KR20220028029A - 항체 약물 접합체 정제 - Google Patents

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아니카 홀츠그레페
미하엘 슐테
라르스 페크
도미닉 초른
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메르크 파텐트 게엠베하
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Abstract

본 발명은 아미노산 기반 말단기를 갖는 이온 교환 분리 물질에 관한 것이다. 이 물질은 ADC 의 분리 및 정제에 특히 적합하다.

Description

항체 약물 접합체 정제
본 발명은 아미노산 기반 말단기를 갖는 이온 교환 분리 물질에 관한 것이다. 이 물질은 ADC 의 분리 및 정제에 특히 적합하다.
항체 약물 접합체 (ADC) 는 전형적으로 암 치료 전용의 새로운 부류의 고효능 약물이다. 이들 접합체에서, 항체 분자는 암 세포의 특이적 인식에 전념하고, 항체 분자에 의해 운반되는 독성 페이로드는 이들을 파괴한다. 상업적으로 입수가능한 ADC 의 예는 Adcetris® 및 Kadcyla® 이다.
이들 신약은 항체 분자에 독성 분자 (페이로드) 를 접합시켜 제조한다. 이는 전형적으로 항체의 표면에 노출된 특정 아미노산 잔기, 예를 들어 시스테인 결합 환원 후 리신 또는 시스테인과의 제어된 화학적 접합 방법을 통해 달성된다. 두 접근 방식 모두 가변적인 약물 대 항체 비율 (DAR's) 을 갖는 ADC 종의 불균질 혼합물을 초래한다. 리신 접합 경로는 100 개 초과의 가능성을 생성하고 상이한 DAR 의 이종 집단 (0, 1, 2, 3, 4...>10) 을 초래할 것이다. 시스테인 접합 경로는 항체의 4 개의 디설파이드 브릿지를 이용하는 짝수 DAR (예를 들어, 0, 2, 4, 6 및 8) 의 집단을 초래할 것이다. ADC 종 부위의 이질성을 최소화하기 위해 특이적 접합 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은 항체에 연결된 페이로드 분자의 정확한 수 및 위치에 대한 더 나은 제어를 갖지만, 이것이 약물의 효능에 영향을 줄 수 있기 때문에, 접합된 독성 분자의 제한된 양 (예를 들어, 보통 단지 2 개) 및 접합 부위의 제한된 선택으로 인해 어렵다. ADC 이질성에서의 제조 문제를 극복하기 위해, 일부 크로마토그래피 기술이 바람직하지 않은 낮은 DAR 및 높은 DAR 종을 제거하는데 사용될 수 있다. 낮은 DAR 종은, 이들이 항체 약물 접합체와 경쟁하고 약물의 효능을 감소시키기 때문에 바람직하지 않다. DAR 종 (> 6) 을 운반하는 높은 독성 페이로드는 또한 바람직하지 않은데, 이는 이들이 약물 효율 및 수명에 영향을 주기 때문이다 (K.J. Hamblett et al. in Clinical Cancer Research 10 (2004) 7063-7070). ADC 에 대한 추가 정보는 Rachel S. Zolot, Satarupa Basu, Ryan P. Million. Antibody-drug conjugates. Nature reviews Drug Discovery. 2013, 12: 259-260 에서 발견될 수 있다. 예시적인 ADC 에 대한 세부사항은 WO 2011/139985, 특히 실시예 8 에서 찾을 수 있다.
소수성 상호작용 크로마토그래피는 종종 접합 과정 후 ADC 종의 정제를 위해 적용된다 (US15104359). 불행하게도, 이 방법은 높은 염 농도 용액에서 낮은 ADC 안정성 및 낮은 결합 용량 (~10 mg/ml) 으로 인해 제한되어 높은 정제 비용 및 낮은 정제 효율을 야기한다. 따라서, DAR2 및 DAR4 종을 주로 수득하고 최상의 약동학, 효능, 반감기 및 내약성을 가능하게 하는 ADC 약물의 효율을 향상시키기 위한 산업에서의 요구가 증가하고 있다.
결과적으로, 상이한 DAR 종들이 효율적으로 분리되는, 광범위한 조건에서 효과적으로 적용가능한, 강건하고 신뢰성 있는 항체 약물 접합체 정제 단계를 제공하는 방법을 찾는 것이 유리할 것이다. 이는 또한 정제 비용을 감소시키는 데 유리할 것이다.
공유적으로 부착된 류신 잔기 또는 유사한 잔기를 보유하는 이온 교환 물질이 >10 mg ADC/ml 물질 용량에서 효율적인 DAR (약물 항체 비) 종 분리를 가능하게 하는 ADC 의 정제를 위해 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌으며, 여기서 더욱 바람직한 구현예에서 용량은 10-80 mg/ml 이다. 또한, 이 혁신적인 이온 교환 물질은 10 mS/cm 초과의 높은 전도도에서 사용될 수 있으며, 더욱 바람직한 구현예에서 전도도는 10 내지 40 mS/cm 이다. 놀랍게도, 용매 pH 구배를 사용하여 이들의 접합 과정에 관계없이, 각각의 개별 DAR 종을 분리하는 것이 가능하였다. 또한, 이 혁신적인 이온 교환 물질의 적용은 소수성 상호작용 또는 히드록시 아파타이트 물질에 비해 현저한 경제적 이점을 나타내어, 90% 초과의 생성물 회수율을 보장하였다.
따라서, 본 발명은 하기를 특징으로 하는, 표면에 중합체 사슬이 공유 결합으로 그래프트된, 히드록실-함유 베이스 매트릭스를 기반으로 하는 이온 교환 크로마토그래피용 분리 물질에 관한 것이다:
a) 베이스 지지체는 히드록실기를 함유하고,
b) 중합체 사슬은 지지체에 공유 결합되고,
c) 중합체 사슬은 아미노산 말단기 -N(Y)-R3 을 포함하고,
Y 는 서로 독립적으로 H 또는 CH3, 바람직하게는 H 이고,
R3 은 -CHCOOMR4 이고,
R4 는 C1 내지 C4 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 바람직하게는 이소프로필 및 이소부틸, 매우 바람직하게는 이소부틸, 또는 C1 내지 C4 퍼플루오로알킬이고,
M 은 H, Na, K 또는 NH4+ 임.
바람직하게는, 중합체 사슬의 단량체 단위는 선형 방식으로 연결되고, 각각의 단량체 단위는 말단기 -N(Y)-R3 을 포함한다.
바람직하게는, 이온 밀도는 10 내지 1200 μeq/g 이다.
바람직한 구현예에서, Y 는 H 이고, R4 는 이소프로필 및/또는 이소부틸이다.
바람직한 구현예에서, 히드록실기 함유 베이스 매트릭스는 지방족 히드록실기를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 베이스 매트릭스는 a) 및 b) 그룹으로부터의 적어도 하나의 화합물의 공중합에 의해 형성된 공중합체이다:
a) 적어도 하나의 화학식 I 의 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르
Figure pct00001
식 중, R1, R2, R3 은 서로 독립적으로, H 또는 C1 내지 C6 알킬, 바람직하게는 H 또는 -CH3 일 수 있고,
R4 는 적어도 하나의 히드록실기를 갖는 라디칼임,
및
b) 화학식 II 및/또는 III 및/또는 IV 에 따르는 적어도 하나의 가교제
Figure pct00002
식 중, X 는 2 내지 5 개의 C 원자, 바람직하게는 2 또는 3 개의 C 원자를 갖는 이가 알킬 라디칼이고, 여기서 인접하지 않고 N 의 바로 근처에 위치하지 않는 하나 이상의 메틸렌 기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 치환될 수 있고, 메틸렌 기의 하나 이상의 H 원자는 서로 독립적으로, 히드록실 기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH-(C1-C8)-알킬, N-(C1-C8)-알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음, 및
Figure pct00003
Figure pct00004
식 중, 화학식 III 및 IV 의 Y1 및 Y2 는 서로 독립적으로, 하기이고:
C1 내지 C10 알킬 또는 시클로알킬, 여기서 하나 이상의 비-인접 메틸렌 기 또는 N 의 바로 근처에 위치하지 않는 메틸렌 기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 치환될 수 있고, 메틸렌 기의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로, 히드록실 기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음,
또는 C6 내지 C18 아릴, 여기서, 아릴 시스템 내의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로, 히드록실 기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음,
A 는 2 내지 5 개의 C 원자, 바람직하게는 2 또는 3 개의 C 원자를 갖는 이가 알킬 라디칼이고, 여기서 하나 이상의 비-인접 메틸렌 기 또는 N 의 바로 근처에 위치하지 않는 메틸렌 기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 치환될 수 있고, 메틸렌 기의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로, 히드록실 기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음.
화학식 I 에서 R4 는 전형적으로 적어도 하나의 히드록실 기를 갖는 알킬 라디칼, 지환족 라디칼 또는 아릴 라디칼이다.
매우 바람직한 구현예에서, 매트릭스는 하기의 공중합에 의해 형성된다:
가교제로서 1,4-부탄디올 모노비닐 에테르, 1,5-펜탄디올 모노비닐 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노비닐 에테르 또는 시클로헥산디메탄올 모노비닐 에테르 및 디비닐에틸렌우레아 (1,3-디비닐이미다졸린-2-온) 의 군으로부터 선택되는 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르.
바람직한 구현예에서, 분리 물질은 히드록실기 함유 베이스 매트릭스를 화학식 V 에 따른 단량체의 세륨 (IV) 촉매된 그래프트 중합에 적용함으로써 제조될 수 있다:
Figure pct00005
식 중, R1, R2 및 Y 는 서로 독립적으로 H 또는 CH3, 바람직하게는 H 이고,
R3 은 -CHCOOMR4 이고,
R4 는 C1 내지 C4 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 바람직하게는 이소프로필 및 이소부틸, 매우 바람직하게는 이소부틸, 또는 C1 내지 C4 퍼플루오로알킬이고,
M 은 H, Na, K 또는 NH4 + 임.
이는 US 5453186 페이지 9 실시예 8 에 따라 바람직하게 수행되는 그래프트 중합이다.
본 발명은 또한, 하기를 특징으로 하는, 항체 약물 접합체 (ADC) 를 포함하는 샘플을, 표면에 중합체 사슬이 공유 결합에 의해 그래프트된 히드록실기 함유 베이스 매트릭스를 포함하는 분리 물질과 접촉시킴으로써, 항체 약물 접합체 (ADC) 를 크로마토그래피 정제 및/또는 분리하는 것에 관한 것이다:
a) 베이스 지지체는 히드록실기를 함유하고,
b) 중합체는 히드록실기를 통해 지지체에 공유 결합되고,
c) 중합체는 말단기 -N(Y)-R3 을 포함하고,
Y 는 서로 독립적으로 H 또는 CH3, 바람직하게는 H 이고,
R3 은 -CHCOOMR4 이고,
R4 는 C1 내지 C4 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 바람직하게는 이소프로필 및 이소부틸, 매우 바람직하게는 이소부틸, 또는 C1 내지 C4 퍼플루오로알킬이고,
M 은 H, Na, K 또는 NH4 + 임.
바람직한 구현예에서, ADC 표적 분자는 2 내지 7 의 pH 에서 분리 매트릭스에 결합하고, 선택적으로 pH 값을 알칼리성 pH, 바람직하게는 9 초과, 예를 들어 9 내지 11, 바람직하게는 약 10 값으로 증가시킴으로써 세척 및 용리된다.
바람직한 구현예에서, 샘플은 10 내지 1200 μeq/g 의 이온 밀도로 분리 매트릭스에 적용된다.
바람직한 구현예에서, 분리 물질 ml 당 10 mg 내지 100 mg ADC 가 결합된다.
도 1 은 아크릴로일류신 단량체의 중합에 의해 형성된 선형 중합체로 관능화된 베이스 물질 (도트) 을 갖는 본 발명에 따른 분리 물질의 개략도를 보여준다.
도 2 는 아크릴로일발린 단량체의 중합에 의해 형성된 선형 중합체로 관능화된 베이스 물질 (도트) 을 갖는 본 발명에 따른 분리 물질의 개략도를 보여준다.
도 3 은 발린 및 류신과의 아크릴산 클로라이드에 대한 반응식을 보여준다.
도 4 는 10 mg ADC/ ml CV 로딩 및 250 mM NaCl 에서 분리 매트릭스 상의 결합된 ADC 의 용리 피크를 보여준다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 5 는 분석용 HPLC 컬럼 (mAbPac HIC-Butyl 5 μm, 4.6 × 100 mm (P/N: 088558) von Thermo Fisher Scientific) 에서 전도도 감소 및 2-프로판올 양 증가의 선형 구배를 이용한 항체 약물 접합체 종 용리의 정성적 예를 보여준다. 완충액 A 는 1.5 M 암모늄 설페이트, 0,05 M 포스페이트 pH 7.0 및 5% 2-프로판올로 구성되며, 완충액 B 는 0,05 M 포스페이트 pH 7.0 및 20% 2-프로판올로 구성된다. HPLC 컬럼을 1 ml/분 유속으로 작동시키고, 완충액 A 로부터 완충액 B 로의 구배를 20 분 내에 달성한다. ADC 샘플을 5 mg/ml 농도로 완충액 A 에 희석하고, 구배 용리 전에 10 ㎕ 를 HPLC 컬럼 상에 주입한다.
도 6 은 10 mg ADC/ ml CV 로딩에서 로딩된 ADC (로딩) 및 250 mM NaCl 을 포함하는, 분석된 용리 분획 (5A1 내지 5B7) 의 정량적 영역에서 표시된 샘플 분획 특성화의 분석 결과를 보여준다.
도 7 는 30 mg ADC/ ml CV 로딩 및 250 mM NaCl 에서 분리 매트릭스 상의 결합된 ADC 의 용리 피크를 나타낸다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 8 은 30 mg ADC/ ml CV 로딩에서 로딩된 ADC (로딩) 및 250 mM NaCl 을 포함하는, 분석된 용리 분획 (5A2 내지 5C6) 의 정량적 영역에서 표시된 샘플 분획 특성화의 분석 결과를 나타낸다.
도 9 는 Adcetris® 샘플에 대한 디콘볼루션된 질량 스펙트럼을 나타내며, DAR0 에서 DAR4 종까지의 범위의 DAR 종의 분포를 보여준다. DAR6 종은 낮은 이온화 및 더 낮은 DAR 종의 방법 과부하로 인해 검출가능하지 않다.
도 10 은 제 1 용리 피크의 최대치를 나타내는, 용리 분획 5A7 에 대한 디콘볼루션된 질량 스펙트럼을 보여준다. 수득된 분자량은 다른 DAR 종의 명백한 존재 없이, DAR2 종에 대한 것이다.
도 11 은 제 2 용리 피크의 최대치를 나타내는, 용리 분획 5B4 에 대한 디콘볼루션된 질량 스펙트럼을 보여준다. 수득된 분자량은 다른 DAR 종의 명백한 존재 없이, DAR4 종에 대한 것이다.
도 12 은 제 3 용리 피크의 최대치를 나타내는, 용리 분획 5B11 에 대한 디콘볼루션된 질량 스펙트럼을 보여준다. 수득된 분자량은 DAR4 종 및 DAR6 종에 대한 것이다. 신호 강도는 정량적이 아니다.
