KR20220023275A - Srebp2의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염성 질환 진단용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염성 질환 진단용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins) 또는 이의 C-말단 펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염성 질환 진단 또는 중증도 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, SREBP2 또는 이의 C-말단 펩타이드는 감염성 질환에서 질환의 중증도와 비례하여 발현 수준이 증가하므로, 이들 마커는 감염성 질환의 진단 및 중증도 예측에 매우 유용하게 활용될 수 있다.

Description

SREBP2의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염성 질환 진단용 조성물{Composition for diagnosing infectious inflammatory disease comprising agents detecting the expression level of SREBP2}
본 발명은 SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins)의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염성 질환 진단용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins) 또는 이의 C-말단 펩타이드의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염성 질환 진단 또는 중증도 진단용 조성물에 관한 것이다.
감염성 질환은 균, 세균, 바이러스 등의 외래물이 혈액, 체액 및 조직 내에 출현하여 서식하기 시작하면서 발병하는 질환으로서, 이들의 정확한 동정 및 적절한 치료가 이루어지지 않을 경우, 생명을 잃을 수 있는 질병이다. 위생 수준의 향상에 따라서 감염질환의 유병율은 대체로 감소하는 것으로 보이나, 항생제 투여의 오남용, 이식에 따른 면역 억제제 사용의 증가, 항암 치료로 인한 면역력 감소, 당뇨, 고혈압 등 기저질환 보유자의 증가 등으로 치명적인 결과를 초래하는 감염질환의 위협은 증가되는 상황이다
특히 감염질환은 대부분 감염부위의 염증반응을 수반하며, 그 중의 일부는 전신 염증반응을 일으켜 치명적인 결과를 초래하기도 한다. 또한 감염에 의한 감염성 환자는 사망에 이를 수 있어 최대한 빠르게 적절한 항생제 치료를 시작하는 것이 중요하므로 정확한 진단과 중증도 예측은 감염성 환자의 생존을 위해 필수적이다.
한편, 새로운 인간 코로나 바이러스의 유행성 전염병이 최근 전세계에 빠르게 확산되어 세계 보건에 위협을 가하고 있다. 놀랍게도, SARS-CoV-2 감염증 환자에서 관찰되는 증상은 이전에 보고된 중증 급성 호흡기 증후군 (SARS) 및 중동 호흡기 증후군 (MERS)과 같은 다른 바이러스 감염증과 유사하다. 이 환자들 중 다수는 급성 호흡 곤란 증후군 (ARDS), 사이토카인 분비 증후군 (CRS), 다기관 부전 (MOF) 및 패혈증과 같은 폐렴 관련 증상이 관찰되었다. SARS-CoV-2 감염증 치료에 사용할 수 있는 승인된 요법이나 효과적인 치료제는 아직까지 확인되지 않고 있다. SARS-CoV-2 감염증의 전염병에 대응하여, 백신 연구 및 개발을 위한 세계적 노력은 속도와 규모면에서 전례가 없다. 하지만, 백신 개발에는 여전히 많은 시간이 필요하기 때문에 SARS-CoV-2 감염증 환자의 사망률을 낮추기 위한 효과적인 치료법의 개발이 시급한 실정이다.
다른 한편, SREBP(Sterol regulatory element binding proteins)는 지질 콜레스테롤 생합성에 관여하는 유전자들의 발현을 조절하는 기본-나선-루프 헬릭스-류신 지퍼 전사인자로 잘 알려져 있다. 이러한 SREBP 전사 인자는 MAPK 활성화 경로를 통해 지질 콜레스테롤 및 지방산 유전자 발현을 조절하는 것으로 보고되었다. SREBP 전사 인자는 진핵생물에서 지질 생합성 및 스테롤 항상성에 중요한 조절자이며, 포유류에서는 SREBP가 지방 상태에 관여하는 콜레스테로제닉 및 지방 형성 유전자의 발현을 촉진하기 위해 섭식 상태에서 매우 활성화되어 있다. 그런데, 최근 소포체(ER) 스트레스, 염증, 세포사멸(apoptosis) 및 자가포식(autophagy)과 같은 다양한 병원성 과정이 SREBP와 관련되어 있다는 것이 보고된 바 있고, 손상된 조직의 경화과정에도 SREBP 발현이 관련되어 있다.
최근에 공개된 연구에 따르면, 세포에서 Sestrin1(SESN1)의 전사가 SREBP2에 의해 조절되며, SESN1이 SREBP2의 표적 유전자이고 SESN1이 콜레스테롤 생합성을 억제한다는 것이 확인되었다. SREBP2에 의해서 SESN1과 PCSK9(proprotein convertase subtilisin kexin type 9)의 발현 수준이 증가하여 지질 생합성을 억제한다. SESN1이 간 콜레스테롤 생합성에 영향을 미치는지 관찰하기 위해, 마우스를 로바스타틴으로 처리하여 HMGCR 활성을 억제하고 콜레스테롤 생합성을 차단하였다. 최근에 공개된 데이터에 따르면, 콜레스테롤 공급 후, SESN1-/- 마우스 간에서 인산화된 AMPK가 현저히 감소했고, mTORC1은 변화하지 않았는데, 이는 SESN1이 AMP 키나제 경로 활성화를 통해 콜레스테롤 생합성을 억제하는 기능을 한다는 것을 의미한다.
그러나, SREBP2가 감염 과정 동안에 세포 및 조직 손상, 그리고 궁극적으로는 염증의 유도와 어떻게 관련되어 있는지에 대해서는 아직까지 알려진 바가 없다.
이에, 본 발명자는 감염성 질환과 SREBP2와의 연관성에 대해 연구를 진행하던 중, 감염성 질환 환자의 생물학적 시료에서 SREBP2의 발현 수준 또는 SREBP2 C-말단 펩타이드의 발현 수준이 정상인과 비교해 현저히 높고, 이의 발현 수준은 질환의 중증도와도 매우 밀접한 관련이 있다는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins) 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염성 질환 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins) 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염성 질환 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 감염성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (a) 감염성 질환이 의심되는 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins) 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 SREBP2 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 정상인과 비교하고 정상인에 비해 SREBP2의 단백질 또는 mRNA 발현 수준이 증가한 경우 감염성 질환인 것으로 판정하는 단계를 포함하는, SREBP2를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.
상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins) 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염성 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins) 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염성 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 감염성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (a) 감염성 질환이 의심되는 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins) 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 SREBP2 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 정상인과 비교하고 정상인에 비해 SREBP2의 단백질 또는 mRNA 발현 수준이 증가한 경우 감염성 질환인 것으로 판정하는 단계를 포함하는, SREBP2를 검출하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 감염성 질환 환자의 혈액에서 SREBP2 단백질 및 mRNA의 발현 수준이 정상인과 비교해 현저히 증가되어 있는 것으로 확인되었으며, SREBP2의 증가 수준은 질환의 중증도과 비례하는 경향성을 나타냈다. 또한, SREBP2 단백질의 C-말단 펩타이드도 이와 동일한 경향성을 나타냈는데, SREBP2는 세포에서 외부로 배출이 되는 특성이 있어 간단한 혈액검사만으로도 매우 정확하게 감염성 질환과 이의 중증도를 진단할 수 있음이 확인되었다.
