KR20220041870A - 생물활성 파이토케미컬 - Google Patents

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KR20220041870A
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Abstract

(2R,3R,4R,5S)-3,4,5-트라이하이드록시피페리딘-2-카복실산(idoBR1)을 포함하는 조성물의 생산 방법이 기재되며, 상기 방법은 (a) 쿠커비타세아에 계통의 식물을 포함하는 식물 공급원으로부터 식물 재료를 제공하는 단계; (b) 상기 식물 재료를 분별하여 idoBR1이 풍부한 추출물을 생산하는 단계; (c) 상기 추출물을 (i) 시알리다제 또는 TNF-알파에 대한 저해 활성; 또는 (ii) IL-10 자극 활성에 대하여 분석하는 단계; 및 (d) 상기 분석된 추출물을 화장료용으로, 기능 식품용으로 또는 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체와 함께 제형화하여 화장료, 기능 식품 또는 약제학적 조성물을 생산하는 단계를 포함한다.

Description

생물활성 파이토케미컬
본 발명은 다양한 제품, 화합물, 조성물, 의학적 용도 및 이를 기반으로 하는 방법과 함께 (2R,3R,4R,5S)-3,4,5-트라이하이드록시피페리딘-2-카복실산(idoBR1)을 포함하는 조성물의 제조 방법 및 염증, 감염, 피부 장애, 시알리다제 활성의 생체 내 저해를 포함하는 의약에 사용하기 위한 다양한 조성물의 제조에 있어서 이들의 용도, 및 다양한 식물 공급원으로부터 상기 조성물을 단리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 (쿠커비타세아에(Cucurbitaceae); 박과) 추출물(예를 들어, 쿠쿠미스(Cucumis; 오이속) 추출물)의 품질을 모니터링하는 방법, 쿠커비타세아에 추출물을 생산하는 방법뿐만 아니라, 이와 같은 방법에 의해 수득 가능한 쿠커비타세아에 추출물(특히 쿠쿠미스 추출물)에 관한 것이다.
오이(쿠쿠미스 사티버스(Cucumis sativus))는 호박을 포함하는 박과 쿠커비타세아에의 널리 재배되는 식물이다. 오이는 인도가 원산지이며, 서아시아에서 적어도 3000년 동안 재배되어 왔고, 아마도 로마인에 의해 유럽의 다른 지역에 소개되었을 것이다. 오이 재배에 대한 기록은 9세기 프랑스, 14세기 영국 및 16세기 중반 북아메리카에서 나타난다.
오이 및 오이 추출물은 오랫동안 항염 특성을 가지는 것으로 인식되어 왔으며, 눈 밑 종창 및 일광화상을 포함한 다양한 유형의 피부 문제에 국소적으로 사용되어 왔다. 오이는 이집트, 그리스 및 로마의 고대 문명에서 매우 인기가 있었으며, 식품으로서뿐만 아니라, 이의 피부 치유 특성으로도 사용되었다.
이미노당산(ISA)은 이미노당으로 알려진 파이토케미컬(phytochemical)의 더 널리 분포된 부류의 하위부류를 구성한다. 알려진 많은 ISA는 식물 조직(방어 역할을 할 수 있는 곳)에서 2차 대사산물로 존재하는 파이토케미컬이다. 이미노당은 식물에 널리 분포되어 있지만(Watson, A. et al. ,2001, Phytochemistry 56, 265), 이미노당산은 훨씬 더 적게 분포되어 있어 단리 및 식별이 더 어렵다(Martinez, R., et al., 2019, Amino acids 51, 991).
이미노당산인 idoBR1은 오래된 오이 품종에서 발생하지만 특정 현대 상업용 품종에는 없다. 이것은 특정 오이 열매의 주요 성분인 것으로 나타났으며, 오이의 유일한 이미노당산이다. 이는 특정 호박 및 박에서는 미량 성분이다.
제WO2013/054070호는 쿠쿠미스 추출물을 기반으로 하는 항염 생약(herbal medicine)에서 중요한 생물활성 원리로서 idoBR1을 식별한다.
허브 식품 첨가제 및 치료법
현재 허브 치료법 및 보충제의 사용에 큰 관심이 있으며, 식품 제조업체, 건강 관리 회사 및 의료 전문가로부터 허브 제품이 가치가 있고 확립된 제형 및 치료법을 보완할 수 있다는 수용이 증가하고 있다. 허브 식품 첨가제 및 보충제는 이제 널리 사용된다.
그러나, 식물 재료의 복합 특성 및 고유한 불균일성으로 인해 허브 식품 첨가제의 품질 관리는 어렵다. 허브 및 식물-기반 식품 첨가제에서 사용되는 재료는 보통 전체 식물 또는 이의 부분 또는 추출물이다. 식물 재료는 많은 다양한 화학 성분을 포함하고 있으므로, 상기 재료는 복합 혼합물이다. 이는 상기 재료의 품질을 표준화하고 제어하는 것을 매우 어렵게 만든다. 더욱이, 많은 허브 식품 첨가제는 2종 이상의 식물-기반 성분의 혼합물이므로 혼합물의 혼합물이기 때문에, 더 복잡한 수준을 도입한다. 또한, 사용되는 제조 처방 및 방법은 종종 균일하지 않으며 계속 밝혀지지 않은 상태일 수 있다. 이러한 요인은 서로 다른 공급원으로부터 얻은 표면상으로 동일한 특정 제품의 2개 샘플이 실제로 성분의 동일한 혼합물을 포함하는지를 보장하는 것을 매우 어렵게 만든다. 이와 같은 재료의 품질을 제어하는 데 어려움을 초래하는 이러한 문제는 심지어 허브 종사자 사이에서도 특정 허브 추출물의 사용을 제한하였다.
다른 문제는 생약의 실무에서 또는 식품 보충제/기능 식품으로서 사용되는 식물이 흔히 현지에서 이용 가능하지 않을 수 있으므로, 최종 사용자와 멀리 떨어진 공급원에서 얻어야 한다는 사실에서 발생한다. 그러나, 특히 이와 같은 많은 식물에 대하여 동일성 및 품질 표준을 포함하는 상세한 논문이 존재하지 않기 때문에, 멀리 떨어진 위치로부터 이와 같은 식물의 공급은 불규칙하고 부정확할 수 있다. 약용 식물에서 발견되는 복합 성분 혼합물은 식물 공급원, 식물이 자라는 위치, 그 주변에서 자라고 있는 다른 식물 또는 미생물의 종류, 연중 식물이 수확되는 시기, 재료가 저장 및 가공되는 조건 및 사용되는 추출 절차를 포함한 다수 요인에 따라 종류와 농도가 광범위하게 다르다.
따라서, idoBR1을 포함하는 허브 제품을 프로파일링하고 이에 따라 활성과 관련될 수 있는 식물-유래 제품에 대한 표준 사양을 설정하여, 생약, 식품 첨가제, 화장료, 기능 식품 및 식품 첨가제의 생산에서 품질 관리를 허용하고 이상적으로는 생물활성 성분을 (구조적으로 및/또는 기능적으로) 정량화할 수 있는 민감한 공정에 대한 필요성이 존재한다.
이제 본 발명자들은 idoBR1이 IL-10 자극 활성을 나타내면서, 시알리다제 및 TNF-알파에 대하여 저해 활성을 나타낸다는 것을 발견하였다. 이러한 발견은 관련된 생물활성 성분인 idoBR1이 이제 식물 재료의 분별 후에 신속하고 용이하게 기능적으로 분석될 수 있으므로, 쿠커비타세아에 계통의 식물을 포함하는 식물 공급원 유래의 식물 재료의 추출물을 기반으로 한 화장료, 기능 식품 또는 약제학적 조성물을 제형화하기 위한 개선된 방법의 개발을 가능하게 한다.
따라서, 표준 사양에 부합하는 화장료, 기능 식품 또는 약제학적 조성물의 제공이 크게 촉진되며: 본 발명은 추출물의 기능적 품질의 신속한 분석을 가능하게 한다. 이는 또한 시간이 걸리고 값비싼 물리적 특성화(예를 들어, GC-MS 및/또는 HPLC에 의함)를 선택적으로 만든다. 더욱이, 추출물의 기능성이 분석되므로, 동시 추출된 모이어티에 의한 가능한 간섭/저해의 영향을 모니터링할 수 있다. 이는 추출물이 국소 적용을 위해 제형화되는 화장료 적용의 경우에 특히 중요할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따르면 (2R,3R,4R,5S)-3,4,5-트라이하이드록시피페리딘-2-카복실산(idoBR1)을 포함하는 조성물의 생산 방법이 제공되되, 상기 방법은,
(a) 쿠커비타세아에 계통의 식물을 포함하는 식물 공급원으로부터 식물 재료를 제공하는 단계;
(b) 상기 식물 재료를 분별하여 idoBR1이 풍부한 추출물을 생산하는 단계;
(c) 상기 추출물을 (i) 시알리다제 또는 TNF-알파에 대한 저해 활성; 또는 (ii) IL-10 자극 활성에 대하여 분석하는 단계; 및
(d) 상기 분석된 추출물을 화장료용으로, 기능 식품용으로 또는 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체와 함께 제형화하여 화장료, 기능 식품 또는 약제학적 조성물을 생산하는 단계를 포함한다.
식물 공급원은 쿠쿠미스 또는 쿠커비타(Cucurbita) 속의 식물을 포함할 수 있다. 쿠쿠미스 속의 바람직한 종은 쿠쿠미스 사티버스(오이) 종의 식물이다. 쿠커비타 속의 바람직한 종은 쿠커비타 멜로스(Cucurbita melos) 또는 쿠커비타 모스카타(Cucurbita moschata) 종이다.
본 명세서에 언급된 모든 간행물, 특허, 특허 출원 및 기타 참고문헌은 각각의 개별적인 간행물, 특허 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참조에 의해 원용되는 것으로 표시되고 그 내용이 전체가 인용되는 것처럼 모든 목적을 위해 본 명세서에 전문이 참조에 의해 원용된다.
정의
본 명세서에서 사용되는 경우 달리 구체적으로 표시되지 않는 한, 다음 용어는 해당 용어가 당업계에서 가질 수 있는 임의의 더 넓은(또는 더 좁은) 의미에 추가적으로 다음 의미를 갖는 것으로 의도된다:
문맥상 달리 요구되지 않는 한, 본 명세서에서 단수의 사용은 복수를 포함하는 것으로 해석되어야 하며, 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 실체와 관련하여 사용되는 용어 "하나"는 하나 이상의 해당 실체를 지칭하는 것으로 해석되어야 한다. 이와 같이, 용어 "하나", "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본 명세서에서 호환 가능하게 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하다", 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 이의 변형어는 인용된 임의의 완전체(예를 들어, 특성, 요소, 특징, 속성, 방법/공정 단계 또는 제한) 또는 완전체의 그룹(예를 들어, 특성들, 요소들, 특징들, 속성들, 방법/공정 단계들 또는 제한들)의 포함을 표시하는 것으로 해석되어야 하지만, 임의의 다른 완전체 또는 완전체의 그룹의 배제하는 것으로 해석되어서는 안된다. 따라서, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는"은 포괄적이나 개방형이며 추가적인 인용되지 않은 완전체 또는 방법/공정 단계를 배제하지 않는다.
어구 "~로 본질적으로 이루어진"은 본 명세서에서 명시된 완전체(들) 또는 단계뿐만 아니라, 청구된 발명의 특징 또는 기능에 실질적으로 영향을 미치지 않는 완전체(들) 또는 단계를 요구하는 데 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "이루어진"은 단독의 인용된 완전체(예를 들어, 특성, 요소, 특징, 속성, 방법/공정 단계 또는 제한) 또는 완전체의 그룹(예를 들어, 특성들, 요소들, 특징들, 속성들, 방법/공정 단계들 또는 제한들)의 존재를 표시하는 데 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "질환"은 생리적 기능을 손상시키고 특정 증상과 연관된 임의의 비정상적인 상태를 정의하는 데 사용된다. 상기 용어는 병인의 특성(또는 실제로 질환에 대한 병인학적 근거가 확립되었는지 여부)과 상관없이 생리적 기능이 손상된 임의의 장애, 질병, 이상, 병리, 아픔, 병태 또는 증후군을 포괄하는 데 광범위하게 사용된다. 따라서 이는 감염, 외상, 부상, 수술, 방사선 절제, 중독 또는 영양 결핍으로 발생하는 상태를 포괄한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 질환의 증상을 치유, 개선 또는 완화하거나 질환의 원인(들)(예를 들어, 병리학적 혼합 상태)을 제거(또는 이의 영향을 완화)하는 개입(예를 들어, 대상체에 대한 작용제의 투여)을 지칭한다. 이 경우에, 상기 용어는 용어 "요법"과 동의어로 사용된다.
추가적으로, 용어 "치료" 또는 "치료하는"은 질환의 발병 또는 진행을 예방 또는 지연시키거나 치료된 집단 내에서 발병을 감소(또는 근절)시키는 개입(예를 들어, 대상체에 대한 작용제의 투여)을 지칭한다. 이 경우, 상기 용어는 용어 "예방"과 동의어로 사용된다.
용어 "대상체"(문맥이 허용하는 경우 "개체", "동물", "환자" 또는 "포유동물"을 포함하는 것으로 해석되어야 함)는 치료가 지시되는 임의의 대상체, 특히 포유동물 대상체를 정의한다. 포유동물 대상체는, 인간, 가축, 농장 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물 및 애완 동물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 바람직한 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
본 명세서에서 당뇨병의 치료에 대한 언급은 제1형 및 제2형 당뇨병 자체뿐만 아니라, 당뇨병 전단계(초기 당뇨병) 및 인슐린 저항성의 치료를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 용어 "당뇨병 전단계" 또는 "초기 당뇨병"은 당뇨병이 없는 상태에서 높은 수준의 글루코스 또는 글라이코실화된 헤모글로빈이 존재하는 상태를 정의한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 화합물 또는 조성물의 유효량은 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 대상체에게 투여될 수 있는 양으로서, 합리적인 유익/유해비에 상응하지만, 원하는 효과, 예를 들어, 대상체의 상태에서 영구적 또는 일시적 개선에 의해 나타나는 치료 또는 예방을 제공하기에 충분한 양을 정의한다. 양은 개체의 연령 및 일반적인 상태, 투여 방식 및 기타 요인에 따라 대상체마다 다를 것이다. 따라서, 정확한 유효량을 명시하는 것은 가능하지 않지만, 당업자는 일상적인 실험 및 일반적인 배경 지식을 사용하여 임의의 개체의 경우에서 적절한 "유효"량을 결정할 수 있을 것이다. 이러한 맥락에서 치료 결과는 증상의 근절 또는 완화, 통증 또는 불편감 감소, 생존 연장, 이동성 개선 및 임상 개선의 기타 마커를 포함한다. 치료 결과가 완전한 치유일 필요는 없다.
용어 파이토케미컬은 본 명세서에서 거대분자 및 소분자를 포함하여 식물의 임의의 화학적 구성성분을 포괄하는 넓은 의미로 사용된다. 중요한 예는 알칼로이드(예를 들어, 이미노당 및 이미노당산, 예를 들어, 피롤리딘, 피페리딘, 피롤리지딘, 인돌리지딘, 트로판 및 노르트로판의 구조적 부류로부터 선택되는 이미노당 및 이미노당산), 탄수화물 유사체, 페놀 화합물, 터페노이드, 효소 저해제, 배당체, 뉴클레오타이드, 아미노산, 지질 및 당을 포함한다.
본 발명의 화합물에 적용되는 용어 단리된은 본 명세서에서 화합물이 자연에서 발생하는 것과 구별되는 물리적 환경에 존재하는 것을 표시하는 데 사용된다. 예를 들어, 단리된 화합물은 이것이 자연적으로 발생하는 복잡한 세포 환경과 관련하여 실질적으로 단리(예를 들어, 농축 또는 정제)될 수 있다. 따라서 단리된 화합물은 본 명세서에 기재된 임의의 식물 공급원의 농축된 분획 또는 추출물의 형태를 취할 수 있다.
단리된 재료가 농축 또는 정제될 때, 농축 또는 순도의 절대 수준은 중요하지 않으며 당업자는 재료가 사용되는 용도에 따라 적절한 수준을 용이하게 결정할 수 있다. 적어도 0.1% w/w, 0.2% w/w, 0.3% w/w, 0.4% w/w, 0.5% w/w, 0.6% w/w, 0.7% w/w, 0.8% w/w, 0.9% w/w, 1.0% w/w, 1.1% w/w, 1.2% w/w, 1.3% w/w, 1.4% w/w, 1.5% w/w, 1.6% w/w, 1.7% w/w, 1.8% w/w, 1.9% w/w 또는 2.0% w/w의 순도 수준이 바람직하다.
