세포(인간 백혈구 세포 유래), HeLa 세포(인간 자궁경부암 유래), Vero 세포(아프리카 녹색 원숭이 신장 상피세포 유래), MDCK 세포(개 신장뇨세관 상피세포 유래), HepG2 세포(인간 간암 유래) 등 인간을 포함하는 다양한 생물종의 다양한 조직에 유래하는 세포주가 존재한다. 「형질전환세포」는 세포 외부로부터 핵산(DNA 등)을 도입하여 유전적 성질을 변화시킨 세포를 의미한다.

엑소좀은 줄기세포나 암세포 등의 미분화 세포에 있어서 활발히 생성되는 것이 알려져 있으며, 유리한 경우, 본 발명의 방법에 있어서 배양세포로서 줄기세포가 이용된다.

2. 엑소좀

엑소좀은 본 발명에 있어서 세포가 세포 밖으로 분비하는 50∼300 nm의 막질 소포 구조를 의미한다. 엑소좀 유래 세포의 종류나 생성 시의 조건이 엑소좀의 품질에 영향을 주기 때문에, 본 발명의 방법에 있어서 원하는 품질 및 수율로 엑소좀을 생성할 수 있는 조건이 적절하게 선택될 수 있다. 유리한 경우, 약물 송달 담체나 생리 활성 물질로서의 사용 등, 취득된 엑소좀이 그 용도에 맞는 품질을 갖추고 있는지 여부가 평가된다.

3. 세포 배양 모듈

본 발명의 방법에 이용하는 세포 배양 모듈은,

폴리머 다공질막과,

을 구비하고, 여기서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이고, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다도 작고, 상기 마크로보이드층은 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 마크로보이드에 연통되고, 여기서, 상기 케이싱 내에

(i) 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약되고,

(ii) 상기 폴리머 다공질막이 접혀 포개어지고,

(iv) 상기 폴리머 다공질막이 줄 형상으로 묶여

수용되어 있다. 상기 세포 배양 모듈을 이하에서 「본 발명의 세포 배양 모듈」이라고도 부른다. 또, 본 명세서에 있어서 「세포 배양 모듈」이라는 기재는, 단순히 「모듈」이라고 기재할 수 있으며, 서로 변경하더라도 같은 의미이다.

본 명세서에 있어서 「세포 배양 모듈」이란, 세포 배양 용기, 세포 배양 장치 및 세포 배양 시스템, 특히 부유 배양에 이용되는 세포 배양 용기, 세포 배양 장치 및 세포 배양 시스템에 적용할 수 있는 세포 배양 기재를 말한다. 세포 배양 모듈의 몇 개의 실시양태를 도 1∼3 및 도 16(A)에 도시한다. 본 발명의 세포 배양 모듈은 도 4∼6 및 8∼17과 같은 실시양태에 의해서 사용할 수 있다. 또한, 후술하는 실시예에 나타내는 양태에 의해서도 사용할 수 있다.

본 발명의 세포 배양 모듈은, 폴리머 다공질막이 케이싱에 수용되어 있음으로써, 막 형상의 폴리머 다공질막이 케이싱 내에서 계속적으로 형태가 변형되는 것이 방지된다. 이에 따라, 폴리머 다공질막 내에서 생육되는 세포에 스트레스가 가해지는 것이 방지되고, 아포토시스 등이 억제되어 안정적이면서 또한 대량의 세포를 배양하는 것이 가능하게 된다.

본 발명의 세포 배양 모듈이 구비하는 케이싱은, 2 이상의 배지 유출 입구를 가짐으로써, 세포 배지가 케이싱 내부로 공급 및 외부로 배출된다. 상기 케이싱의 배지 유출 입구의 직경은, 케이싱의 내부로 세포 유입이 가능하도록 상기 세포의 직경보다도 큰 것이 바람직하다. 또한, 배지 유출 입구의 직경이 상기 배지 유출 입구로부터 폴리머 다공질막이 유출하는 직경보다도 작은 것이 바람직하다. 폴리머 다공질막이 유출하는 직경보다도 작은 직경은, 케이싱에 수용된 폴리머 다공질막의 형상, 크기에 따라서 적절하게 선택 가능하다. 예컨대 폴리머 다공질막이 끈 형상인 경우, 상기 폴리머 다공질막의 짧은 변의 폭보다 작고, 상기 폴리머 다공질막이 유출하지 않는 적절한 직경이라면 특별히 한정되지 않는다. 상기 배지 유출 입구의 수는, 세포 배지가 케이싱 내외로 공급 및/또는 배출되기 쉽도록 가능한 한 많이 형성되어 있는 것이 바람직하다. 바람직하게는 5 이상, 바람직하게는 10 이상, 바람직하게는 20 이상, 바람직하게는 50 이상, 바람직하게는 100 이상이다. 배지 유출 입구는 케이싱의 일부 또는 전부가 메쉬형 구조를 가지고 있어도 좋다. 또한, 상기 케이싱 자체가 메쉬형이라도 좋다. 본 발명에 있어서, 메쉬 형상의 구조란, 예컨대 세로, 가로 및/또는 비스듬한 격자형 구조를 갖는 것이며, 각 개방도가 유체가 통과할 수 있을 정도로 배지 유출 입구를 형성하는 것이지만, 이것에 한정되지 않는다.

본 발명의 세포 배양 모듈이 구비하는 케이싱은, 통상의 배양 조건, 예컨대 교반 배양, 진탕 배양 조건에 있어서의 배지의 움직임에 의해서 변형되지 않을 정도로 강도를 갖는 것이 바람직하고, 비가소성 소재로 형성되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 케이싱은 세포 배양에 있어서 세포의 생육에 영향을 주지 않는 소재로 형성되어 있는 것이 바람직하다. 이러한 재료로서는, 예컨대 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리에스테르, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트 등의 폴리머, 스테인리스망, 티탄 등의 금속을 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 케이싱에 어느 정도 강도가 있음으로써, 케이싱 내부의 폴리머 다공질막의 형상이 계속적으로 변형되는 것이 방지되어, 본 발명의 효과가 보다 발휘된다. 본 명세서에 있어서 「케이싱이 변형되지 않는다」란, 통상의 배양 환경 하에서 받는 부하에 있어서 변형되지 않음을 의미하는 것이며, 절대적으로 변형되지 않음을 의미하는 것은 아니다.

본 발명의 세포 배양 모듈은, 상기 케이싱 내에

(i) 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약되고,

(ii) 상기 폴리머 다공질막이 접혀 포개어지고,

(iv) 상기 폴리머 다공질막이 줄 형상으로 묶여

수용되어 있다.

본 명세서에 있어서 「케이싱 내에 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약되어 수용되어 있다」란, 상호 독립된 2 이상의 폴리머 다공성 막이 케이싱으로 둘러싸인 일정 공간 내에 집약되어 수용되어 있는 상태를 가리킨다. 본 발명에 있어서, 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막은, 상기 폴리머 다공질막의 적어도 한 곳과 상기 케이싱 내의 적어도 한 곳이 임의의 방법에 의해서 고정되어, 상기 폴리머 다공질막이 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태로 고정된 것이라도 좋다. 또한, 2 이상의 독립된 폴리머 다공질막은 소편이라도 좋다. 소편의 형상은, 예컨대 원, 타원형, 사각, 삼각, 다각형, 끈 형상 등, 임의의 형태를 들 수 있지만, 바람직하게는 대략 정방형이 바람직하다. 본 발명에 있어서, 소편의 크기는 임의의 크기를 들 수 있는데, 대략 정방형인 경우, 길이는 임의의 길이라도 좋지만, 예컨대 80 mm 이하가 좋고, 바람직하게는 50 mm 이하가 좋고, 보다 바람직하게는 30 mm 이하가 좋고, 더욱 보다 바람직하게는 20 mm 이하가 좋고, 10 mm 이하라도 좋다. 또한, 폴리머 다공성 막의 소편이 대략 정방형인 경우, 그 한 변의 길이는, 폴리머 다공질막이 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태가 되도록 케이싱의 내벽을 따라서 또는 내벽의 한 변의 길이보다 짧게(예컨대 0.1 mm∼1 mm 정도 짧게) 형성된 것이라도 좋다. 이로써, 폴리머 다공질막 내에서 생육되는 세포에 스트레스가 가해지는 것이 방지되고, 아포토시스 등이 억제되어 안정적이면서 또한 대량의 세포를 배양할 수 있게 된다. 또한, 끈 형상의 폴리머 다공질막의 경우, 후술하는 것과 같이, (ii) 상기 폴리머 다공질막이 접혀 포개어지고, (iii) 상기 폴리머 다공질막이 롤 형상으로 감겨져 들어가고, 및/또는 (iv) 상기 폴리머 다공질막이 줄 형상으로 묶여, 상기 케이싱에 수용되어도 좋다. 또한, 케이싱 내에 2 이상의 독립된 폴리머 다공질막을 집약하여 수용하기 위해서 임의 매수의 폴리머 다공질막을 적층시키더라도 좋다. 이 경우, 폴리머 다공질막과 폴리머 다공질막의 사이에는 속깔개가 마련되어도 좋다. 속깔개가 마련됨으로써, 적층된 폴리머 다공질막의 사이에 효율적으로 배지를 공급하게 할 수 있다. 속깔개는, 적층된 폴리머 다공질막 사이에 임의의 공간을 형성하여, 효율적으로 배지를 공급하게 하는 기능을 갖는 것이라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 메쉬 구조를 갖는 평면 구조체를 이용할 수 있다. 속깔개의 재질은, 예컨대 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 스테인레스강제 메쉬를 이용할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 메쉬 구조를 갖는 속깔개를 갖는 경우, 적층된 폴리머 다공질막 사이에 배지를 공급할 수 있을 정도의 개공도를 가지고 있으면 되며, 적절하게 선택할 수 있다.

본 명세서에 있어서 「접혀 포개어진 폴리머 다공질막」이란, 상기 케이싱 내에서 접혀 포개어져 있음으로써 폴리머 다공질막의 각 면 및/또는 케이싱 내의 표면과의 마찰력에 의해서 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태가 된 폴리머 다공질막이다. 본 명세서에 있어서 「접혀 포개어진」이란, 폴리머 다공막에 접은 자국이 붙은 상태라도 좋고, 자국이 붙지 않은 상태라도 좋다.

본 명세서에 있어서 「롤 형상으로 감겨져 들어간 폴리머 다공질막」이란, 폴리머 다공질막이 롤 형상으로 감겨져 들어가 폴리머 다공질막의 각 면 및/또는 케이싱 내의 표면과의 마찰력에 의해서 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태가 된 폴리머 다공질막을 말한다. 또한, 본 발명에 있어서 줄 형상으로 엮인 폴리머 다공질막이란, 예컨대 스트립형의 복수의 폴리머 다공질막을 임의의 방법에 의해서 줄 형상으로 엮어넣어, 폴리머 다공질막끼리의 마찰력에 의해서 서로 움직이지 않는 상태인 폴리머 다공질막을 말한다. (i) 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약된 폴리머 다공질막, (ii) 접혀 포개어진 폴리머 다공질막, (iii) 롤 형상으로 감겨져 들어간 폴리머 다공질막 및 (iv) 줄 형상으로 묶인 폴리머 다공질막이 조합되어 케이싱 내에 수용되어 있어도 좋다.

본 명세서에 있어서 「상기 폴리머 다공질막이 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태」란, 상기 세포 배양 모듈을 세포 배양 배지 내에서 배양하는 경우에, 상기 폴리머 다공질막이 계속적으로 형태 변화하지 않는 상태가 되도록 케이싱 내에 수용되어 있는 상태를 말한다. 바꿔 말하면, 상기 폴리머 다공질막 자체가 유체에 의해서 계속적으로 물결치는 움직임을 하지 않도록 억제된 상태이다. 폴리머 다공질막이 케이싱 내에서 움직이지 않는 상태를 유지하기 때문에, 폴리머 다공질막 내에서 생육되고 있는 세포에 스트레스가 가해지는 것이 방지되어, 아포토시스 등에 의한 세포가 사멸되는 일 없이 안정적으로 세포 배양이 가능하게 된다.

본 발명의 세포 배양 모듈은 세포를 배양하는 배양 장치 및 시스템 등이라면 시판되는 것을 적용할 수 있다. 예컨대 배양 용기가 가요성의 백을 포함하는 배양 장치에도 적용 가능하며, 상기 배양 용기 내에 부유시킨 상태에서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 세포 배양 모듈은, 예컨대 스피너 플라스크 등의 교반 배양형 용기에 적용하여 배양할 수 있다. 그 밖에, 배양 용기로서는, 개방 용기에도 적용 가능하고, 폐쇄 용기에도 적용 가능하다. 예컨대 세포 배양용의 샤알레, 플라스크, 플라스틱 백, 시험관에서부터 대형 탱크까지 적절하게 이용 가능하다. 예컨대 BD Falcon사 제조의 셀 컬쳐 디쉬나 서모사이엔티픽사 제조의 Nunc 셀 팩토리 등이 포함된다.

4. 세포 배양 장치에의 세포 배양 모듈의 적용

본 명세서에 있어서 「세포 배양 장치」란, 일반적으로 세포 배양 시스템, 바이오리액터 또는 리액터와 동의로 취급되는 용어이며, 서로 바꾸더라도 동일한 의미를 갖는다. 본 발명의 세포 배양 모듈은 이하에 예시하는 세포 배양 장치에 적용할 수 있다. 또한, 이하에 예시하는 장치 이외의 시판되는 장치에 있어서도 적용 가능하다.

(1) 사이펀식 배양 장치

본 발명의 세포 배양 모듈은 도 8 및 9에 도시하는 사이펀식 배양 장치에 있어서 적용 가능하다. 사이펀식 배양 장치란, 폴리머 다공질막과, 상기 폴리머 다공질막이 수용된 세포 배양부와, 상기 세포 배양부를 내부에 격납한 액저장부와, 상기 액저장부의 상부에 배치된 배지 공급 수단과, 상기 액저장부의 바닥부에서 연통된 역U자관과, 상기 역U자관의 타단의 하부에 설치된 배지 회수 수단과, 상기 배지 회수 수단에 배치된 배지 배출 수단을 구비하고, 여기서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이고, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다도 작고, 상기 마크로보이드층은 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 마크로보이드에 연통되고, 여기서, 상기 배지 공급 수단으로부터 상기 액저장부에 공급된 배지의 액면이 상기 역U자관의 정상부에 달했을 때, 사이펀의 원리에 의해 배지가 상기 배지 회수 수단에 간헐적으로 토출되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치이다. 상기 장치에 있어서, 폴리머 다공질막을 세포 배양 모듈로 치환하여 사용할 수 있다.

(2) 통형 기상 배양 장치

본 발명의 세포 배양 모듈은 도 10, 도 11 및 도 17에 도시하는 통형 기상 배양 장치에 있어서 적용 가능하다. 일 실시형태에 있어서, 통형 기상 배양 장치란, 폴리머 다공질막과, 상기 폴리머 다공질막이 수용된 세포 배양부와, 상기 세포 배양부의 상부에 배치된 배지 공급 수단과, 상기 세포 배양부의 하부에 배치된 배지 회수 수단을 구비하고, 여기서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이고, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다도 작고, 상기 마크로보이드층은 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며, 여기서, 상기 세포 배양부가 1 이상의 배지 배출구를 갖는 바닥부와, 상기 바닥부에 대략 수직으로 배치된 측부를 구비한 세포 배양 장치이다. 또한, 일 실시형태에 있어서, 통형 기상 배양 장치란, 폴리머 다공질막과, 상기 폴리머 다공질막이 수용된 세포 배양부와, 상기 세포 배양부의 상부에 배치된 배지 공급 수단과, 상기 세포 배양부의 하부에 배치된 배지 회수 수단을 구비하고, 여기서, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이고, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다도 작고, 상기 마크로보이드층은 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 마크로보이드에 연통되고, 여기서, 상기 배지 회수 수단이 상기 세포 배양부를 수용하는 외통의 일부인 세포 배양 장치이다. 상기 장치에 있어서, 폴리머 다공질막을 세포 배양 모듈로 치환하여 사용할 수 있다.