도 13 는 60 mg ADC/ ml CV 로딩 및 250 mM NaCl 에서 분리 매트릭스 상의 결합된 ADC 의 용리 피크를 나타낸다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 14 은 60 mg ADC/ ml CV 로딩에서 로딩된 ADC (로딩) 및 250 mM NaCl 을 포함하는, 분석된 용리 분획 (1A1 내지 3G12) 의 정량적 영역에서 표시된 샘플 분획 특성화의 분석 결과를 보여준다.
도 15 는 Capto™ MMC ImpRes 수지를 사용하여 30 mg ADC/ ml CV 로딩 및 250 mM NaCl 에서 결합된 ADC 의 용리 피크를 보여준다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 16 은 30 mg ADC/ ml CV 로딩에서 로딩된 ADC (로딩) 및 250 mM NaCl 을 포함하는, 분석된 용리 분획 (4A3 내지 2C2) 의 정량적 영역에서 표시된 샘플 분획 특성화의 분석 결과를 나타낸다.
도 17 는 10 mg ADC/ ml CV 로딩 및 50 mM NaCl 에서 분리 매트릭스 상의 결합된 ADC 의 용리 피크를 보여준다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 18 는 10 mg ADC/ ml CV 로딩 및 100 mM NaCl 에서 분리 매트릭스 상의 결합된 ADC 의 용리 피크를 보여준다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 19 는 10 mg ADC/ ml CV 로딩 및 150 mM NaCl 에서 분리 매트릭스 상의 결합된 ADC 의 용리 피크를 보여준다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 20 는 10 mg ADC/ ml CV 로딩 및 200 mM NaCl 에서 분리 매트릭스 상의 결합된 ADC 의 용리 피크를 보여준다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 21 는 10 mg ADC/ ml CV 로딩 및 300 mM NaCl 에서 분리 매트릭스 상의 결합된 ADC 의 용리 피크를 보여준다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 22 는 10 mg ADC/ ml CV 로딩 및 350 mM NaCl 에서 분리 매트릭스 상의 결합된 ADC 의 용리 피크를 보여준다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 23 는 단계 접근법을 사용하는 10 mg ADC/ ml CV 로딩 및 300 mM NaCl 에서 분리 매트릭스 상의 결합된 ADC 의 용리 피크를 보여준다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 24 는 30 mg ADC/ ml CV 로딩 및 250 mM NaCl 에서 분리 매트릭스 상의 결합된 ADC 의 용리 피크를 나타낸다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 25 는 분석용 HPLC 컬럼 (mAbPac HIC-Butyl 5 μm, 4.6 × 100 mm (P/N: 088558) von Thermo Fisher Scientific) 에서 전도도 감소 및 2-프로판올 양 증가의 선형 구배를 이용한 항체 약물 접합체 종 용리의 정성적 예를 나타낸다. 완충액 A 는 1.5 M 암모늄 설페이트, 0,05 M 포스페이트 pH 7.0 및 5% 2-프로판올로 구성되며, 완충액 B 는 0,05 M 포스페이트 pH 7.0 및 20% 2-프로판올로 구성된다. HPLC 컬럼을 1 ml/분 유속으로 작동시키고, 완충액 A 로부터 완충액 B 로의 구배를 20 분 내에 달성한다. ADC 샘플을 5 mg/ml 농도로 완충액 A 에 희석하고, 구배 용리 전에 10 ㎕ 를 HPLC 컬럼 상에 주입한다.
도 26 은 10 mg ADC/ ml CV 로딩에서 로딩된 ADC (로딩) 및 250 mM NaCl 을 포함하는, 분석된 용리 분획 (1A3 내지 3C10) 의 정량적 영역에서 표시된 샘플 분획 특성화의 분석 결과를 보여준다.
도 27 은 Kadcyla™ 샘플에 대한 디콘볼루션된 질량 스펙트럼을 보여주며, DAR0 에서 DAR7 종까지의 범위의 DAR 종의 분포를 보여준다.
도 28 은 용리 분획 3A4 샘플에 대한 디콘볼루션된 질량 스펙트럼을 보여주며, 이는 더 낮은 DAR 종의 분포를 보여준다.
도 29 는 용리 분획 3B12 샘플에 대한 디콘볼루션된 질량 스펙트럼을 보여주며, 이는 더 높은 DAR 종의 분포를 보여준다.
도 30 는 60 mg ADC/ ml CV 로딩 및 250 mM NaCl 에서 분리 매트릭스 상의 결합된 ADC 의 용리 피크를 나타낸다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 31 은 60 mg ADC/ ml CV 로딩에서 로딩된 ADC (로딩) 및 250 mM NaCl 을 포함하는, 분석된 용리 분획 (2A1 내지 4C10) 의 정량적 영역에서 표시된 샘플 분획 특성화의 분석 결과를 보여준다.
도 32 는 30 mg ADC/ ml CV 로딩 및 250 mM NaCl 에서 Capto™ MMC ImpRes 크로마토그래피 수지 상의 결합된 ADC 의 용리 피크를 보여준다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 33 은 30 mg ADC/ ml CV 로딩에서 로딩된 ADC (로딩) 및 250 mM NaCl 을 포함하는, 분석된 용리 분획 (2B1 내지 5D1) 의 정량적 영역에서 표시된 샘플 분획 특성화의 분석 결과를 보여준다.
도 34 는 단계 접근법을 사용하는 10 mg ADC/ ml CV 로딩 및 400 mM NaCl 에서 분리 매트릭스 상의 결합된 ADC 의 용리 피크를 보여준다. 실선의 UV 흡착 신호 트레이스 및 점선의 pH 신호 트레이스.
도 4 내지 도 34 는 실시예에서 추가로 설명된다.
본 발명을 상세히 기재하기 전에, 본 발명이 특정 조성물 또는 방법 단계에 한정되지 않으며, 그 자체가 달라질 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥 상 다르게 지시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다는 것에 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "리간드" 로 언급하는 것은 복수의 리간드를 포함하고, "항체" 로 언급하는 것은 복수의 항체 등을 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 관련되어 있는 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 하기 용어는 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 목적을 위해 정의된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표적 분자" 는 샘플의 하나 이상의 기타 성분, 예를 들어 불순물로부터 단리, 분리 또는 정제되어야 하는 임의의 분자, 물질 또는 화합물을 지칭한다. 표적 분자의 예는 ADC 이다. 제조 및/또는 정제 방법에서, 표적 분자는 전형적으로 액체 중에 존재한다. 액체는 물, 완충액, 비수성 용매, 예컨대 에탄올 또는 그 임의의 혼합물일 수 있다. 표적 분자 이외에, 상기 액체는 하나 이상의 불순물을 포함할 수 있다. 액체는 샘플이라고도 할 수 있다. 액체의 조성은 수행되는 방법 단계에 따라 제조 및/또는 정제 동안 변화될 수 있다. 크로마토그래피 단계 후에, 크로마토그래피 단계에 사용되는 용리액으로 인해, 액체는 전형적으로 이전과는 다른 용매를 포함한다. 전형적으로 가장 마지막 정제 단계 후에만, 표적 분자가 최종 투여 형태의 제조를 위해 건조될 수 있다.
용어 "항체" 는 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 단백질을 지칭한다. "항체" 또는 "IgG" 는 또한 분석물 (항원) 에 특이적으로 결합하여 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들, 또는 이의 단편에 의해 실질적으로 인코딩된 폴리펩티드를 지칭한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 영역 유전자, 뿐만 아니라 많은 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다 중 어느 하나로서 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로서 분류되고, 이것은 이번에는 면역글로불린 부류, 각각 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE 를 정의한다.
예시적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 두 쌍의 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 각 쌍은 하나의 "경쇄" (약 25 kD) 및 하나의 "중쇄" (약 50-70 kD) 를 가지며, 상기 사슬은 예를 들어, 사슬간 디설파이드 결합에 의해 안정화된다. 각각의 사슬의 N-말단은 주로 항원 인식을 담당하는 약 100개 내지 110 개 이상의 아미노산의 가변 영역을 정의한다. 용어 가변 경쇄 (VL) 및 가변 중쇄 (VH) 는 각각 이들 경쇄 및 중쇄를 의미한다.
항체는 단일클론 또는 다클론일 수 있고, 단량체성 또는 중합체성 형태로 존재할 수 있는데, 예를 들어 IgM 항체는 오량체 형태로 존재하고/하거나 IgA 항체는 단량체, 이량체 또는 다량체 형태로 존재한다. 항체는 유지된다면 항체 단편들 및 다특이적 항체 (예, 이중특이적 항체) 를 또한 포함할 수 있거나, 또는 개질되어 리간드-특이적 결합 도메인을 포함한다. 용어 "단편" 은 무결 또는 완전 항체 또는 항체 사슬보다 적은 아미노산 잔기를 포함하는 항체 또는 항체 사슬의 부분 또는 일부를 지칭한다. 단편은 무결 또는 완전 항체 또는 항체 사슬의 화학적 또는 효소적 처리를 통해 수득될 수 있다. 단편은 또한 재조합 방식에 의해 수득될 수 있다. 재조합으로 생산되는 경우, 단편은 단독으로 또는 융합 단백질로 불리는 거대 단백질의 부분으로서 발현될 수 있다. 예시적 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, Fc 및/또는 Fv 단편을 포함한다. 예시적 융합 단백질은 Fc 융합 단백질을 포함한다. 본 발명에 따라, 융합 단백질은 또한 용어 "항체" 에 포함된다.
일부 구현예에서, 항체는 Fc 영역 포함 단백질, 예를 들어 면역글로불린이다. 일부 구현예에서, Fc 영역 포함 단백질은 또 다른 폴리펩티드 또는 그 단편에 융합된 면역글로불린의 Fc 영역을 포함하는 재조합 단백질이다. 예시적 폴리펩티드는, 예를 들어 레닌; 성장 호르몬 (인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬 포함); 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; α-1-항트립신; 인슐린 α-사슬; 인슐린 β-사슬; 프로인슐린; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성화제, 예컨대 우로키나아제 조직-유형 플라스미노겐 활성화제 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-α 및 -β; 엔케팔리나아제; RANTES (활성화시 조절 정상적 T-세포 발현 및 분비); 인간 대식세포 염증 단백질 (MIP-1-α); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮐러리안(Muellerian)-저해 물질; 렐락신 α-사슬; 렐락신 β-사슬; 프로렐락신; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 β-락타마아제; DNase; IgE; 세포독성 T-림프구 관련 항원 (CTLA) (예, CTLA-4); 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자를 위한 수용체; 단백질 A 또는 D; 류머티즘성 인자; 신경영양성 인자, 예컨대 골-유래 신경영양성 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-β.; 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예컨대 αFGF 및 βFGF; 상피 성장 인자 (EGF); 형질전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-β (TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4, 또는 TGF-β5 포함); 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); 데스(l-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP); CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34, 및 CD40; 에리스로포이에틴; 골전도성 인자; 항체독소; 골 형태발생 단백질 (BMP); 인터페론, 예컨대 인터페론-α, -β, 및 -γ; 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어 M-CSF, GM-CSF, 및 G-CSF; 인터류킨 (IL), 예를 들어 IL-I 내지 IL-IO; 초산화물 디스뮤타아제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 부식 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들어 AIDS 엔벨로프의 일부; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CDl Ia, CDl Ib, CDl Ic, CD 18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 종양 관련 항원, 예컨대 HER2, HER3 또는 HER4 수용체; 및 상기 나열된 폴리펩티드 중 어느 하나의 단편 및/또는 변이체를 포함한다. 추가로, 본 발명에 따른 항체는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드, 그 단편 또는 변이체이며, 이는 상기 나열된 폴리펩티드 중 어느 하나에 특이적으로 결합된다.
본원에 사용된 바와 같고 달리 언급되지 않는 한, 용어 "샘플" 은 표적 분자를 포함하는 임의의 조성물 또는 혼합물을 지칭한다. 샘플은 생물학적 또는 기타 공급원 유래일 수 있다. 생물학적 공급원에는 동물 또는 인간과 같은 진핵생물 공급원이 포함된다. 바람직한 샘플은 포유류로부터 유래된 혈액 또는 혈장 샘플이다. 샘플은 또한 표적 분자와 함께 혼합되어 발견되는 희석제, 완충액, 세제, 및 오염 종 등을 포함할 수 있다. 샘플은 "부분 정제" 될 수 있거나 (예를 들어, 하나 이상의 정제 단계, 예컨대 여과 또는 원심분리 단계에 적용됨), 표적 분자를 생산하는 유기체로부터 직접 수득될 수 있다. 혈장 샘플은 혈장 또는 혈장의 일부를 포함하는 임의의 샘플이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "불순물" 또는 "오염물" 은 생물학적 매크로분자, 예컨대 DNA, RNA, 하나 이상의 숙주 세포 단백질, 핵산, 내독소, 지질, 합성 기원의 불순물, 및 외래 또는 부적당한 분자 중 하나 이상으로부터 분리된 표적 분자를 포함하는 샘플에 존재할 수 있는 하나 이상의 첨가제를 포함하여, 임의의 외래 또는 부적당한 분자를 지칭한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어, "불순물" 또는 "오염물질" 은 면역글로불린 M 뿐만 아니라 특허에서 알레르기 반응을 일으키는 면역글로불린 A 와 같이 표적 분자로부터 분리되어야 하는 특정 면역글로불린에도 적용될 수 있다. 부가적으로, 이러한 불순물은 제조 및/또는 정제 공정의 단계에서 사용되는 임의의 시약을 포함할 수 있다.
본원에서 상호교환되어 사용되는 바와 같은 용어 "정제하는", "분리하는" 또는 "단리하는" 은 표적 분자 및 하나 이상의 기타 성분, 예를 들어 불순물을 포함하는 조성물 또는 샘플로부터 분리에 의해 표적 분자의 순도를 증가시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 표적 분자의 순도는 조성물로부터 하나 이상의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 증가된다.
용어 "크로마토그래피" 는 혼합물에 존재하는 기타 분자로부터 관심있는 분석물 (예, 표적 분자) 을 분리시키는 임의 종류의 기법을 지칭한다. 통상적으로, 표적 분자는 혼합물의 개별 분자가 이동상의 영향 하에 고정 매질 또는 매트릭스를 통해 이동하는 속도, 또는 결합 및 용리 과정의 차이의 결과로서 다른 분자로부터 분리된다. 크로마토그래피 분리 방법을 위한 예는 역상 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피 및 혼합 모드 크로마토그래피이다.
"완충제" 는 그것의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의해 pH 변화에 저항하는 용액이다. 예를 들어, 완충액의 원하는 pH 에 따라 사용될 수 있는 다양한 완충액은 Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975) 에 설명된다. 완충제의 비제한적 예는 MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트, 글리신 및 암모늄 완충제, 뿐만 아니라 이들의 조합을 포함한다.
"매트릭스", "크로마토그래피 매트릭스", "분리 매트릭스" 뿐만 아니라 분리 물질이라는 용어는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 분리 과정에서 정지 상으로 사용되며, 혼합물에 존재하는 다른 분자로부터 표적 분자 (예를 들어, Fc 영역 함유 단백질, 예컨대 면역글로불린) 를 분리하는 임의의 종류의 흡수제, 지지체, 수지 또는 고체 상을 의미한다. 통상적으로, 표적 분자는 혼합물의 개별 분자가 이동상의 영향 하에 매트릭스를 통해 이동하고 매트릭스와 상호작용하는 속도, 또는 결합 및 용리 과정의 차이의 결과로서 다른 분자로부터 분리된다. 전형적으로 수지 입자, 모놀리식 흡수제 또는 멤브레인으로 이루어진 매트릭스는 컬럼 또는 카트리지에 넣어질 수 있다. 전형적으로, 매트릭스는 하나 이상의 유형의 리간드가 부착되는 베이스 매트릭스 또는 베이스 물질을 포함하는 매트릭스를 의미하는 하나 이상의 유형의 리간드를 운반한다.