적어도 0.5 내지 2.0% w/w, 예를 들어, 적어도 0.8 내지 1.5% w/w, 예를 들어, 적어도 약 1.0% w/w의 순도 수준이 특히 바람직하다. 5 내지 10% w/w의 수준은 재료가 자연 공급원으로부터 단리되는 경우, 필요한 경우 적합한 농축 기법, 예컨대, 이온 교환 크로마토그래피를 이용함으로써 용이하게 수득될 수 있다.
일부 상황에서, 단리된 화합물은 조성물(예를 들어, 많은 다른 물질을 포함하는 다소 미정제 상태의 추출물), 또는 예를 들어, 다른 성분을 포함할 수 있는 완충 시스템의 일부를 형성한다. 다른 상황에서, 단리된 화합물은, 예를 들어, NMR 또는 크로마토그래피(예를 들어, 트라이메틸실릴-유도체의 GC-MS)에 의해 분광광도법에 의해 결정된 바와 같이 필수적인 동질성으로 정제될 수 있다.
용어 생약은 본 명세서에서 적어도 하나의 유효 성분(예를 들어, 화합물)이 화학적으로 합성되지 않고 식물의 파이토케미컬 구성성분인 약제학적 조성물을 정의하는 데 사용된다. 대부분의 경우, 이러한 합성되지 않은 유효 성분은 (본 명세서에 정의된 바와 같이) 단리되지 않지만, 공급원 식물과 연관된 다른 파이토케미컬과 함께 존재한다. 그러나, 일부 경우에, 식물-유래 생물작용 성분(들)은 농축된 분획에 또는 단리된 상태(때때로 높은 수준의 정제를 수반함)로 존재할 수 있다. 그러나, 많은 경우에, 생약은 식물 또는 심지어 가공되지 않은 전체 식물(또는 이의 부분)의 다소 미정제 상태의 추출물, 침출물 또는 분획을 포함하지만, 이와 같은 경우에 식물(또는 식물 부분)은 보통 적어도 건조되고/되거나 분쇄된다. 생약은 식품 보충제, 식품 첨가제, 기능 식품, 음료의 형태이거나 생약 키트 또는 팩으로서 단일 용량으로 제공될 수 있다.
용어 허브 식품은 본 명세서에서 적어도 하나의 성분이 화학적으로 합성되지 않고 오히려 식물의 파이토케미컬 구성성분인 조성물을 정의하는 데 사용된다. 대부분의 경우, 이러한 합성되지 않은 성분은 정제되지 않지만, 공급원 식물과 연관된 다른 파이토케미컬과 함께 존재한다. 그러나, 일부 경우에, 식물-유래 성분(들)은 농축된 분획에 또는 (때때로 높은 수준의 순도로) 단리된 상태로 존재할 수 있다. 그러나, 많은 경우에, 허브 식품 첨가제는 식물 또는 심지어 가공되지 않은 전체 식물(또는 이의 부분)의 다소 미정제 상태의 추출물, 침출물 또는 분획을 포함하지만, 이와 같은 경우에 식물(또는 식물 부분)은 보통 적어도 건조되고/되거나 분쇄된다. 따라서 상기 용어는 식품 및 음료와 함께 사용하기 위한 첨가제 및 보충제 형태의 허브 식품을 포함한다.
용어 생물작용 성분은 본 명세서에서 파이토케미컬이 포함된 생약의 약학 효능에 필요하거나 충분한 파이토케미컬을 정의하는 데 사용된다. 본 발명의 경우, 생물작용 성분은 idoBR1을 포함한다.
용어 기능 식품은 본 명세서에서 생리적 이익을 제공하거나 질환으로부터 보호하는 식료품(또는 이의 단리물)을 정의하는 데 사용된다. 본 발명의 바람직한 기능 식품은 항염증제이다.
용어 표준 사양은 본 명세서에서 생약, 화장료 또는 기능 식품의 허용 가능한 품질과 상관되는 특징, 또는 파이토케미컬 프로파일을 정의하는 데 사용된다. 이러한 맥락에서, 용어 품질은 의도된 용도에 대한 제품의 전반적인 적합성을 정의하는 데 사용되며, 적절한 농도에서 ido BR1의 활성을 포함한다.
용어 파이토케미컬 프로파일은 본 명세서에서 다양한 파이토케미컬 구성성분과 관련된 일련의 특징을 정의하는 데 사용된다.
기능 분석
본 발명의 추출물은, (i) 시알리다제 또는 TNF-알파에 대한 저해 활성; 또는 IL-10 자극 활성에 대하여 분석된다. 기능 분석은 생물학적 분석을 포함할 수 있다. 생물학적 분석은 생체 내 또는 시험관 내에서 수행될 수 있으며, 효소 저해 분석(예를 들어, 시알리다제 저해)을 포함할 수 있다. 다른 생물학적 분석은 수용체 결합 분석, 세포 분석(세포 복제, 세포-병원체 및 세포-세포 상호작용 및 세포 분비 분석을 포함함), 면역 분석, 항미생물 활성(예를 들어, 박테리아 및 바이러스 세포-결합 및/또는 복제) 분석 및 독성 분석(예를 들어, LD50 분석)을 포함한다.
기능적 특성화는 또한 생물학적 활성의 하나 이상의 지표의 식별을 허용하는 특성화 형태에 의해 간접적으로 수행될 수 있다.
예시적인 기법은 아래에 더 상세히 기재되어 있다.
시알리다제
idoBR1 또는 이를 포함하는 추출물에 의한 시알리다제(뉴라미니다제) 활성의 저해는 뉴라미니다제 활성을, 예를 들어, 클로스트리듐 페르프린젠스(Clostridium perfringens) 유래의 효소(Sigma-Aldrich)를 사용하여 측정하는 효소 분석에 의해 결정될 수 있다. 분석은 2'-(4-메틸움벨리페릴)-α-D-N-아세틸뉴라민산(MUNANA) 기질을 절단하여 형광 생성물인 4-메틸움벨리페론(4-MU)을 방출하는 효소를 기반으로 한다. 따라서, 저해 효과는 효소 활성의 50%를 감소시키는 데 필요한 idoBR1 또는 추출물의 농도(IC50　값을 제공)를 기반으로 하여 결정된다.
적합한 방법은 다음과 같을 수 있다:
1. 반응 혼합물을 준비한다. 인산나트륨 완충액(pH 4.5), 10 m㏖ MUNANA4MU-NeuAc(완충액 중 100㎕), 100㎕ 중 0.1㎎ 효소, 100㎕의 식물 추출물 또는 화합물
2. 37C에서 10 내지 30분 동안 인큐베이션한다.
3. 1.25㎖의 0.25M 글리신-NaOH(pH 10.4)를 첨가하여 반응을 종결시킨다.
4. 방출된 4-메틸움벨리페론(4-MU)을 형광법으로 측정한다(방출 448㎚, 여기 365㎚).
TNF -α 및 IL-10
추출물에 의해 감소된 TNF-α 및 증가된 IL-10을 ELISA 방법을 사용하여 세포 배양물(예를 들어, THP-1 단핵구 세포)에서 또는 전혈 샘플에서 측정할 수 있다.
THP-1 세포는 상업적으로 입수 가능하다. 배양된 세포를 미세정량판의 RPMI 완전 배지(예를 들어, 96웰 플레이트에서 웰당 5개 세포)에 넣고 24시간 인큐베이션 후, 96 웰플레이트에 PMA(10 ng/㎖)를 첨가하여 THP-1 세포를 분화시키고 TNF-α 및 IL-10 생산에 대한 효과를 결정할 수 있다. 세포를, 예를 들어, 200 ㎍/㎖ 내지 25 ㎍/㎖에서 오이 추출물로 전처리한 다음, 2시간 LPS(100 ng/㎖) 자극을 수행하여야 한다. 인큐베이션 후, 각각의 웰로부터 멸균 마이크로 원심분리 튜브로 세포 상청액을 흡입하고 1000 rpm에서 2 내지 3분 동안 원심분리하여 존재하는 경우 임의의 세포를 침전시킨다. 그 다음 세포 상청액을 ELISA를 사용하여 TNF-α 또는 IL-10의 존재를 평가하는 데 사용한다. 적합한 항체로 코팅된 샌드위치 ELISA 플레이트가 널리 사용 가능하다(예를 들어, R&D Systems, 미국).
전혈 측정의 경우, 전혈 분취액(800㎕)을 RPMI 1640에 용해시킨 추출물과 함께 48시간의 사전 인큐베이션 기간 동안 인큐베이션할 수 있으며, 이 후 LPS(10 ㎍/㎖)를 첨가하고 공기 중 5% CO2의 가습(100%) 대기에서 37℃에서 추가 20시간 동안 인큐베이션을 지속한다. 인큐베이션 기간의 종료시, 혈장으로 이루어진 상청액을 실온에서 30초 동안 10,000g에서 원심분리에 의해 수집하고, 인간 TNF-α 및 IL-10 ELISA 분석(예를 들어, BioSource Europe S.A.(벨기에)로부터 입수 가능한 키트)을 사용하여 TNF-α 및 IL-10 수준을 측정한다.
물리적 특성화
본 발명의 추출물은 또한 (필수적인 것은 아니지만) 물리적으로 특성화될 수 있다. 이는 임의의 주어진 분획에 또는 공정의 임의의 다른 단계에 존재하는 파이토케미컬 성분(들)의 정량화, 구성성분의 순도 측정, 분자량(또는 복수의 다양한 파이토케미컬 구성성분을 포함하는 분획의 경우에 분자량 분포 또는 이의 다양한 통계적 함수)의 결정, 분자식의 결정(예를 들어, 핵 자기 공명에 의함) 및 다양한 스펙트럼 분석의 형태를 취할 수 있다.
특히 유용한 스펙트럼 특징은 다음을 포함한다:
Figure pct00001
질량 스펙트럼(예를 들어, 질량 대 전하(m/z) 값 대 존재비), 및/또는
Figure pct00002
크로마토그래피 데이터(예를 들어, 스펙트럼, 컬럼 보유 시간, 용리 프로파일 등), 및/또는
Figure pct00003
광다이오드 어레이(PDA) 스펙트럼(예를 들어, UV 및 가시광선 범위 모두에서), 및/또는
Figure pct00004
전기화학적 검출(ED) 또는 증발광 산란(ELSE) 검출; 및/또는
Figure pct00005
핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼(1H 및/또는 13C NMR을 통해 수득한 스펙트럼 데이터 세트를 포함함).
스펙트럼 특성화는 분별 단계와 결합될 수 있다. 예를 들어, GC-MS 및 HPLC-PDA-MS-ED-ELSD는 (본 명세서에 기재된 바와 같이) 분별을 질량 스펙트럼, UV-가시광선 스펙트럼, 전기화학적 반응 또는 분획 질량 데이터 및 크로마토그래피 스펙트럼 데이터의 획득과 결합시키는 데 사용될 수 있다.
상기 특징 중 일부 또는 전부는 임의의 주어진 샘플(또는 이의 임의의 분획 또는 파이토케미컬 구성성분)에 대한 "화학적 지문"을 정의하는 데 사용될 수 있다.
화학적 특성화
본 발명의 추출물은 또한 (필수적인 것은 아니지만) 화학적으로 특성화될 수 있다. 이는 특히 파이토케미컬 구성성분(들)의 화학 반응성, 이의 용해도, 안정성 및 융점의 측정 형태를 취할 수 있다.
본 발명의 화합물의 의학적 용도
종양 형성( neoplasia )
본 발명의 화합물은 시알리다제 저해제이고, 따라서 시알리다제 활성 및/또는 시알산에 의해 매개되는 질환 및 장애의 치료 또는 예방에 적용된다.
시알리다제는 박테리아 및 바아러스 감염 및 종양 형성을 포함하여, 다양한 병리학적 과정에 관여하며, 이는 이러한 효소를 매력적인 치료 표적으로 만든다. 시알리다제 Neu1 및 Neu3의 발현은 당뇨병에서 변경된 것으로 보인다(예를 들어, 문헌[Natori, Y., et al, 2013, Biol. Pharm., Bull., 36, 1027]에 의해 논의된 Neu1 활성). 시알리다제는 또한 죽종형성(atherogenesis)(Sukhorukov, V.N., et al., 2017, Curr. Pharm. Des., 23, 4696) 및 골관절염(Katoh, S., et al., 1999, J Immunol., 162, 5058)에 관여한다.
따라서, 본 발명의 화합물은 아래에 더 상세히 기재된 바와 같이, 종양 형성/증식성 장애의 치료 또는 예방에 적용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "종양 형성"은 신생 세포의 비정상적인 증식을 포함하는 질환을 정의하기 위해 협의로 사용된다. 상기 용어는 양성, 전암성 및 악성 종양 형성(상기 정의된 바와 같음)을 포함하며, 용어 "증식성 장애"와 동의어로 사용된다.
종양 형성은 정상적인 생리적 제어에서 벗어나는 유전적 또는 후성적 변화를 획득한 신생 세포(즉, 세포가 "형질전환"됨)에서 부적절하게 높은 수준의 세포 분열 및/또는 낮은 수준의 아폽토시스 또는 노화로 인해 발생한다. 종양 형성은 전형적으로 신생물로 알려진 구조물, 즉 비정상적인 조직 덩어리를 생성하며, 이의 성장은 정상 조직의 성장을 초과하고 조정되지 않으며 변화를 유발한 자극의 중단 후에도 동일한 과도한 방식으로 지속된다. 대부분의 신생물은 큰 조직 덩어리(고형 종양)를 형성하며, 일부 신생물은 이와 같은 별개의 조직 덩어리를 형성하지 않는다. 이는 자궁경부 상피내 종양 형성, 항문 상피내 종양 형성 및 백혈병을 포함한다.
종양 형성은 양성, 잠재적으로 악성 또는 악성일 수 있다. 양성 종양 형성은 침습적이지 않고 악성 신생물로 형질전환하거나 진행하지 않는 자궁 근종 및 멜라닌세포 모반(피부 점)을 포함한다. 잠재적으로 악성(전암성) 신생물은 상피내 암종을 포함하며, 이는 침습적이지 않지만 시간이 지나면 악성 신생물로 변형된다.
악성 종양 형성은 주변 조직을 침범하여 파괴하는 신생물(종양)을 생성하고, 전이를 형성하여 결국 숙주를 죽일 수 있다. 용어 "악성 종양 형성" 및 "암"은 본 명세서에서 동의어로 사용된다.
용어 "증식성 장애" 및 "종양 형성"은 생체 내 세포의 병리학적 성장을 수반하는 질환의 부류를 정의하기 위해 본 명세서에서 동의어로 사용될 수 있다.
따라서, 증식성 장애는 암, 암 전이, 평활근 세포 증식, 전신 경화증, 간경변증, 성인 호흡 곤란 증후군, 특발성 심근병증, 홍반성 낭창, 망막병증(예를 들어, 당뇨 망막병증), 심근세포 과형성, 양성 전립선 비대증, 난소 낭종, 폐섬유증, 자궁내막증, 섬유종증, 과오종, 림프관종증, 사르코이드증 및 섬유성 종양을 포함한다. 평활근 세포 증식을 포함하는 종양 형성은 혈관계에서 세포의 과증식(예를 들어, 혈관내막 평활근 세포 과형성, 재협착증 및 혈관 폐색, 특히 혈관성형술과 같은 생물학적 또는 기계적으로 매개된 혈관 손상 후 협착증을 포함함)을 포함한다. 더욱이, 혈관내막 평활근 세포 과형성은 혈관계 이외의 평활근에서의 과형성(예를 들어, 담관, 기관지 기도 및 신장 간질 섬유증이 있는 환자의 신장에서의 폐색)을 포함할 수 있다. 비-암성 증식성 장애는 또한 피부 세포의 과증식, 예컨대, 건선 및 이의 다양한 임상 형태, 라이터 증후군, 모공성 홍색 비강진 및 각질화 장애의 과증식성 변종(광선 각화증, 노인성 각화증 및 경피증을 포함함)을 포함한다.