(3) 미스트 및 샤워형 배양 장치

본 발명의 세포 배양 모듈은 도 12에 도시하는 미스트 및 샤워형 배양 장치에 있어서 적용 가능하다. 미스트 및 샤워형 배양 장치란, 폴리머 다공질막과, 상기 폴리머 다공질막이 배치된 폴리머 다공질막 배치부와, 상기 폴리머 다공질막 배치부가 수용된 하우징과, 상기 하우징의 내부에 배치된 액적화(液滴化) 배지 공급부와, 상기 액적화 배지 공급부와 연통된 배지 공급 라인과, 상기 배지 공급 라인에 연통된 배지 저류부와, 상기 배지 공급 라인의 일부에 설치된 펌프를 구비하고, 여기서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이고, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다도 작고, 상기 마크로보이드층은 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 마크로보이드에 연통되고, 여기서, 상기 폴리머 다공질막 배치부가 슬릿형 또는 메쉬형의 복수의 배지 배출구를 구비한 세포 배양 장치이다. 상기 장치에 있어서, 폴리머 다공질막을 세포 배양 모듈로 치환하여 사용할 수 있다.

(4) 기상 노출형 회전 배양 장치

본 발명의 세포 배양 모듈은 도 13, 14 및 도 16에 도시하는 회전 배양 장치에 있어서 적용 가능하다. 기상 노출형 회전 배양 장치란, 폴리머 다공질막과, 상기 폴리머 다공질막을 갖는 세포 배양부와, 상기 세포 배양부를 관통한 축과, 상기 축을 회전하기 위한 회전 모터와, 상기 세포 배양부의 적어도 일부를 침지하는 배지조를 구비하고, 여기서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이고, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다도 작고, 상기 마크로보이드층은 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 마크로보이드에 연통되고, 상기 축을 중심으로 하여 상기 세포 배양부가 회전하여, 상기 폴리머 다공질막에 담지된 세포가 기상 및 액상에 있어서 교대로 배양되는 것을 특징으로 하는 세포 배양 장치이다. 상기 장치에 있어서, 폴리머 다공질막을 세포 배양 모듈로 치환하여 사용할 수 있다.

5. 폴리머 다공질막

본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막 중의 표면층 A(이하, 「A면」 또는 「메쉬면」이라고도 부른다)에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 0.01 ㎛ 이상 200 ㎛ 미만, 0.01∼150 ㎛, 0.01∼100 ㎛, 0.01∼50 ㎛, 0.01 ㎛∼40 ㎛, 0.01 ㎛∼30 ㎛, 0.01 ㎛∼20 ㎛ 또는 0.01 ㎛∼15 ㎛이며, 바람직하게는 0.01 ㎛∼15 ㎛이다.

본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막 중의 표면층 B(이하, 「B면」 또는 「큰 구멍면」이라고도 부른다)에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다도 큰 한, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 5 ㎛ 초과 200 ㎛ 이하, 20 ㎛∼100 ㎛, 30 ㎛∼100 ㎛, 40 ㎛∼100 ㎛, 50 ㎛∼100 ㎛ 또는 60 ㎛∼100 ㎛이며, 바람직하게는 20 ㎛∼100 ㎛이다.

폴리머 다공질막 표면의 평균 구멍 직경은, 다공질막 표면의 주사형 전자현미경 사진으로부터 200점 이상의 개공부에 관해서 구멍 면적을 측정하여, 이 구멍 면적의 평균치로부터 하기 식 (1)에 따라서 구멍의 형상이 진원이라고 했을 때의 평균 직경을 계산으로부터 구할 수 있다.

(식 중, Sa는 구멍 면적의 평균치를 의미한다.)

표면층 A 및 B의 두께는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 0.01∼50 ㎛이며, 바람직하게는 0.01∼20 ㎛이다.

폴리머 다공질막에 있어서의 마크로보이드층 중의 마크로보이드의 막 평면 방향의 평균 구멍 직경은, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 10∼500 ㎛이며, 바람직하게는 10∼100 ㎛이고, 보다 바람직하게는 10∼80 ㎛이다. 또한, 상기 마크로보이드층 중의 격벽의 두께는, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 0.01∼50 ㎛이며, 바람직하게는 0.01∼20 ㎛이다. 일 실시형태에 있어서, 상기 마크로보이드층 중의 적어도 하나의 격벽은, 인접하는 마크로보이드끼리를 연통하는, 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의, 바람직하게는 0.01∼50 ㎛의 하나 또는 복수의 구멍을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 상기 마크로보이드층 중의 격벽은 구멍을 갖지 않는다.

본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막 표면의 총 막 두께는, 특별히 한정되지 않지만, 5 ㎛ 이상, 10 ㎛ 이상, 20 ㎛ 이상 또는 25 ㎛ 이상이라도 좋고, 500 ㎛ 이하, 300 ㎛ 이하, 100 ㎛ 이하, 75 ㎛ 이하 또는 50 ㎛ 이하라도 좋다. 바람직하게는 5∼500 ㎛이며, 보다 바람직하게는 25∼75 ㎛이다.

본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막의 막 두께는 접촉식 두께 측정계로 측정할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막의 공극률은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 40% 이상 95% 미만이다.

본 발명에 있어서 이용되는 폴리머 다공질막의 공극률은, 소정의 크기로 잘라낸 다공질 필름의 막 두께 및 질량을 측정하여, 기준 질량으로부터 하기 식 (2)에 따라서 구할 수 있다.

(식 중, S는 다공질 필름의 면적, d는 총 막 두께, w는 측정한 질량, D는 폴리머의 밀도를 각각 의미한다. 폴리머가 폴리이미드인 경우, 밀도는 1.34 g/㎤로 한다.)

본 발명에 있어서 이용되는 폴리머 다공질막은, 바람직하게는 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이고, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 0.01 ㎛∼15 ㎛이며, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 20 ㎛∼100 ㎛이고, 상기 마크로보이드층은 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며, 상기 마크로보이드층의 격벽 및 상기 표면층 A 및 B의 두께는 0.01∼20 ㎛이며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 마크로보이드에 연통되어 있고, 총 막 두께가 5∼500 ㎛이며, 공극률이 40% 이상 95% 미만인 폴리머 다공질막이다. 일 실시형태에 있어서, 마크로보이드층 중의 적어도 하나의 격벽은, 인접하는 마크로보이드끼리를 연통하는, 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의, 바람직하게는 0.01∼50 ㎛의 하나 또는 복수의 구멍을 갖는다. 다른 실시형태에 있어서, 격벽은 그와 같은 구멍을 갖지 않는다.

본 발명에 있어서 이용되는 폴리머 다공질막은 멸균되어 있는 것이 바람직하다. 멸균 처리로서는, 특별히 한정되지 않지만, 건열 멸균, 증기 멸균, 에탄올 등 소독제에 의한 멸균, 자외선이나 감마선 등의 전자파 멸균 등 임의의 멸균 처리 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 폴리머 다공질막은, 상기한 구조적 특징을 갖추는 한 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 폴리이미드 다공질막 또는 폴리에테르술폰(PES) 다공질막이다.

5-1. 폴리이미드 다공질막

폴리이미드란, 반복 단위에 이미드 결합을 포함하는 고분자의 총칭이며, 통상은 방향족 화합물이 직접 이미드 결합으로 연결된 방향족 폴리이미드를 의미한다. 방향족 폴리이미드는 방향족과 방향족이 이미드 결합을 통해 공역 구조를 갖기 때문에, 강직하며 강고한 분자 구조를 가지면서 또한 이미드 결합이 강한 분자간력을 갖기 때문에 매우 높은 레벨의 열적, 기계적, 화학적 성질을 갖는다.

본 발명에서 사용될 수 있는 폴리이미드 다공질막은, 바람직하게는 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 (주된 성분으로서) 포함하는 폴리이미드 다공질막이며, 보다 바람직하게는 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막이다. 「주된 성분으로서 포함한다」란, 폴리이미드 다공질막의 구성 성분으로서, 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드 이외의 성분은, 본질적으로 포함하지 않거나, 혹은 포함되어 있어도 좋지만 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드의 성질에 영향을 주지 않는 부가적인 성분인 것을 의미한다.

일 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용될 수 있는 폴리이미드 다공질막은, 테트라카르복실산 성분과 디아민 성분으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색한 폴리이미드 다공질막도 포함된다.

폴리아믹산은 테트라카르복실산 성분과 디아민 성분을 중합하여 얻어진다. 폴리아믹산은 열 이미드화 또는 화학 이미드화함으로써 폐환하여 폴리이미드로 할 수 있는 폴리이미드 전구체이다.

폴리아믹산은, 아믹산의 일부가 이미드화하고 있더라도, 본 발명에 영향을 주지지 않는 범위라면 그것을 이용할 수 있다. 즉, 폴리아믹산은 부분적으로 열 이미드화 또는 화학 이미드화되어 있어도 좋다.

폴리아믹산을 열 이미드화하는 경우는, 필요에 따라서 이미드화 촉매, 유기 인 함유 화합물, 무기 미립자, 유기 미립자 등의 미립자 등을 폴리아믹산 용액에 첨가할 수 있다. 또한, 폴리아믹산을 화학 이미드화하는 경우는, 필요에 따라서 화학 이미드화제, 탈수제, 무기 미립자, 유기 미립자 등의 미립자 등을 폴리아믹산 용액에 첨가할 수 있다. 폴리아믹산 용액에 상기 성분을 배합하여도 착색 전구체가 석출되지 않는 조건으로 행하는 것이 바람직하다.

본 명세서에 있어서 「착색 전구체」란, 250℃ 이상의 열처리에 의해 일부 또는 전부가 탄화하여 착색화물을 생성하는 전구체를 의미한다.

상기 폴리이미드 다공질막의 제조에 있어서 사용될 수 있는 착색 전구체로서는, 폴리아믹산 용액 또는 폴리이미드 용액에 균일하게 용해 또는 분산되어, 250℃ 이상, 바람직하게는 260℃ 이상, 더욱 바람직하게는 280℃ 이상, 보다 바람직하게는 300℃ 이상의 열처리, 바람직하게는 공기 등의 산소 존재 하에서의 250℃ 이상, 바람직하게는 260℃ 이상, 더욱 바람직하게는 280℃ 이상, 보다 바람직하게는 300℃ 이상의 열처리에 의해 열분해되고 탄화하여 착색화물을 생성하는 것이 바람직하며, 흑색계의 착색화물을 생성하는 것이 보다 바람직하고, 탄소계 착색 전구체가 보다 바람직하다.

착색 전구체는, 가열해 나가면 일견 탄소화물로 보이는 것으로 되지만, 조직적으로는 탄소 이외의 다른 원소를 포함하며, 층 구조, 방향족 가교 구조, 사면체 탄소를 포함하는 무질서 구조인 것을 포함한다.

탄소계 착색 전구체는 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 석유타르, 석유피치, 석탄타르, 석탄피치 등의 타르 또는 피치, 코크스, 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체, 페로센 화합물(페로센 및 페로센 유도체) 등을 들 수 있다. 이들 중에서는 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체 및/또는 페로센 화합물이 바람직하고, 아크릴로니트릴을 포함하는 모노머로부터 얻어지는 중합체로서는 폴리아크릴니트릴이 바람직하다.

또한, 다른 실시형태에 있어서, 본 발명에서 사용될 수 있는 폴리이미드 다공질막은, 상기한 착색 전구체를 사용하지 않고서 테트라카르복실산 성분과 디아민 성분으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액을 성형한 후, 열처리함으로써 얻어지는 폴리이미드 다공질막도 포함된다.

착색 전구체를 사용하지 않고서 제조되는 폴리이미드 다공질막은, 예컨대 극한 점도수가 1.0∼3.0인 폴리아믹산 3∼60 질량%와 유기 극성 용매 40∼97 질량%를 포함하는 폴리아믹산 용액을 필름형으로 유연(流延)하여, 물을 필수 성분으로 하는 응고 용매에 침지 또는 접촉시키고, 폴리아믹산의 다공질막을 제작하고, 그 후 상기 폴리아믹산의 다공질막을 열처리하여 이미드화함으로써 제조되어도 좋다. 이 방법에 있어서, 물을 필수 성분으로 하는 응고 용매가 물이거나 또는 5 질량% 이상 100 질량% 미만의 물과 0 질량%를 넘고 95 질량% 이하인 유기 극성 용매의 혼합액이라도 좋다. 또한, 상기 이미드화 후, 얻어진 다공질 폴리이미드막의 적어도 한쪽 면에 플라즈마 처리를 실시하여도 좋다.

상기 폴리이미드 다공질막의 제조에 있어서 사용될 수 있는 테트라카르복실산이무수물은, 임의의 테트라카르복실산이무수물을 이용할 수 있으며, 원하는 특성 등에 따라서 적절하게 선택할 수 있다. 테트라카르복실산이무수물의 구체예로서, 피로멜리트산이무수물, 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산이무수물(s-BPDA), 2,3,3',4'-비페닐테트라카르복실산이무수물(a-BPDA) 등의 비페닐테트라카르복실산이무수물, 옥시디프탈산이무수물, 디페닐술폰-3,4,3',4'-테트라카르복실산이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)술피드이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판이무수물, 2,3,3',4'-벤조페논테트라카르복실산이무수물, 3,3',4,4'-벤조페논테트라카르복실산이무수물, 비스(3,4-디카르복시페닐)메탄이무수물, 2,2-비스(3,4-디카르복시페닐)프로판이무수물, p-페닐렌비스(트리멜리트산모노에스테르산무수물), p-비페닐렌비스(트리멜리트산모노에스테르산무수물), m-터페닐-3,4,3',4'-테트라카르복실산이무수물, p-터페닐-3,4,3',4'-테트라카르복실산이무수물, 1,3-비스(3,4-디카르복시페녹시)벤젠이무수물, 1,4-비스(3,4-디카르복시페녹시)벤젠이무수물, 1,4-비스(3,4-디카르복시페녹시)비페닐이무수물, 2,2-비스〔(3,4-디카르복시페녹시)페닐〕프로판이무수물, 2,3,6,7-나프탈렌테트라카르복실산이무수물, 1,4,5,8-나프탈렌테트라카르복실산이무수물, 4,4'-(2,2-헥사플루오로이소프로필리덴)디프탈산이무수물 등을 들 수 있다. 또한, 2,3,3',4'-디페닐술폰테트라카르복실산 등의 방향족 테트라카르복실산을 이용하는 것도 바람직하다. 이들은 단독으로 이용할 수도 있고, 2종 이상을 조합하여 이용할 수도 있다.

이들 중에서도 특히 비페닐테트라카르복실산이무수물 및 피로멜리트산이무수물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 방향족 테트라카르복실산이무수물이 바람직하다. 비페닐테트라카르복실산이무수물로서는 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산이무수물을 적합하게 이용할 수 있다.

상기 폴리이미드 다공질막의 제조에 있어서 사용될 수 있는 디아민은 임의의 디아민을 이용할 수 있다. 디아민의 구체예로서 이하의 것을 들 수 있다.

1) 1,4-디아미노벤젠(파라페닐렌디아민), 1,3-디아미노벤젠, 2,4-디아미노톨루엔, 2,6-디아미노톨루엔 등의 벤젠 핵 하나의 벤젠디아민;

2) 4,4'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르 등의 디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3'-디메틸-4,4'-디아미노비페닐, 2,2'-디메틸-4,4'-디아미노비페닐, 2,2'-비스(트리플루오로메틸)-4,4'-디아미노비페닐, 3,3'-디메틸-4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3'-디카르복시-4,4'-디아미노디페닐메탄, 3,3',5,5'-테트라메틸-4,4'-디아미노디페닐메탄, 비스(4-아미노페닐)술피드, 4,4'-디아미노벤즈아닐리드, 3,3'-디클로로벤지딘, 3,3'-디메틸벤지딘, 2,2'-디메틸벤지딘, 3,3'-디메톡시벤지딘, 2,2'-디메톡시벤지딘, 3,3'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐에테르, 3,3'-디아미노디페닐술피드, 3,4'-디아미노디페닐술피드, 4,4'-디아미노디페닐술피드, 3,3'-디아미노디페닐술폰, 3,4'-디아미노디페닐술폰, 4,4'-디아미노디페닐술폰, 3,3'-디아미노벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디클로로벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디메톡시벤조페논, 3,3'-디아미노디페닐메탄, 3,4'-디아미노디페닐메탄, 4,4'-디아미노디페닐메탄, 2,2-비스(3-아미노페닐)프로판, 2,2-비스(4-아미노페닐)프로판, 2,2-비스(3-아미노페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스(4-아미노페닐)-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 3,3'-디아미노디페닐술폭시드, 3,4'-디아미노디페닐술폭시드, 4,4'-디아미노디페닐술폭시드의 벤젠 핵 2개의 디아민;

3) 1,3-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,3-비스(3-아미노페녹시)-4-트리플루오로메틸벤젠, 3,3'-디아미노-4-(4-페닐)페녹시벤조페논, 3,3'-디아미노-4,4'-디(4-페닐페녹시)벤조페논, 1,3-비스(3-아미노페닐술피드)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐술피드)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐술피드)벤젠, 1,3-비스(3-아미노페닐술폰)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐술폰)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐술폰)벤젠, 1,3-비스〔2-(4-아미노페닐)이소프로필〕벤젠, 1,4-비스〔2-(3-아미노페닐)이소프로필〕벤젠, 1,4-비스〔2-(4-아미노페닐)이소프로필〕벤젠 등의 벤젠 핵 3개의 디아민;

4) 3,3'-비스(3-아미노페녹시)비페닐, 3,3'-비스(4-아미노페녹시)비페닐, 4,4'-비스(3-아미노페녹시)비페닐, 4,4'-비스(4-아미노페녹시)비페닐, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕에테르, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕케톤, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕술피드, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕술폰, 비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕메탄, 비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕메탄, 비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕메탄, 비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕메탄, 2,2-비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕프로판, 2,2-비스〔3-(3-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스〔3-(4-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스〔4-(3-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판, 2,2-비스〔4-(4-아미노페녹시)페닐〕-1,1,1,3,3,3-헥사플루오로프로판 등의 벤젠 핵 4개의 디아민.