"리간드" 는 작용기이거나 이를 포함하고, 크로마토그래피 베이스 매트릭스에 부착되고, 매트릭스의 결합 특성을 결정하거나 영향을 미친다. 바람직하게는, 리간드는 하나 이상, 바람직하게는 복수의 작용기를 갖는 중합체 사슬이다. 이들이 형성되는 단량체 단위 당 적어도 하나의 작용기를 갖는 중합체 사슬로 제조된 리간드가 가장 바람직하다. "리간드" 의 예로는 이온 교환기, 소수성 상호작용기, 친수성 상호작용기, 티오친화성 상호작용기, 금속 친화성기, 친화성기, 생체친화성기, 및 혼합 모드기 (전술한 것의 조합) 를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에서 사용될 수 있는 바람직한 리간드는 카르복실산과 같은 약한 이온 교환기를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
"이온-교환" 및 "이온-교환 크로마토그래피" 란 용어는 혼합물 중의 표적 분자 (예를 들어, 표적 단백질을 함유하는 Fc 영역) 가 이온 교환 매트릭스에 연결된 (예컨대, 공유 부착에 의한) 하전 화합물과 상호작용하여, 표적 분자가 혼합물 중의 용질 불순물 또는 오염물질보다 많거나 적은 양의 하전 화합물과 비특이적으로 상호작용하는 크로마토그래피 과정을 말한다. 혼합물 내의 불순물은 표적 분자보다 더 빠르거나 느리게 이온 교환 물질의 컬럼으로부터 용리되거나, 표적 분자에 비해 수지에 결합되거나 수지로부터 배제된다. "이온-교환 크로마토그래피" 는 구체적으로 양이온 교환, 음이온 교환, 및 혼합 모드 이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 이온 교환 크로마토그래피는 표적 분자 (예를 들어, 표적 단백질을 함유하는 Fc 영역) 에 결합시킨 후 용리시키거나, 표적 분자가 컬럼을 "통해 흐르는" 동안 주로 불순물에 결합할 수 있다. 바람직하게는, 이온 교환 크로마토그래피 단계는 결합 및 용리 모드로 수행된다.
구절 "이온 교환 매트릭스" 는 음으로 하전된 (즉, 양이온 교환 수지) 또는 양으로 하전된 (즉, 음이온 교환 수지) 크로마토그래피 매트릭스를 의미한다. 전하는 하나 이상의 하전된 리간드를 매트릭스에 부착함으로써, 예를 들어 공유 결합에 의해 제공될 수 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 전하는 매트릭스의 고유 특성일 수 있다.
본원에서 용어 "양이온 교환 매트릭스" 는 음으로 하전된 크로마토그래피 매트릭스로서, 예를 들어 카르복실산기와 같은 하나 이상의 음전하를 띠는 리간드가 부착된 것을 의미한다.
분리 컬럼을 결합 및 용리 모드로 "로딩" 할 때, 완충액을 사용하여 표적 분자 (예를 들어, 표적 단백질을 함유하는 Fc 영역) 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플 또는 조성물을 크로마토그래피 컬럼 (예를 들어, 이온 교환 컬럼) 에 로딩한다. 완충제는 표적 분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합되지만 이상적으로는 모든 불순물은 결합되지 않고 컬럼을 통해 흐르도록 하는 전도도 및/또는 pH 를 갖는다.
분리 컬럼을 표적 분자를 "통해 흐르게" 하도록 "로딩" 할 때, 완충액을 사용하여 표적 분자 (예를 들어, 표적 단백질을 함유하는 Fc 영역) 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플 또는 조성물을 크로마토그래피 컬럼 (예를 들어, 이온 교환 컬럼) 에 로딩한다. 완충제는 표적 분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합되지 않지만 이상적으로는 모든 불순물은 결합되고 컬럼을 통해 흐르도록 하는 전도도 및/또는 pH 를 갖는다.
분리 컬럼을 표적 분자에 "결합 및 용리" 하도록 "로딩" 할 때, 완충액을 사용하여 표적 분자 (예를 들어, 표적 단백질을 함유하는 Fc 영역) 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 샘플 또는 조성물을 크로마토그래피 컬럼 (예를 들어, 이온 교환 컬럼) 에 로딩한다. 완충제는 표적 분자가 크로마토그래피 매트릭스에 결합되도록 하는 전도도 및/또는 pH 를 갖는다. 하나 이상의 불순물로부터의 분리는 전도도 및/또는 pH 의 변화로 이어져, 표적 분자가 하나 이상의 불순물 전 또는 후에 세척 또는 용리된다.
전형적으로 샘플이 매트릭스에 로딩되는 완충액을 로딩 완충액 또는 샘플 완충액이라고 한다.
용어 "평형화" 는 표적 분자를 로딩하기 전에 크로마토그래피 매트릭스를 평형화하기 위한 완충제의 사용을 지칭한다. 전형적으로, 로딩 완충액은 평형을 위해 사용된다.
크로마토그래피 매트릭스를 "세척하다" 또는 "세척하기" 란, 적절한 액체, 예를 들어, 완충액을 매트릭스를 통해 또는 그 위로 통과시키는 것을 의미한다. 전형적으로 세척은 표적 분자를 용리하기 전에 매트릭스로부터 약하게 결합된 오염물을 제거하고/거나 로딩 후에 비결합된 또는 약하게 결합된 표적 분자를 제거하는데 사용된다.
이 경우, 전형적으로, 세척 완충액과 로딩 완충액은 동일하다. 바이러스 불활성화 완충액을 사용하는 경우, 이것은 표적 분자를 용리하기 전에 특정 존재하는 바이러스를 불활성화시키는데 사용된다. 이 경우, 전형적으로 바이러스 불활성화 완충액은 이것이 세제/세제들을 함유하거나 상이한 특성 (pH/전도도/염 및 그 양) 을 가질 수 있기 때문에 로딩 완충액과 상이하다.
세척은 또한 표적 분자의 용리 후에 매트릭스로부터 오염물을 제거하는데 사용될 수 있다. 이는 표적 분자의 용리 후에 적절한 액체, 예를 들어 완충액을 매트릭스를 통해 또는 그 위로 통과시킴으로써 수행된다. 이 경우, 전형적으로, 세척 완충액은 로딩 완충액과 상이하다. 이것은 세제/세제들을 함유하거나, 상이한 특성 (pH/전도도/염 및 그 양) 을 가질 수 있다. 세척 완충액은 예를 들어 산성 완충액이다.
크로마토그래피 매트릭스로부터 분자 (예를 들어, 면역글로불린 G 또는 불순물과 같은 관심 있는 폴리펩티드) 를 "용리" 하는 것은 그로부터 분자를 제거하는 것을 의미한다. 용리는 표적 분자가 로딩 완충액의 용매 전방에서 용리될 때 또는 로딩 완충액과 상이한 완충액이 크로마토그래피 매트릭스 상의 리간드 부위에 대해 관심 분자와 경쟁하도록 용액 조건을 변경함으로써 플로우 스루 (flow through) 모드로 직접 일어날 수 있다. 비제한적인 예는, 이온 교환 물질을 둘러싸는 완충액의 이온 강도를 변경함으로써 이온 교환 매트릭스로부터 분자를 용리시켜 완충액이 이온 교환 물질 상의 하전된 부위에 대해 분자와 경쟁하도록 하는 것이다.
용어 "평균 입자 크기 직경" 또는 d50 은 누적 입자 크기 분포의 50% 에서의 평균 입자 크기 분포 값을 의미한다. 입자 크기는 레이저-회절에 의해, 바람직하게는 Malvern 'Master Sizer 에 의해 결정된다.
용어 "평균 공극 크기" 는 누적 공극 크기 분포의 50% 에서의 평균 공극 크기 분포 값을 의미한다.
본원에서 상호교환적으로 사용되는 용어 "플로우-스루 공정", "플로우-스루 모드" 및 "플로우-스루 작업" 은, 샘플 내에 하나 이상의 불순물과 함께 함유된 적어도 하나의 표적 분자 (예를 들어, Fc-영역 함유 단백질 또는 항체) 가, 통상적으로 하나 이상의 불순물에 결합하는 크로마토그래피 매트릭스를 통해 흐르도록 의도되고, 여기서 표적 분자는 통상적으로 결합하지 않고 (즉, 통과하여 흐르며) 로딩 완충액을 이용하여 매트릭스로부터 용리되는 분리 기술을 지칭한다.
용어 "결합 및 용리 모드" 및 "결합 및 용리 공정" 은, 샘플 (예를 들어, Fc 영역 함유 단백질) 에 포함된 적어도 하나의 표적 분자가 적합한 크로마토그래피 매트릭스 (예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피 매질) 에 결합하고, 이어서 로딩 완충액과 상이한 완충액으로 용리되는 분리 기술을 의미한다.
"항체-약물 접합체" 또는 "ADC" 는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편을 지칭하고, 본원 하기에 추가로 설명되는 바와 같이 세포독성, 세포증식억제 및/또는 치료 작용제와 같은 약물에 접합된다.
용어 "약물" 은 본원에서 "페이로드" 와 상호교환적으로 사용되며, 항체에 접합되거나 접합될 화학적 화합물 또는 단백질 또는 단백질 단편 또는 다른 세포독성, 성장 억제 또는 영상화 작용제를 의미한다. 따라서 일부 구현예에서, 약물은 소분자이다. 일부 구현예에서, 소분자는 세포독성제 또는 영상화제이다. 일부 구현예에서, 세포독성제는 안트라사이클린, 아우리스타틴, 돌라스타틴, 듀오카르마이신, 엔디인, 겔다나마이신, 메이탄신, 퓨로마이신, 탁산, 빈카 알칼로이드, SN-38, 튜불리신, 헤미아스테린 및 이의 입체이성질체, 이소스테르, 유사체 또는 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 약물은 생체적합성 중합체 또는 폴리펩티드이다. 본원에 사용된 "약물" 은 고전적인 화학적 치료제에 제한되는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들어, 약물 모이어티는 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 바람직하게는 약물은 소분자이다.
용어 "항체에 대한 약물 비율" ("DAR" 로 약칭함) 이란 항체 당 접합된 약물 분자의 수를 말한다. 복수의 항체-약물 접합체의 조성물, 배치, 및/또는 제형은 평균 DAR 에 의해 특징화될 수 있다. DAR 및 평균 DAR 은 UV 분광법, 질량 분광법, ELISA 분석, 방사선 측정 방법, 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC), 전기영동 및 HPLC 와 같은 다양한 통상적인 수단에 의해 결정될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세포독성제" 는 세포 기능을 억제 또는 방해하고/하거나 세포 파괴를 야기시키는 물질을 의미한다. 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, 1131, 1125, Y90, Rel86, Rel88, Sml53, Bi212, P32 및 Lu 의 방사성 동위원소), 화학요법제, 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵분해 효소, 항생제, 및 독소, 예컨대 소분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함), 및 하기 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하는 것으로 의도된다.
다른 세포독성제는 하기에 기술된다. 종양사멸제는 종양 세포의 파괴를 야기한다. "화학치료제" 는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학치료제의 예는 알킬화제 예컨대 티오테파 및 CYTOXAN(R) 시클로포스파미드; 알킬 술포네이트 예컨대 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘 예컨대 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 에틸렌이민 및 메틸아멜라민 예컨대 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 델타-9-테트라히드로칸나비놀 (드로나비놀, MARINOL(R)); 베타-라파콘; 라파콘; 콜히친; 베툴린산; 캄프토테신 (합성 유사체 토포테칸 (HYCAMTIN(R)) (CPT-11 (이리노테칸, CAMPTOSAR(R)), 아세틸캄프토테신, 스코폴렉틴 및 9-아미노캄프토테신 포함); 브리오스타틴; 페메트렉세드; 칼리스타틴; CC-1065 (그의 아도젤레신, 카르젤레신 및 바이젤레신 합성 유사체 포함); 포도필로톡신; 포도필린산; 테니포시드; 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체, KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘류테로빈; 판크라티스타틴; TLK-286; CDP323, 경구 알파-4 인테그린 저해제; 사르코딕티인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예컨대 클로르암부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로르에타민, 메클로르에타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 펜에스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로소우레아 예컨대 카무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴 및 라니무스틴; 항생제 예컨대 엔디인 항생제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마 II 및 칼리키아마이신 오메가 II (예를 들어, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994) 참고); 다이네마이신, 예컨대 다이네마이신 A; 에스페라마이신; 뿐 아니라 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 엔디인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 오트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, ADRIAMYCIN(R) 독소루비신 (모폴리노-독소루비신, 시아노모폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신, 독소루비신 HCl 리포솜 주사 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 예컨대 미토마이신 C, 마이코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 퓨로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스루타틴, 조비신; 항-대사물 예컨대 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체 예컨대 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체 예컨대 플루다라빈, 6-머캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체 예컨대 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카모푸르, 사이타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예컨대 칼루스테론, 드로모스타놀론, 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항-부신 예컨대 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물 예컨대 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레벌린산; 에닐루라실; 암사크린; 베스트라부실; 비스안트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘립티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 메이탄시노이드 예컨대 메이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속잔트론; 2-에틸히드지드; 프로카르바진; PSK(R) 다당류 복합체 (JHS Natural Products, Eugene, OR); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아진산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히 T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신 (ELDISINE(R), FILDESIN(R)); 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 티오테파; 탁소이드, 예를 들어, TAXOL(R) 파클리탁셀 (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANETM 크레모포르-부재, 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제형 (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) 및 TAXOTERE(R) 독세탁셀 (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로란부실; 겜시타빈 (GEMZAR(R)); 6-티오구아닌; 머캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체 예컨대 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴 (VELBAN(R)); 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴 (ONCOVIN(R)); 옥살리플라틴; 류코보빈; 비노렐빈 (NAVELBINE(R)); 노반트론; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 이반드로네이트; 토포이소머라제 저해제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 예컨대 레티노산; 카페시타빈 (XELODA(R)); 상기의 것들 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체; 뿐 아니라 상기의 것들 중 둘 이상의 조합, 예컨대 시클로포스파미드, 독소루비신, 빈크리스틴 및 프레드니솔론의 병용 요법에 대한 약어인 CHOP, 및 5-FU 및 류코보빈과 병용된 옥살리플라틴 (ELOXATINTM) 으로의 치료 양생법에 대한 약어인 FOLFOX 를 포함한다.