따라서, 본 발명은 SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins) 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염성 질환 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 SREBP2는 지질의 항상성 및 대사를 조절하는 전사 인자로서, 내인성 콜레스테롤, 지방산, 트리아실 글리세롤 및 인지질 합성에 필요한 효소의 발현을 정밀하게 조절한다. SREBP2는 SREBF2(sterol regulatory element binding transcription factor 2)로도 알려져 있고, 인간에서 SREBP2 유전자에 의해 암호화된다. SREBP2 단백질의 아미노산 서열과 mRNA 염기 서열은 Genebank accession number NP_004590.2 (단백질), NM_004599.4 (mRNA) 등으로 공지되어 있으며, 바람직하게는 서열번호 1(단백질) 또는 서열번호 2(mRNA)로 표시될 수 있다.
[서열번호 1]; full-length SREBP2의 단백질
MDDSGELGGL ETMETLTELG DELTLGDIDE MLQFVSNQVG EFPDLFSEQL CSSFPGSGGS
GSSSGSSGSS SSSSNGRGSS SGAVDPSVQR SFTQVTLPSF SPSAASPQAP TLQVKVSPTS
VPTTPRATPI LQPRPQPQPQ PQTQLQQQTV MITPTFSTTP QTRIIQQPLI YQNAATSFQV
LQPQVQSLVT SSQVQPVTIQ QQVQTVQAQR VLTQTANGTL QTLAPATVQT VAAPQVQQVP
VLVQPQIIKT DSLVLTTLKT DGSPVMAAVQ NPALTALTTP IQTAALQVPT LVGSSGTILT
TMPVMMGQEK VPIKQVPGGV KQLEPPKEGE RRTTHNIIEK RYRSSINDKI IELKDLVMGT
DAKMHKSGVL RKAIDYIKYL QQVNHKLRQE NMVLKLANQK NKLLKGIDLG SLVDNEVDLK
IEDFNQNVLL MSPPASDSGS QAGFSPYSID SEPGSPLLDD AKGDFAAAAG NLQTCLAVLG
RALPTSRLDL ACSLSWNVIR YSLQKLRLVR WLLKKVFQCR RATPATEAGF EDEAKTSARD
AALAYHRLHQ LHITGKLPAG SACSDVHMAL CAVNLAECAE EKIPPSTLVE IHLTAAMGLK
TRCGGKLGFL ASYFLSRAQS LCGPEHSAVP DSLRWLCHPL GQKFFMERSW SVKSAAKESL
YCAQRNPADP IAQVHQAFCK NLLERAIESL VKPQAKKKAG DQEEESCEFS SALEYLKLLH
SFVDSVGVMS PPLSRSSVLK SALGPDIICR WWTSAITVAI SWLQGDDAAV RSHFTKVERI
PKALEVTESP LVKAIFHACR AMHASLPGKA DGQQSSFCHC ERASGHLWSS LNVSGATSDP
ALNHVVQLLT CDLLLSLRTA LWQKQASASQ AVGETYHASG AELAGFQRDL GSLRRLAHSF
RPAYRKVFLH EATVRLMAGA SPTRTHQLLE HSLRRRTTQS TKHGEVDAWP GQRERATAIL
LACRHLPLSF LSSPGQRAVL LAEAARTLEK VGDRRSCNDC QQMIVKLGGG TAIAAS
[서열번호 2]; full-length SREBF-2 mRNA sequences
atggacgaca gcggcgagct gggtggtctg gagaccatgg agaccctcac ggagctgggc
gacgagctga ccctgggaga catcgacgag atgctgcaat ttgtcagtaa tcaagtggga
gagttccctg acttgttttc agaacagctg tgtagctcct ttcctggcag tggtggtagt
ggtagcagca gcggcagcag tggcagcagc agcagcagca gcaatggcag gggcagcagc
agcggagctg tggacccttc agtgcaacgg tcattcaccc aggtcacatt accttccttc
tctccctcgg cggcctcccc acaggctcca actctgcaag tcaaggtttc tcccacctca
gttcccacca cacccagggc aactcctatt cttcagcccc gcccccagcc ccagcctcaa
cctcaaactc agctgcaaca acagacggta atgatcacgc caacattcag caccactccg
cagacgagga tcatccagca gcctttgata taccagaatg cagctactag ctttcaagtc
cttcagcctc aagtccaaag cctggtgaca tcctcccagg tacagccggt caccattcag
cagcaggtgc agacagtaca ggcccagcgg gtgctgacac aaacggccaa tggcacgctg
cagacccttg ccccggctac ggtgcagaca gttgctgcgc cacaggtgca gcaggtcccg
gtcctggtcc agcctcagat catcaagaca gattcccttg ttttgaccac actgaagaca
gatggcagcc ctgttatggc tgcggtccag aacccggccc tcaccgccct caccacccct
atccagacgg ctgcccttca agtaccaacc ctggtgggca gcagtgggac cattctgacc
acaatgcctg taatgatggg gcaagagaaa gtgcccatta agcaggtacc tgggggagtc
aagcagcttg agccccccaa agaaggagaa aggcggacaa cccataatat cattgagaaa
cgatatcgct cctccatcaa tgacaaaatc atcgaattga aagacctggt catggggaca
gacgccaaga tgcacaagtc tggcgttctg aggaaggcca ttgattacat caaatacttg
cagcaggtca atcataaact gcgccaggag aacatggtgc tgaagctggc aaatcaaaag
aacaagcttc taaagggcat cgacctaggc agtctggtgg acaatgaggt ggacctgaag
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caggctggct tctctcccta ctccattgac tctgagccag gaagccctct attggatgat
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cgggcactgc ccacctcccg cctggacctg gcctgcagcc tctcctggaa cgtgatccgc
tacagcctgc agaagctacg cctggtgcgc tggctgctca agaaagtctt ccagtgccgg
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tccgcctgtt ccgatgtaca catggcgttg tgtgccgtga acctggctga atgtgcagag
gagaagatcc caccgagcac actggttgag atccatctga ctgctgccat ggggctcaag
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tactgtgccc agaggaaccc agctgacccc attgcgcagg tccaccaggc cttctgcaag
aacctgctgg agcgagctat agagtccttg gtgaaacctc aggccaagaa gaaggctgga
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agctggctcc agggagacga tgcagctgtg cgctctcatt ttaccaaagt ggaacgcatc
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ctggccgaag ctgcccgcac cctggagaag gtgggcgacc ggcgctcctg caacgactgc
cagcagatga ttgttaagct gggtggtggc actgccattg ccgcctcctg a
본 발명에서 '발현(expression)'은 세포에서 단백질 또는 핵산이 생성되는 것을 의미한다. '단백질'은 '폴리펩타이드(polypeptide)' 또는 '펩타이드(peptide)'와 호환성 있게 사용되며, 예컨대, 자연 상태의 단백질에서 일반적으로 발견되는 바와 같이 아미노산 잔기의 중합체를 말한다. '폴리뉴클레오티드(polynucleotide)' 또는 '핵산'은 단일-또는 이중-가닥의 형태로 된 데옥시리보뉴클레오티드(DNA) 또는 리보뉴클레오티드(RNA)를 말한다. 다른 제한이 없는 한, 자연적으로 생성되는 뉴클레오티드와 비슷한 방법으로 핵산에 혼성화되는 자연적 뉴클레오티드의 공지된 아날로그도 포함된다. 'mRNA'는 단백질 합성 과정에서 특정 유전자로부터 아미노산 서열을 특정하게 되는 리보솜으로 유전 정보(유전자 특이적 염기 서열)를 전달하는 RNA이다.
'진단'은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명에서의 진단은 SREBP2의 발현 수준, 즉 SREBP2 단백질 또는 mRNA의 수준을 측정하여 감염성 질환의 병리 존재 또는 발병 여부를 확인하는 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 상기 SREBP2 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 SREBP2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 항체의 단편 또는 압타머일 수 있다.