이들은 단독으로 이용할 수도 있고, 2종 이상을 혼합하여 이용할 수도 있다. 이용하는 디아민은 원하는 특성 등에 따라서 적절하게 선택할 수 있다.

이들 중에서도 방향족 디아민 화합물이 바람직하고, 3,3'-디아미노디페닐에테르, 3,4'-디아미노디페닐에테르, 4,4'-디아미노디페닐에테르 및 파라페닐렌디아민, 1,3-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페닐)벤젠, 1,4-비스(4-아미노페닐)벤젠, 1,3-비스(4-아미노페녹시)벤젠, 1,4-비스(3-아미노페녹시)벤젠을 적합하게 이용할 수 있다. 특히 벤젠디아민, 디아미노디페닐에테르 및 비스(아미노페녹시)페닐로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 디아민이 바람직하다.

본 발명에서 사용될 수 있는 폴리이미드 다공질막은, 내열성, 고온 하에서의 치수 안정성의 관점에서, 유리 전이 온도가 240℃ 이상이거나 또는 300℃ 이상에서 명확한 전이점이 없는 테트라카르복실산이무수물과 디아민을 조합하여 얻어지는 폴리이미드로 형성되어 있는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용될 수 있는 폴리이미드 다공질막은, 내열성, 고온 하에서의 치수 안정성의 관점에서, 이하의 방향족 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인 것이 바람직하다.

(i) 비페닐테트라카르복실산 단위 및 피로멜리트산 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 테트라카르복실산 단위와 방향족 디아민 단위를 포함하는 방향족 폴리이미드,

(ii) 테트라카르복실산 단위와, 벤젠디아민 단위, 디아미노디페닐에테르 단위 및 비스(아미노페녹시)페닐 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 방향족 디아민 단위를 포함하는 방향족 폴리이미드

및/또는

(iii) 비페닐테트라카르복실산 단위 및 피로멜리트산 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 테트라카르복실산 단위와, 벤젠디아민 단위, 디아미노디페닐에테르 단위 및 비스(아미노페녹시)페닐 단위로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 1종의 방향족 디아민 단위를 포함하는 방향족 폴리이미드.

본 발명에 있어서 이용되는 폴리이미드 다공질막은, 바람직하게는 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리이미드 다공질막이고, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 0.01 ㎛∼15 ㎛이며, 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 20 ㎛∼100 ㎛이고, 상기 마크로보이드층은 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며, 상기 마크로보이드층의 격벽 및 상기 표면층 A 및 B의 두께는 0.01∼20 ㎛이며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 마크로보이드에 연통되어 있고, 총 막 두께가 5∼500 ㎛이며, 공극률이 40% 이상 95% 미만인 폴리이미드 다공질막이다. 여기서, 마크로보이드층 중 적어도 하나의 격벽은, 인접하는 마크로보이드끼리를 연통하는, 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의, 바람직하게는 0.01∼50 ㎛의 하나 또는 복수의 구멍을 갖는다.

예컨대 국제공개 제2010/038873호, 일본 특허 공개 2011-219585호 공보 또는 일본 특허 공개 2011-219586호 공보에 기재되어 있는 폴리이미드 다공질막도 본 발명에 사용 가능하다.

5-2. 폴리에테르술폰(PES) 다공질막

본 발명에서 사용될 수 있는 PES 다공질막은, 폴리에테르술폰을 포함하며, 전형적으로는 실질적으로 폴리에테르술폰으로 이루어진다. 폴리에테르술폰은 당업자에게 공지된 방법으로 합성된 것이라도 좋고, 예컨대 2가 페놀, 알칼리 금속 화합물 및 디할로게노디페닐 화합물을 유기 극성 용매 중에서 중축합 반응시키는 방법, 2가 페놀의 알칼리 금속2염을 미리 합성하여 디할로게노디페닐 화합물과 유기 극성 용매 중에서 중축합 반응시키는 방법 등에 의해서 제조할 수 있다.

알칼리 금속 화합물로서는 알칼리 금속 탄산염, 알칼리 금속 수산화물, 알칼리 금속 수소화물, 알칼리 금속 알콕시드 등을 들 수 있다. 특히 탄산나트륨 및 탄산칼륨이 바람직하다.

2가 페놀 화합물로서는, 히드로퀴논, 카테콜, 레조르신, 4,4'-비페놀, 비스(히드록시페닐)알칸류(예컨대 2,2-비스(히드록시페닐)프로판 및 2,2-비스(히드록시페닐)메탄), 디히드록시디페닐술폰류, 디히드록시디페닐에테르류 또는 이들의 벤젠환의 수소의 적어도 하나가, 메틸기, 에틸기, 프로필기 등의 저급 알킬기, 또는 메톡시기, 에톡시기 등의 저급 알콕시기로 치환된 것을 들 수 있다. 2가 페놀 화합물로서는, 상기한 화합물을 2종류 이상 혼합하여 이용할 수 있다.

폴리에테르술폰은 시판 제품이라도 좋다. 시판 제품의 예로서는 스미카엑셀 7600P, 스미카엑셀 5900P(이상, 스미토모카가쿠(주) 제조) 등을 들 수 있다.

폴리에테르술폰의 대수 점도는, 다공질 폴리에테르술폰막의 마크로보이드를 양호하게 형성한다는 관점에서, 바람직하게는 0.5 이상, 보다 바람직하게는 0.55 이상이며, 다공질 폴리에테르술폰막의 제조 용이성의 관점에서, 바람직하게는 1.0 이하, 보다 바람직하게는 0.9 이하, 더욱 바람직하게는 0.8 이하, 특히 바람직하게는 0.75 이하이다.

또한, PES 다공질막 또는 그 원료로서의 폴리에테르술폰은, 내열성, 고온 하에서의 치수 안정성의 관점에서, 유리 전이 온도가 200℃ 이상이거나 또는 명확한 유리 전이 온도가 관찰되지 않는 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용될 수 있는 PES 다공질막의 제조 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대

대수 점도 0.5∼1.0의 폴리에테르술폰 0.3 질량%∼60 질량%와 유기 극성 용매 40 질량%∼99.7 질량%를 포함하는 폴리에테르술폰 용액을, 필름형으로 유연하여, 폴리에테르술폰의 빈용매 또는 비용매를 필수 성분으로 하는 응고 용매에 침지 또는 접촉시켜, 공극을 갖는 응고막을 제작하는 공정, 및

상기 공정에서 얻어진 공극을 갖는 응고막을 열처리하여 상기 공극을 조대화(粗大化)시켜 PES 다공질막을 얻는 공정

을 포함하고, 상기 열처리는, 상기 공극을 갖는 응고막을, 상기 폴리에테르술폰의 유리 전이 온도 이상 혹은 240℃ 이상까지 승온시키는 것을 포함하는 방법으로 제조되어도 좋다.

본 발명에서 사용될 수 있는 PES 다공질막은, 바람직하게는 표면층 A, 표면층 B, 및 상기 표면층 A와 상기 표면층 B의 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 PES 다공질막이고,

상기 마크로보이드층은, 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 상기 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인, 막 평면 방향의 평균 구멍 직경이 10 ㎛∼500 ㎛인 복수의 마크로보이드를 가지며,

상기 마크로보이드층의 격벽은 두께가 0.1 ㎛∼50 ㎛이고,

상기 표면층 A 및 B는 각각 두께가 0.1 ㎛∼50 ㎛이고,

상기 표면층 A 및 B 중, 한쪽이 평균 구멍 직경 5 ㎛ 초과 200 ㎛ 이하인 복수의 세공을 가지며, 또한 다른 쪽이 평균 구멍 직경 0.01 ㎛ 이상 200 ㎛ 미만의 복수의 세공을 가지며,

표면층 A 및 표면층 B의, 한쪽의 표면 개구율이 15% 이상이며, 다른 쪽의 표면층의 표면 개구율이 10% 이상이고,

상기 표면층 A 및 상기 표면층 B의 상기 세공이 상기 마크로보이드에 연통되어 있고,

상기 PES 다공질막은 총 막 두께가 5 ㎛∼500 ㎛이며 또한 공극률이 50%∼95%인

PES 다공질막이다.

6. 세포 배양 모듈에의 세포의 적용

세포의 세포 배양 모듈에의 적용의 구체적인 공정은 특별히 한정되지 않는다. 본 명세서에 기재한 공정, 혹은 세포를 막형 담체에 적용하기에 적합한 임의의 수법을 채용할 수 있다. 한정되는 것은 아니지만, 본 발명의 방법에 있어서 세포의 세포 배양 모듈에의 적용은 예컨대 이하와 같은 양태를 포함한다.

(1) 현탁된 세포를 포함하는 제1 배지를 세포 배양 모듈에 적용하는 공정,

(2) 상기 세포 배양 모듈을 세포 배양 가능한 온도로 유지하여, 상기 세포 배양 모듈 중의 폴리머 다공질막에 상기 세포를 흡착시키는 공정, 및

(3) 상기 세포를 흡착시킨 상기 세포 배양 모듈을 배양 용기 중에서 제2 배지로 배양하는 공정

을 포함한다.

세포 배양 모듈을 이용한 세포 배양의 모델 도면을 도 7에 도시한다. 도 7은 이해를 돕기 위한 도면이며, 각 요소는 실제 치수가 아니다. 본 발명의 세포 배양 방법에서는, 세포 배양 모듈에 세포를 적용하여 배양함으로써, 폴리머 다공질막이 갖는 내부의 다면적인 연결 다공 부분이나 표면에 대량의 세포가 생육되기 때문에, 대량의 세포를 간편하게 배양할 수 있게 된다. 또한, 본 발명의 세포 배양 방법에서는, 세포 배양에 이용하는 배지의 양을 종래의 방법보다도 대폭 줄이면서 대량의 세포를 배양하는 것이 가능하게 된다. 예컨대 폴리머 다공질막의 일부분 또는 전체가 세포 배양 배지의 액상과 접촉하지 않은 상태에서도 대량의 세포를 장기간에 걸쳐 배양할 수 있다. 또한, 세포 생존역(生存域)을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총화에 대하여, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적을 현저히 줄이는 것도 가능하게 된다.

본 명세서에 있어서, 세포를 포함하지 않는 폴리머 다공질막이 그 내부 간극의 체적도 포함하여 공간 중에 차지하는 체적을 「겉보기 폴리머 다공질막 체적」이라고 부른다(도 7 참조). 그리고, 폴리머 다공질막에 세포를 적용하여, 폴리머 다공질막의 표면 및 내부에 세포가 담지된 상태에 있어서, 폴리머 다공질막, 세포 및 폴리머 다공질막 내부에 침윤한 배지가 전체적으로 공간 중에 차지하는 체적을 「세포 생존역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적」이라고 부른다(도 1 참조). 막 두께 25 ㎛의 폴리머 다공질막의 경우, 세포 생존역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적은, 겉보기 폴리머 다공질막 체적보다 최대 50% 정도큰 값이 된다. 본 발명의 방법에서는, 하나의 세포 배양 용기 중에 복수의 폴리머 다공질막을 수용하여 배양할 수 있는데, 그 경우, 세포를 담지한 복수의 폴리머 다공질막 각각에 관한 세포 생존역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총화를, 단순히 「세포 생존역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총화」라고 기재하는 경우가 있다.

상기 세포 배양 모듈을 이용함으로써, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이 세포 생존역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총화의 10000배 또는 그보다 적은 조건에서도, 세포를 장기간에 걸쳐 양호하게 배양할 수 있게 된다. 또한, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이 세포 생존역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총화의 1000배 또는 그보다 적은 조건에서도, 세포를 장기간에 걸쳐 양호하게 배양할 수 있다. 더욱이, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이 세포 생존역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총화의 100배 또는 그보다 적은 조건에서도, 세포를 장기간에 걸쳐 양호하게 배양할 수 있다. 그리고, 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지의 총 체적이 세포 생존역을 포함하는 폴리머 다공질막 체적의 총화의 10배 또는 그보다 적은 조건에서도, 세포를 장기간에 걸쳐 양호하게 배양할 수 있다.

즉, 본 발명에 의하면, 세포 배양하는 공간(용기)을 종래의 이차원 배양을 행하는 세포 배양 장치와 비교하여 극한까지 소형화가 가능하게 된다. 또한, 배양하는 세포의 수를 늘리고 싶은 경우는, 적층하는 폴리머 다공질막의 매수를 늘리는 등의 간편한 조작에 의해 유연하게 세포 배양하는 체적을 늘리는 것이 가능하게 된다. 본 발명에 이용되는 폴리머 다공질막을 갖춘 세포 배양 장치라면, 세포를 배양하는 공간(용기)과 세포 배양 배지를 저장하는 공간(용기)을 분리하는 것이 가능하게 되어, 배양하는 세포수에 따라서 필요하게 되는 양의 세포 배양 배지를 준비할 수 있게 된다. 세포 배양 배지를 저장하는 공간(용기)은, 목적에 따라서 대형화 또는 소형화하여도 좋고, 혹은 교환 가능한 용기라도 좋으며, 특별히 한정되지 않는다.

본 발명의 방법에 있어서, 예컨대 폴리머 다공질막을 이용한 배양 후에 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포의 수가, 세포가 전부 세포 배양 용기 중에 포함되는 세포 배양 배지에 균일하게 분산된 것으로 하여, 배지 1 밀리리터당 1.0×10⁵개 이상, 1.0×10⁶개 이상, 2.0×10⁶개 이상, 5.0×10⁶개 이상, 1.0×10⁷개 이상, 2.0×10⁷개 이상, 5.0×10⁷개 이상, 1.0×10⁸개 이상, 2.0×10⁸개 이상, 5.0×10⁸개 이상, 1.0×10⁹개 이상, 2.0×10⁹개 이상 또는 5.0×10⁹개 이상이 될 때까지 배양될 수 있다.

본 명세서에 있어서 「배지」란, 세포, 특히 동물세포를 배양하기 위한 세포 배양 배지를 가리킨다. 배지는 세포 배양액과 동의의 의미로서 이용된다. 그 때문에, 본 발명에 있어서 이용되는 배지란 액체 배지를 가리킨다. 배지의 종류는, 통상 사용되는 배지를 사용할 수 있고, 배양하는 세포의 종류에 따라서 적절하게 결정된다.

본 발명의 세포 배양에 있어서, 상기 공정 (1)에서 이용되는 제1 배지는, 세포를 배양할 수 있는 배지라면 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 CHO 세포를 배양하는 경우라면, Irvine Scientific사 제조 BalanCD(상표) CHO GROWTH A를 이용할 수 있다.

본 발명의 세포 배양에 있어서, 상기 공정 (2)의 세포 배양 가능한 온도란, 세포가 폴리머 다공질막에 흡착 가능한 온도이면 되며, 10℃∼45℃, 바람직하게는 15℃∼42℃, 보다 바람직하게는 20℃∼40℃, 더욱 바람직하게는 25℃∼39℃이다. 또한, 본 발명의 세포 배양 방법에 있어서, 상기 공정 (2)의 세포를 흡착시키는 시간은 예컨대 5분∼24시간, 바람직하게는 10분∼12시간, 보다 바람직하게는 15분∼500분이다.

