KR20220030783A - 암 면역 치료의 효능 예측을 위한 바이오마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 출원은 암 면역 치료의 효능 예측을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것으로서, 백혈구의 CD226 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 암 면역 치료의 효능 예측용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 암 면역 치료의 효능 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
Description
암 면역 치료의 효능 예측을 위한 바이오마커 및 이의 용도에 관한 것이다.
다양한 종류의 암에서, 종양-침윤 T 세포 (tumor-infiltrating T cell)의 공동-억제 수용체 (co-inhibitory receptor)와 종양 세포 및/또는 항원-제시 세포에서 발현되는 그들의 리간드 사이의 상호작용을 차단하는 치료 전략은 성공적인 것으로 밝혀졌다. 현재까지, 세포 독성 T 림프구-연관된 항원 4 (cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4: CTLA-4), 프로그램화된 세포 사멸 단백질 1 (Programmed cell death protein 1: PD-1), 및 프로그램화된 사멸-리간드 1 (programmed death-ligand 1: PD-L1)을 겨냥하는 여섯 종류의 면역 관문 억제제 (immune checkpoint inhibitor: ICI)가 미국 FDA에서 승인되었다． 그러나, ICI 치료법은 일반적으로 고형 종양 환자에게서 20 내지 40%의 종합 반응률을 보인다. 현재, 항-Lag-3 (lymphocyte activation gene 3), 항-TIM-3 (T cell immunoglobulin and mucin-domain containing-3), 및 항-TIGIT (T cell immunoreceptor with immunoglobulin and ITIM domain) 항체를 포함하는 수많은 ICI는 다양한 유형의 암을 위한 임상시험을 거치고 있다.
종양-침윤 CD8+ T 세포는 그들과 관련된 항원과 결합 시 제 기능을 하지 못하거나 피폐된다. TIGIT는 PVR (poliovirus receptor, CD155)과 Nectin-2 (CD112)를 결합하는 공동-억제 수용체인데, 중요하게도, 피폐된 T 세포에 있어서 TIGIT는 PD-1과 함께 높게 상향조절 (upregulation)되고 공동-발현된다. 대한민국 등록특허 제2050082호에서는 TIGIT의 항체-매개된 차단은 CD8+ T 세포의 항-종양 면역력을 증강시킬 수 있음을 개시하고 있다. 그러나, TIGIT 차단의 치료법이 항-종양 효과를 이끌어내는 엄밀한 메커니즘에 대해서는 여전히 연구가 부족하고, 항-TIGIT 요법의 치료 효능을 예측하고 치료 효능을 개선할 수 있는 효과적인 전략은 개발되지 않고 있는 실정이다.
이런 배경 하에서, 본 발명자들은 CD8+ T 세포는 티로신 (tyrosine)-인산화된 CD226의 발현 정도에 따라 TIGIT 차단에 대해 상이하게 반응하는, 기능적 및 표현형적으로 구별되는 상태를 갖음을 확인하였고, 그에 수반하여 항-TIGIT 요법의 치료 효능을 예측하는 바이오마커로서의 CD226의 용도를 확인함으로써, 본 출원을 완성하였다.
일 양상은 백혈구의 CD226 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 암 면역 치료의 효능 예측용 조성물로서, 상기 암 면역 치료는 항-TIGIT 요법 또는 항-PD-1 요법인 것인, 암 면역 치료의 효능 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 암 면역 치료의 효능 예측용 조성물을 포함하는, 암 면역 치료의 효능 예측용 키트를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 CD8+ T 세포의 CD226 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암 면역 치료의 효능 예측을 위한 정보제공방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.
본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
일 양상은 백혈구의 CD226 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 암 면역 치료의 효능 예측용 조성물로서, 상기 암 면역 치료는 항-TIGIT 요법 또는 항-PD-1 요법인 것인, 암 면역 치료의 효능 예측용 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어, "백혈구 (leukocyte)" 는 혈액에서 적혈구를 제외한 나머지 세포들을 의미한다. 상기 백혈구는 CD8+ T 세포일 수 있고, 상기 CD8+ T 세포는 CD8+ 기억 T 세포 (memory T cell), CD8+ 종양침윤림프구 (Tumor Infiltrating Lymphocyte: TIL) 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 백혈구는 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있다. 상기 CD8+ T 세포, CD8+ 기억 T 세포, 또는 CD8+ TIL은 암 치료 중 또는 암 치료 예정인 환자로부터 유래하는 것일 수 있으며, 예를 들어, 말초 혈액 단일클론 세포 (peripheral blood mononuclear cell: PBMC)로부터 얻어지는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, “CD226”은 PTA1 또는 DNAM-1로 불릴 수 있고, 면역세포에서 발현되는 당단백질 (glycoprotein)로, 공동 자극 수용체 중 하나로 정의될 수 있다.
일 구체예에서, 상기 CD226은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 CD226에서 322번째 티로신이 인산화된 것일 수 있다. 여기서, 티로신은 "타이로신" 또는 "4-하이드록시페닐알라닌"과 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 상기 인산화는 티로신의 OH기에서 인산과 결합하는 것을 지칭할 수 있다.
본 명세서에서 용어, “면역 치료”는 개체의 면역 기능을 자극하고 강화하여 특정 암 또는 질환을 억제하거나 그의 진행 속도를 느리게 하는 (완화하는) 것을 목적으로 하는, 치료 목적의 처치 및 예방 또는 억제 처치를 모두 의미할 수 있다. 치료가 필요한 대상은 암 또는 질환이 이미 발생한 대상 및 암 또는 질환이 발생하기 쉬운 대상 또는 암 또는 질환이 억제되어야 하는 대상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 면역 치료는 항-TIGIT 요법 또는 항-PD-1 요법일 수 있으며, 이는 TIGIT 또는 PD-1을 차단하거나 억제하는 방식의 치료법으로서, TIGIT 또는 PD-1과 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합성 단편에 의하여, TIGIT 또는 PD-1의 생물학적 활성을 억제하거나 감소시키는 방식으로 이루어지는 일련의 치료법을 지칭하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어, “암”은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적 (aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침투적 (invasive) 특성 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적 (metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다. 상기 암으로는 고형암 또는 비고형암을 모두 포함할 수 있으며, 예를 들어, 상기 암은 유방암종 (mammary carcinoma), 흑색종 (melanoma), 결장암종 (colon carcinoma), 결장 선암종 (colon adenocarcinoma), 신장암종 (renal cell carcinoma: RCC), 대장암종 (colorectal cancer: CRC), 및 비소세포폐암종 (non-small-cell lung carcinoma: NSCLC)으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
상기 암 면역 치료는 플루오로우라실 (fluorouracil), 류코보린 (leucovorin), 이리노테칸 (irinotecan), 및 옥살리플라틴 (oxaliplatin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 치료 물질이 병용투여 되는 것일 수 있고, 예를 들어, 전이성 췌장암과 대장암에서 쓰이는 병용 화학요법인 FOLFIRINOX 요법일 수 있다.
일 실험예에서, "mFOLFIRINOX" 는 상기 FOLFIRINOX의 구성 중 플루오로우라실을 5-플루오로우라실 (5-fluorouracil)로 교체하여 사용하는 변형된 FOLFIRINOX 치료 요법을 의미하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, “효능 예측”은 특정 치료의 결과로서 발휘될 치료 효과의 정도를 치료의 결과가 확인되기 전에 미리 추측하는 것일 수 있다. 상기 추측의 시기는 치료 전, 치료 직후, 또는 치료 후가 될 수 있다. 따라서, 상기 효능 예측의 결과를 통해, 치료의 진행 여부 또는 치료 방향을 효과적으로 결정할 수 있고, 이를 통해 치료 효과가 개선될 수 있다.
일 실험예에 따르면, 상기 CD226이 고 발현된 CD8+ T 세포에서 CD226이 항원-특이적으로 티로신 322 (서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 CD226에서 322번째에 위치한 티로신을 의미함)에서 인산화되는 경우, TIGIT 차단의 효과로서 CD8+ T 세포가 활성화될 수 있음을 확인하였다. 따라서, 티로신 332에서 인산화를 포함하는 CD226의 발현 수준을 측정함으로써, 암 면역 치료의 효능을 예측할 수 있다.
상기 발현 수준의 측정은 CD226을 코딩하는 유전자 자체, 또는 상기 CD226가 발현된 수준, 즉, CD226 당단백질의 발현 수준을 확인함으로써 측정하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 CD226 당단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 사용하여 CD226의 발현 수준을 측정하는 것일 수 있다. 예를 들어, CD226 발현 수준의 측정은 항-TIGIT 요법 또는 항-PD-1 요법에 있어서, 암 면역 치료의 효능을 예측하기 위하여, 상기 백혈구에서 발현된 CD226 당단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정일 수 있다. 이는 예를 들어, CD226 당단백질을 직접 분리하거나, CD226 당단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체 또는 그 단편을 이용하여 상기 CD226 당단백질을 확인하는 것일 수 있다.
상기 CD226 발현 수준을 측정하기 위한 제제는 상기 CD226 또는 상기 CD226을 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 올리고뉴클레오티드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 리간드, 수용체, 작용제 (agonist) 또는 길항제 (antagonist), 또는 이의 조합인 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "항체" 는 당해 기술 분야에 공지된 용어로서 항원성 부위에 대하여 지시되는 특이적인 면역 글로불린을 의미한다. 상기 항체는 CD226 당단백질 또는 이의 단편에 대해 특이적으로 결합할 수 있다. CD226 당단백질 단편은 예를 들면 면역원성 단편일 수 있다. 상기 단편은 CD226 당단백질에 대한 항체에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 에피토프 (epitope)를 가지고 있는 당단백질 단편을 의미할 수 있다. 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝 하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 상기 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 상기 항체에 포함된다.
또한, 상기 항체는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다. 폴리클론 항체는 당업자에 알려진 종래 방법에 따라 면역원인 바이오 마커 단백질 또는 그 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 외부 숙주는 마우스, 래트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 사용할 수 있다. 상기 면역원은 근내, 복강 내 또는 피하 주사 방법으로 주사되는 경우, 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 아주반트 (adjuvant)와 함께 투여될 수 있다. 이후, 외부 숙주로부터 정기적으로 혈액을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리, 정제할 수 있다.
단일클론 항체는 당업자에 알려진 융합에 의한 불멸화된 세포주 생성 기술에 의해 제조될 수 있다. 단일클론 항체의 제조 방법에 대해 간단히 설명하면, 상기 단백질을 정제하여 약 10 ㎍의 적당량을 Balb/C 마우스에 면역화를 시키거나, 상기 단백질의 폴리펩티드 단편을 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨 다음, 마우스에서 분리된 항원-생산 임파구를 인간 또는 마우스의 미엘로마와 융합하여 불멸화된 하이브리도마를 생성하며, ELISA 방법을 사용하여 원하는 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포만을 선택하여 증식한 후 배양물로부터 단일클론 항체를 분리, 정제할 수 있다. 또한 단일클론 항체는 상업적으로 판매되는 CD226 당단백질에 대한 항체를 입수하여 사용할 수 있다.
상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 CD226에서 322번째 티로신이 인산화된 CD226에 대해 특이적으로 결합하는 항체 (항-pCD226Y322 항체) 또는 이의 항원 결합 단편을 의미할 수 있다.
상기 프라이머는 자유 3-말단 수산화기 (free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 특정 염기 서열에 대해 상보적인 주형 (template)과 염기쌍을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로서 작용하는 핵산 서열을 말한다.
상기 프로브는 표적 핵산 예를 들면, CD226을 코딩하는 mRNA와 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 특정 mRNA의 존재 유무, 함량 및 발현량을 확인할 수 있도록 라벨링 (labeling) 되어 있을 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드 (oligonucleotide) 프로브, 단일 가닥 DNA (single strand DNA) 프로브, 이중 가닥 DNA (double strand DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
일 실험예에 따르면, 항-TIGIT 요법 또는 항-PD-1 요법에 있어서, 상기 CD8+ T 세포에서의 상기 CD226의 발현 수준을 측정하여 항-TIGIT 요법 또는 항-PD-1 요법의 치료 효능을 예측할 수 있고, 이는 항-TIGIT 요법 또는 항-PD-1 요법의 개선방향을 제시하여 치료 효과를 더욱 증가시킬 수 있다.