용어 "종양 형성"은 또한 생체 내 세포의 비정상적인 성장 및/또는 분화를 포함하는 질환을 정의하기 위해 본 명세서에서 광의로 사용되며, 따라서 과형성, 화생 및 이형성을 포함한다.
과형성은 기관 또는 조직 내의 정상적인(형질변환되지 않은) 세포가 비정상적인 정도로 증식하는 상태를 정의한다. 따라서, 이는 장기의 엄청난 확대, 양성 종양의 형성을 초래할 수 있거나, 현미경 하에서만 볼 수 있다. 과형성은 특정 자극에 대한 생리적 반응이며 과형성 세포는 정상적인 조절 제어 메커니즘의 대상으로 남아 있다(세포가 정상적인 생리적 제어에 반응하지 않는 비정상적인 방식으로 증식하는 신생물의 성장과 다름). 예는 선천성 부신 과형성, 자궁내막 과형성, 양성 전립선 비대증(전립선 비대), 유방 과형성(유관 증식증을 포함함), 국소 상피 과형성(헥 질환), 피지 과형성 및 간 과형성을 포함한다.
화생은 성숙하고 분화된 한 유형의 세포가 성숙하고 분화된 다른 유형의 세포로 대체되는 상태를 정의한다. 예는 침샘관 원주 상피 세포의 편평세포 화생(결석이 존재하는 경우), 방광 이행 상피의 편평세포 화생(또한, 결석이 존재하거나 감염과 연관되는 경우), 위산 역류가 있는 환자 식도의 선상 화생(glandular metaplasia)(바렛 식도) 및 결합 조직의 골 화생을 포함한다.
이형성은 조직 내 세포의 비정상적인 성숙을 특징으로 하는 상태를 정의한다. 이는 일반적으로 성숙한 세포의 수와 위치의 상응하는 감소와 함께, 미성숙 세포의 확장으로 이루어진다. 예를 들어, 자궁경부의 상피 이형성은 점막 표면으로 제한된 미성숙 세포의 집단 증가를 특징으로 한다. 골수이형성 증후군, 또는 혈액-형성 세포의 이형성은 골수에서 미성숙 세포 수의 증가와 혈액에서 성숙한 기능 세포의 감소를 나타낸다. 다른 예는 신경섬유종증을 포함한다.
과형성, 화생, 및 이형성은 일반적으로 자극(예를 들어, 상해 또는 부상)의 결과인, 가역적인 상태이다. 대조적으로, 종양 형성은 일반적으로 비가역적이며 세포 형질전환과 연관되어 있다.
본 발명의 화합물은 증식성 장애, 양성, 전암성 및 악성 종양 형성, 과형성, 화생 및 이형성을 포함하여 임의의 종양 형성의 치료에서 일반적으로 적용된다.
따라서, 본 발명은, 암, 암 전이, 평활근 세포 증식, 전신 경화증, 간경변증, 성인 호흡 곤란 증후군, 특발성 심근병증, 홍반성 낭창, 망막병증(예를 들어, 당뇨 망막병증), 심근세포 과형성, 양성 전립선 비대증, 난소 낭종, 폐섬유증, 자궁내막증, 섬유종증, 과오종, 림프관종증, 사르코이드증 및 섬유성 종양을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는 증식성 장애의 치료에 적용된다. 평활근 세포 증식을 포함하는 종양 형성은 혈관계에서 세포의 과증식(예를 들어, 혈관내막 평활근 세포 과형성, 재협착증 및 혈관 폐색, 특히 혈관성형술과 같은 생물학적 또는 기계적으로 매개된 혈관 손상 후 협착증을 포함함)을 포함한다. 더욱이, 혈관내막 평활근 세포 과형성은 혈관계 이외의 평활근에서의 과형성(예를 들어, 담관, 기관지 기도 및 신장 간질 섬유증이 있는 환자의 신장에서의 폐색)을 포함할 수 있다. 비-암성 증식성 장애는 또한 피부 세포의 과증식, 예컨대, 건선 및 이의 다양한 임상 형태, 라이터 증후군, 모공성 홍색 비강진 및 각질화 장애의 과증식성 변종(광선 각화증, 노인성 각화증 및 경피증을 포함함)을 포함한다.
악성 종양 형성(암)의 치료가 특히 바람직하다. 본 발명은, (a) 암종; (b) 모세포종; (c) 백혈병; (d) 림프종; (e) 골수종; (f) 육종 및 (g) 혼합형 암의 주요 그룹으로부터 선택되는 것을 포함하는, 임의의 암의 치료에 적용된다.
암종은 상피 기원의 악성 신생물 또는 신체의 내부 또는 외부 라이닝(lining)의 암을 지칭한다. 상피 조직의 악성 종양인 암종은 전체 암 사례의 80 내지 90%를 차지한다. 상피 조직은 신체 전체에서 발견된다. 이는 피부뿐만 아니라, 기관 및 내부 통로, 예컨대, 위장관의 피복 및 라이닝에도 존재한다. 바람직한 실시형태에서, 본 발명에 따라 치료되는 암종은, 침샘; 결장; 직장; 충수; 폐; 흉선; 유방; 자궁 경부; 방광 및 눈의 암종으로부터 선택된다.
본 발명은 간모세포종(예를 들어, 신모세포종, 비상피성 신장 종양, 간상 신 종양, 신장 육종 및 신장의 pPNET), 수모세포종, 췌장모세포종, 폐모세포종, 흉막폐모세포종, 신경모세포종(일반적으로 말초 신경 세포 종양뿐만 아니라 신경절신경모세포종 및 망막모세포종을 포함함)을 포함하는 모든 모세포종의 치료에 적용된다.
본 발명은 림프성 백혈병(예를 들어, 전구 세포 백혈병, 성숙한 B-세포 백혈병, 성숙한 T-세포 백혈병 및 NK 세포 백혈병); 급성 골수성 백혈병; 만성 골수증식성 질환; 골수이형성 증후군 및 다른 골수증식성 질환을 포함하여, 모든 백혈병, 골수증식성 질환 및 골수이형성 질환의 치료에 적용된다. 따라서 본 발명은 림프성, 림프구성, 또는 림프모구성 백혈병(림프구양 및 림프구성 혈액 세포 계열의 악성 종양) 및 진성 다혈구증 또는 적혈병(다양한 혈액 세포 생성물(그러나 적혈구가 우세함)의 악성 종양)을 포함하여, 다양한 백혈병의 치료에 적용된다.
림프종은 체액을 정화하고 감염과 싸우는 백혈구, 또는 림프구를 생산하는 혈관, 결절, 및 기관(구체적으로는 비장, 편도선, 및 흉선)의 네트워크인 림프계의 샘 또는 결절에서 발생한다. 때때로 "액체암"이라고 불리는 백혈병과 달리, 림프종은 "고형암"이다. 림프종은 또한 위, 유방 또는 뇌와 같은 특정 기관에서 발생할 수 있다. 이러한 림프종은 림프절외 림프종으로 지칭된다. 림프종은, 호지킨 림프종과 비-호지킨 림프종의 2가지 카테고리로 세분된다. 호지킨 림프종에서 리드-슈테른베르크(Reed-Sternberg) 세포의 존재는 호지킨 림프종과 비-호지킨 림프종을 진단적으로 구별한다. 본 발명은, (a) 호지킨 림프종; (b) 비-호지킨 림프종(예를 들어, 전구 세포 림프종, 성숙한 B-세포 림프종, 성숙한 T-세포 림프종 및 NK-세포 림프종); (c) 버킷 림프종 및 (d) 외투 세포 림프종을 포함한 다른 림프세망 신생물을 포함한 이와 같은 모든 림프종 및 망상내피 신생물의 치료에 적용된다.
따라서, 본 발명은, 예를 들어, 림프계(비장, 편도선, 및 흉선을 포함함)의 샘 또는 결절의 종양 및 위, 유방 및 뇌의 림프절외 림프종을 포함하여, 광범위한 림프종의 치료에 적용된다.
골수종은 골수의 형질 세포에서 유래하는 암이다. 따라서, 본 발명은 림프구 계열의 종양(예를 들어, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종(예컨대, 미만성 거대 B 세포 림프종), T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 털세포 림프종 및 버킷 림프종)뿐만 아니라, 골수 계열의 조혈 종양(예를 들어, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 골수성 백혈병 및 이매티닙 민감성 및 불응성 만성 골수성 백혈병, 골수이형성 증후군, 보르테조밉 민감성 및 불응성 다발성 골수종, 골수증식성 질환 또는 전골수구성 백혈병 및 갑상선 여포암)을 포함하여, 조혈 종양 및 혈액 악성 종양의 치료에 적용된다.
본 발명은 모든 육종의 치료에 적용된다. 육종은 뼈, 힘줄, 연골, 근육 및 지방과 같은 지지 조직 및 결합 조직에서 유래하는 암을 지칭한다. 일반적으로 젊은 성인에서 발생하는, 가장 흔한 육종은 종종 뼈에서 통증이 있는 덩어리로 발전한다. 육종 종양은 보통 종양이 자라는 조직과 유사하다. 본 발명에 따른 치료를 위한 예시적인 육종은 골육종(또는 골원성 육종); 연골육종; 평활근육종(평활근); 횡문근육종(골격근); 중피 육종 또는 중피종(체강의 막 라이닝); 섬유육종(섬유 조직); 혈관육종 또는 혈관내피종(혈관); 지방육종; 신경교종; 성상세포종; 점액육종(원시 배아 결합 조직) 및 중간엽 또는 혼합 중배엽성 종양(혼합 결합 조직 유형)을 포함한다. 섬유육종은 말초 신경집 종양 및 다른 섬유성 신생물, 예를 들어, 섬유모세포 및 근섬유아세포 종양, 신경집 종양 및 다른 섬유종성 신생물을 포함한다. 또한 카포시 육종이 포함된다. 또한 연조직 육종, 예를 들어, 연조직의 유잉 종양 및 아스킨 종양, 연조직의 pPNET, 신외성 간상 종양; 섬유조직구 종양; 활막 육종; 연조직의 골성 및 연골종성 신생물 및 폐포 연부 육종이 포함된다. 골육종(악성 골 종양)은, 뼈의 악성 섬유성 신생물; 악성 척색종 및 치성 악성 종양을 포함한다. 신경교종은 희소돌기아교세포종, 혼합 및 불특정 신경교종 및 신경상피 신경교 종양을 포함한다.
본 발명은, 예를 들어, 선편평세포 암종, 혼합 중배엽성 종양, 암육종 및 기형암종을 포함하여, 혼합 유형의 암의 치료에 적용된다. 따라서, 본 발명은 성상세포종, 신경모세포종, 신경교종, 신경초종, 뇌실피복세포종 및 맥락막총 종양(예를 들어, 뇌실피복세포종 및 맥락막총 종양)을 포함하여, 다양한 CNS, PNS 및 여러 가지 두개내 및 척수내 신생물; 두개내 및 척수내 배아 종양(예를 들어, 수모세포종, 원시 신경외배엽 종양(PNET), 수질상피종, 비정형 유기형/간상 종양 및 다른 두개내 및 척수내 신생물(예를 들어, 뇌하수체 선종 및 암종, 안장 영역의 종양(두개인두종), 송과체 실질 종양, 신경세포성 및 혼합신경 교세포 종양, 수막종 및 전반적인 두개내 및 척수내 신생물)의 치료에 적용된다.
따라서, 본 발명은 특히 두개내 및 척수내 생식 세포 종양; 두개내 및 척수내 배아세포종; 두개내 및 척수내 기형종; 두개내 및 척수내 배아 암종; 두개내 및 척수내 난황난 종양; 두개내 및 척수내 융모막암종 및 혼합된 형태의 두개내 및 척수내 종양의 치료에 적용된다.
또한 본 발명은 다양한 생식 세포 종양, 영양막 종양 및 생식샘의 신생물의 치료에 적용된다. 따라서, 본 발명은, 예를 들어, 두개외 및 생식샘외 부위의 악성 배아세포종, 두개외 및 생식샘외 부위의 악성 기형종, 두개외 및 생식샘외 부위의 배아 암종, 두개외 및 생식샘외 부위의 난황낭 종양; 두개외 및 생식샘외 부위의 융모막암종 및 전반적인 두개외 및 생식샘외 부위의 악성 혼합 생식 세포 종양을 포함하여, 악성 두개외 및 생식샘외 생식 세포 종양의 치료에 적용된다. 본 발명은 또한, 예를 들어, 악성 생식샘 배아세포종, 정상피종, 악성 생식샘 기형종, 생식샘 배아 암종, 생식샘 난황낭 종양, 생식샘 융모막암종, 혼합 형태의 악성 생식샘 종양 및 악성 생식샘 생식샘모세포종을 포함하여, 악성 생식샘 생식 세포 종양의 치료에 적용된다.
감염성 질환
본 발명의 화합물은 시알리다제 저해제이고, 따라서 시알리다제 활성 및/또는 시알산에 의해 매개되는 질환 및 장애의 치료 또는 예방에 적용된다. 이와 같은 질환 및 장애는 감염성 질환(박테리아 및 바이러스 감염을 포함함)을 포함한다.
본 발명의 화합물은 임의의 감염성 인자에 대해 항감염(예를 들어, 패소스태틱(pathostatic) 또는 패소사이달(pathocidal)) 활성을 가질 수 있다. 따라서 본 발명의 화합물은 광범위한 상이한 감염원을 표적화할 수 있다(즉, 상기 감염원에 대한 활성을 가질 수 있다). 따라서, 본 발명은 바이러스, 박테리아, 진균, 원생동물, 프리온 또는 후생동물 인자가 관련된 감염성 질환을 포함하여, 임의의 감염 또는 감염성 질환의 치료 또는 예방에 적용된다.
따라서, 본 발명은 바이러스 감염의 치료 또는 예방; 박테리아 감염의 치료 또는 예방; 원생동물 감염의 치료 또는 예방; 진균 감염의 치료 또는 예방; 프리온 감염의 치료 또는 예방; 및/또는 후생동물(예를 들어, 연충) 감염 또는 체내 침입의 치료 또는 예방에 적용된다. 본 발명의 화합물은 또한 만성, 휴면 또는 잠복 바이러스, 박테리아, 원생동물, 진균, 프리온 또는 후생동물(예를 들어, 연충) 감염 또는 체내 침입의 치료 또는 예방에 적용될 수 있다.
Figure pct00006
바이러스 표적은, 레트로바이러스과(Retroviridae)(예를 들어, HIV-1을 포함한 인간 면역결핍 바이러스); 피코르나바이러스과(Picornaviridae)(예를 들어, 폴리오 바이러스(polio virus), A형 간염 바이러스(hepatitis A virus); 엔테로바이러스(enterovirus), 인간 콕사키 바이러스(human Coxsackie virus), 리노바이러스(rhinovirus), 에코바이러스(echovirus)); 칼시바이러스과(Calciviridae)(예를 들어, 위장염을 유발하는 균주); 토가바이러스과(Togaviridae)(예를 들어, 말 뇌염 바이러스(equine encephalitis virus), 풍진 바이러스(rubella virus)); 플라비바이러스과(Flaviridae)(예를 들어, 뎅기 바이러스(dengue virus), 뇌염 바이러스(encephalitis virus), 황열 바이러스(yellow fever virus)); 코로나바이러스과(Coronoviridae)(예를 들어, 코로나바이러스(coronavirus)); 랍도바이러스과(Rhabdoviradae)(예를 들어, 수포성구내염바이러스(vesicular stomatitis virus), 광견병 바이러스(rabies virus)); 필로바이러스과(Filoviridae)(예를 들어, 에볼라 바이러스(ebola virus)); 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae)(예를 들어, 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 볼거리 바이러스(mumps virus), 홍역 바이러스(measles virus), 호흡기세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus)); 오소믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)(예를 들어, 인플루엔자 바이러스(influenza virus)); 분가바이러스과(Bungaviridae)(예를 들어, 한탄 바이러스(Hantaan virus), 분가 바이러스(bunga virus), 플레보바이러스(phlebovirus) 및 나이로 바이러스(Nairo virus)); 아레나바이러스과(Arena viridae)(출혈열 바이러스(hemorrhagic fever virus)); 레오바이러스과(Reoviridae)(예를 들어, 레오바이러스(reovirus), 오르비바이러스(orbiviurs) 및 로타바이러스(rotavirus)); 비르나바이러스과(Birnaviridae); 헤파드나바이러스과(Hepadnaviridae)(B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus)); 파르보바이러스과(Parvoviridae)(파르보바이러스(parvovirus)); 파포바바이러스과(Papovaviridae)(유두종 바이러스(papilloma virus), 폴리오마 바이러스(polyoma virus)); 아데노바이러스과(Adenoviridae)(대부분의 아데노바이러스(adenovirus)); 헤르페스바이러스과(Herpesviridae)(단순 포진 바이러스(herpes simplex virus; HSV) 1 및 2, 수두 대상 포진 바이러스(varicella zoster virus), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus; CMV), 헤르페스 바이러스(herpes virus) ; 폭스바이러스과(Poxviridae)(바리올라 바이러스(variola virus), 우두 바이러스(vaccinia virus). 폭스 바이러스(pox virus)); 및 이리도바이러스과(Iridoviridae)(예를 들어, 아프리카 돼지 콜레라 바이러스(African swine fever virus)); 및 미분류 바이러스(예를 들어, 해면상뇌증의 유병 기생충, 델타 간염(delta hepatitis)의 인자(B형 간염 바이러스의 결핍된 부수체(satellite)인 것으로 생각됨), C형 간염 바이러스(HCV virus)(비-A형, 비-B형 간염을 유발함); 노워크(Norwalk) 및 관련 바이러스, 및 아스트로 바이러스(astrovirus))의 바이러스(또는 바이러스 부류)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 상기한 것 중에서, HIV, A형 간염, B형 간염, C형 간염, 광견병 바이러스, 폴리오바이러스(poliovirus), 인플루엔자 바이러스, 뇌막염 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 풍진, 백일해, 뇌염 바이러스, 유두종 바이러스, 황열 바이러스, 호흡기세포융합 바이러스, 파르보바이러스, 치쿤구니야 바이러스(chikungunya virus), 출혈열 바이러스 및 헤르페스 바이러스, 특히 수두, 사이토메갈로바이러스 및 엡스타인-바 바이러스가 특히 바람직하다.
