KR20220039616A - 바실러스 효소군 이용 생물전환된 기능성 약콩분말을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 용도 - Google Patents
바실러스 효소군 이용 생물전환된 기능성 약콩분말을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 전두유에 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) 균주 유래의 효소액을 처리하여 다양한 생리활성 기능이 향상된 약콩생물전환 분말을 포함하는 조성물에 관한 것으로, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 (Bacillus polyfermenticus) 균주에서 유래된 다양한 분해 효소 및 펩타이드 합성 효소가 혼합된 발효액으로 전두유를 처리하여 저분자의 기능성 아미노산 및 펩타이드가 형성되는 것을 확인하고, 약콩생물전환 분말이 항산화 활성, 행동장애 개선과 같은 기능성 효과가 나타나는 것을 확인함으로써, 약콩생물전환 분말을 유효성분으로 함유하는 행동장애 개선 조성물을 제공하는 것이다.
Description
본 발명은 약콩생물전환 분말을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 전두유에 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) 균주 유래의 효소액을 처리하여 다양한 생리활성 기능이 향상된 약콩생물전환 분말을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
운동수행능력이란 근력을 이용하여 운동을 수행하는 능력으로 운동수행 능력이 떨어지게 되거나 불균형을 이루게 되면 비정상적인 움직임이나 보행을 초래함으로써 정상적인 움직임을 손상시키며, 자세를 불량하게 만든다. 또한 운동수행능력 저하로 인해 운동량이 부족하게 되어 체력저하 및 비만, 고지혈증, 고혈압 등의 문제를 일으킬 수 있다. 그러므로 정상적인 건강한 생활을 하기 위해서는 운동수행능력을 향상하도록 해야 한다.
운동수행능력을 향상시키기 위한 방법으로는 규칙적인 운동, 식이요법, 및 운동수행능력 향상 보조제 등이 사용되고 있다. 운동수행능력 향상을 위한 기능성 보조제와 관련된 연구는 동서양을 막론하고 활발하게 수행되고 있다. 그러나 서양에서 사용하는 운동수행능력 향상 보조제들은 카페인, 아나볼릭 스테로이드 등으로 대부분이 부작용을 갖고 있다. 이에 최근에는 안전성이 보장된 천연물을 이용한 기능성 보조제를 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있으나 아직 미비한 실정이므로, 운동수행능력을 효과적으로 증강시키면서 부작용이 없는 보조제에 대한 연구가 요구된다.
콩은 몸에 좋은 단백질 및 지방과 각종 기능성 성분을 함유하고 있어, 영양학적으로 매우 우수한 이상적인 식품으로 식생활에 있어 매우 중요하며 필수적인 식품이다. 이와 더불어, 최근에는 항암 특성 및 면역성 강화 등 새로운 생리적 기능이 더욱 알려지면서 기능성 식품으로서 콩의 식품 영양학적 가치는 날로 증대되고 있다.
콩의 대표적인 가공식품 중 하나인 두유(soy milk)는 콩의 단백질 이용률을 높인 대표적인 대두가공제품으로 대두 단백질과 필수아미노산 및 필수지방산이 풍부하며 철분, 인, 칼륨 등의 무기질과 이소플라본, 사포닌, 및 피틴산 등 기능성 성분인 생리활성물질이 다량 함유되어 있어 기능성 영양 음료로 알려져 있다. 또한 두유에 단백질 분해효소를 처리하여 대두 단백질을 분해시켜 소화, 흡수를 촉진하는 영양적 기능을 비롯하여 혈압강화, 칼슘 흡수촉진, 항 알러지 및 혈??콜레스테롤 저하작용 등 생리활성을 갖는 펩타이드를 생산하여 기능성을 개선하는 연구가 수행되고 있다. 그러나 운동수행능력 향상 효능에 관해서는 아직까지 알려져 있지 않다.