다른 양상은 백혈구의 CD226 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 암 면역 치료의 효능 예측용 조성물로서, 상기 암 면역 치료는 항-TIGIT 요법 또는 항-PD-1 요법인 것인, 암 면역 치료의 효능 예측용 조성물을 포함하는, 암 면역 치료의 효능 예측용 키트를 제공한다.
상기 키트는 예를 들어, CD226 당단백질 또는 그를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현량을 측정할 수 있는 마이크로어레이일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 상기 CD226의 유전자를 이용하여 당해 기술 분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 CD226 당단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA 또는 그의 단편에 해당하는 서열의 cDNA가 프로브로서 기판에 부착되어 있는 것일 수 있다.
상기 키트는 CD226 당단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체, 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적합한 버퍼, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 또는 발색 기질을 포함할 수 있다. 상기 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 또는 유리 슬라이드글라스가 이용될 수 있다. 발색효소는 퍼옥시다아제 (peroxidase) 또는 알칼라인 포스파타아제 (alkaline phosphatase)가 사용될 수 있다. 형광물질은 FITC, 또는 RITC가 사용될 수 있다. 발색 기질은 ABTS (2,2'-아지노-비스 (3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)), OPD (o-페닐렌디아민), 또는 TMB (테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트가 예를 들어, CD226의 유전자의 mRNA의 발현량을 측정하기 위한 경우, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. 상기 RT-PCR 키트는 마커 유전자의 mRNA에 대한 특이적인 각각의 프라이머 이외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드 (dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수 (dEPC-water), 또는 멸균수를 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.
상기 키트에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 조성물에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
또 다른 양상은 개체의 시료로부터 CD8+ T 세포의 CD226 발현 수준을 측정하는 단계; 및 측정된 CD226의 발현 수준을 대조군 시료의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 암 면역 치료의 효능 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 CD226의 발현 수준을 측정하는 단계는 상기 CD226 당단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질에 부착된 검출 가능한 표지로부터 나오는 신호를 검출함으로써 수행되는 것일 수 있다. 상기 CD226의 발현 수준을 측정하는 것은 CD226을 다시 분리하여 상기 CD226 당단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA의 수준을 측정하는 것, 또는 상기 CD226 당단백질 또는 그를 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 물질의 수준을 측정하는 것 또는 상기 CD226을 분리하지 않고 그 수준을 측정하는 것일 수 있다.
상기 발현 수준의 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR (competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RNase protection assay: RPA), 노던 블랏팅 (Northern blotting), DNA를 포함한 핵산 마이크로어레이, 웨스턴 블랏 (western blot), 효소결합면역흡착검사 (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA), 면역크로마토그래피, 면역형광분석법 (Immunofluorescence assay: IFA), 면역블롯 (immunoblotting), 방사선면역분석법 (Radioimmunoassay: RIA), 방사면역확산법 (Radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (Rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complete fixation assay), FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting), 및 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 그 조합을 포함하여 수행될 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 방법은 상기 CD226의 측정된 발현 수준 또는 측정된 상기 CD226를 코딩하는 mRNA의 수준을 대조군에서 측정된 CD226의 발현 수준 또는 상기 CD226를 코딩하는 mRNA의 수준과 비교하는 단계를 포함한다.
상기 비교하는 단계는 정상 조직의 평균적인 CD226 발현 수준을 갖는 CD8+ T 세포, 즉, 대조군에서의 상기 CD226의 발현량과 대상 CD8+ T 세포에서의 상기 CD226의 발현량을 조사 및 비교하는 방법으로 이루어질 수 있고, 결과는 CD226 발현의 절대적 (예: ㎍/㎖) 또는 상대적 (예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.
상기 방법은 상기 CD8+ T 세포에서 측정된 CD226의 발현 수준이 대조군 대비 유의적인 차이를 나타낸 경우, 상기 개체에 대한 암 면역 치료의 효능이 있을 것, 예를 들어, 암 면역 치료가 유효할 것으로 예측하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 여기서, 상기 대조군은 정상 조직으로부터 분리한 시료 또는 암 면역 치료의 효과가 없는 것으로 기 판단된, 개체의 종양 조직으로부터 분리된 시료일 수 있다.
일 구체예에서, 개체의 시료로부터 측정한 CD226 발현 수준이 상기 대조군에 비해 낮은 경우, 상기 암 면역 치료의 효능이 낮을 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 개체의 시료로부터 측정한 CD226 발현 수준이 상기 대조군에 비해 높은 경우, 상기 암 면역 치료의 효능이 높을 것으로 예측하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 정보제공방법에서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 조성물 또는 키트에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 앞에서 상기 조성물 또는 키트에 대한 설명에서 언급된 바와 같은 것으로 이해된다.
일 양상에 따른 조성물, 키트, 또는 방법에 의하면, 개체의 CD8+ T 세포에서 티로신-인산화된 CD226의 발현 수준을 측정하여, 암 면역 치료를 위한 항-TIGIT 요법 또는 항-PD-1 요법 등에 있어서, 개체의 반응성 또는 암 면역 치료 효능을 예측할 수 있다.
또한, 일 양상에 따른 조성물, 키트, 또는 방법에 의하면, 항-TIGIT 요법 또는 항-PD-1 요법의 효과의 전제가 되는 조건을 제시하고, 그것을 바탕으로 항-TIGIT 요법 또는 항-PD-1 요법에 있어서 다른 치료법과의 조합과 같은 개선 방안을 제시하며, 궁극적으로 암 면역 치료의 효과를 개선할 수 있다.
도 1a는 유방암종 (4T1), 흑색종 (B16F10), 결장암종 (CT26), 및 결장 선암종 (MC38) 종양을 포함하는 마우스의 종양 및 비장 (spleen: SP)으로부터 얻어진 총 CD8+ T 세포에서의 CD226 발현 수준에 대한 유세포 분석기 분석 결과 및 CD226loCD8+ T 세포의 백분율에 대한 요약 플롯이다.
도 1b는 도 1a에서와 같이, 마우스의 SP 및 종양의 CD226hiCD8+ T 세포에서의 CD226 발현 수준에 대한 기하 평균 형광 강도 (mean fluorescence intensity: MFI)의 요약 그래프이다.
도 1c는 암 환자의 종양 및 정상 조직의 CD8+ 기억 T 세포에서의 CD226 발현 수준에 대한 유세포 분석기 분석 결과 및 CD226loCD8+ T 세포의 백분율에 대한 요약 플롯이다.
도 1d는 도 1c에서와 같이, 암 환자의 정상 및 종양조직의 CD8+ TIL에서의 CD226 발현 수준에 대한 기하 MFI를 보여주는 요약 그래프이다.
도 2a는 암 환자의 CD226loCD8+ TIL 및 CD226hiCD8+ TIL에서의 공동-억제 수용체의 발현 수준에 대한 결과를 나타낸다.
도 2b는 마우스 유방암종 종양의 CD226loCD8+ TIL 및 CD226hiCD8+ TIL에 대한 유세포 분석기 분석 결과로서, 기재된 마커의 발현 수준을 나타낸다.
도 2c는 마우스 유방암종 종양의 CD8+ TIL에서의 기재된 마커의 발현 수준에 대한 기하 MFI를 보여주는 요약 그래프이다.
도 2d는 마우스 유방암종 또는 결장 선암종의 CD226loCD8+ TIL 및 CD226hiCD8+ TIL에서의 Slamf6 및 Tim-3 발현 수준에 대한 유세포 분석기 분석 결과 및 요약 플롯이다.
도 3a는 마우스 유방암종 또는 결장 선암종의 CD226loCD8+ TIL 및 CD226hiCD8+ TIL에서의 Ki-67 (세포증식표지자 단백질) 발현 수준의 백분율을 나타낸다.
도 3b는 마우스 유방암종의 CD226loCD8+ TIL 및 CD226hiCD8+ TIL에서의 IFN-γ 및 TNF-α의 발현 수준을 보여주는 유세포 분석기 분석 결과 및 요약 플롯이다.
도 3c는 CD226loCD8+ TIL 및 CD226hiCD8+ TIL에서의 IFN-γ 및 TNF-α의 공동-발현의 수준을 보여주는 유세포 분석기 분석 결과 및 요약 플롯이다.
도 3d는 브레펠딘 A (brefeldin A)의 존재하에 항-CD3 및 CD28 항체로 자극된 CD226loCD8+ T 세포 및 CD226hiCD8+ T 세포에서의 그랜자임 B (granzyme B: GrzB), IFN-γ, 및 TNF-α의 발현 수준을 보여주는 유세포 분석기 분석 결과 및 요약 플롯이다.
도 3e는 CD226loCD8+ 기억 T 세포 및 CD226hiCD8+ 기억 T 세포의 FACS 분류를 위하여 사용된 게이팅 전략 (gating strategy) 및 FACS-분류된 T 세포의 플롯이다.
도 3f는 CEF (CMV, EBV, 및 Flu) 펩티드 풀 (peptide pool)로 자극된 자가 유래 수지상 세포 (autologous DCs)와 함께 배양한 후의 CD226loCD8+ 기억 T 세포 및 CD226hiCD8+ 기억 T 세포의 증식에 대한 유세포 분석기 분석 결과 및 요약 플롯이다. 도 3f의 CTV (CellTrace Violet)는 세포의 증식을 측정하기 위해 CD8+ 기억 T 세포에 표지된 형광 염료를 의미한다.
도 3g는 도 3f에서와 같이 자극되어 FACS-분류된 CD226loCD8+ 기억 T 세포 및 CD226hiCD8+ 기억 T 세포의 IFN-γ 생산의 ELISA 결과를 나타낸다.
도 3h는 CD226-shRNA을 발현하는 레트로바이러스-감염된 OT-I T 세포 (mAmetrine+) 내에서의 CD226 녹 다운 (knockdown)의 결과를 보여주는 CD226lo/KDOT-I T 세포 및 CD226hiOT-I T 세포의 유세포 분석기 분석 결과를 나타낸다.
도 3i는 E.G7-OVA 세포 및 EL4 세포를 1:1 비율로 혼합한 것을 CD226lo/KDOT-I T 세포 또는 CD226hiOT-I T 세포와 기재된 E:T (effector:target) 비율로 공동-배양한 결과로서, E.G7-OVA 세포의 특이적 사멸 (specific killing)의 백분율을 나타낸다.
도 4a는 항-TIGIT 및/또는 항-PD-1 항체의 존재하에 CEF로 자극되어 각각 배양된 CD226loCD8+ 기억 T 세포 및 CD226hiCD8+ 기억 T 세포의 증식에 대한 유세포 분석기 분석 결과 및 요약 플롯이다.
도 4b는 항-TIGIT 및/또는 항-PD-1 항체의 존재하에 CD226loCD8+ 기억 T 세포 및 CD226hiCD8+ 기억 T 세포의 IFN-γ 생산에 대한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 4c는 항-TIGIT 및/또는 항-PD-1 항체의 존재 또는 부존재하에서, CD226lo/KDOT-I 기억 T 세포 또는 CD226hiOT-I 기억 T 세포를 타겟 세포와 1:10 (E:T: effector:target)의 비율로 공동-배양하였을때, E.G7-OVA 세포의 특이적 사멸에 대한 백분율 분석 결과를 나타낸다.
도 5a는 기재된 시간 동안 CHO-OKT3 또는 CHO-OKT3-PVR로 자극되어, CD226 WT 또는 CD226 변이체 (mutant)들을 발현하는 Jurkat 세포 내의 인산화된 ERK1/2, p38, 및 AKT의 면역블랏 분석 결과를 나타낸다. 베타-액틴 (β-actin)은 로딩 대조군으로 사용되었다.