'항체(antibody)'는 항원성 부위에 특이적으로 결합하는 면역글로불린(immunoglobulin)을 의미한다. 본 발명에서의 항체는 SREBP2 이외에는 다른 종류의 SREBPs를 포함하는 다른 단백질에는 반응하지 않고, SREBP2 단백질에만 특이적으로 결합하는 항체이다. SREBP2 항체는 SREBP2 유전자를 발현벡터에 클로닝하여 상기 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 수득하고, 수득한 단백질로부터 당해 기술분야의 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있다. SREBP2 항원성 부위를 포함하는 SREBP2 단백질의 단편을 이용하여 SREBP2 단백질 특이적인 항체를 제조할 수도 있다.
본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며, 다클론항체(polyclonal antibody) 또는 단일클론항체(monoclonal antibody)를 포함한다. 또한 항원-항체 결합성을 갖는 것이면 전체 항체의 일부도 본 발명의 항체에 포함되며, SREBP2에 특이적으로 결합하는 모든 종류의 면역글로불린 항체가 포함된다. 예를 들어 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 갖는 완전한 형태의 항체뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편, 즉 항원 결합 기능을 갖는 Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 나아가 본 발명의 항체에는 SREBP2 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 것이라면 인간화 항체, 키메릭 항체 등의 특수 항체와 재조합 항체도 포함된다.
본 발명에서 SREBP2 단백질은 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 인간의 SREBP2 아미노산 서열을 포함하는 것으로서, 본 발명에서 SREBP2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 상기 SREBP2 특이적인 항체를 SREBP2의 발현 수준을 측정하는 제제로 포함하는 본 발명의 진단용 조성물은 공지된 단백질을 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 본 조성물을 이용하여 공지된 단백질을 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 SREBP2 단백질의 수준을 측정할 수 있다.
본 발명에서 상기 '압타머(aptamer)'는 특정 물질에 대해 높은 특이성과 친화도를 가지는 단일가닥 DNA(ssDNA) 또는 RNA를 말한다. 압타머는 특정 물질에 대한 친화도가 매우 높고 안정하고, 비교적 단순한 방법으로 합성할 수 있으며, 결합력을 높이기 위해 다양한 변형이 가능하고, 세포, 단백질, 및 작은 유기물질까지도 표적물질이 될 수 있기 때문에, 그 특이성 및 안정성이 이미 개발되어 있는 항체에 비해 매우 높은 특징이 있다. 본 발명에서 상기 압타머는 SREBP2에 결합할 수 있는 것이라면 그 종류 및 형태가 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 일 양태에서, 상기 SREBP2 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 SREBP2 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머쌍, 프로브 또는 이의 조합일 수 있다.
상기 SREBP2 mRNA는 인간을 포함하는 포유류에서 유래한 것일 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 인간의 SREBP2 mRNA 염기서열을 포함하는 것일 수 있다. 상기 SREBP2 mRNA 특이적인 프로브 또는 프라이머 세트를 SREBP2의 발현 수준을 측정하는 제제로 포함하는 본 발명의 진단용 조성물은 공지된 RNA를 감지하는 방법에 필요한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 본 조성물을 이용하여 공지된 RNA를 감지하는 방법을 제한없이 사용하여 피검체에서 SREBP2 mRNA의 수준을 측정할 수 있다.
상기 '프라이머(primer)'는 DNA 합성의 개시점(starting point)으로 작용하는 짧은 단일가닥 올리고뉴클레오티드(single strand oligonucleotide)이다. 프라이머는 적합한 완충액(buffer)와 온도 조건에서 주형(template)인 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 결합하고, DNA 중합효소가 프라이머에 주형 DNA에 상보적인 염기를 갖는 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 추가하여 연결함으로써 DNA가 합성된다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 30개의 염기서열로 이루어져 있으며, 염기 구성과 길이에 따라 주형 가닥에 결합하는 온도(melting temperature, Tm)가 달라진다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 염기 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서 SREBP2 mRNA의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머는 SREBP2 유전자 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, DNA 합성을 통해 SREBP2 mRNA 또는 SREBP2 cDNA의 특정 구간을 증폭하여 SREBP2 mRNA의 양을 측정하려는 목적에 맞는 길이와 상보성을 갖는 것이면 충분하다. 상기 증폭 반응을 위한 프라이머는 증폭하고자 하는 SREBP2 mRNA의 특정 구간의 양쪽 끝부분의 주형(또는 센스, sense)과 반대편(안티센스, antisense)에 각각 상보적으로 결합하는 한 세트(쌍)으로 구성된다. 프라이머는 당업자라면 SREBP2 mRNA 또는 cDNA 염기서열을 참조하여 용이하게 디자인할 수 있다.
본 발명에서 상기 프라이머는 바람직하게는 서열번호 2로 표시되는 SREBP2 mRNA 염기서열에 특이적으로 결합하는 한 세트 또는 한 쌍일 수 있다.
상기 '프로브(probe)'는 특정 유전자의 mRNA나 cDNA(complementary DNA)에 특이적으로 결합할 수 있는 짧게는 수개 내지 길게는 수백 개의 염기(base pair) 길이의 RNA 또는 DNA 등 폴리뉴클레오티드의 단편을 의미하며, 표지(labeling)되어 있어서 결합하는 대상 mRNA나 cDNA의 존재 유무, 발현양 등을 확인할 수 있다. 본 발명의 목적을 위해서는 SREBP2 mRNA에 상보적인 프로브를 피검체의 시료와 혼성화 반응(hybridization)을 수행하여 SREBP2 mRNA의 발현양을 측정함으로써 감염성 질환의 진단에 이용할 수 있다. 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 기술에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
본 발명에서 상기 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 또한 프라이머 또는 프로브는 SREBP2 mRNA와의 혼성화를 방해하지 않는 범위에서 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 다양하게 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 그리고 형광 또는 효소를 이용한 표지물질(labeling material)의 결합 등이 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 감염증 환자의 혈액 및 PBMC에는 SREBP2의 C-말단 펩타이드가 현저히 높게 발현이 되는 것으로 확인되었다. 특히, SREBP2의 C-말단 펩타이드는 환자의 혈액에서 검출하여 감염성 질환을 진단하는 것이 가능하기 때문에 신속한 진단 및 비침습적 진단이 가능하다는 점에서 매우 유용할 수 있다.
본 발명에서 상기 SREBP2 C-말단 펩타이드는 상기 서열번호 1의 SREBP2 단백질 전장(full-length) 서열에서 639 내지 1031번째 아미노산을 포함하는 펩타이드를 의미하며, 바람직하게는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다.
[서열번호 3] SREBP2 C-말단이 639-1031aa 영역
VFQCRRATPATEAGFEDEAKTSARDAALAYHRLHQLHITGKLPAGSACSDVHMALCAVNLAECAEEKIPPSTLVEIHLTAAMGLKTRCGGKLGFLASYFLSRAQSLCGPEHSAVPDSLRWLCHPLGQKFFMERSWSVKSAAKESLYCAQRNPADPIAQVHQAFCKNLLERAIESLVKPQAKKKAGDQEEESCEFSSALEYLKLLHSFVDSVGVMSPPLSRSSVLKSALGPDIICRWWTSAITVAISWLQGDDAAVRSHFTKVERIPKALEVTESPLVKAIFHACRAMHASLPGKADGQQSSFCHCERASGHLWSSLNVSGATSDPALNHVVQLLTCDLLLSLRTALWQKQASASQAVGETYHASGAELAGFQRDLGSL
본 발명에서 상기 '감염'은 하나 또는 두 종류 이상의 외인성 박테리아(세균, 그람 음성균 또는 그람 양성균을 모두 포함한다), 바이러스, 곰팡이(균)가 몸속에 침입하여 정착, 증식, 기생상태가 되는 것을 의미하며, 감염성 질환은 병원체의 감염의 결과로 생체에서 반응을 일으켜서 발생하는 모든 질환일 수 있다. 감염성 질환의 결과로 나타나는 반응은 염증, 통증, 발열, 피로감, 부종, 혈압 강하 등이 있을 수 있다.