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 기능성이 향상된 약콩생물전환 분말 및 이의 제조방법을 제공하는 것으로, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 (Bacillus polyfermenticus) 균주에서 유래된 다양한 분해 효소 및 펩타이드 합성 효소가 혼합된 발효액으로 전두유를 처리하여 저분자의 기능성 아미노산 및 펩타이드가 형성되는 것을 확인하고, 약콩생물전환 분말이 항산화 활성, 행동장애 개선과 같은 기능성 효과가 나타나는 것을 확인함으로써, 약콩생물전환 분말을 유효성분으로 함유하는 행동장애 개선 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 생물전환용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 또는 이들의 혼합물을 전두유에 처리하는 단계를 포함하는 약콩생물전환 분말 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 또는 이들의 혼합물을 이용하여 발효된 전두유를 유효성분으로 포함하는 행동장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 또는 이들의 혼합물을 이용하여 발효된 전두유를 유효성분으로 포함하는 행동장애의 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스 (Bacillus polyfermenticus) 균주에서 유래된 다양한 분해 효소 및 펩타이드 합성 효소가 혼합된 발효액으로 전두유를 처리하여 저분자의 기능성 아미노산 및 펩타이드가 형성되는 것을 확인하고, 약콩생물전환 분말이 항산화 활성, 행동장애 개선과 같은 기능성 효과가 나타나는 것을 확인함으로써, 약콩생물전환 분말 및 이의 제조 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 균주의 유전자 지도 및 효소군의 유전자를 나타내는 그림이다.
도 2는 전두유와 약콩생물전환 분말의 콩 단백질 분해도 및 콩펩타이드 생성 정도를 확인한 결과이다.
도 3은 전두유 및 약콩생물전환 분말의 항산화 활성을 평가한 결과이다.
도 4는 전두유 및 약콩생물전환 분말의 행동장애 개선 효과를 평가한 결과이다.
도 5는 산화 스트레스 하에서 전두유 및 약콩생물전환 분말의 행동장애 개선 효과를 평가한 결과이다.
도 2는 전두유와 약콩생물전환 분말의 콩 단백질 분해도 및 콩펩타이드 생성 정도를 확인한 결과이다.
도 3은 전두유 및 약콩생물전환 분말의 항산화 활성을 평가한 결과이다.
도 4는 전두유 및 약콩생물전환 분말의 행동장애 개선 효과를 평가한 결과이다.
도 5는 산화 스트레스 하에서 전두유 및 약콩생물전환 분말의 행동장애 개선 효과를 평가한 결과이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 이와 같은 점을 감안하여 본 발명자들은 행동장애 개선 기능이 우수한 약콩생물전환 분말물을 함유하는 기능성 조성물을 개발하고자 예의 노력한 결과, 발효식품으로부터 분리한 GRAS 발효식품 미생물이 분비생산하는 다양한 단백질 분해효소 및 펩타이드 합성효소가 혼합되어있는 효소군을 사용하여 전두유를 가수분해한 약콩생물전환 분말물을 함유하는 조성물의 경우 행동장애 개선 효과가 우수하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 생물전환용 조성물을 제공한다.
상기 생물전환이란 미생물 또는 미생물이 생산하는 효소의 생물학적 반응을 이용하여 기존 소재(기질)를 변환하는 기술로, 구체적으로 상기 생물전환은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주가 생산하는 다양한 효소들이 포함되어 있는 배양상등액인 효소군을 사용하여 콩 또는 약콩(기질)을 변환하는 것을 뜻하며, 상기의 생물전환을 통해 만들어진 생성물을 약콩생물전환 분말이라고 하였다.
상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주는 2010년 08월 25일자로 생물자원센터(KCTC)에 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) Kimchi라는 명칭으로 수탁되었으나, 이후 명확한 균주의 종명이 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus)로 밝혀짐에 따라 2018년 06월 27일 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01로 종명이 변경되었다.
상기 배양액은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주를 배양한 인공 배지일 수 있고, 상기 발효물은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주를 이용하여 발효된 천연 배지일 수 있다.