도 5b는 CHO-OKT3 또는 CHO-OKT3-PVR로 자극되어, CD226 WT 또는 CD226 변이체들을 발현하는 CD8+ T 세포의 증식에 대한 유세포 분석기 분석 결과 및 요약 그래프이다. 도 5b의 CFSE (carboxy fluorescein succinimidyl ester)는 세포의 증식을 측정하기 위해 CD8+ T 세포에 표지된 형광 염료를 의미한다.
도 5c는 도 5b에서와 같은 조건으로 자극된 CD226 WT 또는 CD226 변이체들을 발현하는 CD8+ T 세포의 IFN-γ 생산에 대한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 5d는 hIgG 1 또는 항-TIGIT 항체의 존재하에 CHO-OKT3-PVR로 자극되어, CD226 WT 또는 변이체들을 발현하는 CD8+ T 세포의 IFN-γ 생산에 대한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 5e는 항-TIGIT 항체의 존재 또는 부존재하에 CHO-OKT3-PVR로 자극되어, TIGIT WT 또는 TIGIT 변이체를 발현하는 Jurkat 세포에서의 티로신 322-인산화된 CD226 (pY322)에 대한 면역블랏 분석 결과를 나타낸다.
도 5f는 항-CD226 작용제 항체로 자극되어, CD226 WT를 발현하는 Jurkat 세포에서의 티로신 322-인산화된 CD226 (pY322)에 대한 면역블랏 분석 결과를 나타낸다.
도 5g는 hIgG 1, 항-CD226 작용제 항체 및/또는 항-TIGIT 항체의 존재 또는 부존재하에 CEF로 자극된, CD226loCD8+ 기억 T 세포 및 CD226hiCD8+ 기억 T 세포의 IFN-γ 생산에 대한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 5h는 CHOOKT3-PVR로 자극되어, CD226 WT 또는 변이체들을 발현하는 Jurkat 세포에서의 티로신 322-인산화된 CD226 (pY322)에 대한 면역블랏 분석 결과를 나타낸다.
도 6a는 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 전이성 췌장암 (pancreatic ductal adenocarcinoma: PDAC) 환자의 CD8+ T 세포의 t-SNE 플롯 및 각 표면 수용체 발현 수준에 대한 MFI 결과를 나타낸다.
도 6b는 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 PDAC 환자의 CD8+ T 세포에 대한 FlowSOM 시각화 결과이고, 각 노드는 하나의 클러스터 (cluster)를 나타낸다.
도 6c는 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 각 그룹 내에서의 각 클러스터의 비중을 보여주는 요약 그래프 및 각 클러스터에서 공동-수용체의 발현 수준을 보여주는 FACS 히스토그램 (histogram)을 나타낸다.
도 6d는 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 PDAC 환자의 CD45RO+CD8+ 기억 T 세포에서의 CD226 발현 수준에 대한 유세포 분석기 분석 결과 및 CD226hiCD8+ 기억 T 세포의 백분율을 나타낸다.
도 6e는 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 PDAC 환자의 CD8+ T 세포에서의 CD226 발현 수준에 대한 요약 그래프이다.
도 6f는 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 PDAC 환자의 CEF-자극된 CD8+ T 세포의 증식에 대한 유세포 분석기 분석 결과 및 CTVlowCD8+ T 세포의 백분율에 대한 요약 플롯이다.
도 6g는 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 PDAC 환자의 CEF-자극된 CD8+ T 세포의 IFN-γ 분비의 배수 증가를 나타낸다.
도 6h는 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 PDAC 환자로부터 얻어진 것으로서, hIgG 1, 항-TIGIT, 또는 항-PD-1 항체의 존재 또는 부존재하에, CEF-자극된 CD8+ T 세포에 대한 CTV 희석 결과를 보여주는 유세포 분석기 분석 결과 및 CTVlowCD8+ T 세포의 백분율에 대한 요약 플롯이다.
도 6i는 항-hIgG 1 항체와 비교하여, 항-TIGIT 또는 항-PD-1 항체의 존재하에 CEF-자극된 CD226loCD8+ T 세포 또는 CD226hiCD8+ T 세포의 IFN-γ 분비의 배수 증가를 나타낸다.
도 1b는 도 1a에서와 같이, 마우스의 SP 및 종양의 CD226hiCD8+ T 세포에서의 CD226 발현 수준에 대한 기하 평균 형광 강도 (mean fluorescence intensity: MFI)의 요약 그래프이다.
도 1c는 암 환자의 종양 및 정상 조직의 CD8+ 기억 T 세포에서의 CD226 발현 수준에 대한 유세포 분석기 분석 결과 및 CD226loCD8+ T 세포의 백분율에 대한 요약 플롯이다.
도 1d는 도 1c에서와 같이, 암 환자의 정상 및 종양조직의 CD8+ TIL에서의 CD226 발현 수준에 대한 기하 MFI를 보여주는 요약 그래프이다.
도 2a는 암 환자의 CD226loCD8+ TIL 및 CD226hiCD8+ TIL에서의 공동-억제 수용체의 발현 수준에 대한 결과를 나타낸다.
도 2b는 마우스 유방암종 종양의 CD226loCD8+ TIL 및 CD226hiCD8+ TIL에 대한 유세포 분석기 분석 결과로서, 기재된 마커의 발현 수준을 나타낸다.
도 2c는 마우스 유방암종 종양의 CD8+ TIL에서의 기재된 마커의 발현 수준에 대한 기하 MFI를 보여주는 요약 그래프이다.
도 2d는 마우스 유방암종 또는 결장 선암종의 CD226loCD8+ TIL 및 CD226hiCD8+ TIL에서의 Slamf6 및 Tim-3 발현 수준에 대한 유세포 분석기 분석 결과 및 요약 플롯이다.
도 3a는 마우스 유방암종 또는 결장 선암종의 CD226loCD8+ TIL 및 CD226hiCD8+ TIL에서의 Ki-67 (세포증식표지자 단백질) 발현 수준의 백분율을 나타낸다.
도 3b는 마우스 유방암종의 CD226loCD8+ TIL 및 CD226hiCD8+ TIL에서의 IFN-γ 및 TNF-α의 발현 수준을 보여주는 유세포 분석기 분석 결과 및 요약 플롯이다.
도 3c는 CD226loCD8+ TIL 및 CD226hiCD8+ TIL에서의 IFN-γ 및 TNF-α의 공동-발현의 수준을 보여주는 유세포 분석기 분석 결과 및 요약 플롯이다.
도 3d는 브레펠딘 A (brefeldin A)의 존재하에 항-CD3 및 CD28 항체로 자극된 CD226loCD8+ T 세포 및 CD226hiCD8+ T 세포에서의 그랜자임 B (granzyme B: GrzB), IFN-γ, 및 TNF-α의 발현 수준을 보여주는 유세포 분석기 분석 결과 및 요약 플롯이다.
도 3e는 CD226loCD8+ 기억 T 세포 및 CD226hiCD8+ 기억 T 세포의 FACS 분류를 위하여 사용된 게이팅 전략 (gating strategy) 및 FACS-분류된 T 세포의 플롯이다.
도 3f는 CEF (CMV, EBV, 및 Flu) 펩티드 풀 (peptide pool)로 자극된 자가 유래 수지상 세포 (autologous DCs)와 함께 배양한 후의 CD226loCD8+ 기억 T 세포 및 CD226hiCD8+ 기억 T 세포의 증식에 대한 유세포 분석기 분석 결과 및 요약 플롯이다. 도 3f의 CTV (CellTrace Violet)는 세포의 증식을 측정하기 위해 CD8+ 기억 T 세포에 표지된 형광 염료를 의미한다.
도 3g는 도 3f에서와 같이 자극되어 FACS-분류된 CD226loCD8+ 기억 T 세포 및 CD226hiCD8+ 기억 T 세포의 IFN-γ 생산의 ELISA 결과를 나타낸다.
도 3h는 CD226-shRNA을 발현하는 레트로바이러스-감염된 OT-I T 세포 (mAmetrine+) 내에서의 CD226 녹 다운 (knockdown)의 결과를 보여주는 CD226lo/KDOT-I T 세포 및 CD226hiOT-I T 세포의 유세포 분석기 분석 결과를 나타낸다.
도 3i는 E.G7-OVA 세포 및 EL4 세포를 1:1 비율로 혼합한 것을 CD226lo/KDOT-I T 세포 또는 CD226hiOT-I T 세포와 기재된 E:T (effector:target) 비율로 공동-배양한 결과로서, E.G7-OVA 세포의 특이적 사멸 (specific killing)의 백분율을 나타낸다.
도 4a는 항-TIGIT 및/또는 항-PD-1 항체의 존재하에 CEF로 자극되어 각각 배양된 CD226loCD8+ 기억 T 세포 및 CD226hiCD8+ 기억 T 세포의 증식에 대한 유세포 분석기 분석 결과 및 요약 플롯이다.
도 4b는 항-TIGIT 및/또는 항-PD-1 항체의 존재하에 CD226loCD8+ 기억 T 세포 및 CD226hiCD8+ 기억 T 세포의 IFN-γ 생산에 대한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 4c는 항-TIGIT 및/또는 항-PD-1 항체의 존재 또는 부존재하에서, CD226lo/KDOT-I 기억 T 세포 또는 CD226hiOT-I 기억 T 세포를 타겟 세포와 1:10 (E:T: effector:target)의 비율로 공동-배양하였을때, E.G7-OVA 세포의 특이적 사멸에 대한 백분율 분석 결과를 나타낸다.
도 5a는 기재된 시간 동안 CHO-OKT3 또는 CHO-OKT3-PVR로 자극되어, CD226 WT 또는 CD226 변이체 (mutant)들을 발현하는 Jurkat 세포 내의 인산화된 ERK1/2, p38, 및 AKT의 면역블랏 분석 결과를 나타낸다. 베타-액틴 (β-actin)은 로딩 대조군으로 사용되었다.
도 5b는 CHO-OKT3 또는 CHO-OKT3-PVR로 자극되어, CD226 WT 또는 CD226 변이체들을 발현하는 CD8+ T 세포의 증식에 대한 유세포 분석기 분석 결과 및 요약 그래프이다. 도 5b의 CFSE (carboxy fluorescein succinimidyl ester)는 세포의 증식을 측정하기 위해 CD8+ T 세포에 표지된 형광 염료를 의미한다.
도 5c는 도 5b에서와 같은 조건으로 자극된 CD226 WT 또는 CD226 변이체들을 발현하는 CD8+ T 세포의 IFN-γ 생산에 대한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 5d는 hIgG 1 또는 항-TIGIT 항체의 존재하에 CHO-OKT3-PVR로 자극되어, CD226 WT 또는 변이체들을 발현하는 CD8+ T 세포의 IFN-γ 생산에 대한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 5e는 항-TIGIT 항체의 존재 또는 부존재하에 CHO-OKT3-PVR로 자극되어, TIGIT WT 또는 TIGIT 변이체를 발현하는 Jurkat 세포에서의 티로신 322-인산화된 CD226 (pY322)에 대한 면역블랏 분석 결과를 나타낸다.
도 5f는 항-CD226 작용제 항체로 자극되어, CD226 WT를 발현하는 Jurkat 세포에서의 티로신 322-인산화된 CD226 (pY322)에 대한 면역블랏 분석 결과를 나타낸다.
도 5g는 hIgG 1, 항-CD226 작용제 항체 및/또는 항-TIGIT 항체의 존재 또는 부존재하에 CEF로 자극된, CD226loCD8+ 기억 T 세포 및 CD226hiCD8+ 기억 T 세포의 IFN-γ 생산에 대한 ELISA 결과를 나타낸다.
도 5h는 CHOOKT3-PVR로 자극되어, CD226 WT 또는 변이체들을 발현하는 Jurkat 세포에서의 티로신 322-인산화된 CD226 (pY322)에 대한 면역블랏 분석 결과를 나타낸다.
도 6a는 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 전이성 췌장암 (pancreatic ductal adenocarcinoma: PDAC) 환자의 CD8+ T 세포의 t-SNE 플롯 및 각 표면 수용체 발현 수준에 대한 MFI 결과를 나타낸다.