본 발명에서 상기 감염성 질환은 바람직하게는 감염성 염증 질환일 수 있으며, 더 바람직하게는 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증, 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV) 감염증, 중동 호흡기 증후군(MERS), 살모넬라증(salmonellosis), 식중독, 장티푸스, 파라티푸스, 전신성 염증반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS), 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 폐렴, 폐결핵, 결핵, 감기, 인플루엔자, 기도 감염, 비염, 비인두염, 중이염, 기관지염, 임파선염, 이하선염, 림프절염, 구순염, 구내염, 관절염, 근육염, 피부염, 혈관염, 치은염, 치근막염, 각막염, 결막염, 창상 감염, 복막염, 간염, 골수염, 봉소염, 수막염, 뇌염, 뇌농양, 뇌척수염, 뇌막염, 골수염, 신장염, 심장염, 심내막염, 장염, 위염, 식도염, 십이지장염, 대장염, 요로염, 방광염, 질염, 자궁경부염, 난관염, 감염성 홍반, 세균성 이질, 농양 및 궤양, 균혈증, 설사, 이질, 위장염, 위장관염, 비뇨생식기 농양, 개방성 창상 또는 상처의 감염, 화농성 염증, 농양, 종기, 농피증, 농가진, 모낭염, 봉소염, 수술 후 상처 감염, 피부열상증후군, 피부화상증후군, 혈전성 혈소판 감소증, 용혈성 요독 증후군, 신부전증, 신우신염, 사구체신염, 신경계 농양, 중이염, 부비동염, 인두염, 편도선염, 유양돌기염, 연조직염, 치성 감염, 누낭염, 늑막염, 복부 농양, 간농양, 담낭염, 비장 농양, 심낭염, 심근염, 태반염, 양수염, 유방염, 유선염, 산욕열, 독소성 쇼크증후군(toxic shock syndrome), 라임(lyme)병, 가스 회저, 아테롬성 동맥경화증, 마이코박테리움 아비움 증후군(MAC), 장출혈성 대장균(EHEC) 감염증, 장병원성 대장균(EPEC) 감염증, 장침습성 대장균 감염증(EIEC), 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA) 감염증, 반코마이신 내성 황색포도상구균(VRSA) 감염증 및 리즈테리아증(listerosis)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 가장 바람직하게는 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 '패혈증'은 감염성 질환의 합병증으로 나타나는 전신성 염증 반응 증후군으로 원인을 조기에 신속하고 정확하게 진단하지 못할 경우에는 중증 패혈증(severe sepsis)이나 패혈성 쇼크(septic shock), 폐, 신장, 간, 순환기 등의 기능 장애까지 초래되는 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 파종성 혈관내 응고 증후군 (DIC), 급성 호흡 촉박 증후군 (ARDS) 또는 급성 신부전 (AKI)으로 진행되어 사망할 수 있는 치명적인 질환이다.
본 발명에서 상기 패혈증은, 패혈증의 최종 단계와 관련된 패혈증, 중증 패혈증, 패혈증성 쇼크 및 패혈증에 수반하는 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 파종성 혈관내 응고 증후군 (DIC), 급성 호흡 촉박 증후군 (ARDS) 또는 급성 신부전 (AKI)의 발병을 포함하나, 이에 제한되지 않으며 패혈증의 모든 단계를 포함한다.
본 발명에서 상기 중증급성호흡기증후군 바이러스 2는 코로나에 속하는 RNA 바이러스로서, SARS-CoV-2, COVID-19, 코비드-19, 코로나-19, 2019-nCoV, 2019 신종 코로나바이러스, coronavirus disease 2019 등으로 불리고 있다. 본 발명에서 상기 SARS-CoV-2는 감염 과정에서 다양한 돌연변이를 일으켜 변종이 발생할 수 있으며, 이들 변종 또한 본 발명의 상기 SARS-CoV-2에 모두 포함이 될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 감염성 환자의 질환 중증도가 높을수록 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 SREBP2 또는 이의 C-말단 펩타이드의 발현 수준이 현격히 증가하는 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명이 제공하는 상기 진단용 조성물은 감염성 질환의 진단뿐 아니라 중증도 예측까지 가능한 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한 SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins) 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염성 질환 진단용 키트를 제공한다.
본 발명의 진단용 키트에는 SREBP2의 발현 수준을 측정하기 위하여 선택적으로 SREBP2 단백질을 마커로 인식하는 항체, 항체의 단편, 압타머 또는 SREBP2 mRNA를 마커로 인식하는 프라이머, 프로브 뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
구체적인 양태로서 상기 진단 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7bp 내지 50bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10bp 내지 30bp의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또 다른 양태로는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
가장 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단용 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(항체와 컨주게이트된 형태로서) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 효소와 발색 반응할 기질 및 결합되지 않은 단백질 등은 제거하고 결합된 단백질 마커 만을 보유할 수 있는 세척액 또는 용리액을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 감염성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, (a) 감염성 질환이 의심되는 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins) 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 SREBP2 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 정상인과 비교하고 정상인에 비해 SREBP2의 단백질 또는 mRNA 발현 수준이 증가한 경우 감염성 질환인 것으로 판정하는 단계를 포함하는, SREBP2를 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명자들은 SREBP2가 신규한 감염성 질환의 마커로서 기능할 수 있음을 처음 발견하여 SREBP2의 발현 수준을 측정하여 감염성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 이하 본 발명의 방법을 단계에 따라 설명한다.
(a) 감염성 질환이 의심되는 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins) 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 생물학적 시료는 감염성 질환 여부를 진단하고자 하는 피검체에서 채취된 것이면 제한없이 사용할 수 있으며, 예를 들어 생검 등으로 얻어진 세포나 조직, 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질 분비물, 소변 및 뇌척수액 등일 수 있다. 바람직하게는 혈액, 혈장, 또는 혈청일 수 있다.
SREBP2 단백질의 수준은 SREBP2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 검출하거나 측정할 수 있다. SREBP2 단백질 특이적인 항체는 본 발명의 진단용 조성물에 서술한 바와 같다. SREBP2 단백질의 발현 수준을 측정하는 방법은 당업계에서 공지되어 있는 방법은 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 웨스턴 블랏팅(western blotting), 닷 블랏팅(dot blotting), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능 면역분석법(RIA), 방사면역확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역 전기영동, 면역조직화학염색, 면역침전법(immunoprecipitation), 보체 고정 분석법, 유세포 분석법(FACS) 또는 단백질 칩(chip) 방법 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 ELISA 방법을 이용할 수 있다.