또한 암의 성장을 촉진할 수 있는 호르몬의 효과를 조절, 감소, 차단 또는 억제하는 작용을 하고, 종종 전신 또는 전신 치료의 형태로 있는 항-호르몬제가 이 정의에 포함된다. 이들은 호르몬 자체일 수도 있다. 예를 들어, 타목시펜 (NOLVADEX(R) 타목시펜 포함), EVISTA(R) 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 FARESTON(R) 토레미펜을 포함하는 항-에스트로겐 및 선택적 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM); 항-프로게스테론; 에스트로겐 수용체 다운-조절제 (ERD); 난소를 억제 또는 차단하는 기능을 하는 작용제, 예를 들어, LUPRON(R) 및 ELIGARD(R) 류프롤리드 아세테이트, 고세렐린 아세테이트, 부세렐린 아세테이트 및 트리프테레린과 같은 류틴화 호르몬-방출 호르몬 (LHRH) 작용제; 플루타미드, 닐루타미드 및 비칼루타미드와 같은 다른 항-안드로겐; 및 예를 들어, 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, MEGASE(R) 메게스트롤 아세테이트, AROMASIN(R) 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, RIVISOR(R) 보로졸, FEMARA(R) 레트로졸, 및 ARIMIDEX(R) 아나스트로졸을 포함한다. 또한, 화학요법제의 이러한 정의는 클로드로네이트 (예를 들어, BONEFOS(R) 또는 OSTAC(R)), DIDROCAL(R) 에티드로네이트, NE-58095, ZOMETA(R) 졸레드론산/졸레드로네이트, FOSAMAX(R) 알렌드로네이트, AREDIA(R) 파미드로네이트, SKELID(R) 틸루드로네이트, 또는 ACTONEL(R) 리세드로네이트와 같은 비스포스포네이트; 및 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히, 예를 들어, PKC-알파, Raf, H-Ras, 및 표피 성장 인자 수용체 (EGF-R) 와 같은 암세포 증식에 관련된 신호전달 경로에서 유전자의 발현을 억제하는 것들; 백신, 예를 들어, THERATOPE(R) 백신 및 유전자 치료 백신, 예를 들어, ALLOVECTIN(R) 백신, LEUVECTIN(R) 백신, 및 VAXID(R) 백신; LURTOTECAN(R) 토모이소머라아제 1 억제제; ABARELIX(R) rmRH; 라파티닙 디토실레이트 (GW572016 로도 공지된 ErbB-2 및 EGFR 이중 티로신 키나제 소분자 저해제); 및 상기 중 임의의 것의 약학적으로 허용가능한 염, 산 또는 유도체를 포함한다.
본원에서 "성장 억제제" 는 세포, 특히 TAT-발현 암세포의 성장을 시험관내 또는 생체내에서 억제하는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 따라서, 성장 억제제는 S 상에서 TAT-발현 세포의 비율을 현저히 감소시키는 것일 수 있다. 성장 억제제의 예는 세포 주기 진행을 차단하는 작용제 (S 상 이외의 장소에서), 예컨대 Gl 정지 및 M-상 정지를 유도하는 작용제를 포함한다. 전형적인 M-상 차단제는 빈카 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁산, 및 토포이소머라제 II 억제제, 예컨대 독소루비신, 에피루비신, 다우노루비신, 에토포시드 및 블레오마이신을 포함한다. Gl 를 정지시키는 이들 작용제는 또한 S-상 정지로 넘어가는데, 예를 들어, DNA 알킬화제, 예컨대 타목시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 및 ara-C 이다. 추가 정보는 Murakami et al. 에 의한 The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" (WB Saunders: Philadelphia, 1995), 특히 p. 13 에서 찾을 수 있다. 탁산 (파클리탁셀 및 도세탁셀) 은 모두 주목 나무로부터 유래된 항암 약물이다. 유럽 주목으로부터 유래된, 도세탁셀 (TAXOTERE(R), Rhone-Poulenc Rorer) 은 파클리탁셀 (TAXOL(R), Bristol-Myers Squibb) 의 반합성 유사체이다. 파클리탁셀 및 도세탁셀은 튜불린 이량체로부터 미세소관의 조립을 촉진하고 해중합을 방지함으로써 미세소관을 안정화시키며, 이는 세포에서 유사분열을 억제한다.
본 발명은 ADC 의 정제에 관한 것이다. 상기 정의된 바와 같이, ADC 는 리신 커플링, 경쇄 및 중쇄 환원성 디설파이드 커플링, 또는 다른 커플링 방법을 포함하는, 바람직하게는 링커를 통해 항체를 독소, 전형적으로 소분자 독소에 공유 결합시킴으로써 형성된 항체-접합된 약물이다. 항체는 임의의 종류의 항체 또는 항체 단편, 예를 들어 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체일 수 있다. 소분자 독소의 예는 메이탄신 유도체 DM1 (N2'-데아세틸-N2'-3-머캅토-1 옥소프로필)-메이탄신), DM4 (N2'-데아세틸-N2'-4)-메틸-4-머캅토-1 옥소펜틸)-메이탄신 및 그의 유사체, 돌핀 독소 유도체 MMAE (모노메틸 아우리스타틴 E, 메틸 아우리스타틴 E), MMAF (모노메틸 아우리스타틴 F, 메틸 아우리스타틴 F) 및 그의 유사체이다. 예시적인 링커는 SMCC (4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실산 숙신이미드 에스테르) 이다.
본 발명은 중합체 사슬이 공유적으로 부착된 베이스 매트릭스를 포함하는 분리 물질 (또한 수지라고도 함) 을 제공한다. 중합체 사슬은 아미노산 및 중합성 이중 결합을 포함하는 단량체로 제조된다.
본 발명은 ADC 의 분리 및 정제, 예를 들어 상이한 DAR 을 갖는 ADC 의 분리 또는 항체 약물 접합체 (ADC) 제제로부터 고분자량 종, 구체적으로 응집체를 제거하는 방법을 추가로 제공한다. 본 발명은 항체 약물 접합체 제제의 대량 정제에 유용하다. 본 발명의 특정 양상에서, 더 소수성이고 더 빠른 소거를 나타내는 높은 DAR (DAR > 6) 을 갖는 ADC 를 제거하는 것이 유리하며, 이는 더 높은 독성 및 더 낮은 치료 지수 (Tl) 에 기여할 수 있다. 본 발명의 다른 양상에서, 효능에 거의 기여하지 않는 낮은 DAR (DAR < 2) 를 갖는 ADC 를 제거하는 것이 유리하지만, 표적 항원에 대해 ADC 와 경쟁할 수 있고 더 낮은 Tl 을 초래할 수 있는 비접합된 항체의 양의 증가를 제공한다. 본 발명의 또다른 양상에서, 높은 DAR (DAR > 6) 을 갖는 ADC 및 낮은 DAR (DAR < 2) 을 갖는 ADC 를 제거하는 것이 유리하다. 본 발명의 하나의 구현예에서, 정제된 ADC 는 3.5 내지 4.5, 또 다른 구현예에서 3 내지 5 의 약물 로딩 (약물 대 항체 비율, DAR) 을 함유한다.
본 발명의 분리 물질은 촉수-유사 구조가 그래프트된 베이스 물질을 포함한다.
베이스 매트릭스라고도 불리는 베이스 물질은 그래프트-중합 반응에 접근할 수 있는 반응성 기, 특히 OH 기, 바람직하게는 지방족 OH 기를 함유한다. 따라서, 베이스 물질은 또한, 예를 들어, 유기 중합체로부터 제조될 수 있다. 이러한 유형의 유기 중합체는 다당류, 예컨대 아가로오스, 덱스트란, 전분, 셀룰로오스 등, 또는 합성 중합체, 예컨대 폴리(아크릴아미드), 폴리(메타크릴아미드), 폴리(아크릴레이트), 폴리(메타크릴레이트), 친수성 치환된 폴리(알킬 알릴 에테르), 친수성 치환된 폴리(알킬 비닐 에테르), 폴리(비닐 알코올), 폴리(스티렌) 및 상응하는 단량체의 공중합체일 수 있다. 이들 유기 중합체는 바람직하게는 또한 가교결합된 친수성 네트워크의 형태로 사용될 수 있다. 이는 또한 스티렌 및 디비닐벤젠으로부터 제조된 중합체를 포함하며, 이는 바람직하게는 다른 소수성 중합체와 같이, 친수화된 형태로 사용될 수 있다.
대안적으로는, 실리카, 산화지르코늄, 이산화티탄, 산화알루미늄 등의 무기 물질을 베이스 물질로 사용할 수 있다. 복합 재료, 즉, 예를 들어 자성화가능한 입자 또는 자성화가능한 코어의 공중합에 의해 자성화될 수 있는 입자를 사용하는 것도 동등하게 가능하다.
그러나, 가수분해에 안정하거나 또는 단지 어렵게 가수분해될 수 있는 친수성 기재의 사용이 바람직한데, 이는 본 발명에 따른 물질이 바람직하게는 예를 들어 연장된 사용 기간에 걸쳐 염기성 pH 에서 알칼리 세정 또는 재생을 견뎌야 하기 때문이다.
베이스 물질은 입자 크기가 2 내지 1000 ㎛ 일 수 있는 불규칙한 형상의 입자 또는 구형 입자로 이루어질 수 있다. 입자 크기가 3 내지 300 ㎛ 인 것이 바람직하다.
베이스 물질은 특히, 비-다공성 또는 바람직하게는 다공성 입자의 형태일 수 있다. 공극 크기는 2 내지 300 nm 일 수 있다. 공극 크기가 5 내지 200 nm 인 것이 바람직하다.
베이스 물질은 또한 동일하게 막, 섬유, 중공 섬유, 코팅 또는 모놀리식 몰딩의 형태일 수 있다. 모놀리식 몰딩은 바람직하게는 다공성의, 3 차원 바디, 예를 들어 원통형 형태이다.
바람직한 구현예에서, 베이스 물질은 a) 및 b) 그룹으로부터의 적어도 하나의 화합물의 공중합에 의해 형성된 공중합체이다
a) 적어도 하나의 화학식 I 의 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르
Figure pct00006
식 중, R1, R2, R3 은 서로 독립적으로, H 또는 C1 내지 C6 알킬, 바람직하게는 H 또는 -CH3 일수 있고,
R4 는 적어도 하나의 히드록실기를 갖는 라디칼임,
및
b) 화학식 II 및/또는 III 및/또는 IV 에 따르는 적어도 하나의 가교제
Figure pct00007
식 중, X 는 2 내지 5 개의 C 원자, 바람직하게는 2 또는 3 개의 C 원자를 갖는 이가 알킬 라디칼이고, 여기서 인접하지 않고 N 의 바로 근처에 위치하지 않는 하나 이상의 메틸렌 기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 치환될 수 있고, 메틸렌 기의 하나 이상의 H 원자는 서로 독립적으로, 히드록실 기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH-(C1-C8)-알킬, N-(C1-C8)-알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음, 및
Figure pct00008
식 중, 화학식 III 및 IV 의 Y1 및 Y2 는 서로 독립적으로, 하기이고:
C1 내지 C10 알킬 또는 시클로알킬, 여기서 하나 이상의 비-인접 메틸렌 기 또는 N 의 바로 근처에 위치하지 않는 메틸렌 기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 치환될 수 있고, 메틸렌 기의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로, 히드록실 기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음,
또는 C6 내지 C18 아릴, 여기서, 아릴 시스템 내의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로, 히드록실 기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음,
A 는 2 내지 5 개의 C 원자, 바람직하게는 2 또는 3 개의 C 원자를 갖는 이가 알킬 라디칼이고, 여기서 하나 이상의 비-인접 메틸렌 기 또는 N 의 바로 근처에 위치하지 않는 메틸렌 기는 O, C=O, S, S=O, SO2, NH, NOH 또는 N 에 의해 치환될 수 있고, 메틸렌 기의 하나 이상의 H 는 서로 독립적으로, 히드록실 기, C1-C6-알킬, 할로겐, NH2, C5-C10-아릴, NH(C1-C8)알킬, N(C1-C8)알킬2, C1-C6-알콕시 또는 C1-C6-알킬-OH 에 의해 치환될 수 있음.
화학식 I 에서 R4 는 전형적으로 적어도 하나의 히드록실 기를 갖는 알킬 라디칼, 지환족 라디칼 또는 아릴 라디칼이다.
매우 바람직한 구현예에서, 매트릭스는 하기의 공중합에 의해 형성된다
가교제로서 1,4-부탄디올 모노비닐 에테르, 1,5-펜탄디올 모노비닐 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노비닐 에테르 또는 시클로헥산디메탄올 모노비닐 에테르 및 디비닐에틸렌우레아 (1,3-디비닐이미다졸린-2-온) 의 군으로부터 선택되는 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르.
적합한 상업적으로 입수가능한 비닐에테르 기재의 베이스 물질의 예는 Eshmuno®, Merck KGaA, Germany 이다.
베이스 물질의 표면에 선형 중합체 사슬이 공유 결합되어 분리 물질이 생성되고, 이에 의해,
a) 베이스 물질은 바람직하게는 지방족 히드록실기를 함유한다,
b) 중합체는 베이스 물질에 공유 결합된다,
c) 중합체는 아미노산 잔기를 포함한다,
d) 중합체의 단량체 단위는 선형 방식으로 연결된다.
베이스 물질 및 공유적으로 부착된 선형 중합체 사슬을 포함하는 실제 분리 물질은 다양한 방식으로 제조될 수 있다. "그래프팅 온투 (~ 상의 그래프팅)" 의 경우, 먼저 단량체로부터 중합체 사슬을 형성해야 하고, 2 단계에서 표면에 결합해야 한다. "그래프팅 프롬 (~ 로부터의 그래프팅)" 의 경우, 표면 상에서 중합 반응이 시작되고, 그래프트 중합체가 개별 단량체로부터 직접 쌓아진다. 지지체 재료의 표면에 결합을 허용하는 다른 중합 방법이 또한 사용될 수 있다.
"그래프팅 프롬" 방법이 바람직하고, 분리되어야 하는 비-공유적으로 결합된 중합체와 같은 소수의 부산물만이 형성된 변이체가 특히 바람직하다. 자유 라디칼 중합이 제어된 방법, 예를 들어 원자-전달 자유 라디칼 중합 (ATRP) 의 방법이 특히 적합한 것으로 보인다. 여기서, 개시제 기는 제 1 단계에서 원하는 밀도로 지지체 표면에 공유 결합된다. 개시제 기는, 예를 들어, 2-브로모-2-메틸프로피온산 에스테르에서와 같이 에스테르 기능을 통해 결합된 할라이드일 수 있다. 그래프트 중합은 구리 (I) 염의 존재 하에 제 2 단계에서 수행된다.
본 발명의 분리 재료의 제조에 적합한 매우 바람직한 일단계 그래프트 중합 반응은 지지체를 활성화시키지 않고, 히드록실-함유 지지체 상의 세륨 (IV) 에 의해 개시될 수 있다.
이러한 세륨 (IV) 개시 그래프팅은 바람직하게는 EP 0 337 144 또는 US 5,453,186 에 따라 수행된다. 생성된 사슬은 단량체 단위를 통해 베이스 물질에 연결된다. 이를 위해, 본 발명에 따른 베이스 물질은 단량체의 용액, 바람직하게는 수용액 중에 현탁된다. 중합체 재료의 그래프팅-온은 산소를 배제하는 종래의 산화환원 중합의 과정에서 수행된다. 사용되는 중합 촉매는 세륨 (IV) 이온인데, 이는 이 촉매가 베이스 물질의 표면에 자유 라디칼 자리를 형성하므로, 이로부터 단량체의 그래프트 중합이 개시된다. 이 반응은 보통 묽은 무기 산에서 수행된다. 이러한 그래프트 중합을 수행하기 위해, 산은 일반적으로 1 내지 0.00001 mol/l, 바람직하게는 0.1 내지 0.001 mol/l 범위의 농도로 수용액에 사용된다. 0.1 내지 0.001 mol/l 범위의 농도로 사용되는 희석 질산의 사용이 매우 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 분리 물질의 제조를 위해, 단량체는 통상적으로 베이스 물질에 과량으로 첨가된다. 전형적으로, 침강된 중합체 재료의 리터 당 0.05 내지 100 mol 의 총 단량체가 사용되며, 바람직하게는 0.05-25 mol/l 가 사용된다.