도 6b는 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 PDAC 환자의 CD8+ T 세포에 대한 FlowSOM 시각화 결과이고, 각 노드는 하나의 클러스터 (cluster)를 나타낸다.
도 6c는 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 각 그룹 내에서의 각 클러스터의 비중을 보여주는 요약 그래프 및 각 클러스터에서 공동-수용체의 발현 수준을 보여주는 FACS 히스토그램 (histogram)을 나타낸다.
도 6d는 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 PDAC 환자의 CD45RO+CD8+ 기억 T 세포에서의 CD226 발현 수준에 대한 유세포 분석기 분석 결과 및 CD226hiCD8+ 기억 T 세포의 백분율을 나타낸다.
도 6e는 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 PDAC 환자의 CD8+ T 세포에서의 CD226 발현 수준에 대한 요약 그래프이다.
도 6f는 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 PDAC 환자의 CEF-자극된 CD8+ T 세포의 증식에 대한 유세포 분석기 분석 결과 및 CTVlowCD8+ T 세포의 백분율에 대한 요약 플롯이다.
도 6g는 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 PDAC 환자의 CEF-자극된 CD8+ T 세포의 IFN-γ 분비의 배수 증가를 나타낸다.
도 6h는 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 PDAC 환자로부터 얻어진 것으로서, hIgG 1, 항-TIGIT, 또는 항-PD-1 항체의 존재 또는 부존재하에, CEF-자극된 CD8+ T 세포에 대한 CTV 희석 결과를 보여주는 유세포 분석기 분석 결과 및 CTVlowCD8+ T 세포의 백분율에 대한 요약 플롯이다.
도 6i는 항-hIgG 1 항체와 비교하여, 항-TIGIT 또는 항-PD-1 항체의 존재하에 CEF-자극된 CD226loCD8+ T 세포 또는 CD226hiCD8+ T 세포의 IFN-γ 분비의 배수 증가를 나타낸다.
이하 본 발명을 실험예 및 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실험예 및 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 명세서에서 특별한 정의가 없으면, 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가질 수 있다.
Ⅰ. CD8
+
T 세포에서의 CD226의 발현 양상과 CD8
+
T 세포의 활성/기능과의 연관성 확인
실험예 1. 실험 과정 및 실험재료
1-1. 환자 및 조직 샘플
수술을 받은 암 환자들 각각으로부터 동의를 받은 후 종양 및 이와 매치되는 인접 정상 조직 샘플을 수집하였다. 퍼콜 덴서티 그래디언트 원심분리 (Percoll density gradient centrifugation)에 의해 환자 및 건강한 공여체의 혈액 샘플로부터 PBMC를 분리하였다.
1-2. 연구 승인 (Study approval)
종양 및 TIL 샘플은 각각 승인된 프로토콜 (#2019-0155)에 따라 수집되었다. 이 연구는 Helsinki 선언문의 가이드라인에 따라 수행되었다.
1-3. 인간 T 세포 분석법
마그네틱 분리 키트 (STEMCELL Technologies, Vancouveer, British Columbia, Canada)를 사용하여 PBMC로부터 인간 CD8+ T 세포를 정제하였다. CD8+ T 세포의 활성화를 위해, 다이나비드 (Dynabead) (Invitrogen)에 의해 코팅된 항-CD3/항-CD28로 CD8+ T 세포를 세포 대 비드의 비율을 2:1로 하여 자극시켰다. T 세포 증식 측정 실험의 경우, 세포 배양 전에 CellTraceViolet (CTV) (Invitrogen) 또는 CFSE (Invitrogen)로 정제된 CD8+ T 세포를 표지하였다. CTV 희석액의 정량화에 의해 CTV-표지된 CD8+ T 세포의 증식을 평가하였다. 항체-특이적인 기억 T 세포 반응을 측정하기 위해, CEF 펩티드 풀 (JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany)-접종된 자가 유래 수지상 세포 (DC)와 CD8+ T 세포를 4:1 (T:DC)의 비율로 공동 배양하였다.
단핵구-유래된 DC를 생성하기 위해, MojoSortTM 인간 팬 단핵구 분리 키트 (BioLegend, San Diego, CA, USA)를 사용하여 PBMC로부터 CD14+ 단핵구를 분리하였다. 그 후, GM-CSF (2 ng/ml) 및 IL-4 (10 ng/ml)을 함유하는 완전-RPMI1640 배지에서 배양하였다. DC 성숙 (maturation)은 LPS (1 μg/ml)와 함께 배양하는 것에 의하여 16시간 동안 수행되었다. ELISA (BioLegend)를 사용하여 배양액 내의 INF-γ 분비를 분석하였다. 원시 T 세포 기능에 있어서 CD226 변이체의 효과를 평가하기 위해, 전기천공에 의해 CD226 WT (Wild Type) 또는 변이체를 발현하는 플라스미드를 인간 원시 CD8+ T 세포에 주입하였다. 그 후, CD226 및 FLAG 염색에 기초하여 CD8+ T 세포를 FACS-분류하였다. FACS-분류된 CD8+ T 세포를 CHO-OKT3 또는 CHO-OKT3-PVR 세포에 의하여 10:1 (T:CHO)의 비율로 자극시켰다. 항체 자극을 위해, Jurkat 세포를 황색포도상구균 장독소 E (SEE) (Toxin Technologies, Sarasota, FL, USA)-펄스 Raji B 세포 (pulsed Raji B cell)와 함께 24시간 동안 10:1 (Jurkat:Raji B)의 비율로 공동 배양하였다.
1-4. 마우스
6 내지 8 주 령의 암컷 C57BL/6 및 BALB/c 마우스는 Joongah Bio (Suwon, Korea)로부터 입수하였다. OT-I TCR-유전자 삽입된 마우스 (C57BL/6-Tg (TcraTcrb) 1100Mjb/J)는 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)로부터 구입하였다. 모든 마우스는 아산 메디컬 센터 (Asan Medical Center)의 동물 시설에서 무-병원균 상태로 유지되었다. 모든 동물실험은 아산 메디컬 센터 기관 동물 보호 (Asan Medical Center Institutional Animal Care) 및 사용 위원회에 의해 승인되었고 감독되었다.
1-5. 마우스 종양 모델
흑색종 (B16F10), 유방암종 (4T1), 결장 선암종 (MC38), 및 결장암종 (CT26)의 세포는 ATCC (American Type Culture Collection)에서 수집되었고, ATCC에서 권고된 대로 관리되었다. 종양 챌린지 (tumor challenge)를 위해, B16F10 또는 MC38 세포를 HBSS 용액 (Welgene, Korea)으로 재현탁 하였으며, C57BL/6 마우스의 좌측 복부 (left flank)에 피하 주입하였다. 또한, 4T1 및 CT26 세포를 BLAB/c 마우스에 상기에 기재된 것과 같이 주입하였다. 종양 볼륨은 (길이 (세로)×폭 (가로)2)/2로 계산되었다. 종양은 피하 주입 후 14일이 지났을 때 유세포 분석기 분석법에 의해 분석되었다.
1-6. TIL에 대한 유세포 분석기 분석
gentleMACSTM 디소시에이터 (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, North Rhine-Westphalia, Germany)를 사용하여 종양조직을 HBSS에서 콜라게나제 IV (collagenase IV) (250 유닛 (unit)/ml) (Worthington Biochemical Cooperation, Lakewood, NJ, USA) 및 DNase I (100 μg/ml) (Roche, Basel, Switzerland) 으로 절단하고, 분해하였다. LymphopureTM (BioLegend)를 사용하여 TIL은 증가되었고, 유세포 분석기 및 인 비트로 (in vitro) 분석법에 의한 분석을 위하여 TIL의 단일 세포를 수득하였다.
1-7. 항체 및 유세포 분석기
항-마우스 CD16/32 (BioLegend) 및 인간 TruStain FcX™ (BioLegend)로 마우스 및 인간 단일 세포 각각을 차단하였고, 그때 FACS 버퍼 (2% FBS 및 0.1% 소듐 아자이드 (sodium azide)를 포함하는 PBS)에서 4°C에서 20 분 동안 하기 기재된 항체로 염색하였다. Zombie NIR™ 픽서블 바이어빌리티 다이 (Fixable viability dye) (BioLegend)를 사용하여 죽은 세포는 제외하였다. 세포 내 염색을 위하여, 표면 마커에 대한 항체로 세포를 염색하였다. 그 후, Cytofix/Cytoperm 버퍼 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) 또는 Foxp3/전사 인자 염색 버퍼 세트 (Invitrogen)로 고정 및 투과하였으며, Perm/Wash 버퍼 (BD Biosciences)로 희석된 하기 기재된 항체로 염색하였다. 하기와 같은 항-인간 항체가 결합된 형광 염색제를 사용하였다: 항-CD8 (SK1), 항-CCR7 (G043H7), 항-CD45RO (UCHL1), 항-CD226 (11A8), 항-TIGIT (MBSA43), 항-PD-1 (EH12.2H7), 항-Lag3 (11C3C65), 항-Tim3 (F38-2E2), 항-CTLA4 (L3D10), 항-4-1BB (4B4-1), 항-IFN-γ (4S.B3), 또는 항-TNF-α (MAb11).
마우스 단백질에 대한 항체는 하기와 같았다: 항-CD45 (30-F11), 항-CD3 (17A2), 항-CD8 (53-6.7), 항-CD226 (10E5), 항-TIGIT (1G9), 항-PD-1 (29F.1A12), 항-Tim3 (B8.2C12), 항-Lag-3 (C9B7W), 항-CD38 (90), 항-CD127 (A7R34), 항-Slamf6 (330-AJ), 항-TNF-α (MP6-XT22), 항-IFN-γ (XMG1.2), 항-T-bet (4B10), 항-Ki-67 (11F6), 또는 항-FLAG (L5) (모두 BioLegend로부터 구매됨). 항-Eomes (Dan11mag)은 Invitrogen으로부터 구매되었다. 항-CD101 (Igsf2)은 BD Biosciences로부터 구매되었다.
CytoFLEX 유세포 분석기 (BeckmanCoulter, Brea, CA, USA)를 통해 데이터 수집을 수행하였고, FlowJo 소프트웨어 (v.10.5.3, TreeStar)로 분석하였다. 다중-파라미터 유세포 분석기 데이터 (multi-parameter flow cytometry data)의 자동분석은 tSNE 알고리즘 또는 FlowSOM 알고리즘에 적용되었다.
1-8. OT-I T 세포에서의 CD226의 녹 다운 및 인 비트로 킬링 분석법 (in vitro killing assay)
마우스 CD226-특이적인 shRNA를 부호화 (encoding) 하는 플라스미드를 제조하기 위하여, 형광 단백질 Ametrine 1.1이 발현된 변형-LMP 벡터에 올리고뉴클레오티드를 클로닝 하였다. 올리고뉴클레오티드 염기서열은 하기와 같다: 5'-TGCTGTTGACAGTGAGCGACACTAGGATCTACATTGATAATAGTGAAGCCACAGATGTATTATCAATGTAGATCCTAGTGGTGCCTACTGCCTCGGA-3’(마우스 CD226 shRNA) (서열번호: 2). shRNA-발현 레트로바이러스를 생성하기 위해 Phoenix-Eco 패키징 세포를 사용하였다. OT-I 마우스 (OVA-특이적인 TCR Tg 마우스)로부터 분리된 비장 세포 (Splenocytes)를 IL-2 (2 ng/ml) 존재하에 SIINFEKL 펩티드 (2 μg/ml)로 자극시켰다. 자극 1 일 후에, 스핀 접종 (spin inoculation)에 의해 비장 세포를 8 μg/ml의 폴리브렌 (polybrene) (MilliporeSigma)과 함께 shRNA-발현 레트로바이러스에 감염시켰다. 감염 2 일 후에, mAmetrine1.1 및 CD226 발현 수준에 기초하여 CD8+ T 세포를 분류하였다. 파이어플라이 루시퍼라제 (firefly luciferase: FLuc)를 안정적으로 발현하는 E.G7-OVA 및 레닐라 루시퍼라제 (renilla luciferase: EL4-Rluc)를 안정적으로 발현하는 EL4 세포를 생성하였고, 인 비트로 OT-I T 세포 매개된-킬링 분석법을 위해 사용하였다. 96 웰 플레이트에서 E.G7-OVA-FLuc 및 EL4-RLuc 세포 (1:1)를 FACS-분류된 OT-I T 세포와 함께 지정된 이펙터:타깃 (E:T) 비율로 공동 배양하였다. 48 시간 동안 37℃ 및 5% CO2 조건하에서 상기 플레이트를 배양하였다. 듀얼-글로 루시퍼라제 분석법 시스템 (Dual-Glo luciferase assay system) (Promega)에 의해 제조사의 지시사항에 따라 상대적인 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
1-9. 통계적 분석
그래프패드 프리즘 8.0 (GraphPad Prism 8.0)을 사용하여 통계적 분석을 수행하였다. 통계적 의의는 Holm-Sidak 다중 비교와 함께 양측 페어드 (two-tailed paired) 또는 언페어드 (unpaired) 스튜던트 t 검정 (Student t test) 또는 일원 ANOVA 분석을 사용하여 결정되었다. P 값 < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 고려되었다 (* < 0.05, ** < 0.01, *** < 0.001, 및 **** < 0.0001).