SREBP2 mRNA 수준은 SREBP2 mRNA에 특이적으로 결합하는 프라이머 세트나 프로브를 이용하여 피검체의 시료로부터 SREBP2의 mRNA나 cDNA를 증폭하거나, 프로브와 혼성화 반응(hybridization)을 이용하여 피검체 시료 내 SREBP2 mRNA의 존재와 발현량을 측정할 수 있다. SREBP2의 프라이머와 프로브는 본 발명의 진단용 조성물에서 서술한 바와 같다. SREBP2 mRNA 발현 수준의 측정은 당업계에서 통상적인 발현 수준 확인 방법을 제한 없이 사용할 수 있으며, 분석 방법의 예로 역전사중합체연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA:RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), DNA 마이크로어레이 칩(microarray chip), RNA 염기서열분석(RNA sequencing), 나노스트링(nanostring)을 이용한 혼성화 방법, 조직 절편의 인시투 혼성화 방법(in situ hybridization) 등이 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 일 양태에서, 상기 (a) 단계에서 SREBP2의 발현 수준의 측정은 SREBP2 단백질의 C-말단 펩타이드의 검출인 것을 특징으로 할 수 있다. SREBP2 단백질의 C-말단 펩타이드에 대해서는 전술한 바가 참고될 수 있다.
(b) 상기 SREBP2 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 정상인과 비교하고 정상인에 비해 SREBP2의 단백질 또는 mRNA 발현 수준이 증가한 경우 감염성 질환인 것으로 판정하는 단계;
전술한 (a) 단계의 방법으로 측정한 피검체의 SREBP2의 발현 수준을, 동일한 방법으로 측정한 정상인의 SREBP2 수준과 비교한다. SREBP2의 발현 수준이 건강한 정상인에 비하여 증가한 피검체를 감염성 질환에 걸린 것으로 판정한다.
또한, 본 발명의 일 양태에서 상기 SREBP2의 발현 수준이 높을수록 질환의 중증도가 높은 것으로 판단할 수 있다. 진단의 기준이 되는 SREBP2 발현 수준 증가의 정도에 대하여서는, 선택한 SREBP2 발현 수준 측정 방법에 맞게 당업계에 공지된 기술에 따라 SREBP2의 발현 수준과 감염성 질환 중증도 사이의 상관성을 분석하여 SREBP2 발현 수준의 범위에 따라 감염성 질환의 중증도를 나타내도록 적절한 진단의 기준을 제공할 수도 있다.
본 발명에 따르면, SREBP2 또는 이의 C-말단 펩타이드는 감염성 질환에서 질환의 중증도와 비례하여 발현 수준이 증가하므로, 이들 감염성 질환의 진단 및 중증도 예측에 매우 유용하게 활용될 수 있다.
도 1A 내지 1H를 포함하는 도 1은 SARS-CoV-2 감염증(COVID-19)의 중증도를 진단하는 마커로서 SREBP2의 유용성을 환자의 혈액에서 분석한 결과이다.
도 2는 SREBF2 (A), SESN1 (B), PCSK9 (C), HMGCR (D), 및 LDLR (E)의 상대적인 mRNA 수준을 측정한 결과이다.
도 3A 내지 3F를 포함하는 도 3은 SREBP2 C-말단이 감염성 질환의 중증도를 반영하며, 진단 마커로서 활용이 될 수 있다는 것을 확인한 결과이다.
도 4A 내지 4G를 포함하는 도 4는은 SREBP2의 활성화가 콜레스테롤 방출 및 사이토카인 발현을 통해 혈관 염증성 반응에 필수적임을 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실험방법
1. 혈장 샘플
대구의 공중 보건소에서 SARS-CoV-2 감염증(COVID-19) 진단을 받은 영남대학교 병원 입원 환자로부터 전혈을 채취하였다. COVID-19 패혈증 환자는 패혈증 합의 회의위원회가 제공한 기준을 사용하여 정의되었다. 폐렴 및 패혈성 쇼크 환자 전혈은 영남대학교 병원에 입원한 환자들로부터 수집되었다. 건강한 지원자들이 대조군으로 사용되었다. 모든 환자에 대해 임상 데이터가 수집되었다. 전혈 수집 후 12 시간 내에 2000xg에서 5 분 동안 원심분리하여 혈장 샘플을 제조하였다. 인간 연구 프로토콜은 대구 영남대학교병원 임상시험 심사위원회의 승인을 받았다.
2. 환자 혈액 내 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤
환자 혈액 내 총 콜레스테롤, HDL-콜레스테롤, LDL-콜레스테롤 수치는 모듈식 DPE 시스템을 이용하여 분석하였다.
3. PBMC 분리 및 배양
건강한 지원자, SARS-CoV-2 폐렴 환자 또는 퇴원 환자의 샘플은 영남 대학교 의료 센터에서 입수했다. 헤파린 처리된 혈액 샘플을 4 시간 이내에 신선한 상태로 사용하였고, 제조업체의 권고에 따라 Ficoll-Hypaquek 또는 NycoPrepk를 사용하여 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 혈액에서 분리했다. 그 후, MACSprep?? PBMC 분리 키트를 이용해 정제된 PBMC를 수득하고, 1mM 피루브산나트륨, 2mM L-글루타민, 4.5mg/L글루코오스, 10mM HEPES 및 2mg/L 중탄산나트륨이 포함된 RPMI-1640에서 배양하였다.
4. SREBP2 전사 활성 분석
SREBP2의 전사 활성은 제조사의 프로토콜에 따라 Abcam(ab133111, Abcam)의 키트를 사용하여 ELISA 방법에 의해 결정되었다. 간략하게, 30 μg의 단백질 함량에 상응하는 핵 추출물을 컨센서스 SREBP-결합 서열(sterol regulatory element, SRE)을 갖는 이중 가닥 DNA 서열이 웰에 코팅 된 96-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 핵 추출물을 4℃에서 밤새 플레이트에서 컨센서스 SRE를 갖는 코팅된 이중 가닥 DNA 서열과 혼성화시켰다. 활성화된 SREBP 전사 인자 복합체는 SREBP2에 특이적인 1차 항체 및 HRP에 접합된 2차 항체 첨가 후 450nm에서 검출했다.
5. NF-kB 전사 활동 분석
종래 공지된 바와 같이, 핵 추출물 제조 및 TransAM 분석을 수행하였다. 개별 NF-κB 서브 유닛의 활성은 ELISA-기반 NF-κB 패밀리 전사 인자 분석 키트를 사용하여 결정되었다. 간략하게, 핵 추출물(2 ㎍)을 NF-κB 컨센서스 올리고 뉴클레오티드로 코팅된 96-웰 플레이트에서 첨가하고 배양하였다. 포획된 복합체는 특정 NF-κB 1차 Ab와 함께 인큐베이션 되었고, 이어서 키트에 포함된 HRP-접합된 2차 항체를 사용하여 검출되었다. 마지막으로, 450 nm에서 OD값을 측정했다.
6. SREBP2 C-말단 ELISA
SREBP2 C-말단을 인식하는 항체를 사용하여 경쟁적 ELISA를 수행했다. SREBP2 C-말단(639-1031aa) 단백질을 2 μg/100 μl로 희석하여 Nunc-Immuno?? MicroWell?? 96 well plate에 코팅하고 4℃에서 밤새 인큐베이션 했다. 사용하기 전에, 플레이트를 PBST로 3회 세척하고 30분 동안, 37℃에서 3% BSA로 차단하였다. 1차 항체 (1:2000 희석) 및 혈장 샘플(20μg)을 37℃에서 1시간 동안 예비 배양한 다음 예비 배양된 샘플을 펩타이드 코팅된 플레이트로 옮기고 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. 2차 항체(1:5000 희석)를 37℃에서 30분 동안 배양한 다음, 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. 세척된 플레이트를 10분 37℃에서 100㎕/웰의 TMB ELISA 기질로 처리한 다음, 정지 용액 100㎕/웰을 첨가하였다. 검출은 마이크로플레이트 리더로 450nm에서 수행되었다.