중합은 세륨 염을 포함하는 종결 반응에 의해 종결된다. 이러한 이유로, (평균) 사슬 길이는 베이스 물질, 개시제 및 단량체의 농도 비에 의해 영향을 받을 수 있다. 또한, 균일한 단량체 또는 또한 상이한 단량체의 혼합물이 사용될 수 있고; 후자의 경우, 그래프팅된 공중합체가 형성된다.
본 발명에 따른 분리 재료의 제조에 유리하게 사용될 수 있는 단량체는 화학식 V 에 따른 것이다
Figure pct00009
식 중, R1, R2 및 Y 는 서로 독립적으로 H 또는 CH3, 바람직하게는 H 이고,
R3 은 -CHCOOMR4 이고,
Figure pct00010
식 중, R4 는 C1 내지 C4 알킬, 예컨대 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, 바람직하게는 이소프로필 및 이소부틸, 매우 바람직하게는 이소부틸, 또는 C1 내지 C4 퍼플루오로알킬이고,
M 은 H, Na, K 또는 NH4 + 임.
퍼플루오로알킬은 알킬 잔기의 모든 H 원자가 F 원자로 치환됨을 의미한다.
화학식 V 의 예시적인, 바람직한 구조는 Va
Figure pct00011
식 중 R1, R2 및 Y 는 H 이고,
R3 은 -CHCOOMR4 이고,
R4 는 이소프로필이고,
M 은 H 임,
뿐 아니라 화학식 Vb 이다:
Figure pct00012
식 중 R1, R2 및 Y 는 H 이고,
R3 은 -CHCOOMR4 이고,
R4 는 이소부틸이고,
M 은 H 임.
이러한 단량체는 또한 아크릴로일발린 (화학식 Va), 아크릴로일류신 (화학식 Vb), 아크릴로일알라닌, 아크릴로일노르류신, 메타크릴로일발린, 메타크릴로일류신, 메타크릴로일알라닌, 메타크릴로일노르류신, 디메타크릴로일발린, 디메타크릴로일류신, 디메타크릴로일알라닌, 디메타크릴로일노르류신으로 기재될 수 있으며, 이로써 아크릴로일발린 및 아크릴로일류신이 바람직하고, 아크릴로일류신이 특히 바람직하다.
본 발명에 따른 분리 물질은 바람직하게는 화학식 V 에 따른 단량체로부터 생성된 베이스 물질 상에 그래프팅된 촉수-유사 선형 중합체 구조만을 함유한다. 바람직하게는, 이들은 화학식 V 에 따른 하나의 유형의 단량체에 의해서만 생성되는 선형 중합체를 함유한다.
그러나, 선형 중합체가 화학식 V 에 따른 2 개 이상의 상이한 단량체의 공중합에 의해 형성되는 것도 가능하다. 선형 중합체가 화학식 V 에 따른 하나 이상의 상이한 단량체 및 예를 들어 이온성, 친수성 또는 소수성 기로 관능화된 다른 아크릴아미드, 메타크릴레이트, 아크릴레이트, 메타크릴레이트 등과 같은 하나 이상의 다른 중합성 단량체의 공중합에 의해 형성되는 것도 가능하다.
본 발명에 따른 분리 재료의 예시적인 구조를 도 1 및 도 2 에 나타내었다. 도 1 은 아크릴로일류신 단량체의 중합에 의해 형성된 선형 중합체로 관능화된 베이스 물질 (도트) 을 보여준다. 또한, 명확성을 위해, 각각의 중합체 단위의 카르복시-알킬 말단기를 나타낸다. 도 2 은 아크릴로일발린 단량체의 중합에 의해 형성된 선형 중합체로 관능화된 베이스 물질 (도트) 을 보여준다. 또한, 명확성을 위해, 각각의 중합체 단위의 카르복시-알킬 말단기를 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 분리 물질은 10-1200μeq/g 범위의 다양한 양의 이온 밀도 윈도우를 갖는 이온 교환 물질이며, 보다 바람직한 구현예에서 이온 밀도 윈도우는 400-900 μeq/g 이다.
바람직한 구현예에서, 이온 교환 물질은 이온 교환 작용기 및 소수성 작용기를 함유할 수 있고, 보다 바람직한 구현예에서 둘 모두의 작용기는 중합체 사슬 내에 내장된 하나의 단량체 단위로부터 생성된 단일 표면 작용기 단위 상에 있고, 가장 바람직한 구현예에서 작용기는 아미노산 잔기의 일부이다.
본 발명은 또한 상기 기재된 본 발명에 따른 분리 물질을 포함하는 크로마토그래피 컬럼에 관한 것이다. 크로마토그래피 컬럼은 당업자에 공지되어 있다. 이들은 전형적으로 분리 재료로 충전된 원통형 튜브 또는 카트리지 뿐만 아니라 튜브 또는 카트리지에 분리 물질을 고정하기 위한 필터 및/또는 수단 및 튜브로 그리고 튜브로부터 용매 전달을 위한 연결부를 포함한다. 크로마토그래피 컬럼의 크기는 적용, 예를 들어, 분석 또는 분취에 따라 달라진다.
본 발명에 따른 재료는 또한 분리 이펙터를 구비한 베이스 물질로서 설명될 수 있다. 이들은 샘플 액체로부터 분리하기 위한 목적으로 하나 이상의 표적 성분의 선택적, 부분 선택적 또는 비-선택적 결합 또는 흡착을 위해, 또는 매트릭스로부터 2 차 성분의 분리, 천연 공급원으로부터의 생물중합체의 분리, 농축 및/또는 고갈, 재조합 공급원으로부터의 생물중합체의 분리, 농축 및/또는 고갈, 단백질 및 펩티드의 분리, 농축 및/또는 고갈, 모노클로날 및 폴리클로날 항체의 분리, 농축 및/또는 고갈, 바이러스의 분리, 농축 및/또는 고갈, 숙주 세포 단백질의 분리, 농축 및/또는 고갈, ADC 의 분리, 농축 및/또는 고갈을 목적으로 하나 이상의 2 차 성분의 선택적, 부분 선택적 또는 비-선택적 결합 또는 흡착을 위해 사용될 수 있다. 바람직한 표적 분자는 ADC 이다.
표적 분자는 샘플로부터 적어도 하나 이상의 다른 물질로부터 분리되고, 여기서 표적 분자를 포함하는 샘플은 액체에 용해되고, 이는 본 발명에 따른 물질과 접촉된다. 접촉 시간은 통상적으로 30 초 내지 24 시간의 범위이다. 본 발명에 따른 분리 물질을 함유하는 크로마토그래피 컬럼에 액체를 통과시킴으로써 액체 크로마토그래피의 원리에 따라 작업하는 것이 유리하다. 액체는 단지 그 중력을 통해 컬럼을 통해 흐를 수 있거나 펌프에 의해 펌핑될 수 있다. 다른 방법은 배치식 크로마토그래피이며, 여기서 표적 분자 또는 생체중합체가 분리 물질에 결합할 수 있는 한, 교반 또는 진탕에 의해 분리 물질을 액체와 혼합한다. 마찬가지로, 예를 들어, 분리 물질을 포함하는 현탁액으로 분리될 액체를 도입함으로써 크로마토그래피 유동층의 원리에 따라 작업하는 것이 가능하며, 여기서 분리 물질은 이의 고밀도 및/또는 자기 코어로 인해 원하는 분리에 적합하도록 선택된다.
크로마토그래피 공정이 결합 및 용리 모드로 수행되는 경우, 표적 분자는 본 발명에 따른 분리 물질에 결합한다. 이어서, 분리 물질을, 바람직하게는 표적 분자가 분리 물질과 접촉하는 액체와 동일한 이온 강도 및 동일한 pH 를 갖는 세척 완충제로 세척할 수 있다. 세척 완충제는 분리 물질에 결합되지 않는 모든 성분을 제거한다. 다른 적합한 완충제를 사용한 추가의 세척 단계는 표적 분자를 탈착시키지 않고 뒤따를 수 있다. 결합된 표적 분자의 탈착은 용리액 내의 이온 강도를 변화시킴으로써 및/또는 용리액 내의 pH 를 변화시킴으로써 및/또는 용매를 변화시킴으로써 수행된다. 따라서, 표적 분자는 용리액 내에서 정제되고 농축된 형태로 수득될 수 있다. 표적 분자는 통상적으로 탈착 후 순도가 70% 내지 99%, 바람직하게는 85% 내지 99%, 특히 바람직하게는 90% 내지 99% 이다.
그러나, 크로마토그래피 공정이 플로우-스루 모드로 진행되면, 표적 분자는 액체 내에 유지되지만, 다른 수반되는 성분은 분리 물질에 결합한다. 그 후, 표적 분자는 스루-플로우에서 컬럼 용리액을 수집함으로써 직접 수득된다. 특정 생체중합체를 분리 물질에 결합시키기 위해, 또는 정제 작업이 표적 분자와 결합하지 않는 것이 유리한지 여부를 조건, 특히 pH 및/또는 전도도를 어떻게 적응시켜야 하는지가 당업자에게 공지되어 있다.
본 발명은 바람직하게는 ADC 의 분리 및 정제를 위한 본 발명에 따른 상기 기재된 분리 물질의 용도 및 본 발명에 따른 분리 물질을 산성 조건 하에 하나 이상의 ADC 를 포함하는 샘플과 접촉시키는 것을 포함하는 액체 크로마토그래피에 의한 ADC 의 정제 및/또는 분리 방법에 관한 것이다.
예상치않게, 본 발명에 따른 이온 교환 물질이 >10 mg ADC/ml 물질 용량에서 효율적인 DAR (약물 항체 비) 종 분리를 가능하게 하는 ADC 의 정제를 위해 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌으며, 여기서 더욱 바람직한 구현예에서 용량은 10 내지 80 mg/ml 이다. 또한, 이 혁신적인 이온 교환 물질은 10 mS/cm 초과의 높은 전도도에서 사용될 수 있으며, 더욱 바람직한 구현예에서 전도도는 10 내지 40 mS/cm 이다. 놀랍게도, 각각의 개별적인 DAR 종을, 바람직하게는 구배 또는 단계 모드에서 4 내지 7 에서 9 초과, 바람직하게는 9 내지 11, 가장 바람직하게는 대략 pH 10 으로의 pH 변화를 사용하여 이들의 접합 절차에 관계없이 분리할 수 있다. 또한, 이 분리 물질의 적용은 소수성 상호작용 또는 히드록시 아파타이트 물질에 비해 현저한 경제적 이점을 나타내어, 90% 초과의 생성물 회수율을 보장하였다. 또한, 적용은 상이한 DAR 종의 분리에 제한되지 않지만, 접합된 mAb 를 접합되지 않은 종으로부터 제거하는 데 사용될 수 있다. 게다가, 분리 물질의 적용은 상이한 DAR 종의 분리에 제한되지 않지만, 접합되지 않은 독성 분자를 제거하는 데 사용될 수 있다.
또한, 이 물질의 적용은 결합 및 용리 적용에 제한되지 않지만, 플로우-스루 모드에서 사용될 수 있어서, pH < 7 및/또는 높은 전도도 ( > 20 mS/cm) 를 갖는 완충제를 사용하여 이온 교환 물질 상에 더 높은 DAR 종 흡착을 초래한다. 또한, 놀랍게도 물질에 공유적으로 부착된 아미노산으로 1 차로 구성된 이러한 이온 교환 물질만이 DAR 종에 대해 필요한 선택성을 가지며, 여기서 더욱 바람직한 구현예에서 이들 아미노산은 발린 또는 류신이고, 이들의 조합 및 유도체를 포함하고, 가장 바람직한 것은 류신이다.
또한, 본 발명은 재생될 수 있고 넓은 작업 윈도우, 예를 들어, pH 3 - 10; 전도도 1 mS/cm - 50 mS/cm 에서 적용가능한 크로마토그래피 기반 ADC 정제 단계를 제공한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 통합되고, DAR 종을 분리하기 위한 결합 및 용리 모드에서 ADC 정제 공정에 사용된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 통합되고, DAR 종을 분리하는 결합 및 용리 모드에서 ADC 정제 공정에 사용되며, 여기서 작동 윈도우 스팬은 pH 2 내지 pH 10 이고, 보다 바람직한 구현예에서 pH 는 4 내지 7 이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 통합되고, DAR 종을 분리하는 결합 및 용리 모드에서 ADC 정제 공정에 사용되며, 여기서 용매 pH 용리는 결합된 성분을 회수하기 위해 사용된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 통합되고, DAR 종을 분리하기 위한 결합 및 용리 모드에서 ADC 정제 공정에 사용되며, 여기서 결합 윈도우 스팬은 10 mg ADC/ml 물질 내지 100 mg ADC/ml 물질이고, 보다 바람직한 구현예에서 결합 윈도우 스팬은 20 mg ADC/ml 물질 내지 80 mg ADC/ml 물질이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 통합되고, DAR 종을 분리하기 위한 결합 및 용리 모드에서 ADC 정제 공정에 사용되며, 여기서 전도도 윈도우 스팬은 1 mS/cm 내지 50 mS/cm 이고, 보다 바람직한 구현예에서 전도도는 2 내지 30 mS/cm 의 범위이다.
또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 이온 교환 물질은 크로마토그래피 컬럼에 통합되고, DAR 종을 분리하는 플로우-스루 모드에서 ADC 정제 공정에 사용되며, 여기서 낮은 DAR 종은 플로우-스루에 있고 높은 DAR 종은 물질에 결합한다.
바람직한 구현예에서, 이온 교환 물질은 1 ㎛ 내지 200 ㎛ 범위의 다양한 입자 크기로 크기화될 수 있고, 보다 바람직한 구현예에서 평균 입자 크기는 20 내지 63 ㎛ 이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 이온 교환 물질은 4 nm 내지 1500 nm 범위의 다양한 공극 크기를 가질 수 있고, 더욱 바람직한 구현예에서 평균 공극 크기는 10 내지 120 nm 이고, 가장 바람직한 구현예에서 평균 공극 크기는 40 내지 110 nm 이다.
본 발명은 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시되지만, 이에 제한되지 않는다.
상기 및 하기에 인용된 모든 특허출원, 특허 및 공보 뿐 아니라, 2019 년 7 월 7 일자 출원된 대응 EP 특허 출원 19184130.3 은, 본원에 참조로서 인용된다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 실용적인 적용에 해당한다.
1. 분리 물질의 합성
공정으로부터의 그래프팅에 사용되는 단량체의 제조를 위해, 아미노산, 예를 들어 발린, 류신 또는 알라닌을 VE 물에 용해시키고, NaOH (32%) 를 첨가함으로써 pH 를 13 초과의 pH 로 조정하였다. 0 내지 5℃ 의 온도에서, 아크릴산 클로라이드 또는 아크릴산과 같은 아크릴 화합물을 첨가하고, 혼합물을 한 시간 동안 교반한다.