본 발명의 세포 배양에 있어서, 상기 공정 (2)는, 진탕 및/또는 교반하면서 상기 세포 배양 모듈의 상기 폴리머 다공질막에 세포를 흡착시키더라도 좋고, 정치하여 상기 세포 배양 모듈의 상기 폴리머 다공질막에 세포를 흡착시키더라도 좋다. 진탕하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 시판되는 진탕 장치 상에, 본 발명의 세포 배양 모듈과 세포를 포함하는 배양 용기를 배치하여 진탕하여도 좋다. 진탕은 계속적 또는 단속적으로 행하여도 좋고, 예컨대 진탕과 정치를 교대로 반복하여도 좋고, 적절하게 조정하면 된다. 교반하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예컨대 본 발명의 세포 배양 모듈과 세포를 시판되는 스피너 플라스크 내에 넣어, 스터러를 회전시킴으로써 교반하여도 좋다. 교반은 계속적 또는 단속적으로 행하여도 좋고, 예컨대 교반과 정치를 교대로 반복하여도 좋고, 적절하게 조정하면 된다.

본 발명의 세포 배양에 있어서, 상기 공정 (3)에서 이용되는 제2 배지는, 접착세포의 배양에 이용되는 배지가 선택되며, 예컨대 D-MEM, E-MEM, IMDM, Ham's F-12 등을 이용할 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다. 제2 배지는, 세포가 기재에 접착하는 것을 저해하는 성분, 예컨대 계면활성제가 포함되지 않는 배지가 바람직하다. 사용되는 제2 배지는 세포의 종류에 따라서 적절하게 선택된다. 상기 공정 (3)에 있어서, 제2 배지에서 배양함으로써, 상기 공정 (2)에서 폴리머 다공질막에 흡착된 세포가 상기 폴리머 다공성 막 내에 접착하는 것을 촉진한다. 이에 따라, 세포가 상기 폴리머 다공질막으로부터 탈락하는 일 없이 안정적으로 배양 가능하다. 또한, 본 발명의 세포 배양 방법은 상술한 폴리머 다공질막을 갖춘 세포 배양 모듈을 사용한다. 본 발명의 세포 배양 방법에서 이용되는 세포 배양 모듈은, 폴리머 다공질막이 케이싱에 수용되어 있음으로써, 막형 폴리머 다공질막이 케이싱 내에서 계속적으로 형태가 변형되는 것이 방지되고 있다. 이에 따라, 폴리머 다공질막 내에서 생육되는 세포에 스트레스가 가해지는 것이 방지되고, 아포토시스 등이 억제되어 안정적이며 또한 대량의 세포를 배양하는 것이 가능하게 된다.

본 발명의 세포 배양에 있어서, 상기 공정 (3)은 세포를 배양하는 배양 장치 및 시스템 등이라면 시판되는 것을 적용할 수 있다. 예컨대 배양 용기가 가요성 백형 배양 용기라도 좋고, 또한, 교반형 배양 용기, 예컨대 스피너 플라스크 등의 배양 용기로 배양하는 것도 가능하다. 그 외, 배양 용기로서는 개방 용기에도 적용 가능하고, 폐쇄 용기에도 적용 가능하다. 예컨대 세포 배양용의 샤알레, 플라스크, 플라스틱 백, 시험관에서부터 대형 탱크까지 적절하게 이용 가능하다. 예컨대 BD Falcon사 제조의 셀 컬쳐 디쉬나 서모사이엔티픽사 제조의 Nunc 셀 팩토리 등이 포함된다. 또한, 본 발명의 세포 배양 방법에 있어서, 세포 배양 모듈을 이용함으로써, 선천적으로 부유 배양이 가능하지 않았던 세포에 관해서도 부유 배양용 장치로 부유 배양 유사 상태에서의 배양을 행할 수 있게 된다. 부유 배양용 장치로서는, 예컨대 코닝사 제조의 스피너 플라스크나 회전 배양 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 공정 (3)은 본 명세서에 기재한 세포 배양 장치로 실시하여도 좋다.

본 발명의 세포 배양에 있어서, 상기 공정 (3)은, 상기 세포 배양 모듈을 포함하는 배양 용기에 연속적으로 배지를 첨가하여 회수하는 식의 연속순환형 장치를 이용하여 실행할 수도 있다.

본 발명의 세포 배양에 있어서, 상기 공정 (3)은, 상기 세포 배양 모듈을 포함하는 배양 용기 밖에 설치된 세포 배양 배지 공급 수단으로부터 연속적 또는 간헐적으로 세포 배양 배지가 세포 배양 용기 중에 공급되는 계라도 좋다. 이때, 세포 배양 배지가 세포 배양 배지 공급 수단과 세포 배양 용기 사이를 순환하는 계로 할 수 있다.

7. 세포의 배양·엑소좀 생성 시스템 및 배양 조건

본 발명의 방법에 있어서, 세포의 배양·엑소좀 생성 시스템 및 배양 조건은 세포의 종류 등에 따라서 적절하게 결정할 수 있다. 각 세포에 적합한 배양 방법은 공지이며, 당업자는 임의의 공지된 방법을 이용하여 세포 배양 모듈에 적용한 세포를 배양할 수 있다. 세포 배양 배지도 세포의 종류에 따라서 적절하게 조제할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 배양에 이용하는 시스템의 형상, 규모 등은 특별히 한정되지 않고, 세포 배양용 샤얄레, 플라스크, 플라스틱 백, 시험관에서부터 대형 탱크까지 적절하게 이용 가능하다. 예컨대 BD Falcon사 제조의 셀 컬쳐 디쉬나 서모사이엔티픽사 제조의 Nunc 셀 팩토리 등이 포함된다. 또한, 본 발명에 있어서 폴리이미드 다공질막을 이용함으로써, 선천적으로 부유 배양이 가능하지 않았던 세포에 관해서도 부유 배양용 장치로 부유 배양 유사 상태에서의 배양을 행할 수 있게 되었다. 부유 배양용 장치로서는 예컨대 코닝사 제조의 스피너 플라스크나 회전 배양 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 세포를 정치 배양 조건 하에서 배양하여도 좋다. 간헐적으로 배지를 교환함으로써 생성된 엑소좀을 단리할 수 있다. 또한, 본 발명에 있어서, 세포를 회전 배양 또는 교반 조건 하에서 배양하여도 좋다. 회전 배양·스피너 플라스크에서의 교반 배양도 마찬가지다. 또한, 이들 각 방법에, 연속적 혹은 간헐적인 배지 교환 시스템을 부착하여, 장기간 배양을 지향할 수도 있다.

본 발명에 있어서, 세포를 연속적으로 배양하여도 좋다. 예컨대 본 발명의 방법에 있어서의 배양은, 세포 배양 모듈에 연속적으로 배지를 첨가하여 회수하는 연속 순환 혹은 개방형 장치를 이용하여, 공기 중에 폴리머 다공질막을 노출시키는 형식으로 실행하는 것도 가능하다.

본 발명에 있어서, 세포의 배양은, 세포 배양 용기 밖에 설치된 세포 배양 배지 공급 수단으로부터 연속적 또는 간헐적으로 세포 배양 배지가 세포 배양 용기 중에 공급되는 계에서 행하여도 좋다. 이때, 세포 배양 배지가 세포 배양 배지 공급 수단과 세포 배양 용기 사이를 순환하는 계일 수 있다.

본 발명은, 세포 배양 장치를 인큐베이터 안에 설치하여 세포를 배양하는 것을 포함하는 양태를 포함한다. 세포 배양 용기 밖에 설치된 세포 배양 배지 공급 수단으로부터 연속적 또는 간헐적으로 세포 배양 배지가 세포 배양 용기 내에 공급되는 계에서 행하는 경우, 그 계는, 세포 배양 용기인 배양 유닛과 세포 배양 배지 공급 수단인 배지 공급 유닛을 포함하는 세포 배양 장치라도 좋고, 여기서, 배양 유닛은 세포를 담지하기 위한 하나 또는 복수의 세포 배양 모듈을 수용하는 배양 유닛이며, 배지 공급구 및 배지 배출구를 구비한 배양 유닛이고, 배지 공급 유닛은 배지 수납 용기와, 배지 공급 라인과, 배지 공급 라인을 통해 배지를 송액하는 송액 펌프를 구비하고, 여기서 배지 공급 라인의 제1 단부는 배지 수납 용기 내의 배지에 접촉하고, 배지 공급 라인의 제2 단부는 배양 유닛의 배지 공급구를 통해 배양 유닛 내에 연통되어 있는 배지 공급 유닛인 세포 배양 장치라도 좋다.

또한, 상기 세포 배양 장치에 있어서, 배양 유닛은 배지 공급 라인, 송액 펌프, 공기 공급구 및 공기 배출구를 갖추지 않는 배양 유닛이라도 좋고, 또한, 배지 공급 라인, 송액 펌프, 공기 공급구 및 공기 배출구를 갖춘 배양 유닛이라도 좋다. 배양 유닛은 공기 공급구 및 공기 배출구를 갖추지 않는 것이라도 좋다. 또한, 상기 세포 배양 장치에 있어서, 배양 유닛이 배지 배출 라인을 더 구비하고, 여기서 배지 배출 라인의 제1 단부는 배지 수납 용기에 접속하고, 배지 배출 라인의 제2 단부는 배양 유닛의 배지 배출구를 통해 배양 유닛 내에 연통되고, 배지가 배지 공급 유닛과 배양 유닛을 순환 가능하여도 좋다.

8. 세포에 의한 엑소좀의 생성

본 발명은 상술한 것과 같이 세포를 배양함으로써 세포로부터 엑소좀을 생성하게 한다. 생성된 엑소좀은 공지된 방법에 의해 회수할 수 있다. 엑소좀은 세포로부터 분비되기 때문에 세포 배양 배지로부터 물질을 회수할 수 있다.

본 발명의 방법에 있어서, 세포 배양 공정과 엑소좀 생성 공정은 개별의 것이라도, 아니라도 좋다. 예컨대 세포 배양 모듈에 세포를 적용하여 세포 배양을 시작한 시점에서 세포는 엑소좀을 생성하고 있기 때문에, 배양 시작에서부터 종료까지 계속해서 세포로부터 엑소좀을 회수하도록 생산계를 설계하는 경우, 세포 배양 공정과 엑소좀 생성 공정은 동시에 실시되게 된다. 혹은 세포 배양과 엑소좀 생성의 사이에서, 예컨대 배지 조성이나 배양 장치의 설정 등이 다른 경우, 세포 배양 공정 종료 후에 엑소좀 생성용으로 설계된 배양 조건으로 전환되기 때문에, 양 공정은 개별의 것으로 된다.

본 발명의 방법에 있어서, 배양 세포는 장기간에 걸쳐 균일한 품질의 엑소좀을 지속적으로 생성할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 있어서 엑소좀을 생성하는 공정은 1개월, 2개월, 3개월 혹은 6개월 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 계속된다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에 있어서, 엑소좀 생성 기간 동안, 세포가 생성한 엑소좀의 분자적 프로필이나 생리 활성이 평가된다.

II. 엑소좀 생성 장치

본 발명은, 또한, 세포 배양 모듈을 포함하는 본 발명의 방법에 사용하기 위한, 세포 배양에 의해 엑소좀을 생성하는 장치에 관한 것이다. 본 발명의 엑소좀 생성 장치에 있어서, 세포 배양 모듈은 고정되어 이용되어도 좋고, 혹은 세포 배양 배지 중에 부유하여 이용되어도 좋고, 배지 중에 놓이더라도 배지로부터 노출되어도 좋다.

본 발명의 세포 배양에 있어서의 엑소좀 생성 장치로서는, 세포 배양 모듈을 포함하는 것이라면 임의의 형태를 취하여도 좋고, 공지된 세포 배양 장치를 이용할 수 있다. 배양 장치의 형상, 규모 등은 특별히 한정되지 않으며, 샤알레, 시험관에서부터 대형 탱크까지 적절하게 이용 가능하다. 예컨대 BD Falcon사 제조의 셀 컬쳐 디쉬나 서모사이엔티픽사 제조의 Nunc 셀 팩토리 등이 포함된다. 또한, 본 발명에 있어서 폴리머 다공질막을 이용함으로써, 선천적으로 부유 배양이 가능하지 않았던 세포에 관해서도 부유 배양용 장치로 부유 배양 유사 상태에서의 배양을 행할 수 있게 되었다. 부유 배양용 장치로서는 예컨대 코닝사 제조의 스피너 플라스크나 회전 배양 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 배양세포에 의한 엑소좀 생성 장치는, 세포 배양 모듈 상에 연속적으로 배지를 첨가하여 회수하는 식의 연속 순환 혹은 개방형 장치로, 공기 중에 폴리머 다공질막 시트를 노출시키는 형식으로 실행할 수도 있다.

본 발명의 방법에 있어서 세포가 생성한 엑소좀을 보다 고농도로 회수하기 위한 수단을 추가로 두어도 좋다. 예컨대 순환식 첨가 배지에 반투막(半透膜) 등을 직결시킴으로써, 젖산 등의 불필요한 물질을 제외하면서 당질이나 아미노산류를 추가하여, 효율적인 장시간의 배양법 겸 불필요물 제거법을 구축할 수도 있다.

III. 키트

본 발명은 또한, 세포 배양 모듈을 포함하는 본 발명의 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다. 본 발명의 키트는, 세포 배양 모듈 외에, 세포 배양, 엑소좀 생성, 엑소좀 회수에 필요한 구성 요소를 적절하게 포함할 수 있다. 예컨대 세포 배양 모듈에 적용하는 세포, 세포 배양 배지, 연속적 배지 공급 장치, 연속적 배지 순환 장치, 세포 배양 장치, 엑소좀 생성을 확인하는 위한 평가 수단, 엑소좀 회수 수단(예컨대 초원심, 한외 여과, 면역 침강, 크로마토그래피 등), 키트의 취급설명서 등이 포함된다.

IV. 사용

본 발명은 또한 세포 배양 모듈의 상술한 본 발명의 방법을 위한 용도를 포함한다.

V. 엑소좀

본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해서 취득한 엑소좀을 포함한다.

이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 상세히 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 당업자는 본 명세서의 기재에 기초하여 용이하게 본 발명에 수식·변경을 가할 수 있으며, 이들은 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.

실시예

이하의 실시예에서 사용된 폴리머 다공질막은 폴리이미드 다공질막이며, 테트라카르복실산 성분인 3,3',4,4'-비페닐테트라카르복실산이무수물(s-BPDA)과 디아민 성분인 4,4'-디아미노디페닐에테르(ODA)로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과, 착색 전구체인 폴리아크릴아미드를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 조제되었다. 얻어진 폴리이미드 다공질막은, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 마크로보이드층을 갖는 3층 구조의 폴리이미드 다공질막이고, 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 19 ㎛이며, 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 42 ㎛이고, 막 두께가 25 ㎛이며, 공극률이 74%였다.

또한, 이하의 실시예에서 사용한 모듈화 폴리머 다공질막(이하의 실시예에서는 「모듈」이라고 한다.)은, 한쪽 면에 2 mm×2 mm의 배지 유출 입구를 16개 갖는 폴리에틸렌제 케이싱에, 이하: 1.0×1.0 cm의 정방형 폴리이미드 다공질막 6장; 1.0×1.0 cm의 속깔개(폴리프로필렌/폴리에틸렌, NBC메쉬테크사 제조, 품번: ESP10TC); 1.0×1.0 cm의 정방형 폴리이미드 다공질막 6장; 1.0×1.0 cm의 속깔개(폴리프로필렌/폴리에틸렌, NBC메쉬테크사 제조, 품번: ESP10TC); 1.0×1.0 cm의 정방형 폴리이미드 다공질막 6장을 이 순서로 적층하여 수용한 것을 이용했다. 특별히 기재가 없는 경우, 모듈은 상기 구조를 의미한다.

또한, 기재에 「2형 모듈」로 특정된 실시예에서는, 한쪽 면에 2 mm×2 mm의 배지 유출 입구를 16개 갖는 폴리에틸렌제 케이싱에, 이하: 1.0×1.0 cm의 정방형 폴리이미드 다공질막 4장; 1.0×1.0 cm의 속깔개(폴리프로필렌/폴리에틸렌, NBC메쉬테크사 제조, 품번: ESP10TC); 1.0×1.0 cm의 정방형 폴리이미드 다공질막 4장; 1.0×1.0 cm의 속깔개(폴리프로필렌/폴리에틸렌, NBC메쉬테크사 제조, 품번: ESP10TC); 1.0×1.0 cm의 정방형 폴리이미드 다공질막 4장; 1.0×1.0 cm의 속깔개(폴리프로필렌/폴리에틸렌, NBC메쉬테크사 제조, 품번: ESP10TC); 1.0×1.0 cm의 정방형 폴리이미드 다공질막 4장; 1.0×1.0 cm의 속깔개(폴리프로필렌/폴리에틸렌, NBC메쉬테크사 제조, 품번: ESP10TC); 1.0×1.0 cm의 정방형 폴리이미드 다공질막 4장을 이 순서로 적층하여 수용한 것을 이용했다.

