KR20220031527A - 식품 유해 물질 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 식품 유해 물질 검출 방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 식품 유해 물질에 특이적인 압타머가 선택적인 분자친화력을 가져, 식품 유해 물질이 존재하지 않을 때에는 칩에 고정된 캡처 프로브에 결합하나, 식품 유해 물질의 존재 시에는 캡처 프로브에서 이탈하여 식품 유해 물질과 결합하므로 원형 DNA가 캡처 프로브에 결합하여 RCA 반응이 일어나 신호증폭을 위한 금속체를 형성하는 것이 가능하여, 검출 정확성을 향상시킬 수 있는 식품 유해 물질 검출 방법에 대한 것이다.
Description
본 발명은 식품 유해 물질 검출 방법에 대한 것으로, 더욱 상세하게는 식품 유해 물질에 특이적인 압타머가 선택적인 분자친화력을 가져, 식품 유해 물질이 존재하지 않을 때에는 칩에 고정된 캡처 프로브에 결합하나, 식품 유해 물질의 존재 시에는 캡처 프로브에서 이탈하여 식품 유해 물질과 결합하므로 원형 DNA가 캡처 프로브에 결합하여 RCA(rolling circle amplication) 반응이 일어나 신호증폭을 위한 금속체를 형성하는 것이 가능하여, 검출 정확성을 향상시킬 수 있는 식품 유해 물질 검출 방법에 대한 것이다.
식품에는 여러 유해 물질이 포함될 수 있는데, 대표적인 식품에 포함된 유해 물질인 농약은 농사 지을 때 농작물이 잡초, 해충, 세균 등으로부터 피해를 받는 것을 예방하기 위해 살포하는 약품으로, 사용 후 농작물, 토양, 하천 등에 잔류하여 주변 환경 및 사람에 피해를 발생시킨다. 따라서, 하기 특허문헌처럼 잔류 농약을 검출하기 위한 장치 및 방법이 널리 개발되고 있다.
<특허문헌>
특허 제10-1050421호(2011. 07. 13. 등록) "잔류 농약 검출용 키트 및 이를 이용한 잔류농약 검출방법"
하지만, 종래의 식품유해물질(농약)을 검출하는 방법은 고가의 장비를 필요로 하고, 빠르고 간편하게 식품유해물질(농약)의 존재 유무를 확인할 수 없었다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로,
본 발명은 식품 유해 물질에 특이적인 압타머가 선택적인 분자친화력을 가져, 식품 유해 물질이 존재하지 않을 때에는 칩에 고정된 캡처 프로브에 결합하나, 식품 유해 물질의 존재 시에는 캡처 프로브에서 이탈하여 식품 유해 물질과 결합하므로 원형 DNA가 캡처 프로브에 결합하여 RCA 반응이 일어나 신호증폭을 위한 금속체를 형성하는 것이 가능하여, 식품 유해 물질을 정확하게 검출할 수 있는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 앞서 본 목적을 달성하기 위해서 다음과 같은 구성을 가진 실시예에 의해서 구현된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 식품 유해 물질 검출 방법은 기판에 고정화되어 링커 역할을 하는 염기서열과, 농약에 선택적인 분자친화력을 가지는 압타머와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열을 포함하는 캡처 프로브를 기판에 고정하여 칩을 준비하는 칩준비단계와; 농약에 선택적인 분자친화력을 가지는 압타머를 상기 칩에 분포시켜, 상기 캡처 프로브와 압타머를 부분적 결합시키는 혼성화단계와; 상기 칩에 측정 대상 농약을 분포시켜 선택적인 분자친화력에 의해 압타머가 캡처 프로브에서 떨어져 농약과 결합하도록 하는 압타머분리단계와; 상기 압타머분리단계 후, 상기 캡처 프로브와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과, 금속체와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 원형 DNA, 및 중합효소를 상기 칩에 공급하고 RCA 반응시켜, 원형 DNA가 상기 캡처 프로브에 부분적으로 결합하여 상기 캡처 프로브에 연결되며 상기 금속체와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열을 반복하여 가지는 단일 가닥을 형성하는 RCA반응단계와; 상기 RCA반응단계를 통해 형성된 단일 가닥을 템플레이트로 하여 신호 증폭을 위한 금속체를 형성하는 금속체형성단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 식품 유해 물질 검출 방법은 상기 금속체형성단계 후 상기 칩에 빛을 조사하고 광학신호를 측정하여 농약의 존재 및 그 양을 검출하는 검출단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 식품 유해 물질 검출 방법에 있어서 상기 금속체와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과 상보적인 염기서열은 복수 개가 연이어진 아데닌으로 이루어져, 상기 가닥은 복수의 티민으로 형성되게 되며, 상기 금속체형성단계에서는 RCA반응단계 후 구리 이온과 아스코베이트를 포함하는 용액을 칩에 주입하여, 상기 복수의 티민을 템플레이트로 하여 구리 나노입자를 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 식품 유해 물질 검출 방법에 있어서 상기 금속체와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과 상보적인 염기서열은 금 프로브와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어져, 상기 가닥은 금 프로브와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열로 형성되게 되며, 상기 금속체형성단계에서는 제1반응기가 결합된 특정 ssDNA에, 상기 제1반응기와 결합하는 제2반응기가 결합된 금 나노입자를 반응시켜, 특정 ssDNA에 금이 결합된 금 프로브를 형성하고, 상기 금 프로브를 칩에 주입하여 상기 가닥에 금 프로브를 결합시키고, 은 이온과 환원제를 추가로 공급하여, 금 나노입자 표면에 은 클러스터를 형성하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 식품 유해 물질 검출 방법에 있어서 상기 기판은 COC(cyclic olefin copolymer) 기판이 사용되며, 상기 캡처 프로브는 다이아지논을 검출하기 위해 서열번호 4의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 식품 유해 물질 검출 방법에 있어서 상기 원형 DNA는 서열번호 7의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 본 발명에 따른 식품 유해 물질 검출 방법에 있어서 상기 원형 DNA는 서열번호 9의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 앞서 본 실시예와 하기에 설명할 구성과 결합, 사용관계에 의해 다음과 같은 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 식품 유해 물질에 특이적인 압타머가 선택적인 분자친화력을 가져, 식품 유해 물질이 존재하지 않을 때에는 칩에 고정된 캡처 프로브에 결합하나, 식품 유해 물질의 존재 시에는 캡처 프로브에서 이탈하여 식품 유해 물질과 결합하므로 원형 DNA가 캡처 프로브에 결합하여 RCA 반응이 일어나 신호증폭을 위한 금속체를 형성하는 것이 가능하여, 검출 정확성을 향상시킬 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 농약을 검출하는 원리를 설명하기 위한 참고도.