Figure pct00007
박테리아 표적은 그람-음성 및 그람-양성 박테리아를 둘 다 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 본 발명의 화합물에 의해 표적화될 수 있는 박테리아의 예는 헬리코박터 파이로리(Helicobacter pylori), 보렐리아 부르그도르페리(Borelia burgdorferi), 레지오넬라 뉴모필리아(Legionella pneumophilia), 마이코박테리움 종(Mycobacterium spp)(예를 들어, 엠. 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis), 엠. 레프래(M. leprae), 엠. 아비움(M. avium), 엠. 인트라셀룰라레(M. intracellulare), 엠. 칸사이(M. kansaii) 및 엠. 고르도나애(M. gordonae)), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 나이세리아 고노레아(Neisseria gonorrhoeae), 나이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes)(그룹 A 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 아갈락티애(Streptococcus agalactiae)(그룹 B 스트렙토코커스), 스트렙토코커스 비리단스(Streptococcus viridans), 스트렙토코커스 패칼리스(Streptococcus faecalis), 스트렙토코커스 보비스(Streptococcus bovis), 스트렙토코커스 속의 임의의 혐기성 종, 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae), 캄필로박터 종(Campylobacter spp.), 엔테로코커스 종(Enterococcus spp.), 해모필러스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae), 바실러스 안트라시스(Bacillus anthracis), 코리네박테리움 종(Corynebacterium spp.)(씨. 디프테리아에(C. diphtheriae)를 포함함), 에리시페로트릭스 루시오파시애(Erysipelothrix rhusiopathiae), 클로스트리듐 페르프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 테타니(Clostridium tetani), 엔테로박터 애로제네스(Enterobacter aerogenes), 클렙시엘라 종(Klebsiella spp)(케이. 뉴모니애(K. pneumoniae)를 포함함), 파스투렐라 물토시다(Pasturella multocida), 박테로이데스 종(Bacteroides spp.), 푸소박테리움 뉴클레아툼(Fusobacterium nucleatum), 스트렙토바실러스 모닐리포르미스(Streptobacillus monilijormis), 트레포네마 팔리디움(Treponema pallidium), 트레포네마 페르테누이(Treponema pertenue), 렙토스피라 종(Leptospira spp.), 리케차 종(Rickettsia spp.) 및 악티노마이세스 종(Actinomyces spp.)(에이. 이스라엘리(A. israelii)를 포함함)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 생체 내에서 바이오필름을 형성하는 박테리아는 본 발명의 화합물의 특정 표적이며, 이는 타네넬라 포시티아(Tannerella forsythia), 타네렐라 덴티콜라(Tannerella denticola), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis) 및 가르드넬라 바기날리스(Gardnerella vaginalis)를 포함한다.
Figure pct00008
진균 표적은 크립토코커스 네오포르만스(Cryptococcus neoformans), 히스토플라스마 캅술라툼(Histoplasma capsulatum), 콕시디오이데스 이미티스(Coccidioides immitis), 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomatis) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00009
원생동물 표적은 플라스모듐 종(Plasmodium spp.)(플라스모듐 팔시파룸(Plasmodium falciparum), 플라스모듐 말라리아에(Plasmodium malariae), 플라스모듐 오발레(Plasmodium ovale) 및 플라스모듐 비박스(Plasmodium vivax)를 포함함), 톡소플라스마 종(Toxoplasma spp.)(티. 곤디(T. gondii) 및 티. 크루지(T. cruzii)를 포함함), 리슈마니아 종(Leishmania spp.), 크립토스포리듐 종(Cryptosporidium spp.)(씨. 파르붐(C. parvum)을 포함함), 사이클로스포라 종(Cyclospora spp.)(씨. 카에타넨시스(C. cayetanensis)를 포함함), 엔타모에바(Entamoeba)(이. 히스톨리티카(E. histolytica)를 포함함) 및 지아르디아 종(Giardia spp.)(지. 람블리아(G. lamblia)를 포함함)을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
Figure pct00010
후생동물 표적은 기생충 또는 병원체, 예컨대, 연충(시스토소마 종(Schistosoma spp.))을 포함한다.
생체 내 박테리아 성장의 저해
시알리다제 활성은 시알로컨쥬게이트(sialoconjugate) 당의 이용에 대해 핵심이며 박테리아와의 숙주-병원체 상호작용에 관여한다. 당단백질-연관 시알산은 바이오필름에서 성장할 때 타네넬라 포시티아에 대한 주요 생체 내 영양 공급원으로 제안되었다(Roy, S., 2011, Microbiology, 157, 3195). 본 발명의 화합물의 시알리다제 저해 특성은 또한 생체 내에서 공생 및/또는 병원성 박테리아 성장의 저해, 특히 포유동물(예를 들어, 인간) 숙주에서 박테리아 바이오필름의 저해 또는 제거를 포함하여, 숙주-박테리아 세포 상호작용의 방해에 적용된다.
따라서, 화합물은 박테리아 바이오필름(예를 들어, 치은연하 플라크 바이오필름 및 점막 바이오필름)의 존재에 의해 매개되거나 이에 의해 특징지어지는 질환 및 장애의 치료 또는 예방에 적용된다.
이와 같은 질환은 치주 질환, 세균성 질염, 및 타네넬라 포시티아, 타네렐라 덴티콜라, 포르피로모나스 긴기발리스 및 가르드넬라 바기날리스의 감염에 의해 유발되는 질환을 포함한다(후자 종은 세균성 질염 및 조산과 연관됨).
공생 박테리아 성장의 조절
본 발명의 화합물의 시알리다제 저해 특성은 또한 숙주에서 미생물군(특히 공생 박테리아)의 조성의 조절, 예를 들어, 포유동물(예를 들어, 인간) 숙주에서 공생 박테리아의 조성의 조절에 적용된다. 장내 미생물군의 조절이 특히 바람직하다.
죽종형성
본 발명의 화합물은 시알리다제 저해제이고, 따라서 시알리다제가 죽종형성 과정에 관여하므로 죽종형성(Sukhorukov, V.N., et al., 2017, Curr. Pharm. Des., 23, 4696) 및 골관절염(Katoh, S., et al., 1999, J Immunol., 162, 5058)의 치료 또는 예방에 적용된다. 따라서, 본 발명의 화합물은 죽상동맥경화증의 치료 및 예방에 적용된다.
염증
본 발명의 화합물은 골관절염에서 TNF-α 유도 염증 과정에 관여하는 것으로 생각되는 시알리다제를 저해한다(Gee, K. et al., 2003, J Biol Chem. 278, 37275). 또한, 본 발명의 화합물은 TNF-α 활성을 억제하거나 저해할 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 화합물은 염증이 생리적 기능의 손상 및/또는 증상 및/또는 통증에 역할을 하는 임의의 장애에 적용된다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은, 예를 들어, 급성, 만성, 국소 또는 전신 염증을 감소 또는 제거하기 위해, 항염증제로서 사용될 수 있다.
염증은 조직이 미생물, 외상, 화학물질, 열, 추위, 일광화상 또는 임의의 다른 유해한 사건에 의해 손상될 때 발생한다. 내인성 화학물질(예를 들어, 브라디키닌, 히스타민 및 세로토닌)은 부상 또는 상해 시 방출되며, 이와 같은 화학물질은 조직 대식세포 및 다른 백혈구를 활성화시키고 유인한다. 이 과정 동안, TNF-α와 같은 화학 매개자가 방출되어, 염증을 일으킨다.
염증성 장애는 염증이 지속되거나 만성적인 장애이다. 이와 같은 상황에서, 장기간의 염증은 조직 파괴를 유발하고 광범위한 손상과 이환된 조직 및/또는 기관의 궁극적인 부전을 초래한다.
따라서, 본 발명의 화합물은 비-국소화 염증성 장애, 예를 들어, 하나 초과의 기관에 영향을 미치는 장애의 치료에 적용된다. 이와 같은 장애는 면역기능 장애로 인해 발생하는 장애를 포함한다(따라서 자가면역 성분이 있을 수 있다). 이와 같은 병태는 전신 홍반성 낭창(SLE), 경피증 및 과민증을 포함한다.
염증을 제2형 당뇨병의 발병과 연관시키는 증거가 점점 늘어나고 있다.
본 발명의 화합물은 또한 피부 염증 및 만성 전립선염, 사구체신염, 염증성 장 질환, 골반 염증성 질환, 재관류 손상, 류마티스 관절염, 이식 거부, 혈관염, 천식, 여드름, 골관절염, 구강 점막, 위장 염증, 안구, 비강 및 귀 염증 및 기타 스테로이드 반응성 염증성 장애를 포함하여, 국소 염증성 장애의 치료에 적용된다.
특히, 본 발명의 화합물은 피부 염증성 질환의 치료에 적용된다. 이는, 예를 들어, 광선 각화증, 여드름(심상성 좌창, 면포성 여드름, 주사성 좌창, 및 결절낭 여드름을 포함함), 알레르기성 접촉 피부염, 혈관성부종, 수포성 유사천포창, 피부 약물 반응, 다형 홍반, 홍반성 낭창, 광피부염, 건선성 관절염, 경피증 및 두드러기, 건선, 피부염(예를 들어, 아토피 피부염), 경피증, 스테로이드-반응성 피부 염증 장애(예를 들어, 요독증성 소양증) 및 태양, 방사선, 화학요법 및 환경 자극제에 대한 노출과 연관된 피부 병태의 치료에 적용된다.
본 발명의 화합물은 또한 염증성 자가면역 질환의 치료에 적용된다. 이와 같은 질환은 특정 조직 또는 기관(예컨대, 류마티스 관절염 및 강직성 척추염에서와 같은 근골격 조직), GI 관(예를 들어, 크론병 및 궤양성 대장염에서와 같음), CNS(예를 들어, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 운동 신경 질환, 파킨슨병 및 만성 피로 증후군에서와 같음), 췌장 베타 세포(예를 들어, 인슐린-의존성 당뇨병), 부신(예를 들어, 애디슨병), 신장(예를 들어, 굿파스쳐 증후군, IgA 신장병증 및 간질성 신염), 외분비선(예를 들어, 쇼그렌 증후군 및 자가면역 췌장염) 및 피부(예를 들어, 건선 및 아토피 피부염)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 치료할 수 있는 기타 염증성 장애는 골관절염, 치주 질환, 당뇨병(제2형 당뇨병 및 당뇨병성 신장 질환을 포함함), 만성 폐쇄성 폐질환, 죽상경화증, 이식편대숙주질환, 만성 골반 염증성 질환, 자궁내막증, 만성 간염 및 결핵과 같은 병태를 포함한다.
약량학
본 발명의 조성물 및 화합물은 정맥내, 근육내, 복강내, 피하, 경피, 기도(에어로졸), 직장, 질, 국소(협측 및 설하를 포함함) 투여를 포함하여 경구 또는 비경구 경로로, 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
투여되는 양은 이용되는 특정 투약 단위, 치료 기간, 치료되는 환자의 연령 및 성별, 치료되는 장애의 성질 및 정도, 및 선택되는 특정 화합물에 따라 광범위하게 변할 수 있다.
일반적으로, 투여되는 화합물의 유효량은 일반적으로 매일 약 0.01㎎/㎏ 내지 500㎎/㎏의 범위일 것이다. 단위 투약량은 0.05 내지 500㎎의 화합물을 포함할 수 있으며, 매일 1회 이상 투약될 수 있다. 화합물은 하기에 기재된 바와 같이, 경구, 비경구, 또는 국소적으로 통상적인 투약 단위 형태를 사용하여 약제학적 담체와 함께 투여될 수 있다.
바람직한 투여 경로는 경구 투여이다. 일반적으로 적합한 용량은 매일 수용자의 체중 킬로그램당 0.01 내지 500㎎의 범위, 바람직하게는 매일 체중 킬로그램당 0.1 내지 50㎎의 범위, 가장 바람직하게는 매일 체중 킬로그램당 1 내지 5㎎의 범위일 것이다.
원하는 용량은 바람직하게는 1일 투여를 위한 단일 용량으로 제시된다. 그러나, 하루 종일 적절한 간격으로 투여되는 2, 3, 4, 5 또는 6회 이상의 하위 용량이 또한 이용될 수 있다. 이러한 하위 용량은, 예를 들어, 단위 투약 형태당 0.001 내지 100㎎, 바람직하게는 0.01 내지 10㎎, 가장 바람직하게는 0.5 내지 1.0㎎의 활성 성분을 포함하는 단위 투약 형태로 투여될 수 있다.
제형
천연 공급원으로부터 단리될 때, idoBR1은 정제될 수 있다. 그러나, 본 발명의 조성물은 본 명세서에서 앞서 정의된 바와 같이, 생약, 식품 보충제, 식품 첨가제, 기능 식품, 음료의 형태 또는 생약 키트 또는 팩으로서 단일 용량을 취할 수 있다. 이와 같은 생약은 바람직하게는 이것이 사용 전에 표준 사양을 충족하는지 여부를 결정하기 위해 분석된다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 생약은 건조된 식물 재료일 수 있다. 대안적으로, 생약은 가공된 식물 재료일 수 있으며, 가공은 물리적 또는 화학적 전처리, 예를 들어, 분말화, 분쇄, 동결, 증발, 여과, 압착, 분무 건조, 압축, 초임계 용매 추출 및 팅크제 생산을 포함한다. 생약이 식물 전체(또는 이의 부분)의 형태로 투여되거나 판매되는 경우에, 식물 재료는 사용 전에 건조될 수 있다. 동결-건조, 분무 건조 또는 공기-건조를 포함하여 임의의 편리한 건조 형태가 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물은 극성 용매(예컨대, 에탄올/물 혼합물, 예를 들어, 50% v/v 이상(예를 들어, 최대 약 70% v/v) 에탄올/물 혼합물)에서의 추출에 의한 고분자량 성분, 예컨대, 단백질 및 다당류로부터 단리될 수 있다. 다른 적합한 기법은 다양한 막 기술을 포함한다. 이는 미세여과, 한외여과 및 나노여과를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 전기투석이 또한 하전된 화합물을 농축시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 특정 크기 미만의 분자만 통과시킬 수 있거나 분자의 전하에 의존하여 분자가 막을 통과할 수 있거나 통과하지 못하게 하는 공극 크기의 막을 사용한다. 음이온 및 양이온 교환 수지가 또한 화합물을 농축시키는 데 사용될 수 있다.
천연 공급원으로부터 단리될 때, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물은 정제될 수 있다. 화합물이 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 함께 제형화되는 실시형태에서, 예를 들어, 불활성 희석제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제를 포함하여 임의의 적합한 부형제가 사용될 수 있다. 적합한 불활성 희석제는 탄산나트륨 및 탄산칼슘, 인산나트륨 및 인산칼슘, 및 락토스를 포함하는 한편, 옥수수 전분 및 알긴산은 적합한 붕해제이다. 결합제는 전분 및 젤라틴을 포함할 수 있는 한편, 윤활제는 존재하는 경우 일반적으로 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석일 것이다.