발린 및 류신과의 아크릴산 클로라이드에 대한 반응식은 도 3 에 제시된다.
이어서, 질산을 첨가하여 pH 를 약 pH 2.2 로 조정한다. 그 후, OH 함유 베이스 물질, 예를 들어 Eshmuno® 입자를 첨가한다.
중합은 세륨 (IV) 니트레이트를 첨가하여 시작한다. 반응은 30 내지 50 ℃ 에서 4 시간 동안 일어난다.
중합 반응 후, 실온 또는 승온에서 산성, 염기성 및 용매 혼합물을 사용하는 광범위한 세척에 의해 미반응 성분 및 출발물질이 제거된다.
퍼플루오로알킬화 말단기를 갖는 분리 물질의 제조를 위해, 헥사플루오로-발린을 VE 물에 용해시키고, NaOH (32%) 를 첨가하여 pH 를 13 초과의 pH 로 조정한다. 0 내지 5 ℃ 의 온도에서, 아크릴산 클로라이드 또는 아크릴산과 같은 아크릴 화합물을 첨가하고, 혼합물을 한 시간 동안 교반한다. 이어서, 질산을 첨가하여 pH 를 약 pH 2.2 로 조정한다. 그 후, OH 함유 베이스 물질, 예를 들어 Eshmuno® 입자를 첨가한다. 중합은 세륨 (IV) 니트레이트를 첨가하여 시작한다. 반응은 30 내지 50 ℃ 에서 4 시간 동안 일어난다.
2.
실시예 1 에 따라 제조된 이온 교환 물질 (예를 들어, 20 내지 63 ㎛ 의 평균 입자 크기, 40 내지 110 nm 의 평균 공극 크기 및 400 내지 900 μeq/g 의 이온 밀도를 가짐) 은 상업적으로 입수가능한 약물 Adcetris® 의 ADC 종을 분리하는 능력에 대해 평가하였다. 이온 교환 물질을 0,8 - 1,2 및 >3000 플레이트/m 의 비대칭으로 5 x 100 mm 치수의 크로마토그래피 컬럼에 패킹하였다. 이온 교환 물질을 패킹한 후, 수득된 크로마토그래피 컬럼을 1 M NaOH 용액으로 30 분 동안 세정하고, pH 4.5 및 300 mM NaCl (예를 들어, 24 mS/cm) 을 갖는 로딩 완충액으로 미리 평형화시켰다. 완충액은 4.5 의 pH 를 얻기 위해 인산이수소나트륨, TRIS, 글리신과 같은 염의 조합을 함유하였다. 동일한 용액을 사용하여 동결건조된 Adcetris® 샘플을 1 mg/ml 농도까지 용해시켰다. 10 mg Adcetris® 로딩이 1 ml 수지에 도달될 때까지, 이 용액을 제조된 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 이들 단계 및 하기 단계를 150 cm/h 완충 속도로 수행하였다. 10 mg/ml Adcetris® 를 로딩한 후, 크로마토그래피 컬럼을 pH 4.5 완충액으로 세척한 후, pH 8.5 및 300 mM NaCl 을 갖는 완충제로 구배 용리를 사용하여 용리하였다. 이 용리 완충액은 인산이수소나트륨, TRIS, 글리신과 같은 상이한 염을 사용하여 제조하였다. 전도도 및 pH 값은 실험 셋업 동안 추적되었고, 이는 구배 용리 동안 pH 변화로 인해 컬럼으로부터의 Adcetris® 용리가 달성되었음을 보여준다. 샘플 용리를 분별하고, 얻어진 분획을 DAR 종 확인을 위한 2 개의 상이한 방법을 사용하여 라인으로 평가하였다. 제 1 선택 방법은 Thermo Fisher Scientific 으로부터의 4.6 x 100 mm 치수를 갖는 mAbPac HIC-부틸 컬럼을 사용하는 분석적 소수성 상호작용 크로마토그래피였다. 분별된 샘플의 크로마토그래피 분리는 각각의 종에 대한 상이한 용리 윈도우 (예를 들어, DAR0 종의 용리는 7 내지 9 분이었고, DAR2 종의 용리는 10 내지 14 분이었고, DAR4 종의 용리는 15 내지 18 분이었고, DAR6 종의 용리는 19 내지 22 분이었다) 에 기초하여 상이한 DAR 종 및 그의 품질을 확인할 수 있게 하였다.
10 mg/ml Adcetris® 로딩의 예시적인 크로마토그래피 실험은 도 4 에 도시되며, 여기서 UV 흡착 신호 트레이스는 실선이고 pH 신호 트레이스는 점선이다.
분획을 수집하고, 분석 HIC (소수성 상호작용 크로마토그래피) HPLC 를 사용하여 분석하고, 상이한 DAR 의 양을 정량적 면적을 사용하여 계산하였다 (도 4). 도 5 는 분석용 HPLC 컬럼 상에서 선형 용리 구배 동안의 항체 약물 접합체 종의 분리를 예시한다. 5 개의 연속적인 용리 풀이, 5 개의 상이한 항체 약물 접합체 종을 나타내는, UV 신호 트레이스에서 확인된다: 피크 1 은 약물이 없는 항체 약물 접합체 종을 나타내고, 피크 2 는 단일 항체 분자에 접합된 2 개의 약물 분자를 갖는 항체 약물 접합체 종을 나타내고, 피크 3 은 단일 항체 분자에 접합된 4 개의 약물 분자를 갖는 항체 약물 접합체 종을 나타내고, 피크 4 는 항체 약물 접합체 종의 혼합물을 나타내고, 피크 5 는 단일 항체 분자에 접합된 6 개의 약물 분자를 갖는 항체 약물 접합체 종을 나타낸다. 확인된 항체 약물 접합체 종은 그들의 평균 소수성에 의해 상이하며, 하나는 좀더 소수성 (예를 들어, 좌측) 에서 친수성 (예를 들어, 우측) 이다.
수집된 분획의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 분석 평가는 도 6 에 제시되고, 3 개의 수득된 피크가 DAR 종의 분리이고, 즉 제 1 피크는 주로 DAR2 및 DAR6 종 (예를 들어, 98 ml 에서의 용리 최대) 이고, 제 2 피크는 주로 DAR4 종 (예를 들어, 104 ml 에서의 용리 최대) 이고, 제 3 피크 - DAR 6 종 (예를 들어, 125 ml 에서의 용리 최대) 임을 나타낸다.
도 6 에 도시된 바와 같이, 선형 pH 구배 용리를 사용하면서 상이한 DAR 의 분리/농축이 가능하다. 도 1 의 제 1 피크에서, DAR2 의 순도는 40% 까지 증가된다 (시작 레벨 DAR2 24%). 제 2 피크에서, DAR4 의 순도는 65% 까지 증가된다 (시작 레벨 22%). 제 3 피크에서, DAR6 의 순도는 95% 까지 증가된다 (시작 레벨 37%).
3.
본 실시예에서, 실시예 1 에 따라 제조된 이온 교환 물질 (예를 들어, 20 내지 63 ㎛ 의 평균 입자 크기, 40 내지 110 nm 의 평균 공극 크기 및 400 내지 900 μeq/g 의 이온 밀도를 가짐) 은 상업적으로 입수가능한 약물 Adcetris® 의 ADC 종을 분리하는 능력에 대해 평가하였다. 이온 교환 물질을 0,8 - 1,2 및 >3000 플레이트/m 의 비대칭으로 5 x 100 mm 치수의 크로마토그래피 컬럼에 패킹하였다. 이온 교환 물질을 패킹한 후, 수득된 크로마토그래피 컬럼을 1 M NaOH 용액으로 30 분 동안 세정하고, pH 4.5 및 300 mM NaCl (예를 들어, 24 mS/cm) 을 갖는 로딩 완충액으로 미리 평형화시켰다. 완충액은 4.5 의 pH 를 얻기 위해 인산이수소나트륨, TRIS, 글리신과 같은 염의 조합을 함유하였다. 동일한 용액을 사용하여 동결건조된 Adcetris® 샘플을 1 mg/ml 농도까지 용해시켰다. 30 mg Adcetris® 로딩이 1 ml 수지에 도달될 때까지, 이 용액을 제조된 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 이들 단계 및 하기 단계를 150 cm/h 완충 속도로 수행하였다. 30　mg/ml Adcetris® 를 로딩한 후, 크로마토그래피 컬럼을 pH 4.5 완충액으로 세척한 후, pH 8.5 및 300 mM NaCl 을 갖는 완충제로 구배 용리를 사용하여 용리하였다. 이 용리 완충액은 인산이수소나트륨, TRIS, 글리신과 같은 상이한 염을 사용하여 제조하였다. 전도도 및 pH 값은 실험 셋업 동안 추적되었고, 이는 구배 용리 동안 pH 변화로 인해 컬럼으로부터의 Adcetris® 용리가 달성되었음을 보여준다. 샘플 용리를 분별하고, 얻어진 분획을 DAR 종 확인을 위한 2 개의 상이한 방법을 사용하여 라인으로 평가하였다. 제 1 선택 방법은 Thermo Fisher Scientific 으로부터의 4.6 x 100mm 치수를 갖는 mAbPac HIC-부틸 컬럼을 사용하는 분석적 소수성 상호작용 크로마토그래피였다. 분별된 샘플의 크로마토그래피 분리는 각각의 종에 대한 상이한 용리 윈도우 (예를 들어, DAR0 종의 용리는 7 내지 9 분이었고, DAR2 종의 용리는 10 내지 14 분이었고, DAR4 종의 용리는 15 내지 18 분이었고, DAR6 종의 용리는 19 내지 22 분이었다) 에 기초하여 상이한 DAR 종 및 그의 품질을 확인할 수 있게 하였다. 두 번째 선택 방법은 질량 분광법이었으며, 여기서 상이한 DAR 종이 그들의 질량 및 이온화 비율에 기초하여 분리된다. 이러한 방법을 사용하면, DAR 종의 상이한 이온화로 인해 (예를 들어, 더 높은 DAR 종은 더 낮은 정도로 이온화되는 경향이 있음) 정성적 샘플 평가는 가능하지만, 정량적인 것은 불가능하다. 30　mg/ml Adcetris® 로딩의 예시적인 크로마토그래피 실험은 도 7 에 도시되며, 여기서 UV 흡착 신호 트레이스는 실선이고 pH 신호 트레이스는 점선이다.
수집된 분획의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 분석 평가는 도 8 에 제시되고, 3 개의 수득된 피크가 DAR 종의 분리이고, 즉 제 1 피크는 주로 DAR2 종 (예를 들어, 110 ml 에서의 용리 최대) 이고, 제 2 피크는 주로 DAR4 종 (예를 들어, 125 ml 에서의 용리 최대) 이고, 제 3 피크 - DAR 6 종 (예를 들어, 140 ml 에서의 용리 최대) 임을 나타낸다.
도 8 에 도시된 바와 같이, 선형 pH 구배 용리를 사용하면서 상이한 DAR 의 분리/풍부화가 가능하다. 도 7 의 제 1 피크에서, DAR2 의 순도는 55% 까지 증가된다 (시작 레벨 28%). 제 2 피크에서, DAR4 의 순도는 81% 까지 증가된다 (시작 레벨 29%). 제 3 피크에서, DAR6 의 순도는 87% 까지 증가된다 (시작 레벨 26%).선택된 샘플 분획을 질량 분광법을 사용하여 추가로 평가하여 DAR 종 분리의 품질을 평가하였다. 도 9-12 에 도시된 결과는 각각의 얻어진 분획이 식별된 DAR 종을 함유함을 보여준다.
도 9 는 Adcetris® 샘플에 대한 디콘볼루션된 질량 스펙트럼을 보여주며, DAR0 에서 DAR4 종까지의 범위의 DAR 종의 분포를 보여준다. DAR6 종은 낮은 이온화 및 더 낮은 DAR 종의 방법 과부하로 인해 검출가능하지 않다.
도 10 은 제 1 용리 피크의 최대치를 나타내는, 용리 분획 5A7 에 대한 디콘볼루션된 질량 스펙트럼을 보여준다. 수득된 분자량은 다른 DAR 종의 명백한 존재 없이, DAR2 종에 대한 것이다.
도 11 은 제 2 용리 피크의 최대치를 나타내는, 용리 분획 5B4 에 대한 디콘볼루션된 질량 스펙트럼을 보여준다. 수득된 분자량은 다른 DAR 종의 명백한 존재 없이, DAR4 종에 대한 것이다.
도 12 은 제 3 용리 피크의 최대치를 나타내는, 용리 분획 5B11 에 대한 디콘볼루션된 질량 스펙트럼을 보여준다. 수득된 분자량은 DAR4 종 및 DAR6 종에 대한 것이다. 신호 강도는 정량적이 아니다.
4.
본 실시예에서, 실시예 1 에 따라 제조된 이온 교환 물질 (예를 들어, 20 내지 63 ㎛ 의 평균 입자 크기, 40 내지 110 nm 의 평균 공극 크기 및 400 내지 900 μeq/g 의 이온 밀도를 가짐) 은 상업적으로 입수가능한 약물 Adcetris® 의 ADC 종을 분리하는 능력에 대해 평가하였다. 이온 교환 물질을 0,8 - 1,2 및 >3000 플레이트/m 의 비대칭으로 5 x 100 mm 치수의 크로마토그래피 컬럼에 패킹하였다. 이온 교환 물질을 패킹한 후, 수득된 크로마토그래피 컬럼을 1 M NaOH 용액으로 30 분 동안 세정하고, pH 4.5 및 300 mM NaCl (예를 들어, 24 mS/cm) 을 갖는 로딩 완충액으로 미리 평형화시켰다. 완충액은 4.5 의 pH 를 얻기 위해 인산이수소나트륨, TRIS, 글리신과 같은 염의 조합을 함유하였다. 동일한 용액을 사용하여 동결건조된 Adcetris® 샘플을 1 mg/ml 농도까지 용해시켰다. 60　mg Adcetris® 로딩이 1 ml 수지에 도달될 때까지, 이 용액을 제조된 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 이들 단계 및 하기 단계를 150 cm/h 완충 속도로 수행하였다. 60　mg/ml Adcetris® 를 로딩한 후, 크로마토그래피 컬럼을 pH 4.5 완충액으로 세척한 후, pH 8.5 및 300 mM NaCl 을 갖는 완충제로 구배 용리를 사용하여 용리하였다. 이 용리 완충액은 인산이수소나트륨, TRIS, 글리신과 같은 상이한 염을 사용하여 제조하였다. 전도도 및 pH 값은 실험 셋업 동안 추적되었고, 이는 구배 용리 동안 pH 변화로 인해 컬럼으로부터의 Adcetris® 용리가 달성되었음을 보여준다. 샘플 용리를 분별하고, 얻어진 분획을 DAR 종 확인을 위한 2 개의 상이한 방법을 사용하여 라인으로 평가하였다. 제 1 선택 방법은 Thermo Fisher Scientific 으로부터의 4.6 x 100mm 치수를 갖는 mAbPac HIC-부틸 컬럼을 사용하는 분석적 소수성 상호작용 크로마토그래피였다. 분별된 샘플의 크로마토그래피 분리는 각각의 종에 대한 상이한 용리 윈도우 (예를 들어, DAR0 종의 용리는 7 내지 9 분이었고, DAR2 종의 용리는 10 내지 14 분이었고, DAR4 종의 용리는 15 내지 18 분이었고, DAR6 종의 용리는 19 내지 22 분이었다) 에 기초하여 상이한 DAR 종 및 그의 품질을 확인할 수 있게 하였다. 60 mg/ml Adcetris® 로딩의 예시적인 크로마토그래피 실험은 도 13 에 도시되며, 여기서 UV 흡착 신호 트레이스는 실선으로 pH 신호 트레이스는 점선으로 나타내진다. 수집된 분획의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 분석 평가는 도 14 에 제시되고, 3 개의 수득된 피크가 DAR 종의 분리이고, 즉 제 1 피크는 주로 DAR2 종 (예를 들어, 188 ml 에서의 용리 최대) 이고, 제 2 피크는 주로 DAR4 종 (예를 들어, 205 ml 에서의 용리 최대) 이고, 제 3 피크 - DAR 6 종 (예를 들어, 230 ml 에서의 용리 최대) 임을 나타낸다.