도 2는 캡쳐 프로브의 최적 결합 염기서열 설계를 위한 CD 분석 결과를 나타내는 그래프.
도 3은 다이아지논 압타머와 cDNA들의 결합관계를 나타내는 참고도.
도 4 및 5는 링커 염기서열을 가지는 DNA를 COC 칩에 고정 시 용매가 미치는 효과를 확인하기 위한 형광 이미지.
도 6는 캡처 프로브가 COC 기판에 고정되는지를 확인하기 위한 형광 변화를 나타내는 그래프.
도 7 및 8은 캡처 프로브의 Spacer 영역 길이에 따른 RCA 효율을 확인하기 위한 형광 변화는 나타내는 그래프.
도 9은 COC 기판에서 poly(T)가 생성되어 CuNP가 합성됨을 확인하기 위한 투과전자현미경(TEM) 이미지.
도 10은 원형 DNA 1의 농도에 따라 형광 세기가 변화함을 확인하기 위한 그래프.
도 11은 COC 기판에서 RCA 생성물로 ssDNA가 형성되어 Au@Ag가 합성됨을 확인하기 위한 주사전자현미경(SEM) 이미지.
도 12는 금 나노입자 크기에 따른 비색 신호 확인을 위한 흡광도 측정 결과를 나타내는 그래프.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 검출 방법을 이용하여 다이아지논을 검출한 결과를 나타내는 그래프.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 검출 방법이 다이아지논을 선택적으로 검출함을 확인하기 위한 그래프.
도 2는 캡쳐 프로브의 최적 결합 염기서열 설계를 위한 CD 분석 결과를 나타내는 그래프.
도 3은 다이아지논 압타머와 cDNA들의 결합관계를 나타내는 참고도.
도 4 및 5는 링커 염기서열을 가지는 DNA를 COC 칩에 고정 시 용매가 미치는 효과를 확인하기 위한 형광 이미지.
도 6는 캡처 프로브가 COC 기판에 고정되는지를 확인하기 위한 형광 변화를 나타내는 그래프.
도 7 및 8은 캡처 프로브의 Spacer 영역 길이에 따른 RCA 효율을 확인하기 위한 형광 변화는 나타내는 그래프.
도 9은 COC 기판에서 poly(T)가 생성되어 CuNP가 합성됨을 확인하기 위한 투과전자현미경(TEM) 이미지.
도 10은 원형 DNA 1의 농도에 따라 형광 세기가 변화함을 확인하기 위한 그래프.
도 11은 COC 기판에서 RCA 생성물로 ssDNA가 형성되어 Au@Ag가 합성됨을 확인하기 위한 주사전자현미경(SEM) 이미지.
도 12는 금 나노입자 크기에 따른 비색 신호 확인을 위한 흡광도 측정 결과를 나타내는 그래프.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 검출 방법을 이용하여 다이아지논을 검출한 결과를 나타내는 그래프.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 검출 방법이 다이아지논을 선택적으로 검출함을 확인하기 위한 그래프.