상기 인공 배지는 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) 또는 세균을 배양할 수 있는 상업적으로 제조되는 합성 배지일 수 있으며, 예컨대, TBS(Tryptic Soy Broth), TSB(Tryptic Soy Broth) NB(Nutrient Broth), 및 LB(Luria-Bertani broth)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 천연 배지는 세균으로 발효될 수 있는 천연물을 의미하며, 예컨대 감자, 토마토, 우유와 같은 자연산물을 이용한 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배양액 및 발효물은 프로테아제(protease), GGT(Gamma-glutamyltransferase, 감마-글루타밀 전이효소), 및 나토키나아제(Nattokinase)의 활성을 나타낼 수 있다.
상기 프로테아제(protease)는 단백질분해효소로 단백질을 이루고 있는 아미노산간의 펩티드 결합을 가수분해하는 효소이며, 어떤 단백질 분해효소의 경우 단백질의 아미노 말단이나 (aminopeptidase), 카르복실 말단을 (carboxypeptidase) 자르는 엑소펩티다아제(exopeptidase) 가 있고, 어떤 경우는 단백질의 중간을 자르는 엔도펩티다아제(endopeptidase, 예, 트립신, 케모트립신, 펩신, 파페인, 엘라스테아제) 가 있다. 상기 GGT(Gamma-glutamyltransferase, 감마-글루타밀 전이효소)는 감마-글루타밀 화합물의 글루타밀기를 적당한 수용체(아민)로 전이하는 효소로, 트렌스아실라아제의 일종이다. 상기 나토키나아제(Nattokinase)는 콩을 발효시킬 때 낫토균(Bacillus natto)이 콩의 영양성분을 섭취 및 생육하면서 만들어 내는 혈전용해효소로서 비타민 B군과 다량의 항산화 효소를 함유하고 있다.
또한, 본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 또는 이들의 혼합물을 전두유에 처리하는 단계를 포함하는 약콩생물전환 분말 제조 방법을 제공한다.
상기 약콩생물전환 분말이란 콩과의 여러해살이 덩굴풀의 열매인 약콩을 미생물 또는 미생물이 생산하는 효소와 반응시켜 약콩 속에 포함된 탄수화물 및 단백질 등이 절단하거 분해되어 생성된 생성물의 분말 형태를 뜻하며, 구체적으로 상기 약콩생물전환 분말은 약콩을 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주가 생산하는 다양한 효소들이 포함되어 있는 배양상등액인 효소군을 사용하여 변환시켜 생성된 생성물의 분말을 의미한다.
상기 약콩은 대두, 흰콩, 서리태, 강낭콩, 완두콩 등의 콩과 식물의 열매를 뜻하며, 상기 콩과 식물의 열매의 종류에 한정되는 것은 아니다.
상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 또는 이들의 혼합물은 전두유에 3%(v/v) 내지 7%(v/v) 농도로 처리될 수 있으며, 바람직하게는 5%(v/v) 농도로 처리될 수 있다.
상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 또는 이들의 혼합물은 35℃ 내지 40℃에서 3 시간 내지 5 시간 동안 처리할 수 있으며, 바람직하게는 37℃에서 4 시간 동안 처리할 수 있다.
상기 약콩생물전환 분말은 항산화 활성을 나타낼 수 있다.
또한, 본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 또는 이들의 혼합물을 이용하여 발효된 전두유를 유효성분으로 포함하는 행동장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 행동장애는 도파민의 과도한 사멸 및 부족으로 나타나는 운동성 저하 및 수면시간 감소와 같은 질환의 일종으로, 예컨대 운동장애, 인지기능 장애, 파킨슨 병, 섭식 장애, 주의력 결핍 장애, 수면장애 등을 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물에 포함되는 첨가제의 함량은 특별히 한정되는 것은 아니며 통상의 제제화에 사용되는 함량 범위 내에서 적절하게 조절될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외용제 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 경구 투여일 경우, 정제, 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여일 경우, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등으로 제형화 될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이 체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율, 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 약 0.1 내지 10,000 mg/kg의 범위일 수 있으나 이제 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여되거나 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하 내, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다.