실험예 2. 정상조직 및 종양조직에서의 CD8
+
T 세포의 CD226 발현 양상의 확인
본 실험예에서는 비장의 정상 CD8+ T 세포와 비교하여 종양의 CD8+ TIL에서 CD226 발현 수준의 차이를 확인하기 위해, 유방암종, 흑색종, 결장암종, 또는 결장 선암종을 포함하는 마우스에서 CD226 발현 수준을 조사하였다.
그 결과, 도 1a에 나타낸 바와 같이, 유방암종, 흑색종, 또는 결장암종 종양을 포함한 마우스에서 비장의 정상 CD8+ 기억 T 세포의 다수는 높은 CD226의 발현을 보여주는 반면, 종양의 CD8+ TIL에서는 CD226의 발현이 낮은 세포군의 비율이 유의하게 높았다. 반면, 결장 선암종 종양으로부터 분리된 CD8+ TIL에서는, CD226의 발현이 낮은 세포군의 비율이 유의하게 낮았다. 이러한 수준은 정상 CD8+ 기억 T 세포에서의 CD226의 발현이 낮은 세포군의 비율과 큰 차이가 없는 것이었다.
또한, 도 1b에 나타낸 바와 같이, CD226의 발현 수준은 비장의 정상 CD8+ 기억 T 세포에서보다 종양의 CD8+ TIL에서 유의하게 더 낮았다. 특히, 흑색종 종양의 CD8+ TIL에서 가장 낮았다. 또한, 결장 선암종 종양의 CD8+ TIL에서의 CD226의 발현 수준은 비장의 정상 CD8+ 기억 T 세포와 비교하여 큰 차이가 없었다. 또한, 다른 암종과 비교하여, 흑색종의 경우에, 정상 CD8+ 기억 T 세포와 종양 CD8+ TIL에서의 CD226의 발현 수준의 차이가 가장 크고, 흑색종 종양 CD8+ TIL에서 CD226의 발현 수준이 가장 낮음을 확인하였다.
추가하여, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 신장암종 (RCC) 또는 대장암종 (CRC)을 갖는 환자의 경우에, 정상 조직과 비교하여, CD226loCD8+ 기억 T 세포가 종양 부위에 유의하게 축적되었다 (CD226lo 는 정상 세포보다 낮은 수준으로 CD226이 발현된 상태를 의미 함). 그럼에도 불구하고, 도 1c에 나타낸 바와 같이, 비소세포폐암종 (NSCLC)을 갖는 환자의 경우에는 종양 부위와 정상 조직 사이에서 CD226loCD8+ 기억 T 세포의 빈도에 있어서, 주목할만한 차이는 관찰되지 않았다.
또한, 도 1d에 나타낸 바와 같이, 신장암종, 대장암종, 및 비소세포폐암종 환자의 종양 조직의 CD8+ TIL에서 CD226의 발현 수준은 정상 조직에서보다 유의하게 더 낮았고, 특히 신장암종 종양의 CD8+ TIL에서 가장 낮았다. 또한, 비소세포폐암종 종양으로부터 분리된 CD8+ TIL에서의 CD226의 발현 수준은 정상 조직과 비교하여 그 차이가 가장 적었다. 또한, 다른 암종과 비교하여, 신장암종의 경우에, 정상 조직과 종양 CD8+ TIL에서의 CD226의 발현 수준의 차이가 가장 크고, 신장암종 종양 CD8+ TIL에서 CD226의 발현 수준이 가장 낮음을 확인하였다.
본 실험예를 통해 유방암종, 흑색종, 결장암종, 결장 선암종, 신장암종, 대장암종, 또는 비소세포폐암종의 종양 부위와 정상 조직의 CD8+ 기억 T 세포 및 CD8+ TIL에 있어서 CD226의 발현 수준의 차이가 존재하고, 또한 암종별로 CD226의 발현 양상에 차이가 존재함을 확인하였다. 구체적으로, 정상 조직에서보다 종양 조직의 CD8+ T 세포에서 CD226의 발현 수준이 더 낮음을 확인하였다.
실험예 3. CD226의 발현과 CD8
+
TIL에서의 공동-억제 수용체 발현의 상관관계의 확인
본 실험예에서는 신장암종, 대장암종, 또는 비소세포폐암종을 갖는 환자의 CD8+ TIL에서의 공동-억제 수용체의 발현 수준을 확인하기 위하여, 고차원적인 (high-dimensional) 유세포 분석기 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 2a에 나타낸 바와 같이, CD226hiCD8+ TIL (CD226hi 는 정상 세포와 유사한 수준 이상으로 CD226이 발현된 상태를 의미 함)보다 CD226loCD8+ TIL에서 공동-억제 수용체 (TIGIT, PD-1, Lag-3, 및 Tim-3)가 유의하게 더 높은 수준으로 발현되었음을 확인하였다.
본 실험예를 통해, 신장암종, 대장암종, 또는 비소세포폐암종 종양의 CD8+ TIL에서의 CD226의 고 발현은 공동-억제 수용체 (TIGIT, PD-1, Lag-3, 및 Tim-3)의 발현을 감소시킬 수 있음을 확인하였다.
실험예 4. CD226의 발현과 CD8
+
TIL의 고갈 (exhaustion)의 상관관계의 확인
본 실험예에서는 추가적으로 CD226loCD8+ T 세포의 고갈 (exhaustion)과 관련된 특성을 확인하기 위하여, 유방암종 종양을 갖는 마우스의 CD226hiCD8+ TIL 및 CD226loCD8+ TIL에서의 하기에 기재된 마커의 발현 수준을 분석하였다. 하기에 기재된 마커는 T 세포 고갈의 상이한 상태와 관련이 있는 마커에 해당한다: TIGIT, PD-1, Tim-3, Lag-3, CD101, CD38, CD127, Slamf6, T-bet, 및 Eomes. 구체적으로, 인간 CD8+ TIL과 일치하는 CD8+ TIL에 대하여, tSNE 맵을 사용하여 CD226hiCD8+ TIL 및 CD226loCD8+ TIL 세포군을 시각화하였고, 이를 통해 상기 마커의 발현 수준을 확인하였다.
그 결과, 도 2b 및 2c에 나타낸 바와 같이, 상기 마커의 발현 수준에 있어서 CD226hiCD8+ TIL과 CD226loCD8+ TIL의 뚜렷한 차이를 확인하였다. 구체적으로, CD226loCD8+ TIL에서는 CD226hiCD8+ TIL과 비교하여, TIGIT, PD-1, Tim-3, Lag-3, CD101, CD38, 및 Eomes의 발현 수준이 상대적으로 높았고, 고갈된 표현형을 나타냈으며, CD127, Slamf6, 및 T-bet의 발현 수준은 상대적으로 낮음을 확인하였다.
추가하여, 도 2d에 나타낸 바와 같이, 유방암종 및 결장 선암종 종양을 갖는 마우스로부터 얻어진 CD226loCD8+ TIL의 대다수는 Tim-3+Slamf6-CD8+ TIL였다. 동시에, 상대적으로 적은 비중이지만, Tim-3-Slamf6+CD8+ TIL의 존재도 확인되었다. 따라서, Tim-3과 Slamf6/Tcf7은 각각 전구체와 말기의 고갈된 T 세포를 구별하는 마커인 점에 비추어, 전구체와 말기의 고갈된 T 세포 모두에서 CD226의 발현 수준이 낮음을 확인하였다.
본 실험예를 통해, 고갈된 CD8+ TIL의 경우 CD226의 발현 수준이 낮음을 확인하였고, 이를 통해, CD226은 T 세포 고갈과 관련된 마커가 될 수 있음을 확인하였다.
실험예 5. CD226의 발현과 CD8
+
TIL의 이펙터 기능의 상관관계의 확인
본 실험예에서는 CD226의 발현과 CD8+ TIL의 이펙터 기능의 상관관계를 확인 하기 위하여, CD226hiCD8+ TIL 및 CD226loCD8+ TIL에서의 Ki-67 및 이펙터 시토킨의 발현 수준을 관찰하였다.
그 결과, 도 3a 및 3b에 나타낸 바와 같이, 유방암종 또는 결장 선암종 종양을 갖는 마우스에서 CD226loCD8+ TIL과 비교하여, CD226hiCD8+ TIL은 세포 증식의 표지자인 Ki-67를 더 높은 수준으로 발현하였고, 이펙터 시토킨 (effector cytokine)인 IFN-γ 및 TNF-α 또한 더 높은 수준으로 발현함을 확인하였다.
추가하여, 도 3c에 나타낸 바와 같이, CD226hiCD8+ TIL은 IFN-γ 및 TNF-α의 공동 발현은 증가된 다기능성 (polyfunctionality)을 나타냄을 확인하였다.
본 실험예를 통해, CD8+ TIL에서의 CD226의 고 발현은 CD8+ TIL의 세포 증식의 증가 및 IFN-γ/TNF-α 발현의 증가를 통해 이펙터 기능을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
실험예 6. CD226의 발현과 CD8
+
기억 T 세포의 이펙터 기능의 상관관계의 확인
본 실험예에서는 CD226 하향조절이 CD8+ 기억 T 세포의 기능 감소의 원인이 되는지 확인하기 위하여 정상 상태 (steady-state) 조건 하에서 CD8+ 기억 T 세포 내의 그랜자임 B (GrzB) 및 시토킨의 발현 수준을 조사하였다.
그 결과, 도 3d에 나타낸 바와 같이, 항-CD3/CD28 자극 시, 건강한 공여체-유래의 PBMC로부터 얻어진 CD226loCD8+ 기억 T 세포에서보다 CD226hiCD8+ 기억 T 세포에서 GrzB, IFN-γ, 또는 TNF-α 발현 집단의 비율이 더 높음을 확인하였다.
본 실험예를 통해, CD8+ 기억 T 세포에서의 CD226의 고 발현은 GrzB, IFN-γ, 또는 TNF-α 발현의 증가를 통해 CD8+ 기억 T 세포의 이펙터 기능을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
실험예 7. CD226의 발현과 CD8
+
기억 T 세포의 기억 반응의 상관관계의 확인
본 실험예에서는 항원-특이적인 반응에서 CD226hiCD8+ 기억 T 세포 및 CD226loCD8+ 기억 T 세포의 반응도 (responsiveness)를 평가하기 위하여, CEF 항원에 대응한 CD8+ 기억 T 세포의 기억 반응을 측정하였다. 구체적으로, 도 3e에 나타낸 바와 같이, CD226hiCD8+ 기억 T 세포 및 CD226loCD8+ 기억 T 세포를 건강한 공여체의 PBMC로부터 FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting)-분류하였고, CEF-접종된 자가유래 수지상 세포와 함께 공동 배양하였다.