약제학적 조성물은 임의의 적합한 형태를 취할 수 있고, 예를 들어, 정제, 엘릭시르, 캡슐, 용액, 현탁액, 분말, 과립 및 에어로졸을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 부품 키트의 형태를 취할 수 있으며, 키트는 사용을 위한 지침서 및/또는 단위 투약 형태로 복수의 상이한 성분과 함께 본 발명의 조성물을 포함할 수 있다.
경구용 정제는 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대, 불활성 희석제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 감미제, 향미제, 착색제 및 보존제와 함께 혼합된, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물을 포함할 수 있다. 적합한 불활성 희석제는 탄산나트륨 및 탄산칼슘, 인산나트륨 및 인산칼슘, 및 락토스를 포함하는 한편, 옥수수 전분 및 알긴산은 적합한 붕해제이다. 결합제는 전분 및 젤라틴을 포함할 수 있는 한편, 윤활제는 존재하는 경우 일반적으로 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 활석일 것이다. 원하는 경우, 정제는 위장관에서 흡수를 지연시키기 위해, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 다이스테아레이트와 같은 재료로 코팅될 수 있다. 경구용 캡슐은 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물이 고체 희석제와 혼합된 경질 젤라틴 캡슐, 및 활성 성분이 물 또는 오일, 예컨대, 땅콩유, 유동 파라핀 또는 올리브유와 혼합된 연질 젤라틴 캡슐을 포함한다.
직장 투여용 제형은, 예를 들어, 코코어 버터 또는 살리실레이트를 포함하는 적합한 기제를 포함하는 좌제로서 제공될 수 있다. 질 투여에 적합한 제형은 활성 성분에 추가적으로 당업계에 적절한 것으로 알려진 담체를 포함하는 페서리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 폼 또는 스프레이 제형으로 제공될 수 있다.
근육내, 복강내, 피하 및 정맥내 사용을 위해, 본 발명의 화합물은 일반적으로 적절한 pH 및 등장성으로 완충된 멸균 수용액 또는 현탁액으로 제공될 것이다. 적합한 수성 비히클은 링거 용액 및 등장성 염화나트륨을 포함한다. 본 발명에 따른 수성 현탁액은 현탁화제, 예컨대, 셀룰로스 유도체, 알긴산나트륨, 폴리비닐피롤리돈 및 트라가칸트 고무, 및 습윤화제, 예컨대, 레시틴을 포함할 수 있다. 수성 현탁액에 적합한 보존제는 에틸 p-하이드록시벤조에이트 및 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트를 포함한다.
본 발명의 화합물은 또한 리포솜 제형으로 제공될 수 있다.
경구 투여를 위해, 화합물 또는 화합물들은 고체 또는 액체 제제, 예컨대, 캡슐, 환제, 정제, 트로키, 로젠지, 용해물, 분말, 과립, 용액, 현탁액, 분산액 또는 애멀션(용액, 현탁액 분산액 또는 에멀션은 수성 또는 비수성일 수 있음)으로 제형화될 수 있다. 고체 단위 투약 형태는, 예를 들어, 계면활성제, 윤활제, 및 불활성 충전제, 예컨대, 락토스, 수크로스, 인산칼슘, 및 옥수수전분을 포함하는 통상적인 경질- 또는 연질-쉘 젤라틴 유형일 수 있는 캡슐일 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 화합물은 결합제, 예컨대, 아카시아, 옥수수전분, 또는 젤라틴, 투여 후 정제의 분해 및 용해를 돕는 것으로 의도된 붕해제, 예컨대, 감자 전분, 알긴산, 옥수수 전분 및 구아 검, 정제 과립화의 흐름을 개선시키고 정제 다이 및 펀치의 표면에 정제 재료의 부착을 방지하는 것으로 의도된 윤활제, 예를 들어, 활석, 스테아르산, 또는 마그네슘, 칼슘 또는 아연 스테아레이트, 정제의 미적 품질을 향상시키고 환자에게 보다 만족스럽게 만드는 것으로 의도된 염료, 착색제, 및 향미제와 함께 통상적인 정제 기제, 예컨대, 락토스, 수크로스, 및 옥수수전분과 함께 정제화된다.
경구 액체 투약 형태에 사용하기에 적합한 부형제는, 약제학적으로 허용 가능한 계면활성제, 현탁화제 또는 유화제의 첨가 여부에 관계없이, 희석제, 예컨대, 물 및 알코올, 예를 들어, 에탄올, 벤질 알코올, 및 폴리에틸렌 알코올을 포함한다.
본 발명의 화합물은 또한 비경구, 즉 피하, 정맥내, 근육내, 또는 복강내로 투여될 수 있다.
이와 같은 실시형태에서, 화합물은, 약제학적 담체(이는 멸균 액체 또는 액체의 혼합물일 수 있음)와 함께 생리학적으로 허용 가능한 희석제 중 주사 가능한 용량으로 제공된다. 적합한 액체는 약제학적으로 허용 가능한 계면활성제(예컨대, 비누 또는 세제), 현탁화제(예컨대, 펙틴, 카보머, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸셀룰로스, 또는 카복시메틸셀룰로스), 또는 유화제 및 기타 약제학적 아쥬반트의 첨가 여부에 관계없이, 물, 식염수, 수성 덱스트로스 및 관련 당 용액, 알코올(예컨대, 에탄올, 아이소프로판올, 또는 헥사데실 알코올), 글라이콜(예컨대, 프로필렌 글라이콜 또는 폴리에틸렌 글라이콜), 글리세롤 케탈(예컨대, 2,2-다이메틸-1,3-다이옥솔란-4-메탄올), 에터(예컨대, 폴리(에틸렌-글라이콜) 400), 오일, 지방산, 지방산 에스터 또는 글라세라이드, 또는 아세틸화 지방산 글리세라이드를 포함한다. 본 발명의 비경구 제형에 사용될 수 있는 적합한 오일은 석유, 동물성, 식물성, 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 참기름, 면실유, 옥수수유, 올리브유, 페트롤라툼, 및 미네랄 오일이다. 적합한 지방산은 올레산, 스테아르산, 및 아이소스테아르산을 포함한다. 적합한 지방산 에스터는, 예를 들어, 에틸 올레에이트 및 아이소프로필 미리스테이트이다.
적합한 비누는 지방 알칼리 금속, 암모늄, 및 트라이에탄올아민 염을 포함하고, 적합한 세제는 양이온성 세제, 예를 들어, 다이메틸 다이알킬 암모늄 할라이드, 알킬 피리디늄 할라이드, 및 알킬아민 아세테이트; 음이온성 세제, 예를 들어, 알킬, 아릴, 및 올레핀 설포네이트, 알킬, 올레핀, 에터, 및 모노글리세라이드 설페이트, 및 설포석시네이트; 비이온성 세제, 예를 들어, 지방 아민 옥사이드, 지방산 알칸올아마이드, 및 폴리옥시에틸렌폴리프로필렌 공중합체; 및 양쪽성 세제, 예를 들어, 알킬-베타-아미노프로피오네이트, 및 2-알킬이미다졸린 4급 암모늄 염뿐만 아니라, 혼합물을 포함한다.
본 발명의 비경구 조성물은 전형적으로 용액 중에 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물을 약 0.5 내지 약 25 중량% 포함할 것이다. 보존제 및 완충액이 또한 사용될 수 있다. 주사 부위에서 자극을 최소화하거나 없애기 위해, 이와 같은 조성물은 친수성-친유성 비(hydrophile-lipophile balance; HLB)가 약 12 내지 약 17인 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 이와 같은 제형에서 계면활성제의 양은 약 5 내지 약 15 중량%의 범위이다. 계면활성제는 상기 HLB를 가지는 단일 성분일 수 있거나 원하는 HLB를 가지는 2종 이상의 성분의 혼합물일 수 있다. 비경구 제형에 사용되는 계면활성제의 예는 폴리에틸렌 솔비탄 지방산 에스터의 부류, 예를 들어, 솔비탄 모노올레에이트, 및 프로필렌 옥사이드와 프로필렌 글라이콜의 축합에 의해 형성된 소수성 염기를 가지는 에틸렌 옥사이드의 고분자량 부가물이다.
본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 화합물들은 또한 국소적으로 투여될 수 있으며, 그렇게 될 때 담체는 용액, 연고 또는 겔 베이스를 적합하게 포함할 수 있다. 기제는, 예를 들어, 페트롤라툼, 라놀린, 폴리에틸렌 글라이콜, 밀랍, 미네랄 오일, 희석제, 예컨대, 물 및 알코올, 및 유화제 및 안정화제 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 국소 제형은 약 0.1 내지 약 10% w/v(단위 부피당 중량) 농도의 화합물을 포함할 수 있다.
부가적으로 사용될 때, 본 발명에 따라 사용하기 위한 화합물 또는 화합물들은 하나 이상의 다른 약물(들)과 함께 사용하기 위해 제형화될 수 있다. 따라서, 부가적 사용은 다른 약물(들)과 양립 가능하도록(또는 상승 효과를 내도록) 설계된 특정 단위 투약, 또는 화합물 또는 화합물들이 하나 이상의 효소와 혼합된 제형에 반영될 수 있다. 부가적 사용은 또한 본 발명의 약학 키트의 조성물에 반영될 수 있으며, 여기서 본 발명의 화합물은 효소와 함께 (예를 들어, 단위 용량 어레이의 일부로서) 공동 포장된다. 부가적 사용은 또한 화합물 또는 화합물들 및/또는 효소의 공동 투여와 관련된 정보 및/또는 지침에 반영될 수 있다.
화장료 제형
본 발명의 화장료 조성물은, 예를 들어, 보습 조성물, 세정 조성물, 또는 피부에 이익을 제공할 수 있는 임의의 조성물로부터 선택될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은, 예를 들어, 하기 기재된 것으로부터 선택되는, 화장용으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 화장료 조성물은 세정 조성물이다. 적합한 세정 조성물은 실온에서 고체 또는 반고체이다. 유용한 세정 조성물의 예는, 글리세린 비누를 포함한 지방산 비누, 합성 세제 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 고체 세정 조성물은 문헌[Soap Technology for the 1990's]에 광범위하게 교시되어 있으며, 이의 내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다. 세정 조성물은 유동성이 있는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 실시형태에서, 세정 조성물은 글리세린 비누를 포함한다. 본 발명에 유용한 글리세린 비누의 예는 미국 특허 제4,405,492호 및 제4,879,063호에 개시된 것을 포함하지만, 이들로 제한되지 않으며, 이의 개시내용은 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
적합한 지방산 비누의 예는 대략 10 내지 22개(카복실 탄소를 포함함)의 탄화수소 사슬 길이로부터 유래된 비누를 포함하며, 포화되거나 불포화될 수 있다. 비누는, 예를 들어, 나트륨염, 칼륨염, 암모늄염, 트라이에탄올암모늄염 및 이들의 혼합물일 수 있다.
적합한 합성 세제는 원하는 목적에 대해 당업계에 알려진 것을 포함한다. 개인 세정에 유용한 세제의 예는 이세싸이오네이트, 사코시네이트, 및 순수한 사슬 길이 변형체일 수 있는 글리세릴 에터 설포네이트, 또는 코코넛 오일과 같은 상업용 오일로부터 유래된 것을 포함한다. 다른 적합한 세제는 음이온성 아실 사코시네이트, 메틸 아실 타우레이트, N-아실 글루타메이트, 알킬 설포석시네이트, 알킬 포스페이트 에스터, 에톡실화 알킬 포스페이트 에스터, 트라이데세스 설페이트, 단백질 축합물, 에톡실화 알킬 설페이트 및 알킬 아민 옥사이트의 혼합물, 베타인, 설타인 및 이들의 혼합물을 포함한다. 1 내지 12개 에톡시기를 가지는 알킬 에터 설페이트, 특히 암모늄 및 소듐 라우릴 에터 설페이트가 포함된다.
화장료 조성물은 보습 조성물일 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물의 다른 선택적인 성분은 향료, 방향제, 보존제, 착색제, 염료, 고결방지제, 및 피부 및 모발 관리 성분을 포함하지만, 이로 제한되지 않는 개인 관리 성분을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 발명에 유용한 적합한 개인 관리 성분의 예는 안전하고 유효한 양의 습윤제, 자외선 차단 활성제, 피부 진정제, 항자극제, 항염증제, 연화제, 피부 컨디셔닝제, 보습제, 탈취제, 발한억제제, 인공 태닝제, 항균제, 여드름 방지제, 주름 방지제, 피부 위축 방지제, 피부 탄력제, 가려움 방지제, 항진균제, 국소 마취제, 피부톤 균일화제, 활성 천연 성분, 원치않는 모발의 외관을 최소화하거나 재성장을 지연시키는 작용제, 피부결 조절제, 및 추가적인 세정제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일 실시형태에서, 화합물은, 예를 들어, 건성 피부의 치료 및 연화제 적용에 이용되는 것과 같은 유중수(w/o) 에멀션을 사용함으로써 물 또는 알코올성 물 추출물로부터 사용될 수 있다.
연화제는 피부 표면이나 각질층에 남아 윤활제 역할을 하고, 박편을 감소시키며, 피부 외관을 개선시키는 능력에 의해 기능한다. 전형적인 연화제는 지방 에스터, 지방 알코올, 미네랄 오일, 폴리에터 실록산 공중합체 등을 포함한다. 적합한 연화제의 예는 프로필렌 글라이콜("PPG")-15 스테아릴 에터, PPG-10 세틸 에터, 스테아레스-10, 올레스-8, PPG-4 라우릴 에터, 비타민 E 아세테이트, PEG-7 글리세릴 코코에이트, 라놀린, 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 비타민 E 아세테이트, PEG-7 글리세릴 코코에이트 및 이들의 조합물이 바람직하다.
적합한 습윤제의 예는 다가 알코올을 포함한다. 적합한 다가 알코올은 글리세롤(또한 글리세린으로도 알려짐), 폴리알킬렌 글라이콜, 알킬렌 폴리올 및 이들의 유도체(프로필렌 글라이콜, 다이프로필렌 글라이콜, 폴리프로필렌 글라이콜, 폴리에틸렌 글라이콜 및 이들의 유도체를 포함함), 솔비톨, 하이드록시프로필 솔비톨, 헥실렌 글라이콜, 1,3-다이뷰틸렌 글라이콜, 1,2,6-헥산트라이올, 에톡실화 글리세롤, 프로폭실화 글리세롤 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
적합한 피부 진정제는 판테놀, 비사보롤, 알란토인, 알로에, 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
적합한 컨디셔닝제는 다이메티콘 프로필 PG-베타인, 다이메티콘 코폴리올, 폴리쿼터늄-10, 구아, 구아 유도체, 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 적합한 여드름 방지 활성 성분은 살리실산, 황, 락트산, 글리콜산, 피루브산, 요소, 레조르시놀, N-아세틸시스테인, 레티노산, 벤조일 퍼옥사이드, 옥토피록스, 트라이클로산, 아젤라산, 페녹시에탄올, 페녹시프로판올, 플라보노이드, 이들의 유도체, 및 이들의 조합물을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 살리실산 및 벤조일 퍼옥사이드가 바람직하다.
실시예
본 발명은 이제 특정 실시예를 참조하여 설명될 것이다. 이는 단지 예시적이고 설명의 목적을 위한 것이며: 어떠한 방식으로든 청구된 독점권 또는 기재된 발명에 대한 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 이들 실시예는 본 발명을 실시하기 위해 현재 고려되는 최상의 방식을 구성한다.
실시예 1: idoBR1에 의한 시알리다제 저해
서론
시알리다제 또는 뉴라미니다제는 올리고당 및 당접합체로부터 말단 시알산의 절단을 촉매하는 효소이다. 이는 생물학적 시스템에서 시알산-포함 분자의 대사를 조절하는 데 중요한 역할을 한다. 이는 또한 많은 바이러스 및 병원성 박테리아, 예컨대, 타네넬라 포시티아에 대한 발병 인자이다. 인간 호중구의 시알리다제 활성은 숙주 면역 반응에서 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다(Glanz, V.Y., 2019, European J. Pharmacol. 842, 345).