이하에서는 본 발명에 따른 식품 유해 물질 검출 방법을 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 특별한 정의가 없는 한 본 명세서의 모든 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 기술자가 이해하는 당해 용어의 일반적 의미와 동일하고 만약 본 명세서에 사용된 용어의 의미와 충돌하는 경우에는 본 명세서에 사용된 정의에 따른다. 또한, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대해 상세한 설명은 생략한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 식품 유해 물질 검출 방법을 도 1 내지 14를 참조하여 설명하기로 한다. 하기에서는 식품 유해 물질의 대표적인 예인 농약을 예로 들어 식품 유해 물질 검출 방법을 설명하기로 한다. 상기 식품 유해 물질 검출 방법은 기판에 고정화되어 링커 역할을 하는 염기서열과, 농약에 선택적인 분자친화력을 가지는 압타머와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열을 포함하는 캡처 프로브를 기판에 고정하여 칩을 준비하는 칩준비단계와; 상기 칩에 농약에 선택적인 분자친화력을 가지는 압타머를 분포시켜, 상기 캡처 프로브와 압타머를 부분적 결합시키는 혼성화단계와; 상기 칩에 측정 대상 농약을 분포시켜 선택적인 분자친화력에 의해 압타머가 캡처 프로브에서 떨어져 농약과 결합하도록 하는 압타머분리단계와; 상기 압타머분리단계 후, 상기 캡처 프로브와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과, 금속체와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 원형 DNA 및 중합효소를 상기 칩에 공급하고 RCA 반응시켜, 원형 DNA가 상기 캡처 프로브에 부분적으로 결합하여 상기 캡처 프로브에 연결되며 상기 금속체와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열을 반복하여 가지는 단일 가닥을 형성하는 RCA반응단계와; 상기 RCA반응단계를 통해 형성된 단일 가닥을 템플레이트로 하여 신호 증폭을 위한 금속체를 형성하는 금속체형성단계와; 상기 금속체형성단계 후 상기 칩에 빛을 조사하고 광학신호를 측정하여 농약의 존재 및 그 양을 검출하는 검출단계;를 포함한다.
상기 칩준비단계는 기판에 고정화되어 링커 역할을 하는 염기서열과, 농약에 선택적인 분자친화력을 가지는 압타머와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열을 포함하는 캡처 프로브를 기판에 고정하여 칩을 준비하는 단계이다. 상기 링커 역할을 하는 염기서열이 예컨대 T(10)C(10)로 이루어지고 5' 말단 부위에 위치하는 경우, 상기 캡처 프로브를 고분자(예컨대, COC 등) 기판에 분포시키고 UV 조사를 하면, 상기 T(10)C(10)가 고분자 기판 표면에 고정되어 캡처 프로브의 5' 말단 부분이 고분자 기판에 고정되므로, 상기 캡처 프로브를 기판에 고정할 수 있게 된다.
상기 혼성화단계는 농약에 선택적인 분자친화력을 가지는 압타머를 상기 칩에 분포시켜, 상기 캡처 프로브와 압타머를 부분적 결합시키는 단계로, 상기 기판에 고정된 캡처 프로브는 상기 압타머와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열을 가지므로, 상기 칩준비단계 후 상기 압타머를 상기 칩에 분포시키면, 상기 캡처 프로브와 압타머는 부분적으로 결합하게 된다.
상기 압타머분리단계는 상기 혼성화단계 후, 상기 칩에 측정 대상 농약을 분포시켜 선택적인 분자친화력에 의해 압타머가 캡처 프로브에서 떨어져 농약과 결합하도록 하는 단계이다. 상기 압타머는 선택적인 분자친화력을 가지므로, 즉 캡처 프로브보다 농약에 분자친화력이 강하므로, 시료에 농약이 존재하는 경우 압타머는 캡처 프로브에서 떨어져 농약에 결합하게 된다.
상기 RCA반응단계는 상기 압타머분리단계 후, 상기 캡처 프로브와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과, 금속체와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 원형 DNA 및 중합효소를 상기 칩에 공급하고 RCA 반응시켜, 원형 DNA가 상기 캡처 프로브에 부분적으로 결합하여 상기 캡처 프로브에 연결되며 상기 금속체와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열을 반복하여 가지는 가닥을 형성하는 단계이다. 예컨대, 형성하고자 하는 금속체가 구리 나노입자인 경우, 상기 금속체와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과 상보적인 염기서열은 복수 개가 연이어진 아데닌으로 이루어져, 상기 가닥은 복수의 티민(poly(T))으로 형성되게 되며, 형성하고자 하는 금속체가 금/은 클러스터인 경우, 상기 금속체와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과 상보적인 염기서열은 금 프로브와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어져, 상기 가닥은 금 프로브와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열로 형성되게 된다.
상기 금속체형성단계는 상기 RCA반응단계를 통해 형성된 가닥을 템플레이트로 하여 신호 증폭을 위한 금속체를 형성하는 단계이다. 예컨대, 상기 가닥이 복수의 티민(poly(T))으로 형성되는 경우, Cu2+와 ascorbate를 칩에 주입하면 poly(T)를 주형으로 한 구리 나노입자가 형성되게 된다. 또한, 상기 금속체형성단계에서 금/은 클러스터를 형성하고자 하는 경우, 제1반응기(예컨대, 비오틴(biotin) 등)가 결합된 특정 ssDNA에, 상기 제1반응기와 결합하는 제2반응기(예컨대, 스트렙타피딘(streptavidin) 등)가 결합된 금 나노입자를 반응시켜, 특정 ssDNA에 금이 결합된 금 프로브를 형성하고, 상기 금 프로브를 칩에 주입하여 상기 가닥에 금 프로브를 결합시키고, 은 이온과 환원제를 추가로 공급하여, 금 나노입자 표면에 은 클러스터를 형성할 수 있다.