비교예 1: 디쉬를 이용한 세포 배양법

IWAKI 콜라겐 I 코트 디쉬로 배양한 2계대째의 간엽계 줄기세포(Y25 male_451491)를 Thermo Fisher Scientific사 제조 TrypLE(상표) Select를 사용하여 세포를 벗기고, 배지(코진바이오가부시키가이샤 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4)로 현탁했다. 세포 현탁액(Total; 3.0×10⁵ cells)을 IWAKI 콜라겐 I 코트 디쉬 60 ㎠에 파종하고, CO₂ 5%, 37℃로 설정한 CO₂ 인큐베이터 내에서 정치하여 약 16시간 세포를 접착시킨 후, 상기 배지(KBM ADSC-4) 12 mL로 배지 교환을 행했다. 그 후, 배양 시작으로부터 6일째에 배지를 교환하여, 13일간 배양을 계속했다.

배양일수 6일째 및 13일째에 회수한 세포 배양액 중에 포함되는 1일당 생성된 엑소좀의 수를 후술하는 「제타 전위·입경 분포 측정 장치를 이용한 엑소좀량 측정」의 수순으로 측정한 결과를 도 18(A)에 도시하고, 배양일수 13일째의 입경 분포 측정의 결과를 도 18(B)에 도시한다.

실시예 1: 코닝 제조 150 mL 둥근형 스토리지 보틀에서 모듈을 이용한 세포 배양법(Bottle(5% 산소))

모듈 5개를 넣은 코닝 제조 150 mL 둥근형 스토리지 보틀에 배지(코진바이오가부시키가이샤 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4)를 50 mL 주입하여 가한 후, CO₂ 5%, O₂ 5%, 37℃로 설정한 큐나사 제조 인큐베이터 쉐이커(Lab-Therm LT-XC) 내에 설치하고, 약 1시간, 회전 속도 100 rpm으로 교반하여 모듈을 습윤시켰다.

IWAKI 콜라겐 I 코트 디쉬로 배양한 2계대째의 간엽계 줄기세포(Y25 male_451491)를 Thermo Fisher Scientific사 제조 TrypLE(상표) Select를 사용하여 세포를 벗기고, 상기 배지(KBM ADSC-4)로 현탁했다. 모듈 내부의 배양 기재 폴리이미드 다공질막의 면적 1 ㎠당 2.0×10⁴ cells(Total; 1.80×10⁶ cells)의 세포 현탁액을 스토리지 보틀 내에 주입하여 가하고, 회전 속도 100 rpm으로 교반하면서 약 16시간 세포를 모듈에 흡착시킨 후, 상기 배지(KBM ADSC-4) 50 mL로 배지 교환을 행했다. 배양 시작에서부터 6일 후에 배지를 교환하고, 그 후에는 3일 혹은 4일에 한 번의 페이스로 배지 교환을 했다.

배양 시작에서부터 배양일수 27일까지의 세포 배양액 중에 포함되는 1일당 생성된 엑소좀의 수를 후술하는 「제타 전위·입경 분포 측정 장치를 이용한 엑소좀량 측정」의 수순으로 측정한 결과를 도 19(A)에 도시하고, 배양일수 27일째의 입경 분포 측정의 결과를 도 19(B)에 도시한다. 약 1개월에 걸친 장기간 연속 배양에 있어서도 안정적으로 엑소좀을 생성하는 것을 확인했다.

실시예 2: 코닝 제조 150 mL 둥근형 스토리지 보틀에서 모듈을 이용한 세포 배양법(Bottle(통상 산소))

CO₂ 5%, 37℃로 설정한 N-BIOTEK사 제조 가습 대응 쉐이커 탑재 CO₂ 인큐베이터(aniCell) 내에 코닝 제조 150 mL 둥근형 스토리지 보틀을 설치한 것 이외에는 실시예 1(Bottle(5% 산소))과 같은 조작으로 세포 배양을 행했다.

배양 시작에서부터 배양일수 27일까지의 세포 배양액 중에 포함되는 1일당 생성된 엑소좀의 수를 후술하는 「제타 전위·입경 분포 측정 장치를 이용한 엑소좀량 측정」의 수순으로 측정한 결과를 도 20(A)에 도시하고, 배양일수 27일째의 입경 분포 측정의 결과를 도 20(B)에 도시한다. 약 1개월에 걸친 장기간 연속 배양에 있어서도 안정적으로 엑소좀을 생성하는 것을 확인했다.

실시예 3: 오버플로우 리액터에서 모듈을 이용한 세포 배양법(Reactor(5% 산소))

모듈 40개를 넣은 오버플로우 리액터 배양 용기 내에 배지(코진바이오가부시키가이샤 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4)를 40 mL 주입하여 가하고, CO₂ 5%, O₂ 5%, 37℃로 설정한 큐나사 제조 인큐베이터 쉐이커(Lab-Therm LT-XC) 내에 설치후, 회전 속도 80 rpm으로 약 1시간 교반하여 모듈을 습윤시켰다.

IWAKI 콜라겐 I 코트 디쉬로 배양한 2계대째의 간엽계 줄기세포(Y25 male_451491)를 Thermo Fisher Scientific사 제조 TrypL(상표) Select를 사용하여 벗기고, 상기 배지(KBM ADSC-4)로 현탁했다. 모듈 내부의 배양 기재 폴리이미드 다공질막의 면적 1 ㎠당 2.0×10⁴ cells(Total; 1.44×10⁷ cells)의 세포 현탁액을 오버플로우 리액터 배양 용기 내에 주입하여 가한 후, 오버플로우 리액터 배양 용기 내의 액량이 80 mL가 되도록 배지를 추가하여, 회전 속도 80 rpm의 교반 조건 하에서 약 26시간 세포를 흡착시켰다.

세포 흡착 후, 상기 배지(KBM ADSC-4)에 글루코오스액(후지필름와코쥰야쿠가부시키가이샤 제조; 45 w/v% D(+)-글루코오스 용액)을 주입하여 가하고, 총 글루코오스 농도가 2000 mg/L로 조정된 액(글루코오스 조정 KBM ADSC-4)을 튜브 펌프로 40 mL/day의 속도로 오버플로우 리액터 배양 용기 내에 송액을 시작하여, 배양 용기 벽면에 설치한 배지의 회수구로부터 넘쳐 나온 배지를 회수액 저장 보틀로 회수했다. 회수한 배지는 로슈사 제조 CedexBio를 이용하여 회수액의 각 대사 파라미터의 변화로 세포 생육 거동을 관찰하고, 세포의 글루코오스 등의 소비 상황에 따라 송액량·회전 속도를 적시에 변동시켜, 장기간 세포 배양을 행했다. 글루코오스 소비량 및 젖산 생성량의 경시 변화를 도 21(A)에, 오버플로우 리액터를 이용한 세포 배양 모습을 도 21(B)에 도시한다. 장기간에 걸친 안정적인 세포의 증식·생육이 관찰되었다.

회수한 세포 배양액 중에 포함되는 1일당 생성된 엑소좀의 수를 후술하는 「제타 전위·입경 분포 측정 장치를 이용한 엑소좀량 측정」의 수순으로 측정한 결과를 도 22(A)에 도시하고, 배양일수 85일째의 입경 분포 측정의 결과를 도 22(B)에 도시한다. 약 3개월에 걸친 장기간 연속 배양에 있어서도 안정적으로 엑소좀을 생성하는 것을 확인했다.

실시예 4: 오버플로우 리액터에서 모듈을 이용한 세포 배양법(Reactor(통상 산소))

CO₂ 5%, 37℃로 설정한 N-BIOTEK사 제조 가습 대응 쉐이커 탑재 CO₂ 인큐베이터(aniCell) 내에 오버플로우 리액터를 설치한 것 이외에는 실시예 3(Reactor(5% 산소))과 같은 조작으로 세포 배양을 행했다. 글루코오스 소비량 및 젖산 생성량의 경시 변화를 도 23(A)에, 오버플로우 리액터를 이용한 세포 배양 모습을 도 23(B)에 도시한다. 장기간에 걸친 안정적인 세포의 증식·생육이 관찰되었다.

회수한 세포 배양액 중에 포함되는 1일당 생성된 엑소좀의 수를 후술하는 「제타 전위·입경 분포 측정 장치를 이용한 엑소좀량 측정」의 수순으로 측정한 결과를 도 24(A)에 도시하고, 배양일수 85일째의 입경 분포 측정의 결과를 도 24(B)에 도시한다. 약 3개월에 걸친 장기간 연속 배양에 있어서도 안정적으로 엑소좀을 생성하는 것을 확인했다.

실시예 5: WAVE 리액터에서 모듈을 이용한 세포 배양

연속의 배지 배출을 실행하기 위해서, GE사 제조 WAVE 배양 백(CELLBAG DISPOSABLE BIOREACTOR Part# CB0002L11-33)의 캡 부분에 액 배출 튜브를 설치하여 γ선 멸균한 Nalgene HDPE 캡(제품 번호: 342151-0384)으로 멸균적으로 교체하여, Harvest 튜브 펌프에 접속한다(도 77). 또한, 이후의 실시예에 있어서, WAVE 리액터에서의 연속 배양 실행의 경우에는, 같은 식의 배출 라인을 설치하여 배양을 실행했다.

같은 백 내에, 미리 Ham's F-12 배지; 후지필름와코쥰야쿠사 제조_글루타민·페놀 레드 함유로 24시간 이상 습윤한 모듈 200개를 멸균적으로 이송하고, 배지(코진바이오사 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4)를 200 mL 주입하여 가하고, GE사 제조 WAVE 리액터(ReadyToProcess WAVE25)에 설치한 후, CO₂ 5%, 온도 37℃, 진동 속도 15 rpm, 진동 각도 9°의 조건으로 약 1시간 교반하여 모듈을 습윤시켰다.

디쉬로 배양한 3계대째의 간엽계 줄기세포(Y25 male_18 TL262066)를 Gibco사 제조 Trypsin-EDTA(0.05%), 페놀 레드를 사용하여 벗기고, 배지(후지필름와코쥰야쿠사 제조; DMEM)로 현탁했다. 모듈 내부의 배양 기재 폴리이미드 다공질막의 면적 1 ㎠당 2.0×10⁴ cells(Total: 7.20×10⁷ cells)의 세포 현탁액을 파종한 직후에 GE사 제조 WAVE 배양 백 내의 액량이 300 mL가 되도록 배지(코진바이오가부시키가이샤 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4)를 추가하여, 모듈 습윤 시와 같은 진동 조건으로 약 27시간 세포를 흡착시켰다.

그 후, 리액터의 퍼퓨젼 기능(백 중량 관리 기능)을 이용하여, GE사 제조 WAVE 배양 백 내로부터 세포 배양액을 Harvest 튜브 펌프 경유로 350 mL/day의 속도로 빼내고, 이 빼낸 배지와 동 용량의 상기 배지(KBM ADSC-4)를 Feed 튜브 펌프 경유로 GE사 제조 WAVE 배양 백 내에 송액했다. 회수한 배지는 로슈사 제조 CedexBio를 이용하여 각 대사 파라미터의 변화로 세포 생육 거동을 관찰하여, 장기간에 걸친 안정적인 세포의 증식·생육이 관찰되었다. 글루코오스 소비 및 젖산 생성량의 경시 변화를 도 25(A)에 도시한다.

회수한 세포 배양액 중에 포함되는 1일당 생성된 엑소좀의 수를 후술하는 「제타 전위·입경 분포 측정 장치를 이용한 엑소좀량 측정」의 수순으로 측정한 결과를 도 25(B)에 도시하고, 배양일수 39일째의 입경 분포 측정 결과를 도 25(C)에 도시한다. 약 1개월에 걸친 장기간 연속 배양에 있어서도 안정적으로 엑소좀을 생성하는 것을 확인했다.

비교예 및 실시예에 나타내는 세포 배양일수 13일째의 각종 배양법에 있어서의 1 세포가 하루에 생성하는 엑소좀의 수의 비교를 도 26에 도시한다. 모듈 배양은 Dish 배양과 비교하면 1 세포당 엑소좀 생성력이 매우 높은 것을 확인했다.

제타 전위·입경 분포 측정 장치를 이용한 엑소좀량의 측정

비교예 1 및 실시예 1∼5의 배양 조건으로 회수한 세포 배양액을 고속 냉각 원심기(구보타쇼지가부시키가이샤 제조, Model 6000)를 이용하여 4℃에서 30분간, 10,000 g으로 원심분리를 행하여 데브리스를 제거했다(조제액 1). 0.025 ㎛의 필터(멜크사 제조, 제품명: MF-밀리포아 멤브레인 필터, 형번: VSWP04700)를 이용한 흡인 여과에 의해 미립자를 제거한 PBS(-)(후지필름와코쥰야쿠가부시키가이샤 제조, 판매원 코드: 166-23555)를 이용하여 「조제액 1」을 소정의 농도로 희석했다(조제액 2). 이어서 「조제액 2」를 0.2 ㎛의 시린지 필터(싸토리우스사 제조, 제품명: 미니잘트, 형번: 16534K)를 이용하여 200 nm 이상의 입자를 제거했다(조제액 3). 제타 전위·입경 분포 측정 장치(가부시키가이샤마이크로테크니치온 제조, ZEECOM ZC-3000)를 이용하여, 브라운 운동 궤적 해석으로부터 「조제액 3」에 포함되는 입자의 입경 분포 및 엑소좀 획분의 입자수를 측정했다.

엑소좀을 측정하는 배지를 회수하는 타이밍에, 가부시키가이샤도진카가쿠겐쿠쇼 제조의 Cell Counting Kit-8을 이용하여 세포수를 측정하고, 하기 「식 1」에 의해 1 세포가 1일당 생성하는 엑소좀량을 산출하여, 각 세포 배양 조건에 있어서의 세포의 엑소좀 생성 능력을 비교했다.

식 1: 입자수×샘플 희석 배율×150 nm 이하 입자의 비율×회수 배지량/총 세포수/배지 저장 일수

하기 「식 2」에 의해 각 세포 배양 조건에 있어서의 1일당 엑소좀 생산량의 경시 변화를 측정했다.

식 2: 입자수×샘플 희석률×150 nm 이하 입자의 비율/배지 저장 일수

GeneChip(상표) miRNA 4.0 Array를 이용한 miRNA 어레이 해석

비교예 1 및 실시예 1∼5의 배양 조건으로 회수한 세포 배양액을 고속 냉각 원심기(구보타쇼지가부시키가이샤 제조, Model 6000)를 이용하여 4℃에서 30분간, 10,000 g으로 원심 분리를 행하여 데브리스를 제거했다. 얻어진 상청 8 mL를 Total Exosome Isolation Regent(cell culture media로부터)(Thermo Fisher Scientific사 제조, Cat. #4478359)를 이용하여 폴리머 침전법에 의해 상청으로부터 엑소좀을 추출했다. 이어서, 엑소좀 추출액으로부터 Total Exosome RNA and Protein Isolation Kit(Thermo Fisher Scientific사 제조, Cat. #4478545)를 이용하여 Total RNA를 추출 및 정제한 후, Total RNA 용액의 농도를 Nano Drop 2000(Thermo Fisher Scientific사 제조)으로 측정했다. 얻어진 Total RNA 390 ng를 이용하여, GeneChip(상표) miRNA 4.0 Array(Thermo Fisher Scientific사 제조, Cat. #902445)에 의해, 인간형 miRNA 어레이 해석을 행했다.

비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 1(Bottle(5% 산소)_Day27)의 엑소좀 생성량 비교 및 miRNA 어레이 해석

비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 1(Bottle(5% 산소)_Day27)의 1 세포당 엑소좀 생성량의 비교를 도 27에 도시한다. Dish_Day6에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Bottle(5% 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, 엑소좀 생성 능력이 2.8배 높은 상태인 것을 확인했다.

비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 1(Bottle(5% 산소)_Day27)의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도 28에, 10배 이상의 miRNA의 발현비의 차가 인정된 miRNA를 표 1에 나타낸다.