또한, 본 발명은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 또는 이들의 혼합물을 이용하여 발효된 전두유를 유효성분으로 포함하는 행동장애의 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능 식품"이라 함은 건강기능 식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능 식품 중 경질캡슐제는 통상의 경질캡슐에 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합 및 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캡슐제는 본 발명에 따른 조성물의 부형제 등의 첨가제와 혼합하고 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에서 용어 “예방”이란 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다. 본 발명에서 "개선"이란 본 발명의 조성물을 개체에 투여하거나 섭취시켜 질환의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 발효식품 미생물 유래 다양한 효소 활성 평가
기능성 약콩생물전환 분말을 제조하기 위해 발효 균주인 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주의 다양한 효소 활성을 평가하였다.
먼저, 프로테아제(protease), GGT(Gamma-glutamyltransferase, 감마-글루타밀 전이효소), 및 나토키나아제(Nattokinase)의 활성을 평가하였다. 발효 균주를 TSB(tryptic soy broth) 배지 50 mL에 접종하여 37℃에서 24시간 배양하고, 배양액의 상등액을 수집하여 8,000 rpm으로 20분 동안 원심분리하였다. 원심분리된 배양액의 상등액을 이용하여 각 효소 활성을 평가하였다.
프로테아제(protease)의 활성은 기질로 0.5%의 아조카세인(azocasein) 용액 0.1 ㎖와 조효소액 0.1 ㎖를 Eppendorf tube에 넣고, 항온수조 37℃에서 1 시간 반응시킨 후, 10% trichloroacetic acid용액 0.4 ㎖를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이 반응액을 13,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상등액을 회수한 후 상등액 0.6 ㎖에 0.525 N NaOH 용액 0.6 ㎖를 첨가하여 중화시키고 420 nm에서 흡광도를 측정하였고, 이 반응조건 하에서 1분간에 tyrosine 1 ㎍을 유리시키는 효소량을 1 unint으로 하여 프로테아제(protease)의 활성을 평가하였다.
GGT(Gamma-glutamyltransferase, 감마-글루타밀 전이효소)의 활성은 0.01 ㎖ 조효소액과 γ-L-glutamyl-p-nitroaniline(p-NA-Glu, Sigma-Aldrich)를 0.1 mM 함유한 50 mM 인산 완충용액 (pH 7.0) 0.09 ㎖를 혼합하여 40℃에서 30분 반응시킨 후 3.5 N acetic acid 0.01ml를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 유리된 p-nitroaniline의 양을 410nm에서 측정하였다. p-nitroaniline을 표준용액으로 하여 standard curve를 그려 효소활성을 계산하였다. GGT 효소 활성 1 unit은 1분 당 p-NA-Glu로부터 1 mole의 p-nitroaniline을 유리시키는 효소양으로 계산하여 GGT 효소 활성도를 평가하였다.
나토키나아제(Nattokinase)의 활성은 50 mM Borate buffer(pH 8.5) 350 ㎕와 1% fibrinogen 용액 100 ㎕, 10 unint Thrombin 용액 25 ㎕를 혼합하여 37 ℃에서 10 분간 반응시킨 후 조효소액 25 ㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨다. 이 반응액에 0.2 M TCA 용액 500 ㎕를 첨가하여 반응을 정지시키 후 37℃에서 10분간 정치시켰다. 이 반응액을 8,000 rpm으로 20분간 원심분리하여 상등액을 회수한 후 275 nm에서 회수한 상등액의 흡광도를 측정하고 하기의 계산식에 의해 효소활성을 계산하여 혈정용해 효소 활성도를 평가하였다.