상기 검출단계는 상기 금속체형성단계 후 상기 칩에 빛을 조사하고 광학신호를 측정하여 농약의 존재 및 그 양을 검출하는 단계로, 검사하고자 하는 시료에 농약이 존재하는 경우 압타머가 캡처 프로브에서 떨어져 결과적으로 금속체가 형성되고 이후 빛을 조사하면, 금속체가 구리나노입자인 경우 발광하는 형광을 측정하고, 금속체가 금/은 클러스터인 경우 흡수되는 빛을 측정하여, 기 설정된 농약의 농도와 형광(또는 흡광도) 값 간의 비례적 상관관계를 고려하여, 농약의 존재 및 그 양을 검출할 수 있게 된다.
이하, 실시예를 통해서 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하지만, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 시료의 준비
1. 캡처 프로브(Capture probe)의 준비
UV 조사를 통해 COC(Cyclic olefin copolymer) 기판에 고정화되는 링커 역할하는 염기서열(이하, '링커 염기서열'이라 함)[TTTTTTTTTTCCCCCCCCCC(서열번호:1)]과, 스페이서(Spacer) 염기서열[TAATCATGATT(서열번호:2)]과, 다이아지논 압타머(Diazinon aptamer)와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열(이하, '결합 염기서열'이라 함)[GTCCAAGAGC(서열번호:3)]을 차례로 포함하는 캡처 프로브[5'-TTTTTTTTTTCCCCCCCCCCTAATCATGATTGTCCAAGAGC-3'(서열번호:4)]를 준비하였다.
2. 다이아지논 압타머(Diazinon aptamer)의 준비
캡처 프로브와 상보적 결합이 가능하도록, 상기 결합 염기서열과 상보적인 염기서열[GCTCTTGGAC(서열번호:5)]을 포함하는 다이아지논 압타머[5'-ATCCGTCACACCTGCTCTAATATAGAGGTATTGCTCTTGGACAAGGTACAGGGATGGTGTTGGCTCCCGTAT-3'(서열번호:6)]를 준비하였다.
3. 원형 DNA 1의 준비
(1) 캡처 프로브와 상보적 결합이 가능하도록, 상기 결합 염기서열과 상보적인 염기서열[GCTCTTGGAC(서열번호:5) 및 poly(A)를 포함하는 linear DNA 1[5'-(phosphate)-GTAGGTGCTCTTGGACGAACATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACG-3'(서열번호:7)]를 준비하였다.
(2) 상기 linear DNA 1과 DNA 연결효소(ligase)를 튜브에 넣은 후(50uM linear DNA 1 15uL, 10X buffer 10uL, 1mM ATP 5uL, 50mM Mncl2 5uL, 100U/Ul Ligase 4uL, DW 61uL), 60℃에서 8시간 동안 유지하고 80℃에서 10분 동안 유지하여 리게이션 생성물(Ligation product)을 얻였다. 이후, 잔류하는 linear DNA 1을 제거하기 위해, 리게이션 생성물, 엑소뉴클레아제 I 및 엑소뉴클레아제 III를 혼합하고(Ligation product 200uL, Buffer1 26uL, Buffer2 26uL, Exo1 (20U/uL) 6uL, Exo3 (10U/uL) 2uL), 37℃에서 6시간 동안 및 80℃에서 20분 동안 배양하였다. 생성된 생성물을 정제하여 원형 DNA 1(CirDNA)을 얻었다.
4. 원형 DNA 2의 준비
(1) 캡처 프로브와 상보적 결합이 가능하도록 상기 결합 염기서열과 상보적인 염기서열[GCTCTTGGAC(서열번호:5)] 및 금 프로브와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열(이하, '연결 염기서열'이라 함)[AAGCCATCAGTC(서열번호:8)]을 포함하는 linear DNA 2[5'-(phosphate)-GTAGGTGCTCTTGGACGAACATATTAGCCTTCAGCGCTCCCAAGCCATCAGTCT-3'(서열번호:9)]를 준비하였다.
(2) linear DNA 1 대신에 linear DNA 2가 사용된 것을 제외하고는 다른 조건을 실시예 1의 3의 (2)와 동일하게 하여 원형 DNA 2(CirDNA)를 얻었다.
5. 금 프로브의 준비
(1) 상기 연결 염기서열과 동일한 염기서열[AAGCCATCAGTC(서열번호:8)]을 포함하고, 바이오틴이 기능화된 금 프로브 DNA[5'-AAGCCATCAGTC-(C6SP)-(biotin)-3']를 준비하였다.
(2) 상기 금 프로브 DNA와 streptavidin으로 코팅된 20nm 크기의 금 나노입자를 혼합한 후 상온에서 밤새 반응시켜, streptavidin-biotin 반응에 의해 금 프로브 DNA가 금 나노입자에 결합한 금 프로브를 얻었다.
<실시예 2> 다이아지논 압타머의 최적 혼성화 사이트 확인
1. 다이아지논 압타머 뿐만 아니라 원형 DNA에 결합하는 캡쳐 브로브의 능력은 다이아지논 검출에 중요한 영향을 미치므로, CD(Circular dichroism) 분석을 통해 다이아지논(DZN)과 민감하고 선택적으로 반응하는 압타머 사이트를 확인하여 캡쳐 프로브의 결합 염기서열을 설계하였다.