특허문헌 2에 기재되어 있는 손상되거나 또는 병을 앓은 심장 조직의 치료로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-146a, hsa-miR-210, hsa-miR-22 및 hsa-miR-24의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도 29에 도시한다. Dish_Day6에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Bottle(5% 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, hsa-miR-210-3p는 4.0배, hsa-miR-24a-3p는 17.5배 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

특허문헌 3에 기재되어 있는 구강 편평상피암의 억제로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-34b, hsa-miR-132, hsa-miR-203, hsa-miR-137 및 hsa-miR-193의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 30에 도시한다. Dish_Day6에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Bottle(5% 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, hsa-miR-193a-5p는 5.8배의 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

비특허문헌 6 및 비특허문헌 7에 기재되어 있는 위세포암 혹은 전립선암 세포의 억제로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-26a/b, hsa-miR-23b, hsa-miR-27b 및 hsa-miR-24-1의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 31에 도시한다. Dish_Day6에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Bottle(5% 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, hsa-miR-26a-5p는 36.6배, hsa-miR-23b-3p는 15.4배의 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 1(Bottle(5% 산소)_Day27)의 엑소좀 생성량 비교 및 miRNA 어레이 해석

비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 1(Bottle(5% 산소)_Day27)의 1 세포당 엑소좀 생성량의 비교를 도 32에 도시한다. Dish_Day13에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Bottle(5% 산소) 배양에서는 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, 엑소좀 생성 능력이 2.9배 높은 상태가 되는 것을 확인했다.

비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 1(Bottle(5% 산소)_Day27)의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도 33에, 10배 이상의 miRNA의 발현비의 차가 인정된 miRNA를 표 2에 나타낸다.

특허문헌 2에 기재되어 있는 손상되거나 또는 병을 앓은 심장 조직의 치료로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-146a, hsa-miR-210, hsa-miR-22 및 hsa-miR-24의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 34에 도시한다. 컨플루엔트에 달하기 직전의 Dish_Day13에 대하여, 장기간 연속 안정 배양 상태의 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Bottle(5% 산소) 배양에 있어서도 hsa-miR-24-3p는 5.3배의 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

특허문헌 3에 기재되어 있는 구강 편평상피암의 억제로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-34b, hsa-miR-132, hsa-miR-203, hsa-miR-137 및 hsa-miR-193의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 35에 도시한다. 컨플루엔트에 달하기 직전의 Dish_Day13에 대하여, 장기간 연속 안정 배양 상태의 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Bottle(5% 산소) 배양에 있어서도, Dish_Day13과 동등한 결과를 보였다.

비특허문헌 6 및 비특허문헌 7에 기재되어 있는 위세포암 혹은 전립선암 세포의 억제로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-26a/b, hsa-miR-23b, hsa-miR-27b 및 hsa-miR-24-1의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 36에 도시한다. 컨플루엔트에 달하기 직전의 Dish_Day13에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Bottle(5% 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, hsa-miR-26a-5p는 29.1배, hsa-miR-23b-3p는 6.1배의 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 2(Bottle(통상 산소)_Day27)의 엑소좀 생성량 비교 및 miRNA 해석

비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 2(Bottle(통상 산소)_Day27)의 1 세포당 엑소좀 생성량의 비교를 도 37에 도시한다. Dish_Day6에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Bottle(통상 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, 엑소좀 생성 능력이 2.5배 높은 상태가 되는 것을 확인했다.

비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 2(Bottle(통상 산소)_Day27)의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도 38에, 10배 이상의 miRNA의 발현비의 차가 인정된 miRNA를 표 3에 나타낸다.

특허문헌 2에 기재되어 있는 손상되거나 또는 병을 앓은 심장 조직의 치료로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-146a, hsa-miR-210, hsa-miR-22 및 hsa-miR-24의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 39에 도시한다. Dish_Day6에 대하여, 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Bottle(통상 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, hsa-miR-24-3p는 3.9배의 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

특허문헌 3에 기재되어 있는 구강 편평상피암의 억제로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-34b, hsa-miR-132, hsa-miR-203, hsa-miR-137 및 hsa-miR-193의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 40에 도시한다. 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Bottle(통상 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, Dish_Day6과 같은 정도의 생성량을 보였다.

비특허문헌 6 및 비특허문헌 7에 기재되어 있는 위세포암 혹은 전립선암 세포의 억제로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-26a/b, hsa-miR-23b, hsa-miR-27b 및 hsa-miR-24-1의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 41에 도시한다. 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Bottle(통상 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, Dish_Day6과 같은 정도의 발현량이었다.

비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 2(Bottle(통상 산소)_Day27)의 엑소좀 생성량 비교 및 miRNA 어레이 해석

비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 2(Bottle(통상 산소)_Day27)의 1 세포당 엑소좀 생성량의 비교를 도 42에 도시한다. Dish_Day13에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Bottle(통상 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, 엑소좀 생성 능력이 2.6배 높은 상태인 것을 확인했다.

비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 2(Bottle(통상 산소)_Day27)의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도 43에, 10배 이상의 miRNA의 발현비의 차가 인정된 miRNA를 표 4에 나타낸다.

특허문헌 2에 기재되어 있는 손상되거나 또는 병을 앓은 심장 조직의 치료로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-146a, hsa-miR-210, hsa-miR-22 및 hsa-miR-24의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 44에 도시한다. 컨플루엔트에 달하기 직전의 Dish_Day13에 대하여, 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Bottle(통상 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, hsa-miR-24-3p는 3.4배의 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

특허문헌 3에 기재되어 있는 구강 편평상피암의 억제로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-34b, hsa-miR-132, hsa-miR-203, hsa-miR-137 및 hsa-miR-193의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 45에 도시한다. 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Bottle(통상 산소) 배양의 장기간 연속 안정 배양 상태에 대하여, 컨플루엔트에 달하기 직전의 Dish_Day13은, hsa-miR-193a-5p는 7.0배, hsa-miR-193b-5p는 4.6배 및 hsa-miR-193b-3p는 4.4배 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

비특허문헌 6 및 비특허문헌 7에 기재되어 있는 위세포암 혹은 전립선암 세포의 억제로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-26a/b, hsa-miR-23b, hsa-miR-27b 및 hsa-miR-24-1의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 46에 도시한다. 컨플루엔트에 달하기 직전의 Dish_Day13에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Bottle(통상 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, hsa-miR-26a-5p는 43.8배, hsa-miR-23b-3p는 9.7배, hsa-miR-26a-3p는 3.4배, hsa-miR-27b-3p는 3.1배의 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 3(Reactor(5% 산소)_Day27)의 엑소좀 생성량 비교 및 miRNA 어레이 해석

비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 3(Reactor(5% 산소)_Day27)의 1 세포당 엑소좀 생성량의 비교를 도 47에 도시한다. Dish_Day6에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Reactor(5% 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, 엑소좀 생성 능력이 1.7배 높은 상태인 것을 확인했다.

비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 3(Reactor(5% 산소)_Day27)의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도 48에, 10배 이상의 miRNA의 발현비의 차가 인정된 miRNA를 표 5에 나타낸다.

특허문헌 2에 기재되어 있는 손상되거나 또는 병을 앓은 심장 조직의 치료로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-146a, hsa-miR-210, hsa-miR-22 및 hsa-miR-24의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 49에 도시한다. Dish_Day6에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Reactor(5% 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, hsa-miR-24a-3p는 10.3배의 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

특허문헌 3에 기재되어 있는 구강 편평상피암의 억제로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-34b, hsa-miR-132, hsa-miR-203, hsa-miR-137 및 hsa-miR-193의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 50에 도시한다. 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Reactor(5% 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, Dish_Day6과 같은 정도의 생성량을 보였다.

비특허문헌 6 및 비특허문헌 7에 기재되어 있는 위세포암 혹은 전립선암 세포의 억제로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-26a/b, hsa-miR-23b, hsa-miR-27b 및 hsa-miR-24-1의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 51에 도시한다. Dish_Day6에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Reactor(5% 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, hsa-miR-26a-5p는 5.0배, hsa-miR-23b-3p는 5.4배의 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 3(Reactor(5% 산소)_Day27)의 엑소좀 생성량 비교 및 miRNA 어레이 해석

비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 3(Reactor(5% 산소)_Day27)의 1 세포당 엑소좀 생성량의 비교를 도 52에 도시한다. Dish_Day13에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Reactor(5% 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, 엑소좀 생성 능력이 1.8배 높은 상태인 것을 확인했다.

비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 3(Reactor(5% 산소)_Day27)의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도 53에, 10배 이상의 miRNA의 발현비의 차가 인정된 miRNA를 표 6에 나타낸다.

특허문헌 2에 기재되어 있는 손상되거나 또는 병을 앓은 심장 조직의 치료로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-146a, hsa-miR-210, hsa-miR-22 및 hsa-miR-24의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 54에 도시한다. 컨플루엔트에 달하기 직전의 Dish_Day13에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Reactor(5% 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, hsa-miR-24-3p가 3.4배의 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

특허문헌 3에 기재되어 있는 구강 편평상피암의 억제로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-34b, hsa-miR-132, hsa-miR-203, hsa-miR-137 및 hsa-miR-193의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 55에 도시한다. 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Reactor(5% 산소) 배양의 장기간 연속 안정 배양 상태에 대하여 컨플루엔트에 달하기 직전의 Dish_Day13은, hsa-miR-193a-5p는 5.2배, hsa-miR-193b-5p는 2.9배 및 hsa-miR-193b-3p는 5.4배 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

비특허문헌 6 및 비특허문헌 7에 기재되어 있는 위세포암 혹은 전립선암 세포의 억제로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-26a/b, hsa-miR-23b, hsa-miR-27b 및 hsa-miR-24-1의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 56에 도시한다. 컨플루엔트에 달하기 직전의 Dish_Day13에 대하여, 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Reactor(5% 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, hsa-miR-26a-5p는 4.0배의 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 4(Reactor(통상 산소)_Day27)의 엑소좀 생성량 비교 및 miRNA 어레이 해석

비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 4(Reactor(통상 산소)_Day27)의 1 세포당 엑소좀 생성량의 비교를 도 57에 도시한다. Dish_Day6에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Reactor(통상 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, 엑소좀 생성 능력이 2.6배 높은 상태인 것을 확인했다.

비교예 1(Dish_Day6)과 실시예 4(Reactor(통상 산소)_Day27)의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도 58에 도시한다. 10배 이상의 miRNA의 발현비의 차가 인정된 miRNA를 표 7에 도시한다.

특허문헌 2에 기재되어 있는 손상되거나 또는 병을 앓은 심장 조직의 치료로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-146a, hsa-miR-210, hsa-miR-22 및 hsa-miR-24의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 59에 도시한다. Dish_Day6에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Reactor(통상 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서, hsa-miR-24-3p는 10.1배의 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

특허문헌 3에 기재되어 있는 구강 편평상피암의 억제로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-34b, hsa-miR-132, hsa-miR-203, hsa-miR-137 및 hsa-miR-193의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 60에 도시한다. Dish_Day6에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Reactor(통상 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, 동등한 생성량을 보였다.

비특허문헌 6 및 비특허문헌 7에 기재되어 있는 위세포암 혹은 전립선암 세포의 억제로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-26a/b, hsa-miR-23b, hsa-miR-27b 및 hsa-miR-24-1의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 61에 도시한다. Dish_Day6에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Reactor(통상 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, hsa-miR-26a-5p는 55.0배, hsa-miR-23b-3p는 24.2배, hsa-miR-27b-3p는 4.2배의 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 4(Reactor(통상 산소)_Day27)의 엑소좀 생성량 비교 및 miRNA 어레이 해석

비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 4(Reactor(통상 산소)_Day27)의 1 세포당 엑소좀 생성량의 비교를 도 62에 도시한다. Dish_Day13에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Reactor(통상 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, 엑소좀 생성 능력이 2.7배 높은 상태인 것을 확인했다.

비교예 1(Dish_Day13)과 실시예 4(Reactor(통상 산소)_Day27)의 miRNA 어레이 해석의 Scatterplot를 도 63에, 10배 이상의 miRNA의 발현비의 차가 인정된 miRNA를 표 8에 나타낸다.

특허문헌 2에 기재되어 있는 손상되거나 또는 병을 앓은 심장 조직의 치료로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-146a, hsa-miR-210, hsa-miR-22 및 hsa-miR-24의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 64에 도시한다. Dish_Day13에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Reactor(통상 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서, hsa-miR-24-3p는 3.4배의 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

특허문헌 3에 기재되어 있는 구강 편평상피암의 억제로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-34b, hsa-miR-132, hsa-miR-203, hsa-miR-137 및 hsa-miR-193의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 65에 도시한다. 컨플루엔트에 달하기 직전의 Dish_Day13에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Reactor(통상 산소) 배양의 장기간 연속 안정 배양 상태는, hsa-miR-193a-5p는 7.0배, hsa-miR-193b-5p는 4.6배 및 hsa-miR-193b-3p는 4.4배 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

비특허문헌 6 및 비특허문헌 7에 기재되어 있는 위세포암 혹은 전립선암 세포의 억제로서 유효한 miRNA인, hsa-miR-26a/b, hsa-miR-23b, hsa-miR-27b 및 hsa-miR-24-1의 miRNA 어레이 해석의 결과를 도 66에 도시한다. 컨플루엔트에 달하기 직전의 Dish_Day13에 대하여 폴리이미드 다공질막 모듈을 이용한 Reactor(통상 산소) 배양은 장기간 연속 안정 배양 상태에 있어서도, hsa-miR-26a-5p는 43.8배, hsa-miR-23b-3p는 9.7배, hsa-miR-26 b-3p는 3.4배, hsa-miR-27 b-3p는 3.2배의 높은 생성량을 보이고, 그 밖의 miRNA에 관해서는 같은 정도의 발현량이었다.

실시예 6: WAVE 리액터에서 모듈을 이용한 세포 배양

실시예 5와 유사한 방법으로 사전에 배지(Ham's F-12 배지; 후지필름와코쥰야쿠사 제조_글루타민·페놀 레드 함유)로 2일간 이상 습윤시킨 모듈 60개를 넣은 GE사 제조 WAVE 배양 백(CELLBAG DISPOSABLE BIOREACTOR Part# CB0002L11-33) 내에 배지(코진바이오사 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4R)를 250 mL 주입하여 가하고, GE사 제조 WAVE 리액터(ReadyToProcess WAVE25)에 설치한 후, CO₂ 5%, 온도 37℃, 진동 속도 15 rpm, 진동 각도 9°의 조건으로 약 1시간 교반하여 모듈을 진탕했다.

디쉬로 배양한 4계대째의 간엽계 줄기세포(21Y Male; ATCC사 제조 Lot 70011721)를 Gibco사 제조 Trypsin-EDTA(0.05%), 페놀 레드를 사용하여 벗기고, 배지(코진바이오사 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4R) 11 mL로 현탁했다. 모듈 내부의 배양 기재 폴리이미드 다공질막의 면적 1 ㎠당 1.0×10⁴ cells(Total: 1.1×10⁷ cells)의 세포 현탁액을 파종하고, 모듈 습윤 시와 같은 진동 조건으로 세포를 흡착시켜, 장기간 배양을 시작했다.

3일간 같은 조건으로 진동 배양을 계속한 후, 리액터의 퍼퓨젼 기능(백 중량 관리 기능)을 이용하여, GE사 제조 WAVE 배양 백 내로부터 세포 배양액을 Harvest 튜브 펌프 경유로 110 mL/day의 속도에 빼내고, 이 빼낸 배지와 같은 용량의 배지(글루코오스 조정 KBM ADSC-4R)을 Feed 튜브 펌프 경유로 GE사 제조 WAVE 배양 백 내에 송액했다. 또한, WAVE25 부속의 harvest 펌프로는 송액 속도가 지나치게 크기 때문에, 아즈원사 제조 마이크로튜브 펌프 셋트 FP100-1을 이용하여 배지 회수는 실시했다. 회수한 배지는 로슈사 제조 CedexBio를 이용하여 각 대사 파라미터의 변화로 세포 생육 거동을 관찰하여, 장기간에 걸친 안정된 세포의 증식·생육이 관찰되었다. 또한, 필요한 시기에, 도진카가쿠겐큐쇼 제조 Cell Counting Kit-8에 의한 정색(呈色) 반응을 이용하여, 백 내 모듈에 생육된 총 세포수를 측정하여, 세포의 생육 상황을 확인했다. 글루코오스 소비 및 젖산 생성량의 경시 변화를 도 67에 도시한다. 또한, 글루코오스 소비량의 증대로 부족이 예상된 경우에는, 고갈을 피하기 위해서 글루코오스액 첨가에 의해 글루코오스 농도를 조정했다.

회수한 세포 배양액 중에 포함되는 1일당 생성된 엑소좀의 수를 측정하기 위해서, 약 20일마다의 회수 배지를 하나의 로트로서 통합하여 5개의 회수액을 작성했다. 0.2 ㎛의 필터로 이물을 제거한 후, 각 액을 상술한 「제타 전위·입경 분포 측정 장치를 이용한 엑소좀량 측정」의 수순으로 측정한 결과를 표 9에 나타냈다. 배양일수 100일을 대표하는 5개의 회수액에 있어서 안정적인 엑소좀 생성이 계속되는 것을 확인했다.