그 결과, 도 3f 및 3g에 나타낸 바와 같이, CD226hiCD8+ 기억 T 세포는 CEF 항원 자극에 의하여 효과적으로 재활성화된 반면, CD226loCD8+ 기억 T 세포는 세포 증식 및 IFN-γ 분비에 있어서 유의하게 더 낮은 수준을 나타냄을 확인하였다.
또한, 본 실험예에서는 CD226 하향조절이 직접적으로 T 세포의 활성에 영향을 미치는지 확인하고자 하였으며, 이에, 도 3h에 나타낸 바와 같이, OT-I T 세포에서 CD226의 shRNA-매개된 녹 다운을 활용하였다. 구체적으로, OT-I T 세포에서 CD226의 shRNA-매개된 녹 다운을 진행한 후, CD226hiCD62L-CD44+OT-I 기억 T 세포 및 CD226lo/KDCD62L-CD44+OT-I 기억 T 세포는 FACS-분류되었다. 그 후, CD226hiCD62L-CD44+OT-I 기억 T 세포 및 CD226lo/KDCD62L-CD44+OT-I 기억 T 세포 각각을 파이어플라이 루시퍼라제 (E.G7-Fluc)를 발현하는 E.G7-OVA 세포 및 레닐라 루시퍼라제 (EL4-Rluc)를 발현하는 EL4 세포와 공동 배양하였다. 그 후, OT-1 T 세포의 OVA-특이적 세포 독성은 파이어플라이 루시퍼라제 신호 변화가 레닐라 루시퍼라제에 의해 정상화되는 듀얼-루시퍼라제 분석법 (dual-luciferase assay)에 의해 측정되었다.
그 결과, 도 3i에 나타낸 바와 같이, CD226hiOT-I 기억 T 세포는 CD226lo/KDOT-I 기억 T 세포보다 더 높은 세포 독성 활성을 나타냈고, 그 차이는 E:T (effector:target) 비율이 1:20인 경우, 더욱 분명함을 확인하였다.
본 실험예를 통해, CD8+ 기억 T 세포에서의 CD226의 고 발현은 세포 증식, 세포 독성 활성, 및 IFN-γ 분비의 증가와 같은 CD8+ 기억 T 세포의 항원-특이적인 기억 반응을 증가시킬 수 있음을 확인하였다.
Ⅱ. CD226의 발현과 TIGIT 및/또는 PD-1 차단의 효과의 상관관계의 확인
실험예 1. 실험 과정 및 실험재료
1-1. 항체
인간 PD-1 (MK-3475, Pembrolizumab) 및 TIGIT (MBSA43, eBioscience, Waltham, MA, USA) 또는 아이소타입 대조군 (isotype control)에 대한 단일 클론 항체를 인간 엑스 비보 (ex vivo) 분석을 위해 사용하였다. 항-인간 CD226 작용제 항체 (NewE1)를 MilliporeSigma로부터 구매하였고, 항-인간 CD226 작용제 항체 (DX11)는 Abcam로부터 구매하였다. 또한, 항-마우스 PD-1 (J43) 및 항-마우스 TIGIT (1G9) 항체는 BioXCell로부터 구매하였다.
실험예 2. TIGIT 및/또는 PD-1의 차단 효과로서, CD8
+
기억 T 세포의 기억 반응과 CD226 발현의 상관관계의 확인
본 실험예에서는 TIGIT 및/또는 PD-1의 차단 효과로서, CD8+ 기억 T 세포의 기억 반응과 CD226 발현의 상관관계를 확인하기 위하여, CD226hiCD8+ 기억 T 세포 및 CD226loCD8+ 기억 T 세포를 건강한 공여체의 PBMC로부터 FACS-분류하였고, 항-TIGIT 차단 항체의 존재 또는 부존재하에 CEF 펩티드 풀로 자극시켰다.
그 결과, 도 4a 및 4b에 나타낸 바와 같이, CEF 펩티드 자극 시, TIGIT 차단은 CD226hiCD8+ 기억 T 세포의 증식 및 IFN-γ 생산 모두를 강화한 반면, CD226loCD8+ 기억 T 세포에서의 뚜렷한 효과는 관찰되지 않음을 확인하였다. PD-1 차단 또한 상기와 같은, CD226hiCD8+ 기억 T 세포에서만 편향된 효과를 보여줌을 확인하였다. 또한, TIGIT 와 PD-1 차단의 시너지 효과는 오직 CD226hiCD8+ 기억 T 세포에서만 관찰됨을 확인하였다.
추가하여, 본 실험예에서는 CD226 하향조절이 직접적으로 TIGIT 차단 활성에 영향을 미치는지 확인하기 위하여, OT-I T 세포에서 CD226의 shRNA-매개된 녹 다운을 활용하였다. 구체적으로, 항원 비접촉 OT-I T 세포는 OVA 펩티드로 재활성화되었고, 그 후에 CD226 shRNA를 처리하였다. 그 후, 도 3h에 나타낸 바와 같이, CD226hiCD62L-CD44+OT-I 기억 T 세포 및 CD226lo/KDCD62L-CD44+OT-I 기억 T 세포는 FACS-분류되었고, 각각을 파이어플라이 루시퍼라제를 발현하는 E.G7-OVA 세포 및 레닐라 루시퍼라제를 발현하는 EL4 세포와 공동 배양하였다. OT-1 T 세포의 OVA-특이적 세포 독성은 파이어플라이 루시퍼라제 신호 변화가 레닐라 루시퍼라제에 의해 정상화되는 듀얼-루시퍼라제 분석법에 의해 측정되었다. CD226hiCD62L-CD44+OT-I 기억 T 세포 및 CD226lo/KDCD62L-CD44+OT-I 기억 T 세포 각각을 EL4-Rluc 및 E.G7-Fluc 세포와 공동-배양 (E:T (effector:target) = 1:10)한 후, 배양액에 항-TIGIT 또는 항-PD-1 차단 항체를 첨가하였다.
그 결과, 도 4c에 나타낸 바와 같이, TIGIT 차단은 E.G7-Fluc에 대한 CD226hiOT-I 기억 T 세포의 세포 독성 활성을 유의하게 강화한 반면, CD226lo/KDOT-I 기억 T 세포에서는 어떠한 현저한 효과도 나타나지 않음을 확인하였다. 마찬가지로, PD-1 차단은 CD226hiOT-I 기억 T 세포에서만 오직 현저한 효과를 나타냄을 확인하였다.
본 실험예를 통해, TIGIT 및/또는 PD-1의 차단 효과로서, CD8+ 기억 T 세포의 기억 반응이 증가되기 위해서는 CD226의 고 발현이 전제되어야 함을 확인하였다.
Ⅲ. CD226의 인산화 사이트와 CD226
hi
CD8
+
T 세포 활성화의 상관관계의 확인
실험예 1. 실험 과정 및 실험재료
1-1. 플라스미드
깁슨 어젬블리 (Gibson assembly)를 사용하여 전체 길이의 인간 CD226 (aa 1-336), TIGIT (aa 1-244), 및 PVR (aa 1-372) 유전자를 합성하였으며, pSBbi-RB 벡터 (Addgene, 플라스미드 #60522)로 클로닝 하였다. CD226의 N 말단을 FLAG로 태깅 (tagging) 하였다. PCR-기반의 특정-부위 돌연변이 유발 (site-directed mutagenesis)에 의하여 CD226 (Y322A, S329A, 및 Y322A/S329A) 및 TIGIT (Y225A/Y231A)의 점 변이체 (point mutant)를 생성하였고, DNA 염기서열 분석에 의해 검증하였다. 항-인간 CD3 단일-사슬 단편의 변수 (scFv)를 부호화하는 유전자를 합성하였고, pLV-EF1α-IRES-Puro 벡터 (Addgene, 플라스미드 #85132; Addgene, Watertown, MA, USA)로 클로닝 하였다. 파이어플라이 루시퍼라제 cDNA는 pGL2-Luc 벡터 (Promega, Madison, Wi, USA)로부터 PCR-증폭되었으며, 이를 pSBbi-RB 벡터로 서브클로닝 하였다. 레닐라 루시퍼라제 cDNA는 pRL 벡터 (Promega)로부터 PCR-증폭되었으며, 이를 pSBbi-BP 벡터 (Addgene, 플라스미드 #60512)로 서브클로닝 하였다.
1-2. 안정적인 세포주 생성
CD226 (WT, Y322A, S329A, 또는 Y322A/S329A) 또는 TIGIT (WT 또는 Y225A/Y231A)을 발현하는 pSBbi-RB를 pCMV (CAT) T7-SB100 (Addgene, 플라스미드 #34879)와 함께 Neon 전기천공 시스템 (Neon electroporation system) (Invitrogen, Waltham, MA, USA)을 사용하여 Jurkat 세포에 주입하였다. 주입 후, 2 주간 블라스티시딘 (blasticidin)의 존재하에 양성 세포를 선별하였고, FACS에 의해 정제하였다. T 세포 자극 세포 (T cell stimulator cell)의 생성을 위해 CHO (Chinese hamster ovary) 세포는 OKT3 scFv를 부호화하는 렌티바이러스 (lentivirus)로 감염되었다. 퓨로마이신 (Puromycin) 선별 2 주 후, 항-마우스 IgG 항체를 사용하여 FACS에 의해 OKT3 scFv 발현을 입증하였다. PVR을 발현하는 CHO-OKT3 세포를 생성하기 위해, PVR을 발현하는 플라스미드를 CHO-OKT3 세포에 주입하였고, 블라스티시딘을 사용하여 선별하였다. 항원-의존 T 세포 활성을 측정하기 위해, PVR을 안정적으로 발현하는 Raji B 세포를 상기 기재된 것과 같은 방법으로 생성하였다. CHO-OKT3-PVR 및 Raji B-PVR 세포에서의 PVR 발현은 항-인간 PVR FACS 염색에 의해 확인되었다.
1-3. 웨스턴 블랏
CD226 WT 또는 변이체를 안정적으로 발현하는 Jurkat 세포를 CHO-OKT3-PVR로 5:1 (Jurkat:CHO)의 비율에서 자극시켰다. 60 mM 트리스 HCl, 2% SDS, 10% 글리세롤, 및 100 mM DTT (dithiothreitol)를 포함하는 SDS 샘플 버퍼에서 상기 세포를 용해하였다. 상기 용해로인한 세포 라이세이트 (cell lysate)를 SDS-PAGE에 리졸빙 (resolving) 하였고, 하기 기재된 항체와 함께 면역블랏팅 (immunoblotting) 하였다. 면역블랏팅을 위하여, phospho-ERK1/2 (#4370, CST), phospho-p38 (#4511, CST), phospho-AKT (#4060, CST), 및 β-actin (#8457, CST)에 대한 프라이머리 항체를 Cell Signaling Technology로부터 구매하였고, MilliporeSigma로부터 항-FLAG M2를 구매하였다.
실험예 2. 항원-특이적으로 CD8
+
T 세포의 CD226의 인산화를 조절하는 CD226 내의 인산화 사이트의 규명
본 실험예에서는 CD8+ T 세포의 TCR (T-cell receptor) 시그널링 전달에 있어서 CD226의 어느 인산화 사이트가 지배적인 역할을 갖는지 확인하기 위하여, CD226WT (CD226WT 또는 CD226 WT 는 유전자 변이체가 아닌 야생형 (Wild Type)의 CD226을 의미 함)를 발현하는 Jurkat 세포 또는 티로신 322를 알라닌 (alanine)으로 변환한 변이 (mutation) (Y322A) 및/또는 세린 (serine) 329을 알라닌으로 변환한 변이 (S329A)를 갖는 변이체를 생성하였다 (CD226Y322A 또는 CD226 Y322A 는 CD226 내의 322번째 아미노산인 티로신을 알라닌으로 변환한 CD226 변이체를 의미함; CD226S329A 또는 CD226 S329A 는 CD226 내의 329번째 아미노산인 세린을 알라닌으로 변환한 CD226 변이체를 의미함; CD226Y322A/S329A 또는 CD226 Y322A/S329A 는 CD226 내의 322번째 아미노산인 티로신을 알라닌으로 변환하고, CD226 내의 329번째 아미노산인 세린을 알라닌으로 변환한 CD226 변이체를 의미 함).