2. 구체적으로, 우선 다이아지논 압타머에 상보적인 DNA 4종(cDNA 1 내지 4))을 준비하였다(cDNA 1[5'-GTGTGACGGA-3'(서열번호:10)], cDNA 2[5'-GCAATACCTC-3'(서열번호:11)], cDNA 3[5'-GTCCAAGAGC-3'(서열번호:12)], cDNA 4[5'-ATACGGGAGC-3'(서열번호:13)]. 다이아지논 압타머와 각각의 cDNA를 혼합하여 혼합용액을 준비하고 88℃에서 5분 동안 및 30℃에서 30분 동안 차례로 인큐베이션하고 25℃로 냉각하여 샘플 A(Sample type A)를 준비하고, 샘플 A에 DZN을 추가하고 30℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 심플 B((Sample type B)를 준비하고, 압타머와 DZN을 혼합하고 30℃에서 30분 동안 인큐베이션하고 각각의 cDNA를 혼합하여 샘플 C(Sample type C)를 준비하였다. 각 샘플에서 다이아지논 압타머, cDNA, 및 DZN의 최종 농도는 각각 0.5μM, 1μM, 및 1ppm이다. 이후, 샘플 A 내지 C에 대하여 CD spectrometer(J-715, JASCO, Tokyo, Japan)로 분석하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.
3. 각 cDNA는 도 3에 도시된 바와 같이 다른 사이트(사이트 1 내지 4)에 결합하는데, 도 2를 보면, 압타머 사이트 1 및 2에서는 샘플 A 및 B의 스펙트럼 패턴이 유사하기 때문에 DNZ보다 cDNA와 강하게 결합함을 알 수 있고, 압타머 사이트 3 및 4에서는 샘플 B 및 C의 스펙트럼 패턴이 유사하기 때문에 cDNA보다 DNZ와 강하게 결합함을 알 수 있으며, 압타머 사이트 3에서는 샘플 A의 압타머-cDNA 복합체와 샘플 C의 압타머-DZN 복합체 사이에 두드러진 스펙트럼 패턴 차이를 가져 두 복합체의 3차원 구조체 사이에 큰 차이를 보임을 알 수 있어, 압타머 사이트 3이 결합 염기서열을 설계를 위한 최적 사이트임을 알 수 있다.
<실시예 3> 캡처 프로브 고정화 확인
1. 링커 염기서열을 가지는 DNA를 COC 기판에 고정 시 용매가 미치는 효과를 확인
(1) 링커 염기서열을 가지는 DNA를 COC 기판에 고정 시 용매가 미치는 효과를 확인하기 위하여, 링커 역할하는 염기서열[CCCCCCCCCCTTTTTTTTTT(서열번호:14)]을 포함하고, 5'에 cy3가 달린 고정화 확인용 DNA[5'-(cy3)-TCATGACCCCCCCCCCTTTTTTTTTT-3'(서열번호:15)]를 준비하였다.
(2) COC 기판 친수화를 위해 COC 기판을 O2 Plasma처리하고(20W (power), 10 (time), 20 sccm (flow rate)), 농도가 0.5uM이 되도록 상기 고정화 확인용 DNA를 용매 A(150 mM sodium phosphate buffer with 0.01% tween 20 (pH 8.5)), 용매 B(1x micro spotting solution plus (Array it)), 특정 비율로 용매 A와 B가 혼합된 혼합용매 각각에 녹이고, pin을 이용한 contact 방식의 microarrayer를 이용하여 DNA를 COC 기판에 spotting 한 후 상온에서 10분 건조하였다. 이후, UV 처리를 수행하고(파장대 254nm, 처리시간 30분 (by XL-1000 UV cross linker)), 세척한 후(0.1x SC buffer with 0.01% SDS (pH 7)로 10min with shaking & DW rinsing), 형광 이미지를 얻어 그 결과를 도 4 및 5에 나타내었다.
(3) 도 4 및 5를 보면, 용매 A 또는 B를 단독으로 사용하여 고정화 확인용 DNA를 스팟팅 했을 경우 DNA가 스팟의 가장자리 또는 중심부에 몰려서 균일도가 낮가 스팟 사이즈가 너무 작아지는 등 고정화 효율이 좋이 않은데 반해, 용매 A와 B를 섞어서 사용했을 경우 DNA가 스팟 내에 고르게 분포되었고 스팟의 사이즈도 일정함을 확인하였으며, 특히 용매 A와 B를 1:1로 섞은 용매를 사용했을 때 고정화 효율이 가장 좋았다. 이후, 실험에서는 캡처 프로브의 용매로 용매 A와 B를 1:1로 섞은 용매를 사용하였다.
2. 캡처 프로브가 COC 기판에 고정화될 수 있는지 확인
(1) COC 기판에 농도별 실시예 1의 1에서 준비된 캡쳐 프로브(단, 3' 말단에 cy3이 컨쥬게이션됨)를 20ul 씩 넣고 건조하고, 자외선 조사를 실시하여 고정하고, 세척하고 건조한 후 cy3의 형광값을 측정(excitation 530nm, emission 575nm)하여, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
(2) 도 6를 보면, 상기 캡쳐 프로브의 농도가 증가할수록 형광값이 커짐을 알 수 있어, 링커 염기서열을 가지는 캡처 프로브가 COC 기판에 잘 고정됨을 알 수 있다.