실험결과
1. SARS-CoV-2 감염증 환자의 PBMC에서 SREBP2가 높게 활성화되어 있었으며, 이어서 PBMC에 세포독성의 영향을 줌
SARS-CoV-2 감염증(COVID-19) 환자의 혈액에서, 총 콜레스테롤(Ch), 고밀도 지단백질(HDL-Ch) 및 저밀도 지단백질(LDL-Ch)의 수준은 정상인에 비해 낮았으며, 비-ICU(intensive care unit) 환자보다 ICU 환자에서 더 낮았다(결과 미도시). 각 그룹에서 현저한 동반 질환은 없었다. 분석에 따르면, SARS-CoV-2 감염증의 중증도가 비-ICU에서 ICU로 증가함에 따라 SREBP2 활성이 증가했으며(도 1A), 이는 콜레스테롤 수준의 경향과 반비례한다. SREBP2의 활성화 수준은 생존 환자보다 사망한 환자에서 높았으며(도 1B), 따라서, SREBP2는 SARS-CoV-2 감염증의 중증도에 대한 지표로 제안될 수 있다.
또한, SREBP2의 crosstalk 분자로 알려진 NF-κB는 SARS-CoV-2 감염증의 중증도가 증가함에 따라 유사한 증가 추세를 나타냈다(도 1C 및 1D). SARS-CoV-2 감염증의 중증도가 증가함에 따라 SREBP2 또는 NF-κB에 의한 IL-1
Figure pat00001
및 TNF-α와 같은 염증성 사이토카인의 생성도 증가했다(도 1E 및 1F).
SARS-CoV-2 감염증 환자의 PBMC를 시험관 내에서 배양한 경우 SARS-CoV-2 감염증 ICU 환자의 혈액과 급성 호흡기 증후군(ARDS) 환자의 혈액에서 분리된 PBMC의 생존력은 정상인의 그것과 비교하여 시간이 지남에 따라 더 빠르게 감소했다(도 1G). 또한, SREBP2의 활성화 수준은 시간이 지남에 따라 배양된 PBMC에서 증가했다(도 1H).
qRT-PCR 결과에 따르면, SREBF2 mRNA는 SARS-CoV-2 감염증 환자에서 중증도-의존적 방식으로 증가했으며, 지질을 조절하는 것으로 알려진 SESN1(sestrin 1) 및 PCSK9(proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)의 수준도 SARS-CoV-2 감염증의 중증도가 증가함에 따라 유사한 증가 추세를 보였다(도 2). 반면, 콜레스테롤 합성의 상류에서 작용하는 효소인 HMGCR(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase)의 mRNA 수준과 저밀도 지단백질 수용체(LDLR)는 SARS-CoV-2 감염증의 중증도와 상관없이 변화하지 않았다(도 2). 이러한 결과는 SARS-CoV-2 감염이 SREBP2의 염증 전사 인자로서의 활성을 증가시키는 반면에, SREBP2에 의한 콜레스테롤의 직접적인 합성 경로는 억제함을 시사한다.
2. SREBP2 C-말단의 발현 수준은 SARS-CoV-2 감염증의 중증도를 반영함
SREBP2 N-말단의 역할이 많은 연구에서 확인된 바 있다. S1P 및 S2P에 의해 SREBP2 N-말단 및 C-말단이 절단되면, N-말단은 핵으로 이동하여 궁극적으로 콜레스테롤의 합성을 조절한다. 그러나 SREBP2 C-말단의 역할은 아직 보고되지 않았다.
본 발명자는 SREBP2 C-말단은 SREBP2가 활성화되는 정도에 대응하여 SARS-CoV-2 감염증 환자의 혈액에서 분비되어야 한다는 가설을 세웠다. 특히, ICU 환자와 사망한 환자를 포함한 중증의 SARS-CoV-2 감염증 환자의 경우 SREBP2 C-말단의 수준이 급격히 증가했다(도 3A 및 3B). SREBP2 C-말단은 또한 중증 패혈증(패혈성 쇼크)에서 분비되었으며(도 3C), 이는 감염성 질환에 대한 일반적인 마커로서 SREBP2 C-말단의 이용 가능성을 암시한다.
이런 가능성은 SARS-CoV-2 감염증 환자의 혈액에서 증가된 수준의 LDH(lactate dehydrogenase) 및 CRP(C-reactive protein)에 의해 뒷받침된다(도 3D 및 3E). 이 높은 수준의 SREBP2 C-말단은 SARS-CoV-2 감염증 환자의 폐 조직에서 과염증과 밀접한 관련이 있다. 혈장에서 높은 SREBP2 C-말단 수준을 나타내는 ICU 환자의 컴퓨터 단층 촬영(CT) 이미지(도 3F의 오른쪽 패널)는 낮은 SREBP2 C-말단 수준을 나타내는 비-ICU 환자보다 심각한 폐 염증을 갖고 있었다(도 3F의 왼쪽 패널).
3. SREBP2 C-말단은 비조절된 혈관 구조의 지표이며, SREBP2의 약리학적 억제 또는 낙다운(knockdown)에 의해 보호될 수 있음
SREBP2의 N-말단 및 C-말단의 상이한 전위 표적을 입증하기 위해, 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. LPS에 노출되면, SREBP2 N-말단의 발현은 HUVEC의 전체 세포 용해물(WCL)에서 시간에 따라 일시적으로 증가했다(도 4A). 한편, SREBP2 C-말단은 LPS 자극의 말기(24 시간)에 상등액에서 고도로 발현되었다(도 4A). 유사하게, HEK293 및 HUVEC와 같은 다른 세포 유형에서, SREBP2 N-말단은 세포 용해물에서 검출되었지만 배양 배지에서는 관찰되지 않았다(결과 미도시). 후기 중개자로서 SREBP2와 달리 LPS에 의한 NF-
Figure pat00002
B 활성화는 조기에 상승했다. 이는 NF-
Figure pat00003
B와 SREBP2 사이의 crosstalk 의해 심각한 폐 손상을 매개하는 것으로 해석된다. SREBP2 C-말단은 WCL과 배양 상등액에서 모두 검출할 수 있었지만, 상등액에서 수준이 더 높았다(도 4A).
SREBP2의 N-말단과 C-말단의 주목할 만한 차이는 시뮬레이션 시간에 대해 증가하는 비율이었다. 이것은 LPS 처리시 시간 의존적인 NF-κB 활성화와 일치하였다(도 4B). SREBP2 N-말단의 단조로운 증가와 대조적으로, SREBP2 C-말단은 LPS 자극 후 24시간에 극적으로 증가하였다(도 4C).
LPS 자극의 지속 시간은 콜레스테롤 대사에서 다른 결과를 유도했다. 세포 내 콜레스테롤을 시각화하는 필리핀(Filipin) 염색을 통해 12시간의 LPS 자극 후 콜레스테롤이 HUVEC에 축적되었음을 확인할 수 있었다(도 4D). 그러나 콜레스테롤 수치는 LPS 자극 24시간 후에 감소했다(도 4D). CERP(cholesterol efflux regulatory protein)로도 알려진 ABCA1(ATP-binding cassette transporter)의 웨스턴 블롯 분석결과, 12시간 후 보다 24시간 후에 더 감소된 발현이 확인되었다(도 4E).
HUVEC에서, LPS 자극은 염증성 사이토카인의 상향 조절된 분비를 유도한다(도 4F의 상부 패널). 그러나, SREBP2의 유전자 제거는 LPS 자극 후에도 사이토카인 폭풍을 억제할 수 있었다(도 4F의 하부 패널). NF-κB, SREBP2 및 S1P (PF-429242)의 약리학적 억제와 SREBP2의 shRNA는 LPS 자극 하에서도 혈관 장벽 파괴를 억제했다(도 4G). SREBP2-과발현 (SREBP2 O/E) HUVEC는 LPS에 의해 더 심하게 손상되었다(도 4G).