놀랍게도, 또한 60 mg/ml 로딩에서, DAR 종의 분리가 가능하여, 49,66% 의 DAR2 종을 함유하는 분획 3B4 에서 보여지는 바와 같이 정제된 DAR2 종을 수득한다. 또한, 분획 3C2 는 83,02% 로 DAR4 종을 주로 함유하고, 분획 3C12 는 83,12% 로 DAR6 종을 주로 함유한다. 이 결과는 모든 크로마토그래피 단계를 고려한 97,37% 의 회수율 내에서 수득되었다.
5.
이 실험에서, 상업적으로 입수가능한 Capto™ MMC Impres 크로마토그래피 수지를 상업적으로 입수가능한 약물 Adcetris® 의 ADC 종을 분리하는 능력에 대해 평가하였다. 이러한 혼합 모드 물질은 또한 약한 양이온 교환기 및 소수성기를 가지며, ADC 종 분리에 적합할 수 있다. Capto™ MMC Impres 물질을 0,8 - 1,2 및 >3000 플레이트/m 의 비대칭으로 5 x 100 mm 치수의 크로마토그래피 컬럼에 패킹하였다. Capto™ MMC Impres 물질을 패킹한 후, 수득된 크로마토그래피 컬럼을 1 M NaOH 용액으로 30 분 동안 세정하고, pH 4.5 및 300 mM NaCl (예를 들어, 24 mS/cm) 을 갖는 로딩 완충액으로 미리 평형화시켰다. 완충액은 4.5 의 pH 를 얻기 위해 인산이수소나트륨, TRIS, 글리신과 같은 염의 조합을 함유하였다. 동일한 용액을 사용하여 동결건조된 Adcetris® 샘플을 1 mg/ml 농도까지 용해시켰다. 30 mg Adcetris® 로딩이 1 ml 수지에 도달될 때까지, 이 용액을 제조된 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 이들 단계 및 하기 단계를 150 cm/h 완충 속도로 수행하였다. 30 mg/ml Adcetris® 를 로딩한 후, 크로마토그래피 컬럼을 pH 4.5 완충액으로 세척한 후, pH 8.5 및 300 mM NaCl 을 갖는 완충제로 구배 용리를 사용하여 용리하였다. 이 용리 완충액은 인산이수소나트륨, TRIS, 글리신과 같은 상이한 염을 사용하여 제조하였다. 전도도 및 pH 값은 실험 셋업 동안 추적되었고, 이는 구배 용리 동안 pH 변화로 인해 컬럼으로부터의 Adcetris® 용리가 달성되었음을 보여준다. 샘플 용리를 분별하고, 얻어진 분획을 DAR 종 확인을 위한 2 개의 상이한 방법을 사용하여 라인으로 평가하였다. 제 1 선택 방법은 Thermo Fisher Scientific 으로부터의 4.6 x 100mm 치수를 갖는 mAbPac HIC-부틸 컬럼을 사용하는 분석적 소수성 상호작용 크로마토그래피였다. 분별된 샘플의 크로마토그래피 분리는 각각의 종에 대한 상이한 용리 윈도우 (예를 들어, DAR0 종의 용리는 7 내지 9 분이었고, DAR2 종의 용리는 10 내지 14 분이었고, DAR4 종의 용리는 15 내지 18 분이었고, DAR6 종의 용리는 19 내지 22 분이었다) 에 기초하여 상이한 DAR 종 및 그의 품질을 확인할 수 있게 하였다. 30 mg/ml Adcetris® 로딩의 예시적인 크로마토그래피 실험은 도 15 에 도시되며, 여기서 UV 흡착 신호 트레이스는 실선으로 pH 신호 트레이스는 점선으로 나타내진다.
수집된 분획의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 분석 평가를 도 16 에 나타내며, 이는 선택된 Capto™ MMC Impres 수지가 모든 30 mg 의 ADC 샘플에 결합할 수 없었고 분리가 그렇게 효율적이지 않음을 보여준다. 개별 DAR 종에 대한 수득된 최대 순도는 DAR2 의 경우 52,92%, DAR4 의 경우 75,32% 및 DAR6 의 경우 72,74% 에 이르렀다. 비교로서, 동일한 조건에서, 혁신적인 이온 교환 수지에 대해 얻어진 순도는 다음과 같았다: DAR2 - 55.27%, DAR4 - 81,24% 및 DAR6 - 86,89%. 추가적으로, Capto MMC Impres 수지를 사용한 회수율은 88,38% 였다.
6.
이 실험에서, 분리 매트릭스는 ADC Adcetris® 의 상이한 DAR (약물 항체 비율) 을 분리하는 능력에 대해 시험된다. 하기 실시예의 경우, 수지를 20% 에탄올 150 mM NaCl 용액을 사용하여 5 mm 직경 100 mm 길이 컬럼에 패킹하였다.
2 가지 하기 완충제, 로딩 완충제인 완충제 A (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.0111 M NaOH 및 0.0889 M NaCl, pH 4.75) 및 B 완충제 (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.046 M NaOH 및 0.054 M NaCl, pH 8.5) 를 제조하였다.
패킹된 컬럼을 0.491 ml/분으로 적어도 10 컬럼 부피에 대해 완충제 A 를 사용하여 평형화시켰다. 동결건조된 제형화된 ADC 를 5 mg/ml 의 농도로 완충제 A 에 용해시켰다. 수득된 용액 3.93 ml 를 평형화된 컬럼에 0.491 ml/분으로 직접 로딩하였다. 로딩 후, 평형화 용액을 사용하여 10 CV 로 컬럼을 세척하였다. 결합된 ADC 의 용리는 0.491 ml/분으로 120 CV 에서 0-100% 의 완충제 B 로부터의 pH 구배 용리를 사용하여 수행하였다 (도 17).
표 1. 10 mg ADC/ ml CV 로딩에서 로딩된 ADC (로딩) 및 50 mM NaCl 을 포함하는, 용리 분획 (피크 1-3) 의 정량적 영역에서 표시된 샘플 분획 특성화의 분석 결과
Figure pct00013
7.
이 실험에서, 분리 매트릭스는 ADC Adcetris® 의 상이한 DAR (약물 항체 비율) 을 분리하는 능력에 대해 시험된다. 하기 실시예의 경우, 수지를 20% 에탄올 150 mM NaCl 용액을 사용하여 5 mm 직경 100 mm 길이 컬럼에 패킹하였다.
2 가지 하기 완충제, 로딩 완충제인 완충제 A (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.0111 M NaOH 및 0.1389 M NaCl, pH 4.75) 및 B 완충제 (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.046 M NaOH 및 0.104 M NaCl, pH 8.5) 를 제조하였다.
패킹된 컬럼을 0.491 ml/분으로 적어도 10 컬럼 부피에 대해 완충제 A 를 사용하여 평형화시켰다. 동결건조된 제형화된 ADC 를 5 mg/ml 의 농도로 완충제 A 에 용해시켰다. 수득된 용액 3.93 ml 를 평형화된 컬럼에 0.491 ml/분으로 직접 로딩하였다. 로딩 후, 평형화 용액을 사용하여 10 CV 로 컬럼을 세척하였다. 결합된 ADC 의 용리는 0.491 ml/분으로 120 CV 에서 0-100% 의 완충제 B 로부터의 pH 구배 용리를 사용하여 수행하였다 (도 18).
표 2. 10 mg ADC/ ml CV 로딩에서 로딩된 ADC (로딩) 및 100 mM NaCl 을 포함하는, 용리 분획 (피크 1-3) 의 정량적 영역에서 표시된 샘플 분획 특성화의 분석 결과
Figure pct00014
8.
이 실험에서, 분리 매트릭스는 ADC Adcetris® 의 상이한 DAR (약물 항체 비율) 을 분리하는 능력에 대해 시험된다. 하기 실시예의 경우, 수지를 20% 에탄올 150 mM NaCl 용액을 사용하여 5 mm 직경 100 mm 길이 컬럼에 패킹하였다.
2 가지 하기 완충제, 로딩 완충제인 완충제 A (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.0111 M NaOH 및 0.1889 M NaCl, pH 4.75) 및 B 완충제 (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.046 M NaOH 및 0.154 M NaCl, pH 8.5) 를 제조하였다.
패킹된 컬럼을 0.491 ml/분으로 적어도 10 컬럼 부피에 대해 완충제 A 를 사용하여 평형화시켰다. 동결건조된 제형화된 ADC 를 5 mg/ml 의 농도로 완충제 A 에 용해시켰다. 수득된 용액 3.93 ml 를 평형화된 컬럼에 0.491 ml/분으로 직접 로딩하였다. 로딩 후, 평형화 용액을 사용하여 10 CV 로 컬럼을 세척하였다. 결합된 ADC 의 용리는 0.491 ml/분으로 120 CV 에서 0-100% 의 완충제 B 로부터의 pH 구배 용리를 사용하여 수행하였다 (도 19).
표 3. 10 mg ADC/ ml CV 로딩에서 로딩된 ADC (로딩) 및 150 mM NaCl 을 포함하는, 용리 분획 (피크 1-3) 의 정량적 영역에서 표시된 샘플 분획 특성화의 분석 결과
Figure pct00015
9.
이 실험에서, 분리 매트릭스는 ADC Adcetris® 의 상이한 DAR (약물 항체 비율) 을 분리하는 능력에 대해 시험된다. 하기 실시예의 경우, 수지를 20% 에탄올 150 mM NaCl 용액을 사용하여 5 mm 직경 100 mm 길이 컬럼에 패킹하였다.
2 가지 하기 완충제, 로딩 완충제인 완충제 A (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.0111 M NaOH 및 0.2389 M NaCl, pH 4.75) 및 B 완충제 (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.046 M NaOH 및 0.204 M NaCl, pH 8.5) 를 제조하였다.
패킹된 컬럼을 0.491 ml/분으로 적어도 10 컬럼 부피에 대해 완충제 A 를 사용하여 평형화시켰다. 동결건조된 제형화된 ADC 를 5 mg/ml 의 농도로 완충제 A 에 용해시켰다. 수득된 용액 3.93 ml 를 평형화된 컬럼에 0.491 ml/분으로 직접 로딩하였다. 로딩 후, 평형화 용액을 사용하여 10 CV 로 컬럼을 세척하였다. 결합된 ADC 의 용리는 0.491 ml/분으로 120 CV 에서 0-100% 의 완충제 B 로부터의 pH 구배 용리를 사용하여 수행하였다 (도 20).
표 4. 10 mg ADC/ ml CV 로딩에서 로딩된 ADC (로딩) 및 200 mM NaCl 을 포함하는, 용리 분획 (피크 1-3) 의 정량적 영역에서 표시된 샘플 분획 특성화의 분석 결과.
Figure pct00016
10.
이 실험에서, 분리 매트릭스는 ADC Adcetris® 의 상이한 DAR (약물 항체 비율) 을 분리하는 능력에 대해 시험된다. 하기 실시예의 경우, 수지를 20% 에탄올 150 mM NaCl 용액을 사용하여 5 mm 직경 100 mm 길이 컬럼에 패킹하였다.
2 가지 하기 완충제, 로딩 완충제인 완충제 A (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.0111 M NaOH 및 0.3389 M NaCl, pH 4.75) 및 B 완충제 (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.046 M NaOH 및 0.304 M NaCl, pH 8.5) 를 제조하였다.
패킹된 컬럼을 0.491 ml/분으로 적어도 10 컬럼 부피에 대해 완충제 A 를 사용하여 평형화시켰다. 동결건조된 제형화된 ADC 를 5 mg/ml 의 농도로 완충제 A 에 용해시켰다. 수득된 용액 3.93 ml 를 평형화된 컬럼에 0.491 ml/분으로 직접 로딩하였다. 로딩 후, 평형화 용액을 사용하여 10 CV 로 컬럼을 세척하였다. 결합된 ADC 의 용리는 0.491 ml/분으로 120 CV 에서 0-100% 의 완충제 B 로부터의 pH 구배 용리를 사용하여 수행하였다 (도 21).
표 5. 10 mg ADC/ ml CV 로딩에서 로딩된 ADC (로딩) 및 300 mM NaCl 을 포함하는, 용리 분획 (피크 1-3) 의 정량적 영역에서 표시된 샘플 분획 특성화의 분석 결과.
Figure pct00017
11.
이 실험에서, 분리 매트릭스는 ADC Adcetris® 의 상이한 DAR (약물 항체 비율) 을 분리하는 능력에 대해 시험된다. 하기 실시예의 경우, 수지를 20% 에탄올 150 mM NaCl 용액을 사용하여 5 mm 직경 100 mm 길이 컬럼에 패킹하였다.
2 가지 하기 완충제, 로딩 완충제인 완충제 A (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.0111 M NaOH 및 0.3889 M NaCl, pH 4.75) 및 B 완충제 (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.046 M NaOH 및 0.354 M NaCl, pH 8.5) 를 제조하였다.
패킹된 컬럼을 0.491 ml/분으로 적어도 10 컬럼 부피에 대해 완충제 A 를 사용하여 평형화시켰다. 동결건조된 제형화된 ADC 를 5 mg/ml 의 농도로 완충제 A 에 용해시켰다. 수득된 용액 3.93 ml 를 평형화된 컬럼에 0.491 ml/분으로 직접 로딩하였다. 로딩 후, 평형화 용액을 사용하여 10 CV 로 컬럼을 세척하였다. 결합된 ADC 의 용리는 0.491 ml/분으로 120 CV 에서 0-100% 의 완충제 B 로부터의 pH 구배 용리를 사용하여 수행하였다 (도 22).
표 6. 10 mg ADC/ ml CV 로딩에서 로딩된 ADC (로딩) 및 350 mM NaCl 을 포함하는, 용리 분획 (피크 1-3) 의 정량적 영역에서 표시된 샘플 분획 특성화의 분석 결과.
Figure pct00018
12.
이 실험에서, 분리 매트릭스는 ADC Adcetris® 의 상이한 DAR (약물 항체 비율) 을 분리하는 능력에 대해 시험된다. 하기 실시예의 경우, 수지를 20% 에탄올 150 mM NaCl 용액을 사용하여 5 mm 직경 100 mm 길이 컬럼에 패킹하였다.
2 가지 하기 완충제, 로딩 완충제인 완충제 A (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.0111 M NaOH 및 0.3389 M NaCl, pH 4.75) 및 B 완충제 (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.046 M NaOH 및 0.304 M NaCl, pH 8.5) 를 제조하였다.