<실시예 4> Spacer 영역 길이에 따른 RCA 효율 확인
1. 실시예 1의 1에서 준비된 캡쳐 프로브와 Spacer 영역의 길이를 달리하는 비교용 캡쳐 프로브[5'-TTTTTTTTTTCCCCCCCCCCTAATCATGAGTCCAAGAGC-'3(서열번호:16)]를 준비하였다.
2. DW에 녹여진 실시예 1의 1에서 준비된 캡처 프로브 또는 실시예 4의 1에서 준비된 비교용 캡쳐 프로브 20ul를 COC 기판에 도포하고, 건조(RT 16h, dry oven 30min), 고정(UV 30min), 세척(SSC washing 10min) 및 건조(dry oven 30min)를 차례로 수행하였다.
3. 비교용 캡쳐 프로브(probe A), 캡처 프로브(probe B)가 각각 고정된 COC 기판에 50% Hybrid Buffer에 녹여진 실시예 1의 3에서 준비된 500nM 원형 DNA 1 20ul를 도포하여, 30℃에서 1시간 혼성화시키고, 세척(SSC washing 10min) 및 건조(dry oven 30min)를 차례로 수행하였다.
4. 3과정 이후, 5x SYBR green 2 20ul를 추가하여 염색한 후, 형광값(EX:480 / Em:522)을 측정하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 또한, 3과정 이후, RCA 반응용액(1x buffer 3ul, 1mM dNTP 3ul, 20U/30ul Phi29 2ul, DW 22ul)을 추가하여 2시간 동안 RCA 반응시키고, 5x SYBR green 2 20ul를 추가하여 염색한 후, 형광값(EX:480 / Em:522)을 측정하여, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
5. 도 7를 보면 캡처 프로브 종류에 따른 COC 기판의 고정 효율이 비슷한 것을 확인할 수 있으나, 도 8을 보면 캡쳐 프로브(probe B)에서만 양에 비례하여 RCA 반응이 이루어진 것을 확인할 수 있어, 캡처 프로브의 길이가 너무 짧다면 입체 장애로 인해 RCA를 저해할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 5> CuNP가 합성됨을 확인 및 RCA 테스트
1. 실시예 1의 1에서 준비된 캡처 프로브(400nM), 실시예 1의 3에서 준비된 원형 DNA 1(200nM), 1x RCA buffer 및 1.25 mM dNTP mixture 및 30 units of phi29 DNA polymerase를 튜브에 혼합하고 30℃에서 90분 동안 RCA 반응시키고 65℃에서 10분 동안 불활성화시켰다. 이후, 2mM ascorbate, 0.5mM CuSO4 및 1x MOPS 퍼버를 RCA 결과물에 추가하고 5분 동안 반응시켜 구리 나노입자를 합성한 후, 투과전자현미경(TEM)으로 확인하여 그 결과를 도 9(스케일바는 100nm임)에 나타내었다.
2. 도 9를 보면, RCA 반응이 일어난 좌측 이미지에서만 수 나노미터의 구리나노입자가 생성됨을 확인할 수 있어, 캡쳐 프로브와 원형 DNA 1이 혼성화된 후 RCA 반응을 통해 poly(T)가 생성되어 이를 template로 하여 CuNP가 합성됨을 알 수 있다.
3. 실시예 1의 1에서 준비된 캡처 프로브(20uM)를 자외선 조사를 통해 COC 기판에 고정하고, 실시예 1의 3에서 준비된 농도를 달리하는 원형 DNA 1(20uL)를 추가하고 30℃에서 1시간 유지하였다. 이후, 1x RCA buffer, 1 mM dNTP mixture 및 30 units of phi29 DNA polymerase을 포함하는 RCA 용액(40uL)을 추가하고 30℃에서 2시간 인큐베이션시키고 65℃에서 10분 동안 불활성화시켰다. 이후, 4mM ascorbate 및 1mM CuSO4를 RCA 결과물에 추가하고 RT에서 10분 동안 반응시켜 구리 나노입자를 합성한 후, 마이크로 플레이트 리더기를 사용하여 형광 강도를 측정하여 그 결과를 도 10에 나타내었다.
4. 도 10을 통해, 원형 DNA 1의 농도 증가에 따라 형광 세기가 증가함을 알 수 있다.
<실시예 6> Au@Ag cluster 생성됨을 확인
1. DW에 녹여진 20uM의 실시예 1의 1에서 준비된 캡처 프로브 20ul를 COC 기판에 도포하고, 건조(RT 16h, dry oven 30min), 고정(UV 30min), 세척(SSC washing 10min) 및 건조(dry oven 30min)를 차례로 수행하여, COC 기판에 캡처 프로브를 고정하였다.