방법. 시알리다제 분석은, 20mM의 인산나트륨 완충액에서 0.1mM의 메틸움벨리페릴-N-아세틸뉴라민산(pH 7.2)의 존재 하에 인큐베이션한 2.5nM의 시알리다제(티. 포시티아 유래의 NanH를 포함함) 및 2.8mM 및 0.28mM의 저해제(또는 저해제 없이 물)를 사용하였다. pH 10.5의 60mM 탄산나트륨 완충액의 첨가를 통해 반응을 30초 및 60초에서 정지시켰다. 450㎚에서 형광 방출, 350㎚에서 여기를 측정함으로써 형광성 메틸움벨리페론(MU)의 방출을 정량화하였다. 시알리다제 활성 백분율을 저해제가 없는 반응과 비교하여 30초 내지 60초 사이의 형광 변화로 표현하였다. 반응을 삼중으로 수행하였다.
결과
idoBR1은 사용된 농도(2.8mM[36%] 및 0.28mM[42%]) 둘 다에서 30% 초과의 저해로 명확하게 용량 의존적이지 않는 시알리다제의 저해를 제공하였다. 두 가지 농도에서 보이는 유사한 저해는 저해가 경쟁적이지 않음을 시사한다.
실시예 2: THP -1 세포에서 내인성 시알리다제 활성의 저해
서론
본 연구의 목적은 idoBR1 또는 1% 초과의 idoBR1을 포함하는 오이 추출물(Q-액틴 배취 B17CF001)이 인간 THP-1(단핵구 유사) 세포 배양물에서 시알리다제의 활성에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 결정하는 것이었다. 이 연구의 결과는 시알리다제의 발현 감소 또는 idoBR1에 의한 효소의 저해의 조합일 수 있었다.
방법
시알리다제 활성 테스트를 위한 THP -1 세포주 처리
머캅토에탄올 및 글루타민을 보충한 RPMI 배지에서 THP-1 세포를 배양하여 배양 플라스크에서 80% 컨플루언스를 얻은 다음, 흡인하고 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 그 다음 세포 펠릿을 1㎖의 RPMI 완전 배지에 재현탁하고 혈구계산판을 사용하여 통상적으로 계수하였다. 세포(5×106)를 별도의 접시에서 PMA(10 ng/㎖)와 함께 인큐베이션하여 THP-1 세포를 분화시켰다. 시알리다제 활성을 결정하기 위해, THP-1 세포를 idoBR1 및 오이 추출물-Q-액틴(배취 번호 B17CF001)으로 각각 100 ㎍/㎖ 내지 12.5 ㎍/㎖ 및 200 ㎍/㎖ 내지 25 ㎍/㎖의 농도로 1시간 동안 전처리한 다음, 24시간 동안 LPS(1 ㎍/㎖ 자극을 수행하였다. 인큐베이션 후, 세포를 사용하여 시알리다제 활성을 결정하였다.
THP-1 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고, 0.25M 수크로스, 1mM EDTA, 및 0.2mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드를 포함하는 아주 차가운 완충액에 재현탁하였다. 세포 현탁액을 낮은 설정(6% 진폭)으로 얼음 위에서 15초 동안 초음파처리한 다음(VibracellTM; Sonics and Materials Inc., 미국 코네티컷주 뉴타운 소재), 4℃에서 15분 동안 25,000g에서 원심분리하였다. 생성된 상청액을 사용하여 리소좀 시알리다제 활성을 결정하였다. 상기 기재된 바와 같은 Bio-Rad 단백질 결정 키트를 사용하여 상청액의 단백질 정량화를 수행하였다. 리소좀 시알리다제 활성의 결정을 위해, 총 단백질 200㎍을 리소좀 시알리다제-특이적 기질인 4-메틸움벨리페릴-α-N-아세틸-D-뉴라민산(Sigma) 40 n㏖, 10 μ㏖의 아세트산나트륨 완충액(pH 4.6), 및 200㎍의 소 혈청 알부민과 200㎕의 총 부피로 혼합하였다. 시알리다제 반응을 37℃에서 1시간 동안 진행시키고 0.25M의 글리신 NaOH(pH 10.4)의 첨가에 의해 종결시켰다. 방출된 4-메틸움벨리페론을 365㎚의 여기 파장 및 448㎚의 방출 파장에서 형광법으로 측정하였다(Synergy 2 멀티모드 마이크로플레이트 리더). 시알리다제 활성은 16시간의 세포 인큐베이션 시점에서 최대인 것으로 밝혀졌다.
결과
IdoBR1에 의한 내인성 시알리다제 활성의 저해
Figure pct00011
오이 추출물 배취 번호 B17CF007(Q-액틴)에 의한 내인성 시알리다제 활성의 저해
Figure pct00012
시알리다제 활성은 LPS(1 ㎍/㎖) 처리 후 16시간 시점에서 가장 높은 것으로 밝혀졌고, 따라서 이 배양 시간을 THP-1 세포에서 시알리다제 활성에 대한 idoBR1 및 오이 추출물의 효과의 추가 평가에 사용하였다.
2시간 동안 테스트 샘플로 처리한 다음 IdoBR1에 의해 16시간 동안 LPS 자극을 한 THP -1 세포에서의 상대적인 시알리다제 활성
Figure pct00013
2시간 동안 테스트 샘플로 처리한 다음 오이 추출물 배취 번호 B17CF007(Q-액틴)에 의해 16시간 동안 LPS 자극을 한 THP -1 세포에서의 상대적인 시알리다제 활성
Figure pct00014
50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖에서 테스트한 표준 idoBR1은 LPS 대조군과 비교하여 각각 0.63 및 0.55의 상대적인 시알리다제 활성의 최대 감소를 나타내었다. 100 ㎍/㎖ 및 200 ㎍/㎖에서 Q-액틴은 대조군(LPS)과 비교하여 각각 0.7 및 0.62로 상대적인 시알리다제 활성의 최대 감소를 나타내었다.
실시예 3: ELISA를 사용하여 idoBR1의 존재 하에 CD44-HA(히알루론산) 결합 활성에 대한 THP -1 세포주 처리
서론
CD44는 조혈, 점막 림프 조직으로의 귀소, 및 염증 조직으로의 림프구 침윤에 관여하는 것으로 나타났다. CD44 및 CD168과 히알루론산(HA)의 상호작용(RHAMM)은 타이로신 키나제, 단백질 키나제 C, FAK, 및 PI3K, MAPK, NFκB, 및 RAS뿐만 아니라, 염증 및 암에 필요한 세포골격 성분의 활성화를 포함하여, 수많은 세포 행동을 유도할 수 있다. 대부분의 세포가 CD44의 일부 형태를 발현하지만, 모든 세포가 HA에 구성적으로 결합하는 것은 아니다(Kryworuchko, M. et al., 1999, Cellular Immunol., 194, 54; Nandi et al., 2000, J. Biol. Chem.,　275, 14939). 기능적으로 활성인 HA 접착 CD44는 MAPK 활성화를 통한 시알리다제의 유도를 통해 생산된다. LPS 유도 염증 반응에서 MARK의 역할을 이해하기 위해 수행된 연구는 MAPK p42/44 매개 TNF-α 생산 및 후속적인 TNF-α 매개 p38 활성화로 인하여, 시알리다제 활성에 의해 HA 접착 CD44를 생산하는 것으로 나타났다(Gee, K. et al., 2003, J Biol Chem. 278, 37275).
방법
머캅토에탄올 및 글루타민을 보충한 RPMI 배지에서 THP-1 세포를 배양하여 배양 플라스크에서 80% 컨플루언스를 얻은 다음, 흡인하고 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 그 다음 세포 펠릿을 1㎖의 RPMI 완전 배지에 재현탁하고 혈구계산판을 사용하여 통상적으로 계수하였다. 세포(5×106)를 별도의 접시에서 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)(10 ng/㎖)와 함께 인큐베이션하여 THP-1 세포를 분화시켰다. CD44-HA 결합 활성을 결정하기 위해, THP-1 세포를 idoBR1 또는 오이 추출물-Q-액틴(배취 번호 B17CF001)으로 각각 100 ㎍/㎖ 내지 12.5 ㎍/㎖ 및 200 ㎍/㎖ 내지 25 ㎍/㎖의 농도로 1시간 동안 전처리한 다음, 24시간 동안 LPS(1 ㎍/㎖) 자극을 수행하였다. 인큐베이션 후, 추가 분석을 위해 세포 용해물을 취하였다.
50mM 카보네이트/바이카보네이트 완충액(pH 9.6)에서 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 대하여 항-CD44 단클론성 항체(Invitrogen, 2㎍)를 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 0.05% Tween 20을 포함하는 PBS(PBS-T 세척 용액)를 사용하여 결합되지 않은 항체를 제거하였다. 1% BSA를 사용하여 웰을 차단하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 웰에 200㎕를 첨가함으로써 PBS-T 세척 용액을 사용하여 웰을 철처하게 3회 세척하였다. 웰에 50㎕의 세포 용해물을 첨가하고 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 각각의 세척 전 30초 동안 웰을 침지시켜 200㎕의 PBS-T를 첨가함으로써 웰을 3회 세척하였다. 바이오틴화-히알루론산(HA) 항체에 이어 스트렙트아비딘-HRP를 첨가하여 면역 복합체를 형성하고 37℃에서 60분 동안 인큐베이션하였다. 용액을 흡인하고 웰을 30초 동안 침지시켜 200㎕의 세척 용액으로 웰을 3회 세척하였다. 50㎕의 색원체 A 및 색원체 B를 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 빛에서 떨어져서 15분 동안 인큐베이션하였다. 50㎕의 정지 용액을 첨가함으로써 반응을 정지시키고 450㎚에서 흡광도를 판독하였다.
결과
IdoBR1에 의한 CD44-HA 결합의 저해
Figure pct00015
오이 추출물 배취 번호 B17CF007(Q액틴)에 의한 CD44-HA 결합의 저해
Figure pct00016
CD44 결합 HA는 LPS-자극(1 ㎍/㎖) (THP-1 세포에서 110.45 ng/㎖인 것으로 밝혀졌다. 100 ㎍/㎖의 Ido-BR1은 LPS 대조군과 비교하여 THP-1 세포에서의 LPS-유도 염증 반응에서 CD44-HA 수준의 가장 높은 감소(26.62%)를 나타내었다. 200 ㎍/㎖에서 오이 추출물-Q-액틴은 LPS 대조군과 비교하여 THP-1 세포에서의 LPS 유도 염증 반응에서 CD44-HA 수준의 가장 높은 감소(30.60%)를 나타내었다.
실시예 4: 인간 혈액에서 idoBR1 및 Q- 액틴 오이 추출물에 의한 TNF -알파 생산의 감소
서론
단핵구(대식세포) 및 T 림프구에 의해 생산되는 사이토카인인 TNF-α는 염증 반응을 생성하는 인자의 캐스케이드에서 핵심 요소이며, 질환 상태의 주요 조율자로서 많은 다면발현성 효과를 가진다(Beutler, B. et al., 1989, Annual Review of Immunology, 7, 625). TNF-α의 생물학적 효과는 이의 농도 및 생산 부위에 따라 다르며: 저농도에서, TNF-α는 바람직한 항상성 및 방어 기능을 생성할 수 있지만, 고농도에서는, 전신적으로 또는 특정 조직에서, TNF-α는 다른 사이토카인, 특히 인터류킨-1(IL-1)과 상승 작용하여 많은 염증 반응을 악화시킬 수 있다. 이 연구의 목적은 인간 전혈에서 TNF-α 수준을 조정하는 능력과 관련하여 idoBR1 또는 idoBR1을 포함하는 오이 추출물의 항염 활성을 평가하는 것이었다.
방법
혈액 및 버피 코트 분획을 스코틀랜드 국립 수혈 서비스(Scottish National Blood Transfusion Service; SNBTS)(영국 글래스고 소재)에서 공급하였다. Ficoll Histopaque(1.077 g/ℓ), 지질다당류(살모넬라 아보르투스 에쿠이(Salmonella abortus equi) 유래)를 Sigma-Aldrich Co. Ltd.(영국 소재)에서 구입하였다. PGE는 Cayman Chemical Co.(미국 미시간주 앤아버 소재)의 제품이었다. TNF-α ELISA 분석을 위한 인간 TNF-α 항체 쌍은 Invitrogen/Life Sciences Europe 제품이었다. 모든 약물을 Gibco BRL(영국 소재)의 RPMI 1640 배지에 용해시켰다.
혈액은 기증 후 임의의 추가 처리 없이 사용되었다. 이는 HIV, B형 및 C형 간염, CMV 및 말라리아와 같은 기생충 질환(국립 수혈 서비스가 테스트함)에 대해 모두 음성으로 테스트되었음을 보장함으로써 정의된 정상적인 건강한 기증자로부터 스코틀랜드 국립 수혈 서비스에 의해 친절하게 공급되었다. 이는 또한 항상 50 pg/㎖ 미만인 TNF-α의 기초 수준을 측정함으로써 혈액 채취 당시에 급성 염증성 질환이 없는 것으로 본 발명자들의 실험실에서 확인되었다.
세포 자극 및 TNF -α의 측정
전혈의 분취량(800㎕)을 결과에 표시된 바와 같이 RPMI 1640에 용해된 화합물과 함께 적절한 사전 인큐베이션 기간 동안 인큐베이션하고, 그 후 LPS를 첨가하고 공기 중 5% CO2의 가습(100%) 대기에서 37℃에서 추가 20시간 동안 인큐베이션을 계속하였다. 인큐베이션 기간의 종료시, 실온에서 30초 동안 10,000g에서 원심분리하여 혈장 또는 배양 배지로부터 상청액을 수집하고 인간 TNF-α ELISA 시스템(BioSource Europe S.A., 벨기에 소재, Invitrogen 공급)을 사용하여 TNF-α 수준을 측정하였다.
결과
인간 혈액에서 LPS-유도 TNF-α에 대한 오이 추출물 및 idoBR1의 강력한 활성은 다음 2개의 표에 나타내어져 있다. 0.09%로 idoBR1을 포함하는 오이 추출물(시험용 Q-액틴)은 TNF-α를 감소시킨 한편, idoBR1은 10μM 미만의 웰에서 효과적이며 idoBR1이 단독으로 오이 추출물의 항염 효과를 담당할 수 있음을 확인하였음이 나타내어져 있다. Q-액틴은 여기서 사용된 시험용 추출물에서보다 10 내지 100배 더 많은 idoBR1을 포함한다. 10배 더 적은 idoBR1을 포함하는 Q-액틴 추출물은 TNF-α에 대하여 10배 더 적은 효과를 나타내었다(데이터는 제시 생략).
두 번째 연구는 사전 인큐베이션한 인간 혈액에서 idoBR1에 대한 훨씬 더 큰 활성(0.01μM에서 유의미함)을 나타내었다. 48시간 사전 인큐베이션한 idoBR1에 대한 IC50은 혈액에 대하여 182nM이고, 인간 단핵구 세포주 THP-1 세포에 의한 TNF-α의 생산 저해에 대해 27nM인 것으로 계산되었다. idoBR1은 트립판 블루 흡수 또는 MTT 염료 전환에 의해 측정된 바와 같이 THP-1 세포의 생존력을 현저하게 변경시키지 않았다. (10μM에서) idoBR1의 저해 작용은 덱사메타손(50μM)을 이용한 동일한 전처리의 저해 작용과 비슷하였으며, 이때 저해는 각각 50% 초과 및 65% 초과였다. 미페프리스톤(글루코코르티코이드 수용체 길항제) 단독과 LPS는 THP-1 세포로부터 TNF-α 생산을 크게 증폭시켰으나, 덱사메타손의 존재 하에 미페프리스톤 덱사메타손의 억제 작용을 역전시켰지만 idoBR1의 억제 작용은 역전시키지 못했다. 데이터는 idoBR1이 인간 혈액에서 TNF-α의 생산을 저해할 수 있음을 분명하게 나타낸다. 따라서, 이것은 강력한 항염증제일 수 있는 것으로 보인다. 또한, 이것은 스테로이드 수용체 경로와 다른 신규 메커니즘을 통해 작용할 수 있는 것으로 보인다.
인간 혈액에서 LPS -자극된 TNF -α 생산에 대한 다양한 idoBR1 농도의 효과를 나타내는 표. 전혈을 다양한 농도의 idoBR1과 함께 48시간 동안 사전 인큐베이션한 후 LPS(10 ㎍/㎖)를 첨가하고 추가 20시간 동안 인큐베이션을 계속하였다. 37℃(5% CO 2 의, 100% 습도)에서 인큐베이션한 다음, 혈장을 원심분리에 의해 혈액으로부터 수집하고 혈장 샘플 중 TNF -α의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다.