패킹된 컬럼을 0.491 ml/분으로 적어도 10 컬럼 부피에 대해 완충제 A 를 사용하여 평형화시켰다. 동결건조된 제형화된 ADC 를 5 mg/ml 의 농도로 완충제 A 에 용해시켰다. 수득된 용액 3.93 ml 를 평형화된 컬럼에 0.491 ml/분으로 직접 로딩하였다. 로딩 후, 평형화 용액을 사용하여 10 CV 로 컬럼을 세척하였다. 결합된 ADC 의 용리는 0.491 ml/분으로 22% B, 30% B 및 36% B 에서 pH 단계를 사용하여 수행하였다 (도 23).
표 7. 단계 모듈러스에 10 mg ADC/ ml CV 로딩에서 로딩된 ADC (로딩) 및 300 mM NaCl 을 포함하는, 용리 분획 (단계 1-3) 의 정량적 영역에서 표시된 샘플 분획 특성화의 분석 결과.
Figure pct00019
13.
이 실험에서, 혁신적인 이온 교환 물질을 상업적으로 입수가능한 약물 Kadcyla® 의 ADC 종을 분리하는 능력에 대해 평가하였다. 이온 교환 물질을 0,8 - 1,2 및 >3000 플레이트/m 의 비대칭으로 5 x 100 mm 치수의 크로마토그래피 컬럼에 패킹하였다. 이온 교환 물질을 패킹한 후, 수득된 크로마토그래피 컬럼을 1 M NaOH 용액으로 30 분 동안 세정하고, pH 4.5 및 300 mM NaCl (예를 들어, 24 mS/cm) 을 갖는 로딩 완충액으로 미리 평형화시켰다. 완충액은 4.5 의 pH 를 얻기 위해 인산이수소나트륨, TRIS, 글리신과 같은 염의 조합을 함유하였다. 동일한 용액을 사용하여 동결건조된 Kadcyla® 샘플을 1 mg/ml 농도까지 용해시켰다. 30 mg Kadcyla® 로딩이 1 ml 수지에 도달될 때까지, 이 용액을 제조된 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 이들 단계 및 하기 단계를 150 cm/h 완충 속도로 수행하였다. 30 mg/ml Kadcyla® 를 로딩한 후, 크로마토그래피 컬럼을 pH 4.5 완충액으로 세척한 후, pH 8.5 및 300 mM NaCl 을 갖는 완충제로 구배 용리를 사용하여 용리하였다. 이 용리 완충액은 인산이수소나트륨, TRIS, 글리신과 같은 상이한 염을 사용하여 제조하였다. 전도도 및 pH 값은 실험 셋업 동안 추적되었고, 이는 구배 용리 동안 pH 변화로 인해 컬럼으로부터의 Kadcyla® 용리가 달성되었음을 보여준다. 샘플 용리를 분별하고, 얻어진 분획을 DAR 종 확인을 위한 2 개의 상이한 방법을 사용하여 라인으로 평가하였다. 제 1 선택 방법은 Thermo Fisher Scientific 으로부터의 4.6 x 100mm 치수를 갖는 mAbPac HIC-부틸 컬럼을 사용하는 분석적 소수성 상호작용 크로마토그래피였다. 분별된 샘플의 크로마토그래피 분리는 각각의 종에 대한 상이한 용리 윈도우에 기초하여 상이한 DAR 종 및 이의 품질을 확인할 수 있게 하였다. 두 번째 선택 방법은 질량 분광법이었으며, 여기서 상이한 DAR 종이 그들의 질량 및 이온화 비율에 기초하여 분리된다. 이러한 방법을 사용하면, DAR 종의 상이한 이온화로 인해 (예를 들어, 더 높은 DAR 종은 더 낮은 정도로 이온화되는 경향이 있음) 정성적 샘플 평가는 가능하지만, 정량적인 것은 불가능하다. 30　mg/ml Kadcyla® 로딩의 예시적인 크로마토그래피 실험은 도 24 에 도시되며, 여기서 UV 흡착 신호 트레이스는 실선으로 pH 신호 트레이스는 점선으로 나타내진다.
분획을 수집하고, 분석 HIC (소수성 상호작용 크로마토그래피) HPLC 를 사용하여 분석하고, 상이한 DAR 의 양을 정량적 면적을 사용하여 계산하였다. 도 25 는 분석용 HPLC 컬럼 상에서 선형 용리 구배 동안의 항체 약물 접합체 종의 분리를 예시한다. 5 개의 연속적인 용리 풀이, 5 개의 상이한 항체 약물 접합체 종을 나타내는, UV 신호 트레이스에서 확인된다: 피크 1 은 약물이 없는 항체 약물 접합체 종을 나타내고, 피크 2 는 단일 항체 분자에 접합된 1 개의 약물 분자를 갖는 항체 약물 접합체 종을 나타내고, 피크 3 은 단일 항체 분자에 접합된 2 개의 약물 분자를 갖는 항체 약물 접합체 종을 나타내고, 피크 4 는 단일 항체 분자에 접합된 3 개의 약물 분자를 갖는 항체 약물 접합체 종을 나타내고, 피크 5 는 단일 항체 분자에 접합된 4 개 초과의 약물 분자를 갖는 항체 약물 접합체 종을 나타낸다. 확인된 항체 약물 접합체 종은 그들의 평균 소수성에 의해 상이하며, 하나는 좀더 소수성 (예를 들어, 좌측) 에서 친수성 (예를 들어, 우측) 이다.
수집된 분획의 소수성 상호작용 크로마토그래피를 이용한 분석 평가는 도 26 에 나타나 있으며, 이는 선택된 혁신적인 이온 교환 수지가 더 낮은 DAR 종을 더 높은 것들로부터 분리할 수 있었음을 보여준다.
선택된 샘플 분획을 질량 분광법을 사용하여 추가로 평가하여 DAR 종 분리의 품질을 평가하였다. 도 27-29 에 도시된 결과는 각각의 얻어진 분획이 식별된 DAR 종을 함유함을 보여준다.
도 27. Kadcyla™ 샘플에 대한 디콘볼루션된 질량 스펙트럼, DAR0 에서 DAR7 종까지의 범위의 DAR 종의 분포를 보여준다.
도 28. 용리 분획 3A4 샘플에 대한 디콘볼루션된 질량 스펙트럼, 이는 더 낮은 DAR 종의 분포를 보여준다.
도 29. 용리 분획 3B12 샘플에 대한 디콘볼루션된 질량 스펙트럼, 이는 더 높은 DAR 종의 분포를 보여준다.
14.
이 실험에서, 분리 매트릭스는 ADC Kadcyla® 의 상이한 DAR (약물 항체 비율) 을 분리하는 능력에 대해 시험된다. 하기 실시예의 경우, 수지를 20% 에탄올 150 mM NaCl 용액을 사용하여 5 mm 직경 100 mm 길이 컬럼에 패킹하였다.
2 가지 하기 완충제, 로딩 완충제인 완충제 A (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.0111 M NaOH 및 0.2889 M NaCl, pH 4.75 및 ~28 mS/cm 의 전도도) 및 B 완충제 (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.046 M NaOH 및 0.254 M NaCl, pH 8.5 및 ~27 mS/cm 의 전도도) 를 제조하였다.
패킹된 컬럼을 0.491 ml/분으로 적어도 10 컬럼 부피에 대해 완충제 A 를 사용하여 평형화시켰다. 동결건조된 제형화된 ADC 를 5 mg/ml 의 농도로 완충제 A 에 용해시켰다. 수득된 용액 22.52 ml 를 평형화된 컬럼에 0.491 ml/분으로 직접 로딩하였다. 로딩 후, 평형화 용액을 사용하여 10 CV 로 컬럼을 세척하였다. 결합된 ADC 의 용리는 0.491 ml/분으로 120 CV 에서 0-100% 의 완충제 B 로부터의 pH 구배 용리를 사용하여 수행하였다 (도 30).
도 31 에 도시된 바와 같이, 선형 pH 구배 용리를 사용하여, 상이한 DAR 의 분리/농축이 가능하다. >DAR4 의 순도는 96% 까지 증가된다 (시작 레벨 68%).
15.
이 실험에서, Capto™ MMC ImpRes 크로마토그래피 수지는 ADC Kadcyla® 의 상이한 DAR (약물 항체 비율) 을 분리하는 능력에 대해 시험된다. 하기 실시예의 경우, 수지를 20% 에탄올 150 mM NaCl 용액을 사용하여 5 mm 직경 100 mm 길이 컬럼에 패킹하였다.
2 가지 하기 완충제, 로딩 완충제인 완충제 A (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.0111 M NaOH 및 0.2889 M NaCl, pH 4.75 및 ~28 mS/cm 의 전도도) 및 B 완충제 (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.046 M NaOH 및 0.254 M NaCl, pH 8.5 및 ~27 mS/cm 의 전도도) 를 제조하였다.
패킹된 컬럼을 0.491 ml/분으로 적어도 10 컬럼 부피에 대해 완충제 A 를 사용하여 평형화시켰다. 동결건조된 제형화된 ADC 를 5 mg/ml 의 농도로 완충제 A 에 용해시켰다. 수득된 용액 11.26 ml 를 평형화된 컬럼에 0.491 ml/분으로 직접 로딩하였다. 로딩 후, 평형화 용액을 사용하여 10 CV 로 컬럼을 세척하였다. 결합된 ADC 의 용리는 0.491 ml/분으로 120 CV 에서 0-100% 의 완충제 B 로부터의 pH 구배 용리를 사용하여 수행하였다 (도 32).
도 32 에 도시된 바와 같이, 선형 pH 구배 용리를 사용하여, 상이한 DAR 의 분리/농축이 가능하다. >DAR4 의 순도는 90% 까지 증가된다 (시작 레벨 72%).
16.
이 실험에서, 분리 매트릭스는 ADC Kadcyla® 의 상이한 DAR (약물 항체 비율) 을 분리하는 능력에 대해 시험된다. 하기 실시예의 경우, 수지를 20% 에탄올 150 mM NaCl 용액을 사용하여 5 mm 직경 100 mm 길이 컬럼에 패킹하였다.
2 가지 하기 완충제, 로딩 완충제인 완충제 A (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.0111 M NaOH 및 0.4389 M NaCl, pH 4.75) 및 B 완충제 (예를 들어, 0.00796 M 시트르산, 0.009068 M 인산이수소나트륨, 0.021543 M 글리신, 0.010668 M TRIS, 0.007666 M 숙시네이트, 0.046 M NaOH 및 0.404 M NaCl, pH 8.5) 를 제조하였다.
패킹된 컬럼을 0.491 ml/분으로 적어도 10 컬럼 부피에 대해 완충제 A 를 사용하여 평형화시켰다. 동결건조된 제형화된 ADC 를 5 mg/ml 의 농도로 완충제 A 에 용해시켰다. 수득된 용액 3.93 ml 를 평형화된 컬럼에 0.491 ml/분으로 직접 로딩하였다. 로딩 후, 평형화 용액을 사용하여 10 CV 로 컬럼을 세척하였다. 결합된 ADC 의 용리는 0.491 ml/분으로, 5% B 및 40% B 에서 pH 단계를 사용하여 수행하였다 (도 34).
표 8. 단계 모듈러스에 10 mg ADC/ ml CV 로딩에서 로딩된 ADC (로딩) 및 400 mM NaCl 을 포함하는, 용리 분획 (단계 1-2) 의 정량적 영역에서 표시된 샘플 분획 특성화의 분석 결과.
Figure pct00020

Claims (12)

  1. 표면에 중합체 사슬이 공유 결합에 의해 그래프팅된, 히드록실기 함유 베이스 매트릭스를 포함하는 분리 물질로서, 중합체 사슬은 -N(Y)-R3:
    식 중,
    a. Y 는 서로 독립적으로 H 또는 CH3, 바람직하게는 H 이고,
    b. R3 은 -CHCOOMR4 이고,
    R4 는 C1 내지 C4 알킬 또는 C1 내지 C4 퍼플루오로알킬이고,
    M 은 H, Na, K 또는 NH4 임
    의 아미노산 말단기를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 물질.
  2. 제 1 항에 있어서, 중합체 사슬의 단량체 단위가 선형 방식으로 연결되고, 각각의 단량체 단위가 말단기 -N(Y)-R3 을 포함하는 분리 물질.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 이온 밀도가 400 - 900 μeq/g 인 분리 물질.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, Y 가 H 이고, R4 가 이소프로필 및/또는 이소부틸인 분리 물질.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 히드록실기 함유 베이스 매트릭스가 지방족 히드록실기를 포함하는 분리 물질.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 베이스 매트릭스가 가교제로서 1,4-부탄디올 모노비닐 에테르, 1,5-펜탄디올 모노비닐 에테르, 디에틸렌 글리콜 모노비닐 에테르 또는 시클로헥산디메탄올 모노비닐 에테르 및 디비닐에틸렌우레아 (1,3-디비닐이미다졸린-2-온) 의 군으로부터 선택되는 친수성 치환된 알킬 비닐 에테르의 공중합에 의해 형성되는 분리 물질.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 물질이 히드록실기 함유 베이스 매트릭스를 화학식 V:
    Figure pct00021

    식 중, R1, R2 및 Y 는 서로 독립적으로 H 또는 CH3 이고,
    R3 은 -CHCOOMR4 이고,
    R4 는 C1 내지 C4 알킬 또는 C1 내지 C4 퍼플루오로알킬이고,
    M 은 H, Na, K 또는 NH4 임
    에 따른 단량체의 세륨 (IV) 촉매된 그래프트 중합에 적용함으로써 제조될 수 있는 분리 물질.
  8. 항체 약물 접합체 (ADC) 를 포함하는 샘플을, 표면에 중합체 사슬이 공유 결합에 의해 그래프트된 히드록실기 함유 베이스 매트릭스를 포함하는 분리 물질과 접촉시킴으로써, 항체 약물 접합체 (ADC) 를 크로마토그래피 정제 및/또는 분리하는 방법으로서, 중합체가 말단기 -N(Y)-R3:
    식 중,
    Y 는 서로 독립적으로 H 또는 CH3 이고,
    R3 은 -CHCOOMR4 이고,
    R4 는 C1 내지 C4 알킬 또는 C1 내지 C4 퍼플루오로알킬이고,
    M 은 H, Na, K 또는 NH4 임
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  9. 제 8 항에 있어서, ADC 표적 분자가 2 내지 7 의 pH 에서 분리 매트릭스에 결합되고, 임의로 세척되고, pH 가 알칼리성 pH 로 변화함으로써 용리되는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 샘플이 10 내지 1200 μeq/g 의 이온 밀도로 분리 매트릭스에 적용되는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 분리 물질 ml 당 10 mg 내지 100 mg ADC 가 결합되는 크로마토그래피 정제 및/또는 분리 방법.
  12. 히드록실기 함유 베이스 매트릭스를 화학식 V:
    Figure pct00022

    식 중, R1, R2 및 Y 는 서로 독립적으로 H 또는 CH3 이고,
    R3 은 -CHCOOMR4 이고,
    R4 는 C1 내지 C4 알킬 또는 C1 내지 C4 퍼플루오로알킬이고, M 은 H, Na, K 또는 NH4 임
    에 따른 단량체의 세륨 (IV) 촉매된 그래프트 중합에 적용함에 의한 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 분리 물질의 제조 방법.
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