본 발명에 따르면, SREBP2 또는 이의 C-말단 펩타이드는 감염성 질환에서 질환의 중증도와 비례하여 발현 수준이 증가하므로, 이들 마커는 감염성 질환의 진단 및 중증도 예측에 매우 유용하게 활용될 수 있어 산업상 이용가능성이 매우 높다.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> Composition for diagnosing infectious inflammatory disease comprising agents detecting the expression level of SREBP2 <130> NP20-0052 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1016 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBP2 protein <400> 1 Met Asp Asp Ser Gly Glu Leu Gly Gly Leu Glu Thr Met Glu Thr Leu 1 5 10 15 Thr Glu Leu Gly Asp Glu Leu Thr Leu Gly Asp Ile Asp Glu Met Leu 20 25 30 Gln Phe Val Ser Asn Gln Val Gly Glu Phe Pro Asp Leu Phe Ser Glu 35 40 45 Gln Leu Cys Ser Ser Phe Pro Gly Ser Gly Gly Ser Gly Ser Ser Ser 50 55 60 Gly Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Ser Ser Asn Gly Arg Gly Ser Ser 65 70 75 80 Ser Gly Ala Val Asp Pro Ser Val Gln Arg Ser Phe Thr Gln Val Thr 85 90 95 Leu Pro Ser Phe Ser Pro Ser Ala Ala Ser Pro Gln Ala Pro Thr Leu 100 105 110 Gln Val Lys Val Ser Pro Thr Ser 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Ala Arg Asp Ala Ala Leu Ala 530 535 540 Tyr His Arg Leu His Gln Leu His Ile Thr Gly Lys Leu Pro Ala Gly 545 550 555 560 Ser Ala Cys Ser Asp Val His Met Ala Leu Cys Ala Val Asn Leu Ala 565 570 575 Glu Cys Ala Glu Glu Lys Ile Pro Pro Ser Thr Leu Val Glu Ile His 580 585 590 Leu Thr Ala Ala Met Gly Leu Lys Thr Arg Cys Gly Gly Lys Leu Gly 595 600 605 Phe Leu Ala Ser Tyr Phe Leu Ser Arg Ala Gln Ser Leu Cys Gly Pro 610 615 620 Glu His Ser Ala Val Pro Asp Ser Leu Arg Trp Leu Cys His Pro Leu 625 630 635 640 Gly Gln Lys Phe Phe Met Glu Arg Ser Trp Ser Val Lys Ser Ala Ala 645 650 655 Lys Glu Ser Leu Tyr Cys Ala Gln Arg Asn Pro Ala Asp Pro Ile Ala 660 665 670 Gln Val His Gln Ala Phe Cys Lys Asn Leu Leu Glu Arg Ala Ile Glu 675 680 685 Ser Leu Val Lys Pro Gln Ala Lys Lys Lys Ala Gly Asp Gln Glu Glu 690 695 700 Glu Ser Cys Glu Phe Ser Ser Ala Leu Glu Tyr Leu Lys Leu Leu His 705 710 715 720 Ser Phe Val Asp Ser Val Gly Val Met Ser Pro Pro Leu Ser Arg Ser 725 730 735 Ser Val Leu Lys Ser Ala Leu Gly Pro Asp Ile Ile Cys Arg Trp Trp 740 745 750 Thr Ser Ala Ile Thr Val Ala Ile Ser Trp Leu Gln Gly Asp Asp Ala 755 760 765 Ala Val Arg Ser His Phe Thr Lys Val Glu Arg Ile Pro Lys Ala Leu 770 775 780 Glu Val Thr Glu Ser Pro Leu Val Lys Ala Ile Phe His Ala Cys Arg 785 790 795 800 Ala Met His Ala Ser Leu Pro Gly Lys Ala Asp Gly Gln Gln Ser Ser 805 810 815 Phe Cys His Cys Glu Arg Ala Ser Gly His Leu Trp Ser Ser Leu Asn 820 825 830 Val Ser Gly Ala Thr Ser Asp Pro Ala Leu Asn His Val Val Gln Leu 835 840 845 Leu Thr Cys Asp Leu Leu Leu Ser Leu Arg Thr Ala Leu Trp Gln Lys 850 855 860 Gln Ala Ser Ala Ser Gln Ala Val Gly Glu Thr Tyr His Ala Ser Gly 865 870 875 880 Ala Glu Leu Ala Gly Phe Gln Arg Asp Leu Gly Ser Leu Arg Arg Leu 885 890 895 Ala His Ser Phe Arg Pro Ala Tyr Arg Lys Val Phe Leu His Glu Ala 900 905 910 Thr Val Arg Leu Met Ala Gly Ala Ser Pro Thr Arg Thr His Gln Leu 915 920 925 Leu Glu His Ser Leu Arg Arg Arg Thr Thr Gln Ser Thr Lys His Gly 930 935 940 Glu Val Asp Ala Trp Pro Gly Gln Arg Glu Arg Ala Thr Ala Ile Leu 945 950 955 960 Leu Ala Cys Arg His Leu Pro Leu Ser Phe Leu Ser Ser Pro Gly Gln 965 970 975 Arg Ala Val Leu Leu Ala Glu Ala Ala Arg Thr Leu Glu Lys Val Gly 980 985 990 Asp Arg Arg Ser Cys Asn Asp Cys Gln Gln Met Ile Val Lys Leu Gly 995 1000 1005 Gly Gly Thr Ala Ile Ala Ala Ser 1010 1015 <210> 2 <211> 3051 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBP2 mRNA <400> 2 atggacgaca gcggcgagct gggtggtctg gagaccatgg agaccctcac ggagctgggc 60 gacgagctga ccctgggaga catcgacgag atgctgcaat ttgtcagtaa tcaagtggga 120 gagttccctg acttgttttc agaacagctg tgtagctcct ttcctggcag tggtggtagt 180 ggtagcagca gcggcagcag tggcagcagc agcagcagca gcaatggcag gggcagcagc 240 agcggagctg tggacccttc agtgcaacgg tcattcaccc aggtcacatt accttccttc 300 tctccctcgg cggcctcccc acaggctcca actctgcaag tcaaggtttc tcccacctca 360 gttcccacca cacccagggc aactcctatt cttcagcccc gcccccagcc ccagcctcaa 420 cctcaaactc agctgcaaca acagacggta atgatcacgc caacattcag caccactccg 480 cagacgagga tcatccagca gcctttgata 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ccaggagctc cgtgctcaag 2220 tccgccctgg gtccagacat catctgtcgg tggtggacgt ctgcaatcac tgtggccatc 2280 agctggctcc agggagacga tgcagctgtg cgctctcatt ttaccaaagt ggaacgcatc 2340 cccaaggccc tggaagtgac agagagcccc ctggtgaagg ccatcttcca tgcctgcaga 2400 gccatgcatg cctcactccc tgggaaagca gatgggcagc agagttcctt ctgccattgc 2460 gagagggcca gtggccacct atggagcagc ctcaacgtca gtggggccac ctctgaccct 2520 gccctcaacc acgtggtcca gctgctcacc tgtgacctgc tactgtcgct acggacagcg 2580 ctctggcaaa aacaggccag tgccagccag gctgtggggg agacctacca cgcgtcaggc 2640 gctgaactgg cgggcttcca acgggacctg ggcagcctgc gcaggctggc acacagcttc 2700 cgcccagcat accgcaaggt gttcctgcat gaagccaccg tgcgcctgat ggcaggagcc 2760 agccccaccc gcacccacca