또한, 이들 5 샘플(배양 회수액)을 Tangential Flow filtration 법(Sartorius사 제조 VIVAFLOW 200 100,000 MWCO HY)로 30배∼50배 정도로 농축 후, 농축액의 반량의 ThermoFisher사 제조 Total Exosome Isolation Reagent(cell culture media로부터)를 첨가하여 교반·밤새 냉장 정치·원심(10000 G/60 min)에 의해 생긴 침전체를 분리했다. 이 침전물에 제거한 액과 같은 정도 양의 DPBS를 주입하여 가하여 현탁 용해하고, 또한 0.2 ㎛ 필터로 이물 제거한 것을 취득 엑소좀액으로 했다. 이와 같이 하여 배양 기간마다의 엑소좀액 5 샘플을 취득했다.

이 5 샘플에 관해서 상술한 「제타 전위·입경 분포 측정 장치를 이용한 엑소좀량 측정」의 수순으로 측정했다. 또한, 인간 유래 엑소좀 정량용 CD9/CD63ELISA 키트(코스모바이오사 제조; 품번_EXH0102EL)를 이용하여, 엑소좀량을 CD63의 단백량으로서 정량했다. 엑소좀량 평가 결과를 표 10에, 엑소좀 입도 분포 결과를 도 68에 도시한다.

상기한 각 엑소좀 샘플에 관해서, 실시예 5에서 나타낸 GeneChip(상표) miRNA 4.0 Array를 이용한 miRNA 어레이 해석을 실시했다. 유전자 발현 비교 해석을 행한 결과, 배양 기간에 상관없이 안정적인 엑소좀 내의 유전자 발현이 확인되었다(도 76).

상기 실시예와 같은 방법으로 얻어진 엑소좀을, 겔 여과 컬럼(HiLoad 16/600 Superdex200 prep grade)으로 정제 후, 한외여과막을 이용하여 농축한 후에 TEM(투과형 전자현미경) 관찰을 행했다. 카본 지지막 구비 Cu 메쉬에 대하여 시료 용액을 흡착시킨 후, 세정, 염색, 세정, 건조하여, TEM 관찰용 시료를 제작했다. 니혼덴시 제조 JEM-2100F형 전계방사형 투과 전자현미경을 이용하여 촬상했다. 측정예를 도 69에 도시한다.

실시예 7: WAVE 리액터에서 모듈을 이용한 세포 배양

실시예 5와 유사한 방법으로 사전에 배지(Ham's F-12 배지; 후지필름와코쥰야쿠사 제조_글루타민·페놀 레드 함유)로 2일간 이상 습윤시킨 모듈 70개를 넣은 GE사 제조 WAVE 배양 백(CELLBAG DISPOSABLE BIOREACTOR Part# CB0002L11-03) 내에 배지(코진바이오사 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4R)를 250 mL 주입하여 가하고, GE사 제조 WAVE 리액터(Xuri Cell Expansion System W5)에 설치 후, CO₂ 5%, 온도 37℃, 진동 속도 11 rpm, 진동 각도 9°의 조건으로 약 1시간 교반하여 모듈을 진탕했다.

디쉬로 배양한 2계대째의 간엽계 줄기세포(21Y Male; ATCC사 제조 Lot 70011721)를 Gibco사 제조 Trypsin-EDTA(0.05%), 페놀 레드를 사용하여 벗기고, 배지(코진바이오사 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4R) 11 mL로 현탁했다. 모듈 내부의 배양 기재 폴리이미드 다공질막의 면적 1 ㎠당 1.0×10⁴ cells(Total: 1.3×10⁷ cells)의 세포 현탁액을 파종하고, 모듈 습윤 시와 같은 진동 조건으로 세포를 흡착시켜, 장기간 배양을 시작했다. 또한, 모듈에의 간엽계 줄기세포 파종과 같은 시기에 IWAKI 제조 콜라겐 타입 1 코트 디쉬에의 계대 파종도 행하여, 엑소좀 생성 비교 실험을 위한 배양을 실시했다.

3일간 같은 조건으로 진동 배양을 계속한 후, 리액터 액세서리(Xuri Cell Expansion System W5 Perfusion Controller)의 퍼퓨젼 기능(백 중량 관리 기능)을 이용하여, 약 3시간 간격으로 Harvest 튜브 펌프 경유로 GE사 제조 WAVE 배양 백 내로부터 세포 배양액을 약 20 mL 빼내고, 이 빼낸 배지와 같은 용량의 배지(글루코오스 조정 KBM ADSC-4R)를 Feed 튜브 펌프 경유로 GE사 제조 WAVE 배양 백 내에 송액하여, 150 mL/day의 액 교환을 실시했다. 회수한 배지는 로슈사 제조 CedexBio를 이용하여 각 대사 파라미터의 변화로 세포 생육 거동을 관찰하여, 장기간에 걸친 안정적인 세포의 증식·생육이 관찰되었다. 또한, 14일·21일·28일·50일에, 도진카가쿠겐큐쇼 제조 Cell Counting Kit-8에 의한 정색 반응을 이용하여, 백 내 모듈에 생육된 인간 간엽계 줄기세포의 1 ㎠당 세포 밀도 및 백 내의 총 세포수를 측정하여, 세포의 생육 상황을 확인했다. 표 11에 측정 결과를 나타낸다.

회수한 세포 배양액 중에 포함되는 1일당 생성된 엑소좀의 수를 측정하기 위해서, 정기적으로 샘플을 빼내어, 0.2 ㎛의 필터로 이물을 제거한 후, 각 액을 상술한 「제타 전위·입경 분포 측정 장치를 이용한 엑소좀량 측정」의 수순으로 측정했다. 측정 결과를 다른 세포에서의 운전 결과를 포함하여 도 70에 도시한다. 도면에서 인간 간엽계 줄기세포 WAVE 리액터(1)가 상기 실험 결과를 보여주고 있다. 결과로부터 명확한 것과 같이, 본 배양 방법에서는 배양일수 50일 동안에 안정적인 엑소좀 생성이 계속되고 있음을 확인했다.

또한, 엑소좀 비교를 위해서 IWAKI 제조 콜라겐 타입 1 코트 디쉬로, 코진바이오사 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4R로 배양하고 있었던 동 간엽계 줄기세포로부터 배양 14일째에 회수한 배양 상청과, 상기 WAVE 리액터에 의한 연속 배양계에서의 50일째 회수 배지를 이용하여, 실시예 5에서 기재한 GeneChip(상표) miRNA 4.0 Array를 이용한 miRNA 어레이 해석을 실시했다. 결과를 도 71에 도시한다.

2종의 다른 배양 조건에 관해서 miRNA 발현량의 비교를 동량의 RNA 사이에서 평준화하여 분포로서 나타내고 있다. 좌측에는 인간형 miRNA의 전체 분포를, 우측에는 miR21∼24에 한정한 부분 분포를 나타냈다. 좌측 도면의 비교로부터 분명한 것과 같이, RNA량이 동일하여도 전반적으로 모듈 배양계에서 miRNA의 발현량이 많아지고 있음이 확인된다. 또한, 이 경향과는 반대로, miR-22-3p의 발현량은 모듈 배양보다도 플레이트 배양에 있어서 증가가 확인되었다. miR-22는 세포의 노화와 함께 발현량이 증가하는 것이 알려져 있는 miRNA이다. 모듈 배양의 기간은 비교 대상이 된 플레이트에서의 평면 배양보다도 3배 이상 긴 기간을 배양하고 있음에도 불구하고, 동 노화 관련 miRNA의 발현량은 플레이트 배양계 쪽이 3배 이상 많다는 것을 알아냈다. 모듈 배양에 의해 특성을 양호하게 유지하여 장기간 세포를 배양할 수 있다는 것이 확인되었다.

실시예 8: WAVE 리액터에서 모듈을 이용한 세포 배양

실시예 5와 유사한 방법으로 사전에 배지(Ham's F-12 배지; 후지필름와코쥰야쿠사 제조_글루타민·페놀 레드 함유)로 2일간 이상 습윤시킨 모듈 55개 및 2형 모듈 55개를 넣은 2개의 GE사 제조 WAVE 배양 백(CELLBAG DISPOSABLE BIOREACTOR Part# CB0002L11-03) 내에 배지(코진바이오사 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4R)를 250 mL 주입하여 가하고, GE사 제조 WAVE 리액터(Xuri Cell Expansion System W5)에 설치 후, CO₂ 5%, 온도 37℃, 진동 속도 13 rpm, 진동 각도 9°의 조건으로 약 1시간 교반하여 모듈을 진탕했다.

디쉬로 배양한 2계대째의 간엽계 줄기세포(25Y Male; Lonza사 제조 Lot 00451491)를 Gibco사 제조 Trypsin-EDTA(0.05%), 페놀 레드를 사용하여 벗기고, 배지(코진바이오사 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4R) 11 mL로 현탁했다. 모듈 내부의 배양 기재 폴리이미드 다공질막의 면적 1 ㎠당 1.0×10⁴ cells(Total: 1.3×10⁷ cells)의 세포 현탁액을 파종하고, 모듈 습윤 시와 같은 진동 조건으로 세포를 흡착시켜, 장기간 배양을 시작했다.

3일간 같은 조건으로 진동 배양을 계속한 후, 리액터 액세서리(Xuri Cell Expansion System W5 Perfusion Controller)의 퍼퓨젼 기능(백 중량 관리 기능)을 이용하여, 약 3시간 간격으로 Harvest 튜브 펌프 경유로 GE사 제조 WAVE 배양 백 내로부터 세포 배양액을 약 20 mL 빼내고, 이 빼낸 배지와 같은 용량의 배지(글루코오스 조정 KBM ADSC-4R)를 Feed 튜브 펌프 경유로 GE사 제조 WAVE 배양 백 내에 송액하여, 150 mL/day의 액 교환을 실시했다. 회수한 배지는 로슈사 제조 CedexBio를 이용하여 각 대사 파라미터의 변화로 세포 생육 거동을 관찰하여, 장기간에 걸친 안정적인 세포의 증식·생육이 관찰되었다. 또한, 7일·14일·21일·29일·48일에, 도진카가쿠겐큐쇼 제조 Cell Counting Kit-8에 의한 정색 반응을 이용하여, 백 내 모듈에 생육된 세포의 1 ㎠당 생육수를 세포 밀도로서 나타내고, 측정 시의 회수 배지 내에 방출된 엑소좀의 입자수를 측정함으로써, 세포의 생육 상황과 연속적인 엑소좀 생성 거동을 확인했다. 표 12에 측정 결과를 나타낸다.

또한, 다른 실험과의 정합성 확인을 위해, 도 70에 엑소좀 생성 거동을 도시하고 있다. 통상 모듈 실험 결과를 인간 간엽계 줄기세포 WAVE 리액터(2)로서, 2형 모듈 실험 결과를 동 리액터(3)로서 도면에 도시했다.

실시예 9: 오버플로우 리액터에서의 골아세포 장기간 모듈 배양

사전에 배지(Ham's F-12 배지; 후지필름와코쥰야쿠사 제조_글루타민·페놀 레드 함유)로 2일간 이상 습윤시킨 모듈 50개를 넣은 오버플로우 리액터 배양 용기 내에 배지(코진바이오가부시키가이샤 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4)를 100 mL 주입하여 가하고, CO₂ 5%, 37℃로 설정한 N-BIOTEK사 제조 가습 대응 쉐이커 탑재 CO₂ 인큐베이터(aniCell) 내에 설치 후, 회전 속도 80 rpm으로 모듈을 약 1시간 교반 진탕했다.

Corning사 제조 세포 배양 FALCON 디쉬로 배양한 6계대째의 PromoCell사 제조 인간 골아세포(Y30 female_439Z037.2)를 Gibco사 제조 Trypsin-EDTA(0.05%), 페놀 레드를 사용하여 벗기고, 원심·세포 회수 후 상기 배지(KBM ADSC-4) 9 ml로 현탁했다. 모듈 내부의 배양 기재 폴리이미드 다공질막의 면적 1 ㎠당 1.0×10⁴ cells(Total; 9.0×10⁶ cells)의 세포 현탁액을 오버플로우 리액터 배양 용기 내에 주입하여 가한 후, 회전 속도 80 rpm의 교반 조건 하에서 세포의 흡착과 배양을 시작했다.

세포 흡착 후, 배지(글루코오스 조정 KBM ADSC-4)를 튜브 펌프로 100 mL/day의 속도로 오버플로우 리액터 배양 용기 내에 송액을 시작하고, 배양 용기 벽면에 설치한 배지의 회수구로부터 흘러넘친 배지를 회수액 저장 보틀로 회수했다. 회수한 배지는 로슈사 제조 CedexBio를 이용하여 회수액의 각 대사 파라미터의 변화로 세포 생육 거동을 관찰하고, 세포의 글루코오스 등의 소비 상황에 따라 송액량·회전 속도를 적시에 변동시켜, 장기간 세포 배양을 행했다. 글루코오스 소비량 및 젖산 생성량의 경시 변화를 도 72에 도시한다. 200일의 장기간에 걸친 안정적인 글루코오스 소비 및 젖산 생성이 관찰되었다.

회수 배지 내의 엑소좀 생성량을 측정하기 위해서, 상술한 「제타 전위·입경 분포 측정 장치를 이용한 엑소좀량 측정」의 수순으로 측정한 결과를 표 13에 나타낸다. 대사 거동과 마찬가지로 100일 이상의 장기간에 걸친 안정적인 엑소좀 생성 거동이 확인되었다.

배양 기간 동안 회수된 배지는, 시기별로 정리한 후에 필터 여과하고, 또한 Tangential Flow filtration법(Sartorius사 제조 VIVAFLOW 200 100,000 MWCO HY)으로 농축한 후, Thermo Fisher사 제조 Total Exosome Isolation Reagent(cell culture media로부터)를 첨가하여 교반·냉장 정치·원심(10000 G/60 min)으로 침전체로서 엑소좀 전구체를 얻었다. 여기에 적량의 DPBS를 주입하여 가하고, 0.2 ㎛ 필터로 이물 제거한 것을 취득 엑소좀액으로 했다. 이와 같이 하여 배양 기간마다의 엑소좀액을 취득했다.

이 중에서, Day72∼Day93 및 Day108∼Day122의 2 샘플을 선택하여, miRNA 어레이 측정으로 각 miRNA의 발현량 비교를 행했다. 결과를 도 73에 나타낸다.

시험 결과로부터 분명한 것과 같이, 양 엑소좀 샘플에 관해서 발현 miRNA량에 거의 차이가 보이지 않고, 품질적으로 안정적인 엑소좀이 장기간에 걸쳐 얻어지고 있다는 것이 분명하게 되었다.

실시예 10: WAVE 리액터에서의 골아세포 장기간 모듈 배양

사전에 배지(Ham's F-12 배지; 후지필름와코쥰야쿠사 제조_글루타민·페놀 레드 함유)로 2일간 이상 습윤시킨 모듈 70개를 넣은 WAVE 리액터 배양 용기 내에 배지(코진바이오가부시키가이샤 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4R)를 100 mL 주입하여 가하고, GE사 제조 WAVE 배양 백(CELLBAG DISPOSABLE BIOREACTOR Part# CB0002L11-03) 내에 배지(코진바이오사 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4R)를 250 mL 주입하여 가하고, GE사 제조 WAVE 리액터(Xuri Cell Expansion System W5)에 설치 후, CO₂ 5%, 온도 37℃, 진동 속도 15 rpm, 진동 각도 9°의 조건으로 약 1시간 교반하여 모듈을 진탕했다.

Corning사 제조 세포 배양 FALCON 디쉬로 배양한 3계대째의 PromoCell사 제조 인간 골아세포(Y30 female_439Z037.2)를 Gibco사 제조 Trypsin-EDTA(0.05%), 페놀 레드를 사용하여 벗기고, 원심·세포 회수 후에 상기 배지(KBM ADSC-4R) 13 ml로 현탁했다. 모듈 내부의 배양 기재 폴리이미드 다공질막의 면적 1 ㎠당 1.0×10⁴ cells(Total; 1.3×10⁷ cells)의 세포 현탁액을 WAVE 리액터 배양 용기 내에 주입하여 가한 후, 진동 속도 15 rpm, 진동 각도 9°의 진동 조건 하에서 세포의 흡착과 배양을 시작했다.