2. 캡처 프로브가 고정된 COC 기판에 50% Hybrid Buffer에 녹여진 실시예 1의 4에서 준비된 (0 or 1.9uM) 원형 DNA 2(Circular DNA) 20ul를 도포하여, 30℃에서 1시간 혼성화시키고, 세척(SSC washing 10min) 및 건조(dry oven 30min)를 차례로 수행하였다. 이후, RCA 반응용액(1x buffer 3ul, 1mM dNTP 3ul, 20U/30ul Phi29 2ul, DW 22ul)을 추가하여 2시간 동안 RCA 반응시키고, 세척(SSC washing 10min)을 하였다.
3. 이후, 실시예 1의 5에서 준비된 금 프로브(in 50% hybrid Buffer) 20ul를 도포하고 34℃에서 60분 동안 혼성화시키고, 추가로 Silver enhancement 용액 50ul를 도포하고 상온에서 20분 반응 후, 세척하고 건조한 후, gel-DOC 및 주사전자 현미경(SEM)을 촬영하여 그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에서 inset 이미지는 gel-DOC 촬영 결과를 나타낸다.
4. 도 11을 보면, 원형 DNA 2가 혼합되어 RCA가 진행된 오른쪽 이미지에서만 RCA 생성물로 보이는 실타래 모양의 ssDNA에 Au@Ag가 합성된 것을 확인할 수 있어, 캡쳐 프로브와 원형 DNA 2이 혼성화된 후 RCA 반응이 이루어지고, 금 프로브가 RCA 생성물에 혼성화되고 Au 프로브가 결합하여 Au@Ag cluster가 합성됨을 알 수 있다.
<실시예 7> 금나노입자 크기에 따른 비색 신호 확인
1. 금 나노입자의 크기(10, 20, 40nm)에 따른 비색 신호를 비교하기 위하여, 20uM 대신에 10uM 캡처 프로브가 사용되고, Silver enhancement 용액 50ul를 도포하고 상온에서 20분 반응하는 과정을 2회 실시하고, 금 프로브의 금 나노입자가 20nm뿐만 아니라 10 및 40nm를 가지도록 한 것을 제외하고는, 다른 조건을 실시예 6과 동일하게 실험하고, 흡광도(360nm)를 측정하여 그 결과를 도 12에 나타내었다(ΔAbs=Abs(w/cirDNA)/Abs(w/o cirDNA)).
2. ΔAbs가 1 이상의 값은 RCA가 진행되었을 때 비색 신호가 증가했음을 나타내는데, 도 12를 보면, 20nm의 금 나노입자가 사용되었을 때 비색 신호 증가량이 가장 큼을 확인할 수 있다.
<실시예 8> DZN의 검출 및 선택성 확인
1. 실시예 1의 1에서 준비된 20uM 캡쳐 프로브(20uL)를 자외선 조사를 통해 COC 기판의 각 웰에 고정하고, 혼성화 버퍼 내의 실시예 1의 2에서 준비된 20uM 압타머(20uL)를 추가하고 34℃에서 1시간 배양하였다. 이후 1x binding buffer에 DZN이 용해되어 다양한 농도를 가지는 DZN 용액을 각 웰에 추가하고 30℃에서 1시간 배양하고, 혼성화 버퍼 내의 실시예 1의 3에서 준비된 2uM 원형 DNA 1(20uL)를 추가하고 30℃에서 1시간 배양하였다. 이후, 1x RCA buffer, 1 mM dNTP mixture 및 30 units of phi29 DNA polymerase을 포함하는 RCA 용액(40uL)을 각 웰에 추가하고 30℃에서 5시간 인큐베이션시키고 65℃에서 10분 동안 불활성화시키고, 4mM ascorbate 및 1mM CuSO4를 각 웰에 추가하고 RT에서 10분 동안 반응시켰다. Alliance Mini HD9 system(UVITEC, USA)을 이용하여 이미지화하고, 이미지 분석 소프트웨어(Nine-Alliance Q9)를 사용하여 CuNPs의 형광을 정량화하여 그 결과를 13에 나타내었다.
2. 도 13을 보면, DZN의 농도가 증가함에 따라 CuNPs의 형광 세기가 점진적으로 증가함을 확인할 수 있어(DZN의 농도가 3ppm보다 큰 경우 포화됨), 본원발명의 검출방법은 효과적으로 DZN을 검출할 수 있음을 알 수 있다.
3. 다양한 농도를 가지는 DZN 대신에 농도가 4ppm으로 고정된 DZN, fenitrothion, abamectin, fipronil 각각을 사용하여 실시예 8의 1과 같이 실험하여 그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14를 보면, DZN을 사용했을 때만 형광 세기 큰 것을 알 수 있어 상기 검출방법은 DZN을 선택적으로 검출 할 수 있음을 알 수 있다.
이상에서, 출원인은 본 발명의 바람직한 실시예들을 설명하였지만, 이와 같은 실시예들은 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 일 실시예일 뿐이며 본 발명의 기술적 사상을 구현하는 한 어떠한 변경예 또는 수정예도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 해석되어야 한다.