Figure pct00017
값은 n = 3의 평균 ± s.d.를 나타낸다. *는 LPS 단독(제로 idoBR1)과 비교하여 P < 0.05를 나타낸다.
인간 혈액에서 LPS -자극된 TNF -α 생산에 대한 다양한 오이 추출물(0.09% idoBR1) 농도의 효과를 나타내는 표. 전혈을 다양한 농도의 오이 Q- 액틴 추출물과 함께 48시간 동안 사전 인큐베이션한 후 LPS(10 ㎍/㎖)를 첨가하고 추가 20시간 동안 인큐베이션을 계속하였다. 37℃(5% CO 2 의, 100% 습도)에서 인큐베이션한 다음, 혈장을 원심분리에 의해 혈액으로부터 수집하고 혈장 샘플 중 TNF -α의 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 값은 n = 3의 평균 ± s.d.를 나타낸다. *는 LPS 단독과 비교하여 P < 0.05를 나타낸다.
Figure pct00018
실시예 5: LPS 자극 THP -1 세포에서 사이토카인 IL-10, IL-12 및 IL- 1β에 대한 idoBR1 및 오이 추출물의 효과
서론
IL-10은 항염증성 사이토카인이며 전염증성 사이토카인의 중요한 음성 조절제이다. T 세포, B 세포, 및 단핵구/대식세포를 포함하여, 다양한 세포 유형은 상이한 면역 활성화 조건 하에 IL-10을 분비한다(Moore, K. et al., 1993, Annu. Rev. Immunol., 11, 165). 시험관내 연구는 IL-10이 IL-1β, IL-6, TNF-α, 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자, 및 IL-12의 방출 및 기능을 억제하고(Casatella, M. et al., 1993, J. Exp. Med., 178, 2207; de Waal Malefyt, R. et al., 1991, J. Exp. Med., 174, 1209; Fiorentino, D. et al., 1991, J. Immunol., 147, 3815), 이에 의해 면역 반응 및 염증의 제어를 위한 정상적인 내인성 피드백 메커니즘을 제안함(Asadullah, K. et al., 1998, J. Clin. Invest. 101, 783;, Joosten, L. et al., 1997, Arthritis Rheum., 40, 249)을 보였다. 연구는 IL-10이 전사 수준에서 IL-12 p40 및 p35뿐만 아니라, TNF-a 유전자 발현에 대해 억제 효과를 발휘함을 입증하였다(Aste-Amezaga, M. et al., 1998, J. Immunol., 160, 5936). 몇몇 자가면역 질환의 발병에 관여하는 전염증성 사이토카인 중에서, IL-12는 IFN-γ생산 및 T 헬퍼(Th) 1 자가면역 반응의 발달의 주요 자극제이다(Paunovic, V. et al., 2008, Rheumatology, 47, 771). IL-12는 다양한 사이토카인과 상승 작용을 하고 IFN-γ 및 전염증성 사이토카인의 생산을 유도하는 것으로 기록되어 있다. 단핵구/대식세포는 감염시 또는 LPS의 자극에 의해 염증을 매개하는 TNF-α와 함께 IL-1β를 생산한다. 이는 독립적으로뿐만 아니라 다른 매개제와 결합하여 염증 반응 및 이화 작용을 유도한다. IL-1β에 의한 세포의 생물학적 활성화는 막 수용체, 즉 IL-1R1(IL-1RI, CD121a)과의 상호작용에 의해 매개되며, 이는 또한 또 다른 IL-1 그룹인 IL-1α에 결합할 수 있다.
방법
THP -1 단핵구에 대한 ELISA 분석
ELISA 분석을 위한 샘플 준비
80% 컨플루언스 배양 플라스크의 세포를 흡인하고 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 그 다음 세포 펠릿을 1㎖의 RPMI 완전 배지에 재현탁하고 96 웰 마이크로나이터 플레이트의 각각의 웰에 1×105개 세포/웰을 파종하였다. 24시간 인큐베이션 후, PMA(10 ng/㎖)를 96 웰 플레이트에 첨가하여 THP-1 세포를 분화시켜 TNF-α 생산을 결정하고, THP-1 세포를 2배 연속적으로 희석한 200 ㎍/㎖ 내지 25 ㎍/㎖의 농도로 idoBR1 또는 오이 추출물-Q-액틴(배취 번호 B17CF001)으로 1시간 동안 전처리한 다음, 2시간 동안 LPS(100 ng/㎖) 자극을 수행하였다. 인큐베이션 후, 각각의 웰로부터 세포 상청액을 멸균 마이크로 원심분리 튜브로 흡인하고, 1000 rpm에서 2 내지 3분 동안 원심분리하였다. 그 다음 세포 상청액을 ELISA를 사용하여 사이토카인의 존재를 평가하는 데 사용하였다.
샌드위치 ELISA 분석
IL-12, IL-1β, 또는 IL-10에 대한 항체(R&D Systems, 미국)로 코팅된 ELISA 플레이트를 다음 연구에 사용하였다. 각각의 웰에 50㎕의 Assay Diluent RD1F를 잘 혼합한 후에 첨가하였다. 웰당 200㎕의 샘플(idoBR1 또는 추출물), 또는 대조군을 첨가하고 접착 스트립으로 덮었다. 실온에서 2시간 동안 인큐베이션한 후, 각각의 웰을 흡인하고 세척 완충액(400㎕)로 4회 세척하였다. 마지막 세척 후, 흡인 또는 경사분리(decanting)에 의해 임의의 남은 세척 완충액을 제거하였다. 플레이트를 뒤집고 깨끗한 종이 타월로 빨아들여 닦아내었다. 각각의 웰에 200㎕의 적절한 인간 접합체를 첨가한 다음 이를 새로운 접착 스트립으로 덮고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 흡인/세척을 반복하였다. 그 다음 200㎕의 기질 용액을 각각의 웰에 첨가하고 빛이 차단된 실온에서 20분 동안 추가로 인큐베이션하였다. 각각의 웰에 50㎕의 정지 용액을 첨가하였다. 웰의 색상이 청색에서 황색으로 변하였다. 450㎚에서 30분 이내에 OD를 측정하였다.
결과
Figure pct00019
Figure pct00020
IdoBR1의 상이한 농도에서 IL-12의 감소
Figure pct00021
오이 추출물(배취 번호 B17CF007 )의 상이한 농도에서 IL-12의 감소
Figure pct00022
IdoBR1의 상이한 농도에서 IL- 1β의 감소
Figure pct00023
오이 추출물(배취 번호 B17CF007 )의 상이한 농도에서 IL- 1β의 감소
Figure pct00024
idoBR1 및 오이 추출물 둘 다에 의해 각각 3.04 및 3.65배의 항염증 마커인 IL-10의 증가가 있었다. IL-10 결과는 항염 효과를 나타낸다. 100 ㎍/㎖의 idoBR1은 LPS 대조군과 비교하여 THP-1 세포에서의 LPS-유도 염증 반응에서 IL-12 수준의 24.53% 감소를 나타내었다. 200 ㎍/㎖의 오이 추출물 Q-액틴은 LPS 대조군과 비교하여 THP-1 세포에서의 LPS-유도 염증 반응에서 IL-12 수준의 25.88% 감소를 나타내었다. 100 ㎍/㎖의 idoBR1은 LPS 대조군과 비교하여 THP-1 세포에서의 LPS-유도 염증 반응에서 IL-1β 수준의 24.07% 감소를 제공하였다. 200 ㎍/㎖의 오이 추출물 Q-액틴은 THP-1 세포에서의 LPS-유도 염증 반응에서 IL-1β 수준의 가장 높은 감소(22.53%)를 나타내었다.
실시예 6: Q- 액틴을 이용한 체육관 운동은 인간 혈액에서 측정된 IL-10을 증가시킨다
서론
본 발명자들은 idoBR1 및 오이 추출물(Q-액틴)에 의한 THP-1 세포에서 항염증성 사이토카인인 IL-10의 조절을 보였다. Q-액틴을 복용하고 자연적으로 근육 염증 반응을 유발하는 격렬한 운동 요법을 받은 사람들에서 사이토카인의 조절을 여기에서 테스트한다.
방법
7명의 위약 대상체와 10명의 Q-액틴 대상체를 사용하는 운동 회복 실험에서, 혈액 샘플에서 IL-10을 측정하였다. 대상체는 제1일, 제2일, 제3일 및 제4일(회복일)에 집중적인 운동을 하면서, 제0일부터 제4일 동안 1일 2회 10㎎의 Q-액틴 또는 위약(둘 다 캡슐)을 제공받았다. 제1일, 제2일, 제3일 운동 전후 및 제4일 회복 후에 혈액 샘플을 채취하였다. ELISA 분석에 의해 IL-10을 측정하였다.
결과
Q-액틴을 제공받은 대상체는 일단 운동이 시작되고 IL-10이 상당히 더 많이 증가하는 경향을 나타내었으며, 이는 LPS-자극 THP-1 세포에서 얻은 결과를 확인하는 것이다.
집중적인 운동 루틴을 제공받은 대상체 유래의 혈액의 IL-10 반응을 나타내는 표(+ 및 - Q- 액틴 , idoBR1이 1% 초과인 오이 추출물)
Figure pct00025
실시예 7: idoBR1 및 idoBR1을 포함하는 오이 추출물의 MAPK 신호전달 효과
서론
MAPK 신호전달 캐스케이드는 염증 반응의 개시에 필수적인 역할을 한다. 염증성 사이토카인 유전자의 유도는 MAPK의 활성화를 필요로 하고, 세포외 조절 단백질 키나제/미토겐-활성화 단백질 키나제(ERK/MAPK) 경로의 자극은 하류 염증 반응에 필수적이다(Kaminska, B., 2005, Biochim. Biophys. Acta, 1754, 253; Buchholz, K. et al., 2007, Infection and Immunity, 75, 5924). MAPK 경로는 또한 COX-2, iNOS, IL-1β 및 TNF-α를 포함하여 염증 매개자 유전자의 발현에도 필요하다. ERK 및/또는 p38 MAPK는 IL-1β의 상향 조절에 관여하는 것으로 보고되었다(Baldassare, J. et al., 1999, J. Immunol., 162, 5367).
방법
머캅토에탄올 및 글루타민을 보충한 RPMI 배지에서 THP-1 세포를 배양하여 배양 플라스크에서 80% 컨플루언스를 얻은 다음, 흡인하고 1500 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 그 다음 세포 펠릿을 1㎖의 RPMI 완전 배지에 재현탁하고 혈구계산판을 사용하여 통상적으로 계수하였다. 세포(5×106)를 별도의 접시에서 PMA(10 ng/㎖)와 함께 인큐베이션하여 THP-1 세포를 분화시켰다. p38 및 p42/44의 단백질 발현을 결정하기 위해, THP-1 세포를 idoBR1(100 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖) 및 오이 추출물(Q-액틴 배취 번호 B17CF001)(200 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖)로 1시간 동안 전처리한 다음, 2시간 동안 LPS(1 ㎍/㎖) 자극을 수행하였다. 인큐베이션 후, 세포를 수확하고 전체 단백질을 단리하였다.
웨스턴 블롯 절차
세포 펠릿을 용해하고, Bio-Rad 단백질 결정 분석(Bio-Rad)을 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 총 세포 단백질에 대하여 8% 폴리아크릴아마이드 SDS 겔 전기영동을 수행한 다음, 폴리비닐리덴 다이플루오라이드 막(Thermoscientific)으로 옮겼다. 막을 마우스 항-포스포-p38 mAb(Thermoscientific) 또는 마우스 항-포스포-p42/44 mAb(Thermoscientific)로 탐색한 다음, 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합 염소 항-마우스 다클론성 항체(Thermoscientific)로 탐색하였다. ECL(Amersham Biosciences)에 의해 모든 면역블롯을 시각화하였다. 100 ㎍/㎖ 및 200 ㎍/㎖에서 테스트한 테스트 샘플 Q-액틴은 LPS 대조군과 비교하여 각각 0.92 및 0.83의 인산화된 p38 발현의 상대적인 감소를 나타내었다. 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖의 idoBR1의 경우, 이것은 LPS 대조군과 비교하여 각각 0.88 및 0.80의 인산화된 p38 발현의 감소를 나타내었다. 100 ㎍/㎖ 및 200 ㎍/㎖에서 테스트한 Q-액틴은 LPS 대조군과 비교하여 각각 0.81 및 0.78의 인산화된 ERK 42/44 발현의 상대적인 감소를 나타내었다. 50 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖의 idoBR1은 LPS 대조군과 비교하여 각각 0.80 및 0.76의 인산화된 ERK 42/44 발현의 감소를 나타내었다.
p42/44의 상대적인 발현을 나타내는 표
Figure pct00026
p38의 상대적인 발현을 나타내는 표.
Figure pct00027
따라서, idoBR1 및 idoBR1을 포함하는 오이 추출물(Q-액틴)은 둘 다 염증 반응에서 필수적인 역할을 하는 MAPK 신호전달 캐스케이드를 감소시킬 수 있는 것으로 나타났다.
실시예 8: idoBR1의 경구 이용 가능성 및 생체 내 안정성
서론
이 연구의 목적은 소변에서 측정함으로써 섭취한 오이/게르킨 유래의 idoBR1의 경구 이용 가능성을 조사하는 것이었다. 이 연구는 idoBR1의 경구 이용 가능성 및 가능한 전신 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 화합물이 변경되지 않고 막을 통과하는 능력을 뒷받침하므로, 또한 국소 이용 가능성도 뒷받침한다.
방법
파리지앵 피클링 오이(Lidl 2013에서 구입한 종자)를 유기농으로 재배하였으며, 남성 지원자 1명 및 여성 지원자 1명이 각각 정오에 3개를 먹었다. 각각의 경우에 소비한 신선한 오이의 중량은 260g이었으며, 30g의 비슷한 중량을 소비한 모든 오이에서 제거하고, 이를 분석을 위해 보관하였다. 지원자는 실험 전 15시간 동안 쿠커비타세아에 식품을 먹지 않았다. 섭취 전 소변 샘플을 3시간에 걸쳐 t = 0으로 수집한 다음, 여성의 경우 9시간, 남성의 경우 15시간 동안 샘플을 수집하였다. 30g의 오이 샘플을 50% 에탄올(수성)에서 균질화하고 15시간 추출 후 이를 여과하고 idoBR1 분획을 H+ 형태로 양이온 교환 수지 IR120에 결합시켰다. 컬럼을 물로 세척한 후, 2M 암모니아 용액으로 대체된 재료를 건조시키고(52.3㎎) Pierce TriSil을 사용하여 트라이메틸실릴화 후 GC-MS에 의해 분석하였다. 그 다음 남은 51㎎의 재료에는 비교 정량화 목적으로 0.2㎎의 카스타노스페르민을 추가하였다. 암모니아 용액에 의해 대체된 재료를 동일한 양이온 교환 수지(현재 암모늄 형태)를 통해 두 번째로 실행하여 강염기(암모늄 형태로 IR120에 결합할 것임)를 감소시키는 것을 제외하고 양이온 교환 수지를 사용하여 유사하게 처리하였으며, 유지되지 않은 재료만 보관하였다. 소변 idoBR1 분획을 건조시키고 물 중에서 최대 20㎖로 만들었다. 각각 500㎕를 샘플링하고 0.025㎎의 카스타노스페르민을 첨가하였다.
결과
오이의 GCMS 분석
이는 Perkin Elmer Turbomass Gold GCMS에서 수행되었다. 10.33분의 주요 피크의 스펙트럼은 진짜 idoBR1, 900288 PhytoQuest Ltd, 영국 소재)의 GCMS 스펙트럼과 일치하였다. 상대 반응 계수는 진짜 BR1(900125, PhytoQuest Ltd) 및 카스타노스페르민 사이에서 1:2인 것으로 계산되었다. 동일한 반응 계수를 가정하면, idoBR1의 양은 30g 샘플에서 1.5㎎인 것으로 추정되었으며, 이는 지원자가 대략 260/30×1.5㎎ = 13㎎의 idoBR1을 소비하였음을 의미한다.