3일간 같은 조건으로 진동 배양을 계속한 후, 리액터 액세서리(Xuri Cell Expansion System W5 Perfusion Controller)의 퍼퓨젼 기능(백 중량 관리 기능)을 이용하여, 약 3시간 간격으로 Harvest 튜브 펌프 경유로 GE사 제조 WAVE 배양 백 내로부터 세포 배양액을 약 20 mL 빼내고, 이 빼낸 배지와 같은 용량의 배지(글루코오스 조정 KBM ADSC-4R)를 Feed 튜브 펌프 경유로 GE사 제조 WAVE 배양 백 내에 송액하여, 150 mL/day의 액 교환을 실시했다. 회수한 배지는 로슈사 제조 CedexBio를 이용하여 각 대사 파라미터의 변화로 세포 생육 거동을 관찰하여, 장기간에 걸친 안정적인 세포의 증식·생육이 관찰되었다. 또한, 8일·22일·36일·58일에, 도진카가쿠겐큐쇼 제조 Cell Counting Kit-8에 의한 정색 반응을 이용하여, 백 내 모듈에 생육된 인간 골아세포의 1 ㎠당 세포 밀도 및 백 내의 총 세포수를 측정하여, 세포의 생육 상황을 확인했다. 결과를 표 14에 나타낸다. 또한, 회수 배지 내의 엑소좀 생성량을 측정하기 위해서, 상술한 「제타 전위·입경 분포 측정 장치를 이용한 엑소좀량 측정」의 수순으로 측정한 결과를 표 15에 나타낸다. 대사 거동과 마찬가지로 130일 이상의 장기간에 걸친 안정적인 엑소좀 생성 거동이 확인되었다.

실시예 11: 오버플로우 리액터에서의 태아 심근세포 장기간 모듈 배양

사전에 배지(Ham's F-12 배지; 후지필름와코쥰야쿠사 제조_글루타민·페놀레 드 함유)로 2일간 이상 습윤시킨 모듈 40개를 넣은 오버플로우 리액터 배양 용기 내에 배지(코진바이오가부시키가이샤 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4)를 100 mL 주입하여 가하고, CO₂ 5%, 37℃로 설정한 N-BIOTEK사 제조 가습 대응 쉐이커 탑재 CO₂ 인큐베이터(aniCell) 내에 설치 후, 회전 속도 80 rpm으로 모듈을 약 1시간 교반 진탕했다.

Corning사 제조 세포 배양 FALCON 디쉬로 배양한 1계대째의 SicenCell사 제조 인간 태아 심근세포(Lot. No. 21757)를 Gibco사 제조 Trypsin-EDTA(0.05%), 페놀 레드를 사용하여 벗기고, 원심·세포 회수 후에 상기 배지(KBM ADSC-4) 7.2 ml로 현탁했다. 모듈 내부의 배양 기재 폴리이미드 다공질막의 면적 1 ㎠당 1.0×10⁴ cells(Total; 7.2×10⁶ cells)의 세포 현탁액을 오버플로우 리액터 배양 용기 내에 주입하여 가한 후, 회전 속도 80 rpm의 교반 조건 하에서 세포의 흡착과 배양을 시작했다.

24시간 후, 배지(글루코오스 조정 KBM ADSC-4)를 튜브 펌프로 100 mL/day의 속도로 오버플로우 리액터 배양 용기 내에 송액을 시작하고, 배양 용기 벽면에 설치한 배지의 회수구로부터 흘러넘친 배지를 회수액 저장 보틀로 회수했다. 회수한 배지는 로슈사 제조 CedexBio를 이용하여 회수액의 각 대사 파라미터의 변화로 세포 생육 거동을 관찰하고, 세포의 글루코오스 등의 소비 상황에 따라 송액량·회전 속도를 적시에 변동시켜, 장기간 세포 배양을 행했다. 글루코오스 소비량 및 젖산 생성량의 경시 변화를 도 74에 도시한다. 80일의 장기간에 걸친 안정적인 글루코오스 소비 및 젖산 생성이 관찰되었다.

14일·38일·93일·114일에, 도진카가쿠겐큐쇼 제조 Cell Counting Kit-8에 의한 정색 반응을 이용하여, 백 내 모듈에 생육된 인간 태아 심근세포의 1 ㎠당 세포 밀도 및 리액터 내의 총 세포수를 측정하여, 세포의 생육 상황을 확인했다. 결과를 표 16에 나타낸다. 당초부터 매우 높은 증식성을 보였기 때문에, 배양 기간 동안 거의 동수 정도의 세포 밀도가 유지되고 있음이 측정으로부터 드러났다. 글루코오스 소비 및 젖산 생성량으로부터도 같은 거동이 상정되었다.

회수 배지 내의 엑소좀 생성량을 측정하기 위해서, 상술한 「제타 전위·입경 분포 측정 장치를 이용한 엑소좀량 측정」의 수순으로 측정한 결과를 표 17에 나타낸다. 대사 거동과 마찬가지로 100일 이상의 장기간에 걸친 안정적인 엑소좀 생성 거동이 확인되었다.

실시예 12: WAVE 리액터에서의 태아 심근세포 장기간 모듈 배양

사전에 DPBS(후지필름와코쥰야쿠사 제조)로 2일간 이상 습윤시킨 2형 모듈 50개를 넣은 GE사 제조 WAVE 배양 백(CELLBAG DISPOSABLE BIOREACTOR Part# CB0002L11-03) 내에 배지(코진바이오사 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4R)를 250 mL 주입하여 가하고, GE사 제조 WAVE 리액터(Xuri Cell Expansion System W5)에 설치 후, CO₂ 5%, 온도 37℃, 진동 속도 15 rpm, 진동 각도 9°의 조건으로 약 1시간 교반하여 모듈을 진탕했다.

Corning사 제조 세포 배양 FALCON 디쉬로 배양한 4계대째의 SicenCell사 제조 인간 태아 심근세포(Lot. No. 21757)를 Gibco사 제조 Trypsin-EDTA(0.05%), 페놀 레드를 사용하여 벗기고, 원심·세포 회수 후에 상기 배지(KBM ADSC-4R) 10 ml로 현탁했다. 모듈 내부의 배양 기재 폴리이미드 다공질막의 면적 1 ㎠당 1.0×10⁴ cells(Total; 1.0×10⁷ cells)의 세포 현탁액을 WAVE 리액터 배양 용기 내에 주입하여 가한 후, 진동 속도 11 rpm, 진동 각도 7°의 진동 조건 하에서 세포의 흡착과 배양을 시작했다.

3일간 같은 조건으로 진동 배양을 계속한 후, 리액터 액세서리(Xuri Cell Expansion System W5 Perfusion Controller)의 퍼퓨젼 기능(백 중량 관리 기능)을 이용하여, 약 3시간 간격으로 Harvest 튜브 펌프 경유로 GE사 제조 WAVE 배양 백 내로부터 세포 배양액을 약 20 mL 빼내고, 이 빼낸 배지와 같은 용량의 배지(글루코오스 조정 KBM ADSC-4R)를 Feed 튜브 펌프 경유로 GE사 제조 WAVE 배양 백 내에 송액하여, 150 mL/day의 액 교환을 실시했다. 회수한 배지는 로슈사 제조 CedexBio를 이용하여 각 대사 파라미터의 변화로 세포 생육 거동을 관찰하여, 장기간에 걸친 안정적인 세포의 증식·생육이 관찰되었다. 또한, 7일·14일·21일·35일에, 도진카가쿠겐큐쇼 제조 Cell Counting Kit-8에 의한 정색 반응을 이용하여, 백 내 모듈에 생육된 인간 태아 심근세포의 1 ㎠당 세포 밀도 및 백 내의 총 세포수를 측정하여, 태아 심근세포 특유의 양호한 세포 생육 상황을 확인했다. 결과를 표 18에 나타낸다.

또한, 회수 배지 내의 엑소좀 생성량을 측정하기 위해서, 배출 배지를 대략 20일분씩 정리하여, 3개의 회수 원액 로트를 준비했다. 이들을 필터 여과한 후에, 실시예 6과 마찬가지로, 「제타 전위·입경 분포 측정 장치를 이용한 엑소좀량 측정」의 수순으로 측정함과 더불어, ELISA법으로 엑소좀 생성량을 CD63의 단백량으로서 측정한 결과를 표 19에 나타낸다. 배양 시작 시기를 제외하고, 안정적인 엑소좀 생성 거동이 확인되었다.

실시예 13: 에를렌마이어 및 소편 다공막에서의 연골세포 모듈 배양

사전에 DPBS(후지필름와코쥰야쿠사 제조)로 2일간 이상 습윤시킨 2형 모듈 5개를 넣은 Thermo Fisher Scientfic사 제조 125 mL 에를렌마이어 및 동 250 mL 에를렌마이어와, 멸균 완료한 폴리이미드 다공질막 소편(1 mm×1 mm) 120 ㎠를 넣은 코닝사 제조 125 ml 각형 PET제 스토리지 보틀(45 mm 캡 구비)을 준비한다. 에를렌마이어 플라스크에는 글루코오스치를 3000 mg/L로 조정한 배지(코진바이오사 제조 제노프리 배지; KBM ADSC-4R)를 20 mL 주입하여 가하고, 소편 다공막이 들어간 각형 코닝 보틀에는 동 배지 30 ml를 주입하여 가한다.

IWAKI 콜라겐 I 코트 디쉬로 배양한 4계대째의 PromoCell사 제조 인간 연골세포(Y30 female_439Z037.3)를 Gibco사 제조 Trypsin-EDTA(0.05%), 페놀 레드를 사용하여 벗기고, 원심·세포 회수 후에 배지(글루코오스 조정 KBM ADSC-4R)로 현탁했다. 모듈 내부의 배양 기재 폴리이미드 다공질막 및 폴리이미드 다공질막 소편의 면적 1 ㎠당 1.0×10⁴ cells(에를렌마이어 플라스크에는 Total; 1.0×10⁶ cells, 또한, 소편 다공막에는 Total; 1.2×10⁶ cells)의 세포 현탁액을 1 ml당 1.0×10⁶ cells의 현탁 세포 밀도로 주입하여 가했다. 에를렌마이어 플라스크에서의 배양은 상술한 aniCell에서의 진탕배양기를 이용하고, 또한, 소편 다공막에서의 연골세포 배양은 CO₂ 인큐베이터를 이용한 정치 배양으로 각각 행하는 것으로 했다.

배양 다음날에는, 에를렌마이어 플라스크에는 추가로 10 ml의 글루코오스 조정 KBM ADSC-4R 배지를 가하고, 상술한 aniCell을 이용하여 80 rpm으로 선회 진탕 배양을 행하고, 주 2회 정도의 배지 교환을 행하면서 배양을 계속했다. 에를렌마이어 플라스크에서의 모듈 배양(2형 모듈 5개) 및 소편 다공막 배양(폴리이미드 다공질막 소편 120 ㎠) 모두 30 ml의 배지로 배양했다. 8일·15일·20일·35일에, 도진카가쿠겐큐쇼 제조 Cell Counting Kit-8에 의한 정색 반응을 이용하여, 각 리액터 내 모듈 및 다공막 소편에 생육된 총 세포수를 측정했다. 각 리액터 특유의 증식 거동으로 인간 연골세포의 양호한 세포 생육 상황을 확인했다. 세포 밀도 및 총 세포수를 도 75에 도시한다. 작은 배양 용기를 이용하여, 안정적이면서 또한 장기간 대량의 세포를 용이하게 다양한 형태로 배양할 수 있다는 것이 드러났다.

또한, 배양 19일째에 있어서의 회수 배지 내의 엑소좀 생성량을 ELISA법으로 엑소좀 생성량을 CD63의 단백량으로서 측정한 바, 3일간 저장으로, 에를렌마이어125 ml 용기 사용 모듈에서는 218 pg/ml의, 또한 250 ml 용기 사용 모듈에서는 141 pg/ml의, 소편 다공막에서의 배양계에서는 117 pg/ml의 엑소좀 생성이 확인되었다. 상술한 연속 배양계와 마찬가지로 간헐 배양계에 있어서도 효율적이면서 또한 안정적인 엑소좀 생성이 확인되었다.

Claims

세포를 이용하여 엑소좀을 생성하는 방법으로서,
세포를 세포 배양 모듈에 적용하여 세포를 배양하는 공정, 및
세포에 의해 엑소좀을 생성시키는 공정
을 포함하고, 여기서 상기 세포 배양 모듈이
폴리머 다공질막과
2 이상의 배지 유출 입구를 가지며, 상기 폴리머 다공질막이 수용된 케이싱
을 구비하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 폴리머 다공질막이, 복수의 구멍을 갖는 표면층 A 및 표면층 B와, 상기 표면층 A 및 표면층 B의 사이에 끼워진 마크로보이드(macro void)층을 갖는 3층 구조의 폴리머 다공질막이고, 여기서 상기 표면층 A에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경은 상기 표면층 B에 존재하는 구멍의 평균 구멍 직경보다도 작고, 상기 마크로보이드층은 상기 표면층 A 및 B에 결합한 격벽과, 이 격벽 그리고 상기 표면층 A 및 B에 둘러싸인 복수의 마크로보이드를 가지며, 상기 표면층 A 및 B에 있어서의 구멍이 상기 마크로보이드에 연통되고,
여기서, 상기 케이싱 내에
(i) 2 이상의 독립된 상기 폴리머 다공질막이 집약되고,
(ii) 상기 폴리머 다공질막이 접혀 포개어지고,
(iii) 상기 폴리머 다공질막이 롤 형상으로 감겨져 들어가고, 및/또는
(iv) 상기 폴리머 다공질막이 줄 형상으로 묶여
수용되어 있는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배지 유출 입구의 직경이 세포의 직경보다도 크며, 또한 상기 폴리머 다공질막이 유출하는 직경보다도 작은 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 케이싱이 메쉬형의 구조를 갖는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 케이싱이 비가소성 소재로 이루어지는 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머 다공질막이 평균 구멍 직경 0.01∼100 ㎛의 복수의 세공을 갖는 방법.
제2항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면층 A의 평균 구멍 직경이 0.01∼50 ㎛인 방법.
제2항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표면층 B의 평균 구멍 직경이 20∼100 ㎛인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머 다공질막의 총 막 두께가 5∼500 ㎛인 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리머 다공질막이 폴리이미드 다공질막인 방법.
제10항에 있어서, 상기 폴리이미드 다공질막이 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리이미드를 포함하는 폴리이미드 다공질막인 방법.
제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 폴리이미드 다공질막이 테트라카르복실산이무수물과 디아민으로부터 얻어지는 폴리아믹산 용액과 착색 전구체를 포함하는 폴리아믹산 용액 조성물을 성형한 후, 250℃ 이상에서 열처리함으로써 얻어지는 착색한 폴리이미드 다공질막인 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 배양하는 공정이 정치 배양 조건 하에서 행해지는 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 배양하는 공정이 회전 배양 또는 교반 조건 하에서 행해지는 방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 배양하는 공정이 연속적으로 행해지는 방법.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포를 배양하는 공정이, 인큐베이터 중에 설치한 세포 배양 장치 중에서 행해지고, 여기서, 상기 세포 배양 장치는, 세포를 담지하는 상기 세포 배양 모듈을 수용하는 배양 유닛으로서, 배지 공급구 및 배지 배출구를 구비한 배양 유닛, 배지 공급 유닛으로서, 배지 수납 용기와, 배지 공급 라인과, 배지 공급 라인을 통해 배지를 송액하는 송액 펌프를 구비하고, 여기서 배지 공급 라인의 제1 단부는 배지 수납 용기 내의 배지에 접촉하고, 배지 공급 라인의 제2 단부는 배양 유닛의 배지 공급구를 통해 배양 유닛 내에 연통되어 있는 배지 공급 유닛을 포함하는 방법.
제16항에 있어서, 상기 세포 배양 장치가 배지 공급 라인, 송액 펌프, 공기 공급구, 공기 배출구 및 산소 투과막을 갖지 않는 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 다능성 줄기세포, 조직 줄기세포, 체세포, 생식세포, 육종세포, 주화세포 및 형질전환세포로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 인간 간엽계 줄기세포, 골아세포, 연골세포, 심근세포로 이루어지는 군에서 선택되는 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀을 생성하는 공정이 상기 세포를 배양하는 공정의 적어도 일부와 중복되는 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀을 생성하는 공정이 1개월, 2개월, 3개월 혹은 6개월 또는 그 이상의 기간에 걸쳐 계속되는 방법.
상기 세포 배양 모듈을 포함하는, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 엑소좀 생성 장치.
상기 세포 배양 모듈을 포함하는, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 사용하기 위한 키트.
상기 세포 배양 모듈의, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 기재된 방법을 위한 용도.
상기 세포 배양 모듈을 포함하는, 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해서 취득한 엑소좀.