<110> KOREA FOOD RESEARCH INSTITUTE
<120> Method for detecting noxious substance of food
<130> PDAHJ-20145
<160> 16
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<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> region of capture probe for immobilization on substrate
<400> 1
tttttttttt cccccccccc 20
<210> 2
<211> 11
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> spacer region of capture probe
<400> 2
taatcatgat t 11
<210> 3
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> region of capture probe for binding diazinon aptamer
<400> 3
gtccaagagc 10
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> capture probe for diazinon aptamer
<400> 4
tttttttttt cccccccccc taatcatgat tgtccaagag c 41
<210> 5
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> region of diazinon aptamer for binding capture probe
<400> 5
gctcttggac 10
<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> diazinon aptamer
<400> 6
atccgtcaca cctgctctaa tatagaggta ttgctcttgg acaaggtaca gggatggtgt 60
tggctcccgt at 72
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linear DNA for generating circular DNA 1
<400> 7
gtaggtgctc ttggacgaac ataaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aacg 54
<210> 8
<211> 12
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> region of linear DNA for binding Au probe
<400> 8
aagccatcag tc 12
<210> 9
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linear DNA for generating circular DNA 2
<400> 9
gtaggtgctc ttggacgaac atattagcct tcagcgctcc caagccatca gtct 54
<210> 10
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA 1 for identfy an optimal hydridiztion site on the diazion
aptamer
<400> 10
gtgtgacgga 10
<210> 11
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA 2 for identfy an optimal hydridiztion site on the diazion
aptamer
<400> 11
gcaatacctc 10
<210> 12
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA 3 for identfy an optimal hydridiztion site on the diazion
aptamer
<400> 12
gtccaagagc 10
<210> 13
<211> 10
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> cDNA 4 for identfy an optimal hydridiztion site on the diazion
aptamer
<400> 13
atacgggagc 10
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> region of DNA for confirming immobilization of capture probe
<400> 14
cccccccccc tttttttttt 20
<210> 15
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA for confirming immobilization of capture probe
<400> 15
tcatgacccc cccccctttt tttttt 26
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA for confirming RCA effect by length of spacer region
<400> 16
tttttttttt cccccccccc taatcatgag tccaagagc 39
Claims (7)
- 기판에 고정화되어 링커 역할을 하는 염기서열과, 농약에 선택적인 분자친화력을 가지는 압타머와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열을 포함하는 캡처 프로브를 기판에 고정하여 칩을 준비하는 칩준비단계와; 농약에 선택적인 분자친화력을 가지는 압타머를 상기 칩에 분포시켜, 상기 캡처 프로브와 압타머를 부분적 결합시키는 혼성화단계와; 상기 칩에 측정 대상 농약을 분포시켜, 선택적인 분자친화력에 의해 압타머가 캡처 프로브에서 떨어져 농약과 결합하도록 하는 압타머분리단계와; 상기 압타머분리단계 후, 상기 캡처 프로브와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과, 금속체와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과 상보적인 염기서열을 포함하는 원형 DNA, 및 중합효소를 상기 칩에 공급하고 RCA 반응시켜, 원형 DNA가 상기 캡처 프로브에 부분적으로 결합하여 상기 캡처 프로브에 연결되며 상기 금속체와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열을 반복하여 가지는 단일 가닥을 형성하는 RCA반응단계와; 상기 RCA반응단계를 통해 형성된 단일 가닥을 템플레이트로 하여 신호 증폭을 위한 금속체를 형성하는 금속체형성단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 유해 물질 검출 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 식품 유해 물질 검출 방법은, 상기 금속체형성단계 후 상기 칩에 빛을 조사하고 광학신호를 측정하여 농약의 존재 및 그 양을 검출하는 검출단계;를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 식품 유해 물질 검출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 금속체와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과 상보적인 염기서열은 복수 개가 연이어진 아데닌으로 이루어져, 상기 가닥은 복수의 티민으로 형성되게 되며,
상기 금속체형성단계에서는 RCA반응단계 후 구리 이온과 아스코베이트를 포함하는 용액을 칩에 주입하여, 상기 복수의 티민을 템플레이트로 하여 구리 나노입자를 형성하는 것을 특징으로 하는 식품 유해 물질 검출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 금속체와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과 상보적인 염기서열은 금 프로브와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어져, 상기 가닥은 금 프로브와 상보적 결합이 가능하도록 하는 염기서열로 형성되게 되며,
상기 금속체형성단계에서는 제1반응기가 결합된 특정 ssDNA에, 상기 제1반응기와 결합하는 제2반응기가 결합된 금 나노입자를 반응시켜, 특정 ssDNA에 금이 결합된 금 프로브를 형성하고, 상기 금 프로브를 칩에 주입하여 상기 가닥에 금 프로브를 결합시키고, 은 이온과 환원제를 추가로 공급하여, 금 나노입자 표면에 은 클러스터를 형성하는 것을 특징으로 하는 식품 유해 물질 검출 방법. - 제1항에 있어서,
상기 기판은 COC 기판이 사용되며, 상기 캡처 프로브는 다이아지논을 검출하기 위해 서열번호 4의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 식품 유해 물질 검출 방법. - 제5항에 있어서,
상기 원형 DNA는 서열번호 7의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 식품 유해 물질 검출 방법. - 제5항에 있어서,
상기 원형 DNA는 서열번호 9의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 식품 유해 물질 검출 방법.
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| KR102196281B1 (ko) * | 2018-02-08 | 2020-12-29 | 고려대학교 산학협력단 | 에디펜포스(edifenphos)에 특이적으로 결합하는 DNA 앱타머 및 그의 용도 |
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2022
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