A1: 시료의 흡광값
A0: 조효소액을 넣지 않고 제조한 공시험 시료의 흡광값 (blank)
0.01: 1분간 흡광도가 0.01 증가한 효소의 활성
60: 효소반응 시간 (분)
0.025: 사용한 효소의 량
D: 시료의 희석배수
하기 표 1에 나타나 바와 같이, 프로테아제(protease) 활성은 78 U/ml로 나타났고, GGT 활성은 3500 mU/ml로 나타났고, 혈전분해 활성을 나타내는 나토키나아제(Nattokinase) 활성은 24 U/ml로 나타났다.
| 효소 활성 평가 | B. polyfermenticus KMU01 |
| Protease activity (U/ml) | 78 |
| GGT activity (mU/ml) | 3500 |
| Nattokinase activity (U/ml) | 24 |
또한, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주의 유전체를 PacBio_20K sequncenr와 SMRT 2.3.0(HGAP2) assembler로 분석하여 다양한 기능성 효소의 유전자를 확인하였다. 그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주는 61개의 펩티다아제(peptidase) 유전자, 23개의 프로테아제(protease) 유전자, 8개의 글루코시다아제(glucosidase) 유전자, 6개의 리파아제(lipase) 유전자, 2개의 GGT(γ-glutamyl transpeptidase)유전자, 2개의 셀룰라아제(cellulase) 유전자, 아밀라아제(amylase) 유전자, 및 나토키나아제(nattokinase) 유전자를 보유하고 있음을 확인하였다.
실시예 2. 발효 균주를 이용한 기능성 생물전환 분말 제조
전두유를 생물전환하기 위한 효소액으로 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주를 TSB(tryptic soy broth) 배지에 37℃에서 24 시간 배양한 상등액을 사용하였다. 전두유를 제조하기 위해 익산소청자를 세척한 후 14 시간 동안 물에 침지시킨 후, 물기를 제거하고 마쇄기를 이용하여 물을 제거하면서 마쇄하였다. 마쇄된 시료를 100℃에서 30분 동안 끓인 후 전두유를 수득하였다. 상기 수득된 전두유에 상기 효소액을 5%(v/v) 비유로 처리하고, 37℃에서 4 시간 동안 반응시켜 생물전환 후, 동결건조하여 약콩생물전환 분말을 제조하였다.
| 구분 | 생물전환 조건 |
| 전두유 (mL) | 95 |
| 효소액 (mL) | 5 |
| 반응온도 (℃) | 37 |
| 반응시간 (hr) | 4 |
실시예 3. 약콩생물전환 분말의 가수분해도 평가
상기 실시예 2에서 제조된 약콩생물전환 분말의 단백질에 대한 가수분해도를 평가하였다. 각 시료의 가수분해물 2 mL를 취하여 20%(w/v) 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid; TCA) 2 mL가 들어있는 시험관에 넣고, 혼합한 후 원심분리 (3,000Хg, 10min)하여, 원심분리한 상층액을 일정량 취하여 단백질량을 측정하여 가수분해도를 계산하였다. 계산한 결과 상기 약콩생물전환 분말의 가수분해도는 53.8%로 나타났다.
또한, 10% 소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)을 수행하여 약콩 단백질의 분자량 차이를 확인한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 대조군(약콩전두유)에 비해 상기 약콩생물전환 분말(약콩 효소처리 두유)에서 10,000 Da이하의 콩 펩타이드가 1.23배 증가하는 것으로 나타났다.