소변 결과
오이 섭취 전에 수집한 소변 샘플은 idoBR1의 머무름 시간(10.33분)에서 유의한 피크를 나타내지 않았다. 15시간 후 남성은 카스타노스페르민 참조 피크 면적과 비교하여 대략 2.4㎎의 idoBR1의 배설을 나타내었지만, 최종적인 물질 균형을 위해 섭취 및 배설에 대한 보다 정확한 측정을 필요할 것이다. 암컷은 대략 2.1㎎의 idoBR1을 배설하였다. 이 연구는 idoBR1이 경구로 이용 가능하고 소변에서 측정될 수 있음을 확인해 주었으며, 이는 idoBR1이 경구 섭취로부터 혈류로 들어갈 수 있고, 적어도 상당한 비율이 소변에서 변화없이 배설된다는 것을 의미한다. 이는 화합물이 소화관의 막을 통과할 수 있고 소변에서 중요하다는 것을 나타낸다. 소변 분석에서 명백한 접합은 관찰되지 않았다.
남은 idoBR1은 체내에 더 오래 남아 있을 가능성이 있다. 따라서, 이것은 강력한 항염증제이고 오래 지속될 수 있는 것으로 보인다.
실시예 9: 미세아교세포에 대한 idoBR1의 효과
서론
미세아교세포는 중추신경계(CNS)의 상주 대식세포이다. 이 세포는 CNS에서 활성 면역 방어의 주요 형태이다. 신경퇴행성 장애, 예컨대, 알츠하이머병 및 파킨슨병에서, 미세아교세포는 만성적으로 활성화되어 정상적인 CNS 활성을 추가로 방해하는 전염증성 사이토카인의 방출을 촉진시킨다. 생물활성 식품 성분이 산화 스트레스를 감소시키고/시키거나 전염증성 유전자 발현을 감소시킴으로써 염증의 영향을 완화시킬 수 있는 정도를 조사하는 데 상당한 관심이 있다.
방법
idoBR1을 0, 20, 40 및 80 ㎍/㎖ + 및 - 차선 LPS에서 뮤린 미세아교세포주 BV-2의 세포 배양물에 사용하였다. 24시간 후에 TNF-α 및 아질산염의 생산을 측정하였다. 흥미롭게도, Q-액틴 유래의 idoBR1은 자극된 미세아교세포에 의해 TNF-α 및 아질산염 생산을 감소시키는 데 효과적인 것으로 밝혀졌다.
Figure pct00028
세포를 추가 24시간 동안 LPS로 자극하기 30분 전에 화합물로 전처리하였다. 모든 실험의 데이터는 적어도 3회 실험의 평균 ± SEM으로 표시된다. 일원 ANOVA에 이어 사후 스튜던트 뉴만-쿨스(post-hoc Student Newman-Keuls) 검정을 사용하여 값을 비교하였다. GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석하였다. *p<0.05; **p<0.01; ***p<0.001
균등물
상기 설명은 현재 본 발명의 바람직한 실시형태를 상술한다. 이들 설명을 고려할 때 당업자는 이의 실시에서 수많은 수정 및 변형이 일어날 것으로 예상한다. 이러한 수정 및 변형은 본 명세서에 첨부된 청구범위 내에 포괄되는 것으로 의도된다.

Claims (53)

  1. (2R,3R,4R,5S)-3,4,5-트라이하이드록시피페리딘-2-카복실산(idoBR1)을 포함하는 조성물의 생산 방법으로서,
    (e) 쿠커비타세아에(Cucurbitaceae) 과의 식물을 포함하는 식물 공급원으로부터 식물 재료를 제공하는 단계;
    (f) 상기 식물 재료를 분별하여 idoBR1이 풍부한 추출물을 생산하는 단계;
    (g) 상기 추출물을 (i) 시알리다제에 대한 저해 활성; (ii) TNF-알파에 대한 저해 활성; 또는 (iii) IL-10 자극 활성에 대하여 분석하는 단계; 및
    (h) 상기 분석된 추출물을 화장료용으로, 기능 식품용으로 또는 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체와 함께 제형화하여 화장료, 기능 식품 또는 약제학적 조성물을 생산하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 식물 공급원은 쿠쿠미스(Cucumis) 속, 예를 들어, 쿠쿠미스 사티버스(Cucumis sativus) 종의 식물을 포함하는, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 식물 공급원은 쿠커비타(Cucurbita) 속, 예를 들어, 쿠커비타 멜로스(Cucurbita melos) 또는 쿠커비타 모스카타(Cucurbita moschata) 종의 식물을 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 재료는 열매, 열매 부분, 열매 추출물, 열매 즙, 종자 및/또는 잎을 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물 재료는 오이를 포함하고, 선택적으로 쿠쿠미스 사티버스 종의 식물 유래의 오이를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, idoBR1은 단리되고, 예를 들어, 적어도 1% w/w, 5% w/w, 10% w/w; 15% w/w; 20% w/w; 25% w/w; 30% w/w; 35% w/w; 40% w/w; 45% w/w; 50% w/w, 60% w/w, 70% w/w, 80% w/w, 90% w/w, 99% w/w(건조 중량 기준)의 수준으로 조성물에 존재하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, idoBR1은 최대 5% w/w(건조 중량 기준)의 수준으로 조성물에 존재하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, idoBR1은 최대 1% w/w(건조 중량 기준)의 수준으로 조성물에 존재하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (d)의 조성물은 화장료 조성물인, 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (d)의 조성물은 기능 식품 조성물인, 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (d)의 조성물은 약제학적 조성물인, 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단계 (d)의 조성물은 (i) 약제학적 팩, 키트 또는 환자 팩의 형태; 또는 (ii) 단위 투약 형태인, 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 제형화 단계는 상기 분석된 추출물을 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합하는 것을 포함하는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 상기 추출물은 시알리다제에 대한 저해 활성에 대하여 분석되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 상기 추출물은 TNF-알파에 대한 저해 활성에 대하여 분석되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (c)에서 상기 추출물은 IL-10 자극 활성에 대하여 분석되는, 방법.
  17. 치료 또는 예방에 사용하기 위한 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득 가능하거나, 상기 방법에 의해 생산되는, 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 염증성 장애를 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 염증성 장애는 (a) 비-국소화 염증성 장애(예를 들어, 전신 홍반성 낭창(SLE), 경피증 및 과민증); (b) 만성 전립선염; (c) 사구체신염; (d) 염증성 장 질환; (e) 골반 염증성 질환; (f) 재관류 손상; (g) 류마티스 관절염; (h) 이식 거부; (i) 혈관염; (j) 천식; (k) 여드름; (l) 골관절염; (m) 구강, 점막, 또는 위장 염증; (n) 안구 염증; (o) 비강 염증; (p) 귀 염증; (q) 스테로이드-반응성 염증성 장애; (r) 피부 염증성 질환(예를 들어, 광선 각화증, 심상성 좌창, 면포성 여드름, 주사성 좌창, 및 결절낭 여드름, 알레르기성 접촉 피부염, 혈관성부종, 수포성 유사천포창, 피부 약물 반응, 다형 홍반, 홍반성 낭창, 광피부염, 건선성 관절염, 경피증 및 두드러기, 건선, 피부염, 아토피 피부염, 경피증, 스테로이드-반응성 피부 염증 장애, 요독증성 소양증 및 방사선, 화학요법 및 환경 자극제에 대한 노출과 연관된 피부 병태); (s) 염증성 자가면역 질환(예를 들어, 강직성 척추염, 크론병, 궤양성 대장염, 알츠하이머병, 다발성 경화증, 운동 신경 질환, 파킨슨병, 만성 피로 증후군, 인슐린-의존성 당뇨병, 애디슨병, 굿파스쳐 증후군, IgA 신장병증, 간질성 신염, 쇼그렌 증후군 및 자가면역 췌장염); (t) 골관절염; (u) 치주 질환; (v) 당뇨병성 신장 질환; (w) 만성 폐쇄성 폐질환; (x) 죽상경화증; (y) 이식편대숙주질환; (z) 만성 골반 염증성 질환; (a') 자궁내막증; (b') 만성 간염; (c') 결핵 및 (d') 예를 들어, 태양, 알레르겐, 자극제 또는 화상에 대한 노출에 의해 유발되는, 피부 염증으로부터 선택되는, 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 상기 염증성 장애는 자가면역 질환, 천식 또는 알레르기인, 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 염증성 장애는 그레이브스병; 류마티스 관절염; 하시모토 갑상선염; 백반증; 당뇨병(예를 들어, 제I형 당뇨병 또는 제II형 당뇨병); 악성 빈혈; 다발성 경화증; 사구체신염; 전신 홍반성 낭창(SLE, 루프스); 쇼그렌 증후군; 경피증; 건선; 강직성 척추염; 중증 근무력증; 천포창; 다발성근염; 피부근염; 포도막염; 길랭-바레 증후군; 크론병; 궤양성 대장염 및 염증성 장 질환(IBD)으로부터 선택되는 자가면역 질환인, 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 상기 염증성 장애는 아토피 알레르기, 알레르기 비염, 알레르기 결막염, 아토피 피부염, 과호산구 증가증, 과민성 대장 증후군, 알레르겐-유도 편두통, 세균성 알레르기, 기관지 알레르기(천식), 접촉성 알레르기(피부염), 지연 알레르기, 꽃가루 알레르기(고초열), 약물 알레르기, 벌독 알레르기, 물림 알레르기(bite allergy), 위장 알레르기; 식품 알레르기; 및 물리적 알레르기, 예를 들어, 한랭 두드러기, 혈관성부종, 콜린성 두드러기 및 광과민성으로부터 선택되는 알레르기인, 조성물.
  23. 제18항에 있어서, 상기 염증성 장애는 이식편대숙주질환; 사르코이드증; 혈관 염증성 질환, 예를 들어, 파종성 혈관 내 응고, 죽상동맥경화증, 가와사키 병; 혈관염; 쇼그렌 증후군; 건선성 관절염; 장병성 관절염; 반응성 관절염 및 염증성 장 질환과 연관된 관절염으로부터 선택되는, 조성물.
  24. 제17항에 있어서, 종양 형성을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 종양 형성은 양성, 전암성 및 악성 종양 형성, 과형성, 화생 및 이형성으로부터 선택되는, 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 종양 형성은 악성 종양 형성(암)인, 조성물.
  27. 제26항에 있어서, 상기 악성 종양 형성은 (a) 암종; (b) 모세포종; (c) 백혈병; (d) 림프종; (e) 골수종; (f) 육종 및 (g) 혼합형 암으로부터 선택되는, 조성물.
  28. 제26항에 있어서, 상기 악성 종양 형성은 방광, 유방(예를 들어, 원발성 유방 종양, 림프절 비전이 유방암, 유방의 침습적 관 선암종 및 비내막 유방암), 결장(예를 들어, 결장직장 암종, 예컨대, 결장 선암종 및 결장 샘종), 신장, 표피(예를 들어, 악성 흑색종), 간, 폐(예를 들어, 선암종, 부신피질, 비인두, 소세포 폐 암 및 비-소세포 폐 암종), 식도, 담장, 난소, 췌장(예를 들어, 외분비 췌장 암종), 위, 자궁 경부, 갑상선, 전립선, 위장 시스템(예를 들어, 위장 기질 종양) 또는 피부(예를 들어, 편평세포 암종)의 암종으로부터 선택되는 암종인, 조성물.
  29. 제26항에 있어서, 상기 악성 종양 형성은 림프성 백혈병, 예를 들어, 전구 세포 백혈병, 성숙한 B-세포 백혈병, 성숙한 T-세포 백혈병 및 NK 세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 질환 및 골수이형성 증후군으로부터 선택되는 백혈병인, 조성물.
  30. 제26항에 있어서, 상기 악성 종양 형성은 (a) 호지킨 림프종; (b) 비-호지킨 림프종, 예를 들어, 전구 세포 림프종, 성숙한 B-세포 림프종, 성숙한 T-세포 림프종 및 NK-세포 림프종; (c) 버킷 림프종 및 (d) 림프세망 신생물, 예를 들어, 외투 세포 림프종으로부터 선택되는 림프종인, 조성물.
  31. 제26항에 있어서, 상기 악성 종양 형성은 골육종; 연골육종; 평활근육종; 횡문근육종; 중피종; 섬유육종; 혈관육종 또는 혈관내피종; 지방육종; 신경교종; 성상세포종; 점액육종 및 중간엽 및 혼합 중배엽성 종양으로부터 선택되는 육종인, 조성물.
  32. 제17항에 있어서, 바이러스 감염을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 조성물.
  33. 제17항에 있어서, 박테리아 감염을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 조성물.
  34. 제33항에 있어서, 상기 방법은 생체 내에서 공생 및/또는 병원성 박테리아 성장을 저해하는 것을 포함하는, 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 상기 방법은 포유동물(예를 들어, 인간) 숙주에서 숙주-박테리아 세포 상호작용의 방해, 및/또는 박테리아 바이오필름 형성의 저해 또는 제거를 포함하는, 조성물.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 방법은 박테리아 바이오필름(예를 들어, 치은연하 플라크 바이오필름 및 점막 바이오필름)의 존재에 의해 매개되거나 이에 의해 특징지어지는 질환 및 장애의 치료 또는 예방을 포함하는, 조성물.
  37. 제17항에 있어서, 치주 질환, 세균성 질염 및/또는 타네넬라 포시티아(Tannerella forsythia), 타네렐라 덴티콜라(Tannerella denticola), 포르피로모나스 긴기발리스(Porphyromonas gingivalis) 또는 가르드넬라 바기날리스(Gardnerella vaginalis)의 감염에 의해 유발되는 질환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 조성물.
  38. 제17항에 있어서, 죽종 형성(atherogenesis), 예를 들어, 죽상동맥경화증을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 조성물.
  39. 제17항에 있어서, 포유동물 숙주에서 공생 박테리아 성장을 조절하는 방법에서 사용하기 위한, 조성물.
  40. 제39항에 있어서, 상기 방법은 포유동물, 예를 들어, 인간인 숙주에서 공생 박테리아의 조성의 조절을 포함하는, 조성물.
  41. 질환의 치료를 위한 약제의 제조, 또는 제18항 내지 제40항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 방법에서 사용하기 위한, 제17항에 정의된 조성물의 용도.
  42. 화장료, 기능 식품, 생약 또는 약제학적 조성물로서, 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득 가능하거나, 상기 방법에 의해 생산되는 조성물을 포함하고, 선택적으로 화장료용으로, 기능 식품용으로 또는 약제학적으로 허용 가능한 부형제 또는 담체를 더 포함하는, 화장료, 기능 식품, 생약 또는 약제학적 조성물.
  43. 피부의 종창 또는 홍반의 감소를 위한 미용 방법으로서, 제42항에 규정된 바와 같은 조성물을, 예를 들어, 피부에 국소 적용함으로써, 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  44. 보충 식료품 또는 음료를 생산하는 방법으로서, (a) 제42항에 규정된 바와 같은 조성물을 제공하는 단계; 및 (b) 단계 (a)의 조성물을 식료품 또는 음료에 첨가하여 보충 식료품 또는 음료를 생산하는 단계를 포함하는, 방법.
  45. 화장료, 기능 식품 또는 약제학적 조성물의 품질을 모니터링하는 방법으로서, (a) 조성물의 샘플을 제공하는 단계; 및 (b) 상기 샘플을 (i) 시알리다제에 대한 저해 활성; (ii) TNF-알파에 대한 저해 활성; 또는 (iii) IL-10 자극 활성에 대하여 분석하는 단계를 포함하는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 상기 화장료, 기능 식품 또는 약제학적 조성물은 idoBR1을 포함하는, 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 화장료, 기능 식품 또는 약제학적 조성물은 쿠커비타세아에 과의 식물을 포함하는 식물 공급원 유래의 식물 재료를 포함하는, 방법.
  48. 제47항에 있어서, 상기 식물 공급원은 쿠쿠미스 속, 예를 들어, 쿠쿠미스 사티버스 종의 식물을 포함하는, 방법.
  49. 제47항 또는 제48항에 있어서, 상기 식물 재료는 열매, 열매 부분, 열매 추출물, 열매 즙, 종자 및/또는 잎을 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 상기 식물 재료는 오이를 포함하는, 방법.
  51. 제50항에 있어서, 상기 식물 재료는 쿠쿠미스 사티버스 종의 식물 유래의 오이를 포함하는, 방법.
  52. 제24항 내지 제40항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 방법에서 사용하기 위한, idoBR1.
  53. 제24항 내지 제40항 중 어느 한 항에 규정된 바와 같은 치료 방법으로서, 유효량의 idoBR1을 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
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