그 결과, 도 5a에 나타낸 바와 같이, CHO-OKT3-PVR 세포 (OKT3 scFv 및 인간 PVR 모두를 발현하는 CHO 세포)로 자극 시, 하위 TCR 신호 전달 분자 (ERK1/2, p38, 및 AKT)의 인산화 수준은 JurkatS329A 세포를 제외한 JurkatY322A와 JurkatY322A/S329A 세포 모두에서 감소됨을 확인하였다.
본 실험예를 통해, 항원 특이적으로 CD8+ T 세포의 CD226의 인산화를 조절하는 CD226 내의 지배적인 인산화 사이트는 티로신 322임을 확인하였다.
실험예 3. CD226의 티로신 인산화와 CD226
hi
CD8
+
T 세포 활성화의 상관관계의 확인
본 실험예에서는 CD226의 티로신 인산화와 CD226hiCD8+ T 세포 활성화의 상관관계를 확인 하기 위하여, 인간 프라이머리 (primary) CD8+ T 세포에서 CD226WT 및 변이체들을 외인성으로 (exogenously) 발현시켰다. 구체적으로, 인간 프라이머리 CD8+ T 세포에 FACS-분류된 CD226WT, CD226Y322A, CD226S329A, 또는 CD226Y322A/S329를 인코딩하는 플라스미드를 주입하였고, CHO-OKT3 또는 CHOOKT3-PVR 세포로 자극 되었다.
그 결과, 도 5b 및 5c에 나타낸 바와 같이, CHO-OKT3 세포에 의한 자극의 경우 CD226WTCD8+ T 세포와 비교하여 CD226Y322ACD8+ T 세포 및 CD226Y322A/S329ACD8+ T 세포에서, 이펙터 반응에 있어서 작은 감소만이 유도됨을 확인하였다. 그러나 CHOOKT3-PVR 세포에 의한 PVR 공동-자극의 경우에는, CD226의 세린 329가 아닌 티로신 322에서의 변이는 T 세포 증식 및 IFN-γ 분비를 유의하게 감소시킴을 확인하였다.
본 실험예를 통해, CD226hiCD8+ T 세포의 활성을 증가시키기 위해서는 항원-특이적인 CD226의 티로신 322 인산화가 요구됨을 확인하였다.
실험예 4. CD226의 티로신 인산화와 TIGIT/PD-1 차단 및/또는 CD226 활성화의 효과의 상관관계의 확인
본 실험예에서는 CD226의 티로신 인산화가 손상된 경우에도, TIGIT 차단에 의한 CD8+ T 세포의 활성이 여전히 증가되는지 확인하기 위하여, 인간 프라이머리 CD8+ T 세포에서 CD226WT 및 변이체들을 외인성으로 발현시키고, TIGIT 차단에 의한 CD8+ T 세포의 활성에 대하여 분석하였다. 구체적으로, 인간 프라이머리 CD8+ T 세포에 FACS-분류된 CD226WT, CD226Y322A, CD226S329A, 또는 CD226Y322A/S329를 인코딩하는 플라스미드를 주입하였고, CHO-OKT3 또는 CHOOKT3-PVR 세포로 자극되었다.
그 결과, 도 5d에 나타낸 바와 같이, CD226Y322ACD8+ T 세포의 IFN-γ 분비는 CD226WTCD8+ T 세포와 비교하여 유의하게 감소하였다. 또한, 이러한 CD226Y322ACD8+ T 세포의 손상된 활성은 항-TIGIT 차단 항체의 투여에 의해 회복되지 않았다. 반면, CD226WTCD8+ T 세포는 항-TIGIT 차단 항체의 투여에 의해 더욱 증가된 이펙터 반응을 나타냄을 확인하였다. 이를 통해, CD8+ T 세포를 활성화시키는 TIGIT 차단의 효과를 위해서는 CD226의 티로신 인산화가 요구됨을 확인하였다.
추가적으로, 본 실험예에서는 TIGIT 및/또는 PD-1의 차단 및/또는 CD226의 활성화는 CD226의 티로신 인산화를 촉진시키고, 그것을 통해, CD8+ T 세포가 활성화되는지 확인하기 위하여, TIGITWT 또는 인산화 변이체 (TIGITY225A/Y231A)를 안정적으로 발현하는 Jurkat 세포를 생성하여 분석하였다 (TIGITWT 또는 TIGIT WT 는 유전자 변이체가 아닌 야생형 (Wild Type)의 TIGIT를 의미 함; TIGITY225A/Y231A 또는 TIGIT Y225A/Y231A 는 TIGIT 내의 225번째 아미노산인 티로신을 알라닌으로 변환하고, TIGIT 내의 231번째 아미노산인 티로신을 알라닌으로 변환한 TIGIT 변이체를 의미 함). 상기의 생성된 Jurkat 세포를 항-TIGIT 차단 항체 및/또는 항-PD-1 차단 항체 및/또는 항-CD226 작용제 항체를 처리하여 배양하고, 항-pCD226Y322 항체에 의하여 Jurkat 세포에서의 CD226의 티로신 인산화를 측정하였다.
그 결과, 도 5e에 나타낸 바와 같이, Jurkat 세포에서 TIGITWT의 발현은 PVR-유도된 CD226의 티로신 322 인산화를 차단한 반면, TIGITY225A/Y231A 변이체의 발현은 CD226의 티로신 322 인산화를 과도하게 촉진시켰음을 확인하였다. 또한, Jurkat TIGITWT 세포에 항-TIGIT 차단 항체를 처리한 경우 CD226에서의 손상된 티로신 인산화가 Jurkat TIGITY225A/Y231A 세포와 비슷한 정도로 회복되었음을 확인하였다.
다음으로, CD226의 활성화의 조건에서 CD226의 티로신 인산화가 촉진되고, 그것을 통해, CD8+ T 세포가 활성화되는지 확인하기 위하여, TIGIT 시그널링을 유도하지 않으면서 CD226 시그널링을 특이적으로 활성화하는 항-CD226 작용제 항체에 의해 CD226를 활성화 하였고, CD226의 티로신 인산화를 항-pCD226Y322 항체에 의하여 측정하였다.
그 결과, 도 5f에 나타낸 바와 같이, 항-CD226 작용제 항체에 의한 CD226의 활성화는 CD226의 티로신 인산화 및 TCR 시그널링을 촉진함을 확인하였다. 또한, 도 5g에 나타낸 바와 같이, CEF 항원에 의한 CD8+ 기억 T 세포의 재활성화에 있어서 항-CD226 작용제 항체는 항-TIGIT 차단 항체와 상당한 시너지 효과를 보이면서 CD8+ 기억 T 세포의 기억반응을 증가시킴을 확인하였다.
즉, 본 실험예를 통해, CD226의 티로신 인산화의 경우에만 TIGIT 차단에 의한 효과가 발생될 수 있고, 구체적으로는, TIGIT 및/또는 PD-1의 차단 및/또는 CD226의 활성화는 CD226의 티로신 인산화를 촉진시키고, 그것을 통해, CD8+ T 세포가 활성화됨을 확인하였다. 결국, CD8+ T 세포를 활성화시키는 TIGIT/PD-1 차단의 효과를 위해서는 CD226의 티로신 인산화가 요구됨을 확인하였다.
실시예 1. 티로신-인산화된 CD226와 결합하는 항체의 제조
본 실시예에서는 티로신-인산화된 CD226와 결합하는 항체를 제조하기 위하여, KLH (keyhole limpet hemocyanin)-접합되고, 티로신 322-인산화된 펩티드를 토끼에 주입하여 항-phospho-CD226 (티로신 322) 항체를 생성하였고, 친화성 크로마토그래피를 사용하여 칼럼 상에서 이를 정제하였다.
그 결과, 도 5h에 나타낸 바와 같이, 티로신 322 인산화된 CD226 (pCD226Y322)에 대한 항체를 생성하였다 (pCD226Y322 는 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성된 CD226의 322번째에 위치한 티로신에서 인산화된 CD226을 의미 함). 그 후, JurkatWT 및 JurkatS329A 세포 모두에서 PVR-유도된 티로신 322에서의 CD226의 인산화가 항-pCD226Y322 항체에 의하여 탐지됨을 확인하였다.
상기 항-pCD226Y322 항체는 폴리클로날 (polyclonal) 항체로서, 항체 제작 업체 (앱클론, AbClon)에 의뢰하여 제조하였다.
본 실시예의 항-pCD226Y322 항체를 통해, 티로신 322 인산화된 CD226를 탐지할 수 있고, 그로 인해 항-pCD226Y322 항체를 항-TIGIT 요법 또는 항-PD-1 요법에 활용하여 암 면역 치료의 효능을 예측할 수 있음을 확인하였다.
Ⅳ. 임상 샘플 (clinical sample)을 사용한, 암 면역 치료의 효능을 예측하는 CD226의 용도 검증
실험예 1. 실험 과정 및 실험재료
1-1. 환자 및 조직 샘플
암 면역 치료의 효능을 예측하는 CD226의 용도를 검증하기 위하여, 변형된 FOLFIRINOX (5-플루오로우라실, 류코보린, 이리노테칸, 및 옥살리플라틴)의 2단계 (phase 2) 임상시험에 등록된 환자로서, 이미 국소적인 췌장관세포암을 가진 환자로부터 mFOLFIRINOX 치료를 받기 전/후의 혈액 샘플을 얻었다. 퍼콜 덴서티 그래디언트 원심분리 (Percoll density gradient centrifugation)에 의해 환자 및 건강한 공여체의 혈액 샘플로부터 PBMC를 분리하였다.
1-2. 연구 승인 (Study approval)
건강한 공여체 및 전이성 췌장암 (pancreatic ductal adenocarcinoma: PDAC) 환자들로부터 혈액 샘플의 수집은 아산 메디컬 센터의 기관 감사 위원회로부터 승인된 프로토콜에 따라 수행되었다 (#2016-0010 및 #2018-1525).
1-3. 항체 및 유세포 분석기
인간 TruStain FcX™ (BioLegend)로 인간 단일 세포 각각을 블록킹화하였고, 그때 FACS 버퍼 (2% FBS 및 0.1% 소듐 아자이드 (sodium azide)를 포함하는 PBS)에서 4°C에서 20 분 동안 하기 기재된 항체로 염색하였다. Zombie NIR™ 픽서블 바이어빌리티 다이 (Fixable viability dye) (BioLegend)를 사용하여 죽은 세포는 제외하였다. 세포 내 염색을 위하여, 표면 마커에 대한 항체로 세포를 염색하였고, 그때 Cytofix/Cytoperm 버퍼 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA) 또는 Foxp3/전사 인자 염색 버퍼 세트 (Invitrogen)로 고정 및 투과하였으며, Perm/Wash 버퍼 (BD Biosciences)로 희석된 하기 기재된 항체로 염색하였다. 하기와 같은 항-인간 항체가 결합된 형광 염색제를 사용하였다: 항-CD8 (SK1), 항-CCR7 (G043H7), 항-CD45RO (UCHL1), 항-CD226 (11A8), 항-TIGIT (MBSA43), 항-PD-1 (EH12.2H7), 항-Lag3 (11C3C65), 항-Tim3 (F38-2E2), 항-CTLA4 (L3D10), 항-4-1BB (4B4-1), 항-IFN-γ (4S.B3), 또는 항-TNF-α (MAb11).
CytoFLEX 유세포 분석기 (BeckmanCoulter, Brea, CA, USA)를 통해 데이터 수집을 수행하였고, FlowJo 소프트웨어 (v.10.5.3, TreeStar)로 분석하였다. 다중-파라미터 유세포 분석기 데이터 (multi-parameter flow cytometry data)의 자동분석은 tSNE 알고리즘 또는 FlowSOM 알고리즘에 적용되었다.