실시예 4. 약콩생물전환 분말의 아미노산 조성 분석
아미노산 자동분석기(Biochrom 30+)를 사용하여 약콩생물전환 분말 내의 기능성 아미노산을 분석하였다. 하기 표 3에 나타난 바와 같이, 근육의 성장에 필요한 분지사슬아미노산 (Branched Chain Amino Acids, BCAA)과 신경전달물질의 전구체 아미노산인 방향족 아미노산 등 기능성 아미노산의 함량이 증가한 것으로 나타났다.
| 분류 | 아미노산 | 함량 (mg/L, mg/콩70g) | |
| 전두유(대조군) | 약콩생물전환 분말 | ||
| 방향족 | Phe | 8 | 65 |
| Tyr | 5 | 28 | |
| Trp | 14 | - | |
| BCAA | Val | 8 | 72 |
| Leu | 3 | 65 | |
| Ile | 1 | 21 | |
| 기타 | GABA | 2 | 12 |
| Glu | 17 | 9 | |
| Cys | 5 | 14 | |
| His | 8 | 75 | |
| Pro | N/D | 51 | |
| Lys | 3 | 79 | |
| Arg | 110 | 111 | |
실시예 5. 약콩생물전환 분말의 항산화 활성 평가
상기 약콩생물전환 분말의 항산화 활성을 평가하기 위해 DPPH 라디칼 소거 활성을 분석하였다. DPPH 라디컬 소거능은 안정한 자유 라디칼인 1.1-diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH)를 일정한 시료 용액과 반응시켜 DPPH 라디칼이 감소되는 정도는 분광광도계를 이용하여 측정하는 방법으로, 샘플 50μl와 0.1mM DPPH용액 50μl를 혼합한 후 실온의 암실에서 30분간 방치한 후 517 nm에서 흡광도를 측정하여 Control 대비 라디칼 감소 정도를 계산하였다. Blank 흡광도는 물 50μl와 0.1mM DPPH용액 50μl를 혼합하여 측정하고, 각 시료의 Control 흡광도는 샘플 50μl와 95% 에탄올을 혼합하여 측정한다. 양성대조군의 샘플로는 ascorbic acid를 사용하였다. 도 3에 나타난 바와 같이, 대조군(약콩전두유)에 비해 약콩생물전환 분말에서 74%의 높은 DPPH 라디칼 소거 활성이 나타났다.
실시예 6. 약콩생물전환 분말의 행동장애 개선 효과 평가
상기 약콩생물전환 분말에 행동장애 개선과 같은 기능성 효과가 나타나는지 확인하기 위해, 대조군(약콩전두유) 및 약콩생물전환 분말(효소처리 전두유)을 초파리에 5 주간 경구 투여하여 각 섭식군 및 비섭십군의 행동 차이 변화를 climbing assay로 평가하였다.
초파리는 Negative geotaxis라는 습성을 가지고 있기 때문에 행동학적 연구에 상당수 이용되고 있다. Negative geotaxis는 말 그대로 초파리를 포함하는 유리관 및 시험관을 1회 충격을 가하여 초파리를 바닥으로 떨어뜨린 후 중력을 거슬러 올라가는 행동을 표현하는 것으로 climbing assay에 많이 이용되고 있다. 파킨슨-모델 초파리는 Negative geotaxis 습성을 가지고 있으나, dj-1유전자의 결실로 인하여 정상 개체에 비해 낮은 Negative geotaxis 경향을 보인다. dj-1유전자의 결실은 도파민의 사멸 속도를 촉진하여 파킨슨병 증상과 같은 운동성 저하 및 수면시간 감소 등이 있다.
사용된 초파리는 야생형 초파리 w 1118 과 파킨슨 모델 초파리인 DJ-1β ex54 를 사용하여 약콩생물전환 분말에 행동장애 개선 효과를 평가하였다. 상기 파킨슨 모델 초파리는 dj-1유전자가 결실된 모델로 dj-1유전자의 결실은 도파민의 사멸 속도를 촉진하여 파킨슨병 증상과 같은 운동성 저하 및 수면시간 감소 등과 같은 현상을 나타낸다. 모든 초파리는 day/night를 12시간 간격으로, 온도를 25℃로, 습도를 60%로 유지하여 배양하였다.