gctgctggaa cacagcctgc ggcggcgcac cacgcagagc 2820 accaagcacg gagaggtgga tgcctggccc ggccagcgag agcgggccac cgccatcctg 2880 ctggcctgcc gccacctgcc cctctccttc ctctcctccc cgggccagcg ggcagtgctg 2940 ctggccgaag ctgcccgcac cctggagaag gtgggcgacc ggcgctcctg caacgactgc 3000 cagcagatga ttgttaagct gggtggtggc actgccattg ccgcctcctg a 3051 <210> 3 <211> 378 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> SREBP2 C-terminal amino acid sequence <400> 3 Val Phe Gln Cys Arg Arg Ala Thr Pro Ala Thr Glu Ala Gly Phe Glu 1 5 10 15 Asp Glu Ala Lys Thr Ser Ala Arg Asp Ala Ala Leu Ala Tyr His Arg 20 25 30 Leu His Gln Leu His Ile Thr Gly Lys Leu Pro Ala Gly Ser Ala Cys 35 40 45 Ser Asp Val His Met Ala Leu Cys Ala Val Asn Leu Ala Glu Cys Ala 50 55 60 Glu Glu Lys Ile Pro Pro Ser Thr Leu Val Glu Ile His Leu Thr Ala 65 70 75 80 Ala Met Gly Leu Lys Thr Arg Cys Gly Gly Lys Leu Gly Phe Leu Ala 85 90 95 Ser Tyr Phe Leu Ser Arg Ala Gln Ser Leu Cys Gly Pro Glu His Ser 100 105 110 Ala Val Pro Asp Ser Leu Arg Trp Leu Cys His Pro Leu Gly Gln Lys 115 120 125 Phe Phe Met Glu Arg Ser Trp Ser Val Lys Ser Ala Ala Lys Glu Ser 130 135 140 Leu Tyr Cys Ala Gln Arg Asn Pro Ala Asp Pro Ile Ala Gln Val His 145 150 155 160 Gln Ala Phe Cys Lys Asn Leu Leu Glu Arg Ala Ile Glu Ser Leu Val 165 170 175 Lys Pro Gln Ala Lys Lys Lys Ala Gly Asp Gln Glu Glu Glu Ser Cys 180 185 190 Glu Phe Ser Ser Ala Leu Glu Tyr Leu Lys Leu Leu His Ser Phe Val 195 200 205 Asp Ser Val Gly Val Met Ser Pro Pro Leu Ser Arg Ser Ser Val Leu 210 215 220 Lys Ser Ala Leu Gly Pro Asp Ile Ile Cys Arg Trp Trp Thr Ser Ala 225 230 235 240 Ile Thr Val Ala Ile Ser Trp Leu Gln Gly Asp Asp Ala Ala Val Arg 245 250 255 Ser His Phe Thr Lys Val Glu Arg Ile Pro Lys Ala Leu Glu Val Thr 260 265 270 Glu Ser Pro Leu Val Lys Ala Ile Phe His Ala Cys Arg Ala Met His 275 280 285 Ala Ser Leu Pro Gly Lys Ala Asp Gly Gln Gln Ser Ser Phe Cys His 290 295 300 Cys Glu Arg Ala Ser Gly His Leu Trp Ser Ser Leu Asn Val Ser Gly 305 310 315 320 Ala Thr Ser Asp Pro Ala Leu Asn His Val Val Gln Leu Leu Thr Cys 325 330 335 Asp Leu Leu Leu Ser Leu Arg Thr Ala Leu Trp Gln Lys Gln Ala Ser 340 345 350 Ala Ser Gln Ala Val Gly Glu Thr Tyr His Ala Ser Gly Ala Glu Leu 355 360 365 Ala Gly Phe Gln Arg Asp Leu Gly Ser Leu 370 375

Claims (11)

  1. SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins) 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염성 질환 진단용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 SREBP2 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 SREBP2 단백질은 SREBP2의 C-말단 펩타이드인 것을 특징으로 하는 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 SREBP2의 C-말단 펩타이드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 감염성 질환은 바이러스, 박테리아 및 곰팡이(fungi)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 감염에 의한 것을 특징으로 하는 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 감염성 질환은 패혈증(sepsis), 패혈성 쇼크(septic shock), 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 감염증 , 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스(SARS-CoV) 감염증, 중동 호흡기 증후군(MERS), 살모넬라증(salmonellosis), 식중독, 장티푸스, 파라티푸스, 전신성 염증반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome, SIRS), 다장기 기능장애 증후군(multiple organ dysfunction syndrome, MODS), 폐렴, 폐결핵, 결핵, 감기, 인플루엔자, 기도 감염, 비염, 비인두염, 중이염, 기관지염, 임파선염, 이하선염, 림프절염, 구순염, 구내염, 관절염, 근육염, 피부염, 혈관염, 치은염, 치근막염, 각막염, 결막염, 창상 감염, 복막염, 간염, 골수염, 봉소염, 수막염, 뇌염, 뇌농양, 뇌척수염, 뇌막염, 골수염, 신장염, 심장염, 심내막염, 장염, 위염, 식도염, 십이지장염, 대장염, 요로염, 방광염, 질염, 자궁경부염, 난관염, 감염성 홍반, 세균성 이질, 농양 및 궤양, 균혈증, 설사, 이질, 위장염, 위장관염, 비뇨생식기 농양, 개방성 창상 또는 상처의 감염, 화농성 염증, 농양, 종기, 농피증, 농가진, 모낭염, 봉소염, 수술 후 상처 감염, 피부열상증후군, 피부화상증후군, 혈전성 혈소판 감소증, 용혈성 요독 증후군, 신부전증, 신우신염, 사구체신염, 신경계 농양, 중이염, 부비동염, 인두염, 편도선염, 유양돌기염, 연조직염, 치성 감염, 누낭염, 늑막염, 복부 농양, 간농양, 담낭염, 비장 농양, 심낭염, 심근염, 태반염, 양수염, 유방염, 유선염, 산욕열, 독소성 쇼크증후군(toxic shock syndrome), 라임(lyme)병, 가스 회저, 아테롬성 동맥경화증, 마이코박테리움 아비움 증후군(MAC), 장출혈성 대장균(EHEC) 감염증, 장병원성 대장균(EPEC) 감염증, 장침습성 대장균 감염증(EIEC), 메치실린 내성 황색포도상구균(MRSA) 감염증, 반코마이신 내성 황색포도상구균(VRSA) 감염증 및 리즈테리아증(listerosis)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 진단은 감염성 질환의 중증도 진단인 것을 특징으로 하는 조성물.
  8. SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins) 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 감염성 질환 진단용 키트.
  9. 감염성 질환의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
    (a) 감염성 질환이 의심되는 환자로부터 제공된 생물학적 시료에서 SREBP2(Sterol regulatory element binding proteins) 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 SREBP2 단백질 또는 mRNA의 발현 수준을 정상인과 비교하고 정상인에 비해 SREBP2의 단백질 또는 mRNA 발현 수준이 증가한 경우 감염성 질환인 것으로 판정하는 단계를 포함하는, SREBP2를 검출하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 타액, 비액, 객담, 관절낭액, 양수, 복수, 자궁경부 또는 질 분비물, 소변 및 뇌척수액으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 SREBP2의 발현 수준이 더 높을수록 감염성 질환의 중증도가 더 높은 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는 방법.
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