실험예 2. 췌장암 환자의 CD8
+
T 세포의 CD226 발현 양상의 차이 확인
본 실험예에서는 CD8+ T 세포에서 CD226 상향조절이 TIGIT 차단에 대한 반응을 예측하는지 확인하기 위하여 임상 샘플을 사용하였다. 구체적으로, 전이성 췌장암용 표준 화학요법 제제인 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 PDAC 환자의 말초 혈액 CD8+ T 세포에 대하여 면역 모니터링 (immune monitoring)을 수행하였다.
그 결과, 도 6a에 나타낸 바와 같이, 면역 관문 마커 (immune checkpoint marker) (CD45RO, CCR7, CD226, TIGIT, PD-1, Lag-3, Tim-3, CTLA4, 및 4-1BB)를 사용하여 수행된 고차원적인 유세포 분석기 분석과 t-SNE 분석을 통해, CD8+ T 세포는 mFOLFIRINOX 치료 후에 보다 활성화된 표현형을 획득하였다는 것을 확인하였다.
추가하여, 본 실험예에서는 mFOLFIRINOX 치료 후의 말초 혈액 CD8+ T 세포의 표현형에 대하여 보다 종합적인 이해를 얻기 위하여, 마커 발현수준을 기반으로 하여 CD8+ T 세포의 클러스터를 생성하기 위한 자율의 (unsupervised) 자기 조직화 지도 (Self-Organizing Map) (FlowSOM) 알고리즘을 채용하였다. 구체적으로, 도 6b에 나타낸 바와 같이, 8개의 CD8+ T 세포 클러스터의 생성수형도 (minimal spanning tree)를 생성하였고, 각 클러스터는 메타클러스터 (metacluster)로 배정되었다.
그 결과, 도 6c에 나타낸 바와 같이, mFOLFIRINOX 치료 전과 후 사이에서 같은 클러스터의 빈도를 비교하였을 때, mFOLFIRINOX 치료 후에 CD226loTIGIThiPD-1hi4-1BBlo/med 발현을 가진 분화 말기의 CD8+ 기억 T 세포를 나타내는 클러스터 1 및 5의 빈도의 감소를 확인하였다. 반대로, mFOLFIRINOX 치료 후에 CD226hiTIGITmedPD-1med4-1BBmed/hi 발현의 프로파일을 갖는 클러스터 2 및 3의 증가된 빈도를 확인하였다. 참고로, 항원 비접촉 CD8+ T 세포와 CD8+ 기억 T 세포 사이의 비율은 크게 변경되지 않음을 확인하였다. 또한, CD8+ 기억 T 세포에서의 CD226 상향조절은 도 6d 및 6e에서 추가적으로 확인되었다.
추가적으로, mFOLFIRINOX 치료 후, CD226의 상향조절이 CD8+ 기억 T 세포의 강화된 반응을 유도하는지 확인하기 위하여 CEF 펩티드 풀 자극에 대한 그들의 반응도를 평가하였다.
그 결과, 도 6f 및 6g에 나타낸 바와 같이, 치료 전과 비교하여, mFOLFIRINOX 치료 후의 CD8+ 기억 T 세포는 IFN-γ의 배수 증가와 더 높은 비율의 증식을 나타냄을 확인하였다.
본 실험예를 통해, 췌장암 환자의 mFOLFIRINOX 치료 전/후의 CD8+ T 세포에서 CD226의 발현 양상에 있어서 뚜렷한 차이를 확인하였고, 특히, mFOLFIRINOX 치료 후에 CD8+ T 세포에서 CD226의 발현이 증가되었고, 그로 인해 CD8+ 기억 T 세포의 활성 또한 증가되었음을 확인하였다.
실험예 3. 췌장암 환자의 CD226 발현 양상에 따른 TIGIT 및/또는 PD-1 차단 효과의 차이 확인
본 실험예에서는 mFOLFIRINOX-유도된 CD226 상향조절이 TIGIT 또는 PD-1 차단 효과를 강화하는지를 평가하였다.
그 결과, 도 6h에 나타낸 바와 같이, mFOLFIRINOX 치료 후의 환자로부터 얻어진 CD8+ 기억 T 세포의 증식 비율은 항-TIGIT 또는 항-PD-1 차단 항체의 투여에 의하여 뚜렷하게 강화되었고, 치료 전의 환자로부터 얻어진 CD8+ 기억 T 세포에서는 오직 제한적인 효과만이 관찰됨을 확인하였다. 또한 도 6i에 나타낸 바와 같이, mFOLFIRINOX 치료 전의 환자로부터 얻어진 CD8+ 기억 T 세포에서 대조군 hIgG 1 항체와 비교하여 항-TIGIT 또는 항-PD-1 차단 항체에 반응하여 분비한 IFN-γ는 각 1.2 배 및 1.9 배 증가한 반면, mFOLFIRINOX 치료 후의 CD8+ 기억 T 세포에서는 TIGIT 또는 PD-1 차단에 의해 IFN-γ의 분비가 각 1.7 배 및 2.5 배 증가하였음을 확인하였다.
본 실험예를 통해, mFOLFIRINOX 치료에 의한 CD226의 상향조절은 CD8+ T 세포가 TIGIT 또는 PD-1 차단에 대하여 더 높은 반응성을 갖게 할 수 있다는 것을 확인하였다. 결국, 이러한 결과는 항-TIGIT/PD-1 요법에 있어서 암 면역 치료의 효능을 예측하는 CD226의 예측적 용도를 보여준다.
따라서, 이러한 CD226의 예측적 용도의 활용은 항-TIGIT/PD-1 요법의 개선방향 및 다른 암 면역 치료와의 조합을 제시할 수 있고, 궁극적으로 암 면역 치료의 효과를 개선할 수 있다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> KOREA INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY
<120> Biomarker for predicting efficacy of cancer immunotherapy and
uses thereof
<130> PN131926
<160> 2
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 336
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(336)
<223> CD226
<400> 1
Met Asp Tyr Pro Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu His Val Tyr Arg Ala
1 5 10 15
Leu Cys Glu Glu Val Leu Trp His Thr Ser Val Pro Phe Ala Glu Asn
20 25 30
Met Ser Leu Glu Cys Val Tyr Pro Ser Met Gly Ile Leu Thr Gln Val
35 40 45
Glu Trp Phe Lys Ile Gly Thr Gln Gln Asp Ser Ile Ala Ile Phe Ser
50 55 60
Pro Thr His Gly Met Val Ile Arg Lys Pro Tyr Ala Glu Arg Val Tyr
65 70 75 80
Phe Leu Asn Ser Thr Met Ala Ser Asn Asn Met Thr Leu Phe Phe Arg
85 90 95
Asn Ala Ser Glu Asp Asp Val Gly Tyr Tyr Ser Cys Ser Leu Tyr Thr
100 105 110
Tyr Pro Gln Gly Thr Trp Gln Lys Val Ile Gln Val Val Gln Ser Asp
115 120 125
Ser Phe Glu Ala Ala Val Pro Ser Asn Ser His Ile Val Ser Glu Pro
130 135 140
Gly Lys Asn Val Thr Leu Thr Cys Gln Pro Gln Met Thr Trp Pro Val
145 150 155 160
Gln Ala Val Arg Trp Glu Lys Ile Gln Pro Arg Gln Ile Asp Leu Leu
165 170 175
Thr Tyr Cys Asn Leu Val His Gly Arg Asn Phe Thr Ser Lys Phe Pro
180 185 190
Arg Gln Ile Val Ser Asn Cys Ser His Gly Arg Trp Ser Val Ile Val
195 200 205
Ile Pro Asp Val Thr Val Ser Asp Ser Gly Leu Tyr Arg Cys Tyr Leu
210 215 220
Gln Ala Ser Ala Gly Glu Asn Glu Thr Phe Val Met Arg Leu Thr Val
225 230 235 240
Ala Glu Gly Lys Thr Asp Asn Gln Tyr Thr Leu Phe Val Ala Gly Gly
245 250 255
Thr Val Leu Leu Leu Leu Phe Val Ile Ser Ile Thr Thr Ile Ile Val
260 265 270
Ile Phe Leu Asn Arg Arg Arg Arg Arg Glu Arg Arg Asp Leu Phe Thr
275 280 285
Glu Ser Trp Asp Thr Gln Lys Ala Pro Asn Asn Tyr Arg Ser Pro Ile
290 295 300
Ser Thr Gly Gln Pro Thr Asn Gln Ser Met Asp Asp Thr Arg Glu Asp
305 310 315 320
Ile Tyr Val Asn Tyr Pro Thr Phe Ser Arg Arg Pro Lys Thr Arg Val
325 330 335
<210> 2
<211> 97
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> mouse CD226 sh RNA
<400> 2
tgctgttgac agtgagcgac actaggatct acattgataa tagtgaagcc acagatgtat 60
tatcaatgta gatcctagtg gtgcctactg cctcgga 97
Claims (12)
- 백혈구의 CD226 발현 수준을 측정하기 위한 제제를 포함하는 암 면역 치료의 효능 예측용 조성물로서,
상기 암 면역 치료는 항-TIGIT 요법 또는 항-PD-1 요법인 것인, 암 면역 치료의 효능 예측용 조성물. - 청구항 1에 있어서, 상기 백혈구는 CD8+ T 세포, CD8+ 기억 T 세포 (memory T cell), 또는 CD8+ 종양침윤림프구 (Tumor Infiltrating Lymphocyte: TIL)인 것인, 암 면역 치료의 효능 예측용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 CD226은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 CD226에서 322번째 티로신 (tyrosine)이 인산화된 것인, 암 면역 치료의 효능 예측용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 상기 CD226 또는 상기 CD226을 코딩하는 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브, 올리고뉴클레오티드, 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 리간드, 수용체, 작용제 (agonist) 또는 길항제 (antagonist), 또는 이의 조합인 것인, 암 면역 치료의 효능 예측용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 제제는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 CD226에서 322번째 티로신이 인산화된 CD226과 결합하는 항체인 것인, 암 면역 치료의 효능 예측용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 암 면역 치료는 플루오로우라실 (fluorouracil), 류코보린 (leucovorin), 이리노테칸 (irinotecan), 및 옥살리플라틴 (oxaliplatin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 치료 물질이 병용투여 되는 것인, 암 면역 치료의 효능 예측용 조성물.
- 청구항 1의 암 면역 치료의 효능 예측용 조성물을 포함하는, 암 면역 치료의 효능 예측용 키트.
- (a) 개체의 시료로부터 CD8+ T 세포의 CD226 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) (a)에서 측정된 CD226의 발현 수준을 대조군에서 측정된 CD226의 발현 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 암 면역 치료의 효능 예측을 위한 정보제공방법. - 청구항 8에 있어서, 상기 CD226은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 CD226에서 322번째 티로신이 인산화된 것인, 정보제공방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 (a) 단계는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 CD226에서 322번째 티로신이 인산화된 CD226과 결합하는 항체에 의하여 상기 CD226 발현 수준을 측정하는 것인, 정보제공방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 (a) 단계는 웨스턴 블랏 (western blot), 효소결합면역흡착검사 (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA), 면역크로마토그래피, 면역형광분석법 (Immunofluorescence assay: IFA), 면역블롯 (immunoblotting), 방사선면역분석법 (Radioimmunoassay: RIA), 방사면역확산법 (Radioimmunodiffusion), 오우크테로니 (Ouchterlony) 면역확산법, 로케트 (Rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전분석법 (immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법 (complete fixation assay), FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting), 및 단백질 칩 (protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상에 의하여 CD226의 발현 수준을 측정하는 것인, 정보제공방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 암 면역 치료는 항-TIGIT 요법 또는 항-PD-1 요법인 것인, 정보제공방법.
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| US20150299804A1 (en) * | 2012-11-15 | 2015-10-22 | Bristol-Myers Squibb Company | Biomarkers for predicting clinical response of cancer patients to treatment with immunotherapeutic agent |
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- 2020-09-03 KR KR1020200112550A patent/KR102647295B1/ko active IP Right Grant
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Sci. Immunol.(2018.11.2) Vol. 3, eaat7061. 1부.* * |
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| KR102647295B1 (ko) | 2024-03-14 |
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