먼저 약콩생물전환 분말의 섭식에 따른 모델동물 초파리를 이용한 행동장애 개선 효과를 확인하기 위하여 초파리가 들어있는 시험관을 충격을 가하여 초파리를 바닥으로 떨어뜨린 후 중력을 거슬러 올라가는 행동을 분석하는 climbing assay를 수행하였다.
전두유 및 약콩생물전환 분말을 초파리에게 5주간 경구 투여하며 초파리의 행동학적 분석인 climbing assay는 18 cm-long vials에서 수행하였다. 실온에서 10분동안 환경에 적응시킨 다음 초파리가 완전히 바닥에 앉아 있는 시점을 기준으로 실시하였고 10초동안 시작부위에서 8 cm 이상 부위까지 상승한 초파리의 수를 측정하였고, 4회 반복 실험을 수행하였다. (n>10) 단 통계는 T-test를 사용하였으며 유의수준(P)은 0.05로 정해 P<0.05는 유의한 것으로 판단하였다.
도 4에 나타난 바와 같이, 일반 초파리 밥(일반식이)을 섭취한 파킨슨씨병 초파리모델(DJ-1β EX54 )은 4주차에 Climbling ability가 25%로 감소하여 5주차에는 24%까지 Climbing ability가 감소하는 반면 약콩생물전환 분말(효소처리 전두유)을 섭취시킨 파킨슨 모델 초파리(DJ-1β EX54 )는 4주차까지 야생초파리와 비슷한 Climbing ability를 나타내었고 5주차에는 야생초파리의 Climbing ability가 69%일 때 파킨슨 모델 초파리(DJ-1βEX54)은 51%의 Climbling ability를 유지함을 확인하였고, 본 결과를 통해 약콩생물전환 분말이 행동 장애 개선 효과가 있음을 확인하였다.
또한, 인위적인 산화 스트레스 하에서 약콩생물전환 분말 섭식이 초파리의 행동장애 개선에 효과가 있는지 확인하기 위하여 1% H2O2가 포함된 5% sucrose와 5% 약콩생물전환 분말(효소처리 전두유)과 1% H2O2가 포함된 5% sucrose 먹이를 초파리 모델에게 섭식모델에게 13일간 경구 투여하며 climbing assay와 생존율을 확인하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 인위적인 산화스트레스 환경에서의 파킨슨 모델초파리(DJ-1β ex54 )는 현저히 낮은 Climbing rate 및 생존율을 보인 반면, 약콩전두유 및 약콩생물전환 분말(효소처리 전두유)을 섭식한 DJ-1β ex54 초파리는 대조군에 비해 높은 Climbing rate를 보였고, 약콩생물전환 분말 섭식군에서 가장 높은 생존율을 보였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
Claims (10)
- 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 생물전환용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 배양액은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주를 배양한 인공 배지인 것을 특징으로 하는 생물전환용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 발효물은 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주를 이용하여 발효된 천연 배지인 것을 특징으로 하는 생물전환용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 배양액 및 발효물은 프로테아제(protease), GGT(Gamma-glutamyltransferase, 감마-글루타밀 전이효소), 및 나토키나아제(Nattokinase)의 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 생물전환용 조성물.
- 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 또는 이들의 혼합물을 전두유에 처리하는 단계를 포함하는 약콩생물전환 분말 제조 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 또는 이들의 혼합물은 3%(v/v) 내지 7%(v/v) 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는 약콩생물전환 분말 제조 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 또는 이들의 혼합물은 35℃ 내지 40℃에서 3 시간 내지 5 시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 약콩생물전환 분말 제조 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 약콩생물전환 분말은 항산화 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 약콩생물전환 분말 제조 방법.
- 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 또는 이들의 혼합물을 이용하여 발효된 전두유를 유효성분으로 포함하는 행동장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus) KMU01 (수탁번호: KCTC 11751BP) 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 또는 이들의 혼합물을 이용하여 발효된 전두유를 유효성분으로 포함하는 행동장애의 예방 또는 개선용 건강기능 식품 조성물.
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|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal |